MX2009000556A - Replicon derivado de potexvirus. - Google Patents

Abstract

Ácido nucleico que comprende o codifica una réplica de ARN que comprende, en este orden, los siguientes segmentos (i) a (iii): (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica una polimerasa de ARN dependiente de ARN de potexvirus o una variante conservadora de la función del mismo; (ii) una secuencia de ácido nucleico que comprende: (a) un bloque genético triple de potexvirus o una variante conservadora de la función del mismo, y (b) una secuencia que codifica una proteína de recubrimiento potexviral o una variante conservadora de la función de la misma; o una secuencia que codifique una proteína de movimiento tobamoviral; y (iii) una secuencia de ácido nucleico heterólogo expresable a partir de esa réplica en una planta o un tejido de planta.

Description

REPLICÓN DERIVADO DE POTEXVIRUS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un proceso de expresión de alta producción de un gen de interés en una planta, en tejido de planta o en células de planta usando un replicón derivado de potexvirus y a un ácido nucleico que comprende o codifica un replicón de ARN potexviral utilizable para expresar un gen de interés. La invención también se refiere a un estuche de partes que comprenden dos o más vectores que codifican juntos el replicón de ARN de la invención.

ENTORNO DE LA INVENCIÓN La expresión de alta producción de proteínas heterólogas en plantas puede lograrse usando vectores virales. Los sistemas de vector viral fueron desarrollados predominantemente para la expresión transitoria seguida por la infección (Donson et al., 1991, Proc Nati Acad Sci USA, 88:7204-7208; Chapman, Kavanagh & Baulcombe, 1992, Plant J., 2:549-557) o la transfección (Marillonnet et al., 2005, Nat Biotechnol., 23:718-723; Santi et al., 2006, Proc Nati Acad Sci U S A. 103:861-866; 02005/049839) de un huésped de planta. Los sistemas mejor establecidos y comercialmente disponibles se basan en virus de ARN de una hebra de sentido positivo, preferiblemente en vectores derivados del Virus del Mosaico del tabaco (TMV) (Kumagai et al., 1994, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90, 427-430; Mallory et al., 2002, Nature Biotechnol. 20, 622-625; US5316931; US5589367; US5866785; US5977438; WO02088369; WO02097080; WO0229068; US5491076) .

Otro grupo de vectores basados en virus de ARN derivados del potexvirus PVX (virus X de la papa) también puede proporcionar producción razonablemente alta de proteínas recombinantes, aunque producción notablemente menor que los vectores derivados de TMV (Chapman, Kavanagh & Baulcombe, 1992, Plant J. , 2:549-557; Baulcombe, Chapman & Santa Cruz, 1995, Plant J. , 7:1045-1053; Zhou et al., 2006, Appl. Microbiol. Biotechnol., Abril 13, Pub antes de impresión; Zelada et al., 2006, Tuberculosis, 86:263-267). Obviamente, tal sistema necesita más desarrollo para aumentar la producción de la proteína recombinante de interés .

En la primera generación de vectores virales sistémicos, una gran proporción de recursos de plantas se gastaron para la producción de la proteína de recubrimiento viral que es necesaria para el movimiento sistémico de un replicón viral. Para los vectores derivados de T V este problema se resolvió removiendo el gen de la proteina de recubrimiento y mediante el uso de agro infiltración para la entrega sistémica eficiente de los replicones, fomentando asi significativamente la producción de proteínas recombinantes de interés (WO2005/049839; Marillonnet et al., (2005), Nat . Biotechnol., 23:718-723). Sin embargo, a diferencia de los replicones derivados de TMV, los replicones derivados de potexvirus requieren proteína de recubrimiento viral no solamente para el movimiento sistémico, sino también para el de corta distancia (de célula a célula) . Por lo tanto, el gen de proteína de recubrimiento de los vectores virales derivados de potexvirus no puede ser eliminado sin una severa pérdida de la eficiencia de la expresión de la proteína. Además, la construcción de hospedero de planta que proporcione proteína de recubrimiento viral in trans es raramente una buena solución, debido al silenciamiento del gen. También, las platas transgénicas que expresan la proteína de recubrimiento podrían exhibir resistencia mediada por la proteína de recubrimiento para los retos por virus de planta (Beachy, RN., 1999, Philos. Trans. R. Soc. Lond B Biol. Sci, 354:659-664/ Wisniewski et al., 1990, Plant Cell, 2:559-567). Otro fenómeno similar, llamado resistencia mediada por CP heteróloga, puede ser un problema por ejemplo cuando una planta transgénica que expresa la CP de PVX reduce la propagación de célula a célula del ARN de TMV (Bazzini et al., 2006, J. Gen. Virol., 87:1005-1012). Además, la expresión de la proteina de recubrimiento de PVX en plantas de tabaco transgénico rescata el PVX de movimiento deficiente, pero compromete la eficiencia del movimiento de célula a célula y la replicación viral (Spillane et al., 1997, Virology, 236:76-84) . Esto podría ser un elemento cuando se requiere el uso de dos vectores virales (p. ej . , vectores basados en TMV y PVX) , en la misma célula de planta, para la expresión de proteínas hetero-oligoméricas (p. ej . , para la expresión conjunta de las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo monoclonal) (WO2006/079546; Giritch et al., 2006, Proc. Nati. Acad. Sci USA, en prensa).

DESCRIPCIÓN GENERAL DE LA INVENCIÓN Por lo tanto, un objetivo de la invención es proporcionar un vector viral basado en potexvirus para la expresión de alta producción de una proteína de interés en plantas, en tejido de plantas o en células de plantas. El vector viral debería ser capaz de movimiento de célula a célula y debería gastar tan pocos recursos como sea posible de un hospedero de planta para producir la proteína de recubrimiento viral.

Este objetivo se resuelve mediante un ácido nucleico que comprende o que codifica un replicón de ARN que comprende, en este orden, los siguientes segmentos: (i) una secuencia de ácido nucleico que codifique una polimerasa de ARN dependiente de ARN o un derivado conservador de la función, de la misma; (ii) una secuencia de ácido nucleico que codifique una o más proteínas requeridas para el movimiento de célula a célula de ese replicón en una planta o en un tejido de planta; (iii) una secuencia heteróloga de ácido nucleico que pueda expresarse a partir de ese replicón en una planta o en un tejido de planta; o una secuencia complementaria de los mismos.

Este objetivo también se resuelve mediante un ácido nucleico que comprenda o codifique un replicón de ARN que comprenda, en este orden, los siguientes segmentos: (i) una secuencia de ácido nucleico que codifique una polimerasa de ARN dependiente de ARN o un derivado conservador de la función de la misma; (ii) una secuencia de ácido nucleico que comprenda un bloque genético triple de potexvirus o una variante conservadora de la función del mismo y una proteina de recubrimiento potexviral o una variante conservadora de la función de la misma; (iii) una secuencia heteróloga de ácido nucleico que sea expresable a partir de ese replicón en una planta o en un tejido de planta; o una secuencia complementaria de los mismos.

Este objetivo también se resuelve mediante un ácido nucleico que comprenda o codifique un replicón de ARN que comprenda, en este orden, los siguientes segmentos: (i) una secuencia de ácido nucleico que codifique una polimerasa de ARN dependiente de ARN o un derivado conservador de la función de la misma; (ii) una secuencia de ácido nucleico que comprenda un bloque genético triple de potexvirus o una variante conservadora de la función del mismo y una proteina de movimiento tobamoviral; y 5 (iii) una secuencia de ácido nucleico que se exprese a partir de ese replicón en una planta o en un tejido de planta¬ i o o una secuencia complementaria de los mismos.

Ese replicón de ARN puede ser un replicón para replicar y expresar la mencionada secuencia heterologa de ácido nucleico en una planta o un tejido de planta. Ese 15 replicón de ARN puede construirse en un potexvirus y usa el sistema de replicación y expresión de un potexvirus para expresar una secuencia heterologa de ácido nucleico.

El ácido nucleico de la invención puede ser un 0 ácido nucleico aislado, o uno aislado y purificado. El ácido nucleico de la invención se usa típicamente como un vector para transfectar o transformar una planta o células de plantas.

La invención también proporciona un estuche de partes, que comprende cuando menos dos vectores (provectores) que son capaces de ensamblar el ácido nucleico de la invención en células de planta mediante la recombinación dirigida al sitio.

La invención también proporciona un procedimiento para la expresión de una secuencia heteróloga de ácido nucleico de interés en una planta o tejido de planta, que comprende proporcionar una planta o tejido de planta con el ácido nucleico de la invención. La invención también proporciona un procedimiento para la expresión de una secuencia heteróloga de ácido nucleico de interés en una planta o tejido de planta, que comprende proporcionar una planta o tejido de planta con dos o más vectores que sean capaces de ensamblar el ácido nucleico de la invención en células de planta mediante la recombinación dirigida al sitio .

Los inventores han identificado, sorprendentemente, una forma de aumentar la producción de la expresión de una proteina de interés que se expresa en una planta o en un tejido de planta, a partir de un vector potexviral mediante un diseño del vector en el cual las secuencias, como se definen en el punto (ii) , son posicionadas después (corriente abajo en la dirección de 5 a 3') de la secuencia codificadora de polimerasa de ARN dependiente de ARN (RdRp o RdRP) del punto (i) y preceden a la secuencia heteróloga de ácido nucleico del punto (iii) . En el caso especial de vectores potexvirales, este diseño de vector conduce a una capacidad de movimiento de célula a célula del replicón de ARN y, al mismo tiempo, a niveles de expresión más altos del ácido nucleico heterólogo en comparación con los vectores potexvirales convencionales en los que un ácido nucleico heterólogo fue colocado corriente arriba del gen de proteina de recubrimiento potexviral. El efecto identificado por los inventores puede deberse al hecho de que la posición de las secuencias del punto (ii) conduce a niveles de expresión más bajos de estas proteínas y a un menor consumo de los recursos de la planta para la expresión de estas proteínas, permitiendo niveles de expresión más altos de la proteína 3' de interés. De manera importante, el nivel de expresión limitado de la proteína de recubrimiento potexviral en la invención es suficiente para soportar el movimiento eficiente de célula a célula para la alta producción de la expresión de la secuencia heteróloga de interés.

Los potexvirus son virus de ARN planta con genoma de una hebra de sentído positivo. lo tanto, ácido nucleico de la invención puede ser ARN que sea, o que comprenda a, ese replicón de ARN, o puede ser ADN que codifique a ese replicón de ARN. Aquí, los términos "vector potexviral" o "replicón potexviral" significan que el vector o el replicón hacen uso del sistema de replicación y de expresión de la proteina de los potexvirus. Este ácido nucleico puede construirse en un potexvirus natural, p. ej . , usando componentes genéticos de un potexvirus. El ácido nucleico de la invención puede obtenerse insertando la secuencia heteróloga de ácido nucleico en una construcción de ácido nucleico que codifique un potexvirus, de modo que la secuencia heteróloga de ácido nucleico de interés se inserta corriente abajo de una secuencia que codifica la proteina de recubrimiento del potexvirus. Sin embargo, pueden hacerse varias modificaciones a los diversos componentes genéticos de un potexvirus natural, tal como al gen RdRP, al bloque genético triple, al gen de proteina de recubrimiento, o a las regiones 5' ó 30 no trasladadas de un potexvirus, para los que se muestran ejemplos más abajo.

El replicón de ARN de la invención comprende, en el orden de desde el extremo 5' hacia el extremo 3', los segmentos (i) a (iii) de la invención. Otros elementos genéticos típicamente estarán presentes en ese replicón para la replicación y la expresión. Para ser un replicón de ARN, es decir, para la replicación autónoma en una célula de planta, el replicón de ARN codifica un RdRp o un derivado de conservación de la función del mismo. El replicón de ARN también puede tener las regiones potexvirales 5' ó 3' no trasladadas y las secuencias del promotor en la región 5' ó 3' no trasladada del replicón de ARN para unir el mencionado RdRp y para replicar el replicón de ARN. El replicón de ARN también puede tener promotores subgenomicos en los segmentos del elemento (ii) y (iii) para generar ARNs subgenomicos para la expresión de las proteínas codificadas por los segmentos de los elementos (ii) y (iii) . Si el ácido nucleico es ADN, típicamente tendrá un promotor de transcripción para permitir la producción por transcripción del replicón de ARN in vitro o en la planta. Un ejemplo de un promotor de transcripción que permite la transcripción del replicón de ARN de un ácido nucleico de ADN en la planta es el promotor 35S que se usa ampliamente en la biotecnología de plantas.

El segmento (i) puede codificar un RdRp de un potexvirus tal como un virus X de la papa, o una variante conservadora de la función del RdRp del potexvirus. El RdRp usado en el replicón de ARN puede ser considerado como una variante conservadora de la función de un RdRp potexviral, si la secuencia del elemento (i) codifica una proteina que tenga una identidad de secuencia de al menos 36% para una proteina codificada por la SEQ ID NO: 4. En otra representación, la identidad de secuencia es la menos de 45%, en otra representación de al menos 55%, en otra representación de al menos 65% y en otra representación más, de al menos 75% para una proteina codificada por la SEQ ID NO: 4. Estas identidades de secuencia pueden estar presentes sobre toda la secuencia de la SEQ ID NO: 4. Alternativamente, estas identidades de secuencia pueden estar presentes dentro de un segmento de secuencia de proteina de al menos 300 residuos de aminoácido, dentro de un segmento de secuencia de proteina de al menos 500 residuos de aminoácido, o dentro de un segmento de secuencia de proteina de al menos 1400 residuos de aminoácido .

Aquí, las identidades de secuencia de aminoácido pueden ser determinadas usando BLASTX2.2.14 , usando los ajustes estándar. Los ajustes estándar permiten, por ejemplo, los espacios de secuencia en las alineaciones.

En un ejemplo, la identidad de secuencia entre una proteina codificada por SEQ ID NO: 4 y una variante conservadora de la función de un RdRp de potexvirus es de 45% en un segmento de secuencia de proteina de al menos 900 residuos de aminoácido. En otro ejemplo, la identidad de secuencia entre una proteina codificada por SEQ ID NO: 4 y una variante conservadora de la función de un RdRp de potexvirus es de 55% en un segmento de secuencia de proteina de al menos 900 residuos de aminoácido.

Alternativamente, el RdRp usado en el replicón de ARN puede ser considerado una variante conservadora de la función de un RdRp potexviral si la secuencia del elemento (i) codifica una proteina que tenga una homología de secuencia de al menos 50% para una proteína codificada por SEQ ID NO: 4. En otra representación, la homología de secuencia es de al menos 60%, en otra representación de al menos 70%, y en otra representación, de al menos 80% para una proteína codificada por SEQ ID NO: 4. Estas homologías de secuencia pueden estar presentes sobre toda la secuencia de SEQ ID NO: 4. Alternativamente, estas homologías de secuencia pueden estar presentes dentro de un segmento de secuencia de proteína de al menos 300 residuos de aminoácido, al menos 500 residuos de aminoácido, al menos 900 residuos de aminoácido, o al menos 1400 residuos de aminoácido. Las homologías de secuencia de aminoácido pueden determinarse usando BLASTX2.2.14 usando los ajustes estándar. Los ajustes estándar permiten, por ejemplo, espacios de secuencia n las alineaciones.

En un ejemplo, la homología de secuencia entre una proteína codificada por SEQ ID NO: 4 y una variante conservadora de la función de un RdRp de potexvirus es de 70% en un segmento de secuencia de proteína de al menos 900 residuos de aminoácido. En otro ejemplo, la identidad de secuencia entre una proteína codificada por SEQ ID NO: 4 y una variante conservadora de un RdRp de potexvirus es de 80% en un segmento de secuencia de proteína de al menos 900 residuos de aminoácido.

Alternativamente, el RdRp usado en el replicón de ARN puede considerarse una variante conservadora de la función de un RdRp de potexvirus si la secuencia del elemento (i) tiene una identidad de secuencia de al menos 55%, de al menos 60% o de al menos 70% para la SEQ ID NO: 4. Las identidades de secuencia pueden estar presentes dentro de la SEQ ID NO: 4, o dentro de un segmento de secuencia de al menos 900 nucleótidos, dentro de un segmento de secuencia de al menos 1500 nucleótidos, dentro de un segmento de secuencia de la menos 2000 nucleótidos, o dentro de un segmento de secuencia de al menos 4200 nucleótidos de SEQ ID NO: 4. Las identidades de secuencia de nucleótido pueden determinarse usando BLASTN2.2.1 , usando los ajustes estándar. Los ajustes estándar permiten, por ejemplo, espacios de secuencia en las alineaciones.

El replicón de ARN comprende la secuencia de ácido nucleico del elemento (ii) para permitir el movimiento de célula a célula del replicón de ARN en una planta o tejido de planta. El movimiento de célula a célula del replicón de ARN es importante para lograr la expresión de la secuencia del elemento (iii) en tantas plantas o tejidos como sean posibles. La secuencia de ácido nucleico del elemento (ii) puede comprender el bloque genético triple potexviral (aqui abreviado como ' TGB ' ) o una variante conservadora de la función del mismo (una revisión del TGB se encuentra en J. Gen. Virol. (2003) 84, 1351, 1366) . El bloque genético triple potexviral codifica tres proteínas necesarias para proporcionar la capacidad de movimiento de célula a célula a un potexvirus. Por lo tanto, se considera que una variante del TGB es una variante conservadora de la función del TGB si la variante puede proporcionar, opcionalmente con otros componentes necesarios, el replicón de ARN de la invención con la capacidad de movimiento de célula a célula en una planta o en un tejido de planta.

Un ejemplo de un TGB potexviral es el TGB del virus X de la papa (aquí llamado 'TGB de PVX'). El TGB de PVX consiste de tres genes que codifican tres proteínas llamadas 25K, 12K, y 8K, de acuerdo con su peso molecular aproximado. Las secuencias genéticas que codifican la proteína 25K de PVX, la proteína 12K de PVX, y la proteína 8K de PVX se dan en SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, y SEQ ID NO: 13, respectivamente. Las secuencias de proteína de la proteína 25K de PVX, la proteína 12K de PVX, y la proteína 8K de PVX se dan en SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, y SEQ ID NO: 14, respectivamente.

En una representación, la variante conservadora de la función de un TGB de potexvirus es un bloque de tres genes, bloque que codifica tres proteínas, una de las cuales tiene una identidad de secuencia de al menos 33% con la proteína 25K de PVX, una que tiene una identidad de secuencia de al menos 36% con la proteína 12K de PVX y una que tiene una identidad de secuencia de al menso 30% con la proteína 8K de PVX. En otra representación, la variante conservadora de la función de un TGB de potexvirus codifica tres proteínas, una de las cuales tiene una identidad de secuencia de al menos 40% con la proteína 25K de PVX, una que tiene una identidad de secuencia de al menos 40% con la proteína 12K de PVX, y una que tiene una identidad de secuencia de al menos 40% con la proteína 8K de PVX. En otra representación, la variante conservadora de la función de un TGB de potexvirus codifica tres proteínas, una de las cuales tiene una identidad de secuencia de al menos 50% con la proteína 25K de PVX, una que tiene una identidad de secuencia de al menos 50% con la proteína 12K de PVX, y una que tiene una identidad de secuencia de al menos 50% con la proteína 8K de PVX. En otra representación, los valores correspondientes de la identidad de secuencia son de 60% para cada proteína. En otra representación, los valores correspondientes de la identidad de secuencia son del 70% para cada proteína.

En otra representación, la variante conservadora de la función de un TGB de potexvirus codifica tres proteínas, como sigue: una primera proteína que comprende un segmento de secuencia de al menos 200 residuos de aminoácido, teniendo ese segmento una identidad de secuencia de al menos 40% con un segmento de secuencia de la proteína 25K de PVX; una segunda proteína que comprende un segmento de secuencia de proteína de al menos 100 residuos de aminoácido, teniendo ese segmento de secuencia una identidad de secuencia de al menos 40% con un segmento de secuencia de la proteína 12K de PVX; y una tercera proteína que comprende un segmento de secuencia de proteína de al menos 55 residuos de aminoácido, teniendo ese segmento de secuencia una identidad de secuencia de al menos 40% con un segmento de secuencia de la proteina 8K de PVX. En otra representación, los valores correspondientes de identidad de secuencia son de 50% para cada proteina. En otra representación, los valores correspondientes de identidad de secuencia son de 60% para cada una de la primera, la segunda y la tercera proteínas.

La secuencia de ácido nucleico del elemento (ii) puede comprender una secuencia adicional que codifica una proteína necesaria para el movimiento de célula a célula del replicón de ARN, tal como una proteína de recubrimiento potexviral o una variante conservadora de la función de la misma. Una variante de la proteína de recubrimiento potexviral es considerada una variante conservadora de la función de la proteína de recubrimiento, si es capaz de proporcionar el replicón de ARN, junto con otros componentes necesarios tales como el TGB, con la capacidad de movimiento de célula a célula en una planta o el en tejido de planta. En una representación en la que el replicón de ARN comprende una proteína de recubrimiento potexviral (o una variante conservadora de la función de la misma) , el replicón de ARN no tiene un origen de ensamble de partícula viral para evitar la propagación del replicón de ARN de planta a planta en la forma de un virus de planta ensamblado. Si el replicón de ARN comprende un gen de proteina de recubrimiento potexviral (o una variante conservadora de la función del mismo) y un TGB (o una variante conservadora de la función del mismo) , es posible que tal TGB se ubique corriente arriba del gen de proteina de recubrimiento, o viceversa. Por lo tanto, el gen de proteina de recubrimiento potexviral (o una variante conservadora de la función del mismo) y el TGB (o una variante conservadora de la función del mismo) pueden estar presentes en cualquier orden en la secuencia de ácido nucleico del elemento (ii) .

La secuencia de codificación de una proteina de recubrimiento de PVX se da como SEQ ID NO: 7, y la secuencia de aminoácido de la proteina de recubrimiento de PVX se da como SEQ ID NO: 8. Una proteina puede ser considerada una variante conservadora de la función de una proteina de recubrimiento potexviral si comprende un segmento de secuencia de proteina de al menos 200, alternativamente de la menos 220, también alternativamente de 237 residuos de aminoácido, teniendo ese segmento de secuencia una identidad de secuencia de al menos 35% con un segmento de secuencia de SEQ ID NO: 8. En otra representación, una proteina se considera una variante conservadora de la función de una proteina de recubrimiento potexviral si comprende un segmento de secuencia de proteina de al menos 200, alternativamente de al menos 220, también alternativamente de 237 residuos de aminoácido, teniendo ese segmento de secuencia una identidad de secuencia de al menos 45% con un segmento de secuencia de SEQ ID NO: 8. En las representaciones alternativas, los valores correspondientes de identidad de secuencia son de 55% ó 65%.

Alternativamente, la secuencia de ácido nucleico del elemento (ii) puede comprender opcionalmente , en lugar de la secuencia que codifica la proteina de recubrimiento potexviral, una secuencia que codifique una proteina de planta de movimiento viral (MP) . Un ejemplo de una MP adecuada es una MP tobamoviral tal como una MP del virus del mosaico del tabaco o una MP de virus aclarador de la vena del nabo. Esta secuencia que codifica una proteina de planta de movimiento viral y el TGB de potexvirus (o una variante conservadora de la función de los mismos) pueden estar presentes en cualquier orden en la secuencia de ácido nucleico del elemento (ii) .

La secuencia de ácido nucleico heterólogo del elemento (iii) comprende típicamente la secuencia de codificación de una proteína de interés que se va a expresar en una planta o en el tejido de la planta. La secuencia de codificación del elemento (iii) también es aquí llamada el gen de interés. La secuencia del elemento (iii) es heteróloga del virus de planta en el cual se basa el replicón de ARN. En muchos casos, esa secuencia también es heteróloga para la planta o el tejido de planta en el cual se va a expresar. Para ser expresable a partir del replicón de ARN en una planta o en el tejido de planta, la secuencia del elemento (iii) comprende típicamente un promotor subgenómico y otras secuencias requeridas para la expresión tales como el sitio de unión del ribosoma y/o un sitio interno de entrada del ribosoma (IRES).En una representación preferida, la secuencia de ácido nucleico heterólogo del elemento (iii) tiene un gen de interés que codifica para una proteína de interés.

El ácido nucleico de la invención puede comprender una región 5' no trasladada de potexvirus (51-NTR) y una región 3' no trasladada de potexvirus (3'-NTR).

El procedimiento de la invención se puede usar para producir una proteína de interés o más de una proteína de interés en una planta o en un tejido de planta. Este procedimiento comprende proporcionar una planta, un tejido de planta o células de planta con el ácido nucleico de la invención. El procedimiento de la invención se realiza preferiblemente en plantas o en tejido de plantas. En una representación, el procedimiento es un procedimiento de expresión transitoria, por lo que la incorporación del ácido nucleico de la invención en el ADN cromosómico de la planta hospedera no es necesario.

Si el ácido nucleico de la invención es ARN, puede usarse para infectar una planta o tejido de planta, preferiblemente en combinación con daño mecánico del tejido de la planta infectada, tal como las hojas. En otra representación, el ácido nucleico de la invención es ADN y ese ADN puede ser introducido en las células de una planta o el tejido de planta, p. ej . , mediante bombardeo de partículas o por transformación mediada por Agrobacteria . La transformación mediada por Agrobacteria es el método de elección si se van a proporcionar varias plantas con el ácido nucleico de la invención, es decir, para los métodos de producción de proteína a gran escala.

El procedimiento de la invención puede realizarse usando el enfoque de pro-vector (WO02088369; Marillonnet et al, 2004, Proc. Nati. Acad. Sci USA, 101:6852-6857), proporcionando una planta o tejido de planta con el estuche o las partes de la invención. En las células de esa planta, es entonces producido el ácido nucleico de la invención mediante recombinación específica del sitio entre los provectores. En una representación, se proporcionan a una planta o a un tejido de planta un primer vector (provector) que comprende o codifica segmentos de los elementos (i) y (ii) y un segundo vector (pro-vector) que comprende o codifica al segmento del elemento (iii) , donde cada uno del primero y del segundo pro-vectores tienen un sitio de recombinación para permitir el ensamble de un ácido nucleico de la invención mediante la recombinación específica del sitio entre el primero y el segundo pro-vectores. Pueden proporcionarse a una planta o tejido de planta dos o más vectores, proporcionando mezclas de los vectores o cepas de Agrobacteria, cada cepa conteniendo uno de esos vectores.

La una, o más de una, proteínas de interés, pueden ser purificadas después de la producción en la planta o el tejido de planta. En la técnica se conocen los métodos de purificación de proteínas a partir de plantas o células de plantas. En un método, una proteína de interés puede ser dirigida al apoplasto de una planta y purificada a partir del mismo, como se describe en el documento WO 03/020938.

Si se tiene que producir una proteina de interés, puede incluirse una secuencia nucleótida, de que codifique para la proteina de interés, en la secuencia nucleótida que codifique el replicón de ARN. Si se van a producir en la misma planta o en el mismo tejido de planta dos o más proteínas de interés, la planta o las células de planta pueden proporcionarse con un segundo ácido nucleico que comprenda o codifique un segundo o un adicional replicón de ARN. Ese replicón adicional de ARN puede codificar entonces una o más proteínas de interés. En una representación, un primero y un segundo ácidos nucleicos de la invención pueden comprender o codificar replicones de ARN no competidores, como se describe en el documento WO2006/079546.

La presente invención se puede aplicar en principio a cualesquiera plantas para las cuales existen potexvirus y para las cuales se establecieron sistemas de vector viral. En una representación, se usan plantas dicotiledóneas o tejido o células de las mismas. En otra representación se usan especies Nicotiana , como la Nicotiana benthamiana y la Nicotiana tabacum; las especies preferidas de plantas distintas de las especies Nicotiana son Petunia hybrida, Brassica campestris, B. júncea, berro, rúcula, mostaza, espinaca fresa, Chenopodium capitatum, alfalfa, lechuga, girasol, papa y pepino. Los virus de ARN de planta más preferidos que infectan replicones de ARN de la invención pueden basarse en potexvirus tales como el virus X de la papa (PVX), el potexvirus del mosaico de la papaya o el potexvirus del mosaico del bambú.

La aplicación principal de la presente invención es la producción de una proteina de interés en plantas, hojas de planta o cultivo de tejido o células de planta. Si el procedimiento de la invención se realiza en plantas, se prefieren las plantas que no entran en la cadena alimentaria humana o animal, como las especies Nicotiana, La plantas que no entran en la cadena alimentaria humana o animal pueden ser cultivadas a campo abierto y cosechadas dentro de un cierto periodo después de la infección con el replicón de ARN. Preferiblemente, las plantas enteras o las partes de planta se confinarán en un ambiente contenido, por ejemplo, un invernadero o una cámara diseñada para el periodo de incubación necesario para proporcionar el nivel de expresión deseado.

La eficiencia del procedimiento de producción de la presente invención es tal que se obtiene una nueva dimensión en los sistemas de expresión de las plantas. Los niveles de expresión que se logran con la presente invención son tales que los gastos para el procedimiento corriente abajo (incluyendo la separación y la purificación de la proteina de interés) son lo suficientemente bajos para hacer al procedimiento de la invención competitivo con otros sistemas de expresión a gran escala. La invención proporciona el primer sistema de expresión potexviral de planta de alta producción que se puede usar a gran escala.

REPRESENTACIONES VENTAJOSAS DE LA INVENCIÓN Las representaciones preferidas, como se describen en las reivindicaciones dependientes o como se describen aquí, pueden ser combinadas. Por ejemplo, la invención proporciona un ácido nucleico que comprende o codifica un replicón de ARN que comprende, en este orden, los siguientes segmentos (i) a (iii) : (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica una polimerasa de ARN dependiente del ARN de potexvirus o una variante conservadora de la función de la misma; (ii) una secuencia de ácido nucleico que comprende : (a) un bloque genético triple de potexvirus o una variante conservadora de la función del mismo, y (b) una secuencia que codifique una proteina de recubrimiento potexviral o una variante conservadora de la función de la misma; y (iii) una secuencia de ácido nucleico heterólogo expresable a partir del replicón en una planta o un tejido de planta; donde la variante conservadora de la función del bloque genético triple de potexvirus codifica tres proteínas como sigue: una primera proteína que comprende un segmento de secuencia de proteína de al menos 200 residuos de aminoácido, teniendo ese segmento de secuencia de proteína una secuencia de identidad de al menos 40% con un segmento de secuencia de SEQ ID NO: 10; una segunda proteína que comprende un segmento de secuencia de proteína de al menos 100 residuos de aminoácido, teniendo el segmento de proteína una identidad de secuencia de al menos 40% con un segmento de secuencia de SEQ ID NO: 12; y una tercera proteína que comprende un segmento de secuencia de proteína de al menos 55 residuos de aminoácido, teniendo el segmento de secuencia de proteína una identidad de secuencia de al menos 40% con un segmento de secuencia de SEQ ID NO: 14; donde la variante conservadora de la función de la proteina de recubrimiento potexviral comprende un segmento de secuencia de proteina de al menos 200 residuos de aminoácido, teniendo ese segmento de secuencia una identidad de secuencia de al menos 35% con un segmento de secuencia de SEQ ID NO: 8; y donde la secuencia del elemento (i) codifica una proteina que tiene una identidad de secuencia de al menos 36& con una proteina codificada por el SEQ ID NO: 4; dentro de un segmento de secuencia de proteina de al menos 300 residuos de aminoácido, preferiblemente al menos 500 residuos de aminoácido, más preferiblemente al menos 900 residuos de aminoácido, y lo más preferible, al menos 1400 residuos de aminoácido.

Los valores de identidad de secuencia que se dan en la representación anterior pueden ser intercambiados por valores de identidad más específicos y/o por segmentos de secuencia más grandes como se describe en la descripción general de la invención. Además, la representación anterior puede ser combinada con las representaciones preferidas como se definen en las reivindicaciones dependientes o como se describen en esta descripción. El ácido nucleico de arriba puede usarse en un proceso de expresión de una secuencia de ácido nucleico heterólogo de interés en una planta o un tejido de planta, tal como en plantas de Nicotiana o en tejidos de planta Nicotiana o en células de la misma.

En otra representación, la invención proporciona un ácido nucleico que comprende o que codifica un replicón de ARN que comprende, en este orden, los siguientes segmentos (i) a (iii) : (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica una polimerasa de ARN dependiente del ARN de potexvirus o una variante conservadora de la función de la misma; (ii) una secuencia de ácido nucleico que comprende: (a) una variante conservadora de la función de un bloque genético triple de potexvirus y (b) una secuencia que codifique una variante conservadora de la función de una proteina de recubrimiento potexviral; y (iii) una secuencia de ácido nucleico heterólogo expresable a partir del replicón en una planta o en un tejido de planta; donde las variantes conservadoras de la función son como se definen arriba.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1A.- Plantas de N. benthamiana (imagen izquierda) y hojas de planta (imagen derecha) monitoreadas bajo luz UV después de la agro infiltración con diferentes vectores PVX. 35S-PVX-CP: vector que proporciona la proteina de recubrimiento (CP) de PVX bajo el control del promotor CaMV 35S; 35S-TVCV MP: vector que proporciona la proteina de movimiento (MP) del virus tobamovirus aclarador de la vena del nabo (TVCV) bajo el control del promotor CaMV 35S. Figura IB.- presentación esquemática de regiones de T-ADN de las construcciones pICH20799 y pICH21333. PVX Pol: polimerasa de ARN dependiente del ARN del virus X de la papa; 35S: promotor CaMV 35S; 25K, 12K, 8K: bloque genético triple; CP: proteina de recubrimiento de PVX. PVX ntr: región no trasladada de PVX; GFP: proteina verde fluorescente de medusa; sgc: promotor subgenómico de un gen de proteina de recubrimiento; RB: frontera derecha de T-ADN; LB: frontera izquierda de T-ADN. Un ATG cruzado significa que un codón ATG fue mutado para evitar el inicio de traslación a la posición indicada.

Figura 2A.- Expresión de GFP usando diferentes módulos del provector PVX. Hojas de N. benthamiana monitoreadas bajo luz UV después de la agro infiltración con diferentes provectores 51 PVX en combinación con el provector 3' pICH21282 y en la presencia de la integrasa C31 del fago que proporciona el ensamble mediado por recombinación especifica del sitio del ADN que codifica el replicón viral. Solamente los provectores 5' (p. ej . , pICH22922; pICH22942, etc.) marcan los puntos de inoculación. 35S-TVCV P: proteina de movimiento (MP) de tobamovirus de virus aclarador de la vena del nabo que proporciona el vector bajo el control del promotor CaMV 35S. Las imágenes se tomaron a los 7 dias post infiltración (7 dpi) . Las suspensiones de agrobacteria usadas para la infiltración se diluyeron 105 veces para lograr un nivel de expresión que permitiera la detección visual de las diferencias en los niveles de expresión.

Figura 2B.- muestra las regiones de T-ADN de los plásmidos pIC22922, pICH22939f pICH22942, pICH22953 y pICH21282. PVX Pol : polimerasa de ARN dependiente del ARN del virus X de la papa; 35S: promotor CaMV 35S; 25K, 12K, 8K: bloque genético triple; 25K (trunco) : gen truncado que codifica para la proteina 25K; CP: proteina de recubrimiento de PVX; Pvx ntr: región no trasladada de PVX; GFP: proteina verde fluorescente de medusa; sgc: promotor subgenómico del gen de proteina de recubrimiento; int: extremo 5' de intrón de planta; AttP y AttB: secuencias reconocidas por la integrasa especifica del sitio del fago C31.

Figura 3A.- Comparación de la expresión GFP usando módulos del provector de PVX que no proporcionan (pICH22922) o que proporcionan (pICH22939 ó pICH22988) el movimiento de célula a célula en el tejido de planta. A -hoja de N. benthamiana monitoreada bajo luz UV después de la agro infiltración con diferentes provectores 5' de PVX en combinación con el provector 3' pICH21282 y en presencia de la integrasa del fago C31 que proporciona el ensamble mediado por recombinación especifica del sitio del ADN que codifica el replicón viral. La imagen se tomó a los 7 días post infiltración (7 dpi) . Las suspensiones de agrobacterxa usadas para la infiltración se diluyeron 103 ó 105 veces como se indicó.

Figura 3B.- Muestra las regiones de T-ADN de los plásmidos pIC22922, pICH22939 y pICH22988 pICH22953 y pICH21282. PVX Pol: polimerasa de ARN dependiente del ARN del virus X de la papa; 35S: promotor CaMV 35S; 25K, 12K, 8K: bloque genético triple; 25K (trunco) : gen truncado que codifica para la proteína 25K; TVCV MP: proteina de movimiento de tobamovirus del virus aclarador de la vena del nabo; CP: proteína de recubrimiento de PVX; Pvx ntr: región no trasladada de PVX; GFP: proteína verde fluorescente de medusa; sgc: promotor subgenómico del gen de proteína de recubrimiento; int : extremo 5' de intrón de planta: AttP y AttB: secuencias reconocidas por la integrasa específica del sitio del fago C31.

Figura 4A.- Comparación de la expresión de GFP usando módulos del provector de PVX que no proporciona (pICH22577) o que proporciona (pICH22988 ó pICH24180) movimiento de célula a célula. hoja de N. benthamiana monitoreada bajo luz UV después de la agro infiltración con diferentes provectores 5' de PVX en combinación con el provector 3' pICH21282 y en presencia de la integrasa del fago C31 que proporciona el ensamble mediado por recombinación específica del sitio del ADN que codifica el replicón viral. Las suspensiones de agrobacteria usadas para la infiltración se diluyeron 103 ó 105 veces como se indicó .

Figura 4B.- Muestra las regiones de T-ADN de los plásmidos pIC22577, pICH22988 y pICH24180. PVX Pol: polimerasa de ARN dependiente del ARN del virus X de la papa; 35S: promotor CaMV 35S; 25K, 12K, 8K: bloque genético triple; CP: proteina de recubrimiento de PVX; PVX ntr: región no trasladada de PVX; sgc: promotor subgenómico del gen de proteina de recubrimiento; sg25: promotor subgenómico del gen 25K; int: extremo 5' de intrón de planta: AttP: secuencia reconocida por la integrasa especifica del sitio del fago C31.

Figura 5A.- Expresión de GFP usando diferentes cassettes de expresión de PVX (módulos de provector y vectores ensamblados) con CP localizada en diferentes posiciones enfrente del gen GFP. Hoja de N. benthamiana monitoreada bajo luz UV después de la agro infiltración con los vectores virales ensamblados pICH25491, pICH25488 ó diferentes provectores 5' de PVX (pICH22988 ó pICH24180) en combinación con el provector 3' pICH21282 en combinación con el provector 3' pICH21282 y en presencia de la integrasa del fago C31 que proporciona el ensamble mediado por recombinación especifica del sitio del ADN que codifica el replicón viral. La imagen se tomó a los 7 dias post infiltración. La suspensión de agrobacteria usada para la infiltración se diluyó 105 veces.

Figura 5B.- Muestra las regiones de T-ADN de los plásmidos pIC22988, pICH25491, pICH25488 y pICH24180. PVX Pol: polimerasa de ARN dependiente del ARN del virus X de la papa; 35S: promotor CaMV 35S; 25K, 12K, 8K: bloque genético triple; CP: proteina de recubrimiento de PVX; Pvx ntr: región no trasladada de PVX; sgc: promotor subgenómico del gen de proteina de recubrimiento; sg25: promotor subgenómico del gen 25K; int : extremo 5' del intrón de planta; AttP: secuencia reconocida por la integrasa especifica del sitio del fago C31.

Figura 6A.- Expresión de GFP usando cassettes de expresión de PVX ensamblados con CP localizada en diferentes posiciones enfrente del gen GFP. Hoja de N. benthamiana monitoreada bajo luz UV después de la agro infiltración con los vectores virales ensamblados pICH25491, pICH25488 y pICH20799, diez días (panel izquierdo) y dieciséis días (panel derecho) post infiltración. Las suspensiones de agrobacteria usadas para la infiltración se diluyeron 105 veces.

Figura 6B.- Muestra las regiones de T-ADN de los plásmidos pIC20799, pICH25491, y pICH25488. PVX Pol: polimerasa de ARN dependiente del ARN del virus X de la papa; 35S: promotor CaMV 35S; 25K, 12K, 8K: bloque genético triple; CP: proteina de recubrimiento de PVX; PVX ntr: región no trasladada de PVX; sgc: promotor subgenómico del gen de proteína de recubrimiento; sg25: promotor subgenómico del gen 25K.

Figura 7. Muestra vectores de clonación de PVX con múltiples sitios de clonación (CS) . PVX Pol: polimerasa de 7ARN dependiente del ARN del virus X de la papa; 35S: promotor CaMV 35S; 25K, 12K, 8K: bloque genético triple; CP: proteína de recubrimiento de PVX; PVX ntr: región no trasladada de PVX; sgc: promotor subgenómico del gen de proteína de recubrimiento; sg25: promotor subgenómico del gen 25K.

Figura 8. Muestra un mapa del pICH25491. La secuencia nucleotida de la región de T-ADN del pICH25491 se da en la SEQ ID NO: 6.

Figura 9. Muestra un mapa del pICH25488. La secuencia nucleotida de la región de T-ADN del pICH25488 se da en la SEQ ID NO: 5.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Esta invención describe un nuevo diseño para los replicones de ARN derivados de potexvirus que mejora la producción de una proteína de interés que va a ser expresada a partir de esos replicones de ARN en una planta o en un tejido de planta. El procedimiento de la invención tiene mejores características de bioseguridad que los replicones de ARN derivados de potexvirus convencionales, ya que produce menos proteína de recubrimiento viral, y en consecuencia puede formar menos partículas virales.

Sorprendentemente, hemos descubierto que la posición de una secuencia de codificación para una proteína de recubrimiento o proteína de movimiento heteróloga que precede a la secuencia de ácido nucleico heterólogo (iii) que codifica una proteína de interés, aumenta la producción de la proteína recombinante a costa de la proteína de recubrimiento viral. La proteína de recubrimiento de PVX es necesaria no solamente para el movimiento sistémico, sino también, junto con otras tres proteínas del bloque genético, para el movimiento (de distancia corta) de célula a célula (Yang et al., 2000, Mol. Plant Microbe Interact, 13:599-605; Fedorkin et al., 2001, J. Gen. Virol., 82:449-458) . Aquí, se muestra (ver el Ejemplo 1 y la Figura 1) que la ausencia de la proteína de recubrimiento de PVX hace a los replicones de ARN derivados de PVX deficientes en el movimiento de distancia larga (Figura 1A, panel izquierdo) y en el movimiento de célula a célula (Figura 1A, panel derecho) . El movimiento de célula a célula puede restablecerse proporcionando la proteina de recubrimiento (CP) de PVX in trans o una proteina de movimiento tobamoviral, p. ej . , la proteina de movimiento (MP) del virus del mosaico del tabaco (Figura 1A, panel derecho) . También se muestra (Ejemplo 2, Figura 2) que el replicón de ARN derivado de PVX con la proteina de movimiento TVCV es capaz de movimiento de corta distancia (de célula a célula) . El experimento se realizó usando el sistema del provector (Marillonnet et al., 2004, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 101:6852-6857) que permite el ensamble in planta de un precursor de ADN de un replicón de ARN via la recombinación especifica del sitio, p. ej . , entre los sitios AttP y AttB de los provectores (Figura 2B) .

Un análisis comparativo de replicones de ARN derivados de PVX, con cualquiera de la MP de TVCV (pICH22939) o la CP de PVX, se describe en el Ejemplo 3 y se muestra en la Figura 3. Como en el caso arriba descrito, se usó el sistema de provector. A partir de la Figura 3 es evidente que la CP de PVX posicionada enfrente del gen de interés proporciona el movimiento de célula a célula del replicón de ARN. Como se desprende del brillo y la densidad de las manchas de GFP (Figura 3A) , la eficiencia del movimiento de célula a célula es significativamente más alta que con la MP de TVCV.

En otra representación de esta invención, se ensayó el efecto de la posición de la CP de PVX que precede al gen de interés. A partir de la Figura 4A es evidente que la ubicación de la CP después del bloque genético triple proporciona un movimiento más eficiente de célula a célula que la ubicación de esa CP entre la polimerasa de ARN dependiente del ARN de PVX y el bloque genético triple. El sistema de provector también fue usado en este experimento. No se encontró diferencia en el nivel de expresión de la proteina de interés (GFP) entre los casos en los que se usaron provectores o vectores ensamblados que proporcionaron los replicones de ARN derivados de PVX (ver Ejemplo 5, Figura 5) . Cuando incluimos en los estudios comparativos a vectores que proporcionaban el replicón de ARN que contenia la CP después del gen de interés, el nivel de expresión (brillo del área de expresión de GFP) del gen de interés de ese vector era, sorprendentemente, significativamente más débil comparado con los vectores en los que la CP se posicionaba antes del gen de interés (pICH20799 versus pICH25488 ó pICH25491, Figura 6, Ejemplo 6) .

En los ejemplos, usamos replicones de ARN basados en PVX. Sin embargo, pueden usarse otros virus pertenecientes al grupo taxonómico de potexvirus, para la construcción de vectores de ARN basados en virus de acuerdo con la presente invención. Las especies virales utilizables para la invención incluyen, pero no se limita a, potexvirus del mosaico del bambú, potexvirus del mosaico de la papaya, potexvirus del mosaico de la alternanthera, virus del mosaico amarillo del trébol, virus X del plátano, virus del mosaico blanco del trébol, y virus del mosaico aucuba de la papa. Para detalles acerca de las proteínas de movimiento viral en plantas, ver la revisión reciente de J Lucas (2006, Virology, 344:169-184).

Un replicón de ARN derivado de un virus de planta puede ser usado en el procedimiento de la invención, p. ej . , a partir del virus X de la papa (PVX) . Sin embargo, pueden usarse dos o más replicones de ARN diferentes en una planta o un tejido de planta, para expresar dos diferentes proteínas de interés, donde esos diferentes replicones de ARN se derivan preferiblemente de diferentes virus de planta. Los diferentes virus de planta de los cuales pueden derivarse los diferentes replicones de ARN son preferiblemente virus sinérgicos o no competidores. "Sinérgico" y "no competidor" se usan aquí como sinónimos. Los virus sinérgicos pueden coexistir y amplificar de manera eficiente en las mismas células de planta. De modo similar, los replicones de ARN derivados de virus sinérgicos de ARN pueden existir y amplificar de manera eficiente en las mismas células de plantas. Un ejemplo de un par de replicones de ARN sinérgicos es un par de replicones de ARN, en el cual un replicón de ARN se deriva de T V o de TVCV y el otro replicón de ARN se deriva de un potexvirus tal como el PVX. Los replicones de ARN sinérgicos pueden ser usados para la expresión de dos o más proteínas o subunidades de proteína de interés, tales como la cadena pesada y la ligera de un anticuerpo monoclonal, en la misma célula de planta. Los procesos de la expresión de dos o más proteínas de interés en la misma planta o en las mismas células de planta, usando diferentes vectores virales (no competidores) , se describe en la Patente EP1686176.

En los ejemplos, usamos de manera predominante la entrega de vectores virales mediada por Agrobacterium en las células de las plantas. Para la entrega de vectores en las células de planta pueden usarse varios otros métodos que se usan normalmente para la transformación estable de plantas, tales como la introducción directa de una secuencia nucleótida heterologa en las células por medio de bombardeo de micro proyectiles, electroporación o transformación de protoplastos mediada por PEG.

Se prefiere la transformación de la planta mediada por Agrobacterium. Por lo tanto, una secuencia nucleótida heterologa puede ser transformada en el interior de células de planta mediante varias tecnologías tales como por el vector plásmido Ti portado por Agrobacterium (Patentes US 5,591,616; US 4,940,838; US 5,464,763), por bombardeo de partícula o micro proyectil (Patentes US 05100792; EP 00444882B1; EP 00434616B1) . En principio, también pueden usarse otros métodos de transformación de plantas, p. ej . , microinyección (Patentes WO 09209696; WO 09400583A1; EP 175966B1), electroporación (Patentes EP00564595B1; EP00290395B1 ; WO 08706614A1), etc. La selección del método de transformación depende, inter alia, de la especie de planta que se va a transformar. Por ejemplo, el bombardeo de micro proyectiles puede ser preferido para la transformación de monocotiledóneas, mientras que para las dicotiledóneas generalmente da mejores resultados la transformación mediada por Agrobacterium.

La presente invención se realiza preferiblemente con plantas superiores multicelulares. Las plantas preferidas para el uso en esta invención incluyen cualquier especie de planta, dando preferencia a las especies agronómica y horticulturalmente importantes. Las plantas de cultivo comunes para uso en la presente invención incluyen las plantas de alfalfa, cebada, frijoles, cañóla, guisantes, algodón, maíz, trébol, loto, lentisco, altramuz, mijo, avena, chícharos, arroz, centeno, trébol de olor, girasol, guisante de olor, frijol de soya, triticala de sorgo, frijoles de camote, frijol terciopelo, arveja, trigo, glicina y nuez. Las especies de plantas preferidas para practicar esta invención incluyen, pero no se restringen a: Representantes de Gramíneas, Compuestas, Solanáceas y Rosáceas. Adicionalmente, las especies preferidas de plantas para usarse en la invención, así como las arriba especificadas, son las plantas de los géneros: Arabidopsis, Agrostis, Allium, Antirrhinum, Apium, Arachis, Asparagus, Atropa, Avena, Bambusa, Brassica, Bromus, Browaalia, Camellia, Cannabis, Capsicum, Cicer, Chenopodium, Chichorium, Citrus, Coffea, Coix, Cucumis, Curcubita, Cynodon, Dactylis, Datura, Daucus, Digitalis, Dioscorea, Elaeis, Eleusine, Festuca, Fragaria, Geranium, Glycine, Helianthus, Heterocallis, Hevea, Hordeum, Hyoscyamus, Ipomoea, Lactuca, Lens, Lilium, Linum, Lolium, Lotus, Lycopersicon, Majorana, alus, angifera, Manihot, Medicago, Nemesia, Nicotiana, Onobrychis, Oryza, Panicum, Pelargonium, Pennisetum, Petunia, Pisum, Phaseolus, Phleum Poa, Prunus, Ranunculus, Raphanus, Ribes, Ricinus, Rubus Saccharum, Salpiglossis, Sécale, Senecio, Setaria, Sinapis Solanum, Sorghum, Stenotaphrum, Theobroma, Trifolium Trigonella, Triticum, Vicia, Vigna, Vitis, Zea, y 1 Olyreae, la Pharoideae, y muchas otras.

En una representación especifica del procedimiento de la invención, los replicones de ARN derivados del PVX se usan con plantas de Nicotiana.

Las proteínas de interés, o fragmentos de las mismas, que pueden expresarse en orientación de sentido o contrasentido, usando la invención, incluyen: enzimas modificadoras de fécula (sintasa de fécula, enzima de fosforilación de fécula, enzima de desrame, enzima de ramificación de fécula, enzima II de ramificación de fécula, sintasa de fécula unida al grano) , sintasa de fosfato de sacarosa, fosforilasa de sacarosa, poligalacturonasa, sucrasa de polifructano, fosforilasa ADP de glucosa, glicosil transferasa de ciclodextrina, fructosil transferasa, sintasa de gicógeno, esterasa de pectina, aprotinina, avidina, levansucrasa bacterial, proteína glgA de E. coli, APK4 y ortólogos, enzima de asimilación/metabolismo de nitrógeno, sintasa de glutamina, osmotina de planta, albúmina 2S, taumatina, recombinasa/integrasa especifica del sitio (FLP, Cre, recombinasa R, Int, integrasa R de SSVI, phiC31 integrase, o un fragmento activo o variante de las mismas), isopentenil transferasa, Sea M5 (calmodulina de frijol de soya) , toxina tipo coleopterano o un fragmento activo de manera insecticida, proteínas de fusión de la enzima de conjugación de ubiquitina (E2), enzimas que metabolizan lípidos, aminoácidos, azúcares, ácidos nucleicos y polisacáridos , dismutasa superóxida, la forma de proenzima inactiva de una proteasa, toxinas de proteína de planta, plantas productoras de fibra con características de alteración, toxina activa de coleopterano de Bacillus thuringiensis (toxina B72, proteína cristal insecticida (ICP) , toxina CryIC, endotoxina delta, toxina polipéptida, protoxina, etc.), toxina AaIT específica de insecto, enzimas degradantes de celulosa, celulasa El de Acidothermus celluloticus, enzimas modificadores de lignina, dehidrogenasa de alcohol cinamoilo, trehalosa-6-fosfato sintasa, enzimas de la vía metabólica de citoquinina, reductasa CoA de HMG, pirofosfatasa inorgánica de E. Coli, proteína de almacenamiento de semilla, sintasa de licopeno de Enwinia herbicola, oxidasa ACC, proteína pTO 36 codificada, fitasa, cetohidrolasa, acetoacetil reductasa CoA, sintasa PHB (polihidroxibutanoato) , proteína portadora de acilo, napina, EA9, sintasa de fitoeno de plantas no superiores, proteina pT0M5 codificada, ETR (receptor de etileno) , fosfato diquinasa de piruvato plástico, proteina de poro transmembrana inducida por nematodo, características que mejoren la función fotosintética o plástida de la célula de planta, estilbeno sintasa, una enzima capaz de hidroxilar los fenoles, catecol dioxigenasa, catecol 2 , 3-dioxigenasa, cloromuconato cicloisomerasa, antranilato sintasa, proteína AGL15 de Brassica, fructosa 1 , 6-bifosfatasa (FBPasa), AMV ARN3, PVY replicasa, PLRV replicase, proteína de recubrimiento de potivirus, proteína de recubrimiento de CMV, proteína de recubrimiento de TMV, replicasa de luteovirus, ARN mensajero de DMV, replicasa geminiviral mutante, C12:0 de Umbellularía californica siendo preferida la tioesterasa ACP de acilo, CIO ó C12:0 de planta, siendo preferida la tioesterasa ACP de acilo, C14:0 siendo preferida la tioesterasa ACP de acilo (luxD) , factor A de sintasa de planta, factor B de sintasa de planta, 6-desaturasa, proteína que tenga una actividad enzimática en la oxidación peroxisomal de los ácidos grasos en células de plantas, oxidasa CoA de acilo, tiolasa CoA de 3-cetoacilo, lipasa, carboxilasa CoA de acilo del maíz, 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintasa (EPSP) , fosfoinotricin acetiltransferasa (BAR, PAT) , proteína CP4, deaminasa ACC, ribozima, proteína que tenga sitio de desdoblamiento transcripcional, fusión de proteina que consiste del dominio de unión de ADN del activados transcripcional Gal4 y un dominio de activación transcripcional, una fusión trasnacional de la proteina oleosina con la proteina de interés capaz de dirigir la proteina de fusión a la fase lipida, gen DHPS que confiere resistencia a la sulfonamida, nitrasa bacterial, 2,4-D monooxigenasa, acetolactato sintasa o acetohidroxiácido sintasa (ALS, AHAS) , poligalacturonasa, nitrilasa bacterial, fusión de la región hidrofóbica de la terminal amino de una proteina madura de translocación de fosfato que reside en la membrana de envoltura interior del plástido con la proteina de interés que va a ser dirigida al interior de esa membrana, etc.

Cualquier proteina humana o animal puede ser expresada usando el sistema de la invención. Los ejemplos de proteínas de interés incluyen, inter alia, las siguientes proteínas (proteínas farmacéuticas) : proteínas de respuesta inmune (anticuerpos monoclonales, anticuerpos de cadena única, receptores de célula T, etc.), antígenos, factores estimulantes de la colonia, relaxinas, hormonas de polipéptido, citocinas y sus receptores, interferones , factores de crecimiento y factores de coagulación, enzima lisosomal enzimáticamente activa, polipéptidos fibrinoliticos, factores de coagulación sanguínea, tripsinógeno, 1-antitripsina (AAT) , así como las proteínas conservadoras de la función, como fusiones, versiones mutantes y derivados sintéticos de las proteínas arriba mencionadas.

El contenido de la Solicitud de Patente Europea No. 06 018 713.5, presentada el 6 de Septiembre de 2006, cuya prioridad se reivindica mediante la presente Solicitud de Patente, se incorpora aquí como referencia en su totalidad .

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Las construcciones de PVX que carecen de CP no se mueven de célula a célula Una construcción de PVX que contiene un gen GFP (pA3151), fue obtenida por el Profesor Yuri Dorokhov (Universidad Estatal de Moscú, Rusia) . Esta construcción se hizo clonando un fragmento de Nhel-Sall que contenía la secuencia de codificación GFP en el pPVX201 (Baulcombe, D., Chapman, S. & Santa Cruz, S., 1995, Plant J., 7:1045-1053) digerido con Nhel y Salí, y luego subclonando a partir del resultado un fragmento Hind3-Sacl (que contenia el inserto viral entero y el gen GFP) en el pBIN19. Luego el inserto viral fue subclonado a partir de pA3151 en el pICBV52 (un pequeño vector binario KanR basado en pBIN19) como un fragmento Sacl-Sphl, dando como resultado el plásmido pICH20799. Esta construcción contiene la construcción PVX clonada bajo el control del promotor 35S (Figura IB) . La secuencia de codificación de GFP se expresa a partir de un promotor subgenómico de CP duplicado (sgc) , y se ubica entre el bloque genético triple (TGB) y la secuencia de codificación de CP. Dado que el fragmento de promotor subgenómico duplicado corriente arriba de GFP también contenia el codón de inicio de la CP, el codón de inicio fue eliminado mediante la mutación de la ATG a la AGG.

Se hizo una construcción de control carente de CP a partir del pICH20799 (Figura IB), eliminando el gen de CP y su promotor subgenómico (usando PCR con uno de los cebos traslapados en los puntos terminales de eliminación) . La construcción resultante, el pICH21333 (Figura IB), fue transformado en Agrobacterium e infiltrado en una hoja de Nicotiana benthamiana . Como se esperaba, los replicones virales fueron incapaces de moverse de célula a célula o sistémicamente . El movimiento de los replicones fue rescatado cuando el pICH21333 se infiltró conjuntamente con las construcciones pICH10745 ó pICH22066, que proporcionan la expresión transitoria de la MP de TVCV o la CP de PVX, respectivamente (Figura 1A) . Las construcciones pICH10745 y pICH22066 contienen la MP de TVCV o las secuencias de codificación de CP de PVX, respectivamente, bajo el control del promotor 35S.

EJEMPLO 2 Un replicón de PVX con el gen de MP de TVCV clonado entre el TGB y el gen de interés , es capaz de moverse de célula a célula Dado que la MP de TVCV es capaz de proporcionar el movimiento de célula a célula a los replicones de PVX que carecen de la CP de PVX, el gen de MP de TVCV fue clonado en la construcción de PVX entre el bloque genético triple de interés (en este caso, el GFP) , bajo el control de un promotor subgenómico de CP duplicado. Por razones prácticas, esta construcción (pICH22939, Figura 2B y SEQ ID N0:1) se hizo como un módulo 5' de provector que contiene el promotor 35S fusionado con las secuencias 5' del vector viral pero que carece de la parte 3' de la construcción incluyendo la secuencia de codificación del gen de interés y el NTR 3' de PVX. Un sitio de recombinación (el sitio AttP del fago C31 de Streptomyces ) y las secuencias de intrón siguen a las secuencias de la construcción viral. Un módulo de provector 3' (pICH21282, Figura 2B) , contiene un sitio de recombinación compatible (sitio de recombinación AttB del fago C31 de Streptomyces ) seguido por las secuencias del intrón, el gen GFP y el NTR de PVX. Las partes 5' y 3' de la construcción son ensambladas in vivo mediante recombinación especifica del sitio en los sitios de recombinación por infiltración conjunta de la agrobacteria que contiene los módulos 5' y 3' y la recombinasa PhiC31 (pICH10881, que contiene la recombinasa PhiC31 bajo el control del promotor ACT2 de Arabidopsis, ver Marillonnet et al., 2005, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 101: 6852-6857). Después de la entrega del T-ADN de los módulos 5' y 3' a las células de planta y de la recombinación en los sitios AttP y AttB, el ADN recombinado es transcrito del promotor 35S. El sitio de recombinación es extirpado del transcrito mediante la unión de las secuencias de intrón flanqueadoras , y el transcrito unido es exportado del núcleo hacia el citoplasma, donde es amplificado como un replicón de ARN viral normal.

La infiltración de una construcción de provector de control (provector 5' de pICH22922 sin secuencias de MP de TVCV) con el provector 3' pICH21282, condujo a la formación de replicones incapaces de movimiento de célula a célula. En contraste, la infiltración del pICH22939 condujo a replicones que eran capaces de moverse de célula a célula (Figura 2A) .

Dado que el TMV es capaz de proporcionar movimiento de célula a célula a los replicones de TMV sin la necesidad de otras proteínas virales, se hizo una segunda construcción de PVX en la cual se eliminaron las proteínas 12K y 8K del bloque genético triple, dando como resultado el pICH22953 (Figura 2B y SEQ ID N0:2). En este caso, la MP de TMV es expresada desde el promotor subgenómico de 12K (sgl2). La infiltración del pICH22953 con el pICH21282 condujo a replicones que eran capaces de moverse de célula a célula. El movimiento de célula a célula y la fluorescencia de la GFP no fueron sin embargo mejores o más fuertes que cuando se usó la construcción pICH22939 (Figura 2) .

EJEMPLO 3 Un vector de PVX con un gen de CP de PVX clonado entre el TGB y el gen de interés, es capaz de moverse de célula a célula.

Se hizo una construcción similar al pICH22939, pero con la CP de PVX reemplazando a la MP de TVCV. La secuencia de esta construcción es la misma que la del virus tipo silvestre del extremo 5' del virus hasta el extremo de la CP. Luego la CP es seguida por el promotor subgenómico de CP duplicado que se usa para la expresión del gen de interés. La infiltración de esta construcción, pICH22988 (Figura 3B) , con el pICH21282 (Figura 2B) condujo a la formación de replicones que se movían de célula a célula mucho más rápido y que producían fluorescencia de GFP más brillante que los replicones producidos a partir de pICH22939 (Figura 3A) .

EJEMPLO 4 Un vector con un gen de CP de PVX clonado entre el RdRP y el T6B es capaz de moverse de célula a célula El gen de CP de PVX fue clonado entre el RdRp y el bloque genético triple, bajo el control de un promotor subgenómico de 25K duplicado (sg25) , resultando en la construcción pICH24180 (Figura 4B, SEQ ID NO: 3). La infiltración del pICH24180 en combinación con el pICH21282 y una fuente de integrasa (pICHl0881) , condujo a la formación de replicones virales que eran capaces de moverse de célula a célula (Figura 4A) . La construcción pICH22577 (similar al pICH22922 pero diferente para unos cuantos sitios de restricción) fue infiltrada en vez de la pICH24180 en el experimento de control y no mostró movimiento de célula a célula, como se esperaba. Como con el pICH22988, la fluorescencia de GFP a partir del pICH24180 fue más fuerte que con la construcción pICH22939.

EJEMPLO 5 Los vectores virales de PVX ensamblados completos que contienen CP también proporcionan movimiento de célula a célula Se hicieron las construcciones ensambladas que incluyen un provector 3' con la parte de GFP (pICH21282, Figura 2B) y correspondientes a los provectores pICH22988 ó pICH24180, produciendo respectivamente los plásmidos pICH25488 y pICH25491 (Figura 5B) . Las secuencias nucleótidas de la región de T-ADN del pICH25488 y el pICH25491 se dan como SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, respectivamente. Se encontró que ambas construcciones trabajan como los provectores, como se esperaba, y proporcionaron movimiento de célula a célula y fluorescencia de GFP más fuerte (Figura 5A) . La fluorescencia de GFP también fue mucho más fuerte que con la construcción estándar (pICH20799) en la cual el gen de CP está ubicado después del gen de interés lo que sugiere la expresión de más proteina recombinante (Figura 6A) . Los geles de proteina manchados con Coomassie mostraron que se expresaba una cantidad mucho mayor de proteina GFP del pICH25491 y el pICH25488 que del pICH20799, y que, en contraste, se produjo una cantidad mucho mayor de CP de PVX del pICH20799 que de las otras dos construcciones.

EJEMPLO 6 Vectores de clonación de PVX Se muestra una representación esquemática de dos tipos de vectores de clonación de PVX con CP entre el RdRP y el TGB, o entre el TGB y el gen de interés. CS : sitios de clonación .

Claims (20)

REIVINDICACIONES

1. Ácido nucleico que comprende o codifica un replicón de ARN que comprende, en este orden, los siguientes segmentos (i) a (iii) : (i) una secuencia de ácido nucleico que codifique una polimerasa de ARN dependiente de ARN de potexvirus o una variante conservadora de la función del mismo; (ii) una secuencia de ácido nucleico que comprende: (a) un bloque genético triple de potexvirus o una variante conservadora de la función del mismo, y (b) una secuencia que codifique una proteina de recubrimiento potexviral o una variante conservadora de la función de la misma; o una secuencia que codifique una proteina de movimiento tobamoviral; y (iii) una secuencia de ácido nucleico heterologo expresable a partir del replicón en una planta o un tejido de planta.

2. Ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado en que la variante conservadora de la función del bloque genético triple de potexvirus codifica tres proteínas como sigue: una primera proteína que comprende un segmento de secuencia de proteína de al menos 200 residuos de aminoácido, teniendo ese segmento de secuencia de proteína una identidad de al menos 40% con un segmento de secuencia de SEQ ID NO: 10; una segunda proteína que comprende un segmento de secuencia de proteína de al menos 100 residuos de aminoácido, teniendo esa secuencia de proteína una identidad de secuencia de al menos 40% con un segmento de secuencia de SEQ ID NO: 12; y una tercera proteína que comprende un segmento de secuencia de proteína de al menos 55 residuos de aminoácido, teniendo ese segmento de secuencia de proteína una identidad de secuencia de al menos 40% con un segmento de secuencia de SEQ ID NO: 14.

3. Ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado en que la variante conservadora de la función del bloque genético triple de potexvirus codifica tres proteínas, una de las cuales tiene una identidad de secuencia de al menos 33% con la SEQ ID NO: 10; una que tiene una identidad de secuencia de al menos 36% con la SEQ ID NO: 12; y una que tiene una identidad de secuencia de al menos 30% con la SEQ ID NO: 14.

4. Ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado en que la variante conservadora de la función del bloque genético triple de potexvirus codifica tres proteínas, una de las cuales tiene una identidad de secuencia de al menos 50% con la SEQ ID NO: 10; una que tiene una identidad de secuencia de al menos 50% con la SEQ ID NO: 12; y una que tiene una identidad de secuencia de al menos 50% con la SEQ ID NO: 14.

5. Ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado en que la variante conservadora de la función de la proteina de recubrimiento potexviral comprende un segmento de secuencia de proteina de al menos 200 residuos de aminoácido, teniendo ese segmento de secuencia una identidad de secuencia de al menos 35% con un segmento de secuencia de la SEQ ID NO: 8.

6. Ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado en que la secuencia del elemento (i) codifica una proteina que tiene una identidad de secuencia de al menos 36% con una proteina codificada por la SEQ ID NO: 4 dentro de un segmento de secuencia de proteina de al menos 300 residuos de aminoácido, preferiblemente de al menos 500 residuos de aminoácido, más preferiblemente de al menos 900 residuos de aminoácido, y lo más preferible, de al menos 1400 residuos de aminoácido.

7. Ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado en que la secuencia del elemento (i) codifica una proteina que tiene una identidad de secuencia de al menos 45% con una proteina codificada por la SEQ ID NO: 4 dentro de un segmento de secuencia de proteina de al menos 300 residuos de aminoácido, preferiblemente de al menos 500 residuos de aminoácido, más preferiblemente de al menos 900 residuos de aminoácido, y lo más preferible, de al menos 1400 residuos de aminoácido.

8. Ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado en que la secuencia del elemento (i) codifica una proteina que tiene una homología de secuencia de al menos 50% con una proteína codificada por la SEQ ID NO: 4 dentro de un segmento de secuencia de proteína de al menos 300 residuos de aminoácido, preferiblemente de al menos 500 residuos de aminoácido, más preferiblemente de al menos 900 residuos de aminoácido, lo más preferible, de al menos 1400 residuos de aminoácido .

9. Ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado en que la secuencia de ácido nucleico del elemento (i) tiene una identidad de secuencia de al menos 55%, preferiblemente de al menos 60%, con la SEQ ID NO: 4 dentro de un segmento de secuencia de al menos 900 nucleótidos, preferiblemente de al menos 1500 nucleótidos, más preferiblemente de al menos 2700 nucleótidos, y lo más preferible, de al menos 4200 nucleótidos .

10. Ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado en que el replicón es un replicón potexviral, preferiblemente un replicón derivado del virus X de la papa, del potexvirus del mosaico del bambú o del potexvirus del mosaico de la papaya.

11. Ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado en que el replicón no tiene un origen de ensamble de partícula viral.

12. Ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado en que este ácido nucleico comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo de: promotor de transcripción activo en células de planta corriente arriba del elemento (i), promotor subgenómico viral, región potexviral 5' ó 3' no trasladada.

13. Ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado en que los elementos (a) y (b) pueden estar en cualquier orden en la secuencia de ácido nucleico del elemento (ii) .

14. Ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado en que, en el elemento (ii), el bloque genético triple de potexvirus o una variante conservadora de la función del mismo se ubica corriente arriba del gen de proteína de recubrimiento potexviral o de una variante conservadora de la función del mismo, o viceversa.

15. Ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado en que la proteína de movimiento tobamoviral es una proteína de movimiento del virus del mosaico del tabaco o del virus aclarador de la vena del nabo o una variante conservadora de la función de esas proteínas de movimiento.

16. Ácido nucleico que comprende una secuencia complementaria del ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.

17. Ácido nucleico que comprende o que codifica un replicón de ARN que comprende, en este orden, los siguientes segmentos (i) a (iii) : (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica una polimerasa de ARN dependiente del ARN de potexvirus o una variante conservadora de la función de la misma; (ii) una secuencia de ácido nucleico que comprende: (a) un bloque genético triple de potexvirus y (b) una secuencia que codifica una proteina de recubrimiento potexviral; o una secuencia que codifica una proteina de movimiento tobamoviral; y (iii) una secuencia de ácido nucleico heterólogo expresable a partir del replicón en una planta o en tejido de planta.

18. Estuche de partes que comprende al menos dos vectores que son capaces de ensamblar en células de planta el ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, mediante recom i ación dirigida al sitio .

19. Estuche de partes de acuerdo con la reivindicación 18, caracterizado en que comprende al menos dos vectores, un primer vector que comprende o codifica los segmentos de los elementos (i) y (ii) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, y un segundo vector que comprende 0 codifica el segmento del elemento (iii) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, donde cada uno del primero y del segundo vectores tiene un sitio de recombinación para permitir el ensamble de un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, mediante recombinación especifica del sitio.

20. Procedimiento para la expresión de una secuencia de interés de ácido nucleico heterólogo en una planta o un tejido de planta, que comprende proporcionar una planta o tejido de planta con el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16. RE S UMEN Ácido nucleico que comprende o codifica una réplica de ARN que comprende, en este orden, los siguientes segmentos (i) a (iii) : (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica una polimerasa de ARN dependiente de ARN de potexvirus o una variante conservadora de la función del mismo; (ii) una secuencia de ácido nucleico que comprende: (a) un bloque genético triple de potexvirus o una variante conservadora de la función del mismo, y (b) una secuencia que codifica una proteina de recubrimiento potexviral o una variante conservadora de la función de la misma; o una secuencia que codifique una proteina de movimiento tobamoviral; y (iii) una secuencia de ácido nucleico heterólogo expresable a partir de esa réplica en una planta o un tejido de planta.