JP2019512461A - ワクチン組成物、その製造方法及び使用 - Google Patents

ワクチン組成物、その製造方法及び使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、ワクチン組成物に関し、当該ワクチン組成物は、免疫量の産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質又は免疫量の産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質遺伝子が組換えられた生ベクター及び獣医薬的に許容し得るベクターを含む。本発明は、多様な地域から起源する野生株に対して効果的予防を行うことができるので、臨床応用的に産卵低下症候群ウイルスの感染を予防及び／又は治療できる。

Description

本発明は、産卵低下症候群ウイルスを防ぐワクチン組成物、その製造方法及び使用に関し、生物医薬分野に属する。
産卵低下症候群ウイルス（Ｅｇｇ Ｄｒｏｐ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｖｉｒｕｓ、ＥＤＳＶ）は、禽アデノウイルスIII群に属する。当該ウイルスが家禽に感染すると、その後、明らかな兆候が見られない、若しくは軽い程度の下痢が見られる。このウイルスは、常に産卵時期のピークに発生して、産卵鶏に軟殻卵、薄殻卵及び無殻卵を産ませ、産卵率を深刻に低下させるため、深刻な経済的損失をもたらす。
ＥＤＳＶは、典型的なアデノウイルス形態を有し、エンベロープがなく、赤血球凝集活性を有し、禽の卵管内で増殖する。ウイルスゲノムは、ほぼ３３ｋｂの二重鎖直鎖状ＤＮＡであり、ウイルス粒子は、構造タンパク質から構成され、ヌクレオカプシドは直径７０〜８０ｎｍであり、２０面体対称になっている。このＤＮＡは、カプシド内に包まれている。ヌクレオカプシドは、２５２個のカプソメアからなり、そのうち２４０個は、ヘキソン（Ｈｅｘｏｎタンパク質）であり、２０面体の２０個の面及び辺の大部分を構成する。これらのカプソメアは、角柱形になっており、幅が７ｎｍ、長さが１１ｎｍである。また、その他の１２個は、ペントン（ペントンタンパク質）であり、それぞれ２０面体の１２個の頂角に配置される。各ペントンタンパク質は、一つのファイバー突起（ファイバータンパク質）を有する。
産卵低下症候群は、現在、世界的規模において、家禽畜産業の発展を深刻に害する主な病気の一つである。各種の予防制御措置において、ワクチン免疫は、依然として一番重要な措置である。現在、禽飼育業において普遍的に使用されているＥＤＳ不活化ワクチンは、アヒル胚に基づいて増殖したウイルスを不活化した後、鉱物油アジュバントと乳化してできるワクチンである。但し、産卵低下症候群ウイルスがアヒル胚で培養される場合、高力価のウイルスを取得し難いので、往々にして、製造されたワクチンは、理想的な免疫効果を提供し難い。なお、当該ウイルス抗原の生産方式は、完全にアヒル種卵に依存し、鳥インフルエンザ等の伝染病が発生した時、アヒル種卵を供給することが困難となるために、産卵低下症候群の予防制御に深刻な影響を及ぼす。また、ウイルスワクチン全体の生産において、ウイルス不活化が不完全なことに起因する生物的安全面のリスクも存在する。
サブユニットワクチンは、近年発展し始めた比較的実施可能な新型遺伝子工学ワクチンである。産卵低下症候群サブユニットワクチンの研究は、Ｈｅｘｏｎ(２４０/２５２)を主な研究対象とするが、従来、免疫効率が低いため、製品開発に至っていない。先行技術では、未だに、ワクチンに用いられる免疫原性に優れるタンパク質が製造できていない。上記したように、今日に至るまで、産卵低下症候群サブユニットワクチンは市場に導入されていない。
このため、臨床的観点から、免疫効果に優れたサブユニットワクチン組成物の開発を、緊急の課題とすべきである。このようなワクチン組成物が開発されれば、当該病気の流行を防止し、アヒル種卵の供給変動の影響を避けることができる。
先行技術の問題点を解決するために、本発明は、産卵低下症候群ウイルス免疫原性タンパク質、それによって製造されるワクチン組成物、並びに、当該ワクチン組成物の製造方法及び使用方法を提供する。当該ワクチン組成物は、産卵低下症候群ウイルスの感染を効果的に予防及び/又は治療できる。
本発明は、産卵低下症候群を防止するためのワクチン組成物に関する。、前記ワクチン組成物は、免疫量の産卵低下症候群ウイルス抗原及び獣医薬的に許容し得るベクターを含む。また、前記産卵低下症候群ウイルス抗原は、本発明に記載される産卵低下症候群ウイルス免疫原性タンパク質のサブユニット抗原又は前記産卵低下症候群ウイルス免疫原性タンパク質遺伝子が組換えられた生ベクターを含む。
本発明は、更に、産卵低下症候群を防止するワクチン組成物に関する。、前記ワクチン組成物は、免疫量の産卵低下症候群ウイルス抗原及び獣医薬的に許容し得るベクターを含む。また、前記産卵低下症候群ウイルス抗原は、産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質抗原又は前記産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質遺伝子が組換えられた生ベクターである。
本発明は、更にまた、前記ワクチン組成物の製造方法に関する。前記製造方法は、前記産卵低下症候群ウイルスタンパク質遺伝子をクローンする工程（１）と、前記工程（１）でクローニングしたタンパク質遺伝子を転化及び組換える工程（２）と、前記組換えられた産卵低下症候群ウイルスタンパク質を発現する工程（３）と、前記組換えられた産卵低下症候群ウイルスタンパク質を分離して精製し、非イオン界面活性剤を使用して前記精製した組換えられた産卵低下症候群ウイルスタンパク質を処理する工程（４）と、前記産卵低下症候群ウイルスタンパク質抗原及びアジュバントを所定の比率どおりに混合し、乳化する工程（５）とを含む。
本発明は、更に、前記ワクチン組成物の、産卵低下症候群ウイルス感染を予防及び／又は治療する薬物製造における使用に関する。
本発明は、先ず、産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質を使用し、選択した産卵低下症候群ウイルスタンパク質遺伝子を高効率で発現した後、ワクチン組成物を製造することにより、産卵低下症候群疫病を予防及び／又は治療できる。当該タンパク質を含有するワクチン組成物で動物を免疫後、動物有機体に急速に抗体を産生させることによって、現在流行する産卵低下症候群ウイルスの単独又は混合感染に対して良好な予防及び制御効果が得られる。また、該ワクチン組成物は生物的安全性が高い。
本発明の産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質により製造されたワクチン組成物は、その免疫原性に優れ、鶏及びアヒルに対して完全に保護することができる。多様な地域から起源する野生株に対して効果的予防を行うことができるので、臨床応用的に産卵低下症候群ウイルスの感染を予防及び／又は治療できる。
以下、本発明の実施形態を説明する。
「産卵低下症候群ウイルス」（Ｅｇｇ Ｄｒｏｐ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｖｉｒｕｓ、ＥＤＳＶ）の用語は、禽アデノウイルスIII群に属し、ゲノムは、二重鎖ＤＮＡであることを意味する。それにより引き起こされる臨床症状には、産卵鶏に軟殻卵、薄殻卵及び無殻卵を産ませ、産卵率を深刻に低下させることが含まれる。その病理的変化は、卵巣が静止し、発育せず、輸卵管が萎縮するといったことを特徴とする。
本発明は、産卵低下症候群を予防するためのワクチン組成物に関する。前記ワクチン組成物は、免疫量の産卵低下症候群ウイルス抗原及び獣医薬的に許容し得るベクターを含む。前記産卵低下症候群ウイルス抗原は、産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質抗原又は前記産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質遺伝子が組換えられた生ベクターである。
本発明は、産卵低下症候群ウイルスカプソメア表面における含有量が極めて少ないファイバータンパク質が良好な免疫原性を有し、それにより製造されたサブユニット抗原又はその遺伝子が組換えられた生ベクターは、免疫後、全て良好な免疫効力を産生し、鶏及びアヒルに対して１００％保護できることを、最初に発見したものである。
本発明で使用される「ワクチン組成物」の用語は、産卵低下症候群ウイルス免疫原性を含有する薬物組成物を指す。当該薬物組成物は、鶏及びアヒルの産卵低下症候群ウイルスのみに対する免疫反応を誘発、刺激又は増強できる。
「免疫量」の用語は、「免疫有効量」として理解すべきであり、免疫保護量又は免疫応答を産生する有効量とも称する。また、受容者体内で免疫応答を効果的に誘導可能な抗原量であり、当該量は、健康への不利な影響又はその合併症を含む病気の徴候又は症状を予防又は改善するに十分である。前記免疫応答は、診断目的又はその他の試験のためには十分可能、若しくは病原体により引き起こされる感染による健康への不利な結果又はその合併症を含む病気の徴候又は症状を予防するのに適合可能である。体液性免疫力又は細胞媒介免疫力、或いはこの両方とも誘導することができる。
動物の免疫原性組成物に対する免疫応答は、例えば、抗体力価を測定し、リンパ細胞増殖を分析して間接的に評価するか、或いは野生株攻撃後、徴候又は症状を観察することにより直接評価することができる。当該ワクチンが提供する保護性免疫力は、例えば、死亡率や発病率の減少、温度数値、被験者の身体全体の生理状況及び身体全体の健康及び表現のような被験者の臨床徴候を測定することにより評価できる。前記免疫応答は、誘導細胞性及び／又は体液性免疫力を含むことができるが、これらに限定されない。
「産卵低下症候群ウイルス抗原」の用語とは、少なくとも一種の産卵低下症候群ウイルス抗原を含有するいかなる組成物も意味する。前記産卵低下症候群ウイルス抗原は、産卵低下症候群ウイルス感染の免疫応答を誘導、刺激又は抵抗できる。また、前記抗原は、不活化、弱毒又はサブユニットの抗原を含むが、これらに限定されない。
本発明に記載される産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質抗原は、組換え発現されたファイバータンパク質サブユニット抗原とすることができる。その発現系は、原核発現系、真核発現系でも良く、人工により合成された合成ペプチド抗原でも良い。
「サブユニット抗原」の用語は、遺伝子工学方法を利用して病原体の保護性抗原遺伝子を原核又は或真核発現系にクローニングすることにより、高効率で発現させて製造した抗原を指す。全ウイルス抗原に比べ、サブユニット抗原は、副反応を引き起こす可能性が小さい。
「合成ペプチド抗原」の用語は、免疫決定基集団分だけを含有する低分子ペプチドを意味する。即ち、人工的方法によって天然タンパク質のアミノ酸配列通りに保護性短鎖ペプチドを合成し、ベクターと連結させた後、アジュバントを加えて製造した抗原を指す。
「生ベクター」の用語は、非病原性微生物に対して、遺伝子工学の方法により、一種の抗原又は抗原決定基の遺伝子を携帯させ且つ発現させて、免疫原性を産生させることを指す。非病原性微生物は、細菌及びウイルスであってよく、ベクターとしてのウイルス生ベクターのウイルスは、一般に、痘苗ウイルス、禽痘ウイルス、火鶏疱疹ウイルス、アデノウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス及びレンチウイルスを含む。また、細菌生ベクターは、弱毒サルモネラ、ＢＣＧ、弱毒ヒト単球リステリア、弱毒ビブリオコレラ菌、弱毒赤痢菌、乳酸球菌、ラクトバチルス プランタルム、ガウゼレンサ球菌を含むことが可能である。
本発明の一実施形態中、本発明のワクチン組成物において、前記産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示すヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質である。
本発明の一実施形態中、本発明のワクチン組成物において、前記産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示すヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質である。
本発明の一実施形態中、本発明のワクチン組成物において、前記産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質のコーディング遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示すヌクレオチド配列又はその縮重配列を有する。
本発明の一実施形態中、本発明のワクチン組成物において、前記産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質のコーディング遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示すヌクレオチド配列又はその縮重配列を有する。
本発明の一実の形態中、本発明のワクチン組成物において、前記産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質抗原含量は、ＨＡ力価≧１：３２である。
本発明の好ましい一実施形態では、本発明のワクチン組成物において、前記産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質抗原含量は、ＨＡ力価１：３２〜１：１２８である。
本発明のより好ましい一実施形態では、本発明のワクチン組成物において、前記産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質抗原含量は、ＨＡ力価１：３２〜１：６４である。
本発明に記載されるワクチン組成物において、前記産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質抗原の含量量の範囲は、ＨＡ力価１：６４〜１：１２８から選択されても良い。
本発明の一実施形態中、本発明のワクチン組成物において、前記産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質遺伝子が組換えられた生ベクターは、組換え弱毒サルモネラ菌、組換えニューカッスル病ウイルス、組換え痘ウイルスである。
本発明の生ベクターワクチン組成物は、不活化ワクチン及び生ワクチン両方の利点を有するので、免疫効力的に、産卵禽に対する保護を行うことができることを保証でき、その免疫効力が強く、アジュバントを添加しなくても良い。
「獣医薬的に許容し得るベクター」の用語は、本発明ワクチン組成物のうち産卵低下症候群ウイルス抗原以外のすべての成分を指す。また、有機体を刺激せず、化合物の生物学活性及び特性を阻害しないベクター又は希釈剤を指し、アジュバントであることが好ましい。
本発明のワクチン組成物は、更に、他の試剤を本発明の組成物に加えることができる。
本発明の一実施形態では、前記獣医薬的に許容し得るベクターは、薬物，免疫刺激剤、抗酸化剤、界面活性剤、着色剤、揮発性油、緩衝剤、分散剤、推進剤及び防腐剤を含み、前記免疫刺激剤は、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）及びインターロイキン２（ＩＬ２）を含む。
免疫刺激剤は、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）及びインターロイキン２（ＩＬ２）を含むことが好ましい。
このような組成物を製造するために、本分野で周知の方法を利用することができる。
「アジュバント」の用語は、アルミナゲルアジュバント、Ｑｕｉｌ Ａ、ＱＳ−２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏn、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ）、ＧＰＩ−０１００（Ｇａｌｅｎｉｃａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ ＡＬ）のようなサポニン（ｓａｐｏｎｉｎ）、油中水型乳剤、水中油型乳剤、水中油中水型乳剤、アクリル酸又はメタクリル酸の重合体、無水マレイン酸とアルケニル（ａｌｋｅｎｙｌ）誘導体との共重合体から選択された化合物を含むことができる。
「乳剤」の用語は、特に、軽質流動パラフィンオイル（ヨーロッパ薬局方類型）、スクアラン（ｓｑｕａｌａｎｅ）又はスクアレンオイル（ｓｑｕａｌｅｎｅ ｏｉｌ）のようなオレフィンがオリゴ重合したイソプレノイドオイル（ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄ ｏｉｌ）、特にイソブテン又はデセン、酸又はアルコールの直鎖アルキルを含むエステル、更に特に、植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコール−（オクタン酸エステル/デカン酸エステル）、トリアシルグリセロール−（オクタン酸エステル/デカン酸エステル）又はプロピレングリコールオレイン酸エステル、分枝鎖脂肪酸又はアルコールのエステル、特にイソステアリン酸エステルに基づくものであってよい。
また、乳剤を形成し易くするように、オイルと乳化剤を組合して使用する。乳化剤は、非イオン界面活性剤であることが好ましく、特にソルビタンのエステル、二縮マンニトール一オレイン酸（ｍａｎｎｉｄｅ）のエステル（例えば、マンニタンオレイン酸エステル）、脂肪族グリコール（グリコール）のエステル、ポリグリセリン（ｐｏｌｙｇｌｙｃｅｒｏｌ）のエステル、プロピレングリコールのエステル及びオレイン酸のエステル、イソステアリン酸のエステル、リシノール酸のエステル又はヒドロキシステアリン酸のエステルであることが好ましく、それらから任意に選択してエトキシ化することができる。
なお、ポリプロピレンオキシド−ポリオキシエチレンブロック共重合体、特にプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）製品、特にＬ１２１である。Ｈｕｎｔｅｒ等により編集された＜Ｔｈｅ ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｊｕｖａｎｔｓ（アジュバントの理論及び実際応用）＞（ＤＥＳ Ｓｔｅｗａｒｔ−Ｔｕｌｌ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、１９９５、５１−９４）及びＴｏｄｄ等により編集された＜Ｖａｃｃｉｎｅ（ワクチン）＞（１９９７、１５、５６４−５７０）を参照のこと。
例えば、Ｐｏｗｅｌｌ Ｍ及びＮｅｗｍａｎ Ｍにより編集された＜Ｖａｃｃｉnｅ ｄｅｓｉｇｎ（ワクチン設計）、ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ａｄｉｕｖａｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ（サブニット及びアジュバントアプローチ）＞（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、１９９５）第１４７ページに記述されたＳＰＴ乳剤及び第１８３ページに記述されたＭＦ５９乳剤を使用することが可能である。
「アクリル酸又はメタクリル酸の重合体」の用語は、架橋したアクリル酸又はメタクリル酸重合体であることが好ましく、特に砂糖（ｓｕｇａｒ）のポリアルケニルエーテル又はポリオールと交差架橋することが好ましい。これらの化合物は、既知のものであり、カルボマー（Ｃａｒｂｏｍｅｒ、商品名カーボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ））（Ｐｈａｍｅｕｒｏｐａ、１９９６、８(２)）と呼ばれる。
当業者は、米国特許ＵＳ２９０９４６２を参照しても良く、そこには、この種類のアクリル酸重合体が記述されている。ポリヒドロキシル化化合物と交差架橋され、前記化合物は、少なくとも３個のヒドロキシを有し、８個を超えないことが好ましく、その内、少なくとも３個のヒドロキシの水素原子は、少なくとも２個の炭素原子を有する不飽和脂肪族ラジカル（ａｌｉｐｈａｔｉｃ ｒａｄｉｃａｌ）により取り替えられる。基は、２〜４個の炭素原子を含有する基、例えば、エチレン基、アリル基及び他のエチレン性不飽和基（ｅｔｈｙｌｅｎｉｃａｌｌｙ ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ｇｒｏｕｐ）であることが好ましい。前記不飽和基自体は、メチル基のような他の置換基を含むことが可能である。
これらの製品は、カーボポールの名義で販売され、（ＢＦ Ｇｏｏｄｒｉｃｈ、Ｏｈｉｏ、ＵＳＡ）が特に適合である。これらは、アリル基スクロースと又はアリルペンタエリトリトール（ａｌｌｙｌ ｐｅｎｔａｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ）と交差架橋される。ここで、カーボポール９７４Ｐ、９３４Ｐ及び９７１Ｐを言及することができ、カーボポール９７１Ｐを使用することが一番好ましい。
「無水マレイン酸とアルケニル誘導体との共重合体」の用語は、無水マレイン酸とエチレンとの共重合体ＥＭＡ（モンサント社）を考慮しても良い。これらの重合体は、水の中で溶解して酸性溶液を産生し、中和を経て、アジュバント溶液を産生し易くするように、生理的ｐＨまで中和させることが好ましい。さらに、その中に免疫原性、抗原性又はワクチン性組成物自体を混ぜ合わせることが可能である。
「アジュバント」の用語は、ＲＩＢＩアジュバントシステム（ＲＩＢＩ社）、ブロック共重合体（ＣｙｔＲｘ、Ａｔｌａｎｔａ ＧＡ）、ＳＡＦ−Ｍ（キロン、エメリビル ＣＡ）、モノホスホリルリピドＡ（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ ｌｉｐｉｄ Ａ）、アブリジン脂質−アミンアジュバント、大腸菌易熱性毒素（組換え又はその他）、コレラ毒素、ＩＭＳ １３１４、ムラミルジペプチド、ゲルアジュバント等を含むが、これらに限らない。
前記アジュバントは、アルミナゲルアジュバント、サポニン、油中水型乳剤、水中油型乳剤、水中油中水型乳剤、アクリル酸又はポリメタクリル酸の重合体、無水マレイン酸和アルケニル（ａｌｋｅｎｙｌ）誘導体の共重合体、ＲＩＢＩアジュバントシステム、ブロック共重合体、ＳＡＦ−Ｍ、モノホスホリルリピドＡ、アブリジン脂質−アミンアジュバント、大腸菌易熱性毒素、コレラ毒素、ＩＭＳ １３１４、ムラミルジペプチド又はゲルアジュバントのうち一種又は数種を含むことが好ましい。
本発明の一実施形態では、前記獣医薬的に許容し得るベクターは、アジュバントを含む。前記アジュバントは、（１）アルミナゲルアジュバント、サポニン、アブリジン、ＤＤＡ、（２）油中水型乳剤、水中油型乳剤、水中油中水型乳剤、又は（３）アクリル酸又はメタクリル酸の重合体、無水マレイン酸とアルケニル誘導体との共重合体、及びＲＩＢＩアジュバントシステム、ブロック共重合体、ＳＡＦ−Ｍ、モノホスホリルリピドＡ、アブリジン脂質−アミンアジュバント、大腸菌易熱性毒素、コレラ毒素、ＩＭＳ１３１４、ムラミルジペプチド、ゲルアジュバントのうち一種又は数種を含む。
サポニンは、Ｑｕｉｌ Ａ、ＱＳ−２１、ＧＰＩ−０１００であることが好ましい。
乳剤は、ＳＰＴ乳剤、ＭＦ５９乳剤であるか、或いは、乳剤は、オイル及び乳化剤を組み合わせて形成されることが好ましい。乳剤は、軽質流動パラフィンオイル、オレフィンオリゴマー化によって生成されたイソプレノイドオイル（例えば、スクアラン又はスクアレンオイル、オレフィン、特にイソブテン又はデセンオリゴマー化によって生成されたオイル）、酸又はアルコールの直鎖アルキルを含むエステル（更に特に、植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコール−（オクタン酸エステル/デカン酸エステル）、トリアシルグリセロール−（オクタン酸エステル/デカン酸エステル）又はプロピレングリコールオレイン酸エステル）、分枝鎖脂肪酸又はアルコールのエステル（特にイソステアリン酸エステル）に基づくことができる。
乳化剤は、非イオン界面活性剤（特にポリオキシエチレン化された脂肪酸（例えば、オレイン酸）のエステル、ソルビタンのエステル、二縮マンニトール一オレイン酸のエステル（例えば、マンニタンオレイン酸エステル）、脂肪族グリコールのエステル、グリセリンのエステル、ポリグリセリンのエステル、プロピレングリコールのエステル及びオレイン酸のエステル、イソステアリン酸のエステル、リシノール酸のエステル又はヒドロキシステアリン酸のエステルであり、上記のエステルは、エトキシ化され、脂肪族アルコールとポリオール（例えば、オレイルアルコール）のエーテル、ポリプロピレンオキシド−ポリオキシエチレンブロック共重合体（特にプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ(R)）、特にＬ１２１））である。
アクリル酸又はポリメタクリル酸の重合体は、架橋アクリル酸又はメタクリル酸重合体、特に砂糖のポリアルケニルエーテル又はポリオールと架橋された化合物であるカルボマーであることが好ましく、カーボポール９７４Ｐ、９３４Ｐ及び９７１Ｐであることが好ましい。
無水マレイン酸とアルケニル誘導体との共重合体は、無水マレイン酸とエチレンとの共重合体ＥＭＡであることが好ましい。
前記アジュバントは、油中水型乳剤を製造するためのワイトオイルアジュバントであることが好ましい。
前記アジュバントの濃度範囲は、５％〜７０％Ｖ／Ｖであり、３０％〜７０％であることが好ましく、６６％Ｖ／Ｖであることがより好ましい。本発明の産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質遺伝子は、発現ベクター、核酸ワクチン、診断試薬開発及び他の産卵低下症候群ウイルスの予防及び／又は治療に関する薬物の開発に応用できる。
本発明は、組換えベクターに関し、前記組換えベクターは、本発明に記載される免疫原性を有し且つ免疫反応を産生できるヌクレオチド配列でコードされる、ファイバータンパク質を発現できる。
本発明は、転換体に関し、前記転換体は、導入された本発明に記載されるファイバータンパク質を発現する組換えベクターを含む。
本発明のファイバータンパク質は、本分野で既知のいかなる方法により製造可能であり、例えば、ファイバータンパク質遺伝子を組換えて発現をすることによって、ファイバータンパク質を製造することができる。また、発現系は、既知のいずれかの発現系、例えば、真核発現系、原核発現系を使用することができる。或いは、ファイバータンパク質配列を直接合成してもよい。真核発現系は、哺乳動物細胞発現、酵母発現系及び昆虫発現系を含むことができる。
本発明のワクチン組成物は、他の病原体又は抗原集合を更に含ませて、産卵低下症候群ウイルス感染を含む各種の病気を防止する混合ワクチン又は複合ワクチンを製造することができる。
「混合ワクチン」の用語は、本発明の産卵低下症候群ウイルスと少なくとも一種の異なるウイルスとのウイルス混合物により製造したワクチンを指す。「複合ワクチン」の用語は、本発明の産卵低下症候群ウイルス及び細菌により製造したワクチンを指す。例えば，本発明の産卵低下症候群ウイルスは、鶏ニューカッスル病ウイルス、鶏伝染性気管支炎ウイルス、鳥インフルエンザウイルス、鶏伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、禽アデノウイルス、鳥類レオウイルス及び／又は大腸菌、副鶏アビバクテリウム・パラガリナラム、マイコプラズマ・シノビエ、鶏マイコプラズマ・ガリセプティクムと混合又は組み合わせることができる。
本発明の一実施形態中、前記ワクチン組成物は、鶏ニューカッスル病ウイルス抗原、鳥インフルエンザウイルス抗原、鶏伝染性気管支炎ウイルス抗原、鶏伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス抗原、禽アデノウイルス抗原、鳥類レオウイルス抗原、大腸菌抗原、副鶏アビバクテリウム・パラガリナラム抗原、マイコプラズマ・シノビエ抗原、鶏マイコプラズマ・ガリセプティクム抗原、パスツレラ・ムルトシダ抗原、マレック病ウイルス抗原、禽脳脊髄炎ウイルス抗原、鶏伝染性喉頭気管炎ウイルス抗原からなる群から選ばれる一種又は数種を更に含む。
本発明の好ましい一実施形態中、前記ワクチン組成物は、鶏ニューカッスル病ウイルス不活化抗原、鳥インフルエンザウイルス不活化抗原、鶏伝染性気管支炎ウイルス不活化抗原、鶏伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスサブユニット抗原、禽アデノウイルス不活化抗原又はサブユニット抗原からなる群のうち一種又は数種を更に含む。
本発明の好ましい一実施形態中、前記鶏ニューカッスル病ウイルス不活化抗原はＮ７ａ株不活化抗原であり、前記鳥インフルエンザウイルス不活化抗原はＳＺ株不活化抗原であり、前記鶏伝染性気管支炎ウイルス不活化抗原はＭ４１株不活化抗原であり、前記鶏伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスサブユニット抗原は鶏伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスＶＰ２タンパク質であり、前記禽アデノウイルス不活化抗原はＦＡＶ−ＨＮ株不活化抗原であり、前記禽アデノウイルスサブユニット抗原は禽アデノウイルスペントンタンパク質又はファイバー−２タンパク質である。
本発明の一実施形態では、前記産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質の含有量はＨＡ力価１：３２〜１：１２８であり、前記鶏ニューカッスル病ウイルス不活化抗原の含有量は不活化前に１０８.０〜１０９.０ＥＩＤ５０/０.１ｍｌであり、前記鳥インフルエンザウイルス不活化抗原の含有量は不活化前に１０６.５〜１０８.５ＥＩＤ５０/０.１ｍｌである。また、前記鶏伝染性気管支炎ウイルス不活化抗原の含有量は不活化前に１０６.０〜１０７.０ＥＩＤ５０/０.１ｍｌであり、前記鶏伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスＶＰ２タンパク質の含有量はＡＧＰ力価１：１６〜１：１２８である。また、前記禽アデノウイルスペントンタンパク質の含有量はＡＧＰ力価１：２〜１：１６であり、前記禽アデノウイルスファイバー−２タンパク質の含有量はＡＧＰ力価１：２〜１：１６である。
本発明の好ましい一実施形態ではて、前記産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質の含有量はＨＡ力価１：３２〜１：１２８であり、前記鶏ニューカッスル病ウイルス不活化抗原の含有量は不活化前に１０８.０ＥＩＤ５０/０.１ｍｌであり、前記鳥インフルエンザウイルス不活化抗原の含有量は不活化前に１０８.０ＥＩＤ５０/０.１ｍｌである。また、前記鶏伝染性気管支炎ウイルス不活化抗原の含有量は不活化前に１０６.０ＥＩＤ５０/０.１ｍｌであり、前記鶏伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスＶＰ２タンパク質の含有量はＡＧＰ力価１：１６である。さらに、前記禽アデノウイルスペントンタンパク質の含有量はＡＧＰ力価１：４であり、前記禽アデノウイルスファイバー−２タンパク質の含有量はＡＧＰ力価１：４である。
本発明は、更に、前記ワクチン組成物の製造方法に関する。前記方法は、前記産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質遺伝子をクローニングし、前記産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質遺伝子を発現ベクターに組換えて、前記産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質遺伝子が組換えられた組換え発現ベクターを得る工程（１）と、前記産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質遺伝子を組換えた組換え発現ベクター及び分子シャペロンの発現ベクターを共に大腸菌に転化し、前記産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質を発現する工程（２）を有する。さらに前記方法は、非イオン界面活性剤を使用して、前記発現した産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質を処理し内毒素を除去する工程（３）と、前記内毒素を除去した産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質及びアジュバントを均一に混合して前記ワクチン組成物を得る工程（４）と、を含む。
本発明の一実施形態中、前記ワクチン組成物の製造方法において、前記工程（１）における前記組換え有産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質遺伝子の組換え発現ベクターは、組換えｐＥＴ２８ａプラスミドである。また、前記工程（２）における前記分子シャペロンの発現ベクターはｐＧ−Ｔｆ２であり、前記大腸菌は大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）である。さらに、前記工程（３）における非イオン界面活性剤は、トリトンＸ−１１４である。
本発明は、更に、前記ワクチン組成物の、産卵低下症候群を予防及び／又は治療する薬物製造における使用に関する。
本発明は、更に、前記ワクチン組成物の、産卵低下症候群ウイルス感染を製造予防及び／又は治療する薬物製造における使用に関する。
本発明に記載される産卵低下症候群ウイルス感染を予防及び／又は治療する薬物製造の適用対象は、鶏又はアヒルを含む。
「予防及び／又は治療」の用語が、産卵低下症候群ウイルス感染に言及している時は、この用語は、産卵低下症候群ウイルスの複製を抑制すること、産卵低下症候群ウイルスの伝播を抑制又は産卵低下症候群ウイルスがその宿主体内で定着することを防止すること、及び産卵低下症候群ウイルス感染の病気又は病症の症状を軽減することを指す。若し、ウイルス負荷量が減少し、病症が軽減され及び／又は摂食量及び／又は生長が増加した場合、前記治療が治療効果に達したとみなすことができる。
以下、具体的な実施例を結びつけながら本発明を更に詳述する。これによって、本発明の利点及び特徴は、記述に連れてより明らかになる。但し、これらの実施例は、ただ範例的なものであり、本発明の範囲に対していかなる限定を加えるものではない。当業者達は、本発明の精神及び範囲を逸脱せずに本発明の技術方案の細部及び形式に対する修正又は変更を行うことができ、これらの修正及び変更は、全て本発明の保護範囲内にあることが理解できよう。
本発明の実施例で用いられた化学試剤は、全て分析純度であり、中国医薬集団より購入したものである。
本発明をより理解し易くするために、以下、具体的な実施例を結びつけながら本発明を更に詳しく述べる。本発明に記載される実験方法は、特に説明のない限り、全て通常の方法であり、記載される生物材料は、特に説明のない限り、全て商業的に入手できるものである。
（ｐＥＴ２８a−ＥＤＳＶ−ファイバー発現ベクターの構築）
１.ＥＤＳＶウイルスＤＮＡの抽出
プラスミド抽出キットは、中国天根生物社より購入し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼは、ＢｉｏＬａｂ社より購入し、ｐＥＴ２８ａプラスミドは、Ｎｏｖａｇｅｎ社より購入し、アガロースゲルエクストラクションキットは、中国天澤生物社より購入した。その他の試剤は、全部分析純度である。
ウイルスＤＮＡ抽出キットの明細書に従って、０.２ｍｌの産卵低下症候群ウイルス液を無菌１.５ｍｌ遠心管に取り入れた。０.４ｍｌのＶＢを試料溶液に加え、渦流混合し、室温で１０分間静置した。０.４５ｍｌのＡＤ緩衝液を試料溶液に加え、激しく均一に混合した。ＶＢカラムを２ｍｌ集合管に入れ、０.６ｍｌの混合液をＶＢカラムに入れ、１４０００ｇ、１分間遠心した。一方、残りの混合液をＶＢカラムに加え、１４０００ｇ、１分間遠心した。２ｍｌ集合管を放棄し、ＶＢカラムを新しい２ｍｌ集合管に入れ、０.４ｍｌのＷ１緩衝液を加え、１４０００ｇ、３０秒間遠心した。続いて、０.６ｍｌの洗浄緩衝液をＶＢカラムに加え、１４０００ｇ、３０秒間遠心した後、緩衝液を加えずに、再び３分間遠心した。次に、ＶＢカラムを新しい１.５ｍｌのＥＰ管に入れ、５０ｕｌのＲＮａｓｅフリー水を加えて膜中央に置き、３分間静置し、１４０００ｇ、１分間遠心した。遠心して得られた液体は、ＤＮＡゲノムであった。。
２.ファイバータンパク質遺伝子増殖
ファイバータンパク質遺伝子５’末端及び３’末端の保存領域配列によって、オリゴヌクレオチドプライマーを合成し、ＰＣＲを行った。プライマー配列は、表１を参照。
Figure 2019512461
ＰＣＲ産物をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社に送り、配列測定を行った。配列測定結果に基づき、ファイバータンパク質遺伝子に対してコドン最適化を行った。最適化後のファイバータンパク質遺伝子配列は、配列表ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示す通りである。
３.発現ベクター構築
最適化後、ファイバータンパク質遺伝子を中国蘇州金唯智生物科技有限会社に送り、全配列合成を行った。次に、ｐＥＴ２８ａプラスミドに連結させた。連結後のプラスミド及び分子シャペロンプラスミドｐＧ−Ｔｆ２を共に大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に転化させ、単クローンを選び、１００μｇ/ｍｌのカナマイシン及び２０μｇ/ｍｌのクロラムフェニコールを含有するＬＢ培地の中で一晩培養させた。続いて、プラスミドを抽出した後、配列測定及び分析を行った。陽性クローンは、ｐＥＴ２８a−ＥＤＳＶ−ファイバー/ｐＧ−Ｔｆ２発現菌株であった。。
（ファイバータンパク質の製造）
実施例１で製造したｐＥＴ２８a−ＥＤＳＶ−ファイバー/ｐＧ−Ｔｆ２/Ｅ.Ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株を、５０−１００μｇ/ｍｌカナマイシン及び２０μｇ/ｍｌクロラムフェニコールを含有するＬＢ培地に接種し、同時に、ＬＢ培地には、分子シャペロンタンパク質の誘導発現に用いる５−１０ｎｇ/ｍｌテトラサイクリンを含有させた。接種量は、１％（Ｖ／Ｖ）であり、３７℃下で振盪培養した。ＯＤ６００値＝０.４〜０.６の時に、２８℃で３０分間放置した。イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加えて、最終濃度が０.１〜１.０ｍＭになるようにし、２８℃で２４時間振盪培養した。培養が完了した後、タルスを収集し、ＰＢＳ（塩化ナトリウム８ｇ、塩化カリウム０.２ｇ、リン酸水素二ナトリウム１.４４ｇ、リン酸二水素カリウム０.２４ｇ、ｐＨ７.４に調整し、１Ｌに定容する）を用いてタルスを再懸濁し、超音波破砕し、遠心して上澄みを取得した。発現産物中、可溶性目的タンパク質の含有量は比較的多く、可溶性ファイバータンパク質の発現量は、タルスタンパク質総量の３０％に達した。さらに、ファイバータンパク質のＨＡ力価は１：５１２に達し、内毒素含有量は０.５１×１０５ＥＵ/ｍｌであった。
（大腸菌発現ファイバータンパク質内毒素の除去）
１.５ｍｌ遠心管に処理すべき溶液０.５ｍｌ及び最終濃度１％（Ｖ／Ｖ）のトリトンＸ−１１４（トリトンＸ−１１４）（５μl）を加え、ボルテックス振盪した。サンプルを氷上に５分間放置した。サンプルをボルテックス振盪・冷却した後、遠心管を直に３７℃湯浴に入れ、５分間温浴して、新たな二相を産生させた。その後、サンプルを３７℃で６０秒間遠心したる。遠心後、目的タンパク質は上層に残ったが、他方、内毒素を含有する洗浄剤は、油滴形状で遠心管の底部に残留した。こうして、内毒素を除去する操作全体を３回繰返し行った。測定した結果、ファイバータンパク質のＨＡ力価は、１：５１２に達し、内毒素含有量は、０.００９×１０５ＥＵ/ｍｌに減少した。
上記結果か、トリトンＸ−１１４は、組換えタンパク質内に残留する内毒素を除去でき、ファイバータンパク質免疫原性に影響を与えないいうことが示された。
（産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質サブユニットワクチンの製造）
実施例３の方法通りに精製した後のファイバータンパク質をワイトオイルアジュバントにゆっくり加える同時に、モーターを運転させ、１７５００ｒ/ｍｉｎで５分間攪拌した。攪拌終了前に、１％チメロサール溶液を加えて、その最終濃度が０.０１％になるようにした。具体的な配合比率を、表２に示す。
Figure 2019512461
（産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質サブユニットワクチンの安全性試験）
２１日齢のＳＰＦ鶏６０羽を取り、１群毎に１５羽ずつ群分けした。第１群〜第３群に対してそれぞれ実施例４で製造したワクチン１〜ワクチン３を頚皮下注射して免疫させた。免疫用量は、１.０ｍｌであった。また、第４群に対して１.０ｍｌの生理食塩水を皮下注射して、ブランク対照とした。同一条件下で飼育し、免疫して第３週後から各群の臨床症状、体重増加率、死亡率を３週間観察した。３週、４週、５週後、それぞれ５羽ずつ解剖し、接種部位に肉眼病変が形成されているか否かを観察した。結果から（表３、表４を参照）、ワクチン１〜ワクチン３の接種群では、臨床症状及び死亡が見られなかった。なお、接種群とブランク対照群との体重増加率は、明らかな差異を示さず、肉芽腫の形成も見られなかった。これは、本発明により製造した産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質サブユニットワクチンは、鶏の免疫に用いるのには安全であり、体重増加にも影響がないということを示している。
Figure 2019512461
Figure 2019512461
（産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質サブユニットワクチンのＳＰＦ鶏免疫原性に対する試験）
２１日齢のＳＰＦ鶏４０羽を取り、１群毎に１０羽ずつ４群に群分けした。、第５群〜第７群に対してそれぞれ実施例４で製造したワクチン１〜ワクチン３を頚皮下注射して免疫させた。免疫用量は、０.５ｍｌであった。また、第８群に対して０.５ｍｌの生理食塩水を頚部皮下注射して、ブランク対照とした。すべての試験鶏は、全て隔離飼育し、免疫前及び免疫して２１日後に、鶏毎にそれぞれ採血し、血清を分離し、血清の産卵低下症候群ＨＩ抗体力価を測定した。その結果を、表５に示す。
Figure 2019512461
上記結果から、第８群の対照群は、免疫後２１日目のＨＩ抗体力価が０であったが、一方、第５群〜第７群の免疫群とも免疫鶏に対して比較的高いＨＩ抗体力価を産生したことが示された。これは、ＨＩ力価が１：３２以上の産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質サブユニットワクチンを用いれば、鶏群に比較的高いＨＩ抗体力価を産生させることができて、鶏群を効果的に免疫保護できることが実現できることを示す。
（産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質サブユニットワクチンの産卵鶏免疫原性に対する試験）
１１５日齢のハイラインブラウン商品産卵鶏（Highland brown laying hens）４０羽を取り、１群毎に１０ずつ４群に分けた。第９群〜第１１群に対してそれぞれ実施例４で製造したワクチン１〜ワクチン３を頚皮下注射して免疫させた。免疫用量は、０.５ｍｌであった。また、第１２群に対して０.５ｍｌの生理食塩水を頚部皮下注射して、ブランク対照とした。免疫前及び免疫して２１日後に、鶏毎にそれぞれ採血し、血清を分離し、血清の産卵低下症候群ＨＩ抗体力価を測定した。産卵率が９０％程度に達した時（免疫後６週）、４群全ての試験鶏に全部ＡＶ１２７株で強毒性感染をさせた。１羽毎に１０倍希釈毒１ｍｌを経口摂取させた。ウイルス含有量は、１０６.５ＥＩＤ５０であった。ウイルス感染させた後、６週間観察し、鶏群摂食、気力、糞便等の状况を観察し、産卵数を記録し、産卵率を計算した。その結果を、表６に示す。
Figure 2019512461
上記結果から、第１２群の対照群は、免疫して２１日後のＨＩ抗体力価が０であり、ブランク対照群の試験鶏は、ウイルス感染後産卵が低下し始め、ウイルス感染後第３週に産卵率が元来の９０％程度から４７％程度に低下する同時に、卵の殻の色が薄くなり、軟殻卵、無殻卵、畸形卵等を産んだ。また、ウイルス感染して第６週後の産卵率は７０％程度であったが、依然として正常水準まで回復しなかった。他方、第９群〜第１１群の免疫群は、全ての免疫鶏に対して比較的高いＨＩ抗体力価を産生し、ウイルス感染後の産卵率はほぼ変化がなかったことが示された。これは、ＨＡ力価が１：３２以上の産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質サブユニットワクチンを用いると、免疫鶏全てが比較的高いＨＩ抗体力価を産生し、本発明のファイバータンパク質抗原免疫原性は良好であり、低い含有量でも鶏群に有効な免疫保護を提供することを実現できるということを示す。
（産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質サブユニットワクチンのチェリバレーアヒルに対する免疫原性試験）
４２日齢のチェリバレーアヒル４０羽を取り、１群毎に１０羽ずつ４群に分けた。第１３群〜第１５群に対してそれぞれ実施例４で製造したワクチン１〜ワクチン３を頚部皮下注射し免疫させた。免疫用量は、０.５ｍｌであった。また、第１６組に対して０.５ｍｌの生理食塩水を頚部皮下注射して、ブランク対照とした。すべての試験アヒルは、全部隔離飼育され、免疫前及び免疫してから２１日後に、アヒル１羽毎にそれぞれ採血し、血清を分離し、血清中の産卵低下症候群ＨＩ抗体力価を測定した。測定結果を、表７に示す。
Figure 2019512461
上記結果から、第１６群の対照群のアヒルは免疫して２１日後のＨＩ抗体力価は０であったが、他方、第１３群〜第１５群の免疫群のアヒルは、全て比較的高いＨＩ抗体力価を産生し、免疫効果が良好であることが示された。これは、ＨＩ力価が１：３２以上の産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質サブユニットワクチンを用いると、免疫アヒルに比較的高いＨＩ抗体力価を産生させることができ、本発明のファイバータンパク質抗原は、免疫原性が良好で、低い含有量でもアヒル群に対して有効な免疫保護を提供できるということを示す。
（産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質サブユニットワクチンの広域性保護試験）
１２０日齢のハイラインブラウン商品産卵鶏１００羽を取り、１群毎に１０羽ずつ１０群に分けた。第１７群〜第２１群に対して実施例４で製造したワクチン１を頚部皮下注射し免疫させた。免疫用量は、０.５ｍｌであった。また、第２２群〜第２６群に対してそれぞれ０.５ｍｌの生理食塩水を頚部皮下注射した。免疫前及び免疫後２１日目に鶏１羽毎にそれぞれ採血し、血清を分離し、血清中の産卵低下症候群中和抗体力価を測定した。産卵率が９０％程度に達した時（免疫後６週）に、第１７群、第２２群の試験鶏を中国河南から新規分離された産卵低下症候群ウイルスＨＮ０９株で強毒性感染させた。さらに、第１８群、第２３群の試験鶏を中国山東から新規分離された産卵低下症候群ウイルスＳＤ０２株で強毒性感染させた。また、第１９群、第２４群の試験鶏を中国広東から新規分離された産卵低下症候群ウイルスＧＤ０４株で強毒性感染させた。さらに、第２０群、第２５群の試験鶏を中国遼寧から新規分離された産卵低下症候群ウイルスＬＮ０２株で強毒性感染させた。さらに、第２１群、第２６群の試験鶏を中国四川から新規分離された産卵低下症候群ウイルスＳＣ０１株で強毒性感染させた。ここにおいて、鶏１羽毎に１０倍希釈毒１ｍｌを経口摂取させ、ウイルス含有量は、１０６.５ＥＩＤ５０であった。また、ウイルス感染後、６週間観察し、鶏群の摂食、気力、糞便等の状况を観察し、産卵数を記録し、産卵率を計算した。その結果を、表８に示した。
Figure 2019512461
上記結果から、第２２群〜第２６群の対照群における免疫後２１日目の産卵低下症候群中和抗体力価は０であった。ウイルス感染後、産卵が低下し始め、ウイルス感染した第３週に、産卵率がウイルス感染前の９０.３％〜９０.６％から４３.６％〜４５.４％に低下する同時に、卵の殻色が浅くなり、軟殻卵蛋、無殻卵等を産んだ。さらに、ウイルス感染後第６週に、産卵率は６５.４％〜６８.６％に回復したが、依然として正常水準まで回復しなかった。一方、第１７群〜第２１群の免疫鶏は、全て比較的高い力価の産卵低下症候群ＨＩ抗体を産生し、且つウイルス感染後の産卵率は変化がほぼないことが示された。これは、本発明では、ＨＡ力価が１：３２以上の産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質サブユニットワクチンを用いることで、免疫鶏全てに比較的高いＨＩ抗体力価を産生させ、且つ抗原が広域性を有し、異なる地域に起源する鶏群の産卵低下症候群ウイルスに対して、鶏のウイルス感染に有効な免疫保護を提供することができて、産卵率が産卵低下症候群ウイルス野生株感染の影響を受けないということを示す。
（鶏ニューカッスル病ウイルス抗原の製造）
ニューカッスル病ウイルス（遺伝子VII型）、Ｎ７a株（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｖｉｒｕｓ(ｇｅｎｏｔｙｐｅ VII)、ｓｔｒａｉｎ Ｎ７a）（中国典型培養物保存中心に保存され、保存番号は、ＣＣＴＣＣ ＮＯ．Ｖ２０１５４５であり、保存日は、２０１５年１０月１９日であり、保存住所は、中国武漢・武漢大学である）を取り、滅菌生理食塩水で適当に希釈（１０−４又は１０−５）して１０〜１１日齢易感染鶏胚に１胚毎に０.１ｍｌずつ接種した後、３７℃で孵化を続けた。接種後４８〜１２０時間内に死亡及び生存した鶏胚を選んで、尿膜腔液を収穫した。ウイルス含有量を測定した結果、１０８.０ＥＩＤ５０/０.１ｍｌであった。最終濃度を０.１％とするホルムアルデヒド溶液（Ｖ／Ｖ）を加え、３７℃で不活化した。この間、４〜６時間おきに一回攪拌し、１６時間不活化して、完全に不活化した後、後に利用するために備えておいた。
（鳥インフルエンザ抗原の製造）
Ｈ９亜型鳥インフルエンザウイルスＳＺ株（中国特許申請ＣＮ１０３７８９２７２Ａに開示）種ウイルスを取り、無菌生理食塩水で１０−３に希釈し（ウイルス液を０.１ｍｌ取って０.９ｍｌ無菌生理食塩水に加え、振盪混合した後、この通りにまた二回希釈する）、１０日齢易感染鶏胚（北京梅里亜維通実験動物技術有限会社より購入したＳＰＦ種卵を使用して自体的に孵化する）を１胚毎に０.１ｍｌ（１０５ＥＩＤ５０含有）ずつ尿膜腔を介して接種した。接種後、針の穴を密封し、３６〜３７℃に置いて孵化を続けた。このとき、転卵する必要はない。９６時間後に取り出して、気室に対して上向きに直立させ、２〜８℃で１２〜２４時間冷却した。冷却後の鶏胚に対して胚抽出物を採取した。ウイルス含有量を測定した結果、１０８.５ＥＩＤ５０/０.１ｍｌであった。最終濃度を０.１％とするホルムアルデヒド溶液（Ｖ／Ｖ）を加え、３７℃で不活化した。この間、４〜６時間おきに一回攪拌し、２４時間不活化し、完全に不活化した後、後に利用するために備えておいた。
（鶏伝染性気管支炎抗原の製造）
鶏伝染性気管支炎ウイルスＭ４１株（中国獣医薬品監察所より購入）を取り、滅菌生理食塩水で適当に希釈（１０−２又は１０−３）して１０〜１１日齢易感染鶏胚を１胚毎に０.１ｍｌずつ接種した。接種後、３６〜３７℃で孵化を続けた。接種後２４〜４８時間内で死亡及び生存した鶏胚を選んで、尿膜腔液を採取した。ウイルス含有量を測定した結果、１０６.０ＥＩＤ５０/０.１ｍｌであった。最終濃度を０.１％とするホルムアルデヒド溶液（Ｖ
／Ｖ）を加え、３７℃で不活化した。この間、４〜６時間おきに一回攪拌し、１６時間不活化し、完全に不活化した後、後に利用するために備えておいた。
（ファブリシウス嚢抗原の製造）
１.ＶＰ２ ｃＤＮＡ製造
ウイルスＲＮＡ抽出キット操作通りに感染鶏伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス超強毒成都株のＳＰＦ鶏ファブリシウス嚢からＩＢＤＶウイルスＲＮＡを抽出し、ランダムプライマーを用いて逆転写を行った。ＶＰ２遺伝子５’末端及び３’末端の保存領域配列によってオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。合成オリゴヌクレオチドプライマーの配列は、表９に示した。続いて、ＰＣＲ増殖を行い、アガロースゲルエクストラクションキットを利用して回収し、−２０℃で保存した。
Figure 2019512461
２.ｐＣｏｌｄIII−ＶＰ２/Ｅ.Ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株の構築
上記のようにして製造したＶＰ２ ｃＤＮＡを取り、ダブルダイジェスションを行い、ダイジェスション後の断片をｐＣｏｌｄIIIベクターに連結させ、連結産物を直接大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に転化させた。次に、１００μｇのアンピシリンナトリウム毒素を含有するＬＢ固体培地に塗布し、一晩培養した。このとき、生えて出る細菌集落は、ｐＣｏｌｄIII−ＶＰ２/Ｅ.Ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株であった。
３.鶏伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスＶＰ２タンパク質の製造
培養タンクで通気培養し、容積で７０％培地及び落花生油消泡剤を入れた。滅菌後、培地量の２％〜４％でｐＣｏｌｄIII−ＶＰ２/Ｅ.Ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株種液を接種し、３７℃下で培養した。菌液のＯＤ６００値が０.６〜１.０になったとき、０.２ｍｏｌ/Ｌα−乳糖を加えて、最終濃度が０.０２ｍｏｌ/Ｌとなるようににして、再び５〜８時間培養した。
培養が完了した後、遠心してタルスを収集し、再懸濁、超音波破砕、遠心して上澄み液を採取した。硫酸アンモニウムによる沈殿を経た後、ＶＰ２タンパク質液を収集した。
（禽アデノウイルス抗原の製造）
１.ファイバー−２ｃＤＮＡ製造
ウイルスＲＮＡ抽出キット操作通りに感染禽アデノウイルスＦＡＶ−ＨＮ株（禽アデノウイルス、ＦＡＶ−ＨＮ株（Ｆｏｗｌ ａｖｉａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ、ｓｔｒａｉｎ ＦＡＶ−ＨＮ）、保存番号は、ＣＣＴＣＣ ＮＯ．Ｖ２０１６０９であり、保存機関は、中国典型培養物保存中心であり、保存住所は、中国武漢・武漢大学であり、保存日は、２０１６年２月２９日である）からＦＡＤＶウイルスＤＮＡを抽出した。ファイバー−２タンパク質遺伝子５’末端及び３’末端の保存領域配列によってオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。合成オリゴヌクレオチドプライマー配列を、表１０に示した。次に、ＰＣＲ増殖を行い、アガロースゲルエクストラクションキットを利用して回収し、-２０℃で保存した。
Figure 2019512461
２.発現ベクター構築
最適化後、ファイバー−２タンパク質遺伝子を中国蘇州金唯智生科技有限会社に送り、全配列合成を行い、それぞれｐＥＴ２８aプラスミドに連結させた。連結後のプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に転化させ、単クローンを選び、１００μｇカナマイシンを含有するＬＢ培地で一晩培養させた。プラスミドを抽出した後、配列測定及び分析を行った。陽性クローンは、ｐＥＴ２８a−ＦＡＤＶ−ファイバー−２発現菌株であった。
３.ファイバー−２タンパク質の製造
実施例１で製造したｐＥＴ２８a−ＦＡＤＶ−ファイバー−２/Ｅ.Ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株を５０−１００μｇ/ｍｌカナマイシンを含有するＬＢ培地に接種した。接種量は、１％（Ｖ／Ｖ）であり、３７℃で振盪培養した。ＯＤ６００値が０.４〜０.６に達したときに、２８℃で３０分間放置した。イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加えて、最終濃度が１.０mMになるようにして、２８℃で２４時間振盪培養した。
培養が完了した後、タルスを収集し、ＰＢＳ（塩化ナトリウム８g、塩化カリウム０.２g、リン酸水素二ナトリウム１.４４g、リン酸二水素カリウム０.２４g、ｐＨを７.４に調整し、１Ｌに定容する）を用いてタルスを再懸濁し、超音波破砕、遠心して上澄みを取った。こうして、ファイバー−２タンパク質液を収集した。
（産卵低下症候群ウイルス混合ワクチンの製造）
実施例３で精製した後の産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質抗原を、それぞれ実施例１０で製造した鶏ニューカッスル病ウイルス抗原、実施例１１で製造した鳥インフルエンザ抗原、実施例１２で製造した鶏伝染性気管支炎抗原、実施例１３で製造した伝染性ファブリシウス嚢抗原、及び実施例１４で製造した禽アデノウイルス抗原と、所定の比率どおりに混合した。続いて、ワイトオイルアジュバントに加える同時に、モーターを運転し、１７５００ｒ/ｍｉｎで５分間攪拌した。攪拌終了前に、１％チメロサール溶液を加えて、その最終濃度が０.０１％になるようにした。具体的な配合比率を、表１１、１２、１３、１４に示す。
Figure 2019512461
Figure 2019512461
Figure 2019512461
Figure 2019512461
（産卵低下症候群ウイルス混合ワクチン免疫原性試験）
１.産卵低下症候群ウイルス部分免疫原性試験
２１日齢のＳＰＦ鶏１７０羽を取り、１群毎に１０羽ずつ１７群に分けた。第２７群〜第４２群に対してぞれぞれ実施例１５で製造したワクチン４〜ワクチン１９を０.５ｍｌ/羽で頚部皮下注射し免疫させた。また、第４３群に対して０.５ｍｌの生理食塩水を皮下注射して、ブランク対照とした。すべての試験鶏は、全部隔離飼育し、免疫して２１日後に、鶏１羽毎にそれぞれ採血し、血清を分離し、血清中の産卵低下症候群ＨＩ抗体力価を測定した。その結果を、表１５に示す。
Figure 2019512461
上記結果から、ワクチン４〜ワクチン１９免疫群は、免疫して２１日後に、全て比較的高いＨＩ抗体力価を産生し、鶏群産卵症候群の発生を効果的に保護できることが示された。これは、本発明が提供する産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質は、抗原製造の油乳濁液混合ワクチンとして鶏群を完全に保護できることを示す。
２.ニューカッスル病ウイルス部分免疫原性試験
２１日齢のＳＰＦ鶏１３０羽を取り、１群毎に１０羽ずつ１３群に分けた。第４４群〜第５５群に対してそれぞれ実施例１５で製造したワクチン４、及びワクチン９〜ワクチン１９を２０μl/羽で頚部皮下注射して免疫させた。また、第４４群に対して２０μlの生理食塩水を皮下注射して、ウイルス感染対照とした。すべての試験鶏は、全部隔離して飼育し、免疫して２１日後に、第４４群〜第５５群の免疫鶏を第５６群ウイルス感染対照鶏と共に採血し、血清を分離した。ニューカッスル病ウイルスＨＩ抗体を検出する同時に、ニューカッスル病ウイルス強毒ＨＮ１１０１株ウイルス液を用いて肌肉注射によりウイルス感染した。１４日間観察し、発病、死亡及び保護数を記録した。その結果を、表１６に示す。
Figure 2019512461
上記結果から、ワクチン４、及びワクチン９〜ワクチン１９免疫群は、免疫して２１日後に、全て比較的高いニューカッスル病ウイルス抗体を産生でき、対照群と比較して、免疫群は強毒性感染から完全に保護されることが示された。これは、本発明が提供するＮ７a株ニューカッスル病ウイルス液を抗原として製造した油乳濁液ワクチンが、鶏群を完全に保護できるということを示す。
３.鳥インフルエンザ部分免疫原性試験
２１日齢のＳＰＦ鶏８０羽を取り、１群毎に１０羽ずつ８群に分けた。第５７群〜第６３群に対してそれぞれ実施例１５で製造したワクチン５、ワクチン９、ワクチン１３及びワクチン１６〜ワクチン１９を０.３ｍｌ/羽で頚部皮下注射して免疫させた。また、第６４群に対して０.３ｍｌの生理食塩水を皮下注射して、ウイルス感染対照とした。すべての試験鶏は、全部隔離飼育し、免疫して２１日後に、第５７群〜第６３群免疫鶏を第６４群対照鶏と共に採血し、血清を分離した。Ｈ９亜型鳥インフルエンザＨＩ抗体力価を検出する同時に、ＳＺ株ウイルス液を用いて鶏１羽毎に０.２ｍｌ（含１０７.０ＥＩＤ５０）ずつ静脈注射してウイルス感染させた。ウイルス感染させて５日後に、総排出腔シュバープを採集し、処理を経た後、１０〜１１日齢ＳＰＦ鶏胚５個を尿膜腔接種した。孵育して５日間観察し、死んだ胚か生きている胚かを問わず、いずれも鶏胚液赤血球凝集価を測定した。各綿棒サンプル別に接種した５個の鶏胚のうち、一個の鶏胚液の凝集価でも１：１６（微量測定法）以上である場合、ウイルス分離が陽性であると判定した。一方、ウイルス分離が陰性であるサンプルに対して、一回ブラインド継代した後で、判定した。免疫群は、少なくとも９羽の鶏のウイルス分離が陰性になるべきであり、対照群は、少なくとも４羽の鶏のウイルス分離が陽性になるべきであった。その結果を、表１７に示す。
Figure 2019512461
上記結果から、ワクチン５、ワクチン９、ワクチン１３、ワクチン１６〜ワクチン１９は、免疫して２１日後まで、全部比較的高い鳥インフルエンザ抗体を産生でき、対照群と比較して、免疫群は、完全に強毒性感染から保護されることが示された。これは、本発明が提供するＨ９亜型鳥インフルエンザウイルス液が、抗原製造の油乳濁液混合ワクチンとして鶏群を完全に保護できるということを示す。
４.鶏伝染性気管支炎部分免疫原性試験
２１日齢のＳＰＦ鶏８０羽を取り、１群毎に１０羽ずつ８群に分けた。第６５群〜第７１群に対してそれぞれ鶏伝染性気管支炎生ワクチン（Ｈ１２０株）１羽分（０.０５ｍｌ）を点眼、経鼻接種した。接種した２１日後に、第７２群対照鶏と共に採血し、血清を分離した。同時に、第６５群〜第７１群の各群に対して実施例１５で製造したワクチン６、ワクチン１０、ワクチン１３、ワクチン１４、ワクチン１５、ワクチン１８、ワクチン１９を０.３ｍｌ/羽で部頚皮下注射し免疫させた。接種して２８日後に、第７２群ウイルス感染対照鶏と共にそれぞれ採血し、血清を分離し、第６５〜第７１群免疫鶏に対して、生ワクチン１次免疫して２１日後及び不活化ワクチン免疫して２８日後に、二回にかけて採血した血清（第７２群ウイルスチャレンジ対照鶏も同じ時間で血清を採集）に対してＨＩ抗体力価を測定した。免疫群の２次免疫血清のＨＩ抗体力価の幾何平均数は、１次免疫血清のＨＩ抗体力価の幾何平均数の４倍以上であり、未免疫対照群の血清のＨＩ抗体力価の幾何平均値は、１：８以下であった（微量測定法）。同時に、鶏伝染性気管支炎Ｍ４１強毒を用いて鶏１羽毎に１０３.０ＥＩＤ５０経鼻ウイルス感染させて、ウイルス感染実験を行った。その結果を、表１８に示す。
Figure 2019512461
上記結果から、ワクチン６、ワクチン１０、ワクチン１３、ワクチン１４、ワクチン１５、ワクチン１８、ワクチン１９の２次免疫血清のＨＩ抗体力価の幾何平均値は、１次免疫血清のＨＩ抗体力価の幾何平均値の４倍以上であった。また、ウイルス感染後のすべての免疫鶏の気管内において、ウイルスが分離・検出されなかったので、強毒のウイルス感染から完全に保護されることが示された。これは、本発明が提供する鶏伝染性気管支炎ウイルス液が、抗原製造の油乳濁液混合ワクチンとして鶏群に完全に保護できるということを示す。
５.ファブリシウス嚢部分免疫原性試験
２１日齢のＳＰＦ鶏６０羽を取り、１群毎に１０羽ずつ６群に分けた。第７３群〜第７７群に対してそれぞれ実施例１５で製造したワクチン７、ワクチン１１、ワクチン１４、ワクチン１６、ワクチン１８を０.３ｍｌ/羽で頚部皮下注射して免疫させた。また、第７８群に対して０.３ｍｌの生理食塩水を皮下注射して、ウイルス感染対照とした。すべての試験鶏は、全部隔離飼育し、免疫して２１日後に、第７３群〜第７８群に対して、１羽毎に１００倍希釈した鶏伝染性ファブリキウス嚢病強毒ＢＣ６−８５（(ＣＶＣＣ ＡＶ７株)、中国獣医薬品監察所より購入）株ウイルス液０.１ｍｌずつ（実際ウイルス含有量≧１００個ＢＩＤ）を点眼手段により接種した。ウイルス感染後、毎日鶏別臨床表現を観察し、発病及び死亡鶏数を記録した。７２〜９６時間経過後、生き残った鶏を捕殺し、１羽毎に解剖し、ファブリシウス嚢等の病変を観察した。免疫鶏は、少なくとも８羽が正常で、ファブリシウス嚢病変が出現しないべきであった。一方、対照鶏は、少なくとも４羽の鶏が発病し、明らかなファブリシウス嚢病変（例えば、胸筋又は股間肌にストリップ状出血、ファブリシウス嚢腫れ又は萎縮、黄変、内部にゼリー状分泌物有り等のうち一種以上の病変）が出現すべきであった。その結を、表１９に示す。
Figure 2019512461
上記結果から、ワクチン７、ワクチン１１、ワクチン１４、ワクチン１６、ワクチン１８は、免疫して２１日後まで、鶏伝染性ファブリキウス嚢病強毒の攻撃から完全に保護されることが示された。
６.禽アデノウイルス部分免疫原性試験
２１日齢のＳＰＦ鶏６０羽を取り、１群毎に１０羽ずつ６群に分けた。第７９群〜第８３群に対してそれぞれ実施例１５で製造したワクチン８、ワクチン１２、ワクチン１５、ワクチン１７、ワクチン１９を０.３ｍｌ/羽で頚部皮下注射し免疫させた。また、第８４群に対して０.３ｍｌの生理食塩水を皮下注射して、ウイルス感染対照とした。すべての試験鶏は、全部隔離飼育し、免疫して２１日後に、ＦＡＶ−ＨＮ株ウイルス液を用いて筋肉注射によって感染させた。１４日間観察して、発病、死亡及び保護数を記録した。その結果を、表２０に示す。
Figure 2019512461
上記結果から、第８４群対照群は、全部発病して死亡したが、一方、第７９群〜第８３群免疫群は全て、免疫鶏に対して比較的良好な免疫保護効果を示し、免疫効果が良好であることが示された。これは、本発明が提供する禽アデノウイルス抗原が、抗原製造の油乳濁液ワクチンとして鶏群に対して完全に保護できるということを示す。
以上のことは、本発明が提供する産卵低下症候群ウイルス混合ワクチンが関連病原の侵襲に抵抗でき、良好な免疫原性を示し、中国産卵低下症候群ウイルス関連疾患の流行を効果的に制御できることを証明している。
（産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質の高効率発現）
産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質遺伝子に基づき設計したプライマーファイバー−Ｆ１：５−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＧＣＡＴＧＡＣＡＡＧＡＣＣＣＧＣＡＡＡＧＣＧＡＣＴＡＣＧＧＴＴＧＧＡＣＣＣＴ−３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９）、ファイバー−Ｒ１：５−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＴＡＣＴＧＴＧＣＴＣＣＡＡＣＡＴＡＴＧ−３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０）を利用し、ＰＣＲ増殖により産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質遺伝子断片を得た。
ＰＣＲ産物をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社に送って配列測定を行た。配列測定結果は、配列表ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示す通りである。
ＰＣＲ産物に対して電気泳動回収目的の断片切り出しを行い、ｐＥＴ２８aプラスミドに連結させた。連結後のプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に転化させ、単クローンを選らんで、１００μｇカナマイシンを含有するＬＢ培地で一晩培養した。次に、プラスミドを抽出した後、配列測定及び分析を行った。陽性クローンは、ｐＥＴ２８a_ＥＤＳＶ_ファイバー発現菌株であった。
ｐＥＴ２８a_ＥＤＳＶ_ファイバー/E.Ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を含有する菌株を、５０−１００μｇ/ｍｌカナマイシン及び２０μｇ/ｍｌクロラムフェニコールを含有するＬＢ培地に接種した。接種量は、１％（Ｖ／Ｖ）であり、３７℃で振盪培養した。ＯＤ６００値＝０.４-０.６である間、２８℃で３０分間放置した。続いて、イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加え、最終濃度が０.１−１.０mＭになるようにして、２８℃で２４時間振盪培養した。培養が完了した後、タルスを収集し、ＰＢＳ（塩化ナトリウム８g、塩化カリウム０.２g、リン酸水素二ナトリウム１.４４g、リン酸二水素カリウム０.２４ｇ、ｐＨを７.４に調整し、１Ｌに定容する）を用いてタルスを再懸濁し、超音波破砕、遠心して上澄みを採取した。発現産物における可溶性目的タンパク質の含有量がは比較的に多く、可溶性ファイバータンパク質の発現量は、タルスタンパク質総量の３２％に達した。さらに、ファイバータンパク質のＨＡ力価は１：２０４８に達し、内毒素含有量は、０.４９×１０５ＥＵ/ｍｌであった。
実施例３の方法に従って内毒素除去を行って測定した結果、ファイバータンパク質のＨＡ力価は、１：２０４８に達した。また、内毒素含有量は、０.００８×１０５ＥＵ/ｍｌであった。
上記結果から、トリトンＸ−１１４は、組換えタンパク質に残留する内毒素を除去できるとともに、ファイバータンパク質免疫原性に対して影響しないことが示された。
（ニューカッスル病、伝染性気管支炎、鳥インフルエンザ、産卵低下症候群、禽アデノウイルス５種混合ワクチンの製造及び免疫原性試験）
１.ニューカッスル病、伝染性気管支炎、鳥インフルエンザ、産卵低下症候群、禽アデノウイルス５種混合ワクチンの製造
実施例１７で精製した後のファイバータンパク質抗原を、それぞれ実施例１０で製造した鶏ニューカッスル病抗原、実施例１１で製造した鳥インフルエンザ抗原、実施例１２で製造した鶏伝染性気管支炎抗原、及び実施例１４で製造した禽アデノウイルス抗原と所定の比率で混合した。続いて、ワイトオイルアジュバントに加えると同時に、モーターを運転させ、１７５００ｒ/分で５分間攪拌した。攪拌終了前に１％チメロサール溶液を加え、その最終濃度が０.０１％になるようにした。具体的な配合比率を、表２１に示す。
Figure 2019512461
２.ニューカッスル病、伝染性気管支炎、鳥インフルエンザ、産卵低下症候群、禽アデノウイルス５種混合ワクチンの産卵低下症候群ウイルス部分免疫原性試験
実施例１６の第１部分で記載した産卵低下症候群ウイルス部分免疫原性試験方法を参照し、５種混合ワクチンの産卵低下症候群ウイルス部分免疫原性を検証した。第８５群は、免疫群であり、第８６群は、ブランク対照とした。その結果を、表２２に示す。
Figure 2019512461
上記結果から、ワクチン２０免疫群は、免疫して２１日後、比較的高いＨＩ抗体力価を産生し、鶏群産卵症候群の発生を効果的に抑制できることが示された。これは、本発明が提供する産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質が、抗原製造のニューカッスル病、伝染性気管支炎、鳥インフルエンザ、産卵低下症候群、禽アデノウイルス５種混合ワクチンとして鶏群を完全に保護できることを示す。
３.ニューカッスル病、伝染性気管支炎、鳥インフルエンザ、産卵低下症候群、禽アデノウイルス５種混合ワクチンのニューカッスル病ウイルス部分免疫原性試験
実施例１６の第２部分で記載したニューカッスル病ウイルス部分免疫原性試験方法を参照し、５種混合ワクチンのニューカッスル病ウイルス部分免疫原性を検証した。第８７群は、免疫群であり、第８８群は、ブランク対照とした。その結果を、表２３に示す。
Figure 2019512461
上記結果から、ワクチン２０免疫群は、免疫して２１日後、比較的多くのニューカッスル病抗体を産生でき，対照群に比較して免疫群は、強毒性の感染から完全に保護されることが示された。これは、本発明が提供するＮ７a株ニューカッスル病ウイルス液が、抗原製造のニューカッスル病、伝染性気管支炎、鳥インフルエンザ、産卵低下症候群、禽アデノウイルス５種混合ワクチンとして鶏群を完全に保護できることを示す。
４.ニューカッスル病、伝染性気管支炎、鳥インフルエンザ、産卵低下症候群、禽アデノウイルス５種混合ワクチンの鳥インフルエンザ部分免疫原性試験
実施例１６の第３部分で記載した鳥インフルエンザ部分免疫原性試験方法を参照し、５種混合ワクチンの鳥インフルエンザ部分免疫原性を検証した。第８９群は、免疫群であり、第９０群は、ブランク対照とした。その結果を、表２４に示す。
Figure 2019512461
上記結果から、ワクチン２０は、免疫して２１日後、比較的多くの鳥インフルエンザ抗体を産生でき，対照群に比較して、免疫群は、強毒性の感染から完全に保護されることが示された。これは、本発明が提供するＨ９亜型鳥インフルエンザウイルス液が、抗原製造のニューカッスル病、伝染性気管支炎、鳥インフルエンザ、産卵低下症候群、禽アデノウイルス５種混合ワクチンとして鶏群を完全に保護できることを示す。
５.ニューカッスル病、伝染性気管支炎、鳥インフルエンザ、産卵低下症候群、禽アデノウイルス５種混合ワクチンの鶏伝染性気管支炎部分免疫原性試験
実施例１６の第４部分に記載した鶏伝染性気管支炎部分免疫原性試験方法を参照し、５種混合ワクチンの鶏伝染性気管支炎部分免疫原性を検証した。第９１群は、免疫群であり、第９２群は、ブランク対照とした。その結果を、表２に示す。
Figure 2019512461
上記結果から、ワクチン２０の２次免疫血清のＨＩ抗体力価の幾何平均値は、全て１次免疫血清のＨＩ抗体力価の幾何平均値の４倍以上であった。さらに、ウイルス感染後、全ての免疫鶏の気管内からウイルスが分離・検出されなかったので、強毒性感染から完全に保護されることが示された。これは、本発明が提供する鶏伝染性気管支炎ウイルス液が、抗原製造のニューカッスル病、伝染性気管支炎、鳥インフルエンザ、産卵低下症候群、禽アデノウイルス５種混合ワクチンとして鶏群を完全に保護できることを示す。
６.ニューカッスル病、伝染性気管支炎、鳥インフルエンザ、産卵低下症候群、禽アデノウイルス５種混合ワクチンの禽アデノウイルス部分免疫原性試験
実施例１６の第６部分に記載した禽アデノウイルス部分免疫原性試験方法を参照し、５種混合ワクチンの禽アデノウイルス部分免疫原性を検証した、第９３群は、免疫群であり、第９４群は、ブランク対照とした。その結果を、表２６に示す。
Figure 2019512461
上記結果から、免疫群は、免疫して２１日後、比較的良い免疫保護を達成できることが示された。これは、本発明が提供する禽アデノウイルスファイバー−２タンパク質が、抗原製造のニューカッスル病、伝染性気管支炎、鳥インフルエンザ、産卵低下症候群、禽アデノウイルス５種混合ワクチンとして鶏群を完全に保護できることをす。
以上の記載はただ本発明の好ましい実施例であり、本発明に対していかなる形式的制限を行うものではない。好ましい実施例として本発明を以上のように開示したが、これらは本発明を限定するものではない。本分野における当業者であれば、本発明の技術方案を逸脱しない範囲で、以上のように開示された技術内容を利用して変更又は修飾を等価変化とする若干の等価実施例を実施することができる。また、本発明の技術方案を逸脱せず、本発明の技術実質によって上記実施例に対して行ういかなる単純な修正、等価変化及び修飾であれば、全て依然として本発明の技術方案の範囲内に含まれる。

Claims (10)

  1. 抗産卵低下症候群ワクチン組成物であって、
    前記ワクチン組成物は、免疫量の産卵低下症候群ウイルス抗原及び獣医薬的に許容し得るベクターを含み、前記産卵低下症候群ウイルス抗原は、産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質の抗原又は前記産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質の遺伝子が組換えられた生ベクターであることを特徴とするワクチン組成物。
  2. 前記産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示すヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質であることを特徴とする請求項１に記載のワクチン組成物。
  3. 前記産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質抗原の含有量は、ＨＡ力価≧１：３２であり、前記産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質抗原含有量は、ＨＡ力価１：３２〜１：１２８であることが好ましく、前記産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質抗原含有量は、ＨＡ力価１：３２〜１：６４であることがより好ましいことを特徴とする請求項１に記載のワクチン組成物。
  4. 前記した産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質遺伝子が組換えられた生ベクターは、組換え弱毒サルモネラ菌と、組換えニューカッスル病ウイルスと、組換え痘ウイルスと、を含むことを特徴とする請求項１に記載のワクチン組成物。
  5. 前記した獣医薬的に許容し得るベクターは、アジュバントを含み、前記アジュバントは、（１）アルミナゲルアジュバント、サポニン、アブリジン、ＤＤＡ、（２）油中水滴型乳剤、水中油滴型乳剤、水中油中水型乳剤、或いは（３）アクリル酸又はメタクリル酸の重合体、無水マレイン酸とアルケニル誘導体との共重合体、及びＲＩＢＩアジュバントシステム、ブロック共重合体、ＳＡＦ−Ｍ、モノホスホリルリピドＡ、アブリジン脂質−アミンアジュバント、大腸菌易熱性毒素、コレラ毒素、ＩＭＳ１３１４、ムラミルジペプチド、ゲルアジュバントの群から選ばれる一種又は数種を含み、
    サポニンは、Ｑｕｉｌ Ａ、ＱＳ−２１、ＧＰＩ−０１００であることが好ましく、
    前記乳剤はＳＰＴ乳剤又はＭＦ５９乳剤であり、或いは、前記乳剤はオイル及び乳化剤を組み合わせて形成されることが好ましく、前記乳剤は、軽質流動パラフィンオイル、オレフィンオリゴマー化によって生成されたイソプレノイドオイル（例えば、スクアラン又はスクアレンオイル、オレフィン、特にイソブテン又はデセンオリゴマー化によって生成されたオイル）、酸又はアルコールの直鎖アルキルを含むエステル（更に特に、植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコール−（オクタン酸エステル/デカン酸エステル）、トリアシルグリセロール−（オクタン酸エステル/デカン酸エステル）又はプロピレングリコールオレイン酸エステル）、分枝鎖脂肪酸又はアルコールのエステル（特にイソステアリン酸エステル）に基づくことが可能であり、前記乳化剤は、非イオン界面活性剤（特にポリオキシエチレン化された脂肪酸（例えば、オレイン酸）のエステル、ソルビタンのエステル、二縮マンニトールのエステル（例えば、マンニタンオレイン酸エステル）、脂肪族グリコールのエステル、グリセリンのエステル、ポリグリセリンのエステル、プロピレングリコールのエステル及びオレイン酸のエステル、イソステアリン酸のエステル、リシノール酸のエステル又はヒドロキシステアリン酸のエステルであり、前記エステルは、エトキシ化され、脂肪族アルコールとポリオール（例えば、オレイルアルコール）のエーテル、ポリプロピレンオキシド−ポリオキシエチレンブロック共重合体（特にプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ(R)）、特にＬ１２１））であり、
    前記したアクリル酸又はメタクリル酸の重合体は、架橋アクリル酸又はメタクリル酸重合体、特に砂糖のポリアルケニルエーテル又はポリオールと架橋した化合物であるカルボマーであることが好ましく、カーボポール９７４Ｐ、９３４Ｐ及び９７１Ｐであることが好ましく、
    前記した無水マレイン酸とアルケニル誘導体との共重合体は、無水マレイン酸とエチレンとの共重合体ＥＭＡであることが好ましく、
    前記アジュバントは、油中水滴型乳剤を製造するためのワイトオイルアジュバントであることが好ましく、
    前記アジュバントの濃度範囲は、５％〜７０％Ｖ／Ｖであり、３０％〜７０％であることが好ましく、６６％Ｖ／Ｖであることがより好ましいことを特徴とする請求項１に記載のワクチン組成物。
  6. 前記ワクチン組成物は、鶏ニューカッスル病ウイルス抗原、鳥インフルエンザウイルス抗原、鶏伝染性気管支炎ウイルス抗原、鶏伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス抗原、禽アデノウイルス抗原、鳥類レオウイルス抗原、大腸菌抗原、副鶏アビバクテリウム・パラガリナラム抗原、マイコプラズマ・シノビエ抗原、鶏マイコプラズマ・ガリセプティクム抗原、パスツレラ・ムルトシダ抗原、マレック病ウイルス抗原、禽脳脊髄炎ウイルス抗原、鶏伝染性喉頭気管炎ウイルス抗原の抗原の群から選ばれる一種又は数種を更に含むことを特徴とする請求項１に記載のワクチン組成物。
  7. 前記ワクチン組成物は、鶏ニューカッスル病ウイルス不活化抗原、鳥インフルエンザウイルス不活化抗原、鶏伝染性気管支炎ウイルス不活化抗原、鶏伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスサブユニット抗原、禽アデノウイルス不活化抗原又はサブユニット抗原の群から選ばれる一種又は数種を更に含み、前記鶏ニューカッスル病ウイルス不活化抗原はＮ７ａ株不活化抗原であり、前記鳥インフルエンザウイルス不活化抗原はＳＺ株不活化抗原であり、前記鶏伝染性気管支炎ウイルス不活化抗原はＭ４１株不活化抗原であり、前記鶏伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスサブユニット抗原は鶏伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスＶＰ２タンパク質であり、前記禽アデノウイルス不活化抗原はＦＡＶ−ＨＮ株不活化抗原であり、前記禽アデノウイルスサブユニット抗原は禽アデノウイルスペントンタンパク質又はファイバー−２タンパク質であることが好ましいことを特徴とする請求項１に記載のワクチン組成物。
  8. 前記産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質の含有量は、ＨＡ力価１：３２〜１：１２８であり、前記鶏ニューカッスル病ウイルス不活化抗原の含有量は、不活化前に１０８.０〜１０９.０ＥＩＤ５０/０.１ｍｌであり、前記鳥インフルエンザウイルス不活化抗原の含有量は、不活化前に１０６.５〜１０８.５ＥＩＤ５０/０.１ｍｌであり、前記鶏伝染性気管支炎ウイルス不活化抗原の含有量は、不活化前に１０６.０〜１０７.０ＥＩＤ５０/０.１ｍｌであり、前記鶏伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスＶＰ２タンパク質の含有量は、ＡＧＰ力価１：１６〜１：１２８であり、前記禽アデノウイルスペントンタンパク質の含有量は、ＡＧＰ力価１：２〜１：１６であり、前記禽アデノウイルスファイバー−２タンパク質の含有量は、ＡＧＰ力価１：２〜１：１６であり、
    前記産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質の含有量は、ＨＡ力価１：３２〜１：１２８であり、前記鶏ニューカッスル病ウイルス不活化抗原の含有量は、不活化前に１０８.０ＥＩＤ５０/０.１ｍｌであり、前記鳥インフルエンザウイルス不活化抗原の含有量は、不活化前に１０８.０ＥＩＤ５０/０.１ｍｌであり、前記鶏伝染性気管支炎ウイルス不活化抗原の含有量は、不活化前に１０６.０ＥＩＤ５０/０.１ｍｌであり、前記鶏伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスＶＰ２タンパク質の含有量は、ＡＧＰ力価１：１６であり、前記禽アデノウイルスペントンタンパク質の含有量は、ＡＧＰ力価１：４であり、前記禽アデノウイルスファイバー−２タンパク質の含有量は、ＡＧＰ力価１：４であることが好ましいことを特徴とする請求項７に記載のワクチン組成物。
  9. 前記産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質遺伝子をクローニングし、前記産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質遺伝子を発現ベクターに組換えて、前記産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質遺伝子が組換えられた組換え発現ベクターを得る、工程（１）と、
    前記産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質遺伝子が組換えられた組換え発現ベクター及び分子シャペロンの発現ベクターを共に大腸菌に転化し、前記産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質を発現する、工程（２）と、
    非イオン界面活性剤を使用して、前記発現した産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質を処理し、内毒素を除去する、工程（３）と、
    前記内毒素を除去した産卵低下症候群ウイルスファイバータンパク質及びアジュバントを均一に混合して、前記ワクチン組成物を得る、工程（４）と、
    を含むことを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載のワクチン組成物を製造する方法。
  10. 請求項１〜８のいずれか一項に記載のワクチン組成物の、産卵低下症候群を予防及び／又は治療する薬物製造における使用。
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