KR20210008047A - 활성을 증가시키기 위한 면역 세포의 변형 - Google Patents
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Abstract
암, 바이러스 및 미생물 감염을 치료하기 위해 NK 세포와 같은 변형된 면역 세포를 제조, 및 사용하기 위한 조성물, 방법. 변형된 CISH -/- NK 세포는 IL-2 및/또는 IL-15와 같은 사이토카인에 과민성을 나타내고 확장 및 항종양 기능을 유지한다.
Description
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2018년 5월 11일에 출원된 미국 가출원 번호 62/670,033의 우선권을 주장하며, 이 출원은 본원에 참조로 포함된다.
정부 이익의 진술
이 발명은 승인 번호 CA217885 및 CA203348에 따라 미국 국립 보건원(National Institutes of Health)의 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 갖는다.
자연 살해(NK) 세포는 내재 면역 시스템의 중요한 부분이며, 항종양 및 항감염 면역에서 림프구 집단의 중요한 이펙터(effector)이다. 그러나, 종양 진행 및 만성 감염은 일반적으로 NK 세포 고갈을 유발하여, 이펙터 기능이 저하되고 NK 세포의 항종양/감염 가능성을 제한한다. 종양 및 만성 감염에서 NK 세포 고갈을 초래하는 정확한 메커니즘은 불충분하게 규정되어 있다.
NK 세포에 의한 비정상 세포의 검출은 리간드 및 사이토카인, 예컨대 인터루킨-15(IL-15)로부터의 활성화 및 억제 신호에 의해 제어된다. 사이토카인-유도성 SH2-함유 단백질(CIS)은 인간의 CISH 유전자에 의해 코딩되는 NK 세포에서 IL-15 시그널링(signaling)의 중요한 음성 조절자(negative regulator)이다. CISH는 IL-15에 대한 반응으로 빠르게 유도되며, CISH 유전자의 결실은 IL-15에 대한 NK 세포의 감수성을 증가시키는 것으로 나타났다. 마우스를 대상으로 한 최근 연구는 CIS가 NK 세포-매개 종양 면역에서 강력한 억제 체크포인트임을 입증했다.
NK 세포는 활성과 기능을 유지하기 위해 인터루킨-2(IL-2) 및 IL-15와 같은 사이토카인이 필요하지만, IL-2는 전신 독성을 유발한다. 따라서, 사이토카인 없이 확장(expansion) 및 기능을 유지하거나 낮은 사이토카인 용량만을 필요로 하는, 암, 및 기타 질병의 치료를 위한 임상 NK 세포 요법이 여전히 필요하다.
본 개시내용은 일반적으로 암 치료에서 CISH -/- 변형된 NK 세포를 사용하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 변형된 NK 세포는 IL-2 및/또는 IL-15 자극에 과민성을 나타내고 저농도 사이토카인 또는 성장 인자, 예컨대 인터루킨으로 확장 및 항종양 기능을 유지할 수 있다.
본 개시내용의 일 측면에 따르면, 변형되지 않은 본래의(native) NK 세포에 비해 개선된 치료 효과를 갖는 암 및 기타 질병 또는 감염의 치료를 위한 NK 세포-기반 요법의 세포 공급원으로 사용할 수 있는 CISH -/- 변형된 NK 세포가 제공된다.
본 개시내용의 일 측면에 따르면, CISH -/- NK 세포의 제조 방법이 제공된다.
본 개시내용의 또 다른 측면에 따르면, CISH -/- NK 세포의 세포 배양물, 및 CISH -/- NK 세포를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
본 개시내용의 특징 및 이점에 대한 더 우수한 이해는 본 개시내용의 원리가 이용되는, 예시적인 구현예를 설명하는 다음의 상세한 설명 및 첨부 도면을 참조하여 얻어질 것이다:
도 1a 내지 1c는 일반적인 방법을 사용한 NK 분화에 대한 CISH의 손실 효과를 도시한다.
도 2a 내지 2b는 변형된 방법을 사용한 NK 분화에 대한 CISH의 손실 효과를 도시한다.
도 3a 내지 3b는 CISH-/- NK 세포 확장(expansion)을 도시한다.
도 4a 내지 4b는 인큐사이트 사멸 분석(incucyte killing assay) 결과를 도시한다.
도 5a 내지 5c는 CISH -/- iPSC-NK 세포가 사이토카인 자극시 더 높은 단일 세포 다기능성 반응을 나타냄을 도시한다.
도 6a 내지 6c는 CISH -/- iPSC-NK 세포가 증가된 기저 해당 과정 및 해당 용량을 나타냄을 도시한다.
도 7a 내지 7c는 인간 백혈병 전신 종양 모델에서 CISH -/- iPSC-NK 세포가 더 우수한 항종양 활성을 매개함을 도시한다.
도 1a 내지 1c는 일반적인 방법을 사용한 NK 분화에 대한 CISH의 손실 효과를 도시한다.
도 2a 내지 2b는 변형된 방법을 사용한 NK 분화에 대한 CISH의 손실 효과를 도시한다.
도 3a 내지 3b는 CISH-/- NK 세포 확장(expansion)을 도시한다.
도 4a 내지 4b는 인큐사이트 사멸 분석(incucyte killing assay) 결과를 도시한다.
도 5a 내지 5c는 CISH -/- iPSC-NK 세포가 사이토카인 자극시 더 높은 단일 세포 다기능성 반응을 나타냄을 도시한다.
도 6a 내지 6c는 CISH -/- iPSC-NK 세포가 증가된 기저 해당 과정 및 해당 용량을 나타냄을 도시한다.
도 7a 내지 7c는 인간 백혈병 전신 종양 모델에서 CISH -/- iPSC-NK 세포가 더 우수한 항종양 활성을 매개함을 도시한다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허, 또는 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다. 간행물에 대한 인용은 이의 최신판을 참조하기 위한 것이다.
본 발명의 실시는 달리 나타내지 않는 한, 당업계의 기술 내에 있는 분자 생물학(재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (MJ. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and CC. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (CA. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: apractical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); 및 Cancer: Principles and Practice of Oncology (V. T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993)과 같은 문헌에 자세히 설명되어 있다.
본 발명은 유효량의 인간 CISH -/- 자연 살해(NK) 세포 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 필요로 하는 인간 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간 대상체에서, 질병, 에컨대 암, 또는 예를 들어 바이러스 또는 박테리아에 의해 야기된 감염을 치료하는 방법에 관한 것이다.
구현예에서, 본 발명은 NK 세포가 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC), 배아 줄기 세포(ESC), 또는 말초 혈액 세포로부터 유도되는, 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
구현예에서, 본 발명은 CISH -/- NK 세포가 대상체에 대해 자가(autologous)인, 인간 대상체에서 암 또는 감염을 치료하는 방법에 관한 것이다.
구현예에서, 본 발명은 유효량의 사이토카인, 예컨대 IL-2, IL-15 또는 둘 모두를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
구현예에서, 본 발명은 IL-2 및/또는 IL-15의 유효량이 본래의 NK 세포 치료에서 요구되는 유효량보다 적은, 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 구현예에서, IL-2의 저농도는 1 내지 10 U/ml, 또는 약 5 U/ml이고, IL-15의 저농도는 1 내지 10 ng/ml, 또는 약 5 ng/ml이며, 이는 CISH -/- NK 세포 확장 및 항종양 기능 유지에 효과적이다.
본 발명에서 사용될 수 있는 사이토카인은 자연 발생, 변형 및 합성 조작된 사이토카인 및 사이토카인-유사 분자(예컨대 ALT-803 또는 NEKTAR Therapeutics, Inc. 제품, 예컨대 NKTR-358 또는 NKTR-255)를 포함한다. 사이토카인은 IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21과 같은 인터루킨을 포함한다.
구현예에서, 본 발명은 암이 조혈 또는 고형 종양인 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
구현예에서, 본 발명은 CISH -/- NK 세포가 본래의 NK 세포에 비하여 개선된 확장, 항종양 기능, 및 항바이러스 기능을 입증하며, 사이토카인 자극에 과민한, 인간 대상체에서 질병 또는 감염을 치료하는 방법에 관한 것이다.
구현예에서, 본 발명은 인간 CISH -/- NK 세포, 및 적어도 1종의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
구현예에서, 본 발명은 CISH -/- NK 세포가 본래의 NK 세포에 비하여 개선된 확장, 항종양 기능, 및 항바이러스 기능을 입증하며, 사이토카인 자극에 과민한, 약학적 조성물에 관한 것이다.
구현예에서, 본 발명은 사이토카인 자극이 IL-2 및/또는 IL-15와 같은 인터루킨에 의한 자극을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 구현예에서, IL-2의 저농도는 1 내지 10 U/ml, 또는 약 5 U/ml이고, IL-15의 저농도는 1 내지 10 ng/ml, 또는 약 5 ng/ml이며, 이는 CISH -/- NK 세포 확장 및 항종양 기능 유지에 효과적이다.
구현예에서, 본 발명은 CISH -/- NK 세포가 유도 만능 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 또는 말초 혈액 세포로부터 유도되는, 약학적 조성물에 관한 것이다.
구현예에서, 본 발명은 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 또는 배아 줄기 세포(ESC)에서 CISH 유전자를 결실시키는 단계(deleting); 및 생체외(in vitro) 분화 프로토콜을 사용하여 CISH-/- iPSC로부터 NK 세포를 유도하는 단계(deriving)를 포함하는, CISH -/- NK 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.
구현예에서, 본 발명은 CISH 유전자의 결실이 CRISPR/Cas9 시스템과 같은 CRISPR 시스템을 사용하여 달성되는, CISH -/- NK 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.
구현예에서, 본 발명은 유도하는 단계가 CISH -/- iPSC를 75% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 또는 80% 초과 CD34+ 로 분화시키는 단계, 및 그 후, 75% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 또는 80% 초과 CD45+ 및CD56+ 로 분화시키는 단계를 추가로 포함하는, CISH -/- NK 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.
구현예에서, 본 발명은 제2 분화는 노치(Notch) 리간드, 예를 들어 노치 리간드를 과발현하도록 조작된 OP9-DL4 세포와의 접촉으로 발생하는, CISH -/- NK 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.
구현예에서, 본 발명은 세포 배양물이 CISH -/- NK 세포를 포함하는, CISH -/- NK 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.
정의
본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해, 본원에서 사용되는 다수의 용어 및 약어는 다음과 같이 정의된다:
본 발명의 구성요소 또는 이의 바람직한 구현예(들)를 도입할 때, 관사, "a", "an", "the" 및 "상기(said)"는 하나 이상의 구성요소가 존재함을 의미하는 것으로 의도된다. 용어, "포함하는(comprising)", "포함하는(including)", 및 "갖는"은 포괄적인 것으로 의도되며, 열거된 구성요소 이외의 추가적인 구성요소가 있을 수 있음을 의미한다.
두 개 이상의 항목 목록에서 사용되는 경우의 용어 "및/또는"은, 열거된 항목 중 임의의 하나가 그 자체로 또는 임의의 하나 이상의 열거된 항목과 조합으로 사용될 수 있음을 의미한다. 예를 들어, 표현 "A 및/또는 B"는 A와 B 중 어느 하나 또는 둘 모두, 즉 A 단독, B 단독 또는 A와 B 조합을 의미하는 것으로 의도된다. 표현 "A, B 및/또는 C"는 A 단독, B 단독, C 단독, A와 B 조합, A와 C 조합, B와 C 조합 또는 A, B, 및 C 조합을 의미하는 것으로 의도된다.
본원에 기술된 본 발명의 측면 및 구현예는 "구성되는" 및/또는 "필수적으로 구성되는" 측면 및 구현예를 포함하는 것으로 이해된다.
범위 형식의 기술은 단지 편의성과 간결성을 위한 것이며 본 발명의 범위에 대한 융통성 없는 제한으로 해석되어서는 안 되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 범위에 대한 기술은 가능한 모든 하위 범위뿐만 아니라 해당 범위 내의 개별 수치를 구체적으로 공개한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위에 대한 기술은 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같은 하위 범위뿐만 아니라 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 및 6과 같이 해당 범위 내의 개별 숫자를 구체적으로 공개한 것으로 간주되어야 한다. 이는 범위의 폭에 관계없이 적용된다. 값 또는 범위는 본원에서, "약" 하나의 특정값으로부터, 및/또는 "약" 다른 특정값으로, "약"으로서 표현될 수 있다. 이러한 값 또는 범위가 표현될 때, 개시된 다른 구현예는 하나의 특정값으로부터, 및/또는 다른 특정값으로, 언급된 특정값을 포함한다. 유사하게, 선행하는 "약"을 사용하여, 값이 근사치로 표현될 때, 특정값은 다른 구현예를 형성하는 것으로 이해될 것이다. 나아가, 본원에 개시된 다수의 값이 있고, 각각의 값은 또한 그 값 자체뿐만 아니라 그 특정값에 대해 "약"으로 본원에서 개시되는 것으로 이해될 것이다. 구현예에서, "약"은 예를 들어, 언급된 값의 10% 이내, 언급된 값의 5% 이내, 또는 언급된 값의 2% 이내를 의미하는 것으로 사용될 수 있다.
본원에 사용된, "환자" 또는 "대상체"는 치료될 인간 또는 동물 대상체를 의미한다.
본원에 사용된, "증식(proliferation)" 또는 "확장(expansion)"은 세포 또는 세포 집단이 수를 증가시키는 능력을 지칭한다.
본원에 사용된, "정제된 세포 집단" 또는 "정제된 세포 조성물"을 함유하는 조성물은 조성물에서 적어도 30%, 50%, 60%, 전형적으로 적어도 70%, 그리고 보다 바람직하게는 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 그 이상의 세포가 확인된 유형임을 의미한다.
본원에 사용된, "치료적으로 유효한"은 암과 같은 질병, 또는 감염과 같은, 상태와 관련된 증상을 치료 또는 개선하거나, 또는 어떤 방식으로 감소시키는데 충분한 NK 세포의 양을 지칭한다. 방법과 관련하여 사용되는 경우, 방법은 질병 또는 상태와 관련된 증상을 치료 또는 개선하거나, 또는 어떤 방식으로 감소시키는데 충분히 효과적이다. 예를 들어, 질병과 관련된 유효량은 발병을 차단하거나 예방하기에; 또는 질병 병리가 시작된 경우, 질병의 완화, 개선, 안정화, 반전 또는 느린 진행, 또는 다르게는 질병의 병리학적 결과를 감소시키기에 충분한 양이다. 임의의 경우에, 유효량은 단일 또는 분할 용량으로 제공될 수 있다.
본원에 사용된, 용어 "치료"는 적어도 환자의 질병 또는 상태와 관련된 증상의 개선을 포함하며, 개선은 적어도 매개 변수(예를 들어, 치료중인 상태와 관련된 증상)의 규모의 감소를 지칭하기 위해 넓은 의미로 사용된다. 이와 같이, "치료"는 또한 질병, 장애, 또는 병리학적 상태, 또는 적어도 이와 관련된 증상이 완전히 억제(예를 들어, 발생 방지) 또는 중지(예를 들어, 종료)되어 환자가 더 이상 상태, 또는 적어도 상태를 특징 짓는 증상으로 고통받지 않는 상황을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "약학적 조성물"은 약학적으로 허용가능한 조성물을 지칭하며, 여기서 조성물은 NK 세포를 포함하고, 일부 구현예에서 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서 약학적 조성물은 조합일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "약학적으로 허용가능한"은 동물 및 보다 특히 인간 및/또는 비인간 포유류에 사용하기에 안전한 다른 제형뿐만 아니라 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 미국 약전, 일반적으로 인정되는 기타 약전에 등재된 것을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 NK 세포와 함께 투여되는 부형제, 희석제, 보존제, 가용화제, 유화제, 보조제 및/또는 비히클을 지칭한다. 이러한 담체는 멸균 액체, 예컨대 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 유래의 것을 포함하는, 물 및 오일, 예컨대 땅콩유, 대두유, 광유, 참기름 등, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 합성 용매일 수 있다. 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항균제; 아스코르브산 또는 소듐 바이설파이트와 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이트제; 및 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같은 긴장성(tonicity) 조절용 제제도 담체일 수 있다. 담체와 조합하여 조성물을 제조하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 약학적 투여에 거부반응을 일으키지 않는(compatible) 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함하는 것으로 의도된다. 약학적 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed., (Lippincott, Williams & Wilkins 2003) 참조. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 활성 화합물과 함께 배합할 수 없는 경우를 제외하고는, 이러한 조성물에서의 사용이 고려된다.
용어 "조합"은 하나의 투여 단위 형태의 고정된 조합, 또는 병용 투여(combined administration)를 위한 부품 키트를 지칭하며, 여기서 NK 세포 및 조합 파트너(예를 들어, 아래에 설명되는 다른 약물, "치료제" 또는 "공-제제(co-agent)"로도 지칭됨)는 동시에 독립적으로 또는 시간 간격 내에서 별도로 투여될 수 있다. 일부 상황에서 조합 파트너는 협력, 예를 들어, 시너지 효과를 나타낸다. 본원에서 사용되는 용어 "공동-투여" 또는 "병용 투여" 등은 이를 필요로 하는 단일 대상체(예를 들어, 환자)에 대한 선택된 조합 파트너의 투여를 포함하는 것을 의미하고, 제제가 반드시 동일한 투여 경로에 의해 또는 동시에 투여되는 것이 아닌 치료 요법을 포함하는 것으로 의도된다. 본원에 사용된 용어 "약학적 조합"은 1종을 초과하는 활성 성분의 혼합 또는 조합에 기인한 생성물을 의미하고 활성 성분의 고정 및 비-고정 조합 모두를 포함한다. 용어 "고정 조합"은 활성 성분(예를 들어, 화합물 및 조합 파트너)이 둘 모두 단일 개체 또는 투여량 형태로 환자에게 동시에 투여됨을 의미한다. 용어 "비-고정 조합"은 활성 성분(예를 들어, 화합물 및 조합 파트너)이 둘 모두 특정한 시간 제한 없이 동시에, 함께 또는 순차적으로 별개의 개체로 환자에게 투여되는 것을 의미하며, 이러한 투여는 환자의 신체에 두 화합물을 치료적 유효 수준으로 제공한다. 후자는 칵테일 요법, 예를 들어 3 가지 이상의 활성 성분의 투여에도 적용된다.
사이토카인 유도성 SH2 함유 단백질(Cytokine Inducible SH2 Containing Protein, CIS)은 인간 자연 살해(NK) 세포 활성화-유도 고갈의 조절에 중요한 역할을 하며, 쥐 시스템(murine system)의 연구와는 달리, CISH-결실(CISH -/-)은 감소된 NK 세포 활성을 초래한다. 현재 개시된 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSCs)에서의 CISH-결실 모델은 인간 NK 세포 발달, 기능, 활성화, 지속성, 및 고갈의 CISH 매개 조절을 추가로 세분화하는 모델을 제공한다. 다른 구현예에서, CISH 유전자의 결실은 인간 배아 줄기 세포(hESC)에서 일어난다. 구현예에서, T 세포는 CISH-/- iPSC 또는 hESC로부터 유도된다. 본원에서 면역 세포, 예컨대 NK 세포 또는 T 세포 발달을 조절하고 면역 세포 고갈을 억제하는 조성물 및 방법이 제공된다.
본 발명은 노치 리간드를 과발현하는 OP9-DL4 세포의 배양 층과 같은 노치 리간드로 세포를 배양함으로써 CISH -/- NK 고갈을 예방 또는 억제할 수 있음을 제공한다. 대안적인 노치 리간드 공급원이 공지되어 있으며 세포-결합 또는 플레이트 결합/무-세포(cell-free) 물질을 포함한다.
본 개시내용은 광범위한 유기체에서 사용될 수 있는(예를 들어, 특정 유전자 서열의 추가, 파괴, 또는 변경에 사용되는) 크리스퍼(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR) 시스템과 같은 게놈 편집 도구에 부분적으로 기초한다. CRISPR/Cas9 시스템은 두 가지 구성요소를 기반으로 한다. 제1 구성요소인 Cas9는 가이드 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 가이드 RNA)인 제2 구성요소에 대한 결합 부위를 갖는 엔도 뉴클레아제이다. 가이드 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 가이드 RNA)는 Cas9 단백질을 서열 상동성을 기반으로 이중 가닥 DNA 템플릿으로 유도한다. 그 후, Cas9 단백질은 그 DNA 템플릿을 분할(cleave)한다. Cas9 단백질 및 적절한 가이드 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 가이드 RNA)를 세포에 전달함으로써, 유기체의 게놈이 원하는 위치에서 절단된다. Cas9/gRNA 복합체에 의한 표적화된 게놈 서열의 분열(cleavage) 후, 두 가지 대체 DNA 복구 메커니즘 중 하나가 염색체 무결성(chromosomal integrity)을 복원할 수 있다: 1) gRNA 절단 부위에서 몇 개의 DNA 염기쌍(bp) 삽입 및/또는 결실을 발생시키는 NHEJ(non-homologous end joining), 또는 2) gRNA 절단 부위에 걸쳐있는 추가 "브리징" DNA 템플릿을 통해 병변을 교정할 수 있는 HDR(homology-directed repair). 당업자에게 공지된 CRISPR/Cas 시스템의 추가 측면은 PCT 공개 번호 WO 2017/049266에 기술되어 있으며, 그 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. 이들 및 기타 잘-알려진 그리고 새로운 기술, 예컨대 CISH -/- NK 세포를 제조하기 위한 TALEN이 본 발명에 의해 고려된다. 본 발명은 또한 조혈세포, 예컨대 NK 세포, T 세포 및 기타 면역 세포를 사용한 조성물, 사용 방법 및 제조 방법을 고려한다.
실시예
인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC)의 CISH 유전자는 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 파괴되었고 CISH-/- iPSC로부터의 NK 세포는 2 단계 생체외 분화 프로토콜을 사용하여 유도되었다. 조혈 전구 세포로의 분화의 제1 단계는 WT 또는 CISH-/- iPSC를 사용한 정상(80% 초과 CD34+ 세포) 이었다. iPSC에서 CISH의 결실은 생체외 NK 세포 분화의 제2 단계를 지연시켰다(도 1 및 도 2). 특히, NK 세포 분화는 전형적으로 WT iPSC를 사용한 4주 후 90% 초과 NK 세포로 완전히 완료되는 반면, CISH-/- iPSC-유도 세포는, 5주에는 80% 초과 NK 세포였지만, 4주에는 10% CD45+CD56+ NK 세포만 생성했다. 이 시간 이후, CISH-/- iPSC-유도 NK 세포는 표현형적으로 성숙되었고 CD94, CD16, NKG2D, NKp44, NKp46과 같은 전형적인 NK 표지 마커(surface maker) 발현을 보였다.
CISH는 NK 세포-매개 종양 면역에서 강력한 세포내 억제 체크포인트이다. 인간 iPSC-유도 NK 세포에서 CISH 유전자의 결실은 NK 세포를 사이토카인에 과민하게 하여 종양에 대한 이의 세포 독성을 향상시킨다(도 3a 내지 4b). 변형되지 않은 인간 NK 세포와 비교하여, CISH 녹아웃(knockout) 인간 NK 세포는 암, 바이러스 및 미생물 감염의 치료를 위한 적응 세포 치료를 위한 세포 공급원으로 사용될 때 인간 환자에서 더 우수한 지속성과 항종양, 항바이러스 및 항균 효과를 가질 것이다.
생성된 CISH-/- 인간 iPSC-NK 세포는 IL-2/IL-15 자극에 과민 반응 및 저농도의 IL-2(5 U/ml) 및 IL-15(5 ng/ml)로 확장 및 항종양 기능을 유지하는 능력을 나타냈다(도 3a 내지 3b). CISH -/- IPSC-NK 세포는 생체외에서 3주를 초과하여 저농도의 IL-2(5 U/ml) 및 IL-15(5 ng/ml)로 확장 및 세포 독성 기능을 유지할 수 있다.
기존 기술에 비해, 유전자 변형된 iPSC-유도 NK 세포는 생체내에서 변형되지 않은 NK 세포보다 더 오래 지속될 수 있고 확장될 수 있어 더 우수한 항종양 효과를 갖는다. 기존의 NK 세포 요법은 말초 혈액(PB-NK 세포)에서 얻은 NK 세포 또는 변형되지 않은 iPSC-유도 NK 세포인 변형되지 않은 NK 세포를 사용하며, 이는 확장 및 항종양 기능 유지하기 위해 전형적으로 고용량의 IL-2 및/또는 IL-15의 투여를 필요로 한다. 그러나, 고농도의 IL-2 및/또는 IL-15는 독성이 높다는 임상 데이터가 보고되었다. 결과적으로, CISH-/- iPSC-유도 NK 세포는 확장 및 항종양 기능을 유지하기 위해 단지 저용량의 Il-2 및/또는 IL-15 또는 다른 사이토카인을 필요로 하므로 IL-2 및/또는 IL-15로 야기되는 이의 독성의 완화로 인해 NK 세포 요법에 유익하게 사용될 수 있다.
CISH -/- iPSC-유도 NK 세포는 개선된 단일-세포 다기능성을 나타낸다. 도 5a는 세포 독성 기능에 관여하는 5개의 이펙터 사이토카인(Granzyme B, IFNγ, MIP-1α, Perforin, TNFα), Isoplexis 32-plex, 면역 사이토카인 반응 패널을 사용한 단일-세포 사이토카인 생산 분석을 나타낸다. 도 5b는 도 5a에 나타낸 2 가지 이상의 사이토카인을 분비하는 샘플의 퍼센트를 나타낸다. 도 5c는 다기능성(polyfunctionality)이 다기능성 강도 지수(polyfunctionality strength index, PSI)를 통해 주요 범주(항상성/증식성, 염증성, 화학주성, 조절성(regulatory), 및 면역 이펙터)에 걸쳐 32개의 주요 면역학적 관련 분자의 사전-특정된 패널에 걸쳐 측정되었음을 나타낸다. CAR-T 세포의 다기능성(우리가 사용한 것과 동일한 분석인, Isoplexis 32-plex로 측정)은 임상 결과와 양의 상관 관계였다. CISH -/- iPSC-NK 세포의 다기능성의 증가는 변형되지 않은 자생형(wild-type) NK 세포에 비해 더 우수한 항종양 활성을 설명한다.
CISH -/- iPSC-NK 세포는 증가된 기저 해당 과정 및 해당 용량을 나타낸다. 도 6a는 Seahorse XF Glycolytic Rate Assay Kit를 사용하여 측정된 세포외 산성화 속도(extracellular acidification rate, ECAR)를 나타낸다. 도 6b는 기저 해당 과정 속도의 정량화를 나타낸다. 도 6c는 해당 용량의 정량화를 나타낸다. 세포외 산성화 속도(ECAR)는 글루코스 대사율의 지표이다. 이 데이터는 CISH -/- iPSC-NK 세포가 CISH -/- iPSC-NK 세포의 개선된 기능의 메커니즘일 수 있는 개선된 글루코스 대사를 가지고 있음을 나타낸다(개선된 글루코스 대사가 기능 증가에 기여하는 것으로 보고되었다).
CISH -/- iPSC-NK는 더 우수한 생체내 항종양 활성을 입증하는 것으로, NSG 마우스에 반딧불이 루시퍼라제 유전자를 발현하는 5 x 106 Molm13 세포로 IP를 접종하였다. 종양 이식 1일 후, 마우스를 처리하지 않은 채로 두거나 또는 10 x 106 WT-iPSC-NK 또는 CISH KO-iPSC-NK 세포로 처리했다. NK 세포는 3주 동안 매주 IL-2 주입을 통해 지원되었으며, IVIS 이미징은 종양 부하를 추적하기 위해 매주 수행되었다. 도 7a는 IVIS 이미지를 나타낸다. 도 7b는 각 그룹의 생존 곡선을 나타낸다. 이 데이터는 CISH-/- iPSC-NK 세포가 이종 이식 종양 모델에서 개선된 항종양 활성을 가짐을 나타낸다.
구현예에서, CISH-/- iPSC-유도 NK 세포는, NK 세포 요법을 위한 개선된 치료 세포 공급원으로서 사용된다.
구현예에서, CISH-/- iPSC-유도 NK 세포는, 생체외에서 확장되어 다른 상태 중에서, 암, 바이러스 및 미생물 질병의 치료 요법의 일부로서 투여하기에 충분한 수의 세포를 수득한다.
구현예에서, CISH-/- iPSC-유도 NK 세포는 변형되지 않은 말초 혈액 NK 세포를 사용하는 NK 세포-기반 요법에 따른 이전의 임상 작업과 유사한 방식으로 환자에게 투여된다. 구현예에서, IL-2 및 IL-15를 사용한 것과 같은 저농도의 사이토카인 자극이 wtNK 세포를 사용한 통상적인 요법과 비교하여 사용된다. 구현예에서, IL-2의 저농도는 1 내지 10 U/ml, 또는 약 5 U/ml이고, IL-15의 저농도는 1 내지 10 ng/ml, 또는 약 5 ng/ml이며, 이는 CISH -/- NK 세포 확장 및 항종양 기능 유지에 효과적이다.
구현예에서, CISH-/- iPSC-유도 NK 세포는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 불응성 암, 혈액 악성 종양 및 고형 종양 둘 모두의 치료와 같은, 불응성 악성 종양에 대한 치료 요법의 일부로서 환자에게 투여된다.
방법
조혈 및 NK 분화 I:
CISH KO hiPSC는 먼저 조혈 전구체(hematopoietic progenitor)로 그리고 이어서 NK 세포로 분화되었다1, 2. 간략하게, 6일째에 EB 내부에 CD34+ 세포 출현시, EB는 NK 세포 분화로 옮겨졌다. 간략하게, 조혈 전구체는 Dulbecco modified Eagle 배지/Ham F12(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, 11965092, 11765054)의 2:1 혼합물, 2 mM L-글루타민(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, 25030081), 1% 페니실린/스트렙토마이신(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, 15140122), 25 μM β-메르캅토에탄올(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, 21985023), 20% 열-불활성화 인간 혈청AB(Corning, NY, U.S., MT35060CI), 5 ng/mL 소듐 셀레나이트(Merck Millipore, Burlington, MA, S5261), 50 μM 에탄올아민(MP Biomedicals, ICN19384590), 20 mg/mL 아스코르브산(Merck Millipore, Burlington, MA, A4544), 인터루킨-3(IL-3; R&D Systems Minneapolis, MN, 203-IL); 첫 주에만), 줄기 세포 인자(SCF; R&D Systems Minneapolis, MN, 7466-SC), 인터루킨-15(IL-15; R&D Systems, 247-ILB), Fms-유사 티로신 키나제 3 리간드(FLT3L; R&D Systems Minneapolis, MN, 308-FK), 및 인터루킨-7(IL-7; R&D Systems Minneapolis, MN, 207-IL)을 함유하는 NK 세포 분화 배지로 옮겼다. 그 후, 세포를 21일 동안 매주 배지를 교환하여 이러한 상태에 두었다.
NK 분화 II:
NK 분화 배지에서 21일 후(NK 분화 I), 서스펜션 세포를 수집하고 14일 동안 기질 세포 OP9-DL4(DL4를 과발현하는 OP9 세포, 노치 리간드)가 있는 6-웰 플레이트로 옮기고, 유세포 분석에 의해 결정된 바와 같이 이들이 CD45+CD56+CD33-CD3- 세포로 발전할 때까지 매주 배지를 교환한다.
확장
분화 후, 조사된 K562-IL21-4-1BBL를 사용하여 NK 세포를 확장시켰다3, 4. 간략하게, 비-부착 세포를 제거하고 유세포 분석으로 분석하여 CD56+ NK 세포의 순도를 결정했다. 그 후, 이들 세포를 RPMI 1640(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, 11875085), 2 mM L-글루타민(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, 25030081), 1% 페니실린/스트렙토마이신(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, 15140122), 1% 비-필수 아미노산(NEAA; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, 11140050) 및 10% 표준 FBS 또는 10% 인간 혈청AB(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, 10100147)을 함유하는 배지의 350,000 NK 세포/mL에서 NK 세포에 2:1 aAPC(10,000 Gy에서 조사)로 자극했다. 이는 50 내지 100 U/mL IL2(Prometheus, 65483011607)로 보충되었다.
참조문헌
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2. Zhu, H. & Kaufman, D. S. (2019). An improved method to produce clinical scale natural killer cells from human pluripotent stem cells. bioRxiv, 2019.
3. Denman, C. J., Senyukov, V. V., Somanchi, S. S., Phatarpekar, P. V., Kopp, L. M., Johnson, J. L., Singh, H., Hurton, L., Maiti, S. N., Huls, M. H., Champlin, R. E., Cooper, L. J. & Lee, D. A. (2012). Membrane-bound IL-21 promotes sustained ex vivo proliferation of human natural killer cells. PLoS One 7, 2012.
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Claims (20)
- 유효량의 인간 CISH -/- 자연 살해(NK) 세포 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 필요로 하는 인간 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간 대상체의 질병 또는 감염 치료 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 NK 세포가 유도 만능 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 또는 말초 혈액 세포로부터 유도되는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 CISH -/- NK세포가 대상체에 대해 자가(autologous)인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 방법은 대상체에게 유효량의 1종 이상의 사이토카인을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 사이토카인은 IL-2 및/또는 IL-15이고, 상기 유효량은 본래의 NK 세포 치료에서 요구되는 유효량보다 적은 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 질병은 조혈암 또는 고형 종양인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 감염은 바이러스 또는 미생물에 의해 야기되는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 CISH -/- NK 세포가 본래의 NK 세포에 비하여 개선된 확장, 항종양 기능, 및 항바이러스 기능을 입증하고, 사이토카인 자극에 과민한 방법.
- 인간 CISH -/- NK 세포 및 적어도 1종의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 CISH -/- NK 세포가 유도 만능 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 또는 말초 혈액 세포로부터 유도되는 약학적 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 CISH -/- NK 세포가 유도 만능 줄기 세포로부터 유도되는 약학적 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 CISH -/- NK 세포가 본래의 NK 세포에 비하여 개선된 확장, 항종양 기능, 및 항바이러스 기능을 입증하고, 사이토카인 자극에 과민한 약학적 조성물.
- 제12항에 있어서, 상기 사이토카인 자극은 Il-2 및/또는 IL-15로의 자극을 포함하는 약학적 조성물.
- 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC), 인간 배아 줄기 세포(ESC), 또는 인간 말초 혈액 세포(PBC)에서 CISH 유전자를 결실시키는 단계; 및
생체외 분화 프로토콜을 사용하여 CISH-/- iPSC, ESC 또는 PBC로부터 NK 세포를 유도하는 단계를 포함하는, 인간 CISH -/- NK 세포의 제조 방법. - 제14항에 있어서, 상기 CISH 유전자의 결실은 CRISPR 시스템을 사용하여 달성되는 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 유도하는 단계는 CISH -/- iPSC, ESC 또는 PBC를 80% 초과 CD34+로 분화시키는 단계, 및 그 후, 80% 초과 CD45+ 및 CD56+로 분화시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 제2 분화는 노치 리간드(Notch ligand)와의 접촉으로 발생하는 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 노치 리간드는 OP9-DL4 세포에 의해 제공되는 방법.
- 인간 CISH -/- NK 세포를 포함하는 세포 배양물.
- 제19항에 있어서, 상기 CISH -/- NK 세포가 본래의 NK 세포에 비하여 개선된 확장, 항종양 기능, 및 항바이러스 기능을 입증하고, 사이토카인 자극에 과민한 세포 배양물.
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