JP2019505565A

JP2019505565A - 新規の抗血管新生融合ポリペプチド

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Publication number: JP2019505565A
Application number: JP2018546726A
Authority: JP
Inventors: シェーンオルウィル; アイバラシダシハムベル; アレクサンダーヴィーデンマン
Original assignee: ピエリスオーストラリアプロプライエタリーリミテッド
Priority date: 2015-11-30
Filing date: 2016-11-30
Publication date: 2019-02-28
Also published as: EP3383921A4; WO2017091850A1; AU2016363668A1; SG10201911499TA; US20180334499A1; SG11201803732PA; EA201891141A1; BR112018010887A2; US10703810B2; EA035586B1; CA3004918A1; CN108699162A; MX2018006559A; KR20180083943A; EP3383921A1

Abstract

本開示は、Ang-2およびVEGF-Aに拮抗するのに有用であり得る、Ang-2に特異的な部分とVEGF-Aに特異的な別の部分とを含む融合ポリペプチドを提供する。好ましい態様において、Ang-2に特異的な部分は、ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン(hNGAL)ムテインから構成されている。このような融合ポリペプチドは、多くの薬学的用途において、例えば、血管新生を阻害するか、または低減させるのに有用な作用物質として、使用され得る。本開示はまた、本明細書において説明する融合ポリペプチドならびにそのような融合ポリペプチドを含む組成物を作製する方法にも関する。本開示は、そのような融合ポリペプチドをコードする核酸分子、それらのアミノ酸配列、ならびにそのような融合ポリペプチドおよび核酸分子を作製するための方法にも、さらに関する。さらに、本出願は、そのような融合ポリペプチドならびに1種または複数種のそのような融合ポリペプチドを含む組成物の、治療的使用および/または診断的使用を開示する。

Description

I. 背景
血管新生、すなわち既存の血管からの新しい血管の形成は、多くの生理学的プロセスおよび病理学的プロセスに不可欠である。通常は、血管新生は血管新生促進因子および抗血管新生因子によってしっかりと調節されているが、癌、眼の新血管新生疾患、関節炎、および乾癬などの疾患の場合には、このプロセスはおかしくなり得る。Folkman, J., Nat. Med., 1:27-31 (1995)（非特許文献1）。無秩序な血管新生または望まれない血管新生に関連していることが公知であるいくつかの疾患がある。このような疾患には、眼の新血管新生、例えば網膜症(糖尿病性網膜症を含む)、加齢黄斑変性症、乾癬、血管芽細胞腫、血管腫、動脈硬化症、炎症性疾患、例えば、リウマチ様もしくはリウマチ性の炎症性疾患、特に関節炎(関節リウマチを含む)、または他の慢性炎症性障害、例えば慢性喘息、動脈アテローム性硬化または移植後アテローム性動脈硬化症、子宮内膜症、ならびに新生物疾患、例えば、いわゆる固形腫瘍および液状(もしくは造血器)腫瘍(例えば、白血病およびリンパ腫)が含まれるが、それらに限定されるわけではない。望まれない血管新生に関連している他の疾患は、当業者には明らかであると考えられる。

多くのシグナル伝達系が血管新生の調節に関係付けられているが、最もよく特徴がわかっており、最も内皮細胞選択的な系の1つは、血管内皮内で選択的に発現されるTie-2受容体型チロシンキナーゼ(「Tie-2」または「Tie-2R」と呼ばれる(「ORK」とも呼ばれる);マウスTie-2は「tek」とも呼ばれる)およびそのリガンド、すなわちアンギオポエチンを必要とする(Yancopoulos, G. D., et al., Nature 407 242-48 (2000)（非特許文献2）; Gale, N. W. and Yancopoulos, G. D., Genes Dev. 13:1055-1066 (1999)（非特許文献3）)。

アンギオポエチン-1(「Ang-1」、あるいはANGPT1またはAng1と略される)からアンギオポエチン-4(「Ang-4」)まで、4種の公知のアンギオポエチンが存在する。これらのアンギオポエチンは、「Tie-2リガンド」とも呼ばれる(Davis, S., et al., Cell, §7:1161-1169 (1996)（非特許文献4）; Grosios, K., et al, Cytogenet Cell Genet, §4:118-120 (1999)（非特許文献5）; Holash, J., et al, Investigative Ophthalmology & Visual Science, 42:1611-1625 (1999)（非特許文献6）; Koblizek, T. I., et al, Current Biology, S:529-532 (1998)（非特許文献7）; Lin, P., et al, Proc Natl Acad Sci USA, 95:8829-8834 (1998)（非特許文献8）; Maisonpierre, P. C, et al, Science, 277:55-60 (1997)（非特許文献9）; Papapetropoulos, A., et al, Lab Invest, 79:213-223 (1999)（非特許文献10）; Sato, T. N., et al, Nature, 375:70-74 (1998)（非特許文献11）; Shyu, K. G., et al, Circulation, 95:2081-2087 (1998)（非特許文献12）; Suri, C, et al, Cell, <37:1171-1180 (1996)（非特許文献13）; Suri, C, et al, Science, 252:468-471 (1998)（非特許文献14）; Valenzuela, D. M., et al, P Proc Natl Acad Sci USA, 96:1904-1909 (1999)（非特許文献15）; Witzenbichler, B., et al, J Biol Chem, 273:18514-18521 (1998)（非特許文献16）)。

Ang-1とAng-2の両方とも、3nM(Kd)の親和性でTie-2に結合する(Maisonpierre, P. C., et al., Science 277 (1997) 55-60（非特許文献9）)。培養内皮細胞においてAng-1がTie-2に結合すると受容体リン酸化が促進されるのに対し、Ang-2はTie-2 受容体リン酸化の刺激と拮抗の両方を行うことが観察されている(Davis, S., et al, (1996), 前記（非特許文献4）; Maisonpierre, P.C., et al, (1997), 前記（非特許文献9）; Kim, I, J.H. Kim, et al, Oncogene 19(39): 4549-4552 (2000)（非特許文献17）; Teichert-Kuliszewska, K., P.C. Maisonpierre, et al, Cardiovascular Research 49(3): 659-70 (2001)（非特許文献18）)。マウスのTie-2ノックアウトおよびAng-1ノックアウトの表現型は、類似しており、Ang-1に刺激されたTie-2リン酸化によって、内皮細胞-支持細胞接着の維持を通して、子宮内で発達中の血管のリモデリングおよび安定化が実現することが示唆される(Dumont, D. J., et al, Genes & Development, 8:1897-1909 (1994)（非特許文献19）; Sato, T. N., et al, Nature, 376:10-14 (1995)（非特許文献20）; Suri, C, et al, (1996), 前記（非特許文献13）)。血管安定化におけるAng-1の役割は、成体で保存されていると考えられており、成体においてAng-1は広範囲かつ構成的に発現される(Hanahan, D., Science, 277:48-50 (1997)（非特許文献21）; Zagzag, D., et al, Experimental Neurology, 59:391-400 (1999)（非特許文献22）)。一方、Ang-2 発現は、主として血管リモデリングの部位に限定されており、そこでAng-1機能を妨害し、それによって血管新生の助けとなる血管可塑性の状態を誘導すると考えられている(Hanahan, D., (1997), 前記（非特許文献21）; Holash, J., et al, Science, 284:1994-1998 (1999)（非特許文献23）; Maisonpierre, P. C, et al, (1997), 前記（非特許文献9）)。

ヒトアンギオポエチン-2 (Ang-2) (あるいは、ANGPT2またはAng2と略される)は、Maisonpierre, P. C., et al., Science 277 (1997) 55-60（非特許文献9）およびCheung, A. H., et al, Genomics 48 (1998) 389-91（非特許文献24）において説明されている。称されるところによれば、公開されている多数の研究によって、無秩序な血管新生に関連している疾患状態における血管選択的なAng-2発現が実証された(Bunone, G., et al, American Journal of Pathology, 155:1961-1916 (1999)（非特許文献25）; Etoh, T., et al, Cancer Research, 67:2145-2153 (2001)（非特許文献26）; Hangai, M., et al, Investigative Ophthalmology & Visual Science, 42:1611-1625 (2001)（非特許文献27）; Holash, J., et al, (1999) 前記（非特許文献23）; Kuroda, K., et al, Journal of Investigative Dermatology, 116:113-120 (2001)（非特許文献28）; Otani, A., et al, Investigative Ophthalmology & Visual Science, 40:1912-1920 (1999)（非特許文献29）; Stratmann, A., et al, American Journal of Pathology, 153: 1459-1466 (1998)（非特許文献30）; Tanaka, S., et al, J Clin Invest, 203:34-345 (1999)（非特許文献31）; Yoshida, Y., et al, International Journal of Oncology, 25:1221-1225 (1999)（非特許文献32）; Yuan, K., et al, Journal of Periodontal Research, 35:165-171 (2000)（非特許文献33）; Zagzag, D., et al, (1999) 前記（非特許文献22）)。有効な抗Ang-2療法は、癌、網膜症、関節炎、および乾癬など血管新生に関連している疾患を患っている膨大な患者集団のためになると考えられる。

生理学的血管新生ならびに無秩序な血管新生に関連している様々な疾患および障害、例えば固形腫瘍増殖に同じく関与している有名な因子は、血管内皮増殖因子VEGF-A(VEGFとしても公知)である(Ferrara, Nature (2005) 438, 967-974（非特許文献34）)。実際に、中和抗体および他の阻害剤を用いる実験により、VEGF-A経路を遮断するだけで十分に、多くのモデルにおける腫瘍増殖に関連している血管新生を顕著に抑制できることが示されており(Willett, Cancer Cell (2007) 10(2), 145-147（非特許文献35）; Batchelor, Cancer Cell (2007) 11(1), 83-95（非特許文献36）)、この因子を標的とする多くの治療物質が、新生血管を伴う加齢黄斑変性症(nAMD)を含む病理学的な血管新生に起因する様々な病態を患っている患者において、血管正常化物質として成功している(Rosenfeld, N Engl J Med (2006) 355(14), 1419-1431（非特許文献37）; Trichonas G, Ophtalmol Ther (2013) 2(2), 89-98（非特許文献38）; Martin, N Engl J Med (2011) 364(2), 1897-1908（非特許文献39）; Solomon, Cochrane Database Syst Rev (2013) 8, Art.No.:CD005139（非特許文献40）)。

しかし、標的化VEGF遮断療法に関する最近の研究により、このような療法が、浸潤性の高い細胞表現型を促進し、腫瘍細胞の播種を増大させ得ることが明らかになった(Casanovas, Cancer Cell (2005) 8(4), 299-309（非特許文献41）; Pae-Ribes, Cancer Cell (2009) 15, 220-231（非特許文献42）)。この作用を説明する1つの理論は、抗血管新生剤が使用される場合に起こる腫瘍への酸素供給の厳しい制限が低酸素状態を引き起こすということに基づいている。低酸素は、酸素の存在下では酸素依存性プロリルヒドロキシラーゼによるプロテオソーム破壊に割り当てられるHIF-1α転写因子を安定化することにより、いくつかの遺伝子の転写活性化をもたらすことができる。活性化の標的とされる遺伝子には、通常の状況では低酸素を克服するために血管新生を促進すると思われるVEGF-Aそれ自体が含まれる。低酸素条件下でVEGF-AによってAng-2発現が誘導され得ること、したがってさらに、生理学的または病理学的な血管新生の過程で血管を不安定にさせる一因となり得ることもまた、報告されている(Simon, J Cell Physiol (2008) 217(3), 809-818（非特許文献43）)。

さらに最近になって、Ang-2が抗VEGF療法中の代償的な腫瘍の血管再生および増殖に関与している可能性があると提唱され、抗VEGFR-2によって誘導される血管正常化の邪魔をすることが示された際に、Ang-2とVEGF-Aの機能的関連がさらに導き出されている(Bullock, J Clin Oncol (2010) 28, abstr 4630（非特許文献44）)。データによっても、腫瘍の血管新生および増殖を防止する状況での、Ang-2およびVEGFのアンタゴニストの補完的作用様式が裏付けられている(Hashizume, Cancer Res (2010) 70, 2213-2223（非特許文献45）)。

Ang-2およびVEGF-Aなど治療的能力が高い重要な血管新生因子の一部重複した代償的な作用様式を考慮すれば、現在の単独療法の臨床的能力は明らかに限定的である(Bergers, Nat Rev Cancer (2008) 8, 592-603（非特許文献46）)。実際、前臨床的データによって、両方の因子を同時に妨害すると、ある種の単特異性作用物質を単独で使用した場合の活性と比べて、抗腫瘍、抗血管新生、および抗転移活性が増大することが、最近示された(Kienast, Clin Cancer Res (2013) 19(24), 6730-6740（非特許文献47）)。このような状況において、本明細書において開示するポリペプチドのような強力な二重ターゲティング物質の開発が明らかに必要である。

本発明は、この必要を満たし、抗VEGF-A/Ang2二重特異性治療的タンパク質を提供する。しかし、VEGF-AおよびAng-2に特異的な現在の二重特異性抗体は、最適とは言えず、例えば、標的との結合および有効性に強い影響を与え得る一価性および形状によって、さらにまた、約150kDaという比較的高い分子量を有することによって、制限を受ける。本開示は、所望の治療標的のそれぞれに対して少なくとも二価であり、かつ標的結合を良くするための独特な形状を有する、新規な二重特異性および多重特異性融合ポリペプチドを提供することによって、これらおよび他の制限に打ち勝つ。

Folkman, J., Nat. Med., 1:27-31 (1995) Yancopoulos, G. D., et al., Nature 407 (2000) 242-48 Gale, N. W. and Yancopoulos, G. D., Genes Dev. 13:1055-1066 (1999) Davis, S., et al., Cell, §7:1161-1169 (1996) Grosios, K., et al, Cytogenet Cell Genet, §4:118-120 (1999) Holash, J., et al, Investigative Ophthalmology & Visual Science, 42:1611-1625 (1999) Koblizek, T. I., et al, Current Biology, S:529-532 (1998) Lin, P., et al, Proc Natl Acad Sci USA, 95:8829-8834 (1998) Maisonpierre, P. C, et al, Science, 277:55-60 (1997) Papapetropoulos, A., et al, Lab Invest, 79:213-223 (1999) Sato, T. N., et al, Nature, 375:70-74 (1998) Shyu, K. G., et al, Circulation, 95:2081-2087 (1998) Suri, C, et al, Cell, <37:1171-1180 (1996) Suri, C, et al, Science, 252:468-471 (1998) Valenzuela, D. M., et al, Proc Natl Acad Sci USA, 96:1904-1909 (1999) Witzenbichler, B., et al, J Biol Chem, 273:18514-18521 (1998) Kim, I, J.H. Kim, et al, Oncogene 19(39): 4549-4552 (2000) Teichert-Kuliszewska, K., P.C. Maisonpierre, et al, Cardiovascular Research 49(3): 659-70 (2001) Dumont, D. J., et al, Genes & Development, 8:1897-1909 (1994) Sato, T. N., et al, Nature, 376:10-14 (1995) Hanahan, D., Science, 277:48-50 (1997) Zagzag, D., et al, Experimental Neurology, 59:391-400 (1999) Holash, J., et al, Science, 284:1994-1998 (1999) Cheung, A. H., et al, Genomics 48 (1998) 389-91 Bunone, G., et al, American Journal of Pathology, 155:1961-1916 (1999) Etoh, T., et al, Cancer Research, 67:2145-2153 (2001) Hangai, M., et al, Investigative Ophthalmology & Visual Science, 42:1611-1625 (2001) Kuroda, K., et al, Journal of Investigative Dermatology, 116:113-120 (2001) Otani, A., et al, Investigative Ophthalmology & Visual Science, 40:1912-1920 (1999) Stratmann, A., et al, American Journal of Pathology, 153: 1459-1466 (1998) Tanaka, S., et al, J Clin Invest, 203:34-345 (1999) Yoshida, Y., et al, International Journal of Oncology, 25:1221-1225 (1999) Yuan, K., et al, Journal of Periodontal Research, 35:165-171 (2000) Ferrara, Nature (2005) 438, 967-974 Willett, Cancer Cell (2007) 10(2), 145-147 Batchelor, Cancer Cell (2007) 11(1), 83-95 Rosenfeld, N Engl J Med (2006) 355(14), 1419-1431 Trichonas G, Ophtalmol Ther (2013) 2(2), 89-98 Martin, N Engl J Med (2011) 364(2), 1897-1908 Solomon, Cochrane Database Syst Rev (2013) 8, Art.No.:CD005139 Casanovas, Cancer Cell (2005) 8(4), 299-309 Pae-Ribes, Cancer Cell (2009) 15, 220-231 Simon, J Cell Physiol (2008) 217(3), 809-818 Bullock, J Clin Oncol (2010) 28, abstr 4630 Hashizume, Cancer Res (2010) 70, 2213-2223 Bergers, Nat Rev Cancer (2008) 8, 592-603 Kienast, Clin Cancer Res (2013) 19(24), 6730-6740

II. 定義
下記のリストは、本明細書の全体を通して使用される用語、語句、および略語を定義するものである。本明細書において列挙され定義される用語はすべて、あらゆる文法的語形を包含することを意図する。

本明細書において使用される場合、「Ang-1」とは、非ヒト種に由来する(例えば、「マウスAng-1」、「サルAng-1」など)と指定されない限り、ヒトAng-1、すなわち、Swiss Prot Q15389によって定義される完全長タンパク質またはその生物学的に活性な断片(例えば、インビトロもしくはインビボで血管新生を誘導することができる、Ang-1タンパク質の断片)を意味する。

本明細書において使用される場合、「Ang-2」とは、非ヒト種に由来する(例えば、「マウスAng-2」、「サルAng-2」など)と指定されない限り、ヒトAng-2、すなわち、Swiss Prot O15123によって定義される完全長タンパク質(その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,166,185号の図6も参照されたい)またはその生物学的に活性な断片(例えば、インビトロもしくはインビボで血管新生を誘導することができる、Ang-2タンパク質の断片)を意味する。

「Tie-2」(当技術分野では「tek」とも呼ばれる)という用語は、非ヒト種に由来する(例えば、「マウスTie-2」、「サルTie-2」など)と指定されない限り、ヒトTie-2またはその生物学的に活性な断片を意味する。ヒトTie-2は、NCBIタンパク質配列データベースにおいてアクセッション番号AAA61130として発表されているアミノ酸配列を有する。

本明細書において使用される場合、「VEGF-A」は、Swiss Prot Data Bankアクセッション番号P15692のアミノ酸配列を有するヒトタンパク質、Swiss Prot Data Bankアクセッション番号Q99PS1のアミノ酸配列を有するハムスタータンパク質、Swiss Prot Data Bankアクセッション番号P15691のアミノ酸配列を有するウシタンパク質、Swiss Prot Data Bankアクセッション番号P49151のアミノ酸配列を有するブタタンパク質、Swiss Prot Data Bankアクセッション番号Q9GKR0のアミノ酸配列を有するウマタンパク質、Swiss Prot Data Bankアクセッション番号P50412のアミノ酸配列を有するヒツジタンパク質、Swiss Prot Data Bankアクセッション番号Q00731のアミノ酸配列を有するマウスタンパク質、Swiss Prot Data Bankアクセッション番号P16612のアミノ酸配列を有するラットタンパク質、Swiss Prot Data Bankアクセッション番号P67964のアミノ酸配列を有するニワトリタンパク質、Swiss Prot Data Bankアクセッション番号P26617のアミノ酸配列を有するモルモットタンパク質、または各タンパク質の断片であってよい。本明細書において言及する「VEGF」という用語は、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、および/またはPLGFを含む。VEGFタンパク質の例は、本明細書において説明される。好ましくは、該用語は、本開示との関連で使用される場合、特に、開示される組合せのリポカリンムテインのうちの1つとの関連で使用される場合、VEGF-Aを指す。したがって、「VEGF」という用語は、完全長VEGFを含むが、VEGFの、好ましくはVEGF-Aの断片、および/または変種、例えばVEGFの、好ましくはVEGF-Aのスプライス変種も含む。好ましくは、該断片または変種は機能的である、すなわち、それらは、本明細書において説明するVEGF、好ましくはVEGF-Aの活性/機能を有している。したがって、開示される組合せのリポカリンムテインのうちの1つがVEGFに対して特異的であると言われる場合、それは、そのようなリポカリンムテインが、VEGF、好ましくはVEGF-A;VEGF、好ましくはVEGF-Aの断片;および/またはVEGF、好ましくはVEGF-Aの変種に結合できることを意味する。

本明細書において使用される場合、「検出可能な親和性」は、通常は少なくとも約10^-5Mまたはそれ未満の親和性定数で、選択された標的に結合する能力を意味する。これより小さい親和性は、通常、ELISAのような一般的な方法で測定することがもはや不可能であり、したがって、それほど重要ではない。

本明細書において使用される場合、選択された標的(本発明の場合、Ang-1またはAng-2)に対する本開示のタンパク質(例えば、ヒトリポカリン2のムテイン)の「結合親和性」は、当業者に公知である多数の方法によって測定することができる(それによって、ムテイン-リガンド複合体のK_d値を決定することができる)。このような方法には、蛍光滴定、直接ELISA、競合ELISA、等温滴定熱量測定(ITC)のような熱量測定法、および表面プラズモン共鳴(Biacore)が含まれるが、それらに限定されるわけではない。このような方法は当技術分野において十分に確立されており、その例もまた、下記に詳述する。

各結合体とそのリガンドとの複合体形成が、各結合パートナーの濃度、競合パートナーの存在、使用される緩衝液系のpHおよびイオン強度、ならびに解離定数K_dを測定するために使用される実験方法(例えば、ほんのいくつかの例を挙げると、蛍光滴定、直接ELISA、競合ELISA、もしくは表面プラズモン共鳴)などの多くの異なる因子、またはさらに、実験データを評価するのに使用される数学アルゴリズムの影響を受けることも、留意されたい。

したがって、K_d値(各結合体とその標的/リガンドとの間で形成された複合体の解離定数)は、所与のリガンドに対する特定のムテインの親和性を測定するのに使用される方法および実験設定によって、一定の実験範囲内で変動し得ることもまた、当業者には明らかである。これは、例えば、K_d値が表面プラズモン共鳴(Biacore)により測定されたか、競合ELISAにより測定されたか、または「直接ELISA」より測定されたかによって、K_d測定値のわずかなずれまたは許容誤差範囲が存在し得ることを意味する。

本明細書において使用される場合、結合特異性は絶対的ではなく相対的な特性であるため、本開示のムテインのような化合物は、その標的と1種または複数種の参照標的とを見分けることができる場合、標的(例えば、Ang-1もしくはAng-2)に「特異的に結合する」か、または標的に対する「結合特異性」を有する。「特異的結合」は、例えば、ウェスタンブロット、ELISA試験、RIA試験、ECL試験、IRMA試験、IHC、およびペプチドスキャンに基づいて判定することができる。

「ヒトリポカリン2」もしくは「ヒトLcn2」または「ヒトNGAL」もしくは「hNGAL」という用語は、本明細書において使用される場合、SWISS-PROT/UniProtデータバンクアクセッション番号P80188の成熟したヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン(NGAL)を意味する。本開示のヒトリポカリン2ムテインは、本明細書において「hNGALムテイン」と呼ばれてもよい。SWISS-PROT/UniProtデータバンクアクセッション番号P80188に示されているアミノ酸配列は、好ましい「参照配列」として使用されてよく、より好ましくは、SEQ ID NO: 1に示すアミノ酸配列が、参照配列として使用される。

本明細書において使用される場合、「ムテイン」、「変異した」実体(タンパク質であろうと核酸であろうと)、または「変異体」とは、天然に存在する(野生型)核酸またはタンパク質の「参照」骨格と比べた、1つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸の交換、欠失、または挿入を意味する。本明細書において使用される場合、「ムテイン」という用語はまた、その機能的な断片または変種も含む。本開示において説明する特定のムテインの断片または変種は、好ましくは、例えば、検出可能な親和性またはさらに高い親和性でAng-1またはAng-2に結合する機能を保持しており、そのような断片または変種は、本明細書において開示する参照ムテイン(mutain)の「機能的な断片または変種」である。

「断片」という用語は、本開示のリポカリンムテインに関連して本明細書において使用される場合、N末端および/またはC末端が短くなっている、すなわち、N末端および/またはC末端のアミノ酸の少なくとも1つを欠いている、完全長成熟ヒトリポカリン2由来のタンパク質またはペプチドに関する。このような断片は、成熟ヒトリポカリン2の一次配列の少なくとも10個以上、例えば、20個以上、または30個以上の連続したアミノ酸を含んでよく、通常、成熟ヒトリポカリン2を対象とするイムノアッセイ法において検出可能である。このような断片は、最高2個、最高3個、最高4個、最高5個、最高10個、最高15個、最高20個、最高25個、または最高30個(これらの数の間の数をすべて含む)の、N末端および/またはC末端のアミノ酸を欠いてもよい。好ましくは、この断片は、完全長成熟ヒトリポカリン2(ムテイン)の機能的断片である、すなわち、好ましくは、由来元である完全長成熟ヒトリポカリン2(ムテイン)の結合ポケットを含むことが、理解されよう。例示的な例として、このような機能的断片は、完全長成熟ヒトリポカリン2の直鎖ポリペプチド配列の少なくともアミノ酸28〜134、好ましくは少なくともアミノ酸13〜157を含んでよい。

通常、「断片」という用語は、本開示のムテインまたは本開示による組み合わせの対応するタンパク質リガンドに関して本明細書において使用される場合、本開示によるムテインによって認識および/または結合される完全長リガンドの能力を保持している、N末端および/またはC末端が短くなっているタンパク質リガンドまたはペプチドリガンドに関する。

「変異誘発」という用語は、本明細書において使用される場合、実験条件を選択して、成熟ヒトリポカリン2の所与の配列位置に天然に存在するアミノ酸を、各天然ポリペプチド配列においてこの特定の位置に存在しない少なくとも1つのアミノ酸で置換できるようにすることを意味する。「変異誘発」という用語はまた、1つまたは複数のアミノ酸の欠失または挿入による、配列セグメントの長さの(さらなる)改変も含む。したがって、例えば、選択された配列位置の1つのアミノ酸が一続きの3つのランダムな変異によって置換されて、野生型タンパク質の各セグメントの長さと比べてアミノ酸残基が2つ挿入されることは、本開示の範囲内である。このような挿入または欠失は、本開示の変異誘発に供され得るペプチドセグメントのいずれかに、互いに無関係に導入されてよい。

「ランダム変異誘発」という用語は、前もって決定された単一アミノ酸(変異)が、ある特定の配列位置に1つも存在しないことを意味するが、少なくとも2つのアミノ酸が、変異誘発の間に規定の配列位置にある程度の確率で組み入れられ得ることを意味する。

「同一性」とは、類似性または関係の程度を示す、配列の性質である。「配列同一性」または「同一性」という用語は、本開示で使用される場合、本開示のポリペプチド配列を問題の配列と(相同性)アライメントした後の、これら2つの配列の長い方の残基数に対する、ペアをなす同一の残基のパーセンテージを意味する。配列同一性は、同一アミノ酸残基の数を残基の総数で割り、その結果に100を掛けることによって計算される。

「相同性」という用語は、本明細書において、その通常の意味で使用され、同一のアミノ酸、ならびに本開示のポリペプチド(例えば、本開示の任意のムテイン)の直鎖アミノ酸配列中の等価な位置における保存的置換(例えば、グルタミン酸残基をアスパラギン酸残基で交換)であるとみなされるアミノ酸を含む。

配列相同性または配列同一性の比率は、例えば、BLASTPプログラム、バージョンblastp 2.2.5(November 16, 2002; cf. Altschul, S. F. et al. (1997) Nucl. Acids Res. 25, 3389-3402)を用いて、本明細書において測定され得る。この態様において、相同性の比率は、好ましくは、ペアワイズ比較において参照として野生型タンパク質骨格を用いた、プロペプチド配列を含むポリペプチド配列全体のアライメントに基づいている(マトリックス:BLOSUM62;ギャップコスト:11.1;カットオフ値10^-3に設定)。これは、BLASTPプログラム出力で結果として示される「陽性」(相同なアミノ酸)の数を、アライメントのためにプログラムによって選択したアミノ酸の総数で割った比率として算出される。

具体的には、野生型ヒトリポカリン2と異なるムテインのアミノ酸配列のアミノ酸残基が、野生型ヒトリポカリン2のアミノ酸配列の特定の位置に対応するかどうかを判定するために、当業者は、当技術分野において周知の手段および方法、例えば、手作業による、またはBLAST2.0(Basic Local Alignment Search Toolを意味する)もしくはClustalWまたは配列アライメントを作成するのに適している他の任意の適切なプログラムなどのコンピュータープログラムを使用することによる、アライメントを用いることができる。したがって、野生型ヒトリポカリン2は、「対象配列」または「参照配列」の役割を果たすことができ、一方、本明細書において説明する野生型ヒトリポカリン2と異なるムテインのアミノ酸配列は、「問い合わせ配列」の役割を果たす。「参照配列」および「野生型配列」という用語は、本明細書において同義的に使用される。

「ギャップ」とは、アミノ酸の付加または欠失の結果である、アライメント中の隙間である。したがって、まさに同じ配列の2つのコピーは100％の同一性を有するが、それほど高度に保存されておらず、欠失、付加、または置換を有する配列は、配列同一性の程度が劣る場合がある。当業者は、いくつかのコンピュータープログラム、例えば、Blast (Altschul, et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402), Blast2 (Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215, 403-410)、およびSmith-Waterman (Smith, et al. (1981) J. Mol. Biol. 147, 195-197)が、標準的なパラメーターを用いて配列同一性を測定するために利用可能であることを認識するであろう。

「変種」という用語は、本開示で使用される場合、例えば、置換、欠失、挿入、または化学的改変によるアミノ酸配列の改変を含む、タンパク質またはペプチドの派生物に関する。いくつかの態様において、このような改変によって、タンパク質またはペプチドの機能性が低下することはない。このような変種には、1つまたは複数のアミノ酸を、それらの各々のD立体異性体によって、または天然に存在する20種のアミノ酸以外のアミノ酸、例えば、オルニチン、ヒドロキシプロリン、シトルリン、ホモセリン、ヒドロキシリジン、ノルバリンによって置換したタンパク質が含まれる。しかしながら、このような置換もまた、保存的であることができ、すなわち、あるアミノ酸残基が、化学的に類似しているアミノ酸残基で置換される。保存的置換の例は、次のグループのメンバー間の置換である:1)アラニン、セリン、およびトレオニン;2)アスパラギン酸およびグルタミン酸;3)アスパラギンおよびグルタミン;4)アルギニンおよびリジン;5)イソロイシン、ロイシン、メチオニン、およびバリン;ならびに6)フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン。

「ネイティブ配列」ヒトリポカリン2とは、自然界に由来する対応するポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するヒトリポカリン2を意味する。したがって、ネイティブ配列ヒトリポカリン2は、天然に存在する各ヒトリポカリン2のアミノ酸配列を有することができる。このようなネイティブ配列ポリペプチドは、自然界から単離することができるか、または組換え手段もしくは合成手段を用いて作製することができる。具体的には、「ネイティブ配列」ポリペプチドという用語は、ヒトリポカリン2の天然に存在する短縮型または分泌型、選択的にスプライシングされた型のような天然に存在する変種型、およびヒトリポカリン2の天然に存在する対立遺伝子変種を包含する。ポリペプチド「変種」とは、ネイティブ配列ポリペプチドとの少なくとも約50％、60％、70％、80％、または少なくとも約85％のアミノ酸配列同一性を有する、生物学的に活性なポリペプチドを意味する。このような変種には、例えば、ポリペプチドのN末端またはC末端において、1つまたは複数のアミノ酸残基が付加されているか、または欠失している、ポリペプチドが含まれる。通常、変種は、ネイティブ配列ポリペプチドとの少なくとも約70％(少なくとも約80％を含む)、例えば少なくとも約85％のアミノ酸配列同一性(少なくとも約90％のアミノ酸配列同一性または少なくとも約95％のアミノ酸配列同一性を含む)を有する。

「位置」という用語は、本開示に従って使用される場合、本明細書において示すアミノ酸配列内のアミノ酸の位置または本明細書において示すヌクレオチド配列内のヌクレオチドの位置のいずれかを意味する。1種または複数種のムテインのアミノ酸配列位置との関連で本明細書において使用される「対応する(correspond)」または「対応する(corresponding)」という用語を理解するために、対応する位置は、先行するヌクレオチド/アミノ酸の数に基づいて決められるだけではない。したがって、置換され得る本開示に従う所与のアミノ酸の位置は、(変異体または野生型)ヒトリポカリン2中の別の場所でのアミノ酸の欠失または付加が原因で、変わり得る。同様に、置換され得る本開示に従う所与のヌクレオチドの位置は、ムテインまたは野生型ヒトリポカリン2の、プロモーターおよび/もしくは他の任意の調節配列を含む5’-非翻訳領域(UTR)または遺伝子(エキソンおよびイントロンを含む)中の別の場所での欠失または付加的ヌクレオチドが原因で、変わり得る。

したがって、本開示に従う対応する位置に関して、ヌクレオチド/アミノ酸の位置は、示される数が、類似する隣接ヌクレオチド/アミノ酸と異なる場合があるが、交換、欠失、または付加されてよい該隣接ヌクレオチド/アミノ酸もまた、1つまたは複数の対応する位置に含まれることを、好ましくは理解すべきである。

さらに、本開示に従う参照骨格に基づくムテイン中の対応する位置について、ヌクレオチド/アミノ酸の位置は、示される数が異なり得る場合でも、ムテインまたは野生型ヒトリポカリン2中の別の場所の位置に構造的に対応することを、好ましくは理解すべきである。

「有機分子」または「有機低分子」という用語は、非天然標的に関して本明細書において使用される場合、少なくとも2個の炭素原子を含み、ただし好ましくは7個または12個以下の回転可能な炭素結合を含み、100〜2000ダルトンの間、好ましくは100〜1000ダルトンの間の範囲の分子量を有しており、かつ任意で、1つまたは2つの金属原子を含む、有機分子を意味する。

「検出する」、「検出」、「検出可能」、または「検出すること」という言葉は、本明細書において使用される場合、定量レベルおよび定性レベルの両方、ならびにそれらの組み合わせに基づいて理解される。したがって、関心対象の分子の定量的測定、半定量的測定、および定性的測定を含む。

「対象」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。「哺乳動物」という用語は、哺乳動物として分類される任意の動物を意味するために本明細書において使用され、ごく少数の例示的な例を挙げれば、ヒト、家畜および農場動物、ならびに動物園、競技用、またはペット用の動物、例えば、ヒツジ、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ラット、ブタ、カニクイザル(cynomolgus monkey)のような類人猿などが非限定的に含まれる。好ましくは、本明細書における哺乳動物はヒトである。

「有効量」とは、有益または望ましい結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、1回または複数回の投与で投与することができる。

「試料」は、任意の対象から採取された生物試料と定義される。生物試料には、血液、血清、尿、大便、精液、または組織が含まれるが、それらに限定されるわけではない。

本開示による「転移」という用語は、原発腫瘍から患者のどこか他の1つまたは複数の部位に癌細胞が伝達されて、そこで二次腫瘍が発生することを意味する。癌が転移したかを判定するための手段は当技術分野において公知であり、骨スキャン、胸部X線、CATスキャン、MRIスキャン、および腫瘍マーカー試験が含まれる。「転移の予防」という用語は、原発性の腫瘍または癌の転移が予防、遅延、または低減され、したがって、二次腫瘍の発生が予防、遅延、または低減されることを意味する。好ましくは、肺の転移、すなわち二次腫瘍は予防または低減され、これは、原発腫瘍から肺への癌細胞の転移性の伝達が予防または低減されることを意味する。

本明細書において使用される「癌」という用語は、増殖性疾患、例えば、リンパ腫、リンパ性白血病、肺癌、非小細胞肺(NSCL)癌、細気管支肺胞(bronchioloalviolar)細胞肺癌、骨癌、膵癌、皮膚癌、頭部または頸部の癌、皮膚黒色腫または眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、胃の癌、結腸癌、乳癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、腟癌、外陰癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌または尿管癌、腎細胞癌、腎う癌、中皮腫、肝細胞癌、胆道癌、中枢神経系(CNS)の新生物、脊椎腫瘍、脳幹神経膠腫、多形性神経膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫(schwanoma)、上衣腫(ependymona)、髄芽細胞腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫、およびユーイング肉腫を意味し、上記の癌のいずれかの難治性のタイプ(version)または上記の癌の1種もしくは複数種の組み合わせを含む。

「血管疾患」という用語には、癌、炎症性疾患、アテローム性動脈硬化症、虚血、外傷、敗血症、COPD、喘息、糖尿病、AMD、網膜症、脳卒中、脂肪過多症、急性肺傷害、出血、血管漏出、例えば、サイトカインに誘発されたもの、アレルギー、グレーブス病、橋本自己免疫性甲状腺炎、特発性血小板減少性紫斑病、巨細胞性動脈炎、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス(SLE)、ループス腎炎、クローン病、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、特に固形腫瘍に対して(to)、眼内新血管新生症候群(増殖網膜症または加齢黄斑変性症(AMD))、関節リウマチ、および乾癬が含まれる(Folkman, J., et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 10931- 10934; Klagsbrun, M., et al., Annu. Rev. Physiol. 53 (1991) 217-239;およびGarner, A., Vascular diseases, In: Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach, Garner, A., and Klintworth, G. K. (eds.), 2nd edition, Marcel Dekker, New York (1994), pp 1625-1710)。

「抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、4本のポリペプチド鎖、すなわち、ジスルフィド結合によって相互に連結した2本の重(H)鎖および2本の軽(L)鎖を含む免疫グロブリン分子、ならびにそれらの多量体(例えばIgM)を意味するものとする。各重鎖は、重鎖可変領域(本明細書においてHCVRまたはV_Hと略される)および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、3種のドメイン、すなわちC_H1、C_H2、およびC_H3を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書においてLCVRまたはV_Lと略される)および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、1つのドメイン(C_L1)を含む。V_H領域およびV_L領域は、フレームワーク領域(FR)と呼ばれる保存の程度が高い領域が間に割り込んでいる、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分することができる。各V_HおよびV₁は、3つのCDRおよび4つのFRから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって次の順序で配列されている:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。本開示の様々な態様において、抗Ang-2抗体(またはその抗原結合部分)のFRは、ヒト生殖系列配列と同一であってもよく、または天然にもしくは人工的に改変されていてもよい。アミノ酸コンセンサス配列は、2つまたはそれ以上のCDRの並行解析に基づいて明らかにすることができる。CDR配列は、軽鎖可変領域および/または重鎖可変領域の配列に基づいて容易に決定することができる。本発明の状況において好ましい方法は、Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999)において説明されているIMGT法である。CDR1は、27〜38位からなり;CDR2は、56〜65位からなり;生殖系列V遺伝子の場合のCDR3は、105〜116位からなり;再構成されたV-J遺伝子またはV-D-J遺伝子の場合のCDR3は、105〜117位からなり(J-PHEもしくはJ-TRP 118の直前の位置)、その際、アミノ酸が13個未満の再構成されたCDR3-IMGTの場合に、ループの上部に隙間を有するか、またはアミノ酸が13個を超える再構成されたCDR3-IMGTの場合に、追加の位置112.1、111.1、112.2、111.2などを有する。この段落で示した位置は、Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999)において説明されているIMGT番号付与に従っている。

「抗体」という用語はまた、本明細書において使用される場合、完全な抗体分子の抗原結合断片も含む。抗体の「抗原結合部分」および抗体の「抗原結合断片」などの用語は、本明細書において使用される場合、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、天然に存在するか、酵素的に得ることができるか、合成であるか、または遺伝的に操作された、任意のポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合断片は、任意の適切な標準的技術、例えば、タンパク質消化、または抗体の可変ドメインおよび任意で定常ドメインをコードするDNAの操作および発現を伴う組換え遺伝子工学技術を用いて、例えば、完全な抗体分子から誘導してもよい。このようなDNAは公知であり、かつ/または例えば商業的供給源であるDNAライブラリー(例えばファージ抗体ライブラリーを含む)から容易に入手可能であるか、もしくは合成することもできる。DNAを、化学的にまたは分子生物学的技術を用いることによって配列決定および操作して、例えば、1つもしくは複数の可変ドメインおよび/もしくは定常ドメインを適切な立体配置に配列させるか、またはコドンを導入するか、システイン残基を作り出すか、アミノ酸を改変、付加、もしくは欠失させるなど、することができる。抗原結合断片の非限定的な例には、(i)Fab断片、(ii)F(ab')₂断片、(iii)Fd断片、(iv)Fv断片、(v)単鎖Fv(scFv)分子、(vi)dAb断片、および(vii)抗体の超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位(例えば、単離された相補性決定領域(CDR))が含まれる。ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、およびミニボディなどの他の操作された分子もまた、本明細書において使用される場合、「抗原結合断片」という表現に包含される。典型的には、抗体の抗原結合断片は、少なくとも1つの可変ドメインを含む。可変ドメインは、任意のサイズまたはアミノ酸組成のものであってよく、通常、1つまたは複数のフレームワーク配列に隣接しているか、またはそれとインフレームである(in frame with)、少なくとも1つのCDRを含む。V_Lドメインと結合しているV_Hドメインを有する抗原結合断片において、V_HドメインおよびV_Lドメインは、任意の適切な配置で互いに対して位置していてよい。例えば、可変領域は二量体であってよく、V_H-V_H、V_H-V_L、またはV_L-V_L二量体を含んでよい。あるいは、抗体の抗原結合断片は、単量体のV_HドメインまたはV_Lドメインを含んでもよい。

III 図面の説明
標的VEGF-AおよびAng-2に関して二重特異性である、本出願において説明する代表的な融合ポリペプチドの設計の概要を提供する。代表的な融合ポリペプチドを、VEGF-Aに特異的な抗体(SEQ ID NO: 8および9)ならびにAng-2に特異的なリポカリンムテイン(SEQ ID NO: 2またはSEQ ID NO: 3)に基づいて作製した。抗体の2つのC末端のいずれか1つに、リポカリンムテインを融合した。結果として生じる融合ポリペプチドは、SEQ ID NO: 9および10、SEQ ID NO: 8および11、SEQ ID NO: 9および14、SEQ ID NO: 8および15を有する。代表的な融合ポリペプチド、ベンチマーク二重特異性抗体(SEQ ID NO: 20、21、22、および23)、ならびに陽性対照抗体(SEQ ID NO: 8および9)のVEGF-Aに対する親和性を測定したELISA実験の結果を示す。組換えVEGF-Aをマイクロタイタープレートにコーティングし、被験作用物質を、濃度100nMから始めて力価測定した。試験中に結合された作用物質は、実施例2に説明するようにして抗ヒトIgG Fc抗体を介して検出した。このデータに、自由パラメーターとしてのEC50値および最大シグナルならびに1に固定された傾きを用いる1:1結合モデルを当てはめた。代表的な融合ポリペプチド(SEQ ID NO: 9および10、SEQ ID NO: 8および11、SEQ ID NO: 9および14、SEQ ID NO: 8および15)、ベンチマーク二重特異性抗体(SEQ ID NO: 20、21、22、および23)、ならびにAng-2に対する陽性対照リポカリンムテイン(SEQ ID NO: 2および3)の親和性を測定したELISA実験の結果を示す。組換えAng-2をマイクロタイタープレートにコーティングし、被験作用物質を、濃度100nMから始めて力価測定した。試験中に結合された作用物質は、実施例3に説明するようにして抗ヒトIgG-Fc抗体または抗リポカリン抗体を介して検出した。このデータに、自由パラメーターとしてのEC50値および最大シグナルならびに1に固定された傾きを用いる1:1結合モデルを当てはめた。代表的な融合ポリペプチド(SEQ ID NO: 9および10、SEQ ID NO: 8および11、SEQ ID NO: 9および14、SEQ ID NO: 8および15)が両方の標的、すなわちVEGF-AおよびAng-2に同時に結合する能力を測定したELISA実験の結果を示す。(A)組換えVEGF-Aをマイクロタイタープレートにコーティングし、その後、融合ポリペプチドを、濃度100nMから始めて力価測定した。続いて、一定濃度のビオチン標識ヒトAng-2を添加し、実施例4に説明するようにエクストラアビジンを介してこれを検出した。(B)代替の形式も使用した。すなわち、Ang-2をマイクロタイタープレートにコーティングし、その後、融合ポリペプチドを、濃度100nMから始めて力価測定した。続いて、一定濃度のビオチン標識ヒトVEGF-Aを添加した。融合ポリペプチド(SEQ ID NO: 9および10、SEQ ID NO: 8および11、SEQ ID NO: 9および14、SEQ ID NO: 8および15)ならびにベンチマーク対照(SEQ ID NO: 6および7)が、ヒトAng-2とHEK細胞表面で過剰発現されたその受容体ヒトTie-2との相互作用を妨害する能力を有することを実証する。一定濃度のヒトAng-2を、様々な濃度の融合ポリペプチド(SEQ ID NO: 9および10、SEQ ID NO: 8および11、SEQ ID NO: 9および14、SEQ ID NO: 8および15)またはベンチマーク対照(SEQ ID NO: 6および7)と共にプレインキュベーションした。抗HISタグ抗体を介して、効力を消されていないAng-2を検出した。このデータに単一部位結合モデルを当てはめた。融合ポリペプチド(SEQ ID NO: 9および10、SEQ ID NO: 8および11、SEQ ID NO: 9および14、SEQ ID NO: 8および15)ならびにベンチマーク対照(SEQ ID NO: 6および7;SEQ ID NO: 8および9)が、細胞に基づく増殖アッセイ法において、VEGF-Aおよび/またはhAng-2の生物活性を妨害する能力を有することを実証する。このアッセイ法において、融合ポリペプチド、IgGアイソタイプ陰性対照、ならびに2つのベンチマーク抗体を、VEGF-Aを添加したヒトリンパ管内皮細胞(LEC)に添加した。この実験から、LEC増殖が、融合ポリペプチド(SEQ ID NO: 9および10、SEQ ID NO: 8および11、SEQ ID NO: 9および14、SEQ ID NO: 8および15)によって1.2〜0.5nMの範囲のIC50値で妨害されることが示される。VEGF-Aベンチマーク抗体対照(SEQ ID NO: 8および9)は、1.2nMのIC50値で増殖を阻害した。リポカリンムテイン(SEQ ID NO: 2またはSEQ ID NO: 3)は、1.9〜1.7nMのIC50で、ある程度細胞増殖を阻害したのに対し、Ang-2ベンチマーク抗体(SEQ ID NO: 6および7)のIC50は4.2nMであった。IgGアイソタイプ陰性対照およびSEQ ID NO: 1陰性対照には、細胞増殖に対する効果はまったくなかった。データにシグモイド用量反応モデルを当てはめた。ウサギにおける二重特異性融合ポリペプチド(SEQ ID NO: 9および14、SEQ ID NO: 8および15)の薬物動態解析の結果を提供する。雌ウサギに、用量100ug/眼の右眼への硝子体内注射剤として被験物質を与えた。標的VEGF-AおよびAng-2を介して完全な二重特異性構築物を検出するサンドイッチELISAを用いて、薬物レベルを検出した。ノンコンパートメントモデルを用いて、このデータを当てはめた。

IV 開示内容の詳細な説明
いくつかの態様において、本開示の融合ポリペプチドは、少なくとも2つのサブユニットを任意の順序で含む:VEGF-Aに特異的な完全長免疫グロブリンまたはその抗原結合ドメインを含む第1のサブユニット、およびAng-2に特異的なリポカリンムテインを含む第2のサブユニット。これらのサブユニットは、共有結合、例えばペプチド結合によって連結され得る。

いくつかの態様において、図1で本質的に示されるように、1つのサブユニットは、別のサブユニットに連結され得る。例えば、1つのリポカリンムテインは、ペプチド結合によって、免疫グロブリン重鎖のC末端、免疫グロブリン重鎖のN末端、免疫グロブリン軽鎖のC末端、および/または免疫グロブリン軽鎖のN末端に連結され得る。したがって、いくつかの特定の態様において、リポカリンムテインサブユニットは、そのN末端および/またはそのC末端において免疫グロブリンサブユニットと融合していてよい。さらに別のいくつかの態様において、2つのサブユニットは、ペプチドリンカーによって連結されてよい。リンカーは、任意の構成およびサイズのものでよく、当業者には明らかであろう。好ましいリンカーは、例えば、SEQ ID NO: 19に示されるような(G4S)3リンカーである。

いくつかの態様において、融合ポリペプチドはまた、第3または付加的なサブユニットも含んでよい。例えば、ポリペプチドは、Ang-2またはVEGF-A以外の標的に特異的なリポカリンムテインを含む第3のサブユニットを含んでよく、この第3のサブユニットは、そのN末端またはそのC末端において、第1のサブユニットまたは第2のサブユニットいずれかの、それぞれC末端またはN末端に結合されてよい。

いくつかの態様において、本開示の融合ポリペプチドにおいて、VEGF-A特異的サブユニットは、Ang-2特異的サブユニットに融合されている。

いくつかのより具体的な態様において、VEGF-A特異的サブユニットは、完全長免疫グロブリン(例えばモノクローナル抗体)またはその抗原結合ドメインを含み、Ang-2特異的サブユニットは、リポカリンムテインを含む。いくつかの態様において、融合ポリペプチドは、SEQ ID NO: 9および10、SEQ ID NO: 8および11、SEQ ID NO: 9および12、SEQ ID NO: 8および13、SEQ ID NO: 9および14、SEQ ID NO: 8および15、SEQ ID NO: 9および16、SEQ ID NO: 8および17、SEQ ID NO: 9および24、SEQ ID NO: 8および25、SEQ ID NO: 9および26、SEQ ID NO: 8および27、SEQ ID NO: 9および28、SEQ ID NO: 8および29、SEQ ID NO: 9および30、SEQ ID NO: 8および31、SEQ ID NO: 9および32、SEQ ID NO: 8および33、SEQ ID NO: 9および34、SEQ ID NO: 8および35、SEQ ID NO: 9および36、SEQ ID NO: 8および37、SEQ ID NO: 9および38、SEQ ID NO: 8および39、SEQ ID NO: 9および40、SEQ ID NO: 8および41、SEQ ID NO: 9および42、SEQ ID NO: 8および43、SEQ ID NO: 9および44、SEQ ID NO: 8および45、SEQ ID NO: 9および46、SEQ ID NO: 8および47、SEQ ID NO: 9および48、SEQ ID NO: 8および49、SEQ ID NO: 9および50、SEQ ID NO: 8および51、SEQ ID NO: 9および52、SEQ ID NO: 8および53、SEQ ID NO: 9および54、SEQ ID NO: 8および55、SEQ ID NO: 9および56、SEQ ID NO: 8および57、SEQ ID NO: 9および58、SEQ ID NO: 8および59、SEQ ID NO: 9および60、SEQ ID NO: 8および61、SEQ ID NO: 9および62、SEQ ID NO: 8および63、SEQ ID NO: 9および64、SEQ ID NO: 8および65、SEQ ID NO: 9および66、SEQ ID NO: 8および67、SEQ ID NO: 9および68、SEQ ID NO: 8および69、SEQ ID NO: 9および70、ならびにSEQ ID NO: 8および71からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、VEGF-A特異的サブユニットは、完全長免疫グロブリン(例えばモノクローナル抗体)またはその抗原結合ドメインを含み、このモノクローナル抗体は、SEQ ID NO: 9および10、SEQ ID NO: 8および11、SEQ ID NO: 9および12、SEQ ID NO: 8および13、SEQ ID NO: 9および14、SEQ ID NO: 8および15、SEQ ID NO: 9および16、SEQ ID NO: 8および17、SEQ ID NO: 9および24、SEQ ID NO: 8および25、SEQ ID NO: 9および26、SEQ ID NO: 8および27、SEQ ID NO: 9および28、SEQ ID NO: 8および29、SEQ ID NO: 9および30、SEQ ID NO: 8および31、SEQ ID NO: 9および32、SEQ ID NO: 8および33、SEQ ID NO: 9および34、SEQ ID NO: 8および35、SEQ ID NO: 9および36、SEQ ID NO: 8および37、SEQ ID NO: 9および38、SEQ ID NO: 8および39、SEQ ID NO: 9および40、SEQ ID NO: 8および41、SEQ ID NO: 9および42、SEQ ID NO: 8および43、SEQ ID NO: 9および44、SEQ ID NO: 8および45、SEQ ID NO: 9および46、SEQ ID NO: 8および47、SEQ ID NO: 9および48、SEQ ID NO: 8および49、SEQ ID NO: 9および50、SEQ ID NO: 8および51、SEQ ID NO: 9および52、SEQ ID NO: 8および53、SEQ ID NO: 9および54、SEQ ID NO: 8および55、SEQ ID NO: 9および56、SEQ ID NO: 8および57、SEQ ID NO: 9および58、SEQ ID NO: 8および59、SEQ ID NO: 9および60、SEQ ID NO: 8および61、SEQ ID NO: 9および62、SEQ ID NO: 8および63、SEQ ID NO: 9および64、SEQ ID NO: 8および65、SEQ ID NO: 9および66、SEQ ID NO: 8および67、SEQ ID NO: 9および68、SEQ ID NO: 8および69、SEQ ID NO: 9および70、ならびにSEQ ID NO: 8および71からなる群より選択される抗体に含まれる重鎖相補性決定領域(CDR)および軽鎖CDRを有する。

いくつかの態様において、第2のサブユニットは、SEQ ID NO: 2、3、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、および97からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むリポカリンムテインから構成されている。

いくつかの態様において、第2のサブユニットは、SEQ ID NO: 72〜85からなる群より選択される核酸配列を含むリポカリンムテインから構成されている。

いくつかの態様において、本開示の融合ポリペプチドに含まれる免疫グロブリンのFc部分は、融合ポリペプチドの血清レベルを維持するのに貢献することができ、体内でのその安定性および持続性にとって不可欠である。例えば、Fc部分が内皮細胞および食細胞の表面のFc受容体に結合すると、融合ポリペプチドは、内部移行され、再循環されて血流に戻り、その半減期を長くすることができる。

いくつかの態様において、例えば、VEGF-Aに対する前記親和性が、実施例2に本質的に説明されるELISAアッセイ法において測定される場合、本開示の融合ポリペプチドは、約1nMまたはそれ未満、例えば、約0.5nM、約0.3nM、または約0.15nMのEC50値で、VEGF-Aに結合することができ得る。

いくつかの態様において、例えば、前記免疫グロブリンおよび融合ポリペプチドが、実施例2に本質的に説明されるELISAアッセイ法において測定される場合、本開示の融合ポリペプチドは、そのような融合ポリペプチドに含まれるVEGF-Aに特異的な免疫グロブリン、例えば、SEQ ID NO: 8および9によって提供される重鎖および軽鎖を有する抗体のEC50値に匹敵するEC50値で、VEGF-Aに結合することができ得る。

いくつかの態様において、例えば、Ang-2に対する前記親和性が、実施例3に本質的に説明されるELISAアッセイ法において測定される場合、本開示の融合ポリペプチドは、約1nMまたはそれ未満、例えば、約0.5nM、約0.25nM、または約0.1nMのEC50値で、Ang-2に結合することができ得る。例えば、前記リポカリンムテインおよび融合ポリペプチドが、実施例3に本質的に説明されるELISAアッセイ法において測定される場合、本開示の融合ポリペプチドは、そのような融合ポリペプチドに含まれるAng-2に特異的なリポカリンムテイン、例えば、SEQ ID NO: 2および3のリポカリンムテインのEC50値に匹敵するEC50値で、Ang-2に結合することができ得る。

いくつかの態様において、VEGF-AおよびAng-2の両方に特異的な本開示の融合ポリペプチドは、例えば、実施例4に本質的に説明されるELISAアッセイ法において測定される場合、VEGF-AおよびAng-2に同時に結合する能力を有し得る。

いくつかの態様において、本開示の融合ポリペプチドは、実施例5に本質的に説明される競合細胞電気化学発光(ECL)アッセイ様式において、ヒトTie-2発現細胞へのヒトAng-2の結合を妨害することができ得る。

いくつかの態様において、本開示の融合ポリペプチドは、実施例6に本質的に説明されるリンパ管微小血管内皮細胞(LEC)を用いる短期増殖アッセイ法において、VEGF-A依存性の細胞増殖を妨害することができ、特に、VEGF-Aの生物活性を無効にすることができる。

A. 融合ポリペプチドに含まれる例示的な免疫グロブリン
いくつかの態様において、融合ポリペプチドに関して、第1のサブユニットは、VEGF-Aに特異的な完全長免疫グロブリンまたはその抗原結合ドメインを含む。免疫グロブリンは、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4であってよく、優先的にはIgG1である。別の態様において、免疫グロブリンは、VEGF-Aに対するモノクローナル抗体である。このような免疫グロブリンのいくつかの例示的な例には、例えば、ベバシズマブ(商品名アバスチン)およびラニビズマブ(商品名ルセンティス)が含まれる。

B. 融合ポリペプチドに含まれる例示的なリポカリンムテイン
本明細書において使用される場合、「リポカリン」は、複数の(好ましくは4つの)ループによって2つ1組で片端が連結されている複数の(好ましくは8本の)β鎖を含み、それによって結合ポケットを画定している円柱状βプリーツシート超二次構造領域を有する、重量約18〜20kDAの単量体タンパク質と定義される。その他の点では強固なリポカリン骨格におけるループのこの多様性こそが、サイズ、形状、および化学的特徴が異なる標的を収容する能力をそれぞれ有するリポカリンファミリーメンバー間の、種々の異なる結合様式をもたらしている(例えば、Flower, D.R. (1996)、前記; Flower, D.R. et al. (2000)、前記、またはSkerra, A. (2000) Biochim. Biophys. Acta 1482, 337-350に総説がある)。実際、リポカリンファミリーのタンパク質は、幅広いリガンドに結合するように自然に進化しており、それらは、全体的配列保存は異常に低レベルである(多くの場合、20％未満の配列同一性を有する)が、高度に保存された全体的フォールディングパターンは保持している。様々なリポカリンにおける位置間の対応は、当業者に周知である。例えば米国特許第7,250,297号を参照されたい。

上記のように、リポカリンは、その超二次構造、すなわち、4つのループによって2つ1組で片端が連結されている8本のβ鎖を含み、それによって結合ポケットを画定している円柱状βプリーツシート超二次構造領域に基づいて定義されるポリペプチドである。本開示は、本明細書において具体的に開示されるリポカリンムテインに限定されない。この点に関して、本開示は、4つのループによって2つ1組で片端が連結されている8本のβ鎖を含み、それによって結合ポケットを画定している円柱状βプリーツシート超二次構造領域を有するリポカリンムテインであって、該4つのループの少なくとも3つのそれぞれの少なくとも1つのアミノ酸が変異しており、該リポカリンは、検出可能な親和性でAng-2に結合するのに有効である、リポカリンムテインに関する。

1つの特定の態様において、本明細書において開示されるリポカリンムテインは、ヒトリポカリン2のムテインである。本明細書において使用される「ヒトリポカリン2」もしくは「ヒトLcn2」または「ヒトNGAL」という用語は、SWISS-PROT/UniProtデータバンクアクセッション番号P80188の成熟したヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン(NGAL)を意味する。本開示のヒトリポカリン2ムテインは、本明細書において「hNGALムテイン」と呼ばれてもよい。SWISS-PROT/UniProtデータバンクアクセッション番号P80188に示されているアミノ酸配列は、好ましい「参照配列」として使用されてよく、より好ましくは、SEQ ID NO: 1に示すアミノ酸配列が、参照配列として使用される。

いくつかの態様において、検出可能な親和性でAng-2に結合するリポカリンムテインは、別のアミノ酸、例えばセリン残基による、ネイティブシステイン残基のアミノ酸置換を少なくとも1つ含んでよい。いくつかの他の態様において、検出可能な親和性でAng-2に結合するリポカリンムテインは、野生型リポカリンの1つまたは複数のアミノ酸を置換する1つまたは複数の非ネイティブシステイン残基を含んでよい。別の具体的な態様において、本開示によるリポカリンムテインは、システイン残基によるネイティブアミノ酸のアミノ酸置換を少なくとも2つ含み、これによって、1つまたは複数のシステイン架橋を形成する。いくつかの態様において、該システイン架橋は、少なくとも2つのループ領域を連結してよい。これらの領域の定義は、Flower(Flower, 1996、前記、Flower, et al., 2000、前記)およびBreustedt et al.(2005、前記)に従って本明細書において使用される。

ある程度、Ang-2を対象とするか、またはAng-2に特異的である本開示のポリペプチドには、定義済みのタンパク質骨格をベースとする任意の数の特異的結合タンパク質ムテインが含まれる。好ましくは、交換、欠失、または挿入されるヌクレオチドまたはアミノ酸の数は、それぞれ、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個またはそれより多い、例えば25個、30個、35個、40個、45個、または50個であり、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、または11個が好ましく、9個、10個、または11個が、さらにより好ましい。しかし、本開示のリポカリンムテインが、Ang-2に結合する能力を依然として有することが好ましい。

1つの局面において、本開示の融合ポリペプチドは、少なくとも検出可能な親和性でAng-2に結合する様々なリポカリンムテインを含む。この意味で、Ang-2は、参照用の野生型リポカリンの非天然リガンドとみなされ得、ここで、「非天然リガンド」とは、生理的条件下では野生型リポカリンに結合しない化合物を意味する。特定の配列位置における1つまたは複数の変異を用いて野生型リポカリンを操作することによって、本発明者らは、非天然リガンドであるAng-2に対する高い親和性および高い特異性が実現可能であることを実証した。いくつかの態様において、野生型Iリポカリン上の特定の配列位置をコードする1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、またはさらにそれ以上のヌクレオチドトリプレットにおいて、ヌクレオチドトリプレットの部分集合によってこれらの位置を置換することにより、ランダム変異誘発を実施してもよい。

さらに、本開示の融合ポリペプチド含まれるリポカリンムテインは、参照リポカリンの直鎖ポリペプチド配列の特定の配列位置に対応する配列位置の、少なくとも任意の1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、または12個を含む、任意の1つまたは複数において変異アミノ酸残基を有してもよい。

本開示の融合ポリペプチドは、変異アミノ酸配列位置以外に、「親」タンパク質骨格(例えばリポカリン)の野生型(天然)アミノ酸配列を含んでよい。また、いくつかの態様において、本開示の融合ポリペプチドに含まれるリポカリンムテインは、1つの配列位置/複数の配列位置に1つまたは複数のアミノ酸変異を、そのような変異がムテインの結合活性およびフォールディングを少なくとも本質的に妨げもせず、邪魔もしない限りにおいて、保有してよい。このような変異は、確立されている標準的方法(Sambrook, J. et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)を用いて、DNAレベルで非常に容易に遂行することができる。アミノ酸配列の変更の例示的な例は、挿入または欠失、ならびにアミノ酸置換である。このような置換は保存的であることができ、すなわち、あるアミノ酸残基が、特に大きさだけでなく極性に関しても化学的に特性が類似しているアミノ酸残基で置換される。保存的置換の例は、次のグループのメンバー間の置換である:1)アラニン、セリン、およびトレオニン;2)アスパラギン酸およびグルタミン酸;3)アスパラギンおよびグルタミン;4)アルギニンおよびリジン;5)イソロイシン、ロイシン、メチオニン、およびバリン;ならびに6)フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン。その一方で、アミノ酸配列に非保存的変更を導入することも可能である。さらに、単一のアミノ酸残基を置換する代わりに、hNGALの一次構造の1つまたは複数の連続的アミノ酸を挿入するかまたは欠失させることもまた、これらの欠失または挿入の結果、安定なフォールディングされた/機能的ムテイン(例えば、N末端およびC末端が短縮されたhNGALムテイン)が得られる限りにおいて、可能である。このようなムテインでは、例えば、ポリペプチドのN末端またはC末端において、1つまたは複数のアミノ酸残基が付加されているか、または欠失している。通常、このようなムテインは、成熟hNGALのアミノ酸配列との少なくとも約70％(少なくとも約80％を含む)、例えば少なくとも約85％のアミノ酸配列同一性を有し得る。例示的な例として、本開示はまた、成熟ヒトリポカリン2(hNGAL)の直鎖ポリペプチド配列(SEQ ID NO: 1)のアミノ酸残基(Lys-Asp-Pro、位置46〜48)が欠失している、上記に定義したNGALムテインも包含する。

本明細書において開示される融合ポリペプチドに含まれるリポカリンムテインのアミノ酸配列は、他のリポカリンとの配列同一性と比べた場合、参照リポカリンに対して高い配列同一性を有する。この一般的な文脈において、本開示のリポカリンムテインのアミノ酸配列は、参照リポカリンのアミノ酸配列と少なくとも実質的に同様であり、ただし、アミノ酸の付加または欠失の結果であるギャップ(以下に定義する)がアライメント中に存在する可能性があることを条件とする。本開示のリポカリンムテインの各配列は、参照リポカリンの配列と実質的に同様であり、いくつかの態様において、参照リポカリンLの配列に対して、少なくとも70％の同一性もしくは配列相同性、少なくとも75％の同一性もしくは配列相同性、少なくとも80％の同一性もしくは配列相同性、少なくとも82％の同一性もしくは配列相同性、少なくとも85％の同一性もしくは配列相同性、少なくとも87％の同一性もしくは配列相同性、または少なくとも90％の同一性もしくは配列相同性(少なくとも95％の同一性もしくは配列相同性を含む)を有しており、ただし、変更された位置または配列が保持されていること、および1つまたは複数のギャップが存在し得ることを条件とする。

本明細書において使用される場合、結合特異性は絶対的ではなく相対的な特性であるため、本開示の融合ポリペプチドに含まれるリポカリンムテインは、その標的と1種または複数種の参照標的とを見分けることができる場合、標的(例えばAng-2)に「特異的に結合する」。「特異的結合」は、例えば、ウェスタンブロット、ELISA試験、RIA試験、ECL試験、IRMA試験、FACS、IHC、およびペプチドスキャンに基づいて判定することができる。

1つの態様において、本開示のリポカリンムテインは、そのN末端および/またはそのC末端において融合パートナーに融合しており、融合パートナーは、ムテインの血清半減期を延長し得る融合パートナードメインである。別の具体的な態様において、タンパク質ドメインは、免疫グロブリンのFc部分、免疫グロブリンのCH3ドメイン、免疫グロブリンのCH4ドメイン、アルブミン結合ペプチド、またはアルブミン結合タンパク質である。

別の態様において、本開示のリポカリンムテインは、ムテインの血清半減期を延長する化合物にコンジュゲートされている。より好ましくは、ムテインは、ポリアルキレングリコール分子、ヒドロエチルデンプン(hydroethylstarch)、免疫グロブリンのFc部分、免疫グロブリンのCH3ドメイン、免疫グロブリンのCH4ドメイン、アルブミン結合ペプチド、およびアルブミン結合タンパク質からなる群より選択される化合物にコンジュゲートされている。

さらに別の態様において、本開示は、本明細書において開示するムテインを含む融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する。本開示は、該核酸分子を含む宿主細胞を包含する。

1つの局面において、本開示は、Ang-2に結合するリポカリンムテインを含む融合ポリペプチドおよびその有用な用途を提供する。本開示はまた、本明細書において説明するAng-2結合サブユニットを含むそのような融合ポリペプチドならびにそのような融合ポリペプチドを含む組成物を作製する方法も提供する。本開示のAng-2結合サブユニットならびにその組成物は、試料中のAng-2を検出する方法または対象中のAng-2に結合する方法において使用され得る。本開示によって提供される使用に伴うこれらの特徴を有するこのようなヒトリポカリンムテインを含む、このような融合ポリペプチドは、以前に説明されていない。

1. Ang-2に特異的な例示的リポカリンムテイン
1つの局面において、本開示は、Ang-2結合ヒトリポカリン2(ヒトLcn2またはhNGAL)ムテインを含む融合ポリペプチドを提供する。

本開示の1つの態様は、検出可能な親和性で、例えば、約200nM以下、例えば約150nM以下のK_dによって示される親和性で、Ang-2に結合することができるムテインを含む融合ポリペプチドに関する。

1つの局面において、本開示は、例えばBiacore T200装置によって、実施例6に本質的に説明される表面プラズモン共鳴(SPR)に基づくアッセイ法において測定される場合、約5nM以下のK_dでAng-2に結合することができるhNGALムテインを含む融合ポリペプチドを提供する。

いくつかの別の態様において、本開示の融合ポリペプチドに含まれる1種または複数種のhNGALムテインは、ELISAアッセイ法において測定される場合、約5nM以下のEC50値によって示される親和性で、Ang-2に結合することができる。

いくつかの他の態様において、本開示の融合ポリペプチドに含まれる1種または複数種のhNGALムテインは、競合ELISA様式のアッセイ法で測定される場合、約5nM以下のIC50値によって示される親和性で、Ang-2に結合することができる。

いくつかの他の態様において、本開示の融合ポリペプチドに含まれる1種または複数種のhNGALムテインは、細胞に基づく増殖アッセイ法において、約5nM以下のIC50値で、Ang-2によって媒介されるリンパ微小管内皮細胞増殖を阻害するか、または減少させることができる。

いくつかの他の態様において、本開示の融合ポリペプチドに含まれる1種または複数種のhNGALムテインは、ヒトAng-2とマウスAng-2の両方と交差反応性である。いくつかの態様において、1種または複数種のそのようなムテインは、検出可能な親和性で、例えば、約200nM以下、例えば約150nM以下のK_dによって示される親和性で、ヒトAng-2とマウスAng-2の両方に結合することができる。

さらに別のいくつかの態様において、本開示の融合ポリペプチドに含まれる1種または複数種のそのようなムテインは、ELISAアッセイ法において測定される場合、約5nM以下のIC50値によって示される親和性で、マウスAng-2に結合することができる。

さらに別のいくつかの態様において、本開示の融合ポリペプチドに含まれる1種または複数種のそのようなムテインは、競合細胞ECL様式において、ヒトAng-2のhTie-2に対する結合およびマウスAng-2のhTie-2に対する結合をそれぞれ約25nM以下のIC50値で妨害することができる。

いくつかの態様において、本開示の融合ポリペプチドに含まれる1種または複数種のhNGALムテインは、ヒトAng-4と交差反応性ではない。いくつかの態様において、本開示の融合ポリペプチドに含まれる1種または複数種のhNGALムテインは、マウスAng-3と交差反応性ではない。いくつかの態様において、本開示の融合ポリペプチドに含まれる1種または複数種のhNGALムテインは、ヒトVEGF-Aと交差反応性ではない。

これに関して、本開示は、融合ポリペプチドに関し、該融合ポリペプチドは、hNGALムテインを含み、該hNGALは、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列と比較して、配列位置28、36、40、41、49、52、65、68、70、72〜74、77、79、81、87、96、100、103、106、116、125、126、127、129、132、および134に、少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、またはさらにそれ以上の変異アミノ酸残基を含み、かつ該ポリペプチドは、検出可能な親和性でAng-2に結合する。

いくつかの態様において、本開示の融合ポリペプチドに含まれるAng-2結合hNGALムテインは、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列(SEQ ID NO: 1)の配列位置36、40、41、49、52、68、70、72〜73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132、および134の任意の1つまたは複数に、以下の変異アミノ酸残基の1つまたは複数を含む:

。いくつかの態様において、本開示の融合ポリペプチドに含まれるhNGALムテインは、成熟hNGALのこれらの配列位置に、2個またはそれ以上、例えば、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、もしくはさらにそれ以上、またはすべての変異アミノ酸残基を含む。

さらに、本開示の融合ポリペプチドに含まれるAng-2結合hNGALムテインはまた、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列と比較して、以下の置換:

を含んでもよい。

いくつかの追加の態様において、Ang-2に結合する本開示の融合ポリペプチドに含まれるhNGALムテインは、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列と比較して、以下のアミノ酸置換を含む:

。アミノ酸置換のこれらのセットのそれぞれは、Gln28→HisおよびCys87→Serの置換を、更に含んでいてもよい。

残存領域、すなわち、配列位置28、36、40、41、49、52、65、68、70、72〜74、77、79、81、87、96、100、103、106、116、125、126、127、129、132、および134とは異なる領域において、本開示の融合ポリペプチドに含まれるhNGALムテインは、変異アミノ酸配列位置以外に、野生型(天然)アミノ酸配列を含んでよい。

別の具体的な態様において、本開示の融合ポリペプチドに含まれるムテインは、SEQ ID NO: 2、3、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96または97からなる群より選択されるアミノ酸配列またはそれらの機能的な断片もしくは変種を含む。いくつかの態様において、このような断片または変種は、SEQ ID NO: 2、3、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96または97のいずれか1つにおいて定義されるムテインの構造的相同物である。

本開示のAng-2結合hNGALムテインのアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 2、3、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96または97からなる群より選択される配列に対して、高い配列同一性、例えば、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも82％、少なくとも85％、少なくとも87％、少なくとも90％の同一性(少なくとも95％の同一性を含む)を有し得る。

いくつかの別の態様において、ヒトAng-2、および/またはマウスAng-2と交差反応する、本開示の融合ポリペプチドに含まれるhNGALムテインは、SEQ ID NO: 2、3、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96または97およびそれらの機能的な断片または変種からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。

本開示はまた、SEQ ID NO: 2、3、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96または97からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する本開示の融合ポリペプチドに含まれるhNGALムテインの構造的相同物を含み、この構造的相同物は、該hNGALムテインに対して、約60％より高い、好ましくは65％より高い、70％より高い、75％より高い、80％より高い、85％より高い、90％より高い、92％より高い、および最も好ましくは95％より高い、アミノ酸配列相同性または配列同一性を有する。

本開示の融合ポリペプチドに含まれるAng-2結合hNGALムテインは、天然型のヒトリポカリン2（またはhNGAL）の変異誘発によって得ることができる。変異誘発のいくつかの態様において、置換(substitution)(または置換(replacement))は、保存的置換である。それでもなお、非保存的置換または以下の例示的置換からの1つもしくは複数を含む、任意の置換が、次のことを条件として想定される:ムテインがAng-2に結合する能力を保持していること、および/またはムテインが、成熟ヒトリポカリン2のアミノ酸配列(SWISS-PROTデータバンクアクセッション番号P80188)のアミノ酸配列に対して、少なくとも60％、例えば、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、もしくはより高い同一性であるという点で、その時に置換された配列に対して同一性を有すること。

本開示はまた、本明細書において開示する少なくとも1つのAng-2結合hNGALムテインを含む本開示の融合ポリペプチド、または本明細書において説明するそのコンジュゲートもしくは融合タンパク質、および任意で薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物にも関する。

したがって、本開示の融合ポリペプチドに含まれるAng-2結合hNGALムテインは、薬学的に許容される成分ならびに確立された調製方法を用いて、組成物に配合することができる(Gennaro and Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA)。薬学的組成物を調製するために、薬学的に不活性な無機または有機の賦形剤を使用することができる。

C. 本開示の融合ポリペプチドに含まれるムテイン
本開示の融合ポリペプチドとの関連で本明細書において使用される場合、Ang-2に結合するムテインに関して、「に特異的な」という用語は、そのムテインがAng-2を標的とするか、Ang-2に結合するか、またはAng-2と反応することを含む。したがって、標的とすること、結合すること、または反応することは、ムテインがAng-2に特異的に結合することを含む。この文脈において「特異的に」という用語は、ムテインが本明細書において説明するようにAng-2と係合するが、別の標的とは本質的に反応しないことを意味する。ムテインが本明細書において上記に定義したように標的に特異的に結合するかまたは反応するかどうかは、特に、本開示の融合ポリペプチドに含まれるhNGALムテインとAng-2の反応を該ムテインと別の標的の反応と比較することによって、容易に試験することができる。「特異的結合」はまた、例えば、ウェスタンブロット、ELISA試験、RIA試験、ECL試験、IRMA試験、FACS、IHC、およびペプチドスキャンに基づいて判定することもできる。

本開示の融合ポリペプチドに含まれるムテインのアミノ酸配列は、別のリポカリンとの配列同一性と比べた場合、ヒトリポカリン2に対して高い配列同一性を有する(上記も参照されたい)。この一般的文脈において、本開示による組み合わせのムテインのアミノ酸配列は、対応するリポカリン(野生型hNGAL)のアミノ酸配列と少なくとも実質的に類似している。本開示による組み合わせのムテインの各配列は、成熟hNGALの配列と実質的に類似しており、例えば、成熟hNGALの配列に対して、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも82％、少なくとも85％、少なくとも87％、少なくとも90％の同一性(少なくとも95％の同一性を含む)である。これに関して、本開示のムテインは当然、他と比べて、ムテインをAng-2に結合できるようにする本明細書において説明する置換を含んでよい。典型的に、hNGALのムテインは、hNGALのネイティブ配列と比較して、hNGALのリガンド結合部位の開放端にある4つのループ中のアミノ酸の1つまたは複数の変異を含む。上記に説明したように、これらの領域は、Ang-2に対するムテインの結合特異性を定めるにあたってきわめて重要である。hNGALに由来するムテインまたはその相同物は、N末端領域中の、ならびに/または天然の結合ポケットと向かい合って位置しているβバレル構造の末端に並んでいる3つのペプチドループBC、DE、およびFG中の、任意の配列位置に、1個、2個、3個、4個、またはそれ以上の変異アミノ酸残基を有していてよい。

本開示の融合ポリペプチドに含まれるムテインは、対応するネイティブhNGALリポカリンと比較して、1つまたは複数の、例えば、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、またはさらに20個の置換を、そのようなムテインが当然Ang-2に結合できることを条件として、含む。例えば、ムテインは、hNGALの独特な位置に対応する位置に(すなわち、対応する位置に)、置換を有することができる。いくつかの態様において、本開示による組み合わせのムテインは、アルギニン残基によるネイティブアミノ酸の2個、3個、4個、5個、またはさらに多くのアミノ酸置換を含む、少なくとも2個のアミノ酸置換を含む。したがって、本明細書において説明するタンパク質「参照」骨格の核酸は、Ang-2に結合することができるムテインを作製することを目指した変異誘発を受ける。

また、本開示の融合ポリペプチドに含まれるムテインは、ムテインの(その標的、例えばAng-2に結合する)生物活性に影響を及ぼさずに、そのN末端またはC末端、好ましくはC末端に、Strepタグ、例えばStrep IIタグのような異種アミノ酸配列を含むこともできる。

具体的には、野生型hNGALと異なる、本開示の融合ポリペプチドに含まれるムテインのアミノ酸配列のアミノ酸残基が、野生型hNGALのアミノ酸配列の特定の位置に対応するかどうかを判定するために、当業者は、当技術分野において周知の手段および方法、例えば、手作業による、またはBLAST2.0(Basic Local Alignment Search Toolを意味する)もしくはClustalWまたは配列アライメントを作成するのに適している他の任意の適切なプログラムなどのコンピュータープログラムを使用することによる、アライメントを用いることができる。したがって、野生型hNGALは、「対象配列」または「参照配列」の役割を果たすことができ、一方、本明細書において説明する野生型hNGALと異なるムテインのアミノ酸配列は、「問い合わせ配列」の役割を果たす。「参照配列」および「野生型配列」という用語は、本明細書において同義的に使用される。

いくつかの態様において、置換(substitution)(または置換(replacement))は、保存的置換である。それでもなお、非保存的置換または以下に列挙する例示的置換からの1つもしくは複数を含む、任意の置換が、次のことを条件として想定される: 本開示の融合ポリペプチドに含まれるムテインがAng-2に結合する能力を保持していること、および/またはムテインが、「元の」配列に対して、少なくとも60％、例えば、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、もしくはより高い同一性であるという点で、その時に置換された配列に対して同一性を有すること。

一般に、保存的置換は、以下の置換であり、変異させられるアミノ酸に応じて、保存的になるように行うことができる1つまたは複数の置換をそれぞれ続けて記載している:

。他の置換もまた許容され、経験に基づいて、または他の公知の保存的置換もしくは非保存的置換を踏まえて、決定することができる。さらなる方針として、以下の8個のグループはそれぞれ、互いにとっての保存的置換を定めるように典型的に選ぶことができるアミノ酸を含む：
a. アラニン(Ala)、グリシン(Gly);
b. アスパラギン酸(Asp)、グルタミン酸(Glu);
c. アスパラギン(Asn)、グルタミン(Gln);
d. アルギニン(Arg)、リジン(Lys);
e. イソロイシン(Ile)、ロイシン(Leu)、メチオニン(Met)、バリン(Val);
f. フェニルアラニン(Phe)、チロシン(Tyr)、トリプトファン(Trp);
g. セリン(Ser)、トレオニン(Thr);および
h. システイン(Cys)、メチオニン(Met)。

このような置換によって生物活性が変化する場合は、以下のような、またはアミノ酸クラスに関してさらに後述するような、より大幅な(substantial)変更を導入し、それらの産物を所望の特徴を求めてスクリーニングしてもよい。このようなより大幅な変更の例は、

である。

hNGALの生物学的特性の実質的な改変は、(a)例えば、シート状もしくはらせん状の立体構造としての、置換領域のポリペプチド骨格の構造、(b)分子の標的部位における電荷もしくは疎水性、または(c)側鎖のかさ、を維持することに対する影響が顕著に異なる置換を選択することによって、達成される。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて、次のグループに分けられる:(1)疎水性:ノルロイシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン;(2)中性で親水性:システイン、セリン、トレオニン;(3)酸性:アスパラギン(asparitic)酸、グルタミン酸;(4)塩基性:アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジン、アルギニン;(5)鎖の向きに影響する残基:グリシン、プロリン;および(6)芳香族:トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン。

非保存的置換は、これらのクラスのうちの1つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。hNGALの適切な立体構造を維持するのに関与していない任意のシステイン残基を、通常はセリンで置換して、分子の酸化安定性を向上させ、異常な架橋を防止することもできる。逆に、システイン結合を追加して安定性を向上させてもよい。

上記の挿入を含む任意の変異は、確立されている標準的方法を用いて、核酸、例えばDNAレベルで、非常に容易に達成することができる。アミノ酸配列の変更の例示的な例は、挿入または欠失、ならびにアミノ酸置換である。このような置換は保存的であることができ、すなわち、あるアミノ酸残基が、特に大きさだけでなく極性に関しても化学的に特性が類似しているアミノ酸残基で置換される。保存的置換の例は、次のグループのメンバー間の置換である:1)アラニン、セリン、およびトレオニン;2)アスパラギン酸およびグルタミン酸;3)アスパラギンおよびグルタミン;4)アルギニンおよびリジン;5)イソロイシン、ロイシン、メチオニン、およびバリン;ならびに6)フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン。その一方で、アミノ酸配列に非保存的変更を導入することも可能である。さらに、単一のアミノ酸残基を置換する代わりに、hNGALの一次構造の1つまたは複数の連続的アミノ酸を挿入するかまたは欠失させることもまた、これらの欠失または挿入の結果、安定なフォールディングされた/機能的ムテインが得られる限りにおいて、可能である。

アミノ酸配列の改変には、特定の制限酵素のための切断部位を組み入れることにより、変異したhNGAL遺伝子またはその一部分のサブクローニングを容易にするための、単一のアミノ酸位置を指定した(directed)変異誘発が含まれる。さらに、これらの変異は、Ang-2のような所与の標的に対するムテインの親和性をさらに向上させるために組み入れることもできる。さらに、変異は、必要に応じて、ムテインのいくつかの特徴を変えるため、例えば、フォールディング安定性、血清安定性、タンパク質耐性、もしくは水溶性を向上させるため、または凝集傾向を小さくするために、導入することもできる。例えば、天然に存在するシステイン残基を他のアミノ酸に変異させて、ジスルフィド架橋の形成を防ぐことができる。また、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)、ヒドロキシエチルデンプン(HES)、ビオチン、ペプチド、もしくはタンパク質などの他の化合物に結合させるため、または天然に存在しないジスルフィド結合を形成させるために、新しい反応性基を導入することを目的として、他のアミノ酸配列位置をシステインに故意に変異させることも可能である。生成されたチオール部分は、例えば、各ムテインの血清半減期を長くするために、ムテインをPEG化またはHES化するのに使用され得る。

また、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)、ヒドロキシエチルデンプン(HES)、ビオチン、ペプチド、もしくはタンパク質などの他の化合物にコンジュゲートさせるため、または天然に存在しないジスルフィド結合を形成させるために、新しい反応性基を導入することを目的として、他のアミノ酸配列位置をシステインに変異させることも可能である。

いくつかの態様において、上記の部分の1つが本開示の融合ポリペプチドに含まれるムテインにコンジュゲートされる場合、アミノ酸側鎖へのコンジュゲーションが有利であり得る。適切なアミノ酸側鎖は、hNGALのアミノ酸配列中に天然に存在する場合があり、または変異誘発によって導入されてもよい。適切な結合部位を変異誘発によって導入する場合、1つの実行可能な手段は、適切な位置のアミノ酸をシステイン残基によって置換することである。

本開示の融合ポリペプチドに含まれるヒトリポカリン2のムテインに関して、ヒトリポカリン2ムテインを含むリポカリンのアミノ酸配列にシステイン残基を導入するためのこのような変異の例示的な実行可能な手段(possibilities)には、ヒトNGALの野生型配列の配列位置14、21、60、84、88、116、141、145、143、146、または158に対応する配列位置の少なくとも1つにおける、システイン(Cys)残基の導入が含まれる。SWISS-PROT/UniProtデータバンクアクセッション番号P80188の配列と比較して、システインが別のアミノ酸残基によって置換された配列を、本開示のヒトリポカリン2ムテインが有するいくつかの態様において、対応するそのシステインは、その配列に再導入されてもよい。例示的な例として、アミノ酸位置87のシステイン残基は、SWISS-PROTアクセッション番号P80188の配列中に当初存在していたようにシステインに戻すことによって、そのような場合に導入され得る。アミノ酸位置14、21、60、84、88、116、141、145、143、146、および/または158のいずれかの側面に生成されたチオール部分は、例えば、各ヒトリポカリン2ムテインの血清半減期を長くするために、ムテインをPEG化またはHES化するのに使用され得る。

別の態様において、本開示の融合ポリペプチドに含まれるムテインに上記の化合物の1つをコンジュゲートさせるのに適切なアミノ酸側鎖を提供するために、人工アミノ酸が変異誘発によって導入されてもよい。一般に、このような人工アミノ酸は、反応性がより高くなるように、したがって、所望の化合物へのコンジュゲーションを促進するように、設計されている。人工tRNAを介して導入され得るそのような人工アミノ酸の1つの例は、パラ-アセチル-フェニルアラニンである。

いくつかの態様において、本開示の融合ポリペプチドに含まれるムテインは、そのN末端またはそのC末端において、タンパク質、タンパク質ドメイン、またはペプチド、例えば、シグナル配列および/またはアフィニティータグに融合されてよい。

Strepタグ(登録商標)もしくはStrepタグ(登録商標)II(Schmidt, T.G.M. et al. (1996) J. Mol. Biol. 255, 753-766)、mycタグ、FLAGタグ、His6タグ、もしくはHAタグなどのアフィニティータグ、または組換えタンパク質の容易な検出および/もしくは精製を同じく可能にするグルタチオン-S-トランスフェラーゼのようなタンパク質は、適切な融合パートナーのさらなる例である。最後に、緑色蛍光タンパク質(GFP)または黄色蛍光タンパク質(YFP)などの発色特性または蛍光特性を有するタンパク質も、同様に本開示のムテインにとって適切な融合パートナーである。

一般に、化学反応、物理反応、光学的反応、または酵素反応において検出可能な化合物またはシグナルを直接的にまたは間接的に生じる任意の適切な化学物質または酵素で本開示の融合ポリペプチドに含まれるムテインを標識することが可能である。物理的反応および同時に光学的反応/マーカーの例は、放射性標識を用いる場合にX線を照射または放射された際の蛍光発光である。アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、およびβ-ガラクトシダーゼは、発色性反応生成物の形成を触媒する酵素標識(同時に光学的標識)の例である。一般に、抗体に対して通常使用される標識すべて(免疫グロブリンのFc部分の糖部分と共にもっぱら使用されるものを除く)もまた、本開示の融合ポリペプチドに含まれるムテインにコンジュゲートさせるために使用され得る。本開示の融合ポリペプチドに含まれるムテインはまた、例えば、任意の適切な治療活性を有する作用物質を所与の細胞、組織、もしくは器官に狙いを定めて送達するため、または周囲の正常細胞に影響を及ぼさずに細胞、例えば腫瘍細胞を選択的に標的とするために、そのような作用物質とコンジュゲートさせることもできる。このような治療活性を有する作用物質の例には、放射性核種、毒素、有機低分子、および治療用ペプチド(例えば、細胞表面受容体のアゴニスト/アンタゴニストとして作用するペプチドまたは所与の細胞標的上のタンパク質結合部位を得るために競合するペプチド)が含まれる。しかしながら、本開示の融合ポリペプチドに含まれるムテインはまた、アンチセンス核酸分子、低分子干渉RNA、マイクロRNA、またはリボザイムなどの治療活性を有する核酸とコンジュゲートさせることもできる。このようなコンジュゲートは、当技術分野において周知の方法によって作製することができる。

先に示したように、いくつかの態様において、本開示の融合ポリペプチドに含まれるムテインは、ムテインの血清半減期を延長する部分にコンジュゲートされ得る(この点に関して、このようなコンジュゲーション戦略が、CTLA-4に対する結合親和性を有するヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリンのムテインに関して説明されているPCT公報WO 2006/56464も参照されたい)。血清半減期を延長する部分は、ほんの少し挙げると、ポリアルキレングリコール分子、ヒドロキシエチルデンプン、パルミチン酸のような脂肪酸分子(Vajo & Duckworth 2000, Pharmacol. Rev. 52, 1-9)、免疫グロブリンのFc部分、免疫グロブリンのCH3ドメイン、免疫グロブリンのCH4ドメイン、アルブミン結合ペプチド、またはアルブミン結合タンパク質、トランスフェリンであってよい。アルブミン結合タンパク質は、細菌アルブミン結合タンパク質、抗体、ドメイン抗体を含む抗体断片(例えば、米国特許第6,696,245号を参照されたい)、またはアルブミンに対する結合活性を有するムテインであってよい。したがって、本開示の融合ポリペプチドに含まれるムテインの半減期を延長するための適切なコンジュゲーションパートナーには、アルブミン結合タンパク質、例えば、連鎖球菌プロテインGの1種のような細菌アルブミン結合ドメイン(Konig, T., & Skerra, A. (1998) J. Immunol. Methods 218, 73-83)が含まれる。コンジュゲーションパートナーとして使用され得るアルブミン結合ペプチドの他の例は、例えば、米国特許出願第2003/0069395号(その全体が参照により本明細書に組み入れられる)またはDennis et al. (Dennis, M. S., Zhang, M., Meng, Y. G., Kadkhodayan, M., Kirchhofer, D., Combs, D. & Damico, L. A. (2002) J Biol Chem 277, 35035-35043)において説明されているように、Cys-Xaa₁-Xaa₂-Xaa₃-Xaa₄-Cysコンセンサス配列[式中、Xaa₁はAsp、Asn、Ser、Thr、またはTrpであり;Xaa₂はAsn、Gln、His、Ile、Leu、またはLysであり;Xaa₃は Ala、Asp、Phe、Trp、またはTyrであり;かつXaa₄はAsp、Gly、Leu、Phe、Ser、またはThrである]を有するものである。

他の態様において、アルブミンそれ自体(Osborn, B.L. et al., 2002, J. Pharmacol. Exp. Ther. 303, 540-548)またはアルブミンの生物活性断片は、本開示の融合ポリペプチドに含まれるムテインのコンジュゲーションパートナーとして使用され得る。「アルブミン」という用語は、ヒト血清アルブミンまたはウシ血清アルブミンもしくはラットアルブミンなどの哺乳動物アルブミンすべてを含む。アルブミンまたはその断片は、米国特許第5,728,553号または欧州特許出願EP0330451およびEP0361991(その全体が参照により本明細書に組み入れられる)において説明されているように組換えによって作製することができる。組換えヒトアルブミン(リコンブミン(Recombumin)(登録商標))Novozymes Delta Ltd. (Nottingham, UK)が、本開示のムテインの半減期を延長するために、このムテインにコンジュゲートまたは融合され得る。

アルブミン結合タンパク質が抗体断片である場合、それはドメイン抗体であってよい。ドメイン抗体(dAb)を操作して、生物物理学的特性およびインビボ半減期の正確な制御を可能にして、最適な安全性および有効性の生成物プロファイルを作り出す。例えば、ドメイン抗体は、Domantis Ltd.(Cambridge, UKおよびMA, USA)から市販されている。

本開示の融合ポリペプチドに含まれるムテインの血清半減期を延長するための部分としてトランスフェリンを用いて、非グリコシル化トランスフェリンのN末端もしくはC末端または両方にムテインを遺伝学的に融合させることができる。非グリコシル化トランスフェリンの半減期は14〜17日であり、トランスフェリン融合タンパク質は、延長された半減期を同様に有すると考えられる。また、トランスフェリン担体は、高度な生物学的利用能、体内分布、および循環血中安定性も与える。この技術は、BioRexis(BioRexis Pharmaceutical Corporation, PA, USA)から市販されている。タンパク質安定化物質/半減期延長パートナーとして使用するための組換えヒトトランスフェリン(デルタフェリン(DeltaFerrin)(商標))もまた、Novozymes Delta Ltd.(Nottingham, UK)から市販されている。

免疫グロブリンのFc部分が、本開示の融合ポリペプチドに含まれるムテインの血清半減期を延長する目的で使用される場合、Syntonix Pharmaceuticals, Inc(MA, USA)から市販されているSynFusion(商標)技術が使用され得る。このFc融合技術の使用により、より長い時間作用する生物薬剤を作ることが可能になり、例えば、薬物動態、溶解度、および製造効率を向上させるために抗体のFc領域に連結されたムテインの2つのコピーからなり得る。

本開示のムテインの半減期を延長するためのさらに別の代替方法は、ムテインのN末端またはC末端に、長くて明確な構造を持たず柔軟なグリシンリッチ配列(例えば、約20〜80個の連続したグリシン残基を有するポリグリシン)を融合することである。例えばWO2007/038619において開示されているこのアプローチは、「rPEG」(recombinant PEG)とも呼ばれている。

ポリアルキレングリコールがコンジュゲーションパートナーとして使用される場合、このポリアルキレングリコールは、置換型、非置換型、直鎖状、または分枝状であることができる。また、これは、活性化ポリアルキレン誘導体であってもよい。適切な化合物の例は、インターフェロンに関してWO 99/64016、米国特許第6,177,074号、もしくは米国特許第6,403,564号において説明されているか、またはPEG修飾アスパラギナーゼ、PEG-アデノシンデアミナーゼ(PEG-ADA)、もしくはPEG-スーパーオキシドジスムターゼなどの他のタンパク質に関して説明されている(例えば、Fuertges et al. (1990) The Clinical Efficacy of Poly(Ethylene Glycol)-Modified Proteins J. Control. Release 11, 139-148を参照されたい)、ポリエチレングリコール(PEG)分子である。ポリエチレングリコールのようなこのようなポリマーの分子量は、約300〜約70,000ダルトンに及んでよく、例えば、分子量が約10,000ダルトン、約20,000ダルトン、約30,000ダルトン、または約40,000ダルトンのポリエチレングリコールが含まれる。さらに、例えば米国特許第6,500,930号または同第6,620,413号で説明されているように、デンプンまたはヒドロキシエチルデンプン(HES)などの炭水化物オリゴマーおよび炭水化物ポリマーを、血清半減期を延長する目的で本開示のムテインにコンジュゲートさせることができる。

さらに、本明細書において開示する融合ポリペプチドに含まれるムテインは、酵素活性または他の分子に対する結合親和性などの新しい特徴を本開示のムテインに与え得る部分に融合されてもよい。適切な融合パートナーの例は、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、プロテインGのアルブミン結合ドメイン、プロテインA、抗体断片、オリゴマー形成ドメイン、または毒素である。

特に、本明細書において開示する融合ポリペプチドに含まれるムテインを別々の酵素活性部位と融合し、その結果、得られた融合タンパク質の両方の「構成要素」が、所与の治療標的に対して一緒に作用するようにすることが可能である場合がある。本開示の融合ポリペプチドに含まれるムテインの結合ドメインが、疾患の原因となる標的に結合して、酵素ドメインが標的の生物学的機能を無効にすることを可能にする。

本開示はまた、本開示の融合ポリペプチドに含まれるムテインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子(DNAおよびRNA)にも関する。遺伝コードの縮重により、いくつかのコドンが、同じアミノ酸を指定する他のコドンによって置換されることが可能であるため、本開示は、本明細書において説明するムテインをコードするある特定の核酸分子に限定されず、機能的ムテインをコードするヌクレオチド配列を含むあらゆる核酸分子を包含する。これに関して、本開示は、本開示の融合ポリペプチドに含まれるいくつかのムテインをコードする、SEQ ID NO: 72〜85に示すヌクレオチド配列を提供する。

本開示の1つの態様において、方法は、ヒトNGALの直鎖ポリペプチド配列(SEQ ID NO: 1)の配列位置28、36、40、41、49、52、65、68、70、72〜74、77、79、81、87、96、100、103、106、116、125、126、127、129、132、および134に対応する配列位置の少なくとも1個、またはさらにそれ以上をコードするヌクレオチドトリプレットにおける変異誘発に、核酸分子を供する段階を含む。

本開示はまた、実験による変異誘発で指定された配列位置以外にその他の変異を含む本開示の融合ポリペプチドに含まれるムテインをコードする核酸分子も含む。このような変異は、許容されることが多いか、または有利であることが判明する場合さえあり、例えば、それらの変異がムテインのフォールディング効率、血清安定性、熱安定性、またはリガンド結合親和性の向上に寄与する場合がそうである。

本出願において開示する核酸分子は、この核酸分子の発現を可能にするために1つの調節配列(または複数の調節配列)に「機能的に連結され」てよい。

DNAのような核酸分子は、転写調節および/または翻訳調節に関する情報を含む配列エレメントを含み、そのような配列が、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に「機能的に連結され」ている場合、「核酸分子を発現させることができる」または「ヌクレオチド配列の発現を可能にする」ことができると呼ばれる。機能的な連結とは、調節配列エレメントおよび発現されるべき配列が、遺伝子発現を可能にするように結合されている連結である。遺伝子発現に必要な調節領域の厳密な性質は、種によって様々であり得るが、一般に、これらの領域はプロモーターを含み、プロモーターは、原核生物では、両方のプロモーター、すなわち、転写開始を指示するDNAエレメント、ならびにRNAに転写されると翻訳開始の合図を出すと考えられるDNAエレメントをそれ自体が含む。通常、このようなプロモーター領域は、原核生物の-35/-10ボックスおよびシャイン・ダルガノエレメント、または真核生物のTATAボックス、CAAT配列、および5'キャッピングエレメントなどの、転写および翻訳の開始に関与する5'非コード配列を含む。また、これらの領域は、エンハンサーエレメントまたはリプレッサーエレメント、ならびにネイティブなポリペプチドを宿主細胞の特定の区画にターゲティングするための翻訳されたシグナル配列およびリーダー配列も含み得る。

さらに、3'非コード配列は、転写終結またはポリアデニル化などに関与している調節エレメントを含み得る。しかしながら、これらの終結配列が、特定の宿主細胞において充分に機能的ではない場合、それらは、その細胞において機能的なシグナルで置換されてよい。

したがって、本開示の核酸分子は、プロモーター配列のような調節配列を含むことができる。いくつかの態様において、本開示の核酸分子は、プロモーター配列および転写終結配列を含む。例えば、適切な原核生物プロモーターは、tetプロモーター、lacUV5プロモーター、またはT7プロモーターである。真核細胞における発現に有用なプロモーターの例は、SV40プロモーターまたはCMVプロモーターである。

本開示の核酸分子はまた、ベクターまたは他の任意の種類のクローニングビヒクル、例えば、プラスミド、ファージミド、ファージ、バキュロウイルス、コスミド、もしくは人工染色体の一部分であることもできる。

1つの態様において、核酸分子はファスミドに含まれている。ファスミドベクターとは、関心対象のcDNAに融合されたM13またはf1などの溶原性(temperent)ファージの遺伝子間領域またはその機能的部分をコードするベクターを意味する。細菌宿主細胞にそのようなファージミドベクターおよび適切なヘルパーファージ(例えば、M13K07、VCS-M13、またはR408)を重感染させた後に、無傷のファージ粒子が生産され、それによって、コードされた異種cDNAを、ファージ表面に提示された対応するポリペプチドに物理的に結び付けることが可能になる(例えば、Lowman, H.B. (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 401-424、またはRodi, D.J., and Makowski, L. (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 10, 87-93を参照されたい)。

このようなクローニングビヒクルは、前述の調節配列および本明細書において説明するムテインをコードする核酸配列とは別に、発現に使用される宿主細胞と適合性のある種に由来する複製配列および制御配列、ならびに形質転換された細胞または形質移入された細胞に選択可能な表現型を与える選択マーカーを含むことができる。多数の適切なクローニングベクターが当技術分野において公知であり、市販されている。

本明細書において説明する融合ポリペプチドに含まれるムテインをコードするDNA分子、特に、そのようなムテインのコード配列を含むクローニングベクターを、その遺伝子を発現することができる宿主細胞に形質転換させることができる。形質転換は、標準的技術を用いて実施することができる。したがって、本開示は、本明細書において開示する核酸分子を含む宿主細胞も対象としている。

形質転換された宿主細胞は、本開示の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を発現するのに適した条件下で培養される。適切な宿主細胞は、大腸菌(Escherichia coli(E. coli))もしくは枯草菌(Bacillus subtilis)などの原核性であるか、またはサッカロミセス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、SF9昆虫細胞もしくはHigh5昆虫細胞、不死化哺乳動物細胞株(例えば、HeLa細胞もしくはCHO細胞)、もしくは初代哺乳動物細胞などの真核性であることができる。

また、本開示は、本明細書において説明する融合ポリペプチドに含まれるムテインを産生するための方法であって、ムテインもしくはポリペプチド、ムテインの断片、またはムテインの融合タンパク質が、そのムテインまたはポリペプチドをコードする核酸から出発して、遺伝子操作方法により産生される、方法にも関する。この方法は、インビボで実施することができ、例えば、ムテインまたはポリペプチドを、細菌宿主生物または真核性宿主生物において産生し、次いで、この宿主生物またはその培養物から単離することができる。また、例えば、インビトロの翻訳系を用いて、タンパク質をインビトロで産生することも可能である。

インビボで本開示の融合ポリペプチドに含まれるムテインを産生する場合、そのようなムテインまたはポリペプチドをコードする核酸は、(前の部分で既に概説したように)組換えDNA技術を用いて適切な細菌宿主生物または真核性宿主生物中に導入される。この目的のために、宿主細胞は最初に、確立された標準的方法を用いて、本明細書において説明するムテインをコードする核酸分子を含むクローニングベクターで形質転換される。次いで、宿主細胞は、異種DNAの発現、したがって対応するポリペプチドの合成の発現を可能にする条件下で培養される。続いて、そのポリペプチドが、細胞または培養培地のいずれかから回収される。

いくつかの態様において、本出願において開示するDNAのような核酸分子は、本開示の融合タンパク質の発現を可能にするように、本開示の別の核酸分子に「機能的に連結され」てよい。これに関して、機能的な連結とは、第1の核酸分子の配列エレメントおよび第2の核酸分子の配列エレメントが、単一のポリペプチドとして融合タンパク質を発現することを可能にするように結合されている連結である。

さらに、いくつかの態様において、Cys76とCys175の間に天然に存在するジスルフィド結合が、本開示の融合ポリペプチドに含まれるhNGALムテインにおいて除かれてもよい。したがって、そのようなムテインは、還元性の酸化還元環境を有する細胞区間、例えば、グラム陰性細菌の細胞質において作製され得る。

本開示の融合ポリペプチドに含まれるムテインが分子内ジスルフィドを含む場合、適切なシグナル配列を用いて、酸化性の酸化還元環境を有する細胞区間に新生ポリペプチドを向かわせることが好ましい場合がある。このような酸化性環境は、大腸菌のようなグラム陰性細菌の周辺質によって、グラム陽性細菌の細胞外環境において、または真核細胞の小胞体の内腔において提供され得、通常、構造的なジスルフィド結合の形成を促進する。

しかしながら、宿主細胞、好ましくは大腸菌のサイトゾルにおいて本開示の融合ポリペプチドに含まれるムテインを作製することもまた可能である。この場合、ムテインまたはポリペプチドは、可溶性の折り畳まれた状態で直接的に獲得され得るか、または封入体の形態で回収され、続いてインビトロで復元され得る。別の選択肢は、酸化性の細胞内環境を有しており、したがって、サイトゾルでのジスルフィド結合形成を可能にし得る特定の宿主株を使用することである(Venturi et al. (2002) J. Mol. Biol. 315, 1-8.)。

しかしながら、本明細書において説明するムテインまたは融合ポリペプチドに含まれるポリペプチドは、必ずしも、遺伝子工学だけを用いて生成または作製しなくてもよい。もっと正確に言えば、このようなムテインまたはポリペプチドは、メリフィールド固相ポリペプチド合成のような化学合成によって、またはインビトロの転写および翻訳によって得ることもできる。例えば、分子モデリングを用いて有望な変異を特定し、次いで、求められている(設計された)ポリペプチドをインビトロで合成し、Ang-2に対する結合活性を調査することが可能である。タンパク質を固相合成および/または溶相合成するための方法は、当技術分野において周知である(例えば、Bruckdorfer, T. et al. (2004) Curr. Pharm. Biotechnol. 5, 29-43を参照されたい)。

別の態様において、本開示のムテインまたは融合ポリペプチドに含まれるポリペプチドは、当業者に公知の十分に確立した方法を用いるインビトロの転写/翻訳によって作製され得る。

熟練した研究者は、本開示によって企図されるが、そのタンパク質配列または核酸配列が本明細書において明確に開示されない融合ポリペプチドに含まれるムテインまたはそのポリペプチドを調製するのに有用な方法を認識するであろう。概要として、アミノ酸配列のこのような改変には、例えば、特定の制限酵素のための切断部位を組み入れることにより、変異したhNGAL遺伝子またはその一部分のサブクローニングを容易にするための、単一のアミノ酸位置を指定した(directed)変異誘発が含まれる。さらに、これらの変異は、その標的(例えば、それぞれAng-2またはAng-1)に対するムテインの親和性をさらに向上させるために組み入れることもできる。さらに、変異は、必要に応じて、ムテインのいくつかの特徴を変えるため、例えば、フォールディング安定性、血清安定性、タンパク質耐性、もしくは水溶性を向上させるため、または凝集傾向を小さくするために、導入することもできる。例えば、天然に存在するシステイン残基を他のアミノ酸に変異させて、ジスルフィド架橋の形成を防ぐことができる。

本明細書において開示する融合ポリペプチドに含まれるムテインまたはそのポリペプチドおよびそれらの誘導体は、抗体またはその断片と同様の多くの分野で使用され得る。例えば、ムテインは、酵素、抗体、放射性物質、または生化学的活性もしくは所定の結合特徴を有する他の任意の基で標識するために使用することができる。そうすることによって、それらの各標的またはそのコンジュゲートもしくは融合タンパク質を検出するか、またはそれらと接触させることができる。さらに、本開示のムテインまたはそのポリペプチドは、確立された分析方法(例えば、ELISAもしくはウェスタンブロット)を用いて、または顕微鏡検査もしくは免疫検知法(immunosensorics)によって、化学構造を検出するのに役立つことができる。これに関して、検出シグナルは、適切なムテインコンジュゲートもしくは融合タンパク質を用いて直接的に、または抗体を介して、結合したムテインを免疫化学的に検出することによって間接的に、生成させることができる。

本開示のその他の目的、利点、および特徴は、限定することを意図しない以下の実施例およびその添付図面を考察すると、当業者に明らかになるであろう。したがって、本開示は例示的な態様および任意の特徴によって具体的に開示されるが、本明細書において開示されその中で具体化される開示内容の修正および変更を当業者は行ってもよいこと、ならびにそのような修正および変更が本開示の範囲内であるとみなされることを理解すべきである。

D. 融合タンパク質の例示的使用、用途、および産生
血管新生には、正常内皮細胞の表面の受容体に血管内皮増殖因子(VEGF)のようなシグナル伝達分子が結合することが必要である。VEGFおよび他の内皮増殖因子が内皮細胞上のそれらの受容体に結合すると、新しい血管の成長および存続を促進する、これらの細胞内のシグナルが働き出す(initiated)。有効な抗血管新生治療様式の開発への1つのアプローチは、血管新生に関与している様々な標的、好ましくは、十分に離れたシグナル伝達経路に影響を与える標的に作用する作用物質を組み合わせることであった。

したがって、本開示は、2つのサブユニットを含む融合ポリペプチドの使用を包含し、その際、第1のサブユニットは、VEGF-Aに特異的な免疫グロブリンまたはその機能的断片を含み、第2のサブユニットは、Ang-2に特異的なhNGALムテインを含む。いくつかの態様において、融合ポリペプチドは、新しい血管の成長および存続を促進するこのようなシグナルのうちの少なくとも1つを妨害する能力を有するか、または妨害するのに寄与する能力を有する。

いくつかのさらなる態様において、融合ポリペプチドは、1種または複数種のさらなる抗血管新生剤と組み合わせて使用される。本明細書において使用される場合、「抗血管新生剤」とは、そのようなシグナル伝達分子の1つがその受容体に結合するのを阻害または邪魔することができる、任意の物質を意味する。いくつかの態様において、抗血管新生剤は、新しい血管の成長および存続を促進するシグナルの1つを妨害することができるか、または妨害するのに寄与する。

いくつかの具体的な態様において、そのようなさらなる抗血管新生剤は、(i)Ang-1、Ang-3、Ang-4、および/またはTie-2のアンタゴニスト;(ii)Fltl、KDR、Flt4、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、PIGF、および/またはEG-VEGFのアンタゴニスト;(iii)デルタ様リガンド4(DLL4、血管特異的ノッチ(Notch)リガンド)アンタゴニスト;(iv)上皮増殖因子受容体(EGFR)アンタゴニスト、ならびに(v)サイトカイン阻害剤を含む。

いくつかの別の態様において、DLL4アンタゴニストは、抗DLL4抗体(例えば、米国特許出願第2009/0142354号で開示されているREGN421などの抗DLL4抗体)であってよい。いくつかの別の態様において、EGFRアンタゴニストは、抗EGFR抗体またはEGFR活性の低分子阻害剤であってよい。本開示の抗Ang-2 hNGALムテインと組み合わせて有益に投与され得る他の抗血管新生剤には、低分子サイトカイン阻害剤を含むサイトカイン阻害剤、ならびにIL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18などのサイトカインおよび/またはそれらの各受容体に結合する抗体が含まれる。

これに関して、本開示はまた、本明細書において言及する融合ポリペプチドのいずれか、およびDLL4、EGFR、または前述のサイトカインのいずれかの1種または複数種に対するアンタゴニストのような抗血管新生剤を含む、治療的組み合わせも含み、その際、アンタゴニストは、アプタマー、アンチセンス分子、リボザイム、siRNA、ペプチボディ、ナノボディ、抗体、抗体断片(例えば、Fab断片;F(ab')₂断片;Fd断片;Fv断片;scFv;dAb断片;人工的に設計した(engineered)分子(ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、および最小認識単位など);抗ウイルス剤、抗生物質、鎮痛薬、コルチコステロイド、および/または非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)であってよい。

いくつかの態様において、前記人工的に設計した分子は、EGF様ドメイン、クリングルドメイン、フィブロネクチンI型ドメイン、フィブロネクチンII型ドメイン、フィブロネクチンIII型ドメイン、PANドメイン、G1aドメイン、SRCRドメイン、クニッツ/ウシ膵臓トリプシンインヒビタードメイン、テンダミスタット、カザル型セリンプロテアーゼインヒビタードメイン、トレフォイル(P型)ドメイン、フォン・ウィルブランド因子C型ドメイン、アナフィラトキシン様ドメイン、CUBドメイン、チログロブリンI型リピート、LDL受容体クラスAドメイン、スシ(Sushi)ドメイン、リンク(Link)ドメイン、トロンボスポンジンI型ドメイン、免疫グロブリンドメインもしくは免疫グロブリン様ドメイン(例えば、ドメイン抗体もしくはラクダ重鎖抗体)、C型レクチンドメイン、MAMドメイン、フォン・ウィルブランド因子A型ドメイン、ソマトメジンBドメイン、WAP型4ジスルフィドコアドメイン、F5/8 C型ドメイン、ヘモペキシンドメイン、SH2ドメイン、SH3ドメイン、ラミニン型EGF様ドメイン、C2 ドメイン、「カッパボディ」(Ill. et al. “Design and construction of a hybrid immunoglobulin domain with properties of both heavy and light chain variable regions” Protein Eng 10:949-57 (1997))、「ミニボディ」(Martin et al. “The affinity-selection of a minibody polypeptide inhibitor of human interleukin-6” EMBO J 13:5303-9 (1994))、「ダイアボディ」(Holliger et al. “‘Diabodies’: small bivalent and bispecific antibody fragments” PNAS USA 90:6444-6448 (1993))、「ジャヌシン(janusin)」(Traunecker et al. “Bispecific single chain molecules (Janusins) target cytotoxic lymphocytes on HIV infected cells” EMBO J 10:3655-3659 (1991)およびTraunecker et al. “Janusin: new molecular design for bispecific reagents” Int J Cancer Suppl 7:51-52 (1992)、ナノボディ、アドネクチン、テトラネクチン、マイクロボディ、アフィリン、アフィボディ、アンキリン、クリスタリン、ノッティン、ユビキチン、亜鉛フィンガータンパク質、自家蛍光タンパク質、アンキリンもしくはアンキリンリピートタンパク質もしくはロイシンリッチリピートタンパク質、またはアビマー (Silverman, Lu Q, Bakker A, To W, Duguay A, Alba BM, Smith R, Rivas A, Li P, Le H, Whitehorn E, Moore KW, Swimmer C, Perlroth V, Vogt M, Kolkman J, Stemmer WP 2005, Nat Biotech, Dec;23(12):1556-61, E-Publication in Nat Biotech. 2005 Nov 20 edition)であってよい。

本開示の1種または複数種の付加的な作用物質と組み合わせる場合、本開示の融合ポリペプチドは、他の作用物質の投与の前に、同時に(例えば、同じ製剤中もしくは別々の製剤中)、または後に、投与されてよい。融合ポリペプチドおよび抗血管新生剤は、並行投与、同時投与、または順次投与を含めて、組み合わせで投与されてよい。いくつかの態様において、本開示の組み合わせ、本開示の融合ポリペプチド、および抗血管新生剤は、投与され得る単一の組成物中に含まれてよい。組成物は、少なくとも1種の薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤、または担体と一緒に、有効成分としての有効量の本開示の融合ポリペプチドおよび抗血管新生剤を含んでよい。これに関して、本開示の組み合わせは、薬学的に許容される成分ならびに確立された調製方法を用いて、組成物に配合することができる(Gennaro and Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA)。薬学的組成物を調製するために、薬学的に不活性な無機または有機の賦形剤を使用することができる。

本開示の融合ポリペプチドおよび抗血管新生剤はまた、個別に間隔をあけた独立した時点における投与を含めて、相互に独立して投与されてもよい。本開示の融合ポリペプチドと抗血管新生剤の組み合わせは、様々な形態および任意の方針(orientation)で提供されてよい。

本開示の融合ポリペプチドおよびその組み合わせはまた、放射線治療および/または従来の化学療法も含む治療計画の一環として投与されてもよい。

いくつかの具体的な態様において、抗血管新生剤は、VEGF/VEGF受容体系およびアンギオポエチン/Tie-2受容体系の任意の構成要素;すなわち、Fltl、KDR、Flt4、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、PIGF、EG-VEGF、Ang-1、Ang-2、Ang-3、Ang-4、またはTie-2のいずれか1つに対するアンタゴニストである。VEGF-VEGFR経路およびTie-2経路は、インビボの血管新生の過程に不可欠な2つの独立した媒体とみなされるべきである(Siemeister, G., et al., Cancer Res. 59:3 (1999) 3185-91; Jendreyko, N., et al., Journal of Biological Chemistry, 278:47812-47819 (2003); Jendreyko, N., et al., PNAS, 102:8293-8298 (2005))。

いくつかの態様において、本開示は、対象における無秩序な血管新生を阻害するための、(i)本開示の融合ポリペプチドおよび(ii)1種または複数種の抗血管新生剤の使用を包含する。このような使用は、有効量の(i)本開示の融合ポリペプチドおよび(ii)1種または複数種の抗血管新生剤を対象に投与する段階を含む。

同様に、本開示は、対象における無秩序な血管新生に関連している疾患または障害の治療、予防、または改善のための、(i)本開示の融合ポリペプチドおよび(ii)1種または複数種の抗血管新生剤の使用も開示する。いくつかの別の態様において、無秩序な血管新生に関連している疾患または障害には、癌、眼の新血管新生疾患(例えば網膜症)、関節炎、および乾癬が含まれる。いくつかの態様において、1つの抗血管新生剤は、本明細書において言及するVEGF-Aアンタゴニストであり、2つ目の抗血管新生剤は、本明細書において言及するVEGF-Cアンタゴニストである。

Ang-2に対して検出可能な親和性を有するサブユニットを含む融合ポリペプチドに関するさらなる詳細は、本開示のセクションBで確認することができる。

特に好ましい態様において、Ang-2に特異的であるサブユニットを含む融合ポリペプチドは、SEQ ID NO: 2、3、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、または97およびそれらの機能的な断片または変種からなる群より選択される。いくつかの態様において、このような断片または変種は、SEQ ID NO: 1のいずれか1つにおいて定義されるムテインの構造的相同物である。

本開示はまた、次のもの、すなわち(i)本開示の融合ポリペプチドおよび(ii)1種または複数種の抗血管新生剤の少なくとも1つを含む薬学的組成物にも関し、この組成物は、無秩序な血管新生を阻害する際に使用することができる。いくつかの態様において、1つの抗血管新生剤は、本明細書において言及するVEGF-Aアンタゴニストであり、2つ目の抗血管新生剤は、本明細書において言及するVEGF-Cアンタゴニストである。

これに関して、本開示の組み合わせは、薬学的に許容される成分ならびに確立された調製方法を用いて、組成物に配合することができる(Gennaro and Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA)。薬学的組成物を調製するために、薬学的に不活性な無機または有機の賦形剤を使用することができる。

さらに別の局面において、本開示は、対象における無秩序な血管新生に関連している疾患または障害を治療、予防、または改善する方法であって、少なくとも次のもの、すなわち(i)本開示の融合ポリペプチド、および(ii)1種または複数種の抗血管新生剤を含む組成物の有効量を該対象に投与する段階を含む方法を特徴とする。いくつかの別の態様において、無秩序な血管新生に関連している疾患または障害には、癌、眼の新血管新生疾患(例えば網膜症)、関節炎、および乾癬が含まれる。いくつかの態様において、1つの抗血管新生剤は、本明細書において言及するVEGF-Aアンタゴニストであり、2つ目の抗血管新生剤は、本明細書において言及するVEGF-Cアンタゴニストである。

さらに別の局面において、本開示は、対象における無秩序な血管新生に関連している疾患または障害を治療、予防、または改善する方法であって、少なくとも次のもの、すなわち：(i)本開示の融合ポリペプチド、および(ii)１つまたは複数の抗血管新生剤を含む組成物の有効量を該対象に投与する段階を含む方法を含む。

本発明は、以下の項目をさらに特徴とする。
項目1。第1のサブユニットおよび第2のサブユニットを含む融合ポリペプチドであって、第1のサブユニットが、VEGF-Aに特異的な免疫グロブリンまたはその抗原結合ドメインから構成されており、第2のサブユニットが、Ang-2に特異的なヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン(hNGAL)ムテインから構成されている、融合ポリペプチド。
項目2。約1nMまたはそれ未満のEC50値でVEGF-Aに結合することができる、項目1記載の融合ポリペプチド。
項目3。実施例2に本質的に説明されるELISAアッセイ法において測定される場合、約1nMまたはそれ未満のEC50値でVEGF-Aに結合することができる、項目1記載の融合ポリペプチド。
項目4。約200pMまたはそれ未満のEC50値でVEGF-Aに結合することができる、項目1記載の融合ポリペプチド。
項目5。実施例2に本質的に説明されるELISAアッセイ法において測定される場合、約200pMまたはそれ未満のEC50値でVEGF-Aに結合することができる、項目1記載の融合ポリペプチド。
項目6。約1nMまたはそれ未満のEC50値でAng-2に結合することができる、項目1記載の融合ポリペプチド。
項目7。実施例3に本質的に説明されるELISAアッセイ法において測定される場合、約1nMまたはそれ未満のEC50値でAng-2に結合することができる、項目1記載の融合ポリペプチド。
項目8。約250pMまたはそれ未満のEC50値でAng-2に結合することができる、項目1記載の融合ポリペプチド。
項目9。実施例3に本質的に説明されるELISAアッセイ法において測定される場合、約250pMまたはそれ未満のEC50値でAng-2に結合することができる、項目1記載の融合ポリペプチド。
項目10。 VEGF-AおよびAng-2に同時に結合することができ、
VEGF-Aに結合するサブユニットが、約1nMまたはそれ未満のEC50値でその標的に結合できる、項目1記載の融合ポリペプチド。
項目11。 VEGF-AおよびAng-2に同時に結合することができ、
VEGF-Aに結合するサブユニットが、実施例4に本質的に説明されるELISAアッセイ法において測定される場合、約1nMまたはそれ未満のEC50値でその標的に結合できる、項目1記載の融合ポリペプチド。
項目12。 VEGF-AおよびAng-2に同時に結合することができ、
VEGF-Aに結合するサブユニットが、約500pMまたはそれ未満のEC50値でその標的に結合できる、項目1記載の融合ポリペプチド。
項目13。 VEGF-AおよびAng-2に同時に結合することができ、
VEGF-Aに結合するサブユニットが、実施例4に本質的に説明されるELISAアッセイ法において測定される場合、約500pMまたはそれ未満のEC50値でその標的に結合できる、項目1記載の融合ポリペプチド。
項目14。 VEGF-AおよびAng-2に同時に結合することができ、
Ang-2に結合するサブユニットが、約1.5nMまたはそれ未満のEC50値でその標的に結合できる、項目1記載の融合ポリペプチド。
項目15。 VEGF-AおよびAng-2に同時に結合することができ、
Ang-2に結合するサブユニットが、実施例4に本質的に説明されるELISAアッセイ法において測定される場合、約1.5nMまたはそれ未満のEC50値でその標的に結合できる、項目1記載の融合ポリペプチド。
項目16。 VEGF-AおよびAng-2に同時に結合することができ、
Ang-2に結合するサブユニットが、約600pMまたはそれ未満のEC50値でその標的に結合できる、項目1記載の融合ポリペプチド。
項目17。 VEGF-AおよびAng-2に同時に結合することができ、Ang-2に結合するサブユニットが、実施例4に本質的に説明されるELISAアッセイ法において測定される場合、約600pMまたはそれ未満のEC50値でその標的に結合できる、項目1記載の融合ポリペプチド。
項目18。約1nMまたはそれ未満のEC50値で、ヒトTie-2へのヒトAng-2の結合を妨害する能力を有する、項目1記載の融合ポリペプチド。
項目19。実施例5に本質的に説明される競合細胞ECL様式において、約1nMまたはそれ未満のEC50値で、ヒトTie-2へのヒトAng-2の結合を妨害する能力を有する、項目1記載の融合ポリペプチド。
項目20。 VEGF-Aの生物学的機能のうちの少なくとも1つを低減させるか、または妨害する能力を有する、項目1記載の融合ポリペプチド。
項目21。実施例6に本質的に説明される機能的な細胞に基づく増殖アッセイ法において測定されるようなVEGF-Aの生物学的機能のうちの少なくとも1つ、特にVEGF-A依存性の細胞増殖を低減させるか、または妨害する能力を有する、項目1記載の融合ポリペプチド。
項目22。ウサギにおける半減期が約3〜5日である、項目1記載の融合ポリペプチド。
項目23。実施例7に本質的に説明される薬物動態アッセイ法において測定されるように、ウサギにおける半減期が約3〜5日である、項目1記載の融合ポリペプチド。
項目24。ヒト対象における半減期が約3〜5日である、項目1記載の融合ポリペプチド。
項目25。ムテインが、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列(SEQ ID NO: 1)の位置28、36、40、41、49、52、65、68、70、72〜74、77、79、81、87、96、100、103、106、116、125、126、127、129、132、および134に対応する位置に、1つまたは複数の変異アミノ酸残基を含む、前記項目のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
項目26。ムテインが、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列の位置36、40、41、49、52、68、70、72〜73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132、および134に、1つまたは複数の変異アミノ酸残基を含む、前記項目のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
項目27。成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列と比較して、ムテインが、以下のアミノ酸置換のセットの1つを含む、前記項目のいずれか一項記載の融合ポリペプチド:

項目28。成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列と比較して、ムテインが、以下の変異アミノ酸置換のセットの1つを含む、前記項目のいずれか一項記載の融合ポリペプチド:Gln28→His;Asn65→Asp;Lys74→Glu;Cys87→Ser;Asn116→Asp;Val126→Met、およびAsn129→Asp。
項目29。ムテインが、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列(SEQ ID NO: 1)の配列位置28、36、40、41、49、52、65、68、70、72〜74、77、79、81、87、96、100、103、106、116、125、126、127、129、132、および134に、少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、または21個の変異アミノ酸残基を含む、前記項目のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
項目30。成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列と比較して、ムテインが、以下のアミノ酸置換のセットの1つを含み:

その際、アミノ酸置換の各セットが、置換Gln28→HisおよびCys87→Serを任意でさらに含む、前記項目のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
項目31。第2のサブユニットが、SEQ ID NO: 2および3からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するムテインおよびその機能的断片または変種を含む、前記項目のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
項目32。ムテインのアミノ酸配列が、SEQ ID NO: 2および3からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも97％、または少なくとも98％の配列同一性を有する、前記項目のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
項目33。 1つまたは複数のサブユニットが、有機分子、酵素標識、放射性標識、着色標識、蛍光標識、発色標識、発光標識、ハプテン、ジゴキシゲニン、ビオチン、細胞分裂阻害剤、毒素、金属複合体、金属、およびコロイド金からなる群より選択される化合物にコンジュゲートされている1つまたは複数の要素を有する、前記項目のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
項目34。第2のサブユニットが、ヒトAng-2およびマウスAng-2の両方と交差反応性であるムテインを含む、項目33記載の融合ポリペプチド。
項目35。第2のサブユニットが、約5nMまたはそれ未満のEC50値によって示される親和性でマウスAng-2に結合することができるムテインを含む、項目34記載の融合ポリペプチド。
項目36。第2のサブユニットが、標準ELISAアッセイ法において測定された場合に、約5nMまたはそれ未満のEC50値によって示される親和性でマウスAng-2に結合することができるムテインを含む、項目34記載の融合ポリペプチド。
項目37。第2のサブユニットに由来するムテインが、ポリペプチドの血清半減期を延長する化合物にコンジュゲートされていてよい、前記項目のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
項目38。血清半減期を延長する化合物が、ポリアルキレングリコール分子、ヒドロエチルデンプン、免疫グロブリンのFc部分、免疫グロブリンのCH3ドメイン、免疫グロブリンのCH4ドメイン、アルブミン結合ペプチド、およびアルブミン結合タンパク質からなる群より選択される、項目37記載の融合ポリペプチド。
項目39。ポリアルキレングリコールが、ポリエチレン(PEG)またはその活性化された誘導体である、項目38記載の融合ポリペプチド。
項目40。第1のサブユニットおよび第2のサブユニットが、ペプチド結合によって連結されている、前記項目のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
項目41。第1のサブユニットおよび第2のサブユニットが、第2のサブユニットのリポカリンムテインのN末端と第1のサブユニットの免疫グロブリンの重鎖定常領域(CH)のC末端との間のペプチド結合によって連結されている、前記項目のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
項目42。第1のサブユニットが、第2のサブユニットのリポカリンムテインのN末端と第1のサブユニットの免疫グロブリンの軽鎖定常領域(CL)のC末端との間のペプチド結合によって第2のサブユニットに連結されている、前記項目のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
項目43。第1のサブユニットが、第2のサブユニットのリポカリンムテインのC末端と第1のサブユニットの免疫グロブリンの軽鎖定常領域(CH)のN末端との間のペプチド結合によって第2のサブユニットに連結されている、前記項目のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
項目44。第1のサブユニットが、第2のサブユニットのリポカリンムテインのC末端と第1のサブユニットの免疫グロブリンの軽鎖定常領域(CL)のN末端との間のペプチド結合によって第2のサブユニットに連結されている、前記項目のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
項目45。ペプチド結合が(G4S)3ペプチドリンカーによって提供される、前記項目のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
項目46。ペプチド結合が、少なくとも4つのグリシン残基および少なくとも1つのセリン残基を含む、前記項目のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
項目47。ペプチド結合が、少なくとも1つの(G4S)単位を含む、前記項目のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
項目48。 (G4S)単位がn回(n=1〜10)繰り返されていてよい、項目48記載の融合ポリペプチド。
項目49。免疫グロブリンがモノクローナル抗体である、前記項目のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
項目50。モノクローナル抗体が、SEQ ID NO: 8の重鎖に含まれる重鎖相補性決定領域(CDR)およびSEQ ID NO: 9の軽鎖に含まれる軽鎖CDRを有する、項目51記載の融合ポリペプチド。
項目51。モノクローナル抗体が、SEQ ID NO: 8によって定められる重鎖およびSEQ ID NO: 9によって定められる軽鎖を有する、前記項目のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
項目52。モノクローナル抗体がIgG1骨格を有する、前記項目のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
項目53。モノクローナル抗体がベバシズマブである、前記項目のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
項目54。 SEQ ID NO: 9および10に示されるアミノ酸、またはSEQ ID NO: 8および11に示されるアミノ酸、またはSEQ ID NO: 9および12に示されるアミノ酸、またはSEQ ID NO: 8および13に示されるアミノ酸、またはSEQ ID NO: 9および14に示されるアミノ酸、またはSEQ ID NO: 8および15に示されるアミノ酸、またはSEQ ID NO: 9および16に示されるアミノ酸、またはSEQ ID NO: 8および17に示されるアミノ酸を含む、前記項目のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
項目55。項目1〜54のいずれか一項記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
項目56。核酸分子の発現を可能にする調節配列と機能的に連結されている、項目55記載の核酸分子。
項目57。ベクターまたはファージミドベクター中に含まれている、項目55または56記載の核酸分子。
項目58。項目56または57記載の核酸分子を含む宿主細胞。
項目59。ムテインをコードしている核酸配列を発現させる段階を含む、前記項目のいずれか一項記載の融合ポリペプチドを作製する方法。
項目60。融合ポリペプチドが、細菌宿主生物または真核宿主生物において産生され、かつこの宿主生物またはその培養物から単離される、項目59記載の方法。
項目61。項目1〜54のいずれか一項記載の融合ポリペプチドを含む薬学的組成物。
項目62。無秩序な血管新生に関連している疾患または障害の治療、予防、および/または改善に適した薬学的組成物を製造するための、項目1〜54のいずれか一項記載の融合ポリペプチドの使用。
項目63。対象中のAng-2およびVEGF-Aに同時に結合するための、項目1〜54のいずれか一項記載の融合ポリペプチドの使用。
項目64。対象中のAng-2およびVEGF-Aに同時に結合するための、項目1〜54のいずれか一項記載の融合ポリペプチドまたはこのような融合ポリペプチドを含む組成物の使用。
項目65。対象における血管新生を阻害するための、項目1〜54のいずれか一項記載の融合ポリペプチドまたはこのような融合ポリペプチドを含む組成物の使用。
項目66。「滲出」型の加齢黄斑変性症(ARMD)に罹患している患者を治療するための、項目1〜54のいずれか一項記載のポリペプチドまたはこのような融合ポリペプチドを含む組成物の使用。
項目67。診断目的で血管新生因子を検出する際の、項目1〜54のいずれか一項記載のポリペプチドまたはこのような融合ポリペプチドを含む組成物の使用。
項目69。項目1〜54のいずれか一項記載の融合ポリペプチドまたはこのような融合ポリペプチドを含む組成物を対象に投与する段階を含む、対象中のAng-2およびVEGF-Aに同時に結合する方法。
項目70。有効量の、項目1〜54のいずれか一項記載の融合ポリペプチドまたはこのような融合ポリペプチドを含む組成物を対象に投与する段階を含む、対象における血管新生を阻害するか、または低減させる方法。
項目71。有効量の、項目1〜54のいずれか一項記載の融合ポリペプチドまたはこのような融合ポリペプチドを含む組成物を対象に投与する段階を含む、対象における無秩序な血管新生に関連している疾患または障害を治療、予防、または改善する方法。
項目72。疾患または障害が、腫瘍増殖、眼障害、血管疾患、炎症性疾患または感染症、癌、眼の新血管新生疾患、関節炎、および乾癬からなる群より選択される、項目71記載の方法または項目62記載の使用。
項目73。項目1〜54のいずれか一項記載の融合ポリペプチドまたはこのような融合ポリペプチドを含む組成物を含む、診断用または分析用のキット。

V.実施例
実施例1:融合ポリペプチドの発現および解析
VEGF-AおよびAng-2と同時に結合するように、本発明者らは、SEQ ID NO: 8および9によって提供される重鎖および軽鎖を有する抗体とSEQ ID NO: 2またはSEQ ID NO: 3のリポカリンムテインのうちの1つを、明確な構造を持たない(G4S)3リンカー(SEQ ID NO: 19)を介して互いに融合させて、いくつかの代表的な抗体-リポカリンムテイン融合ポリペプチドを作製した。設計された様々な形態を図1に示している。このような融合ポリペプチド(SEQ ID NO: 9および10、SEQ ID NO: 8および11、SEQ ID NO: 9および14、SEQ ID NO: 8および15)は、抗体の2つのC末端のいずれか1つへの、SEQ ID NO: 2またはSEQ ID NO: 3のリポカリンムテインのうちの1つの融合によって、作製した。

構築物を遺伝子合成によって作製し、哺乳動物発現ベクター中にクローニングした。次いで、それらをCHO細胞において一過性に発現させた。細胞培養培地中の融合ポリペプチドの濃度を、ForteBioプロテインAセンサー(Pall Corp.)を用いて測定し、ヒトIgG1標準物質を用いて定量した。

これらの融合ポリペプチドを、リン酸緩衝食塩水(PBS)におけるプロテインAクロマトグラフィー、続いてサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を用いて、精製した。SEC精製後、単量体タンパク質を含む画分を集め、解析的SECを用いて再び解析した。この解析によれば、これらの融合ポリペプチドは、全面的に単量体であり、検出可能な多量体種も凝集体もなかった。

実施例2:VEGF-Aに対する融合ポリペプチドの特異性
本発明者らは、ELISAアッセイ法を用いて、組換えVEGF-Aに対する融合ポリペプチドの親和性を測定した。標的をPBSに溶解し(5μg/mL)、4℃で一晩、マイクロタイタープレートにコーティングした。各インキュベーション段階の後に、0.05％(v/v)Tween20を添加したPBS(PBS-T)80μLでプレートを5回洗浄した。これらのプレートを室温で1時間、PBS中2％BSA(w/v)でブロックし、続いて洗浄した。様々な濃度のベンチマーク二重特異性抗体(SEQ ID NO: 20、21、22、および23)ならびに陽性対照抗体 (SEQ ID NO: 8および9)または融合ポリペプチド(SEQ ID NO: 9および10、SEQ ID NO: 8および11、SEQ ID NO: 9および14、SEQ ID NO: 8および15)をウェルに添加し、室温で1時間インキュベーションし、次に洗浄段階を行った。試験中に結合された作用物質を、PBS-T中の1:5000希釈された抗ヒトIgG Fc-HRP(109-035-098番、Jackson Laboratory)と共にインキュベーションした後に検出した。さらなる洗浄段階の後、蛍光原性HRP基質(QuantaBlu, Thermo)を各ウェルに添加し、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて蛍光強度を検出した。

この実験の結果を、EC50値および最大シグナルが自由パラメーターであり、傾きを1に固定した1:1結合シグモイドフィッティングの結果として生じるあてはめ曲線と共に、図2にプロットした。観察されたEC50値は、試験した全融合ポリペプチドおよびベンチマーク抗体について、同様の範囲であった(0.8〜0.15nM)。

実施例3:Ang-2に対する融合ポリペプチドの特異性
本発明者らは、ELISAアッセイ法を用いて、組換えヒトAng-2(Creative BioMart)に対する融合ポリペプチドおよびSEQ ID NO: 2またはSEQ ID NO: 3の陽性対照リポカリンムテインの親和性を測定した。標的をPBSに溶解し(5μg/mL)、4℃で一晩、マイクロタイタープレートにコーティングした。各インキュベーション段階の後に、80μLのPBS-Tでプレートを5回洗浄した。これらのプレートを室温で1時間、PBS中2％BSA(w/v)でブロックし、続いて洗浄した。様々な濃度の単量体型のAng-2特異的リポカリンムテイン(SEQ ID NO: 2もしくはSEQ ID NO: 3)または融合ポリペプチド(SEQ ID NO: 9および10、SEQ ID NO: 8および11、SEQ ID NO: 9および14、SEQ ID NO: 8および15)またはベンチマーク二重特異性対照(SEQ ID NO: 20、21、22、および23)をウェルに添加し、室温で1時間インキュベーションし、次に洗浄段階を行った。試験中に結合された作用物質を、PBS-T中の1:1000希釈された、HRPにコンジュゲートされた抗リポカリン抗体、またはPBS-T中の1:5000希釈された抗ヒトIgG Fc-HRP(109-035-098番、Jackson Laboratory)と共に室温で1時間インキュベーションした後に検出した。さらなる洗浄段階の後、蛍光原性HRP基質(QuantaBlu, Thermo)を各ウェルに添加し、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて蛍光強度を検出した。

この実験の結果を、EC50値および最大シグナルが自由パラメーターであり、傾きを1に固定した1:1結合シグモイドフィッティングの結果として生じるあてはめ曲線と共に、図3にプロットした。試験した全融合ポリペプチド(SEQ ID NO: 9および10、SEQ ID NO: 8および11、SEQ ID NO: 9および14、SEQ ID NO: 8および15)について観察されたEC50値は、類似しており、0.21nM〜0.23nMの範囲であった。SEQ ID NO: 2またはSEQ ID NO: 3の陽性対照リポカリンムテインについて得られた値は0.35〜0.5nMであったのに対し、ベンチマーク二重特異性抗体のEC50は0.83nMであった。

実施例4:ELISAに基づく設定における同時標的結合の実証
VEGF-AおよびAng-2への融合ポリペプチドの同時結合を実証するために、二重結合ELISA様式を使用した。PBS中組換えVEGF-A(R&D Systems)(5μg/mL)を、4℃で一晩、マイクロタイタープレートにコーティングした。各インキュベーション段階の後に、Biotek ELx405 select CW洗浄機を用いて、0.05％(v/v)Tween20を添加したPBS(PBS-T)80μLでプレートを5回洗浄した。これらのプレートを室温で1時間、PBS中2％BSA(w/v)でブロックし、続いて再び洗浄した。様々な濃度の融合ポリペプチドをウェルに添加し、室温で1時間インキュベーションし、次に洗浄段階を行った。続いて、ビオチン標識ヒトAng-2を、PBS-T中1μg/mLの一定濃度で1時間、添加した。洗浄後、エクストラアビジン-HRP(Sigma-Adrich、PBS-T中1:5000)をウェルに1時間添加した。さらなる洗浄段階の後、蛍光原性HRP基質(QuantaBlu, Thermo)を各ウェルに添加し、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて蛍光強度を検出した。

別法として、PBS中組換えAng-2(Creative BioMart)(5μg/mL)を、4℃で一晩、マイクロタイタープレートにコーティングした。各インキュベーション段階の後に、Biotek ELx405 select CW洗浄機を用いて、0.05％(v/v)Tween20を添加したPBS(PBS-T)80μLでプレートを5回洗浄した。これらのプレートを室温で1時間、PBS中2％BSA(w/v)でブロックし、続いて再び洗浄した。様々な濃度の融合ポリペプチド(SEQ ID NO: 9および10、SEQ ID NO: 8および11、SEQ ID NO: 9および14、SEQ ID NO: 8および15)をウェルに添加し、室温で1時間インキュベーションし、次に洗浄段階を行った。続いて、ビオチン標識ヒトVEGF-Aを、PBS-T中1μg/mLの一定濃度で1時間、添加した。洗浄後、エクストラアビジン-HRP(Sigma-Adrich、PBS-T中1:5000)をウェルに1時間添加した。さらなる洗浄段階の後、蛍光原性HRP基質(QuantaBlu, Thermo)を各ウェルに添加し、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて蛍光強度を検出した。

各実験データを図4にプロットした。VEGF-Aをプレートにコーティングした場合、試験した融合ポリペプチドはすべて、明瞭な結合シグナルを示し、EC50値は0.36〜0.55nMの範囲であったことから、これらの融合ポリペプチドがVEGF-AおよびAng-2と同時に結合できることが実証された。ベンチマーク二重特異性分子(SEQ ID NO: 20、21、22、および23)は、より小さな結合シグナルを示し、EC50値は1.8nMであった(図4A)。Ang-2をプレートにコーティングし、ビオチン標識VEGF-Aを検出のために使用する代わりのアッセイ設定を用いた場合、試験した融合ポリペプチドはすべて、明瞭な結合シグナルを示し、EC50値は0.95〜1.3nMの範囲であったのに対し、ベンチマーク二重特異性分子は、より小さな結合シグナルを示し、EC50値は14nMであった(図4B)。このようにベンチマーク二重特異性抗体の結合が劣るのは、その一価の標的結合が原因であり得る。

実施例5:融合ポリペプチドは、hTie-2発現細胞へのヒトAng-2の結合を妨害する
融合ポリペプチドがヒトAng-2に競合的様式で結合するかどうかを、競合細胞電気化学発光(ECL)アッセイ様式を用いて、hTie-2過剰発現HEK細胞において試験した(図5)。この実験において、一定濃度のヒトAng-2を、様々な濃度の融合ポリペプチド(SEQ ID NO: 9および10、SEQ ID NO: 8および11、SEQ ID NO: 9および14、SEQ ID NO: 8および15)、陽性対照リポカリンムテイン(SEQ ID NO: 2またはSEQ ID NO: 3)、ベンチマーク抗体(SEQ ID NO: 6および7)、ならびに陰性対照(SEQ ID NO: 1およびhIgG1)と共に1時間インキュベーションした。溶液中でのこのプレインキュベーションの後、一定量の結合部分/Ang-2混合物を、hTie-2過剰発現HEK細胞でコーティングしたMSDプレートに移して、hTie-2に結合するのを妨害されなかったhAng-2の濃度をそれぞれ測定した。

インキュベーション段階はすべて、室温で実施し、各インキュベーション段階の後に、Biotek EL405 select CW洗浄機(Biotek)を用いてPBS緩衝液80μlでプレートを2回洗浄した。第1段階において、384ウェルプレートをポリDリジンで5分間プレコーティングし、PBSで2回洗浄した。ウェル1つにつき10⁴個のHEK:hTie-2細胞を播種し、37℃で一晩、ウェルの表面に付着させた。洗浄後、60μlのPBS/カゼイン(PBS中2％カゼイン)を用いて、室温で1時間、細胞でコーティングされたウェルをブロックした。

PBS/カゼイン緩衝液中でピコモル範囲に薄まるまで1:3の比率で段階的に希釈される適切な開始濃度を用いて、様々な濃度の融合ポリペプチド、陽性対照リポカリンムテイン、ベンチマーク抗体、および陰性対照と共に、一定濃度のヒトAng-2を溶液中でインキュベーションした。室温で1時間インキュベーションした後、HEK:hTie2でコーティングしたプレートに反応混合物20μlを移して、競合によって結合していないhAng-2を室温で1時間分、捕捉した。様々な濃度のhAng-2を含む検量線を、PBS/カゼインにおいて作成し、同じプレート上で同様に1時間インキュベーションした。

結合したhAng-2の検出および定量を可能にするために、残存している上清を廃棄し、抗HISタグ抗体(Abcam)およびSulfotagで標識した抗ヤギ抗体(Mesoscale Discovery)の混合物20μlを、PBS/カゼインに溶かして濃度1μg/mlで添加し、室温で1時間インキュベーションした。洗浄後、界面活性剤を含まない読み取り緩衝液35μlを各ウェルに添加し、Mesoscale Discoveryリーダーを用いて、すべてのウェルのECLシグナルを読み取った。

各実験データを図5にプロットした。試験した融合ポリペプチドはすべて、hTie2へのhAng-2結合の明瞭な阻害を示し、EC50値は0.3〜0.4nMの範囲であったのに対し、ベンチマーク分子およびリポカリンムテインもまた、0.3〜0.6nMの間という同様の値を示した。

実施例6:細胞に基づく増殖アッセイ法における、融合ポリペプチドによるVEGF-A遮断
融合ポリペプチド(SEQ ID NO: 9および10、SEQ ID NO: 8および11、SEQ ID NO: 9および14、SEQ ID NO: 8および15)、陽性対照リポカリンムテイン(SEQ ID NO: 2またはSEQ ID NO: 3)、ベンチマーク抗体(SEQ ID NO: 6および7;SEQ ID NO: 8および9)、ならびに陰性対照(SEQ ID NO: 1およびhIgG1)がVEGF-Aの生物活性を無効にする能力を、リンパ微小管内皮細胞(LEC)を使用する短期増殖バイオアッセイ法を適用することによって評価した。LEC増殖は、hVEGF-AまたはhAng-2いずれかの効力を消す効果を有する作用物質によって、阻害することができる。このアッセイ法にhAng-2は直接的に添加されないものの、内因性hAng-2がLEC細胞によって放出される。

LECは、製造業者(PAA Laboratories)の取扱い説明書に従う標準条件下(37℃、5％CO₂雰囲気)で、EBM、5％ウシ胎児血清、およびMV2補充キット中で維持した。実験の1日目に、製造業者の取扱い説明書に従ってトリプシン/EDTAを用いて、培養基から付着細胞を分離させた。続いて、1000rpmで5分間、細胞を遠心沈殿させ、EBM中に再懸濁し、100μmのセルストレイナー(Falcon)に通してろ過して、細胞凝集体を取り除いた。次いで、最終体積100μlを用いて、ウェル1つにつき細胞3200個の密度で、96ウェルの平底組織培養プレート(Greiner)に細胞を播種した。これらを標準的条件下で1時間インキュベーションした。1時間後、(50ng/mlのhVEGF-A(R&D systems)と共に30分間プレインキュベーションした)全試験物質の希釈系列を、培養状態のLEC細胞に添加した。3日間培養した後、生細胞の数を定量することによって、増殖の程度を評価した。CellTiter-Glo発光型細胞生死判別アッセイ法(Promega)を用いてこれを実施して、代謝的に活性な細胞の数と相関があるATPレベルを測定した。融合ポリペプチド(SEQ ID NO: 9および10、SEQ ID NO: 8および11、SEQ ID NO: 9および14、SEQ ID NO: 8および15)ならびにVEGF-A特異的ベンチマーク(SEQ ID NO: 8および9)が、VEGF-Aによって誘発される増殖を無効にする能力を、評価した。Ang-2に特異的なリポカリンムテイン(SEQ ID NO: 2またはSEQ ID NO: 3)およびベンチマーク抗体 (SEQ ID NO: 6および7)がhAng-2の効力を消す能力もまた、それらのIC50値、すなわち、hAng-2の媒介による増殖を最大値の半分に阻害するリポカリンムテイン濃度に基づいて評価した。

IC50値は、GraphPad Prismソフトウェア(GraphPad Software Inc.)を用いて、標準化したシグナルを試料濃度に対してプロットすること、およびシグモイド用量反応モデルを用いてデータを非線形回帰することによって、決定した。

各実験データを図6にプロットした。試験した融合ポリペプチドはすべて、増殖の明瞭な阻害を示し、EC50値は1.2〜0.5nMの範囲であったのに対し、VEGF-Aベンチマーク分子のEC50は1.2であった。hAng-2に特異的なリポカリンムテインおよびhAng-2ベンチマーク対照(SEQ ID NO: 6および7)は、1.2〜4.2nMの間のIC50値で、増殖をある程度阻害した。陰性対照は、増殖に対する効果をまったく示さなかった。

実施例7:融合ポリペプチドのインビボでの薬物動態評価
融合ポリペプチドのインビボ評価では、ウサギ(HY79b;有色)に試験物質を硝子体内注射し、続いて、336時間の期間に渡って、血液、硝子体液、および網膜組織を試料採取した。手短に言えば、ウサギ(処置1つにつきn=16)の片方の眼(右)に100ugの融合ポリペプチド(SEQ ID NO: 9および14、SEQ ID NO: 8および15)を注射し、他方の眼(左)を対照として使用した(すなわち、未処置)。眼の検査を定期的に実施して、ウサギの耳の全般的健康を評価した。

注射後に336時間の期間に渡ってウサギから採取した血漿および硝子体液に基づいて、試験物質の薬物動態を明らかにした。具体的には、血液および硝子体液を、投与後2時間目、8時間目、24時間目、72時間目、96時間目、168時間目、216時間目、および336時間目にウサギから採取した(各時点に、処置1つにつき2匹のウサギを屠殺した)。

実施例4に説明するように、標的VEGF-AおよびAng-2を介して完全な二重特異性構築物を検出するサンドイッチELISAを用いて、薬物レベルを検出した。Prism GraphPad 5ソフトウェアを使用してノンコンパートメントモデルを用いて、このデータを当てはめた。図7は、構築物SEQ ID NO: 9および14、SEQ ID NO: 8および15の経時的な硝子体濃度の線形プロットを示す。このデータは、二重特異性融合物のウサギ硝子体中での終末半減期が約3.7〜4.5日の範囲であることを示す。

本明細書において例示的に説明する態様は、本明細書において具体的に開示しない任意の1つまたは複数の要素、1つまたは複数の制限の非存在下で、適切に実施することができる。したがって、例えば、「含む(comprising)」、「含む(including)」、「含む(containing)」などの用語は、包括的に、かつ非限定的に読み取られるものとする。さらに、本明細書において使用される用語および表現は、限定するのではなく説明する用語として使用されており、そのような用語および表現を使用する際、示し説明する特徴またはその一部分の任意の等価物を除外する意図はないが、請求される本発明の範囲内で様々な修正が可能であることが認識される。したがって、本発明の態様は好ましい態様および任意の特徴によって具体的に開示されるが、その修正および変更を当業者は行ってもよいこと、ならびにそのような修正および変更が本発明の範囲内であるとみなされることを理解すべきである。本明細書において説明したすべての特許、特許出願、教科書、および同領域の専門家によって審査された刊行物は、全体が参照により本明細書に組み入れられる。さらに、参照により本明細書に組み入れられる参考文献におけるある用語の定義または使用が、本明細書において提供されるその用語の定義と一致しないか、または相いれない場合、本明細書において提供されるその用語の定義が適用され、その参考文献におけるその用語の定義は適用されない。また、包括的開示(generic disclosure)の範囲に入るより狭義の種および下位概念のグループのそれぞれも、本発明の一部分をなす。これには、削除される題材(material)が本明細書において具体的に挙げられるかどうかに関わらず、上位概念から任意の主題を除く条件または否定的限定を伴う、本発明の包括的説明が含まれる。さらに、特徴がマーカッシュ群によって説明される場合、マーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーの下位集団の観点から、開示内容がそれによっても説明されることを、当業者は認識すると考えられる。さらなる態様は、添付の特許請求の範囲から明らかになる。

等価物:当業者は、ごく普通の実験法を用いるだけで、本明細書において説明した本発明の個々の態様に対する多くの等価物を認識するか、または確認することができる。このような等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されると意図される。本明細書中で言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、あたかも個々の各刊行物、特許、または特許出願が参照により本明細書に組み入れられることが具体的かつ個別に示されたかのように、本明細書において同程度に参照により本明細書中に組み入れられる。

Claims

第1のサブユニットおよび第2のサブユニットを含む融合ポリペプチドであって、該第1のサブユニットが、VEGF-Aに特異的な免疫グロブリンまたはその抗原結合ドメインから構成されており、該第2のサブユニットが、Ang-2に特異的なヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン(hNGAL)ムテインから構成されている、融合ポリペプチド。
約1nMまたはそれ未満のEC50値でVEGF-Aに結合することができる、請求項1記載の融合ポリペプチド。
約200pMまたはそれ未満のEC50値でVEGF-Aに結合することができる、請求項1記載の融合ポリペプチド。
約1nMまたはそれ未満のEC50値でAng-2に結合することができる、請求項1記載の融合ポリペプチド。
約250pMまたはそれ未満のEC50値でAng-2に結合することができる、請求項1記載の融合ポリペプチド。
VEGF-AおよびAng-2に同時に結合することができ、
VEGF-Aに結合するサブユニットが、約1nMまたはそれ未満のEC50値でその標的に結合できる、請求項1記載の融合ポリペプチド。
VEGF-AおよびAng-2に同時に結合することができ、
VEGF-Aに結合するサブユニットが、約500pMまたはそれ未満のEC50値でその標的に結合できる、請求項1記載の融合ポリペプチド。
VEGF-AおよびAng-2に同時に結合することができ、
Ang-2に結合するサブユニットが、約1.5nMまたはそれ未満のEC50値でその標的に結合できる、請求項1記載の融合ポリペプチド。
ムテインが、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列(SEQ ID NO: 1)の位置28、36、40、41、49、52、65、68、70、72〜74、77、79、81、87、96、100、103、106、116、125、126、127、129、132、および134に対応する位置に、1つまたは複数の変異アミノ酸残基を含む、前記請求項のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
ムテインが、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列の位置36、40、41、49、52、68、70、72〜73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132、および134に、1つまたは複数の変異アミノ酸残基を含む、前記請求項のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列と比較して、ムテインが、以下のアミノ酸置換のセットの1つを含む、前記請求項のいずれか一項記載の融合ポリペプチド:

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成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列と比較して、ムテインが、以下の変異アミノ酸置換のセットの1つを含む、前記請求項のいずれか一項記載の融合ポリペプチド:
Gln28→His;Asn65→Asp;Lys74→Glu;Cys87→Ser;Asn116→Asp;Val126→Met、およびAsn129→Asp。
ムテインが、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列(SEQ ID NO: 1)の配列位置28、36、40、41、49、52、65、68、70、72〜74、77、79、81、87、96、100、103、106、116、125、126、127、129、132、および134に、少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、または21個の変異アミノ酸残基を含む、前記請求項のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列と比較して、ムテインが、以下のアミノ酸置換のセットの1つを含み:

アミノ酸置換の各セットが、置換Gln28→HisおよびCys87→Serを任意でさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
第2のサブユニットが、SEQ ID NO: 2および3からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するムテインおよびその機能的断片または変種を含む、前記請求項のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
ムテインのアミノ酸配列が、SEQ ID NO: 2および3からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも97％、または少なくとも98％の配列同一性を有する、前記請求項のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
免疫グロブリンがモノクローナル抗体である、前記請求項のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
モノクローナル抗体が、SEQ ID NO: 8の重鎖に含まれる重鎖相補性決定領域(CDR)およびSEQ ID NO: 9の軽鎖に含まれる軽鎖CDRを有する、請求項17記載の融合ポリペプチド。
モノクローナル抗体がベバシズマブである、請求項17記載の融合ポリペプチド。
SEQ ID NO: 9および10のアミノ酸、またはSEQ ID NO: 8および11のアミノ酸、またはSEQ ID NO: 9および12のアミノ酸、またはSEQ ID NO: 8および13のアミノ酸、またはSEQ ID NO: 9および14のアミノ酸、またはSEQ ID NO: 8および15のアミノ酸、またはSEQ ID NO: 9および16のアミノ酸、またはSEQ ID NO: 8および17のアミノ酸を含む、前記請求項のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。