JP2019506872A - 分子プログラミングツール - Google Patents

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Abstract

本開示は、一部の態様において、分子構造及び可溶性シグナルの記録、並びにプログラムされた分子構造の組織化を可能にする核酸ベースの分子ツールを提供する。

Description

関連出願
本願は、２０１６年２月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／２９６，３１０号、２０１６年２月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／２９９，２０６号、２０１６年１２月２日に出願された米国仮特許出願第６２／４２９，１４９号、及び２０１６年１２月９日に出願された米国仮特許出願第６２／４３２，０１７号の、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ§１１９（ｅ）に対する優先権を主張するものであり、これらの特許出願は参照により本明細書に組み込まれる。
連邦政府による資金提供を受けた研究
本発明は、国立衛生研究所により賦与されたＥＢ０１８６５９；国立科学財団により賦与された１３１７２９１、２０１４１８８、１５４０２１４、及び１３３４１０９；並びに米国国防省、海軍研究局により賦与されたＮ０００１４−１４−１−０６１０、Ｎ０００１４−１３−１−０５９３、及びＮ０００１４−１６−１−２４１０の下で政府の支援を得て実施された。政府は、本発明に一部の権利を有する。
背景
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の特性をコードする情報と、ワトソン・クリック（Watson-Crick）型塩基対相補性を比較的容易にプログラムできることによって、この２０年の間に多様な用途で基質として使用されるＤＮＡが得られた１〜９。さらに、ＤＮＡは、規定された２Ｄ及び３Ｄ形状のナノ構造に自己組織化するようにプログラムされて１０〜１８、生体分子の正確な空間パターン形成１９〜２６、さらには、無機分子の造形２７も可能にする。これらの合成系は、生体分子の核磁気共鳴（ＮＭＲ）構造決定のためのＤＮＡナノ構造２８、細胞経路の条件付き調節２２、２９、３０、並びに薬物送達のためのビヒクルとしてのＤＮＡナノ構造３１、３２の適用に関して進行中の研究により、合成生物学、材料科学、及び生物学的画像の分野で、それらの価値を既に示している。
概要
一部の態様では、分子地形の記録及び再構築を可能にする核酸ベースの分子ツールが本明細書に提供される。ＤＮＡは、ゲノム中の多様な分子機能についての情報をコードすることによって、生命をパターン形成する。ＤＮＡはまた、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Randall K Saiki, et al. Science, 239(4839):487-491, 1988）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）（Paul M Lizardi, et al. Nature genetics, 19(3):225-232, 1998）、及び鎖置換回路（Lulu Qian and Erik Winfree. Science, 332(6034):1196-1201, 201; David Yu Zhang and Georg Seelig. Nature chemistry, 3(2):103-113, 2011）などの多数の合成反応ネットワークのためのテンプレート基質としても役立つ。本開示は、中でも、プライマー交換反応（ＰＥＲ）の概念を導入するが、これは、段階的に、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）の等温合成をパターン形成するために、一部の実施形態では、触媒活性ＤＮＡヘアピン種を用いる。本明細書に提供されるデータは、プライマー交換反応カスケードを用いて、規定の経路に従ってＤＮＡの新生鎖を成長させることができ、さらに、これを用いて、例えば、特定のプライマーシグナルを線上に増幅する合成テロメラーゼを構築することができることを示している。本明細書に提供される別のデータは、溶液中のＲＮＡシグナルをプロセシングし、これに応答するいくつかの機能性システム、例えば、無標識バイオセンサー、タイムレコーダ、論理回路、及び標的シグナルの検出を、独立のＲＮＡ配列について動作する機能性ＤＮＡザイムに変換するナノデバイスなどの実現を明らかにしている。本開示の方法を用いて、等温インサイチュ環境で、任意のｓｓＤＮＡを合成すると共に、例えば、分子デバイスの新たな作製のための基礎を提供することができる。
従って、一部の態様は、中でも、高度に頑健な動的構築物をインサイチュで合成する上での基礎を提供する「プライマー交換」と呼ばれる動的ＤＮＡ回路のための分子プリミティブを提供する。プライマー交換反応（ＰＥＲ）中に、鎖置換ポリメラーゼと、触媒として作用する部分的対分子（例えば、ヘアピン分子）を用いて、個別のヌクレオチド配列（ドメイン）が「成長」核酸鎖に付加される（合成される）（例えば、図１Ａ〜１Ｂを参照）。ＰＥＲは、その触媒活性、モジュール性、頑健性、基本的燃料種（ｄＮＴＰ）、インサイチュ操作、及び単一分子転写物記録と共に、分子プログラミングのための新しいパラダイムを呈示する。任意のユーザ規定配列を有する一本鎖ＤＮＡの等温及び自律的合成のこの方法は、インサイチュ及びインビボのいずれの使用のためにも改変することができる。
本開示の他の態様は、物理的支持を付与する走路の個々の部位として機能し、一部の事例では、成長核酸情報記録のための分子運動の方向及び経路を規定する核酸分子を用いて、化学エネルギー（例えば、ＤＮＡハイブリダイゼーションに関連するエンタルピー又は複合体からのＤＮＡ分子の放出に関連するエントロピー）を機械仕事に変換する分子（例えば、ＤＮＡ）モータシステムを提供する（例えば、図２３Ａ〜２４Ｂを参照）。本明細書に記載するように、分子モータシステムは、一部の実施形態では、必要なとき及び場所でのみ、インサイチュで分子成分のプログラム可能な作製を可能にする。すなわち、分子は、反応が実施されるにつれて、活発に製造され得る。この技術は、分子レベルでの分子環境及び条件の検査を可能にする。また、この技術は、個々の走路部位分子との相互作用から生成された検査記録から分子地形の定量及び再構築も可能にする。特定の環境／地形において１つの走路部位分子から別の走路部位分子へと移動する分子モータとして機能する核酸の成長鎖は、「分子クローラ」（例えば、図２８Ａ〜２８Ｂを参照）及び「分子ウォーカ」（例えば、図２９Ａ〜２９Ｂを参照）と呼ばれる。
本開示の別の態様では、対核酸分子内の距離情報（記録と呼ぶ）を記録することによって標的分子間のナノスケール（又はマイクロスケール）の距離を記録する、自律的ボトムアップ（bottom-up）ツールを提供する。反応中に生成された核酸記録の長さは、測定される距離（例えば、生体分子間の距離）に直接対応する。さらに、各核酸記録は、その配列の一部としての標的分子のアイデンティティをコードすることができる。この分子定規システム（例えば、図３３Ａ〜３４を参照）は、固相又はインサイチュで、標的分子の溶液中の距離を記録することができる。
従って、本開示の一部の態様は、プライマー交換反応（ＰＥＲ）システムを提供し、これは、（ａ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン及び（ｉｉ）トーホールドドメインから５’側に位置する対ドメインを含む初期触媒分子；（ｂ）不対３’トーホールドドメインと相補的な初期プライマー；並びに（ｃ）鎖置換活性を有するポリメラーゼを含む。一部の実施形態では、初期触媒分子は、ヘアピン構造を有することから、３’トーホールドドメインとは反対側の末端（対ドメインから５’側）に位置するループドメインをさらに含む（例えば、図１Ａを参照）。一部の実施形態では、このシステムは、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）をさらに含む。
「ドメイン」は、ドメインが、不対（一本鎖ヌクレオチド）であるか、又は対（二本鎖ヌクレオチド塩基対）であるかによって、それぞれ、ヌクレオチド又はヌクレオチド塩基対の個別の連続した配列を指す。一部の実施形態では、ドメインは、分子内（同じ分子種）及び分子間（２つの個別の分子種間）相補性を定義する目的で、複数のサブドメインを有するものとして記載される。１つのドメイン（又は１つのサブドメイン）は、１つのドメインが、他のドメインのヌクレオチドと塩基対合（ワトソン・クリック型ヌクレオチド塩基対合）して、これら２つのドメインが、対（二本鎖）又は部分的対のドメイン分子種／構造を形成するヌクレオチドを含む場合、別のドメインと「相補的」である。相補的ドメインは、対構造を形成するために完全に（１００％）相補的である必要はないが、一部の実施形態では、完全な相補性が提供される。従って、特定のドメインと「相補的」なプライマーは、例えば、ポリメラーゼの存在下で重合を開始するのに十分な時間にわたって、そのドメインと結合する。例えば、図１Ａは、触媒ヘアピン分子のドメイン「１’」と結合するプライマー「１」を示す。同様に、図１Ｂは、触媒ヘアピン分子のドメイン「２’」と結合するプライマードメイン「２」を示す。
一部の実施形態において、ヘアピンループがない（ヌクレオチドの連続した区間により形成されていない）触媒分子は、「テンプレート鎖」と対合（ハイブリダイズ／結合）した「置換鎖」を含むデュプレックスとして記載されている。図２４（３番目の「デュプレックス」パネル）は、置換鎖「１」（上、短い方の鎖）とテンプレート鎖「１’＋１’」（下、長い方の鎖）の結合によって形成されたデュプレックス触媒分子の一例を示す。
本明細書に提供される触媒分子のいずれか１つは、トーホールドドメインとは反対側の分子の末端に位置する「結合ドメイン」を含み得ることを理解すべきである。結合ドメインは、例えば、図１Ａ〜１Ｃに示すようなヘアピンループ（ループドメイン）であってもよいし、又は結合ドメインは、互いに共有結合架橋した相補的ヌクレオチド（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個の共有結合架橋ヌクレオチド塩基対）を含んでもよい。一部の実施形態では、結合ドメインは、例えば、長さが少なくとも１０ヌクレオチド（例えば、ドメインが、ＰＥＲ条件の全体を通して対を維持するように）の単純に安定した対ドメインである。
本開示の一部の態様は、プライマー交換反応（ＰＥＲ）システムを提供し、これは、（ａ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）分子の３’サブドメインと分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）ループドメインを含む初期触媒ヘアピン分子；（ｂ）不対３’トーホールドドメインと相補的な初期プライマー；並びに（ｃ）鎖置換活性を有するポリメラーゼを含む。ヘアピン分子は、一般に、分子内ヌクレオチド塩基対により形成され、これは、核酸の同じ連続した鎖のドメイン同士の結合を指す。例えば、図１Ａは、５’（上流）ドメイン「２」と３’（下流）ドメイン「２’」の結合により形成されるヘアピン分子を示す。５’ドメイン「２」は、デュプレックス触媒分子の置換鎖と同様に機能し、３’ドメイン「２’」は、デュプレックス触媒分子のテンプレート鎖と同様に機能することを理解すべきである。
本開示の他の態様は、プライマー交換反応（ＰＥＲ）システムを提供し、これは、（ａ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン及び（ｉｉ）置換鎖と、トーホールドドメインを含有するテンプレート鎖とのヌクレオチド塩基対により形成される、トーホールドドメインから５’側に位置する対ドメインを含む初期触媒分子；（ｂ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン及び（ｉｉ）置換鎖と、第２触媒分子のトーホールドドメインを含有するテンプレート鎖とのヌクレオチド塩基対により形成される、トーホールドドメインから５’側に位置する対ドメインを含む第２触媒分子（ここで、第２触媒分子の３’トーホールドドメインは、初期触媒分子の置換鎖と相補的である）；（ｃ）初期触媒分子の不対３’トーホールドドメインと相補的な初期プライマーを含む。一部の実施形態では、ＰＥＲシステムは、鎖置換活性を有するポリメラーゼをさらに含む。一部の実施形態では、ＰＥＲシステムは、ｄＮＴＰをさらに含む。
一部の実施形態では、ＰＥＲシステムは、（ａ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）分子の５’サブドメインと分子の３’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）ループドメインを含む初期触媒ヘアピン分子；（ｂ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）第２ヘアピン分子の３’サブドメインと第２ヘアピン分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）ループドメインを含む第２触媒ヘアピン分子（ここで、第２ヘアピン分子の３’トーホールドドメインは、初期ヘアピン分子の５’サブドメインと相補的である）；並びに（ｃ）初期ヘアピン分子の不対３’トーホールドドメインと相補的な初期プライマーを含む。
本開示のさらに他の態様は、プライマー交換反応（ＰＥＲ）方法を提供し、この方法は、（ａ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン及び（ｉｉ）置換鎖と、トーホールドドメインを含有するテンプレート鎖とのヌクレオチド塩基対により形成される、トーホールドドメインから５’側に位置する対ドメインを含む初期触媒分子、（ｂ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン及び（ｉｉ）置換鎖と、第２触媒分子のトーホールドドメインを含有するテンプレート鎖とのヌクレオチド塩基対により形成される、トーホールドドメインから５’側に位置する対ドメインを含む第２触媒分子（ここで、第２触媒分子の３’トーホールドドメインは、初期触媒分子の置換鎖と相補的である）、（ｃ）初期触媒分子の不対３’トーホールドドメインと相補的なプライマー、（ｄ）鎖置換活性を有するポリメラーゼ、並びに（ｅ）デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を反応バッファー中で合わせることにより、反応混合物を形成した後；一本鎖核酸記録を生成するのに十分な時間にわたって、核酸重合、鎖置換及びアニーリングを達成する条件下で反応混合物をインキュベートすることを含む。
一部の実施形態では、ＰＥＲ方法は、（ａ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）分子の３’サブドメインと分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）ヘアピンループドメインを含む初期触媒ヘアピン分子、（ｂ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）第２ヘアピン分子の３’サブドメインと第２ヘアピン分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）ループドメインを含む第２触媒ヘアピン分子（ここで、第２ヘアピン分子の３’トーホールドドメインは、初期ヘアピン分子の５’サブドメインと相補的である）、（ｃ）初期ヘアピン分子の不対３’トーホールドドメインと相補的なプライマー、（ｄ）鎖置換活性を有するポリメラーゼ、並びに（ｅ）デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を反応バッファー中で合わせることにより、反応混合物を形成した後；一本鎖核酸記録を生成するのに十分な時間にわたって、核酸重合、鎖置換及びアニーリングを達成する条件下で反応混合物をインキュベートすることを含む。
一部の実施形態では、ＰＥＲ方法は、（ａ）鎖置換活性を有するポリメラーゼ及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の存在下で、インプットプライマーを触媒分子と接触させるが、ここで、触媒分子は、（ｉ）不対３’トーホールドドメイン及び（ｉｉ）置換鎖と、トーホールドドメインを含有するテンプレート鎖とのヌクレオチド塩基対により形成される、トーホールドドメインから５’側に位置する対ドメインを含み、ここで、インプットプライマーは、ヘアピン分子の３’トーホールドドメインと相補的であり；（ｂ）触媒分子の対ドメインを介してプライマーを伸長することにより、置換鎖を置換して、伸長アウトプットプライマーを形成し；（ｃ）置換鎖とテンプレート鎖同士のヌクレオチド塩基対によって、ヘアピン分子からの延長アウトプットプライマーを置換し；（ｄ）鎖置換活性を有するポリメラーゼ及びｄＮＴＰの存在下で、（ｃ）の置換された延長アウトプットプライマーを第２触媒分子と接触させることを含み、ここで、第２触媒分子は、（ｉ）不対３’トーホールドドメイン及び（ｉｉ）置換鎖と、第２触媒分子のトーホールドドメインを含有するテンプレート鎖とのヌクレオチド塩基対により形成される、トーホールドドメインから５’側に位置する対ドメインを含み、また、延長アウトプットプライマーは、第２触媒分子の３’トーホールドドメインと相補的である。一部の実施形態では、触媒分子は、触媒ヘアピン分子である。
さらに、（ａ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）分子の３’サブドメインと分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）結合ドメインを含む触媒ヘアピン分子（ここで、（ａ）（ｉ）及び（ａ）（ｉｉ）のドメインは、タンデム反復配列を形成する）、（ｂ）（ｉ）３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）分子の３’サブドメインと分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）結合ドメインを含む少なくとも１つの他の触媒ヘアピン分子（ここで、（ｂ）（ｉ）及び（ｂ）（ｉｉ）のドメインは、シグナル配列により分断されたタンデム反復配列を形成し、（ｂ）（ｉ）の３’トーホールドドメインは、プロテクター鎖と不可逆的に結合している）、並びに（ｃ）（ａ）の触媒ヘアピン分子の３’トーホールドドメインと相補的で、且つ（ｂ）の触媒ヘアピン分子の３’トーホールドドメインと相補的であるドメインを含む核酸プライマーを含む、組成物も本発明に提供される。２つの核酸は、それらが、ＰＥＲ条件下で、互いに結合し、互いから解離することができれば、互いに「不可逆的に結合した」とみなされる。「タンデム反復配列」の一例を図２１Ａ〜２１Ｂに示す（ａ＊−ａ＊を参照）。「シグナル配列によって分断されたタンデム反復配列」の一例も図２１Ａ〜２１Ｂに示す（ａ＊−Ｓ＊−ａ＊を参照）。シグナル配列は、一部の実施形態において、タンデム反復ドメイン中のヌクレオチドの順序とは異なる順序で配列される少なくとも１ヌクレオチド、又は少なくとも２ヌクレオチド（例えば、１〜２０ヌクレオチド、又は少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０ヌクレオチド）であってもよい。一部の実施形態では、プロテクター鎖は、（ｂ）の少なくとも１つの他の触媒ヘアピン分子の３’トーホールドドメインと、任意選択で、ループドメインを介して連結される（例えば、図４２Ａを参照）。
本開示の一部の態様は、一本鎖核酸を生成する方法を提供し、この方法は、（ａ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン及び（ｉｉ）置換鎖と、トーホールドドメインを含有するテンプレート鎖とのヌクレオチド塩基対により形成される、トーホールドドメインから５’側に位置する対ドメインを含む初期触媒分子、（ｂ）ヘアピン分子各々が、（ｉ）不対３’トーホールドドメイン及び（ｉｉ）置換鎖と、トーホールドドメインを含有するテンプレート鎖とのヌクレオチド塩基対により形成される、トーホールドドメインから５’側に位置する対ドメインを含む、複数の異なる触媒分子（ここで、各触媒分子の３’トーホールドドメインは、複数のうち１つの他の触媒分子の置換鎖と相補的である）；（ｃ）初期触媒分子の３’トーホールドドメインと相補的な初期プライマー、（ｄ）鎖置換活性を有するポリメラーゼ、並びに（ｅ）デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を反応バッファー中で合わせることにより、反応混合物を形成した後；初期プライマーよりも長い一本鎖核酸記録を生成するのに十分な時間にわたって、核酸重合、鎖置換及びアニーリングを達成する条件下で反応混合物をインキュベートすることを含む。
一部の実施形態では、一本鎖核酸を生成する方法は、（ａ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）分子の３’サブドメインと分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）ヘアピンループドメインを含む初期ヘアピン分子、（ｂ）ヘアピン分子各々が、（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）複数のうちの１ヘアピン分子の３’サブドメインと、複数のうちの１ヘアピン分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）ループドメインを含む、複数の異なるヘアピン分子（ここで、各ヘアピン分子の３’トーホールドドメインは、複数のうちの１つの他のヘアピン分子の５’サブドメインと相補的である）；（ｃ）初期ヘアピン分子の３’トーホールドドメインと相補的な初期プライマー、（ｄ）鎖置換活性を有するポリメラーゼ、並びに（ｅ）デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を反応バッファー中で合わせることにより、反応混合物を形成した後；初期プライマーよりも長い一本鎖核酸記録を生成するのに十分な時間にわたって、核酸重合、鎖置換及びアニーリングを達成する条件下で反応混合物をインキュベートすることを含む。
本開示の他の態様は、分子事象の間の時間を計測する方法を提供し、この方法は、（ａ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン及び（ｉｉ）置換鎖と、トーホールドドメインを含有するテンプレート鎖とのヌクレオチド塩基対により形成される、トーホールドドメインから５’側に位置する対ドメインを含む初期触媒分子、（ｂ）触媒分子各々が、（ｉ）不対３’トーホールドドメイン及び（ｉｉ）置換鎖と、トーホールドドメインを含有するテンプレート鎖とのヌクレオチド塩基対により形成される、トーホールドドメインから５’側に位置する対ドメインを含む、複数の異なる触媒分子（ここで、各触媒分子の３’トーホールドドメインは、複数のうちの１つの他の触媒分子の置換鎖と相補的である）、（ｃ）初期触媒分子の不対３’トーホールドドメインと相補的な初期プライマー、（ｄ）鎖置換活性を有するポリメラーゼ、並びに（ｅ）デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を反応バッファー中で合わせることにより、反応混合物を形成し；第１の分子事象に反応混合物を曝露し；一本鎖核酸記録を生成するのに十分な時間にわたって、核酸重合、鎖置換及びアニーリングを達成する条件下で反応混合物をインキュベートした後；第２の分子事象に反応混合物を曝露することを含む。
一部の実施形態では、分子事象同士の時間を計測する方法は、（ａ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）分子の３’サブドメインと分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）ヘアピンループドメインを含む初期触媒ヘアピン分子、（ｂ）ヘアピン分子各々が、（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）ヘアピン分子の３’サブドメインと、ヘアピン分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）ループドメインを含む、複数の異なる触媒ヘアピン分子（ここで、各ヘアピン分子の３’トーホールドドメインは、複数のうちの１つの他のヘアピン分子の５’サブドメインと相補的である）；（ｃ）初期ヘアピン分子の不対３’トーホールドドメインと相補的な初期プライマー、（ｄ）鎖置換活性を有するポリメラーゼ、並びに（ｅ）デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を反応バッファー中で合わせることにより、反応混合物を形成した後；第１の分子事象に反応混合物を曝露し；一本鎖核酸記録を生成するのに十分な時間にわたって、核酸重合、鎖置換及びアニーリングを達成する条件下で反応混合物をインキュベートした後；第２の分子事象に反応混合物を曝露することを含む。
本開示のまた別の態様は、分子モータシステムを提供し、これは、（ａ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン及び（ｉｉ）置換鎖と、トーホールドドメインを含有するテンプレート鎖とのヌクレオチド塩基対により形成される、トーホールドドメインから５’側に位置する対ドメインを含む初期核酸分子；（ｂ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン及び（ｉｉ）置換鎖と、トーホールドドメインを含有するテンプレート鎖とのヌクレオチド塩基対により形成される、トーホールドドメインから５’側に位置する対ドメインを含む第２核酸分子（ここで、第２核酸分子の不対３’トーホールドドメインは、初期核酸分子の置換鎖と相補的である）；並びに（ｃ）初期核酸分子の不対３’トーホールドドメイン内に位置するヌクレオチドと相補的なプライマーを含む。
本開示のさらに別の態様は、分子記録システムを提供し、これは、（ａ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）分子の３’サブドメインと分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）ループドメインを含む初期ヘアピン分子（ここで、初期ヘアピン分子は、標的生体分子と連結している）；（ｂ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）分子の３’サブドメインと分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）ループドメインを含む第２ヘアピン分子（ここで、第２ヘアピン分子は、標的生体分子と連結しており、また、初期ヘアピン分子の５’サブドメインは、第２ヘアピン分子の５’サブドメインと相補的である）；（ｃ）一方は、初期ヘアピン分子の不対３’トーホールドドメインと相補的であり、他方は、第２ヘアピン分子の不対３’トーホールドドメインと相補的である、２つのプライマー；（ｄ）分子各々が、（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）分子の３’サブドメインと分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）ループドメインを含む、複数の触媒ヘアピン分子（ここで、複数の各ヘアピン分子の５’サブドメインは、複数のうちの１つの他のヘアピン分子の５’サブドメインと相補的であり、複数のうち１つのヘアピン分子の３’トーホールドドメインは、初期ヘアピン分子の５’サブドメインと相補的であり、また、複数のうちもう１つのヘアピン分子の３’トーホールドドメインは、第２ヘアピン分子の５’サブドメインと相補的である）；並びに（ｅ）鎖置換活性を有するポリメラーゼを含む。
本開示のさらに別の態様は、標的生体分子間の距離を記録する方法を提供し、この方法は、反応バッファー中で、（ａ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）分子の３’サブドメインと分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）ループドメインを含む初期ヘアピン分子（ここで、初期ヘアピン分子は、標的生体分子と連結している）；（ｂ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）分子の３’サブドメインと分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）ループドメインを含む第２ヘアピン分子（ここで、第２ヘアピン分子は、標的生体分子と連結しており、また、初期ヘアピン分子の５’サブドメインは、第２ヘアピン分子の５’サブドメインと相補的である）；（ｃ）一方は、初期ヘアピン分子の不対３’トーホールドドメインと相補的であり、他方は、第２ヘアピン分子の不対３’トーホールドドメインと相補的である、２つのプライマー；（ｄ）分子各々が、（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）分子の３’サブドメインと分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）ループドメインを含む、複数のヘアピン分子（ここで、複数のヘアピン分子各々の５’サブドメインは、複数のうちの１つの他のヘアピン分子の５’サブドメインと相補的であり、複数のうち１つのヘアピン分子の３’トーホールドドメインは、初期ヘアピン分子の５’サブドメインと相補的であり、複数のうちもう１つのヘアピン分子の３’トーホールドドメインは、第２ヘアピン分子の５’サブドメインと相補的である）；並びに（ｅ）鎖置換活性を有するポリメラーゼ、及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を合わせることにより、反応混合物を形成した後；二本鎖核酸記録を生成するのに十分な時間にわたって、核酸重合、鎖置換及びアニーリングを達成する条件下で反応混合物をインキュベートすることを含む。
プライマー交換反応（ＰＥＲ）、又は多段階ＰＥＲの単一ステップ（サイクル）の一例の図を示す。ヘアピンは触媒として作用して、１ドメインを有するプライマー上に２ドメインを付加する。 ＰＥＲ、又は多段階ＰＥＲの単一ステップを示す。 プライマー交換反応（ＰＥＲ）の一例の別の図を示す：（ｉ）触媒ヘアピンを用いて、形態ａｂの転写物を生成する、プライマー交換反応。（ｉｉ）停止配列としてＧ−Ｃ対を使用するヘアピンを用いた反応インプリメンテーションの一例。ここには、他の停止配列を記載する。（ｉｉｉ）プライマー交換反応サイクル。初めに、プライマーａが、触媒ヘアピンに結合する（ステップ１）。次に、ｂドメインを、それが停止配列に達するまで、鎖置換ポリメラーゼと共にａに連結する（ステップ２）。分岐移動により、合成されたｂドメインを置換する（ステップ３）。ａｂ転写物が、ヘアピンから解離し、ヘアピンが再利用される（ステップ４）。（ｉｖ）単一プライマー交換反応についての反応時間シリーズ及びヘアピン濃度勾配を示すＰＡＧＥ変性ゲル。いずれの実験についても、プライマー濃度は、１００ｎＭに固定し、反応物を１０μＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＣＴＰと一緒に３７℃でインキュベートした。レーン１１及び１３は、同一条件に対応する。 ＰＥＲカスケード例の図を示す。（ｉ）プライマー配列の自律的な段階的成長のためにいくつかのＰＥＲヘアピンと他の試薬を組み合わせる概略図。（ｉｉ）ヘアピンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥによりパターン形成された５つの伸長ステップの反応概略図。（ｉｉｉ）存在するヘアピン種の異なるサブセットによる差別的延長を明らかにする変性ゲル。反応物は、濃度１００ｎＭのプライマー、１０ｎＭのヘアピン、各々１０μＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＣＴＰと一緒に３７℃で４時間インキュベートした。（ｉｖ）折り紙構造のための４０ステープル鎖の並列合成の概略図、並びに折り紙境界が重なって凝集したこれらの構造のうちの３つのＡＦＭイメージ。 状態遷移図の例を示す。ヘアピンは触媒として作用して、１及び２ドメインを有するプライマー上に３ドメインを付加する。 ＰＥＲが、規定経路に従って鎖を伸長したことを明らかにするイメージを示す。 ＰＥＲが、規定経路に従って鎖を伸長したことを明らかにするイメージを示す。 ＰＥＲを用いて、合成テロメラーゼを構築することができることを明らかにするイメージを示す。１つのヘアピンを用いて、特定の１０ヌクレオチド配列をコピーするシステムをインプリメントした。レーン（Ａ）は、ヘアピンを含まないプライマーを示し、レーン（Ｂ）〜（Ｄ）は、様々な濃度のヘアピンを用いた結果を示す。反応物は、３７℃で４時間インキュベートした。 多段階ＰＥＲを説明するイメージを示す。 ＰＥＲをツールとして用いることができるいくつかの適用例を示し、トリガーされた複合体ナノ構造の組織化（パネル１）、時間を計測する分子時計及びシグナルを経時的に制御するタイマー（パネル２）、並びにシグナルに経時的に応答して差別化し、これを記録するシステム（パネル３）を含む。 複合体ナノ構造のトリガー組織化のためにＰＥＲを用いることができるいくつかの適用例を示す。上のパネルは、固定長さの長い鎖のトリガー組織化を示す。中央のパネルは、任意の２Ｄ及び３Ｄ形状に折り畳まれる長い鎖を示す。下のパネルは、樹状骨格構造の組織化を示し、これも、様々な形状に折り畳むことができる。 長いスカフォールド鎖の組織化をスケールアップするための２つのアプローチ例を示す。図８Ａは、触媒ヘアピンの数の増加を示し、図８Ｂは、各ヘアピン内のコピー領域の長さの増加を示す。 ＰＥＲを用いて、核酸ナノ構造の組織化をトリガーするための３つのアプローチ例を示す。図９Ａは、トリガーされた従来のＤＮＡ折り紙ナノ構造の組織化の一例を示す。図９Ｂは、トリガーされた一本鎖タイルナノ構造の組織化の一例を示す。図９Ｃは、トリガーされた一本鎖ＤＮＡ折り紙ナノ構造の組織化の一例を示す。 ＰＥＲを用いた樹状組織化のメカニズムの一例を示す。図１０Ａは、１つのヘアピンに加え、一本鎖燃料（核酸）を用いた、指数関数的成長速度論を有するトリガーされたデンドリマーの合成を示す。図１０Ｂは、樹状構造の一例を示す。図１０Ｃは、ステープル鎖（短いオリゴヌクレオチド）を用いて、特定の２Ｄ及び３Ｄ形状に折り畳まれる樹状骨格を示す。 時間を計測するための分子時計として、また、シグナルを経時的に制御するためのタイマーとして、ＰＥＲを用いることができるいくつかの適用例を示す。上のパネルは、経過する時間を計測するための分子時計として用いられるＰＥＲの概略図を示す。中央のパネルは、プログラム可能な時間的駆動のための分子タイマーとして用いられるＰＥＲの概略図を示す。下のパネルは、多重化時間的記録及び駆動のために使用されるＰＥＲの概略図を示す。 シグナル検出モジュールの例を示す。図１２Ａは、条件付き状態遷移についての概要を示す。図１２Ｂは、不可逆的プライマー交換ステップを含む検出を示す。図１２Ｃは、特定の光波長でヘアピンを活性化及び不活性化する可逆的架橋反応５７を示す。図１２Ｄは、シグナルの非存在下でヘアピン上の結合部位を閉塞するプロテクター鎖を用いて検出されるｍＲＮＡシグナルを示す。一部の事例では、このインプットは、ｓｓＤＮＡ又は別の一本鎖核酸であってもよい。一部の実施形態では、このトリガーシグナルは、個別のＰＥＲ反応により合成される鎖である。図１２Ｅは、ＰＣＲによりトーホールド領域を付加することによって達成される二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の検出を示す４５。図１２Ｆは、小分子及びタンパク質標的を認識して、ヘアピンをブロック解除するアプタマーを示す。 分子時計の例を示す。図１３Ａは、テロメア化状態への遷移をトリガーするインプットと、これを停止する第２のインプットを示す。図１３Ｂは、図１２Ａ〜１２Ｆに示すように、状態遷移毎に用いられる１つのヘアピンを示す。図１３Ｃは、２つのインプットの間に経過した時間を示すアウトプットの長さを示す。 分子タイマーの例を示す。図１４Ａは、遅延回路を用いるタイマーを示し、これによって、プライマーは、駆動の前に固定数の状態遷移を経る。図１４Ｂは、状態遷移毎に１つのヘアピンを示す。図１４Ｃは、アウトプット曲線を示す。 ＰＥＲを用いて、タンパク質合成のパルスを記録する例を示す。図１５Ａは、トーホールドスイッチ作動の時間的制御のための基本原理を提供する、アウトプット１及びアウトプット２の間にプログラムされた遅延を示す。図１５Ｂは、分子インプリメンテーションの一例を示す。図１５Ｃは、トーホールドスイッチを作動させ、後に停止するようにプログラムされた回路により生成されるアウトプット配列を示す。図１５Ｄは、アウトプットのトレースを示す。 ＰＥＲ論理の例を示す。論理演算ＡＮＤ（図１６Ａ〜１６Ｃ）、ＯＲ（図１６Ｄ〜１６Ｆ）及びＮＯＴ（図１６Ｇ〜１６Ｉ）は、ＰＥＲ反応グラフを用いてインプリメントすることができる。 ＰＥＲを用いた論理計算の例を示す。図１７Ａは、デジタル論理回路の一例を示す。図１７Ｂは、６つの状態を含むシステムを示す。図１７Ｃは、シグナル検出（図１２Ａ〜１２Ｆ）及び回路に組み込まれた論理（図１６Ａ〜１６Ｉ）モジュールを含む分子インプリメンテーションを示す。 シグナルに応答して差別化し、シグナルを経時的に記録するシステムをインプリメントするために、ＰＥＲを用いることができる２つの適用例を示す。上のパネルは、発達性自己組織化の一例を示し、これにより、発達経路に従って様々な構造の成長がインサイチュで起こる。下のパネルは、経時的なシグナルの時間トレースを記録する分子ティッカーテープの一例を示す。 ＰＥＲを用いた発達性自己組織化の例を示す。図１９Ａは、経時的に遭遇したシグナル（Ａ〜Ｅ）に基づいて状態差別化を経るプライマーを示す。図１９Ｂは、形状の合成をインサイチュでトリガーする差別化状態を示す。図１９Ｃは、図１２Ａ〜１２Ｆに示すようにインプリメントされた状態遷移を示す。 ＰＥＲを用いた分子ティッカーテープの例を示す。図２０Ａは、クロックの役割を果たす１つの遷移、次にシグナルタイプに従い１つの遷移を有するテロメア化回路を示す。図２０Ｂは、シグナル履歴がその中にコードされた、図２０Ｃの転写物を生成するシグナルトレースを示す。図２０Ｄは、１つの構成的に活性のテロメア化ヘアピンと各シグナルの検出器を必要とするシステムを示す。 １シグナルヘアピンシステムを示す。（図２１Ａ）プライマー上にドメインをコピーするヘアピンを用いて、連続的にドメインを転写物配列に付加することにより反応の時間を計測する。（図２１Ｂ）転写物記録上で、反復ドメインａの前に２つの追加塩基（Ｓドメイン）をコピーするヘアピンは、シグナルの役割を果たす。（図２１Ｃ）仮定のシグナル濃度曲線。（図２１Ｄ）時間依存的シグナル濃度に応じて、反復ａドメイン内に挿入されるシグナルドメインＳを含有する転写物の概略図。 アダプタータグ付けの一例を示す。記録によって、初期プライマー配列から転写物が生成された後、２つのスプリント配列を用いて、アダプター配列を転写物のいずれかの末端に導入し、連結させる。 実験Ｂ及びＣからのシグナル濃度の統計学的推定を示す。（図２３Ａ）実験Ｂは、５００ｐＭの一定シグナル濃度を使用した（上）が、実験Ｃは、階段シグナル関数を使用し、１時間後２００ｐＭで一定になった。（図２３Ｂ）１７９の総シグナルを有する３００の転写物（実験Ｂ、上）及び１２７の総シグナルを有する１，０００の転写物（実験Ｃ、下）に基づく２つの実験のシグナル濃度の推定。実線は、事後分布の平均（バーンイン後の１００サンプルに基づく）を示し、灰色部分は、２つの推定値の９５％信用域を示す。実験Ｂの事後分布の時間平均値が５００ｐＭと等しくなるように、両方の実験を正規化した。 単一の触媒ヘアピン分子（左側パネル）、テザリングされた触媒ヘアピン分子（中央のパネル）及びデュプレックス触媒分子（右側パネル）を示す。 分子標的検出のためのＰＥＲシステムの一例を示す。 ＰＥＲナノデバイスの例を示す。（図２６Ａ）ｍｉＲＮＡを検出して、独立した遺伝子を阻害する、ナノデバイスの概略図。（図２６Ｂ）４文字コード合成の停止配列として用いられる、合成ヌクレオチド、ｉｓｏ−ｄＧ及びｉｓｏ−ｄＣ。（図２６Ｃ）ナノデバイスのシステムセットアップ及び反応図。発癌性ｍｉＲ−１９ａ配列は、Ａ、Ｂ、及びＣヘアピンによる１０〜２３ＤＮＡザイム配列（ＤＺ−ＴＷＴ）の合成を介して、Ｔｗｉｓｔ遺伝子（ＴＷＴ）の断片の切断をトリガーする。（図２６Ｄ）付加されたＤＮＡザイム（ＤＺ−ＴＷＴ）によるｍｉＲＮＡ標的（ｍｉＲ−１９ａ）の配列分解。新生プライマー鎖の結合部分は、配列上方の線により示され、ＤＮＡザイムの触媒ドメインは、点線で示される。（図２６Ｅ）インキュベーション溶液中の異なるヘアピンを考慮して、ｍｉＲＮＡ及びＴｗｉｓｔ ｍＲＮＡ断片状態を確認するＰＡＧＥ変性ゲル。反応物は、３７℃で４時間インキュベートした。 ＰＥＲを用いた無標識バイオセンサーの例を示す。（図２７Ａ）単一ＰＥＲヘアピンで合成テロメラーゼをインプリメントするための概略図。（図２７Ｂ）異なるヘアピン濃度の下でのテロメア化を示すＰＡＧＥ変性ゲル。プライマーは、所与のヘアピン濃度を用いて、３７℃で４時間インキュベートした。（図２７Ｃ）無標識バイオセンサーの概略図であり、ここで、ｍｉＲＮＡ標的は、蛍光テロメア鎖の合成を活性化する。（図２７Ｄ）バイオセンサーのシステム構成要素及び反応図。ゲーテッドヘアピン（Ａ）及びテロメラーゼヘアピン（Ｂ）は、ｍｉＲＮＡシグナルの検出に反応して、ヒトテロメア配列TTAGGGの反復配列を濃縮するように設計されており、この配列にThioflavin（ＴｈＴ）が挿入される。（図２７Ｅ）１０ｎＭ ｍｉＲＮＡシグナルの存在下で条件付きテロメア化を示すネイティブＰＡＧＥゲル。標的検出は、アンバーフィルタユニット（ｖｉｓ）を介したブルーライトトランスイルミネータを用いて視覚化することができ、反応物の蛍光も、Typhoonスキャナー（FAM）で視覚化した。 ＰＥＲを用いた論理計算の例を示す。（図２８Ａ）ＲＮＡインプットを含む論理式を評価する演算の概略図。（図２８Ｂ）ｍｉＲ−１９ａ ＯＲ ＴＷＴゲート反応構成要素と、異なるＲＮＡインプットに応答する転写物生成を示すＰＡＧＥ変性ゲル。真のアウトプットは、点線で示される特定の長さの転写物を探すことによって読み取られる。（図２８Ｃ）ｍｉＲ−１９ａ ＡＮＤ ＴＷＴ、（図２８Ｄ）ＮＯＴ ｍｉＲ−２１、及び（図２８Ｅ）（ｍｉＲ−１９ａ ＯＲ ＴＷＴ）ＡＮＤ（ＮＯＴ ｍｉＲ−２１）についての反応セットアップ及びＰＡＧＥ変性ゲル結果も示す。 ＰＥＲを用いた事象記録の例を示す。（図２９Ａ）時間依存的ＲＮＡシグナルに応答してＰＥＲ転写物を生成する事象レコーダの概略図。（図２９Ｂ）ゲーテッドヘアピンの活性化のためのトーホールド交換メカニズム。（図２９Ｃ）レコーダのためのシステム構成要素及び反応図。４つのゲーテッドヘアピン（Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤ）を用いて、２つのＲＮＡ標的−ｍｉＲ−１９ａとＴｗｉｓｔ ｍＲＮＡ（ＴＷＴ）の断片を目撃した様々な順序に応じて、異なる配列の合成をプログラムする。（図２９Ｄ）ＰＡＧＥ変性ゲルは、３７℃で５時間の反応物中への、１及び３時間の時点で、様々なＲＮＡシグナルの急上昇について記録された様々な長さの転写物を示す。更なる詳細については、方法のセクションを参照されたい。 ＰＥＲをインビボでインプリメントする方法の一例を示す。インビボＰＥＲカスケードのための２つの戦略を図示する。（図３０Ａ）第１の戦略では、形質転換又はトランスフェクションにより、構成要素を細胞に直接導入する。一部の細胞は、全ての構成要素を受容して、好適なＰＥＲ合成を可能にするであろう。（図３０Ｂ）第２の戦略は、プラスミド又はゲノムのいずれかにヘアピンＰＥＲ構成要素をコードし、ヘアピンが、ＲＮＡオリゴのリアルタイム合成をプログラムするためのＲＮＡ構築物として発現される。 図３１Ａは、分子クローラの基本的な操作メカニズムを示す。上の列は、単一部位での単位操作を描く。中央の列は、２つの隣接する部位の間のクローリングの１ステップを描く。下の列は、３部位走路の初期及び最終状態を描く。生成された記録は、複数のメカニズムにより放出され得る。ある鎖種の末端で矢印が指す丸は、ポリメラーゼによる伸長に対する保護のための修飾（例えば、逆方向ｄＴ）を示す。図３１Ｂは、２Ｄ空間における分子クローラの運動を示す。基質上に固定されたプローブ部位は、単純化された一本線として描かれており、補助ドメインは、明瞭化のために省かれている。クローラは、様々な経路に従って空間の周りを移動することができ、複数種の記録を生成し、これは、産物の横に示す数の鎖によって示される。 図３２Ａは、分子ウォーカの基本的な操作メカニズムを示す。上の列は、単一部位での単位操作を描く。中央の列は、２つの隣接する部位の間のウォーキングの１ステップを描く。下の列は、３部位走路の初期及び最終状態を描く。生成された記録は、複数のメカニズムにより放出され得る。ある鎖種の末端で矢印が指す丸は、ポリメラーゼによる伸長に対する保護のための修飾（例えば、逆方向ｄＴ）を示す。図３２Ｂは、２Ｄ空間における分子ウォーカの運動を示す。基質に固定されたプローブ部位は、単純化された一本線として描かれており、補助ドメインは、明瞭化のために省かれている。ウォーカは、様々な経路に従って空間の周りを移動することができ、複数種の記録を生成し、これは、産物の横に示す数の鎖によって示される。 図３３Ａは、分子標的を検査して、部位の数を反映する記録を生成する分子モータを示す。図３３Ｂは、結合価を計数するために生物系に適用される分子モータを示す。長さ分布は、標的の結合価を反映している。図３３Ｃは、モデルシステムとしての核孔複合体と、参照データとしての超解像画像を示す。左側のパネルは、広視野を示し、中央のパネルは、６つのサブユニットを含む単一の核孔複合体を示す。右側のパネルは、ヒストグラムと、線形化円強度投影処理の適合状態を示し、これは、サブユニット間の約３０ｎｍの距離を明らかにする。スケールバー、３００ｎｍ（左側パネル）及び３０ｎｍ（中央パネル）。図３３Ｄは、各部位でコードされたユニークな情報と共に、ユニークな情報をコピー、記録及び報告するクローラを示す。図３３Ｅは、所与の分子地形を検査するいくつかの分子モータを示し、各々が異なる経路に従い、空間情報を反映するユニークな記録を生成する。集合的分析によって、分子地形の再構築が可能になる。 図３４Ａは、ＤＮＡ分子内で記録された距離を示す。ＤＮＡ記録の影の付いた末端は、標的のユニークなバーコードを示す。図３４Ｂは、分子定規システムを用いたＤＮＡ記録生成の１ラウンドを示す。 図３５Ａは、ＤＮＡ標的の配置とともに変化する記録のサイズを示す。図３５Ｂは、４つの距離、ｄ１；ｄ２；ｄ３又はｄ４の１つと対応する、生成された２８の異なる記録と一緒に、ＤＮＡナノ構造上のＮＰＣ模倣物を示す。 図３６Ａ〜３６Ｈは、分子定規システムの詳細なメカニズムを示す。 図３７Ａは、二本鎖ＤＮＡロッドの２つの末端の間の距離を記録する分子定規の一例を示す。 図３７Ｂは、二本鎖ＤＮＡロッドの２つの末端の間の距離を記録する分子定規の一例を示す。 図３７Ｃは、二本鎖ＤＮＡロッドの２つの末端の間の距離を記録する分子定規の一例を示す。 図３８Ａは、分子距離を記録する実験の結果を示す。 図３８Ｂは、分子距離を記録する実験の結果を示す。 図３９Ａ〜３９Ｂは、実施例２１に記載する分子定規距離記録実験（図３８Ａ）からのバンドの定量を示し、それらを距離（ＤＮＡヌクレオチド）の関数としてプロットする（図３９Ａ）。ピークは、予測された距離と一致する。 図３８Ｂで説明した分子定規距離記録実験からのバンドを定量し、それらを距離（ナノメートル）の関数としてプロットする。ピークは、予測された距離と一致する。最も短い距離のＤＮＡロッド（５．４ｎｍ）だけが、その距離と一致する単一記録を生成するため、このプロットにはグラフ化していないことに留意されたい。 タンパク質「フィンガープリント」法の一例を示す。 図４１Ａ〜４１Ｄは、４構成要素分子記録システムの一例を示す。 図４２Ａ〜４２Ｄは、３構成要素分子記録システムの一例を示す。 分子モータシステムの運動に関するデータを示す。図４３Ａは、ＤＮＡナノ構造プラットホーム上で試験した走路設計の概略図（上のパネル）と、モータが記録反応を終えた後の走路の分子詳細（下のパネル）を示す。図４３Ｂは、検索及びＰＣＲ増幅後に、生成された記録が、変性ゲル電気泳動の下で、予測された長さ範囲（１１８ｎｔ）で現れることを実証する。図４３Ｃは、走路部位及びモータの原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）による視覚化を示す。モータを付加する前（左側パネル）、灰色をしたプローブ部位は、点として現れており；各プローブは、２つの緩い一本鎖ループ（典型的には３Ｔ）により固定されているため、ＡＦＭチップの走査により、走路位置の不鮮明な画像が得られる。２つの黒い点は、参照点である。記録反応後（右側パネル）、この時点で、走路部位は、モータにより連結され、互いに保持されて、三脚のような特徴として現れる。各折り紙長方形のサイズは、大まかに８０ｎｍ×１００ｎｍである。 別の分子クローラメカニズムを示す。２つのプライマー結合部位、ドメイン「ａ」及び「ｂ」を含むプローブを描く。 別の分子クローラメカニズムを示す。プローブと結合して、置換ポリメラーゼにより延長する、ヘアピンプローブに対して過剰の自由プライマーを示す。 別の分子クローラメカニズムを示す。更なる重合を遅くする、又は停止するために用いられるいくつかの方法（プローブ上のメチル化ＲＮＡ塩基、「ｂ＊」と「ｂ」の間の末端ヌクレオチドでのミスマッチ、プローブ上のｉｓｏ−ｄＣヌクレオチド、並びに各「ａ＊」プライマーの５’末端上の対応するｉｓｏ−ｄＧヌクレオチドなど）を示す。 別の分子クローラメカニズムを示す。低濃度の自由「ｂ」ドメイン鎖を時折結合することによる新たな連結バーコード鎖の停止を示し、これによって、ポリメラーゼは、新しい連結鎖をコピーして、それを全てのプローブから放出する。従って、プローブは、更なる使用のために再生される。 別の分子クローラメカニズムを示す。最終結果：連結バーコードコピーの幾分ランダムなパッチワークを示す。 別の分子クローラメカニズムを示す。表示のドメインを含むプローブ配列の例を示す。配列は、上から下に向かって、配列２〜４に対応する。
説明
本明細書に記載するツールは、分子構造及び可溶性シグナルの記録並びに分子構造のプログラムされた組織化を可能にする。例えば、本開示は、（ａ）インサイチュで、又は治療薬／診断薬としてインビボで、トリガーされた複雑な構造の組織化を操作するために用いることができる一本鎖ＤＮＡの等温及び自律的合成のための組成物及び方法、（ｂ）経過した時間を計測するための分子時計及び時間遅延後のシグナルを制御するためのタイマー、並びに（ｃ）環境シグナルに応じて差別化し、これらのシグナルを経時的に記録する環境応答性ナノマシンを提供する。本開示は、例えば、Ｃｒｙｏ−ＥＭイメージングのためのマーカのインサイチュ成長、汚染物質の長期環境監視、条件付き遺伝子調節、及びトリガーされたインサイチュでの毒素被包などの変革的適用のための基礎を提供する。
プライマー交換反応
本開示のこの態様の基本は、図１Ａ〜１Ｂに描くプライマー交換反応（ＰＥＲ）である。短いプライマー配列から核酸を合成するためのこの酵素による方法は、等温、例えば、典型的には３７℃で操作し、燃料としてｄＮＴＰしか必要としない。反応物を合わせて、長い核酸配列を成長させるＰＥＲカスケードを形成することができ、これらの合成反応物は、存在する多重化環境シグナルに応じて作製することができる。これによって、リアルタイムで合成される転写物への、具体的なｍＲＮＡ種の存在などのシグナル情報の空間・時間的記録が可能になる。さらに、一部の実施形態では、合成された転写物は、任意の配列を有し得るため、合成された鎖自体が、特定の条件に応答して細胞内でプログラムされた機能的挙動を果たす。
基本的なプライマー交換反応は、３つの大まかなステップで起こる。最初に、プライマー（ドメイン１）は、伸長を促進する触媒分子（例えば、ヘアピン分子）と可逆的に結合する。次に、鎖置換ポリメラーゼが、プライマーを延長して、停止配列（又は重合を停止する他の分子）に到達するまで、触媒分子中のステム配列（ドメイン２’）をコピーする。伸長が停止した後、分子の置換されたステム領域は、分子上のその反対鎖と再びハイブリダイズして、それが自発的に触媒分子から解離することができ、且つ、溶液中の別の同族触媒分子と自由に相互作用する程度まで、プライマー配列を置換することができる。このプライマー交換反応は、特定のプログラム可能な方法で、成長する鎖に配列を付加することができる。これらのモジュラー反応単位を他のこうした反応物と組み合わせて、特定の機能を有する分子プログラムを作製することができる。これらの反応物は全て、等温で動作し、溶液中のｄＮＴＰを動力源とする。プライマー交換反応物は、１つの分子（例えば、ヘアピン）のアウトプットプライマー配列を備えることにより、容易に互いに連結することができ（触媒された反応物は、別のものに対するインプットプライマーとしての役割を果たす）、それらの反応関係は、図２（第１列）に示すように、状態遷移図の抽象概念で表すことができる。プライマーの状態は、その３’末端のドメインにより示され、図中、各々の有効辺は、単一のヘアピン種を用いて実現される。例えば、状態１及び状態２の間の辺は、２ドメイン配列を有する１ドメインで終了する鎖の伸長を触媒するヘアピンの存在を示す。この抽象的概念は、システムの機能を表し、ヘアピン及びプライマードメインに直接編集することができる。
このプログラム可能性のモデルは、環境トリガーに応答して触媒分子を条件付きで露出させることにより、さらに明確にすることができ、これによって、プライマー交換反応物は、局所環境に動的に応答することができる。これは、例えば、以下に論じるように、シグナル記録及びプロセシング適用を可能にする。
１つのヘアピン触媒反応物のアウトプットプライマー配列を、別のものに対するインプットプライマーとして機能させることにより、プライマー交換反応物（ＰＥＲ）を一緒に、反応カスケードに連結することが容易にできる（図２Ａ）。図２Ａ（ｉ）は、５ドメイン配列の合成のために使用される分子成分を示す。各ドメインを結び付けるために１つのヘアピンが用いられており、図２Ａ（ｉｉ）に反応プロセスを示す。図２Ａ（ｉｉｉ）は、溶液中に存在する５つのヘアピンの様々なサブセットを用いて実施される合成反応の結果を示す。図２Ａ（ｉｖ）は、８０の異なる触媒ヘアピン分子と４０のプライマーを用いた４０のＤＮＡ折り紙ステープル鎖の合成をワンポット反応で実施することができることを示す。スカフォールド鎖と組み合わせ、アニールすると、これらのステープルは、ＤＮＡ折り紙構造を形成し、これらの構造は、一緒に凝集して、長い構造を形成することができる。
一部の実施形態では、プライマー交換反応（ＰＥＲ）システムは、経路から外れた漏出反応を数桁の規模で低減することによって、頑健なシステムに動力を供給する。ＰＥＲシステムに動力を供給する鎖置換重合カスケードは、新しい情報を動的に合成し、活性化エネルギーは、漏出重合反応を開始する目的のために高い。これらの低漏出システムを用いて、一部の実施形態では、頑健且つスケーラブルな分子システムを構築することができる。さらに、本明細書に記載されるＰＥＲシステムは、溶液中の核酸鎖のセットに自由エネルギー地形を昇らせて、大空間のプログラム可能な挙動、並びに無酵素（例えば、ポリメラーゼ）系では熱力学的に不可能な操作の達成可能性を賦与することができる。エネルギーは、重合反応を介してシステムに導入され、ＰＥＲは、燃料として安価なｄＮＴＰにより動力を連続的に供給される。一部の実施形態では、ｄＮＴＰ濃度は、プライマー交換反応システムが、長時間にわたって動作する上で十分なものであり、濃度の調節又はｄＮＴＰの補充によって、この動作時間はさらに延長される。さらにまた、ＰＥＲシステムは、鎖をインサイチュで合成する。例えば、固定細胞内部に局在化したプライマーは、適切な位置で直接重合することができるため、密集した細胞環境中に大きなオリゴヌクレオチドを送達する課題が解消される。この能力は、大きな構造をインサイチュで組織化する（成長させる）多くの可能性と共に、広範な適用の余地を切り開いた。さらには、ＰＥＲシステムは、一部の実施形態において、１分子解像を有し、溶液中のプライマー分子毎に１つの転写物を自動的に成長させる。各転写物は、状態遷移図グラフ中にそれが横断した状態の順序組織化を経時的に示し、これは、ゲル上で読み取ることができる進行の長さ情報と、シーケンシングによって取得することができるより正確な情報を含む。これらの転写物は、例えば、環境シグナルが溶液中に存在したときの転写物を経時的に記録するために、操作することができる。
一部の実施形態において、個別のＰＥＲ合成反応は、条件付きで活性になり（図２３Ａ〜２３Ｄ及び図２６Ａ〜２６Ｄ）、考えられるプログラム可能な挙動の大きく且つ多様なセット、並びにインサイチュで環境シグナルを記録する機会を可能にするように、プログラムすることができる。図２３Ａ〜２３Ｄは、発癌性ｍｉＲＮＡ標的、ｍｉＲ−１９ａが、マウス細胞中でアポトーシスを促進することが判明したＤＮＡザイム、ＤＺ−ＴＷＴの合成をどのようにしてトリガーすることができるかを示す。ＤＮＡザイム挙動は、ＤＺ−ＴＷＴ標的、ＴＷＴの断片の切断を視覚化することによって、確認される（図２３Ｅ）。図２６Ａ〜２６Ｄは、同じ２つ標的、ｍｉＲ−１９ａ及びＴＷＴが、溶液中で遭遇する順序を記録するために、どのようにしてプライマー交換反応を用いることができるかを示す。
全体として、本明細書に記載されるプライマー交換反応は、分子プログラミングのための新規のパラダイムを、その触媒活性、モジュール性、頑健性、基礎燃料種（ｄＮＴＰ）、インサイチュ操作、及び１分子転写記録と共に提供する。
プライマー交換組成物及びシステム
触媒核酸分子（「触媒分子」）は、一般に、不対（一本鎖）３’トーホールドドメインと、３’トーホールドドメイン（一部の実施形態では、これに直接隣接して）から５’側の対（二本鎖）ドメインを含む。「触媒ヘアピン分子」は、ループドメインも含む。プライマー交換反応の動態学は、例えば、触媒分子（例えば、触媒分子の１つ若しくは複数のドメイン）の長さ、組成及び濃度を変更することによって、制御することができる。
触媒ヘアピン（例えば、例示的な例として図１Ａを参照）は、ヘアピンループドメイン（ループ様構造）に連結したヘアピンステムドメイン（例えば、サブドメイン「２」とサブドメイン「２’」の分子内結合により形成された）に連結した３’トーホールドドメイン（「１’」）を含む。ループドメインのない触媒分子の例を図２４に示す（「デュプレックス」）。触媒分子（例えば、触媒ヘアピン分子）の長さは変動し得る。一部の実施形態では、触媒分子は、２５〜３００ヌクレオチド長である。例えば、触媒分子は、２５〜２５０、２５〜２００、２５〜１５０、２５〜１００、２５〜５０、５０〜３００、５０〜２５０、５０〜２００、５０〜１５０又は５０〜１００ヌクレオチド長であってよい。一部の実施形態では、触媒分子は、３０〜５０、４０〜６０、５０〜７０、６０〜８０、７０〜９０、８０〜１００、１００〜１２５、１００〜１５０又は１００〜２００ヌクレオチド長であってよい。一部の実施形態では、触媒分子は、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９．５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００ヌクレオチド長であってよい。触媒分子は、一部の実施形態において、３００ヌクレオチドより長いか、又は２５ヌクレオチドより短い。
「トーホールドドメイン」とは、触媒分子の３’末端に位置するヌクレオチドの不対配列を指し、プライマー（又はプライマーのプライマードメイン）のヌクレオチド配列と相補的である（且つ結合する）。トーホールドドメインの長さは、変動し得る。一部の実施形態では、トーホールドドメインは、５〜４０ヌクレオチド長である。例えば、トーホールドドメインは、２〜３５、２〜３０、２〜２５、２〜２０、２〜１５、２〜１０、５〜３５、５〜３０、５〜２５、５〜２０、５〜１５、５〜１０、１０〜４０、１０〜３５、１０〜３０、１０〜２５、１０〜２０、１０〜１５、１５〜４０、１５〜３５、１５〜３０、１５〜２５、１５〜２０、２０〜４０、２０〜３５、２０〜３０、２０〜２５、２５〜４０、２５〜３５、２５〜３０、３０〜４０、３０〜３５又は３５〜４０ヌクレオチド長であってよい。一部の実施形態では、トーホールドドメインは、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５又は４０ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、トーホールドドメインは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長である。トーホールドドメインは、一部の実施形態において、４０ヌクレオチドより長いか、又は５ヌクレオチドより短い。
初期プライマー（又はプライマードメイン）は、触媒分子の３’不対（一本鎖）トーホールドドメインと結合して、プライマー交換反応を開始する。この反応（例示的な例として図１Ａを参照）では、初期インプットプライマー（「１」）は、触媒分子のトーホールドドメイン（「１’」）と結合し、反応溶液中に存在する鎖置換ポリメラーゼによるプライマーの延長が、分岐移動プロセスによって、触媒分子のステムドメインのサブドメインの１つ（「２」）を置換する。全体的効果は、ヘアピンステムドメインのサブドメインの１つ（「２」）が、延長された（新しく合成された）プライマードメインで置換されることである。
触媒分子の「対ドメイン」又は「ステムドメイン」は、触媒分子の不対トーホールドドメイン（一部の実施形態では、これに直接隣接して）から５’側に位置するヌクレオチドの対配列（例えば、ワトソン・クリック型核酸塩基対）を指す。触媒分子の対ドメインは、置換鎖と、トーホールドドメインを含有するテンプレート鎖とのヌクレオチド塩基対により形成される。触媒ヘアピン分子の対ステムドメインは、触媒ヘアピン分子の２つのサブドメインの分子内塩基対（同じ分子内のヌクレオチド同士の塩基対）：例えば、触媒ヘアピンの５’末端に位置するサブドメインと結合（ハイブリダイズ）したトーホールドドメインから５’側に位置する内部／中央サブドメインにより形成される。対ドメインの長さは、変動し得る。一部の実施形態では、対ドメインは、５〜４０ヌクレオチド長である。例えば、対ドメインは、５〜３５、５〜３０、５〜２５、５〜２０、５〜１５、５〜１０、１０〜４０、１０〜３５、１０〜３０、１０〜２５、１０〜２０、１０〜１５、１５〜４０、１５〜３５、１５〜３０、１５〜２５、１５〜２０、２０〜４０、２０〜３５、２０〜３０、２０〜２５、２５〜４０、２５〜３５、２５〜３０、３０〜４０、３０〜３５又は３５〜４０ヌクレオチド長であってよい。一部の実施形態では、対ドメインは、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５又は４０ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、対ドメインは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長である。対ドメインは、一部の実施形態において、４０ヌクレオチドより長いか、又は５ヌクレオチドより短い。
対ドメインは、一般に、触媒分子の２つのサブドメインの分子内塩基対により形成されるが、この対ドメインは、少なくとも１つのミスマッチ対（例えば、ＡとＣ若しくはＧの対、又はＴとＣ若しくはＧの対）を含有し得ることは理解すべきである。一部の実施形態では、ステムドメインは、１〜５のミスマッチヌクレオチド塩基対を有する。例えば、対ドメインは、１、２、３、４又は５のミスマッチヌクレオチド塩基対を有し得る。
一部の実施形態では、置換ポリメラーゼによるプライマー（プライマー結合部位に結合してる）の延長は、重合を終結させる触媒分子中の分子又は修飾の存在によって終結する。従って、一部の実施形態では、本開示の触媒分子は、重合を終結させる分子又は修飾を含む。重合を終結させる分子又は修飾（「ストッパー」）は、典型的には、対ドメインによって、重合がプライマーの延長を終結させるように、触媒分子の対ドメイン（例えば、ステムドメイン）内に位置する。ヘアピンの形状で配置された触媒分子の場合、重合を終結させる分子又は修飾は、対ステムドメインとループドメインとの間に位置してもよい。一部の実施形態では、重合を終結させる分子は、合成非ＤＮＡリンカー、例えば、Int Spacer 9（iSp9）又はSpacer 18（Integrated DNA Technologies（IDT））などのトリエチレングリコールスペーサである。ポリメラーゼによる重合を終結させる任意の非ネイティブリンカーを本明細書に記載のように使用してもよいことは理解すべきである。こうした分子及び修飾の他の非限定的な例として、三炭素結合（/iSpC3/）（IDT）、ACRYDITE（商標）（IDT）、アデニル化、アジ化物、ジゴキシゲニン（ＮＨＳエステル）、コレステリル−ＴＥＧ（IDT）、I-LINKER（商標）（IDT）、及び３−シアノビニルカルバゾール（ＣＮＶＫ）並びにこれらの変異体が挙げられる。典型的には、しかし常にではないが、短いリンカー（例えば、iSp9）は、より高速の反応時間をもたらす。
一部の実施形態では、重合を終結させる分子は、それぞれ、シトシン及びグアニンの化学変異体であるiso-dG及びiso-dC（IDT）などの単一又は対の非天然ヌクレオチド配列である。Iso-dCは、Iso-dGと塩基対合（水素結合）するが、ｄＧとはしない。同様に、Iso-dGは、Iso-dCと塩基対合するが、ｄＣとはしない。ヘアピンの反対側の対のストッパー位置にこれらのヌクレオチドを組み込めば、ポリメラーゼは、その位置に付加すべき溶液中の相補的ヌクレオチドを持たないため、停止される。
一部の実施形態では、「ストッパー」修飾の性能の効率は、反応物中のｄＮＴＰの濃度を（例えば、２００μＭから）１００μＭ、１０μＭ、１μＭ、又はそれ以下まで低下させることによって向上する。
重合を終結させる分子又は修飾の含有は、分子又は修飾が対ではないため、触媒分子の二本鎖ドメイン（例えば、ヘアピン構造のステムドメイン）中に「バルジ」を生成することが多い。従って、一部の実施形態では、触媒分子は、分子又は修飾の反対側に、単一のヌクレオチド（例えば、チミン）、少なくとも２つの同じヌクレオチド（例えば、チミン二量体（ＴＴ）若しくは三量体（ＴＴＴ））、又は非天然修飾を含有するように設計される。
触媒ヘアピンの「ループドメイン」は、ステムドメイン（に隣接して）の末端ループ様構造を形成するヌクレオチドの、主として不対の配列を指す。ループドメインの長さは、変動し得る。一部の実施形態では、ループドメインは、３〜２００ヌクレオチド長である。例えば、ループドメインは、３〜１７５、３〜１５０、３〜１２５、３〜１００、３〜７５、３〜５０、３〜２５、４〜１７５、４〜１５０、４〜１２５、４〜１００、４〜７５、４〜５０、４〜２５、５〜１７５、５〜１５０、５〜１２５、５〜１００、５〜７５、５〜５０又は５〜２５ヌクレオチド長であってよい。一部の実施形態では、ループドメインは、３〜１０、３〜１５、３２〜１０、３〜２５、３〜３０、３〜３５、３〜４０、３〜３５、３〜４０、３〜４５、３〜５０、４〜１０、４〜１５、４〜１０、４〜２５、４〜３０、４〜３５、４〜４０、４〜３５、４〜４０、４〜４５又は４〜５０ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ループドメインは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４５、４６、４７、４８、４９又は５０ヌクレオチド長である。ループドメインは、一部の実施形態において、３００ヌクレオチドより長い。
一部の実施形態では、触媒分子は、ヘアピンループドメインを含まない。例えば、触媒分子は、単純に、ステムドメイン（隣接するループドメインを含まない）と同様の、対ドメインと隣接する３’不対トーホールドドメインを含むデュプレックス（例えば、図２４「デュプレックス」を参照）であってもよい。ループドメインを含まない触媒分子は、１区間（例えば、１０以上の）ヌクレオチド塩基対の間の架橋又はヌクレオチド塩基相補性によって、３’トーホールドドメインと反対側の末端で安定化してもよい。
触媒ヘアピン以外に、プライマー交換反応システムは、インプットプライマー又はアウトプットプライマーと呼ばれるプライマーを含む。「プライマー」は、別の核酸と結合すると、ポリメラーゼの存在下で、重合の開始点となる核酸である。本明細書で使用される場合、プライマーは、典型的に、触媒分子のトーホールドドメインと相補的なヌクレオチド配列（ドメイン）を有する（例えば、図１Ａ左上の分子「１」、を参照；また、図１Ｂ左上の分子「１＋２」も参照されたい）。「インプットプライマー」は、触媒分子と結合して、プライマー交換反応を開始するプライマーである。「アウトプットプライマー」は、プライマー交換反応の各ステップの終了時に触媒分子から放出される延長産物である。アウトプットプライマーは、触媒分子からの解離後、プライマー交換反応の別の（次の）ステップでインプットプライマーの役割を果たし得る。
プライマー交換反応の完全な「ステップ」を図１Ａに示す。インプットプライマー（「１」）は、触媒分子のトーホールドドメイン（「１’」）と結合して、プライマー交換反応を開始する。ポリメラーゼ（例えば、鎖置換ポリメラーゼ）及びｄＮＴＰを含有する反応溶液中の触媒分子と結合すると、初期プライマーは、対ドメインを介して伸長され、対ドメイン中のサブドメイン（「２」）を置換する。置換されたサブドメイン（「２」）は、続いて、その相補的サブドメイン（「２’」）との結合（再アニーリング）について延長プライマー（「１＋２」）と競合し、延長アウトプットプライマー「１＋２」を置換する。これによって、プライマー交換反応のステップが完了する。その後、置換されたアウトプットプライマー「１＋２」は、次の反応ステップで、引き続きインプットプライマーとして機能し得る。
例えば、図１Ｂに示すように、プライマー交換反応の別のステップで、置換されたアウトプットプライマー「１＋２」は、インプットプライマーとしての役割を果たし、そのプライマードメイン「２」を介して別の触媒分子のトーホールドドメイン「２’」に結合することにより、プライマー交換反応における別のステップを開始する。ポリメラーゼ及びｄＮＴＰを含有する反応溶液中の触媒分子と結合すると、インプットプライマー「１＋２」は、対ドメインを介して伸長され、対ドメインのサブドメイン（「３」）を置換する。この置換されたサブドメイン（「３」）は、続いて、その相補的サブドメイン（「３’」）との結合（再アニーリング）について延長プライマー（「１＋２＋３」）と競合し、これにより、延長アウトプットプライマー「１＋２＋３」を置換する。これによって、プライマー交換反応の別のステップが完了する。その後、置換されたアウトプットプライマー「１＋２＋３」は、次の反応ステップで、引き続きインプットプライマーとして機能し得る。
一部の実施形態では、プライマー又はプライマードメイン（触媒分子のトーホールドドメインと結合するヌクレオチド配列）は、１０〜５０ヌクレオチド長である。例えば、プライマー又はプライマードメインは、１０〜４５、１０〜４０、１０〜３５、１０〜３０、１０〜２５、１０〜２０、１０〜１５、１５〜５０、１５〜４５、１５〜４０、１５〜３５、１５〜３０、１５〜２５、１５〜２０、２０〜５０、２０〜４５、２０〜４０、２０〜３５、２０〜３０、２０〜２５、２５〜５０、２５〜４５、２５〜４０、２５〜３５、２５〜３０、３０〜５０、３０〜４５、３０〜４０、３０〜３５、３５〜５０、３５〜４５、３５〜４０、４０〜５０、４０〜４５又は４５〜５０ヌクレオチド長であってよい。一部の実施形態では、プライマー又はプライマードメインは、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、プライマー又はプライマードメインは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長である。プライマー又はプライマードメインは、一部の実施形態において、５０ヌクレオチドより長いか、又は１０ヌクレオチドより短い。プライマーの完全長は、少なくとも部分的に、付加（重合）配列の数及び長さに応じて変動し、これらが、反応物中に存在する触媒分子の数及び長さに左右されることは理解すべきである。
本明細書に記載するプライマーは、検出可能な分子（例えば、蛍光又は化学発光シグナルなどの検出可能なシグナルを発する分子）に連結（で標識）してもよい。一部の実施形態では、標識は、蛍光色素である。蛍光色素又は他の蛍光／化学発光分子と連結したプライマーは、単純に「蛍光プライマー」と呼ばれる。本明細書で使用することができる蛍光色素の例として、限定はしないが、ヒドロキシクマリン、メトキシクマリン、Alexa Fluor、アミノクマリン、Cy2、FAM、Alexa fluor 405、Alexa fluor 488、Fluorescein FITC、Alexa fluor 430、Alexa fluor 532、HEX、Cy3、TRITC、Alexa fluor 546、Alexa fluor 555、R-phycoerythrin（PE）、Rhodamine Red-X、Tamara、Cy3.5 581、Rox、Alexa fluor 568、Red 613、Texas Red、Alexa fluor 594、Alexa fluor 633、Allophycocyanin、Alexa fluor 647、Cy5、Alexa fluor 660、Cy5.5、TruRed、Alexa fluor 680、Cy7及びCy7.5が挙げられる。検出可能なシグナルを発する他の蛍光色素及び分子は、本開示に包含される。
一部の実施形態では、検出可能な分子は、プライマーではなく、むしろ触媒分子に連結される。
一部の実施形態では、検出可能な分子は、例えば、図２７Ｄに示すように、成長する核酸鎖に組み込まれる。従って、一部の実施形態では、検出可能な分子は、チオフラビン（Thioflavin）（ＴｈＴ）であり、これは、ヒトテロメア配列TTAGGGの連結反復配列中に挿入される。他の検出可能な挿入分子は本明細書に包含される。
一部の実施形態では、プライマーは、生体分子に連結される。生体分子としては、例えば、核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）及びタンパク質が挙げられる。生体分子は、治療、予防、診断又はイメージング用分子であってよい。一部の実施形態では、生体分子は、癌関連遺伝子若しくはタンパク質、又はＦＤＡ承認若しくは潜在的薬物標的などの疾患関連又は薬物関連生体分子である。一部の実施形態では、生体分子は、酵素、抗原、受容体、リガンド、膜タンパク質、分泌されたタンパク質、又は転写因子である。
一部の実施形態では、触媒分子は、生体分子に連結される。
プライマー交換反応は、ポリメラーゼの使用を必要とする。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、ＤＮＡ鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ（鎖置換ポリメラーゼ）などのＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡＰ）である。「鎖置換」は、合成中に遭遇する下流のＤＮＡを置換する能力を意味する。本明細書に記載されるように、使用することができるＤＮＡ鎖置換活性を有するポリメラーゼの例として、限定はしないが、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、NEB #M0269）、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、ラージフラグメント（例えば、NEB #M0275）、又はＢｓｕ ＤＮＡポリメラーゼ、ラージフラグメント（例えば、NEB #M0330）が挙げられる。鎖置換活性を有する他のポリメラーゼを用いてもよい。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼである。
一部の実施形態では、ポリメラーゼは、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼである。こうした実施形態において、反応条件は、次の通りであってよい：精製済ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で補充した１×反応バッファー（例えば、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、４ｍＭ ＤＴＴ）、ｐＨ７．５、３０℃でインキュベート。
一部の実施形態では、ポリメラーゼは、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、ラージフラグメントである。こうした実施形態において、反応条件は、次の通りであってよい：１×反応バッファー（例えば、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％TRITON（登録商標）X-100）、ｐＨ８．８、６５℃でインキュベート。
一部の実施形態では、ポリメラーゼは、Ｂｓｕ ＤＮＡポリメラーゼである。こうした実施形態において、反応条件は、次の通りであってよい：１×反応バッファー（例えば、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ）、ｐＨ７．９、３７℃でインキュベート。
プライマー交換反応システム中のプライマー、触媒分子及びｄＮＴＰの濃度は、例えば、具体的な適用、及びその具体的な適用に要求される速度論に応じて変動し得る。
プライマー交換反応中のプライマーの濃度は、例えば、１０ｎＭ〜１０００ｎＭであってよい。一部の実施形態では、プライマー交換反応中のプライマーの濃度は、１０〜２０、１０〜３０、１０〜４０、１０〜５０、１０〜６０、１０〜７０、１０〜８０、１０〜９０、１０〜１００、１０〜１２５、１０〜１５０、１０〜２００、２５〜５０、２５〜７５、２５〜１００、２５〜１５０、２５〜２００、５０〜７５、５０〜１００、５０〜１５０又は５０〜２００ｎＭである。一部の実施形態では、プライマー交換反応中のプライマーの濃度は、１００〜２００、１００〜３００、１００〜４００、１００〜５００、１００〜６００、１００〜７０、１００〜８００、１００〜９００又は１００〜１０００ｎＭである。一部の実施形態では、プライマー交換反応中のプライマーの濃度は、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５又は２００ｎＭである。一部の実施形態では、プライマー交換反応中のプライマーの濃度は、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００又は１０００ｎＭである。プライマー交換反応中のプライマーの濃度は、１０ｎＭ未満又は１０００ｎＭ超であってもよい。
プライマー交換反応中の触媒分子（例えば、触媒ヘアピン）の濃度は、例えば、５ｎＭ〜１０００ｎＭであってよい。一部の実施形態では、プライマー交換反応中の触媒分子の濃度は、５〜１０、５〜２０、５〜３０、５〜４０、５〜５０、５〜６０、５〜７０、５〜８０、５〜９０、５〜１００、５〜１２５、５〜１５０、５〜２００、１０〜５０、１０〜７５、１０〜１００、１０〜１５０、１０〜２００、２５〜７５、２５〜１００、２５〜１２５又は２５〜２００ｎＭである。一部の実施形態では、プライマー交換反応物中の触媒分子の濃度は、１０〜２００、１０〜３００、１０〜４００、１０〜５００、１０〜６００、１０〜７０、１０〜８００、１０〜９００又は１０〜１００ｎＭである。一部の実施形態では、プライマー交換反応物中の触媒分子の濃度は、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５又は２００ｎＭである。一部の実施形態では、プライマー交換反応物中の触媒分子の濃度は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ｎＭである。プライマー交換反応物中の触媒分子の濃度は、５ｎＭ未満又は１０００ｎＭ超であってもよい。
プライマー交換反応中のプライマーと触媒分子の比は、２：１〜１００：１であってよい。一部の実施形態では、プライマーと触媒分子の比は、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１又は２０：１である。一部の実施形態では、プライマーと触媒分子の比は、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１又は９０：１である。
プライマー交換反応中の異なる触媒分子の数は、非限定的である。プライマー交換反応は、１〜１０１０個の異なる触媒分子（各々、例えば、特定のトーホールドドメイン配列を有する）を含んでもよい。一部の実施形態では、プライマー交換反応は、１〜１０、１〜１０２、１〜１０３、１〜１０４、１〜１０５、１〜１０６、１〜１０７、１〜１０８、１〜１０９、１〜１０１０個、又はそれ以上の異なる触媒分子を含む。一部の実施形態では、プライマー交換反応は、１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２５、１〜３０、１〜３５、１〜４０、１〜４５、１〜５０、１〜５５、１〜６０、１〜６５、１〜７０、１〜７５、１〜８０、１〜８５、１〜９０、１〜９５、１〜１００、５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜３０、５〜３５、５〜４０、５〜４５、５〜５０、５〜５５、５〜６０、５〜６５、５〜７０、５〜７５、５〜８０、５〜８５、５〜９０、５〜９５、５〜１００、１０〜１５、１０〜２０、１０〜２５、１０〜３０、１０〜３５、１０〜４０、１０〜４５、１０〜５０、１０〜５５、１０〜６０、１０〜６５、１０〜７０、１０〜７５、１０〜８０、１０〜８５、１０〜９０、１０〜９５又は１０〜１００個の異なる触媒分子を含む。一部の実施形態では、プライマー交換反応は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５個の異なる触媒分子を含む。触媒分子は、例えば、トーホールドドメインが互いに異なっていれば、互いに異なる。
プライマー交換反応の速度論は、例えば、温度、時間、バッファー／塩条件、及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）濃度を変化させることにより制御され得る。ほとんどの酵素と同様、ポリメラーゼは、イオン強度、ｐＨ及び存在する金属イオンの種類（例えば、ナトリウムイオン対マグネシウムイオン）をはじめとする様々なバッファー条件に対して感受性である。従って、プライマー交換反応が実施される温度は、例えば、４℃〜６５℃（例えば、４℃、２５℃、３７℃、４２℃又は６５℃）の範囲で変動し得る。一部の実施形態では、プライマー交換反応が実施される温度は、４℃〜２５℃、４℃〜３０℃、４℃〜３５℃、４℃〜４０℃、４℃〜４５℃、４℃〜５０℃、４℃〜５５℃、４℃〜６０℃、１０〜２５℃、１０℃〜３０℃、１０℃〜３５℃、１０℃〜４０℃、１０℃〜４５℃、１０℃〜５０℃、１０℃〜５５℃、１０℃〜６０℃、２５℃〜３０℃、２５℃〜３５℃、２５℃〜４０℃、２５℃〜４５℃、２５℃〜５０℃、２５℃〜５５℃、２５℃〜６０℃、２５℃〜６５℃、３５℃〜４０℃、３５℃〜４５℃、３５℃〜５０℃、３５℃〜５５℃、３５℃〜６０℃、又は３５℃〜６５℃である。一部の実施形態では、プライマー交換反応は室温で実施されるが、他の実施形態では、プライマー交換反応は、３７℃で実施される。
プライマー交換反応は、３０分（ｍｉｎ）〜２４時間（ｈｒ）にわたって実施（インキュベート）してよい。一部の実施形態では、プライマー交換反応は、１０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、６０分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１８時間又は２４時間にわたって実施される。
デオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰ）は、プライマー交換反応を駆動する「燃料」である。従って、一部の実施形態では、プライマー交換反応の速度論は、反応物中のｄＮＴＰの濃度に大きく依存する。プライマー交換反応物中のｄＮＴＰの濃度は、例えば、２〜１０００μＭであってよい。一部の実施形態では、プライマー交換反応物中のｄＮＴＰの濃度は、２〜１０μＭ、２〜１５μＭ、２〜２０μＭ、２〜２５μＭ、２〜３０μＭ、２〜３５μＭ、２〜４０μＭ、２〜４５μＭ、２〜５０μＭ、２〜５５μＭ、２〜６０μＭ、２〜６５μＭ、２〜７０μＭ、２〜７５μＭ、２〜８０μＭ、２〜８５μＭ、２〜９０μＭ、２〜９５μＭ、２〜１００μＭ、２〜１１０μＭ、２〜１２０μＭ、２〜１３０μＭ、２〜１４０μＭ、２〜１５０μＭ、２〜１６０μＭ、２〜１７０μＭ、２〜１８０μＭ、２〜１９０μＭ、２〜２００μＭ、２〜２５０μＭ、２〜３００μＭ、２〜３５０μＭ、２〜４００μＭ、２〜４５０μＭ、２〜５００μＭ、２〜６００μＭ、２〜７００μＭ、２〜８００μＭ、２〜９００μＭ又は２〜１０００μＭである。例えば、プライマー交換反応物中のｄＮＴＰ濃度は、２μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、５０μＭ、５５μＭ、６０μＭ、６５μＭ、７０μＭ、７５μＭ、８０μＭ、８５μＭ、９０μＭ、９５μＭ、１００μＭ、１０５μＭ、１１０μＭ、１１５μＭ、１２０μＭ、１２５μＭ、１３０μＭ、１３５μＭ、１４０μＭ、１４５μＭ、１５０μＭ、１５５μＭ、１６０μＭ、１６５μＭ、１７０μＭ、１７５μＭ、１８０μＭ、１８５μＭ、１９０μＭ、１９５μＭ又は２００μＭであってよい。一部の実施形態では、プライマー交換反応物中のｄＮＴＰの濃度は、１０〜２０μＭ、１０〜３０μＭ、１０〜４０μＭ、１０〜５０μＭ、１０〜６０μＭ、１０〜７０μＭ、１０〜８０μＭ、１０〜９０μＭ又は１０〜１００μＭである。
一部の実施形態では、ｄＮＴＰ変異体を使用する。例えば、ＰＥＲシステムは、ホットスタート／クリーンアンプ（hot start/clean amp）ｄＮＴＰ、ホスホロチオエートｄＮＴＰ、又は蛍光ｄＮＴＰを使用し得る。他のｄＮＴＰ変異体を用いてもよい。一部の修飾ｄＮＴＰは、通常の（非修飾）ＤＮＡ−ＤＮＡ結合より好ましくないため、その使用によってヘアピン戻し置換プロセスが増大し得る。同様に、一部の実施形態では、触媒分子に関して、合成プライマーよりも強力な結合を形成することにより、ＰＥＲの速度を高めるために、様々なタイプの核酸（例えば、ＬＮＡ、ＲＮＡ又はメチルｄＣ若しくはスーパーＴ ＩＤＴ修飾などの散在修飾塩基）を含むヘアピンを用いてもよい。
一部の実施形態では、触媒分子は、蛍光色素又はタンパク質などの生体分子に共有結合している。一部の実施形態では、触媒分子はビオチン修飾を含むことから、ビオチン−ストレプトアビジン結合によってこれらを表面にテザリングしてもよい。一部の実施形態では、合成分子は、１つのサブドメイン内にアジ化物修飾などの修飾を含むが、これにより、クリックケミストリーを介して、これらをアルキンなどの他の分子と共有結合させることができる。他の化学的及び生物学的結合は、本開示に包含される。
本開示の核酸は、天然には存在しないことを理解すべきである。従って、核酸は、「改変核酸」と呼ぶことができる。「改変核酸」は、天然には存在しない核酸（例えば、互いに共有結合し、また、いくつかの事例では、ホスホジエステル「骨格」と呼ばれるホスホジエステル結合を含む少なくとも２つのヌクレオチド）である。改変核酸は、組換え核酸及び合成核酸を包含する。「組換え核酸」は、核酸（例えば、単離された核酸、合成核酸又はそれらの組合せ）を連結することにより構築され、また、一部の実施形態では、生きた細胞内で複製することができる分子である。「合成核酸」は、増幅された、又は化学的に、若しくは他の手段で、合成された分子である。合成核酸は、化学的に修飾されているか、又は他の方法で修飾されているが、天然に存在する核酸分子と塩基対合する（また、例えば、一過性若しくは安定に「結合する」とも呼ばれる）ことができる。組換え及び合成核酸は、前述した分子のいずれかの複製から得られた分子も含む。
概して、改変核酸は、天然に存在しないが、野生型ヌクレオチド配列を含む場合もある。一部の実施形態では、改変核酸は、異なる生物から得られた（例えば、異なる種から得られた）ヌクレオチド配列を含み得る。例えば、一部の実施形態では、改変核酸は、マウスヌクレオチド配列、細菌ヌクレオチド配列、ヒトヌクレオチド配列、ウイルスヌクレオチド配列、又はこれらの配列のいずれか２つ以上の組合せを含む。一部の実施形態では、改変核酸は、１つ又は複数のランダム塩基を含む。
一部の実施形態では、本開示の改変核酸は、ホスホジエステル骨格以外の骨格を含んでもよい。例えば、改変核酸は、一部の実施形態において、ホスホロアミダイト、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、Ｏ−メチルホスホロアミダイト結合、ペプチド核酸又はこれらの結合のいずれか２つ以上の組合せを含んでもよい。改変核酸は、記載される通り、一本鎖（ｓｓ）若しくは二本鎖（ｄｓ）であってもよいし、又は改変核酸は、一本鎖及び二本鎖配列の部分を含有してもよい。一部の実施形態では、改変核酸は、三本鎖配列、又はＧ−カルテット（G-quartet）、Ｇ−４構造（G-quadruplex）、及びｉ−モチーフなどの他の非ワトソン・クリック型塩基対の部分を含有する。改変核酸は、例えば、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ若しくはゲノムＤＮＡとｃＤＮＡの組合せ）、ＲＮＡ又はハイブリッド分子を含んでもよく、その場合、核酸は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチド（例えば、人工若しくは天然）の任意の組合せ、並びにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシシ、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン及びイソグアニンをはじめとする２つ以上の塩基の任意の組合せを含む。
本開示の改変核酸は、標準的分子生物学方法を用いて生成することもできる（例えば、Green and Sambrook, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2012, Cold Spring Harbor Pressを参照）。一部の実施形態では、核酸は、GIBSON ASSEMBLY（登録商標）Cloning（例えば、Gibson, D.G. et al. Nature Methods, 343-345, 2009; and Gibson, D.G. et al. Nature Methods, 901-903, 2010を参照、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる）を用いて生成される。GIBSON ASSEMBLY（登録商標）は、典型的に、シングルチューブ反応で３つの酵素活性：５’エキソヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼの３’延長活性、及びＤＮＡリガーゼ活性を使用する。５’エキソヌクレアーゼ活性は、５’末端配列を分解し直し、アニーリングのために相補的配列を露出させる。次に、ポリメラーゼ活性は、アニーリングされたドメインのギャップを充填する。続いて、ＤＮＡリガーゼが、切れ目を封止し、ＤＮＡ断片を互いに共有結合する。結合する断片のオーバーラップ配列は、Golden Gate Assemblyで使用されるものよりはるかに長いことから、より高い割合で正しい集合体が得られる。改変核酸を生成する他の方法は、当技術分野で公知であり、本開示に従って使用することができる。
本明細書では、ＤＮＡ折り紙「スカフォールド」及び「ステープル」鎖について述べる。これらは、当技術分野で公知の用語である６０。スカフォールド鎖は、典型的に、長さが２００ヌクレオチドを超える長い一本鎖核酸（例えば、ＤＮＡ）である。ステープル鎖は、典型的に、長さが２００ヌクレオチド以下の短い一本鎖核酸（オリゴヌクレオチド）である。２００ヌクレオチド（これより長いか、又は短い）の長さ自体は、ＤＮＡ折り紙システムの構成要素を定義する上で重要ではなく、むしろ相対長さが一般に重要であることを理解すべきである。ＤＮＡスカフォールド鎖は、複数の短いステープル鎖よりも長いため、短いステープル鎖を用いて（ヌクレオチド塩基相補性により）、長いスカフォールド鎖を任意の形状（例えば、２Ｄ又は３Ｄ構造）に折り畳む。
プライマー交換方法及び適用
胚発生中に、環境シグナルと組み合わせた速度論的経路によって、器官及び脚などの複雑な機能性構造の組織化が起こる。速度論、シグナル伝達及び構造、並びに生物系における驚くべきレベルのプログラム可能性及び複雑性の間のこの密接な関係に、本開示は、少なくとも一部が基づくものである。今日まで、アニーリングプロトコルにより形成することができる構造の複雑さに一層近い環境シグナルに応じて形状を動的に形成することはほとんど不可能であった。本明細書に記載するプライマー交換技術は、この隔たりを克服する。ＰＥＲをツールとして使用することができるいくつかの用途の例を図６、７、１１及び１８に描くと共に、以下に説明する。
トリガーされた構造の成長及び折り畳み
一部の実施形態では、プライマー交換反応（ＰＥＲ）を用いて、長い固定長さ核酸鎖を合成する（図７Ａ）。核酸鎖の長さは、反応物中の触媒分子の長さ及び数をはじめとするいくつかの要因に応じて変動する。触媒反応（プライマー結合、プライマーの鎖置換伸長及び分岐移動など；図１を参照）の各々が、成長する核酸鎖にドメインを付加する。全てのプライマー及び触媒分子成分は比較的小さいことから、完全に合成された核酸スカフォールドの直接送達が実現不可能となり得る固定細胞におけるものなど、密集環境において鎖合成を実施することができる。
規定された１Ｄ成長（組織化）の各ステップは、新しいプライマー配列を付加する（例えば、図２の下のパネル参照）ため、プライマー交換反応を用いて、任意の数のアニーリングプロトコルにより、相補的核酸ドメインに基づく折り畳まれた形状をプログラムすることができる（図７Ｂ）９、２７、３８、５１〜５３。プライマー交換反応は等温で動作し、しかも、広範囲の温度及び塩条件の下で動作するように、その速度論を調整することができることから、この方法を用いて、複雑な構造の組織化をトリガーすることができる。これらの複雑な構造は、例えば、Ｃｒｙｏ−ＥＭ（電子顕微鏡）及び他のタイプのイメージングのマーカとして、又はタンパク質及び他の生体分子のパターン形成のためのスカフォールドとして使用してもよい。
スカフォールド鎖（例えば、長さが１００ヌクレオチドを超える、長い一本鎖核酸）を特定の形状に折り畳むことによって、構造を組織化する以外に、プライマー交換反応は、指数関数的成長速度論を用いて構造を設計することにより、時間効率的に大型構造を構築するために使用することができる。例えば、大型構造は、樹状スカフォールディング骨格を組織化することによって生成され得る（図７Ｃ）。この骨格は、一部の実施形態では、様々な２Ｄ及び３Ｄ形状に折り畳むこともできる。例えば、図１０Ａ〜１０Ｃ（実施例５を参照）に描く分岐方法を用いて、類似サイズの構造を、骨格の全長と共にほぼ線形に変化する時間を伴う線形スカフォールド合成法よりもはるかに短時間で組織化することができる。これによって、インサイチュでの大型構造のはるかに時間効率的な構築が可能になる。
分子時計及びタイマー
本開示のプライマー交換反応システムはまた、例えば、任意の分子事象（例えば、物理的又は化学的シグナルに対する曝露）間の時間を計測し、インサイチュでそれらをＤＮＡ中でコードする（「分子時計」として機能する）ことができる合成システムを作製するために使用することもできる。ＰＥＲは、シグナルのネイティブ環境において、また、一部の実施形態では、複数のシグナルを同時に検出するための速度論、さらにはその可能性を妨害し得る蛍光タグ付け又はバーコード化を一切用いずに、シグナルを直接測定することができる。一部の実施形態では、ＰＥＲシステムを用いて、感知された事象と事象の間の時間に、鎖の末端に塩基を絶えず付加することにより、時間を記録することができる。これらの鎖の長さの分布を、２つの分子シグナル間の時間量の指針として用いることができ、この分布は、例えば、変性ゲル上で直接読み取ることができる。反応速度は、ヘアピン濃度により制御することができるため、多くの異なる時間尺度（例えば、分から時間、又はそれより多くの尺度）にわたって時間を計測することが可能である。
シグナルとシグナルの間の時間を計測する以外に、プライマー交換反応を用いて、一部の実施形態において、シグナルを経時的に測定することもできる（「分子タイマー」と呼ばれる）（図１１）。一連の状態遷移をプログラムし、状態遷移の各々について触媒ヘアピンの濃度を変更することにより、タイマーを用いて、インプットシグナルの発生から特定の時間間隔で、アウトプットシグナルを放出させる（触媒ヘアピンからアウトプットプライマーが解離する）ことができる。このタイプの制御は、例えば、プログラム可能な材料及び合成遺伝子調節のために有用である。さらに、この時間の遅延は、複数の時間尺度にわたってプログラムすることができる。
ＰＥＲベースの分子時計及びタイマーシステムは、一部の実施形態では、複数のシグナルを一度に検出し、それに基づいて駆動するように、スケールアップ（多重化）してもよい。これらのシステムは、複雑な論理演算を実施し、いくつかの方法で遺伝子調節ネットワークに影響を与えるものであり、合成生物学者が入手可能な多種多様なツールに加えられる。さらに、生体分子についてインビトロで実験を実施する、例えば、それらの機能性を研究するために、シグナル及び遺伝子の時間制御を用いることもできる。
環境応答性レコーダ
生物は、単細胞から発生し、専用の発達経路の横断を指令する分子シグナルによって、ゲノムプログラムから自己組織化する。これらの驚くほど効率的且つ頑健な発達経路に触発されて、合成発達性自己組織化が、本開示のプライマー交換反応システムにより達成され、これによって、様々な構造が、シグナル濃度の時間的及び空間的変化という結果として形成される。前述した構造合成フレームワーク及びシグナル検出及び作動能力を用いて、一部の実施形態では、発達性自己組織化がプログラムされ、これにより、構造は、それらが経時的に遭遇する様々な環境シグナルに応答して、成長すると共に、形状を変化させる。これらの構造は、規定の動態学的経路に従いながら、分子事象を動的に記録すると共に、イメージング、システム生物学、及び生物学的シグナル処理における適用のための特定の構造に組織化する。これらの反応は、等温で実施され、システムの所望の動作温度、速度、及びイオン濃度と適合するように、反応速度論を修正することができる。このアプローチを首尾よく実施すれば、様々な環境条件への適合能力と、ヒトの介入をほとんど、又は全く必要としない長期にわたる実行能力の両方によって、合成自己組織化の分野に多大なパラダイムシフトが導入される。本明細書に記載するように、プライマー交換反応システムを用いて、イメージング用のマーカとして構造の成長をパターン形成及び指令し、生体分子のパターン形成のためのスカフォールドを構築することができ、あるいはさらに、例えば、特定の標的分子の周囲に形成されて、それを捕捉する構造を合成することもできる。
また、検出されたシグナルの核酸鎖へのＰＥＲコード化を延長して、長期間にわたり複数のシグナルを記録することができる「ティッカーテープ」をインプリメントすることもできる。反応ステップを通過する全ての分子の全履歴が転写物に記録され、しかも、これらの分子は、具体的且つ一貫した速度論的特性を有するため、これらのティッカーテープ転写物を用いて、溶液中の任意のシグナルの正確な時間トレースを計算することができる。これらのシステムを用いて、インサイチュ及びインビボでシステムの動力学を追跡すると共に、任意量の時間にわたって任意のシグナルを記録することが可能な無比の技術を提供することができる。
図４１Ａは、４つの構成要素：シグナルヘアピン（Ｓｉ）、シグナルヘアピンのプライマー結合部位ａ＊をブロックするプロテクター鎖、プライマーａ、及びクロックヘアピン（Ｃｌ）を含む標的鎖Ｘを検出する分子記録システムの一例を示す。「プロテクター鎖」は、標的と、シグナル配列を含む触媒分子の３’トーホールドドメインとの両方に結合する一本鎖核酸を指す。一部の実施形態では、プロテクター鎖は、３’トーホールドドメインよりも長い（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチド超）。図４１Ｂは、シグナルクロックの組込みが、クロックヘアピン（Ｃｌ）により実施される方法を示し、クロックヘアピン（Ｃｌ）は、ａで終結するプライマー配列に追加のａドメインを連結するようにプログラムされている。このクロックは、実験全体を通して一定の濃度で含有されるため、成長するプライマー鎖へのａの組込みの速度は、経時的にほとんど一定のままである。これは、最終転写物中のａドメインの数及び位置が、図１３に示す分子時計当てはめと同様に、分子事象間に経過した時間の量を反映することを意味する。図４１Ｃに示すように、例えば、標的の存在下で、シグナルヘアピンは活性になる。これは、標的Ｘが、プロテクター鎖上の露出した一本鎖領域と結合して、トーホールド交換反応により、シグナルヘアピンからプロテクター鎖を置換するときに起こる。これは、ヘアピン上のプライマー結合部位ａ＊を露出させることから、シグナルヘアピンは、ドメインａで終結するプライマー上に配列Ｓを付加し得る。配列Ｓは、この反応（シグナル組込み）がクロッキング反応（クロック組込み）の代わりに起こったことを示すために用いられる標的Ｘに特異的なバーコード配列を表す。トーホールド交換システムは、予測可能な平衡状態に達するため、所与の時点でのシグナル組込みの速度は、その時点での標的Ｘの濃度を反映する。従って、クロックに対するシグナル組込みの相対速度を用いて、実験時間にわたる標的Ｂの濃度曲線を当てはめることができる。例えば、図４１Ｄに示すように、標的が存在しない場合、転写物中にシグナルバーコードはなく、従って、全ての組込みはクロックである。しかし、標的が存在する場合、シグナル組込み（Ｓ ａ）が反復ドメインＢの濃度に挿入され、それらの時間依存的頻度が当てはめられて、標的Ｂの時間依存的濃度を回復する。
図４２Ａは、３つの構成要素：プライマー結合部位ａ＊を初めにブロックする構成に折り畳まれるシグナルヘアピン（Ｓｉ）、プライマーａ、及びクロックヘアピン（Ｃｌ）を含む標的鎖Ｂを検出する分子記録システムの一例を示す。図４２Ｂは、シグナルクロックの組込みが、クロックヘアピン（Ｃｌ）により実施される方法の一例を示し、クロックヘアピン（Ｃｌ）は、ａで終結するプライマー配列に追加のａドメインを連結するようにプログラムされている。このクロックは、実験全体を通して一定の濃度で含有されるため、成長するプライマー鎖へのａの組込みの速度は、経時的にほぼ一定のままである。従って、最終転写物中のａドメインの数及び位置は、図１３に示す分子時計当てはめと同様に、分子事象間に経過した時間の量を反映する。図４２Ｃに示すように、例えば、標的の存在下で、シグナルヘアピンは活性になる。これは、標的Ｘが、シグナルヘアピン上の露出した一本鎖ループ領域と結合して、トーホールド交換反応により、プライマー結合部位ａ＊をブロックしている鎖を置換するときに起こる。これによって、シグナルヘアピンは、ドメインａで終結するプライマー上に配列Ｓを付加し得る。配列Ｓは、この反応（シグナル組込み）がクロッキング反応（クロック組込み）の代わりに起こったことを示すために用いられる標的Ｘに特異的なバーコード配列を表す。トーホールド交換システムは、予測可能な平衡状態に達するため、所与の時点でのシグナル組込みの速度は、その時点での標的Ｘの濃度を反映する。従って、クロックに対するシグナル組込みの相対速度を用いて、実験時間にわたる標的Ｘの濃度曲線を当てはめることができる。例えば、図４２Ｄに示すように、標的が存在しない場合、転写物中にシグナルバーコードはなく、従って、全ての組込みはクロックである。しかし、標的が存在する場合、シグナル組込み（Ｓ ａ）が反復ドメインの濃度に挿入され、それらの時間依存的頻度がはめ込まれて、標的Ｘの時間依存的濃度を回復する。一般に、標的特異的シグナル配列バーコードを含む追加のシグナルヘアピンを、多くの異なる標的を経時的に多重化モニタリングするために使用することができる。ティッカーテープの２シグナルの例を図２０に示す。
更なる適用
トリガーされたcryo-EMマーカのインサイチュ合成．タンパク質に対して、トリガーされた大型の構造的に健全なＤＮＡナノ構造成長を、cryo-EMを用いた構造決定のためのマーカとして使用することができる。既知形状の非対称マーカを用いれば、タンパク質構造のクラス平均化及び３Ｄ再構築のプロセスが、より容易になるはずである。このアプローチは、例えば、そうでなければイメージングが困難なタンパク質の構造をマッピングする上で特に有用である。
汚染物質の長期環境監視．プライマー交換反応は、ｄＮＴＰを動力源とするため、長期間にわたって実施することができる。長期間にわたって溶液中の汚染物質を測定する分子レコーダは、環境に曝露されたチャンバーの側へのプライマー交換反応体のテザリングを介して、インプリメントすることができる。
ｐＨ、温度メータの構築．ｐＨ及び温度の変化は、ポリメラーゼ及び反応速度論に及ぼされる予測可能な作用であることから、ＰＥＲシステムを用いて、それらが曝露される温度又はｐＨの追跡を維持することができる。ｐＨ及び温度は、ポリメラーゼ速度論に影響を与えるため、提案される光駆動性メカニズムなどの外部クロックを正確な時間トレースのために用いることができる。
一過性材料のプログラムされた廃退．例えば、プログラム可能なタンパク質合成のパルスを用いて、プライマー交換システムは、特定の環境シグナルを検出して、溶液を重合する試薬をまず生成し、次に、設定した時間量の後、重合された基質を完全に破壊する試薬を生成することができる。
予定通りの薬物送達．反応サイクルをインプリメントすることにより、プライマー交換反応を用いて作動時間の変動をプログラムすることができる。この循環状態は、特定のシグナルの定期的放出を活性化し、続いて、このシグナルは、トーホールドスイッチを介してタンパク質シグナルに変換される。プライマー交換反応及びトーホールドスイッチのモジュール性によって、システムのアウトプットは、特定の間隔の後、しかも特定の環境シグナルに応答して初めて生成される治療用タンパク質であってよい。
環境制御のための条件付き遺伝子合成．ＲＮＡを用いてインプリメントされた、及び／又はゲノムにコードされたプライマー交換反応を用いて、機能性ＲＮＡ調節物質又はｍＲＮＡ転写物の合成による遺伝子発現を記録及び調節することができる。一部の実施形態では、条件付き遺伝子合成のためにＰＥＲを用いる。
トリガーされたインサイチュ毒素被包．構造の成長は、プライマーによってトリガーされ、これは、環境シグナルの存在を条件とし得ることから、シグナル検出方法も提供され、これによって、特定の病原性マーカが検出されると、直ちに、毒素を取り囲み、それを不活性化する構造の成長がトリガーされる。
インサイチュシグナル増幅．例えば、イメージング用のインサイチュシグナル増幅のために、長いテロメアコンカテマーの成長を用いてもよい。複数のテロメア形成反応を同時に実施して、シグナル増幅を多重化してもよい。例えば、図２５を参照。
タンパク質検出．条件付きプライマー交換反応は、必要なプライマー結合部位を条件付きで露出させるアプタマー配列を用いることによって、アミノ酸以外のタンパク質を検出するために改変することもできる。合成は、挙動を記録及びプログラムするための多くの異なる分子実体と相互作用し得るため、これにより、広範囲の分子挙動が可能になる。
インビボ適用
一部の実施形態では、ＰＥＲカスケードをインビボでインプリメントすることによって、細胞内での核酸のプログラム可能な動的合成が可能になる。これらのシステムは、単細胞レベルで応答性となって、特定の細胞環境に従って合成される転写物の集団を形成し得る。これらの転写物は、時間とともに検出されるシグナルの記録であってもよいし、又は機能性ＲＮＡ転写物であってもよく、これにより、細胞は、特定の細胞条件に対してプログラムされた応答を有する。
一例として、真核細胞中のＲＮＡ ＰＥＲを用いて、核局在化シグナル（ＮＬＳ）配列などの局在化マーカをｍＲＮＡ配列に動的に付加することができ、その後、ｍＲＮＡ配列は、核から出て、合成されたタンパク質を核内に向けて戻す。この空間プログラム可能性は、タンパク質の特定の活性化又は不活性化に有用となり得る。
一般に、ＰＥＲカスケードは、主に配列非依存性であるため、任意の配列を新たに合成するか、又は既存のオリゴヌクレオチドに付加することができる。各細胞型は、細胞プロセスに対する破壊を制限するために、鎖置換ポリメラーゼ、理想的には、細胞中に既に付与されたＲＮＡポリメラーゼを必要とする。ヘアピンの停止配列をインプリメントするために用いられる任意のタンパク質を同様に組み込むべきである。一例は、原核生物及び真核生物に導入されていることから、より強い結合を有するように進化する可能性があるｄＣａｓ９タンパク質の使用である。
動的に合成されたアウトプット配列を用いて、蛍光リポータ遺伝子を活性化又は阻害することによって、リアルタイム合成をモニターすることができる。例えば、ＤＮＡザイムを合成して、ＧＦＰタンパク質のｍＲＮＡを切断してもよい。あるいは、ガイドＲＮＡを合成してリポータ遺伝子を阻害することもできる。転写物中でコードされる配列情報を即時回収する必要がなければ、細胞内で生成された記録を後でシーケンシングして、時間的記録情報を抽出することができる。
ＰＥＲヘアピンは、触媒として作用することから、反応速度を数桁の範囲にわたりインビトロで調整することができる。細胞内では、濃度を制御するために、必要な合成速度に応じて、プラスミドのコピー数などの要因を調節することができる。一部の事例では、所望の細胞型について入手可能であれば、まず、PURExpress長さ分解能及び／又は細胞抽出物などのインビトロ転写／翻訳系において性能を評価され得る。
一例として、合成鎖は、ｍＲＮＡを切断し、状況特異的ガイドＲＮＡを生成し、アンチセンス転写物を合成するか、又はｓｉＲＮＡ経路を活性化することによって、遺伝子を阻害することができる。また、各々の状況に合わせたドメインを有する要求に応じて新たなタンパク質を作出するために、ｍＲＮＡ転写物をモジュラー様式で合成又は延長してもよい。多種の調節核酸及びタンパク質を検出し、時間とともに記録することができる。
配列を動的に合成し、様々な環境条件に応答することができる、高度にプログラム可能なインビボ合成プラットホームを有することは、合成生物学に大きな用途がある。目的の標的に関する空間・時間的情報を明らかにするために、細胞の様々な部分に局在化したヘアピンを記録するプライマーを標的タンパク質に備えることができる。一般に、ＰＥＲは、インビボで、動的及び応答性核酸合成の全く新しい方法をもたらし、その高度にプログラム可能な性質が、この技術の可能性を多くの異なる状況に適用可能にする
分子モータ
また、分子レベルで分子環境を検査する分子モータシステムも本明細書に記載される。そのために、単位操作がローカルスケールで起こるべきであり、それに続く操作が、隣接する部位に沿って連続的に起こるべきである。単位相互作用は、明確な距離依存的挙動を有するべきである。単位ステップの反応速度は、クローラ及びテンプレートの様々な部分の長さ、並びに部位同士の距離に依存する。「分子クローラ」は、ヘビ様（snake-like）分子種であり、これは、第１走路部位から最終走路部位まで成長する際、全軌道にわたって走路の周りを動き回る（例えば、図３１Ａを参照）。クローラが部位間を移動する際、これは、部位からの情報をコピーし、情報をその成長する本体（核酸）に記録する。「分子ウォーカ」は、部位の間を移動し、各ステップの後に前の部位を去る（例えば、図３２Ａを参照）。走路に沿って移動する間、ウォーカは、その本体を成長させ、走路部位からの情報をコピーし、これを保持する。
１部位での単位操作のメカニズムを図３１Ａ及び３２Ａの上の列に示す。いずれのシステムでも、プライマー（インプットシグナル；図３１Ａでは「ａ」、図３２Ａでは「１」）と、当該部位のそれらの相補的プライマー結合領域との結合により、反応が開始される。次のステップは、ポリメラーゼが、「ポリメラーゼストッパー」地点（重合を終結させる分子）にヒットするまで、テンプレートに沿ったポリメラーゼによるプライマーの伸長である。新しく合成された部分にポリメラーゼを付加するために、システムにＤＮＡ塩基モノマー（ｄＮＴＰ）を供給する。停止地点は、例えば、以下の２つの方法のうちの１つによりコードすることができる。非ヌクレオチド化学スペーサ（例えば、トリエチレングリコールスペーサ）をストッパーとして付加してもよいし、又は塩基のサブセットをシステムで用い、除外された塩基をストッパーとして用いてもよい。重合を終結させる他の分子は本明細書の他所に記載されている。例えば、テンプレートにおいてＡ、Ｔ及びＣの三文字コードを用いる場合、それらの補体塩基モノマーＡ、Ｔ及びＧがシステムに供給され、Ｇ’がテンプレートの末端に埋め込まれる。システムは、補体塩基モノマー、Ｃを含まないため、ポリメラーゼは、新しい鎖を延長することができない。ポリメラーゼが、新しいドメインの合成を完了して、ストッパー地点に達すると、テンプレートから出る（解離する）。次に、新しく合成されたドメインは、テンプレートと同じ配列を有するため、ランダムウォーク分岐移動プロセスを経ることができる。元のテンプレートが、新しく合成されたドメインを置換すると、次の反応のための新たなプライマーが露出する。
単位操作の後、いずれの分子モータシステムにおいても、第１部位は、次の部位のプライマーとして作用することができる新しく合成されたドメインを有する。分子モータ分子（例えば、クローラ又はウォーカ）は、依然として第１部位に固定されている（分子中の関連部分の長さは、この条件を満たすように設計される）ため、新たなプライマーだけが近傍の部位に局部的に作用する。次の部位への移動のメカニズムは、２つのシステム同士で異なっている。分子クローラシステムにおいて、新たなプライマーが、相補性によって次の部位のプライマー結合領域と結合し、単位操作が反復される。その結果、クローラは、第２部位に沿って延長された本体を有する（図３１Ａの中央の列）。プライマー結合ドメイン（例えば、第２部位のドメインｂ＊）は、走路の中央のクローラの自発的放出を阻止するために、プライマー延長に対して保護されなければならないことに留意すべきであり；こうした保護は、例えば、鎖の３’末端で逆転したｄＴなどの延長不可能な塩基を組み込むことによって達成される。
分子ウォーカシステムにおいて、ウォーカ分子は、現時点及び次の部位の間で競合的分岐移動を経る（図３２Ａの中央の列）。第２部位が、第１部位の対応部分を置換すれば、ウォーカを第２部位に輸送することができる；プライマーの長さは、１プライマーとその補体（例えば、ドメイン１と１＊の間）の結合が、ウォーカを前の部位から放出させるのに十分弱く、しかも、２つの連続したプライマーとその補体（例えば、ドメイン１−２と２＊−１＊の間）の結合が、ウォーカを次の部位に保持する上で十分に強くなるように、設計すべきである。しかし、ウォーカは、前の部位のプライマー結合領域と相補的なドメインを依然として含有するため、ウォーカの運動は、可逆性（後戻りが可能）である。これは、例えば、迷路解決において、複数の部位の再訪が必要な場合の特徴となり得る。走路部位は、ウォーカが部位から出た後、元の形状を復元するため、再利用が可能になることに留意されたい。
３つの隣接する部位に沿ってステップを反復した後（図２８Ａ及び２９Ａの下の列）、ヘビ様クローラは、今や走路全体に及ぶが、ウォーカは最終部位に移動している。記録及び履歴の検索のための、クローラの放出は、複数の方法により実施することができる。一例では、反応の記録の終わりに、「リバースプライマー」を添加して、クローラの補体コピーを合成し、テンプレート走路からクローラを除去することができる。例えば、ヘビ様クローラの場合では、ドメイン「ｄ＊」を含むプライマー、またウォーカの場合には、ドメイン「５＊」を含むプライマーが、そうしたリバースコピープロセスを開始することができる。別の例として、自律的にリバースコピープロセスを指令する特殊な種類の走路部位を最終部位の直後に埋め込むことができる。モータが接近したとき、リバースコピープロセスを開始するように、それぞれのケースで、ドメイン「ｄ＊」及び「５＊」を含むプライマーを特殊な部位に組み込むことができる。また別の例として、モータの熱媒介性脱ハイブリダイゼーションに基づく、より単純なメカニズムを用いることができる。システム全体の熱は、プラットホーム構造又は一部の補体を変性し得るが、例えば、特定のプライマーを用いたＰＣＲ増幅と組み合わせれば、標的シグナルの選択的検出が可能である。
一部の実施形態では、本明細書に記載のプローブを繰り返し用いて、連結されたバーコードの可変長さの鎖を作製してもよく、これにより、ステムコード化テンプレートの複写、放出、及び下流結合の比較的低速のステップの同時操作を可能にすることができる。図４４Ａに示すように、ドメイン「ａ」のプライマー結合部位に加えて、プローブは、プローブの３’末端に付加された別のプライマー結合部位（ドメイン「ｂ」）を含む。また、一部の実施形態では、「ストッパーペア」は、非天然の塩基対iso-dC：iso-dG（Integrated DNA Technologies）であり、非延長プライマーは、最後の２つの塩基の間にホスホロチオエート結合を含有する。これらの修飾は、ヘアピンテンプレート「ｂ−ｔ」（ストッパーペア）をコピーした後、ポリメラーゼを停止して、延長プライマーが、一本鎖になりやすく、且つヘアピンが閉じるように、ヘアピンプローブと延長プライマーの平衡状態を偏らせる。ドメイン「ｔ」は、ランダムバーコード又は他のプローブ特異的情報を表す。ヘアピンプローブに対して過剰量の自由プライマーは、初め、通常通りにプローブに結合し、ポリメラーゼを置換することによって延長される（図４４Ｂ）。ＡＰＲにおいて回文ドメインをコピーする代わりに、新しいドメイン「ｂ＊」は、いずれか他のプローブの自由３’末端のドメイン「ｂ」に結合することができる。
一部の実施形態では、自己結合を制限又は防止するために、ドメインの長さ又は配列を調節する。「ｂ＊」が別のプローブに結合しているとき、示されるいくつかの方法（プローブ上のメチル化ＲＮＡ塩基、「ｂ＊」と「ｂ」の間の末端ヌクレオチドのミスマッチ、プローブ上のiso-dCヌクレオチド、及び各「ａ＊」プライマーの５’末端上の対応するiso-dGヌクレオチドなど）のいずれか１つを用いて、それ以上の重合を遅らせるか、又は停止することができる。メチル化ＲＮＡヌクレオチドの場合、例えば、Bst（Integrated DNA Technologies）又はBsm（Thermo Fisher）は、それ以上の延長が遅くなることが判明した。ミスマッチヌクレオチドの場合には、これによって、ＤＮＡ末端に近似するが、不完全なマッチングが可能になり、それ以上の重合を遅らせるか、又は阻止するが、依然として「雑な（slopppy）」リガーゼ（例えば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ）は、連結部をつなげることができる。低速化／ストッパーが失敗すれば、反応は、そのステップについての前のクローラ設計と同様に進行する。クローラ設計と同様に、低濃度の自由「ｂ」ドメイン鎖を時折結合し、これにより、新たな連結鎖をコピーするポリメラーゼを取得し、これを全てのプローブから放出させ、このようにしてさらなる使用のためのプローブを再生することによって、新たな連結バーコード鎖を終結させることができる（図４４Ｄ）。最終結果は、クローラと同様に、それぞれのプローブに最初に結合したとき、連結バーコードコピーの幾分ランダムなパッチワークであるが、その後、放出され、潜在的に異なるパターンで反復される（図４４Ｅ）。前述と同様に、鎖の内容をＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、次世代シーケンシング、又は他の手段により分析することができる。図４４Ｆは、プローブ配列の例を提示し、それぞれのドメインを示す。
一部の実施形態では、分子モータシステムは、分子レベルの標的の大きな集団の同時「ボトムアップ」検査のための分子計器を使用する。分子記録は、各々ユニークなＤＮＡバーコードで標識された所与の標的の分子地形に沿って、標的自体を妨害又は破壊することなく、反復して生成され、その後、基本的な標的の画像のコンピュータ再構築のためのハイスループットシーケンシングにより読み取ることができる。同じスケールのサンプルと「計器」を用いて、この技術は、顕微鏡を用いた技術に伴う多くの課題に取り組む。例えば、動的プロセスの高空間解像を記録することができ；それらの標的と同じサイズである分子計器は、「超鮮明な（ultra-sharp）分子画像」を有し得る。別の例として、各々の標的（標的種ではなく）がユニークにバーコード化され、分子モータシステムは、全ての分子の空間及び時間的分布に従うための高度多重化を提供する。また別の例として、分子モータは、超並列方式でプロセスを記録することができ、これにより、超ハイスループット分子イメージングが可能になる。また別の例として、分子モータは、全体から細部に至る顕微鏡法の構造又は環境上の制約なしに、インサイチュで分子標的にアクセスできるため、粗く、有害なサンプル処理を回避することができる。分子モータシステムが、超並列方式で個々の分子の地形を、インサイチュで同定、追跡、及び記録した後、情報の読み取り及び再組立てを行う能力は、高精度での分子構造の画像のコンピュータ再構成を可能にする。分子モータはさらに、顕微鏡法では解像不可能な空間内の分子標的の数量化、並びに個々のネットワークからの生物学的構造、真の接続性及び動力学的データの超高解像度視覚化を可能にする。分子モータシステムは、分子地形の同時及び多重化検査のための高度に有用なツールを提供することによって、生物学的基礎研究、薬物発見、及び診断薬を変化させる。
一部の実施形態では、分子モータ（例えば、クローラ分子及びウォーカ分子）の走路部位は、（ｉ）不対３’トーホールドドメイン及び（ｉｉ）置換鎖のヌクレオチドと、トーホールドドメインを含有するテンプレート鎖のヌクレオチド同士の塩基対により形成される、トーホールドドメインから５’側に位置する対ドメインを含む。この構成を有する走路部位の例を図３１Ａ及び図３２Ａに示す。
図３１Ａを参照にすると、不対３’トーホールドドメイン（前述したＰＥＲシステムのトーホールドドメインと類似する）は「ａ＊」で示される。不対トーホールドドメインを含有する核酸鎖は、「テンプレート鎖」と呼ばれる。これは、重合を開始するために、プライマーがアニーリングする鎖である。テンプレート鎖が結合（対合、ハイブリダイズ）した反対側の鎖は、「置換鎖」と呼ばれる。置換鎖のサブドメイン「１」及び「ｂ」は、それぞれ、テンプレート鎖のサブドメイン「１＊」及び「ｂ＊」と対合して、トーホールドドメインから５’側に位置する対ドメインを形成する。テンプレート鎖のトーホールドドメインに対するプライマーの結合により開始した重合の間、置換鎖は、初め、伸長産物により置換される。しかし、後に、置換鎖は、伸長産物を置換し、テンプレート鎖に再度結合する（分岐移動と呼ばれるプロセス）（上の列）。この時点で初期分子部位からの情報を含む伸長産物は、プライマーとして機能するのに自由であり、別の分子部位のトーホールドドメインと結合し、伸長／分岐移動プロセスの別のサイクルを開始する（中央の列）。各々のサイクルによって、各分子部位からの情報の記録が、成長する核酸ポリマー鎖（クローラ分子と呼ばれる）に付加される（下の列、「１＋２＋３」）。
図３２Ａを参照にすると、不対３’トーホールドドメインは、「１＊」＋「２＊」で示される。不対トーホールドドメインを含有する核酸鎖は、重合を開始するために、プライマー「１」がアニーリングするテンプレートである。テンプレート鎖が結合（対合、ハイブリダイズ）した反対側の鎖は、置換鎖である。置換鎖のサブドメイン「３」は、テンプレート鎖のサブドメイン「３＊」と対合して、トーホールドドメインから５’側に位置する対ドメインを形成する。テンプレート鎖のトーホールドドメインに対するプライマーの結合により開始した重合の間、置換鎖は、初め、伸長産物により置換される。しかし、後に、置換鎖は、伸長産物を置換し、テンプレート鎖に再度結合する（上の列）。この時点で初期分子部位からの情報を含む伸長産物は、プライマーとして機能するのに自由であり、別の分子部位のトーホールドドメイン（この場合、トーホールドドメインのサブドメイン「３＊」）に結合し、伸長／分岐移動プロセスの別のサイクルを開始する（中央の列）。各々のサイクルによって、各分子モータ（分子モータ同士の各相互作用）からの情報の記録が、成長する核酸ポリマー鎖（ウォーカ分子と呼ばれる）に付加される（下の列、「１＋２＋３＋４＋５」）。
分子モータの走路部位は、前述のように、一般に、不対（一本鎖）３’トーホールドドメインと、３’トーホールドドメインから５’側に位置する対（二本鎖）ステムドメインを含む。一部の実施形態では、対ドメインは、トーホールドドメインと直接隣接する。
走路部位分子の長さは、変動し得る。一部の実施形態では、分子モータは、２５〜３００ヌクレオチド長である。例えば、走路部位分子は、２５〜２５０、２５〜２００、２５〜１５０、２５〜１００、２５〜５０、５０〜３００、５０〜２５０、５０〜２００、５０〜１５０又は５０〜１００ヌクレオチド長であってよい。一部の実施形態では、走路部位分子は、３０〜５０、４０〜６０、５０〜７０、６０〜８０、７０〜９０、８０〜１００、１００〜１２５、１００〜１５０又は１００〜２００ヌクレオチド長であってよい。一部の実施形態では、走路部位分子は、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９．５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００ヌクレオチド長であってよい。走路部位分子は、一部の実施形態において、３００ヌクレオチドより長いか、又は２５ヌクレオチドより短い。
前述した「トーホールドドメイン」は、走路部位分子の３’末端に位置するヌクレオチドの不対配列を指し、プライマー（又はプライマーのプライマードメイン）のヌクレオチド配列と相補的である（且つ結合する）。トーホールドドメインの長さは、変動し得る。一部の実施形態では、トーホールドドメインは、５〜４０ヌクレオチド長である。例えば、トーホールドドメインは、２〜３５、２〜３０、２〜２５、２〜２０、２〜１５、２〜１０、５〜３５、５〜３０、５〜２５、５〜２０、５〜１５、５〜１０、１０〜４０、１０〜３５、１０〜３０、１０〜２５、１０〜２０、１０〜１５、１５〜４０、１５〜３５、１５〜３０、１５〜２５、１５〜２０、２０〜４０、２０〜３５、２０〜３０、２０〜２５、２５〜４０、２５〜３５、２５〜３０、３０〜４０、３０〜３５又は３５〜４０ヌクレオチド長であってよい。一部の実施形態では、トーホールドドメインは、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５又は４０ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、トーホールドドメインは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長である。トーホールドドメインは、一部の実施形態において、４０ヌクレオチドより長いか、又は５ヌクレオチドより短い。
一部の実施形態では、トーホールドドメインは、例えば、図３２Ａに示すように、サブドメイン（例えば、２つのサブドメイン）を有する。こうした実施形態では、プライマーは、典型的に、最も３’側のサブドメイン（「１＊」）と結合する。すなわち、分子モータ反応で使用されるプライマーは、必ずしもトーホールドドメインの全長にわたる必要はなく、トーホールドドメインのサブドメイン（その一部）だけに結合してもよい。
走路部位分子の「対ドメイン」は、走路部位の不対トーホールドドメインに隣接して（且つそれから５’側に）位置するヌクレオチドの対配列（例えば、ワトソン・クリック型核酸塩基対）を指す。走路部位分子の対ドメインは、テンプレート鎖のドメインと置換鎖のドメインとの塩基対により形成される。対ドメインの長さは、変動し得る。一部の実施形態では、対ドメインは、５〜４０ヌクレオチド長である。例えば、対ドメインは、５〜３５、５〜３０、５〜２５、５〜２０、５〜１５、５〜１０、１０〜４０、１０〜３５、１０〜３０、１０〜２５、１０〜２０、１０〜１５、１５〜４０、１５〜３５、１５〜３０、１５〜２５、１５〜２０、２０〜４０、２０〜３５、２０〜３０、２０〜２５、２５〜４０、２５〜３５、２５〜３０、３０〜４０、３０〜３５又は３５〜４０ヌクレオチド長であってよい。一部の実施形態では、対ドメインは、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５又は４０ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、対ドメインは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長である。対ドメインは、一部の実施形態において、４０ヌクレオチドより長いか、又は５ヌクレオチドより短い。
一部の実施形態では、鎖置換ポリメラーゼによるプライマー（プライマー結合部位に結合してる）の延長は、走路部位中の重合を終結させる分子又は修飾の存在によって終結させる。従って、一部の実施形態では、本開示の走路部位分子モータは、重合を終結させる分子又は修飾を含む。重合を終結させる分子又は修飾（「ストッパー」）は、典型的には、対ドメインによって、重合がプライマーの延長を終結させるように、走路部位のテンプレート鎖上の対ドメイン内に位置する。一部の実施形態では、重合を終結させる分子は、合成非ＤＮＡリンカー、例えば、Int Spacer 9（iSp9）又はSpacer 18（Integrated DNA Technologies（IDT））などのトリエチレングリコールスペーサである。ポリメラーゼによる重合を終結させる任意の非ネイティブリンカーを本明細書に記載のように使用してもよいことは理解すべきである。こうした分子及び修飾の他の非限定的な例として、三炭素結合（/iSpC3/）（IDT）、ACRYDITE（商標）（IDT）、アデニル化、アジ化物、ジゴキシゲニン（ＮＨＳエステル）、コレステリル−ＴＥＧ（IDT）、I-LINKER（商標）（IDT）、及び３−シアノビニルカルバゾール（ＣＮＶＫ）及びこれらの変異体が挙げられる。典型的には、しかし常にではないが、短いリンカー（例えば、iSp9）は、より高速の反応時間をもたらす。
一部の実施形態では、重合を終結させる分子は、それぞれ、シトシン及びグアニンの化学変異体である、iso-dG及びiso-dC（IDT）などの単一又は対の非天然ヌクレオチド配列である。Iso-dCは、Iso-dGと塩基対合（水素結合）するが、dGとはしない。同様に、Iso-dGは、Iso-dCと塩基対合するが、dCとはしない。対ドメインの反対側の対のストッパー位置にこれらのヌクレオチドを対で組み込むことによって、ポリメラーゼは、その位置に付加すべき溶液中の相補的ヌクレオチドがないため、停止される。
一部の実施形態では、「ストッパー」修飾の性能の効率は、反応物中のｄＮＴＰ濃度を（例えば、２００μＭから）１００μＭ、１０μＭ、１μＭ、又はそれ以下まで低下させることにより向上する。
重合を終結させる分子又は修飾の含有は、分子又は修飾が対ではないため、触媒分子の二本鎖ドメイン（例えば、ヘアピン構造の場合、ステムドメイン）中に「バルジ」を生成することが多い。従って、一部の実施形態では、分子モータの走路部位は、分子又は修飾の反対側に、単一のヌクレオチド（例えば、チミン）、少なくとも２つの同じヌクレオチド（例えば、チミン二量体（ＴＴ）若しくは三量体（ＴＴＴ））、又は非天然修飾を含有する。
分子モータシステムは、走路部位分子に加えて、インプットプライマー又はアウトプットプライマーと呼ばれるプライマーを含み、それは、延長されて、クローラ分子及び／又はウォーカ分子となる。プライマーについては本明細書の他所で説明する。
分子モータ反応の完全な「ステップ」を図３１Ａに示す。インプットプライマー（「ａ」）は、走路部位分子のトーホールドドメイン（「ａ＊」）と結合して、反応を開始する。ポリメラーゼ（例えば、鎖置換ポリメラーゼ）とｄＮＴＰを含有する反応溶液中の走路部位分子との結合時に、初期プライマーは、対ドメインを介して伸長され、対ドメインの置換鎖（サブドメイン「１＋ｂ」）を置換する。次に、置換された鎖は、テンプレート鎖上のその相補的結合ドメインとの結合（再アニーリング）について延長プライマーと競合し、これにより、延長アウトプットプライマーを置換する。これによって、反応のステップが完了する。その後、置換されたアウトプットプライマー「１＋ｂ」は、反応の次のステップで、引き続きインプットプライマーとして機能し得る。
一部の実施形態では、プライマー又はプライマードメイン（走路部位分子のトーホールドドメインと結合するヌクレオチド配列）は、１０〜５０ヌクレオチド長である。例えば、プライマー又はプライマードメインは、１０〜４５、１０〜４０、１０〜３５、１０〜３０、１０〜２５、１０〜２０、１０〜１５、１５〜５０、１５〜４５、１５〜４０、１５〜３５、１５〜３０、１５〜２５、１５〜２０、２０〜５０、２０〜４５、２０〜４０、２０〜３５、２０〜３０、２０〜２５、２５〜５０、２５〜４５、２５〜４０、２５〜３５、２５〜３０、３０〜５０、３０〜４５、３０〜４０、３０〜３５、３５〜５０、３５〜４５、３５〜４０、４０〜５０、４０〜４５又は４５〜５０ヌクレオチド長であってよい。一部の実施形態では、プライマー又はプライマードメインは、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、プライマー又はプライマードメインは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長である。プライマー又はプライマードメインは、一部の実施形態において、５０ヌクレオチドより長いか、又は１０ヌクレオチドより短い。プライマーの完全長は、少なくとも部分的に、付加（重合）配列の数及び長さに応じて変動し、これらが、反応物中に存在する走路部位分子の数及び長さに依存することは理解すべきである。
本明細書に記載するプライマーは、検出可能な分子（例えば、蛍光又は化学発光シグナルなどの検出可能なシグナルを発する分子）に連結（で標識）してもよい。一部の実施形態では、標識は、蛍光色素である。蛍光色素又は他の蛍光／化学発光分子と連結したプライマーは、単純に「蛍光プライマー」と呼ばれる。本明細書で使用することができる蛍光色素の例として、限定はしないが、ヒドロキシクマリン、メトキシクマリン、Alexa Fluor、アミノクマリン、Cy2、FAM、Alexa fluor 405、Alexa fluor 488、Fluorescein FITC、Alexa fluor 430、Alexa fluor 532、HEX、Cy3、TRITC、Alexa fluor 546、Alexa fluor 555、R-phycoerythrin（PE）、Rhodamine Red-X、Tamara、Cy3.5 581、Rox、Alexa fluor 568、Red 613、Texas Red、Alexa fluor 594、Alexa fluor 633、Allophycocyanin、Alexa fluor 647、Cy5、Alexa fluor 660、Cy5.5、TruRed、Alexa fluor 680、Cy7及びCy7.5が挙げられる。検出可能なシグナルを発する他の蛍光色素及び分子は、本開示に包含される。
一部の実施形態では、検出可能な分子は、プライマーではなく、むしろ走路部位分子に連結される。
一部の実施形態では、走路部位分子は、生体分子に連結される。生体分子としては、例えば、核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）及びタンパク質が挙げられる。生体分子は、治療、予防、診断又はイメージング用分子であってよい。一部の実施形態では、生体分子は、癌関連遺伝子若しくはタンパク質、又はＦＤＡ承認若しくは潜在的薬物標的などの疾患関連又は薬物関連生体分子である。一部の実施形態では、生体分子は、酵素、抗原、受容体、リガンド、膜タンパク質、分泌されたタンパク質、又は転写因子である。
分子モータシステムは、ポリメラーゼの使用を必要とする。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、ＤＮＡ鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡＰ）である。「鎖置換」は、合成中に遭遇する下流のＤＮＡを置換する能力を意味する。本明細書に記載されるように、使用することができるＤＮＡ鎖置換活性を有するポリメラーゼの例として、限定はしないが、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、NEB #M0269）、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、ラージフラグメント（例えば、NEB #M0275）、又はＢｓｕ ＤＮＡポリメラーゼ、ラージフラグメント（例えば、NEB #M0330）が挙げられる。鎖置換活性を有する他のポリメラーゼを用いてもよい。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼである。
一部の実施形態では、ポリメラーゼは、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼである。こうした実施形態において、反応条件は、次の通りであってよい：精製済ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で補充した１×反応バッファー（例えば、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、４ｍＭ ＤＴＴ）、ｐＨ７．５、３０℃でインキュベート。
一部の実施形態では、ポリメラーゼは、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、ラージフラグメントである。こうした実施形態において、反応条件は、次の通りであってよい：１×反応バッファー（例えば、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％TRITON（登録商標）X-100）、ｐＨ８．８、６５℃でインキュベート。
一部の実施形態では、ポリメラーゼは、Ｂｓｕ ＤＮＡポリメラーゼである。こうした実施形態において、反応条件は、次の通りであってよい：１×反応バッファー（例えば、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ）、ｐＨ７．９、３７℃でインキュベート。
反応システム中のプライマー、分子走路及びｄＮＴＰの濃度は、例えば、具体的な適用、及びその具体的な適用に要求される速度論に応じて変動し得る。
反応物中のプライマーの濃度は、例えば、１０ｎＭ〜１０００ｎＭであってよい。一部の実施形態では、反応物中のプライマーの濃度は、１０〜２０、１０〜３０、１０〜４０、１０〜５０、１０〜６０、１０〜７０、１０〜８０、１０〜９０、１０〜１００、１０〜１２５、１０〜１５０、１０〜２００、２５〜５０、２５〜７５、２５〜１００、２５〜１５０、２５〜２００、５０〜７５、５０〜１００、５０〜１５０又は５０〜２００ｎＭである。一部の実施形態では、反応物中のプライマーの濃度は、１００〜２００、１００〜３００、１００〜４００、１００〜５００、１００〜６００、１００〜７０、１００〜８００、１００〜９００又は１００〜１０００ｎＭである。一部の実施形態では、反応物中のプライマーの濃度は、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５又は２００ｎＭである。一部の実施形態では、反応物中のプライマーの濃度は、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００又は１０００ｎＭである。反応物中のプライマーの濃度は、１０ｎＭ未満又は１０００ｎＭ超であってもよい。
反応物中の走路部位分子の濃度は、例えば、５ｎＭ〜１０００ｎＭであってよい。一部の実施形態では、反応物中の走路部位分子の濃度は、５〜１０、５〜２０、５〜３０、５〜４０、５〜５０、５〜６０、５〜７０、５〜８０、５〜９０、５〜１００、５〜１２５、５〜１５０、５〜２００、１０〜５０、１０〜７５、１０〜１００、１０〜１５０、１０〜２００、２５〜７５、２５〜１００、２５〜１２５又は２５〜２００ｎＭである。一部の実施形態では、反応物中の走路部位分子の濃度は、１０〜２００、１０〜３００、１０〜４００、１０〜５００、１０〜６００、１０〜７０、１０〜８００、１０〜９００又は１０〜１００ｎＭである。一部の実施形態では、反応物中の走路部位分子の濃度は、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５又は２００ｎＭである。一部の実施形態では、反応物中の走路部位分子の濃度は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ｎＭである。反応物中の走路部位分子の濃度は、５ｎＭ未満又は１０００ｎＭ超であってもよい。
反応物中のプライマーと走路部位分子の比は、２：１〜１００：１であってよい。一部の実施形態では、プライマーと分子モータの比は、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１又は２０：１である。一部の実施形態では、プライマーと走路部位分子の比は、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１又は９０：１である。
反応物中の異なる走路部位分子の数は、非限定的である。反応物は、１〜１０１０個の異なる走路部位分子（各々、例えば、特定のトーホールドドメイン配列を有する）を含んでもよい。一部の実施形態では、反応物は、１〜１０、１〜１０２、１〜１０３、１〜１０４、１〜１０５、１〜１０６、１〜１０７、１〜１０８、１〜１０９、１〜１０１０個、又はそれ以上の異なる走路部位分子を含む。一部の実施形態では、反応物は、１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２５、１〜３０、１〜３５、１〜４０、１〜４５、１〜５０、１〜５５、１〜６０、１〜６５、１〜７０、１〜７５、１〜８０、１〜８５、１〜９０、１〜９５、１〜１００、５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜３０、５〜３５、５〜４０、５〜４５、５〜５０、５〜５５、５〜６０、５〜６５、５〜７０、５〜７５、５〜８０、５〜８５、５〜９０、５〜９５、５〜１００、１０〜１５、１０〜２０、１０〜２５、１０〜３０、１０〜３５、１０〜４０、１０〜４５、１０〜５０、１０〜５５、１０〜６０、１０〜６５、１０〜７０、１０〜７５、１０〜８０、１０〜８５、１０〜９０、１０〜９５又は１０〜１００個の異なる走路部位分子を含む。一部の実施形態では、反応物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５個の異なる走路部位分子を含む。走路部位分子は、例えば、それらのトーホールドドメインが互いに異なっていれば、互いに異なる。
反応の速度論は、例えば、温度、時間、バッファー／塩条件、及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）濃度を変えることにより制御され得る。ほとんどの酵素と同様、ポリメラーゼは、イオン強度、ｐＨ及び存在する金属イオンの種類（例えば、ナトリウムイオン対マグネシウムイオン）をはじめとする様々なバッファー条件に対して感受性である。従って、反応が実施される温度は、例えば、４℃〜６５℃（例えば、４℃、２５℃、３７℃、４２℃又は６５℃）の範囲で変動し得る。一部の実施形態では、反応が実施される温度は、４℃〜２５℃、４℃〜３０℃、４℃〜３５℃、４℃〜４０℃、４℃〜４５℃、４℃〜５０℃、４℃〜５５℃、４℃〜６０℃、１０〜２５℃、１０℃〜３０℃、１０℃〜３５℃、１０℃〜４０℃、１０℃〜４５℃、１０℃〜５０℃、１０℃〜５５℃、１０℃〜６０℃、２５〜３０℃、２５℃〜３５℃、２５℃〜４０℃、２５℃〜４５℃、２５℃〜５０℃、２５℃〜５５℃、２５℃〜６０℃、２５℃〜６５℃、３５℃〜４０℃、３５℃〜４５℃、３５℃〜５０℃、３５℃〜５５℃、３５℃〜６０℃、又は３５℃〜６５℃である。一部の実施形態では、反応は室温で実施されるが、他の実施形態では、反応は、３７℃で実施される。
反応は、３０分（ｍｉｎ）〜２４時間（ｈｒ）にわたって実施（インキュベート）してよい。一部の実施形態では、反応は、１０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、６０分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１８時間又は２４時間にわたって実施される。
反応物中のｄＮＴＰの濃度は、例えば、２〜１０００μＭであってよい。一部の実施形態では、反応物中のｄＮＴＰの濃度は、２〜１０μＭ、２〜１５μＭ、２〜２０μＭ、２〜２５μＭ、２〜３０μＭ、２〜３５μＭ、２〜４０μＭ、２〜４５μＭ、２〜５０μＭ、２〜５５μＭ、２〜６０μＭ、２〜６５μＭ、２〜７０μＭ、２〜７５μＭ、２〜８０μＭ、２〜８５μＭ、２〜９０μＭ、２〜９５μＭ、２〜１００μＭ、２〜１１０μＭ、２〜１２０μＭ、２〜１３０μＭ、２〜１４０μＭ、２〜１５０μＭ、２〜１６０μＭ、２〜１７０μＭ、２〜１８０μＭ、２〜１９０μＭ、２〜２００μＭ、２〜２５０μＭ、２〜３００μＭ、２〜３５０μＭ、２〜４００μＭ、２〜４５０μＭ、２〜５００μＭ、２〜６００μＭ、２〜７００μＭ、２〜８００μＭ、２〜９００μＭ又は２〜１０００μＭである。例えば、反応物中のｄＮＴＰ濃度は、２μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、５０μＭ、５５μＭ、６０μＭ、６５μＭ、７０μＭ、７５μＭ、８０μＭ、８５μＭ、９０μＭ、９５μＭ、１００μＭ、１０５μＭ、１１０μＭ、１１５μＭ、１２０μＭ、１２５μＭ、１３０μＭ、１３５μＭ、１４０μＭ、１４５μＭ、１５０μＭ、１５５μＭ、１６０μＭ、１６５μＭ、１７０μＭ、１７５μＭ、１８０μＭ、１８５μＭ、１９０μＭ、１９５μＭ又は２００μＭであってよい。一部の実施形態では、反応物中のｄＮＴＰ濃度は、１０〜２０μＭ、１０〜３０μＭ、１０〜４０μＭ、１０〜５０μＭ、１０〜６０μＭ、１０〜７０μＭ、１０〜８０μＭ、１０〜９０μＭ又は１０〜１００μＭである。
一部の実施形態では、ｄＮＴＰ変異体を使用する。例えば、分子モータシステムは、ホットスタート／クリーンアンプ（hot start/clean amp）ｄＮＴＰ、ホスホロチオエートｄＮＴＰ、又は蛍光ｄＮＴＰを使用し得る。他のｄＮＴＰ変異体を用いてもよい。
一部の実施形態では、精製済タンパク質サンプルの単一分子レベルで、個々のタンパク質分子の同定に基づくタンパク質「フィンガープリント法」に分子モータを用いてもよい。タンパク質の配列情報は、核酸の配列情報に変換することができ、次に、例えば、分子クローラにより、これを記録及び報告することができる。
タンパク質フィンガープリント法は、一部の実施形態において、以下の方法により達成される（図４０）。（１）タンパク質分子を表面に付着させ、変性させた後、伸張する。タンパク質分子は、Ｎ末端又はＣ末端特異的ケミカルカップリング法により、表面に固定する。表面結合タンパク質分子は、尿素又はドデシル硫酸ナトリウムなどの一般的変性剤で変性させることができ、外力の適用、例えば、表面から離れた末端に磁気ビーズを付着させ、磁界を適用することにより、又は同様に、荷電粒子及び電界を使用することにより、伸張することができる。（２）ユニークな識別子を含有するＤＮＡ鎖により、アミノ酸残基を特異的に標識する。ＤＮＡとアミノ酸残基同士のケミカルカップリングは、アミノ酸特異的化学修飾法によって達成することができる。例えば、リシン残基は、ＮＨＳ−エステルケミストリーで修飾することができ、システイン残基は、マレイミド基と選択的に相互作用することができる。アミノ酸と結合したＤＮＡ鎖は、標的アミノ酸のアイデンティティ情報を単にコードすることもできるし、又は特定の部位のユニークな分子情報も含むことができる（例えば、ランダム化配列により）。３）分子クローラは、標識部位を検査し、配列情報を記録する。分子クローラは、下流分子構成要素が、プログラムされた様式で、インサイチュで合成され、標的分子からの情報をコピーすることを可能にする原理に基づいて動作する。分子クローラの群は、空間内を動き回り、超並列方式で、分子地形の量的及び幾何学的情報を調べて、記録する。複数のクローラが、同じ標的に作用することができるため、部分的に余剰の記録を生成することができる。（４）記録が放出され、収集される。記録は、相補鎖のインサイチュ合成により、又は熱媒介性脱ハイブリダイゼーションによって放出することができる。（５）検索された記録を、ポリメラーゼ連鎖反応及びゲル電気泳動により、又は次世代シーケンシングによって分析する。（６）記録からの余剰及び部分的に重複する配列情報を用いて、標識アミノ酸の配列を構築する。標識アミノ酸は、標的タンパク質の全アミノ酸配列のサブセットを表す。次に、この部分配列の情報を、全ゲノムシーケンシングからの遺伝子的に同定した全てのタンパク質コード配列のライブラリーと比較及びマッチングし、このようにして、タンパク質のアイデンティティを明らかにすることができる。
分子定規
生物学的研究は、分子相互作用について量的、感受性及びシステムレベルの情報を報告することができるツールを必要とする。これらのツールは、１分子のレベルで、長期にわたり相互作用を報告する能力を有すると同時に、膨大且つ多様な相互作用を処理しなければならない。本明細書には、「分子定規」と呼ばれる分子記録システムも提供され、これは、ＤＮＡ分子内の距離情報を記録することによって標的分子間のナノスケール距離を記録する（図３１Ａ〜３１Ｂ）。生成されたＤＮＡ記録の長さは、測定される距離に直接対応する。加えて、各ＤＮＡ記録は、その配列の一部として、標的分子のアイデンティティをコードする。１ラウンドの記録生成は以下のように進行する（図３４Ｂを参照）：（ａ）標的にＤＮＡ記録の前駆体を接種する。（ｂ）前駆体は、それらがパートナー核酸と遭遇するまで、鎖置換ポリメラーゼ及び触媒分子（例えば、触媒ヘアピン）の助けによって成長する。パートナー同士がハイブリダイズし、延長して記録を生成し、各々が他方をテンプレートとして用いる。（ｃ）記録が放出され、標的はリセットされて、更なる記録ラウンドを可能にする。複数の記録ラウンドによって、複数の隣接物との距離、さらには距離の変化／相違を報告する記録が得られる。
距離は、ＤＮＡ記録の長さにコードされ（１進符号化（unary encoding））、これは自律的に生成され、各々の標的ペアについて複数の記録が生成される。分子定規は、変化する距離の追跡を続けることができ、距離分布を報告する（超解像フィッティング）。生成された記録の読み出しは、ゲル電気泳動を介して記録され、それをほぼ全ての研究室に対してアクセス可能にする。
分子定規は、標的分子の溶液、又は固相若しくはインサイチュでの距離を記録することができる。分子定規によって、ほぼ全ての研究室が、一般的で、しかも安価な試薬及び計器を用いることにより、分子距離測定の実施が可能になる。アウトプットは、ＤＮＡ分子の形態であることから、多くの情報を簡潔にコードすることができ、この技術は、大規模な多重化能力を有する。特定のニーズに応じて、ゲル電気泳動などの迅速且つ一般的なアッセイを用いて、アウトプットを読み取ることができ、あるいは、次世代シーケンシングのハイスループット及び単一分子能力を利用することができる。これらの特徴は、例えば、本明細書に記載される分子定規技術が、タンパク質相互作用をアッセイし、タンパク質複合体組織化を研究し、染色体立体配座を明らかにすることを可能にする。
分子定規は、一部の実施形態において、標的生体分子に結合した触媒分子と相互作用する複数の自由（非結合）触媒分子（上記）を含む。これらの相互作用は、分子定規反応物中に存在するプライマーによって開始され、置換された伸長産物（続くサイクルでインプットプライマーとして機能する、１サイクルにおけるアウトプットプライマー）により媒介される。分子定規システムの一例を図３６Ａ〜３６Ｈに示す。
各標的生体分子（グレーの丸と黒い丸）を触媒分子（この例ではヘアピン）と連結する（図３６Ａ）。反応物は、さらに、触媒分子の１つのトーホールドドメインに結合するプライマーと、他方の触媒分子のトーホールドドメインに結合するもう１つのプライマーも含む（図３６Ｂ）。鎖置換ポリメラーゼ及びｄＮＴＰの存在下での、プライマーとトーホールドドメインとの結合は、各分子の伸長プロセスを開始する。プライマーは、対ドメインを通して延長され、対ドメインの塩基対を破壊する。置換された鎖は、延長産物と競合して、元の対ドメインを再形成し（図３６Ｃ）、次に、置換された延長産物は、反応物中に存在する別の自由触媒分子に結合するためのプライマーの役割を果たす（図３６Ｄ）。置換された延長産物と自由触媒分子との結合（図３６Ｅ）は、自由触媒分子の対ドメインを介した重合、続いて、さらなる延長産物（現時点で、生体分子に結合した両方の触媒分子からの情報（ＤＮＡ）及び自由触媒分子からの情報（ＤＮＡ）を含む）の置換を開始する（図３６Ｆ）。このプロセスは、反応物中の他の自由触媒分子と一緒に、各々のサイクルが、生体分子に連結した触媒分子を成長させるポリマーに新たな情報を加えながら、２つのポリマーが会合して、互いに結合するまで継続する（図３６Ｇ）。この時点で、重合は、ポリマーの全長にわたって進行し、全ての分子定規相互作用の二本鎖核酸記録を形成する（図３６Ｈ）。核酸記録の長さは、２つの生体分子間の距離に対応する。
図３７Ａは、二本鎖ＤＮＡロッドの両端の間の距離を記録する分子定規の別の例を示す。ＤＮＡ配列ドメインは、文字として、場合によっては添え字（例えば、ａ、ｂ、ａ１など）と共に示される。Ａ「＊」の符号は、ドメインの配列補体を示す（例えば、ｒ＊は、ｒの配列補体である）。記録は、自律的に進行するが、概念として、４つのステップで行われると理解することができる。（１）接種：前駆体が、ＤＮＡロッドとハイブリダイズする。（２）活性化：前駆体が、鎖置換ポリメラーゼ（例えば、ＢＳＴラージフラグメント）及びｄＮＴＰの助けにより、バーコード配列（この例では、ａ１又はａ２）及び活性化ドメイン（ｒｒｒ又はｒ＊ｒ＊ｒ＊）をコピーする。これらは、「停止配列」（ここでは、ｓ又はｓ＊）により停止される。停止配列は、溶液中に補充される対応ヌクレオチド（例えば、ｄＧＴＰ）を含まない１つ又は複数のＤＮＡ塩基／ヌクレオチド（例えば、ＧＧＧ）の１区間である。従って、これらは、ポリメラーゼが、それ以上のヌクレオチドをコピーすることを停止する。重合を終結させる他の分子を用いてもよい。（３）成長：活性化ドメイン（ここでは、ｒｒｒ及びｒ＊ｒ＊ｒ＊）は、前駆体が、触媒ヘアピンと相互作用して、配列ドメイン（ここでは、ｒ及びｒ＊）を繰り返し付加することを可能にする。（４Ａ）放出：前駆体が十分な長さまで成長すると、これらは、互いに会合して、相補的ドメイン（ここでは、ｒ及びｒ＊）を介してハイブリダイズすることができる。次に、ポリメラーゼが、各々他方をテンプレートとして用いて、溶液中に放出されるまで、これらを伸長することができる。放出された記録は、ＤＮＡロッドの両端の間の距離の尺度である。（４Ｂ）リセット：ＤＮＡロッドは、この場合、さらなる前駆体を接種して、より多くの記録を生成することができ、これにより、距離の反復測定値が得られる。
図３７Ｂ及び３７Ｃは、成長ステップ（図３７Ａのステップ３）の一例のさらに詳細を示す。成長ステップでは、短い配列ドメイン（ｒ又はｒ＊）が、繰り返し且つ自律的に、活性化前駆体分子の末端に付加される。活性化前駆体（図３７Ａでは、ａ１ ｒｒｒ又はａ２ ｒ＊ｒ＊ｒ＊）は、触媒成長ヘアピンのトーホールドドメインとハイブリダイズする。配列は、鎖置換ポリメラーゼ及びｄＮＴＰの助けにより、単一ドメイン（ｒ又はｒ＊）だけ延長される。これらは、停止配列（ｘ）によってそれ以上の延長が停止される。この時点で、新しくコピーされたドメインを触媒分子から置換することができる。短いトーホールドドメイン（ｒｒｒ又はｒ＊ｒ＊ｒ＊）は、この複合体から自発的に解離する。解離した活性化前駆体分子は、現時点で、末端の３つのドメイン（ｒｒｒ又はｒ＊ｒ＊ｒ＊）を介して成長ステップに再び参加することができる。
分子定規は、前述した触媒分子（例えば、触媒ヘアピン分子）の変形である。分子定規（例えば、標的生体分子に結合した核酸分子）の長さは、変動し得る。一部の実施形態では、分子定規は、２５〜３００ヌクレオチド長である。例えば、分子定規は、２５〜２５０、２５〜２００、２５〜１５０、２５〜１００、２５〜５０、５０〜３００、５０〜２５０、５０〜２００、５０〜１５０又は５０〜１００ヌクレオチド長であってよい。一部の実施形態では、分子定規は、３０〜５０、４０〜６０、５０〜７０、６０〜８０、７０〜９０、８０〜１００、１００〜１２５、１００〜１５０又は１００〜２００ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、分子定規は、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９．５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００ヌクレオチド長である。分子定規は、一部の実施形態において、３００ヌクレオチドより長いか、又は２５ヌクレオチドより短い。
前述した「トーホールドドメイン」は、分子定規の３’末端に位置するヌクレオチドの不対配列を指し、プライマー（又はプライマーのプライマードメイン）のヌクレオチド配列と相補的である（且つ結合する）。トーホールドドメインの長さは、変動し得る。一部の実施形態では、トーホールドドメインは、５〜４０ヌクレオチド長である。例えば、トーホールドドメインは、２〜３５、２〜３０、２〜２５、２〜２０、２〜１５、２〜１０、５〜３５、５〜３０、５〜２５、５〜２０、５〜１５、５〜１０、１０〜４０、１０〜３５、１０〜３０、１０〜２５、１０〜２０、１０〜１５、１５〜４０、１５〜３５、１５〜３０、１５〜２５、１５〜２０、２０〜４０、２０〜３５、２０〜３０、２０〜２５、２５〜４０、２５〜３５、２５〜３０、３０〜４０、３０〜３５又は３５〜４０ヌクレオチド長であってよい。一部の実施形態では、トーホールドドメインは、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５又は４０ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、トーホールドドメインは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長である。トーホールドドメインは、一部の実施形態において、４０ヌクレオチドより長いか、又は５ヌクレオチドより短い。
分子定規の「対ドメイン」は、分子定規の不対トーホールドドメインに隣接して（且つそれから５’側に）位置するヌクレオチドの対配列（例えば、ワトソン・クリック型核酸塩基対）を指す。分子定規の対ドメインは、テンプレート鎖のドメインと置換鎖のドメインとの塩基対により、又は同じ核酸鎖のドメイン同士の分子内塩基対（ヘアピン構造を形成する）によって形成される。対ドメインの長さは、変動し得る。一部の実施形態では、対ドメインは、５〜４０ヌクレオチド長である。例えば、対ドメインは、５〜３５、５〜３０、５〜２５、５〜２０、５〜１５、５〜１０、１０〜４０、１０〜３５、１０〜３０、１０〜２５、１０〜２０、１０〜１５、１５〜４０、１５〜３５、１５〜３０、１５〜２５、１５〜２０、２０〜４０、２０〜３５、２０〜３０、２０〜２５、２５〜４０、２５〜３５、２５〜３０、３０〜４０、３０〜３５又は３５〜４０ヌクレオチド長であってよい。一部の実施形態では、対ドメインは、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５又は４０ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、対ドメインは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長である。対ドメインは、一部の実施形態において、４０ヌクレオチドより長いか、又は５ヌクレオチドより短い。
一部の実施形態では、鎖置換ポリメラーゼによるプライマー（プライマー結合部位に結合してる）の延長は、分子定規中の重合を終結させる分子又は修飾の存在によって終結する。従って、一部の実施形態では、本開示分子定規は、重合を終結させる分子又は修飾を含む。重合を終結させる分子又は修飾（「ストッパー」）は、典型的には、重合が、対ドメインを介してプライマーの延長を終結させるように、分子定規のテンプレート鎖上の対ドメイン内に位置する。一部の実施形態では、重合を終結させる分子は、合成非ＤＮＡリンカー、例えば、Int Spacer 9（iSp9）又はSpacer 18（Integrated DNA Technologies（IDT））などのトリエチレングリコールスペーサである。ポリメラーゼによる重合を終結させる任意の非ネイティブリンカーを本明細書に記載のように使用してもよいことは理解すべきである。こうした分子及び修飾の他の非限定的な例として、三炭素結合（/iSpC3/）（IDT）、ACRYDITE（商標）（IDT）、アデニル化、アジ化物、ジゴキシゲニン（ＮＨＳエステル）、コレステリル−ＴＥＧ（IDT）、I-LINKER（商標）（IDT）、及び３−シアノビニルカルバゾール（ＣＮＶＫ）及びこれらの変異体が挙げられる。典型的には、しかし常にではないが、短いリンカー（例えば、iSp9）は、より高速の反応時間をもたらす。
一部の実施形態では、重合を終結させる分子は、それぞれ、シトシン及びグアニンの化学変異体である、iso-dG及びiso-dC（IDT）などの単一又は対の非天然ヌクレオチド配列である。Iso-dCは、Iso-dGと塩基対合（水素結合）するが、dGとはしない。同様に、Iso-dGは、Iso-dCと塩基対合するが、dCとはしない。ヘアピンの反対側の対のストッパー位置にこれらのヌクレオチドを組み込むと、その位置に付加すべき溶液中の相補的ヌクレオチドがないため、ポリメラーゼは停止される。
一部の実施形態では、「ストッパー」修飾の性能の効率は、反応物中のｄＮＴＰ濃度を（例えば、２００μＭから）１００μＭ、１０μＭ、１μＭ、又はそれ以下まで低下させることにより向上する。
重合を終結させる分子又は修飾を含有させると、分子又は修飾が対ではないため、触媒分子の二本鎖ドメイン（例えば、ヘアピン構造の場合、ステムドメイン）中に「バルジ」を生成することが多い。従って、一部の実施形態では、分子定規は、分子又は修飾の反対側に、単一のヌクレオチド（例えば、チミン）、少なくとも２つの同じヌクレオチド（例えば、チミン二量体（ＴＴ）若しくは三量体（ＴＴＴ））、又は非天然修飾を含有するように設計される。
分子定規反応システムは、さらに、インプットプライマー又はアウトプットプライマーと呼ばれるプライマーも含む。プライマーについては本明細書の他所で説明する。
分子定規反応の完全な「ステップ」を図３７Ａ〜３７Ｃに示す。
一部の実施形態では、プライマー又はプライマードメイン（分子定規のトーホールドドメインと結合するヌクレオチド配列）は、１０〜５０ヌクレオチド長である。例えば、プライマー又はプライマードメインは、１０〜４５、１０〜４０、１０〜３５、１０〜３０、１０〜２５、１０〜２０、１０〜１５、１５〜５０、１５〜４５、１５〜４０、１５〜３５、１５〜３０、１５〜２５、１５〜２０、２０〜５０、２０〜４５、２０〜４０、２０〜３５、２０〜３０、２０〜２５、２５〜５０、２５〜４５、２５〜４０、２５〜３５、２５〜３０、３０〜５０、３０〜４５、３０〜４０、３０〜３５、３５〜５０、３５〜４５、３５〜４０、４０〜５０、４０〜４５又は４５〜５０ヌクレオチド長であってよい。一部の実施形態では、プライマー又はプライマードメインは、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、プライマー又はプライマードメインは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長である。プライマー又はプライマードメインは、一部の実施形態において、５０ヌクレオチドより長いか、又は１０ヌクレオチドより短い。プライマーの完全長は、少なくとも部分的に、付加（重合）配列の数及び長さに応じて変動し、これは、反応物中に存在する自由（タンパク質などの生体分子に連結していない）触媒分子の数及び長さ、並びに触媒分子が連結される標的生体分子間の距離に依存することは理解すべきである。
本明細書に記載するプライマーは、検出可能な分子（例えば、蛍光又は化学発光シグナルなどの検出可能なシグナルを発する分子）と連結（で標識）してもよい。一部の実施形態では、標識は、蛍光色素である。蛍光色素又は他の蛍光／化学発光分子と連結したプライマーは、単純に「蛍光プライマー」と呼ばれる。本明細書で使用することができる蛍光色素の例として、限定はしないが、ヒドロキシクマリン、メトキシクマリン、Alexa Fluor、アミノクマリン、Cy2、FAM、Alexa fluor 405、Alexa fluor 488、Fluorescein FITC、Alexa fluor 430、Alexa fluor 532、HEX、Cy3、TRITC、Alexa fluor 546、Alexa fluor 555、R-phycoerythrin（PE）、Rhodamine Red-X、Tamara、Cy3.5 581、Rox、Alexa fluor 568、Red 613、Texas Red、Alexa fluor 594、Alexa fluor 633、Allophycocyanin、Alexa fluor 647、Cy5、Alexa fluor 660、Cy5.5、TruRed、Alexa fluor 680、Cy7及びCy7.5が挙げられる。検出可能なシグナルを発する他の蛍光色素及び分子は、本開示に包含される。
一部の実施形態では、検出可能な分子は、プライマーではなく、むしろ分子定規と連結させる。
一部の実施形態では、分子定規は、生体分子と連結させる。生体分子としては、例えば、核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）及びタンパク質が挙げられる。生体分子は、治療、予防、診断又はイメージング用分子であってよい。一部の実施形態では、生体分子は、癌関連遺伝子若しくはタンパク質、又はＦＤＡ承認若しくは潜在的薬物標的などの疾患関連又は薬物関連生体分子である。一部の実施形態では、生体分子は、酵素、抗原、受容体、リガンド、膜タンパク質、分泌されたタンパク質、又は転写因子である。
分子定規反応には、ポリメラーゼの使用が必要である。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、ＤＮＡ鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡＰ）である。「鎖置換」は、合成中に遭遇する下流のＤＮＡを置換する能力を意味する。本明細書に記載されるように、使用することができるＤＮＡ鎖置換活性を有するポリメラーゼの例として、限定はしないが、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、NEB #M0269）、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、ラージフラグメント（例えば、NEB #M0275）、又はＢｓｕ ＤＮＡポリメラーゼ、ラージフラグメント（例えば、NEB #M0330）が挙げられる。鎖置換活性を有する他のポリメラーゼを用いてもよい。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼである。
一部の実施形態では、ポリメラーゼは、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼである。こうした実施形態において、反応条件は、次の通りであってよい：精製済ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で補充した１×反応バッファー（例えば、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、４ｍＭ ＤＴＴ）、ｐＨ７．５、３０℃でインキュベート。
一部の実施形態では、ポリメラーゼは、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、ラージフラグメントである。こうした実施形態において、反応条件は、次の通りであってよい：１×反応バッファー（例えば、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％TRITON（登録商標）X-100）、ｐＨ８．８、６５℃でインキュベート。
一部の実施形態では、ポリメラーゼは、Ｂｓｕ ＤＮＡポリメラーゼである。こうした実施形態において、反応条件は、次の通りであってよい：１×反応バッファー（例えば、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ）、ｐＨ７．９、３７℃でインキュベート。
反応システム中のプライマー、触媒分子及びｄＮＴＰの濃度は、例えば、具体的な適用、及びその具体的な適用に要求される速度論に応じて変動し得る。
反応物中のプライマーの濃度は、例えば、１０ｎＭ〜１０００ｎＭであってよい。一部の実施形態では、反応物中のプライマーの濃度は、１０〜２０、１０〜３０、１０〜４０、１０〜５０、１０〜６０、１０〜７０、１０〜８０、１０〜９０、１０〜１００、１０〜１２５、１０〜１５０、１０〜２００、２５〜５０、２５〜７５、２５〜１００、２５〜１５０、２５〜２００、５０〜７５、５０〜１００、５０〜１５０又は５０〜２００ｎＭである。一部の実施形態では、反応物中のプライマー濃度は、１００〜２００、１００〜３００、１００〜４００、１００〜５００、１００〜６００、１００〜７０、１００〜８００、１００〜９００又は１００〜１０００ｎＭである。一部の実施形態では、反応物中のプライマー濃度は、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５又は２００ｎＭである。一部の実施形態では、反応物中のプライマー濃度は、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００又は１０００ｎＭである。反応物中のプライマーの濃度は、１０ｎＭ未満又は１０００ｎＭ超であってもよい。
反応物中の分子定規及び／又は触媒分子の濃度は、例えば、５ｎＭ〜１０００ｎＭであってよい。一部の実施形態では、反応物中の分子定規及び／又は触媒分子の濃度は、５〜１０、５〜２０、５〜３０、５〜４０、５〜５０、５〜６０、５〜７０、５〜８０、５〜９０、５〜１００、５〜１２５、５〜１５０、５〜２００、１０〜５０、１０〜７５、１０〜１００、１０〜１５０、１０〜２００、２５〜７５、２５〜１００、２５〜１２５又は２５〜２００ｎＭである。一部の実施形態では、反応物中の分子定規及び／又は触媒分子の濃度は、１０〜２００、１０〜３００、１０〜４００、１０〜５００、１０〜６００、１０〜７０、１０〜８００、１０〜９００又は１０〜１００ｎＭである。一部の実施形態では、反応物中の分子定規及び／又は触媒分子の濃度は、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５又は２００ｎＭである。一部の実施形態では、反応物中の分子定規及び／又は触媒分子の濃度は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ｎＭである。反応物中の分子定規及び／又は触媒分子の濃度は、５ｎＭ未満又は１０００ｎＭ超であってもよい。
反応物中のプライマーと分子定規及び／又は触媒分子の比は、２：１〜１００：１であってよい。一部の実施形態では、プライマーと分子定規及び／又は触媒分子の比は、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１又は２０：１である。一部の実施形態では、プライマーと分子定規及び／又は触媒分子の比は、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１又は９０：１である。
反応物中の異なる分子定規及び／又は触媒分子の数は、非限定的である。反応物は、１〜１０１０個の異なる分子定規及び／又は触媒分子（各々、例えば、特定のトーホールドドメイン配列を有する）を含んでもよい。一部の実施形態では、分子定規反応物は、１〜１０、１〜１０２、１〜１０３、１〜１０４、１〜１０５、１〜１０６、１〜１０７、１〜１０８、１〜１０９、１〜１０１０個、又はそれ以上の異なる分子定規及び／又は触媒分子を含む。一部の実施形態では、反応物は、１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２５、１〜３０、１〜３５、１〜４０、１〜４５、１〜５０、１〜５５、１〜６０、１〜６５、１〜７０、１〜７５、１〜８０、１〜８５、１〜９０、１〜９５、１〜１００、５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜３０、５〜３５、５〜４０、５〜４５、５〜５０、５〜５５、５〜６０、５〜６５、５〜７０、５〜７５、５〜８０、５〜８５、５〜９０、５〜９５、５〜１００、１０〜１５、１０〜２０、１０〜２５、１０〜３０、１０〜３５、１０〜４０、１０〜４５、１０〜５０、１０〜５５、１０〜６０、１０〜６５、１０〜７０、１０〜７５、１０〜８０、１０〜８５、１０〜９０、１０〜９５又は１０〜１００個の異なる分子定規及び／又は触媒分子を含む。一部の実施形態では、反応物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５個の異なる分子定規及び／又は触媒分子を含む。分子定規は、例えば、それらのトーホールドドメインが互いに異なっていれば、互いに異なる。
反応の速度論は、例えば、温度、時間、バッファー／塩条件、及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）濃度を変えることにより制御され得る。ほとんどの酵素と同様に、ポリメラーゼは、イオン強度、ｐＨ及び存在する金属イオンの種類（例えば、ナトリウムイオン対マグネシウムイオン）をはじめとする様々なバッファー条件に対して感受性である。従って、反応が実施される温度は、例えば、４℃〜６５℃（例えば、４℃、２５℃、３７℃、４２℃又は６５℃）の範囲で変動し得る。一部の実施形態では、反応が実施される温度は、例えば、４℃〜２５℃、４℃〜３０℃、４℃〜３５℃、４℃〜４０℃、４℃〜４５℃、４℃〜５０℃、４℃〜５５℃、４℃〜６０℃、１０〜２５℃、１０℃〜３０℃、１０℃〜３５℃、１０℃〜４０℃、１０℃〜４５℃、１０℃〜５０℃、１０℃〜５５℃、１０℃〜６０℃、２５〜３０℃、２５℃〜３５℃、２５℃〜４０℃、２５℃〜４５℃、２５℃〜５０℃、２５℃〜５５℃、２５℃〜６０℃、２５℃〜６５℃、３５℃〜４０℃、３５℃〜４５℃、３５℃〜５０℃、３５℃〜５５℃、３５℃〜６０℃、又は３５℃〜６５℃である。一部の実施形態では、反応は室温で実施されるが、他の実施形態では、反応は３７℃で実施される。
反応は、３０分（ｍｉｎ）〜２４時間（ｈｒ）にわたって実施（インキュベート）してよい。一部の実施形態では、反応は、１０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、６０分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１８時間又は２４時間にわたって実施される。
反応物中のｄＮＴＰの濃度は、例えば、２〜１０００μＭであってよい。一部の実施形態では、反応物中のｄＮＴＰの濃度は、２〜１０μＭ、２〜１５μＭ、２〜２０μＭ、２〜２５μＭ、２〜３０μＭ、２〜３５μＭ、２〜４０μＭ、２〜４５μＭ、２〜５０μＭ、２〜５５μＭ、２〜６０μＭ、２〜６５μＭ、２〜７０μＭ、２〜７５μＭ、２〜８０μＭ、２〜８５μＭ、２〜９０μＭ、２〜９５μＭ、２〜１００μＭ、２〜１１０μＭ、２〜１２０μＭ、２〜１３０μＭ、２〜１４０μＭ、２〜１５０μＭ、２〜１６０μＭ、２〜１７０μＭ、２〜１８０μＭ、２〜１９０μＭ、２〜２００μＭ、２〜２５０μＭ、２〜３００μＭ、２〜３５０μＭ、２〜４００μＭ、２〜４５０μＭ、２〜５００μＭ、２〜６００μＭ、２〜７００μＭ、２〜８００μＭ、２〜９００μＭ又は２〜１０００μＭである。例えば、反応物中のｄＮＴＰ濃度は、２μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、５０μＭ、５５μＭ、６０μＭ、６５μＭ、７０μＭ、７５μＭ、８０μＭ、８５μＭ、９０μＭ、９５μＭ、１００μＭ、１０５μＭ、１１０μＭ、１１５μＭ、１２０μＭ、１２５μＭ、１３０μＭ、１３５μＭ、１４０μＭ、１４５μＭ、１５０μＭ、１５５μＭ、１６０μＭ、１６５μＭ、１７０μＭ、１７５μＭ、１８０μＭ、１８５μＭ、１９０μＭ、１９５μＭ又は２００μＭであってよい。一部の実施形態では、反応物中のｄＮＴＰ濃度は、１０〜２０μＭ、１０〜３０μＭ、１０〜４０μＭ、１０〜５０μＭ、１０〜６０μＭ、１０〜７０μＭ、１０〜８０μＭ、１０〜９０μＭ又は１０〜１００μＭである。
一部の実施形態では、ｄＮＴＰ変異体を使用する。例えば、分子定規システムでは、ホットスタート／クリーンアンプ（hot start/clean amp）ｄＮＴＰ、ホスホロチオエートｄＮＴＰ、又は蛍光ｄＮＴＰを使用してもよい。他のｄＮＴＰ変異体を用いてもよい。
本開示は、さらに、以下の番号付けしたパラグラフにより包含される実施形態を提供する：
１．（ａ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）分子の３’サブドメインと分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）結合ドメインを含む初期触媒ヘアピン分子；
（ｂ）３’トーホールドドメインと相補的で、これと結合する初期プライマー；並びに
（ｃ）鎖置換活性を有するポリメラーゼ
を含むプライマー交換反応（ＰＥＲ）システム。
２．結合ドメインが、ループドメインである、パラグラフ１に記載のＰＥＲシステム。
３．（ｄ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）第２ヘアピン分子の３’サブドメインと第２ヘアピン分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）ループドメインを含む第２触媒ヘアピン分子をさらに含み、ここで、第２ヘアピン分子の３’トーホールドドメインが、初期ヘアピン分子の５’サブドメインと相補的である、パラグラフ１又は２に記載のＰＥＲシステム。
４．第２ヘアピン分子の不対３’トーホールドドメイン内に位置するヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを含む第２プライマーをさらに含む、パラグラフ３に記載のＰＥＲシステム。
５．（ｅ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）第３ヘアピン分子の３’サブドメインと第３ヘアピン分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）ループドメインを含む第３触媒ヘアピン分子をさらに含み、ここで、第３ヘアピン分子の３’トーホールドドメインが、第２ヘアピン分子の５’サブドメインと相補的である、パラグラフ１〜４のいずれか１つに記載のＰＥＲシステム。
６．第３ヘアピン分子の不対３’トーホールドドメインと相補的な第３プライマーをさらに含む、パラグラフ５に記載のＰＥＲシステム。
７．複数の触媒ヘアピン分子をさらに含み、各ヘアピン分子は、（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）複数のうち１ヘアピン分子の３’サブドメインと、複数のうち１ヘアピン分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）ループドメインを含み、ここで、各ヘアピン分子の３’トーホールドドメインが、複数のうち１つの他のヘアピン分子の５’サブドメインと相補的である、パラグラフ５又は６に記載のＰＥＲシステム。
８．複数のプライマーをさらに含み、各プライマーは、複数のうち１つのヘアピン分子の不対３’トーホールドドメインと相補的である、パラグラフ７に記載のＰＥＲシステム。
９．プライマーが、検出可能な分子と連結される、パラグラフ１〜８のいずれか１つに記載のＰＥＲシステム。
１０．プライマーが、生体分子と連結される、パラグラフ１〜９のいずれか１つに記載のＰＥＲシステム。
１１．生体分子が、タンパク質である、パラグラフ１０に記載のＰＥＲシステム。
１２．ポリメラーゼが、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ又はＢｓｕ ＤＮＡポリメラーゼである、パラグラフ１〜１１のいずれか１つに記載のＰＥＲシステム。
１３．デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）をさらに含む、パラグラフ１〜１２のいずれか１つに記載のＰＥＲシステム。
１４．（ａ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）分子の５’サブドメインと分子の３’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）ループドメインを含む初期触媒ヘアピン分子；
（ｂ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）第２ヘアピン分子の３’サブドメインと第２ヘアピン分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）結合ドメインを含む第２触媒ヘアピン分子（ここで、第２ヘアピン分子の３’トーホールドドメインは、初期ヘアピン分子の５’サブドメインと相補的である）；並びに
（ｃ）初期ヘアピン分子の不対３’トーホールドドメインと相補的な初期プライマー
を含むプライマー交換反応（ＰＥＲ）システム。
１５．結合ドメインが、ループドメインである、パラグラフ１４に記載のＰＥＲシステム。
１６．第２ヘアピン分子の不対３’トーホールドドメインと相補的な第２プライマーをさらに含む、パラグラフ１４又は１５に記載のＰＥＲシステム。
１７．鎖置換活性を有するポリメラーゼをさらに含む、パラグラフ１４又は１６に記載のＰＥＲシステム。
１８．デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）をさらに含む、パラグラフ１４〜１７のいずれか１つに記載のＰＥＲシステム。
１９．（ａ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）分子の３’サブドメインと分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）結合ドメインを含む初期触媒ヘアピン分子、
（ｂ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）第２触媒ヘアピン分子の３’サブドメインと第２触媒ヘアピン分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）ループドメインを含む第２触媒ヘアピン分子（ここで、第２触媒分子の３’トーホールドドメインは、初期触媒分子の５’サブドメインと相補的である）、
（ｃ）初期ヘアピン分子の不対３’トーホールドドメインと相補的なプライマー、
（ｄ）鎖置換活性を有するポリメラーゼ、並びに
（ｅ）デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）
を反応バッファー中で合わせることより、反応混合物を形成した後；
一本鎖核酸記録を生成するのに十分な時間にわたって、核酸重合、鎖置換及びアニーリングをもたらす条件下で反応混合物をインキュベートすること
を含むプライマー交換反応（ＰＥＲ）方法。
２０．結合ドメインがループドメインである、パラグラフ１９に記載のプライマー交換反応。
２１．（ａ）鎖置換活性を有するポリメラーゼ及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の存在下で、インプットプライマーを触媒分子と接触させるが、ここで、触媒分子は、（ｉ）不対３’トーホールドドメイン及び（ｉｉ）置換鎖と、トーホールドドメインを含有するテンプレート鎖とのヌクレオチド塩基対により形成される、トーホールドドメインから５’側に位置する対ドメインを含み、インプットプライマーは、触媒分子の３’トーホールドドメインと相補的であり；
（ｂ）触媒分子の対ドメインを介してプライマーを延長することにより、置換鎖を置換して、延長アウトプットプライマーを形成し；
（ｃ）置換鎖とテンプレート鎖同士の分子内ヌクレオチド塩基対によって、ヘアピン分子から延長アウトプットプライマーを置換し；
（ｄ）鎖置換活性を有するポリメラーゼ及びｄＮＴＰの存在下で、（ｃ）の置換された延長アウトプットプライマーを第２触媒分子と接触させることを含み、ここで、第２触媒分子は、（ｉ）不対３’トーホールドドメイン及び（ｉｉ）置換鎖と、トーホールドドメインを含有するテンプレート鎖とのヌクレオチド塩基対により形成される、トーホールドドメインから５’側に位置する対ドメインを含み、延長アウトプットプライマーは、第２初期触媒分子の３’トーホールドドメインと相同的である、プライマー交換反応。
２２．一本鎖核酸を生成する方法であって、
（ａ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）分子の３’サブドメインと分子の５’サブドメイン同士の分子間ヌクレオチド塩基対により形成される、対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）ヘアピンループドメインを含む初期ヘアピン分子、
（ｂ）各ヘアピン分子が、（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）複数のうち１ヘアピン分子の３’サブドメインと複数のうち１ヘアピン分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）ループドメインを含む、複数の異なるヘアピン分子（ここで、各ヘアピン分子の３’トーホールドドメインは、複数のうち１つの他のヘアピン分子の５’サブドメインと相補的である）、
（ｃ）初期ヘアピン分子の３’トーホールドドメインと相補的な初期プライマー、
（ｄ）鎖置換活性を有するポリメラーゼ、並びに
（ｅ）デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）
を反応バッファー中で合わせることにより、反応混合物を形成した後；
初期プライマーよりも長い一本鎖核酸記録を生成するのに十分な時間にわたって、核酸重合、鎖置換及びアニーリングをもたらす条件下で反応混合物をインキュベートすることを含む方法。
２３．（ｅ）で生成された一本鎖核酸が、複数のうちのヘアピン分子のステムドメインと相補的であるヌクレオチドドメインのコンカテマーを含む、パラグラフ２２に記載の方法。
２４．（ｅ）で生成された一本鎖核酸が、自己相補性のドメインを含む、パラグラフ２２又は２３に記載の方法。
２５．自己相補性のドメインの同士の分子内ヌクレオチド塩基対によって（ｅ）で生成された一本鎖核酸の折り畳みが達成される条件下で、反応混合物をインキュベートすることをさらに含む、パラグラフ２４に記載の方法。
２６．核酸ステープル鎖の存在下で、一本鎖核酸及び核酸ステープル鎖のドメイン同士のヌクレオチド塩基対によって（ｅ）で生成された一本鎖核酸の折り畳みが達成される条件下で、反応混合物をインキュベートすることをさらに含む、パラグラフ２２〜２５のいずれか１つに記載の方法。
２７．パラグラフ１〜１３のいずれか１つに記載のＰＥＲシステムを含む細胞。
２８．細胞が、原核細胞又は真核細胞である、パラグラフ２７に記載の細胞。
２９．細胞が、哺乳動物細胞である、パラグラフ２８に記載の細胞。
３０．少なくとも２つの核酸を含み、これらの各々が、（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）触媒ヘアピン分子の３’サブドメインと、同じ触媒ヘアピン分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）ループドメインを含む触媒ヘアピン分子をコードする、ベクター。
３１．少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つの核酸をコードし、これらの各々が、（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）触媒ヘアピン分子の３’サブドメインと、同じ触媒ヘアピン分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）ループドメインを含む触媒ヘアピン分子をコードする、パラグラフ３０に記載のベクター。
３２．パラグラフ３０又は３１に記載のベクターを含む、細胞。
３３．触媒分子の３’トーホールドドメインと相補的で、且つ、これと結合する初期プライマーをさらに含む、パラグラフ３２に記載の細胞。
３４．鎖置換活性を有するポリメラーゼをさらに含む、パラグラフ３２又は３３に記載の細胞。
３５．（ａ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）分子の３’サブドメインと分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）結合ドメインを含む触媒ヘアピン分子（ここで、（ａ）（ｉ）及び（ａ）（ｉｉ）のドメインは、タンデム反復配列を形成する）、
（ｂ）（ｉ）３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）分子の３’サブドメインと分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）結合ドメインを含む少なくとも１つの他の触媒ヘアピン分子（ここで、（ｂ）（ｉ）及び（ｂ）（ｉｉ）のドメインは、シグナル配列により分断されるタンデム反復配列を形成し、（ｂ）（ｉ）の３’トーホールドドメインは、プロテクター鎖と不可逆的に結合している）、並びに
（ｃ）（ａ）の触媒ヘアピン分子の３’トーホールドドメインと相補的で、且つ（ｂ）の触媒ヘアピン分子の３’トーホールドドメインと相補的であるドメインを含む核酸プライマー
を含む組成物。
３６．（ａ）（ｉｉｉ）及び／又は（ｂ）（ｉｉｉ）の結合ドメインが、ループドメインである、パラグラフ３５に記載の組成物。
３７．（ａ）（ｉｉｉ）及び／又は（ｂ）（ｉｉｉ）の結合ドメインが、少なくとも１つの共有結合架橋したヌクレオチドを含む、パラグラフ３５に記載の組成物。
３８．結合ドメインが、少なくとも１０ヌクレオチド長の安定した対ドメインである、パラグラフ３５に記載の組成物。
３９．シグナル配列が、２〜２０ヌクレオチドを有する、パラグラフ３５〜３８のいずれか１つに記載の組成物。
４０．シグナル配列が、標識分子に特異的にバーコード化される、パラグラフ３５〜３９のいずれか１つに記載の組成物。
４１．プライマーが、実験特異的バーコードを含む、パラグラフ３５〜４０のいずれか１つに記載の組成物。
４２．プロテクター鎖が、任意選択で、ループドメインを介して、（ｂ）の少なくとも１つの他の触媒ヘアピン分子の３’トーホールドドメインと連結している、パラグラフ３５〜４１のいずれか１つに記載の組成物。
４３．標的分子をさらに含む、パラグラフ３５〜４２のいずれか１つに記載の組成物。
４４．標的分子が、核酸である、パラグラフ４３に記載の組成物。
４５．核酸が、一本鎖核酸又は二本鎖核酸である、パラグラフ４４に記載の組成物。
４６．標的分子が、タンパク質、ペプチド、脂質、炭水化物、脂肪、及び分子量９００ダルトン未満の小分子から選択される生体分子である、パラグラフ４３に記載の組成物。
４７．プロテクター鎖が、標的分子と結合することができる、パラグラフ４３〜４６のいずれか１つに記載の組成物。
４８．標的分子が、プロテクター鎖と相補的なヌクレオチド配列を含むか、又はヌクレオチド配列と連結している、パラグラフ４７に記載の組成物。
４９．鎖置換活性を有するポリメラーゼをさらに含む、パラグラフ３５〜４８のいずれか１つに記載の組成物。
５０．標的分子を検出する方法であって、
標的分子、鎖置換ポリメラーゼ、及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含有する反応バッファー中で、
（ａ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）分子の３’サブドメインと分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）結合ドメインを含む触媒ヘアピン分子（ここで、（ａ）（ｉ）及び（ａ）（ｉｉ）のドメインは、タンデム反復配列を形成する）；
（ｂ）（ｉ）３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）分子の３’サブドメインと分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）結合ドメインを含む少なくとも１つの他の触媒ヘアピン分子（ここで、（ｂ）（ｉ）及び（ｂ）（ｉｉ）のドメインは、シグナル配列により分断されるタンデム反復配列を形成し、（ｂ）（ｉ）の３’トーホールドドメインは、標的分子と結合することができるプロテクター鎖と不可逆的に結合している）、並びに
（ｃ）（ａ）の触媒ヘアピン分子の３’トーホールドドメインと相補的で、且つ（ｂ）の触媒ヘアピン分子の３’トーホールドドメインと相補的であるドメインを含む核酸プライマー
を合わせ、
初期プライマーよりも長く、且つシグナル配列の少なくとも１つを含む一本鎖核酸記録を生成するのに十分な時間にわたって、核酸重合、鎖置換及びアニーリングを達成する条件下で、反応混合物をインキュベートすることを含む方法。
５１．分子事象間の時間を計測する方法であって、
（ａ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）分子の３’サブドメインと分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）ヘアピンループドメインを含む初期触媒ヘアピン分子、
（ｂ）各ヘアピン分子が、（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）ヘアピン分子の３’サブドメインとヘアピン分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）ループドメインを含む複数の異なる触媒ヘアピン分子（ここで、各ヘアピン分子の３’トーホールドドメインは、複数のうち１つの他のヘアピン分子の５’サブドメインと相補的である）、
（ｃ）初期ヘアピン分子の不対３’トーホールドドメインと相補的な初期プライマー、
（ｄ）鎖置換活性を有するポリメラーゼ、並びに
（ｅ）デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を反応バッファー中で合わせることにより、反応混合物を形成し；
第１分子事象に反応混合物を曝露し；
一本鎖核酸記録を生成するのに十分な時間にわたって、核酸重合、鎖置換及びアニーリングを達成する条件下で反応混合物をインキュベートした後；
第２分子事象に反応混合物を曝露することを含む方法。
５２．第１分子事象が、ＤＮＡ重合を開始する、パラグラフ５１に記載の方法。
５３．第２分子事象が、ＤＮＡ重合を終結させる、パラグラフ５１又は５２に記載の方法。
５４．生成される一本鎖核酸の長さに基づいて、第１分子事象と第２分子事象との間の時間間隔を決定することをさらに含む、パラグラフ５１〜５３に記載の方法。
５５．（ａ）不対３’トーホールドドメイン、及びトーホールドドメインから５’側に位置し、且つ置換鎖と、トーホールドドメインを含有するテンプレート鎖とのヌクレオチド塩基対により形成される、対ドメインを含む初期触媒分子；
（ｂ）不対３’トーホールドドメインと相補的な初期プライマー；並びに
（ｃ）鎖置換活性を有するポリメラーゼ
を含む、プライマー交換反応（ＰＥＲ）システム。
５６．不対３’トーホールドドメイン、及びトーホールドドメインから５’側に位置し、且つ置換鎖と、トーホールドドメインを含有するテンプレート鎖とのヌクレオチド塩基対により形成される、対ドメインを含む第２触媒分子をさらに含み、ここで、第２触媒分子の３’トーホールドドメインは、初期触媒分子の対ドメインの置換鎖と相補的である、パラグラフ５５に記載のＰＥＲシステム。
５７．（ａ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン及び（ｉｉ）置換鎖と、トーホールドドメインを含有するテンプレート鎖とのヌクレオチド塩基対により形成される、トーホールドドメインから５’側に位置する対ドメインを含む初期核酸分子；
（ｂ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン及び（ｉｉ）置換鎖と、トーホールドドメインを含有するテンプレート鎖とのヌクレオチド塩基対により形成される、トーホールドドメインから５’側に位置する対ドメインを含む第２核酸分子（ここで、第２核酸分子の不対３’トーホールドドメインは、初期核酸分子の置換鎖と相補的である）；
（ｃ）初期核酸分子の不対３’トーホールドドメイン内に位置するヌクレオチドと相補的なプライマー
を含む分子モータシステム。
５８．鎖置換活性を有するポリメラーゼをさらに含む、パラグラフ５７に記載の分子モータシステム。
５９．初期核酸分子の対ドメインが、重合を終結させる分子を含む、パラグラフ５７又は５８に記載の分子モータシステム。
６０．第２核酸分子の対ドメインが、重合を終結させる分子を含む、パラグラフ５７〜５９のいずれか１つに記載の分子モータシステム。
６１．第２核酸分子の３’トーホールドドメインが、重合を停止する３’分子を含む、パラグラフ５７〜５９のいずれか１つに記載の分子モータシステム。
６２．複数の核酸分子をさらに含み、各分子が、（ｉ）不対３’トーホールドドメイン及び（ｉｉ）置換鎖と、トーホールドドメインを含有するテンプレート鎖とのヌクレオチド塩基対により形成される、トーホールドドメインから５’側に位置する対ドメインを含み、ここで、複数のうちの１分子の不対３’トーホールドドメインは、複数のうち１つの他の核酸分子の置換鎖と相補的である、パラグラフ５７〜６１のいずれか１つに記載の分子モータシステム。
６３．核酸分子の少なくとも１つが、標的生体分子と結合している、パラグラフ５７〜６２のいずれか１つに記載の分子モータシステム。
６４．核酸分子の各々が、異なる標的生体分子と結合している、パラグラフ６３に記載の分子モータシステム。
６５．標的分子間の距離を記録する方法であって、
（ａ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、及び（ｉｉ）置換鎖と、トーホールドドメインを含有するテンプレート鎖とのヌクレオチド塩基対により形成される、トーホールドドメインから５’側に位置する対ドメインを含む初期核酸分子（ここで、初期核酸分子は、標的生体分子と連結している）、
（ｂ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、及び（ｉｉ）置換鎖と、トーホールドドメインを含有するテンプレート鎖とのヌクレオチド塩基対により形成される、トーホールドドメインから５’側に位置する対ドメインを含む第２核酸分子（ここで、第２核酸分子の不対３’トーホールドドメインは、初期核酸分子の置換鎖と相補的であり、また、第２核酸分子は、標的生体分子と連結している）、
（ｃ）初期核酸分子の不対３’トーホールドドメインと相補的なプライマー、
（ｄ）鎖置換活性を有するポリメラーゼ、並びに
（ｅ）デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を反応バッファー中で合わせることにより、反応混合物を形成し；
一本鎖核酸記録を生成するのに十分な時間にわたって、核酸重合、鎖置換及びアニーリングを達成する条件下で反応混合物をインキュベートすることを含む方法。
６６．反応混合物が、複数の核酸分子をさらに含み、各分子が、（ｉ）不対３’トーホールドドメイン及び（ｉｉ）置換鎖と、トーホールドドメインを含有するテンプレート鎖とのヌクレオチド塩基対により形成される、トーホールドドメインから５’側に位置する対ドメインを含み、ここで、複数のうち１核酸分子の不対３’トーホールドドメインは、複数のうち１つの他の核酸分子の置換鎖と相補的であり、複数の核酸分子の各々が、標的生体分子と連結している、パラグラフ６５に記載の方法。
６７．（ａ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）分子の３’サブドメインと分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）ループドメインを含む初期ヘアピン分子（ここで、初期ヘアピン分子は、標的生体分子と連結している）；
（ｂ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）分子の３’サブドメインと分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）ループドメインを含む第２ヘアピン分子（ここで、第２ヘアピン分子は、標的生体分子と連結しており、初期ヘアピン分子の５’サブドメインは、第２ヘアピン分子の５’サブドメインと相補的である）；
（ｃ）一方が、初期ヘアピン分子の不対３’トーホールドドメインと相補的であり、他方が、第２ヘアピン分子の不対３’トーホールドドメインと相補的である、２つのプライマー；
（ｄ）各分子が、（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）分子の３’サブドメインと分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）ループドメインを含む、複数の触媒ヘアピン分子（ここで、複数のヘアピン分子各々の５’サブドメインは、複数のうち１つの他のヘアピン分子の５’サブドメインと相補的であり、複数のヘアピン分子の１つの３’トーホールドドメインは、初期ヘアピン分子の５’サブドメインと相補的であり、複数のうちの別のヘアピン分子の３’トーホールドドメインは、第２ヘアピン分子の５’サブドメインと相補的である）；並びに
（ｅ）鎖置換活性を有するポリメラーゼ
を含む分子記録システム。
６８．標的生体分子間の距離を記録する方法であって、
（ａ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）分子の３’サブドメインと分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）ループドメインを含む初期ヘアピン分子（初期ヘアピン分子は、標的生体分子と連結している）；
（ｂ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）分子の３’サブドメインと分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）ループドメインを含む第２ヘアピン分子（第２ヘアピン分子は、標的生体分子と連結しており、初期ヘアピン分子の５’サブドメインは、第２ヘアピン分子の５’サブドメインと相補的である）；
（ｃ）一方が、初期ヘアピン分子の不対３’トーホールドドメインと相補的であり、他方が、第２ヘアピン分子の不対３’トーホールドドメインと相補的である、２つのプライマー；
（ｄ）各分子が、（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）分子の３’サブドメインと分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）ループドメインを含む、複数のヘアピン分子（ここで、複数のヘアピン分子各々の５’サブドメインは、複数のうち１つの他のヘアピン分子の５’サブドメインと相補的であり、複数のヘアピン分子の１つの３’トーホールドドメインは、初期ヘアピン分子の５’サブドメインと相補的であり、複数のうち別のヘアピン分子の３’トーホールドドメインは、第２ヘアピン分子の５’サブドメインと相補的である）；並びに
（ｅ）鎖置換活性を有するポリメラーゼ、並びにデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を反応バッファー中で合わせることにより、反応混合物を形成した後；
二本鎖核酸記録を生成するのに十分な時間にわたって、核酸重合、鎖置換及びアニーリングを達成する条件下で反応混合物をインキュベートすることを含む方法。
実施例
以下の実施例では、中でも、ＰＥＲ分子プリミティブを使用するいくつかのシステムの設計及び実施を説明し、ＰＥＲ分子プリミティブは、インサイチュで任意のｓｓＤＮＡ配列を等温で合成するための一般的なフレームワークを提供する。データは、どのようにして、プライマー交換反応（ＰＥＲ）を互いに連鎖させて、固定長さのオリゴを合成する反応カスケードを形成することができるかを示す。後述するように、発癌性ｍｉＲＮＡマーカの感知に応答して機能性ＤＮＡザイムを合成したナノデバイス、合成テロメラーゼを用いて、ｍｉＲＮＡ標的を検出して、そのシグナル検出を増幅することができる無標識バイオセンサー、オルトゴナルＲＮＡインプットを検出することができる論理回路、及び２つのインプットシグナルの順序を記憶した分子レコーダは、全てインプリメントに成功した。多くのケースで、同じ分子インプット及びヘアピンを異なる経路中に再構成することによって、システムの論理を実行することができる。
プライマー交換反応は、新生プライマー鎖の触媒による伸長を促進するために熱サイクルを必要とせず、安価で、しかも分子生物学者が容易に入手可能なｄＮＴＰを燃料源とする。さらに、溶液中のヘアピン及びマグネシウムイオンの濃度によって、反応速度を調整することができる。ＰＥＲの環境応答性は、ナノデバイス、バイオセンサー、論理回路、及びレコーダにおいて証明されており、シグナル処理及び駆動プラットホームとしてＤＮＡの動的合成を使用する強力な新規の方法を呈示する。さらに、一本鎖アウトプットの配列を規定する能力は、ＤＮＡザイム以外に任意の数の既存のナノデバイス、例えば、トーホールドスイッチ（Alexander A Green, et al. Cell,159(4):925-939, 2014)又はＤＮＡ鎖置換回路（David Yu Zhang and Georg Seelig. Nature chemistry, 3(2):103-113, 2011)などと直接相互作用する機会を提供する。さらには、ＰＥＲの環境応答性は、アプタマーを介したタンパク質検出及び動的遺伝子合成までさらに広げることも可能である。ＰＥＲ回路のプログラム可能な記録、処理、及び駆動能力は、分子プログラム適用の新たなパラダイムを推進するものである。
特に重要なことは、例えば、ＰＥＲ経路が可能にする分子記録適用である。長いポリマーは、環境の現状に応じて異なる経路に従って成長することができるため、ＰＥＲ経路を用いて、長期にわたり環境シグナル情報を記録する分子「ティッカーテープ」を作製することができる。次に、こうした情報豊富なＤＮＡポリマーテープをシーケンシングすることによって、分子事象記録を回収することができる。このタイプの記録行動は、例えば、それ自体がシステムを有意に妨害することなく、多様な分子種及び事象に関する情報を記録することによって、動的生物学的システムの研究に多大な影響をもたらす。
実施例１
この実施例は、プライマー交換反応を用いて、規定の経路に従って核酸鎖を伸長することができることを実証する。濃度１００ｎＭのＣｙ５標識プライマーと濃度１０ｎＭのヘアピンを用いて、第１の反応物を３７℃で２時間インキュベートした（図３Ａ）。Ｃｙ５標識プライマーを導入する前に１時間インキュベートしたＦＡＭ標識プライマーを用いて、第２の反応物を３７℃で４時間インキュベートした。プライマーを１００ｎＭの濃度で使用し、ヘアピンを１０ｎＭの濃度で使用した。８０℃で２０分間のインキュベーションによるポリメラーゼの熱変性によって反応を停止した。また、反応は、ポリメラーゼの熱不活性化又はキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）の導入によって停止してもよい。
別の反応では、基本的な単回プライマー交換反応を確認し、特性決定するために、様々な条件下で、プライマーとヘアピンを一緒にインキュベートした（図１Ｃ（ｉｖ））。システムは、２つの構成要素、すなわち図１Ｃ（ｉｉ）に示す蛍光色素標識プライマーとヘアピンを含み、変性ゲル電気泳動を用いて、基本的プライマー交換反応の進行を追跡する。レーン１は、ヘアピンを含まないプライマーに対応するバンドを示し、レーン２〜１１は、１００：１のプライマー及びヘアピン比を用い、１０分間隔で単回プライマー交換反応の時間的進行を示す。レーン１２〜２２は、様々な量の出発ヘアピンを用いて、９０分間インキュベートした同じ反応を示す。これらのデータから、溶液中のヘアピンの触媒再利用が確認され、ＰＥＲシステムの速度を調整するために用いることができるヘアピン濃度の汎用性が証明される。
ヘアピンとのプライマーの結合親和性を設計する際、考慮されるいくつかの検討事項がある。第１に、プライマーは、成長鎖の主に一本鎖状態を維持すると共に、すべての後続プライマー交換反応を促進するために、最後のステップのヘアピンから自発的に解離する上で十分に短くすべきである。他方で、プライマーは、ポリメラーゼにより伸長させるのに十分な時間にわたってヘアピンと結合する上で十分に長くすべきである。この長さは、ポリメラーゼ、温度、塩、及びバッファー条件の特定の組合せを用いて、例えば、７〜１０塩基対であってよい。
実施例２．
プライマー交換反応を互いに連鎖させて、規定の反応経路に従い固定長さの鎖を成長させるＰＥＲカスケードを形成することができる。本発明者らがインプリメントした第１のＰＥＲ経路は、ｄＮＴＰ、ポリメラーゼ、マグネシウム、及びプライマーを含む溶液中の１組の触媒ヘアピン種により媒介される５つの伸長ステップのカスケードであった（図２Ａ（ｉ））。溶液中に存在する全５つのヘアピン及びプライマーを用いて、経路は、５つの伸長ステップを通して進行する（図２Ａ（ｉｉ））。ヘアピンＡは、ドメインｂと一緒にプライマードメインａの延長を触媒する。次に、ヘアピンＢが、ドメインｃと一緒にドメインｂの延長を触媒する。続いて、ヘアピンＣ〜Ｅが、ｄと一緒にｃ、ｅと一緒にｄ、ｆと一緒にｅの延長をそれぞれ触媒する。
変性ゲル電気泳動によって、ヘアピンの様々なサブセットと混合したときのプライマー鎖の規則的伸長を確認する（図２Ａ（ｉｉｉ））。レーン１は、ヘアピンを用いず、プライマーだけをインキュベートした反応を示す。レーン２は、１つ（ヘアピンＡ）を除いて、成長を開始する全てのヘアピンである、ヘアピンＢ〜Ｅと一緒にインキュベートしたプライマーを示す。この制御は、検出可能な漏出を一切示さない。レーン３は、プライマーとヘアピンＡを一緒にインキュベートする第１の伸長ステップを示す。レーン４は、プライマーを２つの最初のヘアピンＡ及びＢとインキュベートした際の２つの伸長を示す。レーン５、６、及び７は、ヘアピンＡ〜Ｃ、Ａ〜Ｄ、及びＡ〜Ｅとそれぞれインキュベートした場合のプライマーの３、４、及び５つの伸長ステップを示す。生成されたバンドの長さは、Sybr Gold染色後のゲルのイメージングによってさらに確認した。全てのヘアピンの触媒ターンオーバーは、ヘアピンが、プライマー濃度の１／１０で存在するにもかかわらず、全てのプライマーの最終状態へのほぼ完全な変換によって確認された。
ＰＥＲ合成をさらにスケールアップすることができたか否かを調べるために、ＤＮＡ折り紙構造のステープルをワンポット反応で合成した。４０のステープル鎖により一緒に保持される３文字コードスカフォールドからなる構造は、コンパクトな長方形に折り畳まれるように設計され、この形状はその短手に沿って凝集して、折り紙構造の鎖を生成する。合計８０のヘアピンは、４０のプライマーから４０のステープル鎖を、各々２反応ステップで合成するように設計した（図２Ａ（ｉｖ））。８０の反応は、ポリメラーゼと３７℃で１時間のインキュベーションにより、全て同時に実施した。熱不活性化の後、スカフォールド鎖をＰＥＲ混合物に直接導入し、１時間にわたってアニーリングした。次に、原子間力顕微鏡を用いて折り紙構造を視覚化することにより、適正な構造形成を確認した。
低漏出で、しかも高変換速度を有するプライマー交換反応の例をこの実施例でさらに説明する。プライマー交換反応を用いて、合成テロメラーゼを構築したが、これによって、任意の配列を連続的に重複することができ、その結果、わずか数時間で最大数百塩基によるその伸長が達成された（図４）。合成テロメラーゼ構築物（図３）は、最終濃度１００ｎＭのＣｙ５標識プライマー、及び１０ｎＭ〜１００ｎＭのヘアピン濃度を使用した。Ｂｓｔラージフラグメントポリメラーゼを１×ThermoPolバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ、（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、及び０．１％TritonrX-100）、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、及び１００μＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＴＴＰと混合した。２０μＬ反応物を４℃で調製し、残留ｄＧＴＰを除去する専用配列と１５分間のプレインキュベーション期間の後、３７℃で４時間インキュベートした。８０℃で２０分間のインキュベーションによるポリメラーゼの熱不活性化により反応を停止した。インキュベーションの後、反応物を１０μＬの１００％ホルムアミドと混合し、５μＬを１５％ＰＡＧＥ変性ゲル（１×ＴＢＥ及び７Ｍ尿素）の各ゲルレーンにロードした。２００Ｖにてゲルを６５℃で３５分間泳動させ、Ｃｙ５チャネルでスキャンした。さらにゲルをSybr Goldで染色した後、Sybr Goldチャネルでイメージングした（データは示していない）。
所与の回数の伸長ステップによる鎖の延長などの、より複雑な状態遷移もプログラムした（図５）。多段階反応（図４）では、１００ｎＭのプライマー濃度、１０ｎＭのヘアピン濃度、及び１０μＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＴＴＰを使用した。他の反応及びイメージング条件は、テロメラーゼ構築物と同じである。プレインキュベーション浄化ステップは実施しなかった。
これらの実験のいずれも、プライマー交換反応を促進するために、３７℃のインキュベーション温度で十分な鎖置換活性を有するＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、ラージフラグメントを使用した。ドメイン１〜６（図５）は、ポリメラーゼを停止するための停止配列としてＧ塩基を使用することができるように、塩基Ｃ、Ａ及びＴからなる３文字コードで構成した。プライマー配列は、長さが各々８〜９塩基対であり、コピーされるのに十分に安定してヘアピンと結合し得るように十分長く、且つコピー後にヘアピンから自発的に解離するのに十分短くなるように設計した。プライマー配列長さは、より高い温度の反応の場合長くなるか、又は、より低い温度では短くなり得る。
実施例３．長いポリマーの組織化トリガー
一実験では、ヘアピン配列を、５ステップのプライマー交換反応につき１０塩基をコピーするように設計し（図５）、さらに合計５０塩基が付加された。配列付加毎に１つのヘアピンを使用し、プライマー交換反応を用いて、５つの連続的伸長反応の各々における１０ヌクレオチドにより、９ヌクレオチドプライマー配列を延長した。反応物を３７℃で４時間インキュベートした。この伸長は、２つの相補的アプローチを用いて、増大することができる（図８Ａ〜８Ｂ）。最初に、反応グラフにおけるステップの数を増加するために、オルトゴナルプライマー配列（例えば、少なくとも３０プライマー配列）を設計することができる。また、コピーされる各ヘアピンに対する塩基の数を増加することもできる。各ヘアピンは、次のプライマー配列の前に、任意の配列がコピーされるようにプログラムすることができ、一部の事例では、ポリメラーゼ酵素の処理能力、及び戻し鎖置換プロセスのために増加する時間は、この領域の長さにいくらかの実用的制約を課す。
別の実験では、プライマー交換反応条件は、伸長毎に少なくとも３０塩基がコピーされるようなものである。従って、長さが少なくとも９００塩基のスカフォールドが合成される。段階別組織化戦略が用いられ、その場合、各ヘアピンを順次導入して、表面に結合したプライマー鎖を伸長し、その間に洗浄ステップを設ける。どの時点でも、溶液中に他のヘアピンがないことから、偽プライミング事象が起こる確率は最小である。このため、上記の方法は、容易に、より大きな長さまでスケールアップすることができる。次に、経路から外れた結合事象を回避するために、スカフォールドをインサイチュで組織化した後、ステープル鎖を導入する。スカフォールド合成中に全てのヘアピンを溶液中に含有させる自律的戦略も使用される。
方法．全てのＤＮＡ鎖は、商業的に合成されており、−２０℃での長期保存のためにこれらを１×ＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ及び１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に懸濁させる。ＤＮＡ配列は、NUPACKソフトウエアパッケージ、並びに所望の結合エネルギーを有するプライマーについて最適化するために開発されたソフトウエアを用いて、設計する。プライマーは、初めにＨＰＬＣで精製し、ヘアピンは、ポリメラーゼによる延長を防止するためにその３’末端に逆方向ｄＴ修飾を含む非精製のものが注文される。反応のために、ＤＮＡをＢｓｔ鎖置換ポリメラーゼ（又はＰｈｉ２９、Ｂｓｕラージフラグメント、又はKlenow（エキソ−））及び１×ThermoPolバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ、（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、及び０．１％TritonrX-100）と合わせる。添加されるマグネシウムは、反応速度を著しく高めることができる（データは示していない）ため、ＭｇＳＯ４濃度は、特異性を維持しながら、反応速度を調節するために、５ｍＭから５０ｍＭまで変動する。プライマーは、１００ｎＭの最終濃度で導入し、ヘアピン濃度は、１ｎＭから１μＭまで変動する。ｄＮＴＰ濃度は、１０μＭから１００μＭまで変動する。８〜９ｂｐプライマー配列をその５’末端にＣｙ５色素で標識し、ＰＡＧＥ変性ゲル（１×ＴＢＥ及び７Ｍ尿素を含む１５％ゲル）を用いて、固定長さの鎖の制御された成長を確認する。シーケンシングによって、鎖をさらに確認することもできる。段階的組織化アプローチを試験するために、プライマーをその５’末端にビオチンで標識し、ストレプトアビジンでコーティングした表面上に結合させる。バッファー交換のために、鎖が磁石で分解されるように、ストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズを使用する。洗浄のために１×ＰＢＳバッファーを用いて、細胞固定条件との適合性を確実にする。ワンポット合成反応の場合には２〜１０時間、又は段階的組織化反応の場合には１時間にわたって反応物を３７℃でインキュベートする。
実施例４．２Ｄ及び３Ｄ構造のトリガーされた組織化及び折り畳み
この実施例では、任意の２Ｄ及び３Ｄ形状を折り畳むために、長い固定長さの鎖をスカフォールドとして用いる。伝統的なＤＮＡ折り紙アプローチの場合、長い鎖をスカフォールドとして用いて、特定の形状に折り畳む。スカフォールド鎖で構造領域を前後に突き通す、ラスター化戦略を使用する（図９Ａ）。この戦略を用いて、スカフォールド鎖は、２Ｄ又は３Ｄ形状を通過した後、スカフォールド上で局在化しているはずのドメインと相補的なステープル鎖と互いにテザリングする。顕微鏡法で視覚化する上で十分に大きな特徴を有する構造を組織化するために、実施例３で生成した９００ｂｐスカフォールドを使用する。約２０のステープル鎖（各々４２〜４５塩基対を有する）が使用される。
プライマー交換によって規定形状の構造を組織化する別の方法は、レンガ構造に自己組織化するＤＮＡ一本鎖タイル（ＳＳＴ）構造を合成することである（図９Ｂ）。このアプローチを用いて、多くの小さなＤＮＡ鎖が共同して、その相補的領域に基づく複雑な形状に組織化する。各々の鎖は、単一ヘアピンにコード化されるため、個別のヘアピン種の数は、個別のＳＳＴモノマーの数と等しい。あるいは、ＳＳＴ配列は全て、一本鎖スカフォールド上で合成され、その後、制限酵素により切断される。この戦略によって、実施例３のコピー領域を用いる、より少ないヘアピンの使用が可能になるが、１つの鎖への全てのＳＳＴ配列が同時局在化するため、長い鎖がそれ自体とハイブリダイズして、伸長を減速する可能性がある。
構造を組織化するさらに別のアプローチは、一本鎖ＤＮＡ折り紙用のスカフォールドとして合成鎖を使用するものである（図９Ｃ）。このアプローチでは、鎖は節のない様式でそれ自体に折り畳まれて、特定の形状を形成するように設計されている。結合相互作用が分子内であるようにプログラムされていることから、折り畳みにステープルを必要としない。一部の事例では、次のプライマー配列の前にコピーされるヘアピン上の領域内に結合領域が全て位置するような方法で、全ての結合領域がプライマー領域と一緒に挿入されるため、結合領域は、延長反応を妨害しない。
方法．インキュベーション反応のための方法は、実施例３に記載のものと同じ方法である。一部の事例では、プライマー交換反応が完了した後の構造の折り畳み及び安定性を促進するために追加のマグネシウムを添加し、１０ｍＭ〜１００ｍＭの濃度の余剰カチオンを使用する。アガロースゲル電気泳動（２％、Sybr Gold染色剤で染色）を用いて、構造形成を大量に視覚化する。完全に形成された構造に対応するゲルバンドを切り取り、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）及び／又は原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）イメージングによる確認の場合と同じ塩条件のバッファー中で溶離する。また、DNA‐PAINT超解像イメージングを用いて、成長した個々の構造の空間的立体配座を直接視覚化し、評価することもできる。プライマー交換反応物は全て、３７℃でインキュベートし、この温度又は室温のいずれかで構造を折り畳むことにより、固定細胞条件との適合性を確実にする。
実施例５．分岐構造の効率的な成長
この実施例では、プライマー交換反応を用いて、分岐構造を組織化する。新たなプライマーの伸長は、それらが構造と結合したときに初めて起こるべきであるため、ヘアピンは、この同時局在化を認識して、コピーを促進すべきである。これは、２つの配列からなるプライミング配列を用いることによって達成することができる（図１０Ａ）。２つの個別のプライマー領域（図１０Ａのａ１及びａ２）は、それ自体では、ヘアピンと極めて弱く結合するために、プライミング反応を開始する上で十分長く結合することができないようにすべきである。しかし、同時局在化すると、これらのプライマーは、プライマー交換反応で以前使用した８〜９塩基対プライマーと同様の動態学を有し、それによって、ヘアピンから自発的に解離するのに十分短く、且つ鎖置換プライミングを好適に開始するには十分長くなるようにすべきである。８〜９塩基対は、通常のプライマー交換反応におけるプライマー長さについては十分であったことから、４〜６塩基対のａ１及びａ２プライマー領域を使用した。
方法．構造をインキュベート及び評価する方法は、実施例４に記載のものと同じである。
実施例６．ナノデバイス
プライマー交換反応適用の多用途性の証明として、本発明者らは、発癌性ｍｉＲ−１９ａシグナルを検出した後、独立したＲＮＡ転写物を切断するようにプログラムされた機能性ＤＮＡザイムを合成するナノデバイスをインプリメントした（図２６Ａ）。標的検出のために、本発明者らは、発癌性ｍｉｃｒｏＲＮＡであるｍｉＲ−１９ａ及びｍｉＲ−１９ｂの共有３’領域に結合するヘアピンを設計した。検出に応答して、ＰＥＲ経路は、Ｔｗｉｓｔ遺伝子の完全長ｍＲＮＡを切断して、ＤＮＡザイム（ＤＺ−ＴＷＴ）を合成するが、これは、アポトーシスをインビボで促進することが判明している。
この適用のために、１対の合成ヌクレオチド、ｉｓｏ−ｄＧ及びｉｓｏ−ｄＣを全ヘアピン上で停止配列として使用した（図２６Ｂ）。これにより、合成配列において４つのＤＮＡ塩基全てを使用することが可能になった。ＰＥＲ経路のアウトプット構築物の一例として、本発明者らは、既にインビボで確認されているＤＺ−ＴＷＴ ＤＮＡザイムを用いることを選択した。
ＤＺ−ＴＷＴは、同族ＲＮＡ配列と相補的であるように設計された２つのアーム同士の特定のプリン−ピリミジン結合を切断する１５ｎｔ触媒ドメインを有する１０〜２３のＤＮＡザイムのクラスの一部であり、任意のＲＮＡ配列を切断するように再プログラムすることができる。このシステム論理を実行するために、３つのＰＥＲヘアピンは、標的ｍｉｃｒｏＲＮＡの検出時にだけＤＺ−ＴＷＴ配列を合成するように設計した（図２６Ｃ）。標的が存在するとき、Ａヘアピンは、標的鎖上にドメインａの合成をパターン形成する（ステップ１）。続いて、Ｂ及びＣヘアピンは、ドメインｂ及びｃの付加をそれぞれパターン形成することができる（ステップ２〜３）。完了したａｂｃ配列は、ＤＺ−ＴＷＴ配列を形成し、これが、溶液中の２４ｂｐ ＴＷＴ ＲＮＡフラグメントに結合して、特定の塩基でＴＷＴ ｍＲＮＡの切断を触媒するループを形成することができる（ステップ４〜５）。次に、ＤＮＡザイムが、切断した断片から解離した後、これを再利用することができる（ステップ６）。
標的に付加された全ＤＮＡザイムの配列を図２６Ｄに示す。ＤＺ−ＴＷＴ配列を分割した３つのドメインが、異なる色で示されている。新生鎖が、コピー後にヘアピンから解離することが確実にできるように、ヘアピン上のプライマー結合部位の長さ（ヘアピンＡ、Ｂ及びＣ上の１９ｓ＊、ａｓ＊、及びｂｓ＊）を調節して、８〜９ｂｐの新生鎖と結合させる。
ナノデバイス機能を評価するために、本発明者らは、ヘアピンの様々なサブセットと、Ｃｙ５標識ｍｉＲＮＡ標的を含む、又は含まないＦＡＭ標識ＴＷＴ断片とを含有させた（図２６Ｅ）。レーン１及び２は、いずれのヘアピンも存在せずに、インキュベートした場合のＴＷＴ断片及びｍｉＲ−１９ａバンドを示す。レーン３は、最後の２つのヘアピンＢ及びＣの存在下で、しかし最初のヘアピン、Ａが存在しない場合、ｍｉＲＮＡの伸長がないことを示す。レーン４は、ｍｉＲＮＡをＡヘアピンのみ及びＴＷＴ断片と一緒にインキュベートした場合の最初の延長ステップを示す。レーン５は、最初の２つのヘアピン、Ａ及びＢと標的のインキュベーションを示し、これにより２段階伸長が達成される。標的を３つのヘアピン全てと混合すると（レーン６）、全ＤＺ−ＴＷＴ配列が標的に付加され、ＴＷＴ断片を首尾よく切断することができる。しかし、全てのヘアピンを標的なしで混合すると、ＴＷＴ断片の切断は起こらない（レーン７）。ＤＮＡザイム構築物の触媒ターンオーバーは、わずか１０ｎＭのｍｉＲＮＡ標的で、２０ｎＭのＴＷＴ ＲＮＡのほぼ完全な切断によって示される。
実施例７．無標識バイオセンサー
ナノデバイスを用いて、本発明者らは、任意のインプット配列に応答して、任意の生物学的に関連するＤＮＡ配列を合成することができる。１つの配列を別の配列に変換するＰＥＲ経路のプログラム可能性は、環境応答性の合成システム用の強力なモジュラーフレームワークを提供するが、本発明者らは、いくつかの追加適用を用いて、これをさらに詳しく調べた。本発明者らは、反復配列ドメインの長い鎖を合成する単一ヘアピンシステム（合成テロメラーゼと呼ぶ）をインプリメントすることにより開始し、次に、この構築物を、無標識バイオセンサーのためのシグナル増幅の１形態として使用し、これは、特定のｍｉＲＮＡインプットを検出すると、蛍光コンカテマーを成長させる（図２７Ｃ）。
合成テロメラーゼシステムは、単一プライマー配列（ドメインａなし）と、成長鎖に反復ドメインａの付加を触媒するヘアピンとを含む（図２７Ａ）。この実証のために、本発明者らは、反復配列として１０ｂｐ配列ATCTCTTATT（配列番号１）を、この配列の最後の９ｂｐに対応するヘアピン結合領域と共に選択した。前述と同様に、プライマーをゲル視覚化のためにＣｙ５蛍光色素で標識し、ヘアピンには、その延長を防止するために、その３’末端に逆方向ｄＴを設けた。
本発明者らは、以前の実証と同様の実験セットアップを用いて、構築物を確認し、数桁にわたってヘアピン濃度を変化させることにより、どのようにして反応速度を調整することができるかを示した（図２７Ｂ）。外来のｄＧＴＰを消費するように設計された専用のヘアピン種との１５分のインキュベーション後、ヘアピンをプライマーと一緒にインキュベートした。レーン１は、ヘアピンを添加しないプライマーバンドを示し、レーン２〜６は、１〜１００ｎＭの範囲のヘアピン濃度で成長したテロメラーゼを示す。反応速度は、システム中のヘアピンの濃度を調節することにより容易に調整することができ、これによって、制御することができる反応速度の広い動的範囲が提供される。本発明者らは、さらに、マグネシウム濃度を用いて、テロメア化速度を調節することができ、これは、反応速度論を調節するためのさらに別の方法を提供することも見出した。
続いて、本発明者らは、特定のｍｉＲＮＡシグナルの存在に応答して初めてこのタイプのテロメアアウトプットを条件付きで成長させることができる無標識バイオセンサーをインプリメントする戦略を考案した（図２７Ａ）。特定の蛍光染色剤に結合する配列を設計することにより、本発明者らは、これらの合成されたテロメアを蛍光にすることができ、これによって、青色光の下で結果の直接視覚化が可能になる。蛍光は、Thioflavin T（ＴｈＴ）染色剤の結合によって達成され、これは、ヒトテロメア配列TTAGGGの反復により形成される四重鎖モチーフに挿入されると、より蛍光となることが判明している。本発明者らが選択した標的は、発癌性ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ−１９ａであった。
検出器−テロメラーゼシステム（図２７Ｄ）をインプリメントするために、３つの構成要素：プライマー（Ｐ）、ゲーテッドヘアピン（Ａ）、及びテロメラーゼヘアピン（Ｂ）が必要である。標的検出をヒトテロメア配列の合成に変換するために、トーホールド交換反応は、ＰＥＲヘアピン（Ａ）のプライマー結合が、同族ｍｉＲ−１９ａシグナルの存在下でしか露出されないように設計した。ｍｉＲＮＡ標的は、Ａヘアピンに結合したプロテクター鎖上の短い露出ドメインに結合して、残る相補的配列を介して分岐移動することができる。相補的ｍｉＲ−１９ａ＊ドメインが完全に置換されたら、プロテクター鎖は、保護されたＰＥＲヘアピンから自発的に解離して、Ａヘアピン上にプライマー部位ａ＊を露出させることができる（ステップ１）。一旦露出したら、このＰＥＲヘアピンは、プライマーのドメイン上にｂドメインの付加を促進する（ステップ２）。ｂドメインは、ヒトテロメア配列TTAGGGに対応し、この配列は、後に、構成的に活性のテロメラーゼヘアピンＢによってテロメア化する（ステップ３）。最後に、これらのテロメアは、四重鎖構造を形成し、その中にＴｈＴ染色剤が挿入されて、蛍光になる（ステップ４）。
条件付きテロメア化反応を評価するために、本発明者らは、反応物を様々なサブセットの構成要素と一緒にインキュベートし、結果をネイティブＰＡＧＥゲル上で視覚化した（図２７Ｅ）。レーン１は、ｍｉＲＮＡだけを含み、分子プログラム成分のいずれも含まない反応を示す。プライマーＰとテロメラーゼヘアピンＢを含むが、ゲーテッドヘアピンＡなしで、ｍｉＲＮＡ標的は、いずれのオリゴとも結合しないため、テロメア化は起こらない（レーン２）。プライマーＰとゲーテッドヘアピンＡを含むが、テロメラーゼヘアピンＢなしで、ｍｉＲＮＡは、そのバンドにおけるシフトにより示されるように、プロテクター鎖と結合する（レーン３）。テロメア化は、Ｐ、Ａ、及びＢの３つ全てがｍｉＲＮＡ標的と一緒に存在するときにしか起こらない（レーン４）。いずれのｍｉＲＮＡ標的も含まない対照反応では、要素Ｐ、Ａ、及びＢは、バックグラウンドテロメア化をほとんど生成しない（レーン５）。
より単純な読み出し法として、Safe Imager 2.0 Transilluminatorを用い、アンバーフィルターユニット（ｖｉｓ）で、反応物の蛍光を視覚化することができる。これは、シグナルを読み出す、安全で、費用有効的、且つ時間効率的な方式を提供する。また、ＦＡＭチャネル（ＦＡＭ）下の蛍光スキャナー上でチューブを視覚化してもよい（詳細については、方法のセクションを参照されたい）。
実施例８．論理計算
論理式評価による標的配列のシグナル処理は、複雑な動的分子行動をプログラムするための有益なフレームワークとして生まれた。以下に、本発明者らは、単純に、標的鎖の存在の有無に基づいてどのプライマー配列が付加されるかをプログラムすることにより、任意の配列についてＡＮＤ、ＯＲ、及びＮＯＴ論理をインプリメントするために、どのようにしてＰＥＲを用いることができるかを示す。基本的な戦略は、ＲＮＡ標的をゲーテッドヘアピンと平衡させて、プライマーを導入し、インキュベーション後のゲル上の長さによる結果を読み出すことである（図２８Ａ）。
２つのＲＮＡインプットについてのＯＲゲートは、センサー及びレコーダアプリケーションに導入されたゲーテッドヘアピンの２つと一緒にインプリメントすることができる（図８Ｂ）。各標的は、２つのヘアピンの１つを活性化することができ、２つのヘアピンの一方又は両方が活性化されるとき、ｂドメインがプライマーのドメイン上に付加され得る。変性ゲルを用いて結果を確認したが、これは、いずれの標的も存在しない場合、延長産物を示さない（レーン１）。しかし、一方又は両方の標的が存在すれば、プライマーは１つのドメインによって延長される（レーン２〜４）。２つの標的が両方とも存在するか（ＡＮＤ論理）否かを評価するために、それらの存在を段階的にチェックした（図８Ｃ）。プライマードメインａは、いずれの標的も存在しない（レーン５）か、又はＴＷＴ標的だけが存在する（レーン６）場合、延長されない。ｍｉＲ−１９ａ標的だけが存在する場合、プライマーは、１つのドメインによりａｂに延長される（レーン７）。しかし、両方の標的が存在する場合、プライマーは、完全なａｂｃ配列まで延長され、これは、ＡＮＤ式の評価の成功を示している（レーン８）。
ＮＯＴ論理のインプリメントには、標的容認と拒絶の間の時間尺度の分離が必要である（図８Ｄ）。これは、真（True）と評価する、ヘアピンよりはるかに高い濃度の標的依存性シンク反応物を含有させることによって達成することができる（ｂｃ）。従って、この場合、標的であるｍｉＲ−２１が存在すれば、ｂプライマーは、不活性（グレー）状態に送り込まれる。しかし、標的が存在しなければ、低い速度で、全てのｂプライマーが、ｂｃに変換される。標的を含まないインキュベーション結果（レーン９）と標的を含むインキュベーション結果（レーン１０）とを比較することにより、ゲートを確認した。
最後に、これらのタイプのゲートのいくつかを互いに接続して、式（ｍｉＲ−１９ａ ＯＲ ＴＷＴ）ＡＮＤ（ＮＯＴ ｍｉＲ−２１）を計算することができる（図２８Ｅ）ことを示す。この計算は、図２８ＢからのｍｉＲ−１９ａ ＯＲ ＴＷＴゲートの結果から、図２８ＤからのｍｉＲ−２１ゲートの結果へのカスケードによって達成される。前述と同様に、結果をゲル電気泳動によって確認した。インプットが全くないか、又はｍｉＲ−２１標的だけが存在する（レーン１３及び１４）場合、プライマーは、大部分がその非延長状態のままである。ＴＷＴのみ又はｍｉＲ−１９ａのみのいずれかが存在する場合には、式は、完全に延長されたａｂｃ産物（レーン１５及び１６）によって示されるように、真（True）と評価する。しかし、これらのうちの１つが、ｍｉＲ−２１に加えて存在する場合、プライマーは、不活性状態に送り込まれる（レーン１７及び１８）。ｍｉＲ−１９ａ及びＴＷＴの両方を有するが、ｍｉＲ−２１を含まない場合には、再び真という結果になる（レーン１９）が、３つの標的全てが存在する場合には、式は再び偽（False）と評価する（レーン２０）。これらの回路構成要素は、ＰＥＲ方法のモジュール性を実証している。１つの論理評価の結果は、合成プライマードメイン及び結合プライマードメインを組み合わせることにより、互いに容易にカスケードすることができ、このタイプの再構成は、任意の一本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡインプットを仮定して、理論的にあらゆるプライマードメインまで延長することができる。
実施例９．事象レコーダ
前述のシステムを用いて、本発明者らは、アウトプット配列は、インプット配列から完全に独立となり得るため、ＰＥＲが、いかにして、環境応答性動作をインプリメントするためのモジュールフレームワークを提供するかを示した。ＰＥＲのプログラム可能性、及び分子シグナル処理でのその適用をさらに明らかにするために、本発明者らは、２つのＲＮＡ標的が、動的に合成された転写物の証拠となる、順序をコードすることができる時間的記録システムを作出した（図２９Ａ）。
この適用に用いられる４つのヘアピンの各々は、無標識バイオセンサーとして標的検出のために同じトーホールド交換方法を使用し、これによって、ゲーテッドＰＥＲヘアピンの結合部位は、同族シグナル（この場合、ｍｉＲ−１９ａ）の存在下でのみ、条件付きで露出される（図２９Ｂ）。ゲーテッドヘアピンＡ〜Ｄは、プライマーの動的伸長をパターン形成し（図２９Ｃ）、ヘアピンＡ及びＤは、ｍｉＲ−１９ａシグナルの存在下でのみ活性化され、ヘアピンＢ及びＣは、Ｔｗｉｓｔ遺伝子、ＴＷＴの断片の存在下でしか活性化されない（図２９Ｃ）。
２つのＲＮＡシグナルが導入された順序に応じて、プライマーは、２つの伸長経路の１つを経ることになる。ｍｉＲ−１９ａが最初に導入された場合、初期プライマーは、ヘアピンＡを介してｂと一緒に延長される。次に、ＴＷＴ標的が導入されると、ヘアピンＢが、ｃをプライマーに付加することができる。これに対し、ＴＷＴが最初に導入された場合には、ｄが、露出したＣヘアピンを含むプライマー配列に付加され、その後、ｍｉＲ−１９ａシグナルと遭遇すると、ヘアピンＤが、ｅを付加することができる。
ヘアピンは、付加のたびに異なる数のヌクレオチドをコピーするように設計されているため、シグナルが溶液に導入された順序に基づいて、配列長さの差別化を達成することができる。これらの結果は、ＰＡＧＥ変性ゲル上で読み出すことができる（図２９Ｄ）。プライマー及びヘアピンＡ〜Ｄとの５時間のインキュベーションに、１又は３時間のいずれかの時点でシグナルを導入することにより、記録動作を評価した。レーン１は、標的が導入されていないシステムを示し、４つのヘアピン全ての連続的保護によって延長を示していない。レーン２及び３は、ｍｉＲ−１９ａ（ｍｉＲ）が１及び３時間の時点でそれぞれ導入されたときのヘアピンＡによりパターン形成された１０ｂｐステップの単一延長を示す。１又は３時間でＴＷＴを導入すると、露出したＣヘアピンによる１４ｂｐの単一延長が得られる（レーン４及び５）。初めにｍｉＲＮＡを、次にＴＷＴを導入すると、２つの１０ｂｐ延長が起こり、ａｂｃ配列を形成する。最後に、初めにＴＷＴを、次にｍｉＲＮＡを導入すると、２つの１４ｂｐ延長ステップが起こり、ａｄｅを形成するが、これによって、合成ＤＮＡの長さの２つのＲＮＡシグナルの時間的関係を読み出す本発明の能力が確認される。
ＰＥＲによる鎖の動的且つ環境応答性合成は、このタイプのプログラム可能な時間的記録を可能にするものであり、分子事象の転写物を作出するＰＥＲ技術の重要な利点を呈示する。本発明者らは、全てのステップで完全な配列プログラム可能性を有し、任意の標的配列の検出と、それに続いて、シグナル情報から、分子メモリーの形態としての配列アイデンティティ及び長さへの変換とを可能にする。
実施例１０．インビボでのＰＥＲのインプリメント
ＰＥＲは、独立の核酸配列の読み取り及び書き込みを組み合わせる新規の方法を提供することから、これをインビボでインプリメントすれば、細胞内で高度にプログラム可能な遺伝子調節及び記録プラットホームが可能になる。ＰＥＲカスケードは、標準的な細胞インキュベーション温度である３７℃で動作するように既に設計されているが、異なる温度でＰＥＲが動作することができるように、プライマー長さを調節することもできる。反応は、生体サンプルと適合性である２ｍＭ〜２２ｍＭまでの広範なマグネシウム濃度で確認されている。
本明細書には、ＰＥＲをインビボでインプリメントする少なくとも２つのアプローチが、それぞれ異なる適用と共に提供される（図３０）。最初のアプローチは、ＰＥＲヘアピンで、標的細胞集団を直接形質転換又はトランスフェクトするものである（図３０Ａ）。プライマーは、ヘアピンと一緒に導入するか、又は各細胞内に既に転写された配列であってもよい。このアプローチは、全ての細胞をターゲティングしないため、主として記録のためにこれらの適用を用いてもよい。例えば、ＰＥＲを用いて、単細胞レベルで、多重化シグナル情報を記録することができ、合成された転写物を回収し、シーケンシングすることができる。ヘアピンの３’末端は、典型的に、逆方向ｄＴベースを既に有することから、一部の事例では、これらの末端は、細胞内での分解に対する何らかの防御も有する。
第２のアプローチは、ＰＥＲヘアピン配列をプラスミド又は細胞のゲノム中に組み込むことによって、これらの配列が、ＲＮＡ ＰＥＲと一緒に使用するためのＲＮＡヘアピン中に転写され得るようにする（図３０Ｂ）。この発現アプローチは、構成要素が首尾よく組み込まれた細胞がそのために選択されると、細胞内ＰＥＲ合成を含む全集団を生成するという利点を有する。適用範囲がはるかに広く、しかもＰＥＲカスケード構成要素は継代されることから、細胞構成要素の記録は、第１のアプローチと比較して、長い時間枠にわたって起こり得る。いずれのプログラムされた行動も、より広い適用範囲を有する。ＰｏｌｙＴテールは、不要なヘアピン延長の有効な阻害剤として既に立証されているため、これをヘアピンの３’末端に使用することができる。
信頼性の高い停止配列は、鎖置換ＲＮＡポリメラーゼが引き続きそれを通過するのを妨げるが、これは、ヘアピンからの新たに合成された鎖の置換に必要である。一部の実施形態では、停止合流点で構造を折り畳むことにより、重合を阻害する配列モチーフ（例えば、テトラプレックス（四重鎖）及びトリプレックス構造）を用いてもよい。別の実施形態では、重合を阻むのに全てのヘアピンステム同士で共有される特定の配列モチーフと結合する強力な結合タンパク質（例えば、ｄＣａｓ９（そのＲＮＡ結合ハンドルは、全ヘアピンのステムループ部分として直接含有され得るヘアピン構造である）を用いてもよい。
実施例１１．時間を計測するための分子時計
ＰＥＲ多重化能力を最大にするために、大きなセットの作動性シグナル検出モジュールを、ＤＮＡ及びｍＲＮＡなどの多様な一本鎖核酸、二本鎖ＤＮＡ、及び小分子及びタンパク質について編集する（図１２Ａ〜１２Ｆ）。例えば、ヘアピンのプライマー結合領域は、同族シグナル（例えば、カルシウムイオン濃度）が、プロテクター鎖又は架橋剤のいずれかと一緒に、溶液中に存在するときだけ露出される。各ヘアピンが、プライマー鎖の状態間の遷移を決定することから、必要なシグナルが存在しないとき、ヘアピンを阻害すれば、プライマーは、その現状態で有効に停止される。一本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡを検出するために、修飾されたトーホールド交換反応５８，５９を使用するが、その場合、プロテクター鎖（例えば、図１２Ａでは、配列×２’×１’）は、漏出の可能性を低減するために、ヘアピン濃度に対して過剰濃度で存在する。二本鎖ＤＮＡの検出は、非対称ＰＣＲ法を用いて、同族トーホールド対をデュプレックスの末端に結合させることにより実施する。この方法はさらに拡大され、アプタマー配列を用いて、シグナルが存在しないときだけ、ヘアピンのプライマー結合領域を塞ぐことにより、タンパク質及び小分子を検出する。最後に、ＵＶ照射は、ＣＮＶＫ架橋剤の使用によって検出する５７。これらのシグナル検出メカニズムは全て、可逆的であり、これは、シグナルが動作しているだろう溶液からシグナルが無期限に隔離されないことと、シグナル濃度の変化が、ヘアピン結合部位露出の変化により表されることとの両方を意味する。
時間を計測するために、配列延長ステップにおける分布を追跡することにより、テロメラーゼサブ回路を時計として用いる（図１３）。検出されたシグナルは、プライマー交換伸長ステップの場合の「結合」速度などのシステムの動態学的特性を変化させないため、シグナル検出の間に溶液中の鎖が経るテロメラーゼステップの数は、これらのテロメラーゼサブ回路が活性である時間の量を示している。全体として、システムは、ストップウォッチとして作用し、テロメラーゼを２つのインプットモジュールとつなげることにより、２つのシグナルの検出の間に経過した時間の量をコードする。さらに、時間を計測するのに用いる時間尺度は、ヘアピン濃度を変えることによって調節することができ、これにより、反応の速度、並びに溶液中のｄＮＴＰの量を有効に変化させる。
方法．反応インキュベーション条件は、実施例４と同じである。初めにｄＮＴＰを１００μＭ濃度で使用し、ヘアピン濃度は、１０ｎＭから１μＭまで変動させ、テロメラーゼヘアピンの濃度は、他の濃度より低い。ｄＮＴＰ濃度は、所望の速度論と適合するように変動し、ｄＮＴＰ濃度は、高忠実度重合を促進する上で十分に低く、システムの動作を通じて実質的に消費されないように十分高い。インプットシグナルの濃度は、シグナル検出モジュールを最適化すると共に、特異性と収率との間の適切な妥協点を見出すために変動させる。プライマーを１００ｎＭでインキュベートした後、変性ポリアクリルアミド（ＰＡＧＥ）ゲル上でのスクリーニングを可能にするために、前述したようにＣｙ５染色剤で標識する。検出された分子事象間の適正なラダー合成は、ＰＡＧＥゲル上でのバンド長さの分布により視覚化し、同じ反応条件で特定の時間にわたりインキュベートした基準反応物と比較することができる。ゲルの解像は、より長い配列の場合、正確な分布当てはめを困難にする恐れがあるため、次世代シーケンシングを用いて、これらの配列をさらに確認する。
実施例１２．プログラム可能な時間駆動のための分子タイマー
この実施例で説明する遅延回路は、特定の時間にわたって起こるようにプログラムされる、シグナル検出事象と駆動の間の連続的伸長ステップのセットを含む（図１４Ａ〜１４Ｃ）。作動の前に、プライマーにいくつかの反応状態を通過させることによって、時間遅延を生成し、反応の数又はヘアピンの濃度のいずれか、従って反応の速度を変化させることにより調整する。このモジュール性は、広範な時間遅延後に駆動を可能にする（例えば、分から日までの時間尺度で駆動する）。
プライマー交換ヘアピン上に任意の配列をコピーする能力によって、プライマー交換反応システムは、アウトプットとして多数の任意の一本鎖シグナルをアウトプットすることができる。この一本鎖シグナルを用いて、溶液中の鎖置換回路と相互作用するか、又は相補的ＲＮＡ分子とハイブリダイズすることができる。一部の事例では、このアウトプットは、タンパク質合成を活性化するトーホールドスイッチ５８を活性化する。あるいは、有害シグナルの感知が、１つのアウトプットでトーホールドスイッチをトリガーし、続いて、設定時間量の後、別のアウトプットで同じスイッチを不活性化する。これによって、アウトプットを無期限に活性化する必要なく、環境シグナルに応答するアウトプットシグナルのパルスが可能になる（図１５Ａ〜１５Ｄ）。タンパク質シグナルのこのレベルのプログラム可能な、時間的制御は、以前の技術ではスケールアップが難しく、機能性合成システムを作製する、又は制御されたインビトロ環境において、反応速度論などの基本的生物学的メカニズムを研究する上で有用である。
方法．プライマー交換インキュベーション条件は、実施例６と同じである。例えば、アウトプットシグナルによりそのクエンチャー標識補体から蛍光色素標識鎖の置換を経時的に測定する分光蛍光計などで、アウトプットを経時的に直接測定して、駆動の適正な遅延を確認することにより、タイマー回路遅延を評価する。遅延を測定する別の選択肢は、ＧＦＰ生成トーホールドスイッチの駆動を経時的に用いて、蛍光を経時的にモニターするものである。
実施例１３．多重化時間記録及び駆動
プライマー交換反応は、例えば、２つの分子の１つが感知された場合（ＯＲ論理）のみ、又は両方が感知された場合（ＡＮＤ論理）にのみ、アウトプットを放出することによって、様々なセットのシグナルに応答して駆動させるモジュールフレームワークを提供する（図１６Ａ〜１６Ｉ）。これらはまた、一部の事例では、プログラムされた遅延後に、インプットが検出されていない場合、シグナルが存在しないか（ＮＯＴ論理）否かを検出するようにもプログラムされている。これらのゲートは、互いに連結されて、大きなセットの環境シグナル上で論理を実施し、前述した方法で駆動する（図１７Ａ〜１７Ｃ）。これらのデジタル論理回路は、様々な時点で検出される異なるセットのシグナルに応答性であり、転写及び翻訳ネットワークと相互作用する精巧なシグナル処理システムの基礎を提供する。
集積システム内の各モジュールは、実施例６及び７に記載のように、まず個別に試験する。続いて、システム内の各サブ回路がその機能を維持し、あらゆる問題を処理するのに必要なデバッギングを促進することを確実にするために、これらを段階的に組み合わせる。
方法．方法は、実施例６及び７に記載のものと同じである。
実施例１４．発達性自己組織化による差別化
実施例６〜８で作製したシグナル検出モジュールと、実施例３〜５で作製したトリガーされる構造合成とを組み合わせることにより、環境シグナルに基づく形状形成の差別化を操作することが可能である（図１９Ａ〜１９Ｃ）。各シグナル検出器モジュールは、そのプライマー結合領域が、同族シグナルの存在下でしか露出されない単一ヘアピンを必要とする。差別化樹形図の終端状態は、構造形成のトリガーとして役立つ。
方法．反応インキュベーション及び構造評価の方法は、前述した実施例に記載のものと同じである。Ｃｙ５標識プライマーを用いて、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（変性ＰＡＧＥ、典型的には、ＴＢＥ−尿素）によって、発達性自己組織化の最初のステップのための適正な鎖の長さ分布を確認する。続いて、プライマー上で成長した差別化形状をまず、非変性アガロースゲル電気泳動で評価し、次に、ＴＥＭ又はＡＦＭイメージングを用いて視覚化する。さらに構造は、ＤＮＡ−ＰＡＩＮＴ超解像法８，９でもイメージングする。
実施例１５．環境記録のための分子ティッカーテープ
ＰＥＲカスケードの動的合成反応を用いて、分子シグナル情報を経時的に記録することができる。この１つの有力な例は、分子ティッカーテープシステムであり、これは、シグナル依存的合成を連続的ＰＥＲテロメア化反応と組み合わせることにより、特定のシグナルが溶液中に存在する場合についての情報を記録する（図２０Ａ〜２０Ｄ）。まず、１シグナル追跡システムをインプリメントし、これを用いて、２時間にわたる単一シグナルの速度論を解明することができる。実験及びその結果の説明を以下に記載する。
分子インプリメンテーション．１シグナルシステムの分子インプリメンテーションは、２つのＰＥＲヘアピンから構成され、その１つは、分子「時計」として役立ち、全ての実験において同じ一定濃度で存在し、もう１つは、「シグナル」の役割を果たし、反復プライマー配列の前の２つの追加塩基の複写をパターン形成する（図２１Ａ〜２１Ｄ）。各々異なる実験では、反復ドメインの前に実験特異的バーコード配列を有するプライマーを使用するため、全ての実験を一緒にプールして、単一のシーケンシングランに供することができる。
実験の概略
記録．３つの記録実験を実施した。実験Ａでは、２時間のインキュベーション時間を通してシグナルを導入しなかった。これは、適正なクロック反応が起こったことを確認するための対照実験の役割を果たす。実験Ｂは、２時間のインキュベーションを通して、５００ｐＭの一定シグナルヘアピン濃度を用いた。クロック速度に対する相対シグナルを用いて、濃度曲線を較正することができたため、上記の反応を最後の実験の当てはめのための基準として用いた。実験Ｃは、シグナルなしで１時間実施した後、２００ｐＭのシグナルを途中で導入し、濃度曲線ａステップ関数を作成した。
記録は、３７℃で２時間実施した。反応は、５μＬの１０×ThermoPolバッファー、４０単位のＢｓｔラージフラグメントＤＮＡポリメラーゼ、５μＬの１００ｍＭ ＭｇＳＯ４、５μＬの混合ｄＡＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰの１００μＭ溶液、５μＬの１μＭの適切なプライマー、５μＬの５０ｎＭクロックヘアピン、実験Ｂについてのみ５μＬの５ｎＭシグナル溶液、並びに５０μＬまでの水を用いて、氷上で調製した。反応Ｃの場合、１時間のインキュベーション後、１μＬの１０ｎＭを添加した。インキュベーション後、反応物を氷に移し、１０μＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡで停止した。プールした反応物をNEB Monarch PCR & DNA Cleanup Kitに通過させて、記録された転写物を精製した。
アダプタータグ付け．精製した転写物を、アダプター配列で、その５’及び３’末端にタグ付けした（図２２）。結合鎖と記録を余剰のスプリント鎖と混合し、２３℃で１時間のインキュベーションにより、１×Ｔ４ＤＮＡリガーゼバッファー中のＴ４ＤＮＡリガーゼで連結した。連結後、転写物をＤＮＡクリーンアップカラムで再度精製した。
ゲル抽出．精製アダプタータグ付きオリゴを、６５℃で維持する１５％ＰＡＧＥ変性ゲル（１×ＴＢＥ）上に泳動させた。ゲルは、２００Ｖで１５分間泳動させ、１×Sybr Gold染色剤で染色した。Sybr Goldチャネル内で配列分布を視覚化した後、アダプタータグ付き配列のゲル抽出をTyphoon FLA 9000スキャナーで実施した。ゲルの抽出された部分を１．５ｍｌ円錐チューブ中に導入し、粉砕してから、５０μＬの１×ＴＥと合わせ、旋回させた。−８０℃及び９０℃でそれぞれ１０分間の連続的インキュベーションの後、構成要素をFreeze ‘N Squeeze DNAゲル抽出カラム内に導入し、１５，０００ｇで１分間旋回させた。抽出した転写物をもう１回ＤＮＡクリーンアップカラムに通過させた後、シーケンシングした。
転写物シーケンシング．Illumina（登録商標）ペアエンドＤＮＡシーケンシングを用いて、転写物をシーケンシングした。
配列の構文解析．配列をFASTQフォーマットで検索し、下記のように、クロック（０）及びシグナル（１）記録に構文解析した。初めに、有効な実験バーコード及び３’アダプタータグの最初の部分を有する初期プライマー配列の両方を同定することができた配列のみを検索した。というのは、これは、全記録がシーケンシングされ、実施された実験の１つに適用され得ることを示すためである。次に、シグナルヘアピンに対応する配列の全ての発生を「１」で置換し、次に、クロックヘアピンによりコードされる反復クロックドメインの全ての発生を「０」で置換し、その際、プライマー上の初期反復ドメインは除外した。０及び１の完全な２進列を有する記録だけを分析した。
結果
構文解析した２進配列を用いて、濃度曲線を当てはめたが、この最適化の結果は、図２３Ａ〜２３Ｂで見ることができる。
この実施例では、分子ティッカーテープを含む環境におけるシグナルに関する濃度情報を回収できるだけではなく、これらのシグナルが時間経過とともにどのように変化するかについての速度論的情報も回収できることを証明する。このタイプの時間記録は、多重化及び定量的様式で生物学的現象を研究する能力に多大な影響をもたらし得る。さらには、本発明者らのシーケンシングデータを用いて、２００ｐＭのシグナルが容易に検出可能であったが、これは、この記録技術の別の潜在的適用：高感度標的検出を示すものである。検出限界をさらに低濃度までスケールダウンすることができれば、この技術は、血清又はその他の体液中のｍｉＲＮＡといった非常に低濃度のマーカの多重化検出に適用することができるだろう。
別の例として、実施例６〜８でインプリメントしたクロック及び経路再構築システムを組み合わせることにより、環境シグナルに関する情報を記録し、その後、経時的に高精度で読み出すことができる。これは、連続的に伸長する鎖にコードされるシグナル検出事象の使用によって達成される。１つのテロメア化反応がクロックとして用いられ、さらなる反応が、異なるシグナルを経時的に記録する（図２０Ａ〜２０Ｄ）。実際のシグナル濃度の結果としての経時的なクロック及びシグナル配列組込みの分布を考慮することにより、絶対時間にわたる各々のシグナルについての濃度トレースをデータに当てはめる。これらのデータを当てはめるために、クロックのみが作動し、シグナル濃度が変動し、１つのシグナル検出器モジュールだけが動作している、制御された実験を実施することによって、それぞれの組込みタイプについて反応速度を測定する。回路が作動する時間量及びシグナル濃度はわかっていることから、長さの分布を用いて、個別の反応それぞれについて結合速度、ｋｏｎを決定する。次に、これらの速度を用いて、ティッカーテープ転写物中への組込みの数及び既知反応速度に基づいて相対シグナル濃度を決定する。
プライマー配列は、その５’末端に、塩基のランダム配列から構成されるユニークな分子識別子（ＵＭＩ）を含有する。これらを用いて、シーケンシングデータ中の重複読み取りを識別して、環境シグナルの時間依存性に関する可能な限り多くの定量的情報を保存することにより、データ分析におけるバイアスを低減する。
方法．反応条件は、実施例６〜８に記載のものと同じである。各Ｃｙ５標識プライマーは、１５ヌクレオチドのユニークな分子識別子（ＵＭＩ）でも標識されているため、転写物はＰＣＲ反応によって増幅され、次世代シーケンシング法で読み取られる。１５ヌクレオチドＵＭＩを用いると、１，０７３，７４１，８２４の可能性があり、従って、シーケンシングからの最大２千万の読み取りデータ中の同一ＵＭＩを有する読み取りデータは、ヌクレオチドバイアスさえ含む異なるプライマーに由来する。専用のスクリプトを用いてデータを分析することにより、データを構文解析し、選別して、時間トレースに当てはめる。
ポリメラーゼ速度論に影響を与えるシグナルを記録するために、例えば、カルシウム濃度の急上昇、基準とするための外部クロックを用いてもよい。例えば架橋ヘアピンを用いて、特定の波長のＵＶ照射を検出してもよく、これを特定の時間間隔の後パルスし、図１２Ｄで導入される検出器を用いて記録することができる。
実施例１６．分子モータの１Ｄの運動
クローラの基本的作動を試験するための１Ｄ走路は、構造的に明確な硬質ＤＮＡナノ構造上に構築される。単純なＤＮＡ折り紙長方形、又はＤＮＡレンガシステムを使用する５２，５３。下記のパラメータを変更する：（１）インキュベーション時間、（２）プライマー、ポリメラーゼ、及びヌクレオチドモノマーの濃度、（３）様々なドメイン（プライマー、情報コード部位など）の結合強度、（４）走路上で隣接する部位同士の空間的間隔、並びに（５）放出条件。反応のほぼ完了を可能にする１〜２時間の時間尺度を使用する。反応の速度論をより良く理解するために、秒から分を含むインキュベーション時間の様々な変化も試験する。１００ｎＭのプライマー濃度及び１０〜１００ｎＭのｄＮＴＰ濃度を試験する。ドメインの長さ及びＧＣ含量を変化させることにより、並びに必要であれば、反応平衡を偏らせるためのバルジなどの追加的補助成分を導入することによって、様々なドメインの結合強さを変更する。異なる空間的間隔を有する走路は、走路アンカーポイント間の様々な距離を有するナノ構造を組織化することによって作製する。初めに、単純な２部位走路を試験して、基本的な距離依存的性能を特性決定する。また、例えば、インキュベーションの終了時に「リバースプライマー」を手動で付加する、最終走路部位の横に放出シグナル部位を埋め込む、又は熱媒介性解離など、前述したような様々な放出戦略も試験する。
さらに、走路の様々な全長を試験して、長い移動距離中の何らかの性能劣化を測定する。様々な走路組成も同様に試験する。順序指示（例えば、図３１Ａに示すように、プライマー結合部位ａ＊、ｂ＊及びｃ＊の順）を有する十分にアドレスされた走路は、規定の経路に沿ってクローラを誘導する。反復プライマー（例えば、図３１Ａで、ａ−ａ＊として統合された全てのプライマーペアを考慮する）を含む走路は、クローラが、出発点を選択して、その方向に進むことを可能にする。
走路構造のアセンブリを特性決定するために、原子間力顕微鏡法及び超解像イメージングなどの直接ナノスケールイメージング法を使用する。初期検査段階のクローラの操作のために、ほとんどの場合、ゲル電気泳動に基づく質的特性決定が実施される。ゲル電気泳動は、ＤＮＡ分子をサイズ別に分別することによって、反応産物の迅速なプロファイリングを可能にする。所与のステップの前後で反応混合物を比較することによって、反応体の産物への変換を評価することができる。完全な反応物はすべて、３つの単一記録を一緒に結合した長さと一致する長さを有するバンド（補助部分を含む）として見ることができる。不適当な産物の場合、反応の規模及び収率に応じて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いる産物増幅ステップが、ゲル特性決定の前に追加される。ゲルバンドの強度の測定によって、反応収率の推定が可能になる。小規模産物形成の場合には、量的なリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）が、増幅トレースを経時的に分析し、初期状態に外挿し直すことによって、産物の量の推定を可能にする。次世代シーケンシングなどの単一分子分析ツールと組み合わせた、ランダム化ＤＮＡ配列による分子の固有同定を用い、単一走路にわたる複数の記録の生成を検出することによって、クローラの触媒及び反復記録行動を明らかにする。
実施例１７．２Ｄでの分子モータの運動
この実施例は、次の特性を実証する：（１）２Ｄ空間におけるクローラの運動の周角、（２）クローラが動き回って、従うべき経路を「選択」する能力、（３）クローラが、２Ｄ走路に関する情報を集団で収集する能力。
２Ｄ走路は、構造が明確な硬質ＤＮＡナノ構造上に構築される。様々な走路アンカー地点の位置を有するナノ構造を組織化することによって、異なる空間的配置を有する走路を作製する。特定の角度を有する単純な３部位走路（例えば、「Ｌ」字型）を用いて、合流地点でのクローラの挙動を試験する。両方のタイプの分子モータシステム（クローラ及びウォーカ）を試験する。インキュベーション時間及び濃度などの一部のパラメータを調節して、組合せ数の考えられる経路を収容する。同様に、様々な走路組成を試験する。順序指示を含む、十分にアドレスされた走路は、規定の２Ｄ経路に沿ってクローラの運動を誘導する。反復プライマー（ａ−ａ＊、次にａ−ａ＊など）又は交互プライマー（ａ−ａ＊、次にｂ−ｂ＊、次にａ−ａ＊など）の走路の場合、分子は、合流地点で従うべき経路を選択する自由を有する（図３１Ｂ及び３２Ｂ）。図３１Ｂ及び３２Ｂの右側は、２つのシステムのそれぞれについて分子モータの軌道例を示す。クローラが従う様々な走路は、生成された記録の異なる長さ及びアイデンティティとして表される。
走路構造のアセンブリを特性決定するために、原子間力顕微鏡法及び超解像イメージングなどの直接ナノスケールイメージング法を使用する。結果を特性決定して、クローラの主要な能力を実証するために、複数の特性決定方法を使用する。最初に、ゲル電気泳動によって、余剰のプライマーを含む走路の場合に、正しい長さを有する記録の形成と、複数のタイプの記録の形成を明らかにする。十分に規定された走路の場合、ゲルバンドは、予め定めた数の走路部位に対応する長さを有すると思われる。クローラが自由に動き回ることが許される、余剰のプライマーを含む走路の場合には、様々な長さを有するゲルバンドの分布を見ることができ；クローラの場合には、観測される最大長さは、走路部位の数に対応する。１Ｄ走路と同様に、反応の規模及び記録生成の収率に応じて、ゲル特性決定の前に、記録のＰＣＲ増幅を任意選択で追加する。第２に、ＰＣＲを用いて、特定の種類の記録を選択的に増幅し、指定された記録の形成を検出する。例えば、最初と最後の走路部位のプライマー／プライマー結合領域と相補的なＰＣＲプライマーを用いて、完全な記録を選択的に増幅する。第３に、次世代シーケンシング法を用いて、生成された記録のアイデンティティを直接調べる。これらの特性決定方法の組合せによって、全ての走路ポイントが、複数種の経路を介して分子クローラにより繰り返しアクセスされる。
実施例１８．量的情報の検査
分子モータは、所与の走路を動き回り、走路部位からの情報をコピーして、「記録」することができる。この能力について一般的に、各部位が、余剰のプライマーで標識された（全ての部位が同じプライマーを有する）未知の走路が想定される。生成された記録の長さから、分子によって採用される走路サイズ及びステップの数に関する量的情報が得られる。
分子モータの計数能力をまず、規定数の走路部位を有するＤＮＡナノ構造走路について試験する。例えば、１Ｄ構成上に３地点及び５地点を有する走路を性能の特性決定及び最適化のために試験する（図３３Ａ）。円などのより複雑な２Ｄ走路も試験して、一般的な走路に関する好適な計数挙動の能力を調べる。余剰のプライマーを含む走路から、クローラは、長さの分布を含む記録を生成するが、一度アクセスされた部位は、全クローラが走路から放出されるまで再びアクセスされることはできないため、最大長さは、走路部位の考えられる最大数を示す（図３３Ｂの概略図を参照）。ウォーカは、ウォーカにより採用されるステップの数を反映する長さの分布を含む記録を生成する。次に、分子モータシステムが生物学的システムにおいてインプリメントされる（図２８Ｂ）。例えば、特定の分子複合体のターゲティングを試験する。「走路」部位が結合したＤＮＡアンカーと結合した抗体による核孔複合体のターゲティングを用いて、量的情報を収集する（例えば、試験プラットホームについては、図３３Ｃを参照）。隣り合うサブユニット間の距離は約３０ｎｍであるため、核孔複合体の大きさは重要であり、試験システムとして理想的である。量的情報を取得するために、読み出しデータ及び様々な方法の相対性能の比較のための標準として、オルトゴナルシステム、例えば、超解像での直接イメージング（図３１Ｃ）又はｑＰＡＩＮＴと呼ばれる確率的イメージングの速度論的トレースの分析に基づく計数（図３１Ｃに示す同じシステムに、信頼できるものとして適用される）を使用する。
実施例１９．アイデンティティ情報の検査
分子モータは、走路からの情報をコピーして、記録するため、走路部位がユニークなＤＮＡ配列などのユニークな情報を含有していたら、クローラにより生成された記録は、各部位のアイデンティティ情報を含有するであろう。従って、量的情報以外に、ユニークなアイデンティティ情報も取得することができる（図３３Ｄ）。
部位のアイデンティティ情報を含有する記録を実証するために、複数の特性決定方法を使用する。第１に、特定の種類の記録の選択的ＰＣＲ増幅と組み合わせたゲル電気泳動によって、特定の記録の生成を明らかにする。第２に、次世代シーケンシング法に基づく配列情報を直接調べることにより、生成された記録の分子アイデンティティを明らかにする。
実施例２０．分子地形の再構成
分子モータの特性：（１）所与の分子標的のアイデンティティ情報の記録及び（２）複数種の経路を介し、同じ標的に沿った反復記録によって、モータは、標的の地形を調べ、記録することが可能になる。複数のクローラの作用により収集された集合的情報を用いて、標的部位の幾何学的配置を分析し、及び分子地形を再構築する。
所与の分子地形に沿った情報の収集物を、規定配置の走路部位を含むＤＮＡナノ構造走路について試験する（図３３Ｅ）。クローラは、検査及び記録のラウンド毎に異なる経路を取ることができる。各ラウンド後に生成された記録は、隣り合う分子部位の近接情報の収集物を反映する。次世代シーケンシング法による記録を直接調べることにより、地形に沿った可能な経路に各記録を割り当てることができる。一部の近接情報は、異なる記録からの情報と重複する。合流地点付近で生成された記録は、走路部位の複数のペアからの近接情報を含有する。全ての近接情報を編集することによって、隣り合う地点及び合流地点の情報を収集することができ、従って、分子地形の再構築が可能になる。
実施例２１．分子距離の記録
この実施例に記載する分子記録実験では、４つの異なる長さ（ロッド３８、ロッド４９、ロッド５９、ロッド７０のＤＮＡロッド（１０ｎＭ）と負の対照とを使用した。実験の結果を図３８Ａに示す。数（例えば、ロッド３８）は、塩基対内の二本鎖領域の長さを示す。ＤＮＡロッドは、独立に、１×ThermoPolバッファー（３ｍＭ Ｍｇ２＋）中の前駆体（１００ｎＭ）、触媒ヘアピン（１μＭ）、ｄＡＴＰ（１０μＭ）、ｄＴＴＰ（１０μＭ）及びＢｓｔ、ラージフラグメントＤＮＡポリメラーゼ（０．２６Ｕ／μＬ）と一緒に３７℃で４時間インキュベートした。反応の産物を６５℃の１５％ＰＡＧＥゲル（０．５×ＴＢＥ、８Ｍ尿素）上に泳動させ、Typhoonゲルスキャナーで視覚化した。結果は、生成された記録が、測定された距離と一致することを示している。一部のゲルバンドは、それらの対応するＤＮＡ記録で標識する。
３つの異なる長さ（５．４ｎｍ、１２．６ｎｍ及び１９．７ｎｍ）のＤＮＡロッド（濃度１００ｐＭ）を、ThermoPolバッファー（５ｍＭ ＭｇＳＯ４で補充）中の前駆体（１００ｐＭ）、触媒ヘアピン（２００ｎＭ）、ｄＡＴＰ（１００ｕＭ）、ｄＴＴＰ（１００μＭ）及びｄＣＴＰ（１００μＭ）並びにＢＳＴラージフラグメントＤＮＡポリメラーゼ（０．４Ｕ／ｕＬ）と一緒に３７℃で３０分間別々にインキュベートした。次に、溶液をＥｘｏ Ｉ ＤＮＡエキソヌクレアーゼ（０．４Ｕ／μＬ）で処理して、非反応及び未完成の一本鎖産物を消化した。生成された記録をＰＣＲ（５プライムＣｙ５色素標識プライマー−２５０ｎＭ、ｄＮＴＰ−２００μＭ、Ｖｅｎｔ Ｅｘｏ−０．５Ｕ／μＬ、ThermoPolバッファー−１×、１８サイクル、アニーリング温度が４６℃の標準ＰＣＲプロトコル）により増幅した。ＰＣＲ反応の結果を１２％ＰＡＧＥゲル（０．５×ＴＢＥ、８Ｍ尿素、２００Ｖ、６５℃）上に泳動させ、Typhoonゲルスキャナーで視覚化した。結果を図３８Ｂに示す。生成された記録は、測定された距離と一致する。一部のゲルバンドは、ゲルの解釈を助けるために、それらの対応するＤＮＡ記録で標識する。
実施例２２．ＤＮＡナノ構造上での分子定規技術の確認
ＤＮＡナノ構造を用いて、既知の固定距離で、ＤＮＡ標的を正確に配置し（図３５Ａ）、実験により、分子定規がこれらの距離を記録することができることを明らかにする。
実施例２３．複雑な２Ｄ幾何学での単一分子、多重化及びハイスループット測定
ＤＮＡナノ構造上の正八角形の頂点に８つのバーコード化ＤＮＡ標的を正確に配置することによって、核孔複合体（ＮＰＣ）の構造模倣物を生成する（図３５Ｂ）。次に、分子定規を用いて、距離を記録する。次世代シーケンス技術を用いて、距離と、対応する符号化バーコードとを読み出す。次に、分子定規を用いて、典型的な生物学的実験のインサイチュ条件と一致させるためのＮＰＣ模倣物の低いコピー数（１０４〜１０６）を記録する。
実施例２４．固定Ｕ２ＯＳ細胞中の核孔複合体に分子定規を適用する
固定Ｕ２ＯＳ細胞（ヒト骨の骨肉腫細胞）中のヌクレオポリンＮｕｐ９８をカスタムＤＮＡ共役モノクローナル抗体（＃２５９８、Cell Signaling）で標識する。超解像試験によって、この標識が、八角形構成中に８つのクラスターをもたらし、隣接するクラスター同士の距離は約３０ｎｍであることが判明した。分子定規を用い、４ｎｍ未満の解像度で、クラスター同士の距離を記録する。ゲル電気泳動読み出しデータは、予測した４つの異なる斜距離及びそれらの分散を明らかにする。ＮＧＳ読み出しデータは、ＮＰＣの不均質性の研究を可能にする単一分子距離を明らかにする。
方法
ＤＮＡ合成及び精製．オリゴは全て、未精製又はＨＰＬＣ精製のいずれもＩＤＴに注文した。精製ＲＮＡ分子は、無ＲＮａｓｅＨＰＬＣで精製したものを注文した。一部の未精製オリゴは、キットの指示に従って、Qiagen MinElute PCR精製カラムに１００μＬの１００μＭ未精製オリゴを通過させることにより実験室内で精製した後、洗浄した。カラムに結合したオリゴを１５μＬまで溶離し、濃度をNanodrop及びそれらのオリゴアナライザー（www.idtdna.com/site/order/oligoentry）消散係数を用いて測定した。オリゴは、１×ＴＥバッファー中に予め懸濁したものを１００μＭ注文し、これらの濃度は、MinElute精製オリゴを除き、全ての希釈物について想定した。全てのオリゴは、１×ＴＥで１０μＭの使用濃度まで希釈し、ＤＮＡのストック及び使用溶液は、−２０℃で、ＲＮＡは、−８０℃で保存した。
ＰＥＲインキュベーション．ＰＥＲ実験は全て、３７℃で表示される時間量にわたり、通常、１×ThermoPolバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ、（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、及び０．１％TritonrX-100）、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、及び１０〜１００μＭの適切なｄＮＴＰと一緒にインキュベートした。典型的には、２０μＬの反応物を８０℃で２０分間の酵素の熱不活性化によりクエンチングした後、１０μＬのホルムアミドと一緒にロードした。ＲＮＡ感受性サンプルの場合には、上記に代わり、反応物をＥＤＴＡでクエンチングした。無標識バイオセンサーの場合には、反応物をクエンチングしないが、インキュベーションの後直接ロードした。一部の実験は、溶液を平衡させるために、１５分間プレインキュベートした。
ゲル電気泳動．ほとんどの実験は、１５％ＴＢＥ−尿素ＰＡＧＥ変性ゲルを使用し、２００Ｖで、６５℃にて３５分間泳動させ、Ｃｙ５及びＦＡＭチャネルでスキャンした。ゲルは、Sybr Goldでも数分間染色し、その後、Sybr Goldチャネルでイメージングした。一部の実験では、異なるゲル条件を使用した。
ＡＦＭ．ＡＦＭイメージングをNanoscope V装置で実施した。
配列設計．ほとんどの配列は、コマンドラインNUPACK実行ファイルと組み合わせた実験室内最適化コードを用いて設計した。構築物を分析するために、NUPACKウェブアプリケーションも使用した。
実施例２５．クローラシステム
分子モータシステムの１つ、クローラについての一連の試験を実施して、基本的な操作を確認した（図４３Ａ〜４３Ｃ）。ＤＮＡナノ構造プラットホーム上の三角形アラインメントに沿った３点走路を設計した。図４３Ａの上のパネルは、この設計の概略図を示し、図４３Ａの下のパネルは、３つの標的部位にわたりクローリングした後のクローラの分子詳細を示す。クローリングプロセスの完了後、クローラは、長さ１１８ｎｔの完全な記録となる。ＰＣＲにより増幅され、変性ゲル上を泳動するとき、最終記録は、予測された長さ範囲で出現した（図４３Ｂ）。さらに、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）を用いて、クローラを視覚化した。図４３Ｃの左側パネルは、クローリング反応を開始するプライマーが添加される前の標的プローブを示し、ここで、プローブは点として現れる。約１時間の記録反応後に、クローラは、図４３Ｃの右側パネルに示すように、３つの走路部位を一緒に連結し、従って、これに応じてＡＦＭイメージに出現する。これらの試験の結果は、各ステップ：（１）プライマー結合、（２）ポリメラーゼによるプライマー延長、（３）テンプレートによる鎖置換、（４）隣接する部位との相互作用、（５）ポリメラーゼによるさらなる延長、（６）記録の自律的放出についてクローラシステムの基本的操作を明らかにする。
参照文献（これらの各々は、その全体を本明細書に組み込む）
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５９．国際公開第２０１２／０５８４８８Ａ１号（２０１１年２７日に出願されたＰＣＴ／米国特許第２０１１／０５８１７８号）.
６０．Rothemund, Paul W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature 440, 297-302, 2006.
本明細書に開示した参照文献、特許及び特許出願は全て、各々が引用される主題、一部の事例では、文献の全体を包含し得る主題に関して、参照により本明細書に組み込むものとする。
不定冠詞「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、本明細書及び請求項で使用されるとき、明らかに反対のことが示されていない限り、「少なくとも１つの」を意味するものと理解すべきである。
また、明らかに反対のことが示されていない限り、２つ以上のステップ又は行為を含む本明細書で請求されるあらゆる方法において、方法のステップ又は行為の順序は、方法のステップ又は行為が列記される順序に必ずしも限定されるわけではないことを理解されたい。
特許請求の範囲、並びに上の明細書において、「含む」、「包含する」、「担持する」、「有する」、「含有する」、「含む」、「保持する」、「〜から構成される」などの移行句は全て、制限がない、すなわち、包含するが、限定されないことを意味すると理解されるべきである。但し、「〜からなる」及び「ほぼ〜からなる」という移行句だけは、米国特許庁特許審査基準（United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures, Section 2111.03）に記載されている通り、それぞれ制限的又は半制限的移行句とする。

Claims (68)

  1. （ａ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）分子の３’サブドメインと分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）結合ドメインを含む初期触媒ヘアピン分子；
    （ｂ）前記３’トーホールドドメインと相補的で、これと結合する初期プライマー；並びに
    （ｃ）鎖置換活性を有するポリメラーゼ
    を含むプライマー交換反応（ＰＥＲ）システム。
  2. 前記結合ドメインが、ループドメインである、請求項１に記載のＰＥＲシステム。
  3. （ｄ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）第２ヘアピン分子の３’サブドメインと第２ヘアピン分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）ループドメインを含む第２触媒ヘアピン分子をさらに含み、ここで、前記第２ヘアピン分子の３’トーホールドドメインが、前記初期ヘアピン分子の５’サブドメインと相補的である、請求項１に記載のＰＥＲシステム。
  4. 前記第２ヘアピン分子の不対３’トーホールドドメイン内に位置するヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを含む第２プライマーをさらに含む、請求項３に記載のＰＥＲシステム。
  5. （ｅ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）第３ヘアピン分子の３’サブドメインと第３ヘアピン分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）ループドメインを含む第３触媒ヘアピン分子をさらに含み、ここで、前記第３ヘアピン分子の３’トーホールドドメインは、前記第２ヘアピン分子の５’サブドメインと相補的である、請求項１に記載のＰＥＲシステム。
  6. 前記第３ヘアピン分子の不対３’トーホールドドメインと相補的な第３プライマーをさらに含む、請求項５に記載のＰＥＲシステム。
  7. 複数の触媒ヘアピン分子をさらに含み、各ヘアピン分子は、（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）前記複数のうち１ヘアピン分子の３’サブドメインと、前記複数のうち１ヘアピン分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）ループドメインを含み、ここで、各ヘアピン分子の前記３’トーホールドドメインが、前記複数のうち１つの他のヘアピン分子の５’サブドメインと相補的である、請求項５に記載のＰＥＲシステム。
  8. 複数のプライマーをさらに含み、各プライマーは、前記複数のうち１つのヘアピン分子の不対３’トーホールドドメインと相補的である、請求項７に記載のＰＥＲシステム。
  9. 前記プライマーが、検出可能な分子と連結される、請求項１に記載のＰＥＲシステム。
  10. 前記プライマーが、生体分子と連結される、請求項１に記載のＰＥＲシステム。
  11. 前記生体分子が、タンパク質である、請求項１０に記載のＰＥＲシステム。
  12. 前記ポリメラーゼが、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ又はＢｓｕ ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１に記載のＰＥＲシステム。
  13. デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）をさらに含む、請求項１に記載のＰＥＲシステム。
  14. （ａ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）分子の５’サブドメインと分子の３’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）ループドメインを含む初期触媒ヘアピン分子；
    （ｂ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）第２ヘアピン分子の３’サブドメインと第２ヘアピン分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）結合ドメインを含む第２触媒ヘアピン分子（ここで、前記第２ヘアピン分子の３’トーホールドドメインは、前記初期ヘアピン分子の５’サブドメインと相補的である）；並びに
    （ｃ）前記初期ヘアピン分子の不対３’トーホールドドメインと相補的な初期プライマー
    を含むプライマー交換反応（ＰＥＲ）システム。
  15. 前記結合ドメインが、ループドメインである、請求項１４に記載のＰＥＲシステム。
  16. 前記第２ヘアピン分子の不対３’トーホールドドメインと相補的な第２プライマーをさらに含む、請求項１４に記載のＰＥＲシステム。
  17. 鎖置換活性を有するポリメラーゼをさらに含む、請求項１４に記載のＰＥＲシステム。
  18. デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）をさらに含む、請求項１４に記載のＰＥＲシステム。
  19. （ａ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）分子の３’サブドメインと分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）結合ドメインを含む初期触媒ヘアピン分子、
    （ｂ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）第２触媒ヘアピン分子の３’サブドメインと第２触媒ヘアピン分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）ループドメインを含む第２触媒ヘアピン分子（ここで、前記第２触媒ヘアピン分子の３’トーホールドドメインは、前記初期触媒ヘアピン分子の５’サブドメインと相補的である）、
    （ｃ）前記初期ヘアピン分子の不対３’トーホールドドメインと相補的なプライマー、
    （ｄ）鎖置換活性を有するポリメラーゼ、並びに
    （ｅ）デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）
    を反応バッファー中で合わせることより、反応混合物を形成した後；
    一本鎖核酸記録を生成するのに十分な時間にわたって、核酸重合、鎖置換及びアニーリングをもたらす条件下で前記反応混合物をインキュベートすること
    を含むプライマー交換反応（ＰＥＲ）方法。
  20. 前記結合ドメインがループドメインである、請求項１９に記載のプライマー交換反応。
  21. （ａ）鎖置換活性を有するポリメラーゼ及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の存在下で、インプットプライマーを触媒分子と接触させるが、ここで、前記触媒分子は、（ｉ）不対３’トーホールドドメイン及び（ｉｉ）置換鎖と、前記トーホールドドメインを含有するテンプレート鎖とのヌクレオチド塩基対により形成される、前記トーホールドドメインから５’側に位置する対ドメインを含み、前記インプットプライマーは、前記触媒分子の３’トーホールドドメインと相補的であり；
    （ｂ）前記触媒分子の対ドメインを介して前記プライマーを延長することにより、前記置換鎖を置換して、延長アウトプットプライマーを形成し；
    （ｃ）前記置換鎖と前記テンプレート鎖同士の分子内ヌクレオチド塩基対によって、前記ヘアピン分子から前記延長アウトプットプライマーを置換し；
    （ｄ）鎖置換活性を有するポリメラーゼ及びｄＮＴＰの存在下で、（ｃ）の前記置換延長アウトプットプライマーを第２触媒分子と接触させることを含み、ここで、前記第２触媒分子は、（ｉ）不対３’トーホールドドメイン及び（ｉｉ）置換鎖と、前記トーホールドドメインを含有するテンプレート鎖とのヌクレオチド塩基対により形成される、前記トーホールドドメインから５’側に位置する対ドメインを含み、前記延長アウトプットプライマーは、前記第２触媒分子の３’トーホールドドメインと相補的である、プライマー交換反応。
  22. 一本鎖核酸を生成する方法であって、
    （ａ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）分子の３’サブドメインと分子の５’サブドメイン同士の分子間ヌクレオチド塩基対により形成される、対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）ヘアピンループドメインを含む初期ヘアピン分子、
    （ｂ）各ヘアピン分子が、（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）複数のうち１ヘアピン分子の３’サブドメインと複数のうち１ヘアピン分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）ループドメインを含む、複数の異なるヘアピン分子（ここで、各ヘアピン分子の前記３’トーホールドドメインは、前記複数のうち１つの他のヘアピン分子の５’サブドメインと相補的である）、
    （ｃ）前記初期ヘアピン分子の不対３’トーホールドドメインと相補的な初期プライマー、
    （ｄ）鎖置換活性を有するポリメラーゼ、並びに
    （ｅ）デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）
    を反応バッファー中で合わせることにより、反応混合物を形成した後；
    前記初期プライマーよりも長い一本鎖核酸記録を生成するのに十分な時間にわたって、核酸重合、鎖置換及びアニーリングをもたらす条件下で前記反応混合物をインキュベートすることを含む方法。
  23. （ｅ）で生成された前記一本鎖核酸が、前記複数のうちのヘアピン分子のステムドメインと相補的であるヌクレオチドドメインのコンカテマーを含む、請求項２２に記載の方法。
  24. （ｅ）で生成された前記一本鎖核酸が、自己相補性のドメインを含む、請求項２２に記載の方法。
  25. 自己相補性の前記ドメインの同士の分子内ヌクレオチド塩基対によって（ｅ）で生成された前記一本鎖核酸の折り畳みが達成される条件下で、前記反応混合物をインキュベートすることをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
  26. 核酸ステープル鎖の存在下、前記一本鎖核酸及び前記核酸ステープル鎖のドメイン同士のヌクレオチド塩基対によって（ｅ）で生成された前記一本鎖核酸の折り畳みが達成される条件下で前記反応混合物をインキュベートすることをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
  27. 請求項１に記載のＰＥＲシステムを含む細胞。
  28. 前記細胞が、原核細胞又は真核細胞である、請求項２７に記載の細胞。
  29. 前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項２８に記載の細胞。
  30. 少なくとも２つの核酸を含み、これらの各々が、（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）触媒ヘアピン分子の３’サブドメインと、同じ前記触媒ヘアピン分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）ループドメインを含む触媒ヘアピン分子をコードする、ベクター。
  31. 少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つの核酸をコードし、これらの各々が、（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）触媒ヘアピン分子の３’サブドメインと、同じ前記触媒ヘアピン分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）ループドメインを含む触媒ヘアピン分子をコードする、請求項３０に記載のベクター。
  32. 請求項３０に記載のベクターを含む、細胞。
  33. 触媒分子の前記３’トーホールドドメインと相補的で、且つ、これと結合する初期プライマーをさらに含む、請求項３２に記載の細胞。
  34. 鎖置換活性を有するポリメラーゼをさらに含む、請求項３２に記載の細胞。
  35. （ａ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）分子の３’サブドメインと分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）結合ドメインを含む触媒ヘアピン分子（ここで、（ａ）（ｉ）及び（ａ）（ｉｉ）の前記ドメインは、タンデム反復配列を形成する）、
    （ｂ）（ｉ）３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）分子の３’サブドメインと分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）結合ドメインを含む少なくとも１つの他の触媒ヘアピン分子（ここで、（ｂ）（ｉ）及び（ｂ）（ｉｉ）の前記ドメインは、シグナル配列により分断されるタンデム反復配列を形成し、（ｂ）（ｉ）の前記３’トーホールドドメインは、プロテクター鎖と不可逆的に結合している）、並びに
    （ｃ）（ａ）の前記触媒ヘアピン分子の３’トーホールドドメインと相補的で、且つ（ｂ）の前記触媒ヘアピン分子の３’トーホールドドメインと相補的であるドメインを含む核酸プライマー
    を含む組成物。
  36. （ａ）（ｉｉｉ）及び／又は（ｂ）（ｉｉｉ）の前記結合ドメインが、ループドメインである、請求項３５に記載の組成物。
  37. （ａ）（ｉｉｉ）及び／又は（ｂ）（ｉｉｉ）の前記結合ドメインが、少なくとも１つの共有結合架橋したヌクレオチドを含む、請求項３５に記載の組成物。
  38. 前記結合ドメインが、少なくとも１０ヌクレオチド長の安定した対ドメインである、請求項３５に記載の組成物。
  39. 前記シグナル配列が、２〜２０ヌクレオチド長を有する、請求項３５に記載の組成物。
  40. 前記シグナル配列が、標識分子に特異的にバーコード化される、請求項３５に記載の組成物。
  41. 前記プライマーが、実験特異的バーコードを含む、請求項３５に記載の組成物。
  42. 前記プロテクター鎖が、任意選択で、ループドメインを介して、（ｂ）の少なくとも１つの他の触媒ヘアピン分子の３’トーホールドドメインと連結している、請求項３５に記載の組成物。
  43. 標的分子をさらに含む、請求項３５に記載の組成物。
  44. 前記標的分子が、核酸である、請求項４３に記載の組成物。
  45. 前記核酸が、一本鎖核酸又は二本鎖核酸である、請求項４４に記載の組成物。
  46. 前記標的分子が、タンパク質、ペプチド、脂質、炭水化物、脂肪、及び分子量９００ダルトン未満の小分子から選択される生体分子である、請求項４３に記載の組成物。
  47. 前記プロテクター鎖が、前記標的分子と結合することができる、請求項４３に記載の組成物。
  48. 前記標的分子が、前記プロテクター鎖と相補的なヌクレオチド配列を含むか、又はそれと連結している、請求項４７に記載の組成物。
  49. 鎖置換活性を有するポリメラーゼをさらに含む、請求項３５に記載の組成物。
  50. 標的分子を検出する方法であって、
    標的分子、鎖置換ポリメラーゼ、及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含有する反応バッファー中で、
    （ａ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）分子の３’サブドメインと分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）結合ドメインを含む触媒ヘアピン分子（ここで、（ａ）（ｉ）及び（ａ）（ｉｉ）の前記ドメインは、タンデム反復配列を形成する）；
    （ｂ）（ｉ）３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）分子の３’サブドメインと分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）結合ドメインを含む少なくとも１つの他の触媒ヘアピン分子（ここで、（ｂ）（ｉ）及び（ｂ）（ｉｉ）の前記ドメインは、シグナル配列により分断されるタンデム反復配列を形成し、（ｂ）（ｉ）の前記３’トーホールドドメインは、前記標的分子と結合することができるプロテクター鎖と不可逆的に結合している）、並びに
    （ｃ）（ａ）の前記触媒ヘアピン分子の３’トーホールドドメインと相補的で、且つ（ｂ）の前記触媒ヘアピン分子の３’トーホールドドメインと相補的であるドメインを含む核酸プライマー
    を合わせ、
    前記初期プライマーよりも長く、且つ前記シグナル配列の少なくとも１つを含む一本鎖核酸記録を生成するのに十分な時間にわたって、核酸重合、鎖置換及びアニーリングを達成する条件下で、前記反応混合物をインキュベートすることを含む方法。
  51. 分子事象間の時間を計測する方法であって、
    （ａ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）分子の３’サブドメインと分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）ヘアピンループドメインを含む初期触媒ヘアピン分子、
    （ｂ）各ヘアピン分子が、（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）ヘアピン分子の３’サブドメインとヘアピン分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）ループドメインを含む複数の異なる触媒ヘアピン分子（ここで、各ヘアピン分子の前記３’トーホールドドメインは、前記複数のうち１つの他のヘアピン分子の前記５’サブドメインと相補的である）、
    （ｃ）前記初期ヘアピン分子の不対３’トーホールドドメインと相補的な初期プライマー、
    （ｄ）鎖置換活性を有するポリメラーゼ、並びに
    （ｅ）デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を反応バッファー中で合わせることにより、反応混合物を形成し；
    第１分子事象に前記反応混合物を曝露し；
    一本鎖核酸記録を生成するのに十分な時間にわたって、核酸重合、鎖置換及びアニーリングを達成する条件下で前記反応混合物をインキュベートした後；
    第２分子事象に前記反応混合物を曝露することを含む方法。
  52. 前記第１分子事象が、ＤＮＡ重合を開始する、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記第２分子事象が、ＤＮＡ重合を終結させる、請求項５１に記載の方法。
  54. 生成される前記一本鎖核酸の長さに基づいて、前記第１分子事象と前記第２分子事象との間の時間間隔を決定することをさらに含む、請求項５１に記載の方法。
  55. （ａ）不対３’トーホールドドメイン、及び前記トーホールドドメインから５’側に位置し、且つ置換鎖と、前記トーホールドドメインを含有するテンプレート鎖とのヌクレオチド塩基対により形成される、対ドメインを含む初期触媒分子；
    （ｂ）前記不対３’トーホールドドメインと相補的な初期プライマー；並びに
    （ｃ）鎖置換活性を有するポリメラーゼ
    を含む、プライマー交換反応（ＰＥＲ）システム。
  56. 不対３’トーホールドドメイン、及び前記トーホールドドメインから５’側に位置し、且つ置換鎖と、前記トーホールドドメインを含有するテンプレート鎖とのヌクレオチド塩基対により形成される、対ドメインを含む第２触媒分子をさらに含み、ここで、前記第２触媒分子の３’トーホールドドメインは、前記初期触媒分子の対ドメインの置換鎖と相補的である、請求項５５に記載のＰＥＲシステム。
  57. （ａ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン及び（ｉｉ）置換鎖と、前記トーホールドドメインを含有するテンプレート鎖とのヌクレオチド塩基対により形成される、前記トーホールドドメインから５’側に位置する対ドメインを含む初期核酸分子；
    （ｂ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン及び（ｉｉ）置換鎖と、前記トーホールドドメインを含有するテンプレート鎖とのヌクレオチド塩基対により形成される、前記トーホールドドメインから５’側に位置する対ドメインを含む第２核酸分子（ここで、前記第２核酸分子の不対３’トーホールドドメインは、前記初期核酸分子の置換鎖と相補的である）；
    （ｃ）前記初期核酸分子の不対３’トーホールドドメイン内に位置するヌクレオチドと相補的なプライマー
    を含む分子モータシステム。
  58. 鎖置換活性を有するポリメラーゼをさらに含む、請求項５７に記載の分子モータシステム。
  59. 前記初期核酸分子の対ドメインが、重合を終結させる分子を含む、請求項５７に記載の分子モータシステム。
  60. 前記第２核酸分子の対ドメインが、重合を終結させる分子を含む、請求項５７に記載の分子モータシステム。
  61. 前記第２核酸分子の３’トーホールドドメインが、重合を停止する３’分子を含む、請求項５７に記載の分子モータシステム。
  62. 複数の核酸分子をさらに含み、各分子が、（ｉ）不対３’トーホールドドメイン及び（ｉｉ）置換鎖と、前記トーホールドドメインを含有するテンプレート鎖とのヌクレオチド塩基対により形成される、前記トーホールドドメインから５’側に位置する対ドメインを含み、ここで、前記複数のうち１分子の不対３’トーホールドドメインは、前記複数のうち１つの他の核酸分子の置換鎖と相補的である、請求項５７〜６１のいずれか１つに記載の分子モータシステム。
  63. 前記核酸分子の少なくとも１つが、標的生体分子と結合している、請求項５７に記載の分子モータシステム。
  64. 前記核酸分子の各々が、異なる標的生体分子と結合している、請求項６３に記載の分子モータシステム。
  65. 標的生体分子間の距離を記録する方法であって、
    （ａ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、及び（ｉｉ）置換鎖と、前記トーホールドドメインを含有するテンプレート鎖とのヌクレオチド塩基対により形成される、前記トーホールドドメインから５’側に位置する対ドメインを含む初期核酸分子（ここで、前記初期核酸分子は、標的生体分子と連結している）、
    （ｂ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、及び（ｉｉ）置換鎖と、前記トーホールドドメインを含有するテンプレート鎖とのヌクレオチド塩基対により形成される、前記トーホールドドメインから５’側に位置する対ドメインを含む第２核酸分子（ここで、前記第２核酸分子の不対３’トーホールドドメインは、前記初期核酸分子の置換鎖と相補的であり、また、前記第２核酸分子は、標的生体分子と連結している）、
    （ｃ）前記初期核酸分子の不対３’トーホールドドメインと相補的なプライマー、
    （ｄ）鎖置換活性を有するポリメラーゼ、並びに
    （ｅ）デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を反応バッファー中で合わせることにより、反応混合物を形成し；
    一本鎖核酸記録を生成するのに十分な時間にわたって、核酸重合、鎖置換及びアニーリングを達成する条件下で前記反応混合物をインキュベートすることを含む方法。
  66. 前記反応混合物が、複数の核酸分子をさらに含み、各分子が、（ｉ）不対３’トーホールドドメイン及び（ｉｉ）置換鎖と、前記トーホールドドメインを含有するテンプレート鎖とのヌクレオチド塩基対により形成される、前記トーホールドドメインから５’側に位置する対ドメインを含み、ここで、前記複数のうち１核酸分子の前記不対３’トーホールドドメインは、前記複数のうち１つの他の核酸分子の置換鎖と相補的であり、前記複数の核酸分子の各々が、標的生体分子と連結している、請求項６５に記載の方法。
  67. （ａ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）分子の３’サブドメインと分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）ループドメインを含む初期ヘアピン分子（ここで、前記初期ヘアピン分子は、標的生体分子と連結している）；
    （ｂ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）分子の３’サブドメインと分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）ループドメインを含む第２ヘアピン分子（ここで、前記第２ヘアピン分子は、標的生体分子と連結しており、前記初期ヘアピン分子の５’サブドメインは、前記第２ヘアピン分子の５’サブドメインと相補的である）；
    （ｃ）一方が、前記初期ヘアピン分子の不対３’トーホールドドメインと相補的であり、他方が、前記第２ヘアピン分子の不対３’トーホールドドメインと相補的である、２つのプライマー；
    （ｄ）各分子が、（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）分子の３’サブドメインと分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）ループドメインを含む、複数の触媒ヘアピン分子（ここで、前記複数のヘアピン分子各々の５’サブドメインは、前記複数のうち１つの他のヘアピン分子の５’サブドメインと相補的であり、前記複数のヘアピン分子の１つの３’トーホールドドメインは、前記初期ヘアピン分子の５’サブドメインと相補的であり、前記複数のうちの別のヘアピン分子の３’トーホールドドメインは、前記第２ヘアピン分子の５’サブドメインと相補的である）；並びに
    （ｅ）鎖置換活性を有するポリメラーゼ
    を含む分子記録システム。
  68. 標的生体分子間の距離を記録する方法であって、
    （ａ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）分子の３’サブドメインと分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）ループドメインを含む初期ヘアピン分子（前記初期ヘアピン分子は、標的生体分子と連結している）；
    （ｂ）（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）分子の３’サブドメインと分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）ループドメインを含む第２ヘアピン分子（前記第２ヘアピン分子は、標的生体分子と連結しており、前記初期ヘアピン分子の５’サブドメインは、前記第２ヘアピン分子の５’サブドメインと相補的である）；
    （ｃ）一方が、前記初期ヘアピン分子の不対３’トーホールドドメインと相補的であり、他方が、前記第２ヘアピン分子の不対３’トーホールドドメインと相補的である、２つのプライマー；
    （ｄ）各分子が、（ｉ）不対３’トーホールドドメイン、（ｉｉ）分子の３’サブドメインと分子の５’サブドメイン同士の分子内ヌクレオチド塩基対により形成される対ステムドメイン、及び（ｉｉｉ）ループドメインを含む、前記複数のヘアピン分子（ここで、前記複数のヘアピン分子各々の５’サブドメインは、前記複数のうち１つの他のヘアピン分子の５’サブドメインと相補的であり、前記複数のヘアピン分子の１つの３’トーホールドドメインは、前記初期ヘアピン分子の５’サブドメインと相補的であり、前記複数のうち別のヘアピン分子の３’トーホールドドメインは、第２ヘアピン分子の５’サブドメインと相補的である）；並びに
    （ｅ）鎖置換活性を有するポリメラーゼ並びにデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を反応バッファー中で合わせることにより、前記反応混合物を形成した後；
    二本鎖核酸記録を生成するのに十分な時間にわたって、核酸重合、鎖置換及びアニーリングを達成する条件下で前記反応混合物をインキュベートすることを含む方法。
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