JP2020005547A - エンドグリコシダーゼ阻害剤 - Google Patents
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Abstract
Description
又、特許文献2には、コプリナス・シネレウス由来であり、糖タンパク質が有するN−結合型糖鎖を切断し遊離させる活性を有さず、糖鎖を転移させる活性のみを有する酵素であるエンドグリコシダーゼが開示されている。そしてその酵素を、タンパク質及びオキサゾリン化糖鎖と接触させ、糖鎖をタンパク質に転移させる、糖タンパク質の作製方法が開示されている。
式(I)中、R1及びR3は、それぞれ独立に、水素又は酸素と共有結合可能な一価の有機基であるが、酸素と共有結合可能な一価の有機基としては、アルキル基、アルケニル基、フェニル基等を挙げることができる。R1及びR3としては水素、炭素数1〜4の低級アルキル基が好ましい。
前記の糖鎖残基の中でも、3以上11以下の単糖からなり、分岐している糖鎖残基が好ましく、中でも3以上9以下の単糖からなり、分岐している糖鎖残基がより好ましい。
この糖鎖残基の具体例としては、前記式(II)又は式(III)で表される基を挙げることができる。
R2が、1つの単糖からなる糖鎖残基の場合、例えばGlcNacの場合は、優れた阻害活性を示さない。
特開2018−21001号公報に記載の実施例12と同じ方法、条件により反応、精製を行い、同公報中に記載の構造式(f1)で表される糖イミダゾリン誘導体(Fmoc−Lys−SGイミダゾリン体)を得た。MALDI−TOF−MS測定を行ったところ、計算値とよく一致する測定値を得てFmoc−Lys−SGイミダゾリン体が得られていることを確認した。
このようにして得られたFmoc−Lys−SGイミダゾリン体を、100mMリン酸ナトリウムバッファー(pH9.0)中で、50℃の温度に3日間保つことにより脱水し、前記式(V)で表されるFmoc−Lys−SGイミダゾ−ル体を得た。MALDI−TOF−MS測定を行ったところ、計算値とよく一致する測定値を得てFmoc−Lys−SGイミダゾ−ル体が得られていることを確認した。
Fmoc−Lys塩酸塩の代わりにLys塩酸塩を用いた以外は、合成例1と同様な方法、条件にて反応を行ったところLys−SGイミダゾール体を得た。
特開2018−21001号公報に記載の実施例15、16と同じ方法、条件により反応、精製を行い、同公報中に記載の構造式(p)で表される糖イミダゾ−ル誘導体(Fmoc−Lys−GlcNAcイミダゾ−ル体)を得た。MALDI−TOF−MS測定を行ったところ、計算値とよく一致する測定値を得てFmoc−Lys−GlcNAcイミダゾ−ル体が得られていることを確認した。
http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0132848のMaterials and Methods中のPreparation of oligosaccharide oxazolines (M3-Oxa, G0-Oxa, G2-Oxa, and A2-Oxa) に記載の方法により合成した下記構造式(XVII)で表される化合物(M3:25.5mg、36μmol)に、0.5Mの2−クロロ−1,3−ジメチル−1H−ベンズイミダゾール−3−イムクロライド(CDMBI)水溶液(360μL)を加えて撹拌した。0℃でトリエチルアミン(75.4μL、538.6μmol)を加えて、4℃、1000rpmで30分間振とうさせた。得られた反応液を、以下の条件で逆相HPLCにかけ、分離精製を行った後、0.1N水酸化ナトリウム(10μL)を加え凍結乾燥して、下記構造式(XVIII)で表されるM3オキサゾリン(M3O:14.0mg、収率54.9%)を得た。
このようにして得られたFmoc−Lys−M3イミダゾリン体を、100mMリン酸ナトリウムバッファー(pH9.0)中で、50℃の温度に7日間保つことにより脱水し、Fmoc−Lys−M3イミダゾ−ル体を得た。MALDI−TOF−MS測定を行ったところ、計算値とよく一致する測定値を得て前記式(IV)で表されるFmoc−Lys−M3イミダゾ−ル体が得られていることを確認した。
下記のエンドグリコシダーゼ阻害剤について、その阻害活性を測定した。
(測定対象のエンドグリコシダーゼ阻害剤)
・合成例1により得られた前記式(V)で表される糖イミダゾール誘導体(Fmoc−Lys−SGイミダゾール体)。
・合成例1により得られた糖イミダゾリン誘導体(Fmoc−Lys−SGイミダゾリン体)。
・合成例2により得られた糖イミダゾール誘導体(Lys−SGイミダゾール体)。
・合成例3により得られた糖イミダゾール誘導体(Fmoc−Lys−GlcNACイミダゾール体)。
・合成例4により得られた前記式(IV)で表される糖イミダゾール誘導体(Fmoc−Lys−M3イミダゾール体)。
・キチンオリゴ糖(甲陽ケミカル社製)
・ランソプラゾール(富士フィルム和光純薬工業社製)
・オメプラゾール(富士フィルム和光純薬工業社製)
・ラベプラゾール(富士フィルム和光純薬工業社製)
酵素としてEndo−CC(伏見製薬所社製のエンドグリコシダーゼ)を使用し、シアリルグリコペプチド(SGP)をシアリル化糖鎖(SG)とグリコペプチド(GP)に加水分解する反応を、前記エンドグリコシダーゼ阻害剤の存在下及び非存在下で行い、エンドグリコシダーゼ阻害剤による前記加水分解する反応の阻害率を求めた。具体的な反応条件を以下に示す。
Endo−CCを10質量倍の20mM Tris−HCl buffer(pH7.5)に溶解して、酵素溶液を作製する。
(阻害基質溶液の作製)
前記エンドグリコシダーゼ阻害剤のそれぞれを以下に示す溶媒に溶解し、4mMの阻害基質溶液を作成した。
水:阻害剤がFmoc−Lys−SGイミダゾール体、Fmoc−Lys−SGイミダゾリン体、Lys−SGイミダゾール体、Fmoc−Lys−GlcNACイミダゾール体、Fmoc−Lys−M3イミダゾール体の場合
1%DMSO水溶液:阻害剤がキチンオリゴ糖、ラベプラゾール、オメプラゾールの場合
10%DMSO水溶液:阻害剤がランソプラゾールの場合
前記酵素溶液を20μl、4mMのSGP(基質)水溶液を4μl、4mMの阻害基質溶液を4μl、反応buffer(リン酸緩衝液:0.2Mol NaH2PO4−Na2HPO4:pH8.0)を8μl、さらに水4μlを加えて合計40μlとした後、サーマルサイキュラー(TaKaRa社製:PCR Thermal Cycler Dice Touch)中に入れて37℃で70分反応させた後、5分間99℃に加熱して反応を停止した。その後4℃に冷却して、HPLC測定用試料を調整した。
このようにして得られた試料について、下記の条件でHPLCの測定を行い、未反応SGPと生成されたGPのピーク面積の和に対する、加水分解により生成したGPのピーク面積の割合(GP/(未反応SGP+GP):この割合をP1とする)を求めた。
(1)分析機器:紫外可視検出器(Agilent Infinity1260社製)
(2)カラム:メルク社製 クロモリス パフォーマンス RP−18e100−2
(3)移動相
A液:0.1% TFA
B液:アセトニトリル
A液とB液の混合液を用い、Bの比率(Vol%)を、0−7分は0%−7%に変化させ、7−8分は7%−100%に変化させ、8−9分は100%とし、9−10分は100%−0%に変化させた。
(4)流速0.4ml/min
(5)カラム温度:40℃
(6)検出;UV214nm
上記で得られたP1及びP2から下記式により得られた結果を阻害率とする。各阻害剤についての阻害率を表1に示した。
100−{(P2/P1)×100}(%)
サーマルサイキュラー中での70分の反応を、4mMのSGP(基質)水溶液を加えない合計36μlについて37℃で60分反応させた後、4mMのSGP(基質)水溶液を4μl加えてさらに10分間反応させて行った以外は、Co−incubationの場合と同様にして、HPLC測定用試料を調整し、各阻害剤についての阻害率を求め、その結果を表2に示した。
実施例1、3で使用したFmoc−Lys−M3イミダゾール体は、3つの単糖からなり分岐している糖鎖が結合している糖イミダゾール体に、塩基性アミノ酸であるリジンのα−アミノ基が保護基(Fmoc)により保護されている残基が結合している化合物であり、
実施例2、4で使用したFmoc−Lys−SGイミダゾール体は、9つの単糖からなり分岐している糖鎖が結合している糖イミダゾール体に、塩基性アミノ酸であるリジンのα−アミノ基が保護基(Fmoc)により保護されている残基が結合している化合物であるが、
これらをエンドグリコシダーゼ阻害剤として用いた場合は、いずれも50%超える高い阻害率が得られている。
SGイミダゾ−ル体をSGイミダゾリン体としたFmoc−Lys−SGイミダゾリン体、
リジンのα−アミノ基が保護基(Fmoc)により保護されていないLys−SGイミダゾール体、又は
SGを1つの単糖からなるGlcNAcに置き換えたFmoc−Lys−GlcNAcイミダゾール体
をエンドグリコシダーゼ阻害剤として用いた場合は、実施例に比べてはるかに低い阻害率しか得られていない。
又、既存の文献報告等によりエンドグリコシダーゼによる酵素反応を停止する作用を有する可能性が考えられたキチンオリゴ糖、ランソプラゾール、オメプラゾール、ラベプラゾールをエンドグリコシダーゼ阻害剤として用いた場合も、実施例に比べてはるかに低い阻害率しか得られていない。
以上の結果より、2以上の単糖からなる糖鎖残基を有する糖イミダゾール誘導体に、塩基性アミノ酸の残基であってその中に含まれるアミノ基が保護基により保護されている1価基が結合している化合物が、エンドグリコシダーゼによる酵素反応に対する優れた阻害活性を有すること、
他の化合物、例えば糖イミダゾリン誘導体の場合、塩基性アミノ酸の残基中に含まれるアミノ基が保護基により保護されていない場合、糖鎖残基が1つの単糖からなる場合は、優れた阻害活性を有しないことが示されている。
Claims (8)
- R2が、3以上11以下の単糖からなり分岐している糖鎖残基である請求項1に記載のエンドグリコシダーゼ阻害剤。
- 前記塩基性アミノ酸から1つのアミノ基を取り除いた残基が、リジンからその側鎖にあるアミノ基を取り除いた残基である請求項1ないし請求項4のいずれか1項に記載のエンドグリコシダーゼ阻害剤。
- 前記保護基が、9−フルオレニルメチルオキシカルボニル基(Fmoc)、tert−ブトキシカルボニル基(Boc)及び疎水性アミノ酸からそのカルボキシル基の水素を除いた残基からなる群より選ばれる請求項1ないし請求項5のいずれか1項に記載のエンドグリコシダーゼ阻害剤。
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