JP2019524639A - アビジン様タンパク質およびそれらの融合タンパク質を精製する方法 - Google Patents

アビジン様タンパク質およびそれらの融合タンパク質を精製する方法 Download PDF

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Abstract

本発明は概して、ビオチン結合タンパク質（その融合タンパク質および複合体を含む）の精製および単離の方法において使用するための、リポ酸（LA）化合物またはその誘導体を含む分離マトリックスに関する。本明細書に記載された態様は、ビオチン結合タンパク質、例えば、リザビジン（その融合タンパク質および複合体を含む）を、固体支持体に固定されたリポ酸（LA）化合物またはその誘導体を含むマトリックスと可逆的に結合させる方法に関し、本方法において、ビオチン結合タンパク質をマトリックスから脱離させることができ、そのため、タンパク質の変性を最小にしかつタンパク質の精製および単離を最大にしながら、効率的かつ迅速に、温和な条件の下でビオチン結合タンパク質を単離することが可能となる。

Description

発明の分野
本発明は概して、アフィニティクロマトグラフィの領域に関し、より具体的には、ビオチン結合タンパク質（その融合タンパク質および複合体を含む）の精製および単離の方法において使用するためのリポ酸（LA）化合物または誘導体を含む分離マトリックスに関する。本開示は、支持体に固定されたリポ酸またはリポ酸誘導体を効率的に使用し、それによって、短期間で温和な条件の下で効率的に標的材料を単離することを可能にするという利点を有する、前記マトリックスによるビオチン結合タンパク質、例えば、リザビジン（その融合タンパク質および複合体を含む）の分離の方法にも関する。
関連出願の相互参照
本願は、2016年5月4日に出願された米国仮出願第62/331,575号に基づく35 U.S.C.§119（e）による恩典を主張するものであり、その内容は、参照によってその全体が本明細書中に組み入れられる。
発明の背景
アフィニティクロマトグラフィは、関心対象のタンパク質の、ゲルマトリックスのような固相内の標的との優先的な結合に基づき、細胞採取物のような分子の混合物から関心対象のタンパク質を精製することを可能にする。この固相成分は、典型的には、カラムへと成形され、そこに、関心対象のタンパク質を含有している混合物がアプライされる。捕捉工程と呼ばれるこの最初の工程において、関心対象のタンパク質は、固相内の標的と特異的に結合し、混合物中のその他の成分は、カラムを素通りする。
様々な生物学的液体からのアビジンおよびアビジン様タンパク質の迅速で正確な単離または異なる単離の定量的決定の必要性が、医療実務、研究、および診断の手法において継続的に存在する。基本的なストレプトアビジン-ビオチン相互作用技術は、アフィニティクロマトグラフィ、細胞化学、組織化学、病理学的調査、イムノアッセイ、インサイチューハイブリダイゼーション、バイオアフィニティセンサー、および架橋剤において利用されており、ターゲティング、薬物送達、フローサイトメトリー、および細胞学的調査のような、より特異的な技術においても利用されている。
さらに、アビジンまたはストレプトアビジンのようなビオチン結合タンパク質の多段階精製過程の第1段階として、典型的には、アフィニティクロマトグラフィが使用されるが、ビオチン結合タンパク質の、アフィニティクロマトグラフィカラム上のリガンドとの弱いかもしくは強固な結合、またはその他の理由のため、これらのビオチン結合タンパク質を精製するための全てのアフィニティクロマトグラフィマトリックスが、全てのビオチン結合タンパク質にとって効率的または適当であるとは限らない。ビオチン化モエティ、例えば、ビオチンによって標識されたまたはビオチン誘導体によって標識されたタンパク質または細胞を、複雑な粗混合物から捕捉するか、分離するか、または検出するため、ストレプトアビジンもしくはアビジンまたはそれらの修飾型タンパク質を、表面上に容易に固定することができる（例えば、米国出願第2008/0255004号、米国特許第5,395,856号、第5,691,152号（特許文献1〜3）を参照すること）。同様に、ストレプトアビジンタンパク質もしくはアビジンタンパク質のようなビオチン結合タンパク質または同ビオチン結合タンパク質を含有している複合体もしくは融合タンパク質を単離し、捕捉するため、ビオチンまたはビオチン誘導体またはビオチン類似体を、表面上に容易に固定することもできる（例えば、米国出願第2008/0255004号（特許文献1）を参照すること）。
しかしながら、ビオチン-ストレプトアビジン（またはアビジン）連結は、そのようなビオチン結合タンパク質のアフィニティクロマトグラフィ精製のために適当でない、2種の結合パートナーの本質的に不可逆的な結合をもたらす。この高い親和性は、部分的または完全な結合の崩壊を達成するため、刺激性の化学的試薬の使用および複雑な手法、例えば、数分間の高い塩条件での煮沸もしくは94℃に加熱されたホルムアミドおよびEDTAの使用（Tong & Smith,Anal.Chem.64:2672-2677,1992（非特許文献1））または6モルのグアニジンHCl（pH 1.5）を必要とする。従って、ビオチン-ストレプトアビジン連結を逆転させるためのそのような条件の使用は、特に、細胞の完全性を保存しかつ生存可能性もしくは感染性を維持することが重要である場合のタンパク質の精製、もしくは細胞、細菌、およびウイルス等の分離において、またはそのような条件によって精製されたタンパク質の変性が増大するアフィニティクロマトグラフィにとっては、通常望ましくない。さらに、ビオチン-ストレプトアビジン（またはアビジン）連結を使用したアフィニティクロマトグラフィ精製は、典型的には、ビオチンタグ付きのタンパク質および生体分子を単離する方法において、固体支持体に付着したストレプトアビジンまたはアビジン様タンパク質を使用する。
当領域における焦点の多くは、ビオチン-ストレプトアビジン連結を崩壊させるかまたは逆転させる戦略に向けられており（Lee & Vacquier,Anal Biochem.206:206-207,1992、Elgar & Schofield,DNA Sequence 2:219-226,1992、およびConrad & Krupp,Nucleic Acids Res.20:6423-6424,1992（非特許文献2〜4））、アフィニティクロマトグラフィ精製方法を使用したビオチン結合タンパク質の精製の効率を増加させる方法に関しては、ほとんど存在しない。
ストレプトアビジンまたはアビジンに対するビオチンの親和性を低下させる方法には、組換えのまたは化学的に修飾されたストレプトアビジンまたはアビジンの生成が含まれる。WO 01/0597（特許文献4）は、変異体タンパク質が安定的な二量体を生じることを記載している。これらの安定的な二量体は、1時間、37℃で、緩衝液（PBS中の0.5％BSA；0.5％トゥイーン20および1M NaCl）において、0.5mMビオチンで試験された時、可逆的なビオチン結合特性を示す。
米国特許第6,022,951号（特許文献5）も、ビオチンに対する低下した親和性を有する変異型組換えストレプトアビジンを記載しているが、変異型ストレプトアビジンのストレプトアビジン-ビオチン結合を崩壊させるためには、0.1mM〜10mMのビオチンが必要とされる。さらに、溶出は、高いもしくは低いpHで、高い塩で、またはイオン性界面活性剤、解離剤、カオトロピック剤、有機溶媒、プロテアーゼ（プロテアーゼK）の存在下で、少なくとも1時間、実施されなければならず、そのことは、単離されたタンパク質のタンパク質変性のリスクの増加をもたらす。
米国特許第6,391,571号；第6,312,916号；および第6,417,331号（特許文献6〜8）は、ビオチンに対する低下した結合親和性を有するアビジンおよびストレプトアビジンのムテインを記載しているが、これらのムテインがSpherosil-NH2カラムに付着している時、ビオチン化化合物を溶出させるためには、50mM酢酸アンモニウム（pH 3.0）を含む溶出緩衝液もしくは/およびイミノビオチンもしくはビオチンの9〜10mMの勾配、またはPBS緩衝液（pH 7.2）を含む溶出緩衝液およびビオチンの0〜10mMの勾配が必要とされる。
ストレプトアビジンに対する結合活性を有するペプチドの他の報告が存在する。米国特許第5,506,121号（特許文献9）は、1mMイミノビオチンまたは5mMリポ酸の溶液を使用してストレプトアビジンアガロースカラムから溶出させることができる、そのようなペプチド（Strepタグ）の生成を記載している。米国特許第6,103,493号（特許文献10）は、アフィニティクロマトグラフィカラムに付着させることができるストレプトアビジンムテインを記載しており、ここでは2.5mMの濃度で各10mlのジアミノビオチン、デスチオビオチン、およびビオチンを適用することにより、ストレプトアビジン結合ペプチドを段階的に、他のストレプトアビジンリガンド、例えば、ビオチン、イミノビオチン、リポ酸、デスチオビオチン、ジアミノビオチン、HABA（ヒドロキシアゾベンゼン-安息香酸）、または/およびジメチル-HABAによって、競合的に溶出させる。
従って、単独で存在する時、またはビオチン含有複合体もしくはビオチン誘導体複合体の一部として存在する時、ストレプトアビジンおよびアビジンのようなビオチン結合タンパク質を効率的に単離する多くの方法が存在するが、そのような方法は、他のアビジン以外またはストレプトアビジン以外のビオチン結合タンパク質を単離するためには効率的でないかまたは有効でない。Hisタグおよびその他のタンパク質精製タグは、タンパク質を単離するために使用され得るが、これらは、GMP適合タンパク質精製または臨床グレードタンパク質精製のためには適当でない。GMP適合のタンパク質の作製および精製のための典型的な精製法には、サイズ排除、沈殿（例えば、硫酸アルミニウム等の使用）が含まれ、精製すべき特定のタンパク質に合わせた時間のかかる最適化が必要とされる。従って、そのような方法は、一連の融合タンパク質のGMP精製のため、効率的でなく、容易に適合可能でなく、適当でない。
従って、GMP適合タンパク質精製を含む、他のビオチン結合タンパク質の容易な単離のための方法およびシステムが、当技術分野において必要とされている。現在までになされた進歩にも関わらず、他のビオチン結合タンパク質の選択的な単離および放出のための新しい改善された方法の必要性が、未だに存在する。ビオチンとストレプトアビジンまたはアビジンとの間の可逆的結合のための以前に報告された方法は、いずれも、ビオチンと、異なるビオチン結合タンパク質（即ち、ストレプトアビジンまたはアビジンでないビオチン結合タンパク質）との間の可逆的結合において使用するためには最適でなく効率的でない。従って、他のビオチン結合タンパク質（即ち、ストレプトアビジンまたはアビジンでないビオチン結合タンパク質）を可逆的に確実に単離する代替的な方法、ならびに比例して小さく低コストのカラムの使用、および少ないその後の精製工程を可能にする、一連のビオチン結合タンパク質を濃縮するための修飾されたアフィニティクロマトグラフィ法が、当技術分野において継続的に必要とされている。
米国出願第2008/0255004号 米国特許第5,395,856号 米国特許第5,691,152号 WO 01/0597 米国特許第6,022,951号 米国特許第6,391,571号 米国特許第6,312,916号 米国特許第6,417,331号 米国特許第5,506,121号 米国特許第6,103,493号
Tong & Smith,Anal.Chem.64:2672-2677,1992 Lee & Vacquier,Anal Biochem.206:206-207,1992 Elgar & Schofield,DNA Sequence 2:219-226,1992 Conrad & Krupp,Nucleic Acids Res.20:6423-6424,1992
本明細書中の開示は概して、ビオチン結合ドメインのようなビオチン結合タンパク質の効率的で頑強なアフィニティクロマトグラフィ（本明細書中でアフィニティ分離とも呼ばれる）のための方法、組成物、およびキット、ならびにそのようなアフィニティクロマトグラフィのためのマトリックスおよび洗浄方法を提供する。
リザビジンタンパク質またはその融合タンパク質もしくは複合体のようなビオチン結合タンパク質のための多段階精製過程の第1段階として、しばしば、アフィニティクロマトグラフィが使用され、アフィニティクロマトグラフィ後のリザビジンタンパク質またはその融合タンパク質もしくは複合体のようなビオチン結合ドメインの純度は、その後の精製工程の種類および数に顕著に影響を及ぼす。アフィニティクロマトグラフィの別の重要な役割は、生成物を濃縮することであり、それは、その後の精製工程において、比例して小さく低コストのカラムを使用することを可能にする。従って、アフィニティクロマトグラフィ工程における不純物の除去を最適化することは、特に重要である。
本明細書中に開示されるように、本発明者らは、アフィニティクロマトグラフィ精製において使用するため、リザビジンの数種のリガンド（例えば、ビオチンおよびビオチン誘導体）との結合を評価した。リザビジンはビオチンおよびその他のビオチン関連またはビオチン誘導体と結合することが公知であるが、本発明者らは、驚くべきことに、ストレプトアビジンと高い親和性で結合するビオチン誘導体HABA（ヒドロキシアゾベンゼン-安息香酸）またはジメチル-HABAが、リザビジンと結合しないことを発見した。従って、本発明者らは、驚くべきことに、リザビジンおよびストレプトアビジンは類似しているが、ストレプトアビジンと結合するリガンドが必ずしもリザビジンと結合しないことを発見した。本発明者らは、HABAまたはジメチル-HABA（即ち、ストレプトアビジンと結合するビオチン誘導体）を含むアフィニティカムが、リザビジンの精製には有効でないことも証明した。さらに、本発明者らは、驚くべきことに、リポ酸のみが、リザビジンタンパク質またはリザビジン含有融合タンパク質の効率的な精製のために有効であることを発見した。
従って、一つの局面において、本明細書中の本開示は、関心対象のビオチン結合タンパク質が結合するリポ酸（LA）化合物を含むアフィニティクロマトグラフィ（AC）マトリックスを使用して、精製された関心対象のビオチン結合タンパク質、例えば、ビオチン結合ドメインを作製する方法を提供し、本法は、（i）リポ酸（LA）化合物を含むマトリックス（本明細書中で「LAマトリックス」と呼ばれる）を、関心対象のビオチン結合タンパク質を含む溶液と接触させる工程、（ii）未結合のタンパク質を除去するため、LAマトリックスを洗浄する工程、および（iii）LAマトリックスに結合したビオチン結合タンパク質を、本明細書中に開示される1種または複数種の洗浄溶液によって溶出させる工程を含む。いくつかの態様において、1種または複数種の洗浄溶液による洗浄の前に、関心対象のビオチン結合タンパク質をLAマトリックスにロードし、具体的には、LAマトリックスから不純物を除去するため、1種または複数種の洗浄溶液によって洗浄した後に、関心対象のタンパク質をLAマトリックスから溶出させる。
従って、本明細書中の本開示は、例えば、リザビジンタンパク質、またはリザビジンタンパク質を含むタンパク質、例えば、リザビジンタンパク質を含む融合タンパク質もしくは複合体のような、ビオチン結合タンパク質を単離するための、固体支持体の表面上に固定されたリポ酸（LA）化合物を含む、方法、キット、および組成物に関する。いくつかの態様において、リポ酸（LA）化合物は、第2のモエティ、例えば抗体またはビーズに付着しており、いくつかの態様において、抗体またはビーズは、固体支持体に付着していてよい。従って、本明細書中に開示される方法、組成物、およびキットは、以下に限定されるわけではないが、例えば、リザビジンタンパク質、またはリザビジンタンパク質を含む融合タンパク質もしくは複合体のような、リザビジンタンパク質を含むタンパク質のような、ビオチン結合タンパク質、例えば、ビオチン結合ドメインの、混合物中の成分の残りからの分離および単離を可能にする。
従って、本明細書中の本開示の一つの局面は、リザビジンタンパク質またはリザビジンタンパク質を含む融合タンパク質と、支持体を接触させる工程を含む、リザビジンタンパク質またはリザビジンタンパク質を含む融合タンパク質の、固体支持体の表面上にリポ酸（LA）化合物を含む固体支持体への可逆的な固定に関する。いくつかの態様において、リザビジンタンパク質またはその融合タンパク質は、5.5〜9.0のpHを有する溶液または1M NaClを含む溶液において、固体支持体と接触するかまたは結合する。いくつかの態様において、方法は、固定されたリザビジンタンパク質またはリザビジンタンパク質融合タンパク質を含む固体支持体を、1〜10mg/mlのリポ酸（LA）化合物を含む溶出緩衝液と接触させて、固体支持体からリザビジンタンパク質またはその融合タンパク質を放出させる工程をさらに含む。
本明細書中の本開示の別の局面は、以下の工程を含む、固体支持体によってリザビジンタンパク質またはリザビジンタンパク質を含む融合タンパク質を精製する方法に関する：（i）固体支持体の表面上にリポ酸（LA）化合物を含む固体支持体を、リザビジンタンパク質またはリザビジンタンパク質を含む融合タンパク質を含む溶液と接触させる工程；（ii）リザビジンタンパク質またはリザビジンタンパク質を含む融合タンパク質がリポ酸（LA）化合物と結合することを可能にするために十分な量の時間、インキュベートする工程；（iii）未結合のリザビジンタンパク質またはリザビジンタンパク質を含む融合タンパク質を除去するため、固体支持体の表面上にリポ酸（LA）化合物を含む固体支持体を、洗浄溶液によって洗浄する工程；（iv）固定されたリザビジンタンパク質またはリザビジンタンパク質融合タンパク質を含む固体支持体を、1〜10mg/mlのリポ酸（LA）を含む溶出緩衝液と接触させ、固体支持体から放出されたリザビジンタンパク質または融合タンパク質を含む溶出緩衝液の部分を、固体支持体から放出されたリザビジンタンパク質または融合タンパク質を含まない溶出緩衝液の部分から分離する工程；および（iv）リザビジンタンパク質またはその融合タンパク質を含む溶出緩衝液の部分を収集する工程。
いくつかの態様において、リザビジンタンパク質またはその融合タンパク質を固体支持体へ可逆的に固定する方法、またはリザビジンタンパク質またはその融合タンパク質を精製する方法は、固定されたリザビジンタンパク質またはリザビジンタンパク質融合タンパク質を含む固体支持体を、1〜10mg/mlのリポ酸（LA）化合物を含む溶出緩衝液と接触させて、リザビジンタンパク質またはその融合タンパク質を固体支持体から放出させることによって、リザビジンタンパク質またはリザビジンタンパク質融合タンパク質を固体支持体から溶出させる工程をさらに含む。
本明細書中に記載された全ての局面において、リポ酸（LA）化合物を含む固体支持体と接触するリザビジンタンパク質またはその融合タンパク質を含む溶液は、5.5〜9.0のpHを有するか、または1M NaClを含む。本明細書中に記載された全ての局面において、リザビジンタンパク質またはその融合タンパク質を溶出させるための溶出緩衝液は、リザビジンタンパク質またはその融合タンパク質を固体支持体から放出させるため、1.0〜10mg/mlのリポ酸（LA）化合物を含む。
本発明の別の局面は、例えば、固体支持体と、リポ酸化合物と、リザビジンタンパク質またはリザビジン融合タンパク質とを含む組成物に関し、ここでリポ酸化合物は固体支持体に付着しており、リザビジンタンパク質またはリザビジン融合タンパク質は、SEQ ID NO:1のアミノ酸またはSEQ ID NO:1と少なくとも80％の配列同一性を有するタンパク質を少なくとも含み、かつリポ酸化合物に結合している。
いくつかの態様において、組成物は、5.5〜9.0のpHおよび/または1M NaClを有する緩衝溶液をさらに含む。いくつかの態様において、組成物は、アフィニティクロマトグラフィカラムとして構成され、ここでは例えば、上部の入口および下部の出口を有するカラムの形の容器が、固体支持体と、リポ酸化合物と、リザビジンタンパク質またはリザビジン融合タンパク質とを含む。
本発明の別の局面は、固体支持体と、リポ酸化合物と、リザビジンタンパク質またはリザビジン融合タンパク質とを含む組成物を含むアフィニティクロマトグラフィカラムに関し、ここでリポ酸化合物は、固体支持体に付着しており、リザビジンタンパク質またはリザビジン融合タンパク質は、SEQ ID NO:1のアミノ酸またはSEQ ID NO:1と少なくとも80％の配列同一性を有するタンパク質を少なくとも含み、かつリポ酸化合物に結合している。
本発明の別の局面は、固体支持体と固体支持体に付着したリポ酸化合物とを含むLA樹脂を含むアフィニティクロマトグラフィカラムに関する。
本発明の別の局面は、（a）固体支持体への架橋のために活性化されたリポ酸化合物を含む溶液と、固体支持体を接触させ、リポ酸化合物の固体支持体への架橋を可能にするために十分な量の時間、インキュベートする工程；および（b）工程（a）において添加された溶液を除去するかまたは固体支持体および架橋されたリポ酸化合物を新しい精製カラムへ移す工程を含む、リポ酸樹脂（LA樹脂）を作製する方法に関する。いくつかの態様において、架橋のために活性化され、工程（a）において使用されるリポ酸化合物を含む溶液は、スルホ-NHS（N-ヒドロキシスルホスクシンイミド）およびEDCを含み、任意で、pH 7.0であってよい。
本発明の別の局面は、固体支持体および架橋されたリポ酸化合物が精製カラム（例えば、アフィニティクロマトグラフィカラム）内に存在する、本明細書中に開示される方法のいずれかによって作製されたアフィニティクロマトグラフィカラムに関する。
本明細書中に記載された全ての局面において、精製および/または単離のためのリザビジンタンパク質は、SEQ ID NO:1のアミノ酸またはSEQ ID NO:1と少なくとも80％の配列同一性を有するタンパク質を含む。
いくつかの態様において、固体支持体は、プラスチック、ガラス、セラミックス、シリコーン、金属、セルロース、膜、およびゲルからなる群より選択され、例えば、SEPHAROSE（商標）ビーズまたは類似のそのようなビーズ、例えばアガロースのような、粒子または磁性粒子であり得る。いくつかの態様において、固体支持体は、粒子、シート、ディップスティック、ゲル、フィルター、膜、マイクロファイバーストリップ、バイオチップ、チューブ、ウェル、プレート、ファイバーまたはキャピラリー、コーム、ピペットチップ、マイクロアレイのいずれかの形態にある。さらなる態様において、固体支持体が、アガロース、SEPHAROSE（商標）、セルロース、ニトロセルロース、アルギン酸、テフロン（登録商標）、ラテックス、アクリルアミド、ナイロン膜、プラスチック、ポリスチレン、ガラス、またはシリカ、または金属からなる群より選択されるポリマー材料である、請求項27〜35のいずれか一項記載の組成物。
いくつかの態様において、リポ酸化合物は、共有結合を介して直接的に固体支持体に結合しているかもしくは連結されており、あるいはタンパク質リンカー、ペプチド、核酸、オリゴ糖、糖タンパク質、もしくは架橋試薬を介して間接的に固体支持体に連結されていてもよい。
いくつかの態様において、リポ酸化合物は、リポ酸またはα-リポ酸（ALA）であり、ラセミリポ酸または鏡像異性的に純粋なもしくは鏡像異性的に濃縮されたR(+)-α-リポ酸もしくはS-(-)-α-リポ酸であり得る。いくつかの態様において、リポ酸化合物は、例えば、以下に限定されるわけではないが、リポイルピリドキサミン、リポイルピリドキサミン塩酸塩、リポイルピリドキサミン臭化水素酸塩、リポイルピリドキサミンメタンスルホン酸、リポイルピリドキサミンp-トルエンスルホン酸、1,2-ジチオラン類似体、ジエトキシカルボニル化リポ酸、6,8-ビスアセチルメルカプトオクタン酸（ビスアセチルリポ酸）、6,8-ビスベンゾイルメルカプトオクタン酸（ビスベンゾイルリポ酸）、8-アセチルメルカプト-6-メルカプトオクタン酸（モノアセチルリポエート）、6,8-ビスカルバモイルメチルメルカプトオクタン酸、6,8-ビス-[S-(N-メチルスクシンイミド)]メルカプトオクタン酸からなる群より選択されるリポ酸誘導体である。
本発明の別の局面は、（i）固体支持体に付着したリポ酸化合物と、（ii）固定されたリザビジンタンパク質またはリザビジンタンパク質を含む融合タンパク質を、固体支持体に付着したリポ酸化合物から取り出すための少なくとも1種の試薬とを含むキットに関する。いくつかの態様において、キットは、リザビジン融合タンパク質の発現のための核酸配列を含む発現ベクターをさらに含んでいてもよく、核酸配列は、（i）SEQ ID NO:1を含むリザビジンタンパク質またはSEQ ID NO:1と少なくとも80％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸配列、および（ii）リザビジンタンパク質と融合すべき関心対象のタンパク質をコードする核酸配列の挿入のための多重挿入部位（MIS）を含む核酸を含む。いくつかの態様において、核酸は、関心対象のタンパク質がリザビジンタンパク質のN末端にくるよう、SEQ ID NO:1を含むリザビジンタンパク質またはSEQ ID NO:1と少なくとも80％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸配列の5'に、多重挿入部位（MIS）を含んでいてよい。別の態様において、核酸は、関心対象のタンパク質がリザビジンタンパク質のC末端にくるよう、SEQ ID NO:1を含むリザビジンタンパク質またはSEQ ID NO:1と少なくとも80％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸配列の3'に、多重挿入部位（MIS）を含む。いくつかの態様において、発現ベクターは、SEQ ID NO:1を含むリザビジンタンパク質またはSEQ ID NO:1と少なくとも80％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸配列の5'に、脂質付加配列を含む核酸配列をさらに含む。いくつかの態様において、発現ベクターは、SEQ ID NO:1を含むリザビジンタンパク質またはSEQ ID NO:1と少なくとも80％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸配列と、多重挿入部位（MIS）を含む核酸との間に、リンカーペプチドを含む核酸配列をさらに含む。いくつかの態様において、関心対象のタンパク質は、抗原性ペプチドまたは抗原ポリペプチドである。
Hisタグ付きタンパク質を精製するためのNi-NTA樹脂または本明細書中に記載されるリポ酸（LA）樹脂のいずれかによる、SEQ ID NO:1を含むHisタグ付きリザビジンタンパク質の精製を示す。レーン9は、（レーン4における）Ni-NTA樹脂とのHisの結合を使用して精製されたHisタグ付きリザビジンタンパク質と同程度に効率的に、類似のまたはより大きい収率で、Hisタグ付きリザビジンタンパク質を精製し単離するため、LA樹脂が使用され得ることを示す。 リポ酸（LA）樹脂を使用して精製されたリザビジンが、リザビジン上のHisタグと結合するNi-NTA樹脂から精製されたものと同様に、サイズ排除カラムによって決定されたように、溶液中で二量体であることを示す。 リポ酸（LA）樹脂を使用して精製されたリザビジンが、ビオチン化デキストランとMAPS複合体を形成し得ることを示す。レーン2および3は、煮沸しない場合またはする場合のSDSゲル上でのNi-NTA樹脂から精製されたリザビジンの位置を示した。レーン4は、Ni-NTA樹脂によって精製されたリザビジンが、100℃で煮沸しない場合には、ビオチン化デキストランとの複合体を未だ形成していることを示したが、煮沸条件下では、リザビジンが複合体から放出される（レーン5）。レーン6および7は、リポ酸樹脂によって精製されたリザビジンが、SDSゲル上で、Ni-NTA樹脂によって精製されたリザビジンと類似の移動度を示すことを示した。レーン8（非煮沸）および9（煮沸）は、リポ酸樹脂によって精製されたリザビジンが、ビオチン化デキストランと複合体を形成し、その複合体が、Ni-NTA樹脂によって精製されたリザビジンおよびビオチン化デキストランによって作製されたものと同じ挙動を示すことを示した。 LA樹脂を使用した、Hisタグを欠くリザビジン-1500-0785の融合タンパク質（即ち、肺炎球菌タンパク質SP 1500および/またはSP 0785より選択される肺炎球菌抗原に融合した、SEQ ID NO:1を含むリザビジンタンパク質）の精製を示す。融合タンパク質は、溶出液試料1〜3（レーン5〜7）に溶出する。 リポ酸（LA）樹脂を使用して精製されたHisタグなしリザビジン-1500-0785融合タンパク質が、リザビジン-1500-0785上のHisタグと結合するNi-NTA樹脂を使用して精製された二量体と類似して、サイズ排除カラムによって決定されたように、溶液中で二量体であることを示す。
詳細な説明
本明細書中に開示されるように、本発明の一つの局面は、ビオチン結合タンパク質のようなビオチン結合ドメインの効率的で頑強なアフィニティクロマトグラフィのための方法、キット、および組成物、ならびにそのようなアフィニティクロマトグラフィのためのリポ酸マトリックスに関する。いくつかの態様において、方法は、関心対象のビオチン結合タンパク質、例えば、リザビジンタンパク質またはその融合タンパク質もしくは複合体の精製に関する。
従って、本発明の一つの局面は、例えば、リザビジンタンパク質またはリザビジンタンパク質を含むタンパク質、例えば、リザビジンタンパク質を含む融合タンパク質もしくは複合体のようなビオチン結合タンパク質を単離するための、固体支持体の表面上に固定されたリポ酸（LA）化合物を含む固体支持体に関する。いくつかの態様において、リポ酸（LA）化合物は、第2のモエティ、例えば、抗体またはビーズに付着しており、いくつかの態様において、抗体またはビーズは、固体支持体に付着していてよい。従って、本明細書中に開示される方法、組成物、およびキットは、以下に限定されるわけではないが、リザビジンタンパク質、または、例えば、リザビジンタンパク質を含む融合タンパク質もしくは複合体のようなリザビジンタンパク質を含むタンパク質のような、ビオチン結合タンパク質、例えば、ビオチン結合ドメインの、混合物中の成分の残りからの分離および単離を可能にする。
本発明の一つの局面は、リザビジンタンパク質またはリザビジンタンパク質を含む融合タンパク質を、固体支持体上に固定されたリポ酸（LA）化合物と接触させ、それによって、リザビジンタンパク質またはリザビジンタンパク質を含む融合タンパク質を支持体へ固定する工程を含む、リザビジンタンパク質またはリザビジンタンパク質を含む融合タンパク質を支持体へ可逆的に固定する方法に関する。
いくつかの態様において、リザビジンタンパク質またはリザビジンタンパク質を含む融合タンパク質は、7.5〜9.0のpHを有する緩衝液、例えば、ローディングバッファーにおいて、固体支持体上に固定されたリポ酸（LA）化合物を含む支持体にロードされる。従って、いくつかの態様において、リザビジンタンパク質またはリザビジンタンパク質を含む融合タンパク質は、7.5〜9.0のpHを有する溶液において固体支持体と接触し、例えば、溶液のpHは、約pH 7.5または約pH 7.9または約pH 8.0または約pH 8.2または約pH 8.5または約pH 8.7または約pH 9.0またはpH 7.5〜9.0のいずれかである。いくつかの態様において、溶液は溶出緩衝液である。
いくつかの態様において、リザビジンタンパク質またはリザビジンタンパク質を含む融合タンパク質を、固定されたリポ酸（LA）化合物を含む支持体から取り出すため、支持体を、8.0〜9.5のpHを有する溶出緩衝液と接触させる。従って、いくつかの態様において、本明細書中に開示される方法は、付着したリザビジンタンパク質またはリザビジンタンパク質を含む融合タンパク質も含む固体支持体上に固定されたリポ酸（LA）化合物を、8.0〜9.5のpHを有する溶出緩衝液と接触させる工程をさらに含む。いくつかの態様において、本明細書中に開示される方法において使用するための溶出緩衝液は、約pH 7.9または約pH 8.0または約pH 8.25または約pH 8.5または約pH 8.75または約pH 9.0または約pH 9.25または約pH 9.5のpHを有する。いくつかの態様において、溶出緩衝液は、20mMトリス、1M NaCl、5％エタノールの中に、リポ酸、例えば、2.5mg/mlのLAを含む。いくつかの態様において、溶出緩衝液は、ビオチン結合タンパク質またはビオチン結合ドメインを含むタンパク質、例えば、リザビジンタンパク質またはリザビジンタンパク質を含む融合タンパク質を、リポ酸化合物から放出させ、それによって、リザビジンタンパク質またはその融合タンパク質を溶出緩衝液へ単離するよう機能する。
固体支持体上に固定されたリポ酸（即ち、LAマトリックス）の使用と、特定の洗浄緩衝液とのこの組み合わせは、結合したビオチン結合タンパク質を損なうことなく、回収に影響することなく、一般的に使用される手法より非常に多くの不純物を除去する。さらに、開示された溶出の条件および緩衝液は、関心対象のビオチン結合タンパク質の溶出液中のより高い濃度と相関する、より鋭い溶出ピークをもたらし、そのことは、付加的な下流の精製過程の性能を増加させるために有利である。
宿主細胞タンパク質（HCP）ならびに高分子量（HMW）種および低分子量（LMW）種のような生成物関連不純物を含む不純物の効率的な除去は、関心対象のビオチン結合タンパク質の下流処理における重大な因子である。アフィニティクロマトグラフィは、しばしば、ビオチン結合タンパク質の多段階精製過程の第1段階として使用され、アフィニティクロマトグラフィ後の関心対象のビオチン結合タンパク質の純度は、その後の精製工程の種類および数に顕著に影響を及ぼす。アフィニティクロマトグラフィの別の重要な役割は、生成物を濃縮することであり、それは、その後の精製工程において、比例して小さく低コストのカラムを使用することを可能にする。従って、アフィニティクロマトグラフィ工程における不純物の除去を最適化することは、特に重要である。
低いpH条件、典型的には、pH 3〜4は、アビジンまたはストレプトアビジンをビオチンアフィニティマトリックスまたはビオチン誘導体アフィニティマトリックスから溶出させるための必要条件であり、アビジンもしくはストレプトアビジンを変性させかつ/または凝集を誘導する可能性があるという欠点を有する。従って、本明細書中に開示されるいくつかの態様において、洗浄工程および溶出工程は、pH 7.5またはpH 8.0を超える高いpHで実施され、これらのpHは、不純物の除去を可能にしながらLAマトリックスに結合している時、およびビオチン結合タンパク質をLAマトリックスから溶出させる時、ビオチン結合タンパク質のネイティブのタンパク質コンフォメーションならびにタンパク質の二次構成および三次構成を保存する。
いくつかの態様において、ビオチン結合タンパク質は、ビオチン結合ドメインを含む。いくつかの態様において、ビオチン結合タンパク質は、リザビジンタンパク質、例えば、SEQ ID NO:1のアミノ酸と少なくとも85％または少なくとも87％または少なくとも89％または少なくとも90％の配列同一性を含むリザビジンタンパク質である。
いくつかの態様において、ビオチン結合タンパク質は、リザビジンタンパク質を含み、かつリザビジンタンパク質のN末端および/またはC末端に位置する付加的なタンパク質を含む融合タンパク質、例えば、SEQ ID NO:1のアミノ酸と少なくとも85％または少なくとも87％または少なくとも89％または少なくとも90％の配列同一性を含むリザビジンタンパク質を含む融合タンパク質である。
本明細書中に開示される方法のいくつかの態様において、リポ酸が表面に固定される固体支持体は、プラスチック、ガラス、セラミックス、シリコーン、金属、セルロース、ビーズ、膜、およびゲル、またはアフィニティクロマトグラフィにおいて有用な当業者に公知の任意の表面からなる群より選択される。いくつかの態様において、固体支持体は、粒子または磁性粒子またはSEPHAROSE（商標）ビーズである。
本明細書中に開示される全ての局面のいくつかの態様において、リポ酸化合物は、間接的に、例えば、タンパク質リンカー、ペプチド、核酸、オリゴ糖、糖タンパク質等を介して、固体支持体に結合しているかまたは連結されている。いくつかの態様において、リポ酸化合物は、当業者に一般的に公知の方法によって、架橋を介して、固体支持体に結合しているかまたは連結されている。
いくつかの態様において、本明細書中に開示される方法、組成物、およびキットにおいて使用するためのリポ酸化合物は、リポ酸またはα-リポ酸（ALA）、例えば、ラセミリポ酸または鏡像異性的に純粋なもしくは鏡像異性的に濃縮されたR(+)-α-リポ酸もしくはS-(-)-α-リポ酸である。いくつかの態様において、本明細書中に開示される方法、組成物、およびキットにおいて使用するためのリポ酸化合物は、リポ酸誘導体、例えば、リポイルピリドキサミン、リポイルピリドキサミン塩酸塩、リポイルピリドキサミン臭化水素酸塩、リポイルピリドキサミンメタンスルホン酸、リポイルピリドキサミンp-トルエンスルホン酸、1,2-ジチオラン類似体、ジエトキシカルボニル化リポ酸、6,8-ビスアセチルメルカプトオクタン酸（ビスアセチルリポ酸）、6,8-ビスベンゾイルメルカプトオクタン酸（ビスベンゾイルリポ酸）、8-アセチルメルカプト-6-メルカプトオクタン酸（モノアセチルリポエート）、6,8-ビスカルバモイルメチルメルカプトオクタン酸、または参照によってその全体が本明細書に組み入れられる米国特許第6,331,559号に開示されたようなその他のリポ酸誘導体である。
本発明の別の局面は、（i）固体支持体に付着したリポ酸化合物と、（ii）固定されたリザビジンタンパク質またはリザビジンタンパク質を含む融合タンパク質を、固体支持体に付着したリポ酸化合物から取り出すための少なくとも1種の試薬とを含むキットに関する。いくつかの態様において、固定されたリザビジンタンパク質を取り出すための試薬は、本明細書中に開示されるリポ酸化合物、またはリポ酸の競合的阻害剤、例えば、ビオチンもしくはビオチン誘導体を含む溶出緩衝液である。
いくつかの態様において、本明細書中に開示されるキットは、リザビジン融合タンパク質の発現のための核酸配列を含む発現ベクターをさらに含んでいてよく、核酸配列は（i）SEQ ID NO:1を少なくとも含むリザビジンタンパク質またはSEQ ID NO:1と少なくとも80％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸配列、および（ii）リザビジンタンパク質と融合すべき関心対象のタンパク質をコードする核酸配列の挿入のための多重挿入部位（MIS）を含む核酸を含む。いくつかの態様において、関心対象のタンパク質がリザビジンタンパク質のN末端にくるよう、多重挿入部位（MIS）を含む核酸は、SEQ ID NO:1を含むリザビジンタンパク質またはSEQ ID NO:1と少なくとも80％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸配列の5'にある。
いくつかの態様において、発現ベクターは、関心対象のタンパク質がリザビジンタンパク質のC末端にくるよう、SEQ ID NO:1を含むリザビジンタンパク質またはSEQ ID NO:1と少なくとも80％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸配列の3'または5'に位置する多重挿入部位（MIS）を含む。いくつかの態様において、発現ベクターは、任意で、SEQ ID NO:1を含むリザビジンタンパク質またはSEQ ID NO:1と少なくとも80％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸配列と、多重挿入部位（MIS）を含む核酸との間に、リンカーペプチドを含む核酸配列をさらに含む。
いくつかの態様において、キットは、本明細書中に開示される抗原性ペプチドまたは抗原ポリペプチドと融合した、SEQ ID NO:1と少なくとも80％の配列同一性を有するリザビジンタンパク質を含むリザビジン融合タンパク質を生成するための発現ベクターを含む。
定義
便宜のため、（明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲を含む）本願全体において利用されるいくつかの用語を、ここに収集する。そうでないことが定義されない限り、本明細書中で使用される技術用語および科学用語は、全て、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
「アフィニティ分離」という用語は、本明細書中で使用されるように、混合物または懸濁物からの成分の分離、精製、取り出し、富化、および/または濃縮の方法をさす。
「融合タンパク質」という用語は、本明細書中で使用されるように、1個の要素が、ビオチン結合タンパク質であり、少なくとも第2の要素が、例えば、タンパク質抗原のようなタンパク質またはその他の抗原である、少なくとも2種の要素を有するタンパク質を意味する。
「機能性誘導体」および「模倣体」という用語は、交換可能に使用され、機能性誘導体の元の実体または分子の生物学的活性に実質的に類似している生物学的活性（機能的または構造的）を保有する化合物をさす。機能性誘導体という用語には、分子の断片、バリアント、類似体、または化学的誘導体が含まれるものとする。
一般に、ビオチン結合タンパク質は、ビオチン結合ドメインを含む。本明細書中で使用されるように、「ビオチン結合ドメイン」とは、ビオチンと結合するポリペプチド配列をさす。完全なビオチン結合タンパク質を、ビオチン結合ドメインとして使用してもよいが、いくつかの態様において、タンパク質のビオチン結合部分のみを使用してもよい。いくつかの態様において、ビオチン結合ドメインは、リザビジン由来である。
「ビオチン結合」化合物という用語には、本明細書中で使用されるように、強固に、しかし非共有結合的に、ビオチンまたはビオチン誘導体と結合することができる化合物またはタンパク質が包含されるものとする。いくつかの態様において、ビオチン結合化合物は、リザビジンまたはその断片である。いくつかの態様において、ビオチン結合化合物は、リザビジンまたはその断片を含む融合タンパク質または複合体の一部である、リザビジンまたはその断片である。
「リザビジン」という用語は、本明細書中で使用されるように、以下のようなリザビジンの野生型アミノ酸配列をさす：
Figure 2019524639
いくつかの態様において、ビオチン結合タンパク質は、SEQ ID NO:4のN末端アミノ酸1〜44を欠く、即ち、SEQ ID NO:4の野生型リザビジンのアミノ酸
Figure 2019524639
を欠くリザビジンの断片である。いくつかの態様において、ビオチン結合タンパク質は、
Figure 2019524639
のアミノ酸配列を含むリザビジンの断片である。
「リポ酸」および「αリポ酸」または「α-リポ酸」という用語は、本明細書中で交換可能に使用され、いずれも、チオクト酸としても公知の1,2-ジチオン-3-ペンタン酸または1,2-ジチアシクロペンタン-3-吉草酸をさす。
Figure 2019524639
「アビジン」という用語は、本明細書中で使用されるように、ネイティブの卵白糖タンパク質アビジンをさし、アビジンの脱グリコシル型または組換え型のような、その誘導体または等価物、例えば、N-アシルアビジン、例えば、N-アセチルアビジン、N-フタリルアビジン、およびN-サクシニルアビジン、ならびに市販の生成物ExtrAvidin、Neutralite Avidin、およびCaptAvidinもさす。
「ストレプトアビジン」という用語は、本明細書中で使用されるように、ストレプトマイセス（Streptomyces）、例えば、ストレプトマイセス・アビジニー（avidinii）の選択された株によって産生される細菌ストレプトアビジンをさし、例えば、「コア」ストレプトアビジンのような、組換えストレプトアビジンおよび短縮型ストレプトアビジンのようなその誘導体または等価物もさす。
「ビオチン」という用語は、本明細書中で使用されるように、ビオチン（シス-ヘキサヒドロ-2オキソ-1H-チエノ[3,4]イミダゾール-4-ペンタン酸）ならびに任意のビオチン誘導体および類似体をさすものとする。そのような誘導体および類似体は、ネイティブまたは修飾型のストレプトアビジンまたはアビジンのビオチン結合ポケットと複合体を形成する物質である。そのような化合物には、例えば、イミノビオチン、デスチオビオチン、およびストレプトアビジンアフィニティペプチドが含まれ、ビオチン-ε-N-リジン、ビオサイチンヒドラジド、2-イミノビオチンのアミノ誘導体またはスルフヒドリル誘導体、およびビオチニル-ε-アミノカプロン酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルホ-スクシンイミド-イミノビオチン、ビオチンブロモアセチルヒドラジド、p-ジアゾベンゾイルビオサイチン、3-(N-マレイミドプロピオニル)ビオサイチンも含まれる。いくつかの態様において、ビオチンの誘導体は、デスチオビオサイチン、またはMolecular Probes（Eugene,Oreg.,USA）から市販されているその誘導体DSB-X Biotin（製品番号D20658）である（参照によってその全体が本明細書中に組み入れられる米国特許出願US 2008/025504を参照すること）。
「ビオチン化物質」または「ビオチン化モエティ」という用語は、他のモエティが修飾型ビオチンまたはビオチン類似体に共有結合的に連結されている、生体分子、例えば、核酸分子（一本鎖または二本鎖のDNA、RNA、DNA/RNAキメラ分子、核酸類似体、およびヌクレオチド配列を含有しているかまたは取り込んでいる分子、例えば、ペプチド核酸（PNA）、またはそれらの修飾を含む）、タンパク質（糖タンパク質、酵素、ペプチドライブラリーまたはディスプレイ生成物および抗体またはそれらの誘導体を含む）、ペプチド、炭水化物または多糖、脂質等のような他のモエティとの、修飾型ビオチンまたはビオチン類似体のコンジュゲートとして理解される。多くのビオチン化リガンドが、市販されており、または標準的な方法によって調製されてもよい。生体分子、例えば、核酸分子またはタンパク質分子をビオチンにカップリングする過程は、当技術分野において周知である（Bayer and Wilchek,Methods in Molec.Biology 10,143.1992）。
「結合パートナー」という用語は、別の生物学的分子と特異的または非特異的に結合するかまたは相互作用することができる生物学的分子またはその他の有機分子として定義され、その結合または相互作用は、「リガンド」の結合または相互作用とも呼ばれ、以下に限定されるわけではないが、抗体/抗原、抗体/ハプテン、酵素/基質、酵素/阻害剤、酵素/補助因子、結合タンパク質/基質、担体タンパク質/基質、レクチン/炭水化物、受容体/ホルモン、受容体/エフェクター、または抑制因子/誘導因子の結合または相互作用によって例示される。適切なリガンドは、本発明の方法の所望の使用に依って選択されるであろう。
いくつかの場合において、リガンドは、抗原特性を有する薬物、ホルモン、抗生物質、またはその他の化合物に対する抗体である。抗体は、別の抗体に対するもの（即ち、抗抗体）であってもよい。モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方が使用され得、それらは、完全分子またはその様々な断片であり得る。特定のリガンドに対して特異的な抗体は、当技術分野において周知の立証されている方法によって作製され得る。
本発明の方法において使用するための抗体は、そのような抗体が、特定の標的リガンドとの連結を形成することができ、修飾型ビオチンによってビオチン化され得る限り、任意の種、クラス、またはサブクラスのものであり得る。従って、本発明において使用するための抗体には、以下のものが含まれる：任意の動物、例えば、従来使用されている動物、例えば、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、もしくはマウスのいずれかに由来する、免疫グロブリンの様々なクラスもしくはサブクラスのいずれか、例えば、IgG、IgA、IgM、IgD、もしくはIgE、モノクローナル抗体、完全抗体、モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体の「断片」、抗体の結合領域を含有しているものである断片、例えば、Fc部分を欠く断片（例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv）、完全抗体において重鎖成分を接続しているジスルフィド結合の還元的切断によって入手されるいわゆる「半分子」断片、モノクローナル抗体を含む、組換えDNA技術もしくはその他の合成技術によって作製されたもしくは修飾された抗体、抗体の断片、「ヒト化抗体」、キメラ抗体、または合成的に作製されたもしくは改変された抗体様構造。抗体の機能性誘導体または「等価物」、例えば、単鎖抗体も含まれる。
代替として、リガンドは、（一価もしくは多価の抗原または多重決定基抗原を含む）抗原性材料であり得る。
「コンジュゲート」および「複合体」という用語は、本明細書中で使用されるように、タンパク質もしくは融合タンパク質として存在するか、または共有結合（例えば、ペプチド結合）もしくは非共有結合によって別の実体に連結されている、ビオチン結合ドメインタンパク質を含む任意のコンジュゲートまたは複合体をさす。典型的には、ビオチン結合ドメイン、例えば、リザビジンタンパク質は、1種または複数種、好ましくは、1種の生物学的または化学的な実体、例えば、生体分子、または抗原のような他のタンパク質と結合しているかまたは連結されていてよい。
「逆転」、「切断」、「放出」、または「崩壊」という用語は、本明細書中で交換可能に使用され、結合複合体のパートナーの物理的な分離または脱離または解離を意味するものとする。必要とされるのは、リポ酸化合物とビオチン結合ドメイン、例えば、リザビジンとの間の連結が、それぞれの実体の分離を可能にするため、崩壊するかまたは破壊されることである。
「置換分子」（例えば、リポ酸化合物）は、切断または逆転を可能にし、従って、2個の連結された実体の分離を可能にするために十分な様式で、ビオチン結合ドメイン（例えば、リザビジンタンパク質）とリポ酸化合物との間の連結を物理的に破壊するかまたは不安定化することができる。さらに、連結の集団において、十分なまたは有意な割合が「逆転する」限り、例えば、実質的に全ての連結が「逆転」する限り、全ての連結が各々崩壊する必要はない。これに関して「実質的に」とは、連結の少なくとも70％（より好ましくは、少なくとも75％、80％、85％、90％、または95％）が逆転することを意味すると理解され得る。理想的には、連結の100％が逆転する。本発明の連結逆転システムにおいて、逆転が100％完全でないとしても、有用性は保存され得る。
「誘導体」という用語は、本明細書中で使用されるように、例えば、以下に限定されるわけではないが、ユビキチン化、標識、PEG化（ポリエチレングリコールによる誘導体化）、またはその他の分子の付加のような技術によって、化学的に修飾されたタンパク質またはペプチド（例えば、リザビジンタンパク質またはその融合タンパク質）をさす。
本明細書中で使用されるように、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関して「バリアント」とは、それぞれ、参照ポリヌクレオチドまたは参照ポリペプチドと比較して（例えば、野生型ポリヌクレオチドまたは野生型ポリペプチドと比較して）、一次構造、二次構造、または三次構造が変動していてよいポリヌクレオチドまたはポリペプチドをさす。例えば、リザビジンタンパク質の「バリアント」とは、構造および機能、即ち、ビオチンもしくはビオチン誘導体または本明細書中に開示されるリポ酸化合物と結合する能力が実質的に類似している分子をさすものとする。両方の分子が実質的に類似した構造を有するかまたは両方の分子が類似した生物学的活性を保有する場合、一方の分子は、他方の分子に「実質的に類似している」と言われる。従って、2種の分子が類似した活性を保有する場合、分子の一方の構造が他方に見出されなくても、またはアミノ酸残基の配列が同一でなくても、その用語が本明細書中で使用されるように、それらはバリアントと見なされる。
例えば、リザビジンタンパク質のバリアントは、SEQ ID NO:1の参照アミノ酸と異なる変異または修飾を含有していてよい。いくつかの態様において、バリアントは、リザビジンタンパク質の異なるアイソフォームであってもよいし、または異なる異性体アミノ酸を含んでいてもよい。バリアントは、当技術分野において周知の方法を使用して単離されたまたは生成された、天然に存在する、合成の、組換えの、または化学的に修飾されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドであり得る。バリアントは、下記のような保存的または非保存的なアミノ酸変化を含んでいてよい。ポリヌクレオチドの変化は、参照配列によってコードされたポリペプチドにおけるアミノ酸の置換、付加、欠失、融合、および短縮をもたらすことができる。バリアントは、アミノ酸の挿入、欠失、または置換、例えば、バリアントの基礎となるペプチド配列に通常存在しないアミノ酸およびその他の分子の挿入および置換、例えば、以下に限定されるわけではないが、ヒトタンパク質に通常存在しないオルニチンの挿入を含んでいてもよい。「保存的置換」という用語は、ポリペプチドを記載する時、ポリペプチドの活性を実質的に改変しない、ポリペプチドのアミノ酸組成の変化をさす。例えば、保存的置換とは、あるアミノ酸残基を、類似の化学的特性を有する異なるアミノ酸残基に置換することをさす。保存的アミノ酸置換には、ロイシンとイソロイシンまたはバリン、アスパラギン酸とグルタミン酸、またはトレオニンとセリンの交換が含まれる。「保存的アミノ酸置換」は、ロイシンとイソロイシンまたはバリン、アスパラギン酸とグルタミン酸、またはトレオニンとセリンの交換のような、類似の構造的特性および/または化学的特性を有するアミノ酸同士の交換に起因する。従って、特定のアミノ酸配列の「保存的置換」とは、ポリペプチド活性にとって重大でないアミノ酸の置換、または重大なアミノ酸の置換であってもペプチドの活性（即ち、ペプチドがBBBに透過する能力）を低下させないような、類似の特性（例えば、酸性、塩基性、陽性荷電または陰性荷電、極性または非極性等）を有するアミノ酸同士の置換をさす。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当技術分野において周知である。例えば、以下の六つの群が、各々、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有している：（1）アラニン（A）、セリン(S)、トレオニン（T）；（2）アスパラギン酸（D）、グルタミン酸（E）；（3）アスパラギン（N）、グルタミン（Q）；（4）アルギニン(R)、リジン（K）；（5）イソロイシン（I）、ロイシン（L）、メチオニン（M）、バリン（V）；および（6）フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）（Creighton,Proteins,W.H.Freeman and Company(1984)も参照すること）。いくつかの態様において、1個のアミノ酸または小さい割合のアミノ酸を改変するか、付加するか、または欠失させる個々の置換、欠失、または付加も、その変化がペプチドの活性（即ち、例えば、MISRIIと結合しそれを活性化するMISの能力）を低下させない場合、「保存的置換」と見され得る。挿入または欠失は、典型的には、約1〜5アミノ酸の範囲にある。保存的アミノ酸の選択は、置換すべきアミノ酸のペプチド内の位置、例えば、アミノ酸がペプチドの外部にあり溶媒に曝されているか、内部にあり溶媒に曝されていないかに基づき選択され得る。本明細書中で使用されるように、「非保存的」という用語は、あるアミノ酸残基を、異なる化学的特性を有する異なるアミノ酸残基に置換することをさす。非保存的置換には、アスパラギン酸（D）のグリシン（G）との交換；アスパラギン（N）のリジン（K）との交換；またはアラニン（A）のアルギニン(R)との交換が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
「挿入」または「欠失」は、典型的には、約1〜5アミノ酸の範囲にある。可能な変動は、組換えDNA技術を使用して、配列内のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を系統的に作製しながら、ペプチドを合成的に作製することによって実験的に決定され得る。
「機能性誘導体」および「模倣体」という用語は、交換可能に使用され、機能性誘導体の元の実体または分子の生物学的活性に実質的に類似している生物学的活性（機能的または構造的）を保有する化合物をさす。機能性誘導体という用語には、分子の断片、バリアント、類似体、または化学的誘導体が含まれるものとする。
分子の「断片」とは、分子の伝染性ポリペプチドサブセットをさすものとする。例えば、SEQ ID NO:1のアミノ酸と同じ活性を有するリザビジンタンパク質の断片も、本発明において使用するために包含される。
リザビジンタンパク質のような分子の「類似体」、例えば、SEQ ID NO:1のアミノ酸のタンパク質の類似体とは、SEQ ID NO:1の分子全体またはその断片に機能が類似している分子をさすものとする。本明細書中で使用されるように、分子は、通常は分子の一部でない付加的な化学的モエティを含有している時、別の分子の「化学的誘導体」であると言われる。そのようなモエティは、分子の可溶性、吸収、生物学的半減期等を改善する場合がある。あるいは、モエティは、分子の毒性を減少させ、分子の望ましくない副作用を排除するかもしくは減弱させることができる。そのような効果を媒介することができるモエティは、Remington's Pharmaceutical Sciences,18th edition,A.R.Gennaro,Ed.,MackPubl.,Easton,PA(1990)に開示されている。
本明細書中で使用されるように、「相同」とは、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを記載するために使用された時、2種のポリペプチドまたは2種のポリヌクレオチドまたはそれらの指定された配列が、適切なアミノ酸またはヌクレオチドの挿入または欠失によって、最適に整列化され比較された時、アミノ酸またはヌクレオチドの少なくとも70％、通常はアミノ酸またはヌクレオチドの約75％〜99％、より好ましくは、少なくとも約98〜99％において、同一であることを示す。
「相同体」または「相同」という用語は、構造および/または機能に関しても使用され得る。アミノ酸配列相同性に関して、アミノ酸配列が、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％同一、少なくとも97％同一、または少なくとも99％同一である場合、それらは相同体である。「実質的に相同」という用語は、少なくとも90％、少なくとも95％同一、少なくとも97％同一、または少なくとも99％同一である配列をさす。相同配列は、異なる種における同じ機能性遺伝子であり得る。
本明細書中で使用されるように、ポリペプチド配列に関して、「実質的類似性」という用語は、ポリペプチドが、約10〜20アミノ酸残基の比較ウィンドウにおいて、参照配列と少なくとも60％の配列同一性、または参照配列との70％もしくは80％、85％、もしくは87％の配列同一性、最も好ましくは90％の同一性を有する配列を含むことを示す。いくつかの態様において、SEQ ID NO:1との実質的類似性を有するリザビジンタンパク質とは、SEQ ID NO:1と少なくとも約70％または約80％または約85％または約87％または約90％またはそれ以上の配列同一性を有し、かつSEQ ID NO:1のリザビジンタンパク質と比較して類似した生物学的機能または活性、例えば、少なくとも80％のビオチン結合能を有していてよいリザビジンタンパク質である。
アミノ酸配列に関して、「実質的類似性」には、アミノ酸の保存的置換がさらに含まれる。従って、例えば、2種のペプチドが1個または複数個の保存的置換によって異なる場合、一方のポリペプチドは、第2のポリペプチドに実質的に類似している。「実質的同一性」という用語は、2種のペプチド配列が、例えば、デフォルトギャップウェイトを使用してプログラムGAPまたはBESTFITによって、最適に整列化された時、少なくとも65パーセントの配列同一性、好ましくは、少なくとも80パーセントまたは90パーセントの配列同一性、より好ましくは、少なくとも95パーセントまたはそれ以上の配列同一性（例えば、99パーセント以上の配列同一性）を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基の位置は、保存的アミノ酸置換によって異なっている。
本発明の遺伝子またはペプチドの相同体の決定は、当業者によって容易に確認され得る。「相同性」または「同一性」または「類似性」という用語は、本明細書中で交換可能に使用され、2種のペプチドの間または2種の核酸分子の間の配列類似性をさす。相同性および同一性は、各々、比較の目的のために整列化されていてよい各配列の位置を比較することによって決定され得る。比較された配列の等しい位置が同じ塩基またはアミノ酸によって占有される時、分子は、その位置において同一であり；等しい部位が同じまたは類似した（例えば、立体的性質および/または電子的性質が類似した）アミノ酸残基によって占有される時、分子は、その位置において相同である（類似している）と呼ばれ得る。相同性/類似性または同一性の百分率としての表示は、比較された配列が共有している位置における同一または類似のアミノ酸の数の関数をさす。「無関係な」または「非相同の」配列は、本願の配列と40％未満の同一性、好ましくは、25％未満の同一性を共有する。
一つの態様において、「リザビジン相同体」という用語は、本明細書中に開示されるSEQ ID NO:1との40％の相同性、より好ましくは、SEQ ID NO:1と少なくとも約50％、さらに好ましくは、少なくとも約60％の相同性（即ち、配列同一性）、さらに好ましくは、少なくとも約70％の相同性、さらに好ましくは、少なくとも約75％の相同性、さらに好ましくは、少なくとも約80％の相同性、さらに好ましくは、少なくとも約85％の相同性、さらに好ましくは、少なくとも約90％の相同性、より好ましくは、少なくとも約95％の相同性（または配列同一性）を有するアミノ酸配列をさす。前述のように、相同性は、少なくとも約50％〜100％および中間の全ての区間（即ち、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％等）である。
配列比較のため、典型的には、一つの配列が、試験配列が比較される参照配列として働く。配列比較アルゴリズムを使用する時、試験配列および参照配列がコンピュータに入力され、必要であれば、部分配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムが、指定されたプログラムパラメータに基づき、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。
比較のための配列の最適アライメントは、例えば、SmithおよびWatermanのローカルホモロジーアルゴリズム（参照によって本明細書中に組み入れられるAdv.Appl.Math.2:482(1981)）、NeedlemanおよびWunschのホモロジーアライメントアルゴリズム（参照によって本明細書中に組み入れられるJ.Mol.Biol.48：443-53(1970)）、PearsonおよびLipmanの類似性検索（search for similarity）法（参照によって本明細書中に組み入れられるProc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444-48(1988)）、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（例えば、Wisconsin Genetics Software Package（Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,Wis.）内のGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA）、または視覚的検査によって実施され得る（一般的には、Ausubel et al.(eds.),Current Protocols in Molecular Biology,4th ed.,John Wiley and Sons,New York(1999)を参照すること）。
有用なアルゴリズムの一例は、PILEUPである。PILEUPは、パーセント配列同一性を示すため、プログレッシブペアワイズアライメントを使用して、関連配列の群から複数の配列アライメントを作出する。それは、アライメントを作出するために使用されるクラスタリングの関係性を示すツリーまたはデンドログラムもプロットする。PILEUPは、FengおよびDoolittleのプログレッシブアライメント法（参照によって本明細書中に組み入れられるJ.Mol.Evol.25:351-60(1987)）の単純化を使用する。使用される方法は、HigginsおよびSharpによって記載された方法（参照によって本明細書中に組み入れられるComput.Appl.Biosci.5:151-53(1989)）に類似している。プログラムは、各々最大5,000ヌクレオチドまたは5,000アミノ酸の長さの300までの配列を整列化することができる。マルチプルアライメント法は、2種の整列化された配列のクラスタを作製する、2種の最も類似した配列のペアワイズアライメントから開始する。次いで、このクラスタを、次に最も近縁の配列または整列化された配列のクラスタと整列化する。2種の個々の配列のペアワイズアライメントの単純拡大によって、配列の2個のクラスタが整列化される。最終アライメントは、一連のプログレッシブペアワイズアライメントによって達成される。プログラムは、配列比較の領域について特定の配列およびそれらのアミノ酸またはヌクレオチドの座標を指定し、プログラムパラメータを指定することによって実行される。例えば、参照配列は、以下のパラメータを使用して、パーセント配列同一性の関係性を決定するため、他の試験配列と比較され得る：デフォルトギャップウェイト（3.00）、デフォルトギャップレングスウェイト（0.10）および重み付けされたエンドギャップ。
パーセント配列同一性および配列類似性の決定のために適当なアルゴリズムの別の例は、Altschulらによって記載されているBLASTアルゴリズム（参照によって本明細書中に組み入れられるJ.Mol.Biol.215:403-410(1990)）である（参照によって本明細書中に組み入れられるZhang et al.,Nucleic Acid Res.26:3986-90(1998)；Altschul et al.,Nucleic Acid Res.25:3389-402(1997)も参照すること）。BLAST分析を実施するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Informationのインターネットウェブサイトを通して公に入手可能である。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列内の同じ長さのワードと整列化された時に正の値の閾値スコアTに一致するかまたはそれを満たすクエリー配列内の長さWの短いワードを同定することによって、高スコア配列対（HSP）を同定することを含む。Tは近隣ワードスコア閾値と呼ばれる（Altschul et al.(1990)（前記））。これらの初期近隣ワードヒットは、それらを含有しているより長いHSPを見出すための検索を開始するためのシードとして働く。次いで、ワードヒットは、累積アライメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に延長される。各方向へのワードヒットの延長は、累積アライメントスコアが最大達成値から量Xだけ減少した時；1個または複数個の負のスコアの残基アライメントの蓄積のため、累積スコアが0以下になった時；またはいずれかの配列の末端に到達した時、停止される。BLASTアルゴリズムパラメータW、T、およびXが、アライメントの感度およびスピードを決定する。BLASTプログラムは、デフォルトとして、11のワード長（W）、BLOSUM62スコアリングマトリックス（参照によって本明細書中に組み入れられるHenikoff and Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-9(1992)を参照すること）、50のアライメント（B）、10の期待値（E）、M=5、N=4、および両方の鎖の比較を使用する。
「類似体」という用語には、本明細書中で使用されるように、対立形質バリアント、種バリアント、および誘導されたバリアントが含まれるものとする。類似体は、しばしば、保存的置換によって、典型的には、一つまたは少数の位置において、天然に存在するペプチドと異なる。類似体は、典型的には、天然のペプチドまたはポリペプチド（例えば、SEQ ID NO:1）と少なくとも80％または90％の配列同一性を示す。いくつかの類似体は、非天然アミノ酸またはN末端もしくはC末端のアミノ酸の修飾も含む。非天然アミノ酸の例は、例えば、ace二置換アミノ酸、N-アルキルアミノ酸、乳酸、4-ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸、ε-N,N,N-トリメチルリジン、ε-N-アセチルリジン、O-ホスホセリン、N-アセチルセリン、N-ホルミルメチオニン、3-メチルヒスチジン、5-ヒドロキシリジン、σ-N-メチルアルギニンであるが、これらに限定されるわけではない。断片および類似体は、下記のトランスジェニック動物モデルにおいて予防的または治療的な効力についてスクリーニングされ得る。
「置換」という用語は、ペプチドをさす時、あるアミノ酸の、異なる実体、例えば、別のアミノ酸またはアミノ酸モエティへの変化をさす。置換は、保存的置換または非保存的置換であり得る。
本明細書中に開示されるビオチン結合ドメイン、例えば、リザビジンタンパク質の単離に関して、「実質的に純粋」という用語は、試料中の全タンパク質濃度と比較して、ビオチン結合ドメイン（例えば、リザビジンタンパク質）に関して、少なくとも約65％または少なくとも約75％または少なくとも約85％または少なくとも約90％または少なくとも約95％純粋である試料をさす。換言すると、本明細書中に開示されるリポ酸化合物マトリックスを使用して単離され精製されたビオチン結合ドメイン（例えば、リザビジンタンパク質）の調製に関連して、「実質的に純粋」または「本質的に精製された」という用語は、約20％未満、約15％未満、約10％、約8％、約7％、または約5％未満、約4％、約3％、約2％、約1％、または1％未満の非ビオチン結合ドメイン（例えば、リザビジンタンパク質）を含有しているタンパク質試料をさす。
本明細書中で使用されるように、「タンパク質」とは、20種のアミノ酸のいずれかから本質的になるポリマーである。「ポリペプチド」は、しばしば、比較的大きいポリペプチドに関して使用され、「ペプチド」は、しばしば、小さいポリペプチドに関して使用されるが、当技術分野におけるこれらの用語の使用は、重複し、変動する。「ペプチド」、「タンパク質」、および「ポリペプチド」という用語は、本明細書中で交換可能に使用される。
冠詞「1つの（a）」および「1つの（an）」は、その冠詞の一つまたは複数（即ち、少なくとも一つ）の文法上の目的語をさすため、本明細書中で使用される。例えば、「要素（an element）」とは、一つの要素または複数の要素を意味する。
組成物および方法は、（「を含むが、これらに限定されるわけではない」を意味するものとして解釈される）様々な成分または工程を「含む」という用語で記載されるが、そのような用語は、本質的に閉鎖的なメンバー群を定義するものと解釈されるべきであるため、組成物および方法は、様々な成分および工程「から本質的になる」または「からなる」こともできる。
リザビジンタンパク質またはそれを含む複合体もしくは融合タンパク質を単離する方法
リポ酸（LA）化合物
いくつかの態様において、本明細書中に開示される方法、組成物、およびキットにおいて使用するためのリポ酸化合物は、以下の構造：
Figure 2019524639
を有する（チオクト酸としても公知の）α-リポ酸である。
α-リポ酸およびαリポ酸（ALA）およびチオクト酸としても公知のリポ酸（LA）は、オクタン酸に由来する有機硫黄化合物である。LAは、ジスルフィド結合によって接続された2個の硫黄原子を（C6およびC8に）含有しており、従って、酸化型であると見なされるが、いずれかの硫黄原子がより高い酸化状態で存在してもよい。C6の炭素原子は、キラルであり、分子は、2種の鏡像異性体(R)-(+)-リポ酸（RLA）および(S)-(-)-リポ酸（SLA）ならびにラセミ混合物(R/S)-リポ酸（R/S-LA）として存在する。LAは、物理的には、黄色の固体として出現し、構造的には、末端カルボン酸および末端ジチオラン環を含有している。
いくつかの態様において、本明細書中に開示される方法、組成物、およびキットにおいて使用するためのリポ酸化合物は、以下の構造（＊は不斉中心を表す）：
Figure 2019524639
を有するα-ジヒドロリポ酸である。
リポ酸は、2種の鏡像異性体：R鏡像異性体およびS鏡像異性体として存在する。天然に存在するリポ酸は、R体で存在するが、（αリポ酸として一般的に公知の）合成リポ酸は、R体およびS体のラセミ混合物である。従って、本願の全体において、リポ酸との言及には、R鏡像異性体、S鏡像異性体、およびR/S鏡像異性体のラセミ混合物が含まれることが理解されるべきである。
いくつかの態様において、リポ酸はR体である。いくつかの態様において、リポ酸はS体である。リポ酸がS体であるいくつかの態様において、(S)-リポ酸は、(S)-リポ酸を樹脂または固体支持体に付着させる/カップリングするためにスルホNHSリンカーを必要とせず、固体支持体に直接付着することができる。いくつかの態様において、LA樹脂またはLAマトリックスは、R体リポ酸、S体リポ酸、または両方（即ち、R体およびS体のリポ酸のラセミ混合物）のいずれか1つを含む。例えば、（RLAとも呼ばれる）(R)-リポ酸は、上に示され、（SLAとも呼ばれる）(S)-リポ酸は、下に示される。
Figure 2019524639
(R)-リポ酸および(S)-リポ酸の1:1混合物（ラセミ化合物）は、(RS)-リポ酸または(±)-リポ酸（R/S-LA）と呼ばれる。いくつかの態様において、本明細書中に開示される方法、組成物、およびキットにおいて使用するためのリポ酸化合物または成分は、α-リポ酸のラセミ混合物もしくはラセミ化合物混合物、高光学純度のR-(+)-α-リポ酸もしくはS-(-)-α-リポ酸、またはそれらの混合物、ならびにラセミα-ジヒドロリポ酸（6,8-ジメルカプトオクタン酸もしくはDHLA）、高光学純度のR-(-)-ジヒドロリポ酸もしくはS-(+)-ジヒドロリポ酸、またはそれらの混合物である。いくつかの態様において、α-リポ酸もしくはジヒドロリポ酸のを、そのままので、または、例えば、リポ酸のクレアチン塩、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、もしくはオルニチン塩のような完全にもしくは部分的に塩の形態で、溶液の作製のために使用することも包含される。ラセミα-リポ酸、高光学純度のまたは鏡像異性体について濃縮されたR-(+)-α-リポ酸またはS-(-)-α-リポ酸、ラセミジヒドロリポ酸、高光学純度のまたは鏡像異性体について濃縮されたR-(-)-ジヒドロリポ酸またはS-(+)-ジヒドロリポ酸、およびそれらの塩または混合物の作製は、公知の様式で行われ得る。ラセミσ-リポ酸、鏡像異性的に純粋なまたは鏡像異性的に濃縮されたR(+)-σ-リポ酸またはS-(-)-σ-リポ酸、ラセミジヒドロリポ酸、鏡像異性的に純粋なまたは鏡像異性的に濃縮されたR-(-)-ジヒドロリポ酸またはS(+)-ジヒドロリポ酸、およびそれらの塩または混合物の調製は、公知の様式で、例えば、参照によってその全体が本明細書中に組み入れられるWO2003047567または米国出願第20040266858号ならびに米国特許第5,728,735号、第5,281,722号、第6,271,254号、および第5,650,429号に開示されるように実施され得る。
いくつかの態様において、本明細書中に開示される方法、組成物、およびキットにおいて使用するためのリポ酸化合物または成分は、参照によってその全体が本明細書中に組み入れられる米国特許第3,288,797号および第6,331,559号に開示されたようなリポ酸誘導体である。
前述のように、α-リポ酸またはα-ジヒドロリポ酸は、S体もしくはR体であってよく、またはα-リポ酸もしくはα-ジヒドロリポ酸のラセミ（RおよびS）混合物として存在する。いくつかの態様において、固体支持体は、α-リポ酸またはα-ジヒドロリポ酸のS体もしくはR体のいずれかまたはラセミ（RおよびS）混合物として、α-リポ酸およびα-ジヒドロリポ酸の両方を含む。
いくつかの態様において、リポ酸化合物は、当技術分野において公知のリポ酸誘導体である。本明細書中に開示される方法、組成物、およびキットにおいて使用するために包含されるそのようなリポ酸誘導体には、例えば、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる米国特許第6,331,559号に開示されたような、リポイルピリドキサミン、リポイルピリドキサミン塩酸塩、リポイルピリドキサミン臭化水素酸塩、リポイルピリドキサミンメタンスルホン酸、リポイルピリドキサミンp-トルエンスルホン酸、1,2-ジチオラン類似体、ジエトキシカルボニル化リポ酸、6,8-ビスアセチルメルカプトオクタン酸（ビスアセチルリポ酸）、6,8-ビスベンゾイルメルカプトオクタン酸（ビスベンゾイルリポ酸）、8-アセチルメルカプト-6-メルカプトオクタン酸（モノアセチルリポエート）、6,8-ビスカルバモイルメチルメルカプトオクタン酸、6,8-ビス-[S-(N-メチルスクシンイミド)]メルカプトオクタン酸が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
いくつかの態様において、リポ酸誘導体は、式Iの構造を含む化合物のクラスである：
Figure 2019524639
式中、xは0〜16であり、R1およびR2は独立に、アシルR3C(O)（R3はアルキル基またはアリール基である）；アルキルCnH2n+1；アルケニルCmH2m-1；アルキニルCmH2m-3；アリール、アルキルスルフィドCH3(CH2)n-S-；イミドイルCH3(CH2)nC(=NH)-；およびセミアセタールR4CH(OH)-S-（R4はCCl3またはCOOHである）であり；
nは0〜10であり、mは2〜10である。
別の態様において、リポ酸誘導体は、式IIの構造を有する化合物のクラスである：
Figure 2019524639
式中、xは0〜16であり、Rは非パラジウム金属キレートである。
リポ酸組成物のチオール部分の一方または両方は、付加的な試薬またはモエティによって改変または複合体化（即ち、誘導体化）されていてもよい。いくつかの態様において、本明細書中に開示される方法、キット、および組成物において使用するためのリポ酸誘導体は、精製すべきビオチン結合タンパク質のタイプによって変動するであろう。
架橋試薬およびLA化合物の固体支持体への架橋
いくつかの態様において、リポ酸は、参照によってその全体が本明細書中に開示されるMahlicli et al.「血液透析によって誘導される酸化ストレスを抑制するためのαリポ酸のポリスルホン膜への固定（Immobilization of alpha lipoic acid onto polysulfone membranes to suppress hemodialysis induced oxidative stress）」J.Membrane Sci.,2014;449;27-37に開示されるように、固体支持体に固定される。
いくつかの態様において、リポ酸は、Harmon et al.「リポ酸-セファロースでのビオチンに対する抗体の精製（Purification of antibodies against biotin on lipoic acid-sepharose）」Analytical Biochemistry,1980;103(1),58-63に開示され、参照によってその全体が本明細書中に開示されるRyan et al.,J.General Microbiology「アフィニティクロマトグラフィによる緑膿菌からのロダネーゼの単離（The Isolation of Rhodanese from Pseudomonas aeruginosa by Affinity Chromatography）」General Microbiology,1977;103;197-199にも開示されるように、固体支持体に固定される。
いくつかの態様において、リポ酸化合物は、架橋試薬、例えば、CDAP（1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート）、EDC（1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム；臭化シアン；または重炭酸アンモニウム/ヨード酢酸より選択される架橋試薬によって固体支持体に架橋される。いくつかの態様において、リポ酸化合物は、固体支持体のカルボキシル官能基、ヒドロキシル官能基、アミノ官能基、フェノキシ官能基、ヘミアセタール官能基、およびメルカプト官能基に架橋される。いくつかの態様において、リポ酸化合物は、固体支持体と共有結合する。
多くの二価または多価の連結剤が、分子を他の分子にカップリングするために有用である。例えば、代表的なカップリング剤には、チオエステル、カルボジイミド、スクシンイミドエステル、ジイソシアネート、グルタルアルデヒド、ジアゾベンゼン、およびヘキサメチレンジアミンのような有機化合物が含まれ得る。このリストは、当技術分野において公知のカップリング剤の様々なクラスを網羅するためのものではなく、より一般的なカップリング剤の例示である。Killen & Lindstrom,133 J.Immunol.1335(1984)；Jansen et al.,62 Imm.Rev.185(1982)；Vitetta et al.を参照すること。
いくつかの態様において、文献に記載された架橋試薬が、本明細書中に開示される方法、免疫原性組成物、およびキットにおいて使用するために包含される。例えば、（MBS（M-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル）の使用を記載している）Ramakrishnan,et al.,44 Cancer Res.201(1984)；（オリゴペプチドリンカーによって抗体にカップリングされたハロゲン化アセチルヒドラジド誘導体の使用を記載している）Umemotoらの米国特許第5,030,719号を参照すること。具体的なリンカーには、（a）EDC（1-エチル-3-(3-ジメチルアミノ-プロピル)カルボジイミド塩酸塩）；（b）SMPT（4-サクシニミジルオキシカルボニル-α-メチル-α-(2-ピリジル-ジチオ)トルエン）（Pierce Chem.Co.、カタログ番号21558G）；（c）SPDP（サクシニミジル-6[3-(2-ピリジルジチオ)プロピオンアミド]ヘキサノエート）（Pierce Chem.Co.、カタログ番号21651G）；（d）スルホ-LC-SPDP（スルホサクシニミジル6[3-(2-ピリジルジチオ)-プロピオンアミド]ヘキサノエート）（Pierce Chem.Co.、カタログ番号2165-G）；および（f）EDCにコンジュゲートされたスルホ-NHS（N-ヒドロキシスルホ-スクシンイミド）（Pierce Chem.Co.、カタログ番号24510）が含まれる。
前記の連結または連結剤は、異なる属性を有する成分を含有しており、従って、異なる物理化学的特性を有するコンジュゲートをもたらす。例えば、アルキルカルボキシレートのスルホ-NHSエステルは、芳香族カルボキシレートのスルホ-NHSエステルより安定している。NHS-エステル含有リンカーは、スルホ-NHSエステルより可溶性が低い。さらに、リンカーSMPTは、立体的に妨害されたジスルフィド結合を含有しており、安定性が増大したコンジュゲートを形成することができる。ジスルフィド連結は、インビトロで切断され得るため、ジスルフィド連結は、一般に、他の連結より安定性が低く、従って、利用できるコンジュゲートは少なくなる。スルホ-NHSは、特に、カルボジイミドカップリングの安定性を増強することができる。（EDCのような）カルボジイミドカップリングは、スルホ-NHSと共に使用された時、単独のカルボジイミドカップリング反応より加水分解に対して抵抗性のエステルを形成する。
いくつかの態様において、リポ酸は、架橋剤、CDAP（1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート）、EDC（1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、臭化シアン、もしくは重炭酸アンモニウム/ヨード酢酸、またはそれらの誘導体のいずれかを使用して、支持体に架橋される。
本明細書中に開示される方法および免疫原性組成物において使用するための例示的な架橋分子には、表1および2にリストされたものが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
（表１）例示的な同種二官能性架橋剤。同種二官能性架橋剤は、両端に同じタイプの反応基を有する架橋試薬である。試薬は、それらが架橋する化学基（左の列）およびそれらの化学的組成（中央の列）によって分類される。生成物は、各セル内に長さが増加する順にリストされる。
Figure 2019524639
（表２）例示的な異種二官能性架橋剤。異種二官能性架橋剤は、両端に異なる反応基を有する架橋試薬である。試薬は、それらが架橋する化学基（左の列）およびそれらの化学的組成（中央の列）によって分類される。生成物は、各セル内に長さが増加する順にリストされる。
Figure 2019524639
活性化された/官能化されたマトリックス
いくつかの態様において、本明細書中の本開示は、予め活性化された支持体を使用したLAマトリックスの作製に関する。例えば、Sigmaは、本明細書中に開示されるLA化合物を直接カップリングする準備ができている多様な活性化されたマトリックスを提供している。各直接活性化タイプの主要な特性は、添付の表3に記載される。
（表３）直接活性化型マトリックス
Figure 2019524639
いくつかの態様において、固体支持体は、事前の誘導体化のため付加的なスペーサーを含有している活性化されたマトリックスであってよい。これらの樹脂は、より温和なカップリング条件またはより特異的なリガンドの付着を可能にするため、本発明のために適当である。これらの例は、表4に示されるマトリックスである。いくつかの態様において、オーダーメードの誘導体化またはカップリングのために適当な末端基が取り込まれたマトリックス。典型的には、これらの基は、アミド結合によってリポ酸化合物とカップリングされ得、縮合を達成するために付加的な試薬を必要とするカルボキシル官能またはアミン官能であろう。一般的に利用される別の基は、ヒドラゾン形成によってアルデヒドにカップリングすることができ、典型的には、付加的な試薬を必要としないヒドラジドである。
（表４）予め誘導体化されたマトリックスへ取り込まれる活性化された基
Figure 2019524639
固体支持体
いくつかの態様において、リポ酸（LA）化合物は、固定化モエティ、例えば、固体支持体上に固定される。固定されたリポ酸化合物を含むそのような固体支持体は、本明細書中で「LAマトリックス」とも呼ばれる。いくつかの態様において、リポ酸（LA）化合物は、固体支持体の表面上に直接固定され、別の態様において、リポ酸（LA）化合物は、中間実体、例えば、抗体またはビーズに付着していてよく、中間実体、例えば、抗体またはビーズが、固体支持体上に固定されていてもよい。連結のいずれかの成分の固相への付着は、連結された成分の容易な操作を可能にする。従って、ある種類の固相への付着は、連結された成分の、混合物中の成分の残りからの分離を可能にすることができる。これは、連結された成分の、混合物中の成分の残りからの物理的分離を達成するため、例えば、洗浄工程を実施することによって、または、成分が磁性ビーズに付着している場合には、磁場を使用することによって達成され得る。
本明細書中で使用されるように、「リポ酸マトリックス」または「LAマトリックス」という用語は、関心対象のタンパク質（例えば、本明細書中に開示されるリザビジンタンパク質のようなビオチン結合タンパク質）とLAマトリックスとの間の高度に特異的な結合相互作用に基づく生化学的混合物の分離を可能にする固相媒体、典型的には、ゲルまたは樹脂をさすものとする。従って、固相媒体は、関心対象のタンパク質（例えば、本明細書中に開示されるリザビジンタンパク質のようなビオチン結合タンパク質）が、緩衝液条件に依って、可逆的に接着することができるリポ酸化合物を含む。LAマトリックスを含むことができる固定化または固相媒体の非限定的な例には、（市販のセファロースまたはSEPHAROSE（商標）マトリックスのような）アガロースビーズのようなゲルマトリックス、および（市販のProSepマトリックスのような）多孔性ガラスビーズのようなガラスマトリックスが含まれる。
いくつかの態様において、本明細書中に開示されるリポ酸マトリックスは、例えば、再使用可能なLAマトリックスであり、ビオチン結合タンパク質（例えば、リザビジンタンパク質またはその融合タンパク質）の精製のため、2回以上、例えば、以下に限定されるわけではないが、少なくとも2回、または少なくとも3回、または少なくとも4回、または少なくとも5回、または少なくとも6回、または少なくとも7回、または少なくとも8回、または少なくとも9回、または少なくとも10回、または10〜15回、または15〜20回、または20回超、50回未満、使用され得る。
固体支持体は、化学的または生化学的な手法において、固定、分離等のため、現在広く使用されているかまたは提唱されている周知の支持体またはマトリックスのいずれかであり得る。これらは、粒子、シート、ディップスティック、ゲル、フィルター、膜、マイクロファイバーストリップ、チューブ、ウェルもしくはプレート、ファイバーまたはキャピラリー、コーム、ピペットチップ、マイクロアレイもしくはチップ、またはそれらの組み合わせの形態をとっていてよく、便利には、ポリマー材料、例えば、アガロース、SEPHAROSE（商標）、セルロース、ニトロセルロース、アルギン酸、テフロン（登録商標）、ラテックス、アクリルアミド、ナイロン膜、プラスチック、ポリスチレン、ガラス、またはシリカ、または金属で作製されていてよい。バイオチップは、例えば、Nilssonら（Anal.Biochem.224:400-408,1995）に記載されるような小型実験系を提供するための固体支持体として、または診断ツールとして使用され得る。多数の適当な固体支持体が市販されている。
いくつかの態様において、固体支持体は、マトリックスまたは（本明細書中で「ACマトリックス」とも呼ばれる）アフィニティクロマトグラフィマトリックスであってよく、プロテインAカラムである。様々な他の態様において、マトリックスは、例えば、プロテインGカラム、プロテインA/Gカラム、プロテインLカラム、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィ（IMAC）カラム、カルモジュリン樹脂カラム、MEP HYPERCEL（商標）カラム、マルトース結合タンパク質（MBP）と結合するカラム、グルタチオン-Sトランスフェラーゼ（GST）と結合するカラム、およびStrepタグIIと結合するカラムからなる群より選択され得る。
本明細書中で使用されるように、「アフィニティクロマトグラフィマトリックス」または「ACマトリックス」という用語は、関心対象のタンパク質（例えば、ビオチン結合タンパク質、例えば、SEQ ID NO:1またはそれと少なくとも80％の配列同一性を含むリザビジンタンパク質）とACマトリックスとの間の高度に特異的な結合相互作用に基づく生化学的混合物の分離を可能にする固相媒体、典型的には、ゲルまたは樹脂をさすものとする。従って、固相媒体は、関心対象のタンパク質が、緩衝液条件に依って、可逆的に接着することができる標的を含む。ACマトリックスを含むことができる固定化または固相媒体の非限定的な例には、（市販のセファロースまたはSEPHAROSE（商標）マトリックスのような）アガロースビーズのようなゲルマトリックス、および（市販のProSepマトリックスのような）多孔性ガラスビーズのようなガラスマトリックスが含まれる。
関心対象のタンパク質（例えば、ビオチン結合タンパク質、例えば、SEQ ID NO:1またはそれと少なくとも80％の配列同一性を含むリザビジンタンパク質）のACマトリックスとの結合は、典型的には、カラムクロマトグラフィによって達成される。即ち、ACマトリックスがカラムへと成形され、ビオチン結合タンパク質、例えば、SEQ ID NO:1もしくはそれと少なくとも80％の配列同一性を含むリザビジンタンパク質またはそれらの融合タンパク質を含有している生化学的混合物を、カラムに通し、1種または複数種の洗浄溶液をカラムに通すことによってカラムを洗浄し、その後、溶出緩衝液をカラムに通すことによって関心対象のタンパク質をカラムから溶出させる。
代替として、関心対象のタンパク質（例えば、ビオチン結合タンパク質、例えば、SEQ ID NO:1もしくはそれと少なくとも80％の配列同一性を含むリザビジンタンパク質またはそれらの融合タンパク質）のACマトリックスとの結合は、バッチ処理によって達成することができ、バッチ処理において、関心対象のタンパク質を含有している生化学的混合物を容器内でACマトリックスと共にインキュベートして、関心対象のタンパク質をACマトリックスと結合させ、（例えば、遠心分離によって）固相媒体を容器から取り出し、固相媒体を洗浄して不純物を除去し、（例えば、遠心分離によって）固相媒体を再び回収して、関心対象のタンパク質を固相媒体から溶出させる。
さらに別の態様において、バッチ処理とカラムクロマトグラフィとの組み合わせを使用してもよい。例えば、バッチ処理によって、関心対象のタンパク質のACマトリックスとの初期結合を達成し、次いで、固相媒体をカラムに充填し、その後、カラムを洗浄し、関心対象のタンパク質をカラムから溶出させることができる。
いくつかの態様において、リポ酸（LA）化合物は、固相に付着した標的として細菌細胞壁タンパク質プロテインAを含むプロテインAカラムである固体支持体ACマトリックスの表面上に直接固定される。
様々なプロテインA樹脂が、当技術分野において周知であり、本発明において使用するために適当である。市販のプロテインA樹脂の非限定的な例には、MabSelect、MabSelect Xtra、MabSelect Sure、nProtein A Sepharose FF、rmpProtein A Sepharose FF、Protein A Sepharose CL-4B、およびnProtein A Sepharose 4 FF（全て、GE Healthcareから市販されている）；ProSep A、ProSep-vA High Capacity、ProSep-vA Ultra、およびProSep-Va Ultra Plus（全て、Milliporeから市販されている）；Poros AおよびMabcapture A（両方、Porosから市販されている）；IPA-300、IPA-400、およびIPA-500（全て、RepliGen Corp.から市販されている）；Affigel protein AおよびAffiprep protein A（両方、Bio-Radから市販されている）；MABsorbent A1PおよびMABsorbent A2P（両方、Affinity Chromatography Ltd.から市販されている）：Protein A Ceramic Hyper D F（Pall Corporationから市販されている）；Ultralink Immobilized protein AおよびAgarose protein A（両方、PIERCEから市販されている）、ならびにProtein A Cellthru 300およびProtein A Ultraflow（両方、Sterogen Bioseparationsから市販されている）が含まれる。
プロテインAクロマトグラフィに加えて、他のアフィニティクロマトグラフィ系に本発明の洗浄方法が適用されてもよい。例えば、別の態様において、LAマトリックスは、プロテインGカラム、プロテインA/Gカラム、またはプロテインLカラムであり得る。従って、プロテインGマトリックス、プロテインA/Gマトリックス、またはプロテインLマトリックスであるLAマトリックスを、抗体、Fc領域を含む抗体断片、およびFc融合タンパク質を精製するために使用することができる。
LAマトリックスの他の非限定的な例、および精製においてそれらが有効であるタンパク質のタイプには、以下のものが含まれる：（ヒスチジンタグ付きタンパク質のような金属イオンに対する親和性を有するタンパク質の精製のための）固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィ（IMAC）カラム、（カルモジュリン結合ペプチド（CBP）タグ付きタンパク質の精製のための）カルモジュリン樹脂カラム、MEP HYPERCEL（商標）カラム（免疫グロブリンと選択的に結合するセルロースマトリックス）、（MBPタグ付きタンパク質と選択的に結合するデキストリンSEPHAROSE（商標）樹脂のような）マルトース結合タンパク質（MBP）と結合するカラム、（GSTタグ付きタンパク質と選択的に結合するグルタチオンSEPHAROSE（商標）樹脂のような）グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）と結合するカラム、および（Strep-Tag IIタグ付きタンパク質と選択的に結合するSTREP-TACTIN（商標）セファロース樹脂のような）Strep-Tag IIと結合するカラム。さらに、固相に接着した標的として抗体を含むイムノアフィニティマトリックスが、固相に接着した抗体と特異的に結合する関心対象の抗原を精製するために使用され得る。
いくつかの態様において、固体支持体は、リポ酸（LA）化合物の結合のための高い表面積を提供する材料である。そのような支持体は通常、不規則な表面を有し、例えば、多孔性または粒子状、例えば、粒子、ファイバー、ウェブ、シンター、またはシーブであり得る。粒子状の材料、例えば、ビーズ、具体的には、ポリマービーズ/粒子は、より大きい結合能力のため、通常好ましい。
便利には、本発明に従って使用される粒子状の固体支持体には、球状ビーズが含まれるであろう。ビーズのサイズは、重大ではないが、例えば、およそ少なくとも0.01μmの直径を有していてよく、好ましくは、10μm以下、より好ましくは、6μm以下の最大直径を有する。例えば、直径1.0μm、2.8μm、および4.5μmのビーズが、良好に機能することが示されている。
サイズが実質的に均一（例えば、5％未満の直径標準偏差を有するサイズ）である単分散粒子は、反応の極めて均一な再現性を提供するという利点を有する。米国特許第4,336,173号に記載された技術によって作製された単分散ポリマー粒子は、特に適当である。
粒子は、その全体が同じポリマーから構成されていてもよいし、またはシェルポリマーが必要な反応基を有する、例えば、米国特許第4,703,018号およびEPA-0280556に記載されたようなコア-シェルポリマーであってもよい。
本発明の方法において使用するために適当な非磁性ポリマービーズは、DYNOSPHERESという商標でDynal Biotech AS（Oslo,Norway）から入手可能であり、Qiagen、GE Healthcare Life Sciences、Serotec、Seradyne、Merck、Nippon Paint、Chemagen、Promega、Prolabo、Polysciences、Agowa、およびBangs Laboratoriesからも入手可能である。
しかしながら、固定された材料の操作および分離を助けるため、そして、必要とされる場合、自動化を容易にするためにも、磁化可能（「磁性」）ビーズが好ましい。「磁性」という用語は、本明細書中で使用されるように、支持体が磁場に置かれた時に磁気モーメントを付与され得、従って、その磁場の作用の下で置換可能であることを意味する。換言すると、磁性粒子を含む支持体は、磁気凝集によって試料の他の成分から容易に取り出すことができ、それは、本明細書中に記載されるリザビジンタンパク質のようなビオチン結合タンパク質の結合後に粒子を分離するための迅速で、単純で、効率的な方式を提供する。さらに、ビオチン結合タンパク質、例えばリザビジンタンパク質に付着した細胞を崩壊させるかまたは他のモエティ、例えば、タンパク質もしくは核酸を分解する場合がある剪断力を生じる遠心分離のような伝統的な技術より、そのような磁気凝集ははるかに刺激の少ない分離の方法である。
従って、コンジュゲーションを介してリポ酸（LA）化合物に付着したビオチン結合タンパク質、例えば、リザビジンタンパク質を有する磁性粒子は、例えば、永久磁石を使用して、磁場の適用によって、適当な表面へ取り出され得る。残りの試料および/または粒子が所望のさらなる工程のために利用可能となるように、試料混合物を含有している容器の側面に磁石を適用して、容器の壁に粒子を凝集させ、試料の残りを取り出すことが、通常十分である。
代替として、リザビジンおよびリザビジン複合体ならびにそれらの融合タンパク質の単離および精製の方法は、そのような磁性粒子の取り扱いのための自動化されたシステムを使用して実施され得る。例えば、リザビジンタンパク質またはリザビジン複合体およびそれらの融合タンパク質を含有している試料を、そのような装置に移し、リポ酸化合物を保持している磁性粒子を添加することができる。単離された支持体と結合したリザビジンタンパク質もしくは融合タンパク質またはそれらの複合体を、所望により、洗浄し、置換リポ酸を含有している他のバイアルに移し、その後、放出された粒子を除去することができる。これに関して、具体的には、Dynal Biotech AS（Norway）から入手可能なBead Retrieverに言及することができる。その装置は、（リザビジンタンパク質またはリザビジン複合体およびそれらの融合タンパク質を保持している）支持体のウェルからウェルへの容易で効率的な移動のためのシステムを有する。
好ましくは、そのような磁性粒子は、残留磁気を回避し、従って、クランピングを回避するため、超常磁性であり、有利には、均一な速度論および分離を提供するため、単分散である（即ち、サイズが実質的に均一である、例えば、5％未満の直径標準偏差を有するサイズ）。超常磁性単分散粒子の調製は、EPA-106873においてSintefによって記載されている。
DYNABEADSという商標でDynal Biotech AS（Oslo,Norway）から市販されている周知の単分散ポリマー超常磁性ビーズは、本発明によって使用され得るかまたは使用するために修飾され得る市販の磁性粒子の例である。
本発明によるマトリックスの固体支持体は、任意の適当な周知の種類のものであり得る。従来のアフィニティ分離マトリックスは、しばしば、有機性であり、使用された水性媒体に親水性表面を曝す、即ち、ヒドロキシ（-OH）、カルボキシ（-COOH）、カルボキサミド（-CONH2、場合によってN-置換型）、アミノ（-NH2、場合によって置換型）、オリゴエチレンオキシ基またはポリエチレンオキシ基を外側に曝し、存在する場合には、内側表面にも曝すポリマーに基づく。一つの態様において、ポリマーは、有利には、適当な孔隙率および強剛性を提供するため、例えば、ビスエポキシド、エピハロヒドリン、1,2,3-トリハロ置換低級炭化水素によって架橋されている、デキストラン、デンプン、セルロース、プルラン、寒天、アガロース等のような多糖に基づくものであり得る。最も好ましい態様において、固体支持体は、多孔性アガロースビーズである。本発明において使用される支持体は、逆懸濁ゲル化のような標準的な方法に従って容易に調製され得る。あるいは、基本のマトリックスは、SEPHAROSE（商標）FF（GE Healthcare）のような市販の生成物である。大規模分離のために特に有利である態様において、支持体は、強剛性を増大させ、従って、マトリックスを高い流速のためにより適当なものにするため、改変されている。
代替として、固体支持体は、ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシアルキルアクリレート、ポリヒドロキシアルキルメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド等のような合成ポリマーに基づく。ジビニル置換ベンゼンおよびモノビニル置換ベンゼンに基づくマトリックスのような疎水性ポリマーのケースにおいては、周囲の水性液体に前記定義の親水基を曝すため、マトリックスの表面がしばしば親水性化される。そのようなポリマーは、標準的な方法に従って容易に作製される。例えば、「懸濁重合によって開発されたスチレンに基づくポリマー支持体（Styrene based polymer supports developed by suspension polymerization）」（R Arshady:Chimica e L'Industria 70(9),70-75(1988)）を参照すること。あるいは、SOURCE（商標）（GE Healthcare）のような市販の生成物が使用される。
別の代替態様において、本発明による固体支持体には、無機性の支持体、例えば、シリカ、酸化ジルコニウム等が含まれる。さらに別の態様において、固体支持体は、表面、チップ、キャピラリー、またはフィルターのような別の形態にある。本発明によるLAマトリックスの形状に関して、一つの態様において、LAマトリックスは、多孔性モノリスの形態にある。別態様において、LAマトリックスは、多孔性であってもよいしまたは非多孔性であってもよいビーズまたは粒子の形態にある。ビーズまたは粒子の形態にあるマトリックスは、充填ベッドとしてまたは懸濁した形態で使用され得る。懸濁した形態には、粒子またはビーズが自由に移動することができる拡張（expanded）ベッドおよび純粋懸濁物として公知のものが含まれる。モノリス、充填ベッド、および拡張ベッドのケースにおいて、分離の手法は概して、濃度勾配による従来のクロマトグラフィに従う。純粋懸濁物のケースにおいては、バッチモードが使用されるであろう。
リポ酸化合物は、例えば、リガンド内に存在するアミノ基および/またはカルボキシ基を利用した従来のカップリング技術を介して支持体に付着させてもよい。ビスエポキシド、エピクロロヒドリン、CNBr、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）等は、周知のカップリング試薬である。いくつかの態様において、リポ酸化合物の利用可能性を改善し、リポ酸化合物の支持体への化学的カップリングを容易にする、スペーサーとして公知の分子を、支持体とリポ酸化合物との間に導入することができる。あるいは、リポ酸化合物は、物理的吸着または生体特異的吸着のような非共有結合によって支持体に付着させてもよい。マトリックスのリポ酸化合物含量は、例えば、5〜15mg/mlマトリックスであってよく、有利には、5〜10mg/mlであってよい。
いくつかの態様において、リポ酸化合物は、チオエーテル結合によって支持体にカップリングされ得る。そのようなカップリングを実施する方法は、当領域において周知であり、標準的な技術および装置を使用して、当業者によって容易に実施される。
リポ酸（LA）化合物は、当技術分野において周知の方法によって、基質表面上の反応基を通して、適当な支持体に共有結合で付着させてもよい。これらには、例えば、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アルデヒド基、またはアミノ基による付着が含まれ、これらは適当な表面コーティングを提供するために固定支持体を処理することによって提供され得る。
代替として、官能化された表面を有する支持体は、前記の粒子製造業者のような多くの製造業者から市販されている。例えば、以下の官能化された表面を有する磁性粒子が、Dynal Biotech AS（Oslo,Norway）から入手可能である：
（エポキシ基を有する）DYNABEADS（登録商標）M-450 Epoxy；（トシル基を有する）DYNABEADS（登録商標）M-450 Tosylactivated；（トシル基を有する）DYNABEADS（登録商標）M-280 Tosylactivated；（トシル基を有する）DYNABEADS（登録商標）MyOne（商標）Tosylactivated；（トシル基を有する）DYNABEADS（登録商標）M-500 Subcellularを含むが、これらに限定されるわけではない疎水性ビーズ。
（エポキシ基を有する）DYNABEADS（登録商標）M-270 Epoxy；（カルボン酸基を有する）DYNABEADS（登録商標）M-270 Carboxylic acid；（カルボン酸基を有する）DYNABEADS（登録商標）MyOne Carboxylic acid、および（アミノ基を有する）Dynabeads M-270 Amineを含むが、これらに限定されるわけではない親水性ビーズ。
リポ酸（LA）化合物を付着させる表面の適切な選択は、例えば、捕捉すべきビオチン結合タンパク質のタイプ、または（リザビジンタンパク質のような）ビオチン結合タンパク質に付着したモエティ、例えば、それが融合タンパク質であるか、またはビオチン結合タンパク質（例えば、リザビジンタンパク質）が他のタンパク質もしくは分子との複合体として存在するかに依存し得る。
固体表面とリポ酸（LA）化合物との架橋のために適当な試薬には、臭化シアン、カルボニルジイミダゾール、グルタルアルデヒド、ヒドロキシスクシンイミド、および塩化トシルが含まれる。トシル表面およびエポキシ表面は、本発明において良好に機能することが見出されている。
理論によって拘束されることは望まないが、リポ酸（LA）化合物は、例えば、ビーズ、磁性材料、カラム、ゲル等に固定され得る。ビーズは磁化されていてもよい。例えば、磁性粒子を作製し、精製技術において使用するための前述の米国特許、ならびに様々なビオチン-アビジン結合系およびそれらを作製し使用する方法を記載している米国特許第6,287,792号；第6,277,609号；第6,214,974号；第6,022,688号；第5,484,701号；第5,432,067号；第5,374,516号を参照すること。
ビオチン結合ドメインおよびリザビジンタンパク質
いくつかの態様において、方法、組成物、およびキットは、そのようなビオチン結合ドメインを含む「ビオチン結合タンパク質」を含む、ビオチン結合ドメインを単離し精製するために使用され得る。いくつかの態様において、単量体ストレプトアビジン、または、例えば、本明細書中に開示されるリゾビウム・エトリ（Rhizobium etli）由来のリザビジンのようなストレプトアビジン様分子であるビオチン結合タンパク質。
四量体四次構造を有するストレプトアビジンのような他のアビジンタンパク質と異なり、リザビジンは二量体であるという点で独特である。四量体ストレプトアビジンタンパク質は、ビオチンに対する強い結合親和性を有し、リガンド結合（例えば、ビオチン結合）が起こった時にコンフォメーション変化をもたらす。対照的に、二量体リザビジンタンパク質は、リガンド（例えば、ビオチン）結合が起こった時にコンフォメーションの変化を受けない、より閉鎖的なタンパク質コンフォメーションを有する。
全長リザビジンタンパク質は、N末端の24アミノ酸シグナル配列を記載しているHelppolainenら（Biochem J.,2007,405:397-405）によって最初に記載された。Helppolainenは、SEQ ID NO:4の全長リザビジンの最初の24残基（アミノ酸1〜24）の除去を報告している。本発明者らは、以前に（参照によってその全体が本明細書中に組み入れられる）米国出願US2014/0154287において、全長リザビジンの最初の44残基（即ち、SEQ ID NO:4のアミノ酸1〜44）が、コア構造およびリザビジンのビオチンと結合する生物学的機能のために必要ではないことを証明した。本発明者らは、全長リザビジンの最初の44残基を異なるシグナルペプチド、例えば、大腸菌（E.coli）シグナルペプチドに交換した時に、増加した可溶性および増加した分泌が検出されるため、全長リザビジンのSEQ ID NO:4のアミノ酸25〜44（即ち、アミノ酸
Figure 2019524639
）が、大腸菌において発現されるリザビジンの可溶性および分泌を低下させることも以前に証明した。
いくつかの態様において、ビオチン結合タンパク質は、SEQ ID NO:4のアミノ酸1〜44を欠く、即ち、SEQ ID NO:4の野生型リザビジンのアミノ酸
Figure 2019524639
を欠く野生型リザビジンタンパク質の断片である。いくつかの態様において、ビオチン結合タンパク質は、
Figure 2019524639
のアミノ酸配列の少なくとも80個の連続アミノ酸を含むリザビジンの断片である。
いくつかの態様において、ビオチン結合ドメインは、SEQ ID NO:1と少なくとも50％のアミノ酸同一性、少なくとも55％の同一性、少なくとも60％の同一性、少なくとも65％の同一性、少なくとも70％の同一性、少なくとも75％の同一性、少なくとも80％の同一性、好ましくは、少なくとも85％の同一性、少なくとも90％の同一性、少なくとも95％のアミノ酸同一性、少なくとも96％のアミノ酸同一性、少なくとも97％のアミノ酸同一性、少なくとも98％のアミノ酸同一性、または少なくとも99％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ビオチン結合ドメインは、SEQ ID NO:1と少なくとも70％の同一性、少なくとも75％の同一性、少なくとも80％の同一性、好ましくは、少なくとも85％の同一性、少なくとも90％の同一性、少なくとも95％のアミノ酸同一性、少なくとも96％のアミノ酸同一性、少なくとも97％のアミノ酸同一性、少なくとも98％のアミノ酸同一性、または少なくとも99％のアミノ酸配列同一性を有し、かつビオチンとの結合に関してSEQ ID NO:1の生物学的活性の少なくとも80％を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、本明細書中に記載されたビオチン結合タンパク質は、N末端またはC末端で1個または複数個のアミノ酸によって延長されてもよいが、但し、ビオチン結合ドメインのN末端は、野生型リザビジンのアミノ酸配列1〜44に相当するアミノ酸配列を含まない。本明細書中に開示されるように、本発明者らは、野生型リザビジンのN末端の最初の44アミノ酸の短縮が、大腸菌における可溶型ビオチン結合タンパク質の発現を劇的に増加させ得ることを以前に発見した。従って、本明細書中に記載されたビオチン結合タンパク質は、配列X1-X2-X3（X2は SEQ ID NO:4の野生型リザビジンのアミノ酸45〜179に相当するアミノ酸配列を有するペプチドであり、X1およびX3は独立に存在しないか、またはX1が存在せず、X3が存在するか、またはその逆に、X1が存在し、X3が存在せず、X1およびX3が存在する場合、それらは、1〜約1000アミノ酸のペプチドであり得、但し、X1のN末端はSEQ ID NO:4の野生型リザビジンのN末端アミノ酸1〜44に相当するアミノ酸配列を含まない）を含み得る。いくつかの態様において、例えば、ビオチン結合タンパク質が配列X1-X2-X3を含む場合、X2は、SEQ ID NO:1を含むアミノ酸配列を有するペプチドまたはそれと少なくとも80％の配列同一性を有するタンパク質であり、X1はシグナルペプチド（またはリーダー配列）であり、X3は、1種または複数種のタンパク質、例えば、1種または複数種、例えば、少なくとも1種または少なくとも2種または少なくとも3種または少なくとも4種またはそれ以上の、例えば、タンパク質抗原のようなタンパク質を含む。
いくつかの態様において、本明細書中に記載されたビオチン結合タンパク質は、（例えば、ラビ（Rhavi）と呼ばれる）SEQ ID NO:1のリザビジンタンパク質またはそれと少なくとも80％の配列同一性を有するタンパク質を含む融合タンパク質であってよく、融合タンパク質は、例えば、ラビ-A、A-ラビ、ラビ-A-A；ラビ-A-B；ラビ-A-C、ラビ-A-B-C等（A、B、およびCは、別々のタンパク質であり、いくつかの態様において、抗原であり、いくつかの態様において、タンパク質抗原または多糖抗原であり得る）であり得る。
いくつかの態様において、ビオチン結合タンパク質は、少なくとも2種のタンパク質抗原に融合した、SEQ ID NO:1（またはそれと少なくとも80％または85％またはそれ以上の配列同一性を有するタンパク質）のC末端を含む融合タンパク質である。いくつかの態様において、抗原は、同じ抗原（例えば、SEQ ID NO:1-A-Aの融合タンパク質）、あるいは異なるタンパク質抗原（例えば、SEQ ID NO:1-A-Bの融合タンパク質）（AおよびBは異なる抗原である）であり得る。
いくつかの態様において、ビオチン結合タンパク質は、ビオチン結合タンパク質のN末端にコンジュゲートされたシグナルペプチドを含んでいてもよく、即ち、X1がシグナルペプチドを含んでいてもよい。N末端のシグナルペプチドは、リーダーペプチドとも呼ばれ、それは膜を介した移行の後に切断されてもよいしまたは切断されなくてもよい。分泌/シグナルペプチドは、参照によってその全体が本明細書中に組み入れられるUS2014/0154287に、より詳細に記載されており、本発明において使用するために包含される。
いくつかの態様において、ビオチン結合タンパク質は、ビオチン結合タンパク質のN末端にコンジュゲートされたシグナルペプチドを含んでいてもよく、即ち、X1がシグナルペプチドを含む。N末端のシグナルペプチドは、リーダーペプチドとも呼ばれ、それは膜を介した移行の後に切断されてもよいしまたは切断されなくてもよい。いくつかの態様において、大腸菌シグナル配列は、少なくとも
Figure 2019524639
を含むDsbaシグナル配列である。いくつかの態様において、シグナル配列は、
Figure 2019524639
である。分泌/シグナルペプチドは、より詳細に以下に記載される。いくつかの態様において、シグナル配列は、
Figure 2019524639
またはその誘導体もしくは機能性部分である。シグナル配列は、フレキシブルペプチドリンカーによって野生型ラビのアミノ酸45〜179を含む配列と融合していてよい。
いくつかの態様において、ビオチン結合タンパク質は、リザビジンと、1種または複数種のタンパク質、例えば、これに限定されるわけではないが、抗原とを含む融合タンパク質である。例えば、SEQ ID NO:1（またはそれと少なくとも80％または85％またはそれ以上の配列同一性を有するタンパク質）のC末端は、少なくとも1種または少なくとも2種または少なくとも3種または少なくとも4種またはそれ以上のタンパク質、例えば、抗原と融合している。
いくつかの態様において、本明細書中に開示される方法、組成物、およびキットは、ビオチン結合タンパク質と抗原とを含む融合タンパク質を精製するために使用され得る。いくつかの態様において、本明細書中に開示される方法、組成物、およびキットは、抗原と（例えば、共有結合で、例えば、架橋によって、あるいは非共有結合を介して）会合または複合体化したビオチン結合タンパク質を含むタンパク質を精製するために使用され得る。
いくつかの態様において、本明細書中に開示される方法、組成物、およびキットは、抗原（例えば、タンパク質またはペプチド抗原）と、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列の少なくとも80個の連続アミノ酸を含むか、またはSEQ ID NO:1と少なくとも50％のアミノ酸同一性、少なくとも55％の同一性、少なくとも60％の同一性、少なくとも65％の同一性、少なくとも70％の同一性、少なくとも75％の同一性、少なくとも80％の同一性、好ましくは、少なくとも85％の同一性、少なくとも90％の同一性、少なくとも95％のアミノ酸同一性、少なくとも96％のアミノ酸同一性、少なくとも97％のアミノ酸同一性、少なくとも98％のアミノ酸同一性、もしくは少なくとも99％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むリザビジンタンパク質とを含む融合タンパク質を精製するために使用され得る。いくつかの態様において、融合タンパク質は、リザビジンタンパク質と、抗原、例えば、以下に限定されるわけではないが、例えば、参照によってその全体が本明細書中に組み入れられるUS2015/0374811に開示されるSP0010、SP0043、SP0079、SP0084、SP0092、SP0098、SP0106、SP0107、SP0127、SP0149、SP0191、SP0198、SP0249、SP0321、SP0346、SP0402、SP0453、SP0564、SP0582、SP0589、SP0601、SP0604、SP0617、SP0620、SP0629、SP0648、SP0659、SP0662、SP0664、SP0678、SP0724、SP0742、SP0757、SP0785、SP0787、SP0872、SP0878、SP0899、SP1002、SP1026、SP1032、SP1069、SP1154、SP1267、SP1376、SP1386、SP1404、SP1405、SP1419、SP1479、SP1500、SP1545、SP1560、SP1624、SP1652、SP1683、SP1826、SP1872、SP1891、SP1897、SP1942、SP1966、SP1967、SP1998、SP2048、SP2050、SP2083、SP2084、SP2088、SP2145、SP2151、SP2187、SP2192、SP2197、SP2207、およびSP2218の肺炎球菌タンパク質またはそれらの断片のような肺炎球菌抗原とを含む。
いくつかの態様において、融合タンパク質は、リザビジンタンパク質と、抗原、例えば、病原性抗原または癌抗原またはその他の抗原とを含む。病原性抗原は、当技術分野において周知であり、例えば、参照によってその全体が本明細書中に組み入れられる米国特許出願第2014/0154287号または2017年3月28日に出願された米国仮出願第62/477,618号に開示されており、癌抗原も同様である。例示的な病原性抗原および癌抗原は、本明細書中に開示される。いくつかの態様において、本明細書中に開示される方法および組成物およびキットは、参照によってその全体が本明細書中に組み入れられる米国特許出願第2014/054286号および2017年3月28日に出願された米国仮出願第62/477,618号に開示されるリザビジンタンパク質の単離のために使用され得る。
いくつかの態様において、ビオチン結合タンパク質、例えば、SEQ ID NO:1のリザビジンタンパク質と融合されるかまたは複合体化される抗原は、病理、例えば、感染性疾患もしくは病原体または癌または自己免疫疾患のような免疫疾患に関連した抗原である。いくつかの態様において、抗原は、ウイルス、細菌、真菌、または寄生虫を含む多様な感染体のいずれかによって発現されたものであり得る。抗原には、例えば、病原性ペプチド、毒素、トキソイド、それらのサブユニット、またはそれらの組み合わせ（例えば、コレラ毒素、破傷風トキソイド）が含まれ得る。例示的な抗原には、例えば、以下に限定されるわけではないが、肺炎球菌抗原、結核抗原、炭疽抗原、HIV抗原、アシネトバクター抗原、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）抗原、腸内グラム陰性菌抗原（例えば、大腸菌抗原、サルモネラ（Salmonella）抗原、エンテロバクター（Enterobacter）抗原、クレブシエラ（Klebsiella）抗原、シトロバクター（Citrobacter）抗原、セラチア（Serratia）抗原）、非腸内グラム陰性菌抗原（例えば、百日咳（Pertussis）抗原、髄膜炎菌（Meningococcal）抗原、ヘモフィルス（Haemophilus）抗原、シュードモナス（Pseudomonas）抗原）、グラム陽性菌抗原、季節性もしくは伝染性インフルエンザ抗原、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）抗原、ヘモフィルス抗原、HPV抗原、トキソイド、毒素、もしくは毒素部分、真菌抗原、ウイルス抗原、癌抗原、またはそれらの組み合わせが含まれる。
いくつかの態様において、他のビオチン結合タンパク質を、本明細書中に開示される方法を使用して単離することができる。そのようなビオチン結合タンパク質には、10-7mol/l以下、10-8mol/l以下、10-9mol/l以下、10-10mol/l以下、または10-11mol/l以下の解離定数で、リポ酸と結合するか、または本明細書中に開示されるリポ酸化合物を含む化合物と結合することができるポリペプチドが含まれるが、これらに限定されるわけではない。そのようなビオチン結合タンパク質の例には、ストレプトアビジン（UniProt P22629）、アビジン（UniProt P02701）、リザビジン（UniProt Q8KKW2）、またはそれらのバリアントおよび機能性相同体が含まれるが、これらに制限されるわけではない。
いくつかの態様において、ビオチン結合タンパク質は、10-7mol/l以下、10-8mol/l以下、10-9mol/l以下、10-10mol/l以下、または10-11mol/l以下の解離定数で、ビオチンと結合するか、またはビオチンモエティを含む化合物と結合することができるポリペプチドであるが、これらに限定されるわけではない。そのようなビオチン結合タンパク質の例には、ストレプトアビジン（UniProt P22629）、アビジン（UniProt P02701）、リザビジン（UniProt Q8KKW2）、またはそれらのバリアントおよび機能性相同体が含まれるが、これらに制限されるわけではない。本明細書に含有されるUniProt番号は、Protein knowledgebase（Swiss Institute of Bioinformatics）におけるエントリーをさす。
いくつかの態様において、本明細書中に開示される方法による単離および精製のためのリザビジンタンパク質またはその融合タンパク質は、脂質付加配列、例えば、
Figure 2019524639
またはそれと85％の同一性を有するアミノ酸をN末端に含むことができる。
いくつかの態様において、リザビジンタンパク質またはその融合タンパク質は、ビオチン結合ドメインのN末端に直接的に（例えば、結合を介して）または間接的に（例えば、リンカーによって）連結されたシグナルペプチドを含んでいてよい。いくつかの態様において、シグナルペプチドは、ペプチドリンカーによってビオチン結合ドメインのN末端に連結されていてよい。ペプチドリンカー配列は、任意の長さであり得る。例えば、ペプチドリンカー配列は、1アミノ酸長、2アミノ酸長、3アミノ酸長、4アミノ酸長、5アミノ酸長、6アミノ酸長、7アミノ酸長、8アミノ酸長、9アミノ酸長、10アミノ酸長、11アミノ酸長、12アミノ酸長、13アミノ酸長、14アミノ酸長、15アミノ酸長、またはそれ以上であり得る。いくつかの態様において、ペプチドリンカーは、4アミノ酸長である。
ペプチドリンカー配列は、任意のアミノ酸配列を含んでいてよい。例えば、ペプチドリンカーは、シグナルペプチターゼによって切断され得るアミノ酸配列を含んでいてよい。いくつかの態様において、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列AQDP（SEQ ID NO:12）またはVSDP（SEQ ID NO:13）を含む。
いくつかの態様において、本明細書中に開示される方法による単離および精製のためのリザビジンタンパク質またはその融合タンパク質は、C末端において1〜100アミノ酸のペプチドにコンジュゲートされていてよい。C末端のそのようなペプチドは、以下に限定されるわけではないが、例えば、精製タグ、他のドメインへのリンカー等のために使用され得る。いくつかの態様において、本明細書中に開示される方法による単離および精製のためのリザビジンタンパク質またはその融合タンパク質は、N末端またはC末端に、1種または複数種（例えば、1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、またはそれ以上）の精製タグを含む。精製タグの例には、ヒスチジンタグ、c-myタグ、Haloタグ、Flagタグ等が含まれるが、これらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、ビオチン結合タンパク質は、C末端に、ヒスチジンタグ、例えば、(His)6（SEQ ID NO.14）を含む。いくつかの態様において、本明細書中に開示される方法による単離および精製のためのリザビジンタンパク質またはその融合タンパク質は、アミノ酸配列
Figure 2019524639
のペプチドを含む。このC末端のペプチドは、精製のためのヒスチジンタグ、およびビオチンタンパク質に他のドメイン、例えば、抗原性ドメインを挿入するための場所を提供する。さらに、Helppolainenら（Biochem J.,2007,405:397-405）は、大腸菌におけるリザビジンの発現を記載しているが、リザビジンのビオチン結合ドメインのC末端に付加的なペプチドをコンジュゲートすることは、Helppolainenらにおいて教示または示唆されていない。
精製タグは、タグが外部に曝される確率を増強するため、ペプチドリンカーによって、本明細書中に開示される方法による単離および精製のためのリザビジンタンパク質またはその融合タンパク質にコンジュゲートされていてよい。リンカーの長さは、少なくとも1（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15）アミノ酸であり得る。リンカーペプチドは、非限定的に、任意のアミノ酸配列を含んでいてよい。いくつかの態様において、リンカーペプチドは、アミノ酸配列
Figure 2019524639
を含む。いくつかの態様において、本明細書中に開示される方法による単離および精製のためのリザビジンタンパク質またはその融合タンパク質は、C末端に、アミノ酸配列
Figure 2019524639
を含んでいてよい。他の精製タグは、公知であり、本明細書中の使用のために包含される。いくつかの態様において、精製タグは、リザビジンタンパク質またはその融合タンパク質が精製された後、切断されるかまたは除去されてよい。いくつかの態様において、ビオチン結合タンパク質、例えば、リザビジンタンパク質またはその融合タンパク質は、精製タグを含まない。
いくつかの態様において、本明細書中に開示される方法による単離および精製のためのリザビジンタンパク質またはその融合タンパク質は、タンパク質、例えば、抗原を、リザビジンタンパク質から分離するスペーサーペプチド、例えば、14残基スペーサー
Figure 2019524639
を有する。そのような短いスペーサーのコード配列は、相補的な1対のプライマーをアニールすることによって構築され得る。当業者は、選択されたスペーサーをコードするオリゴヌクレオチドを設計し合成することができる。スペーサーペプチドは通常、グリシンおよびプロリンのような非極性アミノ酸残基を有するべきである。
脂質付加されたリザビジン融合タンパク質またはビオチン結合タンパク質
別の局面において、脂質付加されたビオチン結合タンパク質、例えば、脂質付加されたリザビジンタンパク質またはその融合タンパク質の精製および単離が、本明細書中に提供される。本明細書中で使用されるように、「脂質付加されたビオチン結合タンパク質」という用語は、脂質に共有結合でコンジュゲートされたビオチン結合タンパク質をさす。脂質モエティは、ジアシル脂質またはトリアシル脂質であり得る。
いくつかの態様において、本明細書中に開示される方法による単離および精製のためのリザビジンタンパク質またはその融合タンパク質は、脂質付加配列を含む。本明細書中で使用されるように、「脂質付加配列」という用語は、脂質付加配列を保持するポリペプチドの、細菌、例えば、大腸菌における脂質付加を容易にするアミノ酸配列をさす。脂質付加配列は、タンパク質のN末端またはC末端に存在していてよい。従来の組換えテクノロジーによって大腸菌において発現された時に脂質付加された形態にある融合タンパク質が形成されるよう、脂質付加配列は、組換えビオチン結合タンパク質に連結されていてよい。いくつかの態様において、脂質付加配列は、ビオチン結合タンパク質のN末端に位置する。
当業者に公知の任意の脂質付加配列を使用することができる。いくつかの態様において、脂質付加配列は、
Figure 2019524639
またはその誘導体もしくは機能性部分である。他の例示的な脂質付加配列には、
Figure 2019524639
およびその誘導体または機能性部分が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
いくつかの態様において、脂質付加配列は、脂質付加配列をビオチン結合タンパク質に付着させるペプチドリンカーを介して、リザビジンタンパク質またはその融合タンパク質に融合していてよい。いくつかの態様において、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列VSDP（SEQ ID NO:25）またはAQDP（SEQ ID NO:26）を含む。
いくつかの態様において、本明細書中に記載されるリポタンパク質である、本明細書中に開示される方法による単離および精製のためのリザビジンタンパク質またはその融合タンパク質は、増強された免疫原性を有する。理論によって拘束されることは望まないが、リポタンパク質またはリポペプチドのN末端の脂質モエティは、アジュバント活性に寄与する。
いくつかの態様において、本明細書中に開示される方法、組成物、およびキットを使用して単離され精製されるビオチン結合タンパク質は、ビオチンに対する高い親和性を有するストレプトアビジン-リザビジンキメラであるが、モノマーとして（ワールドワイドウェブ上の「ncbi.nlm.nih.qov/pubmed/228G8584」に見出され得る、Lim,KH,Huang,H,Pralle,A,Park,S.「タンパク質標識および一価ビオチン検出のための安定的な高親和性ストレプトアビジンモノマー（Stable,High-Affinity Streptavidin Monomer for Protein Labeling and Monovalent Biotin Detection）」Biotechnol Bioeng.2013 Jan;1 10(1):57-67を参照すること）、または参照によってその全体が本明細書中に組み入れられるWO2015/095603に開示されたように発現されてもよい。
いくつかの態様において、本明細書中に開示される方法、組成物、およびキットを使用して単離され精製されるビオチン結合タンパク質は、アビジン、ストレプトアビジン、またはブラダビジン（bradavidin）（Brad）、ニュートラアビジン、AVRタンパク質、タマビジン（Tamavidin）1、タマビジン2、またはそれらの相同体、融合タンパク質、キメラ、もしくはバリアントである。
本明細書中に開示される方法、組成物、およびキットを使用して単離され精製されるビオチン結合タンパク質は、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、AVRタンパク質（Biochem J,(2002),363:..609-617）、ブラダビジン（J Biol Chem,and(2005),280:13250-13255）、リザビジン（Biochem J.,(2007.),405:397-405）、タマビジン1またはタマビジン2（参照によってその全体が本明細書中に組み入れられるWO02/072817、US20120064543A1に開示されている）、およびビオチンに強く結合するそれらのバリアントであり得る。好ましくは、少なくとも、10-6、より好ましくは、10-8以下、より好ましくは、10-10以下のビオチンの解離定数（KD）。
いくつかの態様において、大腸菌において高発現されるタマビジンおよびそのバリアント。タマビジンは、食用キノコである担子菌類タモギタケ（Pleurotus conucopiae）から見出されたビオチン結合タンパク質である（WO02/072817、Takakura et al(2009)FEBS J 276:.1383-1397）。例えば、高結合能・低非特異的結合タマビジン（PCT/JP2009/64302）のようなタマビジンのバリアントとして。タマビジン1およびタマビジン2ならびにそれらのバリアントの配列は、参照によってその全体が本明細書中に組み入れられるUS20120064543A1に開示されている。タマビジン2は、高い親和性でビオチンと結合し、大腸菌において可溶型で高度に産生される真菌アビジン様タンパク質である（Takakura et al.,J Biotechnol.2010,15;145(4):317-22を参照すること）。
いくつかの態様において、本明細書中に開示される方法、組成物、およびキットを使用して単離され精製されるビオチン結合タンパク質は、参照によってその全体が本明細書中に組み入れられるDubdas et al.「ストレプトアビジン結合テクノロジー；化学的適用および生物学的適用における改善および革新（Streptavidin-binding technology;improvements and innovations in chemical and biological applications）」Applied Microbiol Biotech,2013;DOI;10.1007/s00253-013-5232-zに開示されるような、単量体ストレプトアビジンまたはストレプトアビジンバリアントである。
LAマトリックスを調製する方法
本明細書中に開示される方法および組成物において有用なリポ酸マトリックスまたはリポ酸樹脂を調製するための一般的な手法は、一般に公知の反応を使用して、リポ酸（LA）化合物を粒子に共有結合で付着させることを含む。代表的な手法の詳細は、「リポ酸樹脂（LAマトリックス）の調製」という表題の下記の実施例1において例示される。
本発明の一つの態様は、固体表面に固定されたリポ酸（LA）化合物を利用する方法において、リザビジンタンパク質またはそれを含む複合体もしくは融合タンパク質を回収する過程を提供し、いくつかの態様において、本法は、以下の工程を含む：
（i）本明細書中の実施例において開示されるリポ酸化合物マトリックス（LAマトリックス）を調製する工程。
（ii）ビオチン結合タンパク質、例えば、リザビジンまたはリザビジンタンパク質を含む複合体もしくはリザビジン融合タンパク質を生物学的試料から精製する工程。いくつかの態様において、生物学的試料は、リザビジンもしくはリザビジン融合タンパク質を発現する組換えタンパク質発現系、例えば、以下に限定されるわけではないが、全て、当技術分野において十分に公知の、インビトロ（無細胞）タンパク質発現系、細菌タンパク質発現系、バキュロウイルス発現系のようなウイルス発現系、昆虫発現系、真核生物発現系、哺乳動物発現系、および化学的タンパク質合成を含む、大規模もしくは小規模の組換えタンパク質発現系から得られた細菌培養試料または任意の生物学的試料である。
簡単にするため、理論によって拘束されることは望まないが、出願人は、本明細書中に記載されるLAマトリックスを使用した、細菌発現系を使用して発現されたリザビジンまたはリザビジン融合タンパク質の精製の工程を、本明細書中に記載する；
（i）リザビジンまたはリザビジン融合タンパク質の細菌発現の後、細菌懸濁物を遠心分離し、ペレットを収集し、例えば、20mMトリス、1M NaCl（pH8.0）のような適切な溶解緩衝液に再懸濁させる。標準的な細菌溶解緩衝液、例えば、0.75M〜1.5M NaClを含み、7.5〜9.0のpHを有する溶解緩衝液が、使用するために包含される。いくつかの態様において、溶解緩衝液は、任意で、DNase、RNase、およびプロテイナーゼ阻害剤を含んでいてよく、任意で、10mM MgCl2を含んでいてよい。細菌細胞の溶解は、任意で、超音波処理またはその他のそのようなアプローチによって補助されてもよく、その後、細胞溶解物が遠心分離によって収集される。
（ii）工程（i）からの細胞溶解物を、本明細書中に開示されるLAマトリックスに添加し、十分に混合し、リザビジンまたはリザビジン融合タンパク質のリポ酸化合物との結合を可能にするために適切な量の時間、インキュベートする。典型的には、インキュベーション時間は、例えば、少なくとも1時間または少なくとも2時間または少なくとも約3時間または少なくとも約4時間または少なくとも約5時間または少なくとも約6時間または少なくとも約12時間または少なくとも約24時間、または24時間を超えるが3日未満であり得る。いくつかの態様において、インキュベーションは、振とうしながら、4℃で約2〜4時間行われる。いくつかの態様において、単離すべきリザビジンもしくはリザビジン融合タンパク質を含む細胞溶解物をLAマトリックスに添加する前に、細胞を溶解するために使用された溶解緩衝液またはその他の緩衝溶液によって、LAマトリックスを平衡化する。
（iii）リザビジンまたはリザビジン融合タンパク質を含む試料とのLAマトリックスのインキュベーションの後、LAマトリックスを、適切な洗浄緩衝液、例えば、これに限定されるわけではないが、50％エタノール、20mMトリス、1M NaClによって洗浄する。当業者に公知の任意の洗浄緩衝液が、本明細書中の洗浄緩衝液として使用するために包含される。タンパク質がフロースルー（溶出液）に検出されなくなった時、洗浄を停止する。
（iv）溶出緩衝液、例えば、約7.5〜8.5のpHの過剰リポ酸を含む溶液によってタンパク質を溶出させることによって、リザビジンまたはリザビジン融合物のLAマトリックスからの放出を行う。いくつかの態様において、適当な溶出緩衝液は、20mMトリス、1M NaCl、5％エタノール（pH8）中にリポ酸（約1〜10mg/ml、例えば、約2.5mg/mlのリポ酸）を含む。
当業者は、本明細書中に開示されるリポ酸マトリックスの体積をスケールアップすることができる。例えば、10mlまたは約20mlまたは約30mlまたは約40mlまたは約50mlまたは約60mlまたは約70mlまたは約80mlまたは約90mlまたは約100mlまたは100〜150mlまたは150〜200mlまたは200〜300mlまたは300〜400mlまたは400〜500mlまたは500ml超の体積を有するLAマトリックスが、当業者によって調製され得る。いくつかの態様において、洗浄緩衝液および溶出緩衝液の体積が、それに応じてスケールアップされ、LAマトリックスに適用される関心対象のビオチン結合タンパク質（例えば、リザビジンタンパク質もしくはリザビジン融合タンパク質またはそれらの複合体）を含む溶解緩衝液の体積も、それに応じてスケールアップされる。
リザビジンタンパク質もしくはリザビジン融合タンパク質またはそれらの複合体のLAマトリックスへの結合は、典型的には、カラムクロマトグラフィによって達成される。即ち、LAマトリックスがカラムへと成形され、関心対象のリザビジンタンパク質（例えば、リザビジンタンパク質またはその融合タンパク質もしくは複合体）を含有している生化学的混合物を、カラムに通し、その後、1種または複数種の洗浄溶液をカラムに通すことによってカラムを洗浄し、その後、溶出緩衝液をカラムに通すことによって関心対象のリザビジンタンパク質（例えば、リザビジンタンパク質またはその融合タンパク質もしくは複合体）をカラムから溶出させる。
代替として、関心対象のリザビジンタンパク質（例えば、リザビジンタンパク質またはその融合タンパク質もしくは複合体）のLAマトリックスとの結合は、関心対象のリザビジンタンパク質（例えば、リザビジンタンパク質またはその融合タンパク質もしくは複合体）のLAマトリックスとの結合を可能にするため、関心対象のリザビジンタンパク質（例えば、リザビジンタンパク質またはその融合タンパク質もしくは複合体）を含有している生化学的混合物を、容器内でLAマトリックスと共にインキュベートし、固相媒体を（例えば、遠心分離によって）容器から取り出し、固相媒体は、不純物を除去するために洗浄され、（例えば、遠心分離によって）再び回収され、関心対象のリザビジンタンパク質（例えば、リザビジンタンパク質またはその融合タンパク質もしくは複合体）を固相媒体から溶出させる、バッチ処理によって達成されてもよい。
さらに別の態様において、バッチ処理とカラムクロマトグラフィとの組み合わせを使用することができる。例えば、バッチ処理によって、関心対象のリザビジンタンパク質（例えば、リザビジンタンパク質またはその融合タンパク質もしくは複合体）のLAマトリックスとの初期結合を達成することができ、次いで、固相媒体をカラムに充填し、その後、カラムを洗浄し、関心対象のリザビジンタンパク質（例えば、リザビジンタンパク質またはその融合タンパク質もしくは複合体）をカラムから溶出させることができる。
特定の固相マトリックスの性質、特に、固相に付着した標的の結合特性が、その固相マトリックスを使用して精製することができる関心対象のリザビジンタンパク質（例えば、リザビジンタンパク質またはその融合タンパク質もしくは複合体）のタイプを決定する。例えば、いくつかの態様において、LAマトリックスは、固相に付着したリポ酸化合物として細菌細胞壁タンパク質プロテインAを含むプロテインAカラムである。プロテインAの結合特性は、当技術分野において十分に確立されている。
リザビジンタンパク質、即ち、SEQ ID NO:1のリザビジンタンパク質の精製が、本明細書中に開示されるLAアフィニティクロマトグラフィを使用して精製された例示的なビオチン結合ドメインとして示されるが、本明細書中に記載されるLAマトリックスを使用して、類似した方法を使用して、他のビオチン結合ドメインを精製することもできることは、当業者に容易に明らかであろう。LAアフィニティクロマトグラフィマトリックスからの関心対象のビオチン結合タンパク質の精製を達成するため、LAマトリックスからのビオチン結合タンパク質の溶出の前および後の両方において付加的な工程が実施されることも、当業者に容易に明らかであろう。例えば、洗浄工程の前に、本発明の方法は、アフィニティクロマトグラフィLAマトリックスをローディングバッファー（または溶解緩衝液）によって平衡化する平衡化工程、および関心対象のタンパク質を含有している生化学的混合物（例えば、細胞採取物）をLAマトリックスに適用するロードまたは捕捉の工程を含み得る。平衡化緩衝液およびローディングバッファーのための適当な条件は、LAマトリックスの性質および精製すべき関心対象のビオチン結合タンパク質に依って変動し、当業者は、当技術分野において十分に確立された方法および情報を使用して、そのような条件を容易に決定することができる。LAマトリックスカラムでのリザビジンタンパク質の精製のための平衡化緩衝液およびローディングバッファー（即ち、溶解緩衝液）の非限定的な例は、実施例1において示される。
さらに、前述の洗浄工程の後、本発明の方法は、一般的な洗浄溶液を利用した一つもしくは複数の付加的な洗浄工程、および/または関心対象のビオチン結合タンパク質をLAマトリックスから溶出させるため、溶出緩衝液がアフィニティクロマトグラフィLAマトリックスに適用される溶出工程を含み得る。溶出緩衝液のための適当な条件は、LAマトリックスの性質および精製すべき関心対象のビオチン結合タンパク質に依って変動し、当業者は、当技術分野において十分に確立された方法および情報を使用して、そのような条件を容易に決定することができる。典型的には、関心対象のタンパク質のLAマトリックスからの溶出は、8.0〜9.5のpHで実施される。LAマトリックスカラムでのリザビジンタンパク質の精製のための溶出緩衝液の非限定的な例は、実施例1において示される。
分子生化学および細胞生化学における一般的な方法は、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd Ed.(Sambrook et al.,Harbor Laboratory Press 2001)；Short Protocols in Molecular Biology,4th Ed.(Ausubel et al.eds.,John Wiley & Sons 1999)； Protein Methods(Bollag et al.,John Wiley & Sons 1996)；Nonviral Vectors for Gene Therapy(Wagner et al.eds.,Academic Press 1999)；Viral Vectors(Kaplift & Loewy eds.,Academic Press 1995)；Immunology Methods Manual(I.Lefkovits ed.,Academic Press 1997)；およびCell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology(Doyle & Griffiths,John Wiley & Sons 1998)のような標準的な教科書にも見出され得る。本開示中に言及された遺伝子操作のための試薬、クローニングベクター、およびキットは、BioRad、Stratagene、Invitrogen、Sigma-Aldrich、およびClonTechのような商業的供給元から入手可能である。
洗浄溶液
いくつかの態様において、本明細書中に開示される方法の洗浄工程は、ビオチン結合ドメインまたはビオチン結合タンパク質ではない、高分子量（HMW）種および宿主細胞タンパク質（HCP）を含む多様な不純物を除去するために有効である。
宿主細胞タンパク質（HCP）ならびに高分子量（HMW）種および低分子量（LMW）種のような生成物関連不純物を含む不純物の効率的な除去は、ビオチン結合ドメイン、例えば、リザビジンタンパク質またはその融合タンパク質もしくは複合体の下流処理における重大な因子である。いくつかの態様において、洗浄緩衝液は、20mMトリス、1M NaCl（pH 8.0）を含む。
溶出緩衝液
別の局面において、本発明は、（a）ビオチン結合タンパク質を含む混合物をLAマトリックスカラムにロードする工程；（b）不純物をLAマトリックスカラムから除去する本明細書中に開示される洗浄溶液によってLAマトリックスカラムを洗浄する工程；および（c）例えば、リザビジンタンパク質またはその融合タンパク質もしくは複合体のようなビオチン結合タンパク質をLAマトリックスカラムから溶出させる工程を含む、LAマトリックスカラムを使用して、例えば、リザビジンタンパク質またはその融合タンパク質もしくは複合体のようなビオチン結合タンパク質を作製する方法を提供する。
溶出工程のいくつかの態様において、ビオチン結合ドメインの脱着、即ち、放出を提供する条件の下で、溶出剤（または溶出緩衝液）をマトリックスに通す。そのような条件は通常、pH、塩濃度、即ち、イオン強度、疎水性等の変化によって提供される。勾配溶出および段階的溶出のような様々な溶出スキームが公知である。いくつかの態様において、溶出緩衝液は、リポ酸-ビオチン結合ドメイン相互作用に取って代わるであろう競合物質を含む。いくつかの態様において、競合物質は、例えば、高濃度の本明細書中に開示されるリポ酸化合物、または本明細書中に開示されるビオチンもしくはビオチン誘導体である。別の態様において、LAマトリックスからビオチン結合タンパク質を放出させる競合物質は、ビオチン、PEG-ビオチン、イミノビオチン、デスチオビオチン、ジアミノビオチン、またはそれらのバリアントもしくは誘導体である。
いくつかの態様において、適当な溶出緩衝液は、20mMトリス、1M NaCl、5％エタノール（pH 8.0）中の約1.0mg/ml〜約10.0mg/mlのリポ酸を含む。
いくつかの態様において、本明細書中に開示される方法、キット、および組成物において使用するための溶出緩衝液は、1.0mg/ml超の本明細書中に開示されるリポ酸またはリポ酸化合物、10mg/ml未満のリポ酸またはリポ酸化合物を含む。いくつかの態様において、本明細書中に開示される方法、キット、および組成物において使用するための溶出緩衝液は、約1.0mg/mlまたは約1.5mg/mlまたは約2.0mg/mlまたは約2.5mg/mlまたは約3.0mg/mlまたは約3.5mg/mlまたは約4.0mg/mlまたは約4.5mg/mlまたは約5.0mg/mlまたは約5.5mg/mlまたは約6.0mg/mlまたは約6.5mg/mlまたは約7.0mg/mlまたは約7.5mg/mlまたは約8.0mg/mlまたは約8.5mg/mlまたは約9.0mg/mlまたは約9.5mg/mlまたは約10.0mg/mlの本明細書中に開示されるリポ酸またはリポ酸化合物を含む。
いくつかの態様において、本明細書中に開示される方法において使用するための溶出緩衝液は、不純物とアフィニティマトリックスの1種または複数種の成分との間のイオン相互作用を破壊するために十分なタイプおよび濃度の非緩衝塩を含んでいてよい。
本明細書中で使用されるように、「非緩衝塩」という用語は、適用された（高pHのような）条件の下で、酸または塩基の添加時に洗浄溶液のpHの保持に実質的に寄与しないようなタイプおよび濃度の、溶出溶液中に存在する塩をさす。典型的には、非緩衝塩は、イオン性塩である。非緩衝塩には、ClまたはBr（より好ましくはCl）を含むものを含むハロゲン塩、具体的には、Na、K、Ca、およびMg（より好ましくは、NaまたはK）を含むアルカリ金属またはアルカリ土類金属を含むハロゲン塩が含まれる。「非緩衝塩」という用語には、適用された条件の下で洗浄溶液のpHの保持に実質的に寄与する酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、およびトリスのような緩衝塩は含まれない。好ましい態様において、非緩衝塩は、（例えば、ClまたはBrを含む）ハロゲン塩である。別の態様において、非緩衝塩は、ナトリウム（Na）、カリウム（K）、カルシウム（Ca）、またはマグネシウム（Mg）、より好ましくは、ナトリウム（Na）またはカリウム（K）を含むハロゲン塩である。さらに別の態様において、非緩衝塩は、NaCl、KCl、CaCl2、およびMgCl2からなる群より選択される。特に好ましい態様において、非緩衝塩は、塩化ナトリウム（NaCl）である。典型的には、非緩衝塩は、少なくとも1Mの「高い」濃度で使用される。他の適当な濃度および濃度範囲は、以下にさらに記載される。
いくつかの態様において、非緩衝塩は、ハロゲン塩である。特に好ましい態様において、非緩衝塩は、塩化ナトリウム（NaCl）である。他の態様において、非緩衝塩は、例えば、塩化カリウム（KCl）、塩化カルシウム（CaCl2）、または塩化マグネシウム（MgCl2）であり得る。洗浄溶液中の非緩衝塩の濃度は、0.1M〜2.0M（例えば、0.1M、0.15M、0.2M、0.25M、0.3M、0.35M、0.4M、0.45M、0.5M、0.55M、0.6M、0.65M、0.7M、0.75M、0.8M、0.85M、0.9M、0.95M、1.0M、1.1M、1.15M、1.20M、1.25M、1.30M、1.35M、1.40M、1.45M、1.5M、1.55M、1.6M、1.65M、1.7M、1.75M、1.8M、1.85M、1.9M、1.95M、もしくは2.0M）、または0.5M〜1.5M（例えば、0.5M、0.55M、0.6M、0.65M、0.7M、0.75M、0.8M、0.85M、0.9M、0.95M、1.0M、1.1M、1.15M、1.2M、1.25M、1.3M、1.35M、1.4M、1.45M、もしくは1.5M）、または1M〜2M（例えば、1M、1.1M、1.15M、1.2M、1.25M、1.3M、1.35M、1.4M、1.45M、1.5M、1.55M、1.6M、1.65M、1.7M、1.75M、1.8M、1.85M、1.9M、1.95M、もしくは2M）である。ある種の態様において、溶出溶液中の非緩衝塩の濃度は、1M以上である。具体的な態様において、洗浄溶液中の非緩衝塩は、0.75Mもしくは約0.75M、1.0Mもしくは約1.0M、または1.25Mもしくは約1.25Mの濃度で存在する。
いくつかの態様において、本明細書中に開示される溶出緩衝溶液のpHは、典型的には、8.0超であるが、より低いpHも、本発明の溶出緩衝溶液で使用するために適当である。具体的な態様において、pHは、8.0超、好ましくは、少なくとも8.1、より好ましくは、少なくとも8.5または8.9である。一つの態様において、1種または複数種の洗浄溶液のpHは、8.1〜9.5の範囲内である。別の態様において、1種または複数種の溶出緩衝液のpHは、8.5〜9.5の範囲内である。別の態様において、1種または複数種の溶出緩衝液のpHは、約9.0である。別の態様において、1種または複数種の溶出緩衝液のpHは、9.0である。あるいは、精製すべきビオチン結合タンパク質に依って、より低いpH値、例えば、pH 5.0〜8.0の範囲内のpH、または7.5もしくは7.0もしくは6.5もしくは5.0のpHを使用することができる。精製すべきビオチン結合タンパク質の特性に依って、当業者は、溶出緩衝液および/または洗浄溶液の適切なpH値を選択することができる。従って、溶出緩衝溶液は、pHの調整および/または維持のための1種または複数種の緩衝剤を含有していてよい。溶出緩衝溶液に含まれ得る典型的な緩衝剤の非限定的な例には、トリス（トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミン）、ビストリス、ビストリスプロパン、ヒスチジン、トリエタノールアミン、ジエタノールアミン、ギ酸、酢酸、MES（2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸）、リン酸、HEPES（4-2-ヒドロキシエチル-1-ピペラジンエタンスルホン酸）、クエン酸、MOPS（3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸）、TAPS（3-{[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]アミノ}プロパンスルホン酸）、ビシン（N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)グリシン）、トリシン（N-トリス(ヒドロキシメチル)メチルグリシン）、TES（2-{[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]アミノ}エタンスルホン酸）、PIPES（ピペラジン-N,N'-ビス(2-エタンスルホン酸））、カコジル酸（ジメチルアルシン酸）、およびSSC（生理食塩水クエン酸ナトリウム）が含まれる。
いくつかの態様において、1種または複数種の溶出緩衝溶液のpHは、8.0超、好ましくは、少なくとも8.1、より好ましくは、少なくとも8.5、さらに好ましくは、少なくとも8.9である。一つの態様において、1種または複数種の溶出溶液のpHは、8.1〜9.5の範囲内である。別の態様において、1種または複数種の溶出溶液のpHは、8.5〜9.5の範囲内である。別の態様において、1種または複数種の溶出溶液のpHは、約9.0である。別の態様において、1種または複数種の溶出溶液のpHは、9.0である。
溶出緩衝液の環境は、アルカリ性、即ち、増加したpH値、例えば、約9または10までのような、約8.5超と定義され得る。
いくつかの態様において、本明細書中に記載される溶出工程は、95％超、より好ましくは、96％超、さらに好ましくは、97％超である、関心対象のビオチン結合タンパク質、例えば、リザビジンタンパク質またはその融合タンパク質もしくは複合体の収率をもたらす。溶出液中の％HMWとして表され得る溶出液中のHMW種の低下に関して、様々な態様において、本明細書中に記載される溶出工程は、10％未満または5％未満または2.0％未満または1％未満または0.5％未満である溶出液中の％HMWをもたらす。対数低下値（LRV）として表され得る溶出液中のHCPの低下に関して、様々な態様において、溶出工程は、少なくとも1.1または少なくとも1.3または少なくとも1.5または少なくとも2.0または少なくとも2.3または少なくとも2.5または少なくとも2.7である溶出液中のHCPについてのLRVをもたらす。
使用
例えば、本発明は、生物学的な関心対象の化合物、標的の、不均一な混合物からの検出、同定、決定、精製、分離、および/または単離の方法において使用され得る。そのような化合物は、本明細書中に記載されるリザビジンタンパク質もしくはその断片のようなビオチン結合タンパク質、または共有結合性の付着を介して（即ち、融合タンパク質としてもしくは架橋によって）もしくは非共有結合性の付着を介して（例えば、複合体内に存在する）、本明細書中に記載されるリザビジンタンパク質もしくは断片に付着した生物学的もしくは化学的な化合物として定義され得る。
本発明の方法は、本明細書中に開示されるリポ酸化合物と結合する本明細書中に記載されるリザビジンタンパク質またはその断片のようなビオチン結合タンパク質に付着したモエティ、例えば、任意のタイプの細胞または細胞成分の、生物学的試料または人工培地からの精製または単離に適用され得る。ヒトまたは動物の起源に由来する代表的な生物学的試料には、全血、および血漿、バフィーコート、または白血球フェレーシス生成物、血清のような血液由来の生成物、唾液、リンパ液、胆汁、尿、乳、排泄物、脳脊髄液、または髄液、精液、涙液、膣分泌物等のようなその他の体液、ならびに便標本が含まれる。骨格筋、心臓、腎臓、肺、脳、骨髄、皮膚等のようなヒトもしくは動物の組織の液体調製物、または密度勾配遠心分離等によって入手された細胞の抽出物もしくは分泌物および細胞懸濁物をアッセイすることも可能であり、土壌、水、または食品試料のような環境試料をアッセイすることも可能である。そのような試料は、そのまま使用してもよいし、または様々な精製、汚染除去、ろ過、もしくは濃縮の方法に供されてもよい。試料には、免疫磁気分離のような他の細胞または生体分子の分離過程によって入手された、半純粋調製物のような、比較的純粋なまたは部分的に精製された出発材料も含まれ得る。
さらに、本明細書中に開示されるリポ酸化合物と結合する本明細書中に記載されるリザビジンタンパク質またはその断片のようなビオチン結合タンパク質に付着したまたは会合したミトコンドリアおよび核のような細胞内成分ならびにタンパク質および核酸のような高分子の単離およびその後の遊離に、本発明による方法が適用され得ることは、注目されるべきである。単離すべき実体は、天然に抗原性であってもよいし、または人工的に抗原性にされてもよい。
いくつかの態様において、本明細書中に開示されるリポ酸化合物と結合する本明細書中に記載されるリザビジンタンパク質またはその断片のようなビオチン結合タンパク質と会合したモエティは、より大きい生物学的実体、例えば、細胞の表面に会合した特定の構造分子、例えば、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、脂質、または炭水化物等であり得る。他の標的は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質、核酸（DNA、RNA、PNA、アプタマー）、ならびに核酸前駆体（ヌクレオシドおよびヌクレオチド）、多糖、脂質小胞のような脂質を含む生物学的物質であり得る。従来のストレプトアビジン/ビオチン系において検出可能であり、本明細書中で有用な典型的なタンパク質には、サイトカイン、ホルモン、ビタミン表面受容体、ハプテン、抗原、抗体、酵素、増殖因子、組換えタンパク質、毒素、ならびにそれらの断片および組み合わせが含まれる。
「細胞」という用語は、全ての（古細菌およびマイコプラズマを含む）原核細胞および真核細胞、ならびにウイルスおよびオルガネラ（例えば、ミトコンドリアおよび核）のような細胞内成分のようなその他の実体を含むため、本明細書中で使用される。従って、代表的な「細胞」には、全てのタイプの哺乳動物細胞および非哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、酵母細胞、原虫、細菌、プロトプラスト、ならびにウイルスが含まれる。
いくつかの態様において、本明細書中に開示される方法および組成物およびキットは、ビオチン結合タンパク質、例えば、リポ酸化合物と結合するリザビジンタンパク質またはその融合タンパク質に関連した複合体または細胞の単離のために使用され得る。
いくつかの態様において、本明細書中に開示される方法および組成物およびキットは、参照によってその全体が本明細書中に組み入れられる米国特許出願第2014/054286号に開示されるリザビジンタンパク質の単離のために使用され得る。
いくつかの態様において、本明細書中に開示される方法および組成物およびキットは、参照によってその全体が本明細書中に組み入れられる米国特許出願第2014/0154287号に開示された多重抗原提示（MAPS）複合体において使用するためのビオチン結合タンパク質の単離のために使用され得る。
いくつかの態様において、本明細書中に開示される方法および組成物およびキットは、複数の異なるリザビジン融合タンパク質を同時に単離するため、例えば、少なくとも2種または少なくとも3種または少なくとも約4種または4〜5種または5〜7種または7〜10種または10〜20種または20種超、50種未満の異なるリザビジン融合タンパク質を同時に単離するため、使用され得る。
いくつかの態様において、本明細書中に開示される方法および組成物およびキットは、単独の、または抗原、例えば、病原性抗原もしくは癌抗原等に融合した、SEQ ID NO:1と少なくとも70％の配列同一性を含むリザビジンタンパク質の単離のために使用され得る。例えば、病原性抗原は、当技術分野において周知であり、米国特許出願第2014/0154287号に開示されており、癌抗原も同様である。
いくつかの態様において、ビオチン結合タンパク質、例えば、SEQ ID NO:1のリザビジンタンパク質と融合されるかまたは複合体化される抗原は、病理、例えば、感染性疾患もしくは病原体、または癌、または自己免疫疾患のような免疫疾患に関連した抗原である。いくつかの態様において、抗原は、ウイルス、細菌、真菌、または寄生虫を含む多様な感染体のいずれかによって発現されたものであり得る。抗原には、例えば、病原性ペプチド、毒素、トキソイド、それらのサブユニット、またはそれらの組み合わせ（例えば、コレラ毒素、破傷風トキソイド）も含まれ得る。
抗原が由来し得る感染性ウイルスの非限定的な例には、例えば、レトロウイルス科（Retroviridae）；ピコルナウイルス科（Picornaviridae）（例えば、ポリオウイルス、A型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；（胃腸炎を引き起こす株のような）カリシウイルス科（Calciviridae）；トガウイルス科（Togaviridae）（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラビウイルス科（Flaviridae）（例えば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱ウイルス）；コロナウイルス科（Coronaviridae）（例えば、コロナウイルス）；ラブドウイルス科（Rhabdoviridae）（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（Filoviridae）（例えば、エボラウイルス）；パラミクソウイルス科（Paramyxoviridae）（例えば、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器多核体ウイルス）；オルトミクソウイルス科（Orthomyxoviridae）（例えば、インフルエンザウイルス）；ブニヤウイルス科（Bungaviridae）（例えば、ハンタンウイルス、ブニヤウイルス、フレボウイルス、およびナイロウイルス）；アレナウイルス科（Arena viridae）（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（Reoviridae）（例えば、レオウイルス、オルビウイルス、およびロタウイルス）；ビルナウイルス科（Birnaviridae）；ヘパドナウイルス科（Hepadnaviridae）（B型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（Parvoviridae）（パルボウイルス）；パポーバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス科（Adenoviridae）（大部分のアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科（Herpesviridae）（単純ヘルペスウイルス（HSV）1およびHSV-2、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（CMV）、マレック病ウイルス、ヘルペスウイルス）；ポックスウイルス科（Poxviridae）（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；ならびに（アフリカブタコレラウイルスのような）イリドウイルス科（Iridoviridae）；ならびに未分類のウイルス（例えば、海綿状脳症の病因媒介物、（B型肝炎ウイルスの欠損サテライトであると考えられている）デルタ型肝炎の媒介物、非A非B型肝炎の媒介物（クラス1＝経口伝播型；クラス2＝非経口伝播型（即ち、C型肝炎）；ノーウォークウイルスおよび関連ウイルス、ならびにアストロウイルス）が含まれる。本明細書中に記載された組成物および方法は、これらのウイルス性媒介物による感染の処置において使用するために企図される。
抗原が由来し得る真菌感染の例には、アスペルギルス症；（カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）によって引き起こされる）鵞口瘡；（クリプトコッカス（Cryptococcus）によって引き起こされる）クリプトコッカス症；およびヒストプラズマ症が含まれる。従って、感染性真菌の例には、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（neoformans）、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）、コクシジオイデス・イミチス（Coccidioides immitis）、ブラストミセス・デルマティティディス（Blastomyces dermatitidis）、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）、カンジダ・アルビカンスが含まれるが、これらに限定されるわけではない。これらの生物の成分は、本明細書中に記載されるMAPS内の抗原として含まれ得る。
抗原が由来する感染性微生物の例には、例えば、百日咳菌（Bordatella pertussis）、ブルセラ（Brucella）、エンテロコッカス（Enterococci）種、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、淋菌（Neisseria gonorrheae）、モラクセラ（Moraxella）、分類可能なまたは無莢膜型のヘモフィルス、シュードモナス、サルモネラ、シゲラ（Shigella）、エンテロバクター、シトロバクター、クレブシエラ、大腸菌、ピロリ菌（Helicobacter pylori）、クロストリジウム、バクテロイデス（Bacteroides）、クラミジア科（Chlamydiaceae）、コレラ菌（Vibrio cholera）、マイコプラズマ（Mycoplasma）、トレポネーマ（Treponemes）、ライム病ボレリア（Borelia burgdorferi）、在郷軍人病菌（Legionella pneumophilia）、（結核菌（M.tuberculosis）、M.アビウム（avium）、M.イントラセルラーレ（intracellulare）、M.カンサシ（kansaii）、M.ゴルドナエ（gordonae）、らい菌（M.leprae）のような）マイコバクテリウム（Mycobacteria）種、黄色ブドウ球菌、リステリア菌（Listeria monocytogenes）、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）（A群ストレプトコッカス）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Streptococcus agalactiae）（B群ストレプトコッカス）、ストレプトコッカス（緑色連鎖球菌群）、フェカリス菌（Streptococcus faecalis）、ウシ連鎖球菌（Streptococcus bovis）、ストレプトコッカス（嫌気性菌種）、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）、病原性カンピロバクター種、エンテロコッカス種、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、炭疽菌（Bacillus anthracis）、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）種、ブタ丹毒菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）、破傷風菌（Clostridium tetani）、エンテロバクター・エロゲネス（aerogenes）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、レプトスピラ（Leptospira）種、パスツレラ・マルトシダ（Pasturella multocida）、バクテロイデス種、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum）、ストレプトバチルス・モニリフォルミス（Streptobacillus moniliformis）、梅毒トレポネーマ（Treponema pallidium）、トレポネーマ・ペルテヌエ（Treponema pertenue）、およびアクチノミセス・イスラエリ（Actinomyces israelli）が含まれる。
抗原が由来し得る付加的な寄生虫病原体には、例えば、赤痢アメーバ（Entamoeba histolytica）、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、リーシュマニア（Leishmania）種、トキソプラズマ原虫（Toxoplasma gondii）、リケッチア（Rickettsia）、および蠕虫（Helminths）が含まれる。
ビオチン結合タンパク質、例えば、リザビジンタンパク質と融合させる抗原は、例えば、短縮型肺炎球菌PsaAタンパク質、ニューモリシントキソイド肺炎球菌セリン/トレオニンプロテインキナーゼ（StkP）、肺炎球菌セリン/トレオニンプロテインキナーゼ反復単位（StkPR）、肺炎球菌PcsBタンパク質、ブドウ球菌α溶血素、結核菌mtbタンパク質ESAT-6、結核菌細胞壁コア抗原、クラミジアCT144ポリペプチド、CT242ポリペプチド、またはCT812ポリペプチド、またはこれらの断片、クラミジアDNAジャイレースサブユニットB、クラミジア亜硫酸合成/二リン酸ホスファターゼ、クラミジア細胞分裂タンパク質FtsY、クラミジアメチオニルtRNAシンセターゼ、クラミジアDNAヘリカーゼ（uvrD）、クラミジアATP合成酵素サブユニットI（atpI）、またはクラミジア金属依存性加水分解酵素であり得る。
ビオチン結合タンパク質、例えば、リザビジンタンパク質と融合させる抗原は、細菌性細胞内寄生体である病原体結核菌（TB）に由来し得る。TB抗原の一例は、（Mtb 39Aとしても公知の）TbH9である。他のTB抗原には、（Mtb8.4としても公知の）DPV、381、Mtb4l、Mtb40、Mtb32A、Mtb64、Mtb83、Mtb9.9A、Mtb9.8、Mtb16、Mtb72f、Mtb59f、Mtb88f、Mtb7lf、Mtb46f、およびMtb31f（「f」は、2種以上のタンパク質の融合物であることを示す）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
抗原は、クラミジア種、例えば、偏性細胞内グラム陰性菌である（クラミジア属（Chlamydiae）およびクラミドフィラ属（Chlamydophila）からなる）クラミジア科に由来し得る。クラミジア・トラコマチス感染は、最も有病率の高い細菌性の性行為感染症のうちの一つであり、おそらく、8900万の新しい性器クラミジア感染例が毎年存在する。本発明のクラミジアには、例えば、C.トラコマチス、肺炎クラミジア（Chlamydophila pneumoniae）、C.ムリダルム（muridarum）、C.スイス（suis）、クラミドフィラ・アボルタス（abortus）、オウム病クラミジア（Chlamydophila psittaci）、クラミドフィラ・キャビエ（caviae）、クラミドフィラ・フェリス（felis）、クラミドフィラ・ペコラム（pecorum）、および肺炎クラミジアが含まれる。クラミジア感染の動物モデルは、初感染のクリアランスおよび感受性宿主の再感染からの防御の両方においてT細胞が重大な役割を果たすことを確立した。従って、本明細書中に開示される免疫原性組成物は、クラミジア感染に対する細胞性免疫応答を誘発することによって、特定の価値を提供するために使用され得る。
より具体的には、クラミジア抗原には、DNAジャイレースサブユニットB、亜硫酸合成/二リン酸ホスファターゼ、細胞分裂タンパク質FtsY、メチオニルtRNAシンセターゼ、DNAヘリカーゼ（uvrD）；ATP合成酵素サブユニットI（atpI）、または金属依存性加水分解酵素（米国特許出願公開第20090028891号）が含まれる。付加的なクラミジア・トラコマチス抗原には、CT144ポリペプチド、CT144のアミノ酸残基67〜86を有するペプチド、CT144のアミノ酸残基77〜96を有するペプチド、CT242タンパク質、CT242のアミノ酸109〜117を有するペプチド、CT242ポリペプチドのアミノ酸112〜120を有するペプチド、（pmpD遺伝子由来の）CT812タンパク質、CT812タンパク質のアミノ酸残基103〜111を有するペプチド；および参照によってその全体が本明細書中に組み入れられるWO 2009/020553または米国特許出願第2014/0154287号に開示されたようなC.トラコマチス由来のその他の数種の抗原性ペプチドが含まれる。参照すること。さらに、前記ポリペプチドの相同体を含む肺炎クラミジア抗原（米国特許第6,919,187号を参照すること）が、本明細書中に開示される免疫原性組成物および方法において、抗原として使用され得る。
真菌抗原は、カンジダ種およびその他の酵母；またはその他の真菌（アスペルギルス、その他の環境真菌）に由来し得る。他の寄生虫に関して、マラリアならびに虫およびアメーバも、本明細書中に開示される免疫原性組成物および方法において使用するための抗原性抗原を提供し得る。
抗原は、表面糖タンパク質、赤血球凝集素（HA）またはノイラミニダーゼ（NA）を含む抗インフルエンザ免疫原である。いくつかの態様において、抗原には、CMI応答を誘発することができるリシンのような、生物戦争において使用されるものも含まれ得る。
さらに、抗原は、癌もしくは腫瘍によって発現された、または腫瘍に由来する抗原である。いくつかの態様において、そのような抗原は、本明細書中で「癌抗原」と呼ばれ、典型的には、コンジュゲートがこのタンパク質に対する強力な体液性免疫および強力な細胞性免疫の両方を誘発するような、癌細胞上に主に発現されるタンパク質である。多数の癌関連抗原が同定されており、そのうちの数種は、実験的な癌処置ワクチンを作製するために現在使用されており、従って、本発明の態様において使用するために適当である。複数のタイプの癌に関連した抗原には、癌胎児性抗原（CEA）；NY-ESO-1のような癌/精巣抗原；シアリルTn（STn）のようなムチン-1（MUC1）；GM3およびGD2のようなガングリオシド；p53タンパク質；ならびに（ERBB2としても公知の）HER2/neuタンパク質が含まれる。特定のタイプの癌に独特の抗原には、EGFRvIIIと呼ばれる上皮増殖因子受容体の変異型；チロシナーゼ、MART1、gp100、系統関連癌精巣群（lineage related cancer-testis group）（MAGE）、およびチロシナーゼ関連抗原のようなメラノサイト/黒色腫分化抗原；前立腺特異抗原；融合タンパク質BCR-ABL、ウィルムス腫瘍タンパク質、およびプロテイナーゼ3のような白血病関連抗原（LAA）；ならびにイディオタイプ（Id）抗体が含まれる。例えば、Mitchell,3 Curr.Opin.Investig.Drugs 150(2002)；Dao & Scheinberg,21 Best Pract.Res.Clin.Haematol.391(2008)を参照すること。
いくつかの態様において、本明細書中に開示される方法および組成物およびキットは、SEQ ID NO:1を含むリザビジンタンパク質もしくはそれと少なくとも80％の配列同一性を有するタンパク質のようなビオチン結合タンパク質、または黄色ブドウ球菌（SA）タンパク質抗原を含むそれらの融合タンパク質を単離し精製するために有用である。そのような融合タンパク質は、参照によってその全体が本明細書中に組み入れられる、2017年3月28日に出願された米国仮出願第62/477,618号に開示されている。
癌に対する免疫応答の生成における別のアプローチは、癌の発症を引き起こすかまたはそれに寄与する微生物に由来する抗原を利用する。これらのワクチンは、肝細胞癌（B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、タイ肝吸虫（Opisthorchis viverrin））、リンパ腫および上咽頭癌（エプスタイン・バーウイルス）、結腸直腸癌、胃癌（ピロリ菌）、膀胱癌（ビルハルツ住血吸虫（Schisosoma hematobium））、T細胞白血病（ヒトTリンパ球向性ウイルス）、子宮頸癌（ヒトパピローマウイルス）等を含む癌に対して使用されている。
いくつかの態様において、抗原は、自己免疫疾患の抗原、例えば、「自己抗原」である。本明細書中に記載されたアッセイによる診断のために企図される自己免疫疾患には、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、アジソン病、再生不良性貧血、多発性硬化症、副腎の自己免疫疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性の卵巣炎および精巣炎、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー皮膚炎、慢性疲労症候群、慢性炎症性脱髄症候群（CFIDS）、慢性炎症性多発ニューロパチー、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、クレスト症候群、寒冷凝集素症、クローン病、疱疹状皮膚炎、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛症、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ITP）、IgA腎症、インスリン依存性糖尿病（I型）、扁平苔癬、ループス、メニエール病、混合性結合組織病、重症筋無力症、心筋炎、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎・皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、慢性関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、高安動脈炎、側頭動脈炎/巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、葡萄膜炎、ウェゲナー症候群、血管炎、ならびに白斑が含まれるが、これらに限定されるわけではない。自己免疫疾患を有するか、または有すると推測されるか、または有しやすい対象において、可能性のあるまたは実際のCMI応答性を評価することは、一般に重要である。
いくつかの態様において、本明細書中に開示される方法および組成物およびキットは、抗体がビオチンまたはビオチン誘導体によって標識されており、ビオチンまたはビオチン誘導体にビオチン結合ドメイン、例えば、リザビジンが結合している、単離すべき細胞に対する抗体を使用した望ましい細胞の可能な選択のために使用され得る。従って、本発明の別の局面は、細胞に連結された抗体/リガンドの多くの異なる単離後の使用を可能にするという点である。放出された細胞は、ビオチン化抗体を保持し続ける。
融合タンパク質を形成するため、ペプチド結合によって連結する代わりに、抗原性タンパク質（即ち、抗原）を、ビオチン結合ドメイン、例えば、本明細書中に開示されるリザビジンタンパク質に直接コンジュゲートすることも構想され得る。
結合対の放出の後、即ち、ビオチン結合ドメイン（例えば、リザビジンタンパク質）の放出の後、LAマトリックスまたは支持体は、再使用され得る。
一つの態様において、固相は、LA含有磁性粒子を含み、磁性粒子および付着したビオチン結合ドメイン（例えば、リザビジンタンパク質）は、磁気凝集によって、ビオチン結合ドメイン（例えば、リザビジンタンパク質）およびその他のタンパク質を含む混合されたまたは不均一なタンパク質試料から単離される。
本法が使用され得る精製手法には、細胞、核酸、タンパク質、およびその他の生体材料、有機化合物等を分離するために従来使用されているものが含まれ得る。本法を、単離のために使用し、その後、質量分析のようなさらなる下流分析のため、ビオチン結合ドメイン（例えば、リザビジンタンパク質）複合体を溶出させることもできる。ハイスループットスクリーニングへの適用も、適用可能である。
本明細書中に記載された付着および放出システムに含まれる全てのパラメータが、単離すべきビオチン結合ドメイン（例えば、リザビジンタンパク質、その融合タンパク質または複合体）、使用されるリポ酸化合物、および使用される固相のタイプ、例えば、磁性ビーズのサイズに依って変動し得る。使用される所定のリポ酸化合物およびビオチン結合ドメイン（例えば、リザビジンタンパク質、その融合タンパク質または複合体）の対について、使用される全ての条件が、当業者によって容易に決定され得る。
ビオチン結合ドメイン（例えば、リザビジンタンパク質、その融合タンパク質または複合体）のリポ酸化合物からの放出または置換の条件は、適宜、変動し得る。置換リガンド、例えば、遊離リポ酸化合物またはその代替物（例えば、遊離のビオチンもしくはビオチン誘導体もしくはそれらの断片）によって、ビオチン結合ドメイン（例えば、リザビジンタンパク質、その融合タンパク質または複合体）を放出させる工程は、任意の便利なまたは所望の方式で行われ得る。結合したビオチン結合ドメイン（例えば、リザビジンタンパク質、その融合タンパク質または複合体）を含有しているLAマトリックスまたは固定されたLA試料を、便利には、水性媒体において、単純に置換リガンドと接触させることができ、例えば、置換リガンドを単純に試料に添加し、置換リガンド（即ち、遊離のリポ酸またはビオチン）がビオチン結合ドメイン（例えば、リザビジンタンパク質、その融合タンパク質または複合体）と結合し、それによって、固定されたリポ酸化合物からビオチン結合ドメイン（例えば、リザビジンタンパク質、その融合タンパク質または複合体）を分離することを可能にする時間、反応混合物を適切な条件下に置くことができる。
ビオチン結合ドメイン（例えば、リザビジンタンパク質、その融合タンパク質または複合体）の最適な放出のために必要とされる置換リガンドの量は、当然、結合した実体、それらの比、および実体の数または量、例えば、単離を必要とするビオチン結合ドメイン（例えば、リザビジンタンパク質、その融合タンパク質または複合体）の量に依って変動し、必要に応じて容易に決定され得る。
例えば、本明細書中に開示されるリザビジンタンパク質、その融合タンパク質または複合体の精製および単離のため、リザビジンタンパク質、その融合タンパク質または複合体の量に対する磁性粒子の比は、異なる系において、異なる適用によって変動し得、それに応じて、異なる量の置換リガンド（即ち、リポ酸化合物）が、リザビジンタンパク質、その融合タンパク質または複合体を粒子から脱離させるために必要とされるであろう。リポ酸置換リガンドの濃度の例は、1mg/ml、5mg/ml、または10mg/mlであり得る。約1〜10mg/ml、好ましくは、2〜5mg/mlの範囲の遊離リポ酸の濃度が、有効であることが見出された。あるいは、いくつかの態様において、約1mg/mlまたは約1.5mg/mlまたは約2.0mg/mlまたは約2.5mg/mlまたは約3mg/mlまたは約5mg/mlまたは5mg/ml超の範囲の遊離リポ酸の濃度も、有効であることが見出された。
遊離リポ酸を使用した脱離のための条件も、適宜、変動し得る。典型的には、遊離リポ酸化合物とのインキュベーションは、約0℃（即ち、氷上）〜37℃の範囲の温度で、いくつかの態様において、室温（RT）で、有効であろう。
（リザビジンタンパク質、融合タンパク質または複合体が結合した）LAマトリックスの置換リガンド（即ち、遊離リポ酸）とのインキュベーションのためのインキュベーション時間は、使用される温度、材料、および濃度に依って変動し、所定の条件のセットについて、当業者によって容易に決定され得る。短いインキュベーション時間は、使用者にとって魅力的である。典型的には、固体支持体に固定されたリポ酸からのリザビジンタンパク質、融合タンパク質または複合体の放出のためのインキュベーション時間は、約2〜約30分、好ましくは、約5〜10分の範囲であろう。
いくつかのケースにおいて、置換リガンド（即ち、遊離リポ酸）によって不安定化された連結の破壊を支援するため、例えば、軽い撹拌または混合、例えば、ピペッティングによって、固定されたリポ酸に連結されたリザビジンタンパク質、融合タンパク質または複合体の連結の逆転を支援することが望ましい場合がある。最良の結果は、軽い傾斜および回転の両方を提供する装置においてインキュベートすることによって入手される。
リザビジンタンパク質、融合タンパク質または複合体の固定されたリポ酸化合物との結合を逆転させるこのより一般的な方法の利点は、自明であり、より便利であり、開発するためにより少ない時間および労力を要し、従って、対費用効果がより高いという利点を含む。また、本明細書中に開示される方法は、リザビジンタンパク質、その融合タンパク質または複合体の壊変または活性の喪失を引き起こさず、リザビジンタンパク質、その融合タンパク質または複合体の寿命またはネイティブの状態に影響しない極めて温和な/軽い条件の下で実施される。
キット
本開示の別の局面は、キットに関する。キットは、固体支持体とリポ酸化合物と置換試薬（例えば、遊離リポ酸）とを含んでいてよい。固体支持体は通常、本明細書中に開示される任意の固体支持体であり得る。例えば、固体支持体は、粒子状または磁性粒子であり得る。固体支持体は、少なくとも1種のリポ酸化合物をさらに含んでいてもよい。置換試薬は通常、ビオチン結合ドメイン、例えば、リザビジンタンパク質またはそれを含む融合物もしくは複合体を、固体支持体に固定されたLAから置換するために十分な任意の材料であってよい。例えば、置換試薬は、遊離リポ酸化合物、またはビオチンもしくはビオチン誘導体のような、ビオチン結合タンパク質（例えば、リザビジンタンパク質もしくはそれを含む融合物もしくは複合体）と結合するその他のリガンドであり得る。
いくつかの態様において、本開示は、（a）固体支持体に付着したリポ酸化合物と、（b）固定されたリザビジンタンパク質またはリザビジンタンパク質を含む融合タンパク質を、固体支持体に付着したリポ酸化合物から取り出すための少なくとも1種の試薬（例えば、置換リガンド）とを含むキットに関する。
いくつかの態様において、キットは、リザビジン融合タンパク質をコードする核酸配列を含む発現ベクターをさらに含み、核酸配列は（i）SEQ ID NO:1を含むリザビジンタンパク質またはSEQ ID NO:1と少なくとも80％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸配列、および（ii）リザビジンタンパク質に融合すべき関心対象のタンパク質（例えば、抗原）をコードする核酸配列の挿入のための多重挿入部位（MIS）を含む核酸を含む。例えば、発現ベクターは、関心対象のタンパク質がリザビジンタンパク質のN末端にくるよう、SEQ ID NO:1を含むリザビジンタンパク質またはSEQ ID NO:1と少なくとも80％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸配列の5'に位置する多重挿入部位（MIS）を含む核酸を含み、従って、融合させたタンパク質がリザビジンタンパク質のN末端に位置するリザビジン融合タンパク質の生成を可能にすることができる。別の態様において、発現ベクターは、関心対象のタンパク質がリザビジンタンパク質のC末端にくるよう、SEQ ID NO:1を含むリザビジンタンパク質またはSEQ ID NO:1と少なくとも80％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸配列の3'に位置する多重挿入部位（MIS）を含む核酸を含み、従って、融合させたタンパク質がリザビジンタンパク質のC末端に位置するリザビジン融合タンパク質の生成を可能にすることができる。
いくつかの態様において、発現ベクターは、任意で、SEQ ID NO:1を含むリザビジンタンパク質またはSEQ ID NO:1と少なくとも80％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸配列の5'または3'に、脂質付加配列を含む核酸配列をさらに含んでいてもよい。いくつかの態様において、脂質付加配列は、融合タンパク質の正確な折り畳みを増加させ、可溶性組換えタンパク質の高い収率を入手することを可能にする。いくつかの態様において、脂質付加配列は、以下の配列：
Figure 2019524639
の少なくとも10アミノ酸または少なくとも15アミノ酸または15アミノ酸超を含む。いくつかの態様において、脂質付加配列は、SEQ ID NO:1を含むリザビジンタンパク質またはSEQ ID NO:1と少なくとも80％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸配列の5'末端に位置する。いくつかの態様において、脂質付加は、発現の過程において、細菌、例えば、大腸菌によって、脂質付加配列のCys残基において付加され得る。
いくつかの態様において、発現ベクターは、任意で、SEQ ID NO:1を含むリザビジンタンパク質またはSEQ ID NO:1と少なくとも80％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸配列と多重挿入部位（MIS）を含む核酸との間にリンカーペプチドを含む核酸配列をさらに含んでいてもよい。いくつかの態様において、発現ベクターは、抗原性ペプチドまたは抗原ポリペプチドを含むリザビジン融合タンパク質を生成するため、使用され得る。
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を示すために含まれている。以下の実施例において開示される技術は、本発明の実施において良好に機能することが本発明者らによって発見された技術を表し、従って、その実施のための好ましいモードを構成すると見なされ得ることが、当業者によって認識されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示を考慮すれば、開示された具体的な態様に多くの変化を施しても、本発明の範囲を逸脱することなく、同様のまたは類似の結果を入手することができることを認識するべきである。
本発明を一般的に記載したが、例示のために本明細書中に含まれるに過ぎず、他に特記されない限り、限定するためのものではない、以下の具体的な例を参照することによって、本発明は、より容易に理解されるであろう。
本明細書中に提示される実施例は、リポ酸アフィニティクロマトグラフィを使用した、ビオチン結合タンパク質、例えば、リザビジンの精製および単離の方法に関する。本願の全体において、様々な刊行物が参照される。刊行物およびそれらの刊行物内に引用された参照の全ての開示が、本発明が関係する技術分野の状況をより完全に記載するため、参照によってその全体が本願に組み入れられる。以下の実施例は、本発明の特許請求の範囲の範囲を限定するためのものではなく、ある種の態様を例示するためのものである。当業者が想到する例示された方法の任意の変動が、本発明の範囲内に含まれるものとする。
略語
以下の略語が実験において使用される。
PBS＝リン酸緩衝生理食塩水
RT＝室温
試薬および溶液
リポ酸（LA）（Sigma、T1395-5G）
CARBOXYLINK（商標）カップリング樹脂（ジアミノジプロピルアミン固定化）（Life technologies、20266）；0.02％アジ化ナトリウムを含有している50％スラリーにおいて供給された4％架橋型アガロースビーズ
EDC（エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩）（Life technologies、22980）
スルホ-NHS（N-ヒドロキシスルホスクシンイミド）（Life technologies、24510）
Econo-Pacクロマトグラフィカラム（Bio-Rad、7321010EDU）
溶液および緩衝液
リポ酸（LA）ストック溶液：100％エタノール中の50mg/mlリポ酸（Sigma、T1395-5G）
0.1M MES緩衝液：4.5〜6の範囲、好ましくは、pH 5.0の0.1M 2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸（MES）
1M Na2HPO4：（NaOHによってpH調整された）1M Na2HPO4（pH 11）
カップリング緩衝液：50％エタノール＋50％0.1M MES緩衝液
1×PBS緩衝液：10mM PO4 3-、137mM NaCl、および2.7mM KCl（pH7.5）
洗浄緩衝液：50％エタノール、20mMトリス、1M NaCl
溶解緩衝液：20mMトリス、1M NaCl（pH8.0）
溶出緩衝液：20mMトリス、1M NaCl（pH8）、5％エタノール中の2.5mg/mlのリポ酸（Sigma、T1395-5G）
実施例1
本発明の局面は、リポ酸カラムを使用したアフィニティクロマトグラフィを使用して、ビオチン結合タンパク質を迅速に効率的に精製するテクノロジーに関する。例示的な方法として、本発明者らは、SEQ ID NO:1を含むリザビジンタンパク質の、リポ酸を含むカラムからの高度に効率的な精製を証明する。他のビオチン結合タンパク質、リザビジンタンパク質、およびリザビジン複合体（例えば、リザビジン融合タンパク質およびまたはリザビジンに架橋された抗原）も、本明細書中に開示される方法、組成物、およびキットを使用して精製され得ることが構想される。
具体的には、本発明者らは、リポ酸に対するリザビジンの親和性が、ニッケルに対するヒスチジン、例えば、ポリヒスチジンタグ（ヘキサヒスチジンタグ、6×Hisタグ、His6タグ、またはHIS-TAG（商標）とも呼ばれる）とほぼ同じであることを発見した。ポリヒスチジンタグは、マイクロモル単位の親和性で、イミノ二酢酸（Ni-IDA）およびニトリロ三酢酸（Ni-NTA）のようなキレート剤によって官能化されたセファロース/アガロースと結合することができる。Hisタグは高いpHでニッケルと結合するが、およそ4のpHでは、ヒスチジンはプロトン化され、金属イオンから離れるため、pH滴定を使用して、Hisタグを有するタンパク質を溶出させることができる。従って、Hisタグによる精製は、低い酸性pHを必要とし、タンパク質の変性または精製すべきタンパク質の不正確な折り畳みをもたらし得る。
本明細書中で、本発明者らは、リポ酸が、マイクロモル単位の親和性でリザビジンと結合するために使用され得、約7.5〜9.0のpHで溶出緩衝液中の1.0mg/ml〜10.0mg/mlのリポ酸を使用して競合的阻害によって取り外すことができ、従って、溶出のために低いまたは酸性のpHを必要とすることなく、Hisタグを使用したNi-NTAカラム精製と類似した精製効率を達成し、従って、タンパク質変性のリスクを最小化することを発見した。
さらに、本発明者らは、アフィニティクロマトグラフィ精製において使用するための数種のリガンドとのリザビジンの結合を評価した。リザビジンは、ビオチンおよびその他のビオチン関連またはビオチン誘導体と結合することが公知であるが、本発明者らは、驚くべきことに、例えば、ビオチン誘導体HABA（ヒドロキシアゾベンゼン-安息香酸）またはジメチル-HABAのような多数のビオチン誘導体とリザビジンが結合しないことを発見した。さらに、本発明者らは、HABAまたはジメチル-HABAを含むカラムが、リザビジンを精製するために有効でないことを発見した（データ示さず）。従って、リポ酸のみが、リザビジンタンパク質または融合タンパク質の効率的な精製のために有効であることが発見された。
リポ酸樹脂（LAマトリックス）の調製
本明細書中に開示される方法において使用するためのLAマトリックスを調製するため、以下の工程に従うことができる：
（i.）CARBOXYLINK（商標）カップリング樹脂（Life technologies、20266）を再懸濁させ、懸濁した樹脂1mlを、空のカラム、例えば、bio-rad Econo-Pacクロマトグラフィカラムに等分し、樹脂を安定させる。およそ20mlの水によって樹脂を洗浄し、樹脂を平衡化するため、10mlのPBS（×1）を添加する。
（ii.）0.5mlの0.1M MES緩衝液に50mgのスルホ-NHS（N-ヒドロキシスルホスクシンイミド）を溶解させることによって、スルホ-NHSの100mg/ml溶液を調製する。
（iii.）0.25mlのエタノールおよび0.25mlの50mg/ml LAストック溶液（12.5mgのLA）を0.5mlのスルホ-NHS（100mg/ml）に添加することによって、スルホ-NHS/LA混合物を調製する。
（iv.）LAを樹脂に架橋するため、0.75mlのカップリング緩衝液に25mgのEDCを溶解させ、直ちにスルホ-NHS/LA混合物に添加する。RTで30分間、回転させながらEDC/スルホ-NHS/LA混合物をインキュベートする。1M Na2HPO4（pH11）（およそ0.5mlの1M Na2HPO4）を添加することによって、EDC/スルホ-NHS/LA混合物のpHをpH 7.0に調整する。
（v.）EDC/スルホ-NHS/LA混合物によって平衡化されたCARBOXYLINK（商標）カップリング樹脂を再懸濁させ、5mlチューブに全て移し、RTで一晩、回転させながらインキュベートする。
（vi.）空のカラムに樹脂を移し、LA樹脂/LAマトリックスを安定させる。以下の試薬によって以下の順で樹脂を洗浄する；（i）20mlの洗浄緩衝液、（ii）20mlのH2O、（iii）5mlの20％エタノールを含む洗浄樹脂。使用時まで、20％エタノール中にLA樹脂/LAマトリックスを保管する。
LAマトリックスによるリザビジンまたはリザビジン融合タンパク質の精製
LAマトリックスを使用して、ビオチン結合タンパク質、例えば、リザビジンまたはリザビジン融合タンパク質を、リザビジンまたはリザビジン融合タンパク質を発現する細菌懸濁物から精製するため、本明細書中に開示される方法において以下の工程に従うことができる：
（v.）遠心分離によって大腸菌培養物を収集し、上清を廃棄し、DNase、プロテイナーゼ阻害剤、および10mM MgCl2を含有している溶解緩衝液（20mMトリス、1M NaCl（pH8.0））によってペレット化された細胞を再懸濁させる。超音波処理またはその他のアプローチによって細菌細胞を溶解し、遠心分離によって細胞溶解物を収集する。
（vi.）0.5mlのLA樹脂を空のカラムへ充填し、20mlのH2OによってLA樹脂を洗浄する。20mlの溶解緩衝液（20mMトリス、1M NaCl、pH8.0）によって樹脂を平衡化する。
（vii.）工程（i）からの細胞溶解物をLA樹脂に添加し、よく混合し、振とうしながら、4℃で2時間より長くインキュベートする。
（viii.）インキュベーションの後、樹脂を空のカラムに移し、タンパク質がフロースルーに検出されなくなるまで、洗浄緩衝液（50％エタノール、20mMトリス、1M NaCl）によってLA樹脂を洗浄する。
（ix.）溶出緩衝液（20mMトリス、1M NaCl、5％エタノール（pH8）中の2.5mg/mlのリポ酸）によってタンパク質を溶出させる。

Claims (47)

  1. リザビジンタンパク質またはリザビジンタンパク質を含む融合タンパク質を固体支持体に可逆的に固定する方法であって、
    リザビジンタンパク質またはリザビジンタンパク質を含む融合タンパク質と該支持体を接触させる工程を含み、
    該固体支持体が該固体支持体の表面上にリポ酸（LA）化合物を含む、
    方法。
  2. 5.5〜9.0のpHを有する溶液または1M NaClを含む溶液において、リザビジンタンパク質またはリザビジンタンパク質を含む融合タンパク質が、固体支持体と接触するかまたは結合する、請求項1記載の方法。
  3. 固定されたリザビジンタンパク質またはリザビジンタンパク質融合タンパク質を含む固体支持体を、1〜10mg/mlのリポ酸（LA）化合物を含む溶出緩衝液と接触させて、リザビジンタンパク質またはその融合タンパク質を該固体支持体から放出させる工程をさらに含む、請求項1または2記載の方法。
  4. （i）固体支持体の表面上にリポ酸（LA）化合物を含む該固体支持体を、リザビジンタンパク質またはリザビジンタンパク質を含む融合タンパク質を含む溶液と接触させる工程；
    （ii）リザビジンタンパク質またはリザビジンタンパク質を含む融合タンパク質がリポ酸（LA）化合物と結合することを可能にするのに十分な時間、インキュベートする工程；
    （iii）未結合のリザビジンタンパク質またはリザビジンタンパク質を含む融合タンパク質を除去するため、固体支持体の表面上にリポ酸（LA）化合物を含む該固体支持体を、洗浄溶液によって洗浄する工程；
    （iv）固定されたリザビジンタンパク質またはリザビジンタンパク質融合タンパク質を含む固体支持体を、1〜10mg/mlのリポ酸（LA）を含む溶出緩衝液と接触させ、該固体支持体から放出されたリザビジンタンパク質または融合タンパク質を含む溶出緩衝液の部分を、該固体支持体から放出されたリザビジンタンパク質または融合タンパク質を含まない溶出緩衝液の部分から分離する工程；および
    （v）リザビジンタンパク質またはその融合タンパク質を含む溶出緩衝液の部分を収集する工程
    を含む、固体支持体によってリザビジンタンパク質またはリザビジンタンパク質を含む融合タンパク質を精製するための方法。
  5. 工程（i）において固体支持体の表面上にリポ酸（LA）化合物を含む該固体支持体と接触する、リザビジンタンパク質またはリザビジンタンパク質を含む融合タンパク質を含む溶液が、5.5〜9.0のpHを有するかまたは1M NaClを含む、請求項4記載の方法。
  6. リザビジンタンパク質またはその融合タンパク質を固体支持体から放出させるため、溶出緩衝液が、1.0〜10mg/mlのリポ酸（LA）化合物を含む、請求項4記載の方法。
  7. リザビジンタンパク質が、SEQ ID NO:1のアミノ酸またはSEQ ID NO:1と少なくとも80％の配列同一性を有するタンパク質を含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
  8. 固体支持体が、プラスチック、ガラス、セラミックス、シリコーン、金属、セルロース、膜、およびゲルからなる群より選択される、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
  9. 固体支持体が粒子または磁性粒子である、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
  10. 粒子がSEPHAROSE（商標）ビーズである、請求項9記載の方法。
  11. リポ酸化合物が、共有結合を介して直接的に固体支持体と結合しているかもしくは連結されている、またはタンパク質リンカー、ペプチド、核酸、オリゴ糖、糖タンパク質、もしくは架橋試薬を介して間接的に固体支持体に連結されている、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
  12. リポ酸化合物がリポ酸またはα-リポ酸（ALA）である、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
  13. リポ酸が、ラセミリポ酸、または鏡像異性的に純粋なもしくは鏡像異性的に濃縮されたR(+)-α-リポ酸もしくはS-(-)-α-リポ酸である、請求項12記載の方法。
  14. リポ酸化合物がリポ酸誘導体である、請求項1〜13のいずれか一項記載の方法。
  15. リポ酸誘導体が、リポイルピリドキサミン、リポイルピリドキサミン塩酸塩、リポイルピリドキサミン臭化水素酸塩、リポイルピリドキサミンメタンスルホン酸、リポイルピリドキサミンp-トルエンスルホン酸、1,2-ジチオラン類似体、ジエトキシカルボニル化リポ酸、6,8-ビスアセチルメルカプトオクタン酸（ビスアセチルリポ酸）、6,8-ビスベンゾイルメルカプトオクタン酸（ビスベンゾイルリポ酸）、8-アセチルメルカプト-6-メルカプトオクタン酸（モノアセチルリポエート）、6,8-ビスカルバモイルメチルメルカプトオクタン酸、6,8-ビス-[S-(N-メチルスクシンイミド)]メルカプトオクタン酸の群より選択される、請求項14記載の方法。
  16. 固定されたリザビジンタンパク質またはリザビジンタンパク質融合タンパク質を含む固体支持体を、1〜10mg/mlのリポ酸（LA）化合物を含む溶出緩衝液と接触させて、リザビジンタンパク質またはその融合タンパク質を該固体支持体から放出させることによって、リザビジンタンパク質またはリザビジンタンパク質融合タンパク質を該固体支持体から溶出させる工程
    をさらに含む、請求項1記載の方法。
  17. （a）固体支持体に付着したリポ酸化合物、および
    （b）固定されたリザビジンタンパク質またはリザビジンタンパク質を含む融合タンパク質を、固体支持体に付着したリポ酸化合物から取り出すための少なくとも1種の試薬
    を含む、キット。
  18. リザビジン融合タンパク質の発現のための核酸配列を含む発現ベクターをさらに含み、
    核酸配列が、（i）SEQ ID NO:1を含むリザビジンタンパク質またはSEQ ID NO:1と少なくとも80％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸配列と、（ii）リザビジンタンパク質と融合すべき関心対象のタンパク質をコードする核酸配列の挿入のための多重挿入部位（MIS）を含む核酸とを含む、
    請求項17記載のキット。
  19. 関心対象のタンパク質がリザビジンタンパク質のN末端にくるよう、多重挿入部位（MIS）を含む核酸が、SEQ ID NO:1を含むリザビジンタンパク質またはSEQ ID NO:1と少なくとも80％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸配列の5'にある、請求項17記載のキット。
  20. 関心対象のタンパク質がリザビジンタンパク質のC末端にくるよう、多重挿入部位（MIS）を含む核酸が、SEQ ID NO:1を含むリザビジンタンパク質またはSEQ ID NO:1と少なくとも80％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸配列の3'にある、請求項17記載のキット。
  21. 発現ベクターが、
    SEQ ID NO:1を含むリザビジンタンパク質またはSEQ ID NO:1と少なくとも80％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸配列の5'に脂質付加配列を含む核酸配列
    をさらに含む、請求項18記載のキット。
  22. 発現ベクターが、
    SEQ ID NO:1を含むリザビジンタンパク質またはSEQ ID NO:1と少なくとも80％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸配列と多重挿入部位（MIS）を含む核酸との間にリンカーペプチドを含む核酸配列
    をさらに含む、請求項18記載のキット。
  23. 関心対象のタンパク質が抗原性ペプチドまたは抗原ポリペプチドである、請求項18〜22のいずれか一項記載のキット。
  24. 固体支持体が、プラスチック、ガラス、セラミックス、シリコーン、金属、セルロース、膜、およびゲルからなる群より選択される、請求項17〜24のいずれか一項記載のキット。
  25. 固体支持体が粒子または磁性粒子である、請求項17〜24のいずれか一項記載のキット。
  26. 粒子がSEPHAROSE（商標）ビーズである、請求項25記載のキット。
  27. 固体支持体と、リポ酸化合物と、リザビジンタンパク質またはリザビジン融合タンパク質とを含む組成物であって、
    リポ酸化合物が固体支持体に付着しており、
    リザビジンタンパク質またはリザビジン融合タンパク質が、SEQ ID NO:1のアミノ酸またはSEQ ID NO:1と少なくとも80％の配列同一性を有するタンパク質を少なくとも含み、かつリポ酸化合物と結合している、
    組成物。
  28. リポ酸化合物がリポ酸またはα-リポ酸（ALA）である、請求項27記載の組成物。
  29. リポ酸が、ラセミリポ酸、または鏡像異性的に純粋なもしくは鏡像異性的に濃縮されたR(+)-α-リポ酸もしくはS-(-)-α-リポ酸である、請求項27または28記載の組成物。
  30. リポ酸化合物がリポ酸誘導体である、請求項27〜29のいずれか一項記載の組成物。
  31. リポ酸誘導体が、リポイルピリドキサミン、リポイルピリドキサミン塩酸塩、リポイルピリドキサミン臭化水素酸塩、リポイルピリドキサミンメタンスルホン酸、リポイルピリドキサミンp-トルエンスルホン酸、1,2-ジチオラン類似体、ジエトキシカルボニル化リポ酸、6,8-ビスアセチルメルカプトオクタン酸（ビスアセチルリポ酸）、6,8-ビスベンゾイルメルカプトオクタン酸（ビスベンゾイルリポ酸）、8-アセチルメルカプト-6-メルカプトオクタン酸（モノアセチルリポエート）、6,8-ビスカルバモイルメチルメルカプトオクタン酸、6,8-ビス-[S-(N-メチルスクシンイミド)]メルカプトオクタン酸の群より選択される、請求項27〜30のいずれか一項記載の組成物。
  32. リポ酸化合物が、共有結合の直接連結を介して固体支持体に付着しているか、またはタンパク質リンカー、ペプチド、核酸、オリゴ糖、糖タンパク質、もしくは架橋試薬を介して間接的に固体支持体に連結されている、請求項27〜31のいずれか一項記載の組成物。
  33. 固体支持体が、プラスチック、ガラス、セラミックス、シリコーン、金属、セルロース、膜、およびゲルからなる群より選択される、請求項27〜32のいずれか一項記載の組成物。
  34. 固体支持体が粒子または磁性粒子である、請求項27〜33のいずれか一項記載の組成物。
  35. 固体支持体が、粒子、シート、ディップスティック、ゲル、フィルター、膜、マイクロファイバーストリップ、バイオチップ、チューブ、ウェル、プレート、ファイバーまたはキャピラリー、コーム、ピペットチップ、マイクロアレイのいずれかの形態にある、請求項27〜34のいずれか一項記載の組成物。
  36. 固体支持体が、アガロース、SEPHAROSE（商標）、セルロース、ニトロセルロース、アルギン酸、テフロン（登録商標）、ラテックス、アクリルアミド、ナイロン膜、プラスチック、ポリスチレン、ガラス、またはシリカ、または金属の群より選択されるポリマー材料である、請求項27〜35のいずれか一項記載の組成物。
  37. 粒子がSEPHAROSE（商標）ビーズである、請求項34記載の組成物。
  38. SEQ ID NO:1のアミノ酸またはSEQ ID NO:1と少なくとも80％の配列同一性を有するタンパク質を少なくとも含むリザビジンタンパク質が、リザビジン融合タンパク質である、請求項27〜37のいずれか一項記載の組成物。
  39. 5.5〜9.0のpHを有する緩衝溶液をさらに含む、請求項27〜38のいずれか一項記載の組成物。
  40. 1M NaClを含む溶液をさらに含む、請求項27〜38のいずれか一項記載の組成物。
  41. 固体支持体と、リポ酸化合物と、リザビジンタンパク質またはリザビジン融合タンパク質とを含むアフィニティクロマトグラフィカラムとして構成された、請求項27〜40のいずれか一項記載の組成物。
  42. 請求項1、2、または4〜12のいずれか一項記載の方法によって作製された、請求項27記載の組成物。
  43. 請求項27〜40のいずれか一項記載の組成物を含む、アフィニティクロマトグラフィカラム。
  44. （a）固体支持体への架橋のために活性化されたリポ酸化合物を含む溶液と固体支持体を接触させて、リポ酸化合物が固体支持体に架橋されるのに十分な時間インキュベートする工程、および
    （b）工程（a）において添加された溶液を除去するか、または固体支持体と架橋されたリポ酸化合物とを精製カラムへ移す工程
    を含む、リポ酸樹脂を作製する方法。
  45. 架橋のために活性化されたリポ酸化合物を含む溶液が、スルホ-NHS（N-ヒドロキシスルホスクシンイミド）およびEDCを含む、請求項44記載の方法。
  46. 架橋のために活性化されたリポ酸化合物を含む溶液が、スルホ-NHS（N-ヒドロキシスルホスクシンイミド）およびEDCを含み、かつpH 7.0である、請求項45記載の方法。
  47. 固体支持体および架橋されたリポ酸化合物が精製カラム内に存在する、請求項44〜46のいずれか一項記載の方法によって作製されたアフィニティクロマトグラフィカラム。
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