JP2020003315A - メンブランシートのブロッキング方法 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]イムノクロマトグラフィー用試験片を構成するメンブランシートをブロッキングする方法であって、
(a)被検物質に特異的に結合する少なくとも1種のテスト抗体と、リファレンス抗体とが、互いに異なる位置に固相化されている固相化処理されたメンブランシートを用意する工程、
(b)固相化処理されたメンブランシートにブロッキング溶液を浸透させる浸透処理工程、および
(c)浸透処理されたメンブランシートを乾燥させる乾燥工程
を含んでなり、
前記浸透処理工程(b)におけるブロッキング溶液の浸透方向が、テスト抗体側末端からリファレンス抗体側末端へ向かう方向に対して順方向となるように制御される、方法。
[2]前記浸透処理工程(b)が、前記固相化処理されたメンブランシートの前記テスト抗体側末端をブロッキング溶液に浸漬させて、ブロッキング溶液を前記リファレンス抗体側末端まで浸透させる操作によって行われる、[1]に記載の方法。
[3]前記浸透処理工程(b)が、前記固相化処理されたメンブランシートの前記テスト抗体側末端をブロッキング溶液に浸漬し、かつ、前記リファレンス抗体側末端を吸水性素材に接触させて、ブロッキング溶液を前記リファレンス抗体側末端まで浸透させる操作によって行われる、[1]に記載の方法。
[4]前記浸透処理工程(b)の後に、該浸透処理されたメンブランシートを、吸水性素材に接触させて、該浸透処理されたメンブランシート上の余分なブロッキング溶液を吸収させる吸収工程(A)をさらに含んでなり、
前記吸収工程(A)におけるブロッキング溶液の吸収方向が、テスト抗体側末端からリファレンス抗体側末端へ向かう方向に対して順方向となるように制御される、[1]〜[3]のいずれかに記載の方法。
[5]前記吸収工程(A)が、前記浸透処理されたメンブランシートの、前記リファレンス抗体側末端を吸水性素材に接触させて、ブロッキング溶液が浸透したメンブランシート上の余分なブロッキング溶液を吸収させる操作によって行われる、[4]に記載の方法。
[6]前記浸透処理工程(b)の後に、該浸透処理されたメンブランシートを、洗浄溶液により洗浄する洗浄工程をさらに含んでなる、[1]〜[5]のいずれかに記載の方法。
[7]前記洗浄工程が、前記浸透処理されたメンブランシートの全体を洗浄溶液に浸漬することによって行われる操作を含んでなる、[6]に記載の方法。
[8]前記洗浄工程が、前記浸透処理されたメンブランシートの前記テスト抗体側末端を洗浄溶液に浸漬し、かつ、前記リファレンス抗体側末端を吸水性素材に接触させて、洗浄溶液を前記リファレンス抗体側末端まで浸透させることによって行われる操作を含んでなり、
前記洗浄工程の後に、得られたメンブランシートを、吸水性素材に接触させて、洗浄溶液が浸透したメンブランシート上の余分な洗浄溶液を吸収させる吸収工程(B)をさらに含んでなり、
前記吸収工程(B)における洗浄溶液の吸収方向が、テスト抗体側末端からリファレンス抗体側末端へ向かう方向に対して順方向となるように制御される、[6]または[7]に記載の方法。
[9]イムノクロマトグラフィー用試験片を構成するメンブランシートを製造する方法であって、
(a)被検物質に特異的に結合する少なくとも1種のテスト抗体と、リファレンス抗体とを、メンブランシート上の互いに異なる位置に固相化する抗体固相化工程、並びに
(b)[1]〜[8]のいずれかに記載の方法により、該メンブランシートをブロッキングする工程
を含んでなる、方法。
[10][9]に記載の方法により製造される、メンブランシート。
[11]イムノクロマトグラフィー用試験片を構成するメンブランシートであって、
被検物質に特異的に結合する少なくとも1種のテスト抗体と、リファレンス抗体とが、該メンブランシート上の互いに異なる位置に固相化されており、
遊離したリファレンス抗体が、リファレンス抗体が固相化されている位置からテスト抗体側末端までの間(ただし、リファレンス抗体が固相化されている位置は除く)と比較して、リファレンス抗体が固相化されている位置から前記テスト抗体側末端とは反対側の末端までの間(ただし、リファレンス抗体が固相化されている位置は除く)の方により多く付着している、メンブランシート。
[12][10]または[11]に記載のメンブランシートを含んでなる、イムノクロマトグラフィー用試験片。
[13][12]に記載のイムノクロマトグラフィー用試験片を含んでなる、イムノクロマトグラフィー用試験キット。
以下の手法を用いて、着色粒子標識抗体、コンジュケートパッドおよび抗体固相化メンブランシートを調製した。
青色カルボキシルラテックス粒子(ポリスチレン、粒径400nm)の10(w/v)%水分散液30μLと50mMMES緩衝液(pH6.0)270μLを混合し、次にEDC(水溶性カルボジイミド)を最終濃度1%になるように添加し室温で3時間活性化した。その後、遠心分離し、洗浄した後、1mg/mLに濃度調整したマウス抗インフルエンザウイルスA型抗体100μLを添加し、室温で一晩反応させた。次に遠心分離し、洗浄した後、10(w/v)%BSA/PBS溶液でブロッキングした。次に遠心分離し、10(w/v)%スクロース、1(w/v)%BSAを含むPBS溶液10mL中に懸濁した後、超音波分散装置にかけ、青色粒子標識抗A型抗体分散液を得た。
青色粒子標識抗A型抗体分散液と赤色粒子標識抗B型抗体分散液を混合することで着色粒子混合分散液を得た。網の上に並べたガラス不織布パッド(メルクミリポア社)に、着色粒子混合分散液を45μL/cmの割合で塗布し、均一に塗り広げた後、オーブンで一晩乾燥し、コンジュゲートパッドを得た。
ニトロセルロースメンブランシート(メルクミリポア社、縦3.0cm、横45cm)に、リン酸緩衝液で1.0mg/mLに濃度調整した上記の着色粒子標識抗インフルエンザA型抗体とはエピトープが異なるマウス抗インフルエンザウイルスA型抗体、リン酸緩衝液で1.0mg/mLに濃度調整した上記の着色粒子標識抗インフルエンザB型抗体とはエピトープが異なるマウス抗インフルエンザウイルスB型抗体、およびリン酸緩衝液で1.0mg/mLに調整したヤギ抗マウスIgG抗体を幅1mmのライン状に塗布した。マウス抗インフルエンザウイルスA型抗体を塗布したラインをAライン、マウス抗インフルエンザウイルスB型抗体を塗布したラインをBライン、ヤギ抗マウスIgG抗体を塗布したラインをR(リファレンス)ラインとした。塗布する位置はメンブランシートの下端(上流側)から11mmの位置にAライン、14.5mmの位置にBライン、18.0mmの位置にRラインが来るように設定した。塗布は、イムノクロマトグラフィー用ディスペンサーXYZ3050(バイオドット社)を用い、1μL/cmとなるように設定した。ライン塗布後のニトロセルロースメンブランシートを30℃で一晩乾燥した。
(1)抗体固相化メンブランシートのブロッキング液の浸透処理および洗浄処理
調製例(3)で調製された抗体固相化メンブランシートを、以下の表1に記載された操作に従い、ブロッキングの浸透処理を行い、その後洗浄処理を行った(実施例1〜16および比較例1〜3)。
ブロッキング溶液(100mM Tris−HCl pH=8.0、1.0(w/v)%TritonX−100、1.0(w/v)%スクロース、0.10(w/v)%スキムミルク、10.0mM EDTA−2Na、0.090(w/v)%アジ化ナトリウム)で充たした容器に対して、メンブランシートの下端(テスト抗体側)から5mmだけ液面下に浸し、ブロッキング溶液がメンブランシートの上端(リファレンス抗体側)にくるまで吸い上げた。
メンブランシートの上端(リファレンス抗体側)全体に吸収紙(大王製紙社製キッチンペーパー超吸収キッチンタオル)を接触させながら、ブロッキング溶液で充たした容器に対して、メンブランシートの下端(テスト抗体側)から5mmだけ液面下に浸し、ブロッキング溶液を吸い上げた。
メンブランシート全体を、ブロッキング溶液で充たした容器の中に浸漬させた。
吸収紙を敷き、ブロッキング溶液が浸潤したメンブランシートを逆さまにして、敷いた吸収紙に上端(リファレンス抗体側)を1分間押し付けて、浸潤したブロッキング溶液を吸収させた。
吸収紙を敷き、ブロッキング溶液が浸潤したメンブランシートを逆さまにして、敷いた吸収紙に上端(リファレンス抗体側)を30分間押し付けて、浸潤したブロッキング溶液を吸収させた。
吸収紙を敷き、ブロッキング溶液が浸潤したメンブランシートの下端(テスト抗体側)を1分間押し付けて、浸潤したブロッキング溶液を吸収させた。
洗浄溶液(20mM Tris−HCl pH=7.0、0.01(w/v)%TritonX−100、1.0(w/v)%スクロース)で充たした容器に対して、メンブランシートの下端(テスト抗体側)から5mmだけ液面下に浸し、洗浄溶液がメンブランシートの上端(リファレンス抗体側)にくるまで吸い上げた。
メンブランシートの上端(リファレンス抗体側)全体に吸収紙(大王製紙社製キッチンペーパー超吸収キッチンタオル)を接触させながら、洗浄溶液で充たした容器に対して、メンブランシートの下端(テスト抗体側)から5mmだけ液面下に浸し、洗浄溶液を吸い上げた。
メンブランシート全体を、洗浄溶液で充たした容器の中に浸漬させた。
吸収紙を敷き、洗浄溶液が浸潤したメンブランシートを逆さまにして、敷いた吸収紙に上端(リファレンス抗体側)を1分間押し付けて、浸潤した洗浄溶液を吸収させた。
吸収紙を敷き、洗浄溶液が浸潤したメンブランシートを逆さまにして、敷いた吸収紙に上端(リファレンス抗体側)を30分間押し付けて、浸潤した洗浄溶液を吸収させた。
吸収紙を敷き、洗浄溶液が浸潤したメンブランシートの下端(テスト抗体側)を1分間押し付けて、浸潤した洗浄溶液を吸収させた。
工程1のいずれかの操作および工程2のいずれかの操作により得られたメンブランシートを、凍結真空乾燥機を用いて一晩乾燥させた。
支持材となるバッキングシート(Adhesives Research,Inc)に対して、実施例(1)により調製されたメンブランシートを貼り合わせた後、同じく作製したコンジュゲートパッドを当該メンブランシートと数ミリ重なり合うように貼り合わせた。さらに、展開方向の上流側には、サンプルパッドとして、コンジュゲートパッドに数ミリ重なるようにしてガラス不織布(メルクミリポア社)を貼り合わせた。そして、当該メンブランシートの下流側には、過剰な試薬を受け止めるための吸収パッド(メルクミリポア社)を当該メンブランシートと数ミリ重なるように配置した後、4mm幅に裁断してイムノクロマトグラフィー用試験片を得た。イムノクロマトグラフィー用試験片をハウジングに収納しテストプレートを作製した。
実施例1〜16および比較例1〜3の操作により得られた各イムノクロマトグラフィー用試験片を収納した各テストプレートを用いて、B型ウイルス抗原が試料中に存在する条件下(B型陽性試料)でAライン上にラインが出現しA型への偽陽性を示すかを確認した。
−:Aライン上にラインが認められない;
±:Aライン上にラインが認められるか否か、はっきりしない;
+:Aライン上にわずかに染色ラインが認められるものの、その色度や鮮明度が低いため真の陽性ラインと区別がつく;
++:Aライン上に染色ラインがはっきりと認められ、真の陽性ラインと区別がつかない;本明細書においては、++を偽陽性あり(不合格)、−〜+は偽陽性なし(合格)とする。
実施例1〜16および比較例1〜3の操作により得られた各イムノクロマトグラフィー用試験片を用いて黄変の目視観察を行った。以下に、黄変目視観察の具体的な評価基準を示す:
−:イムノクロマトグラフィー用試験片が黄変していない;
+:イムノクロマトグラフィー用試験片が黄変している;本明細書においては、+を黄変あり(不合格)、−を黄変なし(合格)とする。
実施例1と比較例3、実施例6と比較例2、並びに実施例15と比較例1の比較から、調製例(3)で調製された抗体固相化メンブランシートを、いきなりブロッキング溶液へ浸漬(1−c)するよりも、ブロッキング溶液の吸い上げのみ(1−a)またはブロッキング溶液を吸い上げながら水切り(1−b)をする方が偽陽性の出現を抑制できることがわかった。また、実施例9と実施例16との比較から、ブロッキング溶液を吸い上げ(1−a)とブロッキング溶液への浸漬(1−c)を行ったメンブランシートを逆方向に水切り(1−f)した場合は、偽陽性なしではあるものの、Aライン上にわずかながらラインが認められ、逆方向の水切りはそれをしなかった場合と比較して偽陽性の出現を促進させる傾向にあることがわかった。以上により、ブロッキング溶液の浸透方向が、テスト抗体側末端からリファレンス抗体末端へ向かう方向に対して順方向となるように制御することが、偽陽性の出現を抑制することに寄与しているものと考えられた。
(i)ブロッキング工程では、まずブロッキング溶液を抗体固相化メンブランシートに浸潤させ、最後の乾燥前には余分なブロッキング溶液を抗体固相化メンブランシートから吸い出す(水切りする)必要がある
(ii)この際にリファレンス抗体(本明細書ではR抗体と呼称することもある)が遊離するが(特開2015−232467号公報)、ブロッキング溶液が、テスト抗体側からリファレンス抗体側へ向かう方向と逆方向に流れていると遊離したR抗体がテスト抗体の一つであるB抗体が固相化されたBライン、テスト抗体の一つであるA抗体が固相化されたAラインの方向に流れることになる。
(iii)その過程でR抗体がB抗体を捕捉し、更にAライン上まで展開すると、B抗体を捕捉したR抗体がA抗体も捕捉することでAライン上に固着される。
(iv)ブロッキング溶液を浸透処理させる工程が終了し、そのまま抗体固相化メンブランシートを乾燥すると、Aライン上に固着したR抗体(ここで、R抗体はB抗体を捕捉している)がそのまま残ることになる。
(v)その結果、B型抗原を含む試料を用いて試験を実施すると、Aライン上にR抗体を介してB抗体が存在しているため、これがB型抗原および赤色粒子標識B型抗体の免疫複合体を形成し、Aライン上に偽陽性が発生することになる。
(i)浸透処理工程において、ブロッキング溶液を抗体固相化メンブランシートに浸潤させ、最後の乾燥前には余分なブロッキング溶液を抗体固相化メンブランシートから吸い出す(水切りする)際に、ブロッキング溶液が順方向だけに流れるようにする
(ii)この際にR抗体が遊離するが、ブロッキング溶液が順方向に流れているので、遊離したR抗体がBライン、Aラインの方向に流れない。
(iii)よって浸透処理工程が終了し、そのまま抗体固相化メンブランシートを乾燥しても、Aライン上に固着するのはA抗体だけになる。
(iv)その結果、B型抗原を含む試料を用いて試験を実施すると、Aライン上にはA抗体しかないため、偽陽性が発生しない。
Claims (13)
- イムノクロマトグラフィー用試験片を構成するメンブランシートをブロッキングする方法であって、
(a)被検物質に特異的に結合する少なくとも1種のテスト抗体と、リファレンス抗体とが、互いに異なる位置に固相化されている固相化処理されたメンブランシートを用意する工程、
(b)固相化処理されたメンブランシートにブロッキング溶液を浸透させる浸透処理工程、および
(c)浸透処理されたメンブランシートを乾燥させる乾燥工程
を含んでなり、
前記浸透処理工程(b)におけるブロッキング溶液の浸透方向が、テスト抗体側末端からリファレンス抗体側末端へ向かう方向に対して順方向となるように制御される、方法。 - 前記浸透処理工程(b)が、前記固相化処理されたメンブランシートの前記テスト抗体側末端をブロッキング溶液に浸漬させて、ブロッキング溶液を前記リファレンス抗体側末端まで浸透させる操作によって行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記浸透処理工程(b)が、前記固相化処理されたメンブランシートの前記テスト抗体側末端をブロッキング溶液に浸漬し、かつ、前記リファレンス抗体側末端を吸水性素材に接触させて、ブロッキング溶液を前記リファレンス抗体側末端まで浸透させる操作によって行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記浸透処理工程(b)の後に、該浸透処理されたメンブランシートを、吸水性素材に接触させて、該浸透処理されたメンブランシート上の余分なブロッキング溶液を吸収させる吸収工程(A)をさらに含んでなり、
前記吸収工程(A)におけるブロッキング溶液の吸収方向が、テスト抗体側末端からリファレンス抗体側末端へ向かう方向に対して順方向となるように制御される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。 - 前記吸収工程(A)が、前記浸透処理されたメンブランシートの、前記リファレンス抗体側末端を吸水性素材に接触させて、ブロッキング溶液が浸透したメンブランシート上の余分なブロッキング溶液を吸収させる操作によって行われる、請求項4に記載の方法。
- 前記浸透処理工程(b)の後に、該浸透処理されたメンブランシートを、洗浄溶液により洗浄する洗浄工程をさらに含んでなる、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記洗浄工程が、前記浸透処理されたメンブランシートの全体を洗浄溶液に浸漬することによって行われる操作を含んでなる、請求項6に記載の方法。
- 前記洗浄工程が、前記浸透処理されたメンブランシートの前記テスト抗体側末端を洗浄溶液に浸漬し、かつ、前記リファレンス抗体側末端を吸水性素材に接触させて、洗浄溶液を前記リファレンス抗体側末端まで浸透させることによって行われる操作を含んでなり、
前記洗浄工程の後に、得られたメンブランシートを、吸水性素材に接触させて、洗浄溶液が浸透したメンブランシート上の余分な洗浄溶液を吸収させる吸収工程(B)をさらに含んでなり、
前記吸収工程(B)における洗浄溶液の吸収方向が、テスト抗体側末端からリファレンス抗体側末端へ向かう方向に対して順方向となるように制御される、請求項6または7に記載の方法。 - イムノクロマトグラフィー用試験片を構成するメンブランシートを製造する方法であって、
(a)被検物質に特異的に結合する少なくとも1種のテスト抗体と、リファレンス抗体とを、メンブランシート上の互いに異なる位置に固相化する抗体固相化工程、並びに
(b)請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法により、該メンブランシートをブロッキングする工程
を含んでなる、方法。 - 請求項9に記載の方法により製造される、メンブランシート。
- イムノクロマトグラフィー用試験片を構成するメンブランシートであって、
被検物質に特異的に結合する少なくとも1種のテスト抗体と、リファレンス抗体とが、該メンブランシート上の互いに異なる位置に固相化されており、
遊離したリファレンス抗体が、リファレンス抗体が固相化されている位置からテスト抗体側末端までの間(ただし、リファレンス抗体が固相化されている位置は除く)と比較して、リファレンス抗体が固相化されている位置から前記テスト抗体側末端とは反対側の末端までの間(ただし、リファレンス抗体が固相化されている位置は除く)の方により多く付着している、メンブランシート。 - 請求項10または11に記載のメンブランシートを含んでなる、イムノクロマトグラフィー用試験片。
- 請求項12に記載のイムノクロマトグラフィー用試験片を含んでなる、イムノクロマトグラフィー用試験キット。
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