JP2021522229A

JP2021522229A - 活性を高めるための免疫細胞改変

Info

Publication number: JP2021522229A
Application number: JP2020558896A
Authority: JP
Inventors: カウフマン，ダン; チュー，ファン
Original assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA; University of California
Current assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA; University of California
Priority date: 2018-05-11
Filing date: 2019-05-13
Publication date: 2021-08-30
Also published as: US20210145883A1; EP3790562A4; WO2019217956A1; EP3790562A1; CN112040960B; CN117959334A; KR20210008047A; CA3100045A1; CN112040960A

Abstract

がん、ウイルスおよび微生物による感染症を治療するための、ＮＫ細胞などの改変免疫細胞の組成物、作製方法および使用方法。改変ＣＩＳＨ^−／−ＮＫ細胞は、ＩＬ−２および／またはＩＬ−１５などのサイトカインに対して高感受性を示し、増殖および抗腫瘍機能を維持する。
【選択図】図３Ａ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年５月１１日に提出された米国仮出願第６２／６７０，０３３号の優先権の利益を主張し、その出願は参照により本明細書に組み込まれる。

政府の関心に関する陳述
本発明は、米国立衛生研究所からの助成金番号ＣＡ２１７８８５およびＣＡ２０３３４８を受けて行われた。政府は本発明に特定の権利を有する。

ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は自然免疫システムの重要な部分であり、抗腫瘍免疫および抗感染免疫におけるリンパ球集団の重要なエフェクターである。しかしながら、腫瘍の進行および慢性感染症は一般にＮＫ細胞の疲弊を引き起こすため、エフェクター機能が低下し、ＮＫ細胞の抗腫瘍／抗感染の可能性が制限される。腫瘍および慢性感染症においてＮＫ細胞の疲弊をもたらす正確なメカニズムは十分に定義されていない。

ＮＫ細胞による異常細胞の検出は、リガンド、ならびにインターロイキン１５（ＩＬ−１５）などのサイトカインからの活性化シグナルおよび抑制シグナルによって制御される。サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳ）は、ＮＫ細胞におけるＩＬ−１５シグナル伝達の重要な負の調節因子であり、ヒトではＣＩＳＨ遺伝子によってコードされる。ＣＩＳＨはＩＬ−１５に応答して急速に誘導され、ＣＩＳＨ遺伝子の欠失により、ＩＬ−１５に対するＮＫ細胞の感受性が高められることが示されている。マウスでの最近の研究では、ＣＩＳがＮＫ細胞による腫瘍免疫における強力な抑制チェックポイントであることが示されている。

ＮＫ細胞は、活性および機能を維持するために、インターロイキン２（ＩＬ−２）およびＩＬ−１５などのサイトカインを必要とするが、ＩＬ−２は全身毒性を引き起こす。したがって、サイトカインがなくても増殖および機能を維持するか、またはサイトカインを低用量しか必要としない、がんおよび他の疾患を治療するための臨床的ＮＫ細胞療法が必要とされている。

本開示は、一般に、がん治療においてＣＩＳＨ^−／−改変ＮＫ細胞を使用するための組成物および方法を提供する。改変ＮＫ細胞は、ＩＬ−２および／またはＩＬ−１５の刺激に対して高感受性を示し、サイトカインまたは増殖因子、例えば、インターロイキンなどが低濃度でも増殖および抗腫瘍機能を維持することができる。

本開示の一態様によれば、非改変天然ＮＫ細胞よりも改善された治療効果を有する、がんおよび他の疾患または感染症を治療するためのＮＫ細胞による治療法の細胞源として使用可能なＣＩＳＨ^−／−改変ＮＫ細胞が提供される。

本開示の一態様によれば、ＣＩＳＨ^−／−ＮＫ細胞の製造方法が提供される。

本開示の別の態様によれば、ＣＩＳＨ^−／−ＮＫ細胞の細胞培養物、およびＣＩＳＨ^−／−ＮＫ細胞を含む医薬組成物が提供される。

本開示の特徴および利点のより良い理解は、本開示の原理が利用される例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明および添付の図面を参照することによって得られるであろう。

通常の方法を用いて、ＮＫの分化に対するＣＩＳＨ喪失の影響を示す。通常の方法を用いて、ＮＫの分化に対するＣＩＳＨ喪失の影響を示す。通常の方法を用いて、ＮＫの分化に対するＣＩＳＨ喪失の影響を示す。改変法を用いて、ＮＫの分化に対するＣＩＳＨ喪失の影響を示す。改変法を用いて、ＮＫの分化に対するＣＩＳＨ喪失の影響を示す。ＣＩＳＨ^−／−ＮＫ細胞の増殖を示す。ＣＩＳＨ^−／−ＮＫ細胞の増殖を示す。ｉｎｃｕｃｙｔｅ細胞死滅アッセイの結果を示す。ｉｎｃｕｃｙｔｅ細胞死滅アッセイの結果を示す。ＣＩＳＨ^−／−ｉＰＳＣ−ＮＫ細胞が、サイトカイン刺激に対し、より高い単一細胞の多機能応答を示すことを示す。ＣＩＳＨ^−／−ｉＰＳＣ−ＮＫ細胞が、サイトカイン刺激に対し、より高い単一細胞の多機能応答を示すことを示す。ＣＩＳＨ^−／−ｉＰＳＣ−ＮＫ細胞が、サイトカイン刺激に対し、より高い単一細胞の多機能応答を示すことを示す。ＣＩＳＨ^−／−ｉＰＳＣ−ＮＫ細胞が、基礎解糖および解糖能の増加を示すことを示す。ＣＩＳＨ^−／−ｉＰＳＣ−ＮＫ細胞が、基礎解糖および解糖能の増加を示すことを示す。ＣＩＳＨ^−／−ｉＰＳＣ−ＮＫ細胞が、基礎解糖および解糖能の増加を示すことを示す。ＣＩＳＨ^−／−ｉＰＳＣ−ＮＫ細胞が、ヒト白血病全身性腫瘍モデルにおいてより優れた抗腫瘍活性を媒介することを示す。ＣＩＳＨ^−／−ｉＰＳＣ−ＮＫ細胞が、ヒト白血病全身性腫瘍モデルにおいてより優れた抗腫瘍活性を媒介することを示す。ＣＩＳＨ^−／−ｉＰＳＣ−ＮＫ細胞が、ヒト白血病全身性腫瘍モデルにおいてより優れた抗腫瘍活性を媒介することを示す。

本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が各々参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかの如く同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。刊行物への引用は、その最新版を参照することが意図される。

本発明の実施は、特に明記しない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技術を使用し、これらは当業者の技量の範囲内である。そのような技術は、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，１９８９）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ、ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＭＪ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ、ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＮｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９９８）ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、ＡｎｉｍａｌＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）、ＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎｔｏＣｅｌｌａｎｄＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒａｎｄＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ、ＣｅｌｌａｎｄＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅ：ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９９３−１９９８）Ｊ．ＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒａｎｄＣＣ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）、ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒＶｅｃｔｏｒｓｆｏｒＭａｍｍａｌｉａｎＣｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒａｎｄＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７）、ＰＣＲ：ＴｈｅＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓｅｔａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎｅｔａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）、ＳｈｏｒｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（ＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，１９９９）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（ＣＡ．ＪａｎｅｗａｙａｎｄＰ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａｐｒａｃｔｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，１９８８−１９８９）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａｐｒａｃｔｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．ＳｈｅｐｈｅｒｄａｎｄＣ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，２０００）、Ｕｓｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ（Ｅ．ＨａｒｌｏｗａｎｄＤ．Ｌａｎｅ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９９９）、ＴｈｅＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．ＺａｎｅｔｔｉａｎｄＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．，ＨａｒｗｏｏｄＡｃａｄｅｍｉｃＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）、およびＣａｎｃｅｒ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＯｎｃｏｌｏｇｙ（Ｖ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａｅｔａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊ．Ｂ．ＬｉｐｐｉｎｃｏｔｔＣｏｍｐａｎｙ，１９９３）などの文献で十分に説明されている。

本発明は、ヒト対象におけるがんなどの疾患または感染症、例えば、ウイルスもしくは細菌によって引き起こされる感染症を治療する方法に関し、ヒトＣＩＳＨ^−／−ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞と薬学的に許容される担体とを含む有効量の医薬組成物を、必要とするヒト対象に投与することを含む。

実施形態では、本発明は、ヒト対象におけるがんを治療する方法に関し、ここで、かかるＮＫ細胞は、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、または末梢血細胞に由来する。

実施形態では、本発明は、ヒト対象におけるがんまたは感染症を治療する方法に関し、ここで、ＣＩＳＨ^−／−ＮＫ細胞は対象にとって自己由来である。

実施形態では、本発明は、ヒト対象におけるがんを治療する方法に関し、ここで、かかる方法は、有効量のサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１５またはその両方）を対象に投与することをさらに含む。

実施形態では、本発明は、ヒト対象におけるがんを治療する方法に関し、ここで、ＩＬ−２および／またはＩＬ−１５の有効量は、天然ＮＫ細胞治療で必要とされる有効量より少ない。実施形態では、ＩＬ−２の低濃度は１〜１０Ｕ／ｍｌ、または約５Ｕ／ｍｌであり、ＩＬ−１５の低濃度は１〜１０ｎｇ／ｍｌ、または約５ｎｇ／ｍｌであり、ＣＩＳＨ^−／−ＮＫ細胞の増殖および抗腫瘍機能を維持するのに有効である。

本発明で使用することができるサイトカインには、天然に存在する、改変されている、および合成的に操作されている、サイトカインおよびサイトカイン様分子（ＡＬＴ−８０３、またはＮＥＫＴＡＲＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．製品、例えば、ＮＫＴＲ−３５８もしくはＮＫＴＲ−２５５）が含まれる。サイトカインには、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１などのインターロイキンが含まれる。

実施形態では、本発明は、ヒト対象におけるがんを治療する方法に関し、ここで、がんは造血器腫瘍または固形腫瘍である。

実施形態では、本発明は、ヒト対象における疾患または感染症を治療する方法に関し、ここで、ＣＩＳＨ^−／−ＮＫ細胞は、サイトカイン刺激に対して高感受性であり、かつ、天然ＮＫ細胞と比較して改善された増殖、抗腫瘍機能、および抗ウイルス機能を示す。

実施形態では、本発明は、ヒトＣＩＳＨ^−／−ＮＫ細胞、および少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物に関する。

実施形態では、本発明は、医薬組成物に関し、ここで、ＣＩＳＨ^−／−ＮＫ細胞は、サイトカイン刺激に対して高感受性であり、かつ、天然ＮＫ細胞と比較して改善された増殖、抗腫瘍機能、および抗ウイルス機能を示す。

実施形態では、本発明は、医薬組成物に関し、ここで、サイトカイン刺激は、ＩＬ−２および／またはＩＬ−１５などのインターロイキンによる刺激を含む。実施形態では、ＩＬ−２の低濃度は１〜１０Ｕ／ｍｌ、または約５Ｕ／ｍｌであり、ＩＬ−１５の低濃度は１〜１０ｎｇ／ｍｌ、または約５ｎｇ／ｍｌであり、ＣＩＳＨ^−／−ＮＫ細胞の増殖および抗腫瘍機能を維持するのに有効である。

実施形態では、本発明は、医薬組成物に関し、ここで、ＣＩＳＨ^−／−ＮＫ細胞は、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、または末梢血細胞に由来する。

実施形態では、本発明は、ＣＩＳＨ^−／−ＮＫ細胞を作製する方法に関し、ヒトの人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）またはヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）からＣＩＳＨ遺伝子を欠失させること、およびインビトロ分化プロトコルを使用してＣＩＳＨ^−／−ｉＰＳＣからＮＫ細胞を誘導することを含む。

実施形態では、本発明は、ＣＩＳＨ^−／−ＮＫ細胞を作製する方法に関し、ここで、ＣＩＳＨ遺伝子の欠失は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムなどのＣＲＩＳＰＲシステムを使用して達成される。

実施形態では、本発明は、ＣＩＳＨ^−／−ＮＫ細胞を作製する方法に関し、ここで、誘導ステップは、ＣＩＳＨ^−／−ｉＰＳＣをＣＤ３４^＋が＞７５％、＞６０％、＞７０％、または＞８０％になるまで分化させ、その後、ＣＤ４５^＋およびＣＤ５６^＋が＞７５％、＞６０％、＞７０％、または＞８０％になるまで分化させることをさらに含む。

実施形態では、本発明は、ＣＩＳＨ^−／−ＮＫ細胞を作製する方法に関し、ここで、第２の分化は、ノッチリガンドと接触、例えば、ノッチリガンドを過剰発現するように操作されているＯＰ９−ＤＬ４細胞と接触して起こる。

実施形態では、本発明は、ＣＩＳＨ^−／−ＮＫ細胞を作製する方法に関し、ここで、細胞培養物はＣＩＳＨ^−／−ＮＫ細胞を含む。

定義
本発明の理解を容易にするため、本明細書で使用されるいくつかの用語および略語を以下のように定義する。

本発明またはその好ましい実施形態（複数可）の要素を紹介するとき、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および「ｓａｉｄ」は、要素のうちの１つ以上が存在することを意味することが意図される。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する」という用語は、包括的であることを意図し、列記される要素以外の追加の要素が存在する可能性があることを意味する。

２つ以上の項目の列挙において「および／または」という用語が使用される場合、列挙された項目のいずれか１つを単独で使用しても、または列挙された項目のいずれか１つ以上と組み合わせて使用してもよいことを意味する。例えば、「Ａおよび／またはＢ」という表現は、ＡおよびＢの一方または両方、すなわち、Ａのみ、Ｂのみ、またはＡとＢの組み合わせを意味することが意図される。「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」という表現は、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡとＢの組み合わせ、ＡとＣの組み合わせ、ＢとＣの組み合わせ、またはＡとＢとＣの組み合わせを意味することが意図される。

本明細書に記載される本発明の態様および実施形態は、態様および実施形態「〜からなる」および／または「本質的に〜からなる」を含むことが理解される。

範囲形式での説明は、便宜上かつ簡潔さのためにすぎず、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の説明は、考えられるすべての部分範囲とその範囲内の個々の数値が具体的に開示されているとみなされるべきである。例えば、１〜６などの範囲の説明は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの部分範囲、ならびにその範囲内の個々の数字、例えば、１、２、３、４、５、および６が具体的に開示されているとみなされるべきである。このことは、範囲の幅に関係なく適用される。また、本明細書では、値または範囲は、「約」、「約」１つの特定の値から、および／または「約」別の特定の値まで、として表されうる。そのような値または範囲が表される場合、開示される他の実施形態は、１つの特定の値から、および／または他の特定の値まで、列挙された特定の値を含む。同様に、先行詞「約」を使用することによって値が近似値として表される場合、特定の値が別の実施形態を形成することが理解されよう。本明細書で開示される値がいくつかあり、各値が、本明細書では、値自体に加えて、「約」その特定の値としても開示されることがさらに理解されよう。実施形態では、「約」は、例えば、列挙された値の１０％以内、列挙された値の５％以内、または列挙された値の２％以内を意味するために使用されうる。

本明細書で使用する場合、「患者」または「対象」は、治療されるヒトまたは動物の対象を意味する。

本明細書で使用する場合、「増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）」または「増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）」は、細胞または細胞の集団が数を増加させる能力を指す。

本明細書で使用する場合、「精製細胞集団」または「精製細胞組成物」を含有する組成物は、組成物中の細胞の少なくとも３０％、５０％、６０％、典型的に少なくとも７０％、より好ましくは８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはそれ以上が、特定された種類のものである。

本明細書で使用する場合、「治療上有効な」とは、がんなどの疾患、または感染などの状態に関連する症状を、治療もしくは改善する、または何らかの方法で軽減するのに十分なＮＫ細胞の量を指す。方法に関して使用する場合、その方法は、疾患または状態に関連する症状を、治療もしくは改善する、または何らかの方法で軽減するのに十分有効である。例えば、疾患に関して有効量とは、その発症を阻止または予防するのに十分な量であるか、あるいは疾患病状が始まっている場合は、その疾患の進行を緩和する、改善する、安定化させる、回復に向かわせる、もしくは遅らせるか、またはその疾患の病理学的結果を低減させる量である。いずれの場合も、有効量は単回投与で与えても分割投与で与えてもよい。

本明細書で使用する場合、「治療」という用語は、患者の疾患または状態に関連する症状を少なくとも改善することを包含し、その場合、改善とは、広い意味で使用され、治療されている状態に関連する症状などのパラメータが少なくとも低下することを指す。したがって、「治療」には、疾患、障害、または病的状態、または少なくともそれらに関連する症状が、完全に抑制される（例えば、発生が予防される）かまたは停止され（ｓｔｏｐｐｅｄ）（例えば、停止（ｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ））、患者がそれ以上その状態、または少なくともその状態を特徴付ける症状に苦しむことがないようにする状況が含まれる。

本明細書で使用する場合、「医薬組成物」という用語は、薬学的に許容される組成物を指し、ここで、かかる組成物はＮＫ細胞を含み、いくつかの実施形態では薬学的に許容される担体をさらに含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は組み合わせであってよい。

本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される」という用語は、動物、より具体的にはヒトおよび／または非ヒト哺乳動物での使用に安全な他の製剤に加えて、連邦政府もしくは州政府の規制当局によって承認されていること、または米国薬局方、一般に認められている他の薬局方に収載されていることを意味する。

本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、ＮＫ細胞とともに投与される、賦形剤、希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、および／またはビヒクルを指す。そのような担体は、水および油などの無菌液体であってよく、油としては、石油、動物、植物、または合成に由来する油、例えば、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油等、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒が挙げられる。ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張度を調整するための薬剤もまた、担体であり得る。担体と組み合わせて組成物を作成する方法は、当業者に既知である。いくつかの実施形態では、「薬学的に許容される担体」という用語は、医薬投与に適合する、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、等張剤、および吸収遅延剤などを含むことを意図する。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野で周知である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈｅｄ．，（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ２００３）を参照のこと。従来の媒体または薬剤が活性化合物と適合しない場合を除き、組成物におけるそのような使用が企図される。

「組み合わせ」という用語は、１つの投薬単位形態における固定された組み合わせ、または、組み合わせ投与のためのパーツのキットのいずれかを指し、キットの場合は、ＮＫ細胞と組み合わせパートナー（例えば、「治療薬」または「補助薬剤」とも呼ばれる、以下で説明される別の薬物）を、独立して、同時または時間間隔内で別々に投与することができる。いくつかの状況では、組み合わせパートナーは協同的効果、例えば、相乗効果を示す。本明細書で使用される「併用投与（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」または「併用投与（ｃｏｍｂｉｎｅｄａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」などの用語は、選択された組み合わせパートナーを、それを必要とする単一の対象（例えば、患者）に投与することが包含されることを意味し、薬剤が必ずしも同じ投与経路または同じ時間で投与されるわけではない治療レジメンが含まれることを意図する。本明細書で使用される「医薬の組み合わせ」という用語は、２つ以上の活性成分の混合または組み合わせにより得られ、活性成分の組み合わせが固定されているものも固定されていないものも含まれる製品を意味する。「固定された組み合わせ」という用語は、活性成分、例えば、化合物および組み合わせパートナーの両方が単一の実体または用量の形態で同時に患者に投与されることを意味する。「固定されていない組み合わせ」という用語は、有効成分、例えば、化合物および組み合わせパートナーの両方が、特定の時間的制約を設けることなく別々の実体として同時に（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、同時に（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔｌｙ）、または連続して患者に投与されることを意味し、ここで、そのような投与により、２つの化合物が治療上有効な濃度で患者の体内で提供される。後者は、カクテル療法、例えば、３つ以上の活性成分の投与にも適用される。

サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳ）は、ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化により誘導される疲弊を調節する上で重要な役割を果たし、マウス系での研究とは異なり、ＣＩＳＨ欠失（ＣＩＳＨ^−／−）によりＮＫ細胞活性の低下がもたらされる。現在開示されている、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）でのＣＩＳＨ欠失モデルは、ヒトＮＫ細胞の発達、機能、活性化、持続、および疲弊のＣＩＳＨ媒介調節をさらに詳細に分析するモデルを提供する。他の実施形態では、ＣＩＳＨ遺伝子の欠失は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）で起こる。実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＩＳＨ^−／−のｉＰＳＣまたはｈＥＳＣに由来する。本明細書では、ＮＫ細胞またはＴ細胞などの免疫細胞の発達を調節するため、および免疫細胞の疲弊を抑制するための組成物および方法が提供される。

本発明は、細胞をノッチリガンドとともに培養する、例えば、ノッチリガンドを過剰発現するＯＰ９−ＤＬ４細胞の培養層とともに培養することによってＣＩＳＨ^−／−ＮＫの疲弊を予防または阻害できることを提供する。代替のノッチリガンド源が公知であり、細胞結合材料またはプレート結合／無細胞の材料が含まれる。

本開示は、ゲノム編集ツール、例えば、多種多様な生物で使用可能な、クラスター化され規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）システムなど（例えば、特定遺伝子の配列の不可、破壊、または変更に使用）に一部基づいている。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは２つの要素に基づいている。第１の要素であるＣａｓ９は、ガイドポリヌクレオチド（例えば、ガイドＲＮＡ）である第２の要素が結合する部位を持つエンドヌクレアーゼである。ガイドポリヌクレオチド（例えば、ガイドＲＮＡ）は、Ｃａｓ９タンパク質を配列相同性に基づいて二本鎖ＤＮＡ鋳型に誘導する。次に、Ｃａｓ９タンパク質はそのＤＮＡ鋳型を切断する。Ｃａｓ９タンパク質および適切なガイドポリヌクレオチド（ガイドＲＮＡなど）を細胞に送達することにより、生物のゲノムが所望の位置で切断される。Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体による目的ゲノム配列の切断後、２つの代替的ＤＮＡ修復メカニズム、すなわち、１）ｇＲＮＡ切断部位にてＤＮＡの少数の塩基対（ｂｐ）の挿入および／または欠失を生じさせる非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、または２）ｇＲＮＡ切断部位にまたがる追加の「つなぎ」ＤＮＡ鋳型を介して損傷部位を修正することができる相同組換え修復（ＨＤＲ）のうちどちらかにより染色体の完全性が復元されうる。当業者に知られているＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのさらなる態様は、ＰＣＴ公開第２０１７／０４９２６６号に記載されており、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。ＣＩＳＨ^−／−ＮＫ細胞を作製するための、これらおよび他の周知の新しい技術、例えば、ＴＡＬＥＮなどは、本発明によって企図される。本発明はまた、造血細胞、例えば、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、および他の免疫細胞などを用いた、組成物、使用方法および製造方法を企図する。

ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）のＣＩＳＨ遺伝子を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用して破壊し、ＣＩＳＨ^−／−ｉＰＳＣからのＮＫ細胞を、２段階インビトロ分化プロトコルを使用して誘導した。造血前駆細胞への分化の最初の段階は、ＷＴまたはＣＩＳＨ^−／−のｉＰＳＣいずれかを使用して正常（ＣＤ３４^＋細胞が＞８０％）であった。ｉＰＳＣのＣＩＳＨを欠失させたところ、インビトロでのＮＫ細胞分化の第２段階が遅延した（図１および図２）。具体的には、ＷＴｉＰＳＣを使用すると、典型的に４週間後に９０％超のＮＫ細胞でＮＫ細胞の分化が完全に完了するが、ＣＩＳＨ^−／−ｉＰＳＣ由来の細胞では、５週目でＮＫ細胞が８０％超となったものの、４週目ではＣＤ４５^＋ＣＤ５６^＋のＮＫ細胞が１０％しか産生されなかった。この時点を過ぎると、ＣＩＳＨ^−／−ｉＰＳＣ由来のＮＫ細胞は表現型が成熟しており、ＣＤ９４、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６などの典型的なＮＫ表面マーカーの発現を示した。

ＣＩＳＨは、ＮＫ細胞に媒介される腫瘍免疫における強力な細胞内抑制チェックポイントである。ヒトｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞でＣＩＳＨ遺伝子を欠失させたところ、ＮＫ細胞がサイトカインに対して高感受性になり、それにより腫瘍に対するそれらの細胞傷害性が増強された（図３Ａ〜４Ｂ）。未改変ヒトＮＫ細胞と比較して、ＣＩＳＨノックアウトヒトＮＫ細胞は、がん、ウイルスおよび微生物による感染症を治療するための適応性細胞療法の細胞源として使用される場合、ヒト患者においてより優れた持続性ならびに抗腫瘍、抗ウイルス、および抗微生物という効果がある。

作製されたＣＩＳＨ^−／−ヒトｉＰＳＣ−ＮＫ細胞は、ＩＬ−２／ＩＬ−１５刺激に対する高感受性、ならびに低濃度のＩＬ−２（５Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−１５（５ｎｇ／ｍｌ）で増殖および抗腫瘍機能を維持する能力を示した（図３Ａおよび３Ｂ）。ＣＩＳＨ^−／−ｉＰＳＣ−ＮＫ細胞は、低濃度のＩＬ−２（５Ｕ／ｍｌ）とＩＬ−１５（５ｎｇ／ｍｌ）でもインビトロで３週間以上増殖および細胞傷害性機能を維持することができた。

既存の技術と比較して、遺伝子を改変したｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞は、生体内で未改変ＮＫ細胞よりも長く増殖および持続が可能であるため、より優れた抗腫瘍効果がある。既存のＮＫ細胞療法では、末梢血から得られるＮＫ細胞（ＰＢ−ＮＫ細胞）またはｉＰＳＣ由来の未改変ＮＫ細胞である未改変ＮＫ細胞を使用するが、その場合、増殖および抗腫瘍機能を維持するために典型的に高用量のＩＬ−２および／またはＩＬ−１５の投与を必要とする。しかしながら、高濃度のＩＬ−２および／またはＩＬ−１５には高い毒性があるという臨床データが報告されている。したがって、ＣＩＳＨ^−／−ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞は、増殖および抗腫瘍機能を維持するためのＩＬ−２および／もしくはＩＬ−１５または他のサイトカインが低用量で済むことにより、ＩＬ−２および／またはＩＬ−１５によって生じる毒性が軽減されるため、ＮＫ細胞療法で有益に使用することができる。

ＣＩＳＨ^−／−ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞は、改善された単一細胞多機能性を示す。図５Ａは、Ｉｓｏｐｌｅｘｉｓ３２−ｐｌｅｘ、免疫サイトカイン応答パネル、細胞傷害性機能に関与する５つのエフェクターサイトカイン（グランザイムＢ、ＩＦＮγ、ＭＩＰ−１α、パーフォリン、ＴＮＦα）を使用した単一細胞サイトカイン産生分析を示す。図５Ｂは、図５Ａに示される２つ以上のサイトカインを分泌する試料のパーセンテージを示す。図５Ｃは、多機能性は、恒常性／増殖性、炎症性、走化性、調節性、および免疫エフェクターという主要なカテゴリーにまたがる３２の主要な免疫学的関連分子の事前に指定されたパネルにまたがって、多機能性強度指数（ＰＳＩ）により測定されたことを示している。ＣＡＲ−Ｔ細胞の多機能性（既に使用した同じアッセイのＩｓｏｐｌｅｘｉｓ３２−ｐｌｅｘにより測定）は臨床転帰と正に相関していた。ＣＩＳＨ^−／−ｉＰＳＣ−ＮＫ細胞の多機能性の増大から、未改変の野生型ＮＫ細胞と比較して優れた抗腫瘍活性が説明される。

ＣＩＳＨ^−／−ｉＰＳＣ−ＮＫ細胞は、基礎解糖および解糖能の増大を示す。図６Ａは、ＳｅａｈｏｒｓｅＸＦＧｌｙｃｏｌｙｔｉｃＲａｔｅＡｓｓａｙＫｉｔを使用して測定された細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）を示す。図６Ｂは、基礎解糖速度の定量化を示している。図６Ｃは、解糖能の定量化を示している。細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）は、グルコース代謝率の指標である。このデータは、ＣＩＳＨ^−／−のｉＰＳＣ−ＮＫ細胞でグルコース代謝が改善していることを示し、これは、ＣＩＳＨ^−／−ｉＰＳＣ−ＮＫ細胞の機能改善による機序でありうる（改善されたグルコース代謝は機能増大に寄与することが報告された）。

ＣＩＳＨ^−／−ｉＰＳＣ−ＮＫは、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を発現する５×１０^６のＭｏｌｍ１３細胞をＩＰ接種したＮＳＧマウスの生体内で優れた抗腫瘍活性を示す。腫瘍移植の１日後、マウスを未処置のままにするか、または１０×１０^６のＷＴ−ｉＰＳＣ−ＮＫ細胞もしくはＣＩＳＨＫＯ−ｉＰＳＣ−ＮＫ細胞で処置した。週１回、３週間のＩＬ−２注射でＮＫ細胞を支持し、ＩＶＩＳイメージングを毎週行って腫瘍負荷を追跡した。図７ＡはＩＶＩＳ画像を示す。図７Ｂは、各群の生存曲線を示す。このデータは、ＣＩＳＨ^−／−ｉＰＳＣ−ＮＫ細胞が異種移植腫瘍モデルにおいて抗腫瘍活性を改善したことを示している。

実施形態では、ＣＩＳＨ^−／−ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞療法のための改善された治療用細胞源として使用される。

実施形態では、ＣＩＳＨ^−／−ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞をインビトロで増殖させ、とりわけ、がん、ウイルス性および微生物性疾患の治療レジメンの一部として投与するのに十分な数の細胞を得る。

実施形態では、ＣＩＳＨ^−／−ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞は、未改変の末梢血ＮＫ細胞を使用するＮＫ細胞による治療法を用いた過去の臨床研究と同様の方法で患者に投与される。実施形態では、ｗｔＮＫ細胞による従来の治療と比較して低濃度のサイトカイン刺激、例えば、ＩＬ−２およびＩＬ−１５による刺激が使用される。実施形態では、ＩＬ−２の低濃度は１〜１０Ｕ／ｍｌ、または約５Ｕ／ｍｌであり、ＩＬ−１５の低濃度は１〜１０ｎｇ／ｍｌ、または約５ｎｇ／ｍｌであり、ＣＩＳＨ^−／−ＮＫ細胞の増殖および抗腫瘍機能を維持するのに有効である。

実施形態では、ＣＩＳＨ^−／−ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞は、難治性悪性腫瘍の治療レジメン、例えば、限定するわけではないが、難治性のがん、血液悪性腫瘍および固形腫瘍の両方の治療などの一部として患者に投与される。

方法
造血とＮＫ分化Ｉ：
ＣＩＳＨＫＯｈｉＰＳＣを最初に造血前駆細胞に分化させ、次に、ＮＫ細胞に分化させた^１，２。手短に言えば、６日目にＥＢ内にＣＤ３４＋細胞が出現した時点で、ＥＢをＮＫ細胞分化に移行させた。手短に言えば、造血前駆細胞を、ダルベッコ改変イーグル培地／ＨａｍＦ１２の２：１混合物（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，１１９６５０９２，１１７６５０５４）、２ｍＭのＬ−グルタミン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，２５０３００８１）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，１５１４０１２２）、２５μＭのβ−メルカプトエタノール（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，２１９８５０２３）、２０％熱非働化ヒト血清ＡＢ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，Ｕ．Ｓ．，ＭＴ３５０６０ＣＩ）、５ｎｇ／ｍＬの亜セレン酸ナトリウム（ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，Ｓ５２６１）、５０μＭのエタノールアミン（ＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，ＩＣＮ１９３８４５９０）、２０ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸（ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，Ａ４５４４）、インターロイキン３（ＩＬ−３；Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓＭｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，２０３−ＩＬ）；１週目のみ）、幹細胞因子（ＳＣＦ；Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓＭｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，７４６６−ＳＣ）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５；Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，２４７−ＩＬＢ）、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ；Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓＭｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，３０８−ＦＫ）、およびインターロイキン７（ＩＬ−７；Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓＭｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，２０７−ＩＬ）を含有するＮＫ細胞分化培地に移した。その後、細胞をこれらの条件に２１日間放置し、培地交換を毎週行った。

ＮＫ分化ＩＩ：
ＮＫ分化培地（ＮＫ分化Ｉ）で２１日の後、浮遊細胞を採取し、間質細胞ＯＰ９−ＤＬ４（ＤＬ４、ノッチリガンドを過剰発現するＯＰ９細胞）を含む６ウェルプレートに１４日間移し、フローサイトメトリーで測定してＣＤ４５＋ＣＤ５６＋ＣＤ３３− ＣＤ３−の細胞に発達するまで毎週培地交換を行った。

増殖
分化後、照射されたＫ５６２−ＩＬ２１−４−１ＢＢＬ^３，４を使用してＮＫ細胞を増殖させた。手短に言えば、非接着性細胞を除去し、フローサイトメトリーで分析して、ＣＤ５６＋のＮＫ細胞の純度を決定した。その後、これらの細胞を、２：１のａＡＰＣ（１０，０００Ｇｙで照射）とＮＫ細胞を用い、３５０，０００ＮＫ細胞／培地１ｍＬ（ＲＰＭＩ１６４０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，１１８７５０８５）、２ｍＭのＬ−グルタミン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，２５０３００８１）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，１５１４０１２２）、１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，１１１４００５０）および１０％標準ＦＢＳまたは１０％ヒト血清ＡＢ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，１０１００１４７）を含有）にて刺激した。これには、５０〜１００Ｕ／ｍＬのＩＬ２（Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ、６５４８３０１１６０７）が添加されていた。

参考文献
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Claims

ヒトＣＩＳＨ^−／−ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および薬学的に許容される担体を含む有効量の医薬組成物を、必要とするヒト対象に投与することを含む、ヒト対象の疾患または感染症を治療する方法。
前記ＮＫ細胞が、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞または末梢血細胞に由来する、請求項１に記載の方法。
前記ＣＩＳＨ^−／−ＮＫ細胞が前記対象にとって自己由来である、請求項１に記載の方法。
前記方法が、有効量の１つ以上のサイトカインを前記対象に投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
前記サイトカインがＩＬ−２および／またはＩＬ−１５であり、前記有効量が天然ＮＫ細胞による治療で必要とされる有効量より少ない、請求項４に記載の方法。
前記疾患が造血器がんまたは固形腫瘍である、請求項１に記載の方法。
前記感染症がウイルスまたは微生物によって引き起こされる、請求項１に記載の方法。
前記ＣＩＳＨ^−／−ＮＫ細胞がサイトカイン刺激に対して高感受性であり、かつ、天然ＮＫ細胞と比較して改善された増殖、抗腫瘍機能および抗ウイルス機能を示す、請求項１に記載の方法。
ヒトＣＩＳＨ^−／−ＮＫ細胞および少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
前記ＣＩＳＨ^−／−ＮＫ細胞が人工多能性幹細胞、胚性幹細胞または末梢血細胞に由来する、請求項９に記載の医薬組成物。
前記ＣＩＳＨ^−／−ＮＫ細胞が人工多能性幹細胞に由来する、請求項９に記載の医薬組成物。
前記ＣＩＳＨ^−／−ＮＫ細胞がサイトカイン刺激に対して高感受性であり、かつ、天然ＮＫ細胞と比較して改善された増殖、抗腫瘍機能および抗ウイルス機能を示す、請求項９に記載の医薬組成物。
前記サイトカイン刺激が、Ｉｌ−２および／またはＩＬ−１５による刺激を含む、請求項１２に記載の医薬組成物。
ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）またはヒト末梢血細胞（ＰＢＣ）からＣＩＳＨ遺伝子を欠失させることと、
インビトロ分化プロトコルを使用して、前記ＣＩＳＨ^−／−ｉＰＳＣ、ＥＳＣまたはＰＢＣからＮＫ細胞を誘導することと、を含む、ヒトＣＩＳＨ^−／−ＮＫ細胞を作製する方法。
前記ＣＩＳＨ遺伝子の欠失がＣＲＩＳＰＲシステムを使用して達成される、請求項１４に記載の方法。
前記誘導ステップが、前記ＣＩＳＨ^−／−ｉＰＳＣ、ＥＳＣまたはＰＢＣをＣＤ３４^＋が８０％超になるまで分化させ、次にＣＤ４５^＋およびＣＤ５６^＋が８０％超になるまで分化させることをさらに含む、請求項１４に記載のＣＩＳＨ^−／−ＮＫ細胞を作製する方法。
前記第二の分化がノッチリガンドと接触して起こる、請求項１６に記載の方法。
前記ノッチリガンドがＯＰ９−ＤＬ４細胞によってもたらされる、請求項１７に記載の方法。
ヒトＣＩＳＨ^−／−ＮＫ細胞を含む細胞培養物。
前記ＣＩＳＨ^−／−ＮＫ細胞がサイトカイン刺激に対して高感受性であり、天然ＮＫ細胞と比較して改善された増殖、抗腫瘍機能、および抗ウイルス機能を示す、請求項１９に記載の細胞培養物。