JP2011239692A - 2−ブタノールの製造方法及び2−ブタノール生産能を有する組換え微生物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子と、アセトアセチルCoAから2-プロパノールを合成する一群の酵素をコードする遺伝子群(2-プロパノール合成関連遺伝子群)とを導入した組換え微生物を培養することで培地に2-プロパノールのみならず2-ブタノールを高生産する。
【選択図】なし
Description
(2) 上記アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子は、2分子のアセチルCoAをアセトアセチルCoAに変換する反応を触媒する酵素をコードすることを特徴とする(1)記載の2-ブタノールの製造方法。
(3) 上記アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子は、Clostridium acetobutylicum由来のチオラーゼ遺伝子(thlA遺伝子)であることを特徴とする(2)記載の2-ブタノールの製造方法。
(4) 上記アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子は、配列番号2記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、又は配列番号2のアミノ酸配列に対して80%以上の一致度を有するアミノ酸配列を有し、2分子のアセチルCoAからアセトアセチルCoAを合成する機能を有するタンパク質をコードするものであることを特徴とする(3)記載の2-ブタノールの製造方法。
(5) 上記アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子は、アセチルCoAとマロニルCoAとをアセトアセチルCoAに変換する反応を触媒する酵素をコードすることを特徴とする(1)記載の2-ブタノールの製造方法。
(6) 上記アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子は、Streptomyces属の微生物由来の遺伝子(orfN遺伝子)であることを特徴とする(5)記載の2-ブタノールの製造方法。
(7) 上記アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子は、配列番号1記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、又は配列番号1のアミノ酸配列に対して80%以上の一致度を有するアミノ酸配列を有し、マロニルCoAとアセチルCoAとからアセトアセチルCoAを合成する機能を有するタンパク質をコードするものであることを特徴とする(6)記載の2-ブタノールの製造方法。
(8) 2-プロパノール生合成関連遺伝子群は、アセトアセチルCoA転移酵素遺伝子、アセト酢酸脱炭酸酵素遺伝子及びイソプロパノール脱水素酵素遺伝子からなる群のなかから選ばれる遺伝子であり、上記組換え微生物は、これら2-プロパノール生合成関連遺伝子群の遺伝子のうち内在しない遺伝子が導入されたものであることを特徴とする(1)記載の2-ブタノールの製造方法。
(9) アセトアセチルCoA転移酵素遺伝子は、Clostridium acetobutylicum由来のctfA遺伝子及びctfB遺伝子であることを特徴とする(8)記載の2-ブタノールの製造方法。
(10) アセト酢酸脱炭酸酵素遺伝子は、Clostridium acetobutylicum由来のadc遺伝子であることを特徴とする(8)又は(9)記載の2-ブタノールの製造方法。
(12) 上記組換え微生物は、大腸菌を宿主とした組換え微生物であることを特徴とする(1)記載の2-ブタノールの製造方法。
(13) 上記大腸菌はK株であることを特徴とする(12)記載の2-ブタノールの製造方法。
(14) Streptomyces属の微生物由来のアセトアセチルCoA合成酵素遺伝子(orfN遺伝子)、及びアセトアセチルCoAから2-プロパノールを合成する代謝経路に関連する2-プロパノール生合成関連遺伝子群が導入された組換え微生物。
(15) 上記アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子は、配列番号1記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、又は配列番号1のアミノ酸配列に対して80%以上の一致度を有するアミノ酸配列を有し、マロニルCoAとアセチルCoAとからアセトアセチルCoAを合成する機能を有するタンパク質をコードするものであることを特徴とする(14)記載の組換え微生物。
(16) 2-プロパノール生合成関連遺伝子群は、アセトアセチルCoA転移酵素遺伝子、アセト酢酸脱炭酸酵素遺伝子及びイソプロパノール脱水素酵素遺伝子からなる群のなかから選ばれる遺伝子であり、これら2-プロパノール生合成関連遺伝子群の遺伝子のうち内在しない遺伝子が導入されたものであることを特徴とする(14)記載の組換え微生物。
(17) アセトアセチルCoA転移酵素遺伝子は、Clostridium acetobutylicum由来のctfA遺伝子及びctfB遺伝子であることを特徴とする(16)記載の組換え微生物。
(18) アセト酢酸脱炭酸酵素遺伝子は、Clostridium acetobutylicum由来のadc遺伝子であることを特徴とする(16)又は(17)記載の組換え微生物。
(19) イソプロパノール脱水素酵素遺伝子は、Clostridium beijerinckii由来のpdh遺伝子であることを特徴とする(16)乃至(17)いずれかに記載の組換え微生物。
(20) 上記組換え微生物は、大腸菌を宿主とした組換え微生物であることを特徴とする(14)記載の組換え微生物。
(21) 上記大腸菌はK株であることを特徴とする(20)記載の組換え微生物。
本発明に係る2-ブタノール(Sec-ブチルアルコール)の製造方法は、アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子、及びアセトアセチルCoAから2-プロパノールを合成する代謝経路に関連する2-プロパノール生合成関連遺伝子群が導入された組換え微生物を培養し、培養物から2-ブタノールを取得するものである。
アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子とは、マロニルCoAとアセチルCoAとからアセトアセチルCoAを合成する活性、又は二分子のアセチルCoAからアセトアセチルCoAを合成する活性を有する酵素をコードする遺伝子である。なお、二分子のアセチルCoAからアセトアセチルCoAを合成する活性を有する酵素をチオラーゼと称する場合もある。
2-プロパノール生合成関連遺伝子群とは、アセトアセチルCoAを出発化合物として最終生産物である2-プロパノールを生合成する代謝経路に関与する酵素をコードする複数の遺伝子からなる群を意味する。2-プロパノール生合成代謝経路に関与する酵素としては、アセトアセチルCoAを基質としてアセチル酢酸を合成するアセトアセチルCoA転移酵素、アセチル酢酸を基質としてアセトンを合成するアセト酢酸脱炭酸酵素及び、アセトンを基質として2-プロパノールを合成するイソプロパノール脱水素酵素を挙げることができる。
上述した「アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子」及び「2-プロパノール生合成関連遺伝子群」は、適当な発現ベクターに組み込まれ、宿主微生物に導入される。ここで、宿主微生物としては、本発明の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、エッシェリヒア・コリ(Escherichia coli)などのエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)などのバチルス属、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)などのシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti)などのリゾビウム属に属する細菌が挙げられ、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロマイセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)などの酵母が挙げられる。
上述した「アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子」及び「2-プロパノール生合成関連遺伝子群」が導入された微生物を、グルコース等の炭素源を含む培地で培養することによって、2-プロパノールの生合成のみならず、2-ブタノールの生合成が進行する。一般に、アセトアセチルCoAからブタノールを生合成するには、アセトアセチルCoAを基質として3-ヒドロキシブチルCoAを合成するβ-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ、3-ヒドロキシブチルCoAを基質としてクロトニルCoAを合成する3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ、クロトニルCoAを基質としてブチリルCoAを合成するブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ、ブチリルCoAを基質としてブチルアルデヒドを合成するブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、及びブチルアルデヒドを基質としてブタノールを合成するブタノールデヒドロゲナーゼといったブタノール生合成関連酵素が機能する必要があるとされる。しかし、本発明においては、これらブタノール生合成関連酵素が機能するかたちで導入されていないにも拘わらず、上述した「アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子」及び「2-プロパノール生合成関連遺伝子群」が導入された微生物により2-ブタノールが生合成される。
<Clostridium acetobutylicum のゲノムDNAの調製>
Clostridium acetobutylicum ATCC(824)株を常法に従い3mlのDifco社製クロストリジウム強化培地で30℃、2日間嫌気培養した。QIAGEN社製ゲノムDNA調製キット(Gentra Puregene Yeast/Bact.kit)を用いて培養液1.5mlからゲノムDNAを調製した。
Clostridium acetobutylicum由来のチオラーゼ遺伝子であるthiA遺伝子を以下のようにクローニングした。先ず、以下のプライマーを用いてPCRを行った。
CAC2873-F:5'-ATG AAA GAA GTT GTA ATA GCT AGT GCA G-3'(配列番号7)
CAC2873-R:5'-CTA GCA CTT TTC TAG CAA TAT TGC TG-3'(配列番号8)
大腸菌において上記thiA遺伝子を発現するための発現ベクターを以下のように構築した。先ず、以下のプライマーを用いてPCRを行った。
acat-NdeI-F:5'-AAA CAT ATG AAA GAA GTT GTA ATA GC-3'(配列番号9)
acat-XhoI-R:5'-AAA CTC GAG CTA GCA CTT TTC TAG CAA T-3'(配列番号10)
PCRにおいて鋳型としては上記で調製したpT7Blue-CAC2873を使用した。また、上記一対のプライマーは10pmolとした。反応液組成は1xPfu UltraTMII reaction buffer (Stratagene)中に12.5 nmolのdNTP及び1μlのPfu UltraTMII fusion HS DNA polymerase (Stratagene)を含む50μl溶液とした。PCRのサーマルサイクルは、95℃で2分の後、95℃で20秒、43℃で20秒及び72℃で40秒を1サイクルとして5サイクル行い、その後、95℃で20秒、50℃で20秒及び72℃で40秒を1サイクルとして30サイクル行い、その後72℃で3分とした。また反応終了後は4℃でストックした。
Clostridium acetobutylicum由来であり、マロニルCoAとアセチルCoAからアセトアセチルCoAを合成するアセトアセチルCoA合成酵素遺伝子を以下のようにクローニングした。先ず、以下のプライマーを用いてPCRを行った。
OrfN-NdeI-F:5'-AAA CAT ATG ACC GAC GTC CGA TTC CGC AT 3'(配列番号11)
OrfN-XhoI-R:5'-AAA CTC GAG TTA CCA CTC GAT CAG GGC GA 3'(配列番号12)
Clostridium acetobutylicum由来のアセトアセチルCoA転移酵素遺伝子であるctfA遺伝子及びctfB遺伝子をクローニングした。先ず、上述のように調整したゲノムDNAをテンプレートにして以下に示すPCRを行った。PCRではPfuUltra II fusion HS DNA polymerase(STRATAGEN社製)及び以下のプライマー(下線部は制限酵素サイト)を使用した。
ctfAB-NdeI-F:5’-ATT CAT ATG AAC TCT AAA ATA ATT AGA TTT GAA AAT TTA AGG TC-3’ (配列番号13)
ctfAB-NdeI-R:5’-AGA CTC GAG CTA AAC AGC CAT GGG TCT AAG-3’ (配列番号14)
PCRにおける反応液の組成は、下記の通りとした。
Clostridium acetobutylicum由来のアセト酢酸脱炭酸酵素遺伝子であるadc遺伝子をクローニングした。先ず、上述のように調整したゲノムDNAをテンプレートにして以下に示すPCRを行った。PCRではPfuUltra II fusion HS DNA polymerase(STRATAGEN社製)及び以下のプライマー(下線部は制限酵素サイト)を使用した。
adc-SalI-F:5’-CAC GTC GAC AAG GAG ATA TAA TGT TAA AGG ATG AAG TAA TTA AAC A-3’(配列番号15)
adc-NotI-R:5’-CAC GCG GCC GCT TAC TTA AGA TAA TCA TAT ATA ACT TCA GC-3’(配列番号16)
PCRにおける反応液の組成は、下記の通りとした。
大腸菌において上記ctfA遺伝子、ctfB遺伝子及びadc遺伝子を発現するための発現ベクターを以下のように構築した。先ず、上記で作製したpETDuet-ADCをSalI及びNotIで消化し、0.8%アガロースゲル電気泳動でadc遺伝子を含む753bpの断片を切り出し、QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN社製)を用いて精製した。また、上記で作製したpETDuet-ctfABをSalI及びNotIで消化し、得られた6677bpと上記断片をライゲーションした。得られたベクターをpETDuet-ADC-ctfABと命名した。
Clostridium beijerinckii由来のイソプロパノール脱水素酵素遺伝子であるpdh遺伝子をクローニングした。
PDH-EcoRI-F:5’- GGA ATT CCA TGA AAG GTT TCG CAA TGT T-3’ (配列番号20)
PDH-PstI-R:5’- AAC TGC AGA ACC AAT GCA TTG GTT ACA AAA TGA CTA CGG -3’ (配列番号21)
PCRにおける反応液の組成は、下記の通りとした。
上記で作製したpCDFDuet-thiA、pCDFDuet-orfN、pETDuet-ADC-ctfAB、pCOLADuet-PDHを下記表4に示すA〜Fの組み合わせで、タカラバイオ社製大腸菌BL21(DE3)を形質転換した。A〜Fの発現ベクターの組み合わせを大腸菌BL21(DE3)に形質転換した組み換え大腸菌を、それぞれA/BL21、B/BL21、C/BL21、D/BL21、E/BL21、F/BL21と命名した。
[インレットパラメーター]
インレット温度:260℃
スプリット比:1/20
キャリヤーガス:ヘリウム 1.0ml/分
[オーブン加熱条件]
40℃で5分加熱
5℃/分で75℃まで加熱
100℃/分で260℃まで加熱
[ディテクター条件]
検出器温度:260℃
[Zoom Temp]
Oven:60℃
Loop:150℃
Transfer Line:200℃
[Event Time]
GC Cycle Time:35分
Vial EQ Time:15分
Pressuriz. Time:0.5分
Loop Fill Time:0.2分
Loop EQ Time:0.2分
Inject Time:1.0分
[Vial Parameter]
Shake:HIGH
[その他]
バイアル加圧:15psi
エタノール(比重:0.789)
アセトン(比重:0.789)
イソプロパノール(比重:0.784)
2-ブタノール(比重:0.808)
酢酸(比重:1.05)
上記5物質を適当な濃度に調整し、検量線から%濃度(V/V)を算出し、さらに比重を考慮して重量濃度を計算した。組み換え大腸菌E/BL21の培養液を分析した結果を図1に示す。なお、図2には、上述した標準物質を分析した結果を示す。図1から判るように、同株は主としてイソプロパノールを生産するが、保持時間13.30分にピークが観測された。図2に示した標準物質として分析した2-ブタノールは保持時間13.32分にマスフラグメントパターンとして現れる。したがって、組み換え大腸菌E/BL21は著量の2-ブタノールを生産すると結論づけた。
また、本例で得られた各組み換え大腸菌の2-ブタノールの生産量を下記表7にまとめた。
実施例2では、大腸菌K株に分類される大腸菌NovaBlue(DE3)を使用し、2-ブタノール生合成関連遺伝子であるctfAB遺伝子、adc遺伝子及びpdh遺伝子に加えて、thlA遺伝子を発現させた組み換え大腸菌(組み換え大腸菌E/NB)を作製した。この組み換え大腸菌を実施例1と同様に培養し、培養液に含まれる成分を分析した結果を図4に示した。
Claims (21)
- アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子、及びアセトアセチルCoAから2-プロパノールを合成する代謝経路に関連する2-プロパノール生合成関連遺伝子群が導入された組換え微生物を培養し、培養物から2-ブタノールを取得することを特徴とする2-ブタノールの製造方法。
- 上記アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子は、2分子のアセチルCoAをアセトアセチルCoAに変換する反応を触媒する酵素をコードすることを特徴とする請求項1記載の2-ブタノールの製造方法。
- 上記アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子は、Clostridium acetobutylicum由来のチオラーゼ遺伝子(thlA遺伝子)であることを特徴とする請求項2記載の2-ブタノールの製造方法。
- 上記アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子は、配列番号2記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、又は配列番号2のアミノ酸配列に対して80%以上の一致度を有するアミノ酸配列を有し、2分子のアセチルCoAからアセトアセチルCoAを合成する機能を有するタンパク質をコードするものであることを特徴とする請求項3記載の2-ブタノールの製造方法。
- 上記アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子は、アセチルCoAとマロニルCoAとをアセトアセチルCoAに変換する反応を触媒する酵素をコードすることを特徴とする請求項1記載の2-ブタノールの製造方法。
- 上記アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子は、Streptomyces属の微生物由来の遺伝子(orfN遺伝子)であることを特徴とする請求項5記載の2-ブタノールの製造方法。
- 上記アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子は、配列番号1記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、又は配列番号1のアミノ酸配列に対して80%以上の一致度を有するアミノ酸配列を有し、マロニルCoAとアセチルCoAとからアセトアセチルCoAを合成する機能を有するタンパク質をコードするものであることを特徴とする請求項6記載の2-ブタノールの製造方法。
- 2-プロパノール生合成関連遺伝子群は、アセトアセチルCoA転移酵素遺伝子、アセト酢酸脱炭酸酵素遺伝子及びイソプロパノール脱水素酵素遺伝子からなる群のなかから選ばれる遺伝子であり、上記組換え微生物は、これら2-プロパノール生合成関連遺伝子群の遺伝子のうち内在しない遺伝子が導入されたものであることを特徴とする請求項1記載の2-ブタノールの製造方法。
- アセトアセチルCoA転移酵素遺伝子は、Clostridium acetobutylicum由来のctfA遺伝子及びctfB遺伝子であることを特徴とする請求項8記載の2-ブタノールの製造方法。
- アセト酢酸脱炭酸酵素遺伝子は、Clostridium acetobutylicum由来のadc遺伝子であることを特徴とする請求項8又は9記載の2-ブタノールの製造方法。
- イソプロパノール脱水素酵素遺伝子は、Clostridium beijerinckii由来のpdh遺伝子であることを特徴とする請求項8乃至10いずれか一項記載の2-ブタノールの製造方法。
- 上記組換え微生物は、大腸菌を宿主とした組換え微生物であることを特徴とする請求項1記載の2-ブタノールの製造方法。
- 上記大腸菌はK株であることを特徴とする請求項12記載の2-ブタノールの製造方法。
- Streptomyces属の微生物由来のアセトアセチルCoA合成酵素遺伝子(orfN遺伝子)、及びアセトアセチルCoAから2-プロパノールを合成する代謝経路に関連する2-プロパノール生合成関連遺伝子群が導入された組換え微生物。
- 上記アセトアセチルCoA合成酵素遺伝子は、配列番号1記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、又は配列番号1のアミノ酸配列に対して80%以上の一致度を有するアミノ酸配列を有し、マロニルCoAとアセチルCoAとからアセトアセチルCoAを合成する機能を有するタンパク質をコードするものであることを特徴とする請求項14記載の組換え微生物。
- 2-プロパノール生合成関連遺伝子群は、アセトアセチルCoA転移酵素遺伝子、アセト酢酸脱炭酸酵素遺伝子及びイソプロパノール脱水素酵素遺伝子からなる群のなかから選ばれる遺伝子であり、これら2-プロパノール生合成関連遺伝子群の遺伝子のうち内在しない遺伝子が導入されたものであることを特徴とする請求項14記載の組換え微生物。
- アセトアセチルCoA転移酵素遺伝子は、Clostridium acetobutylicum由来のctfA遺伝子及びctfB遺伝子であることを特徴とする請求項16記載の組換え微生物。
- アセト酢酸脱炭酸酵素遺伝子は、Clostridium acetobutylicum由来のadc遺伝子であることを特徴とする請求項16又は17記載の組換え微生物。
- イソプロパノール脱水素酵素遺伝子は、Clostridium beijerinckii由来のpdh遺伝子であることを特徴とする請求項16乃至18いずれか一項記載の組換え微生物。
- 上記組換え微生物は、大腸菌を宿主とした組換え微生物であることを特徴とする請求項14記載の組換え微生物。
- 上記大腸菌はK株であることを特徴とする請求項20記載の組換え微生物。
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