JP2019505230A - 真核生物のための発現系 - Google Patents

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Abstract

本発明は、真核宿主のための発現系であって、１）合成転写因子（ｓＴＦ）をコードするＤＮＡ配列の発現を制御するコアプロモーターを含む発現カセットと、２）合成プロモーターに作動可能に連結された所望の製品をコードするＤＮＡ配列をそれぞれ含む、１つ以上の発現カセットとを含み、前記合成プロモーターが、コアプロモーター及び前記コアプロモーターの上流にｓＴＦ特異的結合部位を含む、発現系を提供する。本発明はまた、真核宿主のためのユニバーサルコアプロモーターを同定する方法、ユニバーサルコアプロモーターを用いる発現系、当該発現系を有する宿主、及び真核宿主でタンパク質製品を製造する方法を提供する。

Description

本発明は、真核宿主（例えば、微生物宿主）の発現系、当該発現系を含む宿主、及び当該宿主を用いて所望のタンパク質製品を製造する方法に関する。さらに、本発明は、ユニバーサルコアプロモーターを同定する方法、当該方法によって得られ得るユニバーサルコアプロモーター、及び発現系、真核生物宿主（例えば、微生物宿主）、及びユニバーサルコアプロモーターを使用することでタンパク質製品を製造する方法に関する。
制御された予測可能な遺伝子発現は、確立された宿主であっても、特に多様な培養条件又は生長段階における安定した発現の点で達成することは非常に困難である。さらに、多くの潜在的に興味深い産業用の宿主にとって、異種遺伝子の発現を達成するためのツール及び／又は方法の範囲が、非常に限定されている（又は存在しない）。多くの場合、このことから、産業応用におけるこれらの宿主（しばしば非常に有望な宿主）の使用が禁じられる。いくつかの宿主では、標的遺伝子の望ましい発現を達成するために、特異的な誘導条件が必要である。この結果、培地又は下流のプロセシングに特定の要件が生じて、最終的に生産コストを増加させる。産業用の宿主における別の問題は、同時に複数の遺伝子の特定の発現レベルを有することが望まれる複雑な発現プログラムの確立である。例えば、所望の製品に向けた最適な代謝の流れを確保するように、製造経路の酵素をコードする個々の遺伝子をバランスのとれた比で発現させる（及び対応する酵素が産生される）ことが必要である場合は、上記の複雑な発現プログラムは代謝経路工学にとって重要である。
宿主生物における（可変条件における）標的遺伝子の予測可能及び／又は安定な発現パターンを達成するためには、これらの遺伝子の発現が宿主の固有の調節機構によって最小限にしか影響されないことが重要である。これは、設計された標的遺伝子発現系において、固有ではない（異種）成分（プロモーター、転写因子、及び誘導因子）を用いることで達成することができる。これらの発現系は、宿主の影響を受けておらず、また意図した以外の方法で宿主に影響を与えない場合、直交性であると言われる。しかし、直交発現系は依然として、転写及び翻訳等の宿主の内在性細胞機能に依存しているため、直交発現系は宿主におけるそれらの機能性を可能にする特定の基準を満たさなければならない。これらの基準は、ある程度、種（宿主）特異的であるため、広範囲の非常に異なる種にまたがって機能する直交系を設計することが困難である。
典型的には、異種遺伝子の発現のための現在の戦略は、特定の宿主における内因性（宿主特異的）プロモーターの使用を用いる（非特許文献１及び非特許文献２）。これらのプロモーターは、誘導性又はいわゆる構成的（constitutive）のいずれかであり得るが、それらの機能は宿主生物に存在する特定の因子に依存するため、直交性ではない。また、宿主特異的プロモーターを使用することで、これらの発現系の種間の移動が妨げられ、その結果、宿主ごとにカスタマイズされた発現系を開発する必要が生じる。固有の宿主プロモーターに基づく種間で移動可能な発現系の既存の例は、そのプロモーターが機能する近縁の狭い範囲の生物に限定される。これらには、サッカロミケス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）で機能する、クリベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）URA3及びLEU2、又はシゾサッカロミケス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）HIS5プロモーター等のいくつかの酵母プロモーターが含まれる。糸状菌では、例えば、アスペルギルス・ニドュランス（Aspergillus nidulans）のgpdAプロモーターは、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）、及びトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）でうまく使用されている。しかし、これらのプロモーターは、主にこれらの生物における選択マーカー遺伝子の発現に使用される。それらの活性は増殖条件に強く影響され、又は転写活性のスペクトルが不十分であるため、（所望のタンパク質をコードする）標的遺伝子の発現、特に（代謝経路をコードする）複数の遺伝子の同時発現に、これらのプロモーターは適していない。
いくつかの研究は、合成（直交性）転写因子（ｓＴＦ）及び設計されたｓＴＦ依存性プロモーターを用いて標的遺伝子の発現を制御する遺伝子発現系の特徴及び工学を報告している。ｓＴＦ依存性プロモーターは、コアプロモーターに連結された変化する数のｓＴＦ結合部位から構成される。特定のコアプロモーターと組み合わせた結合部位の数は、標的遺伝子の発現レベルを規定し、標的遺伝子発現のために宿主特異的プロモーターを利用する系と比較して、発現レベル制御において有意な改善を表す。しかし、これらの発現系で使用されるｓＴＦは、固有の（宿主特異的）プロモーター又は改変された固有のプロモーターから発現され、それによって、これらの発現系が部分的に直交性となり、多様な種でそれらを使用することが妨げられる。部分的に直交性の発現系の例として、以下のものがある。
１）Ｓ．セレビシエのために開発された発現系。ｓＴＦが、Ｓ．セレビシエTDH3プロモーターから、又はTDH3 UASとＳ．セレビシエCYC1コアプロモーターを組み合わせたプロモーターから、発現される。標的遺伝子が、変化する数のｓＴＦ結合部位及びTDH3又はCYC1コアプロモーターを含有する合成プロモーターから発現される（非特許文献３）。
２）Ａ．ニドランス及びＡ．ニガーのために開発された発現系。ｓＴＦが、Ａ．ニドランスgpdAプロモーターから発現される。標的遺伝子が、ｓＴＦ、Ｓ．セレビシエURA3コアプロモーター、及び大腸菌由来の94bpのランダム配列のための３つの結合部位を含む合成プロモーターから発現される（非特許文献４）。
３）アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）のために開発された発現系。ｓＴＦが、Ａ．タリアナ35Sプロモーター又は他のＡ．タリアナプロモーターから、又はｓＴＦ及びＡ．タリアナ35S最小プロモーターのための４つの結合部位を含む合成プロモーターから発現される。最小プロモーターは、おそらく、参照される刊行物におけるコアプロモーターを指す。標的遺伝子が、ｓＴＦ及びＡ．タリアナ35S最小プロモーターの４つの結合部位を含む合成プロモーターから発現される（特許文献１）。
いくつかの遺伝子発現系が先行技術において開示されているが、堅牢で安定した発現と広範囲の発現レベルを提供することができ、いくつかの異なる真核微生物の種及び属などのいくつかの異なる真核生物の種及び属で使用することができる、真核生物宿主（例えば、真核微生物宿主）のための遺伝子発現系が依然として必要とされている。これは、例えば、いくつかの潜在的な生産宿主で、機能評価のために、設計された代謝経路への効率的な移動及びその試験を同時に可能にする。さらに、真の直交性発現系は、真核生物を研究する科学界に利益をもたらすだろう。
ＵＳ２００２−０８１６６７
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本発明の１つの目的は、真核微生物等の広範囲の真核生物で機能する（移動可能である）直交性発現系を提供することである。そのような発現系は、発現系を構築する際に宿主固有のＤＮＡ配列を使用する必要性を克服し、従って、発現宿主の内在的な転写調節に依存しない発現系を確立する。
本発明の更なる目的は、標的遺伝子の堅牢で安定した予測可能な発現レベルを可能にし、宿主生物の培養条件又は発達段階若しくは成長段階によって影響を受けない発現系を提供することである。
本発明の動機となったものは、１）ｓＴＦを発現させるための宿主特異的プロモーター又はその部分の使用、及び２）標的遺伝子の発現を制御するｓＴＦ依存性プロモーターにおける種特異的コアプロモーターの使用は、ｓＴＦに基づく現在の発現系がそれらの機能を損なうことなく多様な種の間で移動することができない主な理由であるとの知見に基づく。
本発明は、ｓＴＦの発現のためにコアプロモーターのみを用いることが有利であることを示す。これによって、宿主（例えば、微生物宿主）中でのｓＴＦの低い、構成的な発現が可能になる。
さらに、本発明は、遠い種で機能するコアプロモーターを同定する方法を開発することが可能であることを示す。
さらに、本発明は、広範囲の真核生物（例えば、真核微生物）にわたって標的遺伝子の調節可能な発現レベルを可能にする、多様な種で機能するこれらのコアプロモーターに基づく発現系を構築することが可能であることを示す。
従って、本発明は、真核宿主（例えば、微生物宿主）のための発現系であって、
（ａ）合成転写因子（ｓＴＦ）をコードするＤＮＡ配列の発現を制御するための唯一の「プロモーター」であるコアプロモーターを含む発現カセットと、
（ｂ）合成プロモーターに作動可能に連結された所望の製品をコードするＤＮＡ配列をそれぞれ含む、１つ以上の発現カセットとを含み、
前記合成プロモーターが、（ａ）と同一のコアプロモーター又は別のコアプロモーター、及び前記コアプロモーターの上流にｓＴＦ特異的結合部位を含む、発現系を提供する。
本発明はまた、発現系を含む、真核微生物宿主等の真核宿主を提供する。
さらに、本発明は、適切な培養条件下で真核宿主を培養することを含む、真核宿主中で所望のタンパク質製品を（又は複数の所望のタンパク質製品を同時に）製造するための方法を提供する。
さらに、本発明は、適切な培養条件下で真核微生物宿主を培養することを含む、真核微生物宿主中で所望のタンパク質製品を（又は複数の所望のタンパク質製品を同時に）製造するための方法を提供する。
本発明はまた、真核宿主のためのユニバーサルコアプロモーターを同定するための方法を提供する。
同定方法は、以下の工程を含む。
・サッカロミケス・セレビシエ中で合成転写因子ｓＴＦを構成的に発現する工程、
・試験されるコアプロモーターとその上流のｓＴＦ結合部位を含むｓＴＦ依存性試験プロモーターに、作動可能に連結されたレポーター遺伝子を、同一宿主中で同時発現させる工程、
・前記レポーター遺伝子を、前記ｓＴＦによる活性化の存在下、前記試験プロモーター下で発現されることを可能にする工程、
・前記レポーター遺伝子の発現レベルを評価する工程、及び
・同じレポーター系で試験されたＳ．セレビシエPGK1コアプロモーターで得られたレポーター遺伝子の発現の少なくとも40％の高さの発現を示すコアプロモーターを、前記試験されたコアプロモーターから選択する工程、
・特定の場合において、また、同じレポーター系で試験されたＳ．セレビシエPGK1コアプロモーターで得られたレポーター遺伝子の発現と比較して、レポーター遺伝子の発現が40％未満であるコアプロモーターを選択する工程。
さらに、本発明はユニバーサルコアプロモーター（ＵＣＰ）を提供する。ユニバーサルコアプロモーターは、開示された同定方法によって得ることができる。
ユニバーサルコアプロモーター（ＵＣＰ）は、典型的には、TATAボックスの10〜50bp上流で開始し、ATG開始コドンの9bp上流で終わる真核生物遺伝子の５’上流領域を含むＤＮＡ配列を含む。TATAボックスと開始コドンとの間の距離は、好ましくは180bp以下であり、80bp以上である。ＵＣＰは、典型的には、その３’末端でランダムな1〜20bpを含むＤＮＡ配列も含む。一実施態様では、ＵＣＰは、典型的には、真核生物遺伝子の前記５’上流領域と少なくとも90％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、及びその３’末端にランダムな1〜20bpを含むＤＮＡ配列を含む。
さらに、本発明は、真核宿主の発現系であって、
（ａ）合成転写因子（ｓＴＦ）をコードするＤＮＡ配列の発現を制御するユニバーサルコアプロモーターを含む発現カセットと、
（ｂ）合成プロモーターに作動可能に連結された所望のタンパク質製品をコードするＤＮＡ配列をそれぞれ含む、１つ以上の発現カセットとを含み、
前記合成プロモーターが、（ａ）と同一のＵＣＰ又は別のＵＣＰ、及び前記ＵＣＰの上流にｓＴＦ特異的結合部位を含む、発現系を提供する。
さらに、本発明は、ユニバーサルコアプロモータを使用する発現系を含む真核宿主（例えば、真核微生物宿主）を提供する。
本発明はまた、ユニバーサルコアプロモーターを有する発現系を用いて、真核宿主（例えば、真核微生物宿主）中で所望のタンパク質製品を（又は複数の所望のタンパク質製品を同時に）製造する方法を提供する。
従って、本発明は、標的遺伝子の堅牢で安定した予測可能な発現レベルを可能にし、宿主生物の培養条件又は発達段階若しくは成長段階によって影響を受けない、広範囲の真核生物又は真核微生物中で機能的（移動可能）である直交性発現系を提供する。
本発明によって提供される発現系は、新しい発現宿主を構築するために必要な遺伝子ツールを単純化し、焦点を合わせる。現在、高度に生物特異的及び種特異的な多数の発現系が存在する。本発明によって、真核生物に取り組む産業界及びより広い科学界は、より小さい共通の直交性発現ツールのセットを採用することができる。これによって、産業界及び科学界に利益をもたらし、本技術分野における新しいイノベーションを推進する。
真核生物（例えば、真核微生物）中での単一遺伝子の発現のための発現系のスキームを示す。 候補コアプロモーターからＵＣＰを選択するためのスクリーニング方法のスキームを示す。 候補コアプロモーターからＵＣＰを選択するためのスクリーニング方法のスキームを示す。 候補コアプロモーターからＵＣＰを選択するためのスクリーニング方法のスキームを示す。 真核微生物等の真核生物中での複数の遺伝子の発現を同時に調節するためのＵＣＰを利用する発現系のスキームを示す。 多様な生物又は微生物中で機能的／移動可能な発現系の例を示す。 ｓＴＦの異なるバージョンの試験及び蛍光測定法によるサッカロミケス・セレビシエ中の発現系の性能の調節の評価を示す。 ｓＴＦの異なるバージョンの試験及び蛍光測定法によるサッカロミケス・セレビシエ中の発現系の性能の調節の評価を示す。 多様な真菌宿主中での発現系の分析を示す。蛍光フローサイトメトリーによって決定されたレポーター遺伝子発現の定量分析である。 多様な真菌宿主中での発現系の分析を示す。蛍光測定によって決定されたレポーター遺伝子発現の定量分析である。 蛍光フローサイトメトリー及びウエスタンブロッティングによる、異なる宿主（ピキア・クドリアブゼビ（Pichia kudriavzevii）及びアスペルギルス・ニガー）中での調整可能な発現レベルの分析を示す。 蛍光フローサイトメトリー及びウエスタンブロッティングによる、異なる宿主（ピキア・クドリアブゼビ及びアスペルギルス・ニガー）中での調整可能な発現レベルの分析を示す。 蛍光フローサイトメトリー及びウエスタンブロッティングによる、異なる宿主（トリコデルマ・リーゼイ）中での調整可能な発現レベルの分析を示す。 蛍光フローサイトメトリー及びウエスタンブロッティングによる、異なる宿主（トリコデルマ・リーゼイ）中での調整可能な発現レベルの分析を示す。 カザフスタニア・エグジグア（Kazachstania exigua）のための発現系のスキームを示す。 定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によるカザフスタニア・エグジグア中でのレポーター遺伝子発現の分析を示す。 発現系を含む多様な発現宿主（トリコデルマ・リーゼイ）中でのタンパク質の産生の分析を示す。 発現系を含む多様な発現宿主（トリコデルマ・リーゼイ）中でのタンパク質の産生の分析を示す。 発現系を含む多様な発現宿主（ピキア・パストリス（Pichia pastoris））中でのタンパク質の産生の分析を示す。 発現系を含む多様な発現宿主（ピキア・パストリス）中でのタンパク質の産生の分析を示す。
定義
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
「ＤＮＡ」はデオキシリボ核酸を意味する。
「コドン」は、タンパク質をコードする遺伝子中の単一のアミノ酸をコードするトリヌクレオチド単位である。１つのアミノ酸をコードするコドンは、それらの３つのヌクレオチドのいずれかにおいて異なっていてもよい。異なる生物はそれらのゲノム中のコドンの頻度が異なり、これはｍＲＮＡ翻訳及びタンパク質産生の効率に影響を及ぼす。
「コード配列」は、特定のＲＮＡ又はポリペプチド（すなわち特定のアミノ酸配列）をコードするＤＮＡ配列を意味する。コード配列は、場合によっては、イントロン（すなわち、ＲＮＡスプライシングと呼ばれる過程でＲＮＡ分子成熟の間に除去される、リーディングフレームを中断する付加的な配列）を含み得る。コード配列がポリペプチドをコードする場合、この配列はリーディングフレームを含む。
「リーディングフレーム」は、開始コドン（ＲＮＡ中のAUG；ＤＮＡ配列中のATGに対応する）で規定され、ポリペプチド（タンパク質）をコードする連続したコドンの配列である。リーディングフレームは、終止コドン（ＲＮＡ中のUAG、UGA及びUAAの３つのうちの１つ；ＤＮＡ配列中のTAG、TGA及びTAAに対応する）で終わる。当業者は、一般に利用可能なコンピュータプログラム及びデータベースを用いてオープンリーディングフレームの位置を予測することができる。
真核生物の「プロモーター」は、遺伝子の転写の開始に必要なＤＮＡの領域である。これは、特定のＲＮＡ又はポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（「コード配列」）の上流にある。これには、上流活性化配列（ＵＡＳ）及びコアプロモーターが含まれる。当業者は、一般に利用可能なコンピュータプログラム及びデータベースを使用することによってプロモーターの位置を予測することができる。
「コアプロモーター（ＣＰ）」は、真核生物のプロモーターの一部であり、開始コドンで規定されるポリペプチドをコードするコード配列のすぐ上流（５’上流領域）のＤＮＡの領域である。コアプロモーターは、TATAボックス等の転写の開始に必要な全般的な転写調節モチーフを含むが、ＵＡＳ配列（固有のアクチベーター及びリプレッサーのための結合部位）等の特定の調節モチーフを含まない。
「コアプロモーター」は、本発明の目的のために、１）「TATAボックス」の10〜50bp上流で開始し、開始コドンの9bp上流で終わる「高度に発現される遺伝子」の５’上流領域であって、TATAボックスと開始コドンとの距離が180bp以下で80bp以上である５’上流領域と、２）ＤＮＡ領域（１）の開始コドンのすぐ上流の9bpの代わりに位置する、ランダムな1〜20bp、典型的には5〜15bp又は6〜10bpとを含むＤＮＡ配列として定義されるか、又は１）前記５’上流領域と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％の配列同一性を有するＤＮＡ配列と、２）ＤＮＡ領域（１）の開始コドンのすぐ上流の9bpの代わりに位置する、ランダムな1〜20bp、典型的には5〜15bp又は6〜10bpとを含むＤＮＡ配列として定義される。
本発明の文脈における生物中の「高度に発現される遺伝子」は、その生物中に現われ、トランスクリプトミクス分析によって決定された任意の研究された条件における全遺伝子中の上位3％又は5％の中に発現される遺伝子、又はトランスクリプトミクス分析が行われていない生物中の遺伝子であって、前記高度に発現される遺伝子に最も近い配列相同体である遺伝子である。
「TATAボックス」は、本発明の目的のために、開始コドンの上流のＤＮＡ配列（TATA）であって、TATA配列と開始コドンとの距離が180bp以下で80bp以上であるＤＮＡ配列として定義される。この定義を満たす配列が複数ある場合、TATAボックスは、開始コドンから最小の距離を有するTATA配列として定義される。
「転写因子」は、ＵＡＳ中に存在する特定のＤＮＡ配列に結合し、それによってＲＮＡポリメラーゼIIによって行われる転写速度を制御するタンパク質を意味する。転写因子は、遺伝子のコアプロモーターへのＲＮＡポリメラーゼの動員を（アクチベーターとして）促進するか、又は（リプレッサーとして）遮断することによって、この機能を単独で、又は複合体中の他のタンパク質と共に行う。
「合成転写因子（ｓＴＦ）」は、転写因子として機能するが、宿主生物の固有のタンパク質ではないタンパク質を意味する。本発明の文脈において、ｓＴＦは、典型的には原核生物由来のＤＮＡ結合タンパク質、核局在化シグナル、及びウイルス起源の転写活性化ドメインを含む人工のタンパク質である。
「合成プロモーター」は、真核生物プロモーターとして機能するＤＮＡの領域を意味するが、宿主生物の天然起源のプロモーターではない。これは、上流活性化配列（ＵＡＳ）及びコアプロモーターを含み、ＵＡＳ、又はコアプロモーター、又は両方の要素は、宿主生物にとって固有ではない。本発明の文脈において、合成プロモーターは、コアプロモーターに連結された（通常１〜１０個の、典型的には１、２、４又は８個の）ｓＴＦ特異的結合部位（合成ＵＡＳ−ｓＵＡＳ）を含む。
「ＤＮＡ結合ドメイン」又はＤＢＤは、タンパク質と特定のＤＮＡ配列との相互作用（結合）に応答性があるタンパク質の領域、典型的には特異的なタンパク質ドメインを意味する。
「ユニバーサルコアプロモーター（ＵＣＰ）」は、本発明に開示されるような「ＣＰ−スクリーニング系」で試験され、サッカロミケス・セレビシエPKG1コアプロモーターと共に得られた、十分な（通常、少なくとも40％の、しかし必ずしもそうとも限らない）レポーター発現、又は蛍光レベル等の活性レベルを与えるコアプロモーターである。この系を用いて選択されたコアプロモーターは、典型的には、真核生物の種々の種及び属における転写因子の十分な発現を提供する。
「直交性発現系」は、本明細書において、異種（固有ではない）コアプロモーター、転写因子、及び転写因子特異的結合部位からなる発現系を意味する。典型的には、直交性発現系は、真核微生物等の多様な真核生物において機能的（移動可能）である。
「ＣＰ−スクリーニング系」はサッカロミケス・セレビシエ中に構築される。ＣＰ−スクリーニング系は、ｓＴＦを構成的に発現するサッカロミケス・セレビシエ株と、好ましくは試験されるコアプロモーターを組み立てたセントロメア型レポータープラスミドとを含む。レポータープラスミドは、典型的にはｓＴＦに特異的な結合部位、mCherry遺伝子等のレポーター遺伝子、及びmCherry遺伝子のためのADH1ターミネーター等のターミネーターを含む。試験されたコアプロモーターは、ｓＴＦ結合部位とレポーター遺伝子の間に挿入される。試験されたコアプロモーターは、典型的には、その３’末端に、配列TTAATTAAA等の１〜２０個のランダムなヌクレオチドを含み、典型的には制限部位を含む。コアプロモーターの機能は、得られた株の蛍光測定等のレポーター測定によって評価され、サッカロミケス・セレビシエPKG1コアプロモーターである対照株と比較される。
「セントロメアプラスミド」とは、本明細書において、Ｓ．セレビシエで使用される単一又は低コピー数のプラスミドを意味する。このプラスミドは、Ｓ．セレビシエにおけるセントロメア（ＣＥＮ配列）及び自律複製配列（ＡＲＳ）として機能するＤＮＡ領域を含む。ＡＲＳ配列は複製起点を提供し、ＣＥＮ配列は細胞分裂中のプラスミドの複製及び分布を調節し、セントロメアプラスミドを染色体に類似するようにする。
「転写因子の十分な発現」は、転写因子依存性プロモーターの制御下にある１つ又は複数の遺伝子の転写活性化をもたらす転写因子の発現レベルとして定義される。
「真核生物」は、本明細書において、以下の１）〜３）に属する生物として定義される。
１）菌類界。これには、酵母が含まれ、例えばサッカロミケス・セレビシエ、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、カンジダ・クルセイ（Candida krusei（ピキア・クドリアブゼビ））、ピキア・パストリス（コマガタエラ・パストリス（Komagataella pastoris））、エレモテシウム・ゴシッピー（Eremothecium gossypii）、カザフスタニア・エグジグア、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）及びその他の種を含むがこれに限定されないサッカロミケス目（Saccharomyceetales）；シゾサッカロミケス・ポンベ等のシゾサッカロミケス綱（Schizosaccharomycetes）；アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・ニドュランス、ペニシリウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）及びその他が含まれるがこれらに限定されないユーロチウム菌綱（Eurotiomycetes）の種等の糸状菌；トリコデルマ・リーゼイ、マイセリオフィソラ・サーモフィル（Myceliophthora thermophile）及びその他の種を含むがこれらに限定されないフンタマカビ綱（Sordariomycetes）；又はムコール・インディカス（Mucor indicus）及びその他等のケカビ目（Mucorales）が含まれる。
２）植物界。これには、タバコ属（Nicotiana（ニコチアナ・ベンタミアーナ（N. benthamiana）））、ナス属（Solanum（ジャガイモ（S. tuberosum）））、トマト属（Lycopersicon（トマト（L. esculentum）））、トウガラシ属（Capsicum（トウガラシ（C. anuum）））及びその他の属を含むがこれらに限定されないナス目（Solanales）；シロイヌナズナ属（Arabidopsis（アラビドプシス・サリアナ（A. thaliana）））、アブラナ属（Brassica（セイヨウアブラナ（B. napus）））及びその他の属を含むがこれに限定されないアブラナ目（Brassicales）；エンバク（Avena sativa）、ライムギ（Secale cereale）、トウモロコシ（Zea mays）、小麦（Triticum spp.）、イネ（Oryza sativa）、大麦（Hordeum vulgare）、タカキビ（Sorghum bicolor）、サトウキビ（Sacchumum officinalum）及びその他の種を含むがこれらに限定されないイネ目（Poales）；インゲンマメ属（Phaseolus spp.）、ササゲ属（Vigna spp.）、ダイズ（Glycine max）、エンドウ（Pisum sativum）、レンズマメ（Lens culinaris）、ヒヨコマメ（Cicer arietinum）及びその他の種を含むがこれらに限定されないマメ目（Fabales）；ポプラス属（Populus）及びその他の属を含むがこれらに限定されないキントラノオ目（Malpighiales）；マツ属（Pinus）及びその他の属を含むがこれらに限定されないマツ目（Pinales）；アブラヤシ（Elaeis guineensis）、ココヤシ（Cocos nucifera）及びその他の種を含むがこれらに限定されないヤシ目（Arecales）等の顕花植物が含まれ、また、クラミドモナス属（Chlamydomonas（クラミドモナス・レインハルディ（C. reinhardtii）））を含むがこれに限定されない緑藻類（Chlorophyceae）；又はクロレラ種（Chlorella spp.）及びその他を含むがこれらに限定されないトレボウクシア藻綱（Trebouxiophyceae）等の緑藻が含まれる。
３）動物界。これには、ムス・ムスクルス（Mus musculus（マウス））、Cricetulus griseus（チャイニーズハムスター（ハムスター））、ホモサピエンス（Homo sapiens（ヒト））及びその他の種を含むがこれらに限定されない哺乳類（Mammalia）；並びにヨトウガ（Mamestra brassicae）、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）、イラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）及びその他の種を含むがこれらに限定されない昆虫が含まれる。
「真核微生物」は、本発明の文脈において、サッカロミケス・セレビシエ、クルイベロマイセス・ラクティス、カンジダ・クルセイ（ピキア・クドリアブゼビ）、ピキア・パストリス（コマガタエラ・パストリス）、エレモテシウム・ゴシッピー、カザフスタニア・エグジグア、ヤロウィア・リポリティカ及びその他の種を含むがこれに限定されないサッカロミケス目等の酵母；シゾサッカロミケス・ポンベ等のシゾサッカロミケス綱；アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・ニドュランス、ペニシリウム・クリソゲナム及びその他が含まれるがこれらに限定されないユーロチウム菌綱の種等の糸状菌；トリコデルマ・リーゼイ、マイセリオフィソラ・サーモフィル及びその他の種を含むがこれらに限定されないフンタマカビ綱；ムコール・インディカス及びその他等のケカビ目を含む微生物として定義される。
本発明は、真核宿主のための発現系であって、
（ａ）合成転写因子（ｓＴＦ）をコードするＤＮＡ配列の発現を制御するための唯一のプロモーターであるコアプロモーターを含む発現カセットと、
（ｂ）合成プロモーターに作動可能に連結された所望の製品をコードするＤＮＡ配列をそれぞれ含む、１つ以上の発現カセットとを含み、
前記合成プロモーターが、（ａ）におけるコアプロモーターと同一のコアプロモーター又は別のコアプロモーター、及び前記コアプロモーターの上流に１つ以上のｓＴＦ特異的結合部位を含む、発現系を提供する。
コアプロモーターは、典型的には、TATAボックスの10〜50bp上流で開始し、ATG開始コドンの9bp上流で終わる真核生物遺伝子の５’上流領域を含むＤＮＡ配列を含む。TATAボックスと開始コドンの間の距離が180bp以下で80bp以上である。コアプロモーターは、典型的には、その３’末端に位置するランダムな1〜20bpを含むＤＮＡ配列も含む。一実施態様では、コアプロモーターは、典型的には、真核生物遺伝子の前記５’上流領域と少なくとも90％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、及びその３’末端にランダムな1〜20bpを含むＤＮＡ配列を含む。
合成転写因子（ｓＴＦ）をコードするＤＮＡ配列は、典型的には、原核生物転写調節因子、核局在化シグナル、及び転写活性化ドメインを含む。
発現系で用いられるＣＰは、異なるものであってもよく、又は第１のＣＰ１は、第２のＣＰ２（又は第３のＣＰ３、又は第４のＣＰ４）と同一であってもよい。これは図１と図３に示される。
２つの発現カセット（（ａ）及び（ｂ））を、２つの個々のＤＮＡ分子として、又は２つ（又はそれ以上）の発現カセットが単一のＤＮＡを形成するように連結された（融合された）１つのＤＮＡ分子として、真核宿主に（典型的にはゲノムに組み込まれて）導入することができる。
標的遺伝子が宿主生物の固有の（同種の）遺伝子である特定の適用において、合成プロモーターを、宿主生物のゲノム中の標的遺伝子のコード領域のすぐ上流に、ことによると標的遺伝子の元々の（固有の）プロモーターと取り替えて、挿入することができる。
より具体的には、従って、発現系は、以下の少なくとも２つの個々の発現カセットを含む発現系に組み立てられた２つのＤＮＡ部分を含む。
（ａ）融合タンパク質（ｓＴＦ）をコードする遺伝子の発現を制御するＣＰ、ｓＴＦそれ自体、及びターミネーターを含む、ｓＴＦ（合成転写因子）カセット。ｓＴＦは、原核生物由来のＤＮＡ結合タンパク質、典型的にはTetRファミリー由来等の細菌転写調節因子と、SV40 NLS等の核局在シグナルと、VP16又はVP64活性化ドメイン等の転写活性化ドメインとを含む。及び
（ｂ）０〜２０個の、典型的には５〜１５個のランダムなヌクレオチドで分離された、変化する数の、通常は１〜１０個、典型的には１、２、４又は８個のｓＴＦ結合部位と、ＣＰと、標的遺伝子と、ターミネーターとを含む合成プロモーターを含む、標的遺伝子発現カセット。
例示的な発現系の構成を図１に示す。
本発明は、合成転写因子（ｓＴＦ）の発現のために、完全プロモーターの代わりにコアプロモーター（ＣＰ）を使用するという考えに基づいている。一部のＣＰは、遺伝子の前に配置されたときに低レベルの転写を維持することができる。完全なプロモーター（典型的には上流活性化配列（ＵＡＳ））中に存在する条件的転写制御に必要とされる特異的調節配列がないために、この転写は構成的であり、それはすべての増殖又は代謝条件で一定である。一般的な転写機構は進化的に保存されているため、ＣＰのいくつかは非常に多様な種で機能することができる。これらの特徴は、本発明において、複数の種に転写可能な発現系の構築のために使用される。
ＣＰによって促進されるｓＴＦ遺伝子の構成的な低い発現は、十分な量の合成転写因子を提供し、合成転写因子は標的遺伝子の合成プロモーター上のその特異的結合部位に結合し、その発現を活性化する。結合部位の数は標的遺伝子の発現レベルに比例し、結合部位が多いほど高い発現になる。合成プロモーターは、ｓＴＦ結合部位に加えて、ＣＰも含む。標的遺伝子の発現を制御する合成プロモーターにおけるＣＰの選択もまた、標的遺伝子の発現レベルのために重要である。ｓＴＦ結合部位とＣＰの組み合わせによって、非常に低いレベルから非常に高いレベルまで調節することができる発現レベルの範囲がもたらされ得る。最高の発現では、この発現系で達成される発現は、宿主生物における最も高度に発現される固有の遺伝子の発現レベルを超える。
図１は、真核生物又は微生物中での単一遺伝子の発現のための発現系のスキームの例を示す。合成転写因子（ｓＴＦ）発現カセットは、ＣＰ（ＣＰ１）、ｓＴＦコード配列、及びターミネーターを含む。ＣＰ１は、ｓＴＦの構成的な低い発現を提供する。従って、ｓＴＦは、常に、すべての増殖条件及びすべての発生段階及び成長段階で、宿主細胞内に一定のレベルで存在する。標的遺伝子発現カセットは、合成プロモーター、標的遺伝子コード配列、及びターミネーターを含む。合成プロモーターは、複数のｓＴＦ特異的結合部位（通常１〜１０個、典型的には１、２、４又は８個；合成上流活性化配列（ｓＵＡＳ）を形成する）及びＣＰ（ＣＰ２）を含む。標的遺伝子は目的のタンパク質製品をコードする。
ＣＰ１の転写活性である「シグナル」は、ｓＵＡＳに結合したｓＴＦによって「増幅」される。これは、ＣＰ２上で転写を活性化し、標的遺伝子の発現をもたらす。上記のように、２つの発現カセットを、２つの個々のＤＮＡ分子として、又は２つの発現カセットが単一のＤＮＡに連結された（融合された）１つのＤＮＡ分子として、真核宿主に（典型的にはゲノムに組み込まれて）導入することができる。標的遺伝子が宿主生物の固有の（同種の）遺伝子である特定の適用において、合成プロモーターを、宿主生物のゲノム中の標的遺伝子のコード領域のすぐ上流に挿入することができる。本発現系で使用されるＣＰは異なってもよく、ＣＰ１はＣＰ２と同一であってもよい。
本発明はまた、本明細書中に開示される発現系を含む真核宿主（例えば、真核微生物宿主）を提供する。
真核生物は、本明細書において、特に以下の１）〜３）の生物を意味する。
１）菌種。これには、酵母が含まれ、例えばサッカロミケス・セレビシエ、クルイベロマイセス・ラクティス、カンジダ・クルセイ（ピキア・クドリアブゼビ）、ピキア・パストリス（コマガタエラ・パストリス）、エレモテシウム・ゴシッピー、カザフスタニア・エグジグア、ヤロウィア・リポリティカ及びその他を含むがこれに限定されないサッカロミケス目；シゾサッカロミケス・ポンベ等のシゾサッカロミケス綱；アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・ニドュランス、ペニシリウム・クリソゲナム及びその他が含まれるがこれらに限定されないユーロチウム菌綱の種からの菌種等の糸状菌種；トリコデルマ・リーゼイ、マイセリオフィソラ・サーモフィル及びその他を含むがこれらに限定されないフンタマカビ綱；又はムコール・インディカス及びその他等のケカビ目が含まれる。
２）植物種。これには、ニコチアナ・ベンタミアーナ、ジャガイモ、トマト、トウガラシ及びその他の属を含むがこれらに限定されないナス目；アラビドプシス・タリアナ、セイヨウアブラナ及びその他の属を含むがこれに限定されないアブラナ目；エンバク、ライムギ、トウモロコシ、小麦、イネ、大麦、タカキビ、サトウキビ及びその他の種を含むがこれらに限定されないイネ目；インゲンマメ属、ササゲ属、ダイズ、エンドウ、レンズマメ、ヒヨコマメ及びその他を含むがこれらに限定されないマメ目；ポプラス属及びその他の属を含むがこれらに限定されないキントラノオ目；マツ属及びその他の属を含むがこれらに限定されないマツ目；アブラヤシ、ココヤシ及びその他の種を含むがこれらに限定されないヤシ目からの種等の顕花植物が含まれ、及び、クラミドモナス・レインハルディ、クロレラ種及びその他を含むがこれらに限定されない緑藻種が含まれる。
３）動物種。これには、ムス・ムスクルス（マウス）、チャイニーズハムスター（ハムスター）、ホモサピエンス（ヒト）及びその他の種を含むがこれらに限定されない哺乳類；並びにヨトウガ、スポドプテラ・フルギペルダ、イラクサギンウワバ、キイロショウジョウバエ及びその他の種を含むがこれらに限定されない昆虫種が含まれるがこれらに限定されない。
本発明はまた、適切な培養条件下で宿主を培養することを含む、真核宿主（例えば、微生物宿主）中で所望のタンパク質製品を製造する方法を提供する。
適切な培養条件とは、宿主生物の生存若しくは増殖及び／又は宿主生物中での所望の製品の製造を可能にする任意の条件を意味する。所望の製品は、１つ又は複数の標的遺伝子（１つ又は複数のタンパク質）の製品、又はタンパク質（酵素）若しくは代謝経路によって製造される化合物であり得る。本明細書の文脈において、所望の製品は、典型的にはタンパク質（酵素）製品である。
本発明は、いくつかの異なる真核生物の種及び属中で機能的である遺伝子発現系も提供する。本発現系の重要な要素は、いくつかの種で発現を促進するコアプロモーターである。このようなコアプロモーターは、本明細書においてユニバーサルコアプロモーター（ＵＣＰ）と呼ばれる。
いわゆる基礎転写活性と呼ばれるこの性質は、コアプロモーターへのＲＮＡポリメラーゼII複合体の効率的な動員に基づいている。この動員によって、すべての培養及び成長（発育）条件において、低いが安定した発現レベルをもたらされる。この低い構成的なシグナルは、ＵＣＰによって発現が制御される合成転写因子（ｓＴＦ）によって、（固有の又は異種の）標的遺伝子の調節可能な発現レベルにまで増幅される。各標的遺伝子は、設計されたプロモーターの制御下にあり、選択された数のｓＴＦ特異的結合部位及びＵＣＰを含む。ｓＴＦ特異的結合部位とＵＣＰの組み合わせは、標的遺伝子の発現レベルを規定する。
これは、未開発のノウハウのものを含む、多様な宿主中での発現を制御する手段を提供する。ＵＣＰの使用は、タンパク質製造、代謝工学、人工遺伝的規制ネットワークに適用される。
さらに、発現系は、新しい特性を有する新規なＵＣＰを同定するためのプラットフォームとして使用することができる。
本発明は、真核宿主のためのユニバーサルコアプロモーターを同定するための方法を提供する。同定方法は、以下の工程を含む。
・サッカロミケス・セレビシエ中で合成転写因子ｓＴＦを構成的に発現する工程、
・試験されるコアプロモーターとその上流のｓＴＦ結合部位を含むｓＴＦ依存性試験プロモーターに、作動可能に連結されたレポーター遺伝子を、同一宿主中で同時発現させる工程、
・前記レポーター遺伝子を、前記ｓＴＦによる活性化の存在下、前記試験プロモーター下で発現されることを可能にする工程、
・前記レポーター遺伝子の発現レベルを評価する工程、及び
・同じレポーター系で試験されたＳ．セレビシエPGK1コアプロモーターで得られたレポーター遺伝子の発現の少なくとも40％の高さの発現を示すコアプロモーターを、前記試験されたコアプロモーターから選択する工程、
・特定の場合において、また、40％未満のレポーターの発現レベルを示すコアプロモーターを選択する工程。
より具体的には、本方法は、試験されたコアプロモーターに作動可能に連結されたｓＴＦ特異的結合部位及びレポーター遺伝子を含む環状セントロメアプラスミドの使用を最適に含む。
合成転写因子（ｓＴＦ）をコードするＤＮＡ配列は、典型的には、原核生物由来のＤＮＡ結合タンパク質をコードするＤＮＡ配列、核局在化シグナル、及び転写活性化ドメインを含む。ｓＴＦは、原核細胞由来の、典型的には細菌由来のＤＮＡ結合タンパク質、TetRファミリー由来等のタンパク質等の細菌転写調節因子と、SV40 NLS等の核局在化シグナルと、VP16又はVP64活性化ドメイン等の転写活性化ドメインとを含む。
試験されるプロモーターは、所定の真核生物の任意の状態において、全ての遺伝子の最高3％又は5％のレベルまで発現された真核生物の遺伝子のプロモーターから選択される。
本発明は、コアプロモーターが本明細書に開示された同定方法によって得ることができるユニバーサルコアプロモーター（ＵＣＰ）を提供する。
典型的には、ユニバーサルコアプロモーターは、１）TATAボックスの10〜50bp上流で開始し、ATG開始コドンの9bp上流で終わる真核生物の遺伝子の５’上流領域と、２）ＤＮＡ領域（１）の開始コドンのすぐ上流の9bpの代わりに位置するランダムな1〜20bpのＤＮＡ配列とを含むＤＮＡ配列を含む。TATAボックスと元の真核生物の遺伝子の開始コドンとの距離は、180bp以下で80bp以上である。一実施態様では、コアプロモーターは、前記５’上流領域と少なくとも90％の配列同一性を有するＤＮＡ配列と、ＤＮＡ領域（１）の開始コドンのすぐ上流の9bpの代わりに位置する、ランダムな1〜20bpのＤＮＡ配列とを含む。
遠い生物で機能的なＣＰの選択はサッカロミケス・セレビシエで行われた。候補ＣＰの供給源は、好ましくは（必然的ではないが）産業的に関連する生物であり、好ましくは（必然的ではないが）、進化的分岐の観点で、又はゲノム構造若しくはGC含有量等の他の特徴の点で遠いものである。
候補ＣＰの選択は、プロモーター中に候補ＣＰを含む選択された供給源の生物における遺伝子の発現レベルに基づく。別の選択基準は、候補ＣＰ中のTATAボックスの存在である（図２Ａ）。
一実施態様では、機能的なＣＰのスクリーニングは、候補ＣＰを、ｓＴＦを構成的に発現するＳ．セレビシエ株中で発現されるｓＴＦ依存性レポーターカセットと共にインビボで組み立てることによって、有利に行われる（図２Ｂ）。得られた株を、レポーターのレベル、好ましくは蛍光について試験し、これらのレベルをＳ．セレビシエPGK1コアプロモーターがレポーター構築物中に使用される対照株と比較する。十分なレポーターレベル、好ましくは蛍光レベル（通常は必ずしも対照株の40％以上である必要はない）を促進し（図２Ｃ）、従ってスクリーニングの基準を満たす候補ＣＰは、ユニバーサルコアプロモーター、ＵＣＰと呼ばれる。選択されたＣＰ及びＵＣＰは、発現系の構築に用いられる。
得られた発現系は、真核宿主において機能的である。これらの宿主は、すべての真核生物を含み、特に以下の１）〜３）の生物を含む。
１）真菌微生物。これには、糸状菌及び酵母が含まれ、特に、以下の分類群からの生物が含まれる。Ａ）サッカロミケス・セレビシエ、クルイベロマイセス・ラクティス、カンジダ・クルセイ（ピキア・クドリアブゼビ）、ピキア・パストリス（コマガタエラ・パストリス）、エレモテシウム・ゴシッピー、カザフスタニア・エグジグア、ヤロウィア・リポリティカ及びその他の種を含むがこれに限定されないサッカロミケス目；シゾサッカロミケス・ポンベ等のシゾサッカロミケス綱；Ｂ）アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・ニドュランス、ペニシリウム・クリソゲナム及びその他が含まれるがこれらに限定されないユーロチウム菌綱；Ｃ）トリコデルマ・リーゼイ、マイセリオフィソラ・サーモフィル及びその他を含むがこれらに限定されないフンタマカビ綱；Ｄ）ムコール・インディカス及びその他等のケカビ目。
２）植物。これには、顕花植物及び緑藻が含まれ、特に以下の分類群からの生物が含まれる。Ｅ）ニコチアナ・ベンタミアーナ、ジャガイモ、トマト、トウガラシ及びその他の属を含むがこれらに限定されないナス目；Ｆ）アラビドプシス・タリアナ、セイヨウアブラナ及びその他の属を含むがこれに限定されないアブラナ目；Ｇ）エンバク、ライムギ、トウモロコシ、小麦、イネ、大麦、タカキビ、サトウキビ及びその他の種を含むがこれらに限定されないイネ目；Ｈ）インゲンマメ属、ササゲ属、ダイズ、エンドウ、レンズマメ、ヒヨコマメ及びその他を含むがこれらに限定されないマメ目；Ｉ）ポプラス属及びその他の属を含むがこれらに限定されないキントラノオ目；Ｊ）マツ属及びその他の属を含むがこれらに限定されないマツ目；Ｋ）アブラヤシ、ココヤシ及びその他の種を含むがこれらに限定されないヤシ目；Ｌ）クラミドモナス・レインハルディ及びその他を含むがこれに限定されない緑藻類；Ｍ）クロレラ種及びその他を含むがこれらに限定されないトレボウクシア藻綱。
３）動物。これには、特に以下の分類群からの生物が含まれる。Ｎ）ムス・ムスクルス（マウス）、チャイニーズハムスター（ハムスター）、ホモサピエンス（ヒト）及びその他の種を含むがこれらに限定されない哺乳類；Ｏ）ヨトウガ、スポドプテラ・フルギペルダ、イラクサギンウワバ、キイロショウジョウバエ及びその他の種を含むがこれらに限定されない昆虫種（Insecta）。
図２Ａ、２Ｂ及び２Ｃは、候補コアプロモーターからＵＣＰを選択するためのスクリーニング方法のスキームの例を示す。
図２Ａは、真核生物における候補コアプロモーターの選択のスキームを例示する。任意の状態において、最も高発現している上位3％又は5％の遺伝子のグループに属する、任意の真核生物の遺伝子のすぐ上流のＤＮＡ領域を、開始コドン（ATG）の上流の-180bpと-80bpの間にあるTATA配列（TATAボックス）の存在について分析する。この領域に２つ以上のTATA配列が出現する場合、ATG（開始コドン）に最も近いものがTATAボックスとして選択される。TATAボックスの10〜50bp上流で開始し、ATG（開始コドン）の9bp上流で終わる配列が、コアプロモータースクリーニングのために選択される。
図２Ｂは、ｓＴＦを構成的に発現するサッカロミケス・セレビシエ株を示す。これは、典型的には、線状化セントロメア（単一又は低コピー数）プラスミド、及び試験されるコアプロモーターのライブラリー又は個々のバージョンで共形質転換される。セントロメアプラスミドは、典型的には、例えば４つのｓＴＦ結合部位と、mCherry遺伝子等のレポーター遺伝子を含み、図に示すようにこれら２つの特徴の間で線状化される。各コアプロモーターＤＮＡ断片は、選択されたＤＮＡ配列（図２Ａ）、次いで典型的には制限部位を含むランダムヌクレオチドを含む配列を含む。ここでは１つの有用な配列は、例えばTTAATTAAAであり、各末端に20〜50bpの長さのＤＮＡ配列が隣接する。これらの隣接配列は、線状化プラスミドの各末端に相同であり、５’隣接配列は、線状化プラスミド中のｓＴＦ結合部位を部分的に覆う領域に相同であり、３’隣接配列はmCherry遺伝子等のレポーター遺伝子のオープンリーディングフレームの５’末端に相同である。形質転換の後、サッカロミケス・セレビシエ酵母の内因性相同組換え機構によってインビボでプラスミドが組み立てられ、ｓＴＦ結合部位、TTAATTAAA等の配列を含むコアプロモーター、及びmCherry遺伝子等のレポーター遺伝子を含む、環状セントロメアプラスミドが得られる。得られた株を、産生されたmCherryタンパク質によって引き起こされる赤色蛍光等のレポーターについて分析する。蛍光等のレポーターの強度レベルは、試験されたコアプロモーターの機能に対応するmCherry遺伝子等のレポーター遺伝子の発現レベルに対応する。
図２Ｃ）典型的には、同じセントロメアプラスミドに組み立てられたPGK1コアプロモーターを含有する株の蛍光等のレポーター（図中、矢印で印を付けた）の40％以上である蛍光等の十分なレベルのレポーターを与える形質転換株が、選択される。選択された株からセントロメアプラスミドを単離し、プラスミドＤＮＡを精製し、配列決定した。選択されたコアプロモーターは、その後の他の真核生物中で試験するための発現カセットの構築のために使用される。特定の場合には、40％以上のレベルのレポーター発現を与えないコアプロモーターも、真核生物の発現カセットの構築のために使用される。コアプロモーターが、コア−プロモーター−ドナー宿主において、及びコア−プロモーター−ドナー宿主とは異なる種である少なくとも１つの他の宿主において機能的である場合、コアプロモーターはユニバーサルコアプロモーターＵＣＰとして選定する。
本発明は、本明細書に開示された方法によって得ることができるユニバーサルコアプロモーター（ＵＣＰ）を提供する。典型的には、ＵＣＰは、１）TATAボックスの10〜50bp上流で開始し、ATG開始コドンの9bp上流で終わる真核生物の遺伝子の５’上流領域であって、TATAボックスと開始コドンとの距離が180bp以下で80bp以上である５’上流領域と、２）ＤＮＡ配列（１）の３’末端に位置するランダムな1〜20bpを含むＤＮＡ配列とを含むＤＮＡ配列を含む。一実施態様では、ユニバーサルコアプロモーターは、１）前記５’上流領域と少なくとも90％の配列同一性を有するＤＮＡ配列と、２）ＤＮＡ配列（１）の３’末端に位置するランダムな1〜20bpを含むＤＮＡ配列とを含む。
本発明は、真核宿主のための発現系であって、
（ａ）合成転写因子（ｓＴＦ）をコードするＤＮＡ配列の発現を制御するＵＣＰを含む発現カセットと、
（ｂ）合成プロモーターに作動可能に連結された所望の製品をコードするＤＮＡ配列をそれぞれ含む、１つ以上の発現カセットとを含み、
前記合成プロモーターが、（ａ）のＵＣＰ又は別のＵＣＰ、及び前記ＵＣＰの上流にｓＴＦ特異的結合部位を含む、発現系を、提供する。
１つのｓＴＦで異なる標的遺伝子を同時に制御する、異なる数の結合部位（０〜２０個の、典型的には５〜１５個のランダムなヌクレオチドで分離されている、通常は１〜１０個、典型的には１、２、４又は８個のもの）を有する複数の合成プロモーターを構築することが可能である。これは、例えば代謝経路を形成する、異なって発現される遺伝子のセットをもたらす。
図３は、真核生物（例えば、微生物）中での複数の遺伝子の発現を同時に調節するためのＵＣＰを利用する発現系のスキームの例を示す。このスキームは仮説的な代謝経路を示す。しかし、このアプローチは、他の多遺伝子の発現系（シグナル伝達、輸送、又はグリコシル化経路、同時タンパク質製造等）又はこれらの組み合わせにも利用できる。
図３の合成転写因子（ｓＴＦ）発現カセット（Ａ）は、図１に示すものと類似しており、同じ目的を果たす。標的遺伝子発現カセットは、１〜２０の範囲の変化する数で存在することができる。各標的遺伝子発現カセットは、古典的な（一方向性の）構造（Ｂ）又は双方向性の設計（Ｃ）のいずれかを有する合成プロモーターを含む。合成プロモーター（一方向性又は双方向性）は、複数のｓＴＦ特異的結合部位（通常１〜１０個、典型的には１、２、４又は８個）及びＵＣＰからなる。標的遺伝子（遺伝子Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）は、代謝経路又はその一部を形成することができる目的のタンパク質をコードするか、又は適用に応じた任意のタンパク質の組み合わせをコードする。
図３に示す発現系の機能は図１に示すものと類似しており、ＵＣＰ１の転写活性は標的遺伝子のｓＵＡＳに結合したｓＴＦによって「調節」される。ＵＣＰと組み合わせた各ｓＵＡＳの占有は、個々の遺伝子の特異的発現レベルをもたらし、標的タンパク質の特定レベルをもたらす。発現カセットは、個々のＤＮＡ分子として、又は個々の発現カセットが互いに融合したより大きなＤＮＡ分子として、真核宿主（典型的にはゲノムに組み込まれている）に導入することができる。標的遺伝子が宿主生物の固有の（同種の）遺伝子である特定の適用では、合成プロモーターを宿主生物のゲノムの各標的遺伝子コード領域のすぐ上流に挿入することもできる。発現系中に用いられるＵＣＰは、異なるものであってもよいし、ＵＣＰの一部又は全部が同一であってもよい。
本発明は、開示された発現系を含む真核宿主を提供する。これらの宿主は、すべての真核生物、特に糸状菌及び酵母を含む真菌微生物、顕花植物及び藻類を含む植物宿主、並びに哺乳動物及び昆虫を含む動物宿主を含む。
本発明はまた、適切な培養条件下で宿主を培養することを含む、真核宿主（例えば、微生物宿主）中で所望のタンパク質製品を製造する方法を提供する。
異なる発現レベルのための発現系の調整はＳ．セレビシエ中で行うことができ、ＵＣＰ、ｓＴＦ、異なる数のＢＳ及び標的遺伝子の選択を含む多数の選択肢を迅速に試験することができる。異なって発現される遺伝子の確立された最適のセットは、その機能を保持する目的宿主に直接導入することができる。この発現系によって達成される高レベルの発現はまた、タンパク質（酵素）製造宿主で利用され得る。Ｓ．セレビシエを使用する利点は、遺伝的改変、ＤＮＡ形質転換、スクリーニング、分析、培養及びin silicoモデリングのための確立された迅速な方法の利用可能性である。この発現系によって、産業用の宿主の開発プロセスが加速され、特定の目的のために高い可能性を有するが、遺伝子工学のためのツールのスペクトルは非常に限られる新規宿主の使用を可能にする。
図４は、多様な真核生物中で機能的／移動可能な発現系の例を示す。単一のＤＮＡ分子中に組み立てられた発現系は、２つの発現カセットを含む。１）ｓＴＦ発現カセット：これは、本明細書中、533cp又は008cp（参照、表１及び２）のいずれかで例示される異なるＵＣＰ、本明細書中、BM3R1で例示されるＤＮＡ結合タンパク質を有するｓＴＦバージョン、及び本明細書中、トリコデルマ・リーゼイTEF1ターミネーターで例示されるターミネーターを含む。そして、２）標的遺伝子発現カセット：これは、本明細書中、８個のBM3R1特異的結合部位で例示される多数のｓＴＦ特異的結合部位、本明細書中、114cp又は201cp（参照、表１及び２）のいずれかで例示される異なるＵＣＰ、本明細書中、mCherry（赤色蛍光タンパク質）コード領域で例示されるレポーター遺伝子コード領域、及び本明細書中、Ｓ．セレビシエADH1ターミネーターで例示されるターミネーターが含まれる。ＤＮＡ結合タンパク質（本明細書ではBM3R1）のコード領域は、アスペルギルス・ニガーのコドン使用に適合するようにコドン最適化された。実施例３では、201cpと008cpを含む発現系バージョンを「バージョンＡ」と称し、114cpと533cpを含む発現系バージョンを「バージョンＢ」と称する。
図５Ａ及び５Ｂは、ｓＴＦの異なるバージョンの試験の例、及びサッカロミケス・セレビシエ中の発現系の性能の調節の評価を示す。
図５Ａ）図４に提示されたものと類似の発現系が、上記発現系に以下の改変を伴って構築された。１）異なるＤＮＡ結合タンパク質をｓＴＦの一部として用いた（LexA、SrpR、PhlF、TetR、BM3R1、及びTarA。参照、実施例１）。２）異なる数のｓＴＦ特異的結合部位を標的遺伝子発現カセットの合成プロモーターに用いた（図に示す８個の結合部位を有するバージョン）。３）個々のカセット（ｓＴＦ発現カセットとレポーターカセット）をそれぞれ単一コピーでサッカロミケス・セレビシエゲノム中に２つの別々のゲノム遺伝子座に組み込んだ（本明細書中、URA3とLEU2で例示）。４）ｓＴＦがＳ．セレビシエコアプロモーターから発現された（本明細書中、TDH3コアプロモーターで例示）。５）レポーター発現カセットで使用されるコアプロモーターが、本明細書中、Ｓ．セレビシエENO1cpで例示された。
図５Ｂ）両方の発現カセットが組み込まれた株を蛍光レベルについて試験した。８つのｓＴＦ特異的結合部位を有し、ｓＴＦ発現カセットを欠く対照発現系（図中に「ｗｏ ｓＴＦ」として示す）を試験した。ＤＮＡ結合タンパク質：SrpR、PhlF、TetR、BM3R1及びTarAが、サッカロミケス・セレビシエのコドン使用頻度に対してコドン最適化された。ほとんどの場合、標的遺伝子の発現レベルの明確な調節が実証され、標的遺伝子発現カセットの合成プロモーターにおけるｓＴＦ特異的結合部位の数（図に示す通り、０〜８個）を反映している。
図６Ａ及び６Ｂは、多様な真菌宿主における発現系の分析の例を示す。蛍光フローサイトメトリー（６Ａ）及び蛍光測定（６Ｂ）によって決定されたレポーター遺伝子発現の定量分析である。構築された発現系（表２）は、単一コピーでサッカロミケス・セレビシエ、アスペルギルス・ニガー、トリコデルマ・リーゼイ、ヤロウィア・リポリティカ、カンジダ・クルセイ（ピキア・クドリアブゼビ）及びピキア・パストリス（コマガタエラ・パストリス）のゲノム中に組み込まれた。これら全ての生物における発現系の機能性は、形質転換株の蛍光分析で確認された。各生物に使用された発現系は、図４に示されるものと同一である。図（６Ａ及び６Ｂ）中の株の名前は、以下を意味する。「WT」は、発現系が形質転換されていない各発現宿主のバックグラウンド株を表す。「A」は、図４に示された201cp及び008cpを含む発現系（単一コピーでゲノムに組み込まれた）のバージョンを有する株を表す。「A＊」は、ｓＴＦのＤＮＡ結合部分がサッカロミケス・セレビシエにおいて頻繁に生じるコドンと一致するようにコドン最適化された発現系バージョンAを有する株を表す。「B」は、図４に示された114cp及び533cpを含む発現系（単一コピーでゲノムに組み込まれた）のバージョンを有する株を表す。「B＊」は、ｓＴＦのＤＮＡ結合部分がサッカロミケス・セレビシエにおいて頻繁に生じるコドンと一致するようにコドン最適化された発現系バージョンBを有する株を表す。「A_NC」及び「B_NC」は、ｓＴＦ発現カセットが存在せず（欠失し）、標的遺伝子発現カセットのみが残っている発現系（A又はB）の陰性対照バージョン（単一コピーでゲノムに組み込まれている）を有する株を表す（本明細書中、８BS＋201cp／114cp＋mCherry＋Sc-ADH1ターミネーターで例示される）。
図６Ａは、宿主中でのmCherry発現のフローサイトメトリー分析（DB FACSAria III Instrument）を示す。分析は細胞（単細胞菌類：サッカロミセス・セレビシエ、ヤロウィア・リポリティカ、ピキア・クドリアブゼビ、ピキア・パストリス）又は胞子（糸状菌：アスペルギルス・ニガー、トリコデルマ・リーゼイ）の上で行った。グラフは、各株からの10000細胞／胞子についての粒子（細胞／胞子）サイズで標準化された蛍光強度（mCherry）（FSC：前方散乱）を示す。横線（灰色の箱の内部）は中央値を表し、灰色の箱は四分位間の範囲（ＩＱ範囲）を表し、灰色の箱の下の線は25％値を表し、灰色の箱の上の線は75％値を表し、箱ひげ図のひげは、25％値／75％値からＩＱ範囲の１．５倍以下の最高値及び最低値まで延びた値を表し、ＩＱ範囲と共に、これらの実験のすべての測定された事象（細胞／胞子）の約99％を表す。
図６Ｂは、宿主中でのmCherry発現の分析の例を示す。分析は、ＳＣＤ培地中で18時間増殖させた後、細胞／菌糸体懸濁液について、Varioskan Instrument（Thermo Electron Corporation）を用いた蛍光測定によって行った。グラフは、蛍光分析に使用した細胞／菌糸体懸濁液の光学密度で標準化した蛍光強度（mCherry）を示す。長柱は、平均値を表し、エラーバーは少なくとも３回の反復実験からの標準偏差を示す。
図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ及び７Ｄは、異なる宿主（ピキア・クドリアブゼビ、アスペルギルス・ニガー及びトリコデルマ・リーゼイ）中での調節可能な発現レベルの分析の例を示す。
図７Ａは、ピキア・クドリアブゼビ及びアスペルギルス・ニガー中でのレポーター遺伝子の発現の調節に使用される変化する数のｓＴＦ結合部位を有する発現系の例（スキームとして示される）を示す。単一のＤＮＡ分子中に組み立てられた発現系は、２つの発現カセット（図４のものに類似）を含む。１）ｓＴＦ発現カセット：これは、本明細書中、008cp（参照、表１）で例示されるＵＣＰ、本明細書中、BM3R1で例示されるＤＮＡ結合タンパク質を有するｓＴＦバージョン、本明細書中、VP16で例示される活性化ドメイン、及び本明細書中、トリコデルマ・リーゼイTEF1ターミネーターで例示されるターミネーターを含む。そして、２）標的遺伝子発現カセット：これは、本明細書中、０、１、２、４及び８個のBM3R1特異的結合部位で例示される異なる数のｓＴＦ特異的結合部位、本明細書中、201cp（参照、表１）で例示される異なるＵＣＰ、本明細書中、mCherry（赤色蛍光タンパク質）コード領域で例示されるレポーター遺伝子コード領域、及び本明細書中、Ｓ．セレビシエADH1ターミネーターで例示されるターミネーターが含まれる。ＤＮＡ結合タンパク質（本明細書ではBM3R1）のコード領域は、アスペルギルス・ニガーのコドン使用に適合するようにコドン最適化された。
図７Ｂは、変化する数（０、１、２、４及び８個）のｓＴＦ結合部位を有する発現系を含む、ピキア・クドリアブゼビ及びアスペルギルス・ニガー中でのmCherry発現のフローサイトメトリー分析（DB FACSAria III Instrument）を示す。分析は、SCD培地で18時間培養して得られた細胞（ピキア・クドリアブゼビ）又はPDA寒天プレートで培養４日後に得られた胞子（アスペルギルス・ニガー）の上で行った。グラフは、各株からの10000細胞／胞子についての粒子（細胞／胞子）サイズで標準化された蛍光強度（mCherry）（FSC：前方散乱）を示す。横線（灰色の箱の内部）は中央値を表し、灰色の箱は四分位間の範囲（ＩＱ範囲）を表し、灰色の箱の下の線は25％値を表し、灰色の箱の上の線は75％値を表し、箱ひげ図のひげは、25％値／75％値からＩＱ範囲の１．５倍以下の最高値及び最低値まで延びた値を表し、ＩＱ範囲と共に、これらの実験のすべての測定された事象（細胞／胞子）の約99％を表す。
図７Ｃは、トリコデルマ・リーゼイ中でのCBH1タンパク質の産生の調節に用いられる変化する数のｓＴＦ結合部位を有する発現系の例（スキームとして示す）を示す。単一のＤＮＡ分子中に組み立てられた発現系は、２つの発現カセット（図４及び７Ａのものに類似）を含む。１）ｓＴＦ発現カセット：これは、本明細書中、533cp（参照、表１）で例示されるＵＣＰ、本明細書中、BM3R1で例示されるＤＮＡ結合タンパク質を有するｓＴＦバージョン、本明細書中、VP16で例示される活性化ドメイン、及び本明細書中、トリコデルマ・リーゼイTEF1ターミネーターで例示されるターミネーターを含む。そして、２）標的遺伝子発現カセット：これは、本明細書中、０、１、２、４及び８個のBM3R1特異的結合部位で例示される異なる数のｓＴＦ特異的結合部位、本明細書中、201cp（参照、表１）で例示される異なるＵＣＰ、本明細書中、トリコデルマ・リーゼイCBH1コード領域（固有のトリコデルマ・リーゼイCBH1遺伝子中に存在するイントロンを含む）で例示される標的遺伝子コード領域、及び本明細書中、Ｓ．セレビシエADH1ターミネーターで例示されるターミネーターが含まれる。ＤＮＡ結合タンパク質（本明細書ではBM3R1）のコード領域は、アスペルギルス・ニガーのコドン使用に適合するようにコドン最適化された。
図７Ｄは、変化する数（０、１、２、４及び８個）のｓＴＦ結合部位を有する発現系を用いて異なるレベルでトリコデルマ・リーゼイによって産生されたCBH1タンパク質のウエスタンブロット分析を示す。２つの異なる培養条件、すなわち、１）（バックグラウンド株WT中で）固有のCBH1遺伝子発現の強力なアップレギュレーションをもたらす、ビール粕抽出物及びラクトースを含む培地（図中の「SGE-ラクトース」）、及び２）（バックグラウンド株WT中で）固有のCBH1遺伝子発現に対する強い阻害効果を有するSCD（図中の「SCD」）を用いた。各培養からの3日間培養物の上清15μLをゲル（4〜20％グラジエント）に負荷した。ゲルをニトロセルロース膜上に移し、CBH1タンパク質を特異的（マウス）抗CBH1一次抗体（及び抗マウスIR680結合二次抗体）で検出し、シグナルの視覚化は、Odyssey CLxイメージングシステム機器（LI-COR Biosciences）で行った。
図８Ａ及び８Ｂは、発現系（８Ａ）のスキーム、及びカザフスタニア・エグジグア（８Ｂ）におけるレポーター遺伝子発現の分析を示す。
図８Ａは、カザフスタニア・エグジグアに使用される発現系の例（スキームとして示される）を示す。単一のＤＮＡ分子中に組み立てられた発現系は、２つの発現カセット（表３）を含む。１）ｓＴＦ発現カセット：これは、本明細書中、Sc-TDH3cp（参照、表１）で例示されるＵＣＰ、本明細書中、TetRで例示されるＤＮＡ結合タンパク質を有するｓＴＦバージョン、本明細書中、VP16で例示される活性化ドメイン、及び本明細書中、カザフスタニア・エグジグアg706ターミネーターで例示されるターミネーターを含む。そして、２）標的遺伝子発現カセット：これは、本明細書中、８個のTetR特異的結合部位で例示される多数のｓＴＦ特異的結合部位、本明細書中、Sc-ENO1cp（参照、表１）で例示される異なるＵＣＰ、本明細書中、Venus（黄色蛍光タンパク質）コード領域で例示されるレポーター遺伝子コード領域、及び本明細書中、Ｓ．セレビシエPDC1ターミネーターで例示されるターミネーターが含まれる。ＤＮＡ結合タンパク質（本明細書ではTetR）のコード領域、及び標的遺伝子のコード領域（本明細書ではVenusレポーター）は、サッカロミケス・セレビシエのコドン使用に適合するようにコドン最適化された。
図８Ｂは、発現系を含むカザフスタニア・エグジグア中でのVenus発現の分析の例（図８Ａ、表３に記載）を示す。発現カセットは、カザフスタニア・エグジグアのバックグラウンド株（図中の「WT」）のゲノムに組み込まれ、固有のg706コード領域を置換して、試験された株（図中「SES」）を得た。２つの株（WT及びSES）をSCD培地中で10時間培養し、SES株は22時間定常期に達した（図中の「SES_stat」）。ALG9遺伝子を発現定量化のための標準化対照として用いて、Venus及びADH1遺伝子の転写をｑＰＣＲで分析した。長柱は、平均値を表し、エラーバーは少なくとも３回の反復実験からの標準偏差を示す。
図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ及び９Ｄは、発現系を含む多様な発現宿主（トリコデルマ・リーゼイ及びピキア・パストリス）におけるタンパク質の産生の分析を示す。
図９Ａは、トリコデルマ・リーゼイ中でのCBH1タンパク質の製造のための発現系の例（スキームとして示される）を示す。単一のＤＮＡ分子中に組み立てられた発現系は、２つの発現カセット（図４及び７Ｃのものに類似）を含む。１）ｓＴＦ発現カセット：これは、本明細書中、533cp（参照、表１）で例示されるＵＣＰ、本明細書中、BM3R1で例示されるＤＮＡ結合タンパク質を有するｓＴＦバージョン、本明細書中、VP16で例示される活性化ドメイン、及び本明細書中、トリコデルマ・リーゼイTEF1ターミネーターで例示されるターミネーターを含む。そして、２）標的遺伝子発現カセット：これは、本明細書中、８個のBM3R1特異的結合部位で例示される多数のｓＴＦ特異的結合部位、本明細書中、114cp（参照、表１）で例示される異なるＵＣＰ、本明細書中、トリコデルマ・リーゼイCBH1コード領域（固有のトリコデルマ・リーゼイCBH1遺伝子中に存在するイントロンを含む）で例示される標的遺伝子コード領域、及び本明細書中、トリコデルマ・リーゼイPDC1ターミネーターで例示されるターミネーターが含まれる。ＤＮＡ結合タンパク質（本明細書ではBM3R1）のコード領域は、アスペルギルス・ニガーのコドン使用に適合するようにコドン最適化された。
図９Ｂは、発現系（図９Ａに記載）を含有するトリコデルマ・リーゼイ中でのCBH1の産生の分析の例を示す。トリコデルマ・リーゼイのバックグラウンド株（図中の「WT」）は、８つの多様なプロテアーゼをコードする遺伝子の複数の欠失を有する突然変異株であった。発現カセットを、バックグラウンド株のゲノムに組み込み、試験された株（図中の「SES」）を得た。２つの株（WT及びSES）を、バイオリアクター（発酵槽）中で、２つの異なる条件、すなわち、１）（バックグラウンド株WT中で）固有のCBH1遺伝子発現と（両方の株中で）他のセルロース分解遺伝子発現との強力なアップレギュレーションをもたらす、ビール粕、ビール粕抽出物及びラクトースを含む培地（図中の「SGM」）、及び２）（バックグラウンド株WT中で）固有のCBH1遺伝子発現と（両方の株中で）他のセルロース分解遺伝子発現とに対する強い阻害効果を有する酵母抽出物及びグルコースを含む培地（図中の「グルコース」）で培養した。これらの培養物からの上清を、総タンパク質含量（クーマシー）及び特異的CBH1含量（ウェスタンブロット）について、SDS-PAGE（SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）分析で分析した。全タンパク質含量分析のために、異なる時点の培養上清1.5μL及び精製CBH1タンパク質（負荷対照）の範囲をゲル（4〜20％グラジエント）に負荷し、ゲルをコロイドクーマシー（PageBlue Protein Staining Solution、Thermo Fisher Scientific）で染色した。CBH1特異的分析のために、異なる時点の培養上清0.075μL及び精製されたCBH1タンパク質（負荷対照）の範囲をゲル（4〜20％グラジエント）に負荷し、CBH1タンパク質（ニトロセルロース膜上に移した後）を特異的（マウス）抗CBH1一次抗体（及び抗マウスIR680結合二次抗体）で検出した。両方の分析のために、シグナルの視覚化を、Odyssey CLxイメージングシステム機器（LI-COR Biosciences）で行った。各ゲルに負荷された精製CBH1の範囲から（培養上清中の）タンパク質濃度を推定し、その値を図に示す。
図９Ｃは、タンパク質製品の製造のためのピキア・パストリスに使用される発現系の例（スキームとして示される）を示す。単一のＤＮＡ分子中に組み立てられた発現系は、２つの発現カセット（図４のものに類似）を含む。１）ｓＴＦ発現カセット：これは、本明細書中、008cp（参照、表１）で例示されるＵＣＰ、本明細書中、BM3R1で例示されるＤＮＡ結合タンパク質を有するｓＴＦバージョン、本明細書中、VP16で例示される活性化ドメイン、及び本明細書中、トリコデルマ・リーゼイTEF1ターミネーターで例示されるターミネーターを含む。そして、２）標的遺伝子発現カセット：これは、本明細書中、８個のBM3R1特異的結合部位で例示される多数のｓＴＦ特異的結合部位、本明細書中、201cp（参照、表１）で例示される異なるＵＣＰ、本明細書中、Ｓ．セレビシエ分泌シグナル（α因子）、KEX/spe13プロテアーゼ切断部位、炭水化物結合モジュール（CBM）、エラスチン様タンパク質（ELP5）、及び他のCBMを含む融合タンパク質のコード領域で例示される標的遺伝子コード領域、並びに本明細書中、Ｓ．セレビシエADH1ターミネーターで例示されるターミネーターが含まれる。ＤＮＡ結合タンパク質（本明細書ではBM3R1）のコード領域は、サッカロミケス・セレビシエのコドン使用に適合するようにコドン最適化された。
図９Ｄは、発現系（図９Ｃに記載）を含有するピキア・パストリスにおけるCBM-ELP5-CBMの産生の分析を示す。この株を種々の条件で培養し、これらの培養物からの上清をウエスタンブロットで分析した。培養上清22.5μLをゲル（4〜20％グラジエント）に負荷し、CBM-ELP5-CBMタンパク質（ニトロセルロース膜上に移した後）を特異的（マウス）抗CBM一次抗体（及び抗マウスIR680結合二次抗体）で検出した。シグナルの視覚化は、Odyssey CLxイメージングシステム機器（LI-COR Biosciences）で行った。
実施例１
発現系で使用された細菌性ＤＮＡ結合タンパク質及びそれらの結合部位
・LexA（大腸菌（Escherichia coli）由来の転写リプレッサー；GenBank：EDV67321.1）
LexA結合部位（ＤＮＡ鎖に関わらず）：
CTGTATATAAACACAG（配列番号７６）
CTGTATATATACCCAG（配列番号７７）
CTGTATATAAAACCAG（配列番号７８）
GTGGTTATATATACAG（配列番号７９）
・SrpR（シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来の転写調節因子；NCBI参照配列：WP_019437727.1）
SrpR結合部位（ＤＮＡ鎖に関わらず）：
ATATACATACATGCTTGTTTGTTTGTAAAC（配列番号８０）
ATTTACATACATTCTTGTTTGTTTGTAAAC（配列番号８１）
・PhlF（シュードモナス・プロテジェンス（Pseudomonas protegens）からの転写レギュレーター；GenBank：AAF20928.1）
PhlF結合部位（ＤＮＡ鎖にかかわらず）：
ATGATACGAAACGTACCGTATCGTTAAGGT（配列番号８２）
ATGATACGGAACGTTACGTATCGTTAAGCT（配列番号８３）
ATGATACGGAAGCTACCGTATCGTAAAGGT（配列番号８４）
ATGATACGTAACGTACCGTATCGTAAAGGT（配列番号８５）
・TetR（大腸菌由来の転写調節因子、GenBank：EFK45326.1）
TetR結合部位（ＤＮＡ鎖に関わらず）：
ACTCCCTATCAGTGATAGAGA（配列番号８６）
・BM3R1（バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）由来の転写調節因子；NCBI参照配列：WP_013083972.1）
BM3R1結合部位（ＤＮＡ鎖に関わらず）：
CGGAATGAAGGTTCATTCCG（配列番号８７）
CGGAATGAACTTTCATTCCG（配列番号８８）
CGGAATGAACATTCATTCCG（配列番号８９）
CGGAATGAACGTTCATTCCG（配列番号９０）
・TarA（ストレプトマイセス・ラベンデゥリグリセウス（Streptomyces lavenduligriseus）由来の転写調節因子；NCBI参照配列：WP_030788560.1）
TarA結合部位（ＤＮＡ鎖に関わらず）：
AACATACCGTGTGGTATGTT（配列番号９１）
AACATACCGAGTGGTATGTT（配列番号９２）
AACATACCGTGAGGTATGTT（配列番号９３）
AAACATACCGTGTGGTATGTTC（配列番号９４）
・LacI（大腸菌由来のlacリプレッサー；NCBI参照配列：WP_048339836.1）
LacI結合部位（ＤＮＡ鎖に関わらず）：
AATTGTGAGCGGCTCACAATT（配列番号９５）
実施例２
ｓＴＦの異なるバージョンの試験及びサッカロミケス・セレビシエ中での発現系の性能の調節の評価（図５）
発現系（個々のｓＴＦのための発現カセット及びレポーターのための発現カセット）は、２つの別個のＤＮＡ分子（プラスミド）として構築された（図５Ａ）。各ｓＴＦのための発現カセットを有するプラスミドは、１）各ｓＴＦコード領域中のＤＮＡ結合タンパク質（LexA、PhlF、SrpR、TetR、BM3R1及びTarA；実施例１）のサッカロミケス・セレビシエコドン最適化コード領域、２）各ｓＴＦコード領域中のNLS及びVP16活性化ドメイン、３）各ｓＴＦの発現を制御するSc-TDH3cp（表１）、４）（クルイベロマイセス・ラクティス由来の）URA3選択マーカー遺伝子、５）（遺伝子座の突然変異したコード領域を置換するための）ura3-52遺伝子座へ相同組換えによってゲノムへ組込むための隣接領域、及び６）大腸菌中でのプラスミドの増殖に必要な領域を含んだ。レポーター発現カセットを有するプラスミドは、１）Venus（黄色蛍光）タンパク質のサッカロミケス・セレビシエコドン最適化コード領域、２）Venusの発現を制御するSc-ENO1cp（表１）、３）上流に位置するｓＴＦ結合部位（０、１、２、４又は８個）、４）（クルイベロマイセス・ラクティス由来の）LEU2選択マーカー遺伝子、５）（遺伝子座の突然変異したコード領域を置換するための）leu2-3_112遺伝子座へ相同組換えによってゲノムへ組み込むための隣接領域、及び６）大腸菌中でのプラスミドの増殖に必要な領域を含んだ。
サッカロミケス・セレビシエCEN.PK（MATα、ura3-52 leu2-3_112 his3Δ1 MAL2-8C SUC2）を親株として用いた。発現カセット（図５Ａ）を、線状化組込みプラスミドの形質転換を介して細胞に導入し、ｓＴＦ発現カセット及び対応するレポーター発現カセットを単一株に形質転換した。各組込みカセットは、形質転換の前にプラスミドからのNotI制限エンドヌクレアーゼによって放出された。標準的な酢酸リチウムプロトコールを用いて形質転換を行った。単一コピーの組込みはｑＰＣＲによって確認され、Venus遺伝子のｑＰＣＲシグナルを各株の唯一の固有の配列のｑＰＣＲシグナルと比較した。
全ての培養において、6.7g／Lの酵母窒素原礎培地（YNB、Becton, Dickinson and Company）、20g／LのＤ−グルコースで補充したウラシル及びロイシンを欠く合成完全アミノ酸混合物（SCD-LU）を用いた。寒天平板培養の場合、上記の成分に加えて20g／Lの寒天を用いた。
試験される株の前培養物をSCD-LU寒天プレート上で24〜48時間増殖させた後、24ウェル培養プレート中、4mLのSCD-LUでOD600＝0.2に接種した。培養物を、トリプリケートで18時間、800rpm（Infors HT Microtron）及び28℃で培養し、遠心分離し、洗浄し、0.2mLの滅菌水に再懸濁した。Varioskan（Thermo Electron Corporation）蛍光光度計を使用して、黒色96ウェル（Black Cliniplate、Thermo Scientific）中で200μLの細胞懸濁液を分析した。Venusの設定は、それぞれ510nm（励起）と530nm（発光）であった。蛍光結果の標準化のために、分析された細胞懸濁液を100倍に希釈し、Varioskan（Thermo Electron Corporation）を用いて透明な96ウェルマイクロタイタープレート（NUNC）中でOD600を測定した。
蛍光分析の結果を図５Ｂに示す。
実施例３
多様な真菌宿主中での発現系の性能の定量的分析（図６）
発現系（表２、図４）及びその陰性対照バージョン（ｓＴＦを制御するコアプロモーター及びｓＴＦ自体にまたがる領域が欠損する発現系）は、６つの異なる種のための選択マーカー及びゲノム組込み隣接領域を導入するプラスミドにクローニングした。１）サッカロミケス・セレビシエCEN.PK株を親株として用いた。（クルイベロマイセス・ラクティス由来の）LEU2選択マーカー遺伝子を含む発現系（ＤＮＡ結合タンパク質BM3R1のサッカロミケス・セレビシエコドン最適化コード領域を含むバージョンを含む）を、相同組換えのための対応する隣接領域を用いて、leu2-3_112遺伝子座に組み込んだ（遺伝子座の突然変異したコード領域を置換した）。標準的な酢酸リチウムプロトコールによって形質転換を行った。２）アスペルギルス・ニガーATCC1015株を親株として用いた。適切なプロモーター及びターミネーターを有するハイグロマイシン耐性選択マーカー遺伝子を含む発現系を、相同組換えのための対応する隣接領域を用いて、gaaC遺伝子座に組み込んだ（固有のコード領域を置換した）。Ａ．ニガー株のプロトプラスト、線状ドナーＤＮＡ（選択マーカー及び組込み隣接領域を有する発現カセット）、タンパク質Cas9（IDT）、及び合成crＲＮＡとtracrＲＮＡ（IDT）の混合物を含むCRISPR形質転換プロトコール（下記参照）を用いて形質転換を行った。Cas9、crＲＮＡ及びtracrＲＮＡは、標的ゲノム遺伝子座で二本鎖切断を生成するリボヌクレオタンパク質（RNP）複合体を形成し、相同組換えによって線状ドナーＤＮＡで修復される。３）トリコデルマ・リーゼイM124株（VTT culture collection）を親株として用いた。適切なプロモーター及びターミネーターを有するハイグロマイシン耐性選択マーカー遺伝子を含む発現系を、相同組換えのための対応する隣接領域を用いて、pep4遺伝子座に組み込んだ（固有のコード領域を置換した）。Ｔ.リーゼイ株のプロトプラスト、線状ドナーＤＮＡ（選択マーカー及び隣接領域を有する発現カセット）、及び標的ゲノム遺伝子座で二本鎖切断を生成し、その後、線状ドナーＤＮＡで修復されるRNP複合体を含むCRISPR形質転換プロトコール（下記参照）を用いて形質転換を行った。４）ピキア・クドリアブゼビATCC 32196株を親株として用いた。適切なプロモーター及びターミネーターを有するハイグロマイシン耐性選択マーカー遺伝子を含む発現系を、相同組換えのための対応する隣接領域を用いて、PDC1遺伝子座に組み込んだ（固有のコード領域を置換した）。標準的な酢酸リチウムプロトコールによって形質転換を行った。５）ピキア・パストリスX-33株（Invitrogen）を親株として用いた。適切なプロモーター及びターミネーターを有するゼオシン耐性選択マーカー遺伝子を含む発現系（サッカロミケス・セレビシエのコドン使用に適合するようにコドン最適化されたＤＮＡ結合タンパク質BM3R1のコード領域を有する）を、相同組換えのための対応する隣接領域を用いて、PDC1遺伝子座に組み込んだ（AOX1プロモーター領域へ組み込んだ）。標準的な酢酸リチウムプロトコールによって形質転換を行った。６）ヤロウィア・リポリティカC-00365（VTT cuture collection）を親株として用いた。適切なプロモーター及びターミネーターを有するストレプトスライシン耐性選択マーカー遺伝子を含む発現系を、相同組換えのための対応する隣接領域を用いて、ANT1遺伝子座に組み込んだ（固有のコード領域を置換した）。標準的な酢酸リチウムプロトコールによって形質転換を行った。
CRISPR形質転換プロトコール：単離されたプロトプラストを、200μLのSTC溶液（1.33Mのソルビトール、10mMのトリス-HCl、50mMのCaCl2、pH 8.0）に懸濁した。100μLのプロトプラスト懸濁液を、3.5μgのドナーＤＮＡ及び20μLのRNP溶液（1μMのCas9タンパク質（IDT）、1μMの合成crＲＮＡ（IDT）及び1μMのtracrＲＮＡ（IDT））及び100μLの形質転換溶液（25％のPEG 6000、50mMのCaCl2、10mMのトリス-HCl、pH 7.5）と混合した。混合物を氷上で20分間インキュベートした。2mLの形質転換溶液を加え、混合物を室温で5分間インキュベートした。4mLのSTCを添加し、続いて7mLの溶融した（50℃）上層寒天（200g／LのＤ−ソルビトール、6.7g／Lの酵母窒素原礎培地（YNB、Becton, Dickinson and Company）、合成完全アミノ酸混合物、20g／LのＤ−グルコース、400mg／L（Ａ．ニガーについて）又は100mg／L（Ｔ．リーゼイについて）のハイグロマイシンＢ、20g／Lの寒天）を加えた。混合物をハイグロマイシン選択プレート（200g／LのＤ−ソルビトール、6.7g／Lの酵母窒素原礎培地（YNB、Becton, Dickinson and Company）、合成完全アミノ酸混合物、20g／LのＤ−グルコース、400mg／L（Ａ．ニガーについて）又は100mg／L（Ｔ．リーゼイについて）のハイグロマイシンＢ、20g／Lの寒天）に注いだ。＋28℃で5又は7日間培養し、コロニーを集めて、400mg／L（Ａ．ニガーについて）又は100mg／L（Ｔ．リーゼイについて）のハイグロマイシンＢを含むYPDプレート上で、再培養した。
組み込まれた構造物と組込み隣接領域の外側のゲノムＤＮＡとに増幅産物（増幅されたＤＮＡ領域）が広がる、各形質転換株のゲノムＤＮＡのＰＣＲによって、正しい組込みが確認された。単一コピーの組込みは、ｑＰＣＲによって、mChergy遺伝子のｑＰＣＲシグナルを各宿主中の唯一の固有の配列のｑＰＣＲシグナルと比較して、確認された。
液体培養において、6.7g／Lの酵母窒素原礎培地（YNB、Becton, Dickinson and Company）、20g／LのＤ−グルコースで補充した合成完全アミノ酸混合物（SCD）を用いた。寒天平板培養の場合、20g／Lの寒天、20g／Lのバクトペプトン（Becton Dickinson）、10g／Lの酵母エキス、及び20g／LのＤ−グルコースを含む固化培地（YPDプレート）を用いた。糸状菌の胞子を得るために、PDA寒天プレートを胞子形成に使用した（39g／L BD-Difco Potato dextrose agar）。
試験された株（図６Ａ）中でのmCherryの産生のフローサイトメトリー分析のために、試験された酵母株の前培養物をYPD寒天プレート上で24〜48時間増殖させ、糸状菌（Ａ．ニガー株及びＴ．リーゼイ株）をPDAプレート上で胞子形成させ（7日間）、胞子を収集し、分析前に1×PBS中に希釈した。酵母株の場合、24ウェル培養プレート中の4mLのSCD培地を、前培養物から、すべての試験された酵母株によってOD600＝0.2に接種した。培養物を、18時間、800rpm（Infors HT Microtron）及び28℃で培養した。分析の前に、100μLの培養物を1.5mLの1×PBSと混合した。測定はFACSAria III（BD）で行い、10000事象が記録され、細胞サイズ（前方散乱、FSC-A）でmCherry蛍光値を分けることで、結果を標準化した。フローサイトメトリー蛍光分析の結果を図６Ａに示す。
定量的蛍光定量分析（図６Ｂ）のために、試験された酵母株の前培養物をYPD寒天プレート上で24〜48時間増殖させ、トリコデルマ・リーゼイ株の前培養物（胞子を接種したもの）をYPG培地（20g／Lのバクトペプトン、10g／Lの酵母エキス、30g／Lのゼラチン）中で24時間増殖させた。4mLのSCD培地を24ウェル培養プレート上で、すべての試験された酵母株によってOD600＝0.2（Ｔ．リーゼイの場合、OD600＝0.5）に接種した。培養物を、トリプリケートで18時間、800rpm（Infors HT Microtron）及び28℃で増殖させ、遠心分離し、洗浄し、0.2mLの滅菌水に再懸濁した。Varioskan（Thermo Electron Corporation）蛍光光度計を使用して、黒色96ウェル（Black Cliniplate、Thermo Scientific）中で200μLの各細胞懸濁液を分析した。mCherryの設定は、それぞれ587nm（励起）と610nm（発光）であった。蛍光結果の標準化のために、分析した細胞懸濁液を100倍に希釈し、Varioskan（Thermo Electron Corporation）を用いて透明な96ウェルマイクロタイタープレート（NUNC）中でOD600を測定した。分析の結果を図６Ｂに示す。
実施例４
異なる宿主（ピキア・クドリアブゼビ、アスペルギルス・ニガー及びトリコデルマ・リーゼイ）中での調節可能な発現レベルの分析（図７）
ピキア・クドリアブゼビ及びアスペルギルス・ニガーのための多様な数（０、１、２、４又は８個）のｓＴＦ特異的結合部位を有する発現系（図７Ａ）を、実施例３（図４に示す発現系Ａのバージョンを使用した）と同様にして構築した。ピキア・クドリアブゼビの場合、ATCC32196株を親株として用いた。適切なプロモーター及びターミネーターを有するハイグロマイシン耐性選択マーカー遺伝子を含む発現系を、相同組換えのための対応する隣接領域を用いて、PDC1遺伝子座に組み込んだ（固有のコード領域を置換した）。標準的な酢酸リチウムプロトコールによって形質転換を行った。アスペルギルス・ニガーの場合、ATCC1015株を親株として用いた。適切なプロモーター及びターミネーターを有するハイグロマイシン耐性選択マーカー遺伝子を含む発現系を、相同組換えのための対応する隣接領域を用いて、gaaC遺伝子座に組み込んだ（固有のコード領域を置換した）。Ａ．ニガー株のプロトプラスト、線状ドナーＤＮＡ（選択マーカー及び隣接領域を有する発現カセット）、及び標的ゲノム遺伝子座で二本鎖切断を生成し、その後、線状ドナーＤＮＡで修復されるRNP複合体を含むCRISPR形質転換プロトコールを用いて形質転換を行った。
CBH1遺伝子の調節可能な発現のためのトリコデルマ・リーゼイの発現系を含むＤＮＡ分子（図７Ｃ）は、201cp（表１）、CBH1コード領域の発現を制御する上流に位置するBM3R1特異的結合部位（０、１、２、４又は８個）、Ｔ．リーゼイPDC1ターミネーター、ｓＴＦコード領域の発現を制御する533cp（表１）、ｓＴＦコード領域、トリコデルマ・リーゼイTEF1ターミネーター、適切なプロモーター及びターミネーターを有するハイグロマイシン耐性選択マーカー遺伝子、並びに（固有のコード領域を置換するための）CBH1遺伝子座へ相同組換えによってゲノムへ組み込むための隣接領域を含んだ。Ｔ．リーゼイ株M124（VTT cuture collection）を親株として用いた。Ｔ．リーゼイ株のプロトプラスト、及び線状ドナーＤＮＡ（選択マーカー及び隣接領域を有する発現カセット）を含むプロトプラスト形質転換プロトコール（下記参照）を用いて形質転換を行った。
プロトプラスト形質転換プロトコール：単離されたプロトプラストを、200μLのSTC溶液（1.33Mのソルビトール、10mMのトリス-HCl、50mMのCaCl2、pH 8.0）に懸濁した。100μLのプロトプラスト懸濁液を、10μgのドナーＤＮＡ及び100μLの形質転換溶液（25％のPEG 6000、50mMのCaCl2、10mMのトリス-HCl、pH 7.5）と混合した。混合物を氷上で20分間インキュベートした。2mLの形質転換溶液を加え、混合物を室温で5分間インキュベートした。4mLのSTCを添加し、続いて7mLの溶融した上層寒天（200g／LのＤ−ソルビトール、6.7g／Lの酵母窒素原礎培地（YNB、Becton, Dickinson and Company）、合成完全アミノ酸混合物、20g／LのＤ−グルコース、100mg／LのハイグロマイシンＢ、20g／Lの寒天）を加えた。この混合物を選択プレート（200g／LのＤ−ソルビトール、6.7g／Lの酵母窒素原礎培地（YNB、Becton, Dickinson and Company）、合成完全アミノ酸混合物、20g／LのＤ−グルコース、100mg／LのハイグロマイシンＢ、20g／Lの寒天）に注いだ。＋28℃で5日間培養し、コロニーを集めて、100mg／LのハイグロマイシンＢを含むYPDプレート上で、再培養した。
組み込まれた構造物と組込み隣接領域の外側のゲノムＤＮＡとに増幅産物（増幅されたＤＮＡ領域）が広がる、各形質転換株のゲノムＤＮＡのＰＣＲによって、正しい組込みが確認された。単一コピーの組込みは、ｑＰＣＲによって、mChergy遺伝子（ピキア・クドリアブゼビ及びアスペルギルス・ニガー株について）又はBM3R1コード領域（トリコデルマ・リーゼイ株について）のｑＰＣＲシグナルを各宿主中の唯一の固有の配列のｑＰＣＲシグナルと比較して、確認された。
液体培養において、6.7g／Lの酵母窒素原礎培地（YNB、Becton, Dickinson and Company）、20g／LのＤ−グルコースで補充した合成完全アミノ酸混合物（SCD）を用いた。寒天平板培養の場合、20g／Lの寒天、20g／Lのバクトペプトン（Becton Dickinson）、10g／Lの酵母エキス、及び20g／LのＤ−グルコースを含む固化培地（YPDプレート）を用いた。糸状菌の胞子を得るために、PDA寒天プレートを胞子形成に使用した（39g／L BD-Difco Potato dextrose agar）。
試験された株（図７Ｂ）中でのmCherryの産生のフローサイトメトリー分析のために、ピキア・クドリアブゼビ株の前培養物をYPD寒天プレート上で24〜48時間増殖させ、アスペルギルス・ニガー株をPDAプレート上で胞子形成させ（7日間）、胞子を収集し、分析前に1×PBS中に希釈した。ピキア・クドリアブゼビ株の場合、24ウェル培養プレート中の4mLのSCD培地を、前培養物からOD600＝0.2に接種した。培養物を、18時間、800rpm（Infors HT Microtron）及び28℃で培養した。分析の前に、100μLの培養物を1.5mLの1×PBSと混合した。測定はFACSAria III（BD）で行い、10000事象が記録され、細胞サイズ（前方散乱、FSC-A）でmCherry蛍光値を分けることで、結果を標準化した。フローサイトメトリー蛍光分析の結果を図７Ｂに示す。
トリコデルマ・リーゼイ株中でのCBH1の産生のウエスタンブロット分析のために、YPG培地（20g／Lのバクトペプトン、10g／Lの酵母抽出物、及び30g／Lのゼラチン）中で24時間、前培養物（胞子を接種したもの）を増殖させた。24ウェル培養プレート中の4mLのSGE-ラクトース（15g／LのKH2PO4、5.4g／LのNa2SO4、1mL／Lの微量元素（3.7mg／LのCoCl2、5mg／LのFeSO4・7H2O、1.4mg／LのZnS04・7H2O、1.6mg／LのMnS04・7H2O）、40g／Lのラクトース、333.25g／Lのビール粕抽出物、8.6ｇ／Lの(NH4)2クエン酸塩、100mMのPIPPS、2.4mMのMgSO4、4.1mMのCaCl2、pHはKOHで4.8に調整）又はSCD培地を、試験された各株についてOD600＝0.5に接種した。培養物を、3日間、800rpm（Infors HT Microtron）及び28℃で増殖させ、遠心分離し、上清を清潔なチューブに移した。15μLの各上清を、4μLの4×SDSローディングバッファー（400mL／Lのグリセロール、100mL／Lのβ−メルカプトエタノール、2g／LのOrangeG色素（Sigma）、40g／LのSDS、及び125mMのトリス-HCl、pH 6.8）と混合し、煮沸し、4〜20％SDS-PAGEグラジエントゲルに負荷した。ゲルをニトロセルロース膜上に移し、CBH1タンパク質を特異的（マウス）抗CBH1一次抗体（及び抗マウスIR680結合二次抗体）で検出し、シグナルの視覚化は、Odyssey CLxイメージングシステム機器（LI-COR Biosciences）で行った。分析の結果を図７Ｄに示す。
実施例５
カザフスタニア・エグジグア中での発現系の試験（図８）
カザフスタニア・エグジグアのために使用した発現系（表３，図８Ａ）を、Ｓ．セレビシエALD2の相同物をコードするＫ．エクジグア遺伝子g706のための隣接領域を含むプラスミドにクローニングした。得られた構築物中に、Ｋ．エクジグアg706の3'UTR隣接領域は、発現系中のｓＴＦのためのターミネーター配列を形成した。相同組換えのための隣接領域を含む発現系をg706遺伝子座に組み込んだ（固有のコード領域を置換した）。
Cas9発現カセット（適当なプロモーター及びターミネーターを含む）でKU70遺伝子座を置き換えることによって、カザフスタニア・エグジグアC-02458株（VTT cuture collection）を改変した。得られた株（MAT a／α ura3Δ／ura3Δ ku70Δ::Cas9／ku70::Cas9）を親株として用いた（図８ＢのWT）。バックグラウンド株への発現系（ドナーＤＮＡ）の形質転換を、URA3選択マーカーとCas9をg706遺伝子座に標的とするsgRNAの発現カセットとを含むセントロメアプラスミドと共に実施した（Ｓ．セレビシエRNAポリメラーゼIIIプロモーターSNR52及びターミネーターSUP4の制御の下、sgRNAは発現された）。得られた株を図８Ｂに「SES」として示す。
エレクトロポレーションプロトコールで形質転換を行った。細胞をYPD培地に接種し、250rpm及び30℃で一晩培養した。一晩培養した物をOD600＝0.2に希釈し、OD600＝1.3に増殖させた。採取し、洗浄した細胞を、10mMのジチオスレイトールを含む10mLのTris-EDTA（pH 7.5）に再懸濁し、30℃で30分間インキュベートした。40mLの氷冷水を細胞に加え、続いて遠心分離した。さらに続いて、最初に50mLの氷冷滅菌水、次いで10mLの氷冷した1Mのソルビトールで2回の洗浄工程を行った。最後に、細胞を125μLの氷冷した1Mのソルビトールに再懸濁した。50μLの細胞懸濁液を、15μLのＤＮＡミックス（5μgのドナーＤＮＡと5μgのgRNAプラスミドを含む）と混合した。電気穿孔は、2mmのキュベット中で、1.25kV、200Ω及び25μFで実施した。950μLの回収溶液（10g／Lの酵母エキス、10g／Lのバクトペプトン、20g／Lのグルコース、1Mのソルビトール）を電気穿孔直後に添加した。細胞を250rpm及び30℃で30分間回収し、ウラシルを欠くSCD培地にプレーティングした。
発現分析のために、２つの株（WT及びSES）をトリプリケートでSCD培地中、10時間培養し、すべてのグルコースが消費された時、SES株は22時間定常期に達した（図８Ｂの「SES_stat」）。すべてのRNAを株から単離（RNeasy Kit、QIAGEN）し、cＤＮＡを作製（Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit、Roche）し、Venus及びADH1遺伝子（指数増殖期で高度に発現し、グルコースの非存在下でダウンレギュレートされる解糖系遺伝子）を、各遺伝子に特異的なプライマーを用いてｑＰＣＲによって分析した。ALG9遺伝子を発現定量化のための標準化対照として使用した。分析の結果を図８Ｂに示す。
実施例６
真菌（トリコデルマ・リーゼイ及びピキア・パストリス）中での分泌タンパク質の産生のために使用される発現系（図９）
トリコデルマ・リーゼイの発現系を含むＤＮＡ分子（図９Ａ）は、114cp（表１）、CBH1コード領域の発現を制御する上流に位置する８個のBM3R1特異的結合部位、CBH1遺伝子のコード領域、トリコデルマ・リーゼイPDC1ターミネーター、ｓＴＦコード領域の発現を制御する533cp（表１）、ｓＴＦコード領域、トリコデルマ・リーゼイTEF1ターミネーター、適切なプロモーター及びターミネーターを有するハイグロマイシン耐性選択マーカー遺伝子、並びに（固有のコード領域を置換するための）CBH1遺伝子座へ相同組換えによってゲノムへ組み込むための隣接領域を含んだ。Ｔ．リーゼイ株M1763（VTT culture collection）を親株として用いた（図９Ｂの「WT」）。Ｔ．リーゼイ株のプロトプラスト、及び線状ドナーＤＮＡ（選択マーカー及び隣接領域を有する発現カセット）を含むプロトプラスト形質転換プロトコール（実施例４）を用いて形質転換を行った。
組み込まれた構造物と組込み隣接領域の外側のゲノムＤＮＡとに増幅産物（増幅されたＤＮＡ領域）が広がる、ゲノムＤＮＡのＰＣＲによって、正しい組込みが確認された。単一コピーの組込みは、ｑＰＣＲを用いて、BM3R1コード領域からのｑＰＣＲシグナルを宿主中の唯一の固有の配列のｑＰＣＲシグナルと比較して、試験した。発現カセット（図９Ｂの「SES」）を含む株を、CBH1の産生について分析し、セルラーゼ誘導性及び抑制性条件におけるバックグラウンド株と比較した。
トリコデルマ・リーゼイ株中でのCBH1の産生は、1Lバイオリアクター中で行った。セルラーゼ誘導条件の培養のための前培養物（胞子を接種したもの）を、SGE-ラクトース培地（実施例４）中で24時間増殖させ、バイオリアクター接種のために十分な量の菌糸体を産生させた。セルラーゼ抑制条件の培養のための前培養物（胞子を接種したもの）を、YE-グルコース-Ａ培地（20g／Lのグルコース、10g／Lの酵母エキス、15g／LのKH2P04、5g／Lの(NH4)2SO4、1mL／Lの微量元素（3.7mg／LのCoCl2、5mg／LのFeS04・7H20、1.4mg／LのZnS04・7H20、1.6mg／LのMnS04・7H20）、2.4mMのMgSO4、4.1mMのCaCl2、pHを4.8に調整）中で24時間増殖させた。セルラーゼ誘導バイオリアクター培養物を、SGM培地（図９Ｂの「SGM」）（20g／Lのビール粕抽出物、20g／Lの販売ビール粕、60g／Lのラクトース、5g／LのKH2PO4、5g／Lの(NH4)2SO4、1mL／Lの微量元素、2.4mMのMgSO4、4.1mMのCaCl2、1mL／Lの消泡剤J647、pH 4.8）中で、0.5 slpm（0.4〜0.6 vvm）の空気流、及び600rpmで撹拌しながら、接種した。セルラーゼ抑制バイオリアクター培養物を、YE-グルコース-Ｂ培地（図９Ｂの「グルコース」）（10g／Lのグルコース、20g／Lの酵母エキス、5g／LのKH2PO4、5g／Lの(NH4)2SO4、1mL／Lの微量元素、2.4mMのMgSO4、4.1mMのCaCl2、1mL／Lの消泡剤J647、pH 4.8）中で接種し、これらの培養物にグルコース（300g／Lのグルコース、4.4g／hの流速）を連続して加えて、0.5 slpm（0.4〜0.6 vvm）の空気流、及び900rpmで撹拌した。培養は150時間実施し、サンプルは種々の時間に採取し、サブセットを図９Ｂに示す。
クーマシー染色分析（図９Ｂの左上のパネル）のために、1.5μLの各培養物（時点ごと）の上清を、15μLの1×SDSローディングバッファー（100mL／Lのグリセロール、25mL／Lのβ−メルカプトエタノール、0.5g／LのOrangeG色素（Sigma）、10g／LのSDS、31.2mMのトリス-HCl、pH 6.8）と混合し、煮沸し、4〜20％SDS-PAGEグラジエントゲルに標準としての精製CBH1タンパク質の希釈液と共に負荷した。ゲルをコロイドクーマシー染色（PageBlue Protein Staining Solution、Thermo Fisher Scientific）で製造元のプロトコールに従って染色した。染色されたゲルの視覚化は、Odyssey CLxイメージングシステム機器（LI-COR Biosciences）で行った。培養上清中のタンパク質の濃度は、同じゲル中のCBH1標準から推定した（図９Ｂの右上の表）。ウェスタン分析（図９Ｂの左下パネル）のために、0.075μLの各培養物（時点ごと）の上清を15μLの1×SDSローディングバッファーと混合し、煮沸し、4〜20％SDS-PAGEグラジエントゲル上に精製CBH1タンパク質の希釈液と共に負荷した。ゲルをニトロセルロース膜上に移し、CBH1タンパク質を特異的（マウス）抗CBH1一次抗体（及び抗マウスIR680結合二次抗体）で検出し、シグナルの視覚化は、Odyssey CLxイメージングシステム機器（LI-COR Biosciences）で行った。培養上清中のCBH1濃度を推定した（図９Ｂの右下の表）。
ピキア・パストリスの発現系を含むＤＮＡ分子（図９Ｃ）は、201cp（表１）、融合タンパク質のコード領域の発現を制御する上流に位置する８個のBM3R1特異的結合部位、融合タンパク質のコード領域（N末端サッカロミケス・セレビシエ分泌シグナル（α因子）、KEX／spe13プロテアーゼ切断部位、炭水化物結合モジュール（CBM）、エラスチン様タンパク質（ELP5）、及び他のCBMからなる）、Ｓ．セレビシエADH1ターミネーター、ｓＴＦコード領域の発現を制御する008cp（表１）、ｓＴＦコード領域（ｓＴＦのＤＮＡ結合タンパク質BM3R1のコード領域は、サッカロミケス・セレビシエのコドン使用に適合するようにコドン最適化された）、トリコデルマ・リーゼイTEF1ターミネーター、適切なプロモーター及びターミネーターを有するゼオシン耐性選択マーカー遺伝子、並びに（AOX1プロモーター領域を置換するための）AOX1遺伝子座へ相同組換えによってゲノムへ組み込むための隣接領域を含んだ。標準的な酢酸リチウムプロトコールによって形質転換を行った。発現カセットの単一コピーを含む株を、様々な条件でタンパク質の産生について試験した（図９Ｄ）。
ピキア・パストリス中でのCBM-ELP5-CBMの産生は、エルレンマイヤーフラスコ中で実施した。前培養を、20g／Lのグリセロールを有するYPP培地（10g／Lの酵母エキス、20g／Lのペプトン、13.4g／Lの酵母窒素原礎培地、0.4mg／Lのビオチン、20g／Lのグリセロール、13.2mMのK2HP04、86.8mMのKH2PO4、pH 6.0）（YPP-Gly）中で24時間行った。異なる炭素源の効果を試験するために、グリセロールを20g／Lのグルコース（図９Ｄの「YPP-Glc」）又は20g／Lのエタノール（図９Ｄの「YPP-EtOH」）のいずれかに置き換えた。前培養物からの細胞を、YPP-Gly、YPP-Glc、又はYPP-EtOHに接種（OD600＝1.0に）し、2日間培養し、プロテアーゼ阻害剤（キモスタチン及びペプスタチン）の添加も試験した。前培養物はさらに2日間（合計3日間）培養した。
ウェスタン分析（図９Ｄ）のために、22.5μLの各培養上清を、7.5μLの4×SDSローディングバッファーと混合し、煮沸し、4〜20％SDS-PAGEグラジエントゲルに負荷した。ゲルをニトロセルロース膜上に移し、CBM-ELP5-CBMタンパク質を特異的（マウス）抗CBM一次抗体（及び抗マウスIR680結合二次抗体）で検出し、シグナルの視覚化は、Odyssey CLxイメージングシステム機器（LI-COR Biosciences）で行った（図９Ｄ）。
実施例７
植物（ニコチアナ・ベンタミアーナ）中での発現系の性能の試験
２つの発現系がニコチアナ・ベンタミアーナ中で試験される（表４）。単一のＤＮＡ分子中に組み立てられる発現系は、２つの発現カセットを含む。１）ｓＴＦ発現カセット：これは、本明細書中、At-RPL41D_cp（表１）で例示されるｓＴＦ発現制御のために用いられるコアプロモーター、本明細書中、BM3R1又はTetRのいずれかで例示されるＤＮＡ結合タンパク質と、本明細書中、VP16AD又はVP64ADのいずれかで例示される活性化ドメインとを有するｓＴＦバージョン、及び本明細書中、アラビドプシス・タリアナMT3ターミネーターで例示されるターミネーターを含む。そして、２）標的遺伝子発現カセット：これは、本明細書中、８個のBM3R1特異的結合部位又は８個のTetR特異的結合部位のいずれかで例示される多数のｓＴＦ特異的結合部位、本明細書中、At-ATT17_cp（参照、表１）で例示される異なるコアプロモーター、本明細書中、mCherry（赤色蛍光タンパク質レポーター）コード領域で例示される標的遺伝子コード領域、及び本明細書中、アラビドプシス・タリアナPSBXターミネーターで例示されるターミネーターが含まれる。ｓＴＦ及びmCherryのコード領域は、ニコチアナ・ベンタミアーナのコドン使用に適合するようにコドン最適化される。また、陰性対照バージョン（At-RPL41D_cp、ｓＴＦ、及びMT3ターミネーターにまたがる領域が削除される発現系）が構築される。
発現系（及び陰性対照バージョン）を、適切なプロモーター及びターミネーターを有する植物（NptII）選択マーカーコード領域及びカナマイシン選択マーカーを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）中での増殖のための配列を含むプラスミドにクローニングする。プラスミドをエレクトロポレーション（2mmのキュベット；1.25kV、200Ω及び25μFに設定）によってアグロバクテリウム・ツメファシエンス（EHA105株）に形質転換し、形質転換体をカナマイシン及びリファンピシンの存在下で増殖させて、ニコチアナ・ベンタミアーナの葉に感染させる。6週齢の植物の葉を、１つは発現系を保有する株と、もう１つは転写後遺伝子サイレンシング阻害剤p19のための発現ベクターを有する株であるアグロバクテリウム・ツメファシエンス培養物の１：１混合物で浸潤させる（非特許文献５）（両方の培養物を10mMのMgCl2＋10mMのMESでOD600＝0.7に希釈される，pH 5.8）。浸潤された葉のディスク（浸潤した領域に対応する）を温室中で6日間のインキュベーション後に収穫し、1×PBS中で粉砕し、粗抽出物をVarioskan Instrument（Thermo Electron Corporation）を用いてmCherry蛍光について分析する。
実施例８
緑藻類（クラミドモナス・レインハルディ）中での発現系の性能の試験
２つの発現系がクラミドモナス・レインハルディ中で試験される（表５）。単一のＤＮＡ分子中に組み立てられる発現系は、２つの発現カセットを含む。１）ｓＴＦ発現カセット：これは、本明細書中、Cr-elF-5A_cp（表１）で例示されるｓＴＦ発現制御のために用いられるコアプロモーター、本明細書中、BM3R1又はTetRのいずれかで例示されるＤＮＡ結合タンパク質と、本明細書中、VP16AD又はVP64ADのいずれかで例示される活性化ドメインとを有するｓＴＦバージョン、及び本明細書中、クラミドモナス・レインハルディRPS27Aターミネーターで例示されるターミネーターを含む。そして、２）標的遺伝子発現カセット：これは、本明細書中、８個のBM3R1特異的結合部位又は８個のTetR特異的結合部位のいずれかで例示される多数のｓＴＦ特異的結合部位、本明細書中、Cr-RPS3A_cp（表１）で例示される異なるコアプロモーター、本明細書中、mCherry（赤色蛍光タンパク質レポーター）コード領域で例示される標的遺伝子コード領域、及び本明細書中、クラミドモナス・レインハルディRBCS2ターミネーターで例示されるターミネーターが含まれる。ｓＴＦ及びmCherryのコード領域は、クラミドモナス・レインハルディのコドン使用に適合するようにコドン最適化される。また、陰性対照バージョン（Cr-elF-5A_cp、ｓＴＦ、及びRPS27Aターミネーターにまたがる領域が削除される発現系）が構築される。
発現系（及び陰性対照バージョン）をプラスミドpChlamy_4（Invitrogen）のNcoI部位にクローニングする。得られるプラスミド（非改変pChlamy_4プラスミドを含む）を、線状化後、クラミドモナス・レインハルディ（137c株、Invitrogen）に形質転換する。形質転換は、GeneArt Chlamydomonas Protein Expression Kitマニュアル（Invitrogen）のプロトコールに従って行う。形質転換体を、ゼオシンの存在下でGibco Tap増殖培地中で増殖させ、Varioskan Instrument（Thermo Electron Corporation）を用いてmCherry蛍光について分析する。
実施例９
ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター）中での発現系の性能の試験
単一のＤＮＡ分子中に組み立てられるチャイニーズハムスターのための発現系（表６）は、２つの発現カセットを含む。１）ｓＴＦ発現カセット：これは、本明細書中、Mm-Atp5b_cp（表１）で例示されるｓＴＦ発現制御のために用いられるコアプロモーター、本明細書中、BM3R1で例示されるＤＮＡ結合タンパク質と、本明細書中、VP64ADで例示される活性化ドメインとを有するｓＴＦバージョン、及び本明細書中、ムス・ムスクルスINHAターミネーターで例示されるターミネーターを含む。そして、２）標的遺伝子発現カセット：これは、本明細書中、８個のBM3R1特異的結合部位で例示される多数のｓＴＦ特異的結合部位、本明細書中、Mm-Eef2_cp（表１）で例示される異なるコアプロモーター、本明細書中、mCherry（赤色蛍光タンパク質レポーター）コード領域で例示される標的遺伝子コード領域、及び本明細書中、ムス・ムスクルスFTH1ターミネーターで例示されるターミネーターが含まれる。ｓＴＦ及びmCherryのコード領域は、チャイニーズハムスターのコドン使用に適合するようにコドン最適化される。また、陰性対照バージョン（Mm-Atp5b_cp、ｓＴＦ、及びINHAターミネーターにまたがる領域が削除される発現系）が構築される。
発現系（及び陰性対照バージョン）を、プラスミドpcDNA3.1（Invitrogen）のMluI及びXbaI部位の間でクローニングする。得られるプラスミドをチャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO-K1；American Type Culture Collection（Rockville、MD））に形質転換する。形質転換の前に、CHO-K1細胞を、10％のウシ胎仔血清（FBS）、100U／mLのペニシリン、及び100mg／mLのストレプトマイシンで補充した、2mMのＬ−グルタミン及び1500mg／Lの重炭酸ナトリウムを含む、Ham's F-12K（Kaighn's）培地（Gibco）中で培養する。細胞を37℃で5％CO2及び90％相対湿度の雰囲気中に維持する。細胞のフラスコを培養し、分割し、3×105細胞を6ウェル培養プレートに播種し、70％コンフルエントになるまで2mLの培地中で増殖させる。形質転換は、製造業者の指示に従って、ウェル当たり約1μgの添加されたプラスミドＤＮＡと共にFuGene 6（Roche）で行う。形質転換される細胞は、5日間まで増殖を続けさせる。mCherry発現は、形質転換後毎日、蛍光顕微鏡でモニターされる。

Claims (7)

  1. 真核宿主のための発現系であって、
    （ａ）合成転写因子（ｓＴＦ）をコードするＤＮＡ配列の発現を制御するための唯一のプロモーターであるコアプロモーターを含む発現カセットと、
    （ｂ）合成プロモーターに作動可能に連結された所望の製品をコードするＤＮＡ配列をそれぞれ含む、１つ以上の発現カセットとを含み、
    前記合成プロモーターが、（ａ）と同一のコアプロモーター又は別のコアプロモーター、及び前記コアプロモーターの上流にｓＴＦ特異的結合部位を含む、発現系。
  2. 前記コアプロモーターが、TATAボックスの10〜50bp上流で開始し、ATG開始コドンの9bp上流で終わる真核生物遺伝子の５’上流領域を含むＤＮＡ配列を含み、
    前記TATAボックスと前記開始コドンの間の距離が180bp以下で80bp以上であり、ＤＮＡ配列がその３’末端でランダムな1〜20bpを含むか；又は前記コアプロモーターが、前記５’上流領域と少なくとも90％の配列同一性を有するＤＮＡ配列を含み、ＤＮＡ配列が前記ＤＮＡ配列の３’末端に位置するランダムな1〜20bpを含む、請求項１に記載の発現系。
  3. 前記コアプロモーターが、多様な真核生物で機能するユニバーサルコアプロモーター（ＵＣＰ）である、請求項１又は２に記載の発現系。
  4. 前記合成転写因子（ｓＴＦ）が、原核生物転写調節因子、核局在化シグナル、及び転写活性化ドメインを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の発現系。
  5. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の発現系を含む真核宿主。
  6. 前記コアプロモーターが、多様な真核生物で機能するユニバーサルコアプロモーター（ＵＣＰ）であり、Ｓ．セレビシエ以外の真核宿主の種又は属に由来する、請求項５に記載の真核宿主。
  7. 適切な培養条件下で、請求項５又は６に記載の宿主を培養することを含む、真核宿主中で所望のタンパク質製品を製造する方法。
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