JP2019527562A

JP2019527562A - 長時間作用性ｐｃｓｋ９特異的結合タンパク質及びその応用

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Publication number: JP2019527562A
Application number: JP2019517134A
Authority: JP
Inventors: 少雄王
Original assignee: 常州博嘉生物医▲薬▼科技有限公司
Priority date: 2016-06-08
Filing date: 2017-06-08
Publication date: 2019-10-03
Anticipated expiration: 2037-06-08
Also published as: CN107474140A; JP6854343B2; CN107474140B; WO2017211313A1; US11028184B2; US20190194356A1

Abstract

本発明は、長時間作用性ＰＣＳＫ９特異的結合タンパク質及びその応用を提供する。本発明が、特有の相補性決定領域を含有するＭＶ０７２タンパク質、すなわちプロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン９型（PCSK９）と特異的結合する結合タンパク質を提供し、それが、ＰＣＳＫ９と特異的に結合でき、かつ有効的にＰＣＳＫ９の機能を障害でき、血漿におけるＬＤＬコレステロールレベルを低下できる；さらに、前記結合タンパク質の、ＰＣＳＫ９機能に関連する、又はＰＣＳＫ９機能に影響される疾患の治療における応用も提供する。

Description

本発明は、免疫学分野に属し、具体的に、本発明は、プロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン９型（Ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎｃｏｎｖｅｒｔａｓｅｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎｋｅｘｉｎｔｙｐｅ９、ＰＣＳＫ９）特異的結合タンパク質及びその応用に関する。

心血管疾患は、人の死亡を引き起こす最大の死亡原因である。低比重リポタンパク質コレステロール（Ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、ＬＤＬ−Ｃ）は、心血管疾患を引く要因の一つであることは、既に実証された。ＬＤＬ−Ｃのそんな作用は、相対的に独立で、かつ有効的に制御できる作用であり、過去の２０年には、スタチン（ｓｔａｔｉｎｓ）系脂質降下薬の使用で、心血管疾患の発病率を成功的に低減した。

しかしながら、スタチン系薬品による治療の方法は、いつも有効なものではなく、別の脂質降下の治療の方法に対する需要がある。一部の患者、特に家族性高コレステロール血症（ｆａｍｉｌｉａｌｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌａｅｍｉａＦＨ）の患者は、しばしばスタチン系の薬品に対する感受性が低い。最高投与量のスタチン系薬品を使用しても、それらの患者は低いＬＤＬ−Ｃレベルを得にくい。また、スタチン系薬品は、筋肉痛及び横紋筋融解などの副作用を有し、一部の患者は、血中脂質レベルを制御するために、スタチン系薬品を使用できない、或いは非常に小さい投与量のスタチン薬品しか使用できない。プロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン９型（ＰＣＳＫ９）阻害剤は、こんな新しい種類の薬品であり、新しい血中ＬＤＬ−Ｃ濃度を制御する選択肢を提供する。

ＰＣＳＫ９は、セリンプロテアーゼであり、低比重リポタンパク質受容体（Ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＬＤＬＲ）のレベルの調整に関与する。生体外実験が、ＰＣＳＫ９を加えられたＨｅｐＧ２細胞には、細胞表面のＬＤＬＲレベルは、低下したことを実証した。マウス実験によって、ＰＣＳＫ９タンパク質レベルの向上が、肝臓におけるＬＤＬＲのタンパク質のレベルを低下できて、同時に、通常のマウスと比べて、ＰＣＳＫ９ノックアウトマウスにおけるＬＤＬＲレベルが、ある程度に向上したことを知られる。ＰＣＳＫ９がＬＤＬＲと直接に結合し、かつＬＤＬＲとともに貪食され、エンドサイトーシス途径に、ＰＣＳＫ９がＬＤＬＲと免疫蛍光を共発生することは示された。只今、ＰＣＳＫ９が、細胞外ＬＤＬＲを分解することを証明する直接な証拠がない、それが、細胞外ＬＤＬＲタンパク質のレベルを低下させるメカニズムは、まだ明確ではない。

研究は、既に、ＰＣＳＫ９がＬＤＬの産生を調節することに機能することを実証した。ＰＣＳＫ９の発現又はそのアップレギュレートは、増加したＬＤＬコレステロールの血漿中レベルに関わり、ＰＣＳＫ９の発現に対する阻害又は欠損は、ＬＤＬコレステロールの低い血漿中レベルに関わる。

したがって、ＰＣＳＫ９活性と、さまざまな治療状況におけるＰＣＳＫ９が果たした相応な作用とを阻害又は拮抗する、治療によるＰＣＳＫ９拮抗剤、特にＰＣＳＫ９特異的結合のモノクローナル抗体の調製は、非常に重要なことである。只今、研究中のＰＣＳＫ９阻害剤は、大体に、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ａｎｔｉｓｅｎｓｅｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、ＡＳＯｓ）、モノクローナル抗体及び、ａｄｎｅｃｔｉｎ技術から得られた融合タンパク質のような新らしい技術の応用から得られた特異的結合の融合タンパク質を含む。只今、研究しているＰＣＳＫ９阻害剤は、主にｓｉＲＮＡ類薬品とするＲＧ７６５２（ＡｌｎｙｌａｍＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／ＴｈｅＭｅｄｉｃｉｎｅｓＣｏｍｐａｎｙ）、Ａｄｎｅｃｔｉｎ技術による融合タンパク質とするＢＭＳ−９６２４７６（ＢＭＳ）、ＡＳＯ類薬品とするＡＬＮ−ＰＣＳ０２（ＩｄｅｒａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、抗体類薬品とするＢｏｃｏｃｉｚｕｍａｂ（Ｐｆｉｚｅｒ／Ｒｉｎａｔ）、ＬＧＴ−２０９（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）などである。

しかしながら、動物試験又は臨床研究には、一部のＰＣＳＫ９モノクローナル抗体類阻害剤は、特異性と親和力にあまり理想的ではない、又は副作用を有するという問題があり、そして、さらに新しい抗ＰＣＳＫ９抗体を最適化と調製する需要がある。

本発明の目的は、新しいＰＣＳＫ９特異的結合タンパク質ＭＶ０７２及びその応用を提供する。

本発明の一つは、ＰＣＳＫ９特異的結合の結合タンパク質ＭＶ０７２を提供し、当該結合タンパク質が、軽鎖可変領域と重鎖可変領域を有し、かつ
その重鎖可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：７に示された；
その重鎖可変領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：８又はＳＥＱＩＤＮＯ：１３に示された；
その重鎖可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：９又はＳＥＱＩＤＮＯ：１４に示されたアミノ酸配列である；
その軽鎖可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０に示された；
その軽鎖可変領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１に示された；
その軽鎖可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２に示された。

本発明の好ましい例において、上記のＰＣＳＫ９特異的結合の結合タンパク質ＭＶ０７２は：
（ａ）、その重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれに、ＳＥＱＩＤＮＯ：７、ＳＥＱＩＤＮＯ：８、ＳＥＱＩＤＮＯ：９に示された；その軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２に示された；又は
（ｂ）、その重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれに、ＳＥＱＩＤＮＯ：７、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４に示された；その軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２に示されたものから選べられたものである。

別の好ましい例において、上記のＰＣＳＫ９特異的結合の結合タンパク質ＭＶ０７２は、その重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２又はＳＥＱＩＤＮＯ：２４、その軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４又はＳＥＱＩＤＮＯ：２６に示された；又はその重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：６又はＳＥＱＩＤＮＯ：２８、その軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４又はＳＥＱＩＤＮＯ：２６に示されたことを特徴とする。

別の好ましい例において、上記のＰＣＳＫ９特異的結合の結合タンパク質ＭＶ０７２には、その重鎖可変領域が、更にＩｇＧ１Ｆｃと連結する。
別の好ましい例において、上記のＩｇＧ１Ｆｃは、変異体ＩｇＧ１Ｆｃであり、ＱＬ変異（ＳＥＱＩＤＮＯ：３０の融合配列と対応する場合に、相応な変異はＴ２５５Ｑ／Ｍ４３３Ｌ）を有し、又はＹＴＥ変異（ＳＥＱＩＤＮＯ：３２の融合配列と対応する場合に、相応な変異はＭ２５７Ｙ／Ｓ２５９Ｔ／Ｔ２６１Ｅ）有する。

別の好ましい例において、重鎖可変領域とＩｇＧ１Ｆｃと連結して得るアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３０又はＳＥＱＩＤＮＯ：３２に示された。
別の好ましい例において、上記の結合タンパク質ＭＶ０７２は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二価一本鎖抗体、一本鎖ファージ抗体、二重特異性二本鎖抗体、三重鎖抗体、四重鎖抗体である。

別の好ましい例において、上記の結合タンパク質ＭＶ０７２は、モノクローナル抗体である。
別の好ましい例において、上記の結合タンパク質ＭＶ０７２の重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、それぞれにＳＥＱＩＤＮＯ：２とＳＥＱＩＤＮＯ：４に示されたアミノ酸配列を有し、又はそれぞれにＳＥＱＩＤＮＯ：６とＳＥＱＩＤＮＯ：４に示されたアミノ酸配列を有し、その重鎖定常領域は、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂとＩｇＧ３から選べられた一つの重鎖タイプの定常領域である；かつその軽鎖定常領域は、κ鎖とλ鎖から選べられた一つの軽鎖タイプの定常領域である；
本発明のもう一つは、上記のＰＣＳＫ９特異的結合の結合タンパク質ＭＶ０７２をコードする核酸を提供する。

本発明のもう一つは、上記の核酸を含む発現ベクターを提供する。
本発明のもう一つは、上記の発現ベクターを含む、或いはそのゲノムに上記の核酸が組み込まれた宿主細胞を提供する。

本発明のもう一つは、上記のＰＣＳＫ９特異的結合の結合タンパク質ＭＶ０７２の、ＰＣＳＫ９発現又は活性障害に関連する疾患を診断、治療及び／又は予防する薬品の調製における応用を提供する。

好ましい例において、上記のＰＣＳＫ９発現又は活性障害に関連する疾患は、高血清コレステロールレベルに関連する病症を含むが、それらに限定されない；より好ましくは、高コレステロール血症、冠状動脈心臓病、代謝症候群、急性冠動脈症候群を含む。

在本発明のもう一つは、有効量の上記のＰＣＳＫ９特異的結合の結合タンパク質ＭＶ０７２と、薬学的に許容される担体を含む薬品組成物を提供する。
本発明のもう一つは、ＰＣＳＫ９発現又は活性障害に関連する疾患を治療及び／又は予防するためのキットを提供し、当該キットは、上記のＰＣＳＫ９特異的結合の結合タンパク質ＭＶ０７２、又は上記の薬品組成物を含む。

本発明のもう一つは、免疫抱合体を提供し、上記の免疫抱合体は、上記のＰＣＳＫ９特異的結合の結合タンパク質ＭＶ０７２、及び検出可能なマーカーを含む；より好ましくは、上記の検出可能なマーカーは、蛍光マーカー、発色マーカーを含む。

本発明のもう一つは、ＰＣＳＫ９レベルの検出に用いられる検出キットを提供し、当該検出キットは、上記のＰＣＳＫ９特異的結合の結合タンパク質ＭＶ０７２、又は上記の免疫抱合体を含む。

本文に開示された内容に基づき、当業者にとって、本発明の他の面は自明なものである。

図１は、それぞれにヒトＰＣＳＫ９抗原、マウスＰＣＳＫ９抗原、カニクイザルＰＣＳＫ９抗原に対するＭＶ０７２結合タンパク質、すなわちモノクローナル抗体９Ｍ２８３、９Ｍ２８４の動力学的分析結果を示す図である。図２は、ＭＶ０７２結合タンパク質、すなわちモノクローナル抗体９Ｍ２８３、９Ｍ２８４結合タンパク質が、細胞へのＬＤＬ吸収を低下する能力を測定する図である。図３は、好ましい抗ＰＣＳＫ９抗体の、高脂血症アカゲザル血清ＬＤＬのレベルに対する反応を示す図である。群ごとに、７歳を超える雄と雌アカゲザル４匹があり、０日目に皮下注射で、示された投与量のＰＣＳＫ９の好ましい抗体又は同等の体積の食塩水担体を投与する。示された時点に、血漿サンプルを採取し、血漿ＬＤＬ量を測定し、０日目の血清ＬＤＬ量と比較する。図４は、実施例８の、異なるＰＣＳＫ９モノクローナル抗体とＦｃＲｎの、それぞれにｐＨ６．０とｐＨ７．４におけるＥＬＩＳＡ結合実験を示す図である。図５は、ＭＶ０７２結合タンパク質、すなわちモノクローナル抗体９Ｍ２８４と９Ｍ２８４ＱＬの、それぞれにヒトＰＣＳＫ９抗原に対する動力学的分析結果を示す図である。図６は、ＭＶ０７２結合タンパク質、すなわちモノクローナル抗体９Ｍ２８４、９Ｍ２８４ＱＬと９Ｍ２８４ＹＴＥ結合タンパク質が、細胞へのＬＤＬ吸収を低下する能力を測定する図である。図７は、ＭＶ０７２結合タンパク質、すなわちモノクローナル抗体９Ｍ２８４と９Ｍ２８４ＱＬの、それぞれに異なるヒトＰＣＳＫ９抗原変異体に対する動力学的分析結果を示す図である。

発明者が、広範かつ十分な研究で、特有の相補性決定領域（ＣＤＲ領域）を含有し、プロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン９型（Ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎｃｏｎｖｅｒｔａｓｅｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎｋｅｘｉｎｔｙｐｅ９、ＰＣＳＫ９）と特異的結合する結合タンパク質ＭＶ０７２を得、それが、ＰＣＳＫ９と特異的に結合でき、かつ有効的にＰＣＳＫ９の機能を障害でき、血漿におけるＬＤＬコレステロールレベルを低下し、ＰＣＳＫ９機能に関連する、又はＰＣＳＫ９機能に影響される疾患の治療に用いられる。

<結合タンパク質ＭＶ０７２>
本発明が、ＰＣＳＫ９と特異的に結合できる結合タンパク質ＭＶ０７２を提供できる。本発明の結合タンパク質ＭＶ０７２は、完整な免疫グロブリン分子であっても良く、抗原結合断片であっても良い、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ’）₂断片、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ドメイン抗体、二価一本鎖抗体、一本鎖ファージ抗体、二重特異性二本鎖抗体、三重鎖抗体、四重鎖抗体等を含むが、それらに限定されない。

ＣＤＲ領域は、免疫学に、注目を集めるタンパク質の配列である。本発明の実施形態において、結合タンパク質は、本明細書に記載された二つ、三つ、四つ、五つ又は全ての六つのＣＤＲ領域を含んでもよい。好ましくは、本発明の結合タンパク質ＭＶ０７２が、本明細書に記載された少なくとも二つのＣＤＲを含む。

本発明のもう一つは、本明細書に記載された結合タンパク質ＭＶ０７２の機能的なバリアントを含む。バリアントが親の結合タンパク質と競合的にＰＣＳＫ９と特異的結合できる場合に、当該バリアント分子を、本発明の結合タンパク質の機能的なバリアントと見なす。言い換えれば、上記の機能的なバリアントは、依然として、ＰＣＳＫ９又はその断片と結合できる。機能的なバリアントは、一次構造配列が基本的に類似するが、例えば親の結合タンパク質に発見されない生体外又は生体内化学及び／又は生物化学的に修飾された誘導体を有するものを含むが、それらに限定されない。こんな修飾は、アセチル化、アシル化、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有付着、脂質又は脂質誘導体の共有付着、架橋、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、ヒドロキシル化、メチル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解処理、リン酸化などを含む。言い換えれば、親の結合タンパク質のアミノ酸及び／又はヌクレオチド配列における修飾は、上記のヌクレオチド配列がコードした、又は上記のアミノ酸配列を有する上記の結合タンパク質の結合特性を著しく影響又は変化しない、すなわち上記の結合タンパク質は、依然として、その標的を認識・結合できる。

上記の機能的なバリアントは、ヌクレオチドとアミノ酸の置換、付加、と欠失を含む保存的な配列修飾を有しても良い。これらの修飾は、本分野の既知の標準技術（例えば標的変異とランダムＰＣＲ仲介の変異）から導入でき、かつ天然及び非天然ヌクレオチドとアミノ酸を含んでも良い。

保存的なアミノ酸置換は、その中のアミノ酸残基を、類似する構造又は化学性質を有する別のアミノ酸残基に置き換える置換を含む。本分野において、類似する側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーは、既に限定された。それらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖のアミノ酸（例えばアスパラギン酸とグルタミン酸）、非電荷極性側鎖のアミノ酸（例えばアスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖のアミノ酸（例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、分岐側鎖のアミノ酸（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香側鎖のアミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）を含む。当業者が、上記のファミリー以外の他のアミノ酸残基ファミリーの分類方式も使えることを知るはず。なお、バリアントは、非保存的なアミノ酸置換（例えばアミノ酸を異なる構造又は化学性質を有する別のアミノ酸残基に置き換える）を有しても良い。類似する小さい変異は、アミノ酸の欠失、又は挿入、又は両方を含んでもよい。本分野によく知られるコンピュータプログラムの使用で、どんなアミノ酸残基が、置換、挿入又は欠失されても免疫学活性を失わないかに関わる指導を発見・確定できる。

機能的なバリアントは、アミノ末端又はカルボキシ末端又は両方で短縮されたアミノ酸配列を含んでも良い。親の結合タンパク質と比べて、本発明の機能的なバリアントは、同じまたは異なる、より高い又はより低い結合親和性を有しても良いが、依然として、ＰＣＳＫ９又はその断片と結合できる。例えば、親の結合タンパク質と比べて、本発明の機能的なバリアントは、ＰＣＳＫ９又はその断片に対して、増加又は低減された（好ましくは増加）結合親和性を有しても良い。好ましくは、可変領域（フレームワーク領域、高度可変領域又はＣＤＲ領域を含むが、それらに限定されない）のアミノ酸配列は修飾される。一般的に、軽鎖と重鎖可変領域は、三つのＣＤＲ、及びより保存的な領域、すなわちいわゆるフレームワーク領域（ＦＲ）を含む三つの高度可変領域を含む。高度可変領域は、ＣＤＲ由来のアミノ酸残基と、高度可変リングのアミノ酸残基を含む。本発明の範囲内の機能的なバリアントと、本明細書に記載された親の結合タンパク質は、少なくとも約５０％乃至約９９％、好ましくは少なくとも約６０％乃至約９９％、より好ましくは少なくとも約７０％乃至約９９％、更に好ましくは少なくとも約８０％乃至約９９％、特に好ましくは少なくとも約９０％乃至約９９％、最も好ましくは少なくとも約９５％乃至約９９％、及び最も特に好ましくは少なくとも約９７％乃至約９９％のアミノ酸配列相同性を有する。当業者が既知したコンピュータアルゴリズム（例えばＧａｐ又はＢｅｓｔｆｉｔ）は、アミノ酸配列を最適に配列して、アラインメントを行い、類似又は同じのアミノ酸残基を判明することに用いられる。機能的なバリアントは、本分野に既知された一般的な分子生物学方法の使用で、親の結合タンパク質又はその一部分を変えて得られる；上記の方法は、エラープローンＰＣＲ、オリゴヌクレオチド指定突然変異導入、部位特異的変異導入及び重鎖及び／又は軽鎖に対するシャフリングを含むが、それらに限定されない。

本発明の好ましい形態として、上記の結合タンパク質ＭＶ０７２は、モノクローナル抗体である。抗体の抗原結合特性は、重鎖と軽鎖可変領域に位置する３つの特定の区域（相補性決定領域（ＣＤＲ）という）で表現でき、上記のＣＤＲ領域が、可変領域を４つのフレームワーク領域（ＦＲ）に分け、４つのＦＲのアミノ酸配列は、比較的に保存的なもので、結合反応と直接に関与しない。それらのＣＤＲが、リング状の構造に形成し、それらの間のＦＲに形成されたβシートを通じて、空間構造で互に近づき、重鎖におけるＣＤＲと、相応する軽鎖におけるＣＤＲとが、抗体の抗原結合サイトを構成する。本発明の抗ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体のＣＤＲ領域は、新しいものであって、既存の抗ＰＣＳＫ９抗体と異なる。

本発明のモノクローナル抗体は、全てヒト由来であって、低い免疫原性と高い安全性の特徴を有する。
本発明の好ましい形態として、本発明の結合タンパク質ＭＶ０７２は、ＩｇＧＦｃと融合したタンパク質であっても良い。よりましくは、上記のＩｇＧ１Ｆｃは、変異体ＩｇＧ１Ｆｃであって、Ｔ２５５Ｑ／Ｍ４３３Ｌ変異又はＭ２５７Ｙ／Ｓ２５９Ｔ／Ｔ２６１Ｅ変異を有する。発明者らが、酸性条件において、このように改造されて得た結合タンパク質と、抗体の回収と再利用を担当するＦｃＲｎとの結合は、著しく向上する（ＥＣ５０値が著しく低下する）ことを見出した；これは、当該ＩｇＧ１Ｆｃ変異のＭＶ０７２結合タンパク質は、生体内にエンドソーム（Ｅｎｄｏｓｏｍｅ）に分解されにくいことを予測した；その生体内の半減期が、もっと長くなりつつ、ＭＶ０７２結合タンパク質と抗原との結合能を持ちつづける。

本発明のもう一つは、本発明の少なくとも一種の結合タンパク質、その機能的なバリアント又は免疫抱合体をコードする核酸分子を提供する。こんな核酸分子は、クローンための中間体として用いられても良く、例えば、以上に記載された親和性成熟方法に用いられる。一つの好ましい実施形態において、上記の核酸分子は、分離又は精製されたものである。ＤＮＡ分子の配列は、通常の技術、又はハイブリドーマ技術で得られる。

関わる配列を得ると、組換え方法で、大量に関わる配列を得られる。通常に、それをベクターにクローン化され、細胞にトランスフェクションし、その後、通常の方法で、増殖した宿主細胞から、関わる配列を分離して得る。

また、特に断片の長さが短い際に、人工合成の方法で、関わる配列を合成しても良い。通常に、まず複数の小さい断片を合成し、その後それらを連結し、長い配列の断片を得る。

只今、もう完全の化学合成で、本発明の結合タンパク質ＭＶ０７２（又はその断片、又はその誘導体）をコードするＤＮＡ配列を得られる。その後、当該ＤＮＡ配列を本分野に既知された既存の各ＤＮＡ分子（又はベクター）と細胞に導入しても良い。また、化学合成で、変異を、本発明の結合タンパク質の配列に導入しても良い。

本発明は、さらに、上記の適当なＤＮＡ配列及び適当なプロモーター又は制御配列を含むベクターに関する。これらのベクターは、タンパク質を発現できるように、適当な宿主細胞の形質転換に用いられる。好ましくは、本発明のベクターは、例えば、ウイルスプロモーターを含むプラスミド発現ベクターであり、かつ上記の発現ベクターには、それぞれに、抗ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体重鎖可変領域（ＶＨ）と定常領域のＩｇＧ２（ヒト化ＩｇＧ２由来の定常領域）融合配列、及び軽鎖可変領域ＶＬと人体ＩｇＬａｍｂｄａ（ヒト化Ｉｇｌａｍｂｄａ由来の定常領域）融合配列が挿入される。

宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞であっても良く、または酵母細胞のような下等真核細胞であっても良く、または哺乳動物細胞のような高等真核細胞であっても良い。代表の例としては、大腸菌、ストレプトマイセス属のような細菌細胞；ネズミチフス菌；酵母のような真菌細胞；植物細胞；ショウジョウバエＳ２またはＳｆ９のような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ７、ＮＳＯまたはＢｏｗｅｓメラノーマ細胞のような動物細胞がある。本発明に好適な宿主細胞は、真核宿主細胞であって、特に、ＣＨＯ細胞、２９３細胞のような哺乳動物細胞である。

必要に応じて、その物理・化学・他の特性を利用し、様々な分離方法で、組換え結合タンパク質を分離や精製しても良い。それらの方法は、当業者がよく知られるものである。それらの方法の例は、通常のリフォールディング処理、タンパク質沈殿剤での処理（塩析方法）、遠心分離、浸透での細胞破壊、超音波処理、超遠心分離、モレキュラーシーブクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）と他の各液体クロマトグラフィー技術及びそれらの方法の組み合わせを含むが、それらに限定されない。

<薬品組成物〉
本発明の結合分子は、ＰＣＳＫ９発現又は活性障害に関連する疾患を診断、治療及び／又は予防する薬品組成物の調製に用いられる。

上記の「ＰＣＳＫ９発現又は活性障害に関連する疾患」は、高血清コレステロールレベルに関連する病症を含む。好ましくは、上記の「ＰＣＳＫ９発現又は活性障害に関連する疾患」は、高コレステロール血症、冠状動脈心臓病、代謝症候群、急性冠動脈症候群及び関連病症を含むが、それらに限定されない。上記のＰＣＳＫ９機能とは、ＰＣＳＫ９の関与が必要し、又はＰＣＳＫ９に激化又は増強されたいずれかの活性及び機能を指す。上記のＰＣＳＫ９モノクローナル抗体は、さらにＰＣＳＫ９を検出と定量化し、様々な診断目的に用いられる。

本発明の新発見に基づき、さらにＰＣＳＫ９発現又は活性障害に関連する疾患を診断、治療及び／又は予防できる薬品組成物を提供し、それは、有効量の本発明に記載された結合分子、及び薬学的に許容される担体を含む。

本明細書に用いられる用語「薬学的に許容される」とは、分子自身と、その組成物が、適当に動物又は人に投与される際に、副作用、アレルギーまたは他の有害反応を生じないことを意味する。本明細書に用いられる「薬学的に許容される担体」は、本発明の結合分子と調和でき、すなわち、通常の場合にそれと混ぜ合わせても、組成物の効果を大幅に低下することがない。

薬学的に許容される担体又はその組分とするいくつかの物質の具体な例はラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖類；トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよびメチルセルロースなどのセルロース及びその誘導体；トラガカントゴム粉末；モルト；ゼラチン；タルク；ステアリン酸およびステアリン酸マグネシウムなどの固体潤滑剤；硫酸カルシウム；ピーナッツ油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油およびココアバターなどの植物油；プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール；アルギン酸；Ｔｗｅｅｎ(などの乳化剤；ラウリル硫酸ナトリウムなどの湿潤剤；着色剤；調味剤；圧縮錠剤、安定剤；抗酸化剤；防腐剤；パイロジェンフリー水；等張食塩水；およびリン酸塩緩衝液などである。

本発明の薬品組成物は、必要に応じて、各製剤に調製されても良く、かつ医師が患者のタイプ、年齢、体重、および大体な疾患状態、投与方式などの因子に従って決定した患者に有益な投与量で投与できる。投与方式は、例えば注射又は他の治療方式を採用しても良い。

本発明の結合分子は、分離されない又は分離された形式で使用されても良い。また、本発明の結合分子は、単独で応用されても良く、又は少なくとも一つの本発明の結合分子（又はそのバリアント又は断片）の混合物に含まれる状態で応用されても良い。言い換えれば、上記の結合分子は、組み合わせて応用されてもよく、例えば、二つ又はそれ以上の本発明の結合分子、そのバリアント又は断片を含むの薬品組成物として応用されてもよい。例えば、異なる相補性活性を有する結合分子を、一つの治療方案に組み合わせて、所望の予防、治療又は診断作用を達成しても良いが、同じ活性を有する結合分子を一つの治療方案に組み合わせて、所望の予防、治療又は診断作用を達成しても良い。

本発明の結合分子又は薬品の組み合わせは、ヒトに使用する前に、適切な動物モデル系で測定できる。こんな動物モデル系は、マウス、サルを含むが、それらに限定されない。
本発明の結合分子の適当な投与量の範囲は、例えば、０．００１−１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、０．０１−１５ｍｇ／ｋｇ体重である。また、例えば、一回の注射で投与しても良く、時間の経過とともに投与量を複数回に分けて投与しても良く、又は治療状況の緊急性に応じて、比例して投与量を低減又は増加しても良い。本発明の分子と組成物は、好ましくは無菌なものである。それらの分子と組成物を無菌化する方法は、本分野によく知られることである。診断、予防及び／又は治療に使用する他の分子は、本発明の結合分子と類似する投与方案で投与されても良い。単独で他の分子を投与すると、本発明の一つ又は複数の結合分子又は薬品組成物を投与する前、同時又は後に、患者に他の分子を投与しても良い。通常に、人患者に対する精確な投与方案は、臨床実験にわたって選べられる。

本発明に記載された結合分子は、臨床医が使用するために、適当なパッケージングに配置され、キットを製造しても良い。好ましくは、上記のキットには、投与方法を説明するための取扱説明書を含んでも良い。

本発明は、さらに血清コレステロールレベルを低下させ、患者の高血清コレステロールレベルに関連する疾患を治療又は予防する方法を含み、上記の方法は、患者に、有効量の本発明の少なくとも一つのモノクローナル抗体を投与することを含む。好ましくは、本発明のモノクローナル抗体と、ＬＤＬＲタンパク質の利用率を向上する薬品とを併用投与しても良い。上記のＬＤＬＲタンパク質の利用率を向上する薬品は、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチンを含むが、二つ以上の上記のＬＤＬＲタンパク質の利用率を向上する薬品を選択しても良い。

〈免疫抱合体〉
一方、本発明は、免疫抱合体を含み、すなわち本明細書に記載された少なくとも一つの結合タンパク質を含みつつ、少なくとも一つの機能性分子（例えば検出可能の部分／物質の分子）も含む。上記の抗体と、上記の機能性分子とは、共有連結、カップリング、付着、架橋等の方式で、抱合体を構成できる。本発明の免疫抱合体は、一つ以上のマーカーを含んでも良い。上記のマーカーが、共有結合を通じて、本発明の結合タンパク質と直接に結合／抱合しても良い。又は、上記のマーカーは、一つ又は複数の連結化合物を通じて、上記の結合タンパク質と結合／抱合しても良い。マーカーと結合タンパク質との結合技術は、当業者によく知られるものである。本発明の免疫抱合体のマーカーは、治療剤であっても良い。

上記の免疫抱合体は、本発明の抗体及び検出可能なマーカーを含んでも良い。上記の検出可能なマーカーは、蛍光マーカー、発色マーカー；酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、放射性材料、陽電子放出金属及び非放射性常磁性金属イオンを含むが、それらに限定されない。一つ以上のマーカーを含んでも良い。検出及び／又は分析及び／又は診断するための、抗体を標識するマーカーは、使用される特定な検出／分析／診断技術及び／又は方法（例えば、免疫組織化学的染色（組織）サンプル、フローサイトメトリーなど）に依存する。本分野に既知された検出／分析／診断技術及び／又は方法に好適なマーカーは、当業者によく知られるものである。

また、本発明の人結合タンパク質又は免疫抱合体を、固体支持体に付着しても良く、特に、ＰＣＳＫ９タンパク質又はその断片の生体外免疫測定又は精製に使用しても良い。こんな固体支持体は、多孔性または非多孔性、平面状または非平面状にしてもよい。本発明の結合タンパク質は、精製の便利のために、マーカー配列と融合しても良い。上記のマーカー配列の例は、Ｈｉｓタグ、ヘマグルチニン（ＨＡ）マーカー、ｍｙｃマーカー又はｆｌａｇマーカーを含むが、それらに限定されない。又は、一つの抗体は、別の一つの抗体を結合して、抗体のヘテロコンジュゲート（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を形成しても良い。

〈検出試剤とキット〉
本発明に記載された結合分子に基づき、便利、快速かつ正確に測定しようとするサンプルにおけるＰＣＳＫ９レベルを検出する試剤又はキットを調製できる。

本明細書に使わられたように、用語「測定しようとするサンプル」は、生物学由来の血液及び他の体液サンプル、生検組織サンプルや組織培養物のような固形組織サンプル、又はこれらから発生する細胞又はその後代を含む複数のサンプル種類を総括する。当該用語は、さらに、得られたから任意の方式で処理されたサンプルを含み、例えば、試剤でタンパク質又はポリヌクレオチドのような成分を処理、溶解、又は富化する。

そして、本発明が、測定しようとするサンプルにおけるＰＣＳＫ９レベルを検出するための検出キットを提供し、当該キットには、本発明のＰＣＳＫ９結合分子、又はＰＣＳＫ９結合分子と検出可能なマーカーとが構成する免疫抱合体を含む。

本発明が提供したＰＣＳＫ９結合分子を得た後に、特異性にＰＣＳＫ９レベルを検出するための検出キットを、簡便に製造できる。
便利に検出するために、上記のキットには、本発明の結合分子を含み、又はＰＣＳＫ９結合分子と検出可能なマーカーとが構成する免疫抱合体を含む以外に、さらに他の検出試剤又は補助試剤（発色剤、マーカー、二次抗体、抗‐抗体、増感剤など）を含んでも良く、上記の補助試剤は、例えばＥＬＩＳＡキットに通常に使用された試剤であり、それらの試剤の特性及びそれらの調製方法は、いずれも当業者によく知られるものである。当業者が理解すべきのは、本発明の結合分子をＰＣＳＫ９認識用試薬として利用する限り、各の変化形式の検出キットは、いずれも本発明に含まれる。

また、上記のキットには、さらにその中に配置された試剤の使用方法を説明するための取扱説明書を含んでも良い。
本発明が提供した結合分子及び／又はキットを得た後に、複数の免疫学関連方法で、サンプルにおけるＰＣＳＫ９又はその含有量を検出でき、そして測定しようとするサンプルのドナーに、ＰＣＳＫ９発現又は活性障害に関連する疾患が存在するか否かを確定する。

以下、具体的な実施例を参照して、本発明をさらに説明する。これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の単なる例示であることが理解されるべく。以下の実施例における特定の条件を特定しない実験方法は、通常に、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＧｕｉｄｅｔｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、ＴｈｉｒｄＥｄｉｔｉｏｎ、ＳｃｉｅｎｃｅＰｒｅｓｓ、２００２に記載された通常条件に従って実施され、或いはメーカーが推奨する条件に従って実施される。

〔実施例１〕
ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体の最適化とスクリーニング
要件を満たすＰＣＳＫ９抗体を探すために、発明者らが、大量の研究とスクリーニングで、全てヒト由来ファージライブラリーから、二つの優れた性能を有するモノクローナル抗体を得た。それらの可変ドメインの核酸配列及びアミノ酸配列は、以下のとおりである：
１、モノクローナル抗体９Ｍ２８４
重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１である。
重鎖可変領域アミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２である。
重鎖の各ＣＤＲ領域アミノ酸配列：
ＨＣＤＲ１：ＡＦＴＦＤＳＦＧＭＨ（ＳＥＱＩＤＮＯ：７）；
ＨＣＤＲ２：ＬＬＷＳＤＧＳＧＥＹＹＡＤＳＡＫＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：８）；
ＨＣＤＲ３：ＡＭＧＡＩＹＹＹＹＡＭＤＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：９）。
重鎖各ＣＤＲ領域のヌクレオチド配列：
ＨＣＤＲ１：ＧＣＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＧＡＣＡＧＣＴＴＣＧＧＣＡＴＧＣＡＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１５）；
ＨＣＤＲ２：ＣＴＧＣＴＴＴＧＧＡＧＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＧＡＧＴＡＣＴＡＣＧＣＣＧＡＣＴＣＣＧＣＴＡＡＧＧＧＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１６）；
ＨＣＤＲ３：ＧＣＧＡＴＧＧＧＣＧＣＣＡＴＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＧＣＣＡＴＧＧＡＣＧＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７）。
軽鎖ヌクレオチド配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３である。
軽鎖アミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４である。
軽鎖の各ＣＤＲ領域アミノ酸配列：
ＬＣＤＲ１：ＴＧＴＳＳＮＩＧＮＱＦＶＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０）；
ＬＣＤＲ２：ＥＹＮＫＲＰＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１）；
ＬＣＤＲ３：ＧＳＷＤＳＳＬＳＧＹＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２）。
軽鎖の各ＣＤＲ領域ヌクレオチド配列：
ＬＣＤＲ１：ＡＣＣＧＧＣＡＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＧＧＣＡＡＣＣＡＡＴＴＣＧＴＧＴＣＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１８）；
ＬＣＤＲ２：ＧＡＧＴＡＣＡＡＣＡＡＧＣＧＧＣＣＣＴＣＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１９）；
ＬＣＤＲ３：ＧＧＣＴＣＣＴＧＧＧＡＣＴＣＴＴＣＣＣＴＧＴＣＣＧＧＣＴＡＴＧＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２０）。

２、モノクローナル抗体９Ｍ２８３
重鎖ヌクレオチド配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：５である。
重鎖アミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：６である。
重鎖の各ＣＤＲ領域アミノ酸配列：
ＨＣＤＲ１：ＡＦＴＦＤＳＦＧＭＨ（ＳＥＱＩＤＮＯ：７）；
ＨＣＤＲ２：ＬＬＷＳＤＧＳＤＥＹＹＡＤＳＡＫＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）；
ＨＣＤＲ３：ＡＬＧＡＩＹＳＹＹＡＭＤＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）。
重鎖の各ＣＤＲ領域ヌクレオチド配列：
ＨＣＤＲ１：ＧＣＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＧＡＣＡＧＣＴＴＣＧＧＣＡＴＧＣＡＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１５）；
ＨＣＤＲ２：ＣＴＧＣＴＴＴＧＧＡＧＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＧＡＣＧＡＧＴＡＣＴＡＣＧＣＣＧＡＣＴＣＣＧＣＴＡＡＧＧＧＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２１）；
ＨＣＤＲ３：ＧＣＧＴＴＧＧＧＣＧＣＧＡＴＣＴＡＣＡＧＣＴＡＣＴＡＣＧＣＣＡＴＧＧＡＣＧＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２２）。

モノクローナル抗体９Ｍ２８３の軽鎖ヌクレオチドとアミノ酸配列は、９Ｍ２８４の軽鎖ヌクレオチドとアミノ酸配列と同じ、相応する各ＣＤＲ領域も９Ｍ２８４と同じである。

〔実施例２〕
トランスフェクションされた細胞でＰＣＳＫ９モノクローナル抗体の調製
上記のモノクローナル抗体９Ｍ２８４の重鎖ヌクレオチド配列の両端に、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩサイトを添加し、ｐＣＤＮＡ３．１＋プラスミドの相応するサイトに挿入した；上記のモノクローナル抗体９Ｍ２８４の軽鎖ヌクレオチド配列の両端に、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩサイトを添加し、ｐＣＤＮＡ３．１＋プラスミドのの相応するサイトに挿入した。上記のモノクローナル抗体９Ｍ２８４を発現する組換えプラスミドを得た。

上記のモノクローナル抗体９Ｍ２８３の重鎖ヌクレオチド配列の両端に、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩサイトを添加し、ｐＣＤＮＡ３．１＋プラスミドの相応するサイトに挿入した；上記のモノクローナル抗体９Ｍ２８３の軽鎖ヌクレオチド配列の両端に、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩサイトを添加し、ｐＣＤＮＡ３．１＋プラスミドのの相応するサイトに挿入した。上記のモノクローナル抗体９Ｍ２８３を発現する組換えプラスミドを得た。

１、一過性トランスフェクション
リポフェクション法で、上記の組換えプラスミドを、懸濁しているＨＥＫ２９３細胞に一過性トランスフェクションした。

Ｅｘｐｉ２９３Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ培地には、３７℃、ＣＯ₂ ８％、１２０ｒｐｍ回転速度の条件において、得たトランスフェクション細胞を培養した。
培養された大量のトランスフェクション細胞を、二次遠心分離処理（一回目遠心分離の条件は１０ｍｉｎ、１０００ｇ；二回目遠心分離の条件は３０ｍｉｎ、１００００ｇ）を経て、細胞と細胞破片を除去し、上清を得た。澄んだ上清を、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィーカラムにロードし、三回のリンス（リンス緩衝液は、順にＰＢ１５０ｍＭＮａＣｌｐＨ６．５；２０ｍＭＮａ−ｃｉｔｒａｔｅ１ＭＮａＣｌｐＨ５．５；２０ｍＭＮａ−ｃｉｔｒａｔｅｐＨ５．５である）で不純物を除去し、その後、ｐＨリニア勾配溶離方式（開始緩衝液Ａ：２０ｍＭＮａ−ｃｉｔｒａｔｅｐＨ５．５；標的緩衝液Ｂ：２０ｍＭＮａ−ｃｉｔｒａｔｅｐＨ３．０）で、標的抗体を分離、捕獲した。最後、限外濾過濃縮ステップで、標的抗体を、２００ｍＭＨＥＰＥ、１００ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭＮａＯＡｃｐＨ７．０緩衝液に置換した。

２、９Ｍ２８４を安定に発現する細胞の電気トランスフェクション
構築された、９Ｍ２８４重鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：２３、それが、ＳＥＱＩＤＮＯ：２４のアミノ酸配列をコードし、リードペプチドを有しない）と、９Ｍ２８４軽鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：２５、それが、ＳＥＱＩＤＮＯ：２６のアミノ酸配列をコードし、リードペプチドを有しない）を有するプラスミド（合計量２０μｇのプラスミドＤＮＡ）を、１．０×１０^７宿主細胞ＣＨＯ−Ｋ１細胞に混ぜた；当該細胞とプラスミドとの混合液をエレクトロポレーター（ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒＩＩ）に入れ、電圧３００Ｖ、静電容量９５０μＦの指数関数的減衰波で、細胞とプラスミドとの混合液に対して、電気ショックコトランスフェクションを行った。電気トランスフェクションされた細胞とＤＮＡとの混合液を、２ｍＬ宿主細胞基礎培地（ＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅｄ（商標）ＣＨＯＦｅｄ−ｂａｔｃｈＭｅｄｉｕｍ、Ｓｉｇｍａ、６ｍＭのＬ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、Ｓｉｇｍａを含む）を含む６ウェルプレートに加え、細胞を二酸化炭素インキュベーターに入れ、３７°Ｃで２４ｈ培養し、その後、培地を、選択的成長培地（ＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅｄ（商標）ＣＨＯＦｅｄ−ｂａｔｃｈＭｅｄｉｕｍ、Ｓｉｇｍａ；Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ、２０μｇ／ｍＬ、ＧＩＢＣＯと６ｍＭＬ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、Ｓｉｇｍａを含む）に変更し、約３週間にわたって、細胞生存性が９０％以上に回復するまで圧力スクリーニングを行い、重鎖と軽鎖が組み込まれたＣＨＯ−Ｋ１ゲノムを含むＰｏｏｌ細胞系を得た。細胞生存性が９０％以上まで回復した時点に、１２５ｍＬシェイクボトルにＦｅｄ−ｂａｔｃｈ培養を行い、培養体積は３０ｍＬであり、開始細胞濃度は０．３×１０６／ｍＬであった。３日目、５日目、７日目、９日目、１１日目と１３日目にフィード培地（Ｅｘ−ＣＥＬＬＡｄｖａｎｃｅｄＣＨＯｆｅｅｄ１（グルコースを含む）、Ｓｉｇｍａ）を補充し、かつ細胞密度と生存性をサンプリングテストし、グルコース濃度が３ｇ／Ｌまで低下した時点に、グルコースを６ｇ／Ｌまで添加し、生存性が７０％以下になる時点に、培養を終了し、かつ抗体濃度を検出した。

構築された、９Ｍ２８３重鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：２７、それが、ＳＥＱＩＤＮＯ：２８のアミノ酸配列をコードし、リードペプチドを有しない）と９Ｍ２８３軽鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：２５、それが、ＳＥＱＩＤＮＯ：２６のアミノ酸配列をコードし、リードペプチドを有しない）を含むプラスミドで、同様に９Ｍ２８３を安定に発現する細胞を得た。

３、９Ｍ２８４トランスフェクタントを安定に発現する半固体クローンとＥＬＩＳＡスクリーニング
抗体濃度が比較に高いＰｏｏｌ細胞を選択し、モノクローンのスクリーニングを行い、５０−２００個Ｐｏｏｌ細胞を含む細胞懸濁液を、１０ｍＬ半固体培地（ＣｌｏｎｅＭｅｄｉａＣＨＯＧｒｏｗｔｈＡ（Ｌ−Ｇｌｎを含む）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｄｅｖｉｃｅｓ）と均一に混ぜた後に、１００ｍｍペトリ皿に播種し、３７°Ｃ、５％ＣＯ２インキュベーターに１４日培養し、中等大きさの細胞コロニーを選択し、２００μＬ選択的培地を含む９６ウェルプレートに転移し、４−５日培養し、細胞懸濁液を吹き付けて均一に混ぜて、２つの９６ウェルプレートに平均に配って、かつそれぞれに新鮮な培地を、２００μＬ培養体系まで補充し、その中、１つのプレートには、正常に液体交換・増幅を行い、液体交換・増幅際に、細胞懸濁液を吹き付けて均一に混ぜて、１００μＬ培地を取って捨て、１００μＬ新鮮な培地を補充し、これによって類推した；もう１つのプレートには、液体交換を行わないまま、１０日連続に培養し、細胞の上清を採取し、ＥＬＩＳＡ検出を行った。ＯＤ値によって、細胞株を選択し、増幅とサブクローンスクリーニングを行った。最初のラウンドの半固体スクリーニングから得た好ましい細胞株を、０．５細胞／ウェルの密度で、９６ウェルプレートに播種した。７日後、細胞を観察し、単一細胞クローンが、一定のスクリーニング規模に成長したまで、単一細胞集団だけ存在するウェルを、単一細胞ウェルとして選択した。９６ウェルプレートの単一細胞ウェルにおける培養液（適切な希釈を行っても良い）を、コーティングされたＥＬＩＳＡプレートに転移し、ＥＬＩＳＡスクリーニング分析を行い、ＴＯＰ３単一細胞系までスクリーニングし、Ｆｅｄ−Ｂａｔｃｈで、発現量を確認した。

〔実施例３〕
ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体の生物的分析特性
１、キャピラリー電気泳動（ＣＥ−ＳＤＳ）
ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩシステムより、キャピラリー電気泳動を行い、抗体を分析した。結果として、還元と非還元条件において、本発明のＰＣＳＫ９モノクローナル抗体サンプルのピーク純度百分比と分子量は、表１（非還元条件）と表２（還元条件）に示された。

２、モレキュラーシーブ液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）
モノクローナル抗体を、０．２μｍフィルターで濾過し（Ｔｈｏｍｓｏｎ、カタログ番号２５５３５−１００）、その後、ＭＡｂＰａｃＳＥＣ−１カラム（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号０７４６９６２０）にロードした。移動相緩衝液は、５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ塩化ナトリウムであり、ｐＨ６．２、流速は０．２ｍｌ／ｍｉｎである。ピーク計算はＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアを使用して統合された。本発明のＰＣＳＫ９モノクローナル抗体の主ピークおよびマルチマーピークの百分比は、表３に示された。

３、示差走査熱量測定法でタンパク質の安定性を評価
示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）は、追加する必要が有るサンプルと、基準物質との熱量の差を、温度の関数とする測量技術である。示差走査熱量測定法は、複数のタンパク質の特性（５０％タンパク質が変性（ＴＭ）した際の温度／融解温度を含む）の測量に使用でき、これはタンパク質の安定性を評価する方法の一つである。

検出された抗体を、１ｍｇ／ｍｌの濃度でＮａｎｏＤＳＣサンプルルームに入れ、２５℃から１００℃まで１℃／ｍｉｎの速度で昇温した。実施する前に、精確な開始温度を確保するために、サンプルを検出する前に、予め１５分間にスキャンした。サンプルデータには、緩衝液のみ含むサンプルの値を引いた；ＮａｎｏＤＳＣソフトウェアでＴｍを計算した。

結果は、表４を参照。

〔実施例４〕
抗体のＰＣＳＫ９と結合する特性
ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体の、人、マウス又はカニクイザルＰＣＳＫ９と結合する能を、ＯｃｔｅｔＲｅｄ９６システム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）で表示した。抗ヒトＩｇＧＦｃ（ＡＨＣ）の動力学バイオセンサ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ、＃１８−５０６３）を、ｐＨ１．７のグリシンで予処理した後に、測定緩衝液に浸した。検出しようとするＰＣＳＫ９モノクローナル抗体を、１０μｇ／ｍｌの濃度でＡＨＣバイオセンサに１２０秒間固定した。その後、ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体をロードしたＡＨＣバイオセンサを、異なる濃度のヒトＰＣＳＫ９抗原（ＧｅｎｅＢａｎｋＡＸ１２７５３０．１）、マウスＰＣＳＫ９抗原（ＮＣＢＩＮＭ＿１５３５６５．２）又はカニクイザルＰＣＳＫ９抗原（ＮＣＢＩＮＭ＿００１１１２６６０．１）と緩衝液に浸した。緩衝液とロードされたバイオセンサの間の非特異的結合をテストするために、分析物カラムの最後希釈点には、検出緩衝液しか含まない。８０〜１２０秒の間、抗原と抗体との結合を検出した、その後、１２０〜１８０秒の間、解離を発生した。検出緩衝液で、６０秒間のベースラインを確定した。抗ＰＣＳＫ９のモノクローナル抗体の親和力曲線は、１：１に結合する動力学センシング単価結合モデルでフィッティングしたものである。

動力学的分析は、図１と表５に示された。

〔実施例５〕
細胞ＬＤＬ吸収の測定
ヒトＨｅｐＧ２細胞を、ウェルごとに５×１０⁴個細胞の濃度でブラック透明の９６−ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）における、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ培地（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、Ｉｎｃ）に播種し、３７℃（５％ＣＯ₂）で一夜インキュベートした。ＰＣＳＫ９と抗体の複合体を形成させるために、２０ μｇ／ｍｌのヒトＰＣＳＫ９を、吸収緩衝液（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ）で希釈した各濃度の抗体又は単独の緩衝液（コントロール）と共に、室温において１時間インキュベートした。細胞上清を除去した後に、ＰＣＳＫ９／抗体混合物を添加し、そして最終濃度が８μｇ／ｍｌになるように吸収緩衝液で希釈したＤｉｌ−ＬＤＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した。３７℃（５％ＣＯ₂）で１６〜１８時間インキュベートした後、ＰＢＳで細胞を徹底に洗浄し、ＴＥＣＡＮＭ１０００で、５５４ｎｍ（励起）と５７１ｎｍ（発射）に、細胞蛍光シグナルを検出した。

細胞吸収の測定結果は、図２に示された。要するに、ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体のＩＣ５０値を測定し、具体的に、６．１２ｎＭ（９Ｍ２８３）と５．７５ｎＭ（９Ｍ２８４）ｐＭの値を得た（図２）。

上記の結果としては、本発明の抗原結合タンパク質が、優れた細胞へのＬＤＬ吸収を低下させる能力を有する。

〔実施例６〕
ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体が、高血脂アカゲザル体内の血中ＬＤＬレベルに対する影響
高脂血症アカゲザルにおいて、ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体９Ｍ２８４が、非ヒト霊長類動物疾患モデルにおいて体内の血清ＬＤＬを低下する効果をテストした。４匹の７歳以上の、高脂血症を有するアカゲザルに、０日目、一回皮下注射の方式で、ベクター（ＰＢＳ＋０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）又は３ｍｇ／ｋｇの投与量の、好ましいＰＣＳＫ９モノクローナル抗体９Ｍ２８４を注射した。それぞれに、０日目、１日目、３日目、５日目、７日目、９日目、１１日目、１４日目に、一晩中断食した後に、血清ＬＤＬの含有量を分析した。

結果は、図３を参照。一回注射された３ｍｇ／ｋｇＰＣＳＫ９モノクローナル抗体９Ｍ２８４は、全ての４匹の動物において、血清ＬＤＬ（５０％及び以上）の大幅低下を引き起こした。

同様に、発明者らが、高脂血症アカゲザルにおいて、ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体９Ｍ２８３の、体内血清ＬＤＬを低下する効果をテストした。結果として、ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体９Ｍ２８３が、アカゲザルの血清ＬＤＬレベルを著しく低下できる。
そして、ＰＣＳＫ９抗体が、非ヒト霊長類動物疾患モデルの血清ＬＤＬレベルを低下する。

〔実施例７〕
Ｆｃの改造で、ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体９Ｍ２８４の生体内の半減期を延長
通常の遺伝子工学の改造方法で、９Ｍ２８４抗体のＶＨ部分を、酵素消化より、それぞれに二つ又は三つの異なるアミノ酸変異を有するＩｇＧ１Ｆｃ（野生型の配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＤ３８１５８．１）に連結した。

その中、二つのアミノ酸変異を発生するのは、ＱＬ変異であり、ＱＬ変異のサイトが、ＳＥＱＩＤＮＯ：３０の融合配列の２５５位（野生型Ｆｃには、当該サイトはＴであるが、変異した後はＱ（Ｔ２５５Ｑ）である）と４３３位（野生型Ｆｃには、当該サイトはＭであるが、変異した後はＬ（Ｍ４３３Ｌ）である）に対応する。

その中、三つのアミノ酸変異を発生するのは、ＹＴＥ変異であり、変異サイトが、ＳＥＱＩＤＮＯ：３２の融合配列の２５７位（変異前はＭであるが、変異した後はＹ（Ｍ２５７Ｙ）である）、２５９位（変異前はＳであるが、変異した後はＴ（Ｓ２５９Ｔ）である）、２６１位（変異前はＴであるが、変異した後はＥ（Ｔ２６１Ｅ）である）に対応する。ＱＬとＹＴＥの変異が、ｐＨ６．０の酸性条件において、ＩｇＧＦｃの、エンドソーム（Ｅｎｄｏｓｏｍｅ）における新生児Ｆｃ受容体ＦｃＲｎとの結合力を数倍に増強できるから、エンドソーム（ｐＨ酸性条件）において、抗体と、ＦｃＲｎとの分離の程度は低下され、そして抗体が、再度に血液に放出・回収され（ｐＨ７．４の正常生理条件において、抗体が、ＦｃＲｎと結合しない）、半衰期を延長する効果を達成した。

９Ｍ２８４ＱＬの重鎖配列は、例えばＳＥＱＩＤＮＯ：２９（ヌクレオチド）とＳＥＱＩＤＮＯ：３０（アミノ酸）である；
９Ｍ２８４ＹＴＥの重鎖配列は、例えばＳＥＱＩＤＮＯ：３１（ヌクレオチド）とＳＥＱＩＤＮＯ：３２（アミノ酸）である。

〔実施例８〕
ＥＬＩＳＡで、異なるＦｃ変異体ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体とＦｃＲｎとの結合を検出
コーティング液（１５ｍＭＮａ₂ＣＯ₃、３５ｍＭＮａＨＣＯ₃、ｐＨ９．６）を使用し、標的抗体を１０ μｇ／ｍＬまで希釈した後、１００μＬ／ウェルの量で９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに添加し、４℃に一夜インキュベートし、コーティングを行った。コーティング終了した後、ｐＨ７．４のＰＢＳＴで、サンプルウェルを４回洗浄し、３００μＬ／ウェルの４％スキムミルク（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を添加し、２５℃に２時間インキュベートし、ブロッキングを行った。ブロッキング終了した後、ｐＨ７．４のＰＢＳＴで、サンプルウェルを４回洗浄し、ＰＢＳＴ（ｐＨ６．０／７．４）に溶解した０．４％スキムミルクでそれぞれに希釈したＦｃＲｎ（開始濃度２０μｇ／ｍＬ、２倍勾配希釈、合わせて１１個濃度勾配がある）を１００ μＬ／ウェルで添加し、２５℃に１．５時間インキュベートした。インキュベート終了した後、ｐＨ６．０／７．４のＰＢＳＴでサンプルウェルを４回洗浄し、０．４％スキムミルク（ｐＨ６．０／７．４）でそれぞれに１／５００に希釈したａｎｔｉ−Ｈｉｓ−Ｔａｇ−ＨＲＰを添加し、２５℃に１時間インキュベートした。インキュベート終了した後、ｐＨ６．０／７．４のＰＢＳＴでサンプルウェルを４回洗浄し、かつ１００μＬ／ウェルのＴＭＢを添加し、発色を行った（発色条件：２５℃、１０〜１５分間）。発色終了した後、１００μＬ／ウェルの１ＭＨ２ＳＯ４を添加し、発色反応を終了し、４５０ｎｍの吸光値を読んだ（６５０ｎｍの吸光度値に基づく減算補正した）。

結果は、表６に示されたように、ｐＨ６．０の条件において、９Ｍ２８４ＱＬと９Ｍ２８４ＹＴＥの変異体抗体の、ＦｃＲｎとの結合ＥＣ５０値は、９Ｍ２８４抗体のＦｃＲｎとの結合ＥＣ５０値より２．８倍に小さい。

〔実施例９〕
Ｆｃを改造した長い半減期ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体の親和力と細胞活性の検出
具体的な実験ステップは、実施例４と実施例５を参照し、図５と表７に示されたように、９Ｍ２８４と比べて、改造された抗体９Ｍ２８４ＱＬのＦａｂ領域（ＶＨとＶＬを含む）は、変化しないから、長い半減期抗体９Ｍ２８４ＱＬの、ヒトＰＣＳＫ９タンパク質との親和力は、９Ｍ２８４と基本に一致する。親和力が変化しないから、長い半減期のＦｃを改造したＰＣＳＫ９抗体９Ｍ２８４ＱＬ、９Ｍ２８４ＹＴＥと、一般的な半減期の抗体９Ｍ２８４の細胞活性ＬＤＬ吸収実験の比較試験ＥＣ５０も類似し、図６と表８に示された。

〔実施例１０〕
ＰＣＳＫ９モノクローナル候補抗体と異なるＰＣＳＫ９変異タンパク質との結合能
ヒトＰＣＳＫ９タンパク質は、異なる変異体があり、高血脂に関連するヒトＰＣＳＫ９変異体は、多くの種類があると報道され、発明者らが、その中から、Ｒ２１８Ｓ、Ｒ３０６Ｓ、Ｄ３７４Ｈ、Ｄ３７４ＹのヒトＰＣＳＫ９変異体タンパク質を選択し、本発明のＰＣＳＫ９モノクローナル抗体と、異なる変異体ＰＣＳＫ９タンパク質と結合する能力を、ＯｃｔｅｔＲｅｄ９６システム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用し、以上に記載されたように表示した。動力学的分析は、図７と表９に示されたように、Ｒ３０６Ｓ以外に、他のヒトＰＣＳＫ９タンパク質変異体の、本発明のＰＣＳＫ９モノクローナル抗体（正常ＩｇＧと長い半減期のＩｇＧ形式）との親和力は、いずれも天然ヒトＰＣＳＫ９タンパク質と、同じオーダーの大きさであり、ただし、長い半減期のＰＣＳＫ９モノクローナル抗体９Ｍ２８４−ＱＬと、ＰＣＳＫ９Ｒ２１８Ｓタンパク質との結合能は、９Ｍ２８４抗体より３倍に高い。

本出願に言及されている全ての参考文献は、参照として単独に引用されるように、本出願に引用されて、参照になる。理解すべきのは、本発明の上記の開示に基づき、当業者は、本発明を様々な変更または修正を行っても良い、これらの同等の形態も本出願に添付された請求の範囲に規定される範囲内に含まれる。

Claims

軽鎖可変領域と重鎖可変領域を有する結合タンパク質ＭＶ０７２であって、
その重鎖可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：７に示された；
その重鎖可変領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：８又はＳＥＱＩＤＮＯ：１３に示された；
その重鎖可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：９又はＳＥＱＩＤＮＯ：１４に示された；
その軽鎖可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０に示された；
その軽鎖可変領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１に示された；
その軽鎖可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２に示された
ことを特徴とするＰＣＳＫ９特異的結合の結合タンパク質ＭＶ０７２。
（ａ）その重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれに、ＳＥＱＩＤＮＯ：７、ＳＥＱＩＤＮＯ：８、ＳＥＱＩＤＮＯ：９に示された；その軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２に示された；又は
（ｂ）その重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれに、ＳＥＱＩＤＮＯ：７、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４に示された；その軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２に示された
ことを特徴とする請求項１に記載されたＰＣＳＫ９特異的結合の結合タンパク質ＭＶ０７２。
その重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２又はＳＥＱＩＤＮＯ：２４に示され、その軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４又はＳＥＱＩＤＮＯ：２６に示された；又は
その重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：６又はＳＥＱＩＤＮＯ：２８に示され、その軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４又はＳＥＱＩＤＮＯ：２６に示された
ことを特徴とする請求項１また２に記載されたＰＣＳＫ９特異的結合の結合タンパク質ＭＶ０７２。
その重鎖可変領域が、さらにＩｇＧ１Ｆｃと連結することを特徴とする請求項１又は２に記載されたＰＣＳＫ９特異的結合の結合タンパク質ＭＶ０７２。
上記のＩｇＧ１Ｆｃは、ＱＬ変異又はＹＴＥ変異を有する変異体ＩｇＧ１Ｆｃであることを特徴とする請求項４に記載されたＰＣＳＫ９特異的結合の結合タンパク質ＭＶ０７２。
重鎖可変領域と、ＩｇＧ１Ｆｃと連結して得たアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３０又はＳＥＱＩＤＮＯ：３２に示されたことを特徴とする請求項５に記載されたＰＣＳＫ９特異的結合の結合タンパク質ＭＶ０７２。
請求項１〜６にいずれかに記載されたＰＣＳＫ９特異的結合の結合タンパク質ＭＶ０７２をコードする核酸。
請求項７に記載された核酸を含む発現ベクター。
請求項８に記載された発現ベクターを含む、或いはそのゲノムに請求項７に記載された核酸が組み込まれた宿主細胞。
請求項１〜６にいずれか記載されたＰＣＳＫ９特異的結合の結合タンパク質ＭＶ０７２が、ＰＣＳＫ９発現又は活性障害に関連する疾患を診断、治療及び／又は予防する薬品の調製における応用。
上記のＰＣＳＫ９発現又は活性障害に関連する疾患は、高血清コレステロールレベルに関連する病症を含む；より好ましいのは、高コレステロール血症、冠状動脈心臓病、代謝症候群、急性冠動脈症候群を含む請求項１０に記載された応用。
有効量の請求項１〜６にいずれか記載されたＰＣＳＫ９特異的結合の結合タンパク質ＭＶ０７２と；薬学的に許容される担体を含有することを特徴とする薬品組成物。
キットに請求項１〜６にいずれか記載されたＰＣＳＫ９特異的結合の結合タンパク質ＭＶ０７２；又は請求項１２に記載された薬品組成物を含むことを特徴とするＰＣＳＫ９発現又は活性障害に関連する疾患を治療及び／又は予防するためのキット。
請求項１〜６にいずれか記載されたＰＣＳＫ９特異的結合の結合タンパク質ＭＶ０７２、及び検出可能なマーカーを含む；より好ましくは、上記の検出可能なマーカーは、蛍光マーカー、発色マーカーを含むことを特徴とする免疫結合体。
請求項１〜６にいずれか記載されたＰＣＳＫ９特異的結合の結合タンパク質ＭＶ０７２；又は請求項１４に記載された免疫結合体を含むことを特徴とするＰＣＳＫ９レベルの検出に用いられる検出キット。