JP2019509043A - 光学活性物質の生産のための方法および微生物 - Google Patents
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Abstract
Description
これらのネイティブの還元酵素は、クロストリディウムの中に天然である3−ヒドロキシブチリル−CoAのS型にもかかわらず、R型に触媒作用を及ぼす。
遺伝子の例は表1に示される。
TesBをコードする核酸は、図2BのTesBシーケンス(配列番号:2)と、少なくとも60%、70%、80%、90および95%または99%の配列同一性があるシーケンスを含むことができる。
したがって、1つの実施態様では、クロストリディウム種は、1つ以上のネイティブの非基体特異性還元酵素(native non−substrate specific dehydrogenase)をコードする遺伝子、および/または(R)−3−ヒドロキシブチリル−CoAを(R)−3−ヒドロキシブチレート/(R)−3−ヒドロキシ酪酸および/または(R)−1,3−ブタンジオールに変換することができる脱水素酵素を含む。ネイティブの酵素(例えばPtb、Buk)は、(R)−3−ヒドロキシブチリル−CoAを(R)−3−ヒドロキシブチレートへ変換する。(R)−1,3−ブタンジオールは、それぞれアルデヒド/アルコール脱水素酵素活性化を行う、ネイティブの酵素(たとえばBldおよび/またはAdhE)によって、(R)−3−ヒドロキシブチレート−CoAから生産される。
ald(酪酸菌(Clostridium beijerinckii)から)、bld(クロストリディウム サッカロペルブチルアセトニカム(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)から)、puuC aldH b1300 JW1293(大腸菌から)、およびアルデヒド脱水素酵素(クロストリディウム ブチリカム(Clostridium butyricum)、クロストリディウム オートエタノゲナム(Clostridium autoethanogenum)、クロストリジウム−ベエイジェリンキー(Clostridium beijerinckii)、クロストリジウム−クルイベリ(Clostridium kluyveri)、クロストリディウム イジュンダヒー(Clostridium ljungdahlii)、クロストリジウム−パストゥリアヌム(Clostridium pasteurianum)、クロストリディウム サッカロブチリカム(Clostridium saccharobutylicum)、クロストリディウム サッカロペルブチルアセトニカム(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)、クロストリディウムスポロゲネス菌(Clostridium sporogenes)から)。
bdhAおよびbdhB(クロストリジウム−アセトブチリクムから)、bdh1およびbdh2(クロストリジウム−クルイベリ(Clostridium kluyveri)から)、bdh(クロストリディウムl イジュンダヒー(Clostridium ljungdahlii)から)、adh 1(クロストリディウム サッカロブチリカム(Clostridium saccharobutylicum)から)、bdh(クロストリディウム サッカロペルブチルアセトニカム(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)から)、およびyqhD(大腸菌から)。
adhE(枯草菌(Bacillus subtilis)から)、adhEおよびadhE2(クロストリジウム−アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)から)、およびアルデヒドアルコール脱水素酵素(クロストリディウム オートエタノゲナム(Clostridium autoethanogenum)、クロストリジウム−ベエイジェリンキー(Clostridium beijerinckii)、クロストリジウム−クルイベリ(Clostridium kluyveri)、クロストリディウムl イジュンダヒー(Clostridium ljungdahlii)、クロストリジウム−パストゥリアヌム(Clostridium pasteurianum)、クロストリディウム サッカロブチリカム(Clostridium saccharobutylicum)、クロストリディウム サッカロペルブチルアセトニカム(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)、クロストリディウムスポロゲネス菌(Clostridium sporogenes)、および大腸菌(Escherichia coli))から。
アルコール/アルデヒド脱水素酵素のノックアウトは、ブタノールと(R)−1,3−ブタンジオールをなくすだろう。
酵素PtbおよびBukはR型には特異性で、(R)−3−ヒドロキシブチリル−CoAを、(R)−3−ヒドロキシブチリル−リン酸塩を介して、(R)−3−ヒドロキシブチレートに変換する。一方、アルデヒド脱水素酵素(つまりBld)および/または2官能性のアルデヒド/アルコール脱水素酵素(つまりAdhE)は、(R)−3−ヒドロキシブチリル−CoAを(R)−1,3−ブタンジオールに、直接または(R)−3−ヒドロキシブチルアルデヒドを介して変換する。
1) 遺伝子合成
遺伝子クプリアウィドゥス ネカトル(Cupriavidus necator) PhaBはクロストリジウムのためにコドン最適化された。図2Aは、Gene Art (r) (Thermo Fisher Scientific)によって合成された、コドン最適化されたシーケンスの一例を示す。
PhaBは制限部位NdeIおよびNheIを使用して、プラスミドpMTL83151へクローンを作られた。C.sporogenes Pfdxプロモータは、プラスミドpMTL83151_pfdx_phaBを与えるインフェクションクローニング・キットを使用して、遺伝子の上流にクローンを作られた。PfdX−phaBは制限部位NotIおよびNheIを使用して、pMTL83151_pfdx_phaBから抽出された。抽出されたフラグメントは、標準クローニング方法を使用してpMTL83251へクローンを作られた(図3Aおよび3B)。
デザインされたプラスミドは、標準トランスフォーメーションプロトコルを使用して、生体外のメチル化のために大腸菌TOP10 pAN2をトランスフォーメーションするために使用された。メチル化プラスミドは、市販のキットを使用して抽出され、クロストリジウム−アセトブチリカム(C.acetobutylicum) ATCC 824をトランスフォーメーションするために使用された。簡潔には、クロストリジウム−アセトブチリカム(C.acetobutylicum)の一晩の培養が、2xYTGを播種するために使用された。細胞は、0.6−0.8のOD600へ37℃で酸素欠如状態で成長され、氷冷された嫌気性生物エレクトロポレーションバッファー(EPB)(270mMショ糖、5mMリン酸ナトリウム(pH 7.4))で洗われた。最終ペレットは氷冷された小体積の嫌気性生物EPB中に再懸濁され、直ちにトランスフォーメーションに使用された。プラスミドDNA(1−2μg)および細胞は、あらかじめ冷蔵された0.4cmのギャップ・キュベットに加えられた。エレクトロポレーションは次のセッティングを備えたバイオラド エレクトロポレーター(BioRad electroporator)を使用して実行された:2.0kV、25μFおよび∞Ω。トランスフォームされた細胞は、2xYTGの中で1−3hで37℃、pH 5.2で酸素欠如状態で回収された。その後、必要な抗生物質(15μg/mlのチアンフェニコールまたは50μg/mlのエリスロマイシン)を含むCGMメディア上で培養され、単一のコロニーが、24−48時間以内に得られた。プラスミドの存在はコロニーPCRおよびプラスミド特異性プライマーを使用して確認された。トランスフォームされたコロニーは、各プラスミドについて採取され、−80℃で冷凍装置内で格納された。
例証されたメディアは次のとおりである:1Lにつき以下を含むCBM:1mlのFeSO4x7H2O(10mg/mL)、10mlのMgSO4x7H2O(20mg/mL)、1mlのMnSO4 x 4H2O(10mg/mL)、4gのカゼイン水解物、1mlの4−アミノ安息香酸(1mg/ml)、1mlのチアミン−HCL(1mg/ml)、1.33μlのビオチン(1.5mg/ml)、10mlのK2HPO4(50mg/ml)、10mlのKH2PO4(50mg/ml)、20mlのCaCO3(250mg/ml)、2.5−5%のグルコース。固形培地については、寒天が15g/lで加えられた。また、CaCO3が省略された。
2gの硫酸アンモニウム、1gの第二燐酸カリウム、0.5gの第二燐酸カリウム、0.2gのマグネシウム硫酸塩ヘプタハイドレード、0.75mlの硫酸鉄ヘプタハイドレード(20g/l)、0.5mlの塩化カルシウム(20g/l)、0.5mlの硫酸マンガン一水化物(20g/l)、0.1mlのコバルト水化物(20g/l)、0.1mlの硫酸亜鉛(20g/l)、トリプトン2g、酵母抽出物1g、50gのグルコース、12gの寒天。
成長方法
トランスフォームされた菌株は−80℃の冷凍装置ストックから取り出し、適切な抗生物質(15μg/mlのチアンフェニコールまたは50μg/mlのエリスロマイシン)を含むCBMまたはCGMのプレート上に、再度ストリークした。単一のコロニーが採取され、1晩置かれた種培地(2xYTG、pH 5.2)に接種するために使用された。種培地は、16時間まで37℃で酸素欠如状態で成長された。2.5%のグルコースを含む40mlのCGM培地は、種培地を使用して、翌日、1:100で接種を受けた。
菌株は、37℃で酸素欠如状態で成長された。代謝の分析のためのサンプルは48時間の成長の後に得られ、R/S)−3−ヒドロキシブチレート(R/S−HB)および(R/S)−1,3−ブタンジオール(R/S−BDO)について分析された。
R/S−3−ヒドロキシブチレートのための分析はHPLC−MSを使用して行なわれた。サンプルはDATAN(ジアセチル酒石酸無水物)を使用して誘導体とされ、R型とS型との分離は、標準の非キラルLCカラム(Agilent Zorbax Eclipse Plus C18、2.1×150mm、1.8μm)を使用して行われた。簡潔に言えば、10μlの上澄みを250μlのメタノールと混合した。サンプルは50℃で乾燥され、調製された新鮮なDATAN溶液(ジクロロメタン:酢酸4:1(v/v)中の200g/lのDATAN)の50μlが加えられた。サンプルは75℃で120分間インキュベートされ、次いで蒸発ステップを行った。乾燥されたサンプルは、500μlの水中に懸濁され、LC−MSによって分析された。
図4(pMTL83151_pfdx_phaB)および図5(pMTL83251_pfdx_phaB)に示されるように、phaBの発現は(R)−3−ヒドロキシブチレートおよび(R)−1,3−ブタエンジオールの生産に導く。(R)−1,3−ブタンジオールの250μM以上、(R)−3−ヒドロキシブチレートの3000μM以上の濃度が達成された。(S)−1,3−ブタンジオールおよび(S)−3−ヒドロキシブチレートの非存在または最小のレベルの存在が、トランスフォームされた菌株で検知された。
1) 遺伝子合成
遺伝子クプリアウィドゥス ネカトル(Cupriavidus necator) PhaBはクロストリジウムのためにコドン最適化された。図2Aは、Gene Art(登録商標)(Thermo Fisher Scientific)によって合成された、コドン最適化されたシーケンスの一例を示す。
PhaBは、C.sporogenes Pfdxプロモータと一緒に、制限部位NotIおよびNheIを使用してプラスミドpMTL82151内へクローンされ、プラスミドpMTL82151_pfdx_phaBが作られた。
プラスミドpMTL82151_pfdx_phaBは、標準エレクトロポレーション方法によってクロストリジウム−サッカロペルブチルアセトニカム(C.saccharoperbutylacetonicum)(Cspa)にトランスフォームするために使用された。簡潔には、細胞は、0.6−0.8のOD600へ37℃で酸素欠如状態で成長され、氷冷された嫌気性生物エレクトロポレーションバッファー(EPB)(270mMショ糖、5mMリン酸ナトリウム(pH 7.4))で洗われた。最終ペレットは氷冷された小体積の嫌気性生物EPB中に再懸濁され、直ちにトランスフォーメーションに使用された。プラスミドDNA(1−2μg)および細胞は、あらかじめ冷蔵された0.4cmのギャップ・キュベットに加えられた。エレクトロポレーションは次のセッティングを備えたBioRad electroporatorを使用して実行された:2.0kV、25μFおよび∞Ω。トランスフォームされた細胞は、RCMの中で1−3時間で37℃、pH 5.2で酸素欠如状態で回収された。その後、RCM+50μg/mlクロラムフェニコール上で培養され、単一のコロニーが、24−48時間以内に得られた。
プラスミドの存在はコロニーPCRおよびプラスミド特異性プライマーを使用して確認された。トランスフォームされたコロニーは、各プラスミドについて採取され、−80℃で冷凍装置内で格納された。
成長方法
トランスフォーマントは、37℃で種培養(成長メディア:CGMまたはFMC)の中で一晩成長された。5%のグルコースを含む40mlのCGM培地は翌日インキュベートされ、0.05−0.1のスタートODだった。菌株は、37℃で酸素欠如状態で成長された。代謝の分析のためのサンプルは定期的に採取され、(R/S)−3−ヒドロキシブチレート(R/S−HB)および(R/S)−1,3−ブタンジオール(R/S−1,3−BDO)について分析された。
上澄みサンプルは、HPLCに接続されたAminexイオン排除カラム(HPX−87H、300mm 7.8mm、Bio−Rad)を使用して分析された。代謝物質は0.5ml毎分の流量で5mMのH2SO4で溶出された。生成された3−ヒドロキシブチレートおよび1,3−ブタンジオールのキラリティー分析はHPLC−MSを使用して実行された。サンプルはDATAN(ジアセチル酒石酸無水物)を使用して誘導体とされ、R型とS型との分離は、標準の非キラルLCカラム(Agilent Zorbax Eclipse PlusのC18、2.1×150mm、1.8μm)を使用して行われた。簡潔に言えば、10μlの上澄みを250μlのメタノールと混合した。サンプルは50℃で乾燥され、調製された新鮮なDATAN溶液(ジクロロメタン:酢酸4:1(v/v)中の200g/lのDATAN)の50μlが加えられた。サンプルは75°Cで120分間インキュベートされ、次いで蒸発ステップを行った。乾燥されたサンプルは、500μlの水中に懸濁され、LC−MSによって分析された。
図6に示されるように、クロストリジウム−サッカロペルブチルアセトニカム(C.saccharoperbutylacetonicum)におけるphaBの発現は(R)−3−ヒドロキシブチレートおよび(R)−1,3−ブタエンジオールの生産に導いた。成長メディアに依存して、約5.5−7mMの3−ヒドロキシブチレートおよび5−6 mMの1,3−ブタンジオールが、72時間以内に生産された。質量分析は、生成された3−ヒドロキシブチレートおよび1,3−ブタンジオールのRキラリティーを確認した。
1) 遺伝子合成
遺伝子クプリアウィドゥス ネカトル(Cupriavidus necator) PhaBはクロストリジウムのためにコドン最適化された。図2Aは、Gene Art(登録商標) (Thermo Fisher Scientific)によって合成された、コドン最適化されたシーケンスの一例を示す。
PhaBはC.sporogenes Pfdxプロモータを管理した条件で標準クローニング技術を使用してプラスミドpMTL83251へクローンを作られ、プラスミドpMTL83251_pfdx_phaを得た。
プラスミドpMTL83251_pfdx_phaBは大腸菌CA434を使用して、クロストリジウム−ブチリカム(Clostridium butyricum)へ接合(conjugate)された。標準接合プロトコルが適用された。簡潔に言えば、プラスミドpMTL83251_pfdx_phaBを有する大腸菌CA43および(C.butyricum)を一晩培養し、それぞれ9mlのLBメディアおよびRCMに接種するために使用された。培地は0.5−0.7のODまで成長された。1mlの大腸菌培養物は遠沈され、ペレットは200μlのクロストリジウム−ブチリカム(C.butyricum)培養物と混合された。細胞混合物は非選択的なRCMプレート上にスポットされ、一晩インキュベートされた。インキュベートされた混合物は、500μlの新鮮なRCMへ再懸濁され、10μg/mlのエリスロマイシンを含む選択培地で培養された。得られたトランス接合体(transconjugants)内のプラスミドの存在はプラスミド特異性プライマーを使用して、PCRによって確認された。
成長方法
1Lにつき以下を含むRCMが使用された:酵母抽出物13g、ペプトン10g、可溶性デンプン1g、塩化ナトリウム5.g、酢酸ナトリウム3g、塩酸システイン0.5g、炭水化物2%。炭酸カルシウム10g/lが、pH調整のために液体培地に加えられた。
固形培地は15g/lの寒天を含んでいた。トランスフォーマンツ(transformants)は、37℃で種培養(RCM)中で一晩成長された。2%のグルコースを含む100mlのRCメディアは、出発OD0.05−0.1で接種を受けた。菌株は、要求された抗生物質が存在する状態で37℃で酸素欠如状態で成長された。代謝の分析のためのサンプルは一定間隔で得られた。
培養液上清は3−ヒドロキシブチレート分析キット(Sigma Aldrich)を使用して(R)−3−ヒドロキシブチレートについて分析された。図7に示されるように、phaB発現株は約17mg/Lの3−ヒドロキシブチレートを生産した。
1) 遺伝子合成
遺伝子クプリアウィドゥス ネカトル(Cupriavidus necator) PhaBおよび大腸菌TesBはクロストリジウムのためにコドン最適化された。図2Aは、Gene Art(登録商標) (Thermo Fisher Scientific)によって合成されたコドン最適化されたphaBシーケンスの1つの例を示す。
図2Bは、Gene Art(登録商標)(Thermo Fisher Scientific)によって合成されたコドン最適化されたTesBシーケンスの1つの例を示す。
PhaBとTesBは、標準クローニング技術を使用して、pfdxプロモータの管理の下でpMTL83151の中へ1つのオペロン(operon)としてクローンを作られた。生成されたプラスミドは標準トランスフォーメーションプロトコルを使用して、生体外のメチル化のために大腸菌TOP10 pAN2をトランスフォームするために使用された。メチル化プラスミドは、商用キットを使用して抽出され、クロストリジウム−アセトブチリカム(C.acetobutylicum) ATCC 824に変換するために使用された。簡潔に言えば、クロストリジウム−アセトブチリカム(C.acetobutylicum)の一晩の培養物が、2xYTGに接種するために使用された。細胞は、0.6−0.8のOD600へ37℃で酸素欠如状態で成長され、氷冷された嫌気性生物エレクトロポレーションバッファー(EPB)(270mMショ糖、5mMリン酸ナトリウム(pH 7.4)。)で洗われた。最終ペレットは氷冷された小体積の嫌気性生物EPB中に再懸濁され、直ちにトランスフォーメーションに使用された。プラスミドDNA(1−2μg)および細胞は、あらかじめ冷蔵された0.4cmのギャップ・キュベットに加えられた。エレクトロポレーションは次のセッティングを備えたBioRad electroporatorを使用して実行された:2.0kV、25μFおよび∞Ω。トランスフォームされた細胞は、2xYTGの中で1−3時間で37℃、pH 5.2で酸素欠如状態で回収された。その後、15μg/mlのチアンフェニコールを含むCGMメディア上で培養され、単一のコロニーが、24−48時間以内に得られた。プラスミドの存在はプラスミド特異性プライマーを使用してコロニーPCRにより確認された。トランスフォームされたコロニーは、各プラスミドについて採取され、−80℃で冷凍装置内で格納された。
成長方法
トランスフォーマンツは、37℃で種培養(成長培地:CBM)の中で一晩成長された。サンプルは一定間隔で採取され、HPLC_MSによってキラル化学物質(R)−1,3−ブタンジオールおよび(R)−3−ヒドロキシブチレートの生産が分析された。
R/S−3−ヒドロキシブチレートについての分析はHPLC−MSを使用して行なわれた。サンプルはDATAN(ジアセチル酒石酸無水物)を使用して誘導体とされ、R型とS型との分離は、非キラルLCカラム(Agilent Zorbax Eclipse Plus C18、2.1×150mm、1.8μm)を使用して行われた。簡潔に言えば、10μlの上澄みを250μlのメタノールと混合した。サンプルは50℃で乾燥され、調製された新鮮なDATAN溶液(ジクロロメタン:酢酸4:1(v/v)中の200g/lのDATAN)の50μlが加えられた。サンプルは75°Cで120分間インキュベートされ、次いで蒸発ステップを行った。乾燥されたサンプルは、500μlの水中に懸濁され、LC−MSによって分析された。
クロストリジウム−アセトブチリカム(C.acetobutylicum)の中のphaBの過剰発現は、図8に示されるように2つのキラル化学物質(R)−1,3−ブタンジオールおよび(R)−3−ヒドロキシブチレートの生産に結びつく。TesBの添加は(R)−3−ヒドロキシブチレートのタイターを1.5倍に増加させた。TesBは非キラル特異性で、S/R−3−HB−CoAを基体として使用することができ、(R)−3−ヒドロキシブチレートと(S)−3−ヒドロキシブチレートを10:1の比率で生産する株が得られた。
1) 遺伝子合成
遺伝子クプリアウィドゥス ネカトル(Cupriavidus necator) PhaBはクロストリジウムのためにコドン最適化された。図2は、Gene Art(r) (Thermo Fisher Scientific)によって合成されたコドン最適化されたシーケンスの1つの例を示す。
PhaBは、pyrEに基づいた、公表されたACE方法(例えばWO2009/101400に記述される)を使用して、クロストリジウム−サッカロペルブチルアセトニカム(C.saccharoperbutylacetonicum)のゲノムへインテグレートされた。トランスフォーマンツは遺伝子特異性プライマーを使用して確認された。3) クロストリジウム−サッカロペルブチルアセトニカム(C.saccharoperbutylacetonicum)のための発酵
FMCとCGMを含むがこれらに制限されない適切な培地を使用して、以下に提供されるように、トランスフォーマンツを一晩成長させた。
1Lにつき以下を含むFMCメディア:酵母抽出物2.5g、トリプトン2.5g、FeSO4x7H2O 0.025g(NH4)2SO4 0.5g。pHはチェックされ、6.5−7にオートクレーブ滅菌する前に調節された。CaCO3 5g−10gがpHを規制するために添加された。
上澄みサンプルは、HPLCに接続されたAminexイオン排除カラム(HPX−87H、300mm 7.8mm、Bio−Rad)を使用して分析された。代謝物質は0.5ml毎分の流量で5mMのH2SO4で溶出された。生成された3−ヒドロキシブチレートおよび1,3−ブタンジオールのキラリティー分析はHPLC−MSを使用して実行された。サンプルはDATAN(ジアセチル酒石酸無水物)を使用して誘導体とされ、R型とS型との分離は、非キラルのLCカラム(Agilent Zorbax Eclipse PlusのC18、2.1×150mm、1.8μm)を使用して行われた。簡潔に言えば、10μlの上澄みを250μlのメタノールと混合した。サンプルは50℃で乾燥され、調製された新鮮なDATAN溶液(ジクロロメタン:酢酸4:1(v/v)中の200g/lのDATAN)の50μlが加えられた。サンプルは75°Cで120分間インキュベートされ、次いで蒸発ステップを行った。乾燥されたサンプルは、500μlの水中に懸濁され、LC−MSによって分析された。
クロストリジウム−サッカロペルブチルアセトニカム(C.saccharoperbutylacetonicum)のゲノムの中へのphaBのインテグレーションは、図9Aおよび9Bに示されるように、2つのキラル化学物質、(R)−1,3−ブタンジオールおよび(R)−3−ヒドロキシブチレートの生産に結びつく。生産された量は、0.3g/lの3−ヒドロキシブチレートおよび3.2g/lの1,3−ブタンジオールだった。
1) 遺伝子合成
遺伝子クプリアウィドゥス ネカトル(Cupriavidus necator) PhaBはクロストリジウムのためにコドン最適化された。図2は、Gene Art(登録商標)(Thermo Fisher Scientific)によって合成された、コドン最適化されたシーケンスの1例を示す。
第1の株PhaBは、pyrEに基づいた、公表されたACE方法(例えばWO2009101400に記載されている)を使用して、クロストリジウム−サッカロペルブチルアセトニカム(C.saccharoperbutylacetonicum)のゲノムへインテグレーションされた。第2の株phaBは、pfdxプロモータの管理の下で複製pMTL82151プラスミド上で発現された。プラスミドは嫌気性クロストリジウムに対して標準エレクトロポレーション・プロトコルを使用して、Cspaにトランスフォームされた。各トランスフォーマンツの正確な遺伝子型は遺伝子特異性プライマーを使用して確認された。
成長方法
FMCとCGMを含むがこれらに制限されない適切な培地を使用して、先に記載されたように、トランスフォーマンツを一晩成長させた。代謝の分析のためのサンプルは一定間隔で採取され、(R/S)−3−ヒドロキシブチレート(R/S−HB)および(R/S)−1,3−ブタンジオール(R/S−1,3−BDO)について分析された。
上澄みサンプルは、HPLCに接続されたAminexイオン排除カラム(HPX−87H、300mm 7.8mm、Bio−Rad)を使用して分析された。代謝物質は0.5ml毎分の流量で5mMのH2SO4で溶出された。生成された3−ヒドロキシブチレートおよび1,3−ブタンジオールのキラリティー分析はHPLC−MSを使用して実行された。サンプルはDATAN(ジアセチル酒石酸無水物)を使用して誘導体とされ、R型とS型との分離は、非キラルLCカラム(Agilent Zorbax Eclipse PlusのC18、2.1×150mm、1.8μm)を使用して行われた。簡潔に言えば、10μlの上澄みを250μlのメタノールと混合した。サンプルは50℃で乾燥され、調製された新鮮なDATAN溶液(ジクロロメタン:酢酸4:1(v/v)中の200g/lのDATAN)の50μlが加えられた。サンプルは75℃で120分間インキュベートされ、次いで蒸発ステップを行った。乾燥されたサンプルは、500μlの水中に懸濁され、LC−MSによって分析された。
図10Aおよび10Bに示されるように、クロストリジウム−サッカロペルブチルアセトニカム(C.saccharoperbutylacetonicum)のゲノムへのphaBのインテグレーションおよび複製プラスミド発現は、2つのキラル化学物質、(R)−1,3−ブタンジオールおよび(R)−3−ヒドロキシブチレートの生産に導く。プラスミド発現対phaBのインテグレーションの比較は予期しない結果を示した。ゲノムへのphaBのインテグレーションは、(R)−3−ヒドロキシブチレートタイターの減少に結びつく。その一方でphaBがゲノムへインテグレーションされた時、(R)−1,3−ブタンジオール生産の6倍の増加が観察された。
Claims (27)
- (R)−3−ヒドロキシブチリル−CoA脱水素酵素を発現することができるノンネイティブ遺伝子を含むクロストリディウム種を培養することを含む、(R)−3−ヒドロキシ酪酸および/またはその塩、および/または(R)−1,3−ブタンジオールの製造方法。
- 嫌気性または微好気性の条件下で、クロストリディウム種を培養することを含む、請求項1記載の方法。
- 生産された(R)−3−ヒドロキシ酪酸および/またはその塩、および/または(R)−1,3−ブタンジオールを精製する工程を含む、請求項1または2記載の方法。
- 遺伝子はPhaBである、請求項1から3のいずれか1項記載の方法。
- (R)−3−ヒドロキシ酪酸異性体は、3−ヒドロキシ酪酸の100%を構成するか、または(R)−3−ヒドロキシ酪酸異性体は形成された3−ヒドロキシ酪酸の90−100%を構成し、(S)−3−ヒドロキシ酪酸異性体が形成された3−ヒドロキシ酪酸の0−10%を構成する、請求項1から4のいずれか1項記載の方法。
- 形成された1,3−ブタンジオールは、100%の(R)−1,3−ブタンジオール異性体であるか、または、形成された1,3−ブタンジオールは、90−100%の(R)−1,3−ブタンジオール異性体と0−10%の(S)−1,3−ブタンジオール異性体を含む、請求項1から5のいずれか1項記載の方法。
- クロストリディウム種がチオエステラーゼを発現することができるノンネイティブ遺伝子をさらに含む、請求項1から6のいずれか1項記載の方法。
- チオエステラーゼを発現することができる遺伝子はTesBである、請求項7記載の方法。
- クロストリディウム種がS−ステレオ特異性クロトナーゼを含む、請求項1から8のいずれか1項記載の方法。
- クロストリディウム種が、(R)−3−ヒドロキシブチリル−CoAを(R)−3−ヒドロキシ酪酸および/または(R)−1,3−ブタンジオールに変換することのできる、1以上のネイティブ非基体特異性脱水素酵素/還元酵素を含む、請求項1から9のいずれか1項記載の方法。
- クロストリディウム種が、(R)−3−ヒドロキシブチリル−CoAを(R)−1,3−ブタンジオールに変換することのできる、非基体特異性アルデヒド脱水素酵素および/またはアルコール脱水素酵素を発現することができる、1以上のノンネイティブ遺伝子を含む、請求項1から9のいずれか1項記載の方法。
- (R)−3−ヒドロキシブチリル−CoA脱水素酵素を発現することができるノンネイティブ遺伝子が、クロストリディウム種の染色体へインテグレートされている、請求項1から11のいずれか1項記載の方法。
- クロストリディウム種の、ブタノール、アセトン、エタノール、酪酸塩、酢酸塩および/または乳酸塩の生産に関与するネイティブの遺伝子の発現が、低減またはノックアウトされている、請求項1から12のいずれか1項記載の方法。
- クロストリディウム種のネイティブのptb、buk、hbdおよび/またはアルコール/アルデヒド脱水素酵素の発現が、低減またはノックアウトされている、請求項13記載の方法。
- 請求項1から14のいずれか1項記載の方法によって生産された、(R)−3−ヒドロキシ酪酸、および/またはその塩、および/または(R)−1,3−ブタンジオール。
- (R)−3−ヒドロキシブチリル−CoA脱水素酵素を発現することができるノンネイティブ遺伝子を含むクロストリディウム種。
- ノンネイティブ遺伝子がPhaBである、請求項16記載のクロストリディウム種。
- チオエステラーゼを発現することができるノンネイティブ遺伝子を含む、請求項16または17記載のクロストリディウム種。
- S−ステレオ特異性クロトナーゼを含む、請求項16から18のいずれか1項記載のクロストリディウム種。
- (R)−3−ヒドロキシブチリル−CoAを(R)−3−ヒドロキシ酪酸および/または(R)−1,3−ブタンジオールに変換することのできる、1以上のネイティブ非基体特異性脱水素酵素/還元酵素を含む、請求項16から19のいずれか1項記載のクロストリディウム種。
- (R)−3−ヒドロキシブチリル−CoAを(R)−1,3−ブタンジオールに変換することのできる、非基体特異性アルデヒド脱水素酵素および/またはアルコール脱水素酵素を発現することができる、1以上のノンネイティブ遺伝子を含む、請求項16から20のいずれか1項記載のクロストリディウム種。
- クロストリディウム種はクロストリジウムアセトブチリカム(C.acetobutylicum)、クロストリジウム−ブチリカム(C.butyricum)またはクロストリジウム−サッカロペルブチルアセトニカム(C.saccharoperbutylacetonicum)である、請求項16から21のいずれか1項記載のクロストリディウム種。
- (R)−3−ヒドロキシブチリル−CoA脱水素酵素を発現することができるノンネイティブ遺伝子が、クロストリディウム種の染色体へインテグレートされている、請求項16から22のいずれか1項記載のクロストリディウム種。
- クロストリディウム種の、ブタノール、アセトン、エタノール、酪酸塩、酢酸塩および/または乳酸塩の生産に関与するネイティブの遺伝子の発現が、低減またはノックアウトされている、請求項16から23のいずれか1項記載のクロストリディウム種。
- クロストリディウム種のネイティブのptb、buk、hbdおよび/またはアルコール/アルデヒド脱水素酵素の発現が、低減またはノックアウトされている、請求項24記載のクロストリディウム種。
- (R)−3−ヒドロキシブチリル−CoAを発現することができるノンネイティブ遺伝子をクロストリディウム種に組込むことを含む、請求項16から25のいずれか1項記載のクロストリディウム種。
- ノンネイティブ遺伝子がクロストリディウム種の染色体へインテグレートされている、請求項26記載のクロストリディウム種。
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