JP2019510502A5 - - Google Patents

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無血清IMDM+BIT培地を使用して培養した7日目のDN2細胞()またはDN3細胞()の頻度を、ポジティブコントロール(25-5-1の再供給条件)と、最適化された供給なしの条件とで比較したグラフである。IL-7の濃度を単純に2ng/mLから10ng/mLに増加したところ(50-10-10の供給なしの条件)、コントロールと比較して、DN2細胞が有意に高い収率で得られ、T細胞系列に分化決定されたDN3細胞も高頻度および高収率で得られた(影をつけた部分は二次元カーネル密度推定を使用してプロットした;データポイントはいずれも、生物学的反復をn=3として行った実験のデータを示す)。
0日目のCD34-細胞または12日目のFB培養由来CD34-細胞から分化誘導されたCD7発現細胞を評価したところ、T前駆細胞マーカーの共発現が見られなかったことを示したグラフである。
実施例8:スケールアップ可能なT前駆細胞の分化誘導
本明細書において「幹細胞」は、さらに特化した細胞に分化することが可能な、自己複製能を有する細胞を指す。幹細胞としては、胚性幹細胞(ESC)や人工多能性幹細胞(iPSC)などの多能性幹細胞(PSC);および臍帯血幹細胞や成体幹細胞などの、様々な組織で見出され、複数の細胞に分化可能な幹細胞が挙げられる。
まず、無血清IMDM+BIT培地中において、10μg/mLのリガンドDL4を吸着させたプレートに播種するソーティング後のsca1+ckit+HSPCの細胞密度を調整した。1000個/ウェル(3125個/cm2)未満の細胞密度では、増殖した総細胞数のばらつきが大きいことが観察された(図4a)。さらに、3.1×103個/cm2よりも細胞密度を高くすると、増殖した総細胞数は有意に低下した(図4a)。これは、HSPCコンパートメントが本質的にばらつきを持っていることに起因すると考えられ、供給源として播種する細胞をさらに精製することによって、このようなばらつきを排除することができると考えられる。しかし、播種密度を1000個/ウェル以上とすると、増殖した総細胞数の相対値のばらつきは最小となった。播種する細胞密度を様々に変えて試験を行ったところ、各DNサブセットの頻度に有意差は見られなかった(図5a)。さらに、播種密度を1000個/ウェル(3125個/cm2)とすると、別の細胞である骨髄系細胞およびB細胞への分化に傾倒した細胞が最も少なくなった(図5a)。また、播種密度を1000個/ウェルよりも多くすると、細胞増殖が低下することが観察された。これらを踏まえ、アッセイ最適化の次の段階では、最初に播種するHSPCの播種密度を1000個/ウェル(3125個/cm2)とした。
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