CN114929250A - 用于疗法的经工程化的细胞 - Google Patents

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J·二世·穆
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Abstract

描述了在包含激活素的培养基中培养胚胎干细胞、诱导型多能干细胞和/或分化的细胞的方法。在一个方面，本披露的特征在于多能人干细胞，其中所述干细胞包含：(i)导致细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)的功能丧失的基因组编辑和(ii)导致TGFβ信号传导通路的激动剂的功能丧失的基因组编辑，或导致腺苷A2a受体的功能丧失的基因组编辑。

Description

用于疗法的经工程化的细胞
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年12月18日提交的美国临时申请号62/950,063、2020年5月15日提交的美国临时申请号63/025,735和2020年11月18日提交的美国临时申请号63/115,592的权益，所有这些申请的内容以其整体在此并入本文。
背景技术
仍然需要用于治疗性干预的经工程化的细胞，以及培养干细胞(例如胚胎干细胞和诱导型多能细胞)的方法，从而保持多能性。
发明内容
在一个方面，本披露的特征在于多能人干细胞，其中该干细胞包含：(i)导致细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)的功能丧失的基因组编辑和(ii)导致TGFβ信号传导通路的激动剂的功能丧失的基因组编辑，或导致腺苷A2a受体(ADORA2A)的功能丧失的基因组编辑。在一些实施例中，干细胞包含导致TGFβ信号传导通路的激动剂的功能丧失的基因组编辑和导致ADORA2A的功能丧失的基因组编辑。
在一些实施例中，干细胞包含导致TGFβ受体的功能丧失或TGFβ受体的显性失活变体的基因组编辑。在一些实施例中，TGFβ受体是TGFβ受体II(TGFβRII)。
在一些实施例中，干细胞表达一种或多种选自下组的多能性标志物，该组由以下组成：SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-49/6E、ALP、Sox2、E-钙粘蛋白、UTF-1、Oct4、Rex1和Nanog。
在一些实施例中，本披露以分化的细胞为特征，其中分化的细胞是本文所述的多能人干细胞的子细胞。在一些实施例中，分化的细胞是免疫细胞。在一些实施例中，分化的细胞是淋巴细胞。在一些实施例中，分化的细胞是自然杀伤细胞。在一些实施例中，干细胞是人诱导型多能干细胞(iPSC)，并且其中分化的子细胞是iNK细胞。在一些实施例中，细胞：(a)不表达内源CD3、CD4和/或CD8；并(b)表达至少一种编码以下的内源基因：(i)CD56(NCAM)、CD49、CD43和/或CD45，或其任何组合；(ii)NK细胞受体免疫球蛋白γFc区受体III(FcγRIII，分化簇16(CD16))；(iii)自然杀伤组-2成员D(NKG2D)；(iv)CD69；(v)天然细胞毒性受体；或其两种或更多种的任何组合。
在一些实施例中，本文所述的任何细胞包含一个或多个另外的基因组编辑。在一些实施例中，细胞(1)包含至少一个基因组编辑，其特征在于外源核酸表达构建体，该外源核酸表达构建体包含编码以下的核酸序列：(i)嵌合抗原受体(CAR)；(ii)FcγRIII(CD16)或FcγRIII(CD16)的变体(例如，非天然存在的变体)(iii)白介素15(IL-15)；(iv)IL-15受体(IL-15R)激动剂，或IL-15受体的组成型活性变体；(v)IL-12受体(IL-12R)激动剂，或IL-12受体的组成型活性变体；(vi)IL-12受体(IL-12R)激动剂，或IL-12受体的组成型活性变体；(vii)人白细胞抗原G(HLA-G)；(viii)人白细胞抗原E(HLA-E)；(ix)白细胞表面抗原分化簇CD47(CD47)；或其两种或更多种的任何组合；和/或(2)包含至少一种导致以下中至少一种的功能丧失的基因组编辑：(i)ADORA2A；(ii)具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)；(iii)β-2微球蛋白(B2M)；(iv)程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)；(v)II类主要组织相容性复合体反式激活因子(CIITA)；(vi)自然杀伤细胞受体NKG2A(自然杀伤组2A)；(vii)两种或更多种HLA II类组织相容性抗原α链基因，和/或两种或更多种HLA II类组织相容性抗原β链基因；(viii)分化簇32B(CD32B，FCGR2B)；(ix)T细胞受体α恒定区(TRAC)；或其两种或更多种的任何组合。
在另一个方面，本披露的特征在于人诱导型多能干细胞(iPSC)，其中iPSC包含导致腺苷A2a受体(ADORA2A)的功能丧失的基因组编辑。在一些实施例中，iPSC包含导致TGFβ信号传导通路的激动剂的功能丧失的基因组编辑或导致细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)的功能丧失的基因组编辑。在一些实施例中，iPSC包含导致TGFβ信号传导通路的激动剂的功能丧失的基因组编辑和导致CISH的功能丧失的基因组编辑。
在一些实施例中，iPSC包含导致TGFβ受体的功能丧失或TGFβ受体的显性失活变体的基因组编辑。在一些实施例中，TGFβ受体是TGFβ受体II(TGFβRII)。
在一些实施例中，iPSC表达一种或多种选自下组的多能性标志物，该组由以下组成：SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-49/6E、ALP、Sox2、E-钙粘蛋白、UTF-1、Oct4、Rex1和Nanog。
在一些实施例中，本披露以分化的细胞为特征，其中分化的细胞是本文所述的人iPSC的子细胞。在一些实施例中，分化的细胞是免疫细胞。在一些实施例中，分化的细胞是淋巴细胞。在一些实施例中，分化的细胞是自然杀伤细胞。在一些实施例中，分化的子细胞是iNK细胞。在一些实施例中，细胞：(a)不表达内源CD3、CD4和/或CD8；并(b)表达至少一种编码以下的内源基因：(i)CD56(NCAM)、CD49、CD43和/或CD45，或其任何组合；(ii)NK细胞受体免疫球蛋白γFc区受体III(FcγRIII，分化簇16(CD16))；(iii)自然杀伤组-2成员D(NKG2D)；(iv)CD69；(v)天然细胞毒性受体；或其两种或更多种的任何组合。
在一些实施例中，本文所述的任何细胞包含一个或多个另外的基因组编辑。在一些实施例中，细胞：(1)包含至少一个基因组编辑，其特征在于外源核酸表达构建体，该外源核酸表达构建体包含编码以下的核酸序列：(i)嵌合抗原受体(CAR)；(ii)FcγRIII(CD16)或FcγRIII(CD16)的变体(例如，非天然存在的变体)；(iii)白介素15(IL-15)；(iv)IL-15受体(IL-15R)激动剂，或IL-15受体的组成型活性变体；(v)IL-12受体(IL-12R)激动剂，或IL-12受体的组成型活性变体；(vi)IL-12受体(IL-12R)激动剂，或IL-12受体的组成型活性变体；(vii)人白细胞抗原G(HLA-G)；(viii)人白细胞抗原E(HLA-E)；(ix)白细胞表面抗原分化簇CD47(CD47)；或其两种或更多种的任何组合；和/或(2)包含至少一种导致以下中至少一种的功能丧失的基因组编辑：(i)细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)；(ii)具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)；(iii)β-2微球蛋白(B2M)；(iv)程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)；(v)II类主要组织相容性复合体反式激活因子(CIITA)；(vi)自然杀伤细胞受体NKG2A(自然杀伤组2A)；(vii)两种或更多种HLA II类组织相容性抗原α链基因，和/或两种或更多种HLA II类组织相容性抗原β链基因；(viii)分化簇32B(CD32B，FCGR2B)；(ix)T细胞受体α恒定区(TRAC)；或其两种或更多种的任何组合。
在一些实施例中，使用包含靶向结构域序列的指导RNA产生导致本文所述的任何细胞中CISH的功能丧失的基因组编辑，该靶向结构域序列包含根据SEQ ID NO:258-364、1155和1162中任一个的核苷酸序列或由其组成。在一些实施例中，使用包含靶向结构域序列的指导RNA产生导致本文所述的任何细胞中CISH的功能丧失的基因组编辑，该靶向结构域序列包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:258-364、1155和1162中任一个相同或相差不超过1、2或3个核苷酸的核苷酸序列。在一些实施例中，使用指导RNA产生导致本文所述的任何细胞中CISH的功能丧失的基因组编辑，该指导RNA包含(i)包含SEQ ID NO:1155或1162的核苷酸序列或由其组成的靶向结构域序列，和(ii)表3中描述的5'延伸序列。在一些实施例中，使用指导RNA产生导致本文所述的任何细胞中CISH的功能丧失的基因组编辑，该指导RNA包含(i)包含SEQ ID NO:1155或1162的核苷酸序列或由其组成的靶向结构域序列，(ii)位于靶向结构域序列5'的支架序列，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:1153的核苷酸序列，以及(iii)在支架序列5'的SEQ ID NO:1154的核苷酸序列。
在一些实施例中，使用包含靶向结构域序列的指导RNA产生导致本文所述的任何细胞中TGFβRII的功能丧失的基因组编辑，该靶向结构域序列包含根据SEQ ID NO:29-257、1157和1161中任一个的核苷酸序列或由其组成。在一些实施例中，使用包含靶向结构域序列的指导RNA产生导致本文所述的任何细胞中TGFβRII的功能丧失的基因组编辑，该靶向结构域序列包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:29-257、1157和1161中任一个相同或相差不超过1、2或3个核苷酸的核苷酸序列。在一些实施例中，使用指导RNA产生导致本文所述的任何细胞中TGFβRII的功能丧失的基因组编辑，该指导RNA包含(i)包含SEQ ID NO:1157或1161的核苷酸序列或由其组成的靶向结构域序列，和(ii)表3中描述的5′延伸序列。在一些实施例中，使用指导RNA产生导致本文所述的任何细胞中TGFβRII的功能丧失的基因组编辑，该指导RNA包含(i)包含SEQ ID NO:1157或1161的核苷酸序列或由其组成的靶向结构域序列，(ii)位于靶向结构域序列5'的支架序列，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:1153的核苷酸序列，以及(iii)在支架序列5′的SEQ ID NO:1154的核苷酸序列。
在一些实施例中，使用包含靶向结构域序列的指导RNA产生导致本文所述的任何细胞中ADORA2A的功能丧失的基因组编辑，该靶向结构域序列包含根据SEQ ID NO:827-1143、1159和1163中任一个的核苷酸序列或由其组成。在一些实施例中，使用包含靶向结构域序列的指导RNA产生导致本文所述的任何细胞中ADORA2A的功能丧失的基因组编辑，该靶向结构域序列包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:827-1143、1159和1163中任一个相同或相差不超过1、2或3个核苷酸的核苷酸序列。在一些实施例中，使用指导RNA产生导致本文所述的任何细胞中ADORA2A的功能丧失的基因组编辑，该指导RNA包含(i)包含SEQ ID NO:1159或1163的核苷酸序列或由其组成的靶向结构域序列，和(ii)表3中描述的5'延伸序列。在一些实施例中，使用指导RNA产生导致本文所述的任何细胞中ADORA2A的功能丧失的基因组编辑，该指导RNA包含(i)包含SEQ ID NO:1159或1163的核苷酸序列或由其组成的靶向结构域序列，(ii)位于靶向结构域序列5′的支架序列，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:1153的核苷酸序列，以及(iii)在支架序列5′的SEQ ID NO:1154的核苷酸序列。
在一些实施例中，使用核糖核蛋白(RNP)复合物产生导致本文所述的任何细胞中CISH的功能丧失的基因组编辑，该RNP包含(i)RNA指导的核酸酶(例如，Cas12a变体，例如，包含选自M537R、F870L和H800A的1、2或3个氨基酸取代的Cas12a变体，例如，包含与SEQ IDNO:1148有90％、95％或100％同一性的氨基酸序列的Cas12a变体)和(ii)包含靶向结构域序列的指导RNA，该靶向结构域序列包含以下或由以下组成：根据SEQ ID NO:258-364、1155和1162中任一个的核苷酸序列。在一些实施例中，使用核糖核蛋白(RNP)复合物产生导致本文所述的任何细胞中CISH的功能丧失的基因组编辑，该RNP包含(i)RNA指导的核酸酶(例如，Cas12a变体，例如，包含选自M537R、F870L和H800A的1、2或3个氨基酸取代的Cas12a变体，例如，包含与SEQ ID NO:1148有90％、95％或100％同一性的氨基酸序列的Cas12a变体)和(ii)包含靶向结构域序列的指导RNA，该靶向结构域序列包含以下或由以下组成：与SEQID NO:258-364、1155和1162中任一个相同或相差不超过1、2或3个核苷酸的核苷酸序列。在一些实施例中，使用核糖核蛋白(RNP)复合物产生导致本文所述的任何细胞中CISH的功能丧失的基因组编辑，该RNP包含(i)RNA指导的核酸酶(例如，Cas12a变体，例如，包含选自M537R、F870L和H800A的1、2或3个氨基酸取代的Cas12a变体，例如，包含与SEQ ID NO:1148有90％、95％或100％同一性的氨基酸序列的Cas12a变体)和(ii)指导RNA，该指导RNA包含(i)包含SEQ ID NO:1155或1162的核苷酸序列或由其组成的靶向结构域序列，和(ii)表3中描述的5′延伸序列。在一些实施例中，使用核糖核蛋白(RNP)复合物产生导致本文所述的任何细胞中CISH的功能丧失的基因组编辑，该RNP包含(i)RNA指导的核酸酶(例如，Cas12a变体，例如，包含选自M537R、F870L和H800A的1、2或3个氨基酸取代的Cas12a变体，例如，包含与SEQ ID NO:1148有90％、95％或100％同一性的氨基酸序列的Cas12a变体)和(ii)指导RNA，该指导RNA包含(i)包含SEQ ID NO:1155或1162的核苷酸序列或由其组成的靶向结构域序列，(ii)位于靶向结构域序列5'的支架序列，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:1153的核苷酸序列，以及(iii)在支架序列5'的SEQ ID NO:1154的核苷酸序列。
在一些实施例中，使用核糖核蛋白(RNP)复合物产生导致本文所述的任何细胞中TGFβRII的功能丧失的基因组编辑，该RNP包含(i)RNA指导的核酸酶(例如，Cas12a变体，例如，包含选自M537R、F870L和H800A的1、2或3个氨基酸取代的Cas12a变体，例如，包含与SEQID NO:1148有90％、95％或100％同一性的氨基酸序列的Cas12a变体)和(ii)包含靶向结构域序列的指导RNA，该靶向结构域序列包含以下或由以下组成：根据SEQ ID NO:29-257、1157和1161中任一个的核苷酸序列。在一些实施例中，使用核糖核蛋白(RNP)复合物产生导致本文所述的任何细胞中TGFβRII的功能丧失的基因组编辑，该RNP包含(i)RNA指导的核酸酶(例如，Cas12a变体，例如，包含选自M537R、F870L和H800A的1、2或3个氨基酸取代的Cas12a变体，例如，包含与SEQ ID NO:1148有90％、95％或100％同一性的氨基酸序列的Cas12a变体)和(ii)包含靶向结构域序列的指导RNA，该靶向结构域序列包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:29-257、1157和1161中任一个相同或相差不超过1、2或3个核苷酸的核苷酸序列。在一些实施例中，使用核糖核蛋白(RNP)复合物产生导致本文所述的任何细胞中TGFβRII的功能丧失的基因组编辑，该RNP包含(i)RNA指导的核酸酶(例如，Cas12a变体，例如，包含选自M537R、F870L和H800A的1、2或3个氨基酸取代的Cas12a变体，例如，包含与SEQID NO:1148有90％、95％或100％同一性的氨基酸序列的Cas12a变体)和(ii)指导RNA，该指导RNA包含(i)包含SEQ ID NO:1157或1161的核苷酸序列或由其组成的靶向结构域序列，和(ii)表3中描述的5'延伸序列。在一些实施例中，使用核糖核蛋白(RNP)复合物产生导致本文所述的任何细胞中TGFβRII的功能丧失的基因组编辑，该RNP包含(i)RNA指导的核酸酶(例如，Cas12a变体，例如，包含选自M537R、F870L和H800A的1、2或3个氨基酸取代的Cas12a变体，例如，包含与SEQ ID NO:1148有90％、95％或100％同一性的氨基酸序列的Cas12a变体)和(ii)指导RNA，该指导RNA包含(i)包含SEQ ID NO:1157或1161的核苷酸序列或由其组成的靶向结构域序列，(ii)位于靶向结构域序列5′的支架序列，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:1153的核苷酸序列，以及(iii)在支架序列5′的SEQ ID NO:1154的核苷酸序列。
在一些实施例中，使用核糖核蛋白(RNP)复合物产生导致本文所述的任何细胞中ADORA2A的功能丧失的基因组编辑，该RNP包含(i)RNA指导的核酸酶(例如，Cas12a变体，例如，包含选自M537R、F870L和H800A的1、2或3个氨基酸取代的Cas12a变体，例如，包含与SEQID NO:1148有90％、95％或100％同一性的氨基酸序列的Cas12a变体)和(ii)包含靶向结构域序列的指导RNA，该靶向结构域序列包含以下或由以下组成：根据SEQ ID NO:827-1143、1159和1163中任一个的核苷酸序列。在一些实施例中，使用核糖核蛋白(RNP)复合物产生导致本文所述的任何细胞中ADORA2A的功能丧失的基因组编辑，该RNP包含(i)RNA指导的核酸酶(例如，Cas12a变体，例如，包含选自M537R、F870L和H800A的1、2或3个氨基酸取代的Cas12a变体，例如，包含与SEQ ID NO:1148有90％、95％或100％同一性的氨基酸序列的Cas12a变体)和(ii)包含靶向结构域序列的指导RNA，该靶向结构域序列包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:827-1143、1159和1163中任一个相同或相差不超过1、2或3个核苷酸的核苷酸序列。在一些实施例中，使用核糖核蛋白(RNP)复合物产生导致本文所述的任何细胞中ADORA2A的功能丧失的基因组编辑，该RNP包含(i)RNA指导的核酸酶(例如，Cas12a变体，例如，包含选自M537R、F870L和H800A的1、2或3个氨基酸取代的Cas12a变体，例如，包含与SEQ ID NO:1148有90％、95％或100％同一性的氨基酸序列的Cas12a变体)和(ii)指导RNA，该指导RNA包含(i)包含SEQ ID NO:1159或1163的核苷酸序列或由其组成的靶向结构域序列，和(ii)表3中描述的5'延伸序列。在一些实施例中，使用核糖核蛋白(RNP)复合物产生导致本文所述的任何细胞中ADORA2A的功能丧失的基因组编辑，该RNP包含(i)RNA指导的核酸酶(例如，Cas12a变体，例如，包含选自M537R、F870L和H800A的1、2或3个氨基酸取代的Cas12a变体，例如，包含与SEQ ID NO:1148有90％、95％或100％同一性的氨基酸序列的Cas12a变体)和(ii)指导RNA，该指导RNA包含(i)包含SEQ ID NO:1159或1163的核苷酸序列或由其组成的靶向结构域序列，(ii)位于靶向结构域序列5′的支架序列，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:1153的核苷酸序列，以及(iii)在支架序列5'的SEQ ID NO:1154的核苷酸序列。
在另一方面，本披露的特征在于一种制备细胞(例如本文所述的细胞)的方法，该方法包括使细胞(例如，多能人干细胞或人诱导型多能干细胞)与以下中的一种或多种接触：RNA指导的核酸酶和包含靶向结构域序列的指导RNA，该靶向结构域序列包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:258-364、1155和1162中任一个相同或相差不超过1、2或3个核苷酸的核苷酸序列；RNA指导的核酸酶和包含靶向结构域序列的指导RNA，该靶向结构域序列包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:29-257、1157和1161中任一个相同或相差不超过1、2或3个核苷酸的核苷酸序列；和/或RNA指导的核酸酶和包含靶向结构域序列的指导RNA，该靶向结构域序列包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:827-1143、1159和1163中任一个相同或相差不超过1、2或3个核苷酸的核苷酸序列。
在一些实施例中，该方法包括使细胞与以下一种或多种接触：(1)指导RNA，其包含(i)包含SEQ ID NO:1155或1162的核苷酸序列或由其组成的靶向结构域序列，和(ii)表3中描述的5′延伸序列；(2)指导RNA，其包含(i)包含SEQ ID NO:1157或1161的核苷酸序列或由其组成的靶向结构域序列，和(ii)表3中描述的5'延伸序列；以及(3)指导RNA，其包含(i)包含SEQ ID NO:1159或1163的核苷酸序列或由其组成的靶向结构域序列，和(ii)表3中描述的5′延伸序列。
在一些实施例中，该方法包括使细胞与以下一种或多种接触：(1)指导RNA，其包含(i)包含SEQ ID NO:1155或1162的核苷酸序列或由其组成的靶向结构域序列，(ii)位于靶向结构域序列5′的支架序列，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:1153的核苷酸序列，以及(iii)在支架序列5′的SEQ ID NO:1154的核苷酸序列；(2)指导RNA，其包含(i)包含SEQID NO:1157或1161的核苷酸序列或由其组成的靶向结构域序列，(ii)位于靶向结构域序列5'的支架序列，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:1153的核苷酸序列，以及(iii)在支架序列5'的SEQ ID NO:1154的核苷酸序列；以及(3)指导RNA，其包含(i)包含SEQ ID NO:1159或1163的核苷酸序列或由其组成的靶向结构域序列，(ii)位于靶向结构域序列5'的支架序列，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:1153的核苷酸序列，以及(iii)在支架序列5′的SEQ ID NO:1154的核苷酸序列。
在一些实施例中，RNA指导的核酸酶是Cas12a变体。在一些实施例中，Cas12a变体包含一个或多个选自M537R、F870L和H800A的氨基酸取代。在一些实施例中，Cas12a变体包含氨基酸取代M537R、F870L和H800A。在一些实施例中，Cas12a变体包含与SEQ ID NO:1148具有90％、95％或100％同一性的氨基酸序列。
在另一方面，本披露的特征在于一种制备细胞(例如本文所述的细胞)的方法，该方法包括使细胞(例如，多能人干细胞或人诱导型多能干细胞)与以下中的一种或多种接触：核糖核蛋白(RNP)复合物，其包含(i)RNA指导的核酸酶(例如，Cas12a变体，例如，包含选自M537R、F870L和H800A的1、2或3个氨基酸取代的Cas12a变体，例如，包含与SEQ ID NO:1148有90％、95％或100％同一性的氨基酸序列的Cas12a变体)和(ii)包含靶向结构域序列的指导RNA，该靶向结构域序列包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:258-364、1155和1162中任一个相同或相差不超过1、2或3个核苷酸的核苷酸序列；核糖核蛋白(RNP)复合物，其包含(i)RNA指导的核酸酶(例如，Cas12a变体，例如，包含选自M537R、F870L和H800A的1、2或3个氨基酸取代的Cas12a变体，例如，包含与SEQ ID NO:1148有90％、95％或100％同一性的氨基酸序列的Cas12a变体)和(ii)包含靶向结构域序列的指导RNA，该靶向结构域序列包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:29-257、1157和1161中任一个相同或相差不超过1、2或3个核苷酸的核苷酸序列；和/或核糖核蛋白(RNP)复合物，其包含(i)RNA指导的核酸酶(例如，Cas12a变体，例如，包含选自M537R、F870L和H800A的1、2或3个氨基酸取代的Cas12a变体，例如，包含与SEQ ID NO:1148有90％、95％或100％同一性的氨基酸序列的Cas12a变体)和(ii)包含靶向结构域序列的指导RNA，该靶向结构域序列包含以下或由以下组成：与SEQID NO:827-1143、1159和1163中任一个相同或相差不超过1、2或3个核苷酸的核苷酸序列。
在一些实施例中，该方法包括使细胞与以下一种或多种接触：(1)包含指导RNA的RNP，该指导RNA包含(i)包含SEQ ID NO:1155或1162的核苷酸序列或由其组成的靶向结构域序列，和(ii)表3中描述的5′延伸序列；(2)包含指导RNA的RNP，该指导RNA包含(i)包含SEQ ID NO:1157或1161的核苷酸序列或由其组成的靶向结构域序列，和(ii)表3中描述的5′延伸序列；以及(3)包含指导RNA的RNP，该指导RNA包含(i)包含SEQ ID NO:1159或1163的核苷酸序列或由其组成的靶向结构域序列，和(ii)表3中描述的5′延伸序列。
在一些实施例中，该方法包括使细胞与以下一种或多种接触：(1)包含指导RNA的RNP，该指导RNA包含(i)包含SEQ ID NO:1155或1162的核苷酸序列或由其组成的靶向结构域序列，(ii)位于靶向结构域序列5′的支架序列，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:1153的核苷酸序列，以及(iii)在支架序列5′的SEQ ID NO:1154的核苷酸序列；(2)包含指导RNA的RNP，该指导RNA包含(i)包含SEQ ID NO:1157或1161的核苷酸序列或由其组成的靶向结构域序列，(ii)位于靶向结构域序列5'的支架序列，其包含以下或由以下组成：SEQ IDNO:1153的核苷酸序列，以及(iii)在支架序列5′的SEQ ID NO:1154的核苷酸序列；以及(3)包含指导RNA的RNP，该指导RNA包含(i)包含SEQ ID NO:1159或1163的核苷酸序列或由其组成的靶向结构域序列，(ii)位于靶向结构域序列5'的支架序列，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:1153的核苷酸序列，以及(iii)在支架序列5'的SEQ ID NO:1154的核苷酸序列。
在一些实施例中，RNA指导的核酸酶是Cas12a变体。在一些实施例中，Cas12a变体包含一个或多个选自M537R、F870L和H800A的氨基酸取代。在一些实施例中，Cas12a变体包含氨基酸取代M537R、F870L和H800A。在一些实施例中，Cas12a变体包含与SEQ ID NO:1148具有90％、95％或100％同一性的氨基酸序列。
在另一方面，本披露的特征在于一种制备细胞(例如本文所述的细胞)的方法，该方法包括使细胞(例如，多能人干细胞或人诱导型多能干细胞)与以下接触：(i)包含靶向结构域序列的指导RNA，该靶向结构域序列包含SEQ ID NO:1155或1162的核苷酸序列或由其组成；包含靶向结构域序列的指导RNA，该靶向结构域序列包含SEQ ID NO:1157或1161的核苷酸序列或由其组成；以及包含靶向结构域序列的指导RNA，该靶向结构域序列包含SEQ IDNO:1159或1163的核苷酸序列或由其组成；以及(ii)RNA指导的核酸酶，其包含与SEQ IDNO:1144-1151之一(或其部分)具有90％、95％或100％同一性的氨基酸序列。
在另一方面，本披露的特征在于一种制备细胞(例如本文所述的细胞)的方法，该方法包括使细胞(例如，多能人干细胞或人诱导型多能干细胞)与以下接触：(1)RNP，其包含(i)包含靶向结构域序列的指导RNA，该靶向结构域序列包含SEQ ID NO:1155或1162的核苷酸序列或由其组成；以及(ii)RNA指导的核酸酶，其包含与SEQ ID NO:1144-1151之一(或其部分)具有90％、95％或100％同一性的氨基酸序列；(2)RNP，其包含(i)包含靶向结构域序列的指导RNA，该靶向结构域序列包含SEQ ID NO:1157或1161的核苷酸序列或由其组成，以及(ii)RNA指导的核酸酶，其包含与SEQ ID NO:1144-1151之一(或其部分)具有90％、95％或100％同一性的氨基酸序列；以及(3)RNP，其包含(i)包含靶向结构域序列的指导RNA，该靶向结构域序列包含SEQ ID NO:1159或1163的核苷酸序列或由其组成，以及(ii)RNA指导的核酸酶，其包含与SEQ ID NO:1144-1151之一(或其部分)具有90％、95％或100％同一性的氨基酸序列。
在另一方面，本披露的特征在于一种制备细胞(例如本文所述的细胞)的方法，该方法包括使细胞(例如，多能人干细胞或人诱导型多能干细胞)与以下接触：(1)指导RNA，其包含(i)包含SEQ ID NO:1155或1162的核苷酸序列或由其组成的靶向结构域序列，和(ii)表3中描述的5′延伸序列；(2)指导RNA，其包含(i)包含SEQ ID NO:1157或1161的核苷酸序列或由其组成的靶向结构域序列，和(ii)表3中描述的5'延伸序列；(3)指导RNA，其包含(i)包含SEQ ID NO:1159或1163的核苷酸序列或由其组成的靶向结构域序列，和(ii)表3中描述的5′延伸序列；以及(4)RNA指导的核酸酶，其包含与SEQ ID NO:1144-1151之一(或其部分)具有90％、95％或100％同一性的氨基酸序列。
在另一方面，本披露的特征在于一种制备细胞(例如本文所述的细胞)的方法，该方法包括使细胞(例如，多能人干细胞或人诱导型多能干细胞)与以下接触：(1)RNP，其包含(a)指导RNA，该指导RNA包含(i)包含SEQ ID NO:1155或1162的核苷酸序列或由其组成的靶向结构域序列，和(ii)表3中描述的5'延伸序列；以及(b)RNA指导的核酸酶，其包含与SEQID NO:1144-1151之一(或其部分)具有90％、95％或100％同一性的氨基酸序列；(2)RNP，其包含(a)指导RNA，该指导RNA包含(i)包含SEQ ID NO:1157或1161的核苷酸序列或由其组成的靶向结构域序列，和(ii)表3中描述的5'延伸序列；以及(b)RNA指导的核酸酶，其包含与SEQ ID NO:1144-1151之一(或其部分)具有90％、95％或100％同一性的氨基酸序列；以及(3)RNP，其包含(a)指导RNA，该指导RNA包含(i)包含SEQ ID NO:1159或1163的核苷酸序列或由其组成的靶向结构域序列，和(ii)表3中描述的5'延伸序列；以及(b)RNA指导的核酸酶，其包含与SEQ ID NO:1144-1151之一(或其部分)具有90％、95％或100％同一性的氨基酸序列。
在另一方面，本披露的特征在于一种制备细胞(例如本文所述的细胞)的方法，该方法包括使细胞(例如，多能人干细胞或人诱导型多能干细胞)与以下接触：(1)指导RNA，其包含(i)包含SEQ ID NO:1155或1162的核苷酸序列或由其组成的靶向结构域序列，(ii)位于靶向结构域序列5′的支架序列，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:1153的核苷酸序列，以及(iii)在支架序列5′的SEQ ID NO:1154的核苷酸序列；(2)指导RNA，其包含(i)包含SEQ ID NO:1157或1161的核苷酸序列或由其组成的靶向结构域序列，(ii)位于靶向结构域序列5′的支架序列，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:1153的核苷酸序列，以及(iii)在支架序列5′的SEQ ID NO:1154的核苷酸序列(3)指导RNA，其包含(i)包含SEQ ID NO:1159或1163的核苷酸序列或由其组成的靶向结构域序列，(ii)位于靶向结构域序列5'的支架序列，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:1153的核苷酸序列，以及(iii)在支架序列5'的SEQ ID NO:1154的核苷酸序列；以及(4)RNA指导的核酸酶，其包含与SEQ ID NO:1144-1151之一(或其部分)具有90％、95％或100％同一性的氨基酸序列。
在另一方面，本披露的特征在于一种制备细胞(例如本文所述的细胞)的方法，该方法包括使细胞(例如，多能人干细胞或人诱导型多能干细胞)与以下接触：(1)RNP，其包含(a)指导RNA，该指导RNA包含(i)包含SEQ ID NO:1155或1162的核苷酸序列或由其组成的靶向结构域序列，(ii)位于靶向结构域序列5'的支架序列，其包含以下或由以下组成：SEQ IDNO:1153的核苷酸序列，以及(iii)在支架序列5'的SEQ ID NO:1154的核苷酸序列；以及(b)RNA指导的核酸酶，其包含与SEQ ID NO:1144-1151之一(或其部分)具有90％、95％或100％同一性的氨基酸序列；(2)RNP，其包含(a)指导RNA，该指导RNA包含(i)包含SEQ ID NO:1157或1161的核苷酸序列或由其组成的靶向结构域序列，(ii)位于靶向结构域序列5′的支架序列，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:1153的核苷酸序列，以及(iii)在支架序列5′的SEQ ID NO:1154的核苷酸序列；以及(b)RNA指导的核酸酶，其包含与SEQ ID NO:1144-1151之一(或其部分)具有90％、95％或100％同一性的氨基酸序列；以及(3)RNP，其包含(a)指导RNA，该指导RNA包含(i)包含SEQ ID NO:1159或1163的核苷酸序列或由其组成的靶向结构域序列，(ii)位于靶向结构域序列5′的支架序列，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:1153的核苷酸序列，以及(iii)在支架序列5′的SEQ ID NO:1154的核苷酸序列；以及(b)RNA指导的核酸酶，其包含与SEQ ID NO:1144-1151之一(或其部分)具有90％、95％或100％同一性的氨基酸序列。
在另一个方面，本披露的特征在于多能人干细胞，其中该干细胞包含转化生长因子β(TGFβ)信号传导通路的破坏。在一些实施例中，干细胞包含导致TGFβ信号传导通路的激动剂的功能丧失的基因修饰。在一些实施例中，基因修饰是基因组编辑。在一些实施例中，干细胞包含TGFβ受体的功能丧失或TGFβ受体的显性失活变体。在一些实施例中，TGFβ受体是TGFβ受体II(TGFβRII)。
在一些实施例中，干细胞进一步包括白介素信号传导的拮抗剂的功能丧失。在一些实施例中，干细胞进一步包含导致白介素信号传导的拮抗剂的功能丧失的基因组修饰。在一些实施例中，白介素信号传导通路的拮抗剂是IL-15信号传导通路和/或IL-2信号传导通路的拮抗剂。
在一些实施例中，干细胞包含含细胞因子诱导含SH2蛋白(CISH)的功能丧失。在一些实施例中，干细胞包含导致CISH的功能丧失的基因组修饰。
在一些实施例中，干细胞表达一种或多种选自下组的多能性标志物，该组由以下组成：SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-49/6E、ALP、Sox2、E-钙粘蛋白、UTF-1、Oct4、Rex1和Nanog。
在一些实施例中，干细胞包含一个或多个另外的基因修饰。在一些实施例中，干细胞：(1)包含至少一种基因修饰，其特征在于外源核酸表达构建体，该外源核酸表达构建体包含编码以下的核酸序列：(i)嵌合抗原受体(CAR)；(ii)FcγRIII(CD16)或FcγRIII(CD16)的变体(例如，非天然存在的变体)；(iii)白介素15(IL-15)；(iv)IL-15受体(IL-15R)激动剂，或IL-15受体的组成型活性变体；(v)IL-12受体(IL-12R)激动剂，或IL-12受体的组成型活性变体；(vi)IL-12受体(IL-12R)激动剂，或IL-12受体的组成型活性变体；(vii)人白细胞抗原G(HLA-G)；(viii)人白细胞抗原E(HLA-E)；(ix)白细胞表面抗原分化簇CD47(CD47)；或其两种或更多种的任何组合；和/或(2)包含至少一个导致以下中至少一种的功能丧失的基因修饰：(i)细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)；(ii)腺苷A2a受体(ADORA2A)；(iii)具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)；(iv)β-2微球蛋白(B2M)；(v)程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)；(vi)II类主要组织相容性复合体反式激活因子(CIITA)；(vii)自然杀伤细胞受体NKG2A(自然杀伤组2A)；(viii)两种或更多种HLA II类组织相容性抗原α链基因，和/或两种或更多种HLA II类组织相容性抗原β链基因；(ix)分化簇32B(CD32B，FCGR2B)；(x)T细胞受体α恒定区(TRAC)；或其两种或更多种的任何组合。
在一些实施例中，干细胞包含使用RNA指导的核酸酶和gRNA分子在TGFβRII基因中进行的基因修饰，该gRNA分子包含靶向结构域，该靶向结构域与SEQ ID NO:29-257、1157和1161中任一个相同或差异不超过3个核苷酸。在一些实施例中，干细胞包含使用RNA指导的核酸酶和gRNA分子在CISH基因中进行的基因修饰，该gRNA分子包含靶向结构域，该靶向结构域与SEQ ID NO:258-364、1155和1162中任一个相同或差异不超过3个核苷酸。在一些实施例中，干细胞包含使用RNA指导的核酸酶和gRNA分子在ADORA2A基因中进行的基因修饰，该gRNA分子包含靶向结构域，该靶向结构域与SEQ ID NO:827-1143、1159和1163中任一个相同或差异不超过3个核苷酸。在一些实施例中，干细胞包含使用RNA指导的核酸酶和gRNA分子在TIGIT基因中进行的基因修饰，该gRNA分子包含靶向结构域，该靶向结构域与SEQ IDNO:631-826中任一个相同或差异不超过3个核苷酸。在一些实施例中，干细胞包含使用RNA指导的核酸酶和gRNA分子在B2M基因中进行的基因修饰，该gRNA分子包含靶向结构域，该靶向结构域与SEQ ID NO:365-576中任一个相同或差异不超过3个核苷酸。在一些实施例中，干细胞包含使用RNA指导的核酸酶和gRNA分子在NKG2A基因中进行的基因修饰，该gRNA分子包含靶向结构域，该靶向结构域与SEQ ID NO:577-630中任一个相同或差异不超过3个核苷酸。
在另一个方面，本披露以分化的细胞为特征，其中分化的细胞是本文所述的多能人干细胞的子细胞。在一些实施例中，分化的细胞是免疫细胞。在一些实施例中，分化的细胞是淋巴细胞。在一些实施例中，分化的细胞是自然杀伤细胞。在一些实施例中，干细胞是人诱导型多能干细胞(iPSC)，并且其中分化的子细胞是诱导型自然杀伤(iNK)细胞。
在一些实施例中，分化的细胞：(a)不表达内源CD3、CD4和/或CD8；并(b)表达至少一种编码以下的内源基因：(i)CD56(NCAM)、CD49、CD43和/或CD45，或其任何组合；(ii)NK细胞受体免疫球蛋白γFc区受体III(FcγRIII，分化簇16(CD16))；(iii)自然杀伤组-2成员D(NKG2D)；(iv)CD69；(v)天然细胞毒性受体；或其两种或更多种的任何组合。
在一些实施例中，分化的干细胞包含一个或多个另外的基因修饰。在一些实施例中，分化的干细胞：(1)包含至少一种基因修饰，其特征在于外源核酸表达构建体，该外源核酸表达构建体包含编码以下的核酸序列：(i)嵌合抗原受体(CAR)；(ii)FcγRIII(CD16)或FcγRIII(CD16)的变体(例如，非天然存在的变体)；(iii)白介素15(IL-15)；(iv)IL-15受体(IL-15R)激动剂，或IL-15受体的组成型活性变体；(v)IL-12受体(IL-12R)激动剂，或IL-12受体的组成型活性变体；(vi)IL-12受体(IL-12R)激动剂，或IL-12受体的组成型活性变体；(vii)人白细胞抗原G(HLA-G)；(viii)人白细胞抗原E(HLA-E)；(ix)白细胞表面抗原分化簇CD47(CD47)；或其两种或更多种的任何组合；和/或(2)包含至少一个导致以下中至少一种的功能丧失的基因修饰：(i)细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)；(ii)腺苷A2a受体(ADORA2A)；(iii)具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)；(iv)β-2微球蛋白(B2M)；(v)程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)；(vi)II类主要组织相容性复合体反式激活因子(CIITA)；(vii)自然杀伤细胞受体NKG2A(自然杀伤组2A)；(viii)两种或更多种HLA II类组织相容性抗原α链基因，和/或两种或更多种HLA II类组织相容性抗原β链基因；(ix)分化簇32B(CD32B，FCGR2B)；(x)T细胞受体α恒定区(TRAC)；或其两种或更多种的任何组合。
在一些实施例中，分化的干细胞包含使用RNA指导的核酸酶和gRNA分子在TGFβRII基因中进行的基因修饰，该gRNA分子包含靶向结构域，该靶向结构域与SEQ ID NO:29-257、1157和1161中任一个相同或差异不超过3个核苷酸。在一些实施例中，分化的干细胞包含使用RNA指导的核酸酶和gRNA分子在CISH基因中进行的基因修饰，该gRNA分子包含靶向结构域，该靶向结构域与SEQ ID NO:258-364、1155和1162中任一个相同或差异不超过3个核苷酸。在一些实施例中，分化的干细胞包含使用RNA指导的核酸酶和gRNA分子在ADORA2A基因中进行的基因修饰，该gRNA分子包含靶向结构域，该靶向结构域与SEQ ID NO:827-1143、1159和1163中任一个相同或差异不超过3个核苷酸。在一些实施例中，分化的干细胞包含使用RNA指导的核酸酶和gRNA分子在TIGIT基因中进行的基因修饰，该gRNA分子包含靶向结构域，该靶向结构域与SEQ ID NO:631-826中任一个相同或差异不超过3个核苷酸。在一些实施例中，分化的干细胞包含使用RNA指导的核酸酶和gRNA分子在B2M基因中进行的基因修饰，该gRNA分子包含靶向结构域，该靶向结构域与SEQ ID NO:365-576中任一个相同或差异不超过3个核苷酸。在一些实施例中，分化的干细胞包含使用RNA指导的核酸酶和gRNA分子在NKG2A基因中进行的基因修饰，该gRNA分子包含靶向结构域，该靶向结构域与SEQ ID NO:577-630中任一个相同或差异不超过3个核苷酸。
在另一个方面，本披露的特征在于一种培养多能人干细胞的方法，该方法包括在包含激活素的培养基中培养干细胞。在一些实施例中，多能人干细胞是胚胎干细胞或诱导的多能干细胞。在一些实施例中，多能人干细胞不表达TGFβRII。在一些实施例中，多能人干细胞经基因工程化以不表达TGFβRII。在一些实施例中，多能人干细胞经基因工程化以敲除编码TGFβRII的基因。
在一些实施例中，激活素是激活素A。在一些实施例中，培养基不包含TGFβ。
在一些实施例中，培养进行定义的时间段(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12天或更长)。在一些实施例中，在培养步骤期间或之后的一个或多个时间，多能人干细胞保持多能性(例如，表现出一种或多种多能性标志物)。在一些实施例中，在培养步骤期间或之后的一个或多个时间，多能人干细胞表达可检测水平的以下一种或多种：SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-49/6E、ALP、Sox2、E-钙粘蛋白、UTF-1、Oct4、Rex1和Nanog。在一些实施例中，在培养步骤期间或之后的时间，多能人干细胞分化成内胚层、中胚层和/或外胚层谱系的细胞。在一些实施例中，多能人干细胞或其后代进一步分化成自然杀伤(NK)细胞。
在一些实施例中，多能人干细胞在包含人血清的培养基中分化成NK细胞。在一些实施例中，培养基包含NKMACS+人血清(例如，5％、10％、15％、20％或更多的人血清)。在一些实施例中，相对于分化的NK细胞，NK细胞表现出改善的细胞扩增、增加的NK成熟度(如通过增加的标志物表达(例如，CD45、CD56、CD16和/或KIR)所展示)和/或增加的细胞毒性在没有血清的培养基中。
在一些实施例中，多能人干细胞(1)包含至少一种基因修饰，其特征在于外源核酸表达构建体，该外源核酸表达构建体包含编码以下的核酸序列：(i)嵌合抗原受体(CAR)；(ii)FcγRIII(CD16)或FcγRIII(CD16)的变体(例如，非天然存在的变体)；(iii)白介素15(IL-15)；(iv)IL-15受体(IL-15R)激动剂，或IL-15受体的组成型活性变体；(v)IL-12受体(IL-12R)激动剂，或IL-12受体的组成型活性变体；(vi)IL-12受体(IL-12R)激动剂，或IL-12受体的组成型活性变体；(vii)人白细胞抗原G(HLA-G)；(viii)人白细胞抗原E(HLA-E)；(ix)白细胞表面抗原分化簇CD47(CD47)；或其两种或更多种的任何组合；和/或(2)包含至少一个导致以下中至少一种的功能丧失的基因修饰：(i)细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)；(ii)腺苷A2a受体(ADORA2A)；(iii)具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)；(iv)β-2微球蛋白(B2M)；(v)程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)；(vi)II类主要组织相容性复合体反式激活因子(CIITA)；(vii)自然杀伤细胞受体NKG2A(自然杀伤组2A)；(viii)两种或更多种HLA II类组织相容性抗原α链基因，和/或两种或更多种HLA II类组织相容性抗原β链基因；(ix)分化簇32B(CD32B，FCGR2B)；(x)T细胞受体α恒定区(TRAC)；或其两种或更多种的任何组合。
在一些实施例中，多能人干细胞包含使用RNA指导的核酸酶和gRNA分子在TGFβRII基因中进行的基因修饰，该gRNA分子包含靶向结构域，该靶向结构域与SEQ ID NO:29-257、1157和1161中任一个相同或差异不超过3个核苷酸。在一些实施例中，多能人干细胞包含使用RNA指导的核酸酶和gRNA分子在CISH基因中进行的基因修饰，该gRNA分子包含靶向结构域，该靶向结构域与SEQ ID NO:258-364、1155和1162中任一个相同或差异不超过3个核苷酸。在一些实施例中，多能人干细胞包含使用RNA指导的核酸酶和gRNA分子在ADORA2A基因中进行的基因修饰，该gRNA分子包含靶向结构域，该靶向结构域与SEQ ID NO:827-1143、1159和1163中任一个相同或差异不超过3个核苷酸。在一些实施例中，多能人干细胞包含使用RNA指导的核酸酶和gRNA分子在TIGIT基因中进行的基因修饰，该gRNA分子包含靶向结构域，该靶向结构域与SEQ ID NO:631-826中任一个相同或差异不超过3个核苷酸。在一些实施例中，多能人干细胞包含使用RNA指导的核酸酶和gRNA分子在B2M基因中进行的基因修饰，该gRNA分子包含靶向结构域，该靶向结构域与SEQ ID NO:365-576中任一个相同或差异不超过3个核苷酸。在一些实施例中，多能人干细胞包含使用RNA指导的核酸酶和gRNA分子在NKG2A基因中进行的基因修饰，该gRNA分子包含靶向结构域，该靶向结构域与SEQ ID NO:577-630中任一个相同或差异不超过3个核苷酸。
在一些实施例中，该方法进一步包括(1)基因修饰多能人干细胞，使得多能人干细胞表达编码以下的核酸序列：(i)嵌合抗原受体(CAR)；(ii)非天然存在的FcγRIII变体(CD16)；(iii)白介素15(IL-15)；(iv)IL-15受体(IL-15R)激动剂，或IL-15受体的组成型活性变体；(v)IL-12受体(IL-12R)激动剂，或IL-12受体的组成型活性变体；(vi)IL-12受体(IL-12R)激动剂，或IL-12受体的组成型活性变体；(vii)人白细胞抗原G(HLA-G)；(viii)人白细胞抗原E(HLA-E)；(ix)白细胞表面抗原分化簇CD47(CD47)；或其两种或更多种的任何组合；和/或(2)对多能人干细胞进行基因修饰，使以下中至少一种丧失功能：(i)细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)；(ii)腺苷A2a受体(ADORA2A)；(iii)具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)；(iv)β-2微球蛋白(B2M)；(v)程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)；(vi)II类主要组织相容性复合体反式激活因子(CIITA)；(vii)自然杀伤细胞受体NKG2A(自然杀伤组2A)；(viii)两种或更多种HLA II类组织相容性抗原α链基因，和/或两种或更多种HLA II类组织相容性抗原β链基因；(ix)分化簇32B(CD32B，FCGR2B)；(x)T细胞受体α恒定区(TRAC)；或其两种或更多种的任何组合。
在一些实施例中，该方法进一步包括使用RNA指导的核酸酶和gRNA分子对TGFβRII基因进行基因修饰，该gRNA分子包含靶向结构域，该靶向结构域与SEQ ID NO:29-257、1157和1161中任一个相同或差异不超过3个核苷酸。在一些实施例中，该方法进一步包括使用RNA指导的核酸酶和gRNA分子对CISH基因进行基因修饰，该gRNA分子包含靶向结构域，该靶向结构域与SEQ ID NO:258-364、1155和11162中任一个相同或差异不超过3个核苷酸。在一些实施例中，该方法进一步包括使用RNA指导的核酸酶和gRNA分子对ADORA2A基因进行基因修饰，该gRNA分子包含靶向结构域，该靶向结构域与SEQ ID NO:827-1143、1159和1163中任一个相同或差异不超过3个核苷酸。在一些实施例中，该方法进一步包括使用RNA指导的核酸酶和gRNA分子对TIGIT基因进行基因修饰，该gRNA分子包含靶向结构域，该靶向结构域与SEQ ID NO:631-826中任一个相同或差异不超过3个核苷酸。在一些实施例中，该方法进一步包括使用RNA指导的核酸酶和gRNA分子对B2M基因进行基因修饰，该gRNA分子包含靶向结构域，该靶向结构域与SEQ ID NO:365-576中任一个相同或差异不超过3个核苷酸。在一些实施例中，该方法进一步包括使用RNA指导的核酸酶和gRNA分子对NKG2A基因进行基因修饰，该gRNA分子包含靶向结构域，该靶向结构域与SEQ ID NO:577-630中任一个相同或差异不超过3个核苷酸。
在另一个方面，本披露的特征在于一种细胞培养物，其包含(i)多能人干细胞和(ii)包含激活素的细胞培养基，其中多能人干细胞包含转化生长因子β(TGFβ)信号传导通路的破坏。在一些实施例中，干细胞包含导致TGFβ信号传导通路的激动剂的功能丧失的基因修饰。在一些实施例中，基因修饰是基因组编辑。在一些实施例中，干细胞包含TGFβ受体的功能丧失或TGFβ受体的显性失活变体。在一些实施例中，TGFβ受体是TGFβ受体II(TGFβRII)。
在一些实施例中，多能人干细胞：(1)包含至少一种基因修饰，其特征在于外源核酸表达构建体，该外源核酸表达构建体包含编码以下的核酸序列：(i)嵌合抗原受体(CAR)；(ii)FcγRIII(CD16)或FcγRIII(CD16)的变体(例如，非天然存在的变体)；(iii)白介素15(IL-15)；(iv)IL-15受体(IL-15R)激动剂，或IL-15受体的组成型活性变体；(v)IL-12受体(IL-12R)激动剂，或IL-12受体的组成型活性变体；(vi)IL-12受体(IL-12R)激动剂，或IL-12受体的组成型活性变体；(vii)人白细胞抗原G(HLA-G)；(viii)人白细胞抗原E(HLA-E)；(ix)白细胞表面抗原分化簇CD47(CD47)；或其两种或更多种的任何组合；和/或(2)包含至少一个导致以下中至少一种的功能丧失的基因修饰：(i)细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)；(ii)腺苷A2a受体(ADORA2A)；(iii)具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)；(iv)β-2微球蛋白(B2M)；(v)程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)；(vi)II类主要组织相容性复合体反式激活因子(CIITA)；(vii)自然杀伤细胞受体NKG2A(自然杀伤组2A)；(viii)两种或更多种HLA II类组织相容性抗原α链基因，和/或两种或更多种HLA II类组织相容性抗原β链基因；(ix)分化簇32B(CD32B，FCGR2B)；(x)T细胞受体α恒定区(TRAC)；或其两种或更多种的任何组合。
在一些实施例中，多能人干细胞包含使用RNA指导的核酸酶和gRNA分子在TGFβRII基因中进行的基因修饰，该gRNA分子包含靶向结构域，该靶向结构域与SEQ ID NO:29-257、1157和1161中任一个相同或差异不超过3个核苷酸。在一些实施例中，多能人干细胞包含使用RNA指导的核酸酶和gRNA分子在CISH基因中进行的基因修饰，该gRNA分子包含靶向结构域，该靶向结构域与SEQ ID NO:258-364、1155和1162中任一个相同或差异不超过3个核苷酸。在一些实施例中，多能人干细胞包含使用RNA指导的核酸酶和gRNA分子在ADORA2A基因中进行的基因修饰，该gRNA分子包含靶向结构域，该靶向结构域与SEQ ID NO:827-1143、1159和1163中任一个相同或差异不超过3个核苷酸。在一些实施例中，多能人干细胞包含使用RNA指导的核酸酶和gRNA分子在TIGIT基因中进行的基因修饰，该gRNA分子包含靶向结构域，该靶向结构域与SEQ ID NO:631-826中任一个相同或差异不超过3个核苷酸。在一些实施例中，多能人干细胞包含使用RNA指导的核酸酶和gRNA分子在B2M基因中进行的基因修饰，该gRNA分子包含靶向结构域，该靶向结构域与SEQ ID NO:365-576中任一个相同或差异不超过3个核苷酸。在一些实施例中，多能人干细胞包含使用RNA指导的核酸酶和gRNA分子在NKG2A基因中进行的基因修饰，该gRNA分子包含靶向结构域，该靶向结构域与SEQ ID NO:577-630中任一个相同或差异不超过3个核苷酸。
在另一个方面，该方法包括增加iNK细胞活性水平的方法，该方法包括：(i)提供包含转化生长因子β(TGFβ)信号传导通路的破坏的多能人干细胞；以及(ii)使多能人干细胞分化成iNK细胞，其中该iNK细胞与不包含TGFβ信号传导通路的破坏的iNK细胞相比具有更高水平的细胞活性。
在一些实施例中，iNK从在包含激活素的培养基中培养的多能人干细胞分化。在一些实施例中，该方法进一步包括在分化步骤之前和/或期间在包含激活素的培养基中培养多能人干细胞。
在一些实施例中，多能人干细胞在包含人血清的培养基中分化成NK细胞。在一些实施例中，培养基包含NKMACS+人血清(例如，5％、10％、15％、20％或更多的人血清)。在一些实施例中，相对于分化的NK细胞，NK细胞表现出改善的细胞扩增、增加的NK成熟度(如通过增加的标志物表达(例如，CD45、CD56、CD16和/或KIR)所展示)和/或增加的细胞毒性在没有血清的培养基中。
在一些实施例中，该方法进一步包括破坏多能人干细胞中的转化生长因子β(TGFβ)信号传导通路。在一些实施例中，干细胞包含导致TGFβ信号传导通路的激动剂的功能丧失的基因修饰。在一些实施例中，基因修饰是基因组编辑。在一些实施例中，干细胞包含TGFβ受体的功能丧失或TGFβ受体的显性失活变体。在一些实施例中，TGFβ受体是TGFβ受体II(TGFβRII)。
在一些实施例中，多能人干细胞：(1)包含至少一种基因修饰，其特征在于外源核酸表达构建体，该外源核酸表达构建体包含编码以下的核酸序列：(i)嵌合抗原受体(CAR)；(ii)FcγRIII(CD16)或FcγRIII(CD16)的变体(例如，非天然存在的变体)；(iii)白介素15(IL-15)；(iv)IL-15受体(IL-15R)激动剂，或IL-15受体的组成型活性变体；(v)IL-12受体(IL-12R)激动剂，或IL-12受体的组成型活性变体；(vi)IL-12受体(IL-12R)激动剂，或IL-12受体的组成型活性变体；(vii)人白细胞抗原G(HLA-G)；(viii)人白细胞抗原E(HLA-E)；(ix)白细胞表面抗原分化簇CD47(CD47)；或其两种或更多种的任何组合；和/或(2)包含至少一个导致以下中至少一种的功能丧失的基因修饰：(i)细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)；(ii)腺苷A2a受体(ADORA2A)；(iii)具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)；(iv)β-2微球蛋白(B2M)；(v)程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)；(vi)II类主要组织相容性复合体反式激活因子(CIITA)；(vii)自然杀伤细胞受体NKG2A(自然杀伤组2A)；(viii)两种或更多种HLA II类组织相容性抗原α链基因，和/或两种或更多种HLA II类组织相容性抗原β链基因；(ix)分化簇32B(CD32B，FCGR2B)；(x)T细胞受体α恒定区(TRAC)；或其两种或更多种的任何组合。
在一些实施例中，多能人干细胞包含使用RNA指导的核酸酶和gRNA分子在TGFβRII基因中进行的基因修饰，该gRNA分子包含靶向结构域，该靶向结构域与SEQ ID NO:29-257、1157和1161中任一个相同或差异不超过3个核苷酸。在一些实施例中，多能人干细胞包含使用RNA指导的核酸酶和gRNA分子在CISH基因中进行的基因修饰，该gRNA分子包含靶向结构域，该靶向结构域与SEQ ID NO:258-364、1155和1162中任一个相同或差异不超过3个核苷酸。在一些实施例中，多能人干细胞包含使用RNA指导的核酸酶和gRNA分子在ADORA2A基因中进行的基因修饰，该gRNA分子包含靶向结构域，该靶向结构域与SEQ ID NO:827-1143、1159和1163中任一个相同或差异不超过3个核苷酸。在一些实施例中，多能人干细胞包含使用RNA指导的核酸酶和gRNA分子在TIGIT基因中进行的基因修饰，该gRNA分子包含靶向结构域，该靶向结构域与SEQ ID NO:631-826中任一个相同或差异不超过3个核苷酸。在一些实施例中，多能人干细胞包含使用RNA指导的核酸酶和gRNA分子在B2M基因中进行的基因修饰，该gRNA分子包含靶向结构域，该靶向结构域与SEQ ID NO:365-576中任一个相同或差异不超过3个核苷酸。在一些实施例中，多能人干细胞包含使用RNA指导的核酸酶和gRNA分子在NKG2A基因中进行的基因修饰，该gRNA分子包含靶向结构域，该靶向结构域与SEQ ID NO:577-630中任一个相同或差异不超过3个核苷酸。
在一些实施例中，该方法进一步包括(1)基因修饰多能人干细胞，使得多能人干细胞表达编码以下的核酸序列：(i)嵌合抗原受体(CAR)；(ii)FcγRIII(CD16)或FcγRIII(CD16)的变体(例如，非天然存在的变体)；(iii)白介素15(IL-15)；(iv)IL-15受体(IL-15R)激动剂，或IL-15受体的组成型活性变体；(v)IL-12受体(IL-12R)激动剂，或IL-12受体的组成型活性变体；(vi)IL-12受体(IL-12R)激动剂，或IL-12受体的组成型活性变体；(vii)人白细胞抗原G(HLA-G)；(viii)人白细胞抗原E(HLA-E)；(ix)白细胞表面抗原分化簇CD47(CD47)；或其两种或更多种的任何组合；和/或(2)对多能人干细胞进行基因修饰，使以下中至少一种丧失功能：(i)细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)；(ii)腺苷A2a受体(ADORA2A)；(iii)具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)；(iv)β-2微球蛋白(B2M)；(v)程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)；(vi)II类主要组织相容性复合体反式激活因子(CIITA)；(vii)自然杀伤细胞受体NKG2A(自然杀伤组2A)；(viii)两种或更多种HLA II类组织相容性抗原α链基因，和/或两种或更多种HLA II类组织相容性抗原β链基因；(ix)分化簇32B(CD32B，FCGR2B)；(x)T细胞受体α恒定区(TRAC)；或其两种或更多种的任何组合。
在一些实施例中，该方法进一步包括使用RNA指导的核酸酶和gRNA分子对TGFβRII基因进行基因修饰，该gRNA分子包含靶向结构域，该靶向结构域与SEQ ID NO:29-257、1157和1161中任一个相同或差异不超过3个核苷酸。在一些实施例中，该方法进一步包括使用RNA指导的核酸酶和gRNA分子对CISH基因进行基因修饰，该gRNA分子包含靶向结构域，该靶向结构域与SEQ ID NO:258-364、1155和1162中任一个相同或差异不超过3个核苷酸。在一些实施例中，该方法进一步包括使用RNA指导的核酸酶和gRNA分子对ADORA2A基因进行基因修饰，该gRNA分子包含靶向结构域，该靶向结构域与SEQ ID NO:827-1143、1159和1163中任一个相同或差异不超过3个核苷酸。在一些实施例中，该方法进一步包括使用RNA指导的核酸酶和gRNA分子对TIGIT基因进行基因修饰，该gRNA分子包含靶向结构域，该靶向结构域与SEQ ID NO:631-826中任一个相同或差异不超过3个核苷酸。在一些实施例中，该方法进一步包括使用RNA指导的核酸酶和gRNA分子对B2M基因进行基因修饰，该gRNA分子包含靶向结构域，该靶向结构域与SEQ ID NO:365-576中任一个相同或差异不超过3个核苷酸。在一些实施例中，该方法进一步包括使用RNA指导的核酸酶和gRNA分子对NKG2A基因进行基因修饰，该gRNA分子包含靶向结构域，该靶向结构域与SEQ ID NO:577-630中任一个相同或差异不超过3个核苷酸。
在另一个方面，本披露的特征在于培养干细胞，例如人干细胞，例如人胚胎干细胞、人诱导型多能干细胞或人多能干细胞的方法，该方法包括在包含激活素例如激活素A的培养基中培养干细胞。在一些实施例中，干细胞是胚胎干细胞或诱导型多能干细胞。在一些实施例中，干细胞包含破坏干细胞中的TGF(转化生长因子)信号传导通路的修饰，例如基因修饰。在一些实施例中，基因修饰是破坏(例如，减少或消除)干细胞中的TGFβ信号传导的修饰。例如，在一些实施例中，修饰是对编码TGFβ信号传导通路的蛋白质(例如TGFβ受体)的基因的修饰。在一些实施例中，修饰导致TGFβ信号传导通路的蛋白质功能丧失和/或表达丧失。在一些实施例中，修饰导致TGFβ信号传导通路的蛋白质敲除。在一些实施例中，干细胞不表达功能性TGFβ受体蛋白，例如，干细胞不表达TGFβRII蛋白或不表达功能性TGFβRII蛋白。在一些实施例中，干细胞表达TGFβ信号传导通路蛋白激动剂的显性失活变体，例如TGFβRII的显性失活变体。在一些实施例中，干细胞过表达TGFβ信号传导通路的拮抗剂。在一些实施例中，干细胞不表达TGFβRII。在一些实施例中，干细胞经基因工程化以不表达TGFβRII。在一些实施例中，干细胞经基因工程化以敲除编码TGFβRII的基因。在一些实施例中，基因修饰是增强(例如，保持或增加)干细胞中IL-15信号传导的修饰。例如，在一些实施例中，修饰是编码作用于IL-15信号传导通路的蛋白质的基因的修饰，所述蛋白质例如细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)，IL-15信号传导的负调节剂。在一些实施例中，修饰导致作用于IL-15信号传导通路的蛋白质的功能丧失和/或表达丧失。在一些实施例中，修饰导致作用于IL-15信号传导的蛋白质的敲除。在一些实施例中，干细胞不表达功能性CISH基因，例如，干细胞不表达CISH蛋白或不表达功能性CISH蛋白。在一些实施例中，干细胞不表达CISH。在一些实施例中，干细胞经基因工程化以不表达CISH。在一些实施例中，干细胞经基因工程化以敲除编码CISH(即，CISH，细胞因子诱导型含SH2蛋白)的基因。在一些实施例中，干细胞不表达TGFβRII或CISH。在一些实施例中，干细胞经基因工程化以不表达TGFβRII或CISH中的每一个。在一些实施例中，干细胞经基因工程化以敲除同一细胞中编码TGFβRII的基因和编码CISH的基因(双KO)。在一些实施例中，干细胞已被编辑，例如，通过CRISPR/Cas编辑或其他合适的技术，以破坏细胞基因组内编码参与TGFβ信号传导的基因产物的基因，例如TGFβ信号传导中例如编码TGFβRII蛋白的基因，或例如IL-15信号传导中例如编码CIS蛋白的基因。在一些实施例中，例如在其中编码参与TGF信号传导和/或IL-15信号传导的基因产物的基因的两个拷贝或等位基因存在于细胞中的实施例中，细胞被修饰(例如，被编辑)，使得两个拷贝或等位基因都被修饰，例如，从而基因或由该基因编码的功能性基因产物的表达从两个等位基因破坏、减少或消除。
在一些实施例中，激活素是激活素A。在一些实施例中，培养基不包含TGFβ。
在一些实施例中，培养进行定义的时间段(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12天或更长)。在一些实施例中，在培养步骤期间或之后的一个或多个时间，人干细胞保持多能性(例如，表现出一种或多种测量的多能性)。在一些实施例中，在培养步骤期间或之后的一个或多个时间，人干细胞表达可检测水平的以下一种或多种：SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-49/6E、ALP、Sox2、E-钙粘蛋白、UTF-1、Oct4、Rex1和Nanog。在一些实施例中，在培养步骤期间或之后的时间，人干细胞保留分化成内胚层、中胚层和外胚层胚层细胞的能力。
在另一个方面，本披露的特征在于一种细胞培养物，其包含(i)胚胎干细胞或诱导型多能干细胞和(ii)包含激活素的细胞培养基，其中胚胎干细胞或诱导型多能干细胞经基因工程化以不表达TGFβRII和/或CISH。
在一些实施例中，RNA指导的核酸酶是Cas12a变体。在一些实施例中，Cas12a变体包含选自M537R、F870L和H800A的氨基酸取代。在一些实施例中，Cas12a变体包含氨基酸取代M537R、F870L和H800A。在一些实施例中，Cas12a变体包含根据SEQ ID NO:1148的氨基酸序列。
附图说明
当与附图一起阅读时，从各种说明性实施例的以下描述中将更充分地理解本文描述的本教导。应当理解，以下描述的附图仅用于说明目的并且不旨在以任何方式限制本教导的范围。
图1显示了在不存在或存在激活素A(1ng/ml或4ng/ml ActA)的情况下在各种培养基中生长的人诱导型多能干细胞(hiPSC)的细胞形态学显微镜检查和多能性标志物流式细胞术。
图2显示TGFβRII敲除hiPSC(克隆7)或CISH/TGFβRII DKO hiPSC(克隆7)在含有或不含有激活素A(1ng/mL、2ng/mL、4ng/mL或10ng/mL)的培养基中培养的形态。
图3显示TGFβRII敲除hiPSC(克隆9)在含有或不含有激活素A(1ng/mL、2ng/mL、4ng/mL或10ng/mL)的培养基中培养的形态。
如图4A显示单敲除和双敲除hiPSC在CISH和TGFβRII基因座处的批量编辑率。
图4B显示在激活素A中培养的TGFβRII敲除hiPSC、CISH敲除hiPSC和双敲除hiPSC中Oct4和SSEA4的表达。
图5显示在激活素A中培养的TGFβRII敲除hiPSC、CISH敲除hiPSC和双敲除hiPSC中Nanog和Tra-1-60的表达。
图6是与STEMdiffTM三系分化试剂盒(干细胞技术公司(STEMCELL TechnologiesInc.))相关的程序示意图。
图7A显示在激活素A中培养的TGFβRII敲除hiPSC、CISH敲除hiPSC和双敲除hiPSC的分化标志物的表达。
图7B显示在激活素A中培养的TGFβRII/CISH双敲除hiPSC的核型。
如图7C显示了在未经编辑的亲代PSC系、经编辑的TGFβRII KO克隆(C7)和称为RUCDR的另外的代表性(未经编辑的)细胞系上进行的扩展激活素A浓度曲线。保持每个系所需的最小激活素A浓度略有不同，其中TGFβRII KO克隆需要与亲代对照相比更高的激活素A基线量(0.5ng/ml相比于0.1ng/ml)。
图7D显示当仅与基础培养基一起培养时(无补充激活素A)，未经编辑的亲代PSC系、经编辑的TGFβRII KO克隆(C7)和未经编辑的RUCDR细胞系中的干性标志物表达。TGFβRII KO iPSC不保持干性标志物表达，而两个未经编辑的系能够保持E8中的干性标志物表达。
图8A是用于产生经编辑的iPSC克隆的示例性方法，随后是增强的CD56+iNK细胞的分化和表征的示意图。
图8B是在分化过程的第二阶段期间利用STEMDiff APEL2的iNK细胞分化过程的示意图。
图8C是在分化过程的第二阶段期间利用具有15％血清的NK-MACS的iNK细胞分化过程的示意图。
图8D显示当分别使用如图8C和图8B中描绘的NK-MACS或Apel2方法分化时，在分化的第39天，未经编辑的PCS衍生的iNK细胞的倍数扩增和表达CD45和CD56的iNK细胞的百分比。
图8E在上分图中显示了当分别使用如图8C和图8B中描绘的NK-MACS或APEL2方法分化时，衍生自未经编辑的PCS iPSC的分化的iNK细胞的表面表达表型(测量为群体的百分比)的热图。底图显示代表性直方图，以说明两种方法生成的iNK的差异。
图8F显示了当分别使用如图8C和图8B中描绘的NK-MACS或APEL2方法分化时，分化的经编辑iNK(TGFβRII敲除、CISH敲除和双敲除(DKO))和未经编辑的亲代iPSC(WT)的表面表达表型(测量为群体的百分比)的热图。
图8G显示使用NK-MACS或APEL2方法分化时未经编辑的iNK细胞效应子功能，如图8C和图8B中分别描述。
图9显示与亲代野生型克隆相比，经编辑的克隆(TGFβRII敲除、CISH敲除和双敲除)的分化表型。
图10显示与亲代克隆iNK和野生型细胞相比，经编辑的iNK的表面表达表型(TGFβRII敲除、CISH敲除和双敲除)。
图11A显示与亲代克隆iNK(“WT”)和外周血衍生的自然杀伤细胞相比，经编辑的iNK(TGFβRII敲除、CISH敲除和双敲除)的表面表达表型。
图11B是流式细胞术直方图，其显示与亲代克隆iNK细胞(“未经编辑的iNK细胞”)相比，经编辑的iNK细胞(TGFβRII/CISH双敲除)的表面表达表型。
图11C显示与亲代克隆iNK细胞(“未经编辑的iNK细胞”)相比，经编辑的iNK细胞(TGFβRII/CISH双敲除)在hiPSC分化后第25天、第32天和第39天的表面表达表型(测量为群体的百分比)(来自至少5个独立分化的平均值)。
图11D显示在IL-15诱导激活后10分钟和120分钟与亲代克隆CD56+iNK细胞(“未经编辑的iNK”)相比，经编辑的CD56+iNK细胞(“CISH KO iNK”)的pSTAT3表达表型(测量为群体的百分比)。简而言之，第39天或第40天在细胞因子饥饿条件下在前一天接种iNK。第二天，用10ng/ml IL15刺激细胞指定的时间长度。细胞在时间点结束时立即固定，对CD56进行染色，然后进行细胞内染色。细胞在NovoCyte Quanteon上进行处理，并在FlowJo中分析数据。显示的数据是进行的>3个实验的代表性实验。
图11E显示与亲代克隆CD56+iNK细胞(“未经编辑的iNK细胞”)相比，经编辑的CD56+iNK细胞(TGFβRII/CISH双敲除，“DKO iNK”)在IL-15和TGF-β诱导激活后10分钟和120分钟时的pSMAD2/3表达表型(测量为群体的百分比)简而言之，将第39天或第40天的iNK在前一天在细胞因子饥饿条件下铺板。第二天，用10ng/ml IL-15和50ng/ml TGF-β刺激细胞指定的时间长度。细胞在时间点结束时立即固定，对CD56进行染色，然后进行细胞内染色。细胞在NovoCyte Quanteon上进行处理，并在FlowJo中分析数据。显示的数据是进行的>3个实验的代表性实验。
图11F显示与亲代克隆CD56+iNK细胞(未经编辑的iNK，“WT IFNg”)相比，在有或没有乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)和离子霉素(IMN)刺激情况下，经编辑的CD56+iNK细胞(TGFβRII/CISH双敲除，“DKO IFNg”)的IFN-γ表达表型(测量为群体的百分比)。数据是代表性的。它由单次分化产生，测定中的每个条件都运行2个技术重复。**p<0.05相比于未经编辑的iNK细胞(配对t检验)。
图11G显示与亲代克隆CD56+iNK细胞(未经编辑的iNK细胞，“WT TNFa”相比，在有或没有乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)和离子霉素(IMN)刺激情况下，经编辑的CD56+iNK细胞(TGFβRII/CISH双敲除，“DKO TNFa”)的TNF-α表达表型(测量为群体的百分比))。数据是代表性的。它由单次分化产生，测定中的每个条件都运行2个技术重复。**p<0.05相比于未经编辑的iNK细胞(配对t检验)。
图12A是示例性实体瘤细胞杀伤测定的示意图，描绘了在IL-15和TGF-β存在或不存在的情况下使用经编辑的iNK细胞(TGFβRII/CISH双敲除)来杀伤SK-OV-3卵巢细胞。
图12B显示了如图12A中所述的实体瘤杀伤测定的结果。iNK细胞的功能是减小肿瘤细胞球状体大小。某些经编辑的iNK细胞(CISH单敲除，“CISH_2、4、5和8”)与亲代克隆iNK细胞(“WT_2”)没有显著差异，而某些经编辑的iNK细胞(TGFβRII单敲除，“TGFβRII_7”，和TGFβRII/CISH双敲除“DKO”)与亲代克隆iNK细胞(“WT_2”)相比，在存在TGF-β的情况下测量时，在效应细胞-靶细胞(E:T)比率为1或更高时效果显著更好。****p<0.0001相比于未经编辑的iNK细胞(双向ANOVA，Sidak多重比较检验)。
图12C显示与未经编辑的iNK细胞相比，经编辑的iNK细胞效应子功能。
图13显示体外连续杀伤测定的结果，其中在10ng/ml IL-15和10ng/ml TGF-β的存在下用血液癌细胞(例如，Nalm6细胞)连续激发iNK细胞；X轴代表时间，每48小时添加肿瘤细胞，而Y轴代表通过归一化的总红色物体面积(例如，肿瘤细胞的存在)测量的杀伤效力。数据显示，经编辑的iNK细胞(TGFβRII/CISH双敲除)继续杀伤血液癌细胞，而未经编辑的iNK细胞在相同时间点失去此功能。
图14显示与亲代克隆iNK细胞(“WT”)相比，某些经编辑的iNK克隆细胞(CISH单敲除“CISH_C2、C4、C5和C8”、TGFβRII单敲除“TGFβRII-C7”和TGFβRII/CISH双敲除“DKO-C1”)当在1ng/mL或10ng/mL IL-15存在下培养时在hiPSC分化后第25天、第32天和第39天的表面表达表型(测量为群体的百分比)。
图15A是体内肿瘤杀伤测定的示意图。用1x106个SKOV3-luc细胞对小鼠进行腹膜内接种，将小鼠随机分组，4天后，将20x106个iNK细胞引入腹膜内。在肿瘤植入后对小鼠进行长达60天的追踪。X轴表示自植入以来的时间，而Y轴表示通过总生物发光(p/s)测量的杀伤效力。
图15B显示了如图15A中所述的体内肿瘤杀伤测定的结果。每条水平线代表单独小鼠。数据显示，未经编辑的iNK细胞(“未经编辑的iNK”)和DKO编辑的iNK细胞(TGFβRII/CISH双敲除)均比媒剂更好地防止肿瘤生长，而经编辑的iNK细胞在体内比媒剂显著更好地杀伤肿瘤细胞。每个实验组各有9只动物。***p<0.001，****p<0.0001，通过2向ANOVA分析。
图15C显示了图15B中描述的体内肿瘤杀伤测定的具有平均值标准误差的平均结果。小鼠群体由每条水平线表示。数据显示，DKO编辑的iNK细胞(TGFβRII/CISH双敲除)在体内比媒剂或未经编辑的iNK细胞显著更好地抑制肿瘤生长和杀伤肿瘤细胞。***p<0.001，****p<0.0001，通过2向ANOVA分析。
图16A显示与亲代克隆iNK细胞(“PCS_WT”)相比，批量的经编辑的iNK细胞(左分图-ADORA2A单敲除)或某些经编辑的iNK克隆细胞(右分图-ADORA2A单敲除)在hiPSC分化后的第25天、第32天和第39天或第28天、第36天和第39天的表面表达表型(测量为群体的百分比)。来自多个分化的代表性数据。
图16B显示与亲代克隆iNK细胞(“未经编辑的iNK”)相比，经编辑的iNK克隆细胞(ADORA2A单敲除)在5′-(N-乙基甲酰胺基)腺苷(“NECA”，腺苷激动剂)激活后的环AMP(cAMP)浓度表型。Y轴代表以nM为单位的平均cAMP浓度(代表ADORA2A激活)，而X轴代表以nM为单位的NECA浓度。
图16C显示体外连续杀伤测定的结果，其中在100μM NECA和10ng/ml IL-15的存在下用血液癌细胞(例如，Nalm6细胞)连续激发iNK细胞；X轴代表时间，每48小时添加肿瘤细胞，而Y轴代表通过总红色物体面积(例如，肿瘤细胞的存在)测量的杀伤效力。数据显示，在模拟腺苷抑制的条件下，经编辑的iNK细胞(“ADORA2A KO iNK”)比未经编辑的iNK细胞(“Ctrl iNK”)更有效地杀伤血液癌细胞。
图17A显示在hiPSC分化后的第25天、第32天和第39天与亲代克隆iNK细胞(“WT_2”)相比，某些经编辑的iNK克隆细胞(TGFβRII/CISH/ADORA2A三重敲除，“CRA_6”和“CR+A_8”)的表面表达表型(测量为群体的百分比))。数据是多个分化的代表。
图17B显示与亲代克隆iNK细胞(“未经编辑的iNK”)相比，经编辑的iNK克隆细胞(TGFβRII/CISH/ADORA2A三重敲除，“TKO iNK”)在NECA(腺苷激动剂)激活后的环AMP(cAMP)浓度表型。Y轴代表以nM为单位的平均cAMP浓度(代表ADORA2A激活)，而X轴代表以nM为单位的NECA浓度。
图17C显示了如图12A中所述的没有IL-15时实体瘤杀伤测定的结果。iNK细胞的功能是减小肿瘤细胞球状体大小。Y轴测量总的积分红色物体(例如，肿瘤细胞的存在)，而X轴表示效应细胞与靶细胞(E:T)的比率。当在TGF-β存在下测量时，与亲代克隆iNK细胞(“对照组”)相比(至少3个独立分化的平均值)，经编辑的iNK细胞(ADORA2A单敲除“ADORA2A”，TGFβRII/CISH双敲除“DKO”，或TGFβRII/CISH/ADORA2A三敲除“TKO”)的EC50率较低。
图18显示在iPSC中利用体外编辑对基因座TGFβRII、CISH、ADORA2A、TIGIT和NKG2A的指导RNA选择测定的结果。
具体实施方式
本披露的一些方面至少部分基于以下认识：令人惊讶的是，干细胞，例如胚胎干细胞或诱导型多能干细胞，可以在包含激活素A的培养基中培养，并且培养基中激活素的存在消除了对培养基中存在TGFβ信号传导激动剂例如TGFβ的要求。本披露的一些方面涉及以下认识：令人惊讶的是，干细胞，包括人干细胞，例如人胚胎干细胞或人诱导型多能干细胞，当在包含激活素例如激活素A的培养基中甚至在培养基中不存在TGFβ信号传导激动剂例如TGFβ的情况下培养时保持其多能性。此外，本披露部分基于以下认识：令人惊讶的是，缺乏TGFβIIR(例如，基因敲除，例如，通过基因编辑)的iPSC可以在包含激活素的培养基中培养，并且此类细胞不仅生长而且保持其多能性。本披露另外涵盖包括胚胎干细胞和包含激活素的培养基的细胞培养物，以及培养此类干细胞和/或其后代的方法。
定义和缩写
除非另外指定，否则以下术语中的每一个具有此章节中阐述的含义。
不定冠词“一个”(“a”和“an”)是指至少一个相关名词，并且可与术语“至少一个”和“一个或多个”互换使用。连词“或”和“和/或”可作为非排他析取词互换使用。
如本文所用，术语“癌症”(也可与术语“过度增殖”和“赘生”互换使用)是指具有自主生长能力的细胞，即由快速增殖细胞生长表征的异常状态或病症。癌性疾病状态可以分类为病理性，即表征或构成疾病状态，例如恶性肿瘤生长，或者可以被分类为非病理性，即偏离正常但与疾病状态无关，例如与伤口修复相关的细胞增殖。该术语意在包括所有类型的癌性生长或致癌过程，转移组织或恶性转化细胞、组织或器官，而不论组织病理学类型或侵袭性阶段如何。在一些实施例中，“癌症”包括影响各种器官系统(例如肺、乳腺、甲状腺、淋巴、胃肠道和泌尿生殖道)的恶性肿瘤。在一些实施例中，“癌症”包括腺癌，其包括恶性肿瘤，例如大多数结肠癌、肾细胞癌、前列腺癌和/或睾丸肿瘤、非小细胞肺癌、小肠癌和/或食道癌。
如本文所用，术语“癌”是指上皮或内分泌组织的恶性病，包括呼吸系统癌、胃肠系统癌、泌尿生殖系统癌、睾丸癌、乳腺癌、前列腺癌、内分泌系统癌和黑素瘤。如本文所用，术语癌是本领域公认的。示例性癌包括由宫颈、肺、前列腺、乳腺、头和颈、结肠和卵巢的组织形成的癌。在一些实施例中，癌还包括癌肉瘤，例如，其包括由癌性和肉瘤性组织组成的恶性肿瘤。在一些实施例中，“腺癌”是衍生自腺体组织的癌或其中肿瘤细胞形成可识别的腺体结构的癌。在一些实施例中，“肉瘤”是本领域公认的，并且是指间充质衍生的恶性肿瘤。
如本文所用，术语“分化”是非特化(“非专能”)或较少特化的细胞获取特化细胞例如血细胞或肌细胞的特征的过程。在一些实施例中，分化的或分化诱导的细胞是在细胞谱系中占据更特化(“专能”)位置的细胞。例如，在用细胞培养基中的适合分化因子处理后，可以将iPSC分化为各种更高分化的细胞类型，例如神经干细胞或造血干细胞、淋巴细胞、心肌细胞和其他细胞类型。在一些实施例中，用于将多潜能和多能细胞类型分化为更高分化的细胞类型的适合的方法、分化因子和细胞培养基是本领域技术人员熟知的。在一些实施例中，术语“专能”应用于分化过程是指在分化路径中行进到如下的点的细胞，其中在正常情况下，它会或将继续分化为特定的细胞类型或细胞类型的子集，并且在正常情况下，不能分化成不同的细胞类型(除特定的细胞类型或细胞类型的子集外)，也不能恢复到分化程度较低的细胞类型。
如本文所用，术语“分化标志物”、“分化标志物基因”或“分化基因”是指其表达指示细胞(如多潜能细胞)中发生的细胞分化的基因或蛋白质。在一些实施例中，分化标志物基因包括但不限于以下基因：CD34、CD4、CD8、CD3、CD56(NCAM)、CD49、CD45；NK细胞受体(分化簇16(CD16))、自然杀伤组2成员D(NKG2D)、CD69、NKp30、NKp44、NKp46、CD158b、FOXA2、FGF5、SOX17、XIST、NODAL、COL3A1、OTX2、DUSP6、EOMES、NR2F2、NR0B1、CXCR4、CYP2B6、GATA3、GATA4、ERBB4、GATA6、HOXC6、INHA、SMAD6、RORA、NIPBL、TNFSF11、CDH11、ZIC4、GAL、SOX3、PITX2、APOA2、CXCL5、CER1、FOXQ1、MLL5、DPP10、GSC、PCDH10、CTCFL、PCDH20、TSHZ1、MEGF10、MYC、DKK1、BMP2、LEFTY2、HES1、CDX2、GNAS、EGR1、COL3A1、TCF4、HEPH、KDR、TOX、FOXA1、LCK、PCDH7、CD1D FOXG1、LEFTY1、TUJ1、T基因(Brachyury)、ZIC1、GATA1、GATA2、HDAC4、HDAC5、HDAC7、HDAC9、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH4、PAX5、RBPJ、RUNX1、STAT1和STAT3。
如本文所用，术语“分化标志物基因谱”或“分化基因谱”、“分化基因表达谱”、“分化基因表达签名”、“分化基因表达面板”、“分化基因面板”或“分化基因签名”是指多种分化标志物基因的表达或表达水平。
如本文所用，术语“经编辑的iNK细胞”是指自然杀伤细胞，其已被修饰以在细胞发育的某个时间点改变至少一种基因的至少一种表达产物。在一些实施例中，可以使用例如基因编辑技术如CRISPR-Cas或例如显性失活构建体来引入修饰。在一些实施例中，在iNK细胞分化成iNK细胞之前的时间点编辑iNK细胞，例如在前体阶段、在干细胞阶段等。在一些实施例中，将经编辑的iNK细胞与未经编辑的iNK细胞(通过分化iPSC细胞产生的NK细胞，该iPSC细胞和/或iNK细胞没有修饰，例如基因修饰)进行比较。
如本文所用，术语“胚胎干细胞”是指衍生自胚胎囊胚的内细胞团的多潜能干细胞。在一些实施例中，胚胎干细胞是多能的并且在发育过程中产生以下三个初级胚层的所有衍生物：外胚层、内胚层和中胚层。在一些这样的实施例中，胚胎干细胞对胚胎外膜或胎盘没有贡献，即，不是全能的。
如本文所用，在核酸(例如，基因、蛋白质编码基因组区域、启动子)的背景下，术语“内源”是指在例如细胞的基因组内其自然位置的天然核酸或蛋白质。
本文在核酸例如表达构建体、cDNA、插缺和核酸载体的背景下所用的术语“外源”是指使用例如基因编辑或基因工程技术(例如基于CRISPR的编辑技术)已人工引入细胞的基因组中的核酸。
术语“基因组编辑系统”是指具有RNA指导的DNA编辑活性的任何系统。
术语“指导RNA”和“gRNA”是指促进RNA指导的核酸酶(例如Cas9或Cpf1(Cas12a))与细胞中的靶序列(例如基因组或附加体序列)的特异性缔合(或“靶向”)的任何核酸。
如本文所用，术语“造血干细胞”或“确定性造血干细胞”是指CD34阳性干细胞。在一些实施例中，CD34阳性干细胞能够产生成熟的髓系细胞和/或淋巴细胞类型。在一些实施例中，髓系细胞和/或淋巴细胞类型包括例如T细胞、自然杀伤细胞和/或B细胞。
如本文所用，术语“诱导型多能干细胞”或“iPSC”是指通过称为重编程的过程(例如，去分化)从分化的体细胞(例如成人、新生儿或胎儿)细胞获得的干细胞。在一些实施例中，重编程的细胞能够分化成所有三个胚层或真皮层的组织：中胚层、内胚层和外胚层。iPSC在自然界中不存在。
如本文所用，术语“多能干细胞”是指具有分化为具有一个或多个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)但非全部三个胚层的细胞的发育潜力的细胞。因此，在一些实施例中，多能细胞也可以称为“部分分化的细胞”。多能细胞在本领域中是熟知的，并且多能细胞的实例包括成体干细胞，例如像造血干细胞和神经干细胞。在一些实施例中，“多能”指示细胞可以形成许多类型的给定谱系细胞(而非其他谱系细胞)。例如，多能造血细胞可以形成许多不同类型的血细胞(红细胞、白细胞、血小板等)，但不能形成神经元。因此，在一些实施例中，“多能性”是指发育潜力程度低于全能和多潜能的细胞的状态。
如本文所用，术语“多能”是指细胞形成身体或体细胞(即胚体)或给定生物体(例如，人)的所有谱系的能力。例如，胚胎干细胞是一种类型的多潜能干细胞，其能够由三个胚层即外胚层、中胚层和内胚层中每个形成细胞。一般来说，多能性可以描述为范围自不能够产生完整生物体的不完全或部分多潜能细胞(例如，上胚层干细胞或EpiSC)至能够产生完整生物体的更原始、更具潜能的细胞(例如，胚胎干细胞或诱导性多潜能干细胞)的发育潜能的连续体。
如本文所用，术语“多能性”是指具有分化成所有三个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)细胞的发育潜力的细胞。在一些实施例中，可以部分地通过评估细胞的多潜能性特征来确定多潜能性。在一些实施例中，多潜能性特征包括但不限于：(i)多潜能干细胞形态；(ii)无限自我更新的潜力；(iii)多能干细胞标志物的表达，包括但不限于SSEA1(仅限小鼠)、SSEA3/4、SSEA5、TRA1-60/81、TRAl-85、TRA2-54、GCTM-2、TG343、TG30、CD9、CD29、CD133/prominin、CD140a、CD56、CD73、CD90、CD105、OCT4、NANOG、SOX2、CD30和/或CD50；(iv)分化为所有三种体细胞谱系(外胚层、中胚层和内胚层)的能力；(v)由三种体细胞谱系组成的畸胎瘤形成；以及(vi)由来自三种体细胞谱系的细胞组成的拟胚体的形成。
如本文所用，术语“多能干细胞形态”是指胚胎干细胞的经典形态特征。在一些实施例中，正常胚胎干细胞形态的特征在于小且圆形的形状(具有高核质比)、明显存在核仁、以及典型的细胞内间隙。
如本文所用，术语“多核苷酸”(包括但不限于“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”、“核酸序列”和“寡核苷酸”)是指DNA和RNA中的一系列核苷酸碱基(也称为“核苷酸”)，并且意指两个或更多个核苷酸的任何链。在一些实施例中，多核苷酸、核苷酸序列、核酸等可以是嵌合混合物或其衍生物或经修饰的形式，单链或双链。在一些这样的实施例中，修饰可以发生在碱基部分、糖部分或磷酸骨架上，例如，以改善分子的稳定性、其杂交参数等。通常，核苷酸序列典型地携带基因信息，包括但不限于细胞器用于制造蛋白质和酶的信息。在一些实施例中，核苷酸序列和/或基因信息包括双链或单链基因组DNA、RNA、任何合成的和经基因操作的多核苷酸，和/或有义和/或反义多核苷酸。在一些实施例中，核酸含有经修饰的碱基。
常规IUPAC表示法用于本文所呈现的核苷酸序列中，如下表1中所示(还参见Cornish-Bowden A，Nucleic Acids Res.[核酸研究]1985年5月10日；13(9):3021-30，通过引用并入本文)。然而应注意，在序列可能由DNA或者RNA编码的那些情况下，例如在gRNA靶向结构域中，“T”表示“胸腺嘧啶或尿嘧啶”。
表1：IUPAC核酸表示法
符号 碱基
A 腺嘌呤
T 胸腺嘧啶或尿嘧啶
G 鸟嘌呤
C 胞嘧啶
U 尿嘧啶
K G或T/U
M A或C
R A或G
Y C或T/U
S C或G
W A或T/U
B C、G或T/U
V A、C或G
H A、C或T/U
D A、G或T/U
N A、C、G或T/U
如本文所用，术语“潜能”或“发育潜能”是指细胞可获得的所有发育选择的总和(即，发育潜能)，特别是例如在细胞发育潜力的情况下，在一些实施例中，细胞潜能的连续体包括但不限于全能细胞、多潜能细胞、多能细胞、寡能细胞、单能细胞和末端分化细胞。
如本文所用，术语“预防(prevent/preventing/prevention)”是指预防哺乳动物(例如人)的疾病，包括：(a)避免或预先排除疾病；(b)影响朝向疾病的倾向；或(c)预防或延迟疾病的至少一种症状的发作。
如本文所用，术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可互换使用，是指通过肽键连接在一起的氨基酸的连续链。这些术语包括个别蛋白质、缔合在一起的蛋白质的组或复合物，以及此类蛋白质的片段或部分、变体、衍生物和类似物。除非另有说明，肽序列使用常规表示法呈现于本文中，在左侧以氨基或N末端开始，并且前进至右侧的羧基或C末端。可以使用标准单字母或三字母缩写。
如本文所用，术语“重编程”或“脱分化”或“增加细胞潜能”或“增加发育潜能”是指增加细胞潜能或将细胞分化为较低分化状态的方法。例如，在一些实施例中，与非重编程状态的相同细胞相比，具有增加的细胞潜能的细胞具有更多的发育可塑性(即，可以分化为更多细胞类型)。即，在一些实施例中，重编程细胞是处于比在非重编程状态下相同细胞更低分化状态的细胞。在一些实施例中，“重编程”是指将体细胞或多潜能干细胞分化为多潜能干细胞，也称为诱导性多潜能干细胞或iPSC。用于由体细胞或多能干细胞产生iPSC的适合方法是本领域技术人员所熟知的。
术语“RNA指导的核酸酶”和“RNA指导的核酸酶分子”在本文可互换使用。在一些实施例中，RNA指导的核酸酶是RNA指导的DNA内切核酸酶。在一些实施例中，RNA指导的核酸酶是CRISPR核酸酶。RNA指导的核酸酶的非限制性实例列于下表2中，并且本文披露的方法和组合物可以使用本文披露的或本领域普通技术人员已知的RNA指导的核酸酶的任何组合。本领域普通技术人员将知道适用于本披露的背景下的另外的核酸酶和核酸酶变体，并且应该理解本披露在这方面不受限制。
表2.RNA指导的核酸酶
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Figure BDA0003723238800000381
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考虑到本披露，另外的适合的RNA指导的核酸酶(例如Cas9和Cas12核酸酶)对于本领域技术人员将是显而易见的，并且本披露不受本文提供的示例性的适合核酸酶的限制。在一些实施例中，适合的核酸酶是Cas9或Cpf1(Cas12a)核酸酶。在一些实施例中，本披露还包括核酸酶变体，例如Cas9或Cpf1核酸酶变体。在一些实施例中，核酸酶是核酸酶变体，其是指包含由与核酸酶的野生型氨基酸序列相比的一个或多个氨基酸取代、缺失或添加表征的氨基酸序列的核酸酶。在一些实施例中，合适的核酸酶和/或核酸酶变体还可以包括纯化标签(例如，多组氨酸标签)和/或信号肽，例如，包含核定位信号序列或由其组成。在本文其他地方更详细地描述了适合的核酸酶和核酸酶变体的一些非限制性实例，并且还包括于2019年3月14日提交且标题为“用于治疗血红蛋白病的系统和方法”的PCT申请PCT/US2019/22374中描述的那些，该申请的全部内容通过引用并入本文。在一些实施例中，RNA指导的核酸酶是氨基酸球菌属物种(Acidaminococcus sp.)Cpf1变体(AsCpf1变体)。在一些实施例中，适合的Cpf1核酸酶变体(包括适合的AsCpf1变体)对于本领域普通技术人员而言将是已知的或显而易见的，并且包括但不限于本文披露的Cpf1变体或本领域已知的其他。例如，在一些实施例中，RNA指导的核酸酶是氨基酸球菌属Cpf1RR变体(AsCpf1-RR)。在另一个实施例中，RNA指导的核酸酶是Cpf1 RVR变体。例如，适合的Cpf1变体包括具有M537R取代、H800A取代和/或F870L取代或其任何组合(根据AsCpf1野生型序列的编号方案)的那些。
如本文所用，术语“受试者”是指人或非人动物。在一些实施例中，人受试者可以是任何年龄(例如胎儿、婴儿、儿童、年轻成人或成人)。在一些实施例中，人受试者可能有患疾病的风险或患有疾病，或者可能需要改变基因或特定基因的组合。可替代地，在一些实施例中，受试者可以是非人动物，其可以包括但不限于哺乳动物。在一些实施例中，非人动物是非人灵长类动物、啮齿动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等)、兔、狗、猫等。在本披露的某些实施例中，非人动物对象是家畜，例如，马、绵羊、山羊等。在某些实施例中，非人动物对象是家禽，例如鸡、火鸡、鸭等。
如本文所用，术语“治疗(treatment、treat和treating)”是指临床干预，该临床干预旨在逆转、减轻、延迟以下的发作或抑制以下的进展，改善、降低以下的严重程度，预防或延迟以下的复发：疾病、障碍或病症或其一种或多种症状善，和/或改善如本文所述的疾病、障碍或病症的一种或多种症状。在一些实施例中，病症包括损伤。在一些实施例中，损伤可以是急性的或慢性的(例如，来自潜在疾病或障碍的组织损伤，该潜在疾病或障碍导致例如诸如组织损伤的继发性损伤)。在一些实施例中，可以在发展一种或多种症状之后和/或诊断出疾病之后向受试者施用例如如本文所述的经修饰的NK细胞或经修饰的NK细胞群的形式的治疗。治疗可以在不存在症状的情况下施用，例如，以预防或延迟症状或者抑制疾病的发作或进展。例如，在一些实施例中，可以在症状发作之前向易感个体施用治疗(例如，鉴于基因或其他易感因子)。在一些实施例中，治疗也可以在症状消退后继续，例如以预防或延迟其复发。在一些实施例中，治疗导致疾病、障碍或病症的一种或多种症状的改善和/或消退。
如本文所用，术语“变体”是指诸如多肽、多核苷酸或小分子的实体，其与参照实体显示出显著的结构同一性，但与参照实体相比，在一个或多个化学部分的存在或水平方面与参照实体在结构上不同。在许多实施例中，变体在功能上也与其参考实体不同。通常，特定实体是否被恰当地视为参照实体的“变体”是基于其与参照实体的结构同一性程度。
干细胞
本披露的方法可用于培养干细胞。干细胞通常是具有产生未改变的子细胞(自我更新；细胞分裂产生至少一个与亲代细胞相同的子细胞)并产生特化细胞类型(潜能)的能力的细胞。干细胞包括但不限于胚胎干细胞(ES)、胚胎生殖(EG)细胞、生殖系干(GS)细胞、人间充质干细胞(hMSC)、脂肪组织来源干细胞(ADSC)、多能成体祖细胞(MAPC)、多能成体生殖系干细胞(maGSC)和非限制性体干细胞(USSC)。一般来说，干细胞可以无限分裂。分裂后，干细胞可以保持为干细胞，成为前体细胞，或进行终末分化。前体细胞是可以产生至少一种给定细胞类型的完全分化的功能细胞的细胞。通常，前体细胞可以分裂。分裂后，前体细胞可以保持为前体细胞，或者可以进行终末分化。
多能干细胞在本领域中通常是已知的。本披露提供与多能干细胞相关的技术(例如，系统、组合物、方法等)。在一些实施例中，多能干细胞是以下干细胞，其：(a)在移植到免疫缺陷(SCID)小鼠中时能够诱导畸胎瘤；(b)能够分化为所有三个胚层的细胞类型(例如，可以分化为外胚层、中胚层和内胚层细胞类型)；和/或(c)表达胚胎干细胞的一种或多种标志物(例如，人胚胎干细胞表达Oct4、碱性磷酸酶、SSEA-3表面抗原、SSEA-4表面抗原、nanog、TRA-1-60、TRA-1-81、SOX2、REX1等)。在一些方面，人多能干细胞不表现出分化标志物的表达。在一些实施例中，使用本披露的方法培养的ES细胞和/或iPSC保持它们的多能性(例如，(a)当移植到免疫缺陷(SCID)小鼠中时能够诱导畸胎瘤；(b)能够分化为所有三个胚层的细胞类型(例如，可以分化为外胚层、中胚层和内胚层细胞类型)；和/或(c)表达一种或多种胚胎干细胞标志物)。
在一些实施例中，ES细胞(例如，人ES细胞)可以来源于囊胚或桑椹胚的内细胞团。在一些实施例中，ES细胞可以从胚胎的一个或多个卵裂球中分离，例如，不破坏胚胎的其余部分。在一些实施例中，ES细胞可以通过体细胞核移植产生。在一些实施例中，ES细胞可以来源于卵细胞与精子或DNA的受精、核移植、孤雌生殖，或通过产生ES细胞的方式，例如在HLA区域中具有纯合性。在一些实施例中，人ES细胞可以产生或衍生自通过以下产生的受精卵、卵裂球或囊胚阶段哺乳动物胚胎：精子和卵细胞的融合、核移植、孤雌生殖或染色质重编程以及随后将重编程的染色质掺入质膜中以产生胚胎细胞。示例性人ES细胞是本领域已知的并且包括但不限于MAO1、MAO9、ACT-4、No.3、H1、H7、H9、H14和ACT30 ES细胞。在一些实施例中，人ES细胞，无论其来源或用于产生它们的特定方法如何，都可以基于以下来鉴定：例如(i)分化成所有三个胚层细胞的能力，(ii)表达至少Oct-4和碱性磷酸酶，和/或(iii)移植到免疫功能低下的动物体内时产生畸胎瘤的能力。在一些实施例中，ES细胞已作为细胞系连续传代。
iPSC
诱导型多能干细胞(iPSC)是一种通过诱导某些基因的表达人工衍生自非多能细胞，例如成体体细胞(例如，成纤维细胞或其他合适的体细胞)的多能干细胞。iPSC可以来源于任何生物体，例如哺乳动物。在一些实施例中，iPSC由小鼠、大鼠、兔、豚鼠、山羊、猪、牛、非人灵长类动物或人产生。iPSC在许多方面与ES细胞相似，例如某些干细胞基因和蛋白质的表达、染色质甲基化模式、倍增时间、胚状体形成、畸胎瘤形成、可行的嵌合体形成、潜能和/或可分化性。用于产生iPSC的各种合适方法是本领域已知的。在一些实施例中，iPSC可以通过将某些干细胞相关基因(例如Oct-3/4(Pouf51)和Sox2)转染到非多能细胞例如成体成纤维细胞中而得到。转染可以通过病毒载体实现，例如逆转录病毒、慢病毒或腺病毒。其他合适的重编程方法包括使用不整合到宿主细胞基因组中的载体，例如游离型载体，也已经描述了通过编码RNA或作为蛋白质直接递送重编程因子。例如，可以使用逆转录病毒系统用Oct3/4、Sox2、Klf4和/或c-Myc转染细胞，或者使用慢病毒系统用OCT4、SOX2、NANOG和/或LIN28转染细胞。3-4周后，少量转染细胞开始在形态和生化上与多能干细胞相似，可通过形态选择、倍增时间或报告基因和抗生素选择进行分离。在一个实例中，来自成人细胞的iPSC是通过Yu等人(Science[科学]318(5854):1224(2007))或Takahashi等人(Cell[细胞]131:861-72(2007))描述的方法生成的。在一些实施例中，iPSC由商业来源产生。在一些实施例中，iPSC由供应商生成。在一些实施例中，iPSC由合同研究组织生成。用于重编程的许多合适方法是本领域技术人员已知的，并且本披露在这方面不受限制。
基因工程化的干细胞
在一些实施例中，本文所述的干细胞(例如，iPSC)经基因工程化以在本文所述的一种或多种靶标中引入破坏。例如，在一些实施例中，干细胞(例如，iPSC)可以经基因工程化以敲除一个或多个靶基因的全部或部分，在一个或多个靶基因中引入移码，和/或导致编码的基因产物截短(例如，通过引入过早的终止密码子)。在一些实施例中，干细胞(例如，iPSC)可以经基因工程化以使用基因编辑系统(例如，如本文所述)敲除靶基因的全部或部分。在一些这样的实施例中，基因编辑系统可以是或包含CRISPR系统、锌指核酸酶系统、TALEN和/或大范围核酸酶。
TGF信号传导
在某些实施例中，本披露提供了一种经基因工程化的干细胞和/或后代细胞，其包括TGFβ信号传导例如TGFβ信号传导中的破坏。这例如在需要从多能干细胞产生分化细胞的情况下是有用的，其中TGFβ信号传导在分化的细胞中被破坏。
例如，TGFβ信号传导抑制或降低可用于治疗性应用的一些分化的细胞类型的存活和/或活性，例如TGFβ信号传导是自然杀伤细胞的负调节剂，其可用于免疫治疗应用。在一些实施例中，需要产生临床有效数量的自然杀伤细胞，其包含破坏TGFβ信号传导的基因修饰，从而避免TGFβ对此类细胞的临床有效性的负面影响。在一些实施例中，从多能干细胞而不是例如自供体获得的成熟NK细胞中获得这样的NK细胞是有利的。修饰干细胞而不是分化的细胞具有以下优点：允许克隆衍生、表征和/或扩增特定基因型，例如，具有特定基因修饰(例如，在没有任何不希望的(如脱靶)修饰的情况下，对TGFβRII的靶向破坏)的特定干细胞克隆。在一些实施例中，干细胞，例如人iPSC，经基因工程化以不表达一种或多种TGFβ受体，例如TGFβRII，或表达TGFβ受体的显性失活变体，例如显性失活TGFβRII变体。KR710923.1、NM_001024847.2和NM_003242.5中列出了TGFβRII的示例性序列。示例性显性失活TGFβRII在以下中披露：Immunity[免疫].2000年2月；12(2):171-81。
另外的功能丧失修饰
在某些实施例中，本披露提供了经基因工程化的干细胞和/或后代细胞，其另外地或可替代地包括对白介素信号传导例如IL-15信号传导的破坏。IL-15是一种与白介素2(IL-2)结构相似的细胞因子，它结合并通过由IL-2/IL-15受体β链(CD122)和共同的γ链(γ-C，CD132)组成的复合物来发出信号。IL-15的示例性序列在NG_029605.2中提供。IL-15信号传导的破坏可能是有用的，例如，在需要从多能干细胞产生分化的细胞但在分化的细胞中破坏某些信号传导通路(例如，IL-15)的情况下。IL-15信号传导可以抑制或降低某些类型的分化的细胞(例如可用于治疗性应用的细胞)的存活和/或活性。例如，IL-15信号传导是自然杀伤(NK)细胞的负调节剂。CISH(由CISH基因编码)位于IL-15受体下游，可作为NK细胞中IL-15信号传导的负调节剂。如本文所用，术语“CISH”是指细胞因子诱导型含SH2蛋白(参见，例如，Delconte等人,Nat Immunol.[自然免疫学]2016年7月；17(7):816-24；CISH的示例性序列阐述为NG_023194.1)。在一些实施例中，CISH调节的破坏可以增加Jak/STAT通路的激活，导致NK细胞的存活、增殖和/或效应子功能增加。因此，在一些实施例中，与非经基因工程化的NK细胞相比，经基因工程化的NK细胞(例如，iNK细胞，例如，由经基因工程化的hiPSC产生，包括CISH调节的破坏)表现出对IL-15介导的信号传导的更大响应性。在一些这样的实施例中，经基因工程化的NK细胞相对于非经基因工程化的NK细胞表现出更大的效应子功能。
在一些实施例中，经基因工程化的干细胞和/或后代细胞另外地或可替代地包含B2M、NKG2A、PD1、TIGIT、ADORA2a、CIITA、HLA II类组织相容性抗原α链基因、HLA II类组织相容性抗原β链基因、CD32B或TRAC中的一种或多种中的功能破坏和/或丧失。
如本文所用，术语“B2M”(β2微球蛋白)是指发现与几乎全部有核细胞表面的主要组织相容性复合体(MHC)I类重链相关的血清蛋白。B2M的示例性序列阐述为NG_012920.2。
如本文所用，术语“NKG2A(自然杀伤组2A)”是指属于杀伤细胞凝集素样受体家族的蛋白质，该受体家族也称为NKG2家族，是优先在NK细胞中表达的一组跨膜蛋白。该蛋白质家族的特征在于II型膜取向和C型凝集素结构域的存在。参见，例如，Kamiya-T等人,J ClinInvest[临床研究杂志]2019 https://doi.org/10.1172/JCI123955。NKG2A的示例性序列如AF461812.1所示。
如本文所用，术语“PD1”(程序性细胞死亡蛋白1)，也称为CD279(分化簇279)，是指在细胞表面上发现的蛋白质，其具有以下作用：通过下调免疫系统来调节免疫系统对人体细胞的应答，以及通过抑制T细胞炎症活性来促进自身耐受。PD1是免疫检查点并且可预防自身免疫。PD1的示例性序列阐述为NM_005018.3。
如本文所用，术语“TIGIT”(具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体)是指免疫球蛋白的PVR(脊髓灰质炎病毒受体)家族的成员。该基因的产物在几类T细胞上表达，包括滤泡B辅助T细胞(TFH)。NM_173799.4中阐述了TIGIT的示例性序列。
如本文所用，术语“ADORA2A”是指腺苷A2a受体(鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)偶联受体(GPCR)超家族的成员)，其被细分为类别和亚型。该蛋白质是A2A亚型的腺苷受体，用腺苷作为优选的内源激动剂，优先与G蛋白的G(s)和G(olf)家族相互作用，以增加细胞内cAMP水平。NG_052804.1中提供了ADORA2a的示例性序列。
如本文所用，术语“CIITA”是指位于核中的蛋白质，其充当II类主要组织相容性复合体基因转录的正调节子，并且被称为表达这些基因的“主控制因子”。该蛋白质还结合GTP并使用GTP结合促进其自身运输进入核中。该基因中的突变已与裸淋巴细胞综合征II型(也称为遗传性MHC II类缺乏或HLA II类缺乏联合免疫缺陷)相关，对类风湿性关节炎、多发性硬化和可能的心肌梗死的易感性增加。参见，例如，Chang等人,J Exp Med[实验医学杂志]180:1367-1374；和Chang等人,Immunity[免疫力].1996年2月；4(2):167-78，其每一个的全部内容通过引用并入本文。CIITA的示例性序列阐述为NG_009628.1。
在一些实施例中，两个或更多个HLA II类组织相容性抗原α链基因和/或两个或更多个HLA II类组织相容性抗原β链基因被破坏，例如，敲除，例如，通过基因组编辑。例如，在一些实施例中，选自HLA-DQA1、HLA-DRA、HLA-DPA1、HLA-DMA、HLA-DQA2和HLA-DOA的两个或更多个HLA II类组织相容性抗原α链基因被破坏，例如敲除。再如，在一些实施例中，选自HLA-DMB、HLA-DOB、HLA-DPB1、HLA-DQB1、HLA-DQB3、HLA-DQB2、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、和HLA-DRB5的两种或更多种HLA II类组织相容性抗原β链基因被破坏，例如敲除。参见，例如，Crivello等人,J Immunol[免疫学杂志]2019年1月,ji1800257；DOI:https://doi.org/10.4049/jimmunol.1800257，其全部内容通过引用并入本文。
如本文所用，术语“CD32B”(分化簇32B)是指低亲和力免疫球蛋白γFC区受体II-b蛋白，在人体中由FCGR2B基因编码。参见，例如，Rankin-CT等人,Blood[血液]2006 108(7):2384-91，其全部内容通过引用并入本文。
如本文所用，术语“TRAC”是指由TRAC基因座编码的T细胞受体α亚基(恒定区)。
功能获得修饰
在一些实施例中，经基因工程化的干细胞和/或后代细胞，另外地或可替代地，包含导致以下中一种或多种的表达的基因修饰：CAR；非天然存在的FcγRIII变体(CD16)；白介素15(IL-15)；IL-15受体(IL-15R)激动剂，或IL-15受体的组成型活性变体；白介素12(IL-12)；IL-12受体(IL-12R)激动剂，或IL-12受体的组成型活性变体；人白细胞抗原G(HLA-G)；人白细胞抗原E(HLA-E)；或白细胞表面抗原分化簇CD47(CD47)。
如本文所用，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指受体蛋白已经被修饰，以向表达CAR的细胞给出靶向特定蛋白质的新能力。在本披露的背景下，经修饰以包含CAR的细胞可用于针对靶标的免疫疗法并破坏与疾病或障碍相关的细胞，例如癌细胞。
目的CAR包括但不限于靶向间皮素、EGFR、HER2和/或MICA/B的CAR。迄今为止，靶向间皮素的CAR T细胞疗法已显示了在患有间皮瘤、非小细胞肺癌和乳腺癌的受试者的I期临床试验中的早期疗效证据(NCT02414269)。类似地，靶向EGFR、HER2和MICA/B的CAR在早期研究显示了前景(参见，例如，Li等人(2018),Cell Death&Disease[细胞死亡和疾病],9(177)；Han等人(2018)Am.J.Cancer Res.[美国癌症研究杂志],8(1):106-119；和Demoulin2017)Future Oncology[未来肿瘤学],13(8)；每一个的全部内容通过引用的方式明确并入本文)。
CAR为本领域普通技术人员所熟知，并包括例如以下中描述的那些：WO 13/063419(间皮素)、WO 15/164594(EGFR)、WO 13/063419(HER2)、WO 16/154585(MICA和MICB)，其每一项的全部内容明确地通过引用并入本文。靶向细胞(例如NK细胞，例如与疾病或障碍相关的细胞)的任何适合的CAR、NK-CAR或其他结合剂可以在本文提供的经修饰的NK细胞中表达。示例性CAR和结合剂包括但不限于结合BCMA、CD19、CD22、CD20、CD33、CD123、雄激素受体、PSMA、PSCA、Muc1、HPV病毒肽(即E7)、EBV病毒肽、CD70、WT1、CEA、EGFRvIII、IL13Rα2和GD2、CA125、CD7、EpCAM、Muc16、CD30的CAR和结合剂。基于本披露和本领域的一般知识，用于本文提供的经修饰的NK细胞的另外的适合CAR和结合剂对于本领域技术人员而言是显而易见的。这些另外的适合CAR包括Davies和Maher,Adoptive T-cell Immunotherapy ofCancer Using Chimeric Antigen Receptor-Grafted T Cells[使用嵌合抗原受体接枝T细胞的癌症过继性T细胞免疫疗法],Archivum Immunologiae et TherapiaeExperimentalis 58(3):165-78(2010)的图3中描述的那些，该文献的全部内容通过引用并入本文。
如本文所用，术语“CD16”是指免疫球蛋白G的Fc部分的受体(FcγRIII)，并且涉及于从循环中去除抗原抗体复合物以及其他抗体依赖性应答中。
如本文所用，术语“IL-15/IL15RA”或“白介素-15”(IL-15)是指与白介素-2(IL-2)具有结构相似性的细胞因子。与IL-2一样，IL-15与由IL-2/IL-15受体β链(CD122)和常见的γ链(γ-C，CD132)组成的复合物结合和通过其发出信号。在一种或多种病毒感染后，单核吞噬细胞(和一些其他细胞)分泌IL-15。这种细胞因子诱导自然杀伤细胞的细胞增殖；即主要作用是杀死病毒感染细胞的先天免疫系统的细胞。IL-15受体α(IL15RA)以非常高的亲和力特异性结合IL15，并且能够独立于其他亚基结合IL-15。表明该特性允许IL-15由一个细胞产生，被另一个细胞内吞，然后呈递给第三方细胞。据报道IL15RA提高凋亡抑制剂BCL2L1/BCL2-XL和BCL2的细胞增殖和表达。IL-15的示例性序列在NG_029605.2中提供，IL-15RA的示例性序列在NM_002189.4中提供。在一些实施例中，IL-15R变体是组成型活性IL-15R变体。在一些实施例中，组成型活性IL-15R变体是IL-15R和IL-15R激动剂(例如IL-15蛋白或其IL-15R结合片段)的融合体。在一些实施例中，IL-15R激动剂是IL-15，或其IL-15R结合变体。示例性的适合IL-15R变体包括但不限于，例如，描述于以下中的那些：Mortier E等人,2006；The Journal of Biological Chemistry[生物化学杂志]2006 281:1612-1619；或Bessard-A等人,Mol Cancer Ther.[分子癌症治疗学]2009年9月；8(9):2736-45，其每一项的全部内容通过引用并入本文。
如本文所用，术语“IL-12”是指白介素-12，作用于T细胞和自然杀伤细胞的一种细胞因子。在一些实施例中，经基因工程化的干细胞和/或后代细胞包含导致以下中的一种或多种表达的基因修饰：白介素12(IL12)通路激动剂，例如IL-12、白介素12受体(IL-12R)或其变体(例如，IL-12R的组成型活性变体，例如与IL-12R激动剂(IL-12RA)融合的IL-12R。
如本文所用，术语“HLA-G”是指HLA非经典的I类重链旁系同源物。该I类分子是由重链和轻链(β-2微球蛋白)组成的异二聚体。重链锚固在膜中。HLA-G在胎源胎盘细胞上表达。HLA-G是NK细胞抑制性受体KIR2DL4的配体，因此通过滋养层，这种HLA的表达使其防御NK细胞介导的死亡。参见，例如Favier等人,Tolerogenic Function of Dimeric Forms ofHLA-G Recombinant Proteins:A Comparative Study In Vivo[HLA-G重组蛋白二聚体形式的耐受原功能：体内比较性研究]PLOS One[公共科学图书馆·综合]2011，其全部内容通过引用并入本文。HLA-G的示例性序列阐述为NG_029039.1。
如本文所用，术语“HLA-E”是指HLA I类组织相容性抗原，α链E，有时也称为MHC I类抗原E。在人体中HLA-E蛋白由HLA-E基因编码。人HLA-E是一种非经典的MHC I类分子，其特征在于有限的多态性和比其经典旁系同源物低的细胞表面表达。该I类分子是由重链和轻链(β-2微球蛋白)组成的异二聚体。重链锚固在膜中。HLA-E结合由其他I类分子的前导肽衍生的限制性肽子集。HLA-E表达细胞逃避同种异体应答和NK细胞的裂解。参见，例如，Geornalusse-G等人,Nature Biotechnology[自然生物技术]2017 35(8)，其全部内容通过引用并入本文。NM_005516.6中提供了HLA-E蛋白的示例性序列。
如本文所用，术语“CD47”有时也称为“整联蛋白相关蛋白”(IAP)，是指在人体中由CD47基因编码的跨膜蛋白。CD47属于免疫球蛋白超家族，与膜整联蛋白为配偶体，并且还结合配体血小板反应蛋白-1(TSP-1)和信号调节蛋白α(SIRPα)。CD47用作巨噬细胞的信号，允许CD47表达细胞逃避巨噬细胞攻击。参见，例如，Deuse-T等人,Nature Biotechnology[自然生物技术]2019 37:252-258，其全部内容通过引用并入本文。
iNK细胞的产生
在一些实施例中，本披露提供了产生源自本文描述的干细胞的iNK细胞(例如，经基因修饰的iNK细胞)的方法。
在一些实施例中，存在于本披露的iNK细胞中的基因修饰(例如，基因组编辑)可以在从供体细胞到iPSC的重编程过程期间的任何阶段、在iPSC阶段期间和/或在iPSC分化为iNK状态(例如处于中间状态，例如iPSC衍生的HSC状态，或者甚至达到或处于最终iNK细胞状态)过程的任何阶段进行。
例如，本披露的经编辑的iNK细胞中存在的一个或多个基因组编辑可以在一个或多个不同的细胞阶段进行(例如，从供体重编程为iPSC，iPSC分化为iNK)。在一些实施例中，本文提供的经基因修饰的iNK细胞中存在的一个或多个基因组编辑在将供体细胞重编程为iPSC状态之前进行。在一些实施例中，本文提供的经基因修饰的iNK细胞中存在的所有编辑都是在重编程/分化过程中的同时、密切接近的时间、和/或相同细胞阶段(例如在供体细胞阶段、重编程过程期间、iPSC阶段或在分化过程期间(例如从iPSC到iNK))进行。在一些实施例中，本文提供的经基因修饰的iNK细胞中存在的两个或更多个编辑在从供体细胞到iPSC到iNK的重编程/分化过程的不同时间和/或不同细胞阶段进行。例如，在一些实施例中，在供体细胞阶段进行第一编辑并且在iPSC阶段进行第二(不同的)编辑。在一些实施例中，在重编程阶段(例如，供体细胞到iPSC)进行第一编辑，并且在iPSC阶段进行第二(不同的)编辑。
多种细胞类型可用作供体细胞，其可经受本文所述的重编程、分化和/或基因组编辑策略。例如，供体细胞可以是多潜能干细胞或分化的细胞，例如体细胞，例如像成纤维细胞或T淋巴细胞。在一些实施例中，对供体细胞进行操作(例如，进行重编程、分化和/或基因组编辑)以产生本文所述的iNK细胞。
供体细胞可以来自任何合适的生物体。例如，在一些实施例中，供体细胞是哺乳动物细胞，例如人细胞或非人灵长类动物细胞。在一些实施例中，供体细胞是体细胞。在一些实施例中，供体细胞是干细胞或祖细胞。在某些实施例中，供体细胞现在不是或先前不是人胚胎的一部分，并且其衍生不涉及人胚胎的破坏。
在一些实施例中，经编辑的iNK细胞衍生自iPSC，而iPSC又衍生自体细胞供体细胞。任何适合的体细胞都可用于产生iPSC，然后其又产生iNK细胞。已经描述了从各种体细胞供体细胞类型衍生iPSC并且本领域已知的适合策略。在一些实施例中，体细胞供体细胞是成纤维细胞。在一些实施例中，体细胞供体细胞是成熟T细胞。
例如，在一些实施例中，衍生iPSC和随后衍生iNK细胞的体细胞供体细胞是发育成熟的T细胞(经历过胸腺选择的T细胞)。发育成熟的T细胞的一个标志是重排的T细胞受体基因座。在T细胞成熟期间，TCR基因座经历V(D)J重排以产生完整的V-结构域外显子。这些重排在T细胞重编程为iPSC的整个过程中以及在所得iPSC分化为体细胞的整个过程中都保持不变。
在某些实施例中，体细胞供体细胞是CD8+T细胞，CD8+天然T细胞、CD4+中枢记忆T细胞、CD8+中枢记忆T细胞、CD4+效应记忆T细胞、CD4+效应记忆T细胞、CD4+T细胞、CD4+干细胞记忆T细胞、CD8+干细胞记忆T细胞、CD4+辅助T细胞、调节性T细胞、细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、CD4+天然T细胞、TH17 CD4+T细胞、TH1 CD4+T细胞、TH2 CD4+T细胞、TH9 CD4+T细胞、CD4+Foxp3+T细胞、CD4+CD25+CD127-T细胞或CD4+CD25+CD127-Foxp3+T细胞。
T细胞可能有利于iPSC的产生。例如，可以相对轻松地编辑T细胞，例如通过基于CRISPR的方法或其他基因编辑方法。此外，重新排列的TCR基因座允许对单个细胞及其子细胞进行基因追踪。例如，如果重编程、扩增、培养和/或分化策略在NK细胞产生中涉及单个细胞的克隆扩增，则重排的TCR基因座可用作明确地鉴定细胞及其子细胞的基因标志物。这进而允许表征细胞群为真实克隆，或允许鉴定混合群或克隆群中的污染细胞。在产生携带多种编辑的iNK细胞时使用T细胞的另一个潜在优势是在T细胞培养物中选择与染色体易位相关的某些核型畸变。当通过CRISPR技术编辑细胞时，特别是在产生携带多种编辑的细胞时，这种畸变造成了问题。使用T细胞衍生的iPSC作为衍生治疗性淋巴细胞的起点可以允许在淋巴细胞中表达预筛选的TCR，例如通过针对特定抗原(例如肿瘤抗原)的结合活性选择T细胞，将所选择的T细胞重编程为iPSC，然后由这些iPSC衍生表达TCR的淋巴细胞(例如，T细胞)。该策略可以允许在其他细胞类型中激活TCR，例如，通过遗传或表观遗传策略。此外，T细胞在整个重编程过程中保留其“表观遗传记忆”的至少一部分，因此随后的相同或密切相关的细胞类型(如iNK细胞)的分化与使用非相关细胞(如成纤维细胞)作为iNK衍生的起点的方法相比将更有效和/或得到更高质量的细胞群。
在一些实施例中，被操纵的供体细胞，例如被重编程和/或经历基因组编辑的细胞，是长期造血干细胞、短期造血干细胞、多能祖细胞、谱系限制性祖细胞、淋巴样祖细胞、髓样祖细胞、普通髓样祖细胞、红系祖细胞、巨核细胞红系祖细胞、视网膜细胞、感光细胞、视杆细胞、视锥细胞、视网膜色素上皮细胞、小梁细胞、耳蜗毛细胞、外毛细胞、内毛细胞、肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞、肺上皮祖细胞、横纹肌细胞、心肌细胞、肌卫星细胞、神经元、神经元干细胞、间充质干细胞、诱导性多潜能干细胞(iPS)、胚胎干细胞、成纤维细胞、单核细胞源性巨噬细胞或树突细胞、巨核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、网织红细胞、B细胞例如祖B细胞(progenitor B cell)、前B细胞、祖B细胞(Pro B cell)、记忆B细胞、血浆B细胞、胃肠上皮细胞、胆管上皮细胞、胰腺导管上皮细胞、肠干细胞、肝细胞、肝星形细胞、库普弗细胞、成骨细胞、破骨细胞、脂肪细胞、前脂肪细胞、胰岛细胞(例如，β细胞、α细胞、δ细胞)、胰腺外分泌细胞、施旺细胞或少突胶质细胞。
在一些实施例中，供体细胞是以下中的一种或多种：例如，网织红细胞、巨核细胞红系祖细胞(MEP)、髓样祖细胞(CMP/GMP)、淋巴样祖细胞(LP)、造血干细胞/祖细胞(HSC)、或内皮细胞(EC)。在一些实施例中，供体细胞是以下中的一种或多种：骨髓细胞(例如，网织红细胞、红系细胞(例如，成红细胞)、MEP细胞、髓样祖细胞(CMP/GMP)、LP细胞、红系祖细胞(EP)、HSC、多能祖细胞(MPP)、内皮细胞(EC)、生血内皮(HE)细胞、或间充质干细胞)。在一些实施例中，供体细胞是以下中的一种或多种：髓样祖细胞(例如，普通髓样祖细胞(CMP)或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子祖细胞(GMP))。在一些实施例中，供体细胞是以下中的一种或多种：淋巴祖细胞，例如，常见的淋巴祖细胞(CLP)细胞。在一些实施例中，供体细胞是以下中的一种或多种：红系祖细胞(例如MEP细胞)。在一些实施例中，供体细胞是以下中的一种或多种：造血干细胞/祖细胞(例如，长期HSC(LT-HSC)、短期HSC(ST-HSC)、MPP细胞、或谱系限制性祖细胞(LRP))。在某些实施例中，供体细胞是CD34+细胞、CD34+CD90+细胞、CD34+CD38-细胞、CD34+CD90+CD49f+CD38-CD45RA-细胞、CD105+细胞、CD31+或CD133+细胞或CD34+CD90+CD133+细胞。在一些实施例中，供体细胞是以下中的一种或多种：脐血CD34+HSPC、脐带静脉内皮细胞、脐带动脉内皮细胞、羊水CD34+细胞、羊水内皮细胞、胎盘内皮细胞或胎盘造血CD34+细胞。在一些实施例中，供体细胞是以下中的一种或多种：动员的外周血造血CD34+细胞(在患者用动员剂例如，G-CSF或普乐沙福(Plerixafor)治疗之后)。在一些实施例中，供体细胞是外周血内皮细胞。在一些实施例中，供体细胞是外周血自然杀伤细胞。
在一些实施例中，供体细胞是分裂细胞。在一些实施例中，供体细胞是非分裂细胞。
在一些实施例中，将由本文所述的一种或多种方法和/或策略产生的经基因修饰的(例如，经编辑的)iNK细胞施用于有需要的受试者，例如在免疫肿瘤治疗方法的背景下。在一些实施例中，可以使用本领域已知的任何适合的方法，将供体细胞或本文提供的重编程、分化和/或编辑策略的任何阶段的细胞保持在培养基中或储存(例如，在液氮中冷冻)，例如，用于后续表征或施用给有需要的受试者。
基因组编辑系统
本披露的基因组编辑系统可用于例如编辑干细胞。在一些实施例中，本披露的基因组编辑系统包括至少两种从天然存在的CRISPR系统改适的组分：指导RNA(gRNA)和RNA指导的核酸酶。这两种组分形成复合物，所述复合物能够与特定核酸序列结合并在所述核酸序列中或其周围编辑DNA，例如通过制备一条或多条单链断裂(SSB或切口)、双链断裂(DSB)和/或点突变。
天然存在的CRISPR系统进化性地组织化为两个类别和五种类型(Makarova等人，Nat Rev Microbiol.[自然综述：微生物学]2011年6月；9(6):467–477(“Makarova”))，并且虽然本披露的基因组编辑系统可改适任一类型或类别的天然存在的CRISPR系统的组分，但本文所呈现的实施例通常是从2类和II型或V型CRISPR系统改适。2类系统涵盖II型和V型，其特征为相对较大的多结构域RNA指导的核酸酶蛋白(例如，Cas9或Cpf1)以及一个或多个指导RNA(例如，crRNA和任选地tracrRNA)，它们形成核糖核蛋白(RNP)复合物，该复合物缔合(即，靶向)并切割与crRNA的靶向(或间隔序列)序列互补的特定基因座。根据本披露的基因组编辑系统类似地靶向并编辑细胞DNA序列，但与自然界中存在的CRISPR系统显著不同。例如，本文所述的单分子指导RNA在自然界中不存在，并且根据本披露的指导RNA和RNA指导的核酸酶二者可并入任一数目的非天然存在的修饰。
基因组编辑系统可以用多种方式来实施(例如施用于或递送至细胞或受试者)，并且不同的实施可适合于不同应用。例如，在某些实施例中，基因组编辑系统是作为蛋白质/RNA复合物(核糖核蛋白，或RNP)来实施，其可以包括于药物组合物中，所述药物组合物任选地包括药学上可接受的载体和/或囊封剂，例如脂质或聚合物微粒或纳米颗粒、胶束、脂质体等。在某些实施例中，基因组编辑系统是作为一种或多种编码上述RNA指导的核酸酶和指导RNA组分的核酸(任选地具有一种或多种其他组分)来实施；在某些实施例中，基因组编辑系统是作为一种或多种包含此类核酸的载体来实施，例如病毒载体，例如腺相关病毒；并且在某些实施例中，基因组编辑系统是作为前述任一种的组合来实施。根据本文所述原理操作的其他或经修改的实施将为技术人员所显而易见并且在本披露的范围内。
应注意，本披露的基因组编辑系统可靶向单一特定核苷酸序列，或者可通过使用两个或更多个指导RNA靶向(并且能平行编辑)两个或更多个特定核苷酸序列。在本披露通篇中，多种gRNA的使用称为“多重化”，并且可用于靶向多个无关的目的靶序列，或用于在单一靶结构域内形成多个SSB或DSB，并且在一些情形中，用于在这种靶结构域内产生特定编辑。例如，Maeder等人的国际专利公开号WO 2015/138510(“Maeder”)描述用于修正人类CEP290基因中的点突变(C.2991+1655A至G)的基因组编辑系统，所述点突变导致产生隐蔽剪接位点，这又降低或消除该基因的功能。Maeder的基因组编辑系统利用两个指导RNA，这些指导RNA靶向该点突变任一侧上的(即，侧接)序列，并且形成侧接该突变的DSB。这又促进了包括突变在内的间插序列的缺失，由此消除隐蔽剪接位点并恢复正常的基因功能。
作为另一实例，Cotta-Ramusino等人的WO 2016/073990(“Cotta-Ramusino”)描述利用两个gRNA与Cas9切口酶(制造单链切口的Cas9，例如化脓链球菌(S.pyogenes)D10A)的基因组编辑系统，该布置称为“双重切口酶系统”。Cotta-Ramusino的双重切口酶系统经配置以在目的序列的相对链上制造两个偏移一个或多个核苷酸的切口，所述切口组合产生具有悬突(在Cotta-Ramusino情形中是5′悬突，但3′悬突也有可能)的双链断裂。在一些情况下，该悬突又可以促进同源定向修复事件。并且作为另一实例，Palestrant等人的WO 2015/070083(“Palestrant”)描述靶向编码Cas9的核苷酸序列的gRNA(称为“管理RNA”)，其可以包括于基因组编辑系统中，所述基因组编辑系统包含一个或多个另外的gRNA以容许Cas9的瞬时表达，所述Cas9可能原本例如在一些经病毒转导的细胞中是组成型表达的。这些多重化应用旨在具有示例性而不是限制性，并且技术人员将了解，其他多重化应用通常与本文所述的基因组编辑系统相容。
在一些情况下，基因组编辑系统可以形成双链断裂，这些双链断裂是通过细胞DNA双链断裂机制例如NHEJ或HDR来修复。这些机制描述于多处文献中，例如Davis和Maizels,PNAS,111(10):E924-932，2014年3月11日(“Davis”)(描述Alt-HDR)；Frit等人，DNA Repair[DNA修复]17(2014)81-97(“Frit”)(描述Alt-NHEJ)；以及Iyama和Wilson III,DNA Repair[DNA修复](Amst.)2013年8月；12(8):620-636(“Iyama”)(概括描述经典HDR和NHEJ路径)。
如果基因组编辑系统通过形成DSB来操作，那么此类系统任选地包括促进或有助于特定双链断裂修复模式或特定修复结果的一个或多个组分。例如，Cotta-Ramusino还描述其中添加单链寡核苷酸“供体模板”的基因组编辑系统；将供体模板并入细胞DNA的靶区域中，该靶区域由基因组编辑系统切割，并且可以导致靶序列中的变化。
在某些实施例中，基因组编辑系统在不引起单链或双链断裂的情况下修饰靶序列，或修饰靶序列中或附近的靶基因的表达。例如，基因组编辑系统可包括融合至作用于DNA的功能结构域的RNA指导的核酸酶，由此修饰靶序列或其表达。作为一个实例，RNA指导的核酸酶可连接至(例如融合至)胞苷脱氨酶功能结构域，并且可通过产生所靶向的C至A取代来操作。示例性核酸酶/脱氨酶功能描述于Komor等人Nature[自然]533,420–424(2016年5月19日)(“Komor”)中。可替代地，基因组编辑系统可利用裂解失活的(即，“死”)核酸酶，例如死Cas9(dCas9)，并且可通过在细胞DNA的一个或多个所靶向区域上形成稳定复合物来操作，由此干扰涉及一个或多个所靶向区域的功能，包括但不限于mRNA转录、染色质重塑等。
指导RNA(gRNA)分子
本披露的指导RNA(gRNA)可以是单分子(包含单一RNA分子，并且可替代地称为嵌合)或模块(包含多于一个、并且典型地两个单独的RNA分子，例如crRNA和tracrRNA，其通常例如通过双链化彼此缔合)。gRNA和其组成部分的描述遍及于文献中，例如Briner等人(Molecular Cell[分子细胞]56(2),333-339，2014年10月23日(“Briner”))，以及Cotta-Ramusino。
在细菌和古细菌中，II型CRISPR系统通常包含RNA指导的核酸酶蛋白(例如Cas9)、包括与外来序列互补的5′区的CRISPR RNA(crRNA)和包括与crRNA的3′区互补并形成双链体的5′区的反式激活crRNA(tracrRNA)。虽然并非旨在受限于任何理论，但认为此双链体有助于形成Cas9/gRNA复合物，并且是所述复合物的活性所需的。在II型CRISPR系统经改适用于基因编辑中时，发现crRNA和tracrRNA可以接合成单一单分子或嵌合指导RNA，在一个非限制性实例中借助桥接crRNA(在其3′末端)和tracrRNA(在其5′末端)的互补区的四核苷酸(例如GAAA)“四环(tetraloop)”或“接头”序列来接合。(Mali等人Science.[科学]2013年2月15日；339(6121):823-826(“Mali”)；Jiang等人Nat Biotechnol[自然生物技术].2013年3月；31(3):233-239(“Jiang”)；和Jinek等人,2012Science[科学]8月17日；337(6096):816-821(“Jinek 2012”))。
指导RNA不论是单分子或模块都包括“靶向结构域”，所述靶向结构域与靶序列内的靶结构域完全或部分互补，所述靶序列例如期望编辑的细胞基因组中的DNA序列。靶向域在文献中通过多种名称来提及，包括但不限于“指导序列”(Hsu等人,Nat Biotechnol.[自然生物技术]2013年9月；31(9):827–832(“Hsu”))，“互补性区”(Cotta-Ramusino)，“间隔区”(Briner)，并统称为“crRNA”(Jiang)。不论给予其何种名称，靶向结构域典型地长度为10-30个核苷酸，并且在某些实施例中长度为16-24个核苷酸(例如，长度为16、17、18、19、20、21、22、23或24个核苷酸)，并且在Cas9 gRNA情形中位于5′末端处或5'末端附近，并且在Cpf1 gRNA情形中位于3'末端处或3'末端附近。
除了靶向结构域以外，gRNA典型地(但不一定，如下文所讨论)包括多个可影响gRNA/Cas9复合物的形成或活性的域。例如，如上文所提及，通过gRNA的第一和第二互补性结构域形成的双链化结构(也称为重复:抗重复双链体)与Cas9的识别(REC)叶相互作用，并且可以介导Cas9/gRNA复合物的形成。(Nishimasu等人,Cell[细胞]156,935-949,2014年2月27日(“Nishimasu 2014”)和Nishimasu等人,Cell[细胞]162,1113-1126,2015年8月27日(“Nishimasu 2015”))。应注意，第一和/或第二互补性结构域可含有一个或多个多聚腺苷酸段，其可以由RNA聚合酶识别为终止信号。因此，第一和第二互补性域的序列任选地经修饰以消除这些段，并促进gRNA的体外转录的完成，例如通过使用如Briner中所述的A-G交换、或通过使用A-U交换来修饰。对第一和第二互补性结构域的这些和其他类似修饰在本公开的范围内。
与第一和第二互补性结构域一起，Cas9 gRNA典型地包括两个或更多个其他双链化区域，该两个或更多个另外的双链化区域在体内但不一定在体外参与核酸酶活性。(Nishimasu 2015)。在第二互补性结构域的3'部分附近的第一茎环1被不同地称为“近端结构域”(Cotta-Ramusino)、“茎环1”(Nishimasu 2014和2015)以及“连结(nexus)”(Briner)。一个或多个其他茎环结构通常存在于gRNA的3'末端附近，其数目依物种而变：化脓链球菌gRNA典型地包括2个3'茎环(总计4个茎环结构，包括重复:抗重复双链体)，而金黄色葡萄球菌和其他物种仅具有一个(总计3个茎环结构)。对根据物种组织化的保守茎环结构(更通常地，和gRNA结构)的描述于Briner中提供。
虽然前述说明集中于用于Cas9的gRNA，但应了解，已经(或可能在未来)发现或发明其他RNA指导的核酸酶，其利用在一些方面与针对这一点描述的那些gRNA不同的gRNA。例如，Cpf1(“来自普雷沃菌属和弗朗西斯菌属1的CRISPR”)是最近发现的RNA指导的核酸酶，其发挥功能不需要tracrRNA。(Zetsche等人,2015,[细胞]163,759–771 2015年10月22日(“Zetsche I”))。用于Cpf1基因组编辑系统的gRNA通常包括靶向结构域和互补性结构域(替代性地称为“把手”)。还应注意，在用于Cpf1的gRNA中，靶向结构域通常存在于3'末端处或附近，而不是如上文结合Cas9 gRNA所述的5'末端(把手位于Cpf1 gRNA的5'末端处或5'末端附近)。
但本领域技术人员将了解，虽然在来自不同原核物种的gRNA之间或在Cpf1与Cas9gRNA之间可能存在结构差异，但gRNA的操作原理通常是一致的。因为这种操作一致性，gRNA可在广义上通过其靶向结构域序列来定义，并且技术人员将了解，可将给定靶向结构域序列并入任何适宜gRNA中，包括单分子或嵌合gRNA，或包括一种或多种化学修饰和/或序列修饰(取代、另外的核苷酸、截短等)的gRNA。因此，为了便于呈现本披露，gRNA可仅在其靶向结构域序列方面加以描述。
更通常地，技术人员将了解，本披露的一些方面涉及可以使用多种RNA指导的核酸酶实施的系统、方法和组合物。为此，除非另外指定，否则术语gRNA应理解为不仅涵盖那些与Cas9或Cpf1的特定种类相容的gRNA，还涵盖可以用于任何RNA指导的核酸酶的任何适宜gRNA。通过说明，在某些实施例中，术语gRNA可以包括与存在于2类CRISPR系统(例如II型或V型或CRISPR系统)中的任何RNA指导的核酸酶或从其衍生或改适的RNA指导的核酸酶一起使用的gRNA。
gRNA设计
先前已经描述了用于靶序列的选择和验证以及脱靶分析的方法(例如，Mali；Hsu；Fu等人,2014Nat Biotechnol[自然生物技术]32(3):279-84，Heigwer等人,2014Natmethods[自然方法]11(2):122-3；Bae等人(2014)Bioinformatics[生物信息学]30(10):1473-5；和Xiao A等人(2014)Bioinformatics[生物信息学]30(8):1180-1182。作为非限制性实例，gRNA设计可包括使用软件工具来优化对应于使用者的靶序列的潜在靶序列的选择，例如以使全基因组的总脱靶活性降至最低。虽然脱靶活性不限于切割，但每个脱靶序列处的切割效率可以例如使用实验衍生的加权方案来预测。这些和其他指导选择方法详细描述于Maeder和Cotta-Ramusino中。
例如，可以使用cas-offinder执行用于选择和验证靶序列以及脱靶分析的方法(Bae S,Park J,Kim J-S.Cas-OFFinder:a fast and versatile algorithm thatsearches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases[Cas-OFFinder：一种快速且通用的算法，可搜索Cas9 RNA指导的核酸内切酶的潜在脱靶位点].Bioinformatics[生物信息学].2014；30:1473-5)。Cas-offinder是一种工具，可以快速鉴定基因组中与指导序列有指定数量的错配的所有序列。
作为另一个实例，可以执行用于对给定序列是脱靶的可能性(例如，一旦鉴定出候选靶序列)进行评分的方法。示例性得分包括切割频率测定(CFD)得分，如以下所描述：Doench JG,Fusi N,Sullender M,Hegde M,Vaimberg EW,Donovan KF,等人OptimizedsgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9[优化的sgRNA设计以使CRISPR-Cas9活性最大化并使脱靶效应最小化].NatBiotechnol.[自然生物技术]2016；34:184-91。
gRNA修饰
在某些实施例中，本文使用的gRNA可以是经修饰的或未修饰的gRNA。在某些实施例中，gRNA可以包括一个或多个修饰。在某些实施例中，一个或多个修饰可包括硫代磷酸酯连接修饰、二硫代磷酸酯(PS2)连接修饰、2’-O-甲基修饰或其组合。在某些实施例中，一个或多个修饰可以在gRNA的5'末端、在gRNA的3′末端或其组合。
在某些实施例中，gRNA修饰可包含一个或多个二硫代磷酸酯(PS2)连接修饰。
在一些实施例中，本文使用的gRNA包括一个或多个或一段脱氧核糖核酸(DNA)碱基，在本文中也称为“DNA延伸”。在一些实施例中，本文使用的gRNA在gRNA的5'末端、gRNA的3'末端或其组合处包括DNA延伸。在某些实施例中，DNA延伸可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个DNA碱基长。例如，在某些实施例中，DNA延伸可以是1、2、3、4、5、10、15、20或25个DNA碱基长。在某些实施例中，DNA延伸可以包括一个或多个选自腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)的DNA碱基。在某些实施例中，DNA延伸包括相同的DNA碱基。例如，DNA延伸可以包括一段腺嘌呤(A)碱基。在某些实施例中，DNA延伸可以包括一段胸腺嘧啶(T)碱基。在某些实施例中，DNA延伸包括不同DNA碱基的组合。在某些实施例中，DNA延伸可包含表3所示的序列。
下表3中提供了用于Cpf1指导RNA的示例性的适合5'延伸：
表3：示例性Cpf1 gRNA 5'延伸
Figure BDA0003723238800000591
Figure BDA0003723238800000601
Figure BDA0003723238800000611
在某些实施例中，本文使用的gRNA包括DNA延伸以及化学修饰，例如，一个或多个硫代磷酸酯连接修饰、一个或多个二硫代磷酸酯(PS2)连接修饰、一个或多个2'-O-甲基修饰或本文披露的一个或多个另外的合适的化学gRNA修饰，或其组合。在某些实施例中，一个或多个修饰可以在gRNA的5'末端、在gRNA的3′末端或其组合。
不希望被理论所束缚，可以预期的是，本文中任何DNA延伸可以与本文披露的任何gRNA一起使用，只要它不与gRNA靶向的靶核酸杂交并且还相对于不包含此类DNA延伸的gRNA在靶核酸位点处表现出编辑增加。
在一些实施例中，本文使用的gRNA包括一个或多个或一段核糖核酸(RNA)碱基，在本文中也称为“RNA延伸”。在一些实施例中，本文使用的gRNA在gRNA的5'末端、gRNA的3'末端或其组合处包括RNA延伸。在某些实施例中，RNA延伸可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个RNA碱基长。例如，在某些实施例中，RNA延伸可以是1、2、3、4、5、10、15、20或25个RNA碱基长。在某些实施例中，RNA延伸可以包括一个或多个选自腺嘌呤(rA)、鸟嘌呤(rG)、胞嘧啶(rC)或尿嘧啶(rU)的RNA碱基，其中“r”代表RNA，2'-羟基。在某些实施例中，RNA延伸包括相同的RNA碱基。例如，RNA延伸可以包括一段腺嘌呤(rA)碱基。在某些实施例中，RNA延伸包括不同RNA碱基的组合。在某些实施例中，本文使用的gRNA包括RNA延伸以及一个或多个硫代磷酸酯连接修饰、一个或多个二硫代磷酸酯(PS2)连接修饰、一个或多个2’-O-甲基修饰、本文披露的一个或多个另外的合适的gRNA修饰例如化学修饰、或其组合。在某些实施例中，一个或多个修饰可以在gRNA的5′末端、在gRNA的3'末端或其组合。在某些实施例中，包含RNA延伸的gRNA可以包含本文所述的序列。
预期本文中使用的gRNA也可以包括RNA延伸和DNA延伸。在某些实施例中，RNA延伸和DNA延伸两者可以都在gRNA的5'末端、gRNA的3'末端或其组合处。在某些实施例中，RNA延伸在gRNA的5′末端，并且DNA延伸在gRNA的3′末端。在某些实施例中，RNA延伸在gRNA的3′末端，并且DNA延伸在gRNA的5′末端。
在一些实施例中，包含修饰的gRNA，例如在5′末端的DNA延伸和/或如本文披露的化学修饰，与RNA指导的核酸酶(例如AsCpf1核酸酶)复合以形成RNP，然后将其用于编辑靶细胞，例如多能干细胞或其子细胞。
基于本披露，另外的适合gRNA修饰对本领域普通技术人员而言是显而易见的。适合的gRNA修饰包括例如以下中描述的那些：2018年10月2日提交且标题为“MODIFIED CPF1GUIDE RNA[经修饰的Cpf1指导RNA]”的PCT申请PCT/US 2018/054027；2015年12月3日提交且标题为“GUIDE RNA WITH CHEMICAL MODIFICATIONS[具有化学修饰的指导RNA]”的PCT申请PCT/US 2015/000143；2016年4月5日提交且标题为“CHEMICALLY MODIFIED GUIDE RNASFOR CRISPR/CAS-MEDIATED GENE REGULATION[关于CRISPR/CAS介导的基因调节的经化学修饰的指导RNA]”的PCT申请PCT/US 2016/026028；以及2016年9月23日提交且标题为“NUCLEASE-MEDIATED GENOME EDITING OF PRIMARY CELLS AND ENRICHMENT THEREOF[原代细胞的核酸酶介导的基因组编辑及其富集]”的PCT申请PCT/US 2016/053344；其每一项的全部内容通过引用并入本文。
这个章节中讨论的某些示例性修饰可以包括于gRNA序列内的任一位置，包括但不限于在5′末端处或5′末端附近(例如，在5′末端的1-10、1-5或1-2个核苷酸内)和/或在3′末端处或3′末端附近(例如，在3′末端的1-10、1-5或1-2个核苷酸内)。在一些情形中，修饰定位于功能基序内，例如Cas9 gRNA的重复-抗重复双链体、Cas9或Cpf1 gRNA的茎环结构和/或gRNA的靶向结构域。
作为一个实例，gRNA的5′末端可以包括真核mRNA帽结构或帽类似物(例如，G(5′)ppp(5′)G帽类似物、m7G(5′)ppp(5′)G帽类似物或3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)G抗反向帽类似物(ARCA))，如下文所示：
Figure BDA0003723238800000631
在gRNA的化学或酶促合成过程中可以包括帽或帽类似物。
按类似方式，gRNA的5′末端可能缺少5′三磷酸基团。例如，体外转录的gRNA可能经磷酸酶处理(例如，使用小牛肠碱性磷酸酶)以移除5′三磷酸基团。
另一常见修饰包括在gRNA的3′末端添加多个(例如，1-10、10-20或25-200个)腺嘌呤(A)残基，称为polyA段。使用聚腺苷聚合酶(例如，大肠杆菌聚(A)聚合酶)，可以在化学或酶促合成期间将聚A段添加到gRNA中。
指导RNA可以在3′末端U核糖处经修饰。例如，U核糖的两个末端羟基可以被氧化为醛基，并且伴随核糖环的打开，以提供如下所示的经修饰核苷：
Figure BDA0003723238800000632
其中“U”可以是未经修饰或经修饰的尿苷。
3′末端U核糖可以经如下所示的2′3′环状磷酸酯修饰：
Figure BDA0003723238800000633
其中“U”可以是未经修饰或经修饰的尿苷。
指导RNA可以例如通过并入本文所述的一个或多个经修饰核苷酸而含有可以针对降解稳定的3′核苷酸。在某些实施例中，尿苷可以由经修饰尿苷(例如，5-(2-氨基)丙基尿苷和5-溴代尿苷)或由本文所述的任何经修饰尿苷替代；腺苷和鸟苷可以由经修饰腺苷和鸟苷(例如，在8位处具有修饰，例如8-溴代鸟苷)或由本文所述的任何经修饰腺苷和鸟苷替代。
在某些实施例中，可以将糖修饰的核糖核苷酸并入gRNA中，例如，其中2′OH-基团由选自以下的基团替代：H、-OR、-R(其中R可以是例如烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)、卤基、-SH、-SR(其中R可以是例如烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)、氨基(其中氨基可以是例如NH2、烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基、二杂芳基氨基或氨基酸)；或氰基(-CN)。在某些实施例中，磷酸骨架可以如本文所述经修饰，例如经硫代磷酸酯(PhTx)基团修饰。在某些实施例中，gRNA的一个或多个核苷酸可以各自独立地是经修饰或未经修饰的核苷酸，包括但不限于2′-糖修饰的，例如2′-O-甲基、2′-O-甲氧基乙基，或2′-氟修饰的，包括例如，2′-F或2′-O-甲基腺苷(A)、2′-F或2′-O-甲基胞苷(C)、2′-F或2′-O-甲基尿苷(U)、2′-F或2′-O-甲基胸苷(T)、2′-F或2′-O-甲基鸟苷(G)、2′-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷(Teo)、2′-O-甲氧基乙基腺苷(Aeo)、2′-O-甲氧基乙基-5-甲基胞苷(m5Ceo)及其任何组合。
指导RNA还可以包括“锁定”核酸(LNA)，其中2′OH-基团可以例如通过C1-6亚烷基C1-6亚杂烷基桥连接至同一核糖的4′碳。可使用任何适宜部分来提供此类桥，包括但不限于亚甲基、亚丙基、醚或氨基桥；O-氨基(其中氨基可以是例如NH2、烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基、乙二胺或聚氨基)和氨基烷氧基或O(CH2)n-氨基(其中氨基可以是例如NH2、烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基、乙二胺或聚氨基)。
在某些实施例中，gRNA可以包括经修饰核苷酸，其为多环状(例如，三环；和“解锁”形式，如二醇核酸(GNA)(例如，R-GNA或S-GNA，其中核糖被附接至磷酸二酯键的二醇单元置换)，或苏糖核酸(TNA，其中核糖被α-L-苏呋喃糖基(threofuranosyl)-(3’→2’)置换)。
通常，gRNA包括糖基核糖，其为具有氧的5元环。示例性的经修饰gRNA可以包括但不限于核糖中氧的替代(例如，经硫(S)、硒(Se)或亚烷基，例如亚甲基或亚乙基)；双键的添加(例如，以用环戊烯基或环己烯基替代核糖)；核糖的缩环(例如，以形成环丁烷或氧杂环丁烷的4元环)；核糖的扩环(例如，以形成具有另外的碳或杂原子的6元环或7元环，例如脱水己糖醇、阿卓糖醇、甘露醇、环己烷基、环己烯基以及吗啉代，其也具有氨基磷酸酯骨架)。尽管大多数的糖类似物改变位于2′位，但其他位点也适于修饰，包括4′位。在某些实施例中，gRNA包含4′-S、4′-Se或4′-C-氨基甲基-2′-O-Me修饰。
在某些实施例中，可以将脱氮核苷酸(例如，7-脱氮-腺苷)并入gRNA中。在某些实施例中，可以将O-烷基化和N-烷基化核苷酸(例如，N6-甲基腺苷)并入gRNA中。在某些实施例中，gRNA分子中的一个或多个或所有核苷酸是脱氧核苷酸。
指导RNA还可以包括crRNA(在其3′末端)和tracrRNA(在其5′末端)的互补区域之间的一个或多个交联(例如，在“四环”结构内和/或位于gRNA内存在的任何茎环结构中)。多种接头都适合使用。例如，指导RNA可以包括常见的连接部分，包括但不限于聚乙烯醚、聚乙烯、聚丙烯、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙交酯(PGA)、聚丙交酯(PLA)、聚己内酯(PCL)和其共聚物。
在一些实施例中，双官能交联剂用于连接第一gRNA片段的5'末端和第二gRNA片段的3’末端，并且用与交联剂的反应性基团反应的官能团修饰要连接的gRNA片段的3'或5’末端。通常，这些修饰包括胺、巯基、羧基、羟基、烯烃(例如末端烯烃)、叠氮化物和/或其他合适的官能团中的一种或多种。多官能(例如，双官能)交联剂也是本领域公知的，并且可以是异型官能的或同型官能的，并且可以包括任何合适的官能团，包括但不限于异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰基叠氮化物、NHS酯、磺酰氯、甲苯磺酸酯、三苯甲基酯、醛、胺、环氧化物、碳酸酯(如、双(对硝基苯基)碳酸酯)、芳基卤、烷基卤、亚胺酯、羧酸酯、烷基磷酸酯、酸酐、氟苯酯、HOBt酯、羟甲基膦、O-甲基异脲、DSC、NHS氨基甲酸酯、戊二醛、活化双键、环状半缩醛、NHS碳酸酯、咪唑氨基甲酸酯、酰基咪唑、甲基吡啶鎓醚、吖内酯、氰酸酯、环状亚胺碳酸酯、氯三嗪、脱氢氮杂环庚三烯、6-磺基-胞嘧啶衍生物、马来酰亚胺、氮杂环丙烷、TNB硫醇、Ellman试剂、过氧化物、乙烯基砜、苯硫酯、重氮烷、重氮乙酰基、环氧化物、重氮、二苯甲酮、蒽醌、重氮衍生物、二氮杂环丙烯衍生物、补骨脂素衍生物、烯烃、苯基硼酸等。在一些实施例中，第一gRNA片段包括第一反应性基团，第二gRNA片段包括第二反应性基团。例如，第一和第二反应性基团可各自包含胺部分，其与含碳酸酯的双官能交联剂交联以形成脲连接。在其他情况下，(a)所述第一反应性基团包含溴乙酰基部分并且所述第二反应性基团包含巯基部分，或(b)所述第一反应性基团包含巯基部分并且所述第二反应性基团包含溴乙酰基部分，并且其通过使该溴乙酰基部分与该巯基部分反应形成溴乙酰基-硫醇连接而交联。这些和其它交联化学物质是本领域已知的，并且在文献中进行了总结，包括Greg T.Hermanson,Bioconjugate Techniques[生物缀合物技术],第3版.2013,学术出版社(Academic Press)出版。
基于本披露，另外的适合gRNA修饰对本领域普通技术人员而言是显而易见的。适合的gRNA修饰包括例如以下中描述的那些：2018年10月2日提交且标题为“MODIFIED CPF1GUIDE RNA[经修饰的Cpf1指导RNA]”的PCT申请PCT/US 2018/054027；2015年12月3日提交且标题为“GUIDE RNA WITH CHEMICAL MODIFICATIONS[具有化学修饰的指导RNA]”的PCT申请PCT/US 2015/000143；2016年4月5日提交且标题为“CHEMICALLY MODIFIED GUIDE RNASFOR CRISPR/CAS-MEDIATED GENE REGULATION[关于CRISPR/CAS介导的基因调节的经化学修饰的指导RNA]”的PCT申请PCT/US 2016/026028；以及2016年9月23日提交且标题为“NUCLEASE-MEDIATED GENOME EDITING OF PRIMARY CELLS AND ENRICHMENT THEREOF[原代细胞的核酸酶介导的基因组编辑及其富集]”的PCT申请PCT/US 2016/053344；其每一项的全部内容通过引用并入本文。
示例性gRNA
在本文中提供(例如，在下表中)了适合于本披露包括的某些实施例的指导RNA的非限制性实例。本领域普通技术人员将能够以作为DNA或RNA序列的靶向结构域序列的披露内容设想用于特异性核酸酶(例如Cas9或Cpf-1核酸酶)的适合的指导RNA序列。例如，包含由RNA核苷酸组成的靶向序列的指导RNA将包含对应于作为DNA序列提供的靶向结构域序列的RNA序列，并且这含有尿嘧啶，代替胸苷核苷酸。例如，包含由RNA核苷酸组成并由DNA序列TCTGCAGAAATGTTCCCCGT(SEQ ID NO:24)描述的靶向结构域序列的指导RNA将具有相应RNA序列UCUGCAGAAAUGUUCCCCGU(SEQ ID NO:25)的靶向结构域。如对于本领域技术人员而言显而易见的，这种靶向序列将与适合的指导RNA支架(例如，crRNA支架序列或嵌合crRNA/tracrRNA支架序列)连接。适合的gRNA支架序列是本领域普通技术人员已知的。对于AsCpf1，例如，适合的支架序列包含序列UAAUUUCUACUCUUGUAGAU(SEQ ID NO:26)，添加到靶向结构域的5′末端。在上文的实例中，这将得到具有序列UAAUUUCUACUCUUGUAGAUUCUGCAGAAAUGUUCCCCGU(SEQ ID NO:27)的Cpf1指导RNA。本领域技术人员将进一步了解如何修饰这种指导RNA，例如，通过添加DNA延伸(例如，在上文的实例中，添加如本文所述的25-mer DNA延伸将得到例如具有序列ATGTGTTTTTGTCAAAAGACCTTTTrUrArArUrUrUrCrUrArCrUrCrUrUrGrUrArGrArUrUrCrUrGrCrArGrArArArUrGrUrUrCrCrCrCrGrU(SEQ ID NO:28)的指导RNA。应当理解，本文提供的示例性靶向序列不是限制性的，并且基于本披露，鉴于本领域的一般知识，另外的适合序列(例如本文所披露的特定序列的变体)对于本领域技术人员而言是显而易见的。
在一些实施例中，用于本披露的gRNA是靶向TGFβRII的gRNA(TGFβRII gRNA)。在一些实施例中，靶向TGFβRII的gRNA是表4中描述的gRNA中的一种或多种。
表4：示例性TGFβRII gRNA
Figure BDA0003723238800000671
Figure BDA0003723238800000681
Figure BDA0003723238800000691
Figure BDA0003723238800000701
Figure BDA0003723238800000711
Figure BDA0003723238800000721
Figure BDA0003723238800000731
Figure BDA0003723238800000741
Figure BDA0003723238800000751
在一些实施例中，用于本披露的gRNA是靶向CISH的gRNA(CISH gRNA)。在一些实施例中，靶向CISH的gRNA是表5中描述的gRNA中的一种或多种。
表5：示例性CISH gRNA
Figure BDA0003723238800000752
Figure BDA0003723238800000761
Figure BDA0003723238800000771
Figure BDA0003723238800000781
在一些实施例中，用于本披露的gRNA是靶向B2M的gRNA(B2M gRNA)。在一些实施例中，靶向B2M的gRNA是表6中描述的gRNA中的一种或多种。
表6：示例性B2M gRNA
Figure BDA0003723238800000791
Figure BDA0003723238800000801
Figure BDA0003723238800000811
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Figure BDA0003723238800000851
在一些实施例中，用于本披露的gRNA是靶向PD1的gRNA。用于本披露的靶向B2M和PD1的gRNA进一步描述于Welstead等人的WO 2015161276和WO 2017152015中；两者均通过引用以其整体并入本文。
在一些实施例中，用于本披露的gRNA是靶向NKG2A的gRNA(NKG2A gRNA)。在一些实施例中，靶向NKG2A的gRNA是表7中描述的gRNA中的一种或多种。
表7：示例性NKG2A gRNA
Figure BDA0003723238800000861
Figure BDA0003723238800000871
在一些实施例中，用于本披露的gRNA是靶向TIGIT的gRNA(TIGIT gRNA)。在一些实施例中，靶向TIGIT的gRNA是表8中描述的gRNA中的一种或多种。
表8.示例性TIGIT gRNA
Figure BDA0003723238800000881
Figure BDA0003723238800000891
Figure BDA0003723238800000901
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Figure BDA0003723238800000941
在一些实施例中，用于本披露的gRNA是靶向ADORA2a的gRNA(ADORA2a gRNA)。在一些实施例中，靶向ADORA2a的gRNA是表9中描述的gRNA中的一种或多种。
表9.示例性ADORA2a gRNA
Figure BDA0003723238800000942
Figure BDA0003723238800000951
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Figure BDA0003723238800001011
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Figure BDA0003723238800001051
应当理解，提供本文披露的示例性gRNA是为了说明本披露所包含的非限制性实施例。基于本披露，另外合适的gRNA序列对于技术人员将是显而易见的，并且本披露在这方面不受限制。
RNA指导的核酸酶
根据本披露的RNA指导的核酸酶包括但不限于天然存在的2类的CRISPR核酸酶，如Cas9和Cpf1，以及由其衍生或获得的其他核酸酶。在功能方面，RNA指导的核酸酶被定义为如下的那些核酸酶：(a)与gRNA相互作用(例如复合)；和(b)与gRNA一起缔合或任选地切割或修饰DNA的靶区域，该靶区域包括(i)与gRNA的靶向结构域互补的序列，以及任选地，(ii)称为“原型间隔子邻近基序”或“PAM”的另一序列，其更详细地描述于下文中。在说明以下实例时，RNA指导的核酸酶可以在广义上依据其PAM特异性和切割活性来定义，即使在共享相同PAM特异性或切割活性的个别RNA指导的核酸酶之间可能存在变异。本领域技术人员将理解，本披露的一些方面涉及可以使用具有某种PAM特异性和/或切割活性的任何适宜RNA指导的核酸酶实施的系统、方法和组合物。为此，除非另外指明，否则术语RNA指导的核酸酶应理解为通用术语，并不限于RNA指导的核酸酶的任何特定类型(例如，Cas9与Cpf1)、种类(例如，酿脓链球菌与金黄色葡萄球菌)或变体(例如，全长与截短或分裂；天然存在的PAM特异性与工程化PAM特异性等)。
PAM序列的名称来源于其与“原型间隔子”序列的顺序关系，所述原型间隔子与gRNA靶向结构域(或“间隔序列”)互补。与原型间隔子一起，PAM序列定义特定RNA指导的核酸酶/gRNA组合的靶区域或序列。
多种RNA指导的核酸酶可能需要PAM与原型间隔子之间的不同顺序关系。通常，Cas9识别原型间隔子3'的PAM序列。另一方面，Cpf1通常识别原型间隔子5’的PAM序列。
除了识别PAM和原型间隔子的特定顺序定向以外，RNA指导的核酸酶还可以识别特定PAM序列。例如，金黄色葡萄球菌Cas9识别NNGRRT或NNGRRV的PAM序列，其中N个残基紧靠由gRNA靶向结构域所识别区域的3′。酿脓链球菌Cas9识别NGG PAM序列。新凶手弗朗西斯菌(F.novicida)Cpf1识别TTN PAM序列。已鉴别多种RNA指导的核酸酶的PAM序列，并且鉴别新颖PAM序列的策略已描述于Shmakov等人,2015,Molecular Cell[分子细胞]60,385–397，2015年11月5日中。还应注意，工程改造的RNA指导的核酸酶可具有与参考分子的PAM特异性不同的PAM特异性(例如，在工程改造的RNA指导的核酸酶的情形中，参考分子可以是衍生出RNA指导的核酸酶的天然存在的变体，或与工程改造的RNA指导的核酸酶具有最大氨基酸序列同源性的天然存在的变体)。
除了其PAM特异性以外，RNA指导的核酸酶可通过其DNA切割活性来表征：天然存在的RNA指导的核酸酶典型地在靶核酸中形成DSB，但是已产生仅生成SSB的工程化变体(上文所讨论)(Ran和Hsu等人,Cell[细胞]154(6),1380–1389,2013年9月12日(“Ran”))，或完全不切割的工程化变体。
Cas9
已确定酿脓链球菌Cas9的晶体结构(Jinek等人,Science[科学]343(6176),1247997,2014(“Jinek 2014”)，以及与单分子指导RNA和靶DNA复合的金黄色葡萄球菌Cas9的晶体结构(Nishimasu 2014；Anders等人,Nature[自然].2014年9月25日；513(7519):569-73(“Anders 2014”)；和Nishimasu 2015)。
天然存在的Cas9蛋白包含两个叶：识别(REC)叶和核酸酶(NUC)叶；每一叶包含特定的结构和/或功能域。REC叶包含富精氨酸桥螺旋(BH)域，以及至少一个REC域(例如REC1域和任选地REC2域)。REC叶与其他已知蛋白不共享结构相似性，指示其是独特的功能域。不希望受限于任何理论，突变分析提出BH和REC域的特殊功能作用：BH结构域显现在gRNA:DNA识别中发挥作用，而REC结构域被认为与gRNA的重复:抗重复双链体相互作用并介导Cas9/gRNA复合物的形成。
NUC叶包含RuvC结构域、HNH结构域和PAM相互作用(PI)结构域。RuvC域与逆转录病毒整合酶超家族成员共享结构相似性，并且切割靶核酸的非互补(即底部)链。其可从两个或更多个分裂RuvC基序(例如酿脓链球菌和金黄色葡萄球菌中的RuvC I、RuvCII和RuvCIII)形成。同时，HNH域在结构上与HNN内切核酸酶基序类似，并且切割靶核酸的互补(即顶部)链。顾名思义，PI结构域有助于PAM特异性。
虽然Cas9的某些功能与上文所述的特定结构域相关(但不一定完全取决于所述结构域)，但这些和其他功能可以由其他Cas9结构域或任一叶上的多个结构域来介导或影响。例如，在化脓链球菌Cas9中，如在Nishimasu 2014中所述，gRNA的重复:抗重复双链体落在REC叶与NUC叶之间的沟中，并且双链体中的核苷酸与BH、PI和REC结构域中的氨基酸相互作用。第一茎环结构中的一些核苷酸也与多个结构域(PI、BH和REC1)中的氨基酸相互作用，第二和第三茎环(RuvC和PI结构域)中的一些核苷酸也是如此。
Cpf1
与crRNA和包括TTTN PAM序列的dsDNA靶复合的氨基酸球菌属物种(Acidaminococcus sp.)Cpf1的晶体结构已经由Yamano等人(Cell[细胞].2016年5月5日；165(4):949-962(“Yamano”)，通过引用并入本文)解析。Cpf1像Cas9一样有两个叶：REC(识别)叶和NUC(核酸酶)叶。REC叶包括REC1和REC2结构域，其缺少与任何已知蛋白质结构的相似性。同时，NUC叶包括三个RuvC结构域(RuvC-I、-II和-III)和BH结构域。然而，与Cas9相反，Cpf1 REC叶缺少HNH结构域，并且包括同样缺少与已知蛋白质结构的相似性的其他结构域：结构上独特的PI结构域、三个楔形(WED)结构域(WED-I、-II和-III)和核酸酶(Nuc)结构域。
虽然Cas9和Cpf1共享结构和功能的相似性，但应了解，某些Cpf1活性是由与任何Cas9域不同的结构域介导的。例如，靶DNA的互补链的切割似乎是由Nuc结构域介导，所述Nuc结构域在顺序上和空间上与Cas9的HNH结构域不同。另外，Cpf1 gRNA的非靶向部分(把手)采用假结(pseudoknot)结构，而不是Cas9 gRNA中由重复:抗重复双链体形成的茎环结构。
核酸酶变体
本文所述的RNA指导的核酸酶具有可用于多种应用的活性和特性，但技术人员将了解，RNA指导的核酸酶在某些情况下也可以经修饰，以改变切割活性、PAM特异性或其他结构或功能特征。
首先参看改变切割活性的修饰，上文已描述降低或消除NUC叶内结构域活性的突变。可在RuvC结构域中、在Cas9 HNH结构域中或在Cpf1 Nuc结构域中进行的示例性突变描述于Ran&Hsu等人,(Cell[细胞]154(6),1380-1389,2013年9月12日),和Yamano等人(Cell[细胞].2016年5月5日；165(4):949-962)；以及Cotta-Ramusino的WO 2016/073990中，其每个的全部内容通过引用并入本文。通常，降低或消除两个核酸酶结构域之一中的活性的突变导致具有切口酶活性的RNA指导的核酸酶，但应注意，切口酶活性的类型根据哪个结构域失活而变化。作为一个实例，RuvC结构域或Cas9 HNH结构域的失活得到切口酶。
对于化脓链球菌(Kleinstiver等人,Nature[自然].2015年7月23日；523(7561):481-5和金黄色葡萄球菌(Kleinstiver等人,Nat Biotechnol.[自然生物技术]2015年12月；33(12):1293–1298)，相对于天然存在的Cas9参考分子的PAM特异性的修饰已经由Kleinstiver等人描述。Kleinstiver等人还已描述改进Cas9的靶向保真性的修饰(Nature[自然],2016年1月28日；529,490-495)。这些参考文献中的每一篇都是通过引用并入本文。
已将RNA指导的核酸酶分裂成两个或更多个部分，如Zetsche等人(NatBiotechnol.[自然生物技术]2015年2月；33(2):139-42，通过引用并入)和Fine等人(SciRep.[科学报告]2015年7月1日；5:10777，通过引用并入)所描述。
在某些实施例中，RNA指导的核酸酶可以是尺寸经优化的或截短的，例如通过一个或多个缺失来进行，所述缺失减小核酸酶的尺寸，同时仍保留gRNA关联、靶标和PAM识别以及切割活性。在某些实施例中，RNA指导的核酸酶以共价或非共价方式，任选地通过接头结合至另一多肽、核苷酸或其他结构。示例性结合的核酸酶和接头描述于Guilinger等人,Nature Biotechnology[自然生物技术]32,577–582(2014)中，其通过引用并入本文。
RNA指导的核酸酶还任选地包括标签，例如但不限于核定位信号，以促进RNA指导的核酸酶蛋白移动至细胞核中。在某些实施例中，RNA指导的核酸酶可以并入C末端和/或N末端核定位信号。核定位序列是本领域中已知的并且描述于Maeder和其他文献中。
前述修饰列表旨在具有示例性，并且技术人员根据本披露将了解，在某些应用中，其他修饰可以是可能的或期望的。因此，为简洁起见，参考特定RNA指导的核酸酶呈现本披露的示例性系统、方法和组合物，但应理解，所用RNA指导的核酸酶可以不改变其操作原理的方式经修饰。此类修饰在本披露的范围内。
示例性的适合核酸酶变体包括但不限于包含M537R取代、H800A取代和/或F870L取代或其任何组合(根据AsCpf1野生型序列的编号方案)的AsCpf1变体。在一些实施例中，ASCpf1变体包含M537R取代、H800A取代和F870L取代。AsCpf1氨基酸序列的其他适合修饰是本领域普通技术人员已知的。下面提供了野生型AsCpf1和AsCpf1变体的一些示例性序列：
His-AsCpf1-sNLS-sNLS H800A氨基酸序列(SEQ ID NO:1144)：
Figure BDA0003723238800001091
Cpf1变体1氨基酸序列(SEQ ID NO:1145)：
Figure BDA0003723238800001101
Cpf1变体2氨基酸序列(SEQ ID NO:1146)：
Figure BDA0003723238800001111
Cpf1变体3氨基酸序列(SEQ ID NO:1147)：
Figure BDA0003723238800001112
Figure BDA0003723238800001121
Cpf1变体4氨基酸序列(SEQ ID NO:1148)：
Figure BDA0003723238800001122
Cpf1变体5氨基酸序列(SEQ ID NO:1149)：
Figure BDA0003723238800001131
Cpf1变体6氨基酸序列(SEQ ID NO:1150)：
Figure BDA0003723238800001132
Figure BDA0003723238800001141
Cpf1变体7氨基酸序列(SEQ ID NO:1151)：
Figure BDA0003723238800001142
示例性AsCpf1野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:1152)：
Figure BDA0003723238800001143
Figure BDA0003723238800001151
鉴于本领域的知识，基于本披露，其他合适的核酸酶和核酸酶变体对于技术人员将是显而易见的。示例性合适的核酸酶可包括但不限于本文表2中提供的那些。
编码RNA指导的核酸酶的核酸
本文提供编码RNA指导的核酸酶(例如Cas9、Cpf1或其功能片段)的核酸。先前已描述编码RNA指导的核酸酶的示例性核酸(参见，例如，Cong 2013；Wang 2013；Mali 2013；Jinek 2012)。
在一些情形中，编码RNA指导的核酸酶的核酸可以是合成的核酸序列。例如，合成核酸分子可以经化学修饰。在某些实施例中，编码RNA指导的核酸酶的mRNA将具有一种或多种(例如，所有)以下特性：其可以被加帽；多聚腺苷酸化；以及经5-甲基胞苷和/或假尿苷取代。
合成的核酸序列也可以经密码子优化，例如，至少一个非常见密码子或较不常见的密码子已经常见密码子替代。例如，合成核酸可以引导经优化信使mRNA的合成，例如，针对在哺乳动物表达系统中的表达进行优化，例如，本文所述。密码子优化的Cas9编码序列的实例呈现于Cotta-Ramusino中。
另外，或可替代地，编码RNA指导的核酸酶的核酸可包含核定位序列(NLS)。核定位序列是本领域中已知的。
例如，Cpf1变体4的核酸序列如下SEQ ID NO:1177所示
Figure BDA0003723238800001161
Figure BDA0003723238800001171
Figure BDA0003723238800001181
激活素
TGF-β超家族由超过45个成员组成，包括激活素、抑制素、肌肉生长抑制素、骨形态发生蛋白(BMP)、生长和分化因子(GDF)和淋巴结(参见例如Morianos等人,Journal ofAutoimmunity[自身免疫杂志]104:102314(2019))。激活素被发现为与二硫键连接的βA或/和βB亚基的同二聚体或异二聚体。激活素有三种功能异构体：激活素A(βAβA)、激活素B(βΒβΒ)和激活素AB(βAβΒ)(Xia等人,J.Endocrinol[内分泌杂志].202:1-12(2009))。βC和βE亚基存在于哺乳动物中，并且βB亚基存在于非洲爪蟾中。βA和βB亚基的转录物几乎在人体的每个组织中都可以检测到，并且在生殖系统中表现出增加的表达，而βC和βE亚基主要在肝脏中表达(Woodruff,Biochem.Pharmacol[生物化学与药理学].55:953-963(1998))。激活素A是约25kDa的细胞因子并且代表激活素家族中研究最广泛的蛋白质。激活素A最初被鉴定为性腺蛋白，其诱导垂体中促卵泡激素的生物合成和分泌(Hedger等人,CytokineGrowth Factor Rev.[细胞因子和生长因子评论]24:285-295(2013))。它在脊椎动物中高度保守，物种间同源性高达95％。激活素A调节基本的生物学过程，例如造血、胚胎发育、干细胞维持和多能性、组织修复和纤维化(Kariyawasam等人,Clin.Exp.Allergy[临床和实验性过敏]41:1505-1514(2011))。
激活素，例如激活素A，是众所周知的并且可商购获得(例如，来自马萨诸塞州剑桥市的干细胞技术公司(STEMCELL Technologies Inc.))。
培养方法
一般而言，可以通过以下来培养ES细胞(例如，经基因工程化以不表达一种或多种TGFβ受体例如TGFβRII的ES细胞)以保持多能性：在含有激活素(例如，特定的有效水平的激活素)的培养基中培养(例如，在一个或多个培养阶段期间)这种ES细胞。
在一些实施例中，本文所述的ES细胞在包含激活素(例如，升高的激活素水平)的培养基中培养(例如，在一个或多个培养阶段)以保持细胞的多能性。在一些实施例中，一种或多种ES标志物(例如，SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-49/6E、ALP、Sox2、E-钙粘蛋白，UTF-1、Oct4、Rex1和/或Nanog)在来自培养物的细胞样品中相对于在使用不包含激活素的相同培养基中培养的细胞样品中的一个或多个相应水平增加，例如，升高的激活素水平。在一些实施例中，一种或多种ES标志物的增加水平比相应的一个或多个水平高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％或更多。
如本文所用，“升高的激活素水平”是指比标准培养基、起始培养基、在一个或多个培养阶段使用的培养基和/或培养ES细胞的培养基中存在的激活素浓度更高。在一些实施例中，激活素不存在于标准和/或起始培养基、在一个或多个培养阶段使用的培养基和/或培养ES细胞的培养基中，并且“升高的水平”是激活素的任何量。培养基最初(即，在培养开始时)可包括升高的激活素水平，和/或培养基可在培养过程中的特定时间或多个时间(例如，在一个或多个阶段)补充激活素以实现升高的激活素水平。
在一些实施例中，升高的激活素水平是相对于标准培养基、起始培养基、一个或多个培养阶段期间的培养基和/或培养ES细胞的培养基中的激活素水平增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、550％、600％、650％、700％、750％、800％、850％、900％、950％、1000％或更多。
在一些实施例中，升高的激活素水平是约0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、3ng/mL、4ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、45ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL、100ng/mL或更多激活素。在一些实施例中，升高的激活素水平是约0.5ng/mL至约20ng/mL激活素、约0.5ng/mL至约10ng/mL激活素、约4ng/mL至约10ng/mL激活素。
细胞可以在本领域已知的多种细胞培养基中培养，其根据本披露内容被修饰以包括如本文所述的激活素。本领域技术人员理解细胞培养基是指培养细胞(例如动物或哺乳动物细胞)的营养液。细胞培养基通常包括以下一种或多种组分：能源(例如，碳水化合物，如葡萄糖)；氨基酸；维生素；脂质或游离脂肪酸；和微量元素，例如微摩尔范围内的无机化合物或天然存在的元素。细胞培养基还可以含有其他组分，例如激素和其他生长因子(例如，胰岛素、转铁蛋白、表皮生长因子、血清等)；信号因子(例如，白介素15(IL-15)、转化生长因子β(TGF-β)等)；盐(例如钙、镁和磷酸盐)；缓冲液(例如，HEPES)；核苷和碱基(例如腺苷、胸苷、次黄嘌呤)；抗生素(例如庆大霉素)；和细胞保护剂(例如，Pluronic多元醇(Pluronic F68))。
可以根据本披露修改已经制备的或可商购的培养基以用于本文所述的方法中。此类培养基的非限制性示例包括基本必需培养基(MEM,西格玛公司(Sigma)，圣路易斯，密苏里州)；汉姆氏(Ham’s)F10培养基(西格玛公司)；杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM，西格玛公司)；RPM I-1640培养基(西格玛公司)；HyClone细胞培养基(HyClone公司，洛根(Logan)，犹他州)；Power CHO2(龙沙公司(Lonza Inc.),艾伦代尔(Allendale)，新泽西州)；以及针对特定细胞类型配制的化学成分确定(CD)的培养基。在一些实施例中，培养基是在例如Chen等人,Nat.Methods[自然方法]8:424-429(2011)中描述的E8培养基。在一些实施例中，细胞培养基包含激活素但缺乏TGFβ。
适用于ES细胞的细胞培养条件(包括pH、O2、CO2、搅拌速率和温度)是本领域已知的那些，例如在Schwartz等人,Methods Mol.Biol.[分子生物学方法]767:107-123(2011)和Chen等人,Nat.Methods[自然方法]8:424-429(2011)中描述的。
在一些实施例中，细胞在一个或多个阶段培养，并且细胞可以在一个或多个阶段在具有升高的激活素水平的培养基中培养。例如，培养方法可以包括第一阶段(例如，使用具有降低的激活素水平或没有激活素的培养基)和第二阶段(例如，使用具有升高的激活素水平的培养基)。在一些实施例中，培养方法可以包括第一阶段(例如，使用具有升高的激活素水平的培养基)和第二阶段(例如，使用具有降低的激活素水平的培养基)。在一些实施例中，培养方法包括多于两个阶段，例如3、4、5、6或更多个阶段，并且任何阶段可以包括具有升高的激活素水平或降低的激活素水平的培养基。培养的长度不受限制。例如，培养方法可以是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20天或更多天。在一些实施例中，培养方法包括至少两个阶段。例如，第一阶段可以包括在具有降低的激活素水平的培养基中培养细胞(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多天)，以及第二阶段可以包括在具有升高的激活素水平的培养基中培养细胞(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多天)。在一些实施例中，第一阶段可包括在具有升高的激活素水平的培养基中培养细胞(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多天)，和第二阶段可以包括在具有降低的激活素水平的培养基中培养细胞(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多天)。
在特定方法中，在细胞培养的一个或多个时间(例如，一个或多个阶段)期间监测在来自细胞培养物的细胞样品中表达的一种或多种ES标志物(例如，SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-49/6E、ALP、Sox2、E-钙粘蛋白、UTF-1、Oct4、Rex1和/或Nanog)的水平，从而允许调整(例如，增加或减少培养物中激活素的量)停止培养，和/或从培养物中收获细胞。
表征方法
包括表征细胞表型的表征细胞的方法是本领域技术人员已知的。在一些实施例中，一种或多种这样的方法可以包括但不限于例如形态分析和流式细胞术。细胞谱系和身份标志物是本领域技术人员已知的。一种或多种此类标志物可与一种或多种表征方法组合以确定细胞群的组成或一种或多种细胞的表型身份。例如，在一些实施例中，特定群体的细胞将使用流式细胞术来表征。在一些这样的实施例中，将评估细胞群样品中一种或多种细胞表面标志物和/或一种或多种细胞内标志物的存在和比例。如本领域技术人员将理解的，这样的细胞表面标志物可以代表不同的谱系。例如，多能细胞可以通过已知与此类细胞相关的任何数量的标志物中的一种或多种来鉴定，例如CD34。此外，在一些实施例中，可以通过指示某种分化程度的标志物来鉴定细胞。这样的标志物对于本领域技术人员来说是已知的。例如，在一些实施例中，分化的细胞的标志物可以包括与分化的造血细胞例如CD43、CD45(分化的造血细胞)相关的那些。在一些实施例中，分化的细胞的标志物可以与NK细胞表型相关，例如CD56(也称为神经细胞粘附分子)、NK细胞受体免疫球蛋白γFc区受体III(FcγRIII、分化簇16(CD16)、自然杀伤组2成员A(NKG2A)、自然杀伤组2成员D(NKG2D)、CD69、天然细胞毒性受体(例如，NCR1、NCR2、NCR3、NKp30、NKp44、NKp46和/或CD158b)、杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)和CD94(也称为杀伤细胞凝集素样受体亚家族D，成员1(KLRD1))等。在一些实施例中，标志物可以是T细胞标志物(例如，CD3、CD4、CD8等)。
使用方法
可以通过使用本披露提供的技术来治疗多种疾病、障碍和/或病症。例如，在一些实施例中，可以通过将如本文所述的经修饰的细胞(例如，经编辑的iNK细胞)引入受试者来治疗疾病、障碍和/或病症。可以治疗的疾病的实例包括但不限于例如脑、前列腺、乳腺、肺、结肠、子宫、皮肤、肝脏、骨、胰腺、卵巢、睾丸、膀胱、肾、头、颈、胃、宫颈、直肠、喉或食道的癌症，例如实体瘤；和血液系统恶性肿瘤，例如急性和慢性白血病，淋巴瘤，例如B细胞淋巴瘤，包括霍奇金和非霍奇金淋巴瘤，多发性骨髓瘤和骨髓增生异常综合征。
在一些实施例中，本披露提供了通过向有需要的受试者施用包含本文所述的任何细胞的组合物来治疗受试者的方法。在一些实施例中，治疗剂或组合物可以在疾病、障碍或病症(包括例如损伤)发作之前、期间或之后施用。
在特定实施例中，受试者患有可以通过细胞疗法治疗的疾病、障碍或病状。在一些实施例中，需要细胞疗法的受试者是患有疾病、障碍和/或病症的受试者，由此将细胞疗法，例如其中包含本文所述细胞的组合物的疗法，施用于受试者，由此细胞疗法治疗与疾病、障碍和/或病症相关的至少一种症状。在一些实施例中，需要细胞疗法的受试者包括但不限于骨髓或干细胞移植的候选者、接受化疗或照射疗法的受试者、患有过度增殖性障碍或癌症(例如过度增殖性障碍或造血系统的癌症)或者有患此的风险的受试者、患有肿瘤(例如实体肿瘤)或有发展此的风险的受试者、和/或患有病毒感染或与病毒感染相关的疾病或者有患此的风险的受试者。
药物组合物
在一些实施例中，本披露提供了药物组合物，其包含本文所述的一种或多种经基因修饰的细胞，例如本文所述的经编辑的iNK细胞。在一些实施例中，药物组合物还包含药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，药物组合物包含分离的多能干细胞衍生的造血谱系细胞，其包含至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％T细胞、NK细胞、NKT细胞、CD34+HE细胞或HSC，例如经基因修饰(例如，经编辑)的T细胞、NK细胞、NKT细胞、CD34+HE细胞或HSC。在一些实施例中，药物组合物包含分离的多能干细胞衍生的造血谱系细胞，其包含约95％至约100％T细胞、NK细胞、NKT细胞、CD34+HE细胞或HSC，例如经基因修饰(例如，经编辑)的T细胞、NK细胞、NKT细胞、CD34+HE细胞或HSC。
在一些实施例中，本披露的药物组合物包含多能干细胞衍生的造血谱系细胞的分离群，其中分离的群具有少于约0.1％、0.5％、1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％或30％T细胞、NK细胞、NKT细胞、CD34+HE细胞或HSC，例如经基因修饰(例如，经编辑)的T细胞、NK细胞、NKT细胞、CD34+HE细胞或HSC。在一些实施例中，多能干细胞衍生的造血谱系细胞的分离群具有超过约0.1％、0.5％、1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％或30％T细胞、NK细胞、NKT细胞、CD34+HE细胞或HSC，例如经基因修饰(例如，经编辑)的T细胞、NK细胞、NKT细胞、CD34+HE细胞或HSC。在一些实施例中，多能干细胞衍生的造血谱系细胞的分离群具有约0.1％至约1％、约1％至约3％、约3％至约5％、约10％-约15％、约15％-20％、约20％-25％、约25％-30％、约30％-35％、约35％-40％、约40％-45％、约45％-50％、约60％-70％、约70％-80％、约80％-90％、约90％-95％或约95％至约100％T细胞、NK细胞、NKT细胞、CD34+HE细胞或HSC，例如经基因修饰(例如，经编辑)的T细胞、NK细胞、NKT细胞、CD34+HE细胞或HSC。
在一些实施例中，多能干细胞衍生的造血谱系细胞的分离群包含约0.1％、约1％、约3％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％、约99％或约100％T细胞、NK细胞、NKT细胞、CD34+HE细胞或HSC，例如经基因修饰(例如，经编辑)的T细胞、NK细胞、NKT细胞、CD34+HE细胞或HSC。
如本领域普通技术人员将理解的，自体和同种异体的细胞均可用于过继细胞疗法。与其他细胞疗法相比，自体细胞疗法通常具有减少的感染、低GVHD概率和快速免疫重建。与其他细胞疗法相比，同种异体细胞疗法通常具有免疫介导的移植物抗恶性病(GVM)效应和低复发率。基于需要细胞疗法的受试者的一个或多个特定病症，本领域普通技术人员将能够确定要施用哪一个或多个特定类型的疗法。
在一些实施例中，药物组合物包含与受试者同种异体的多能干细胞衍生的造血谱系细胞。在一些实施例中，药物组合物包含受试者自体的多能干细胞衍生的造血谱系细胞。对于自体移植，多能干细胞衍生的造血谱系细胞的分离群可以与患者受试者完全或部分HLA匹配。在一些实施例中，多能干细胞衍生的造血谱系细胞与受试者不是HLA匹配的。
在一些实施例中，可以将多能干细胞衍生的造血谱系细胞施用给受试者，而无需在施用前离体或体外扩增。在特定实施例中，使用一种或多种药剂调节和离体处理衍生的造血谱系细胞的分离群，以获得具有改进的治疗潜力的免疫细胞。在一些实施例中，可以洗涤经调节的衍生的造血谱系细胞以除去一种或多种处理剂，并可以将经改进的细胞群施用给受试者，而不进一步体外扩增该细胞群。在一些实施例中，在用一种或多种药剂调节衍生的造血谱系细胞的分离群之前扩增该分离群。
在一些实施例中，可以对衍生的造血谱系细胞的分离群进行基因修饰(例如，通过重组方法)以表达TCR、CAR或其他蛋白质。对于表达重组TCR或CAR的基因工程化的衍生的造血谱系细胞，无论在细胞的基因修饰之前或之后，这些细胞可以使用例如在以下文献中描述的方法激活和扩增：美国专利号6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利申请公开号20060121005。
癌症
可以使用本文所述的组合物治疗任何癌症。本披露的示例性治疗靶标包括来自膀胱、血液、骨、骨髓、脑、乳腺、结肠、食道、眼睛、胃肠、牙龈、头、肾、肝脏、肺、鼻咽、颈、卵巢、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌或子宫的癌细胞。此外，癌症具体可以是以下非限制性组织学类型：恶性赘生物；癌；未分化癌；巨细胞癌和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；恶性胃泌素瘤；胆管癌；肝细胞癌；混合性肝细胞癌和胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉的腺癌；家族性息肉病的腺癌；实体癌；恶性类癌；细支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌(chromophobe carcinoma)；嗜酸细胞癌(acidophil carcinoma)；嗜酸性细胞腺癌(oxyphilic adenocarcinoma)；嗜碱性粒细胞癌；透明细胞腺癌；粒细胞癌；滤泡状腺癌；乳头状和滤泡状腺癌；非包裹性硬化性癌(nonencapsulating sclerosing carcinoma)；肾上腺皮质癌；内膜样癌；皮肤附属器癌；大汗腺腺癌(apocrine adenocarcinoma)；皮脂腺癌；耵聍腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；黏液性囊腺癌；黏液性腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；佩吉特氏病，乳房；腺泡细胞癌；腺鳞癌；伴有鳞状化生的腺癌；恶性胸腺瘤；恶性卵巢基质肿瘤；恶性泡膜细胞瘤；恶性粒细胞瘤；恶性男性母细胞瘤；支持细胞癌(sertoli cell carcinoma)；恶性莱迪希细胞瘤；恶性脂质细胞瘤(lipid cell tumor)；恶性副神经节瘤；恶性乳腺外副神经节瘤；嗜铬细胞瘤；血管球瘤；恶性黑素瘤；无黑素性黑素瘤；浅表扩散性黑素瘤；巨色素痣的恶性黑素瘤；上皮样细胞黑素瘤；恶性蓝痣；肉瘤；纤维肉瘤；恶性纤维组织细胞瘤；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；肺泡型横纹肌肉瘤；间质肉瘤；恶性混合瘤；缪勒混合瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；恶性间质瘤；恶性布伦纳瘤；恶性乳腺叶状肿瘤；滑膜肉瘤；恶性间皮瘤；无性细胞瘤；胚胎性癌；恶性畸胎瘤；恶性卵巢甲状腺瘤；绒毛膜癌；恶性中肾瘤；血管肉瘤；恶性血管内皮瘤；卡波西肉瘤；恶性血管外皮细胞瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁成骨肉瘤；软骨肉瘤；恶性成软骨细胞瘤；间充质软骨肉瘤；骨巨细胞肿瘤；尤因肉瘤；恶性牙源性肿瘤；成釉细胞牙肉瘤；恶性成釉细胞瘤；成釉细胞纤维肉瘤；恶性松果体瘤；脊索瘤；恶性胶质瘤；室管膜细胞瘤；星形细胞瘤；原生质性星形细胞瘤；纤维型星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突神经胶质瘤；成少突神经胶质瘤；原始神经外胚层瘤；小脑肉瘤；节细胞性神经母细胞瘤；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；恶性脑膜瘤；神经纤维肉瘤；恶性神经鞘瘤；恶性粒细胞瘤；恶性淋巴瘤；B细胞淋巴瘤；霍奇金氏病；霍奇金氏淋巴瘤；副肉芽肿；恶性小淋巴细胞性淋巴瘤；恶性弥漫性大细胞淋巴瘤；恶性滤泡状淋巴瘤；蕈样肉芽肿；其他指定的非霍奇金氏淋巴瘤；恶性组织细胞增多症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增殖性小肠疾病；白血病；淋巴性白血病；浆细胞性白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；骨髓性白血病；嗜碱性粒细胞白血病；嗜酸性粒细胞白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；成巨核细胞白血病；髓样肉瘤；和毛细胞白血病。
在一些实施例中，癌症是乳腺癌。在一些实施例中，癌症是结肠癌。在一些实施例中，癌症是胃癌。在一些实施例中，癌症是RCC。在另一个实施例中，癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)。
在一些实施例中，可以用本文提供的iNK细胞(例如，经基因修饰的iNK细胞，例如，经编辑的iNK细胞)单独或与一种或多种另外癌症治疗方式组合治疗的实体癌适应症包括：膀胱癌、肝细胞癌、前列腺癌、卵巢癌/子宫癌、胰腺癌、间皮瘤、黑素瘤、胶质母细胞瘤、HPV相关和/或HPV阳性癌症如宫颈癌和HPV+头颈癌、口腔癌、咽癌、甲状腺癌、胆囊癌和软组织肉瘤。在一些实施例中，可用本文提供的iNK细胞(例如，经基因修饰的iNK细胞，例如，经编辑的iNK细胞)单独或与一种或多种另外癌症治疗方式组合治疗的血液癌症适应症包括：ALL、CLL、NHL、DLBCL、AML、CML和多发性骨髓瘤(MM)。
肺的细胞增殖和/或分化障碍的实例包括但不限于肿瘤，如支气管源性癌，包括副肿瘤综合征、细支气管肺泡癌，神经内分泌肿瘤如支气管癌，混合性肿瘤，转移性肿瘤和胸膜肿瘤，包括孤立性纤维肿瘤(胸膜纤维瘤)和恶性间皮瘤。
乳腺细胞增殖和/或分化障碍的实例包括但不限于增殖性乳腺疾病，包括例如上皮增生、硬化性腺病和小导管乳头状瘤(small duct papillomas)；肿瘤，例如基质肿瘤，如纤维腺瘤、乳腺叶状肿瘤和肉瘤，以及上皮肿瘤，如大导管乳头状瘤；乳腺癌，包括原位(非侵袭性)癌，其包括导管原位癌(包括佩吉特氏病)和原位小叶癌，以及侵袭性(浸润性)癌，包括但不限于侵袭性导管癌、侵袭性小叶癌、髓样癌、胶样(黏液性)癌、小管癌和侵袭性乳头状癌，以及混合性恶性赘生物。雄性乳腺的障碍包括但不限于男性乳房增大和癌。
涉及结肠的细胞增殖和/或分化障碍的实例包括但不限于结肠肿瘤，如非赘生性息肉、腺瘤、家族性综合征、结直肠癌发生、结直肠癌和类癌肿瘤。
除了上述那些之外，癌症或赘生性病症的实例包括但不限于纤维肉瘤、肌肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮细胞肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、胃癌、食管癌、直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、子宫癌、头颈癌、皮肤癌、脑癌、鳞状细胞癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管源性癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、威尔姆氏肿瘤、宫颈癌、睾丸癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜细胞瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、白血病、淋巴瘤或卡波西肉瘤。
示例性有用的另外癌症治疗方式包括但不限于：化学治疗剂包括烷基化剂，如噻替派和
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环磷酰胺；烷基磺酸盐，如白消安、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，如苯并多巴(benzodopa)、卡巴醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和脲多巴(uredopa)；乙烯亚胺和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺、曲他胺、三亚乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；多聚乙酰类(acetogenins)(尤其是布拉它辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone)；δ-9-四氢大麻酚(屈大麻酚，
Figure BDA0003723238800001272
)；β-拉帕醌；拉帕醇；秋水仙碱；桦木酸；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康
Figure BDA0003723238800001273
CPT-11(伊立替康、
Figure BDA0003723238800001274
)、乙酰基喜树碱(acetylcamptothecin)、莨菪亭(scopolectin)和9-氨基喜树碱(aminocamptothecin))；苔藓虫素卡利他汀(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷；念珠藻素类(cryptophycins)(具体是念珠藻素1和念珠藻素8)；尾海兔素(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；五加素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑制素(spongistatin)；氮芥类，如苯丁酸氮芥、萘氮芥、胆怜酸胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥，氮芥、盐酸氧氮芥(mechlorethamineoxide hydrochloride)、美法仑、新恩比兴(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼氮芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosf amide)、乌拉莫司汀；亚硝基脲类(nitrosureas)，如卡莫司汀、氯脲霉素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、环己亚硝脲、尼莫司汀(nimustine)、和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，如烯二炔抗生素(例如，卡奇霉素(calicheamicin)，尤其卡奇霉素γ1I和卡奇霉素ωl1(参见，例如，Agnew,Chem.Intl.Ed.Engl.,33:183-186(1994))；达内霉素(dynemicin)，包含达内霉素A；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素发色团(neocarzinostatin chromophore)和相关的色蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素类(aclacinomysins)、放线菌素、氨茴霉素(authramycin)、重氮丝氨酸(azaserine)、博莱霉素、放线菌素C、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素D、道诺霉素、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括
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吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉代-多柔比星、多柔比星HCl脂质体注射
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和去氧多柔比星)、表柔比星、依索比星(esorubicin)、伊达比星、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素如丝裂霉素C、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素类(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲菌素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、新制癌菌素(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，如甲氨蝶呤、吉西他滨
Figure BDA0003723238800001283
喃氟啶(tegafur)
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卡培他滨
Figure BDA0003723238800001285
埃博霉素和5-氟脲嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，例如氟达拉滨，6-巯嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如环胞苷(ancitabine)、阿扎胞苷、6-氮尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖孢苷、二脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨、氟尿苷；雄激素，例如卡普睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺类，如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，例如亚叶酸；醋葡醛内酯(aceglatone)；醒磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶；阿莫司汀(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地佛法明(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elformithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；洛尼代宁(lonidainine)；美登木素生物碱，如美登素和安丝菌素(ansamitocins)；米托胍腙；米托蒽醌；莫匹丹莫(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁；苯来美特(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼；
Figure BDA0003723238800001291
多糖复合物(JHS自然产品公司(JHS NaturalProducts)，尤金市(Eugene)，俄勒冈州(Oreg))；丙亚胺(razoxane)；根霉素；裂裥菌素(sizofuran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌；2,2′,2″-三氯三乙胺；单端孢霉烯(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、维拉库林(verracurin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇形菌素(anguidine)；乌拉坦(urethan)；长春地辛
Figure BDA0003723238800001292
达卡巴嗪；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加西托新(gacytosine)；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；噻替派；紫杉烷类，例如紫杉醇
Figure BDA0003723238800001293
紫杉醇(ABRAXANETM)的白蛋白工程化的纳米颗粒配制品、和多西他赛
Figure BDA0003723238800001294
苯丁酸氮芥(chloranbucil)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，如顺铂和卡铂；长春碱
Figure BDA0003723238800001295
铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱
Figure BDA0003723238800001296
奥沙利铂；甲酰四氢叶酸；长春瑞滨
Figure BDA0003723238800001297
能灭瘤(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤；环孢菌素、西罗莫司、雷帕霉素、雷帕霉素类似物(rapalogs)、伊班膦酸钠(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇，如视黄酸；CHOP，即环磷酰胺、多柔比星、长春花碱和泼尼松龙组合疗法的缩写，以及FOLFOX，即奥沙利铂(ELOXATINTM)与5-FU、亚叶酸组合的治疗方案的缩写；抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括例如他莫昔芬(包括
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他莫昔芬)、雷洛昔芬
Figure BDA0003723238800001299
屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、克沃西芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮和托瑞米芬
Figure BDA00037232388000012910
抗孕激素；雌激素受体下调剂(ERD)；雌激素受体拮抗剂，如氟维司群
Figure BDA00037232388000012911
发挥作用以抑制或关闭卵巢的剂，例如，黄体生成素-释放激素(LHRH)激动剂，如醋酸亮丙瑞林(
Figure BDA00037232388000012912
和
Figure BDA00037232388000012913
)、醋酸戈舍瑞林、醋酸布舍瑞林和曲普瑞林；其他抗雄激素，如氟他胺、尼鲁米特和比卡鲁胺；和芳香酶抑制剂，其抑制酶芳香酶，该芳香酶调节肾上腺中的雌激素产生，如例如，4(5)-咪唑、氨鲁米特、醋酸甲地孕酮
Figure BDA0003723238800001301
依西美坦
Figure BDA0003723238800001302
福美坦、法倔唑、伏氯唑
Figure BDA0003723238800001303
来曲唑
Figure BDA0003723238800001304
和阿那曲唑
Figure BDA0003723238800001305
二膦酸盐，如氯膦酸盐(例如，
Figure BDA0003723238800001306
或
Figure BDA0003723238800001307
)、依替膦酸盐
Figure BDA0003723238800001308
NE-58095，唑来膦酸/唑来膦酸盐
Figure BDA0003723238800001309
阿伦膦酸盐
Figure BDA00037232388000013010
帕米膦酸盐
Figure BDA00037232388000013011
替鲁膦酸盐
Figure BDA00037232388000013012
或利塞膦酸盐
Figure BDA00037232388000013013
曲沙他滨(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；适体，例如在通过引用以其整体并入本文的美国专利号6,344,321中描述的；抗HGF单克隆抗体(例如，来自阿韦奥公司(Aveo)的AV299、来自安进公司(Amgen)的AMG102)；截短的mTOR变体(例如，来自Compugen的CGEN241)；蛋白激酶抑制剂，其阻断mTOR诱导的路径(例如，来自阿库利公司(Arqule)的ARQ197、来自埃克利西斯公司(Exelexis)的XL880、来自SGX制药公司(SGXPharmaceuticals)的SGX523、来自超基因公司(Supergen)的MP470、来自辉瑞公司(Pfizer)的PF2341066)；疫苗，如
Figure BDA00037232388000013014
疫苗和基因疗法疫苗，例如
Figure BDA00037232388000013015
疫苗、
Figure BDA00037232388000013016
疫苗和
Figure BDA00037232388000013017
疫苗；拓扑异构酶1抑制剂(例如，
Figure BDA00037232388000013018
)；rmRH(例如，
Figure BDA00037232388000013019
)；二甲苯磺酸拉帕替尼(ErbB-2和EGFR双酪氨酸激酶小分子抑制剂，也称为GW572016)；COX-2抑制剂，例如塞来昔布(
Figure BDA00037232388000013020
4-(5-(4-甲基苯基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基)苯磺酰胺；以及上述任一项的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
有效于治疗癌症的其他化合物在本领域中是已知的，并且本文所述的适合于作为另外癌症治疗方式与本披露的组合物和方法一起使用的其他化合物描述于例如，“Physicians Desk Reference[医生桌面参考],第62版.奥拉德尔,新泽西州:医学经济有限公司(Medical Economics Co.),2008“,Goodman&Gilman，“The Pharmacological Basisof Therapeutics[治疗剂的药理学基础],第十一版.McGraw-Hill,2005”，“Remington:TheScience and Practice of Pharmacy[雷明顿：药学科学与实践],第20版.巴尔的摩,马里兰州:Lippincott Williams&Wilkins,2000.”，和“The Merck Index[默克索引],第十四版.白宫,新泽西州:默克研究实验室(Merck Research Laboratories),2006”，这些文献的相关部分通过引用并入本文。
在整个说明书中，除非上下文另有要求，否则单词“包括(comprise/comprises和comprising)”将被理解为暗示包括所述步骤或要素或者步骤或要素的群组，但不排除任何其他步骤或要素或者步骤或要素的群组。“由...组成”意在包括但不限于短语“由以下组成：”之后的任何。因此，短语“由...组成”指示所列出的要素是必需的或强制性的，并且没有其他要素可以存在。“基本上由...组成”意在包括该短语之后列出的任何要素，并限于不会干扰或有助于本披露针对所列出的要素指定的活性或作用的其他要素。因此，短语“基本上由...组成”指示所列出的要素是必需的或强制性的，而没有其他元素是可选的，并且根据它们是否影响所列出的要素的活性或作用而可以存在或可以不存在。
根据上文详细说明，可以对实施例作出这些和其他改变。总体上，在以下权利要求书中，所使用的术语不应解读为将权利要求书限制为说明书和权利要求书中披露的具体实施例，而应解读为包括所有可能的实施例连同这些权利要求所享有的等效权利的全部范围。因此，权利要求书不受本披露的限制。
可以组合上述不同的实施例以提供另外的实施例。将在本说明书中引用的和/或在申请数据表中列举的所有美国专利申请公开案、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利公开案通过引用以其整体并入本文。数据库条目的内容，例如本文提供的NCBI核苷酸或蛋白质数据库条目，以其整体并入本文。如果数据库条目经受随时间的变化，则自本申请的申请日期的内容通过引用并入本文。如果必要的话，可以修改实施例的方面，以采用不同专利、申请和公开案的概念以提供又另外的实施例。
通过以下实例进一步说明本披露。提供这些实例仅出于说明目的。它们不应以任何方式解释为限制本披露的范围或内容。
实例
实例1：使用Cas12a生成经编辑的iPSC细胞并测试激活素A对多能性的影响
为了从多能干细胞产生自然杀伤细胞，产生了代表性的诱导型多能干细胞(iPSC)系并命名为“PCS-201”。该系是通过使用市售的非修饰RNA重编程试剂盒(Stemgent/Reprocell，美国)对购自ATCC(
Figure BDA0003723238800001311
PCS-201-012)的成年男性原代真皮成纤维细胞进行重编程而产生的。重编程试剂盒包含未修饰的重编程mRNA(OCT4、SOX2、KLF4、cMYC、NANOG和LIN28)以及来自302/367簇的免疫逃避mRNA(E3、K3和B18R)和双链微小RNA(miRNA)。将成纤维细胞接种在成纤维细胞扩增培养基(含10％FBS的DMEM/F12)中。第二天，将培养基切换到Nutristem培养基，每天进行过夜转染，持续4天(第1至第4天)。原代iPSC集落出现在第7天，并在第10-14天被挑选出来。对挑选的集落进行克隆扩增，以获得足够数量的细胞来建立主细胞库。从此过程中选择并用于后续实验的亲代系通过了标准质量控制，包括确认干性标志物表达、正常核型和多能性。
为了生成经编辑的iPSC细胞，将PCS-201(PCS)细胞用设计用于切割目的靶基因的Cas12a RNP进行电穿孔。简而言之，在转染前24小时用ROCK抑制剂(Y27632)处理细胞。在转染当天，使用accutase生成单细胞溶液，并将500,000个PCS iPS细胞重新悬浮在适当的电穿孔缓冲液和Cas12a RNP中，最终浓度为2μM。当同时添加两种RNP时，总RNP浓度为4μM(2+2)。使用Lonza 4D电穿孔系统对该溶液进行电穿孔。电穿孔后，将细胞接种在含有CloneR(干细胞技术公司)的mTESR培养基中的6孔板中。使细胞生长3-5天，每天更换培养基，并在电穿孔后48小时从培养基中除去CloneR。为了挑选单集落，将扩增的细胞重新悬浮在单细胞悬浮液中后，以低密度铺板在10cm板中。取决于板上集落的大小，在单细胞铺板期间使用Rock抑制剂来支持细胞持续3-5天(铺板后)。7-10天后，挑取具有可接受形态的足够大小的集落并铺板到24孔板中。将挑选的集落扩增到足够数量，以便收获基因组DNA用于后续分析和细胞系冷冻保存。通过NGS确认编辑，选择的克隆被进一步扩增和储存。最终，对选择的克隆的一个子集进行核型分析、干性流和分化测定。
两个目的靶基因是CISH和TGFβRII，它们都被假设为增强自然杀伤细胞功能。由于TGFβ:TGFβRII通路被认为与多能性的维持有关，推测iPSC中TGFβRII的功能缺失可能导致分化并阻止TGFβRII编辑的iPSC的产生。由于激活素受体信号传导和TGFβRII信号传导在调节SMAD2/3和其他细胞内分子方面的收敛性，推测激活素A可以在市售的多能干细胞培养基中替代TGFβ以生成经编辑的系。为了检验这一假设，评估了用激活素A生长的未经编辑的和TGFβRII编辑的iPSC的多能性。使用了几种不同的培养基：“E6”(Essential 6TM培养基，#A1516401，赛默飞世尔公司(Thermo Fisher))，它缺乏TGFβ，“E7”，它是E6补充了100ng/mlbFGF(派普泰克公司(Peprotech)，#100-18B)，“E8”(Essential 8TM)培养基，#A1517001，赛默飞世尔公司)和“E7+ActA”，它是E6补充了100ng/ml的bFGF和不同浓度的激活素A(派普泰克公司#120-14P)。通常，E6和E7培养基通常不足以在培养中经多个传代保持PSC的干性和多能性。
为了确定激活素A是否可以在不存在外源性TGFβ的情况下保持PCS iPSC，将未经编辑的PCS iPSC铺板在LaminStemTM 521(生物工业公司(Biological Industries))包被的6孔板上并在E6、E7、E8或E7+ActA(具有两种不同浓度的激活素A-1ng/ml和4ng/ml)中培养。2代后，评估细胞的形态和干性标志物表达。使用倒置显微镜上的标准相差设置评估形态。具有明确边缘的集落和iPSC集落典型的未分化细胞被认为是干细胞样的。为了确认形态观察，使用细胞内流式细胞术测量标准iPS细胞干性标志物的表达。简而言之，将细胞解离，针对细胞外标志物进行染色，然后固定过夜并使用Foxp3/转录因子染色缓冲液组(eBioscienceTM)中的试剂和标准方案进行透化。用抗人
Figure BDA0003723238800001331
488(
Figure BDA0003723238800001332
克隆TRA-1-60-R)、抗人
Figure BDA0003723238800001333
647(BD PharmingenTM；克隆N31-355)和抗Oct4(Oct3)_PE(
Figure BDA0003723238800001334
克隆3A2A20)对细胞进行染色以进行流式细胞术分析。在NovoCyte Quanteon流式细胞仪(安捷伦公司(Agilent))上记录细胞并使用FlowJo(FlowJo,LLC公司)进行分析。如图1所示，1ng/mL和4ng/ml的激活素A足以保持多能性，与在E8中生长的细胞具有相等的干性标志物表达。正如预期的那样，在E6和E7(缺乏TGFβ)中生长的细胞没有保持与E8相同程度的干性基因表达，表明在没有TGFβ或激活素A的情况下iPSC干性丧失。这些结果表明激活素A可以在没有TGFβ信号传导情况下补充iPSC干性。
鉴于激活素A可以在没有TGFβ的情况下支持iPSC干性，生成了TGFβRII敲除(“KO”)iPSC、CISH KO iPSC和TGFβRII/CISH双敲除(“DKO”)iPSC系。具体而言，使用RNP编辑iPSC，该RNP具有经工程化的Cas12a(该Cas12a具有三个氨基酸取代(M537R、F870L和H800A(SEQID NO:1148)))和对CISH或TGFβRII特异的gRNA。为了制造CISH/TGFβRII DKO iPSC，iPSC同时用靶向CISH的RNP和靶向TGFβRII的RNP处理。表10的特定指导RNA序列用于编辑CISH和TGFβRII。产生具有以下的两种指导物：由RNA组成的靶向结构域，位于靶向结构域5’的序列UAAUUUCUACUCUUGUAGAU(SEQ ID NO:1153)的AsCpf1支架以及支架序列的5'末端的序列ATGTGTTTTTGTCAAAAGACCTTTT(SEQ ID NO:1154)的25-mer DNA延伸。
表10.指导RNA序列
Figure BDA0003723238800001341
如上所述生成经编辑的克隆，对用TGFβRII RNP处理的细胞具有小修饰。简而言之，TGFβRII编辑的PCS iPSC和TGFβRII/CISH编辑的PCS iPSC在6孔阶段电穿孔后在补充有10ng/ml激活素A的mTESR中进行铺板，以支持经编辑的克隆的生成。在细胞集落挑选和早期扩增阶段过程中用10ng/ml激活素A培养细胞。挑选并扩增(克隆选择)评估为具有正确单KO(CISH KO或TGFβRII KO)或双KO(CISH/TGFβRII DKO)的集落。
为了确定用于培养TGFβRII KO和TGFβRII/CISH DKO iPSC的激活素A的最佳浓度，测试了稍微扩展的浓度曲线，如图2所示。与之前进行的评估类似，iPSC在具有1ng/ml、2ng/ml、4ng/ml和10ng/ml浓度激活素A的经基质胶处理的6孔板中培养。如图2所示，在补充有4ng/mL激活素A的E7培养基中培养19天(超过5代)的TGFβRII KO或CISH/TGFβRII DKO细胞保持野生型形态。图3显示了TGFβRII KO PCS-201hiPSC克隆9的形态。
如图4A所示，用CISH和TGFβRII RNP(克隆选择之前)同时处理的iPSC的初始编辑效率很高，95％的CISH等位基因被编辑，78％的TGFβRII等位基因被编辑。未经编辑的iPSC对照在任一基因座都没有插入缺失。在克隆选择之前，分别用CISH或TGFβRII RNP处理的iPSC显示出93％和82％的编辑率(如图4A所示)随后评估KO细胞系(CISH KO iPSC、TGFβRIIKO iPSC和CISH/TGFβRII DKO iPSC)在存在补充激活素A的情况下培养后是否存在多能性标志物Oct4、SSEA4、Nanog和Tra-1-60。如图4B和5所示，在激活素A中培养KO细胞系保持了这些多能性标志物的表达。
接下来使用STEMdiffTM Trilineage分化试剂盒测定法(来自干细胞技术公司，温哥华，加拿大)评估在激活素A中培养的KO iPSC细胞系的分化能力，如图6所示。如图7A所示，在补充了激活素A的培养基中培养单KO(TGFβRII KO iPSC或CISH KO iPSC)和DKO(TGFβRII/CISH DKO iPSC)细胞系保持了它们分化为所有3个胚层早期祖细胞的能力，如外胚层(OTX2)、中胚层(brachyury)和内胚层(GATA4)标志物的表达所示(图7A)。未经编辑的PCS对照细胞也能够表达这些标志物中的每一个。
接下来对经编辑的iPSC进行核型分析，以确定Cas12a编辑是否会导致大的基因异常，例如易位。如图7B所示，细胞具有正常核型，在切割位点之间没有易位。
为了进一步支持上述结果，对未经编辑的亲代PSC系、经编辑的TGFβRII KO iPSC克隆(C7)和称为RUCDR的另外代表性(未经编辑)细胞系(RUCDR无限生物集团(RUCDRInfinite Biologics group)，皮斯卡威(Piscaway)，新泽西州)进行扩展的激活素A浓度曲线。一开始，iPSC以每孔1e5个细胞接种在1xLaminStemTM 521(生物工业公司(BiologicalIndustries))包被的12孔板中。然后使用0.5mM EDTA在1x PBS解离和Y-27632(生物工业公司)中在约40-50天内将细胞传代10次，直到孔达到>75％的汇合度。在Essential 6TM培养基(吉博科公司(Gibco))、TeSRTM-E7TM和TeSRTM-E8TM(干细胞技术公司)中培养细胞作为对照，并使用补充有大肠杆菌衍生的重组人/鼠/大鼠激活素A(派普泰克公司)的TeSRTM-E7TM(跨4-log浓度剂量(0.001-10ng/mL))进行滴定。在5和10次传代后，将细胞解离，然后固定过夜，并使用Foxp3/转录因子染色缓冲液组(eBioscienceTM)中的试剂和标准方案进行透化。用抗人
Figure BDA0003723238800001352
488(
Figure BDA0003723238800001353
克隆TRA-1-60-R)、抗Sox2_PerCP-CyTM5.5(BDPharmingenTM；克隆O30-678)、抗人
Figure BDA0003723238800001351
647(BD PharmingenTM；克隆N31-355)、抗Oct4(Oct3)_PE(
Figure BDA0003723238800001354
克隆3A2A20)和抗人SSEA-4_PE/DazzleTM 594(
Figure BDA0003723238800001355
克隆MC-813-70)对细胞进行染色以进行流式细胞术分析。在NovoCyte Quanteon流式细胞仪(安捷伦公司(Agilent))上记录细胞并使用FlowJo(FlowJo,LLC公司)进行分析。图7C显示了测试的iPSC系的滴定曲线。保持每个系所需的最小激活素A浓度略有不同，其中TGFβRII KO iPSC需要与亲代对照相比更高的激活素A基线量(0.5ng/ml相比于0.1ng/ml)。在所有3种细胞系中，4ng/ml远高于在延长培养期过程中保持干性标志物表达所需的最小激活素A量。图7D显示了仅使用基础培养基(无激活素A)的细胞培养物中的干性标志物表达。正如预期的那样，TGFβRII KO iPSC不能保持表达，而两个未经编辑的系能够保持E8中的干性标志物表达。
实例2：经编辑的CISH KO、TGFβRII KO和CISH/TGFβRII DKO iPSC分化为功能增强 的iNK细胞
图8A描绘了用于开发CRISPR-Cas12a编辑的iPSC平台以产生增强的CD56+iNK细胞的示例性工作流程的示意图。如图8A所示，通过使用电穿孔将RNP递送至细胞来靶向iPSC中的CISH和TGFβRII基因以产生CISH/TGFβRII DKO iPSC。然后可以选择并扩增在CISH和TGFβRII基因上具有所需编辑的iPSC，以创建主iPSC库。然后可以将来自iPSC主库的经编辑的细胞分化为CD56+CISH/TGFβRII DKO iNK细胞。
图8B和8C描绘了将iPSC分化成iNK细胞的过程的两个示例性示意图。如图8B和8C所示，使用两阶段过程使经编辑的细胞(或未经编辑的对照细胞)分化。首先，在“造血分化阶段”，hiPSC(经编辑和未经编辑)在含有SCF(40ng/mL)、BMP4(20ng/mL)和VEGF(20ng/mL)的StemDiffTM APEL2TM培养基(干细胞技术公司)中培养从第0天到第10天，产生自旋胚状体(SEB)。如图8B所示，在NK细胞分化阶段SEB在包含IL-3(5ng/mL，仅存在于培养的第一周)、IL-7(20ng/mL)、IL-15(10ng/mL)、SCF(20ng/mL)和Flt3L(10ng/mL)的StemDiffTMAPEL2TM培养基中培养从第11天到第39天。CISH KO iPSC、TGFβRIIKO iPSC、CISH/TGFβRII DKO iPSC和未经编辑的野生型iPSC系(PCS)根据图8B中的示意图分化为iNK，然后进行表征以评估它们是否表现出与NK一致的表型细胞(参见图9、10和11A)。图11B、11C、12B、12C和13中描述的CISH KO iPSC、TGFβRII KO iPSC、CISH/TGFβRII DKO iPSC和未经编辑的野生型iPSC系也使用图8C中所示的替代方法分化为iNK，以及然后进行表征以评估它们是否表现出与NK细胞一致的表型(参见图11B、11C、12B、12C和13)。
具体而言，通过流式细胞术针对示例性表型标志物(i)干细胞(CD34)；和(ii)造血细胞(CD43和CD45)评估了CISH KO iNK、TGFβRII KO iNK、CISH/TGFβRII DKO iNK。简而言之，针对每个基因型从96孔板中收获两排胚状体用于染色。一旦使用胰蛋白酶和机械破坏产生单细胞溶液，就针对人标志物CD34、CD45、CD31、CD43、CD235a和CD41对细胞进行染色。如图9所示，CISH KO iNK、TGFβRII KO iNK、CISH/TGFβRII DKO iNK和衍生自野生型亲代克隆(PCS)的iNK的CD34水平低于对照细胞，对照细胞是纯化的CD34+HSC。这些iNK细胞克隆的CD34表达水平相似，表明iPSC的编辑不影响向CD34+阶段的分化。图10显示CISH KO iNK、TGFβRII KO iNK、CISH/TGFβRII DKO iNK和衍生自野生型亲代克隆(PCS)的iNK针对CD43和CD45表现出相似的表面表达谱。因此，从经编辑和未经编辑的iPSC分化的iNKS表现出相似水平的干细胞和造血细胞标志物，并且分化的经编辑和未经编辑的细胞都表现出基于标志物表达谱的某些NK细胞表型。
进一步测定CISH KO iNK、TGFβRII KO iNK、CISH/TGFβRII DKO iNK、衍生自野生型亲代克隆(WT)的iNK和衍生自外周血的NK细胞(PBNK)以确定它们的表面表达NK细胞标志物CD56。简而言之，在分化的第39天收获细胞，洗涤并重悬浮于含有识别人CD56、CD16、NKp80、NKG2A、NKG2D、CD335、CD336、CD337、CD94、CD158的抗体的流动染色缓冲液中。在NovoCyte Quanteon流式细胞仪(安捷伦公司(Agilent))上记录细胞事件并使用FlowJo(FlowJo,LLC公司)进行分析。图11A显示，衍生自经编辑的iPSC的iNK细胞表现出与衍生自未经编辑的iPSC亲代克隆和PBNK细胞的iNK相似的CD56+表面表达(在培养的第39天)。图11B显示，衍生自经编辑的iPSC的iNK细胞表现出与衍生自未经编辑的iPSC亲代克隆的iNK相似的CD56+和CD16+表面表达(在培养的第39天)。图11C显示，衍生自经编辑的iPSC的iNK细胞表现出与衍生自未经编辑的iPSC亲代克隆和PBNK细胞的iNK相似的CD56+、CD54+、KIR+、CD16+、CD94+、NKG2A+、NKG2D+、NCR1+、NCR2+和NCR3+表面表达(在培养的第39天)
为了确认细胞功能性，在xCelligence平台上使用肿瘤细胞细胞毒性测定对细胞进行了评估。简而言之，将肿瘤靶标SK-OV-3肿瘤细胞在96孔xCelligence板中铺板并生长至最佳细胞密度。然后在TGFβ的存在下，以不同的E:T比例(1:4、1:2、1:1、2:1、4:1和8:1)将iNK添加到肿瘤靶标。图12C显示相对于未经编辑的iNK细胞，无论是否存在TGF-β(在E:T比率为1:4、1:2、1:1和2:1)，TGFβRII KO和CISH/TGFβRII DKO细胞更有效地杀伤SK-OV-3细胞，如通过百分比细胞溶解测量。
虽然使用图8B中描述的替代方法生成的iNK细胞是CD56+，并且能够在体外细胞毒性测定中杀伤肿瘤靶标，但iNK不表达与成熟NK细胞相关的许多典型标志物，例如CD16、NKG2A和KIR。K562饲养细胞系通常用于使由类似分化方法产生的iNK扩增和成熟。在饲养细胞上扩增后，iNK通常表达CD16、KIR和其他表明更成熟表型的表面标志物。为了鉴定无饲养细胞的方法来获得具有增强功能的更成熟的iNK，在第11天和第39天之间针对分化阶段测试了替代性培养基组合物。代替在APEL2中第11天和第39天之间培养细胞(如图8B所示)，在含有15％人AB血清的NK
Figure BDA0003723238800001381
培养基((MACS Miltenyi Biotec))中在与上述相同的细胞因子存在下培养自旋胚状体(SEB)。该方案在图8C中进行了描述。为了比较两种培养基组合物，来自WT PCS、TGFβRII KO iPSC、CISH KO iPSC和DKO iPSC的第11天SEB在分化过程的后半部分被分成两种条件，一种基于APEL2，另一种基于NKMACS+血清。在第39天，评估了细胞产率、标志物表达和细胞毒性水平。在所有情况下，NKMACS+血清条件(如图8C所描绘)均优于APEL2条件(如图8B所描绘)。图8D显示NKMACS+血清条件在39天过程结束时产生了更大的扩增倍数(近300倍扩增相比于100倍扩增)。当如上所述通过流式细胞术分析NK标志物表达时，在NKMACS+血清中培养的iNK为34％CD16阳性并表现出20％KIR表达，而APEL2条件产生的细胞对两种标志物基本上都是阴性的。这是所有测试基因型的情况。为了相对于时间或条件可视化标志物，流式细胞仪数据在FlowJo中进行了门控和分析，并构建了热图(图8E和8F)。首先通过门控活细胞(FSC-H相比于LIVE/DEADTM Fixable Yellow)，然后是免疫细胞(SSC-A相比于FSC-A)、单峰(FSC-H相比于FSC-A)和自然杀伤细胞群(CD56相比于CD45)来清洁样品。对定义为CD45+56+细胞的NK群体进行门控，并在与直方图/计数图同义的分析中沿X轴分析每个标志物(CD16+、CD94+、NKG2A+、NKG2D+、CD335+、CD336+、CD337+、NKp80+、panKIR+)。上述标志物的统计数据通过双梯度热图(GraphPad Prism 8)可视化，符号说明设置为以下参数：黑色＝0，中等强度30<x<50，最大强度＝100。基于该分析，NKMACS+血清条件改善了所有基因型的表达动力学和幅度。还在如前所述的肿瘤细胞细胞毒性测定中评估细胞。在NKMACS+血清条件下产生的iNK能够以比在APEL2中分化的细胞更低的E:T比率进行杀伤，表明改进的NK成熟对细胞的功能有积极影响(图8G)。
NKMACS+血清中另外分化标志物的分析证实了CD16表达的存在。图11B显示了对衍生自未经编辑或DKO iPSC的特定亚群(CD45相比于CD56和CD56相比于CD16)的分析。此外，图11C中未经编辑的iNK细胞和CISH/TGFβRII DKO iNK的细胞表面标志物谱证实，经编辑的iNK细胞的NK细胞标志物谱与未经编辑的iNK细胞相似。总之，这些数据表明，Cas12a编辑的单和双KO iPSC克隆以与未经编辑的iPSC克隆相似的方式分化成iNK细胞，如NK细胞标志物所定义。
此外，某些经编辑的iNK克隆细胞(CISH单敲除“CISH_C2、C4、C5和C8”、TGFβRII单敲除“TGFβRII-C7”和TGFβRII/CISH双敲除“DKO-C1”)和亲代克隆iNK细胞(“WT”)在1ng/mL或10ng/mL IL-15存在下培养，并在hiPSC分化后第25天、第32天和第39天评估分化标志物。如图14所示，在10ng/mL IL-15中培养的表面表达表型(测量为群体的百分比)导致单敲除、双敲除和亲代克隆系中的表面表达比例更高。
使用一系列分子和功能分析评估在NK
Figure BDA0003723238800001391
培养基+血清条件下分化的经编辑iNK细胞的体外效应子功能。首先，进行磷酸流式细胞术测定以确定第39天iNK细胞中STAT3(pSTAT3)和SMAD2/3(pSMAD2/3)的磷酸化状态。与未经编辑的iNK细胞相比，CISH KO iNK在IL-15刺激后表现出增加的pSTAT3(图11D)，并且CISH/TGFβRII DKO iNK在TGF-β刺激后表现出降低的pSMAD2/3水平(图11E)。这些数据表明，CISH/TGFβRII DKO iNK对IL-15的敏感性增强并且对TGF-β介导的免疫抑制具有抗性。此外，使用乙酸肉豆蔻佛波醇和离子霉素(PMA/IMN)刺激测定来表征CISH/TGFβRII DKO iNK的IFNγ和TNFα产生。简而言之，用2ng/ml PMA和0.125μM离子霉素以及蛋白质转运抑制剂处理细胞4小时。收获细胞并且使用标准细胞内染色方案染色。当用PMA/IMN刺激时，CISH/TGFβRIIDKO iNK产生显著更高量的IFNγ和TFNα(图11F和11G)，这提供了相对于未经编辑的对照iNK在刺激后细胞因子产生增强的证据。
为了测试iNK肿瘤细胞杀伤活性，使用了3D实体肿瘤细胞杀伤测定(在图12A中示意性地描绘)。简而言之，通过在96孔超低附着板中接种5,000个经NucLight Red标记的SK-OV-3细胞形成球状体。在添加效应细胞(以不同的E:T比率)和10ng/mL TGF-β之前，将球状体在37℃孵育，随后使用Incucyte S3系统每2小时对球状体成像长达120小时。在添加效应细胞时，将所示的数据相对于红色目标强度归一化。球状体曲线的归一化保持与在非归一化数据中观察到的相同的功效模式。使用该测定，将从四个CISH KO iPSC克隆、两个TGFβRII KO iPSC克隆和一个CISH/TGFβRII DKO iPSC克隆分化的iNK的细胞毒性与衍生自未经编辑的亲代iPSC的对照iNK进行比较。如图12B所示，与未经编辑的iNK对照细胞相比，经编辑的iNK细胞能够更有效地减小SK-OV-3球状体的大小(来自6次测定的平均数据)。特别是CISH/TGFβRII DKO iNK细胞在所有E:T比率大于0.01时，比未经编辑的iNK细胞更大程度地减少了SK-OV-3球状体的大小，在E:T比率为1或更高时比未经编辑的iNK细胞显著减少了SK-OV-3球状体的大小。与未经编辑的iNK细胞相比，TGFβRII KO克隆7iNK也表现出显著增强的杀伤。虽然许多单CISH KO克隆在10:1E:T比率时没有显示出显著的杀伤增强，但大多数克隆确实显示出增加的SK-OV-3球状体细胞杀伤的趋势，其中在最高E:T比率时差异最大。为了进一步阐明经编辑的iNK的功能，细胞被推动在多天的时间内反复杀伤肿瘤靶标，本文描述为体外连续杀伤测定。在测定的第0天，将10x106个Nalm6肿瘤细胞(B细胞白血病细胞系)和2x105个iNK铺板在IL-15(10ng/ml)和TGF-β(10ng/ml)存在下的平板96孔板的每个孔中。每隔48小时，添加大剂量5x103个Nalm6肿瘤细胞(B细胞白血病细胞系)以重新激发iNK群体。如图13所示，经编辑的iNK细胞(CISH/TGFβRII DKO iNK细胞)在多次用Nalm6肿瘤细胞激发后表现出持续杀伤Nalm6细胞，而未经编辑的iNK细胞的连续杀伤效果有限。数据支持这样的结论，即CISH和TGFβRII编辑导致细胞杀伤的延长增强。
最后，在体内模型中测定了经编辑的iNK细胞(CISH/TGFβRII DKO iNK细胞)杀伤肿瘤靶标的能力。为此，已建立的NOD scidγ(NSG)异种移植模型用于如图15A所示的测定。简而言之，在第0天腹膜内(IP)注射1x106个经工程化以表达荧光素酶的SK-OV-3细胞。在第3天，接种的小鼠使用体内成像系统(IVIS)进行成像，并随机分为3组。第二天(第4天)，通过IP注射施用20x106个未经编辑的iNK或CISH/TGFβRII DKO iNK，而第三组注射媒剂作为对照。在给动物接种肿瘤细胞后，每周对动物进行一次成像，以测量随时间推移的肿瘤负荷。图15B描绘了3个不同组(每组中n＝9)(媒剂、未经编辑的iNK和CISH/TGFβRII DKO iNK)中个体小鼠中肿瘤的生物发光。图15C描绘了这些相同动物随时间推移的平均肿瘤负荷。对数据进行了双向方差分析，与用未经编辑的iNK治疗的动物相比，经CISH/TGFβRII DKO iNK治疗的动物通过生物发光测量的肿瘤负荷显著减少(p值：0.0004)。到肿瘤植入后10天，注射CISH/TGFβRII DKO iNK的小鼠相对于注射媒剂对照或未经编辑的iNK的小鼠表现出肿瘤大小显著减小。肿瘤大小的整体减小持续数天，至少到肿瘤植入后35天。这些数据表明，经编辑的DKO iNK在这个体内模型中正在积极杀伤肿瘤细胞。
总体而言，这些结果表明，未经编辑的和CISH/TGFβRII DKO iPSC可以分化为表现出典型NK细胞标志物的iNK细胞。此外，CISH/TGFβRII DKO iNK细胞对衍生自实体和血液恶性肿瘤的肿瘤细胞系表现出增强的抗肿瘤活性。
实例3：ADORA2A编辑的iPSC产生具有增强功能的经编辑的iNK
ADORA2A是另一个目的靶基因，假设其缺失会影响肿瘤微环境(TME)中的NK细胞功能。ADORA2A基因编码受体，该受体对TME中的腺苷作出反应，导致产生cAMP，其功能是驱动对NK细胞的许多抑制作用。我们假设敲除ADORA2A的功能可以增强iNK细胞功能。利用与实例1和2中描述的方法相似的方法，使用RNP编辑PCS iPSC系，该RNP具有经工程化的Cas12a(其具有三个氨基酸取代(M537R、F870L和H800A(SEQ ID NO:1148)))和特异于ADORA2A的gRNA(除了4μM RNP被递送到细胞而不是2μM RNP)。如实例1中所述，产生具有以下的gRNA：由RNA组成的靶向结构域，位于靶向结构域5’的序列UAAUUUCUACUCUUGUAGAU(SEQ ID NO:1153)的AsCpf1支架以及支架序列的5'末端的序列ATGTGTTTTTGTCAAAAGACCTTTT(SEQ IDNO:1154)的25-mer DNA延伸。ADORA2A gRNA序列如表11中所示。
表11.指导RNA序列
Figure BDA0003723238800001421
由下一代测序(NGS)确定，克隆选择前Cas12a RNP的批量编辑率为49％。尽管如此，已鉴定、扩增和分化了几个其中两个ADORA2A等位基因被编辑的克隆。为了确定ADORA2A编辑的iPSC是否可以产生CD45+CD56+iNK，使用实例2中所述的NKMACS+血清方案(图8C)分化批量和单一ADORA2A KO克隆。如图16A所示，与未经编辑的对照iPSC相比，经编辑的iPSC分化为具有相似NK细胞标志物表达的iNK。
为了证实Cas12a介导的ADORA2A编辑导致基因的功能性缺失，在经编辑和未经编辑的对照iNK中评估了响应于5′-N-乙基甲酰胺腺苷(“NECA”，一种更稳定的腺苷类似物，充当ADORA2A激动剂)处理的cAMP积累。相对于具有功能性ADORA2A的细胞，预计具有ADORA2A功能性敲除的经编辑的细胞不会在细胞中响应NECA积累很多cAMP。简而言之，iNK细胞用不同浓度的NECA处理15分钟。然后裂解iNK细胞，然后使用CisBio cAMP试剂盒测量裂解物中的cAMP。如图16B所示，随着NECA浓度的增加(n＝2)，未经编辑的iNK的cAMP积累水平增加。相反，ADORA2A(“A2A KO”)KO iNK在NECA浓度增加时显示出最小的cAMP产生，表明Cas12a诱导的编辑在功能上敲除ADORA2A功能。批量iNK(图16B中的前两个A2A KO iNK系)显示出比选择的ADORA2A KO克隆(图16B中较后的四个A2A KO iNK系)略高的cAMP水平，正如对于批量群体中的较低编辑率所预期的那样。基于ADORA2A功能性消融的分子证据，预计iNK在肿瘤微环境中对腺苷的抑制作用具有抗性。
ADORA2A KO iNK还在如实例2中所述的体外NALM6连续杀伤测定中进行了测试，其中有一个主要区别：添加100μM NECA代替TGFβ。在NECA存在下，ADORA2A KO iNK表现出相对于野生型iNK增强的连续杀伤，表明ADORA2A KO iNK对NECA抑制具有抗性(图16C)。因此，相对于未经编辑的iNK细胞，在TME中存在腺苷的情况下，预计ADORA2A KO iNK细胞对肿瘤细胞具有改善的细胞毒性。
实例4：CISH/TGFβRII/ADORA2A三重编辑(TKO)的iPSC的生成和分化的TKO iNK的 表征
为了生成CISH、TGFβRII和ADORA2A三重编辑(TKO)的iPSC，采用了两种方法；1)两步编辑，其中实例1和2中描述的CISH/TGFβRII DKO(CR)iPSC克隆在ADORA2A基因座处通过电穿孔用靶向ADORA2A的RNP进行编辑(如实例3中所述)，和2)用所有3种RNP(每种针对每个靶基因)同时编辑PCS iPS细胞。两种策略都使用了实例1中简要描述的编辑方案。在同时编辑的情况下，总RNP浓度为8μM(Cish：2μM+TGFβRII：2μM+ADORA2A：4μM)。不管采用何种方法，细胞都被铺板、扩增并如上所述挑取集落。使用NGS分析从iPSC收获的gDNA，确定同时编辑所有靶基因时，CISH、TGFβRII和ADORA2A的批量编辑率分别为96.70％、97.17％和90.16％。选择在所有6个等位基因上都具有插入和/或缺失(InDels)的集落进行进一步分析。
与实例1中描述的分析类似，未经编辑的iPSC和经编辑的iPSC使用NK MACS+血清条件(如图8C中所描绘)分化为iNK，并在培养中的不同时间点(包括在第25天、第32天、和第39天)通过流式细胞术评估。如图17A所示，不同NK表面标志物的分析显示，通过两步编辑方法(CR+A 8)或同时编辑方法(CRA 6)生成的克隆之间没有重大差异。两个TKO克隆(CR+A 8和CRA 6)在每个时间点都显示出与未经编辑的iNK(Wt)相似的表达谱。当分析TKO iNK细胞对NECA的反应性时(如实例3中所述)，两种TKO iNK有很少或没有cAMP积累(图17B)，表明ADORA2A在功能上被敲除。相比之下，未经编辑的iNK表现出cAMP的NECA剂量依赖性增加(图17B)。这些结果表明，预计TKO iNK将对TME中腺苷的抑制作用具有抗性。最后，在3D肿瘤细胞杀伤测定中，CISH/TGFβRII/ADORA2A TKO iNK与CISH/TGFβRII DKO iNK、ADORA2A单KO(SKO)iNK和未经编辑的iNK一起评估。如实例2中所述，使用IL-15和TGFβ但没有NECA进行该测定。有趣的是，TKO(CRA6)和DKO(CR)iNK在杀伤肿瘤细胞方面都优于未经编辑的iNK，表明这两种多重编辑的iNK都比未经编辑的对照细胞具有增强的功能(图17C)。这些结果表明，敲除ADORA2A不会对具有CISH和TGFBRII KO的iNK杀伤肿瘤球状细胞的能力产生负面影响。
实例5：靶向CISH、TGFβRII、ADORA2A、TIGIT和NKG2A的gRNA的选择。
进一步测试了CISH、TGFBRII、ADORA2A、TIGIT和NKG2A Cas12a指导RNA的切割效率。通过在体外将商业合成的gRNA与Cas12a复合并通过电穿孔将gRNA/Cas12a核糖核蛋白(RNP)递送到IPSC来筛选指导RNA。使用具有经工程化的Cas12a的RNP进行编辑iPSC，该Cas12a具有三个氨基酸取代(M537R、F870L和H800A(SEQ ID NO:1148))。产生具有以下的gRNA：由RNA组成的靶向结构域，位于靶向结构域5’的序列UAAUUUCUACUCUUGUAGAU(SEQ IDNO:1153)的AsCpf1支架以及支架序列的5′末端的序列ATGTGTTTTTGTCAAAAGACCTTTT(SEQID NO:1154)的25-mer DNA延伸。表12提供了针对编辑活性进行测试的指导RNA的靶向结构域。
表12：指导RNA序列
Figure BDA0003723238800001441
Figure BDA0003723238800001451
简而言之，用目的RNP转染100,000个iPSC/孔，将细胞在37℃孵育72小时，然后收获用于DNA表征。用不同浓度的gRNA/Cas12a RNP转染iPSC。确定了八种不同RNP浓度的编辑事件百分比，范围从阴性对照(0mM)到8mM。
如图18分图1所示，TGFβRII gRNA(SEQ ID NO:1161)表现出约79nM RNP的EC50。如图18分图2所示，CISH gRNA(SEQ ID NO:1162)表现出约50nM RNP的EC50。如图18分图3所示，包含在RNP2960中的ADORA2A gRNA(SEQ ID NO:1163)表现出约63nM RNP的EC50，而包含在RNP3109中的ADORA2A gRNA(SEQ ID NO:1164)或包含在RNP3108中的gRNA(SEQ ID NO:1165)分别表现出约493nM和约280nM RNP的EC50值。如图18分图4所示，包含在RNP2892中的TIGIT gRNA(SEQ ID NO:1166)表现出约29nM RNP的EC50，而包含在RNP3106中的TIGITgRNA(SEQ ID NO:1167)或包含在RNP3107中的gRNA(SEQ ID NO:167)分别表现出约1146nM和约40nM RNP的EC50值。如图18分图5所示，包含在RNP19142中的NKG2A gRNA(SEQ ID NO:1169)表现出约8nM RNP的EC50，而包含在RNP3069中的NKG2A gRNA(SEQ ID NO:1170)或包含在RNP2891中的gRNA(SEQ ID NO:1171)分别表现出约12nM和约13nM RNP的EC50值。
等效物
应理解，虽然已经结合其详细描述，对本披露进行了描述，但前面的描述旨在说明而非限制本发明的范围，本披露的范围由所附的权利要求书的范围限定。其他方面、优点以及修改都在以下权利要求书的范围之内。

Claims (82)

1.一种多能人干细胞，其中所述干细胞包含：
(i)导致细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)的功能丧失的基因组编辑和
(ii)导致TGFβ信号传导通路的激动剂的功能丧失的基因组编辑，或导致腺苷A2a受体(ADORA2A)的功能丧失的基因组编辑。
2.如权利要求1所述的多能人干细胞，其中所述干细胞包含导致TGFβ信号传导通路的激动剂的功能丧失的基因组编辑和导致ADORA2A的功能丧失的基因组编辑。
3.如权利要求1或2所述的多能人干细胞，其中所述干细胞包含导致TGFβ受体的功能丧失或TGFβ受体的显性失活变体的基因组编辑。
4.如权利要求3所述的多能人干细胞，其中所述TGFβ受体是TGFβ受体II(TGFβRII)。
5.如前述权利要求中任一项所述的多能人干细胞，其中所述干细胞表达一种或多种选自下组的多能性标志物，该组由以下组成：SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-49/6E、ALP、Sox2、E-钙粘蛋白、UTF-1、Oct4、Rex1和Nanog。
6.一种分化的细胞，其中所述分化的细胞是如前述权利要求中任一项所述的多能人干细胞的子细胞。
7.如权利要求6所述的分化的细胞，其中所述分化的细胞是免疫细胞。
8.如权利要求6所述的分化的细胞，其中所述分化的细胞是淋巴细胞。
9.如权利要求6所述的分化的子细胞，其中所述分化的细胞是自然杀伤细胞。
10.如权利要求6所述的分化的细胞，其中所述干细胞是人诱导型多能干细胞(iPSC)，并且其中所述分化的子细胞是iNK细胞。
11.如权利要求6所述的分化的细胞，其中所述细胞：
(a)不表达内源CD3、CD4和/或CD8；以及
(b)表达至少一种编码以下的内源基因：
(i)CD56(NCAM)、CD49、CD43和/或CD45，或其任何组合；
(ii)NK细胞受体免疫球蛋白γFc区受体III(FcγRIII，分化簇16(CD16))；
(iii)自然杀伤组-2成员D(NKG2D)；
(iv)CD69；
(v)天然细胞毒性受体；
或其两种或更多种的任何组合。
12.如前述权利要求中任一项所述的细胞，其中所述细胞包含一个或多个另外的基因组编辑。
13.如权利要求12所述的细胞，其中所述细胞：
(1)包含至少一个基因组编辑，其特征在于外源核酸表达构建体，所述外源核酸表达构建体包含编码以下的核酸序列：
(i)嵌合抗原受体(CAR)；
(ii)FcγRIII(CD16)或FcγRIII(CD16)的变体；
(iii)白介素15(IL-15)；
(iv)IL-15受体(IL-15R)激动剂，或IL-15受体的组成型活性变体；
(v)IL-12受体(IL-12R)激动剂，或IL-12受体的组成型活性变体；
(vi)IL-12受体(IL-12R)激动剂，或IL-12受体的组成型活性变体；
(vii)人白细胞抗原G(HLA-G)；
(viii)人白细胞抗原E(HLA-E)；
(ix)白细胞表面抗原分化簇CD47(CD47)；
或其两种或更多种的任何组合；
和/或
(2)包含至少一个导致以下中至少一种的功能丧失的基因组编辑：
(i)ADORA2A；
(ii)具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)；
(iii)β-2微球蛋白(B2M)；
(iv)程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)；
(v)II类主要组织相容性复合体反式激活因子(CIITA)；
(vi)自然杀伤细胞受体NKG2A(自然杀伤组2A)；
(vii)两种或更多种HLA II类组织相容性抗原α链基因，和/或两种或更多种HLAII类组织相容性抗原β链基因；
(viii)分化簇32B(CD32B，FCGR2B)；
(ix)T细胞受体α恒定区(TRAC)；
或其两种或更多种的任何组合。
14.一种人诱导型多能干细胞(iPSC)，其中所述iPSC包含导致腺苷A2a受体(ADORA2A)的功能丧失的基因组编辑。
15.如权利要求14所述的人iPSC，其中所述iPSC包含导致TGFβ信号传导通路的激动剂的功能丧失的基因组编辑或导致细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)的功能丧失的基因组编辑。
16.如权利要求15所述的人iPSC，其中所述iPSC包含导致TGFβ信号传导通路的激动剂的功能丧失的基因组编辑和导致CISH的功能丧失的基因组编辑。
17.如权利要求15或16所述的人iPSC，其中所述iPSC包含导致TGFβ受体的功能丧失或TGFβ受体的显性失活变体的基因组编辑。
18.如权利要求17所述的人iPSC，其中所述TGFβ受体是TGFβ受体II(TGFβRII)。
19.如权利要求14-18中任一项所述的人iPSC，其中所述iPSC表达一种或多种选自下组的多能性标志物，该组由以下组成：SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-49/6E、ALP、Sox2、E-钙粘蛋白、UTF-1、Oct4、Rex1和Nanog。
20.一种分化的细胞，其中所述分化的细胞是如权利要求14-19中任一项所述的人iPSC的子细胞。
21.如权利要求20所述的分化的细胞，其中所述分化的细胞是免疫细胞。
22.如权利要求20所述的分化的细胞，其中所述分化的细胞是淋巴细胞。
23.如权利要求20所述的分化的子细胞，其中所述分化的细胞是自然杀伤细胞。
24.如权利要求20所述的分化的细胞，其中所述分化的子细胞是iNK细胞。
25.如权利要求20所述的分化的细胞，其中所述细胞：
(a)不表达内源CD3、CD4和/或CD8；以及
(b)表达至少一种编码以下的内源基因：
(i)CD56(NCAM)、CD49、CD43和/或CD45，或其任何组合；
(ii)NK细胞受体免疫球蛋白γFc区受体III(FcγRIII，分化簇16(CD16))；
(iii)自然杀伤组-2成员D(NKG2D)；
(iv)CD69；
(v)天然细胞毒性受体；
或其两种或更多种的任何组合。
26.如权利要求14-25中任一项所述的细胞，其中所述细胞包含一个或多个另外的基因组编辑。
27.如权利要求26所述的细胞，其中所述细胞：
(1)包含至少一个基因组编辑，其特征在于外源核酸表达构建体，所述外源核酸表达构建体包含编码以下的核酸序列：
(i)嵌合抗原受体(CAR)；
(ii)FcγRIII(CD16)或FcγRIII(CD16)的变体；
(iii)白介素15(IL-15)；
(iv)IL-15受体(IL-15R)激动剂，或IL-15受体的组成型活性变体；
(v)IL-12受体(IL-12R)激动剂，或IL-12受体的组成型活性变体；
(vi)IL-12受体(IL-12R)激动剂，或IL-12受体的组成型活性变体；
(vii)人白细胞抗原G(HLA-G)；
(viii)人白细胞抗原E(HLA-E)；
(ix)白细胞表面抗原分化簇CD47(CD47)；
或其两种或更多种的任何组合；
和/或
(2)包含至少一个导致以下中至少一种的功能丧失的基因组编辑：
(i)细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)；
(ii)具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)；
(iii)β-2微球蛋白(B2M)；
(iv)程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)；
(v)II类主要组织相容性复合体反式激活因子(CIITA)；
(vi)自然杀伤细胞受体NKG2A(自然杀伤组2A)；
(vii)两种或更多种HLA II类组织相容性抗原α链基因，和/或两种或更多种HLAII类组织相容性抗原β链基因；
(viii)分化簇32B(CD32B，FCGR2B)；
(ix)T细胞受体α恒定区(TRAC)；
或其两种或更多种的任何组合。
28.如权利要求1-27中任一项所述的细胞，其中：
使用包含靶向结构域序列的指导RNA产生导致CISH的功能丧失的基因组编辑，所述靶向结构域序列包含根据SEQ ID NO:258-364、1155和1162中任一个的核苷酸序列；
使用包含靶向结构域序列的指导RNA产生导致TGFβRII的功能丧失的基因组编辑，所述靶向结构域序列包含根据SEQ ID NO:29-257、1157和1161中任一个的核苷酸序列；和/或
使用包含靶向结构域序列的指导RNA产生导致ADORA2A的功能丧失的基因组编辑，所述靶向结构域序列包含根据SEQ ID NO:827-1143、1159和1163中任一个的核苷酸序列。
29.如权利要求1-28中任一项所述的细胞，其中：
使用核糖核蛋白(RNP)复合物产生导致CISH的功能丧失的基因组编辑，所述核糖核蛋白包含(i)RNA指导的核酸酶和(ii)包含靶向结构域序列的指导RNA，所述靶向结构域序列包含根据SEQ ID NO:258-364、1155和1162中任一个的核苷酸序列；
使用核糖核蛋白(RNP)复合物产生导致TGFβRII的功能丧失的基因组编辑，所述核糖核蛋白包含(i)RNA指导的核酸酶和(ii)包含靶向结构域序列的指导RNA，所述靶向结构域序列包含根据SEQ ID NO:29-257、1157和1161中任一个的核苷酸序列；和/或
使用核糖核蛋白(RNP)复合物产生导致ADORA2A的功能丧失的基因组编辑，所述核糖核蛋白包含(i)RNA指导的核酸酶和(ii)包含靶向结构域序列的指导RNA，所述靶向结构域序列包含根据SEQ ID NO:827-1143、1159和1163中任一个的核苷酸序列。
30.一种制备如权利要求1-29中任一项所述的细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与以下中的一种或多种接触：
RNA指导的核酸酶和包含靶向结构域序列的指导RNA，所述靶向结构域序列包含根据SEQ ID NO:258-364、1155和1162中任一个的核苷酸序列；
RNA指导的核酸酶和包含靶向结构域序列的指导RNA，所述靶向结构域序列包含根据SEQ ID NO:29-257、1157和1161中任一个的核苷酸序列；和/或
RNA指导的核酸酶和包含靶向结构域序列的指导RNA，所述靶向结构域序列包含根据SEQ ID NO:827-1143、1159和1163中任一个的核苷酸序列。
31.一种制备如权利要求1-30中任一项所述的细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与以下中的一种或多种接触：
核糖核蛋白(RNP)复合物，其包含(i)RNA指导的核酸酶和(ii)包含靶向结构域序列的指导RNA，所述靶向结构域序列包含根据SEQ ID NO:258-364、1155和1162中任一个的核苷酸序列；
核糖核蛋白(RNP)复合物，其包含(i)RNA指导的核酸酶和(ii)包含靶向结构域序列的指导RNA，所述靶向结构域序列包含根据SEQ ID NO:29-257、1157和1161中任一个的核苷酸序列；和/或
核糖核蛋白(RNP)复合物，其包含(i)RNA指导的核酸酶和(ii)包含靶向结构域序列的指导RNA，所述靶向结构域序列包含根据SEQ ID NO:827-1143、1159和1163中任一个的核苷酸序列。
32.如权利要求29-31中任一项所述的方法，其中所述RNA指导的核酸酶是Cas12a变体。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述Cas12a变体包含一个或多个选自M537R、F870L和H800A的氨基酸取代。
34.如权利要求32所述的方法，其中所述Cas12a变体包含氨基酸取代M537R、F870L和H800A。
35.如权利要求32所述的方法，其中所述Cas12a变体包含SEQ ID NO:1148的氨基酸序列。
36.如权利要求30-35中任一项所述的方法，其包括使所述细胞与以下接触：
(i)包含靶向结构域序列的指导RNA，所述靶向结构域序列包含SEQ ID NO:1155或1162的核苷酸序列；包含靶向结构域序列的指导RNA，所述靶向结构域序列包含SEQ ID NO:1157或1161的核苷酸序列；和包含靶向结构域序列的指导RNA，所述靶向结构域序列包含SEQ IDNO:1159或1163的核苷酸序列；以及
(ii)RNA指导的核酸酶，其包含SEQ ID NO:1144-1151之一(或其部分)的氨基酸序列。
37.一种多能人干细胞，其中所述干细胞包含转化生长因子β(TGFβ)信号传导通路的破坏。
38.如权利要求34所述的多能人干细胞，其中所述干细胞包含导致TGFβ信号传导通路的激动剂的功能丧失的基因组编辑。
39.如权利要求37或38所述的多能人干细胞，其包含TGFβ受体的功能丧失或TGFβ受体的显性失活变体。
40.如权利要求39所述的多能人干细胞，其中所述TGFβ受体是TGFβ受体II(TGFβRII)。
41.如权利要求37-40中任一项所述的多能人干细胞，其进一步包含白介素信号传导的拮抗剂的功能丧失。
42.如权利要求37-41中任一项所述的多能人干细胞，其中所述干细胞进一步包含导致白介素信号传导的拮抗剂的功能丧失的基因组修饰。
43.如权利要求41或42所述的多能人干细胞，其中白介素信号传导通路的拮抗剂是IL-15信号传导通路和/或IL-2信号传导通路的拮抗剂。
44.如权利要求37-43中任一项所述的多能人干细胞，其包含细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)的功能丧失。
45.如权利要求44所述的多能人干细胞，其中所述干细胞包含导致CISH的功能丧失的基因组修饰。
46.如权利要求37-45中任一项所述的多能人干细胞，其中所述干细胞表达一种或多种选自下组的多能性标志物，该组由以下组成：SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-49/6E、ALP、Sox2、E-钙粘蛋白、UTF-1、Oct4、Rex1和Nanog。
47.一种分化的细胞，其中所述分化的细胞是如权利要求37-46中任一项所述的多能人干细胞的子细胞。
48.如权利要求47所述的分化的细胞，其中所述分化的细胞是免疫细胞。
49.如权利要求47所述的分化的细胞，其中所述分化的细胞是淋巴细胞。
50.如权利要求47所述的分化的子细胞，其中所述分化的细胞是自然杀伤细胞。
51.如权利要求47所述的分化的细胞，其中所述干细胞是人诱导型多能干细胞(iPSC)，并且其中所述分化的子细胞是iNK细胞。
52.如权利要求47所述的分化的细胞，其中所述细胞：
(a)不表达内源CD3、CD4和/或CD8；以及
(b)表达至少一种编码以下的内源基因：
(i)CD56(NCAM)、CD49、CD43和/或CD45，或其任何组合；
(ii)NK细胞受体免疫球蛋白γFc区受体III(FcγRIII，分化簇16(CD16))；
(iii)自然杀伤组-2成员D(NKG2D)；
(iv)CD69；
(v)天然细胞毒性受体；
或其两种或更多种的任何组合。
53.如权利要求37-52中任一项所述的细胞，其中所述细胞包含一个或多个另外的基因组编辑。
54.如权利要求53所述的细胞，其中所述细胞：
(1)包含至少一个基因组编辑，其特征在于外源核酸表达构建体，所述外源核酸表达构建体包含编码以下的核酸序列：
(i)嵌合抗原受体(CAR)；
(ii)FcγRIII(CD16)或FcγRIII(CD16)的变体；
(iii)白介素15(IL-15)；
(iv)IL-15受体(IL-15R)激动剂，或IL-15受体的组成型活性变体；
(v)IL-12受体(IL-12R)激动剂，或IL-12受体的组成型活性变体；
(vi)IL-12受体(IL-12R)激动剂，或IL-12受体的组成型活性变体；
(vii)人白细胞抗原G(HLA-G)；
(viii)人白细胞抗原E(HLA-E)；
(ix)白细胞表面抗原分化簇CD47(CD47)；
或其两种或更多种的任何组合；
和/或
(2)包含至少一个导致以下中至少一种的功能丧失的基因组编辑：
(i)细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)；
(ii)腺苷A2a受体(ADORA2A)；
(iii)具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)；
(iv)β-2微球蛋白(B2M)；
(v)程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)；
(vi)II类主要组织相容性复合体反式激活因子(CIITA)；
(vii)自然杀伤细胞受体NKG2A(自然杀伤组2A)；
(viii)两种或更多种HLA II类组织相容性抗原α链基因，和/或两种或更多种HLAII类组织相容性抗原β链基因；
(ix)分化簇32B(CD32B，FCGR2B)；
(x)T细胞受体α恒定区(TRAC)；
或其两种或更多种的任何组合。
55.一种培养多能人干细胞的方法，所述方法包括在包含激活素的培养基中培养所述干细胞。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述多能人干细胞是胚胎干细胞或诱导型多能干细胞。
57.如权利要求55或56所述的方法，其中所述多能人干细胞不表达TGFβRII。
58.如权利要求55-57中任一项所述的方法，其中所述多能人干细胞经基因工程化以不表达TGFβRII。
59.如权利要求55-57中任一项所述的方法，其中所述多能人干细胞经基因工程化以敲除编码TGFβRII的基因。
60.如权利要求55-59中任一项所述的方法，其中所述激活素是激活素A。
61.如权利要求55-60中任一项所述的方法，其中所述培养基不包含TGFβ。
62.如权利要求55-61中任一项所述的方法，其中所述培养进行定义的时间段(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12天或更长)。
63.如权利要求55-62中任一项所述的方法，其中在培养步骤期间或之后的一个或多个时间，所述多能人干细胞保持多能性(例如，表现出一种或多种多能性标志物)。
64.如权利要求63所述的方法，其中在所述培养步骤期间或之后的一个或多个时间，所述多能人干细胞表达可检测水平的以下一种或多种：SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-49/6E、ALP、Sox2、E-钙粘蛋白、UTF-1、Oct4、Rex1和Nanog。
65.如权利要求63所述的方法，其中在所述培养步骤期间或之后的时间，所述多能人干细胞分化成内胚层、中胚层和/或外胚层谱系的细胞。
66.如权利要求65所述的方法，其中所述多能人干细胞或其后代进一步分化成自然杀伤(NK)细胞。
67.如权利要求55-66中任一项所述的方法，其中所述多能人干细胞：
(1)包含至少一个基因组编辑，其特征在于外源核酸表达构建体，所述外源核酸表达构建体包含编码以下的核酸序列：
(i)嵌合抗原受体(CAR)；
(ii)FcγRIII(CD16)或FcγRIII(CD16)的变体；
(iii)白介素15(IL-15)；
(iv)IL-15受体(IL-15R)激动剂，或IL-15受体的组成型活性变体；
(v)IL-12受体(IL-12R)激动剂，或IL-12受体的组成型活性变体；
(vi)IL-12受体(IL-12R)激动剂，或IL-12受体的组成型活性变体；
(vii)人白细胞抗原G(HLA-G)；
(viii)人白细胞抗原E(HLA-E)；
(ix)白细胞表面抗原分化簇CD47(CD47)；
或其两种或更多种的任何组合；
和/或
(2)包含至少一个导致以下中至少一种的功能丧失的基因组编辑：
(i)细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)；
(ii)腺苷A2a受体(ADORA2A)；
(iii)具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)；
(iv)β-2微球蛋白(B2M)；
(v)程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)；
(vi)II类主要组织相容性复合体反式激活因子(CIITA)；
(vii)自然杀伤细胞受体NKG2A(自然杀伤组2A)；
(viii)两种或更多种HLA II类组织相容性抗原α链基因，和/或两种或更多种HLAII类组织相容性抗原β链基因；
(ix)分化簇32B(CD32B，FCGR2B)；
(x)T细胞受体α恒定区(TRAC)；
或其两种或更多种的任何组合。
68.一种细胞培养物，其包含(i)多能人干细胞和(ii)包含激活素的细胞培养基，其中所述多能人干细胞包含转化生长因子β(TGFβ)信号传导通路的破坏。
69.如权利要求68所述的细胞培养物，其中所述干细胞包含导致TGFβ信号传导通路的激动剂的功能丧失的基因组编辑。
70.如权利要求69所述的细胞培养物，其中所述基因组编辑是基因组编辑。
71.如权利要求68-70中任一项所述的细胞培养物，其中所述干细胞包含TGFβ受体的功能丧失或TGFβ受体的显性失活变体。
72.如权利要求71所述的细胞培养物，其中所述TGFβ受体是TGFβ受体II(TGFβRII)。
73.如权利要求68-72中任一项所述的细胞培养物，其中所述多能人干细胞：
(1)包含至少一个基因组编辑，其特征在于外源核酸表达构建体，所述外源核酸表达构建体包含编码以下的核酸序列：
(i)嵌合抗原受体(CAR)；
(ii)FcγRIII(CD16)或FcγRIII(CD16)的变体；
(iii)白介素15(IL-15)；
(iv)IL-15受体(IL-15R)激动剂，或IL-15受体的组成型活性变体；
(v)IL-12受体(IL-12R)激动剂，或IL-12受体的组成型活性变体；
(vi)IL-12受体(IL-12R)激动剂，或IL-12受体的组成型活性变体；
(vii)人白细胞抗原G(HLA-G)；
(viii)人白细胞抗原E(HLA-E)；
(ix)白细胞表面抗原分化簇CD47(CD47)；
或其两种或更多种的任何组合；
和/或
(2)包含至少一个导致以下中至少一种的功能丧失的基因组编辑：
(i)细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)；
(ii)腺苷A2a受体(ADORA2A)；
(iii)具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)；
(iv)β-2微球蛋白(B2M)；
(v)程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)；
(vi)II类主要组织相容性复合体反式激活因子(CIITA)；
(vii)自然杀伤细胞受体NKG2A(自然杀伤组2A)；
(viii)两种或更多种HLA II类组织相容性抗原α链基因，和/或两种或更多种HLAII类组织相容性抗原β链基因；
(ix)分化簇32B(CD32B，FCGR2B)；
(x)T细胞受体α恒定区(TRAC)；
或其两种或更多种的任何组合。
74.一种增加iNK细胞活性水平的方法，所述方法包括：
(i)提供包含转化生长因子β(TGFβ)信号传导通路的破坏的多能人干细胞；以及
(ii)使所述多能人干细胞分化为iNK细胞，
其中所述iNK细胞与不包含TGFβ信号传导通路的破坏的iNK细胞相比具有更高水平的细胞活性。
75.如权利要求74所述的方法，其中所述iNK从在包含激活素的培养基中培养的多能人干细胞分化。
76.如权利要求74或75所述的方法，其进一步包括在所述分化步骤之前和/或期间在包含激活素的培养基中培养所述多能人干细胞。
77.如权利要求74-76中任一项所述的方法，其进一步包括破坏所述多能人干细胞中的转化生长因子β(TGFβ)信号传导通路。
78.如权利要求73-77中任一项所述的方法，其中所述干细胞包含导致TGFβ信号传导通路的激动剂的功能丧失的基因组编辑。
79.如权利要求73-78中任一项所述的方法，其中所述干细胞包含TGFβ受体的功能丧失或TGFβ受体的显性失活变体。
80.如权利要求79所述的方法，其中所述TGFβ受体是TGFβ受体II(TGFβRII)。
81.如权利要求73-80中任一项所述的方法，其中所述多能人干细胞：
(1)包含至少一个基因组编辑，其特征在于外源核酸表达构建体，所述外源核酸表达构建体包含编码以下的核酸序列：
(i)嵌合抗原受体(CAR)；
(ii)FcγRIII(CD16)或FcγRIII(CD16)的变体；
(iii)白介素15(IL-15)；
(iv)IL-15受体(IL-15R)激动剂，或IL-15受体的组成型活性变体；
(v)IL-12受体(IL-12R)激动剂，或IL-12受体的组成型活性变体；
(vi)IL-12受体(IL-12R)激动剂，或IL-12受体的组成型活性变体；
(vii)人白细胞抗原G(HLA-G)；
(viii)人白细胞抗原E(HLA-E)；
(ix)白细胞表面抗原分化簇CD47(CD47)；
或其两种或更多种的任何组合；
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(i)细胞因子诱导型含SH2蛋白(CISH)；
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82.一种治疗患有癌症或有患癌症风险的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求6-13、20-29或47-54中任一项所述的细胞，从而治疗所述受试者的所述癌症。
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