CN101512002A - 马铃薯x病毒组衍生的复制子 - Google Patents

马铃薯x病毒组衍生的复制子 Download PDF

Info

Publication number
CN101512002A
CN101512002A CNA2007800326362A CN200780032636A CN101512002A CN 101512002 A CN101512002 A CN 101512002A CN A2007800326362 A CNA2007800326362 A CN A2007800326362A CN 200780032636 A CN200780032636 A CN 200780032636A CN 101512002 A CN101512002 A CN 101512002A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sequence
protein
nucleic acid
plant
virus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA2007800326362A
Other languages
English (en)
Inventor
S·马里约内
C·恩格勒
V·克利姆克
Y·格莱巴
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Icon Genetics AG
Original Assignee
Icon Genetics AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Icon Genetics AG filed Critical Icon Genetics AG
Publication of CN101512002A publication Critical patent/CN101512002A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8203—Virus mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/26011—Flexiviridae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/26011—Flexiviridae
    • C12N2770/26041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2770/26043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

包含或编码RNA复制子的核酸，所述复制子以这样的顺序包含下列区段(i)至(iii)：(i)编码马铃薯X病毒组RNA依赖性RNA聚合酶或其功能保守的变体的核酸序列；(ii)核酸序列，其包含：(a)马铃薯X病毒组三基因块或其功能保守的变体和(b)编码马铃薯X病毒组外壳蛋白或其功能保守的变体的序列；或编码烟草病毒组移动蛋白的序列；以及(iii)在植物或在植物组织中可从所述复制子表达的异源核酸序列。

Description

马铃薯X病毒组衍生的复制子
发明领域
本发明涉及使用马铃薯X病毒组衍生的复制子在植物、在植物组织或在植物细胞中高产量表达目的基因的过程，以及涉及包含或编码可用于表达目的基因的马铃薯X病毒组RNA复制子的核酸。本发明还涉及包含两个或多个载体的部分的试剂盒，所述载体一起编码本发明的RNA复制子。
发明背景
可以使用病毒载体在植物中高产量表达异源蛋白质。主要开发病毒载体系统用于瞬时表达，然后感染(Donson等人，1991，Proc NatlAcad Sci USA，88：7204-7208；Chapman，Kavanagh & Baulcombe，1992，Plant J.，2：549-557)或转染(Marillonnet等人，2005，Nat Biotechnol.，23：718-723；Santi等人，2006，Proc Natl Acad Sci U S A.103：861-866；WO2005/049839)植物宿主。最佳建立和商业可行的系统是基于正义的单链RNA病毒，优选是基于烟草花叶病毒(TMV)-衍生的病毒(Kumagai等人，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，427-430；Mallory等人，2002，Nature Biotechnol.20，622-625；US5316931；US5589367；US5866785；US5977438；WO02088369；WO02097080；WO0229068；US5491076)。
另一组衍生自马铃薯X病毒组PVX(马铃薯X病毒)的基于RNA病毒的载体也提供了合理的重组蛋白质的高产量，尽管产量显著低于TMV衍生的载体(Chapman，Kavanagh & Baulcombe，1992，Plant J.，2：549-557；Baulcombe，Chapman & Santa Cruz，1995，Plant J.，7：1045-1053；Zhou等人，2006，Appl.Microbiol.Biotechnol.，4月13日，印刷前电子公布；Zelada等人，2006，Tuberculosis，86：263-267)。显然，此类系统需要进一步改良以增加目的重组蛋白质的产量。
在系统病毒载体的最初产生中，为了产生病毒复制子的系统(systemic)移动所需要的病毒外壳蛋白浪费了大量的植物资源。对于TMV-衍生的载体而言，这一问题通过移除外壳蛋白基因并且通过使用农杆菌浸润用于复制子的有效系统递送来解决，从而显著地增强了目的重组蛋白质的产量(WO2005/049839；Marillonnet等人，(2005)，Nat.Biotechnol.，23：718-723)。但是，与TMV-衍生的复制子不同，马铃薯X病毒组衍生的复制子需要病毒外壳蛋白不仅是用于系统移动，还用于短距离(细胞间)移动。因此，不能够在不严重损失蛋白质表达效率的情况下移除马铃薯X病毒组衍生的病毒载体的外壳蛋白基因。此外，反式改造提供病毒外壳蛋白的植物宿主由于基因沉默而很少成为良好的解决方案。同样，表达外壳蛋白的转基因植物可以表现出外壳蛋白-介导的对由植物病毒引起的攻击的抗性(Beachy，RN.，1999，Philos.Trans.R.Soc.Lond B Biol.Sci.，354：659-664；Wisniewski等人，1990，PlantCell，2：559-567)。被称为异源CP-介导的抗性的另一类似的现象也造成问题，例如当表达PVX CP的转基因植物减少TMV RNA的细胞间扩散时(Bazzini等人，2006，J.Gen.Virol.，87：1005-1012)。此外，在转基因烟草植物中的PVX外壳蛋白的表达减少了移动缺陷的PVX，但是破坏了细胞间移动以及病毒复制的效率(Spillane等人，1997，Virology，236：76-84)。当这可以在当表达异源-寡聚蛋白质需要在同一植物细胞中使用两种病毒载体(例如基于TMV和PVX的载体)时将成为问题(例如，为了共表达单克隆抗体的重链和轻链)(WO2006/079546；Giritch等人，2006，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，刊印中)。
发明简述
因此，本发明的目标是提供用于在植物中、在植物组织中或在植物细胞中目的蛋白质高产量表达的基于马铃薯X病毒组的病毒载体。病毒载体应当能够细胞间移动，并且应当尽可能少的浪费植物宿主的资源来产生病毒外壳蛋白。
本目标通过下述核酸或其互补序列来解决，所述核酸包含或编码RNA复制子，所述复制子以这样的顺序包含下述区段：
(i)编码RNA依赖性RNA聚合酶或其功能保守的衍生物的核酸序列；
(ii)编码所述复制子在植物或在植物组织中进行细胞间移动所需的一种或多种蛋白质的核酸序列；
(iii)在植物或在植物组织中可从所述复制子表达的异源核酸序列。
本目标还通过下述核酸或其互补序列来解决，所述核酸包含或编码RNA复制子，所述复制子以这样的顺序包含下述区段：
(i)编码RNA依赖性RNA聚合酶或其功能保守的衍生物的核酸序列；
(ii)包含马铃薯X病毒组三基因块或其功能保守的变体以及马铃薯X病毒组的外壳蛋白或其功能保守的变体的核酸序列；
(iii)在植物或在植物组织中可从所述复制子表达的异源核酸序列。
本目标还通过下述核酸或其互补序列来解决，所述核酸包含或编码RNA复制子，所述复制子以这样的顺序包含下述区段：
(i)编码RNA依赖性RNA聚合酶或其功能保守的衍生物的核酸序列；
(ii)包含马铃薯X病毒组三基因块或其功能保守的变体以及烟草花叶病毒组移动蛋白的核酸序列；以及
(iii)在植物或在植物组织中可从所述复制子表达的异源核酸序列。
所述RNA复制子可以是在植物或在植物组织中用于复制和表达所述异源核酸序列的复制子。所述RNA复制子可以基于马铃薯X病毒组建立并且使用马铃薯X病毒组的复制和表达系统用于表达异源核酸序列。
本发明的核酸可以是经分离的，或经分离和纯化的核酸。本发明的核酸通常用作为用于转染或转化植物或植物细胞的载体。
本发明还提供了包含至少两个载体(前-载体)的部分的试剂盒，所述载体能够在植物细胞中通过位点定向重组装配本发明的所述核酸。
本发明还提供了在植物或植物组织中表达目的异源核酸序列的方法，包括对植物或植物组织提供本发明的所述核酸。本发明还提供了在植物或植物组织中表达目的异源核酸序列的方法，包括向植物或植物组织提供两个或多个载体，所述载体能够在植物细胞中通过位点定向重组装配本发明的所述核酸。
发明人已经令人惊讶地鉴定了一种方式，来增加在植物或植物组织中从马铃薯X病毒组载体表达的目的蛋白质的表达产量，这是通过载体设计来实现的，在所述设计中，在条目(ii)中定义的序列位于条目(i)的RNA依赖性RNA聚合酶编码序列(RdRp或RdRP)之后(5’到3’方向的下游)，并且在条目(iii)的所述异源核酸序列之前。在马铃薯X病毒组载体的特定情形中，该载体设计使得RNA复制子能够细胞间移动，并且同时，与常规马铃薯X病毒组载体相比，达到异源核酸更高的表达水平，在所述常规马铃薯X病毒组载体中，异源核酸位于马铃薯X病毒组外壳蛋白基因的上游。发明人鉴定的效果可能是由于下述事实：条目(ii)序列的位置导致这些蛋白质的更低的表达水平，并且导致用于表达这些蛋白质的植物资源的更少的浪费，使得3’目的蛋白质的表达水平更高。重要地，本发明中马铃薯X病毒组外壳蛋白的受限表达水平足以支持用于目的异源序列高产量表达的有效的细胞间移动。
马铃薯X病毒组是具有正义单链基因组的植物RNA病毒。因此，本发明的所述核酸可以是作为或者包含所述RNA复制子的RNA，或者可以是编码所述RNA复制子的DNA。在本文中，术语“马铃薯X病毒组载体”或者“马铃薯X病毒组复制子”意思是该载体或复制子使用马铃薯X病毒组的复制和蛋白质表达系统。所述核酸可以基于天然马铃薯X病毒组建立，例如通过使用来自马铃薯X病毒组的遗传成分。本发明的所述核酸可以通过将所述异源核酸序列插入编码马铃薯X病毒组的核酸构建体中来获得，其中所述目的异源核酸序列被插入到编码所述马铃薯X病毒组的外壳蛋白的序列的下游。但是，可以对天然马铃薯X病毒组的多种遗传成分进行多种修饰，例如对RdRP基因，三基因块、外壳蛋白基因，或对马铃薯X病毒组的5’或3’未翻译区，下文描述了实例。
本发明的所述RNA复制子以从5’端到3’端的顺序包含本发明的所述区段(i)至(iii)。其它遗传元件通常将存在于所述复制子上，用于复制和表达。对于作为RNA复制子，即对于在植物细胞中自主复制，所述RNA复制子编码RdRp或其功能保守的衍生物。所述RNA复制子还在所述RNA复制子的5’-或3’-未翻译区中具有马铃薯X病毒组5’-或3’-未翻译区和启动子序列，用于结合所述RdRp和用于复制所述RNA复制子。所述RNA复制子还可以在条目(ii)和(iii)的区段中具有次基因组启动子，用于产生次基因组RNA，所述次基因组RNA用于表达由条目(ii)和(iii)的区段所编码的蛋白质。如果所述核酸是DNA，其通常将具有转录启动子，用于允许在体外或在植物中通过所述RNA复制子的转录来产生。在植物中允许所述RNA复制子从DNA核酸中转录的转录启动子的实例是广泛用于植物生物技术的35S启动子。
所述区段(i)可以编码马铃薯X病毒组(例如马铃薯X病毒)的RdRp，或所述马铃薯X病毒组RdRp的功能保守的变体。在所述RNA复制子中使用的RdRp可以被认为是马铃薯X病毒组RdRp的功能保守的变体的条件是，如果条目(i)的所述序列编码与SEQ ID NO：4所编码的蛋白质具有至少36％的序列同一性的蛋白质。在另一个实施方案中，与SEQ ID NO：4所编码的蛋白质的所述序列同一性为至少45％，在其它实施方案中，至少55％，在另一个实施方案中，至少65％，以及在甚至其它实施方案中，至少75％。这些序列的同一性可以在SEQ ID NO：4的整条序列上存在。可选地，这些序列同一性可以在至少300个氨基酸残基的蛋白质序列区段中，在至少500个氨基酸残基的蛋白质序列区段中，在至少900个氨基酸残基的蛋白质序列区段中，或在至少1400个氨基酸残基的蛋白质序列区段中存在。
在本文中，使用标准设置，使用BLASTX2.2.14确定氨基酸序列的同一性。这些标准设置允许例如在比对中有序列空位。
在一个实例中，SEQ ID NO：4所编码的蛋白质和马铃薯X病毒组RdRp的功能保守的变体之间的所述序列同一性在至少900个氨基酸残基的蛋白质序列区段中是45％。在另一个实例中，SEQ ID NO：4所编码的蛋白质和马铃薯X病毒组RdRp的功能保守的变体之间的所述序列同一性在至少900个氨基酸残基的蛋白质序列区段中是55％。
可选地，在所述RNA复制子中使用的RdRp可以被认为是马铃薯X病毒组RdRp的功能保守的变体的条件是，如果条目(i)的所述序列编码与SEQ ID NO：4所编码的蛋白质具有至少50％的序列同源性的蛋白质。在另一个实施方案中，与SEQ ID NO：4所编码的蛋白质的所述序列同源性为至少60％，在另一个实施方案中为至少70％，并且在另一个实施方案中为至少80％。这些序列同源性可以是在SEQ ID NO：4的整条序列上存在。可选地，这些序列同源性可以在至少300个氨基酸残基的蛋白质序列区段中，在至少500个氨基酸残基的蛋白质序列区段中，在至少900个氨基酸残基的蛋白质序列区段中，或在至少1400个氨基酸残基的蛋白质序列区段中存在。可以使用标准设置，使用BLASTX 2.2.14确定氨基酸序列的同源性。这些标准设置允许例如在比对中有序列空位。
在一个实例中，SEQ ID NO：4所编码的蛋白质和马铃薯X病毒组RdRp的功能保守的变体之间的所述序列同源性在至少900个氨基酸残基的蛋白质序列区段中是70％。在另一个实例中，SEQ ID NO：4所编码的蛋白质和马铃薯X病毒组RdRp的功能保守的变体之间的所述序列同一性在至少900个氨基酸残基的蛋白质序列区段中是80％。
可选的，用在所述RNA复制子中的RdRp可以被认为是马铃薯X病毒组RdRp的功能保守的变体的条件是，如果条目(i)的所述序列与SEQID NO：4具有至少55％、至少60％、或至少70％的序列同一性。所述序列同一性可以存在于SEQ ID NO：4中，或者在SEQ ID NO：4的至少900个核苷酸的序列区段中，在SEQ ID NO：4的至少1500个核苷酸的序列区段中、在SEQ ID NO：4的至少2000个核苷酸的序列区段中，或在SEQ IDNO：4的至少4200个核苷酸的序列区段中。可以使用标准设置，使用BLASTX 2.2.14确定核苷酸序列的同一性。这些标准设置允许例如在比对中有序列空位。
所述RNA复制子包含条目(ii)的所述核酸序列，用于允许所述RNA复制子在植物或在植物组织中进行细胞间移动。所述RNA复制子的细胞间移动对于在所述植物或所述组织的尽可能多的细胞中实现条目(iii)的序列表达是重要的。条目(ii)的所述核酸序列可以包含马铃薯X病毒组三基因块(在本文中缩写为“TGB”)，或者其功能保守的变体(对于TGB的综述见J.Gen.Virol.(2003)84，1351-1366)。马铃薯X病毒组三基因块编码向马铃薯X病毒组提供细胞间移动能力所需要的三个蛋白质。因此，如果所述TGB的变体可以(任选地与其它所需成分)提供具有在植物或植物组织中进行细胞间移动能力的本发明的RNA复制子，则该变体被认为是TGB的功能保守的变体。
马铃薯X病毒组TGB的实例是马铃薯X病毒的TGB(在本文中被称作“PVX TGB”)。PVX TGB由编码三个蛋白质(根据其适当的分子量被称为25K、12K和8K)的三个基因组成。编码PVX25K、PVX12K蛋白质和PVX8K蛋白质的基因序列分别在SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：13中给出。PVX25K蛋白质、PVX12K蛋白质和PVX8K蛋白质的蛋白质序列分别在SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12和SEQ IDNO：14中给出。
在一个实施方案中，所述马铃薯X病毒组TGB的功能保守的变体是三基因的区块(block)，所述区块编码三个蛋白质，其中之一与PVX 25K蛋白质具有至少33％的序列同一性，一个与PVX 12K蛋白质具有至少36％的序列同一性，一个与PVX8K蛋白质具有至少30％的序列同一性。在另一个实施方案中，所述马铃薯X病毒组TGB的功能保守的变体编码三个蛋白质，其中之一与PVX 25K蛋白质具有至少40％的序列同一性，一个与PVX 12K蛋白质具有至少40％的序列同一性，一个与PVX 8K蛋白质具有至少40％的序列同一性。在另一个实施方案中，所述马铃薯X病毒组TGB的功能保守的变体编码三个蛋白质，其中之一与PVX 25K蛋白质具有至少50％的序列同一性，一个与PVX 12K蛋白质具有至少50％的序列同一性，一个与PVX 8K蛋白质具有至少50％的序列同一性。在另一个实施方案中，相应的序列同一性值对于每个蛋白质而言是60％。在另一个实施方案中，相应的序列同一性值对于每个蛋白质而言是70％。
在另一个实施方案中，马铃薯X病毒组TGB的所述功能保守的变体编码如下的三个蛋白质：第一个蛋白质包含至少200个氨基酸残基的蛋白质序列区段，所述区段与PVX 25K蛋白质的序列区段具有至少40％的序列同一性；第二个蛋白质包含至少100个氨基酸残基的蛋白质序列区段，所述序列区段与PVX 12K蛋白质的序列区段具有至少40％的序列同一性；以及第三个蛋白质包含至少55个氨基酸残基的蛋白质序列区段，所述序列区段与PVX 8K蛋白质的序列区段具有至少40％的序列同一性。在另一个实施方案中，对于每个蛋白质而言相应的序列同一性值为50％。在另一个实施方案中，对于所述第一、第二和第三蛋白质的每一个而言相应的序列同一性值为60％。
条目(ii)的所述核酸序列可以包含另一个序列，其编码所述RNA复制子的细胞间移动所需的蛋白质(例如马铃薯X病毒组外壳蛋白或其功能保守的变体)。所述马铃薯X病毒组外壳蛋白的变体被认为是所述外壳蛋白的功能保守的变体的条件是，如果它能够与其它所需成分(例如TGB)一起为所述RNA复制子提供在植物或植物组织中进行细胞间移动的能力。在一个实施方案中，当所述RNA复制子包含马铃薯X病毒组外壳蛋白(或其功能保守的变体)时，所述RNA复制子不具有病毒颗粒装配的起点，以避免所述RNA复制子以经装配的植物病毒的形式从植物向植物扩散。如果所述RNA复制子包含马铃薯X病毒组外壳蛋白基因(或其功能保守的变体)以及TGB(或其功能保守的变体)，则可能所述TGB位于所述外壳蛋白基因的上游，或者反过来。因此，所述马铃薯X病毒组外壳蛋白基因(或其功能保守的变体)和所述TGB(或其功能保守的变体)可以以任何顺序在条目(ii)的所述核酸序列中存在。
PVX外壳蛋白的编码序列作为SEQ ID NO：7给出，而PVX外壳蛋白的氨基酸序列作为SEQ ID NO：8给出。蛋白质可以被认为是马铃薯X病毒组外壳蛋白的功能保守的变体的条件是，如果其包含至少200、可选至少220、另外可选237个氨基酸残基的蛋白质序列区段，所述序列区段与SEQ ID NO：8的序列区段具有至少35％的序列同一性。在另一个实施方案中，蛋白质可以被认为是马铃薯X病毒组外壳蛋白的功能保守的变体的条件是，如果其包含至少200、可选至少220、另外可选237个氨基酸残基的蛋白质序列区段，所述序列区段与SEQ ID NO：8的序列区段具有至少45％的序列同一性。在可选的实施方案中，相应的序列同一性值为55％或65％。
可选地，条目(ii)的所述核酸序列可以包含(任选地代替编码所述马铃薯X病毒组外壳蛋白的所述序列)编码植物病毒移动蛋白(MP)的序列。适当的MP的实例是烟草花叶病毒组MP例如烟草花叶病毒的MP或者芜青脉明病毒(turnip vein clearing virus)的MP。所述编码植物病毒移动蛋白的序列和所述马铃薯X病毒组TGB(或其功能保守的变体)可以以任何顺序存在于条目(ii)的所述核酸序列中。
条目(iii)的所述异源核酸序列通常包含在植物或植物组织中待表达的目的蛋白质的编码序列。条目(iii)的此类编码序列在本文中也是指目的基因。条目(iii)的所述序列对于所述RNA复制子所基于的所述植物病毒而言是异源的。在许多情形中，所述序列对于其所待在其中表达的所述植物或所述植物组织而言也是异源的。为了可在植物或植物组织中从所述RNA复制子表达，条目(iii)的所述序列通常包含次基因组启动子和表达所需的其它序列，例如核糖体结合位点和/或内部核糖体进入位点(IRES)。在优选的实施方案中，条目(iii)的所述异源核酸序列具有编码一种目的蛋白质的一种目的基因。
本发明的所述核酸可以包含马铃薯X病毒组5’-未翻译区(5’NTR)和马铃薯X病毒组3’-未翻译区(3’NTR).
本发明的方法可以用于在植物或植物组织中产生一种目的蛋白质或多于一种目的蛋白质。所述方法包括向植物、植物组织或植物细胞提供本发明的所述核酸。本发明的方法优选在植物或植物组织中进行。在一个实施方案中，所述方法是瞬时表达方法，其中不需要将本发明的核酸掺入到植物宿主的染色体DNA中。
如果本发明的所述核酸是RNA，则其可以用于感染植物或植物组织，优选与感染的植物组织(例如叶)的机械损伤组合。在另一实施方案中，本发明的所述核酸是DNA，并且可以通过例如粒子轰击或通过农杆菌介导的转化来将所述DNA引入植物或植物组织的细胞中。如果要向多个植物中提供本发明的所述核酸，即，用于大规模蛋白质产生方法，则选择农杆菌介导的转化方法。
可以使用前-载体方法(WO02088369；Marillonnet等人，2004，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，101：6852-6857)，通过向植物或植物组织提供本发明的所述试剂盒或部分，来进行本发明的方法。在所述植物的细胞中，然后通过前-载体之间位点特异的重组来产生本发明的核酸。在一个实施方案中，向植物或植物组织提供包含或编码条目(i)和(ii)的区段的第一载体(前-载体)和包含或编码条目(iii)的区段的第二载体(前-载体)，其中所述第一和所述第二前载体各自具有重组位点，所述重组位点用于允许通过在所述第一和所述第二前-载体之间的位点-特异性重组来实现的本发明的核酸的装配。可以通过向植物或植物组织提供载体的混合物或者农杆菌菌株的混合物(每个菌株包含所述载体之一)来向植物或植物组织提供两个或更多个载体。
在所述植物或植物组织中产生后，可以纯化所述一个或多于一个的目的蛋白质。从植物或植物细胞中纯化蛋白质的方法是本领域已知的。在一个方法中，可以将目的蛋白质导向植物质外体，并且从其中纯化，如WO03/020938中所述。
如果要产生一个目的蛋白质，则可以在编码所述RNA复制子的所述核苷酸序列中包括编码所述目的蛋白质的核苷酸序列。如果要在同一植物或同一植物组织中产生两个或多个蛋白质，则向所述植物或植物细胞提供包含或编码第二或另一RNA复制子的第二核酸。所述另一RNA复制子随后可以编码一个或多个另一目的蛋白质。在一个实施方案中，本发明的第一和第二核酸可以包含或编码非竞争性RNA复制子，如WO2006/079546所述。
本发明原则上可以应用于对于其而言感染性马铃薯X病毒组存在并且建立了病毒载体系统的任何植物。在一个实施方案中，双子叶植物或其组织或细胞可以使用。在另一个实施方案中，使用烟草属(Nicotiana)物种，例如本生烟(Nicotiana benthamiana)和烟草(Nicotiana tabacum)；优选的除烟草属物种外的植物物种是碧冬茄(Petunia hybrida)、芸苔(Brassicacampestris)、芥菜(B.juncea)、水芹、芝麻菜、芥、草莓、菠菜、Chenopodiumcapitatum、苜蓿、莴苣、向日葵、马铃薯和黄瓜。本发明的RNA复制子所可以基于的最优选的植物RNA病毒是马铃薯X病毒组，例如马铃薯X病毒(PVX)、木瓜环花叶马铃薯X病毒(papaya mosaic potexvirus)或箣竹花叶马铃薯X病毒(bamboo mosaic potexvirus)。
本发明的主要应用是在植物、植物叶或植物组织或细胞培养物中产生目的蛋白质。如果本发明的方法在植物中进行，则优选不进入人或动物食物链的植物，例如烟草属物种。不进入人或动物食物链的植物可以在开放的田地中栽培，并且用所述RNA复制子感染后在某一时期内收获。优选地，整株植物或植物部分应当被限制在包含的环境中，例如温室或特别设计的用于提供所述水平表达所需的孵育时期的室。
本发明的产生方法的效率是这样的，使得达到植物表达系统中的新规模。用本发明可达到的表达水平是这样的，从而使得用于下游加工(包括目的蛋白质的分离和纯化)的支出足够低，使得本发明的方法与其它大规模表达系统不相上下。本发明提供了可以大规模使用的第一高产量马铃薯X病毒组植物表达系统。
本发明的优选实施方案
在从属权利要求中所述或如本文所述的优选的实施方案可以组合。例如，本发明提供了包含或编码RNA复制子的核酸，所述复制子以这样的顺序包含下列区段(i)至(iii)：
(i)编码马铃薯X病毒组RNA依赖性RNA聚合酶或其功能保守的变体的核酸序列；
(ii)核酸序列，其包含：
(a)马铃薯X病毒组三基因块或其功能保守的变体，和
(b)编码马铃薯X病毒组外壳蛋白或其功能保守的变体的序列；以及
(iii)在植物或在植物组织中可从所述复制子表达的异源核酸序列；
其中所述马铃薯X病毒组三基因块的所述功能保守的变体编码如下三个蛋白质：包含至少200个氨基酸残基的蛋白质序列区段的第一蛋白质，所述蛋白质序列区段与SEQ ID NO：10的序列区段具有至少40％的序列同一性；包含至少100个氨基酸残基的蛋白质序列区段的第二蛋白质，所述蛋白质序列区段与SEQ ID NO：12的序列区段具有至少40％的序列同一性；以及包含至少55个氨基酸残基的蛋白质序列区段的第三蛋白质，所述蛋白质序列区段与SEQ ID NO：14的序列区段具有至少40％的序列同一性；
其中所述马铃薯X病毒组外壳蛋白的所述功能保守的变体包含至少200个氨基端残基的蛋白质序列区段，所述序列区段与SEQ ID NO：8的序列区段具有至少35％的序列同一性；以及其中条目(i)的所述序列编码这样的蛋白质，其在至少300个氨基酸残基(优选至少500个氨基酸残基、更优选至少900个氨基酸残基，以及最优选至少1400个氨基酸残基)的蛋白质序列区段中与SEQ ID NO：4所编码的蛋白质具有至少36％的序列同一性。
上述实施方案中给出的序列同一性的值可以由在本发明简述中所公开的更加具体的同一性值和/或更大的序列区段所改变。此外，上述实施方案可以与在从属权利要求中所定义的或在本说明书中所描述的优选的实施方案组合。上述核酸可以用于在植物或植物组织(例如烟草属植物或烟草属植物组织或其细胞)中表达目的异源核酸序列的方法。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含或编码RNA复制子的核酸，所述RNA复制子以这样的顺序包含下列区段(i)至(iii)：
(i)编码马铃薯X病毒组RNA依赖性RNA聚合酶或其功能保守的变体的核酸序列；
(ii)核酸序列，其包含：
(a)马铃薯X病毒组三基因块的功能保守的变体和
(b)编码马铃薯X病毒组外壳蛋白的功能保守的变体的序列；以及
(iii)在植物或在植物组织中可从所述复制子表达的异源核酸序列；
其中所述功能保守的变体如上所述。
附图简述：
图1.A-在用不同的PVX载体农杆菌-浸润后，在UV光下监控的本生烟植物(N.benthamiana)(左图)和植物叶(右图)。35S-PVX-CP：提供在CaMV 35S启动子控制下的PVX外壳蛋白(CP)的载体；35S-TVCVMP：提供在CaMV 35S启动子控制下的烟草花叶病毒组芜青脉明病毒(TVCV)移动蛋白(MP)的载体。B-构建体pICH20799和pICH21333的T-DNA区域的图示。PVX Pol：马铃薯X病毒RNA依赖性RNA聚合酶；35S：CaMV 35S启动子；25K，12K，8K：三基因块；CP：PVX外壳蛋白；PVX ntr：PVX未翻译区；GFP：水母绿色荧光蛋白；sgc：外壳蛋白基因的次基因组启动子；RB：T-DNA右边界；LB：T-DNA左边界。删除ATG意思是将ATG密码子突变以防止在所标位置处的翻译起始。
图2.使用不同PVX前载体构件的GFP表达。A-在用不同的5’PVX前载体与3’前载体pICH21282组合并且在噬菌体C31整合酶存在时进行农杆菌浸润后在UV光下监控的本生烟叶，所述整合酶提供了编码病毒复制子的DNA的位点特异性重组介导的装配。仅5’前载体(例如pICH22922；pICH22942等)标记出了接种点。35S-TVCV MP：提供在CaMV 35S启动子控制下的烟草花叶病毒组芜青脉明病毒移动蛋白(MP)的载体。该图在浸润后7天(7dpi)摄得。将用于浸润的农杆菌悬液稀释105倍，用于达到允许视觉检测表达水平差异的表达水平。
B描述了质粒pIC22922、pICH22939、pICH22942、pICH22953和pICH21282的T-DNA区域。PVX Pol：马铃薯X病毒RNA依赖性RNA聚合酶；35S：CaMV 35S启动子；25K，12K，8K：三基因块；25K(trunk)：截短的编码25K蛋白质的基因；CP：PVX外壳蛋白；Pvx ntr：PVX未翻译区；G FP：水母绿色荧光蛋白；sgc：外壳蛋白基因的次基因组启动子；int：植物内含子的5’端；AttP和AttB：噬菌体C31的位点特异性整合酶所识别的序列。
图3.使用在植物组织中不提供(pICH22922)或提供(pICH22939或pICH22988)细胞间移动的PVX前载体构件的GFP表达的比较。A-用不同的5’PVX前载体与3’前载体pICH21282组合并且在噬菌体C31整合酶存在时进行农杆菌浸润后在UV光下监控的本生烟叶，所述整合酶提供了编码病毒复制子的DNA的位点特异性重组介导的装配。该图在浸润后7天(7dpi)获得。将用于浸润的农杆菌悬液如所示稀释103或105倍。
B-标示了质粒pIC22922、pICH22939和pICH22988，pICH22953和pICH21282的T-DNA区域。PVX Pol：马铃薯X病毒RNA依赖性RNA聚合酶；35S：CaMV 35S启动子；25K，12K，8K：三基因块；25K(trunk)：截短的编码25K蛋白质的基因；TVCV MP：烟草花叶病毒组芜青脉明病毒移动蛋白；CP：PVX外壳蛋白；Pvx ntr：PVX未翻译区；GFP：水母绿色荧光蛋白；sgc：外壳蛋白基因的次基因组启动子；int：植物内含子的5’端；AttP和AttB：噬菌体C31的位点特异性整合酶所识别的序列。
图4.使用不提供(pICH22577)或提供(pICH22988或pICH24180)细胞间移动的PVX前载体构件的GFP表达的比较。A-用不同的5’PVX前载体与3’前载体pICH21282组合并且在噬菌体C31整合酶存在时进行农杆菌浸润后在UV光下监控的本生烟叶，所述整合酶提供了编码病毒复制子的DNA的位点特异性重组介导的装配。该图在浸润后7天(7dpi)获得。将用于浸润的农杆菌悬液如所示稀释103或105倍。
B-标示了质粒pIC22577、pICH22988和pICH24180的T-DNA区域。PVX Pol：马铃薯X病毒RNA依赖性RNA聚合酶；35S：CaMV 35S启动子；25K，12K，8K：三基因块；CP：PVX外壳蛋白；PVX ntr：PVX未翻译区；sgc：外壳蛋白基因的次基因组启动子；sg25：25K基因的次基因组启动子；int：植物内含子的5’端；AttP：噬菌体C31的位点特异性整合酶识别的序列。
图5.使用不同的PVX表达盒(前载体构件和装配的载体)的GFP表达，所述表达盒具有在GFP基因之前的不同位置上的CP。A-在用装配的病毒载体pICH25491、pICH25488或不同的5’PVX前载体(pICH22988或pICH24180)与3’前载体pICH21282组合并且在噬菌体C31整合酶存在时进行农杆菌浸润后在UV光下监控的本生烟叶，所述整合酶提供了编码病毒复制子的DNA的位点特异性重组介导的装配。该图在浸润后7天(7dpi)获得。将用于浸润的农杆菌悬液稀释105倍。
B-标示质粒pIC22988、pICH25491、pICH25488和pICH24180的T-DNA区域。PVX Pol：马铃薯X病毒RNA依赖性RNA聚合酶；35S：CaMV 35S启动子；25K，12K，8K：三基因块；CP：PVX外壳蛋白；Pvx ntr：PVX未翻译区；sgc：外壳蛋白基因的次基因组启动子；sg25：25K基因的次基因组启动子；int：植物内含子的5’端；AttP：噬菌体C31的位点特异性整合酶识别的序列。
图6.使用装配的PVX表达盒的GFP表达，所述表达盒具有在GFP基因之前的不同位置上的CP。A-在用装配的病毒载体pICH25491、pICH25488和pICH20799进行农杆菌浸润后，在浸润后10天(左图)和16天(右图)在UV光下监控的本生烟叶。将用于浸润的农杆菌悬液稀释105倍。
B-标示了质粒pIC20799、pICH25491和pICH25488的T-DNA区域。PVX Pol：马铃薯X病毒RNA依赖性RNA聚合酶；35S：CaMV 35S启动子；25K，12K，8K：三基因块；CP：PVX外壳蛋白；PVX ntr：PVX未翻译区；sgc：外壳蛋白基因的次基因组启动子；sg25：25K基因的次基因组启动子。
图7标示了具有多个克隆位点(CS)的PVX克隆载体.PVX Pol：马铃薯X病毒RNA依赖性RNA聚合酶；35S：CaMV 35S启动子；25K，12K，8K：三基因块；CP：PVX外壳蛋白；PVX ntr：PVX未翻译区；sgc：外壳蛋白基因的次基因组启动子；sg25：25K基因的次基因组启动子。
图8显示了pICH25491的图。pICH25491的T-DNA区域的核苷酸序列在SEQ ID NO：6中给出。
图9显示了pICH25488的图。pICH25488的T-DNA区域的核苷酸序列在SEQ ID NO：5中给出。
发明详述
本发明描述了用于马铃薯X病毒组衍生的RNA复制子的新设计，其提高了在植物或植物组织中要从所述RNA复制子表达的目的蛋白质的产量。本发明的方法比常规的马铃薯X病毒组衍生的RNA复制子具有更好的生物安全性特征，因为其产生了更少的病毒外壳蛋白并且因此可以形成更少的病毒颗粒。
我们已经令人惊讶地发现外壳蛋白或异源移动蛋白的编码序列的位置在编码目的蛋白质的所述异源核酸序列(iii)之前会在消耗病毒外壳蛋白时增加所述重组蛋白质的产量。PVX外壳蛋白不仅对于系统移动是必需的，而且与三基因块的三个其它蛋白质一起用于细胞间(短距离)移动(Yang等人，2000，Mol.Plant Microbe Interact.，13：599-605；Fedorkin等人，2001，J.Gen.Virol.，82：449-458)。在本文中，显示了(见实施例1和图1)缺乏PVX外壳蛋白使得PVX衍生的RNA复制子不能进行长距离(图1A，左图)和细胞间(图1A，右图)移动。可以通过提供反式PVX外壳蛋白(CP)或烟草花叶病毒组移动蛋白(例如烟草花叶病毒(TMV)移动蛋白(MP)(图1A，右图))来恢复细胞间移动。还显示(实施例2，图2)了具有TVCV移动蛋白的PVX衍生的RNA复制子能够进行短距离(细胞间)移动。使用前载体系统进行实验(Marillonnet等人，2004，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，101：6852-6857)，所述前载体系统允许在植物中通过例如前载体AttP和AttB位点之间的位点特异性重组来装配RNA复制子的DNA前体(图2B)。
具有TVCV MP(pICH22939)或PVX CP的PVX衍生的RNA复制子的比较分析描述在实施例3中并且显示在图3中。如上文所述的情形中，使用前载体系统。从图3中很明显看出位于目的基因之前的PVX CP提供了所述RNA复制子的细胞间移动。根据GFP点的亮度和密度(图3A)可以得出，细胞间移动的效率显著高于TVCV MP。
在本发明的另一个实施方案中，测试了PVX CP在目的基因之前的位置的效率。从图4A中很明显，CP在三基因块之后的位置与所述CP在PVXRNA依赖性RNA聚合酶和三基因块之前的位置相比，提供了更有效的细胞间移动。也在此实验中使用前载体系统。在使用前载体或提供PVX衍生的RNA复制子的转配的载体的情形之间发现没有目的蛋白质(GPF)表达水平上的差异(见实施例5，图5)。当我们在比较研究中包括这样的载体(所述载体提供了在目的基因之后包含CP的RNA复制子)时，所述目的基因从此类载体中的表达水平(GFP表达区域的亮度)令人惊讶地显著弱于CP位于目的基因之前的载体(pICH20799对pICH25488或pICH25491，图6，实施例6)。
在实施例中，我们使用基于PVX的RNA复制子。但是，属于马铃薯X病毒组分类学组的其它病毒可以用于构建本发明的基于RNA病毒的载体。可用于本发明的病毒物种包括但不限于箣竹花叶马铃薯X病毒(bamboo mosaic potexvirus)、木瓜环花叶马铃薯X病毒(papaya mosaicpotexvirus)、莲子草花叶马铃薯X病毒(alternanthera mosaic potexvirus)、三叶草黄花叶病毒(clover yellow mosaic virus)、车前草X病毒(plantainvirus X)、白三叶草花叶病毒(white clover mosaic virus)和奥古巴马铃薯花叶病毒(potato aucuba mosaic virus)。植物病毒移动蛋白的细节见近期的综述WJ Lucas(2006，Virology，344：169-184)。
衍生自一种植物病毒的一种RNA复制子可以用于本发明的方法，例如衍生自马铃薯X病毒(PVX)。但是，两种或多种不同的RNA复制子也可以用于植物或植物组织中，用于表达两种不同的目的蛋白质，其中此类不同的RNA复制子优选衍生自不同的植物病毒。所述不同的RNA复制子所来源的此类不同的植物病毒优选是协同或非竞争性病毒。在本文中“协同”和“非竞争性”同义。协同病毒可以在相同的植物细胞中共存在并且有效扩增。类似地，衍生自协同RNA病毒的RNA复制子可以在相同的植物细胞中共存在且有效扩增。此类RNA复制子的协同对的实例为这样的RNA复制子对，其中一个RNA复制子衍生自TMV或TVCV，而另一个RNA复制子衍生自马铃薯X病毒组例如PVX。协同RNA复制子可以用于在相同的植物细胞中表达两种或多种目的蛋白质或蛋白质亚基，例如单克隆抗体的重链和轻链。在相同的植物或相同的植物细胞中使用不同(非竞争性)病毒载体表达两种或多种目的蛋白质的方法描述在EP1686176中。
在实施例中，我们在植物细胞中主要使用农杆菌介导的病毒载体的递送。可以使用多种通常用于稳定转化植物的其它方法将载体递送到植物细胞中，例如将异源核苷酸序列通过下述方法直接引入到细胞中：微粒轰击、电穿孔或PEG-介导的原生质体转化。农杆菌介导的植物转化是优选的。因此，可以通过多种技术将异源核苷酸序列转化到植物细胞中，例如通过农杆菌(Agrobacterium)携带的Ti-质粒载体(US 5,591,616；US 4,940,838；US 5,464,763)、粒子或微粒轰击(US 05100792；EP 00444882B1；EP00434616B1)。原则上，其它植物转化方法也可以使用，例如显微注射(WO09209696；WO 09400583A1；EP 175966B1)、电穿孔(EP00564595B1；EP00290395B1；WO 08706614A1)等。转化方法的选择取决于待转化的植物物种及其它。例如对于单子叶植物转化，微粒轰击可以是优选的，而对于双子叶植物，农杆菌-介导的转化一般给出更优结果。
本发明优选用高等多细胞植物进行。用于本发明中的优选的植物包括优先提供农业经济和园艺重要物种的任何植物物种。用于本发明的常规作物植物包括苜蓿、大麦、菜豆、卡诺拉油菜、豇豆、棉、谷类、三叶草、莲、兵豆、羽扇豆、黍、燕麦、豌豆、花生、稻、黑麦、草木樨、向日葵、香豌豆、大豆、高粱、黑小麦、西印度豆薯、黎豆、野豌豆、小麦、紫藤和坚果植物。优选用于实践本发明的植物物种包括但不限于：禾本科(Graminae)、菊科(Compositae)、茄科(Solanacea)和蔷薇科(Rosaceae)的代表。此外用于本发明的优选的物种，以及上文特定指出的那些植物来自属：鼠耳芥属(Arabidopsis)、剪股颖属(Agrostis)、葱属(Allium)、金鱼草属(Antirrhinum)、芹属(Apium)、落花生属(Arachis)、天门冬属(Asparagus)、颠茄属(Atropa)、燕麦属(Avena)、山白竹属(Bambusa)、芸苔属(Brassica)、雀麦属(Bromus)、Browaalia、山茶属(Camellia)、大麻属(Cannabis)、辣椒属(Capsicum)、鹰嘴豆属(Cicer)、藜属(Chenopodium)、菊苣属(Chichorium)、柑橘属(Citrus)、咖啡属(Coffea)、薏苡属(Coix)、香瓜属(Cucumis)、南瓜属(Curcubita)、狗牙根属(Cynodon)、鸭茅属(Dactylis)、曼陀罗属(Datura)、胡萝卜属(Daucus)、毛地黄属(Digitalis)、薯蓣属(Dioscorea)、油棕属(Elaeis)、属(Eleusine)、羊茅属(Festuca)、草莓属(Fragaria)、老鹳草属(Geranium)、大豆属(Glycine)、向日葵属(Helianthus)、Heterocallis、橡胶树属(Hevea)、大麦属(Hordeum)、天仙子属(Hyoscyamus)、番薯属(Ipomoea)、莴苣属(Lactuca)、兵豆属(Lens)、百合属(Lilium)、亚麻属(Linum)、黑麦草属(Lolium)、百脉根属(Lotus)、番茄属(Lycopersicon)、Majorana、苹果属(Malus)、芒果属(Mangifera)、木薯属(Manihot)、苜蓿属(Medicago)、龙面花属(Nemesia)、烟草属(Nicotiana)、驴食豆属(Onobrychis)、稻属(Oryza)、稷属(Panicum)、天竺葵属(Pelargonium)、狼尾草属(Pennisetum)、碧冬茄属(Petunia)、豌豆属(Pisum)、菜豆属(Phaseolus)、梯牧草属(Phleum)、早熟禾属(Poa)、李属(Prunus)、毛茛属(Ranunculus)、萝卜属(Raphanus)、Ribes、茶藨子属(Ricinus)、悬钩子属(Rubus)、甘蔗属(Saccharum)、智利喇叭花属(Salpiglossis)、黑麦属(Secale)、千里光属(Senecio)、狗尾草属(Setaria)、白芥属(Sinapis)、茄属(Solanum)、蜀黍属(Sorghum)、钝叶草属(Stenotaphrum)、可可树属(Theobroma)、车轴草属(Trifolium)、胡卢巴属(Trigonella)、小麦属(Triticum)、野豌豆属(Vicia)、豇豆属(Vigna)、葡萄属(Vitis)、玉蜀黍属(Zea)、以及莪利竹族(Olyreae)、Pharoideae和许多其它。
在本发明方法的一个特定实施方案中，衍生自PVX的RNA复制子与烟草属植物使用。
使用本发明可以以正义或反义方向表达的目的蛋白质或其片段包括淀粉修饰酶(淀粉合酶、淀粉磷酸化酶、脱支酶、淀粉分支酶、淀粉分支酶II、颗粒体结合的淀粉合酶)、蔗糖磷酸合酶、蔗糖磷酸化酶、多聚半乳糖醛酸酶、多聚果聚糖蔗糖酶、腺苷二磷酸-葡糖焦磷酸化酶、环化糊精糖基转移酶、果糖基转移酶、糖原合酶、果胶酯酶、抑酶肽、抗生物素蛋白、细菌果聚糖蔗糖酶、大肠杆菌(E.coli)glgA蛋白、MAPK4和直向同源物、氮同化/代谢酶、谷氨酰胺合酶、植物渗透蛋白、2S清蛋白、奇异果甜蛋白、位点特异性重组酶/整合酶(FLP、Cre、R重组酶、Int、SSVI整合酶R、整合酶phiC3l、或其活性片段或变体)、异戊烯基转移酶、Sca M5(大豆钙调蛋白)、鞘翅类之昆虫型毒素(coleopteran type toxin)或杀虫活性的片段、泛素缀合酶(E2)融合蛋白、代谢脂类、氨基酸、糖类、核酸和多糖的酶、超氧化物岐化酶、蛋白酶的非活性酶原形式、植物蛋白毒素、在纤维生产植物中改变纤维的性状、来自苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)的鞘翅类之昆虫活性毒素(Bt2毒素、杀虫晶体蛋白(ICP)、CryIC毒素、δ内毒素、多肽毒素、毒素原等)、昆虫特异性毒素AaIT、纤维素降解酶、来自解纤维热酸菌(Acidothermus celluloticus)的E1纤维素酶、木质素修饰酶、肉桂酰醇脱氢酶、海藻糖-6-磷酸合酶、细胞分裂素代谢途径的酶、HMG-CoA还原酶、大肠杆菌无机焦磷酸酶、种子贮存蛋白、草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)番茄红素合酶、ACC氧化酶、pTOM36编码的蛋白质、肌醇六磷酸酶、酮水解酶(ketohydrolase)、乙酰乙酰辅酶A还原酶、PHB(聚羟基丁酸酯(polyhydroxybutanoate))合酶、酰基载体蛋白、油菜籽蛋白、EA9、非高等植物八氢番茄红素合酶、pTOM5编码的蛋白质、ETR(乙烯受体)、质体丙酮酸磷酸双激酶(plastidicpyruvate phosphate dikinase)、线虫-诱导型跨膜孔蛋白、增强植物细胞的光合或质体功能的性状、芪合酶(stilbene synthase)，能够羟基化酚类的酶、儿茶酚双加氧酶、儿茶酚2，3-双加氧酶、氯黏康酸环化异构酶、邻氨基苯甲酸合酶、芸苔属AGL15蛋白、果糖1，6-二磷酸酶(FBPase)、AMVRNA3、PVY复制酶、PLRV复制酶、马铃薯Y病毒组外壳蛋白、CMV外壳蛋白、TMV外壳蛋白、黄矮病毒组复制酶、MDMV信使RNA、突变双粒病毒组复制酶、加州月桂(Umbellularia californica)C12：0优选的酰基-ACP硫酯酶、植物C10或C12:0优选的酰基-ACP硫酯酶、C14:0优选的酰基-ACP硫酯酶(luxD)、植物合酶因子A、植物合酶因子B、6-去饱和酶、在植物细胞中脂肪酸的过氧化物酶体(peroxysomal)-氧化中具有酶促活性的蛋白质、酰基辅酶A氧化酶、3-酮脂酰辅酶A硫解酶、脂肪酶、玉米乙酰辅酶A羧化酶、5--烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase)(EPSP)、膦丝菌素乙酰基转移酶(BAR、PAT)、CP4蛋白、ACC脱氨酶、核酶、具有翻译后切割位点的蛋白质、由Gal4转录激活子的DNA结合结构域和转录激活结构域组成的蛋白质融合、能够将融合蛋白靶向到脂相的油质蛋白与目的蛋白质的翻译融合、赋予氨磺酰抗性的DHPS基因、细菌腈水解酶、2，4-D单加氧酶、乙酰乳酸合酶或乙酰羟酸合酶(ALS、AHAS)、多聚半乳糖醛酸酶、细菌腈水解酶、位于质体的内包膜的成熟磷酸易位蛋白的氨基末端疏水区域与待靶向到所述膜中的目的蛋白质的融合等。
可以使用本发明的系统表达任何人或动物蛋白质。此类目的蛋白质的实例包括下述蛋白质(药物蛋白质)等：免疫应答蛋白(单克隆抗体、单链抗体、T细胞受体等)、抗原、集落刺激因子、松弛素、多肽激素、细胞因子及其受体、干扰素、生长因子和凝固因子、酶促活性的溶酶体酶、纤维蛋白溶酶多肽、凝血因子、胰蛋白酶原、1-抗胰蛋白酶(AAT)，以及功能性保守的蛋白质例如上述蛋白质融合体(fusion)、突变形式和合成衍生物。
本专利申请要求优先权的在2006年9月6日提交的欧洲专利申请No.06018713.5的内容在本文以其全文引入作为参考。
实施例
实施例1
缺乏CP的PVX构建体不进行细胞间移动
从Yuri Dorokhov教授处(莫斯科州立大学，俄罗斯(Moscow StateUniversity，Russia))获得包含GFP基因的PVX构建体(pA3151)。这一构建体通过下述制备：将包含GFP编码序列的NheI-SalI片段克隆到用NheI和SalI消化的pPVX201(Baulcombe，D.，Chapman，S.& SantaCruz，S.，1995，Plant J.，7：1045-1053)中，然后从得到的构建体中将Hind3-SacI片段(包含完整的病毒插入片段和GFP基因)亚克隆到pBIN19。然后将病毒插入片段作为SacI-SphI片段从pA3151亚克隆到pICBV52(小的基于pBIN19的KanR二元载体)中，得到质粒pICH20799。该构建体包含克隆的在35S启动子控制下的PVX构建体(图1B)。GFP编码序列从重复CP次基因组启动子(sgc)表达，并且位于三基因块(TGB)和CP编码序列之间。由于CP上游的重复次基因组启动子片段也包含CP起始密码子，因此通过从ATG突变成AGG来消除该起始密码子。
通过删除CP基因和其次基因组启动子(使用一条引物重叠住缺失终点的PCR)，从pICH20799(图1B)制备缺乏CP的对照构建体。将得到的构建体pICH21333(图1B)转化到农杆菌(Agrobacterium)中，并且浸润在本生烟叶中。如所预期的，病毒复制子不能进行细胞间或系统移动。当将pICH21333与构建体pICH10745或pICH22066一起共浸润时会恢复复制子移动，所述pICH10745或pICH22066分别提供TVCV MP或PVXCP的瞬时表达(图1A)。pICH10745和pICH22066构建体分别包含TVCVMP或PVX CP编码序列，它们受到35S启动子的控制。
实施例2
具有在TGB和目的基因之间克隆的TVCV MP基因的PVX复制子能够细胞间移动
由于TVCV MP能够向缺乏PVX CP的PVX复制子提供细胞间移动，将TVCV MP基因克隆到PVX构建体的三基因块和目的基因(在该情形中是GFP)之间，受到重复CP次基因组启动子的控制。为了实践的原因，将该构建体(pICH22939，图2B和SEQ ID NO：1)制备为5’前载体构件，所述构件包含与5’病毒载体序列融合的35S启动子但是缺乏构建体的3’部分(包括目的基因的编码序列和PVX 3’NTR)。重组位点(链霉菌属(Streptomyces)噬菌体C31 AttP位点)和内含子序列在病毒构建体序列之后。3’前载体构件pICH21282(图2B)包含相容的重组位点(链霉菌属噬菌体C31AttB重组位点)，其后接着内含子序列、GFP基因和PVX NTR。通过包含5’和3’构件的农杆菌与PhiC31重组酶(pICH10881，包含受到拟南芥ACT2启动子控制的PhiC31重组酶，见Marillonnet等人，2005，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，101：6852-6857)的共浸润，在重组位点进行位点特异性重组，来体内装配构建体的5’和3’部分。在将5’和3’构件向植物细胞进行T-DNA递送并且在AttP和AttB位点重组后，从35S启动子转录重组DNA。通过侧翼内含子序列的剪接将重组位点从转录物切除，并且剪接的转录物从核输出到细胞质中，在其中被扩增为正常的病毒RNA复制子。
对照前载体构建体(pICH22922，无TVCV MP序列的5’前载体)与3’前载体pICH21282的浸润导致形成不能进行细胞间移动的复制子。相反，pICH22939的浸润产生了能够进行细胞间移动的复制子(图2A)。
由于不需要其它病毒蛋白质，TMV就能够向TMV复制子提供细胞间移动，因此，制备了第二PVX构建体，其中删除了三基因块的12K和8K蛋白质，产生了构建体pICH22953(图2B和SEQ ID NO：2)。在该情形中，TMV MP从12K次基因组启动子(sg12)表达。pICH22953与pICH21282的浸润产生了能够细胞间移动的复制子。但是细胞间移动和GFP荧光并不优于或强于使用构建体pICH22939时(图2)。
实施例3
具有在TGB和目的基因之间克隆的PVX CP基因的PVX载体能够细胞间移动。
制备类似于pICH22939但是用PVX CP替换了TVCV MP的构建体。该构建体的序列与野生型病毒从病毒的5’端直到CP末端的序列相同。CP后面是用于表达目的基因的重复CP次基因组启动子。将该构建体pICH22988(图3B)与pICH21282(图2B)浸润导致形成这样的复制子，其与产生自pICH22939(图3A)的复制子相比，有更快的细胞间移动并且产生更亮的GFP荧光。
实施例4
具有在RdRP和TGB之间克隆的PVX CP基因的PVX载体能够细胞间移动
在重复25K次基因组启动子(sg25)的控制下，将PVX CP基因克隆到RdRp和三基因块之间，得到构建体pICH24180(图4B，SEQ ID NO：3)。pICH24180与pICH21282组合与整合酶来源(pICH10881)的浸润导致形成能够细胞间移动的病毒复制子(图4A)。在对照实验中将构建体pICH22577(与pICH22922类似但是在一些限制性位点上不同)而不是pICH24180浸润，其如预期表现出不进行细胞间移动。与用pICH22988类似，来自pICH24180的GFP荧光强于用构建体pICH22939的荧光。
实施例5
包含CP的完全装配的PVX病毒载体也提供了细胞间移动
制备包括具有GFP部分的3’前载体(pICH21282，图2B)并且对应于前载体pICH22988或pICH24180的装配的构建体，分别产生质粒pICH25488和pICH25491(图5B)。pICH25488和pICH25491的T-DNA区域的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所给出的。发现两个构建体都如所预期的与前载体一样工作，并且提供细胞间移动和强的G FP荧光(图5A)。GFP荧光也比标准构建体(pICH20799)强得多，表明有更多重组蛋白质表达(图6A)，其中在所述标准构建体中，CP基因位于目的基因之后。考马斯染色的蛋白质凝胶显示与pICH20799相比，从pICH25491和pICH25488表达出了高得多的量的GFP蛋白质，并且相反，从pICH20799比其它两种构建体产生了高得多的量的PVX CP。
实施例6
PVX克隆载体
显示了在RdRP和TGB之间或在TGB和目的基因之间具有CP的两种类型的PVX克隆载体的图示。CS：克隆位点。
序列表
<110>爱康遗传有限公司(Icon Genetics GmbH)
<120>马铃薯X病毒组衍生的复制子
<130>PCT-14592
<150>EP 06 018 713.5
<151>2006-09-06
<160>14
<170>PatentIn版本3.1
<210>1
<211>786
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>pICH22939的片段(次基因组启动子-TMV MP，在25K和次基因组启动子-目的基因之间)
<400>1
Figure A200780032636D00301
<210>2
<211>792
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>来自pICH22953的序列，其包含25K编码序列的11C-末端氨基酸，接着是TVCV MP编码序列(25K序列中的12K蛋白质的ATG从ATG突变为ACG)
<400>2
Figure A200780032636D00302
Figure A200780032636D00311
<210>3
<211>817
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>pICH24180的序列片段，其包括RdRP的4个最后的氨基酸、25K基因的次基因组启动子、PVX CP基因、25K基因的次基因组启动子和25K蛋白质的前4个氨基酸
<400>3
Figure A200780032636D00312
<210>4
<211>4371
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码RNA依赖性RNA聚合酶的pICH25488的序列片段
<400>4
Figure A200780032636D00313
Figure A200780032636D00321
Figure A200780032636D00331
<210>5
<211>8070
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒pICH25488的T-DNA区域
<400>5
Figure A200780032636D00332
Figure A200780032636D00341
Figure A200780032636D00351
Figure A200780032636D00361
<210>6
<211>8060
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒pICH25491的T-DNA区域
<400>6
Figure A200780032636D00362
Figure A200780032636D00371
Figure A200780032636D00381
Figure A200780032636D00391
<210>7
<211>714
<212>DNA
<213>马铃薯X病毒
<400>7
Figure A200780032636D00392
Figure A200780032636D00401
<210>8
<211>237
<212>PRT
<213>马铃薯X病毒
<400>8
Figure A200780032636D00402
<210>9
<211>681
<212>DNA
<213>马铃薯X病毒
<400>9
<210>10
<211>226
<212>PRT
<213>马铃薯X病毒
<400>10
Figure A200780032636D00413
<210>11
<211>345
<212>DNA
<213>马铃薯X病毒
<400>11
Figure A200780032636D00431
<210>12
<211>115
<212>PRT
<213>马铃薯X病毒
<400>12
Figure A200780032636D00432
<210>13
<211>210
<212>DNA
<213>马铃薯X病毒
<400>13
Figure A200780032636D00433
<210>14
<211>70
<212>PRT
<213>马铃薯X病毒
<400>14
Figure A200780032636D00441

Claims (20)

1.包含或编码RNA复制子的核酸，所述RNA复制子以这样的顺序包含下列区段(i)至(iii)：
(i)编码马铃薯X病毒组RNA依赖性RNA聚合酶或其功能保守
的变体的核酸序列；
(ii)核酸序列，其包含：
(a)马铃薯X病毒组三基因块或其功能保守的变体和
(b)编码马铃薯X病毒组外壳蛋白或其功能保守的变体的序列；或编码烟草花叶病毒组移动蛋白的序列；以及
(iii)在植物或在植物组织中可从所述复制子表达的异源核酸序列。
2.根据权利要求1的核酸，其中所述马铃薯X病毒组三基因块的所述功能保守的变体编码如下三种蛋白质：包含至少200个氨基酸残基的蛋白质序列区段的第一蛋白质，所述蛋白质序列区段与SEQ ID NO：10的序列区段具有至少40％的序列同一性；包含至少100个氨基酸残基的蛋白质序列区段的第二蛋白质，所述蛋白质序列区段与SEQ ID NO：12的序列区段具有至少40％的序列同一性；以及包含至少55个氨基酸残基的蛋白质序列区段的第三蛋白质，所述蛋白质序列区段与SEQ ID NO：14的序列区段具有至少40％的序列同一性。
3.根据权利要求1的核酸，其中所述马铃薯X病毒组三基因块的所述功能保守的变体编码三种蛋白质，其中之一与SEQ ID NO：10具有至少33％的序列同一性；一种与SEQ ID NO：12具有至少36％的序列同一性；并且一种与SEQ ID NO：14具有至少30％的序列同一性。
4.根据权利要求3的核酸，其中所述马铃薯X病毒组三基因块的所述功能保守的变体编码三种蛋白质，其中之一与SEQ ID NO：10具有至少50％的序列同一性；一种与SEQ ID NO：12具有至少50％的序列同一性；并且一种与SEQ ID NO：14具有至少50％的序列同一性。
5.根据权利要求1至4中任一项的核酸，其中所述马铃薯X病毒组外壳蛋白的所述功能保守的变体包含至少200个氨基酸残基的蛋白质序列区段，所述序列区段与SEQ ID NO：8的序列区段具有至少35％的序列同一性。
6.根据权利要求1至5中任一项的核酸，其中条目(i)的所述序列编码这样的蛋白质，所述蛋白质与SEQ ID NO：4所编码的蛋白质在至少300个氨基酸残基、优选至少500个氨基酸残基、更优选至少900个氨基酸残基、以及最优选至少1400个氨基酸残基的蛋白质序列区段中具有至少36％的序列同一性。
7.根据权利要求1至6中任一项的核酸，其中条目(i)的所述序列编码这样的蛋白质，所述蛋白质与SEQ ID NO：4所编码的蛋白质在至少300个氨基酸残基、优选至少500个氨基酸残基、更优选至少900个氨基酸残基、以及最优选至少1400个氨基酸残基的蛋白质序列区段中具有至少45％的序列同一性。
8.根据权利要求1至5中任一项的核酸，其中条目(i)的所述序列编码这样的蛋白质，所述蛋白质与SEQ ID NO：4所编码的蛋白质在至少300个氨基酸残基、优选至少500个氨基酸残基、更优选至少900个氨基酸残基、最优选至少1400个氨基酸残基的蛋白质序列区段中具有至少50％的序列同源性。
9.根据权利要求1至5中任一项的核酸，其中条目(i)的所述核酸序列与SEQ ID NO：4在至少900个核苷酸、优选至少1500个核苷酸、更优选至少2700个核苷酸、最优选至少4200个核苷酸的序列区段中具有至少55％，优选至少60％的序列同一性。
10.根据权利要求1至9中任一项的核酸，其中所述复制子是马铃薯X病毒组复制子，优选是衍生自马铃薯X病毒、自箣竹花叶马铃薯X病毒、或自木瓜环花叶马铃薯X病毒的复制子。
11.根据权利要求1至10中任一项的核酸，其中所述复制子不具有病毒颗粒装配的起点。
12.根据权利要求1至11中任一项的核酸，所述核酸包含选自以下的序列：在条目(i)的上游在植物细胞中有活性的转录启动子、病毒次基因组启动子、马铃薯X病毒组5’或3’未翻译区。
13.根据权利要求1至12中任一项的核酸，其中条目(a)和(b)在条目(ii)的所述核酸序列中可以是任何顺序。
14.根据权利要求13的核酸，其中，在条目(ii)中，所述马铃薯X病毒组三基因块或其功能保守的变体位于所述马铃薯X病毒组外壳蛋白基因或其功能保守的变体的上游，或者反过来。
15.根据权利要求1至13中任一项的核酸，其中所述烟草花叶病毒组移动蛋白是烟草花叶病毒或者芜青脉明病毒的移动蛋白或者所述移动蛋白的功能保守的变体。
16.核酸，其包含权利要求1至15中任一项的所述核酸的互补序列。
17.包含或编码RNA复制子的核酸，所述RNA复制子以这样的顺序包含下列区段(i)至(iii)：
(i)编码马铃薯X病毒组RNA依赖性RNA聚合酶或其功能保守的变体的核酸序列；
(ii)核酸序列，其包含：
(a)马铃薯X病毒组三基因块和
(b)编码马铃薯X病毒组外壳蛋白的序列；或者编码烟草花叶病毒组移动蛋白的序列；以及
(iii)在植物或在植物组织中可从所述复制子表达的异源核酸序列。
18.包含至少两种载体的部分的试剂盒，所述载体能够在植物细胞中通过位点定向重组装配权利要求1至16中任一项的所述核酸。
19.根据权利要求18的部分的试剂盒，其包含至少两种载体，第一载体包含或编码权利要求1至15中任一项的条目(i)和(ii)的区段，并且第二载体包含或编码权利要求1至15中任一项的条目(iii)的区段，其中所述第一和所述第二载体每个具有重组位点，所述重组位点用于允许通过位点特异性重组来装配根据权利要求1至15中任一项的核酸。
20.在植物或植物组织中表达目的异源核酸序列的方法，其包括向植物或植物组织提供权利要求1至16中任一项的所述核酸。
CNA2007800326362A 2006-09-06 2007-09-06 马铃薯x病毒组衍生的复制子 Pending CN101512002A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP06018713A EP1897953A1 (en) 2006-09-06 2006-09-06 Potexvirus-derived replicon
EP06018713.5 2006-09-06

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101512002A true CN101512002A (zh) 2009-08-19

Family

ID=37309718

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2007800326362A Pending CN101512002A (zh) 2006-09-06 2007-09-06 马铃薯x病毒组衍生的复制子

Country Status (11)

Country Link
US (1) US8415463B2 (zh)
EP (2) EP1897953A1 (zh)
JP (1) JP2010502203A (zh)
CN (1) CN101512002A (zh)
AU (1) AU2007294097B2 (zh)
BR (1) BRPI0716193A2 (zh)
CA (1) CA2657132C (zh)
DK (1) DK2061890T3 (zh)
ES (1) ES2389783T3 (zh)
MX (1) MX2009000556A (zh)
WO (1) WO2008028661A2 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103543264A (zh) * 2013-11-05 2014-01-29 广西大学 淮山药x病毒的多克隆抗体制备、检测及其应用
CN111542608A (zh) * 2017-07-28 2020-08-14 双刃基金会 马铃薯y病毒抗性基因及使用方法

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2351917B1 (es) * 2009-06-30 2011-12-23 Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) Secuencia viral implicada en la regulación de la expresión génica, vector de expresión, célula y planta que la comprende.
US8637653B2 (en) * 2009-12-22 2014-01-28 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Infectious plant viral vector and an artificial bipartite plant viral vector an infectious plant viral vector and an artificial bipartite plant viral vector
EP2418283A1 (en) 2010-08-07 2012-02-15 Nomad Bioscience GmbH Process of transfecting plants
EP2584042A1 (en) 2011-10-17 2013-04-24 Nomad Bioscience GmbH Production, storage and use of cell wall-degrading enzymes
EP2647715A1 (en) 2012-04-03 2013-10-09 Nomad Bioscience GmbH Agrobacterium for transient transfection of whole plants
EP2960331A4 (en) * 2013-02-20 2016-11-23 Nat Inst Of Advanced Ind Scien NUCLEIC ACID MOLECULE FOR EXPRESSION OF A FOREIGN GENE IN A PLANT, AND METHOD THEREOF
CA2904472A1 (en) * 2013-03-22 2014-09-25 Fraunhofer-Gesellschaft Zur Forderung Der Angewandten Forschung E.V. Kits comprising plus-sense single stranded rna viral vectors and methods for producing polypeptides using the kits
JP6453315B2 (ja) 2013-05-23 2019-01-16 ノマド・バイオサイエンス・ゲーエムベーハー 植物に非生物的ストレス抵抗性をもたらす方法
EP3097783B1 (en) 2015-05-26 2019-11-13 Nomad Bioscience GmbH Colicin m for the control of ehec
EP3178313A1 (en) 2015-12-09 2017-06-14 Leibniz-Institut für Pflanzenbiochemie Gene and protein for the synthesis of oxidized zingiberene derivatives
EP3372091A1 (en) 2017-03-07 2018-09-12 Nomad Bioscience GmbH Method of reducing contamination of an object with clostridium
EP3378485A1 (en) 2017-03-24 2018-09-26 Nomad Bioscience GmbH Bacteriocins for control of salmonella enterica
EP3456829A1 (en) * 2017-09-18 2019-03-20 Nomad Bioscience GmbH Method of improving potexviral vector stability
JP2021514391A (ja) 2018-02-15 2021-06-10 アイコン ジェネティクス ゲーエムベーハー ノロウイルスに対する免疫応答を生成するための免疫原性組成物及びワクチン
CA3133030A1 (en) 2019-03-12 2020-09-17 Icon Genetics Gmbh Norovirus-like particles with improved stability
US20220227818A1 (en) 2019-06-06 2022-07-21 Nomad Bioscience Gmbh Klebicins for the control of klebsilella
US20230270145A1 (en) 2020-07-16 2023-08-31 Nomad Bioscience Gmbh Products for oral consumption with reduced sugar content
EP4248987A1 (en) 2022-03-21 2023-09-27 Nomad Bioscience GmbH Chimeric bacteriocins and method for the control of pseudomonas

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001038512A2 (en) * 1999-11-22 2001-05-31 Plant Bioscience Limited Enhanced transgene expression by co-expression with a suppressor of post-transcriptional gene silencing (ptgs)
DE10121283B4 (de) * 2001-04-30 2011-08-11 Icon Genetics GmbH, 80333 Verfahren und Vektoren zur Amplifikation oder Expression von gewünschten Nucleinsäuresequenzen in Pflanzen
DE10143205A1 (de) * 2001-09-04 2003-03-20 Icon Genetics Ag Verfahren zur Proteinproduktion in Pflanzen
EP1686176A1 (en) * 2005-01-28 2006-08-02 Icon Genetics AG Production of antibodies in plants with plus-sense single-stranded viral RNA vectors

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103543264A (zh) * 2013-11-05 2014-01-29 广西大学 淮山药x病毒的多克隆抗体制备、检测及其应用
CN103543264B (zh) * 2013-11-05 2015-10-07 广西大学 淮山药x病毒的多克隆抗体制备、检测及其应用
CN111542608A (zh) * 2017-07-28 2020-08-14 双刃基金会 马铃薯y病毒抗性基因及使用方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2008028661A2 (en) 2008-03-13
AU2007294097B2 (en) 2013-11-07
JP2010502203A (ja) 2010-01-28
BRPI0716193A2 (pt) 2013-11-12
CA2657132A1 (en) 2008-03-13
ES2389783T3 (es) 2012-10-31
EP2061890B1 (en) 2012-06-27
US20100071084A1 (en) 2010-03-18
AU2007294097A1 (en) 2008-03-13
WO2008028661A3 (en) 2008-04-24
US8415463B2 (en) 2013-04-09
DK2061890T3 (da) 2012-07-23
EP2061890A2 (en) 2009-05-27
EP1897953A1 (en) 2008-03-12
CA2657132C (en) 2016-05-03
MX2009000556A (es) 2009-01-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101512002A (zh) 马铃薯x病毒组衍生的复制子
JP5172828B2 (ja) 植物ウイルスに基づいた誘導性発現システム
Mahajan et al. Roles of the sequence encoding tobacco etch virus capsid protein in genome amplification: requirements for the translation process and a cis-active element
US8222488B2 (en) Enhancing expression of value-added genes by transgenic expression of tombusvirus-based P19 gene mutants
EP1564295A1 (en) RNA virus-derived plant expression system
EP2976428B1 (en) Kits comprising plus-sense single stranded rna viral vectors and methods for producing polypeptides using the kits
Radian-Sade et al. Transgenic Nicotiana benthamiana and grapevine plants transformed with grapevine virus A (GVA) sequences
US20160002654A1 (en) Nucleic acid molecule for expressing foreign gene in plant and method therefor
CN115960954A (zh) Rna干扰载体及其在诱导双子叶植物基因沉默中的应用
JP5230608B2 (ja) Ｐ１５ヘアピン構造及びその使用方法
US20190062767A1 (en) Method and system for expressing foreign gene in a plant
MXPA06003715A (es) Sistema de expresion de planta derivado de virus de arn.
Shin et al. The 5′-UTR of Turnip yellow mosaic virus does not include a critical encapsidation signal
CN104910264B (zh) 一种毛竹油菜素内酯受体蛋白及其编码基因与应用
WO2024099163A1 (zh) 一种玉米氨基酸转运蛋白及其编码基因在植物抗病中的应用
WO2011154611A2 (en) A method for enhanced protein synthesis
KR20230032679A (ko) 이종 바이러스의 RNA 침묵억제 단백질을 포함하는 Potato virus X 기반 재조합 식물 발현 벡터 및 이의 용도
JP2002516089A (ja) 形質転換のための改良された方法および材料
CN103740716B (zh) 组成型启动子及其用途
JPH09252779A (ja) 組換え植物におけるタンパク質の生産方法
CN101454456A (zh) 植物基于病毒的诱导型表达系统

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20090819