JP2019528239A - 変形性関節症を診断するためのコムペプチドおよびそれに対する抗体 - Google Patents

Abstract

Ｎ末端−ＳＧＰＴＨのアミノ酸配列を備えるペプチド、およびこのペプチドに対する抗体が提供される。このペプチドは、人間および動物、特にウマの診断に使用することができる。特に、この抗体は、全身性低悪性度慢性炎症性疾患、例えば、変形性関節症、アテローム性動脈硬化症、神経変性疾患、または神経炎症性疾患の診断に使用可能である。【選択図】 図２

Description

本発明は、ペプチドおよびこのペプチドに対する抗体、および診断、特に、全身性炎症性疾患の診断、特に、変形性関節症(osteoarthritis)および心臓血管系疾患の診断、におけるこれらの使用に関する。

アテローム性動脈硬化症(atherosclerosis)は、全身性の低悪性度(low-grade)慢性炎症、およびそれに続く血管内の炎症性プラーク(plaques)の形成と関連し、西洋諸国における主要な死因の１つである。アテローム性動脈硬化症は、危険性の低い無症候段階から、プラークの発達、さらにこのプラークが、毛細血管を塞いで心臓麻痺または脳卒中(stroke)を引き起こす血栓症(thrombosis)を引き起こしかねない段階へと緩やかに進行する。

進行期段階において、アテローム性動脈硬化症は、頻繁に、プラークにより引き起こされる頚動脈の内表面の狭窄である頚動脈狭窄(carotid artery stenosis)へ進行する。この段階において、血栓形成、および脳卒中を引き起こす塞栓(embolus)の放出のリスクは非常に高い。

今日でも、アテローム性動脈硬化症がどのように危険な段階へ進行するかをモニターすることは不可能である。

頚動脈狭窄は、通常、中程度の感度(sensitivity)および特異性(specificity)を有する超音波を使用して診断される。このため、アテローム性動脈硬化症が頚動脈狭窄へ進行することをモニターする方法へのニーズがある。

変形性関節症(osteoarthritis)（ＯＡ）は、関節軟骨および下層の骨の破壊(breakdown) に起因する、低悪性度の慢性全身性炎症である。この疾患は、患部の関節における炎症および基質(matrix)タンパク質の解体(disorganization)の開始によりしばしば特徴付けられる早期段階から、下層の骨の損傷を伴うより重症段階へと進行する。その主な症状は、関節の痛みである。変形性関節症は、人口の約３．８％を罹患させるものであるため、主要な臨床上の問題である。非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）(Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug)の鎮痛処方薬の５０％はＯＡに関連していると見積もられている。

関節痛はしばしば内科医にＯＡを疑わせるが、特に患者が高齢者である場合、今日でも早期段階のＯＡを診断することは困難である。今日の診断は、放射線学(radiology)を使用して、後期段階のＯＡに特有の不可逆的な構造上の損傷を同定することにしばしば基づく。Ｘ線やＭＲＩは、しかしながら、構造上の損傷がまだ可視的でないため、早期段階のＯＡの診断に使用することはできない。また、Ｘ線およびＭＲＩ検査は、高価な設備、および放射線技師への予約を必要とする。

ウマの変形性関節症は、馬主にとって大きな問題である。馬を所有する主要な理由は、それを使うことができることであり、しばしばそれで競争することである。ＯＡは、ウマを使用することができなくなる最も頻度の高い理由であり、ウマ（競馬）産業における最も大きい唯一の経済的損失の主要因となる。

ウマの早期段階のＯＡは、跛行（歩行困難）(lameness)、すなわち異常歩行または異常姿勢、として頻繁に現れる。跛行は、しばしば僅かであり得るが、跛行をモニターする改良された方法を持つことは有用であろう。これにより、馬主は、跛行により、馬をいつトレーニングや競争から休息させるかを知ることができるであろう。

馬および人間のＯＡは、同様な機序により引き起こされる。人間と馬の双方において、ＯＡは、数ヶ月および数年に亘る炎症により特徴付けられる早期段階から、広範な組織の損傷を伴う後期段階へと進行する（Ｇｏｌｄｒｉｎｇ， Ｍ．Ｂ． ａｎｄ Ｏｔｅｒｏ Ｍ、 Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ （２０１１） ２３（５）：４７１）。
人間および馬におけるＯＡの疾患発症機序はまた、分子レベルで非常に良く似ている（Ｓｔｅｎｂｅｒｇ Ｊ， Ｒｕｅｔｓｃｈｉ Ｕ， Ｓｋｉｏｌｄｅｂｒａｎｄ Ｅ， Ｋａｒｒｈｏｌｍ Ｊ， Ｌｉｎｄａｈｌ Ａ、 Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｓｃｉ． （２０１３） Ｏｃｔ ４；１１（１）：４３） （Ｓｖａｌａ Ｅ， Ｌｏｆｇｒｅｎ Ｍ， Ｓｉｈｌｂｏｍ Ｃ， Ｒｕｅｔｓｃｈｉ Ｕ， Ｌｉｎｄａｈｌ Ａ， Ｅｋｍａｎ Ｓ， Ｓｋｉｏｌｄｅｂｒａｎｄ Ｅ、 Ｃｏｎｎｅｃｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ． （２０１５）；５６（４）：３１５−２５）。

ＯＡのための初期段階のマーカの欠如は、不可逆的な組織損傷としてそれが現れる前に疾患をコントロールするために使用可能な薬剤の開発を妨げる。ＯＡを診断および病期分類する、より便宜な方法があるならば有用である。

本発明は、これらおよび他の課題を解決する。

本発明の第１の態様によれば、Ｎ末端−ＳＧＰＴＨ（セリン（Ｓｅｒ）；グリシン（Ｇｌｙ）；プロリン（Ｐｒｏ）；トレオニン（Ｔｈｒ）；ヒスチジン（Ｈｉｓ））のアミノ酸配列を備えるペプチドに特異的に結合する抗体が提供される。この抗体は診断に使用することができる。
こうして、本発明の第２の態様によれば、Ｎ末端−ＳＧＰＴＨのアミノ酸配列を備えるペプチドに特異的に結合する抗体の、診断における使用が提供される。

この診断は、全身性炎症、特に、例えば変形性関節症のような全身性低悪性度慢性炎症、特に、早期段階の変形性関節症またはアテローム性動脈硬化症、特に頚動脈狭窄、に関連する疾患の診断であってよい。この診断はまた、動脈硬化症(arteriosclerosis)の診断であってもよい。この診断はまた、例えば、アルツハイマー病、血管性認知症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）等の神経変性(neurodegenerative)疾患、または多発性硬化症、パーキンソン病、ギランバレー症候群、重症筋無力症、視神経脊髄炎、自己免疫性脳炎、ナルコレプシー（発作性睡眠）等の神経炎症性疾患の診断であってよい。

この抗体は、被験者(subject)からのサンプル（試料）中の、Ｎ末端−ＳＧＰＴＨのアミノ酸配列を備えるペプチドの量を検出するために使用されてよい。好適な実施形態において、このサンプルは、滑液(synovial fluid)、血液、血清、または血漿のサンプルである。

本発明は、例えばアテローム性動脈硬化症およびＯＡ等の全身性低悪性度慢性炎症疾患のための生物学的マーカを提供する。こうして、これらの疾患を、従来よりも便宜な方法でモニターすることができる。

ＯＡは、本発明の抗体を使用して滑液のサンプルをテストすることにより、その早期段階で発見することができる。これはいくつもの利点を持つ。これにより、ＯＡを発見してモニターすることができ、ＯＡの薬剤の開発を促進することができる。

後期のアテローム性動脈硬化症は、本発明の抗体を使用して血液サンプルをテストすることにより、検出することができる。

好適な実施形態において、被験者はヒト（人間）であり、疾患はアテローム性動脈硬化症であり、サンプルは血液サンプルである。

好適な実施形態において、被験者はウマであり、疾患は変形性関節症（ＯＡ）、特に早期段階のＯＡまたは急性跛行(acute lameness)であり、サンプルは滑液サンプルである。

第３の態様によれば、診断において使用するための、本発明の第１の態様に係る抗体が提供される。

本発明の第４の態様によれば、診断のための方法が提供され、この方法は、被験者からサンプルを分離し、前記サンプルを分析して、前記サンプル中のＮ末端−ＳＧＰＴＨのアミノ酸配列を備えるペプチドの存在または量を分析する、ことを含む。

本発明の第５の態様によれば、上記の抗体を備える診断キットが提供される。

本発明の第６の態様によれば、Ｎ末端−ＳＧＰＴＨのアミノ酸配列を備えるペプチドが提供される。

本発明の第７の態様によれば、抗体を産生するためのＮ末端−ＳＧＰＴＨのアミノ酸配列を備えるペプチドの使用が提供される。

図１は、対照(control)ペプチド（配列番号４）またはＳＧＰＴＨＥＧＶＣのペプチド（配列番号３）の連続希釈法（段階希釈法）を使用してテストされた、抗Ｎ−ＳＧＰＴＨ抗体の特異性を示す図である。 図２は、ウマからの滑液サンプル中のＮ末端−ＳＧＰＴＨの配列を備えるペプチドの濃度を示すグラフである（＊＝ｐ＜０．０５０、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１）。 図３は、ヒトからの血清中のＮ末端−ＳＧＰＴＨの配列を供えるペプチドの濃度を示すグラフである（＊＊＊＝ｐ＜０．００１）。 図４は、Ｎ−ＳＧＰＴＨペプチドに対する抗体で染色されたウマからの関節軟骨のサンプル画像である。免疫組織学的に染色された切片は、それぞれ、健常なウマ（健常軟骨 図４）および関節軟骨の表在性フィブリル化を有するウマ（早期ＯＡ 図５）の関節軟骨である。ペプチドに対する抗体は、健常な軟骨においてネガティブ（陰性）に染色するが、早期ＯＡにおいて、抗体はフィブリル化領域においてポジティブ（陽性）に染色する（矢印で示す）。 図５は、Ｎ−ＳＧＰＴＨペプチドに対する抗体で染色されたウマからの関節軟骨のサンプル画像である。免疫組織学的に染色された切片は、それぞれ、健常なウマ（健常軟骨 図４）および関節軟骨の表在性フィブリル化を有するウマ（早期ＯＡ 図５）の関節軟骨である。ペプチドに対する抗体は、健常な軟骨においてネガティブ（陰性）に染色するが、早期ＯＡにおいて、抗体はフィブリル化領域においてポジティブ（陽性）に染色する（矢印で示す）。 図６は、Ｎ−ＳＧＰＴＨペプチドに対する抗体で染色されたヒト（人間）の患者のアテローム性動脈硬化症のプラークのサンプルの組織切片を示す図である。

本発明は、Ｎ末端−ＳＧＰＴＨの配列（配列番号１）を備えるペプチド、このペプチドに対する抗体、およびこうした抗体の診断における使用、に関する。

ペプチドは、Ｎ末端がＳＧＰＴＨの配列を有する限り、５個から１００個、好適には５個から３０個、より好適には５個から２０個のアミノ酸、より好適には５個から９個のアミノ酸の長さを有してよい。ペプチドのこの配列のセリン残基は、こうして、ペプチドのＮＨ_２基を有する。

ある実施形態において、ペプチドは、免疫付与(immunization)に使用可能な長さを有する。ペプチドの長さは、この場合、好適には、少なくとも９個の残基である。

ペプチドは、単離(isolated)ペプチドであってよい。ペプチドは、例えば、滑液、血液、血漿または血清から単離されてよい。ペプチドはまた、当該技術分野で公知な方法を使用して合成することができる。この方法は、例えば、Ｒ．Ｂ． Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ （１９６３） “Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ｉ． Ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａ Ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ”、 Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ８５ （１４）： ２１４９−２１５４、および、Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ， Ｍ． Ａ．， Ｐ．； Ｊｏｎｅｓ， Ａ．； Ａｌｅｗｏｏｄ， Ｄ．； Ｋｅｎｔ，Ｓ．Ｂ．Ｈ．（２００７） “Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ Ｂｏｃ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ” Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ． Ｔｈｅｒａｐ． １３ （１−２）： ３１−４４である。ペプチドは単離ペプチドであってよい。

ペプチドは、抗体の産生および単離に使用することができる。この抗体は、Ｎ末端−ＳＧＰＴＨのアミノ酸配列を備えるペプチド、特に少なくとも９個のアミノ酸残基からなるペプチド、に特異的に結合する。「抗体」という用語はまた、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）２、Ｆｖ、および一本鎖抗体を含む。ペプチドに対する抗体を産生する方法は、周知である。ペプチドは、ペプチドに結合する抗体をスクリーニングすること、および抗体を精製(purifying)するのに使用することができる。

好適には、抗体は、ペプチドへの高い親和性を有する。親和性は、解離定数(dissociation constant)またはＫｄを使用して表すことができる。好適な結合親和性（結合親和力）は、解離定数（Ｋｄ）が、１０^−６Ｍ、より好適には５×１０^−７Ｍ、より好適には１０^−７Ｍ、より好適には５×１０^−８Ｍ、より好適には１０^−８Ｍ、より好適には５×１０^−９Ｍ、より好適には１０^−９Ｍ、より好適には５×１０^−１０Ｍ、より好適には１０^−１０Ｍ、より好適には５×１０^−１１Ｍ、より好適には１０^−１１Ｍ、より好適には５×１０^−１２Ｍ、より好適には１０^−１２Ｍ、より好適には５×１０^−１３Ｍ、最も好適には１０^−１３Ｍ、以下であるものを含む。好適には、抗体は、単離抗体である。抗体は、精製された抗体であってよい。

好適には、抗体は、Ｎ末端−ＳＧＰＴＨの配列（配列番号１）を備えるペプチドに特異的に結合する。抗体を生成するには、ＳＧＰＴＨより長いペプチド、例えば、免疫性付与ペプチドＳＧＰＴＨＧＧＧＣ（配列番号２）、で免疫付与することが好適であり得る。
しかしながら、後続するスクリーニングステップは、免疫性付与に使用されたペプチドの他の残基が抗体結合に関与していない場合、Ｎ末端−ＳＧＰＴＨのエピトープ（抗原決定基）に特異的に結合する抗体を同定することができる。ＳＧＰＴＨＧＧＧＣ（配列番号２）の免疫性付与ペプチドにおいて、Ｃ末端システインが、ペプチドをコンジュゲートする(conjugating)のに、例えば、抗体精製に使用される基質(matrix)に対して、使用されてよい。

抗体は、哺乳類、例えば、マウス、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ウマ、ニワトリ等に由来するあらゆる抗体であってよく、これらのうちマウスが好適である。抗体のアイソタイプ(isotype)は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＹ等のいずれかであってよい。

抗体は、動物、例えば、当該技術分野で公知なようにウサギ、の免疫性付与(immunization)により産生されるポリクロナール抗体であってよい。しかしながら、好適には、抗体は、モノクローナル抗体である。好適には、モノクローナル抗体は、マウスまたはウサギのモノクローナル抗体である。ペプチドに対するモノクローナル抗体は、周知のハイブリドーマ(hybridoma)技術を使用して生成されてよい（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６， ４９５−４９７， １９７５）。単一クローンは、限界希釈分析法、軟寒天法(soft agar assay)、蛍光活性化細胞選別装置を使用する方法等により、単離することができる。限界希釈分析法において、例えば、ハイブリドーマのコロニーは、培養前に、培地中で連続的に約１セル／ウェルに希釈されて、所望の抗体を産生するハイブリドーマを単離する。抗体は、キメラ(chimeric)抗体またはヒト化抗体であってよい。

抗体クローンはまた、他の方法、例えば、ファージ(phage)ディスプレイ法を使用して生成することができる。

抗体がマウス(murine)ＩｇＧである場合、抗体は、タンパク質Ａコンジュゲート(conjugated)担体または抗マウス免疫グロブリンコンジュゲート担体を使用する親和性クロマトグラフィで精製することができる。

抗体を産生、精製、および単離する方法、およびそれらの結合能を判断する方法は、周知である。詳細には、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」および「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」が参照される。

抗体は、異なる手法で診断に使用することができる。抗体は、ヒトまたは動物であってよい被験者からのサンプル中のペプチドの存在、その量、またはその濃度を測定するために使用することができる。サンプルは、あらゆるタイプの生物学的サンプル、例えば、滑液、血漿、血清、髄液または尿、腹水、または組織切片であってよい。好適には、サンプルは液体サンプルである。好適な実施形態において、サンプルは、血清サンプル、血液サンプル、血漿サンプル、または滑液のサンプルである。よりさらに好適な実施形態において、サンプルは、滑液のサンプルである。

抗体で、サンプル中のペプチドの濃度を計測する便宜な方法は、ＥＬＩＳＡである。ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）の設計および使用は、診断の分野において周知である。抗体はまた、例えば、免疫組織化学(immunohistochemistry)において使用することができる。例えば、冷凍された、パラフィン処理された、または固定化された組織の薄片を、抗体を使用して、病理学の分野で公知であるように、染色することができる。抗体はまた、ウェスタンブロット法(western blot)で使用されることができる。

抗体は、多様な手法で検出することができる。頻繁に使用される方法は、検出可能な物体（マーカまたは標識）、例えば、酵素（ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）等）、蛍光色素分子、または放射性同位元素標識(radiolabel)、でコンジュゲートされた二次抗体を使用することである。例えば、一次抗体がマウス抗体である場合、二次抗体は、ヤギ抗マウス抗体であってよい。マーカの存在は、技術分野において公知な方法で検出することができる。すなわち、酵素は、色または光を生成する試薬で検出することができ、放射性標識は、シンチレータまたは写真用フィルムで検出することができ、蛍光色素分子は、蛍光検出器により検出することができ、または蛍光顕微鏡で見ることができる。

代替的に、一次抗体（抗ＳＧＰＴＨ抗体）は、マーカ／標識と直接コンジュゲートされてよい。

抗体の好適な作用(working)濃度は、例えばＥＬＩＳＡや免疫組織化学のような多様な手順で使用される場合、抗体の親和性に依存し、良好なシグナル・ノイズ比（ＳＮ比）を与える濃度を見つけるため、抗体の異なる濃度をテストすることにより決定することができる。一例として、１ｍｇ／ｍｌ濃度の抗体ストック(stock)は、好適な作用濃度をテストするため、１／１００、１／２００、１／１０００、および１／５０００で希釈されてよい。これらの手順における抗体の作用濃度は、通常、μｇ／ｍｌの範囲、例えば１〜１０μｇ／ｍｌの範囲にある。抗体は、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中で、可能であれば、例えばＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）等の追加的タンパク質、および例えばアジ化ナトリウム等の防腐剤の使用とともに、希釈されるのが好適である。

抗体は、被験者、特に、ヒトまたはウマ、の疾患の診断に使用することができる。例えば、サンプル中のペプチドの濃度は、標準方法、例えばＥＬＩＳＡを使用して判断することができる。このように判定された濃度は、標準値(standard value)と比較されることができる。標準値からの偏差は、特定の疾患、またはその疾患の病期（ステージ）を示すことができる。

診断は、全身性炎症、特に、全身性低悪性度慢性炎症に関連する疾患の診断であってよい。診断は、例えば、アルツハイマー病、血管性認知症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）等の神経変性疾患、または、多発性硬化症、パーキンソン病、ギランバレー症候群、重症筋無力症、視神経脊髄炎、自己免疫性脳炎、またはナルコレプシー等の神経炎症性疾患の診断であってよい。

好適な実施形態において、診断される疾患は、特にヒトの、アテローム性動脈硬化症および頚動脈狭窄からなる群から選択される１つであってよい。特に、疾患は、頚動脈狭窄であってよい。そしてサンプルは、好適には、血液サンプル、血漿サンプル、または血清サンプルである。

抗体は、ヒトのアテローム性動脈硬化症の進行を、特に、プラーク疾患から頚動脈狭窄への進行をモニターするのに使用されることができる。抗体は、プラークのみを有する患者を、頚動脈狭窄を有する患者から識別するのに使用されてよい。
ウサギポリクロナール抗血清(antisera)での現在の較正器（キャリブレータ）に基づいて、１００ｎｇ／ｍｌより上、より好適には６００ｎｇ／ｍｌより上、より好適には８００ｎｇ／ｍｌより上、より好適には１０００ｎｇ／ｍｌより上、より好適には１２００ｎｇ／ｍｌ、最も好適には２０００ｎｇ／ｍｌより上の血清中のペプチド濃度は、ヒトの頚動脈狭窄を示し得る。適切なカットオフ(cut-off)は、標準実験および適切な対照群(controls)を使用することで確立することができる。

抗体は、ヒトまたはウマのＯＡの診断に使用することができる。好適な実施形態において、滑液中のペプチドの高濃度は、早期ＯＡを示し得る。ペプチドの低濃度は、ＯＡがないか、または後期段階のＯＡを示し得る。抗体は、急性跛行／早期ＯＡから慢性跛行／慢性ＯＡへの進行を、特にウマにおいてモニターするのに使用されることができる。ウマにおいて、抗体は、急性跛行／早期ＯＡおよび慢性跛行／慢性ＯＡからなる群から選択される１つの条件を診断するのに使用されてよい。

ウマにおいて、ウサギポリクロナール抗血清での現在の較正器（キャリブレータ）に基づいて、１μｇ／ｍｌより上、より好適には２０μｇ／ｍｌより上、より好適には３０μｇ／ｍｌより上、より好適には４０μｇ／ｍｌより上、より好適には２００μｇ／ｍｌより上の滑液濃度におけるペプチド濃度は、早期跛行および従って早期ＯＡを示し得る（兆候であり得る）。ウマのカットオフレベルは、標準実験および適切な対照群を使用することで確立することができる。

抗体および必要な試薬は、サンプル中のペプチドを検出するキットに含まれてよい。このキットは、ＥＬＩＳＡ、例えば、競合(competitive)ＥＬＩＳＡに基づいてよい。キットは、固定相（例えば、ウェルを備えるプレート）、二次抗体、マーカを検出するための緩衝器(buffer)および試薬を含んでよい。

実施例１
ポリクロナール抗体
ウサギポリクロナール抗体を、Ｎ末端−ＳＧＰＴＨＧＧＧＣ−Ｃ末端（配列番号２）の免疫ペプチドに対して作製した(raised)。Ｎ末端−ＳＧＰＴＨのペプチドは、ウマの滑液中のＣＯＭＰ（軟骨オリゴマー基質タンパク質）タンパク質（トロンボスポンジン５）の開裂(cleavage)断片（フラグメント）として同定された。ヒトのタンパク質は、同じ配列を有する。抗原性ペプチドは、ウサギ血清からの抗体精製に使用された。ポリクロナール抗体は、実施例２から実施例６で使用された。

実施例２
阻害ＥＬＩＳＡ（酸素結合免疫吸着測定法）、ウマおよびヒトのペプチドの検出
実施例１からの抗体を使用して、ＳＧＰＴＨＥＧＶＣ（配列番号３）の配列を有するペプチドのため、阻害ＥＬＩＳＡが展開(developed)された。ＥＬＩＳＡは、実施例３（ウマ）および実施例４（ヒト）におけるように、実行された。抗体のこのペプチドへの結合は、ポリクロナール抗体がＮ−ＳＧＰＴＨに特異的であることを確認する。
また、抗体は、ＰＰＧＹＳＧＰＴＨＥＧＶＧＭＣ（配列番号４）の配列を有する非開裂(uncleaved)対照ペプチドには結合しなかった。このペプチド（配列番号４）は、ＳＧＰＴＨを備えるが、Ｎ末端のＮ−ＳＧＰＴＨではないため（図１）、このことは、Ｎ末端がこの抗体のためのエピトープ（抗原決定基）の一部であることを示す。予測されたように、阻害ＥＬＩＳＡにおいて、このＳＧＰＴＨＥＧＶＣ（配列番号３）ペプチドは、ペプチド濃度の増加に伴い、吸収信号の減少を示す。ＥＬＩＳＡは、ヒトおよびウマの双方からの血清および滑液（ＳＦ）において検証された。これにより、抗体が、ヒトおよびウマからの血清および滑液に存在するペプチドを検出することが実証された。

ウマの試験において、試験内(intra assay)検証の変動係数（ＣＶ）（％）は１０．９であり、試験間(inter assay)検証のＣＶ（％）は１０．７であった（定量下限値は０．１５６μｇ／ｍｌであった）。ヒトの血清サンプルでのＣＶは、ウマのデータと同様であった。血清および滑液サンプルはまた、冷凍後（−８０°Ｃ）、解凍後、およびプロテアーゼ(protease)阻害剤とともにＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を添加した際の安定性に関してテストされた。

実施例３
変形性関節症(osteoarthritis)のウマからの滑液中のペプチドの検出
滑液（ＳＦ）サンプルが、バイオバンクから収集された。使用された材料は、ウマからの手根中央(middle carpal)関節および蹴爪（球節）(fetlock)関節からの滑液を有する。

ここにおけるサンプルの試験対象患者基準（選択基準）(inclusion criteria)は、Ａ）利用可能な液体が１００μｌより多く、かつ以下の条件のうち１つである：Ｂ）早期ＯＡ／急性跛行の病歴（＜４週間）、Ｃ）慢性ＯＡ／慢性跛行の病歴（＞４週間）、Ｄ）跛行の病歴がなく、かつ正常形態(morphology)の関節（健常対照）、またはＥ）後期ＯＡが現れた関節。

バイオバンクＩは、同じキャンパス(campus)で同じトレーナにより訓練された２８頭の若いスタンダードブレッド（ＳＴＢ）(Standard-bred)の速歩馬(trotters)（１３頭の雌子馬(fillies)および１５頭の雄子馬(colts)）を含んでいた。これらのウマは、その訓練を、平均年齢１９．５ヶ月から開始し、平均年齢４０ヶ月で終了した。すべてのウマは、臨床的に健常であり、６つの機会で試験された（訪問検査(visit)１、２、３、４、５、および６）。ＳＦサンプリングにおいて、手根関節のＸ線写真およびシンチグラフィを含む屈曲(flexion)テストで、臨床的跛行試験が実行された。
バイオバンクＩＩは、１箇所の食肉処理場で安楽死させられたスタンダードブレッド（ＳＴＢ）およびスウェーデンの温血乗用馬（ＳＷＨｓ）からの左手根関節から成るものであった。左の手根骨間の関節からのＳＦは、検死後、即座にサンプル取得された。関節軟骨は、正常、または第３手根骨の近位（身体基部に近い）関節面の構造的ＯＡ損傷（病変）(lesions)を伴うもの、として特徴付けられた。

バイオバンクＩＩＩは、臨床的に歩行困難な(lame)ウマからのＳＦから成るものであった。ウマは、屈曲テストおよび関節内麻酔(anaesthesia)を含むルーティン(routine)の跛行試験の間に試験された。この試験はまた、麻酔前後での跛行を評価する跛行探知(locator)テストを含むものであった。ＳＦは、臨床での跛行評価に依存して、異なる関節から収集された。このバンクは、関節内麻酔および跛行探知（ロケータ）を介して、特定の関節における規定の跛行を伴う関節からのＳＦからなるものであった。

図２で使用された材料は、顕微鏡的に正常な関節軟骨を有するウマの健常対照群（ｎ＝８、バイオバンクＩＩ）、軽度から中程度の関節軟骨の構造的ＯＡ病変を有するウマの後期段階ＯＡ（ｎ＝８、バイオバンクＩＩ）、早期ＯＡ／急性跛行＜４週間（ｎ＝９、バイオバンクＩＩＩ）、および慢性ＯＡ／慢性跛行＞４週間（ｎ＝９、バイオバンクＩＩＩ）、のそれぞれの手根中央関節および蹴爪関節からのＳＦであり、および訓練中の若く健常な競走馬の健常対照群（ｎ＝７、バイオバンクＩ）の手根中央関節および蹴爪関節からのＳＦである。

阻害ＥＬＩＳＡは、ＳＦ中のペプチド濃度を計量して展開された。ＮＵＮＣプレートは、０．１Ｍの炭酸緩衝剤で希釈された、ｐＨ９．６、および４℃で一晩培養された４．０μｇ／ｍｌのペプチド（ＳＧＰＴＨＥＧＶＣの配列（配列番号３））で被覆された(coated)。０．６％のＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）および０．８％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む１０ｍＭのＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）中の５．０μｇ／ｍＬペプチド（ＳＧＰＴＨＥＧＶＧＭＡ（配列番号５））の連続希釈法が、較正曲線（検量線）（範囲＝５−０．０７８ｕｇ／ｍＬ）として使用された。ＳＦサンプルは、０．８４％のＳＤＳを含むＰＢＳ中で１：２０に希釈された。基準(standard)およびＳＦの複製は、９６ウェルのＳｔｅｒｉｌｉｎプレート中で、２５℃で一晩培養された。２日目、一次抗ＳＧＰＴＨ抗体（１％のＢＳＡおよび４％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を含むＰＢＳ中で１：２０００に希釈された）が、Ｓｔｅｒｉｌｉｎプレートに添加され、このプレートは、２５℃で１時間２０分培養された。ＮＵＮＣプレートは、１％のＢＳＡおよび０．１％のＴｗｅｅｎを含むＰＢＳで、２５℃で１時間、洗浄およびブロック(blocked)された。トータル１００μＬが、ＳｔｅｒｉｌｉｎプレートからＮＵＮＣプレートへトランスファされ、２５℃で１時間培養された。
培養の後、ＮＵＮＣプレートは洗浄され、１％のＢＳＡおよび０．１％のＴｗｅｅｎを含むＰＢＳで１：２０，０００に希釈された二次抗体（ヤギ抗ウサギＩｇＧ Ｈ＆Ｌ ［ＨＲＰ］）が添加された。このプレートは、２５℃で１時間培養され、その後６回洗浄されて、２５℃で約８分間、基板(substrate)で培養された（Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐａｃｋ ＤＹ９９９、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、英国）。停止液（１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４）が添加され、および４５０ｎｍでの吸光度が計測された（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＰｌｕｓ ３８４、ＭＤＳ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ，英国）。

健常対照群の関節、および慢性変形性関節症／慢性跛行および／または後期変形性関節症のウマからの関節と比較して、早期変形性関節症／急性跛行のウマからの滑液中のペプチドの濃度には、統計的に増加が見られた（図２）。

データは、平均(mean)±ＳＤ（標準偏差）として表され、平均間の差異は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６を使用した一方向ＡＮＯＶＡ（分散分析）により評価された（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ、サンディエゴ、カリフォルニア、米国）。グループ間の比較のため、テューキー（Ｔｕｋｅｙ）多重比較テストが実行された。有意性のレベルは、ｐ＜０．０５に設定された。

実施例４
変形性関節症の患者からの血清中のペプチドの検出
患者の材料は、「症候性頚動脈狭窄における早期再発性脳卒中梗塞のリスク」（Ｓｔｒｏｍｂｅｒｇ Ｓ、 Ｎｏｒｄａｎｓｔｉｇ Ａ、 Ｂｅｎｔｚｅｌ Ｔ、 Ｏｓｔｅｒｂｅｒｇ Ｋ、 Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ ＧＭ、 Ｒｉｓｋ ｏｆ ｅａｒｌｙ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔｒｏｋｅ ｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ ｃａｒｏｔｉｄ ｓｔｅｎｏｓｉｓ、 Ｅｕｒ Ｊ Ｖａｓｅ Ｅｎｄｏｖａｓｃ Ｓｕｒｇ （２０１５）； ４９： １３７−４４）等であった。

阻害ＥＬＩＳＡは、血清中のペプチド濃度を計量して展開された。ＮＵＮＣプレートは、０．１Ｍの炭酸緩衝剤で希釈された、ｐＨ９．６、および４℃で一晩培養された４．０μｇ／ｍＬのペプチド（ＳＧＰＴＨＥＧＶＣの配列（配列番号３））で被覆された。０．６％のＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）および０．８％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む１０ｍＭ ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）中の１０００ｎｇ／ｍＬから１５，６ｎｇ／ｍｌペプチド（ＳＧＰＴＨＱＧＶＧＬＡの配列（配列番号６））の連続希釈法が、較正曲線（検量線）として使用された。血清サンプルは、０．８４％のＳＤＳを含むＰＢＳ中で１：４に希釈された。基準(standard)および血清の複製は、９６ウェルのＳｔｅｒｉｌｉｎプレート中で、２５℃で一晩培養された。２日目、一次抗ＳＧＰＴＨ抗体（１％のＢＳＡおよび４％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を含むＰＢＳ中で１：６０００に希釈された）が、Ｓｔｅｒｉｌｉｎプレートに添加され、このプレートは、２５℃で１時間２０分培養された。ＮＵＮＣプレートは、１％のＢＳＡおよび０．１％のＴｗｅｅｎを含むＰＢＳで、２５℃で１時間、洗浄およびブロック(blocked)された。トータル１００μＬが、ＳｔｅｒｉｌｉｎプレートからＮＵＮＣプレートへトランスファされ、２５℃で１時間培養された。
培養の後、ＮＵＮＣプレートは洗浄され、１％のＢＳＡおよび０．１％のＴｗｅｅｎを含むＰＢＳで１：２０，０００に希釈された二次抗体（ヤギ抗ウサギＩｇＧ Ｈ＆Ｌ−ＨＲＰ）が添加された。このプレートは、２５℃で１時間培養され、その後６回洗浄されて、２５℃で約２１分間、基板で培養された（Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐａｃｋ ＤＹ９９９、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、英国）。停止液（１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４）が添加され、および４５０ｎｍでの吸光度が計測された（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＰｌｕｓ ３８４、ＭＤＳ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ，英国）。

頚動脈狭窄を持つ患者と比較して、頚動脈プラークを持つ患者からの血清中のペプチドの濃度には、統計的に増加が見られた（図３）。
統計は、実施例３にあるとおりであった。

実施例５
ウマからの関節軟骨の免疫組織化学
健常のおよび早期ＯＡ関節軟骨のホルマリン固定したブロック(Formalin-fixed blocks)は、ペプチドのため免疫染色された（ウサギポリクロナール抗体）。ポリクロナール抗体は、１：８００および１：１０００でそれぞれ希釈されて使用された。つまり、試料(specimens)は、薄片に切り分けられ(sectioned)、載物ガラス（スライド）(slides)に搭載され、脱パラフィンされ(deparaffinized)、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；０．０１Ｍ、ｐＨ７．４）で再水和(rehydrated)および洗浄された。内因性ペルオキシダーゼ活性(endogenous peroxidase activity)は、ＰＢＳ中で３％の過酸化水素で急冷された(quenched)。非特異性結合は、薄片を２％の正常ヤギ血清（ＤＡＫＯ、Ｘ０９０７、ウサギ抗体）中で培養することによりブロックされ、その後、乾燥され、および抗体とともに６０分間室温（ＲＴ）で培養された。ＰＢＳ中ですすがれた後、薄片は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−コンジュゲート二次抗体（Ｄａｋｏ Ｒｅａｌ ＥｎＶｉｓｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（登録商標） Ｓｙｓｔｅｍ、ｋ５００７、Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ ｋｉｔ）とともに３０分間、室温（ＲＴ）で培養された。視覚化は、発色現像液(color developer)３，３−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ＋ Ｃｒｏｍｏｇｅｎ Ｄａｋｏ ＥｎＶｉｓｉｏｎ）、およびヘマトキシリン(haematoxylin)での対比染色を使用して実行された。ネガティブ（陰性）対照群として、一次抗体は、一次抗体と同一の希釈で、非免疫性ウサギ血清（Ｒａｂｂｉｔ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｘ０９３６、ＤＡＫＯ）で置き換えられた。

薄片(sections)は、ニコン Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ６００顕微鏡およびＮＩＳ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ｂａｓｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈソフトウエア バージョン３．２２．１１（Ｎｉｋｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ，メルヴィル、ニューヨーク、米国）を使用して、主観的に評価された。
健常なウマからの関節軟骨の免疫組織化学の載物ガラス（スライド）（健常軟骨、図４）、および関節軟骨の表在性フィブリル化(fibrillation)（軟骨表面上の損傷）を有する（早期ＯＡ）ウマからの関節軟骨の免疫組織化学のスライドは、明確に異なる染色パターンを示す（図５）。ペプチドに対する抗体は、健常軟骨中でわずかのみまたはネガティブ（陰性）に染色する。しかしながら、早期ＯＡにおいて、抗体は、フィブリル化領域においてポジティブ（陽性）に染色する。

実施例６
「Ｆａｇｅｒｂｅｒｇ Ｂ、 Ｒｙｎｄｅｌ Ｍ、 Ｋｊｅｌｌｄａｈｌ Ｊ等 Ｊ Ｖａｓｅ Ｒｅｓ （２０１０）； ４７： ２２１−３０」に記載される材料からの、ヒトのアテローム性動脈硬化症プラークの免疫組織化学
症候性頚動脈狭窄を有する患者からのサンプルは、動脈血管内膜切除術の前に、磁気共鳴血管造影法（ＭＲＡ）で検査されてインヴィヴォ（生体内）(in-vivo)で最大の狭窄の場所を見つけ出した。最大狭窄の横行組織薄片が、免疫組織化学に使用され、これは実施例５として実行された。内壁(intima wall)中に染色の増加（矢印で示される）が見られ、これはＮ−ＳＧＰＴＨの配列を備えるペプチドの存在を示すものであった（図６）。

これら実施例６および実施例４は、抗体がアテローム性動脈硬化症の診断に使用することができることを示す。さらに、実施例３および実施例５は、抗体が変形性関節症の診断に使用することができることを示す。変形性関節症およびアテローム性動脈硬化症の共通する特徴(denominator)は、全身性炎症である。我々は、抗体が、全身性炎症が存在する疾患、例えば、変形性関節症、アテローム性動脈硬化症、アルツハイマー病や血管性認知症等の神経変性疾患、および多発性硬化症等の神経炎症疾患、の診断に使用可能であると結論する。

Claims (15)

1. Ｎ末端−ＳＧＰＴＨのアミノ酸配列を備えるペプチドに特異的に結合する抗体。
2. 診断における使用のための請求項１に記載の抗体。
3. 請求項２に記載の抗体であって、前記抗体が使用される前記診断は、被験者の変形性関節症(osteoarthritis)、アテローム性動脈硬化症、神経変性疾患、または神経炎症性疾患の診断である、
   ことを特徴とする抗体。
4. 請求項３に記載の抗体であって、前記抗体が使用される前記診断は、骨関節症(osteoarthrosis)の診断である、
   ことを特徴とする抗体。
5. 請求項４に記載の抗体であって、前記骨関節症は、早期段階の変形性関節症である、
   ことを特徴とする抗体。
6. 請求項３に記載の抗体であって、前記抗体が使用される前記診断は、アテローム性動脈硬化症の診断である、
   ことを特徴とする抗体。
7. 請求項６に記載の抗体であって、前記アテローム性動脈硬化症は、頚動脈狭窄である、
   ことを特徴とする抗体。
8. 請求項３に記載の抗体であって、前記神経変性疾患は、アルツハイマー病、血管性認知症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）からなる群から選択され、または、前記神経炎症性疾患は、多発性硬化症、パーキンソン病、ギランバレー症候群、重症筋無力症、視神経脊髄炎、自己免疫性脳炎、ナルコレプシーからなる群から選択される、
   ことを特徴とする抗体。
9. 請求項３から８のいずれか１項に記載の抗体であって、前記抗体は、被験者からのサンプル中のＮ末端−ＳＧＰＴＨのアミノ酸配列を備えるペプチドの量を検出するため使用される、
   ことを特徴とする抗体。
10. 請求項９に記載の抗体であって、前記サンプルは、滑液、髄液、血清、血液、または血漿のサンプルである、
    ことを特徴とする抗体。
11. 請求項１に記載の抗体の診断における使用。
12. 診断方法であって、
    被験者からサンプルを分離し、
    前記サンプル中の、Ｎ末端−ＳＧＰＴＨのアミノ酸配列を備えるペプチドの存在または量を分析する、
    ことを含むことを特徴とする診断方法。
13. 請求項１に記載の抗体を備えるキット。
14. Ｎ末端−ＳＧＰＴＨのアミノ酸配列を備えるペプチド。
15. 抗体を産生するためのＮ末端−ＳＧＰＴＨのアミノ酸配列を備えるペプチドの使用。

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