JP2019506860A - 脱脂処理による病原体の不活性化 - Google Patents

脱脂処理による病原体の不活性化 Download PDF

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Abstract

本発明は、メチルβ−シクロデキストリン（ＭＢＣＤ）を用いてエンベロープの脂質を枯渇させたエンベロープウイルスを含有するワクチンに関する。２段階工程におけるエンベロープウイルスの脱脂処理は、当該ウイルスの感染力を消失させ、このことは、脱脂処理されたウイルスをワクチンにおいて安全に使用させられる。コレステロールなどの脂質を脱脂処理するためのＭＢＣＤの使用は、他の方法とは対照的に、未処理のウイルスの２０％未満のコレステロールを有するウイルスを結果的に生じるが、このような脱脂処理されたウイルスは、未処理のウイルスの少なくとも８５％のタンパク質含有量を保持する。ＭＢＣＤによる脱脂処理はまた、ウイルスタンパク質の免疫原性を保存する。エンベロープウイルスを脱脂処理するために２段階工程においてＭＢＣＤ処理を用いる本発明は、有効なワクチンへと組み込まれた不活性化型ウイルスの作製のための新たな代替法を表す。【選択図】なし

Description

本発明は、エンベロープがメチルβ−シクロデキストリン（ＭＢＣＤ）を用いて脱脂処理されたエンベロープウイルス粒子を含有するワクチンに関する。
ウイルスは、それ自体に代謝活性を持たない可動性遺伝要素である。その代わり、ウイルスは、繁殖するために、宿主細胞に感染して、当該宿主細胞のエネルギー及びプロセスを使用しなければならない。いくつかのウイルスは「裸」であり、これは、個々のウイルス粒子またはビリオンが、ウイルスゲノムを取り囲むカプシド、及びことによるとウイルスでコードされた少数の非構造タンパク質のみから構成されていることを意味する。他のウイルスにおいて、カプシドは、膜またはエンベロープ内に含有されている。ウイルスゲノムが、脂質合成に関与するタンパク質をコードするには概して小さ過ぎるため、このようなエンベロープウイルスは、宿主細胞脂質から当該ウイルスのエンベロープを構築しなければならない。ウイルスエンベロープの脂質含有量はしたがって、宿主細胞の脂質特徴によって変わる。
ウイルスは、当該ウイルスの宿主生命体へ十分適応し、しばしば病原性であり、当該ウイルスの宿主へ疾患及びさらには死滅をもたらす。ウイルスは、ヒト及び／もしくは当該ヒトのペット動物に感染することによって、または食物源である植物及び動物に影響することによって、大きな経済的影響を有し得る。ワクチンは、ウイルス感染から宿主動物を防御する好ましい方法である。ワクチンは、抗体及び細胞免疫を含む、ウイルスに対する防御免疫応答を創り出す。両タイプの応答はしばしば、宿主細胞の新たな感染を低下させて、ウイルス粒子及び感染した細胞を宿主から除去するために必要とされる。
ほぼ４０年前、Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２７（２）：３２０〜３２９，１９７８）は、コレステロール非含有小胞を用いて、ウイルスエンベロープからのコレステロールの枯渇が、ウイルス粒子の標的細胞を感染させるウイルス粒子の能力を低下させることができることを実証した。対照的に、他の研究者らは、ウイルス感染力が標的細胞膜におけるコレステロールの存在を必要とするが、ウイルスエンベロープにおいては必要としないことを報告した。さらに他の者は、エンベロープにおけるコレステロールの欠乏よりもむしろ、コレステロールを除去する過程が感染力の低下の原因であると仮定した。ウイルス機能におけるコレステロールの役割にかかわらず、感染力の完全かつ永久的な喪失は、コレステロール枯渇性ウイルスについてこれまで実証されておらず、コレステロール枯渇性ウイルスが安全かつ有効なワクチンにおいて有用であることも示されていない。
例えば、シクロデキストリン、ｎ−ブタノール、ジ−イソプロピルエーテル（ＤＩＰＥ）、セボフルランなどのフルオロエーテル、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００（商標）（ポリエチレングリコールｐ−（ｌ，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテルまたはポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル）またはＴＷＥＥＮ ２０（商標）（ＰＥＧ（２０）ソルビタンモノラウラート）などの界面活性剤、ジエチルエーテル、及びこれらの組み合わせの使用などのコレステロールを枯渇させる化学的手段がこれまで報告されてきた。いくつかの化学的手段は、過酷過ぎることが立証されており、結果的に、ビリオンからのウイルスタンパク質の喪失、または残留タンパク質への構造的な変化を生じた。当該タンパク質の存在及び固有立体配座は、コレステロール枯渇性ビリオンが、ワクチン、特にウイルスエンベロープタンパク質に対する中和抗体の産生を刺激するワクチンにおいて有用であるために、必要であろう。
いくつかの場合、コレステロールの枯渇は、可逆的であることが示されてきた。外来性コレステロールの添加は、ウイルスエンベロープを再構築して感染力を取り戻し得る。このことは、血液もしくは他の体液の中に存在するコレステロール及び他の脂質、またはコレステロール枯渇性ビリオンと接触している宿主細胞膜でさえ、ビリオンを潜在的に再構築して感染力を取り戻し得るので、ワクチンにおけるコレステロール枯渇性ウイルスの使用に関する安全上の懸念があり得る。
弱毒ウイルスを含有するワクチンは通常、防御免疫を生じるうえで最も有効であるとみなされている。しかしながら、弱毒ウイルスが変異または組換えし得、したがって毒性の強い状態へ戻り得るという安全上の懸念がある。不活性化型（すなわち、殺滅した）ウイルスは通常、ワクチンにおける使用により安全であるとみなされているが、不活性化の手段はしばしば、抗原性エピトープを変化させるかまたは破壊し、それにより、防御免疫の刺激因子としての有効性は低下または喪失する。
有効なワクチンがないことにより、エンベロープウイルスは、ヒト及び非ヒト動物に対する健康上の危険性を有し続け、エンベロープウイルスに起因する疾患は、膨大な経済上の影響を有する。安全かつ有効である改良されたワクチンが必要とされている。例えば、ウイルス抗原の免疫原性を保存し、ビリオンを未処置で維持し、安全性の危険がほとんどまたはまったくないエンベロープウイルスを不活性化する改良された方法は、エンベロープウイルスに起因する疾患を緩和する上で有益であろう。本出願は、ＭＢＣＤによるウイルスエンベロープの脱脂処理を含む、このようなウイルス不活性化の改良された方法を開示する。
したがって、本発明は、不活性化型エンベロープウイルスを調製する方法であって、エンベロープウイルスを含む溶液を第１のＭＢＣＤ溶液と混合して第１の混合物を得ることと、第１の混合物を第１の時間インキュベートすることと、第１の混合物に由来するエンベロープウイルスを第２のＭＢＣＤ溶液と混合して、第２の混合物を得ることと、当該第２の混合物を第２の時間インキュベートすることと、を含む、方法を提供する。第１の混合物中のＭＢＣＤの濃度は、少なくとも５ｍＭ〜約１００ｍＭである。さらに、第１の混合物中のＭＢＣＤの濃度は、約２０ｍＭ〜約４０ｍＭである。さらにまた、第１の混合物中のＭＢＣＤの濃度は、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、または約４０ｍＭである。
本発明は、不活性化型エンベロープウイルスを調製する方法であって、エンベロープウイルスを含む溶液を第１のＭＢＣＤ溶液と混合して、第１の混合物を得ることと、第１の混合物を第１の時間インキュベートすることと、第１の混合物由来のエンベロープウイルスを第２のＭＢＣＤ溶液と混合して、第２の混合物を得ることと、当該第２の混合物を第２の時間インキュベートすることと、を含む、方法であって、第２の混合物中のＭＢＣＤの濃度が少なくとも１０ｍＭ〜約１００ｍＭである、方法を提供する。さらに、第２の混合物中のＭＢＣＤの濃度は、約３０ｍＭ〜約５０ｍＭである。さらにまた、第１の混合物中のＭＢＣＤの濃度は、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、または約５０ｍＭである。
本発明は、不活性化型エンベロープウイルスを調製する方法であって、エンベロープウイルスを含む溶液を第１のＭＢＣＤ溶液と混合して、第１の混合物を得ることと、第１の混合物を第１の時間インキュベートすることと、第１の混合物に由来するエンベロープウイルスを第２のＭＢＣＤ溶液と混合して、第２の混合物を得ることと、当該第２の混合物を第２の時間インキュベートすることと、を含む、方法であって、第１の時間が約１５分〜約２４時間である、方法を提供する。さらに、第１の時間は、約４時間〜約２４時間である。さらにまた、第１の時間は、約４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間、または２４時間である。
本発明は、不活性化型エンベロープウイルスを調製する方法であって、エンベロープウイルスを含む溶液を第１のＭＢＣＤ溶液と混合して、第１の混合物を得ることと、第１の混合物を第１の時間インキュベートすることと、第１の混合物に由来するエンベロープウイルスを第２のＭＢＣＤ溶液と混合して、第２の混合物を得ることと、当該第２の混合物を第２の時間インキュベートすることと、を含む、方法であって、第２の時間が約４時間〜約４８時間である、方法を提供する。さらに、第２の時間は、約２４時間〜約４８時間である。さらにまた、第２の時間は、約２４時間、３０時間、３６時間、４０時間、４４時間、または４８時間である。
本発明は、不活性化型エンベロープウイルスを調製する方法であって、エンベロープウイルスを含む溶液を第１のＭＢＣＤ溶液と混合して、第１の混合物を得ることと、第１の混合物を第１の時間インキュベートすることと、第１の混合物に由来するエンベロープウイルスを第２のＭＢＣＤ溶液と混合して、第２の混合物を得ることと、当該第２の混合物を第２の時間インキュベートすることと、を含む、方法であって、第１の時間における第１の混合物の温度が、室温、または約２０℃〜約２５℃である、方法を提供する。さらに、第１の時間の第１の混合物の温度は、約２２℃〜約２４℃である。
本発明は、不活性化型エンベロープウイルスを調製する方法であって、エンベロープウイルスを含む溶液を第１のＭＢＣＤ溶液と混合して、第１の混合物を得ることと、第１の混合物を第１の時間インキュベートすることと、第１の混合物に由来するエンベロープウイルスを第２のＭＢＣＤ溶液と混合して、第２の混合物を得ることと、当該第２の混合物を第２の時間インキュベートすることと、を含む、方法であって、第２の時間の第２の混合物の温度が、室温、または約２０℃〜約２５℃である、方法を提供する。さらに、第２の時間の第２の混合物の温度は、約２２℃〜約２４℃である。
本発明は、不活性化型エンベロープウイルスを調製する方法であって、エンベロープウイルスを含む溶液を第１のＭＢＣＤ溶液と混合して、第１の混合物を得ることと、第１の混合物を第１の時間インキュベートすることと、第１の混合物に由来するエンベロープウイルスを第２のＭＢＣＤ溶液と混合して、第２の混合物を得ることと、当該第２の混合物を第２の時間インキュベートすることと、を含む、方法であって、エンベロープウイルスが、第２の混合物を得るステップの前に、第１の混合物から単離される、方法を提供する。代替的に、かつ制限することなく、第２のＭＢＣＤ溶液は、第１の混合物と直接混合され得る。直接混合は、第１の混合と同じ不活性化容器の中で実施され得、または第１の混合物は、第２のＭＢＣＤ溶液と混合する前に、新たな不活性化容器へと移動され得る。
本発明は、不活性化型エンベロープウイルスを調製する方法であって、エンベロープウイルスを含む溶液を第１のＭＢＣＤ溶液と混合して、第１の混合物を得ることと、第１の混合物を第１の時間インキュベートすることと、第１の混合物に由来するエンベロープウイルスを第２のＭＢＣＤ溶液と混合して、第２の混合物を得ることと、当該第２の混合物を第２の時間インキュベートすることと、を含む、方法であって、第１の時間が、第１の混合物の混合をさらに含む、方法を提供する。撹拌は、約３０ｒｐｍ〜約１００ｒｐｍであり得る。好ましくは、撹拌は、約４０ｒｐｍ〜約６０ｒｐｍであり得る。最も好ましくは、撹拌は、約５０ｒｐｍであり得る。
本発明は、不活性化型エンベロープウイルスを調製する方法であって、エンベロープウイルスを含む溶液を第１のＭＢＣＤ溶液と混合して、第１の混合物を得ることと、第１の混合物を第１の時間インキュベートすることと、第１の混合物に由来するエンベロープウイルスを第２のＭＢＣＤ溶液と混合して、第２の混合物を得ることと、当該第２の混合物を第２の時間インキュベートすることと、を含む、方法であって、第２の時間が、第２の混合物の混合をさらに含む、方法を提供する。撹拌は、約３０ｒｐｍ〜約１００ｒｐｍであり得る。好ましくは、撹拌は、約５０ｒｐｍであり得る。
本発明は、不活性化型エンベロープウイルスを調製する方法であって、エンベロープウイルスを含む溶液を第１のＭＢＣＤ溶液と混合して、第１の混合物を得ることと、第１の混合物を第１の時間インキュベートすることと、第１の混合物に由来するエンベロープウイルスを第２のＭＢＣＤ溶液と混合して、第２の混合物を得ることと、当該第２の混合物を第２の時間インキュベートすることと、を含む、方法であって、エンベロープウイルスが、ブタ生殖器呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）ウイルスである、方法を提供する。エンベロープウイルスは、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）でもあり得る。
本発明は、脱脂処理されたエンベロープウイルスであって、エンベロープウイルスを含む溶液を第１のＭＢＣＤ溶液と混合して、第１の混合物を得ることと、第１の混合物を第１の時間インキュベートすることと、第１の混合物に由来するエンベロープウイルスを第２のＭＢＣＤ溶液と混合して、第２の混合物を得ることと、当該第２の混合物を第２の時間インキュベートすることと、から構成された方法、によって得られる、脱脂処理されたエンベロープウイルスを提供する。好ましくは、第１の混合物中のＭＢＣＤの濃度は、少なくとも５ｍＭ〜約１００ｍＭ、または約２０ｍＭ〜約４０ｍＭである。好ましくは、第２の混合物中のＭＢＣＤの濃度は、少なくとも１０ｍＭ〜約１００ｍＭ、または約３０ｍＭ〜約５０ｍＭ、または約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、または約５０ｍＭである。好ましくは、第１の時間は、約１５分〜約２４時間、または約４時間〜約２４時間、または約４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間、もしくは２４時間である。好ましくは、第２の時間は、約４時間〜約４８時間、または約２４時間〜約４８時間、または約２４時間、３０時間、３６時間、４０時間、４４時間、もしくは４８時間である。好ましくは、第１の時間の第１の混合物の温度は、室温、または約２０℃〜約２５℃、またはさらには約２２℃〜約２４℃である。好ましくは、第２の時間の第２の混合物の温度は、室温、または約２０℃〜約２５℃、またはさらには約２２℃〜約２４℃である。好ましくは、エンベロープウイルスは、第２の混合物を得るステップの前に、第１の混合物から単離される。代替的に、かつ制限することなく、第２のＭＢＣＤ溶液は、第１の混合物と直接混合され得る。直接混合は、第１の混合と同じ不活性化容器の中で実施され得、または第１の混合物は、第２のＭＢＣＤ溶液と混合する前に、新たな不活性化容器へ移動され得る。好ましくは、第１の時間は、第１の混合物の混合をさらに含み、撹拌は、約３０ｒｐｍ〜約１００ｒｐｍ、約４０ｒｐｍ〜約６０ｒｐｍ、または約５０ｒｐｍであり得る。好ましくは、第２の時間は、第２の混合物の混合をさらに含み、撹拌は、約３０ｒｐｍ〜約１００ｒｐｍ、約４０ｒｐｍ〜約６０ｒｐｍ、または約５０ｒｐｍであり得る。好ましくは、エンベロープウイルスは、ブタ生殖器呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）ウイルスまたはブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）である。
本発明は、脱脂処理されたエンベロープウイルスを含むワクチンであって、エンベロープウイルスを含む溶液を第１のＭＢＣＤ溶液と混合して、第１の混合物を得ることと、第１の混合物を第１の時間インキュベートすることと、第１の混合物に由来するエンベロープウイルスを第２のＭＢＣＤ溶液と混合して、第２の混合物を得ることと、当該第２の混合物を第２の時間インキュベートすることと、から構成された方法、によって得られる脱脂処理されたエンベロープウイルスを含むワクチンを提供する。好ましくは、第１の混合物中のＭＢＣＤの濃度は、少なくとも５ｍＭ〜約１００ｍＭ、または約２０ｍＭ〜約４０ｍＭである。好ましくは、第２の混合物中のＭＢＣＤの濃度は、少なくとも１０ｍＭ〜約１００ｍＭ、または約３０ｍＭ〜約５０ｍＭ、または約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、もしくは約５０ｍＭである。好ましくは、第１の時間は、約１５分〜約２４時間、または約４時間〜約２４時間、または約４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間、もしくは２４時間である。好ましくは、第２の時間は、約４時間〜約４８時間、または約２４時間〜約４８時間、または約２４時間、３０時間、３６時間、４０時間、４４時間、もしくは４８時間である。好ましくは、第１の時間の第１の混合物の温度は、室温、または約２０℃〜約２５℃、またはさらには約２２℃〜約２４℃である。好ましくは、第２の時間の第２の混合物の温度は、室温、または約２０℃〜約２５℃、またはさらには約２２℃〜約２４℃である。好ましくは、エンベロープウイルスは、第２の混合物を得るステップの前に、第１の混合物から単離される。代替的に、かつ制限することなく、第２のＭＢＣＤ溶液は、第１の混合物と直接混合され得る。直接混合は、第１の混合と同じ不活性化容器の中で実施され得、または第１の混合物は、第２のＭＢＣＤ溶液と混合する前に、新たな不活性化容器へ移動され得る。好ましくは、第１の時間は、第１の混合物の混合をさらに含み、撹拌は、約３０ｒｐｍ〜約１００ｒｐｍ、約４０ｒｐｍ〜約６０ｒｐｍ、または約５０ｒｐｍであり得る。好ましくは、第２の時間は、第２の混合物の混合をさらに含み、撹拌は、約３０ｒｐｍ〜約１００ｒｐｍ、または約５０ｒｐｍであり得る。好ましくは、エンベロープウイルスは、ブタ生殖器呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）ウイルスまたはブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）である。
本発明は、脱脂処理されたエンベロープウイルスを含むワクチンであって、エンベロープウイルスを含む溶液を第１のＭＢＣＤ溶液と混合して、第１の混合物を得ることと、第１の混合物を第１の時間インキュベートすることと、第１の混合物に由来するエンベロープウイルスを第２のＭＢＣＤ溶液と混合して、第２の混合物を得ることと、当該第２の混合物を第２の時間インキュベートすることと、から構成された方法、によって得られる脱脂処理されたエンベロープウイルスを含むワクチンであって、アジュバント、安定剤、保存剤、及びブレンド希釈剤のうちの少なくとも１つをさらに含む、ワクチンを提供する。好ましくは、アジュバントは、アクリラートまたはポリアクリラートである、水性ポリマーアジュバントである。好ましくは、安定剤は、糖、炭水化物、タンパク質、及びゼラチンのうちの少なくとも１つを含む。好ましくは、保存剤は、微生物の生育、代謝活性、または増殖を遅滞させ、抑止し、または予防する、抗生物質化合物または生物静力学的化合物である。好ましくは、ブレンド希釈剤は、水、リン酸緩衝塩類溶液、細胞培地、または生理学的な塩分とｐＨとを含む他の溶液である。
本発明は、脱脂処理されたエンベロープウイルスの使用であって、エンベロープウイルスを含む溶液を第１のＭＢＣＤ溶液と混合して、第１の混合物を得ることと、第１の混合物を第１の時間インキュベートすることと、第１の混合物に由来するエンベロープウイルスを第２のＭＢＣＤ溶液と混合して、第２の混合物を得ることと、当該第２の混合物を第２の時間インキュベートすることと、から構成された方法、によって得られる脱脂処理されたエンベロープウイルスの使用を提供する。
本発明は、エンベロープウイルスによって発症する疾患または症状の治療のための薬剤の製造における、脱脂処理されたエンベロープウイルスの使用を提供し、脱脂処理されたエンベロープウイルスは、エンベロープウイルスを含む溶液を第１のＭＢＣＤ溶液と混合して、第１の混合物を得ることと、第１の混合物を第１の時間インキュベートすることと、第１の混合物に由来するエンベロープウイルスを第２のＭＢＣＤ溶液と混合して、第２の混合物を得ることと、当該第２の混合物を第２の時間インキュベートすることと、から構成された方法、によって得られる。
本明細書で使用する場合、「エンベロープウイルス」とは、核タンパク質中心を取り囲んでいる脂質二重層の膜またはエンベロープを有する何らかのウイルスである。ウイルスエンベロープは典型的には、宿主細胞膜に由来し、リン脂質、糖脂質、スフィンゴ脂質、及びコレステロールなどのステロールを含有する。エンベロープウイルスは、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかによってコードされるゲノムを有するウイルスを含む。エンベロープウイルスの種は、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、イリドウイルス、ヘパドナウイルス、レトロウイルス、オルトミクソウイルス、アレナウイルス、ブンヤウイルス、パラミクソウイルス、モノネガウイルス、ラブドウイルス、フィロウイルス、コロナウイルス、アルテリウイルス、フラビウイルス、及びトガウイルスを含むが、これらに限定されない。新たなエンベロープウイルスは発見されつつあり、エンベロープウイルスは、各ウイルスがより良好に特徴づけられるように分類及び再分類されつつある。エンベロープウイルスのより完全な説明は、今や第６版であるＦｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ ａｎｄ Ｐ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ編，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，ＵＳＡ），２０１３）などの本文において認められ得る。
本明細書で使用する場合の「ウイルス」という用語は、ウイルスの種、又は相互交換可能に、核酸、タンパク質、及びエンベロープを含有する個々の１つもしくは複数の感染単位のいずれかを意味し得る。「ウイルス粒子」とは、個々の感染単位であり、この用語は、「ビリオン」という用語と同義である。
「脱脂処理」とは、ウイルスエンベロープから脂質を除去または枯渇させるプロセスである。脱脂処理は、ＭＢＣＤによってウイルス粒子から除去されたコレステロールの量によって測定される。しかしながら、ＭＢＣＤは、リン脂質などの他の脂質も抽出、除去、または枯渇させ得る。ＭＢＣＤは、いくつかのタンパク質と相互作用することも示されてきたが、本明細書に説明されるプロセスは、ＭＢＣＤ仲介性脱脂処理の結果として、ウイルスタンパク質からのタンパク質の喪失を最小限にする。
「感染力」とは、ウイルスの複製を支持することができるヒトまたは非ヒト動物に由来する何らかの細胞である宿主細胞内で感染を確立するウイルスの能力である。感染力は、例えば、一定数のウイルス粒子に感染した宿主細胞の数もしくは百分率によって、または宿主細胞に感染するのに必要なウイルス粒子の数もしくは百分率によって測定されることができる。ウイルス粒子は、ウイルス粒子の体積内のプラーク形成単位（ＰＦＵ）の数の測定などによって有効に数え上げることができる。ウイルス粒子は、例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって検出される特定のウイルスタンパク質の存在によって、または、例えば、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって検出される、溶液中に存在するウイルスゲノムのコピー数の測定によってなど、物理的に測定することもできる。
「抗原」とは、生体の免疫系によって特異的に検出されることができる何らかの分子である。典型的には、ウイルス抗原とは、ウイルスゲノムによってコードされたウイルスタンパク質である。ウイルス抗原の存在は、Ｔリンパ球及びＢリンパ球の両方によって特異的に検出することができる。「免疫原性」は、免疫応答を惹起する抗原の能力を指す。ワクチンについては、ウイルス抗原の免疫原性は、ウイルス感染を低下させ、軽減させ、または緩和するであろう動物における防御免疫を優先的に結果的に生じるであろう。
抗原とは対照的に、「アジュバント」とは、免疫応答の非特異的刺激因子である。アジュバントは、パターン認識受容体（ＰＲＲ）を結合及び活性化することによって生得的免疫応答を刺激し得る。ＰＲＲのこのような刺激因子は、例えば、ウイルスもしくは細菌の核酸、細菌もしくは寄生虫に由来する脂質、または細菌のタンパク質もしくは毒素、あるいはこのような分子の何らかの人工的に構築された模倣体であり得る。アジュバントは、ミョウバン、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、水酸化リン酸カルシウムまたは硫酸アンモニウムなど、Ｂリンパ球による認識または食細胞による取り込みを容易にするために抗原を凝集させる無機化合物と、油と、洗剤とをも含むが、これらに限定されない。アジュバントは、サイトカイン、リンホカイン、ケモカイン、インターフェロン、アナフィラトキシン、成長因子、分化因子、及び接着分子などだがこれらに限定されない免疫シグナル伝達の宿主仲介因子でもあり得る。
本明細書で使用する場合、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療すること（ｔｏ ｔｒｅａｔ）」、または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、既存の症状、障害、容態、または疾患の進行または重症度を抑制し、遅延させ、停止させ、低下させ、緩和させ、または逆転させることを含む。治療は、予防上または治療上適用され得る。
本明細書で使用する場合、「動物へ投与すること」は、皮膚投与、皮下投与、筋肉内投与、粘膜投与、粘膜下投与、経皮投与、経口投与または鼻内投与を含む。投与は、注射または局所投与を含み得る。
以下の実験例は、脱脂処理プロセスを説明する。他の実施形態及び使用が当業者に明白であり、かつ本発明がこれらの具体的な実例となる実施例または好ましい実施形態に制限されないことが認識されるであろう。エンベロープウイルスは、例えば、エンベロープウイルスのタイプ及び種ならびにエンベロープウイルスが複製する宿主細胞によるがこれらに限定されずに、エンベロープウイルスのエンベロープ中に異なるレベルのコレステロールを含有する。当業者は、本明細書で説明する脱脂処理プロセスが、各特定のウイルスストックに対して最適化を必要とし得ることを認識するであろう。微生物膜は、コレステロール、ホパノイド、または他のステロール及びステロール様分子を含有し得、したがって、ウイルス以外の病原体も本明細書に開示する方法によって不活性化され得る。
実施例１
ヒトインフルエンザウイルスＨ１Ｎ１ Ａ／ＷＳＮ／３３株は、以下の手順を用いて脱脂処理される。以下の実施例において、インフルエンザウイルス（ＩＦＶ）の脱脂処理は感染力を減じる。本発明の脱脂処理方法は、ウイルスエンベロープのタンパク質を保存するので、脱脂処理されたＩＦＶを接種された動物は、発症量の毒性のあるウイルスの感染から当該動物を保護する免疫原性応答を展開すると予期される。
試薬：
ヒトインフルエンザウイルスＨ１Ｎ１ Ａ／ＷＳＮ／３３株及びその宿主細胞株ＭＤＣＫは、Ｗｕｘｉ ＡｐｐＴｅｃ（中国上海市）から入手可能である。他の試薬は、ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））、ＥＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））、ＵＬＴＲＡＭＤＣＫ（商標）無血清培地（Ｌｏｎｚａ，Ｉｎｃ．（Ａｌｌｅｎｄａｌｅ，ＮＪ））、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、メチル−β−シクロデキストリン（ＭＢＣＤ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＡＭＰＬＥＸ Ｒｅｄコレステロールアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＰＩＥＲＣＥ（商標）ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、及びＭＴＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む。
ＭＤＣＫ細胞株におけるＨ１Ｎ１ Ａ／ＷＳＮ／３３インフルエンザウイルスの増殖：
以下の手順によって、細胞をＩＦＶとともに播種する。培地をＴ−７５フラスコ中で生育させたＭＤＣＫ細胞から取り除き、ＭＤＣＫ細胞の単層を室温の５ｍＬのＰＢＳですすぎ、細胞を３７℃のトリプシン／ＥＤＴＡ１．５ｍＬではがす。細胞を、１０％ＦＢＳを含有する１０ｍＬのＭＥＭ中に再懸濁し、４℃、８００ｒｐｍで５分間の遠心分離によってペレット化する。細胞を、１０％ＦＢＳを含有するＭＥＭ中で再懸濁し、細胞密度を２．５×１０５個／ｍＬへ調整する。１５ｍＬのＭＤＣＫ細胞懸濁液を各Ｔ−７５フラスコへ播種し、フラスコを５％ＣＯ２で３７℃へ置き、一晩インキュベートする。
ＭＤＣＫ細胞が９０％超のコンフルエントになった時、ＭＥＭをＴ７５フラスコから取り出し、１％ＦＢＳ及び１μｇ／ｍＬトリプシンを含有する５ｍＬのＥＭＥＭ維持培地を添加し、この細胞にインフルエンザウイルスを０．０１の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させる。フラスコを５％ＣＯ２の３７℃で６０〜９０分間インキュベートし、１５分ごとに緩徐に振盪する。１％ＦＢＳ及び１μｇ／ｍＬトリプシンを含有する１０ｍＬのＥＭＥＭ維持培地を各フラスコへ添加し、フラスコを３７℃かつ５％ＣＯ２で４８時間インキュベートする。ウイルスのおよそ８０％の細胞変性作用（ＣＰＥ）に到達したとき（概して約４８時間後）、培養上清を収集して、ＩＦＶを得る。
Ｈ１Ｎ１ Ａ／ＷＳＮ／３３ＩＦＶの精製及び滴定：
ＩＦＶを以下の手順によって精製する。収集した培養上清を３，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、細胞片を除去し、上清を収集する。上清を３８，０００ｒｐｍで６０分間遠心分離して、ＩＦＶをペレット化する。このＩＦＶペレットを適切な容積の生理塩類溶液（ＰＢＳ）中に再懸濁して、１．０×１０９超のプラーク形成単位／ｍＬ（ＰＦＵ／ｍＬ）の最終力価を得る。この濃縮したＩＦＶストック溶液の１００μＬの一定分量を−８０℃で保存する。
以下の手順を用いて、ＩＦＶをインビトロでの感染力について滴定する。先の細胞培養物及び転移手順を用いて、ＭＤＣＫ細胞を、１０％ＦＢＳを含有するＭＥＭ中に２．５×１０５個／ｍＬの最終密度で懸濁する。２ｍＬのＭＤＣＫ細胞懸濁液を６穴プレートの各ウェルへ入れ、このプレートを３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートする。ウイルスストックを３７℃の水浴で解凍した後、４℃、５００×ｇで１０分間遠心分離する。希釈緩衝液としてＵＬＴＲＡＭＤＣＫ（商標）無血清培地及び２．５μｇ／ｍＬトリプシンを用いてストック溶液の１／１０連続希釈物を調製し、使用時まで４℃で保存する。
この細胞が少なくとも９０％コンフルエントであるとき、培地を取り出し、０．５ｍＬの希釈緩衝液及び０．５ｍＬのウイルス希釈物を各ウェルへ添加する。陰性対照用に、１．０ｍＬの希釈緩衝液を使用する。各希釈物を添加した直後に、プレートを緩徐に振盪する。プレートを５％ＣＯ２における３７℃で６０〜９０分間インキュベートし、１５分ごとに揺する。次に、各６穴プレートの各ウェルに、３７℃の２．５％低融点アガロースＰＢＳ溶液及び希釈緩衝液の１：４の混合物３ｍＬを重ねる。プレートを室温で１５分間インキュベートして、重層混合物を凝固させた後、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で３日間インキュベートする。
以下の手順を用いて、プラークを可視化する。プラークを完全に顕在化させた後（感染３日後）、１ｍＬの４％パラホルムアルデヒドを添加し、プレートを室温で１時間インキュベートする。可溶化したアガロースを廃棄し、０．１ｍＬの０．５％クリスタルバイオレットを各ウェルへ添加する。プラーク数をインキュベーションの１５分後に計数し、希釈因子を基にして力価へ変換する。
脱脂処理：
精製したＩＦＶの脱脂処理プロセスを、２つの並行反応において実施する。すなわち、ＩＦＶをＭＢＣＤと接触させることを含む溶媒処理及び偽処理であり、偽処理では、ＩＦＶを同じ様式で処理するが、ＭＢＣＤへの曝露がない。同じ力価のＩＦＶを偽処理及び溶媒処理の両方において使用する。偽処理におけるＩＦＶを滴定して、溶媒処理後に残存している脱脂処理したＩＦＶの量の間接的な尺度を提供することができる。
次の手順によって、溶媒処理及び偽処理を実施する。先に調製したＩＦＶストック（１．０×１０９ＰＦＵ／ｍＬ超）の一定分量（１００μＬ）をエッペンドルフチューブ中の９００μＬのＰＢＳへと希釈して、１．０〜５．０×１０８ＰＦＵ／ｍＬの最終力価を達成する。ＰＢＳ中のＭＢＣＤを溶媒処理用の５０ｍＭの終濃度になるよう添加し、または等容積のＰＢＳを偽処理物へ添加する。次に、エッペンドルフチューブをキャップし、パラフィルムで密封する。試料をすべて、３７℃へ予熱しておいたＳＨＺ−８２定温軌道空気浴振盪器（Ｃｈａｎｇｚｈｏｕ Ｇｕｏｈｕａ Ａｐｐｌｉａｎｃｅ Ｃｏ．（Ｃｈｉｎａ））の中に保持する。溶媒処理した及び偽処理した試料を、３７℃、２２０ｒｐｍの軌道回転速度で３０分間または４５分間のいずれかで回転させる。試料を微量遠心装置において１分間回転させ、ＩＦＶを含有する上清を超遠心チューブへ移す。チューブを２００，０００×ｇ（ＯＰＴＩＭＡ（商標）Ｌ−１００ＸＰ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ ＩＮ））で３０分間遠心分離してＩＦＶをペレット化し、上清を廃棄する。このＩＦＶペレットを先の各エッペンドルフチューブへ入れた１／１０の元の容積中で再懸濁し、さらなる分析まで−８０℃で保存する。
脱脂処理したＩＦＶの特徴づけ：
脱脂処理した及び偽処理したＩＦＶのタンパク質含有量は、製造元の説明書により、ＢＣＡアッセイ（ＰＩＥＲＣＥ（商標）ＢＣＡタンパク質アッセイキット）を用いて測定する。コレステロール含有量は、製造元の説明書により実施するコレステロールアッセイ（ＡＭＰＬＥＸ（登録商標）Ｒｅｄ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ））を用いて測定する。インビトロ感染力は、先に明らかにしたのと同じ滴定手順を用いて測定する。
赤血球凝集（ＨＡ）活性を、以下の通り測定する。新鮮に単離したニワトリ血をＰＢＳで３回洗浄し、赤血球（ＲＢＣ）をＰＢＳ中に１％の濃度で再懸濁する。ウイルス希釈物（５０μＬ）をＰＢＳ中に作製し、５０μＬのＲＢＣ懸濁液と混合する。この混合物を９６穴プレートにおける個々のウェルへ入れ、ＲＢＣを４５分間沈降させておく。ＲＢＣのドットまたはペレットが存在する場合、ウェルはＨＡ陰性であると判断され（すなわち、ＲＢＣ凝集反応なし）、ＲＢＣの滑らかな懸濁液が存在する場合、ウェルは陽性であると判断される。
脱脂処理した及び偽処理したＩＦＶ試料の２つのバッチを先に説明した手順により調製する。検査に使用するＩＦＶストックは、２．２×１０１０ＰＦＵ／ｍＬの力価を有している。第１のバッチ（「調製物Ａ」）において、脱脂処理時間は３０分であり、第２のバッチ（「調製物Ｂ」）において、脱脂処理時間は４５分である。超遠心分離後、脱脂処理した及び偽処理した試料を特徴づける。
インビトロでの感染力は、脱脂処理した試料のＰＦＵが対応する偽試料のＰＦＵの約１／７，０００であることを示す。感染力の結果を以下の表１に示す。力価の差異にもかかわらず、種々の試料のタンパク質含有量は互いの１０％内である。調製物Ａに由来する脱脂処理したＩＦＶのタンパク質含有量は、偽試料の９７％であり、調製物Ｂに由来する脱脂処理したＩＦＶのタンパク質含有量は、偽試料の９３％である（表１を参照されたい）。処理後に出発材料のおよそ２０％が、タンパク質含有量によって測定されるように、回収されていることも観察される。タンパク質含有量を基にした回収百分率は、出発材料（２．２×１０９ＰＦＵ／ｍＬ）及び偽処理試料（４．０×１０８ＰＦＵ／ｍＬ、出発力価の１８％である）の測定された力価と比較できる。脱脂処理後、２％未満のコレステロールが、偽処理と比較して残留している（表１を参照されたい）。
偽処理は、物理的な処理（振盪及び遠心分離）が力価及びタンパク質の喪失を結果的に生じることを示す。ＭＢＣＤによる脱脂処理は、コレステロールを優先的に除去するが、ＩＦＶからのタンパク質はそうではない。さらに、ＭＢＣＤで処理されたＩＦＶは、インビトロでの感染力がほとんどないが、感染力が完全になくなることはなかった。
ジイソプロピルエーテル及びＭＢＣＤを用いたＩＦＶ脱脂処理の比較：
ＭＢＣＤに加えて、別の脂質溶媒であるジイソプロピルエーテル（ＤＩＰＥ）を使用して、ＩＦＶを脱脂処理する。同じ出発材料のＩＦＶ試料を、異なる濃度のＤＩＰＥでまたは５０ｍＭのＭＢＣＤで処理する。等量の一定分量のＩＦＶを２％、４％、８％、もしくは１２％のＤＩＰＥまたは５０ｍＭのＭＢＣＤで、３７℃で３０分間処理する。２，０００×ｇで３分間の簡潔な遠心分離の後、可視的な溶媒を取り出し、水性材料をドラフトチャンバーの中で２０分間乾燥させておく。次に、試料を２００，０００×ｇで３０分間遠心分離して、ウイルス粒子を回収する。インビトロ感染力、ＨＡ活性、タンパク質含有量、及びＩＦＶのコレステロール含有量を表２に示す。
１２％までの濃度でのＤＩＰＥ処理は、コレステロールを除去する上で同じ条件下で５０ｍＭのＭＢＣＤほど有効ではない。１２％のＤＩＰＥがＩＦＶから約８０％のコレステロールを除去するのに対し、５０ｍＭのＭＢＣＤは９８％超を除去する。これら２つの処理のＩＦＶ感染力は、ＰＦＵ／ｍＬを比較することによって判定されるように、偽処理と比較してそれぞれ３２倍及び２２５０倍低下する。両溶媒によるコレステロールの除去は、比較的特異的であり、その理由は、タンパク質含有量が種々の処理において２０％未満しか低下しないからである。赤血球凝集（ＨＡ）活性を定量化する能力内で、５０ｍＭのＭＢＣＤは、２％〜８％のＤＩＰＥと同じ程度、ＨＡ活性に影響する。
溶媒による４５分間の処理：
先の処理を反復するが、例外は、ＭＢＣＤ処理時間が３０分から４５分間に延びたことである。結果を以下の表３に示す。
３０分の処理と同様に、偽処理と比較して、５０ｍＭのＭＢＣＤを用いた４５分の処理は、ＩＦＶについて約９７％のコレステロールを除去し、当該ウイルスを１０，０００倍超未満のインビトロでの感染にする。対照的に、１０％のＤＩＰＥ（３０分間処理）は、コレステロールを除去する上であまり有効ではなく（約８０％）、インビトロでの感染力を結果的に約１２０倍低下させる。ＨＡ活性は、ＭＢＣＤによって測定上影響されないのに対し、１０％のＤＩＰＥによって測定可能に減少した。タンパク質含有量は、５０ｍＭのＭＢＣＤによる６％の減少と比較して、１０％のＤＩＰＥ処理後、５０％まで減少する。
本明細書に呈示される２セットの実験は、５０ｍＭのＭＢＣＤがコレステロールを選択的に除去し、タンパク質のほとんどを維持しながら脱脂処理されたＩＦＶにほとんど感染させないことを実証する。しかしながら、これらの処理はいずれも、感染力を完全に消滅することができず、したがって、ウイルスを完全に不活性化することができなかったので、当該手順のさらなる最適化が、インフルエンザウイルスを完全に不活性化するために必要とされる。さらなる最適化は、ＭＢＣＤ処理時間を延長すること、及びウイルスをＭＢＣＤで第２の時間処理することを含み得るが、これらに限定されない。
実施例２
ＭＢＣＤによるＰＲＲＳＶの処理は、コレステロールを選択的に除去し、ウイルス感染力を低下させ、ウイルスのタンパク質含有量のほとんどを維持する。
試薬：
本実施例で使用するＰＲＲＳＶウイルス株は、ＲＥＳＰ（江蘇省農業科学院，中国）である。使用する宿主細胞は、Ｍａｒｃ−１４５（Ｗｕｘｉ ＡｐｐＴｅｃ，中国上海市）である。使用する他の試薬は、先の実施例１と同じであるが、ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は例外で、Ｍａｒｃ−１４５細胞を培養するときに使用する。
Ｍａｒｃ−１４５細胞におけるＰＲＲＳＶの増殖：
以下の手順により、細胞をＰＲＲＳＶとともに播種する。培地を、Ｔ−７５フラスコ中で生育したＭａｒｃ−１４５細胞から取り出し、Ｍａｒｃ−１４５細胞の単層を室温の５ｍＬのＰＢＳですすぎ、細胞を３７℃の１．５ｍＬのトリプシン／ＥＤＴＡではがす。細胞を、１０％ＦＢＳを含有する１０ｍＬのＤＭＥＭ培地中に再懸濁し、４℃、８００ｒｐｍで５分間の遠心分離によってペレット化する。細胞を、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で再懸濁し、細胞密度を２．５×１０５個／ｍＬに調整する。１５ｍＬのＭａｒｃ−１４５細胞懸濁液を各Ｔ７５フラスコ中へ播種し、フラスコを３７℃、５％ＣＯ２に置き、一晩インキュベートする。
Ｍａｒｃ−１４５細胞が９０％超のコンフルエントであるとき、ＤＭＥＭをＴ−７５フラスコから取り出し、２％ＦＢＳを含有する５ｍＬのＥＭＥＭ維持培地を添加し、細胞を０．１のＭＯＩでＰＲＲＳＶに感染させる。フラスコを３７℃、５％ＣＯ２で６０〜９０分間インキュベートし、１５分ごとに緩徐に振盪する。２％ＦＢＳを含有する１０ｍＬのＥＭＥＭ維持培地を各フラスコに添加し、このフラスコを３７℃かつ５％ＣＯ２で９６時間インキュベートする。ＣＰＥの８０％に到達したとき（概して９６時間）、培養上清を収集して、ＰＲＲＳＶを得る。
ＰＲＲＳＶの精製：
ＰＲＲＳＶを、以下の手順により精製する。収集した培養上清を３，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して細胞片を除去し、上清を収集する。この上清を１００，０００×ｇで６０分間遠心分離して、ＰＲＲＳＶをペレット化する。ＰＲＲＳＶペレットを適切な容積の生理塩類溶液（ＰＢＳ）中に再懸濁し、約１×１０９ＰＦＵ／ｍＬの力価にする。１００μＬの濃ＰＲＲＳＶの一定分量を−８０℃で保存する。
以下の手順を用いて、ＰＲＲＳＶをインビトロでの感染力について滴定する。先の細胞培養物及び転移手順を用いて、１．５×１０５個／ｍＬの最終密度の１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中に、Ｍａｒｃ−１４５細胞を懸濁する。２ｍＬのＭａｒｃ−１４５細胞懸濁液を６穴プレートの各ウェルへ入れ、このプレートを３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートする。ウイルス試料を３７℃の水浴中で解凍した後、４℃、５００×ｇで１０分間遠心分離する。ＥＭＥＭを希釈緩衝液として使用して１／１０連続希釈のウイルスを調製し、使用時まで４℃で保存する。
Ｍａｒｃ−１４５細胞が少なくとも９０％コンフルエントであるとき、培地を取り出し、０．５ｍＬの希釈緩衝液及び０．５ｍＬのウイルス希釈物を各ウェルへ添加する。陰性対照用に、１．０ｍＬ希釈緩衝液を使用する。このプレートを、各希釈物を添加した直後に緩徐に振盪する。プレートを５％ＣＯ２の中で３７℃で６０〜９０分間インキュベートし、１５分ごとに揺らす。次に、各６穴プレートの各ウェルに、３７℃の２．５％低融点アガロースＰＢＳ溶液及び希釈緩衝液の３ｍＬの１：４混合物を重ねる。このプレートを室温で１５分間インキュベートして、重層混合物を凝固させておいた後、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で９６時間インキュベートする。
以下の手順を用いて、プラークを可視化する。プラークを完全に顕在化させた後（感染９６時間後）、１ｍＬの４％パラホルムアルデヒドを添加し、このプレートを室温で１時間インキュベートする。可溶化したアガロースを廃棄し、０．５ｍＬの０．５％クリスタルバイオレットを各ウェルへ添加する。クリスタルバイオレットによる１５分間のインキュベーション後、プラーク数を計数し、希釈因子に基づいて力価へ変換する。
ＰＲＲＳＶのインビトロでの増殖：
１×１０７ＰＦＵ／ｍＬを超えるＰＲＲＳＶの力価は、タンパク質及びコレステロールのアッセイに好ましい。Ｍａｒｃ−１４５細胞におけるＰＲＲＳＶ−ＲＥＳＰ株の増殖は、１×１０８ＰＦＵ／ｍＬを超える力価を有する濃ウイルス試料を生じる。
ＰＲＲＳＶの脱脂処理：
溶媒処理及び偽処理を、以下の手順により実施する。約１×１０９ＰＦＵ／ｍＬにおける濃ＰＲＲＳＶの１００μＬの一定分量を、エッペンドルフチューブ中の９００μＬのＰＢＳ中に希釈して、１．０〜５．０×１０８ＰＦＵ／ｍＬの最終力価を得る。ＰＢＳ中のＭＢＣＤを溶媒処理用に所望の濃度まで添加し、または等容積のＰＢＳを偽処理用に添加する。次に、エッペンドルフチューブをキャップし、パラフィルムで密封する。試料をすべて、３７℃へ予熱しておいたＳＨＺ−８２定温軌道空気浴振盪器（Ｃｈａｎｇｚｈｏｕ Ｇｕｏｈｕａ Ａｐｐｌｉａｎｃｅ Ｃｏ．（Ｃｈｉｎａ））の中に保持する。溶媒処理した及び偽処理した試料を、３７℃、２２０ｒｐｍの軌道回転速度で所望の時間回転させる。個々の試料を微量遠心装置において１分間回転させ、ＩＦＶを含有する上清を超遠心チューブへ移す。チューブを１００，０００×ｇ（ＯＰＴＩＭＡ（商標）Ｌ−１００ＸＰ遠心分離機、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ ＩＮ））で３０分間遠心分離してＰＲＲＳＶをペレット化し、上清を廃棄する。このＰＲＲＳＶペレットを２００μＬのＰＢＳ中で再懸濁し、さらなる分析まで−８０℃で保存する。
脱脂処理したＰＲＲＳＶの特徴づけ：
脱脂処理した及び偽処理したＰＲＲＳＶのタンパク質含有量は、製造元の説明書によりＢＣＡアッセイ（ＰＩＥＲＣＥ（商標）ＢＣＡタンパク質アッセイキット）を用いて測定する。また、コレステロール含有量は、製造元の説明書により実施するコレステロールアッセイ（Ａｍｐｌｅｘ（登録商標）Ｒｅｄ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ））を用いて測定する。インビトロ感染力は、先に明らかにしたのと同じ手順を用いて測定する。
ＭＢＣＤの濃度依存性：
第１の脱脂処理実験において、ＰＲＲＳＶを５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、及び５０ｍＭのＭＢＣＤで３７℃で６０分間脱脂処理する。超遠心分離後、偽処理した及び脱脂処理した試料をＭａｒｃ−１４５細胞においてインビトロ感染力を検査し、タンパク質及びコレステロールの含有量を、先に明らかにした手順を用いて測定する。脱脂処理したＰＲＲＳＶの感染力、タンパク質含有量、及びコレステロール含有量を表４に示す。
出発ＰＲＲＳＶ−ＲＥＳＰストックの力価は、１．０×１０８ＰＦＵ／ｍＬであり、このうち、０．１ｍＬを、適量のＭＢＣＤとともに、０．９ｍＬのＰＢＳと混合する。３７℃、２２０ＲＰＭで６０分間の軌道振盪後、ウイルス試料を超遠心分離によりペレット化し、０．２ｍＬの最終容積のＰＢＳ中に懸濁する。偽処理した試料の力価は、１．６×１０７ＰＦＵ／ｍＬ（表４）であり、ウイルス活性の３０％超が偽処理後に回復することを示唆する。ＭＢＣＤ処理は、主として濃度依存的な様式で感染力及びコレステロール含有量を低下させるのに対し、総タンパク質含有量の８８％〜９８％は、すべてのＭＢＣＤ濃度において回復する（表４を参照されたい）。５０ｍＭのＭＢＣＤを用いた処理後、脱脂処理したＰＲＲＳＶは、偽試料と比較してコレステロールの出発量の約２８％を保持しているのに対し、ＰＲＲＳＶ感染力は、約３８０倍低下するが、これもまた、完全に消滅するわけではない。
脱脂処理したＰＲＲＳＶ試料の継代盲検アッセイ：
脱脂処理したＰＲＲＳＶ試料のうちの１つの力価（９０分間で１００ｍＭのＭＢＣＤ）は、検出限界未満である。このことで、試料中に何らかの感染性ウイルス粒子があるかどうかという問いが持ち上がる。このような感染性ウイルス粒子が存在するかどうかという問いに対処するために、新たな試料を１００ｍＭのＭＢＣＤで９０分間脱脂処理し、以下に説明する継代盲検アッセイに供する。対照のＰＲＲＳＶ−ＲＥＳＰ試料が１．６×１０６ＰＦＵ／ｍＬの力価を有している一方で、１００ｍＭのＭＢＣＤを９０分間脱脂処理したＰＲＲＳＶ試料からは、継代盲検アッセイによってプラークは、何ら検出されない。１００ｍＭのＭＢＣＤで９０分間の脱脂処理は、ＰＲＲＳＶ−ＲＥＳＰを完全に不活性化しそうである。
継代盲検アッセイを、以下の手順によって実施する。１００μＬの脱脂処理したＰＲＲＳＶ試料を、先の手順によって調製した、Ｍａｒｃ−１４５細胞を含有する６穴プレートの各ウェルへ移す。このプレートを５％ＣＯ２において３７℃で４日間インキュベートする。３回の連続した凍結解凍周期を実施して、細胞を溶解し、ＰＲＲＳＶを含有する上清を収集し、４℃、８００ｒｐｍで５分間遠心分離する。４００μＬの上清をＭａｒｃ−１４５細胞のフラスコへ移す。このフラスコを３７℃かつ５％ＣＯ２で４日間インキュベートする。凍結解凍周期を反復し、上清を再度収集し、遠心分離して、以前のようにＭａｒｃ−１４５細胞のフラスコへ移す。凍結解凍周期をもう１回反復し、上清を再度収集し、遠心分離して、ＰＲＲＳＶを含有する上清を、さらなる使用まで−８０℃で凍結する。最終的な収集した試料のＰＲＲＳＶ力価を、先の通り、Ｍａｒｃ−１４５細胞を用いて測定する。
実施例３
本研究の目的は、メチルβシクロデキストリン（ＭＢＣＤ）を利用する脱脂処理方法を通じて、ＰＲＲＳＶ株ＮＤ９９−１４の不活性化のための時間依存性を判定することとした。ＭＢＣＤをＣＴＤ，Ｉｎｃ．（Ａｌａｃｈｕａ，ＦＬ）から粉末状で購入した。３００ｍＭのストック溶液を、１０００ｍＬの水を２８０ｇのＭＢＣＤへ添加して、ストック溶液を作製することによって、ストック溶液を調製した。
ウイルスの脱脂処理：
不活性化動態実験を、同時係属中の２０１６年２月１８日出願の米国出願第６２／２９６，６５８号において説明されたＰＲＲＳＶ株ＮＤ９９−１４を用いて実施した。概して、この方法は、４０ｍＭの終濃度でのＭＢＣＤの添加、及び定常混合しながらの室温での合計７２時間のインキュベーション時間を包含する。ＭＢＣＤの添加は、２段階で生じ、不活性化プロセスを開始する２０ｍＭ、さらなる２０ｍＭのＭＢＣＤを２４時間後に添加し、定常混合しながら室温でさらに４８時間インキュベートする。室温は、約２０℃〜約２５℃であり、任意に約２２℃〜約２４℃である。
ＭＢＣＤ溶液の３００ｍＭストックをまずこのウイルスへ、５６７ｍＬのＭＢＣＤ溶液を８．５Ｌのウイルスストックへ添加することによって２０ｍＭの終濃度になるよう添加した。このウイルスを室温で５０ｒｐｍで混合しながら２４時間インキュベートした。３０ｍＬのウイルスをＭＢＣＤ添加０時間後、１５分後、４時間後、８時間後、１２時間後、１６時間後、２０時間後及び２４時間後に回収した。各時点についての一定分量を４℃及び−７０℃で、さらなる使用まで保存した。
２４時間試料を回収した後、ウイルスを新たな容器へ移した。さらに２０ｍＭのＭＢＣＤを添加して（ウイルスストック９．７５Ｌへ添加した６５０ｍＬのＭＢＣＤ）４０ｍＭの終濃度にした。このウイルスを室温でさらに４８時間インキュベートした。３０ｍＬのウイルスを第１のＭＢＣＤ添加の３０時間後、３６時間後、４２時間後、４８時間後、６０時間後、７２時間後、８４時間後及び９６時間後に回収した。各時点についての一定分量を４℃及び−７０℃で、さらなる使用まで保存した。
ウイルス測定：
偽の不活性化型ウイルス及び不活性化型ウイルスの１０倍連続希釈物（１０−１〜１０−９）を、９６穴プレート上で培養したＭＡＲＣ１４５細胞へ添加した。このプレートを３７℃かつ５％ＣＯ２で９６時間インキュベートして、生ウイルスを細胞に感染させておいた。ウイルス複製は、ＭＡＲＣ１４５細胞のウイルス感染による細胞変性作用（ＣＰＥ）の観察によって判定した。ウイルス希釈物を含有する各ウェルをＣＰＥに関して陽性または陰性のいずれかでスコア化し、各希釈物について結果として生じる陽性ウェルまたは陰性ウェルの数を用いて、Ｒｅｅｄ−ＭｕｅｎｃｈのＴＣＩＤ５０算出を用いてＴＣＩＤ５０／ｍＬを判定した。偽の不活性化ウイルスを、不活性化薬の添加のない不活性化ウイルスと同じ培地及び温度条件に対して処理した。
偽の不活性化ウイルス及び不活性化ウイルスならびに培地のみの対照の３つの連続した継代盲検を、Ｔ−２２５フラスコ上で培養したＭＡＲＣ１４５細胞を用いて実施した。不活性化試料及び対照試料をＭＡＲＣ１４５細胞の２日間培養物へ添加し、３７℃かつ５％ＣＯ２で７日間インキュベートした（２７ｍＬ培地中への３ｍＬ試料）。このフラスコを、ＣＰＥの存在について視覚的に検査した。各フラスコをＣＰＥに関して陽性（＋）または陰性（−）のいずれかにスコア化し、記録した。フラスコ由来の上清を収集し、ＭＡＲＣ−１４５細胞の２日間培養物を含有する新たなセットのＴ−２２５フラスコへ添加し、３７℃かつ５％ＣＯ２で７日間インキュベートした。先のプロセスを２回反復して、ＣＰＥ観察を３回連続ウイルス継代について得た。
ＰＲＲＳウイルス力価を、示される２つの異なる温度で保存した試料を用いて９６時間のインキュベーション中に回収したすべての時点について測定した。０は、力価がＰＲＲＳ生ウイルスＴＣＩＤ５０測定アッセイによって検出不可能であったまたは測定されなかったことを示す。表５に呈する結果は、２段階工程において添加した４０ｍＭが、少なくとも８ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬの力価でＰＲＲＳウイルスを不活性化することができることを実証した。より高い力価は、２０ｍＭのＭＢＣＤを用いた不完全な不活性化を実証したが、ウイルスは、第２のＭＢＣＤを添加して濃度を４０ｍＭにした後で検出不可能であることを実証した。本結果は、時間が、不活性化のための寄与因子にさほど問題にならないことも示した。所与の濃度のＭＢＣＤでのより長いインキュベーション時間は、不活性化のレベルを高めなかった。２０ｍＭ濃度のＭＢＣＤは、１５分間のインキュベーション後に生ウイルスをおよそ２．５対数減少させ、検出された生ウイルスのレベルは、２４時間定常のままであった。２４時間のインキュベーションでの２０ｍＭのＭＢＣＤの第２の添加は、回収された次の時点の試料（３０時間）によって検出できないレベルまでウイルスを不活性化した。異なる保存温度での４０ｍＭのＭＢＣＤの存在下での生存可能性の差異も観察された。検出可能な生ウイルスを有する時点試料は、４℃に対して−７０℃で保存したとき、少なくとも１００倍少ないウイルスを有していた。
実施例４
本研究の目的は、ワクチン接種負荷試験における実験的な不活性化型ＰＲＲＳＶワクチンの安全性及び効能を評価することとした。肺病変及びウイルス血症レベルを低下させる能力に関してワクチンを評価した。関心対象のワクチンの特徴は、保存温度、投与回数（１対２）及びアジュバントの添加を含んだ。本研究は、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｉｏｗａ）におけるＢＳＬ−２施設において実施した。実験アッセイは、Ｉｏｗａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ａｍｅｓ，Ｉｏｗａ）及びＳｏｕｔｈ Ｄａｋｏｔａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂｒｏｏｋｉｎｇｓ，Ｓｏｕｔｈ Ｄａｋｏｔａ）において実施した。六十（６０）匹の臨床的に健常なＰＲＲＳＶに対して血清陰性の約３週齢の離乳したブタを本研究に登録した。ブタを、体重を減少させることによって階級分類し、各６匹から構成された１０個のブロックを形成した。ブタを６個の処理群（１群あたり１０匹）のうちの１つへ無作為に割り当てた。処理群は、ワクチン非接種の対照群（Ｔ０１）及び実験的な不活性化型ＰＲＲＳＶワクチンを接種した５つの群を含んだ。このワクチンを、メチル−ベータ−シクロデキストリン（ＭＢＣＤ）を用いた脱脂処理によって不活性化した。Ｔ０２群及びＴ０３群のワクチンは、アジュバントを含有せず、２〜８℃（Ｔ０２）または−２０℃（Ｔ０３）のいずれかで保存した。Ｔ０４群及びＴ０５群のワクチンは、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）ゲル０１アジュバント（Ｓｅｐｐｉｃ）を含有し、１回（Ｔ０４）または２回（Ｔ０５）のいずれかで投与された。Ｔ０６群のワクチンは、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）ＩＭＳ１３１３ＶＧ Ｎ ＰＲアジュバント（Ｓｅｐｐｉｃ）を含有し、２回与えた。
ブタに市販の薬用（ＣＴＣ／ＤＥＮＡＧＡＲＤ（登録商標））スターター食（ＮＲＣ，２０１２）を、上部搭載型供給装置を介して自由に摂餌させた。ブタは、ニプル給水器を介する清潔な飲用水への自由なアクセスを有した。研究用ブタはすべて、ワクチン接種１０日後（１０ＤＰＶ）にＥＸＣＥＤＥ（登録商標）で処理された。さらに、ブタはすべて、単回用量のＶＩＴＡＬ Ｅ（登録商標）−５００及びＥＸＣＥＤＥ（登録商標）のさらなる処理で２１ＤＰＶに処理された。投薬はすべて、標識指示により投与された。
ワクチン
ＰＲＲＳＶ株ＳＤ１１−２１（継代レベル８４）を本研究における抗原として使用した。ＳＤ１１−２１は、ＭＡＲＣ−１４５細胞株中で８４回の継代、ならびに同時係属中の２０１６年２月１８日出願の米国出願第６２／２９６，６５８号において説明されているような、３回のプラーク精製及びショ糖密度勾配法を通じた細胞培養における生育に適したフィールド株である。継代８５（ｐ８５）を、２％ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））及び５０ｕｇ／ｍＬのゲンタマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ））を補充したＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ））中で、ＨＩＬＬＥＸ ＩＩマイクロキャリア（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ））へ装着した、ＭＡＲＣ−１４５を播種した５ＬのＢｉｏＢＬＵ単回使用バイオリアクタ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ））において作製した。収集したｐ８５ウイルスストックの力価は、実施例３において説明したウイルス力価アッセイによって測定されるように、７．３ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０であった。
１Ｌボトルの中で、１９．７ｍＬの３００ｍＭのＭＢＣＤ（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））ストック溶液を、３００ｍＬのＳＤ１１−２１ウイルスストックへ添加した。この混合物を室温で、５０ｒｐｍで２４時間定常混合しながらインキュベートした。２４時間のインキュベーション後、さらに９．８ｍＬのＭＢＣＤストック溶液を添加し、混合物を５０ｒｐｍで定常混合しながら室温でさらに２４時間インキュベートした。ＭＢＣＤの終濃度は、合計４８時間の室温でのインキュベーションによる３０ｍＭとした。ＭＢＣＤの代わりに等量の水を添加して、偽の不活性化ウイルスストックも調製し、インキュベーション時間及び混合は、不活性化ウイルスと同一とした。偽の不活性化ウイルスを、ウイルス測定アッセイのための対照として使用した。処理後、偽の不活性化ウイルスは、６．５ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬで存在したのに対し、生ウイルスは、ＭＢＣＤで不活性化したウイルス溶液中で検出されなかった。さらなる使用まで、ウイルスストックを４℃で保存した。
ワクチンは、安定剤及び保存剤を含むよう製剤化した。ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ低下血清培地をブレンド希釈剤として使用した。アジュバントは、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）ゲル０１（Ｓｅｐｐｉｃ）及びＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）１３１３ＶＧ Ｎ ＰＲ（Ｓｅｐｐｉｃ）の市販の製剤を含んだ。対照生成物は、リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）の市販の調製物（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｅｌｌｇｒｏ，Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）であった。アジュバント非含有ワクチンは、デリペートウイルス（ｄｅｌｉｐａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）、２５％Ｓｔａｂｉｌｉｌｚｅｒ Ｂ、保存剤としての２５μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、及びブレンド希釈剤を含有した。アジュバント含有ワクチンは、２０％の示されたアジュバントを含有した。Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ Ｂは、２．５％のＤ−マンニトール（Ｓｉｇｍａ）、１．２％ゼラチンＡ型（Ｆｉｓｈｅｒ，ペンシルベニア州ピッツバーグ市）、１％のＮＺアミンカゼインヒドロシラート（Ｓｉｇｍａ）、５％スクロース（Ｓｉｇｍａ）、及び６．２％トレハロース（Ｆｉｓｈｅｒ）を、ｐＨ７．０〜７．２の超純水（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に含有した。
ワクチン接種及び負荷
本研究に登録した６０匹のブタに各々、３５日後の前負荷においてワクチン接種した。Ｔ０１〜Ｔ０５におけるブタに、頸部右側において１．０ｍＬの筋肉内投与として割り当てられた処理を注射した。Ｔ０６におけるブタに１．５ｍＬを注射した。Ｔ０１〜Ｔ０３ならびにＴ０５及びＴ０６におけるブタに再度、同じ様式で１４日後に（前負荷の−２１日前）ワクチン接種した。０ＤＰＣに、負荷材料を、負荷直前にＮＡＤＣ−２０株の凍結した一定分量を解凍することによって調製した。力価は、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．製のイーグル塩及びＬ−グルタミンを含有する最小必須イーグル培地（ＭＥＭ）における希釈後に１．２６×１０５．０ＴＣＩＤ５０／ｍｌであると測定された。各ブタに対して頭部に向かって上向きに、負荷のために身体を拘束した。３ｍＬの非ルアーロック注射器を用いて、２ｍＬ用量を鼻内送達し、鼻孔あたりおよそ１ｍＬとした。
結果
１４ＤＰＣにおいて、動物を部位手順当たりで人道的に安楽死させた。肺を摘出し、処理に対して盲検である治験分担医師によってスコア化した。７葉の肺の各々を、ＰＲＲＳＶに寄与する全体的な特徴的な病変について、視覚的に及び触診によっての両方で検査した。肺の各葉における病変／硬化の量を、葉の０〜１００％の実際の値としてスコア化した。各葉についてのスコアを秤量式へ当てはめ、病変を有する肺の百分率を算出した。病変を有する肺の百分率を、以下の式によって算出した。病変を有する肺全体の百分率＝｛（０．１０×左尖部）＋（０．１０×左心）＋（０．２５×左横隔膜）＋（０．１０×右尖部）＋（０．１０×右心）＋（０．２５×右横隔膜）＋（０．１０×中間部）｝
さらに、病変を有する肺全体の百分率を、さらなる分析の前に、アークサインの平方根を用いて変換した。変換したデータを、処理の固定した作用（ＳＡＳにおける混合型手順）及びブロックの無作為な作用を含む混合型線形モデルによって分析した。
肺病変スコアの統計分析の結果を、表６に要約する。処理の主な作用は、統計的に有意であった（Ｐ＝０．０００３）。対照群（Ｔ０１）との比較は、ゲル０１アジュバント強化群（Ｔ０４及びＴ０５）において有意により低い（Ｐ＜０．０５）肺障害の百分率を示した。また、２回投与しかつ２〜８℃で保存したアジュバント非強化ワクチン（Ｔ０２）は結果的に、−２０℃で保存したワクチンで処理した類似の群（Ｔ０３）よりも有意に低い（Ｐ＜０．０５）病変スコアを生じた。
ウイルス血症のレベルの測定のための血液試料を、負荷の３５日前及び２１日前に回収した。さらに、ウイルス血症レベルの判定のための血液試料を、０、３、７、１０及び１４ＤＰＣで回収した。試料を、ｑＲＴ−ＰＣＲ技術を用いて、ＰＲＲＳウイルス核酸の存在について検査した。
血清学データ及びウイルス血症データを、分析前に、非正規分布が与えられるｌｏｇ１０単位へ変換した。変換された値を、反復尺度混合型モデル（混合型手順）を用いて分析した。この統計モデルは、処理、時間、及び固定された作用としての時間の相互作用による処理を含んだ。ブロックは、無作為な作用としてのモデルにおいて含まれた。時間の相互作用による処理が有意である場合（Ｐ＜０．０５）、時間処理内の作用を評価した。相互作用が有意ではない場合、処理の主要作用を評価した。最小二乗平均（逆変換された）及び統計誤差を表す。
ウイルス血症の分析を表７に要約する。ウイルス血症は、ワクチンウイルスが不活性化されたことを確認するＰＲＲＳＶ負荷の前に、いかなるブタにおいても観察されなかった。負荷の前の時点は、統計分析から除外した。負荷後、１日の相互作用による処理は、有意ではなく（Ｐ＝０．０９７４）、したがって、処理の主要作用を評価した。処理の作用は有意であった（Ｐ＝０．０１０７）。対照群（Ｔ０１）との比較は、アジュバント強化されたすべてのワクチン群（Ｔ０４、Ｔ０５及びＴ０６）において有意により低い（Ｐ＜０．０５）レベルを示した。事前に計画された対照はいずれも、統計的に有意ではなかった。
結論
ＭＢＣＤにより不活性化したゲル０１アジュバント強化ワクチンの１回または２回用量でブタをワクチン接種すると、対照群と比較して、肺病変及びウイルス血症レベルの両方を有意に低下させる上で有効であった。肺病変は、２〜８℃で保存された他のＭＢＣＤ不活性化型ワクチン（Ｔ０２及びＴ０６）をワクチン接種したブタにおいては数の上では減少した。肺病変スコアにおける変動により、これらの差は、Ｐ＜０．０５レベルで有意ではなかった。アジュバント（ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）ゲル０１または１３１３）を含有するＭＢＣＤワクチンはすべて、ウイルス血症を有意に低下させた。将来的な研究において、肺病変及びウイルス血症の両方における意味のある生物学的な差を検出するために、ＮＡＤＣ−２０株を負荷材料として利用するとき、より大きな試料サイズが必要とされ得る。
保存温度は、ワクチンの効能に及ぼす影響を有するように見える。−２０℃でワクチンを保存することは、２〜８℃で保存されたワクチンと比較して、ワクチン効能に及ぼす陰性作用を有した。
さらなるワクチン接種を第１の１４日後に追加することは、ゲル０１でアジュバント強化したＭＢＣＤ不活性化型ワクチンをワクチン接種したブタにおいて、ワクチンの効能をさらに改善することはなかった。
ＭＢＣＤ不活性化型ワクチンへのゲル０１アジュバントの包含は、ワクチンの効能に影響しなかった。
ＭＢＣＤ不活性化型ワクチンは、第２のワクチン接種後のＳｅｐｐｉｃ ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）ゲル０１でアジュバント強化した群において、ワクチン接種後全身反応がないこと、注射部位の病変がないこと及び一過性（１日または２日）の熱性応答のみがあることによって明らかなように、発育中のブタにとって安全であった。

Claims (18)

  1. 不活性化型エンベロープウイルスを調製する方法であって、
    エンベロープウイルスを含む溶液を第１のＭＢＣＤ溶液と混合して、第１の混合物を得ることと、
    前記第１の混合物を第１の時間、インキュベートすることと、
    前記第１の混合物に由来する前記エンベロープウイルスを第２のＭＢＣＤ溶液と混合して、第２の混合物を得ることと、
    前記第２の混合物を第２の時間、インキュベートすることと、を含む、方法。
  2. 前記第１の混合物中のＭＢＣＤの濃度が、少なくとも５ｍＭ〜約１００ｍＭである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記第１の混合物中のＭＢＣＤの濃度が、約２０ｍＭ〜約４０ｍＭである、請求項１に記載の方法。
  4. 前記第２の混合物中のＭＢＣＤの濃度が、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記第２の混合物中のＭＢＣＤの濃度が、約３０ｍＭ〜約５０ｍＭである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記第１の時間が、約１５分〜約２４時間である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記第１の時間が、約４時間〜約２４時間である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記第２の時間が、約４時間〜約４８時間である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記第２の時間が、約２４時間、約３６時間、または約４８時間である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記第１の時間及び前記第２の時間のうちの少なくとも１つの温度が、約２０℃〜約２５℃である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記温度が、約２２℃〜約２４℃である、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記エンベロープウイルスが、前記第２の混合物を得る前記ステップの前に、前記第１の混合物から単離される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記エンベロープウイルスが、ブタ生殖器呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）ウイルスである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記第１の時間及び前記第２の時間のうちの少なくとも１つが、前記第１の混合物及び／または前記第２の混合物の撹拌をさらに含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法によって得られた、脱脂処理されたエンベロープウイルス。
  16. 請求項１５に記載の脱脂処理されたエンベロープウイルスを含む、ワクチン。
  17. アジュバント、安定剤、保存剤、及びブレンド希釈剤のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項１６に記載のワクチン。
  18. 前記エンベロープウイルスに起因する疾患の治療における、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法によって得られた脱脂処理されたエンベロープウイルスの使用。
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