JP2019511247A - 酵素組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、乾燥形態の酵素組成物、及び動物用飼料に噴霧することができる液体形態の酵素組成物を調製するためのこれらの酵素組成物の使用に関する。酵素組成物は、１つ以上の水溶性飼料用酵素、安息香酸の塩及び弱酸を含む。それらは、液体形態の酵素組成物を提供するために水に溶解可能な乾燥形態である。一旦溶解すると、液体酵素組成物は、水溶性粉末中に存在する弱酸によってｐＨ５以下に緩衝され、弱酸とベンゾアートとの反応により形成される安息香酸による微生物劣化に対して保護される。【選択図】図１

Description

本発明は、乾燥形態の酵素組成物、及び液体形態の酵素組成物を調製するためのこれらの酵素組成物の使用に関する。

動物を治療するための酵素の使用は周知である。酵素は、動物に利用可能なエネルギー及び/又は栄養素を増加させるなどして、飼料の消化率を改善し栄養価を向上させるために、動物飼料に添加されることが多い。

しかし、酵素が飼料添加物として有する多くの利益にもかかわらず、それらの使用は限られており、多くの欠点を有する。酵素はタンパク質であり、したがって、温度及びｐＨのような多くの環境パラメータに対して感受性である。

飼料製品の調製において、使用前に一定時間、酵素溶液を保存することがしばしば望ましい。有効性を維持するために酵素を保存するために必要とされる環境条件は、しばしば汚染を引き起こす可能性のある微生物の生育にとって最適な条件となる。

抽出された酵素は、それらの本来の環境、例えば細胞コンパートメント、細胞外液にない場合、しばしば不安定であり得るし、最適な条件が維持されない場合、適切に機能しないか、又は溶解し続けない可能性がある。例えば、タンパク質分解又は凝集の結果として活性が失われる可能性がある。保存寿命は、数日から1年超まで変動し得、酵素の性質及び使用される保存条件に依存する。

一般に、液体酵素は、本質的に、粒状又は乾燥形態の酵素よりも安定性が低い。水性環境はまた、微生物の増殖の重大なリスクをもたらす。異なる酵素を保存のために一緒に混合すると、安定性及びリスクがさらに増大する。

室温での保存は、一般に、例えば、微生物の増殖、加水分解又はタンパク質分解のために、わずか数時間後にタンパク質分解及び/又は酵素不活化を生じる。

低温、例えば約４℃での保存は当該技術分野では保存寿命を延ばすことが知られているが、微生物及びタンパク質分解は依然として一般的であり、しばしば不可避である。さらに、低温で多量の液体酵素を保存することは、設備と冷却エネルギーの両方に比較的高いコストを伴う。

酵素の凍結乾燥（通常は凍結による）も場合によっては使用され、分解を最小限にしてはるかに長い保存寿命を提供する。

タンパク質安定化溶液及び添加剤はまた、保存安定性を増加させ、酵素溶液の保存寿命を延ばすことも知られている。アジ化ナトリウム（ＮａＮ_３）のような抗菌剤もまた公知であるが、これらはしばしばまた酵素の構造を損傷させ、従って活性を阻害する。さらに、ＮａＮ_３は急性毒性であり、その後の飼料用途には適さない。

ＣＮ１０１６１７７４０は、ペレット化動物飼料に噴霧することを意図した液体フィターゼ製剤を開示している。ペレット化プロセスの前に、粉末、顆粒又は丸剤の形態の固形製剤を飼料に添加しなければならなかったので、液体製剤が好ましかったのである。しかしながら、ペレット化プロセスの間、供給物はより高い温度に、特に７０℃より高い温度にさらされ、その結果フィターゼ酵素がその活性の少なくとも一部を失う。事実、動物飼料に一般的に使用されているフィターゼ酵素は、６０℃の温度からすでに活性を失い始めるのである。

液体フィターゼ製剤の欠点は、乾燥フィターゼ製剤と比較して保存安定性が低いことである。液体製剤の保存安定性を高めるために、ＣＮ１０１６１７７４０は、ポリエチレングリコールを添加して酵素分子及び安定剤、特にトレハロースを保護し、溶液の浸透圧を高めて酵素を安定化することを開示する。安息香酸ナトリウムをさらに保存料として添加し、溶液のｐＨを４．５〜５のｐＨで緩衝させた。これらの添加剤により、酵素の活性の損失は、室温で６ヶ月間保存した場合、−４０％から−１０％に低下し、４０℃の温度で６週間保存した場合には−４０％から−１７％に低下した。

ＣＮ１０１６１７７４０に開示されている液体製剤の欠点は、非常に多くの添加剤、すなわち例えば１０００ｋｇの溶液あたり約３０ｋｇのポリエチレングリコール、５０ｋｇのトレハロース、０．５ｋｇの安息香酸ナトリウム及び２０ｋｇの０．５ＭＨＣｌを使用しなければならないことである。一般に、液体酵素製剤の欠点は、冷却条件下（たとえ低温条件下で保存してもその保存安定性が乾燥製剤よりも低い）で保存しなければならず、乾燥配合物と比較して、はるかに多量の酵素溶液を保存し、取り扱い、輸送する必要がある。これらの欠点にもかかわらず、飼料配合物へのペレット化プロセスの前に乾燥酵素配合物を混合するときの酵素活性の喪失を考慮して、ＣＮ１０１６１７７４０において液体配合物が好ましいとされたのである。

国際公開第２０１４／１５９１８５号パンフレットはまた、飼料ペレットに噴霧することができる液体酵素製剤及びペレット化する前に飼料と混合することができる顆粒化酵素製剤を開示している。液体酵素製剤は、フィターゼ、バッファー、安定剤、特にトレハロース、及び抗菌剤、特に安息香酸ナトリウムを含む。粒状化酵素製剤は、とりわけ、担体及びフィターゼを含む。担体は、例えば、小麦粉又はデンプンを含み、したがって水に溶解せず、例えば２０℃の低温、すなわち酵素を失活させない温度では特に、水に溶解しない。

したがって、飼料に噴霧することができるが、保存安定性、保存条件、及び保管され、輸送され、処理されることが必要とされる大量の水に関して、既知の液体酵素製剤の欠点を示さない新規で改良された酵素組成物が必要とされている。

本発明によれば、第１の態様から明らかなように、１種以上の水溶性飼料用酵素、安息香酸の塩及び弱酸を含む酵素組成物が提供され、その酵素組成物は乾燥形態であり、これは液体形態で酵素組成物を提供するために水に溶解可能であり、この液体酵素組成物は、水溶性粉末中に存在する弱酸によってｐＨ５以下に緩衝される。

酵素組成物が乾燥形態であるという事実のために、それは既知の安定化溶液よりもずっと優れた良好な保存安定性を有する。さらに、制御されていない保存条件下で、よりコンパクトな空間に保存することができ、より小さな重量及び体積のために、輸送及び取り扱いがより容易になる。酵素組成物は、水に容易に溶解することができ、飼料に噴霧される直前に水に容易に溶解することができる。それは、例えば1週間未満又は１日（２４時間）未満のような短時間の間だけ液体形態で保存されればよいので、この保存期間の間、液体がより高い温度、例えば２０℃より高い温度で保存される場合でさえも、酵素活性は失われないか、ほとんど失われない。したがって、安定剤を酵素製剤中に提供する必要がなく、特に水溶性乾燥製剤中に提供する必要がない。安定剤は酵素を安定させたまま完全に水溶性の乾燥製剤を製造することをはるかに困難にするのである。

乾燥製剤を水に溶解することによって得られる液体製剤の比較的低いｐＨのために、ベンゾアート塩（安息香酸塩）は抗微生物活性酸形態に部分的に変換される。液体製剤は、弱酸と安息香酸の塩との反応によって形成された弱酸の共役塩の存在によって規定のｐＨ値に緩衝化される。

いくつかの実施形態において、安息香酸の塩は、安息香酸ナトリウムを含み得る。

いくつかの実施形態では、酵素組成物は、前記ベンゾアートを少なくとも３．０重量％の量、好ましくは少なくとも４．０重量％の量、より好ましくは少なくとも５．０重量％の量で含むことができるが、好ましくは１５重量％未満の量で、より好ましくは１０重量％未満の量で含むことができる。

いくつかの実施形態において、液体酵素組成物は、水溶性酵素組成物中に存在する弱酸によって４．５以下のｐＨに緩衝化され得る。液体組成物のｐＨは、ｐＨ４．３〜ｐＨ４．５であってもよい。

いくつかの実施形態では、飼料用酵素は、乾燥飼料組成物中に少なくとも７５重量％の量、好ましくは少なくとも８０重量％の量、より好ましくは少なくとも８５重量％の量で存在することができる。

飼料用酵素は、フィターゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、ガラクトシダーゼ、セルロース、カルボヒドラーゼ、ヘミセルロース、リパーゼ及びキシログルカナーゼからなる群から選択される１種以上の酵素を含むことができる。一実施形態では、酵素はフィターゼ、特に４未満のｐＨで最適に作用するフィターゼを含む。別の実施形態では、酵素はキシラナーゼ、好ましくはセルロース及び／又はヘミセルロースを含む。

いくつかの実施形態では、酵素組成物は、水溶性粉末の形態であり得る。他の実施形態では、酵素組成物は、水溶性顆粒の形態であり得る。

いくつかの実施形態では、乾燥酵素組成物は、２０℃の温度で蒸留水に１０ｇ／ｌの量で完全に可溶性である。

水溶性粉末は好ましくは自由流動性である。これは、固化防止剤、特にシリカを含有してもよい。シリカは乾燥配合物中に１〜３重量％の量、好ましくは約２重量％の量で存在することができる。

いくつかの実施形態において、弱酸は、クエン酸、特にクエン酸一水和物を含み得る。

本発明によれば、第２の態様から明らかなように、本発明の第１の態様による水溶性酵素組成物を水に溶解する液体形態の酵素組成物の調製方法が提供される。

いくつかの実施形態では、液体酵素組成物は、調製後１週間未満以内、好ましくは１日未満以内に動物飼料と混合される。

いくつかの実施形態では、ベンゾアート及び安息香酸は、約０．０１重量％〜約１．５重量％の量で液体酵素組成物中に存在し得る。いくつかの実施形態において、ベンゾアート及び安息香酸は、約０．０５重量％〜約０．１５重量％の量で存在し得る。

本発明によれば、第３の態様から明らかなように、飼料配合物を調製するための方法であって、
本発明による酵素組成物を乾燥形態で提供する工程；
場合により組成物を一定期間保管すること；
乾燥酵素組成物を水に溶解する工程；
溶解した酵素組成物を飼料混合物、特に飼料ペレットにスプレーする工程
を含む方法が提供される。

本発明は、添付の図面を参照してさらに説明される。
図１は、水に溶解後０日目、３日目及び１５日目に飼料用酵素フィターゼを含む、本発明による酵素組成物の酵素活性を示すチャートである。 図２は、水への溶解後０日目、３日目及び１５日目の、図１の酵素組成物中の微生物数を示すチャートである。 図３は、水に溶解後０日目、３日目及び１５日目の、飼料用酵素キシラナーゼを含む、本発明による酵素組成物の酵素活性を示すチャートである。 図４は、水への溶解後０日目、３日目及び１５日目の、図３の酵素組成物中の微生物数を示すチャートである。

詳細な説明
定義
用語「酵素」は、特定の化学変化を引き起こす触媒として作用する物質、例えば、タンパク質を指す。例えば、フィターゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、ガラクトシダーゼ、セルロース、カルボヒドラーゼ、ヘミセルロース、リパーゼ。

「飼料用酵素」又は「食品用酵素」という用語は、食物又は飼料の分解又は消化に特異的に適合し得る動物の消化管において典型的に見出される酵素を指す。例えば、酵素フィターゼは、種子及びナッツに一般的に見られるフィチン酸の加水分解を触媒する。これらの酵素は、天然源又は合成源から得ることができ、インビボ又はインビトロで増殖させることができる。

酵素に関連して「活性」という用語は、当業者には容易に理解されるであろう。例えば、酵素活性は、１分間に１マイクロモルの基質の変換を触媒する量を指すことができる。酵素活性は関連する標準、例えば、フィターゼ活性についてはＩＳＯ３００２４：２００９を用いて測定することができる。代替酵素の活性を測定するための関連する標準的方法は、当技術分野で公知であろう。

酵素活性の変化、例えば酵素活性の低下は、ｐＨ、温度、競合的又は非競合的阻害剤、及び固定化剤のような因子によって引き起こされる可能性がある。いくつかの場合における酵素活性の有意な変化は、元の活性の５０％未満の酵素活性の低下を意味し得る。いくつかの実施形態によれば、元の活性の５０％未満の酵素活性は、酵素活性の有意な変化、例えば減少又は低下をもたらす。酵素活性の有意な変化は、例えば、酵素、保存条件及び酵素組成物の意図された用途に依存して変化することが理解されよう。酵素活性の有意な変化（すなわち、５０％未満）は、依然として特定の用途における本発明の組成物の酵素活性の要件を満たすことも理解されよう。

用語「ベンゾアート」は、当業者に知られており、化学式Ｃ_７Ｈ_５Ｏ_２−のアニオンを指す。アニオンは安息香酸（Ｃ_６Ｈ_５ＣＯＯＨ）の塩及びエステル、例えば安息香酸ナトリウムに通常見出される。

「バッファー」という用語は、酸性又は塩基性であれ、ｐＨの変化に抵抗し得る１つ又は複数の化合物を指す。バッファーは、一般に、１つ以上の弱酸及びそれらの対応する共役塩基を含む水溶液の形態である。しかし、バッファーは、ｐＨを緩衝する溶液に添加され得る液体（水性）形態又は乾燥形態で提供され得る。適切なバッファーは、例えば、クエン酸塩（シトラート）、アコニット酸塩(アコニタート)、酢酸塩（アセタート）、コハク酸塩（スクシナート）、マレイン酸塩（マレアート）、リン酸塩（ホスファート）、ホウ酸、炭酸塩（カーボナート）などを含む。本発明の１つの実施形態では、バッファーはクエン酸塩（シトラート）である。有利には、クエン酸塩（シトラート）は安全で経済的であり、多くの異なる種類の食品及び飼料添加物の安定した緩衝を提供することができる。

「飼料配合物」という用語は、飼料又は食物の組成物を指す。飼料配合物中の各成分の量は、しばしば定量化され、特定の栄養要求に適した量で選択される。成分は、混合して飼料混合物を形成することができる。

「機能性」という用語は、酵素に関して容易に理解されるであろう。例えば、機能性は、例えば保存後の、酵素に保持されている機能性パーセンテージとして表すことができる。

酵素に関する「保存」、「保存寿命」、「湿度」という用語は、当業者には容易に理解されるであろう。しかし、これらは、本発明の組成物の地理的位置がどこにあるかによって変化し得る。

本発明の酵素組成物に関する「温度」という用語は、例えば、インキュベーション温度、試験温度、保存温度を指してもよい。いくつかの実施形態において、インキュベーション温度は約３０℃であり得、試験温度は例えば、酵素活性を試験するために約５０℃であり得る。

「微生物増殖」という用語は、微生物の集団の拡大、繁殖、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）又は増殖（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）を指す。細菌、真菌、ウイルス又は藻類である。

微生物増殖の制御に関して「制御する」という用語は、例えば、ＩＳＯ４８３３−２：２０１３によって決定されるような、前記微生物の集団の増加又は増殖又は前記微生物の増殖率の変化、例えば減少又は低減を指す。増殖の制御はまた、微生物の増殖又は死の完全な阻害を意味し得る。

用語「期間」は、任意の長さの時間を意味すると理解される。例えば、酵素組成物の保存に関して、いくつかの実施形態では、酵素組成物は、１時間以上、１日以上、又は１週間以上の期間保存することができる。いくつかの実施形態では、酵素組成物を１日、３日間又は１５日間保存する。

本発明によれば、第１の態様から明らかなように、１種以上の水溶性飼料用酵素、安息香酸の塩及び弱酸を含み、液体形態で酵素組成物を提供するために水に溶解可能な乾燥形態の酵素組成物であって、液体酵素組成物が水溶性粉末中に存在する弱酸によってｐＨ５以下に緩衝される酵素組成物が提供される。乾燥酵素組成物を水に溶解する際に得られるｐＨは、特に乾燥組成物１０ｇを蒸留水１リットルに２０℃の温度で溶解することにより測定される。酵素組成物は、蒸留水に２０℃の温度で１０ｇ／ｌの量で完全に溶解することが好ましい。

液体製剤中の酵素の必要濃度に依存して、乾燥酵素組成物を水中に異なる量で溶解させることができる。いくつかの実施形態では、乾燥酵素組成物は、水１リットル当たり少なくとも１ｇ、好ましくは少なくとも３ｇ、より好ましくは少なくとも５ｇ、最も好ましくは少なくとも７ｇの量で溶解される。いくつかの実施形態において、乾燥酵素組成物は、水１リットル当たり１００ｇ以下、好ましくは７５ｇ以下、より好ましくは５０ｇ以下、最も好ましくは２５ｇ以下の量で溶解される。

本発明の乾燥酵素組成物は、微生物の増殖を実質的に示さず、室温で1年間保存した場合、酵素活性の有意な変化を示さない。

さらに、本発明の酵素組成物は最適化され、酵素安定性と酵素機能との間のバランスが達成される。

本発明の教示に従って、酵素組成物の活性は、液体の形態で保存中、すなわち水に溶解した後、２０℃で、３日以上、５日以上、1０日以上、１５日以上、２０日以上、酵素組成物に対する微生物汚染が実質的に低減されているか又は全くない状態で維持することができる。

本発明の酵素組成物を液体の形態で２０℃で３日以上、５日以上、１０日以上、１５日以上、２０日以上保存した場合、酵素組成物に対する微生物汚染が実質的に減少しているか又は全くなしに、８０％以上、８５％以上、９０％以上又は９９％以上の酵素活性を維持することができる。

いくつかの実施形態において、安息香酸の塩は、安息香酸ナトリウム又は安息香酸カリウムを含む。

一実施形態では、安息香酸の塩は、安息香酸ナトリウムを含む。驚くべきことに、安息香酸ナトリウムの添加は、酵素活性を有意に低下させることなく、溶解した酵素生成物中の微生物の増殖を妨げるか又は実質的に減少させることが見出された。

いくつかの実施形態において、ベンゾアート塩（安息香酸塩）は、約０．０１ｗｔ％〜約１．５ｗｔ％の量で溶解した製剤中に存在する。ベンゾアート塩（安息香酸塩）は、約０．０５重量％〜約１．１重量％の量で存在してもよい。一実施形態では、溶解した酵素組成物は、約０．１重量％のベンゾアート塩（安息香酸塩）を含む。ベンゾアート塩（安息香酸塩）は、約０．９重量％〜約１．１重量％の量で存在してもよい。一実施形態では、酵素組成物は約１重量％のベンゾアート塩（安息香酸塩）を含む。

抗菌剤としてのベンゾアートの認識された機能は、本発明に組み込まれる。さらに、ベンゾアートの官能性は、例えばｐＨのような条件に応じて、変化、例えば低減又は強化され得る。

非解離形態の安息香酸は、活性抗菌剤である。安息香酸は、水に僅かしか溶けないので、乾燥製剤に含まれるのには適していない。安息香酸ナトリウムのようなベンゾアートは、高度に可溶性であり、酸性条件下、例えば、ｐＨ＜５で、解離していない安息香酸に変換する。したがって、本発明では、酵素組成物をｐＨ≦５に緩衝化する。

いくつかの実施形態では、溶解した組成物のｐＨは約ｐＨ５以下である。溶解した組成物のｐＨは約ｐＨ４〜約ｐＨ４．８である。一実施形態では、溶解した組成物のｐＨは、約ｐＨ４．０〜４．５、好ましくは約ｐＨ４．３〜４．５である。溶解した酵素溶液中の０．１重量％及び１重量％安息香酸ナトリウムの異なる濃度の有効性を評価すると、４．３〜４．５の範囲の標的ｐＨが酵素及びベンゾアートの最適な作用を確実にすることが判明した。

酸性条件下、特にｐＨ４．５以下では、安息香酸ナトリウムは静菌剤、静真菌剤及び保存剤である。ＥナンバーＥ２１の食品添加物として使用されることが多い。安息香酸ナトリウムは化学式ＮａＣ_７Ｈ_５Ｏ_２を有し、これは動物の食品添加物又は飼料として許容される。

いくつかの実施形態では、水溶性乾燥酵素組成物は、少なくとも７５重量％、好ましくは少なくとも８０重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％の量で前記水溶性飼料用酵素を含む。

いくつかの実施形態では、飼料用酵素は、溶解した組成物の最終体積の少なくとも０．０５重量％の量で存在することができる。いくつかの実施形態では、飼料用酵素は、溶解した酵素組成物中に少なくとも０．５重量％の量で存在し得る。

いくつかの実施形態では、酵素は、約０．２重量％〜約１０重量％の量で液体組成物中に存在し得る。いくつかのさらなる実施形態では、酵素は、約０．２重量％〜約５重量％の量で存在し得る。他の実施形態では、酵素は、約０．２重量％〜約２重量％の量で存在し得る。酵素はまた、約０．２重量％〜約１重量％の量で存在してもよい。一実施形態では、組成物は約０．７重量％の飼料用酵素を含む。酵素は、約１重量％〜約２重量％の量で存在し得る。一実施形態では、組成物は約１．５重量％の酵素を含むことができる。

別の実施形態では、飼料用酵素は、液体組成物中に、約０．０５重量％〜約１重量％の量で、約０．５重量％〜約１重量％の量で、０．６重量％〜約０．８重量％の量で存在し得る。

別の実施形態では、飼料用酵素は、液体組成物中に、約１重量％〜約２．５重量％の量で、約１重量％〜約２重量％の量で、約１．４重量％〜約１．６重量％の量で存在し得る。

液体組成物中に存在する酵素の量は、その活性及び所望の投与量に依存することが理解されよう。

酵素は、当該分野で公知の任意の適切な飼料用酵素であり得る。酵素は、フィターゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、ガラクトシダーゼ、セルロース、カルボヒドラーゼ、ヘミセルロース、リパーゼ及びキシログルカナーゼからなる群から選択される１種以上の酵素を含み得る。一実施形態では、酵素はフィターゼ及び／又はキシラナーゼである。一実施形態では、酵素は、フィターゼ、キシラナーゼ又はα−ガラクトシダーゼ又はそれらの組み合わせである。一実施形態では、酵素は、４．０未満のｐＨで最適に作用するフィターゼである。４未満のｐＨで最適に作用するフィターゼの非限定的な例は、特に市販の３−及び６−フィターゼである。

例えば、本発明の酵素組成物は、水溶性粉末、顆粒、ペレット凍結乾燥、凍結乾燥又は任意の他の適切な乾燥形態の形態であってもよい。

いくつかの実施形態では、酵素組成物を液体形態で提供することができ、例えば、乾燥酵素組成物を水に溶解することによって酵素を溶解状態で提供することができる。

本発明によれば、第２の態様から明らかなように、本発明の第１の態様による水溶性酵素組成物を水に溶解した液体形態の酵素組成物の調製方法が提供される。。いくつかの実施形態では、乾燥酵素組成物は、水１リットル当たり少なくとも１ｇ、好ましくは少なくとも３ｇ、より好ましくは少なくとも５ｇ、最も好ましくは少なくとも７ｇの量で溶解される。いくつかの実施形態において、乾燥酵素組成物は、水１リットル当たり１００ｇ以下、好ましくは７５ｇ以下、より好ましくは５０ｇ以下、最も好ましくは２５ｇ以下の量で溶解される。

いくつかの実施形態において、液体酵素組成物は、調製後１週間未満以内、好ましくは１日未満以内に動物飼料と混合される。したがって、酵素噴霧ステーションにおいて温度が室温よりも高い場合でも、酵素の活性は完全に又はほぼ完全に維持される。

本発明の酵素組成物は、飼料配合物中の成分又は含有物であってもよい。酵素の成分

乾燥組成物を水に溶解することによって調製された液体組成物は、飼料に適用される前に、ある期間保存され得る。この期間は、酵素組成物が使用前に、例えば数分から１日又は数日又は数週間保存される必要がある任意の適切な期間であり得ることが理解されるであろう。好ましくは、本発明の酵素組成物を２０℃で３日以上、５日以上、１０日以上、１５日以上、２０日以上保存した場合、酵素組成物への微生物汚染が実質的に減少しているか、又は全くなしに、８０％以上、８５％以上、９０％以上又は９９％以上の酵素活性を維持することができる。

飼料配合物は動物飼料の調製に使用することができる。飼料配合物は、使用直前に調製してもよく、又は有意な酵素活性を失うことなく、及び動物飼料と混合する前、特に動物飼料に液体組成物を撒布する前に、短期間、例えば１週間未満又は１時間未満又は数時間未満保存してもよい。

本発明の酵素組成物は、水に溶解した後、３日以上、１週間以上、１５日以上、３週間以上の期間保存すると５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上の機能性を維持することができる（図１及び３参照）。

溶解した酵素組成物は、３日以上、１週間以上、１５日以上、３週間以上の期間保存した場合、８５％以上の機能性、９０％以上の機能性、９５％以上の機能性、９９％以上の機能性を維持することができる（図１及び図３を参照）。

酵素の機能は、その通常の機能を果たす能力であり、例えば、フィターゼの機能は、フィチン酸の加水分解を触媒することである。酵素の機能性は酵素の活性に大いに関連しており、したがって酵素の機能性の低下はしばしば酵素活性の低下に関連することが理解されるであろう。酵素の機能性、例えば温度、光、湿度の低下を引き起こし得る他の因子が存在し得ることが理解されるであろう。

特に水に溶解された場合、本発明の酵素組成物は、酵素活性に有意に影響を及ぼすことなく、微生物の増殖を有意に減少させるか又は実質的に全く示さない。

微生物の増殖とは、微生物体、例えばウイルス、真菌、細菌又は藻類の増殖を指すことが理解されるであろう。増殖の制御は、微生物の集団の増殖又は繁殖の減少、微生物の増殖の完全な阻害又は死、又はこのスペクトルにおける制御のレベルを意味し得る。

実験
次に、本発明の酵素組成物の製造方法について説明する。

方法
フィターゼ及びキシラナーゼを含む私有の酵素は、水溶性粉末又は顆粒（それぞれＷＳＰ又はＷＳＧ）として提供された。これらの酵素を、飼料配合物調合用の調製装置の水槽に、それぞれ７ｇ／Ｌ（フィターゼ）及び１５ｇ／Ｌ（キシラナーゼ）の濃度で溶解した。

酵素溶液中の０．１重量％及び１重量％安息香酸ナトリウムの異なる濃度の有効性を評価した。

私有のフィターゼの水溶性ペレット（ＷＳＰ）を７ｇ／Ｌの濃度で水に溶解し、４．３−４．５のｐＨに緩衝した。０．１重量％及び１重量％の安息香酸ナトリウムをそれぞれ含む２つの試験溶液を調製した。

私有のキシラナーゼの水溶性ペレット（ＷＳＰ）を１５ｇ／Ｌの濃度で水に溶解し、ｐＨを４．３−４．５に緩衝化した。０．１重量％及び１重量％の安息香酸ナトリウムをそれぞれ含む２つの試験溶液を調製した。

適切な量のクエン酸を用いて、各酵素溶液をｐＨ４．３〜４．５で緩衝化した。４．３〜４．５の範囲の標的ｐＨが酵素及び安息香酸ナトリウムの最適な作用を確実にすることが判明した。

飼料ミル及び飼料工場に見出される標準レベルの微生物汚染を、例えば塵の形成から再現するために、各実験において溶液１リットルあたり０．１グラムの微細飼料を添加した。３０℃で酵素組成物を溶解し、インキュベートした後、０日目、３日目及び１５日目に、総好気性微生物数及び酵素活性をアッセイした。

フィターゼに関して、酵素活性は、標準ＩＳＯ３００２４：２００９方法（http://www.iso.org/iso/iso catalogue/catalogue tc/cataiogue detail.htm? csnumber=45787）を用いて測定した。ＩＳＯ３００２４：２００９は飼料サンプル中のフィターゼ活性の測定を規定しており、もっぱらフィターゼ活性の測定及びもっぱら完全飼料でのみ検証されている。

好気性微生物の増殖は、標準的ＩＳＯ４８３３−２：２０１３方法（http://www.iso.org/iso/catalogue detail.htm?csnumber=59509）を使用して測定した。ＩＳＯ４８３３−２：２０１３は、３０℃で好気的にインキュベートした後、固体培地の表面上に増殖してコロニーを形成することができる微生物の列挙のための水平方法を規定している。この方法は、人間の摂取又は動物飼料用の製品、ならびに食品及び飼料生産及び食品処理分野の環境試料に適用することができる。

キシラナーゼ（エンド−１，４−β−Ｄ−キシラナーゼ）については、Ｍａｇａｚｙｍｅからのキシラザイム錠を用いてｐＨ４．７及び５０℃で酵素活性を測定した。キシラナーゼ活性はエンドペントサナーゼ単位（ＥＰＵ）で表現される。ＥＰＵ単位は、既知の活性を有するエンド−１，４−β−キシラナーゼ酵素及び標準添加法を用いて計算される。１ＥＰＵは、ｐＨ４．７及び５０℃で、オート麦のキシランから毎分０．００８３ピコモルの還元糖（キシロース当量）を放出する酵素の量である。

結果
図１は、０日、３日及び１５日の期間、３０℃での溶解及びインキュベーション後のフィターゼ活性をｆｔｕ／ｇ（フィターゼ単位／グラム）で示す。０．１％安息香酸ナトリウムを含む酵素組成物は、１５日目に最良の活性を保持する。

図２は、図１の酵素組成物の好気性微生物増殖を同じ時間期間で示す。０．１％又は１％の安息香酸ナトリウムを含有する溶液には微生物の増殖は見られなかった。

図３は、０日、３日及び１５日の期間、３０℃での溶解及びインキュベーション後のｅｐｕ／ｇ（キシラナーゼ単位／グラム）におけるキシラナーゼ活性を示す。酵素の活性は、ベンゾアートの存在によって３日又は１５日で影響されなかった。

図４は、同じ期間における図３の酵素組成物の好気性微生物増殖を示す。０．１重量％又は１重量％の安息香酸ナトリウムを含有する溶液中に微生物の増殖は見られなかった。１５日目には、好気性細菌増殖も対照において抑制された。これは、１５日目の培養上部で明らかになった真菌の伸長に起因する競合阻害によって引き起こされた可能性が高い。

したがって、酵素組成物は、飼料配合物の調製に適用及び使用される前に、少なくとも１５日間水槽に保存され得ることが見出された。

Claims (15)

1. １種以上の水溶性飼料用酵素、安息香酸の塩及び弱酸を含み、液体形態で酵素組成物を提供するために水に溶解可能な乾燥形態の酵素組成物であって、液体酵素組成物が水溶性粉末中に存在する弱酸によってｐＨ５以下に緩衝化される、上記酵素組成物。
2. 水に溶解したとき、水溶性酵素組成物中に存在する弱酸により液体酵素組成物がｐＨ４．５以下に緩衝される、請求項１に記載の酵素組成物。
3. 水に溶解したとき、水溶性酵素組成物中に存在する弱酸により液体酵素組成物がｐＨ４．０〜４．５に、好ましくはｐＨ４．３〜４．５に緩衝される、請求項１又は２に記載の酵素組成物。
4. 酵素組成物が水溶性粉末の形態である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵素組成物。
5. 酵素組成物が水溶性顆粒の形態である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵素組成物。
6. 安息香酸の塩が安息香酸ナトリウムを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の酵素組成物。
7. 飼料用酵素が、フィターゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、ガラクトシダーゼ、セルラーゼ、カルボヒドラーゼ、ヘミセルラーゼ及びリパーゼからなる群から選択される１種以上を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の酵素組成物。
8. 飼料用酵素がフィターゼ、特にｐＨ４．０未満で最適に作用するフィターゼを含む、請求項７に記載の酵素組成物。
9. 前記飼料用酵素が、キシラナーゼ、好ましくはセルロース及び／又はヘミセルロースを含む、請求項７に記載の酵素組成物。
10. 少なくとも７５重量％の量、好ましくは少なくとも８０重量％の量、より好ましくは少なくとも８５重量％の量の前記水溶性飼料用酵素を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の酵素組成物。
11. 前記ベンゾアートを少なくとも３．０重量％の量で、好ましくは少なくとも４．０重量％の量で、より好ましくは少なくとも５．０重量％の量で含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の酵素組成物。
12. 前記弱酸がクエン酸、特にクエン酸一水和物を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の酵素組成物。
13. 酵素組成物が２０℃の温度で蒸留水に１０ｇ／ｌの量で完全に溶解可能である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の酵素組成物。
14. 請求項１〜１３のいずれか一項に記載の水溶性酵素組成物を水に溶解させる、液体形態の酵素組成物を調製する方法。
15. 液体酵素組成物が、調製後１週間未満以内、好ましくは１日未満以内に動物飼料と混合される、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。