JP2019504892A

JP2019504892A - 癌治療のための改変哺乳類細胞

Info

Publication number: JP2019504892A
Application number: JP2018560705A
Authority: JP
Inventors: ファン，シャオフー; チャン，ファンリャン; ジュアン，チーチュアン; ワン，ピンヤン; ユ，ジエ; ヘ，シアン; ワン，リン; ハオ，ジャーイン; ヤン，レイ
Original assignee: ナンキンレジェンドバイオテックカンパニーリミテッド
Priority date: 2016-02-04
Filing date: 2017-01-26
Publication date: 2019-02-21
Also published as: US20190038671A1; EP3411079A1; WO2017133175A1; EP3411079A4; CN108883202A; WO2017133633A1

Abstract

本発明は、免疫調節剤（免疫チェックポイント阻害剤等）をコードする異種核酸を含んだ改変哺乳類細胞を含む、医薬組成物を提供する。さらに、前記医薬組成物を単独で、または、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）もしくは組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）改変Ｔ細胞免疫療法等の他の技術と組み合わせて、使用することによる癌の治療方法を提供する。本発明は、癌免疫療法に広く適用されている免疫調節剤および他の治療用タンパク質を、制御可能に、局所的に、かつ優れた費用対効果で送達するための細胞ベースのプラットフォームを提供する。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１６年２月４日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１６／０７３４８９号および２０１６年６月３０日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１６／０８７８５５号の優先権の利益を主張するものであり、これらそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるものとする。

本発明は、治療用タンパク質を発現する改変哺乳類細胞を含んだ医薬組成物、および癌免疫療法のためのその使用法に関する。

免疫監視機構の仮説によると、免疫系は腫瘍の増殖を阻害するのに重要な役割を担っている。免疫系は腫瘍関連抗原を認識することによって腫瘍細胞を正常細胞から区別することができる。Ｔ細胞は、癌免疫において重要な役割を担う主要な免疫細胞の一種である。免疫編集（immunoediting）の理論においては、腫瘍細胞の一部は免疫系による監視や排除を「回避」し、免疫原性を低下させ、最終的に臨床的に重要な腫瘍へと成長する。上記「回避」には腫瘍細胞によるいくつかの活動が含まれる可能性があり、共刺激分子発現のダウンレギュレーションや抑制分子発現のアップレギュレーション等が例として挙げられる。腫瘍細胞に対するＴ細胞の応答は、抑制シグナルと共刺激シグナルとの間のバランスによって調節される。

近年、いくつかの癌免疫療戦略が研究されている。ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４等の抑制性免疫チェックポイントを遮断することが、癌免疫療法の魅力的な戦略と考えられるようになってきた。Blakeらは、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１を抗ＰＤ−Ｌ１抗体で遮断することにより、免疫寛容原性の環境において養子Ｔ細胞免疫療法が促進されることを報告した（２０１５）。他の戦略としては癌ワクチンが挙げられ、この戦略においては臨床目的で人体に異種遺伝子が導入される。２０１５年１０月には、手術不能な腫瘍を有する患者におけるメラノーマ治療に対するＴ−ＶＥＣ（ＩＭＬＹＧＩＣ（登録商標））の注射製剤が米国ＦＤＡに認可された。単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）を改変して作製されたＴ−ＶＥＣは、ＧＭ−ＣＳＦサイトカイン遺伝子をコードする腫瘍崩壊性ウイルスであり、癌細胞内で選択的に複製する。Ｔ−ＶＥＣ感染癌細胞はＧＭ−ＣＳＦを分泌する。それがＤＣ細胞を誘引し、次いで細胞傷害性Ｔ細胞を亢進して腫瘍細胞を破壊する。免疫チェックポイント遮断を癌ワクチンと組み合わせることもできる。例えば、単純ヘルペスウイルスと併用で免疫チェックポイント阻害剤を投与することによるメラノーマの治療方法に関する最近のＡｍｇｅｎの特許（特許文献１）を参照のこと。

近年、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）改変Ｔ細胞技術を用いた養子細胞免疫療法が著しい臨床成果を挙げている。２０１５年１２月以降、８０件超の臨床試験がClinicalTrials.govに登録されている。特徴的な研究の１つにおいては、ＣＤ１９に対するＣＡＲ−Ｔ（ＣＴＬ０１９）が白血病の持続的寛解をもたらすのに有効であることが示された。第５７回米国血液学会（ＡＳＨ）年会のＮｏｖａｒｔｉｓの報告によれば、新規ＣＴＬ０１９第２相データでは、ｒ／ｒＡＬＬを有する小児患者において９３％（５９名の患者中５５名の患者）が完全寛解を示した。様々な疾患に対して、様々な種類の腫瘍抗原を標的としたＣＡＲ−Ｔ研究が多数進行中である。例として、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＨＥＲ２、ＩＧＦ１Ｒ、メソテリン（mesothelin）、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、およびＷＴ１が標的となっている。Miaoらによれば、最も致死的な形態の癌の一種、膠芽腫の治療においてＥＧＦＲｖＩＩＩを標的とするＣＡＲ−
Ｔを使用することが報告されている。

現在までに、治療用生物製剤、特にモノクローナル抗体は一般的にチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＨＥＫ２９３、ＮＳ０、およびＳｐ２／０等の細胞によって製造されている。ＣＨＯ細胞株は、ＨＵＭＩＲＡ（登録商標）（アダリムマブ（adalimumab））、ＥＮＢＲＥＬ（登録商標）（エタネルセプト（etanercept））、ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）（リツキシマブ（Rituximab））、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）（ベバシズマブ（bevacizumab））、およびＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（トラスツズマブ（trastuzumab））等の組換えタンパク治療薬全体のうち、約７０％の製造に使用されてきた。イピリムマブ（Ipilimumab）およびラムブロリズマブ（Lambrolizumab）もまた、工業的にＣＨＯ細胞培養物中に精製される。これらの生物製剤は複雑なバイオプロセス手順によって製造された後、精製され、臨床用途の注射または輸液組成物として製剤される。

本明細書で参照される全ての出版物、特許、特許出願、および特許出願公開の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるものとする。

本出願は、免疫調節剤を発現する改変哺乳類細胞を含んだ医薬組成物、および癌治療のためのその使用方法を提供する。

本出願の一側面においては、ａ）免疫調節剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類細胞であって、前記異種核酸がプロモーターに機能的に連結した、改変哺乳類細胞；およびｂ）薬理学的に許容される賦形剤、を含む医薬組成物が提供される。一部の実施形態において、前記異種核酸は前記改変哺乳類細胞のゲノム中に存在する。

上記いずれかの医薬組成物による一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は初代細胞である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞、ＮＫ−９２、およびＪｕｒｋａｔ細胞からなる群より選択される細胞株等の細胞株に由来する。

上記いずれかの医薬組成物による一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはＮＫ細胞等の免疫細胞である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらにキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、前記免疫調節剤をコードする前記異種核酸と、前記ＣＡＲまたは前記ＴＣＲをコードする第２の異種核酸を含んだベクターを含む。一部の実施形態において、前記ＣＡＲまたは前記ＴＣＲをコードする前記第２の異種核酸は、前記プロモーターに機能的に連結している。一部の実施形態において、前記プロモーターは、前記キメラ抗原受容体または前記組換えＴ細胞受容体の細胞内シグナル伝達ドメインによって誘導可能である。一部の実施形態において、前記ＣＡＲまたはＴＣＲは、免疫エフェクター機能が無効化または減弱化した細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、短縮型ＣＡＲである。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、一次細胞内シグナル伝達ドメイン（primary intracellular signaling domain）（ＣＤ３ζ等）を含まない。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、非機能的または減弱化した一次細胞内シグナル伝達ドメイン（変異ＣＤ３ζ等）を含む。

一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、造血幹細胞、間葉系幹細胞、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）等の幹細胞である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらにキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する。一部の実施形態において、前記プロモーターは、前記キメラ抗原受容体または
前記組換えＴ細胞受容体の細胞内シグナル伝達ドメインによって誘導可能である。

上記いずれかの医薬組成物による一部の実施形態において、前記医薬組成物は、さらに第２の細胞を含み、前記第２の細胞はキメラ抗原受容体または組換えＴ細胞受容体を発現する哺乳類免疫細胞である。

上記いずれかの医薬組成物による一部の実施形態において、前記プロモーターは内在性プロモーターである。一部の実施形態において、前記プロモーターは異種プロモーターである。

上記いずれかの医薬組成物による一部の実施形態において、前記プロモーターは誘導条件によって誘導可能なプロモーターである。一部の実施形態において、前記誘導条件は、誘導物質、照射、温度、酸化還元状態、腫瘍環境、および前記改変哺乳類細胞の活性化状態からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記プロモーターは前記改変哺乳類細胞の内在性活性化シグナルによって誘導可能である。一部の実施形態において、前記プロモーターはＴ細胞活性化依存プロモーターである。一部の実施形態において、前記プロモーターは、小分子、ポリペプチド（例えば前記改変哺乳類細胞によって発現されるポリペプチド）等の誘導物質によって誘導可能である。

上記いずれかの医薬組成物による一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、腫瘍抗原を認識するターゲティング分子をその表面上に発現する。

上記いずれかの医薬組成物による一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫チェックポイント阻害剤である。一部の実施形態において、前記免疫チェックポイント阻害剤はＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、ＢＬＴＡ、ＴＩＭ−３、またはＬＡＧ−３の阻害剤である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫賦活剤である。一部の実施形態において、前記免疫賦活剤はＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−１２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ２ｂ、ヘパラナーゼ、ＣＤ１３７Ｌ、ＬＥＭ、およびＢｃｌ−２からなる群より選択される。

上記いずれかの医薬組成物による一部の実施形態において、前記免疫調節剤は分泌タンパク質である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は抗体である。一部の実施形態において、前記抗体は一本鎖抗体である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は単一ドメイン抗体である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は重鎖のみ抗体（heavy chain-only antibody）である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤はＦｃ含有抗体（全長抗体など）である。

上記いずれかの医薬組成物による一部の実施形態において、前記免疫調節剤は重鎖と軽鎖を含む抗体である。一部の実施形態において、前記重鎖をコードする核酸と前記軽鎖をコードする核酸とが、同一のプロモーターに機能的に連結される。一部の実施形態において、前記重鎖をコードする核酸と前記軽鎖をコードする核酸とが、異なるプロモーターに機能的に連結される。一部の実施形態において、前記重鎖をコードする核酸のためのプロモーターと前記軽鎖をコードする核酸のためのプロモーターを同時に誘導することができる。一部の実施形態において、前記重鎖をコードする核酸のためのプロモーターと前記軽鎖をコードする核酸のためのプロモーターを順次誘導することができる。一部の実施形態において、前記重鎖をコードする核酸のためのプロモーターと前記軽鎖をコードする核酸のためのプロモーターが、約１０：１〜約１：１０の強度比を有する。

上記いずれかの医薬組成物による一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、免疫調節剤等の治療用タンパク質、または免疫調節剤ではない治療用タンパク質、
をコードする第２の異種核酸を含む。一部の実施形態において、前記免疫調節剤をコードする異種核酸と前記治療用タンパク質をコードする前記第２の異種核酸が、同一のプロモーターに機能的に連結される。一部の実施形態において、前記免疫調節剤をコードする異種核酸と前記治療用タンパク質をコードする前記第２の異種核酸が、異なるプロモーターに機能的に連結される。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、免疫調節剤と２種以上の治療用タンパク質と発現する。

上記いずれかの医薬組成物による一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、該組成物が治療的に有効であるように十分に高い濃度で免疫調節剤を発現する。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、少なくとも約１ｍｇ／Ｌ、例えば、少なくとも約５ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ、２００ｍｇ／Ｌ、３００ｍｇ／Ｌ、４００ｍｇ／Ｌ、５００ｍｇ／Ｌ、６００ｍｇ／Ｌ、７００ｍｇ／Ｌ、８００ｍｇ／Ｌ、９００ｍｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ、または１０ｇ／Ｌのいずれかの濃度で免疫調節剤を発現する。

本発明の一側面においては、個体（ヒト個体等）における癌の治療法であって、上記医薬組成物いずれかの有効量を該個体に投与することを含む方法が提供される。一部の実施形態において、前記医薬組成物は輸液等により全身投与される。一部の実施形態において、前記医薬組成物は注射等により癌の部位に局所投与される。

上記いずれかの癌の治療法による一部の実施形態において、該方法は、前記免疫調節剤の発現を前記改変哺乳類細胞内で誘導することをさらに含む。

上記いずれかの癌の治療法による一部の実施形態において、前記癌は固形腫瘍である。一部の実施形態において、前記癌は液性腫瘍である。

上記いずれかの癌の治療法による一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は前記個体から得られる。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は前記個体に対し同種異系である。

本出願の一側面においては、上記いずれかの医薬組成物を調製する方法が提供され、該方法は、前記免疫調節剤をコードする前記異種核酸を含んだベクターを哺乳類細胞に導入することを含む。一部の実施形態において、前記ベクターは、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、およびそれらの誘導体からなる群より選択されるウイルスベクター等のウイルスベクターである。一部の実施形態において、前記ベクターはエレクトロポレーションによって前記細胞に導入される。

本出願の一側面においては、ａ）上記いずれかの医薬組成物；およびｂ）該医薬組成物の使用のための説明書、を含むキットが提供される。一部の実施形態において、前記キットは、ｃ）キメラ抗原受容体または組換えＴ細胞受容体を発現する第２の哺乳類免疫細胞を含む組成物をさらに含む。

本発明のこれらおよび他の側面、ならびに長所は、以下の詳細な説明および添付の請求の範囲から明確になるであろう。本明細書に記載される各種実施形態の特性の１つ、一部、または全体を組み合わせることによって、本発明の他の実施形態を形成してもよいことを理解すべきである。

図１は、改変哺乳類細胞における免疫チェックポイント阻害剤の構成的発現と、腫瘍細胞上に発現する抑制性免疫チェックポイント分子の遮断を示す例示的な一実施形態の模式図である。図２は、改変哺乳類細胞における免疫チェックポイント阻害剤の構成的発現と、改変哺乳類細胞上および非改変免疫細胞上に発現する抑制性免疫チェックポイント分子の遮断を示す例示的な一実施形態の模式図である。図３は、改変哺乳類細胞における免疫チェックポイント阻害剤の誘導性発現と、腫瘍細胞上に発現する抑制性免疫チェックポイント分子の遮断を示す例示的な一実施形態の模式図である。図４は、改変哺乳類細胞における免疫チェックポイント阻害剤の誘導性発現と、改変哺乳類細胞上および非改変免疫細胞上に発現する抑制性免疫チェックポイント分子の遮断を示す例示的な一実施形態の模式図である。図５は、改変哺乳類細胞による免疫チェックポイント阻害剤およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の共発現を示す例示的な一実施形態の模式図である。免疫チェックポイント阻害剤の分泌、および腫瘍細胞上に発現する抑制性免疫チェックポイント分子の遮断は、ＣＡＲ分子による腫瘍抗原認識の下流でＣＡＲ細胞内シグナル伝達ドメインの活性化により制御される。図６は、改変哺乳類細胞による免疫チェックポイント阻害剤およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の共発現を示す例示的な一実施形態の模式図である。免疫チェックポイント阻害剤の分泌、ならびに改変哺乳類細胞上および非改変免疫細胞上に発現する抑制性免疫チェックポイント分子の遮断は、ＣＡＲ分子による腫瘍抗原認識の下流でＣＡＲ細胞内シグナル伝達ドメインの活性化により制御される。図７Ａは、改変哺乳類免疫細胞（Ｔ細胞等）による免疫チェックポイント阻害剤および短縮型抗ＥＧＦＲＣＡＲの共発現を示す例示的な一実施形態の模式図である。腫瘍細胞上の過剰発現されたＥＧＦＲに前記ＣＡＲが結合する結果、前記免疫チェックポイント阻害剤の部位特異的発現と分泌が起こる。図７Ｂは、改変哺乳類免疫細胞（Ｔ細胞等）による、免疫チェックポイント阻害剤および短縮型抗ＥＧＦＲＣＡＲ；ならびにＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＣＣＲ類、およびＢｃｌ２等の１つまたは複数の免疫賦活剤の共発現を示す例示的な一実施形態の模式図である。腫瘍細胞上の過剰発現されたＥＧＦＲに前記ＣＡＲが結合する結果、前記免疫チェックポイント阻害剤および前記免疫賦活剤の部位特異的発現と分泌が起こる。図８Ａは、形質導入初代ヒトＴ細胞における、ｈＥＦ１αプロモーターによって駆動される抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ−４抗体の発現を示す。図８Ｂは、形質導入初代ヒトＢ細胞における、ｈＥＦ１αプロモーターによって駆動される抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ−４抗体の発現を示す。図８Ｃは、形質導入初代ヒトＮＫ細胞における、ｈＥＦ１αプロモーターによって駆動される抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ−４抗体の発現を示す。図９Ａは、形質導入初代ヒトＴ細胞における、ＴＥＴＯＮ（登録商標）プロモーターによって駆動される抗ＰＤ−１の発現を示す。図９Ｂは、形質導入初代ヒトＴ細胞における、ＴＥＴＯＮ（登録商標）プロモーターによって駆動される抗ＣＴＬＡ−４抗体の発現を示す。図１０Ａは、形質導入初代ヒトＴ細胞における、ＮＦＡＴプロモーターによって駆動される抗ＰＤ−１の発現を示す。図１０Ｂは、形質導入初代ヒトＴ細胞における、ＮＦＡＴプロモーターによって駆動される抗ＣＴＬＡ−４抗体の発現を示す。図１１は、形質導入初代ヒトＴ細胞における、温度制御プロモーターによって駆動される抗ＰＤ−１の発現を示す。図１２Ａは、レポーター細胞株Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ．Ｌｕｃ−ＰＤ−１におけるＰＤ−１の発現を示す。図１２Ｂは、レポーター細胞株ＣＨＯ／ＰＤ−Ｌ１におけるＰＤ−Ｌ１の発現を示す。図１２Ｃは、レポーター細胞株Ｊｕｒｋａｔ／ＩＬ−２プロモーター．Ｌｕｃ．ＣＴＬＡ−４におけるＣＴＬＡ−４の発現を示す。図１３Ａは、改変レポーター細胞株に対する抗ＰＤ−１抗体の結合親和性を示す。図１３Ｂは、改変レポーター細胞株に対する抗ＣＴＬＡ−４抗体の結合親和性を示す。図１４は、ＣＴＬＡ−４レポーターアッセイにおける抗ＣＴＬＡ−４抗体のｉｎｖｉｔｒｏ活性を示す。図１５Ａは、レポーター細胞株Ｕ８７ＭＧ／ｖＩＩＩ．Ｌｕｃ．ＰＤ−Ｌ１上でのＥＧＦＲｖＩＩＩの発現を示す。図１５Ｂは、レポーター細胞株Ｕ８７ＭＧ／ｖＩＩＩ．Ｌｕｃ．ＰＤ−Ｌ１上でのＰＤ−Ｌ１の発現を示す。図１６Ａは、Ｕ８７ＭＧ／ｖＩＩＩ−ｌｕｃ−ＰＤ−Ｌ１腫瘍細胞に対する、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲおよび／または抗ＰＤ−１抗体を発現する改変Ｔ細胞の細胞毒性を示す。図１６Ｂは、Ｕ８７ＭＧ／ｖＩＩＩ−ｌｕｃ−ＰＤ−Ｌ１腫瘍細胞と共培養された、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲおよび／または抗ＰＤ−１抗体を発現する改変Ｔ細胞による、ＩＦＮ−ガンマの分泌を示す。図１６Ｃは、改変Ｔ細胞単独、またはＵ８７ＭＧ／ｖＩＩＩ−ｌｕｃ−ＰＤ−Ｌ１腫瘍細胞と共培養された同細胞による、抗ＰＤ−１抗体の発現を示す。図１７は、ＲＰＭＩ−８２２６／ｌｕｃ−ＰＤ−Ｌ１腫瘍細胞に対する、抗ＢＣＭＡ−ＣＡＲおよび／または抗ＰＤ−１抗体を発現する改変Ｔ細胞の細胞毒性を示す。図１８は、Ｕ８７ＭＧ／ｖＩＩＩ−ｌｕｃ−ＣＤ８０／ＣＤ８６腫瘍細胞に対する、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲおよび／または抗ＣＴＬＡ−４抗体を発現する改変Ｔ細胞の細胞毒性を示す。図１９Ａは、Ｕ８７ＭＧ／ＥＳＯ１−ｌｕｃ−ＰＤ−Ｌ１腫瘍細胞に対する、各種抗ＮＹ−ＥＳＯ−１−ＴＣＲ（ＬＩＴ−００１〜ＬＩＴ−００６）を発現する改変Ｔ細胞の細胞毒性を示す。図１９Ｂは、Ｕ８７ＭＧ／ＥＳＯ１−ｌｕｃ−ＰＤ−Ｌ１腫瘍細胞に対する、抗ＮＹ−ＥＳＯ−１−ＴＣＲ（ＬＩＴ−００６）および／または抗ＰＤ−１抗体を発現する改変Ｔ細胞の細胞毒性を示す。図１９Ｃは、Ｕ８７ＭＧ／ＥＳＯ１−ｌｕｃ−ＰＤ−Ｌ１腫瘍細胞と共培養された、抗ＮＹ−ＥＳＯ−１−ＴＣＲ（ＬＩＴ−００６）および／または抗ＰＤ−１抗体を発現する改変Ｔ細胞による、ＩＦＮ−ガンマ分泌を示す。図２０は、Ｕ８７ＭＧ／ＥＳＯ１−ｌｕｃ−ＣＤ８０／ＣＤ８６腫瘍細胞に対する、抗ＮＹ−ＥＳＯ−１−ＴＣＲ（ＬＩＴ−００６）および／または抗ＣＴＬＡ−４抗体を発現する改変Ｔ細胞の細胞毒性を示す。図２１Ａは、抗ＨＥＲ２抗体および／または抗ＰＤ−１抗体をコードするベクターを導入した改変Ｔ細胞による抗体発現量を示す。図２１Ｂは、抗ＨＥＲ２抗体および／または抗ＣＴＬＡ−４抗体をコードするベクターを導入した改変Ｔ細胞による抗体発現量を示す。図２２Ａは、ＳＫ−ＢＲ−３／ｌｕｃ細胞に対する、抗ＨＥＲ２抗体および／または抗ＰＤ−１抗体を発現する改変Ｔ細胞の細胞毒性を示す。図２２Ｂは、ＳＫ−ＢＲ−３／ｌｕｃ細胞に対する、抗ＨＥＲ２抗体および／または抗ＣＴＬＡ−４抗体を発現する改変Ｔ細胞の細胞毒性を示す。図２３は、ｍＡｂ４２５ｓｃＦｖを含む抗ＥＧＦＲＣＡＲをコードする、各種構築物を示す。ＧＳＩ０５４〜ＧＳＩ０６０はさらに、抗ＰＤ−１抗体をコードする。ＧＳＩ０５５〜ＧＳＩ０６０はさらに、ＩＬ−７またはＩＬ−２１、ＣＣＲ２ｂまたはＣＣＲ４、および／またはＢｃｌ２等の、１つまたは複数の免疫賦活剤をコードする。図２４は、抗ＥＧＦＲＣＡＲ−Ｔ細胞のｉｎｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイを、Ａ５４９−ｌｕｃ細胞に対する７日間の共培養で行った結果を示す。図２５Ａは、短縮型ＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞毒性アッセイを、Ａ５４９−ｌｕｃ細胞に対する１日間の共培養で行った結果を示す。図２５Ｂは、短縮型ＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞毒性アッセイを、Ａ５４９−ｌｕｃ細胞に対する３日間の共培養で行った結果を示す。図２５Ｃは、短縮型ＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞毒性アッセイを、Ａ５４９−ｌｕｃ細胞に対する５日間の共培養で行った結果を示す。図２５Ｄは、短縮型ＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞毒性アッセイを、Ａ５４９−ｌｕｃ細胞に対する７日間の共培養で行った結果を示す。図２６Ａは、Ａ５４９−ｌｕｃ細胞と共に３日間共培養を行った短縮型ＣＡＲ−Ｔ細胞による抗ＰＤ−１発現を示す。図２６Ｂは、Ａ５４９−ｌｕｃ細胞と共に３日間共培養を行った短縮型ＣＡＲ−Ｔ細胞によるＩＬ−２１発現を示す。図２７Ａは、ＧＳＩ０５９導入Ｔ細胞におけるＣＣＲ４の発現を示す。図２７Ｂは、ＧＳＩ０６０導入Ｔ細胞におけるＣＣＲ４の発現を示す。図２７Ｃは、ＧＳＩ０６０導入Ｔ細胞におけるＢｃｌ２の発現を示す。図２８は、カニクイザルから得られたＧＳＩ０６０導入初代Ｔ細胞の細胞毒性を示す。図２９Ａは、ＣＡＲ−Ｔを注入したカニクイザルの体重を示す。図２９Ｂは、ＣＡＲ−Ｔを注入したカニクイザルの体温を示す。図２９Ｃは、ＣＡＲ−Ｔを注入したカニクイザルＮＨＰ＃２の全血球計算値を示す。図２９Ｄは、ＣＡＲ−Ｔを注入したカニクイザルＮＨＰ＃２の血清化学値を示す。図３０Ａは、Ｕ８７ＭＧ／ｖＩＩＩ−ｌｕｃ−ＰＤ−Ｌ１腫瘍細胞に対する、抗ＰＤ−１ｓｄＡｂを発現するＥＧＦＲｖＩＩＩＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞毒性を示す。図３０Ｂは、Ｕ８７ＭＧ／ｖＩＩＩ−ｌｕｃ−ＣＤ８０／ＣＤ８６腫瘍細胞に対する、抗ＣＴＬＡ−４ｓｄＡｂを発現するＥＧＦＲｖＩＩＩＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞毒性を示す。

本発明は、免疫チェックポイント阻害剤等の免疫調節剤をコードする異種核酸を含んだ改変哺乳類細胞を含む、医薬組成物を提供する。本明細書に記載される医薬組成物は、免疫調節剤を含む従来の医薬組成物とは異なり、制御可能かつ局所的な、費用対効果の高い、腫瘍細胞に対する免疫調節剤の細胞ベースの送達システムを提供することが可能である。本発明の医薬組成物は、改変哺乳類細胞（免疫細胞等）または第２の細胞のいずれかによって発現された、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をさらに含んでいてもよい。このような２成分医薬組成物においては、前記ＣＡＲまたはＴＣＲの活性化と免疫調節剤の分泌との機能の組み合わせが正のフィードバックループで互いを強化し合い、それによって腫瘍細胞に対する改変細胞の細胞毒性を増強し、また同時に、非改変宿主免疫細胞を該腫瘍細胞に対して動員することができる。本明細書に記載される医薬組成物は、それを必要とする個体に、癌（固形腫瘍等）に対する増強された強固な免疫療法を提供することにおいて有用である。

本出願の一側面においては、ａ）免疫調節剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類細胞であって、前記異種核酸がプロモーターに機能的に連結した、改変哺乳類細胞；およびｂ）薬理学的に許容される賦形剤、を含む医薬組成物が提供される。

一部の実施形態において、ａ）免疫調節剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類細胞（免疫細胞または幹細胞等）であって、前記異種核酸がプロモーターに機能的に連結され、前記改変哺乳類細胞がさらにキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する、改変哺乳類細胞；およびｂ）薬理学的に許容される賦形剤、を含む医薬組成物が提供される。

一部の実施形態において、ａ）免疫調節剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類細胞であって、前記異種核酸がプロモーターに機能的に連結した、改変哺乳類細胞；ｂ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する第２の哺乳類免疫細胞；およびｃ）薬理学的に許容される賦形剤、を含む医薬組成物が提供される。

本出願の他の一側面においては、ａ）免疫調節剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類細胞であって、前記異種核酸がプロモーターに機能的に連結した、改変哺乳類細胞；およびｂ）薬理学的に許容される賦形剤、を含む医薬組成物の有効量を個体に投与することを含む、個体における癌の治療法が提供される。

一部の実施形態において、ａ）免疫調節剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類細胞（免疫細胞または幹細胞等）であって、前記異種核酸がプロモーターに機能的に連結され、前記改変哺乳類細胞がさらにキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する、改変哺乳類細胞；およびｂ）薬理学的に許容される賦形剤、を含む医薬組成物の有効量を個体に投与することを含む、個体における癌の治療法が提供される。

一部の実施形態において、ａ）免疫調節剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類細胞であって、前記異種核酸がプロモーターに機能的に連結した、改変哺乳類細胞；ｂ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する第２の哺乳類免疫細胞；およびｃ）薬理学的に許容される賦形剤、を含む医薬組成物の有効量を個体に投与することを含む、個体における癌の治療法が提供される。

一部の実施形態において、ａ）免疫調節剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類細胞であって、前記異種核酸がプロモーターに機能的に連結した、改変哺乳類細胞、を含む医薬組成物の有効量を個体に投与すること；およびｂ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する第２の哺乳類免疫細胞、を含む医薬組成物の有効量を前記個体に投与すること、を含む個体における癌の治療法が提供される。

さらには、本明細書に記載される方法に対して有用なキットおよび製品が提供される。

Ｉ．定義
本明細書で使用される「治療」という語は、臨床病理学の過程で、治療対象の個体または細胞の自然経過を改変するように設計された臨床的介入のことを指す。治療の望ましい効果としては、疾患の進行速度の低下、病状の改善または緩和、および寛解または予後の改善等が含まれる。例えば、癌と関連した１つまたは複数の症状が軽減または解消された場合に個体の癌に対する「治療」が成功したこととなり、その例は、癌性細胞の増殖の低下（または該細胞の破壊）、前記疾患に由来する症状の減少、前記疾患に苦しむ患者の生活の質の改善、前記疾患の治療に必要な他の薬物の投与量の減少、および／または個体の生存期間の延長等を含むが、これらに限定されない。

本明細書で使用される「疾患の進行の遅延」という語は、疾患（癌等）の発症を延期させ、妨害し、減速させ、安定化し、および／または遅れて起こるようにすることを意味す
る。この遅延は、前記疾患の過程および／または治療を受ける個体によってその期間の長さが異なりうる。当業者にとっては明らかなことであるが、十分な、または有意な遅延は、事実上、個体において前記疾患が発症しない予防をも包含しうる。例えば、転移の発生を含む末期癌の遅延であってもよい。

「有効量」は、特定の疾患の測定可能な改善をもたらすのに必要な、少なくとも最小限の量である。本明細書における有効量は、患者の病状、年齢、性別、および体重や、該個体において所望の反応を引き起こすための抗体の能力等の要素によって異なりうる。有効量は、治療的に有利な効果が、治療の任意の有毒または有害な効果を上回る量であってもよい。治療用途において有益な、または所望の結果としては、疾患に由来する１つまたは複数の症状の減少、疾患に苦しむ患者の生活の質の改善、疾患の治療に必要な他の薬物の投与量の減少、ターゲティング等による他の薬物の効果の増強、疾患の進行の遅延、および／または生存期間の延長等の臨床結果が挙げられる。癌または腫瘍の場合、薬剤の有効量は、癌細胞数の減少、腫瘍サイズの減少、癌細胞の周囲器官への浸潤の阻害（すなわち、ある程度までの減速、または望ましくは停止）、腫瘍転移の阻害（すなわち、ある程度までの減速、または望ましくは停止）、腫瘍増殖のある程度までの阻害、および／または疾患と関連した１つまたは複数の症状のある程度までの軽減において効果を有するものであってよい。

本明細書で使用される「併用」という語は、ある治療法を他の治療法に加えて適用することを指す。従って、「併用」とは、個体に対して、ある治療法を、他の治療法の適用前、適用中、または適用後に適用することを指す。

治療の目的における「対象」または「個体」とは、ヒト、家畜、および、動物園、スポーツ、またはペット用途の動物などを含む、哺乳類に分類される任意の動物のことを指し、イヌ、ウマ、ネコ、およびウシ等が例として挙げられる。

本明細書で使用される「抗体」という語は最も広い意味で用いられ、具体的には、それが所望の生物活性を示す限り、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、多重特異性抗体（二重特異性抗体等）、および抗体断片を包含する。

本明細書で使用される「天然抗体」、「全長抗体」、「インタクト抗体」、および「全抗体（whole antibody）」という語は互換的に使用され、実質的にインタクトな形態の抗体のことを表し、以下に定義されるような抗体断片のことは表さない。これらの語は特に、Ｆｃ領域を含む重鎖を有する抗体のことを指す。天然抗体は通常、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、２個の同一な軽（Ｌ）鎖と２個の同一な重（Ｈ）鎖とからなる。各軽鎖は１個の共有ジスルフィド結合によって１個の重鎖と連結するが、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間ではジスルフィド結合の数が異なる。各重鎖と軽鎖は、規則的に間隔を空けた鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は一方の末端に１個の可変領域（Ｖ_Ｈ）を有し、それに続いて、いくつかの定常領域を有する。各軽鎖は一方の末端に１個の可変領域（Ｖ_Ｌ）を有し、もう一方の末端に１個の定常領域を有する。軽鎖の定常領域は重鎖の第１定常領域と並び、軽鎖の可変領域は重鎖の可変領域と並ぶ。特定のアミノ酸残基が軽鎖と重鎖の可変領域間の接点を形成すると信じられている。

「定常領域」という語は、抗原結合部位を含む免疫グロブリンの他の部分、すなわち可変領域と比べて、より保存的なアミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子の部分のことを指す。定常領域には、重鎖のＣ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３ドメイン（ＣＨと総称）ならびに軽鎖のＣＨＬ（またはＣＬ）ドメインが含まれる。

抗体の「可変ドメイン」または「可変領域」とは、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端領域のことを指す。重鎖の可変領域は「ＶＨ」と呼ばれることがある。軽鎖の可変領域は「ＶＬ」と呼ばれることがある。これらの領域は一般には抗体の最も可変性の部分であり、抗原結合部位を含む。

「可変性」という語は、可変領域の一部の配列が抗体間で大きく相違し、特定の抗原に対する個々の抗体の結合および特異性においてそれが用いられるという事実のことを指す。しかし、この可変性は抗体の可変領域内に均一に分布しているわけではない。それは、軽鎖と重鎖両者の可変領域内で、超可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる３個のセグメント内に集中している。可変領域のより保存的な部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖および軽鎖の可変領域は、それぞれ４個の、主としてβシート形状をとるＦＲ領域を含み、ＦＲ領域同士は３個のＨＶＲによって接続され、ＨＶＲは前記βシート構造を接続するループを形成し、または場合によって前記βシート構造の一部を形成する。各鎖のＨＶＲはＦＲ領域によって互いに近接して支持され、他方の鎖のＨＶＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)を参照のこと）。定常領域は抗原に対する抗体の結合には直接的には関与しないが、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）への抗体の関与など、各種免疫エフェクター機能を示す。

いずれの哺乳類の種に由来する抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」も、その定常領域のアミノ酸配列に基づき、カッパ（「κ」）およびラムダ（「λ」）と呼ばれる明確に異なる２つのタイプのどちらかに分類することができる。

本明細書で使用されるＩｇＧ「アイソタイプ」または「サブクラス」という語は、定常領域の化学的および抗原的特徴によって定義される免疫グロブリンのサブクラスのいずれかを意味する。

重鎖の定常領域のアミノ酸配列によって、抗体（免疫グロブリン）は異なるクラスに分けられる。免疫グロブリンには、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭという５つの主要なクラスが存在し、これらのうちいくつかは、さらに、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２等のサブクラス（アイソタイプ）に分けることができる。前記の異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常領域は、それぞれα、γ、ε、γ、およびμと呼ばれる。免疫グロブリンの各種クラスのサブユニット構造および三次元構造は周知であり、例えば、Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (W.B. Saunders, Co., 2000)等に一般的に記載されている。抗体は、該抗体が１つまたは複数の他のタンパク質またはペプチドと共有的または非共有的に結合することによって形成された、より大きな融合分子の一部でありうる。

本明細書で使用される「全長抗体」、「インタクト抗体」、および「全抗体」という語は互換的に使用され、実質的にインタクトな形態の抗体のことを表し、以下に定義されるような抗体断片のことは表さない。これらの語は特に、Ｆｃ領域を含む重鎖を有する抗体のことを指す。

「抗体断片」はインタクト抗体の一部を含み、好ましくはその抗原結合領域を含む。一部の実施形態において、本明細書で記載される抗体断片は抗原結合断片である。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、およびＦｖ断片、ダイアボディ（diabody）、直鎖抗体、一本鎖抗体分子、および抗体断片から形成された多重特異性抗体などを含む。

抗体のパパイン消化により、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる、それぞれが単一の抗原結合部
位を有する、２個の同一の抗原結合断片と、残りの部分である、その名前が容易に結晶化する能力を反映した、「Ｆｃ」断片とが生成する。ペプシン処理により、２個の抗原結合部位を有し、抗原を架橋することが依然可能な、Ｆ（ａｂ’）_２断片が生成する。

「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を含んだ最小の抗体断片である。一実施形態において、二本鎖Ｆｖ種は、互いに密に非共有的に結合した１個の重鎖可変領域と１個の軽鎖可変領域との二量体からなる。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種においては、１個の重鎖可変領域と１個の軽鎖可変領域とをフレキシブルなペプチドリンカーによって共有結合的に連結し、二本鎖Ｆｖ種と類似した「二量体」構造をとるように軽鎖と重鎖を結合することができる。この構成では、各可変領域の３個のＨＶＲが相互作用し、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上に抗原結合部位を規定する。まとめると、これら６個のＨＶＲ全体により、抗体に抗原結合特異性が付与される。しかし、該結合部位全体と比べて親和性が低いのだけれども、単一の可変領域（すなわち、抗原に対して特異的な３個のＨＶＲしか含まない、Ｆｖの半分）でさえも抗原を認識して結合する能力を有する。

Ｆａｂ断片は、重鎖および軽鎖可変領域に加え、軽鎖の定常領域と、重鎖の第１定常領域（ＣＨ１）とを含む。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つまたは複数のシステインを含む、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端の少数の残基がさらに加わる点で、Ｆａｂ断片と異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書において、定常領域のシステイン残基が遊離チオール基を持つＦａｂ’のことを指す。Ｆ（ａｂ’）_２抗体断片はもともと、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片のペアとして生成したものである。抗体断片の他の化学的結合も知られている。

「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは一本のポリペプチド鎖の中に存在する。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドは、さらにＶＨおよびＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを含み、該リンカーはｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする。ｓｃＦｖの総説として、例えば、Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies. Springer Berlin Heidelberg, 1994. 269-315を参照のこと。

「ダイアボディ」という語は、２個の抗原結合部位を有する抗体断片であって、該断片が、同一ポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）内に、軽鎖可変領域（ＶＬ）と、それに結合した重鎖可変領域（ＶＨ）とを含むものを表す。同一鎖上の２個の該ドメイン間でペアを形成させない短さのリンカーを使用することにより、該ドメインは他の鎖の相補ドメインとペアを形成することを強いられ、２個の抗原結合部位が生成される。ダイアボディは二価または二重特異性でありうる。ダイアボディのより完全な記載としては、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ１９９３／０１１６１；Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)；およびHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)がある。トリアボディ（triabody）およびテトラボディ（tetrabody）についても、Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)に記載されている。

「重鎖のみ抗体」または「ＨＣＡｂ」という語は、重鎖を含むが、抗体に通常見られる軽鎖を欠く、機能的抗体のことを指す。ラクダ科の動物（ラクダ、ラマ、およびアルパカ等）はＨＣＡｂを産することが知られる。

「単一ドメイン抗体」または「ｓｄＡｂ」という語は、単一の単量体可変抗体領域からなる抗体断片のことを指す。一部の例では、単一ドメイン抗体は、ラクダ科ＨＣＡｂから改変されたものであり、このようなｓｄＡｂを本明細書において「ナノボディー」または「Ｖ_ＨＨｓ」と呼ぶ。ラクダ科ｓｄＡｂは、公知の抗原結合抗体断片の中で、最も小さなものの１つである（例えば、Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-8 (1993)；Gree
nberg et al., Nature 374:168-73 (1995)；Hassanzadeh-Ghassabeh et al., Nanomedicine (Lond), 8:1013-26 (2013）を参照のこと）。

本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という語は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体のことを指す。例えば、該集団を構成する個々の抗体は、わずかな量で存在しうる突然変異、例えば自然発生の突然変異、を除いては同一である。従って、「モノクローナル」という修飾語句は、異なった抗体の混合物ではない抗体としての特徴のことを示す。ある実施形態において、このようなモノクローナル抗体は、典型的には、標的に結合するポリペプチド配列を含んだ抗体を含み、該標的結合ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列から単一の標的結合ポリペプチド配列を選択することを含むプロセスによって得られたものである。例えば、この選択プロセスは、ハイブリドーマクローン、ファージクローン、または組換えＤＮＡクローンのプール等の複数のクローンから、ある特定のクローンを選択することでありうる。選択された標的結合配列をさらに改変することによって、例えば、標的に対する親和性を改善し、標的結合配列をヒト化し、細胞培養におけるその産生を改善し、ｉｎｖｉｖｏでのその免疫原性を減じ、または多重特異性抗体を生成できるということ、また、該改変標的結合配列を含んだ抗体も本発明のモノクローナル抗体であるということ、を理解すべきである。異なる決定基（エピトープ）を標的とする異なる抗体を典型的に含んだポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を標的とする。モノクローナル抗体調製物は、その特異性に加え、典型的には他の免疫グロブリンの混入が無いという点において有利である。

「モノクローナル」という修飾語句は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体としての特徴のことを示し、なんらかの特定の方法によって抗体を製造することを必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法（例えば、Kohler and Milstein, Nature 256:495-97 (1975)；Hongo
et al., Hybridoma 14 (3): 253-260 (1995)；Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)；Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)）、組換えＤＮＡ法（例えば米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）、ファージディスプレイ技術（例えば、Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991)；Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992)；Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)；Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)；Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)；およびLee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004)を参照のこと）、ならびに、ヒト免疫グロブリン遺伝子座またはヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部または全体を有する動物において、ヒトまたはヒト様抗体を製造するための技術（例えば、ＷＯ１９９８／２４８９３；ＷＯ１９９６／３４０９６；ＷＯ１９９６／３３７３５；ＷＯ１９９１／１０７４１；Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993)；Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993)；Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993)；米国特許第５，５４５，８０７号、第５，５４５，８０６号、第５，５６９，８２５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、および第５，６６１，０１６号；Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992)；Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994)；Morrison, Nature 368: 812-813 (1994)；Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996)；ならびにLonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)を参照のこと）等を含む各種技術によって作製されたものであってよい。

所望の生物活性を示す限りにおいて、本明細書のモノクローナル抗体には、具体的には、「キメラ」抗体およびその断片が含まれ、該「キメラ」抗体においては、重鎖および／
または軽鎖の一部が、特定の種に由来する抗体中の、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同であり、一方、鎖の残りの部分は、他の種に由来する抗体中の、または他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の、対応する配列と同一または相同である（例えば米国特許第４，８１６，５６７号；およびMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)を参照のこと）。キメラ抗体としては、ＰＲＩＭＡＴＴＺＥＤ（登録商標）抗体などが挙げられ、該抗体においては抗原結合領域が、例えば、目的の抗原でマカクザルを免疫すること等によって産生された抗体に由来する。

「ヒト化」型の非ヒト（例えばマウス）抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含んだキメラ抗体である。一実施形態においては、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）中の該レシピエントのＨＶＲ由来の残基が、マウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類等のヒト以外の種（ドナー抗体）の、所望の特異性、親和性、および／または能力を有するＨＶＲに由来する残基によって置換されたものである。一部の例では、ヒト免疫グロブリンのＦＲ残基が、対応する非ヒト残基によって置換される。さらには、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体中に見出されない残基を含んでいてもよい。これらの改変を、抗体性能をさらに高めるために行ってもよい。一般に、ヒト化抗体は、超可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのそれらに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のそれらとなっている、少なくとも１個、典型的には２個の可変領域を実質的に全て有することとなる。該ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も含むことになってもよく、それは典型的にはヒト免疫グロブリンのものである。より詳細には、例えば、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)；およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照のこと。また、例えば、Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998)；Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)；Hurle and Gross, Curr.
Op. Biotech. 5:428-433 (1994)；ならびに米国特許第６，９８２，３２１号および第７，０８７，４０９号を参照のこと。

「ヒト抗体」はヒトによって生成された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するもの、および／または本明細書に開示されるヒト抗体の作製のためのいずれかの技術を用いて作製されたものである。ヒト抗体のこの定義によれば、具体的には、非ヒト抗原結合残基を有するヒト化抗体は除外される。ヒト抗体は公知の各種技術を用いて製造することができ、それら技術の例はファージディスプレイライブラリーを含む。Hoogenboom
and Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991)；Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581 (1991)、Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, 77 (1985)；Boerner et al., J. Immunol. 147(1):86-95 (1991)に記載の方法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である。van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001)も参照のこと。ヒト抗体の作製は、前記抗原を、抗原チャレンジに応答してこのような抗体を産生するが、内在性遺伝子座は機能しないように改変したトランスジェニック動物に投与することによって行うことができ、該トランスジェニック動物の例は免疫化ゼノマウス（xenomouse）（例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）技術に関して米国特許第６，０７５，１８１号および第６，１５０，５８４号を参照のこと）を含む。また、例えば、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術によって生成されたヒト抗体に関してLi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:3557-3562 (2006)を参照のこと。

本明細書で使用される「結合する」「〜に特異的に結合する」、または「〜に対して特異的な」という語は、標的と抗体の間の結合などの、測定可能かつ再現可能な相互作用のことを表し、これによって生体分子等の分子の不均質集団の存在下で標的の存在が判定される。例えば、ある標的（例えばエピトープ）に結合または特異的に結合する抗体は、他
の標的に対して結合する場合と比べ、この標的に対して、より高い親和性と結合活性で、より容易に、および／またはより長い持続時間で、結合する抗体である。一実施形態においては、抗体の無関係な標的への結合の程度は、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）による測定において、該抗体の標的への結合の約１０％未満である。ある実施形態においては、標的に特異的に結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、または≦０．１ｎＭの解離定数（Ｋｄ）を有する。ある実施形態においては、抗体は、異なる種に由来するタンパク質間で保存されている該タンパク質上のエピトープに特異的に結合する。他の一実施形態において、特異的な結合は排他的な結合を含みうるが、必ずしもそれが必要というわけではない。

本明細書で使用される「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」とは、Ｔ細胞等の細胞上に１つまたは複数の抗原特異性を付与する、遺伝子操作された受容体のことを指す。ＣＡＲは「人工Ｔ細胞受容体」、「キメラＴ細胞受容体」、または「キメラ免疫受容体」としても知られる。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、腫瘍抗原に対して特異的な抗体の細胞外可変領域と、Ｔ細胞または他の受容体の細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインとを含む。「ＣＡＲ−Ｔ」とは、ＣＡＲを発現するＴ細胞のことを指す。

本明細書で使用される「Ｔ細胞受容体」または「ＴＣＲ」とは、ＭＨＣ分子に結合した特異的抗原ペプチドに対して結合する細胞外抗原結合ドメインを含んだ、内在性または組換えＴ細胞受容体のことを指す。一部の実施形態において、前記ＴＣＲは、ＴＣＲαポリペプチド鎖とＴＣＲβポリペプチド鎖とを含む。一部の実施形態において、前記ＴＣＲは、腫瘍抗原に特異的に結合する。「ＴＣＲ−Ｔ」とは、組換えＴＣＲを発現するＴ細胞のことを指す。

「組換え」という語は、（１）天然の環境から取り出された、（２）天然に遺伝子が見出されるポリヌクレオチドの全体または一部と関連したものではない、（３）天然には連結していないポリヌクレオチドと機能的に連結した、または（４）天然には産しない、遺伝子またはタンパク質等の生体分子のことを指す。「組換え」という語は、クローン化されたＤＮＡ単離物、化学合成されたポリヌクレオチド類似体、もしくは異種系によって生物学的に合成されたポリヌクレオチド類似体、またはこのような核酸によってコードされたタンパク質および／またはｍＲＮＡのことを指して用いることができる。

「発現する」という語は、核酸をタンパク質に翻訳することを指す。タンパク質は発現後細胞内に留まる場合もあり、細胞表面膜の成分になる場合もあり、細胞外マトリクスまたは培地中へ分泌される場合もある。

「宿主細胞」という語は、発現ベクターの複製または発現を補助しうる細胞のことを指す。宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）等の原核細胞であってもよく、または酵母、昆虫細胞、両生類細胞、もしくは哺乳類細胞等の真核細胞であってもよい。

本明細書で使用される「トランスフェクトされた」、「形質転換された」、または「形質導入された」という語は、外来の核酸が宿主細胞中に移入または導入されるプロセスのことを指す。「トランスフェクトされた」、「形質転換された」、または「形質導入された」細胞は、外来の核酸でトランスフェクトされた、形質転換された、または形質導入された細胞である。

「ｉｎｖｉｖｏ」という語は、細胞を入手した生物の体内のことを指す。「ｅｘｖｉｖｏ」または「ｉｎｖｉｔｒｏ」という語は、細胞を入手した生物の体外のことを指す。

「細胞」という語は、初代対象細胞およびその子孫を含む。

本明細書で使用される「免疫調節剤」という語は、免疫系に対する効果（例えば阻害または刺激効果）を有する、任意のタンパク質またはペプチドに基づいた薬剤のことを指す。

本明細書で使用される「免疫チェックポイント阻害剤」という語は、Ｔ細胞の活性化および機能を制御することができる１つまたは複数のチェックポイントタンパク質を完全にまたは部分的に減少し、阻害し、または妨げる分子のことを指す。

本明細書で使用される「免疫賦活剤」という語は、免疫応答を刺激し、活性化させ、またはその強度を高める分子のことを指す。

本明細書で使用される「治療用タンパク質」という語は、治療効果を有する、任意のタンパク質またはペプチドに基づいた薬剤のことを指す。

本明細書で記載される発明の実施形態には、「〜からなる」および／または「〜から本質的になる」実施形態が含まれると理解される。

本明細書で値またはパラメーターに関して「約」といった場合、それは、その値またはパラメーター自体に対する変動をも含む（そしてそれを記述する）ものである。例えば、「約Ｘ」と記述された場合、そこには「Ｘ」という記述が包含される。

本明細書で値またはパラメーターに関して「〜ではない」といった場合、それは通常、値またはパラメーターに関して「〜以外」ということを意味し、それを記述するものである。例えば、方法がＸ型の癌の治療に使用されないといった場合、この方法はＸ以外の型の癌の治療に使用されることを意味する。

本明細書で使用される「約Ｘ〜Ｙ」という語は、「約Ｘ〜約Ｙ」と同じ意味を有する。

本明細書および添付の請求の範囲で使用される「ある（a）」、「または（or）」、または「その（the）」という単数形は、文脈からそうではないことが明らかな場合を除き、複数の対象も包含する。

ＩＩ．医薬組成物
本発明の一側面により、ａ）免疫調節剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類細胞であって、前記異種核酸がプロモーターに機能的に連結した、改変哺乳類細胞；およびｂ）薬理学的に許容される賦形剤、を含む医薬組成物が提供される。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は免疫細胞である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は幹細胞である。一部の実施形態において、前記プロモーターは誘導性である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫チェックポイント阻害剤である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫賦活剤である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は分泌タンパク質である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は抗体である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、腫瘍抗原を認識するターゲティング分子をその表面上に発現する。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、治療用タンパク質（例えば第２の免疫調節剤、または免疫調節剤ではない治療用タンパク質）をコードする第２の異種核酸を含む。

本発明の医薬組成物は、免疫調節剤を製造するための細胞を含む組成物とは多くの面で
異なる。例えば、本発明の改変哺乳類細胞が発現する免疫調節剤は、該改変哺乳類細胞を、それを必要とする個体に直接投与することによってその個体に送達することができ、その際に該免疫調節剤を該改変哺乳類細胞から単離または精製する必要がない。一部の実施形態において、前記医薬組成物はヒト個体等の個体に投与するのに適したものである。一部の実施形態において、前記医薬組成物は注射に適したものである。一部の実施形態において、前記医薬組成物は輸液に適したものである。一部の実施形態において、前記医薬組成物は細胞培養培地を実質的に含まない。一部の実施形態において、前記医薬組成物はエンドトキシンまたはアレルゲンタンパク質を実質的に含まない。一部の実施形態において、「実質的に含まない」とは、医薬組成物の総容量または重量に対し、約１０％、５％、１％、０．１％、０．０１％、０．００１％、１ｐｐｍ、またはそれ未満、のいずれかよりも少ないことを意味する。一部の実施形態において、前記医薬組成物はマイコプラズマ、微生物因子、および／または感染症因子を含まない。

改変哺乳類細胞
本出願人の医薬組成物は、前記改変哺乳類細胞を任意の数含んでいてよい。一部の実施形態において、前記医薬組成物は、１コピーの前記改変哺乳類細胞を含む。一部の実施形態において、前記医薬組成物は、前記改変哺乳類細胞を、少なくとも約１、１０、１００、１０００、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、またはそれよりも多い、いずれかのコピー数で含む。一部の実施形態において、前記医薬組成物は、１種類の改変哺乳類細胞を含む。一部の実施形態において、前記医薬組成物は少なくとも２種類の改変哺乳類細胞を含み、これらの異なる種類の改変哺乳類細胞では、細胞源、細胞型、発現する治療用タンパク質、免疫調節剤、および／またはプロモーター等が異なる。

前記改変哺乳類細胞は各種細胞型および細胞源に由来するものでありうる。マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、サル、およびヒト等を含むが、限定されない任意の哺乳類の種に由来する細胞が本明細書中で想定される。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞はヒト細胞である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞はレシピエント個体に対して同種異系（allogenic）である（すなわち、同一種であるが異なるドナーに由来する）。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は自己由来（autologous）である（すなわち、ドナーとレシピエントが同一である）。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は同系（syngeneic）である（すなわち、ドナーとレシピエントは異なる個体であるが一卵生双生児である）。

一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は初代細胞に由来する。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は個体から単離された初代細胞である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は個体から単離された初代細胞から増えた（例えば増殖および／または分化した）ものである。一部の実施形態において、前記初代細胞は上皮、筋肉、神経、または結合組織から得られたものである。一部の実施形態において、前記初代細胞は造血系である。一部の実施形態において、前記初代細胞は胸腺から得られたものである。一部の実施形態において、前記初代細胞はリンパまたはリンパ節（例えば腫瘍を排出するリンパ節）から得られたものである。一部の実施形態において、前記初代細胞は脾臓から得られたものである。一部の実施形態において、前記初代細胞は骨髄から得られたものである。一部の実施形態において、前記初代細胞は末梢血等の血液から得られたものである。一部の実施形態において、前記初代細胞は末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。一部の実施形態において、前記初代細胞は血漿から得られたものである。一部の実施形態において、前記初代細胞は腫瘍から得られたものである。一部の実施形態において、前記初代細胞は粘膜免疫系から得られたものである。一部の実施形態において、前記初代細胞は皮膚から得られたものである。一部の実施形態において、前記初代細胞は生検試料から得られたものである。

一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は細胞株に由来する。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は市販の細胞株から得られたものである。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は個体から単離された初代細胞から樹立された細胞株である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は細胞株から増えた（例えば増殖および／または分化した）ものである。一部の実施形態において、前記細胞株は死を免れないもの（mortal）である。一部の実施形態において、前記細胞株は不死化されたものである。一部の実施形態において、前記細胞株は白血病またはリンパ腫細胞株等の腫瘍細胞株である。一部の実施形態において、前記細胞株はＰＢＭＣに由来する細胞株である。一部の実施形態において、前記細胞株は幹細胞株である。一部の実施形態において、前記細胞株は、ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞、ＮＫ−９２細胞、およびＪｕｒｋａｔ細胞からなる群より選択される。

一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は免疫細胞である。本発明の有用な免疫細胞の例は、樹状細胞（未成熟樹状細胞および成熟樹状細胞等）、Ｔリンパ球（ナイーブＴ細胞、エフェクターＴ細胞、メモリーＴ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球、ヘルパーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、制御性Ｔ細胞（Treg cell）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、およびリンホカイン（lyphokine）活性化キラー（ＬＡＫ）細胞等）、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、マクロファージ、好中球、顆粒球、およびこれらの組み合わせを含むが、それらに限定されない。免疫細胞の亜集団を、当該分野で公知の１つまたは複数の細胞表面マーカー（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１２３、ＣＤ５６、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ３３等）の有無によって定義することができる。前記医薬組成物が複数の改変哺乳類免疫細胞を含む場合、該改変哺乳類免疫細胞は１つの免疫細胞型の特定の亜集団、１つの免疫細胞型の複数の亜集団の組み合わせ、または２つ以上の免疫細胞型の組み合わせでありうる。一部の実施形態において、前記免疫細胞は均質な細胞集団中に存在する。一部の実施形態において、前記免疫細胞は該免疫細胞を増強した不均質な細胞集団中に存在する。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞はリンパ球である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞はリンパ球ではない。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は養子免疫療法に適する。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞はＰＢＭＣである。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞はＰＢＭＣに由来する免疫細胞である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞はＴ細胞である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞はＣＤ４^＋Ｔ細胞である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞はＣＤ８^＋Ｔ細胞である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞はＢ細胞である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞はＮＫ細胞である。

従って、一部の実施形態において、ａ）免疫調節剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類（ヒト等）免疫細胞であって、前記異種核酸がプロモーターに機能的に連結した、改変哺乳類免疫細胞；およびｂ）薬理学的に許容される賦形剤、を含む医薬組成物が提供される。一部の実施形態において、前記改変哺乳類免疫細胞はＰＢＭＣ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはＮＫ細胞から選択される。一部の実施形態において、前記プロモーターは誘導性である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫チェックポイント阻害剤である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫賦活剤である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は分泌タンパク質である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は抗体である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類免疫細胞は、さらに、腫瘍抗原（ＣＡＲまたはＴＣＲ等）を認識するターゲティング分子をその表面上に発現する。一部の実施形態において、前記改変哺乳類免疫細胞は、さらに、治療用タンパク質（例えば第２の免疫調節剤、または免疫調節剤ではない治療用タンパク質）をコードする第２の異種核酸を含む。

一部の実施形態において、ａ）免疫調節剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類（ヒ
ト等）Ｔ細胞であって、前記異種核酸がプロモーターに機能的に連結した、改変哺乳類Ｔ細胞；およびｂ）薬理学的に許容される賦形剤、を含む医薬組成物が提供される。一部の実施形態において、前記改変哺乳類Ｔ細胞は細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、ＴＩＬ、ＬＡＫ細胞、ＣＡＲ−Ｔ、またはＴＣＲ−Ｔから選択される。一部の実施形態において、前記プロモーターは誘導性である。一部の実施形態において、前記プロモーターはＴ細胞活性化依存プロモーターである。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫チェックポイント阻害剤である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫賦活剤である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は分泌タンパク質である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は抗体である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類Ｔ細胞は、さらに、腫瘍抗原（ＣＡＲまたはＴＣＲ等）を認識するターゲティング分子をその表面上に発現する。一部の実施形態において、前記改変哺乳類Ｔ細胞は、さらに、治療用タンパク質（例えば第２の免疫調節剤、または免疫調節剤ではない治療用タンパク質）をコードする第２の異種核酸を含む。

一部の実施形態において、ａ）免疫調節剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類（ヒト等）ＰＢＭＣであって、前記異種核酸がプロモーターに機能的に連結した、改変哺乳類ＰＢＭＣ；およびｂ）薬理学的に許容される賦形剤、を含む医薬組成物が提供される。一部の実施形態において、前記プロモーターは誘導性である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫チェックポイント阻害剤である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫賦活剤である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は分泌タンパク質である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は抗体である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類ＰＢＭＣは、さらに、腫瘍抗原（ＣＡＲまたはＴＣＲ等）を認識するターゲティング分子をその表面上に発現する。一部の実施形態において、前記改変哺乳類ＰＢＭＣは、さらに、治療用タンパク質（例えば第２の免疫調節剤、または免疫調節剤ではない治療用タンパク質）をコードする第２の異種核酸を含む。

一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は幹細胞である。一部の実施形態において、前記幹細胞は全能性幹細胞である。一部の実施形態において、前記幹細胞は多能性幹細胞である。一部の実施形態において、前記幹細胞は単能性幹細胞である。一部の実施形態において、前記幹細胞は前駆細胞である。一部の実施形態において、前記幹細胞は胚性幹細胞である。一部の実施形態において、前記幹細胞は造血幹細胞である。一部の実施形態において、前記幹細胞は間葉系幹細胞である。一部の実施形態において、前記幹細胞は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。

従って、一部の実施形態において、ａ）免疫調節剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類（ヒト等）幹細胞であって、前記異種核酸がプロモーターに機能的に連結した、改変哺乳類幹細胞；およびｂ）薬理学的に許容される賦形剤、を含む医薬組成物が提供される。一部の実施形態において、前記改変哺乳類幹細胞は、造血幹細胞、間葉系幹細胞、またはｉＰＳＣから選択される。一部の実施形態において、前記プロモーターは誘導性である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫チェックポイント阻害剤である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫賦活剤である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は分泌タンパク質である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は抗体である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類幹細胞は、さらに、腫瘍抗原を認識するターゲティング分子をその表面上に発現する。一部の実施形態において、前記改変哺乳類幹細胞は、さらに、治療用タンパク質（例えば第２の免疫調節剤、または免疫調節剤ではない治療用タンパク質）をコードする第２の異種核酸を含む。

前記改変哺乳類細胞は前記異種核酸を任意の数（例えば１個、２個、３個、４個、５個、１０個、５０個、１００個、もしくは１０００個のいずれか、またはそれ以上）含んでいてよい。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は１コピーの前記異種核酸を有
する。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は複数コピーの前記異種核酸を有する。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は少なくとも一種のさらなる異種核酸を含み、その例は、第２の免疫調節剤もしくは免疫調節剤ではない治療用タンパク質をコードする第２の異種核酸；または、細胞内のバイオマーカーの発現に対するレポーターをコードする第２の異種核酸を含む。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は２種類以上の異種核酸を含み、これらはそれぞれ異なる治療用タンパク質（例えば免疫調節剤または非免疫調節剤）をコードする。

本明細書に記載される異種核酸は異種遺伝子発現カセット中に存在することができ、該カセットは１つまたは複数のタンパク質コード配列と、任意に１つまたは複数のプロモーターを含む。一部の実施形態において、前記異種遺伝子発現カセットは、単一のタンパク質コード配列を含む。一部の実施形態において、前記異種遺伝子発現カセットは、単一のプロモーターにより駆動される２つ以上のタンパク質コード配列を含む（すなわちポリシストロニックである）。一部の実施形態において、前記異種遺伝子発現カセットは、さらに、１つまたは複数の調節配列（例えば５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、エンハンサー配列、ＩＲＥＳ、または転写終結配列）、組換え部位、１つまたは複数の選択マーカー（例えば抗生物質耐性遺伝子またはレポーター遺伝子）、シグナル配列、またはその組み合わせを含む。一部の実施形態において、前記免疫調節剤または治療用タンパク質をコードする異種核酸は、分泌のためのシグナル配列を含む。

前記異種核酸は前記改変哺乳類細胞に一過性または安定的に組み込まれてよい。一部の実施形態において、前記異種核酸は前記改変哺乳類細胞中に一過性に発現する。例えば、前記異種核酸は、前記改変哺乳類細胞の核内で、前記異種遺伝子発現カセットを含む染色体外アレイ内に存在してよい。異種核酸は、当該分野で公知の任意のトランスフェクションまたは形質導入法、例えばウイルスまたは非ウイルス法を用いて前記改変哺乳類に導入してよい。非ウイルストランスフェクション法の例は、リン酸カルシウム、デンドリマー、リポソーム、またはカチオン性ポリマー（ＤＥＡＥ−デキストランまたはポリエチレンイミン等）などの化学物質を用いたトランスフェクション；エレクトロポレーション、セルスクイージング（cell squeezing）、ソノポレーション（sonoporation）、光学トランスフェクション（optical transfection）、インペールフェクション（impalefection）、原形質融合、ハイドロダイナミックデリバリー（hydrodynamic delivery）、またはトランスポゾンなどの、非化学的手法；遺伝子銃、マグネトフェクション（magnectofection）、すなわち磁石を使用したトランスフェクション、または微粒子銃などの、粒子を用いる方法；およびヌクレオフェクション（nucleofection）等のハイブリッド法などを含むが、これらに限定されない。一部の実施形態において、前記異種核酸はＤＮＡである。一部の実施形態において、前記異種核酸はＲＮＡである。一部の実施形態において、前記異種核酸は直鎖状である。一部の実施形態において、前記異種核酸は環状である。

一部の実施形態において、前記異種核酸は前記改変哺乳類細胞のゲノム中に存在する。例えば、前記異種核酸は、当該分野で公知の任意の方法により前記改変哺乳類細胞のゲノム中に組み込まれていてもよく、そのような方法の例は、ウイルス媒介組み込み、ランダム組み込み、相同組換え法、および、部位特異的リコンビナーゼまたはインテグラーゼ、トランスポゼース、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ（登録商標））、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、およびジンクフィンガーヌクレアーゼ等を用いた部位特異的組み込み法などを含むが、それらに限定されない。一部の実施形態において、前記異種核酸は、前記改変哺乳類細胞のゲノムの特異的に設計された座位に組み込まれる。一部の実施形態において、前記異種核酸は、前記改変哺乳類細胞のゲノムの組み込みホットスポット内に組み込まれる。一部の実施形態において、前記異種核酸は、前記改変哺乳類細胞のゲノムのランダムな座位に組み込まれる。前記異種核酸が単一の改変哺乳類細胞内に複数コピー存在する場合、該異種核酸は該改変哺乳類細胞のゲノムの複数の座位に組み込
まれていてよい。

免疫調節剤
前記改変哺乳類細胞は、免疫調節剤を任意の数（例えば１個、２個、３個、４個、５個、もしくは６個のいずれか、またはそれ以上）発現してよい。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、単一の免疫調節剤をコードする異種核酸を含む。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、少なくとも２つの免疫調節剤をコードする１つまたは複数の異種核酸を含む。一部の実施形態において、前記少なくとも２つの免疫調節剤をコードする異種核酸は、同一のプロモーターに機能的に連結している。一部の実施形態において、前記少なくとも２つの免疫調節剤をコードする異種核酸は、異なるプロモーターに機能的に連結している。

従って、一部の実施形態において、ａ）免疫調節剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類（ヒト等）細胞であって、前記異種核酸がプロモーターに機能的に連結した、改変哺乳類細胞；およびｂ）薬理学的に許容される賦形剤、を含む医薬組成物が提供される。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は免疫細胞（ＰＢＭＣ、ＮＫ細胞、またはＴ細胞等）である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は幹細胞である。一部の実施形態において、前記プロモーターは誘導性である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫チェックポイント阻害剤である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫賦活剤である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は分泌タンパク質である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は抗体である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、腫瘍抗原を認識するターゲティング分子をその表面上に発現する。

一部の実施形態において、ａ）少なくとも２個の免疫調節剤をコードする１つまたは複数の異種核酸を含む改変哺乳類（ヒト等）細胞であって、各免疫調節剤をコードする異種核酸がプロモーターに機能的に連結した、改変哺乳類細胞；およびｂ）薬理学的に許容される賦形剤、を含む医薬組成物が提供される。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は免疫細胞（ＰＢＭＣ、ＮＫ細胞、またはＴ細胞等）である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は幹細胞である。一部の実施形態において、前記少なくとも２個の免疫調節剤をコードする異種核酸は、同一のプロモーターに機能的に連結している。一部の実施形態において、前記少なくとも２つの免疫調節剤をコードする異種核酸は、異なるプロモーターに機能的に連結している。一部の実施形態において、前記プロモーターは誘導性である。一部の実施形態において、前記少なくとも２個の免疫調節剤は免疫チェックポイント阻害剤を含む。一部の実施形態において、前記少なくとも２個の免疫調節剤は免疫賦活剤を含む。一部の実施形態において、前記少なくとも２個の免疫調節剤はそれぞれ分泌タンパク質である。一部の実施形態において、前記少なくとも２個の免疫調節剤はそれぞれ抗体である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、腫瘍抗原を認識するターゲティング分子をその表面上に発現する。

本明細書が企図する免疫調節剤はタンパク質またはペプチドである。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は単一のポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は複数（例えば２個、３個、もしくは４個のいずれか、またはそれ以上）のポリペプチド鎖を含む。前記免疫調節剤のポリペプチド鎖は任意の長さのものであってよく、例えば、少なくとも約１０、２０、５０、１００、２００、３００、もしくは５００アミノ酸のいずれか、またはそれ以上の長さであってよい。多鎖免疫調節剤の場合、それらのポリペプチド鎖をコードする核酸配列は同一のプロモーターまたは異なるプロモーターに機能的に連結していてよい。

一部の実施形態において、前記免疫調節剤は分泌タンパク質である。一部の実施形態に
おいて、前記免疫調節剤は抗体である。モノクローナル抗体等の天然抗体は、特定の抗原と免疫学的な反応性を有する免疫グロブリン分子である。本明細書で使用される「抗体」という語は遺伝子操作された形態のものを含み、その例はキメラ抗体（例えばヒト化マウス抗体）、ヘテロ結合抗体（heteroconjugate antibody）（例えば二重特異性抗体）、組換え一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、および重鎖のみ抗体などを含む。「抗体」という語はまた、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ、およびＶ_ＨＨ等の抗原結合型の抗体も含む。一部の実施形態において、前記抗体はアゴニスト抗体である。一部の実施形態において、前記抗体はアンタゴニスト抗体である。一部の実施形態において、前記抗体はモノクローナル抗体である。一部の実施形態において、前記抗体は全長抗体である。一部の実施形態において、前記抗体は、Ｖ_Ｈ、Ｖ_Ｌ、Ｖ_ＮＡＲ、Ｖ_ＨＨ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、ミニボディ（minibody）、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）_２、トリボディ（tribody）、テトラボディ（tetrabody）、ＢｉＴＥ、ミニボディ（minibody）、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、トリアボディ（triabody）、および全長抗体の他の抗原結合サブ配列、またはこれらの人為的な組み合わせ、からなる群より選択される抗原結合断片である。一部の実施形態において、前記抗体はヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である。一部の実施形態において、前記抗体は一価抗体である。一部の実施形態において、前記抗体は二価抗体または四価抗体等の多価抗体である。一部の実施形態において、前記抗体は二重特異性抗体である。一部の実施形態において、前記抗体は多重特異性抗体である。一部の実施形態において、前記抗体は単一ドメイン抗体である。一部の実施形態において、前記抗体は重鎖のみ抗体である。一部の実施形態において、前記抗体は、抗体断片（Ｆｃ含有融合タンパク質等）、または全長抗体の任意の他の機能的バリアントもしくは誘導体を含む、融合タンパク質である。

一部の実施形態において、前記免疫調節剤は一本鎖抗体である。一部の実施形態において、前記一本鎖抗体は単一ドメイン抗体である。一部の実施形態において、前記一本鎖抗体はｓｃＦｖである。一部の実施形態において、前記一本鎖抗体はタンデムｓｃＦｖまたはＢｉＴＥ等の二重特異性一本鎖抗体である。一部の実施形態において、前記一本鎖抗体は多重特異性一本鎖抗体である。

一部の実施形態において、前記一本鎖抗体は、ラクダ科抗体またはその誘導体等の、重鎖のみ抗体である。一部の実施形態において、単一ドメイン抗体である免疫調節剤（例えば抗ＰＤ−１または抗ＣＴＬＡ−４）とＣＡＲ（またはＴＣＲ）とを共発現する改変哺乳類細胞を含んだ医薬組成物は、ＩｇＧ抗体である免疫調節剤（例えば抗ＰＤ−１または抗ＣＴＬＡ−４）とＣＡＲ（またはＴＣＲ）とを共発現する改変哺乳類細胞を含んだ医薬組成物と比べ、より強力な抗腫瘍効果を有する。どのような理論または仮説にも拘束されるものではないが、サイズが小さいこと、安定性が高いこと、および／または単一ドメイン抗体と関連した埋もれたエピトープへのアクセスがより容易であることが、単一ドメイン抗体免疫調節剤とＣＡＲ（またはＴＣＲ）を共発現する改変細胞の有効性を高めることに貢献している可能性がある。

一部の実施形態において、前記免疫調節剤は重鎖と軽鎖を含む抗体である。一部の実施形態において、前記重鎖はＶ_Ｈドメインを有する。一部の実施形態において、前記重鎖はさらに、１つまたは複数のＣ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３等の定常領域、またはその任意の組み合わせを含む。一部の実施形態において、前記軽鎖はＶ_Ｌドメインを有する。一部の実施形態において、前記軽鎖はさらに、１つまたは複数の、Ｃ_Ｌ１、Ｃ_Ｌ２、Ｃ_Ｌ３等の定常領域、またはその任意の組み合わせを含む。一部の実施形態において、前記重鎖および前記軽鎖は複数のジスルフィド結合を介して互いに結合している。一部の実施形態において、前記抗体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のＦｃ断片等のＦｃを含む。一部の実施形態において、前記抗体はＦｃ断片を含まない。一部の実施形態において、前記免疫調節剤はＦａｂである。

多鎖免疫調節抗体の重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドは、単一の異種核酸により、または２個の異種核酸により、前記改変哺乳類細胞中に共発現される。一部の実施形態において、前記重鎖ポリペプチドおよび前記軽鎖ポリペプチドは等モル比で発現される。一部の実施形態において、前記重鎖ポリペプチドおよび前記軽鎖ポリペプチドは、約１０：１、８：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、３：２、４：３、５：４、１：１、４：５、３：４、２：３、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：８、または１：１０のいずれかの比で発現される。一部の実施形態において、前記重鎖ポリペプチドと前記軽鎖ポリペプチドは、約１：１０〜約１：５、約１：５〜約１：３、約１：４〜約１：２、約１：２〜約１：１、約１：１〜約２：１、約２：１〜約４：１、約３：１〜約５：１、約５：１〜約１０：１、約１：２〜約２：１、約１：３〜約３：１、約１：５〜約５：１、または約１：１０〜約１０：１のいずれかの比で発現される。前記重鎖ポリペプチドと前記軽鎖ポリペプチドの間の最適な発現比によって、抗体のフォールディングと構築の過程を促進できる。例えば、Schlatter S et al., Biotechnol Prog. 21(1): 122-33 (2005)を参照のこと。

多鎖免疫調節抗体の前記重鎖ポリペプチドと前記軽鎖ポリペプチドの間の各種発現比は、前記異種核酸および／もしくは該重鎖と該軽鎖をコードする核酸のコピー数；ならびに／または誘導配列；ならびに／または該重鎖および該軽鎖をコードする核酸に連結されたプロモーターの強度を操作することにより達成されてよい。一部の実施形態において、前記重鎖をコードする核酸と前記軽鎖をコードする核酸とが、同一のプロモーターに機能的に連結される。一部の実施形態において、前記重鎖をコードする核酸と前記軽鎖をコードする核酸とが、異なるプロモーターに機能的に連結される。一部の実施形態において、前記重鎖をコードする核酸のためのプロモーターと前記軽鎖をコードする核酸のためのプロモーターとを同時に誘導することができる。一部の実施形態において、前記重鎖をコードする核酸のためのプロモーターと前記軽鎖をコードする核酸のためのプロモーターとを順次誘導することができる。一部の実施形態において、前記重鎖をコードする核酸のためのプロモーターの誘導が、前記軽鎖をコードする核酸のためのプロモーターの誘導よりも先に行われる。一部の実施形態において、前記重鎖をコードする核酸のためのプロモーターの誘導が、前記軽鎖をコードする核酸のためのプロモーターの誘導よりも後に行われる。一部の実施形態において、前記重鎖をコードする核酸のためのプロモーターと前記軽鎖をコードする核酸のためのプロモーターは、約１０：１、８：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、３：２、４：３、５：４、１：１、４：５、３：４、２：３、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：８、または１：１０のいずれかの強度比を有する。一部の実施形態において、前記重鎖をコードする核酸のためのプロモーターと前記軽鎖をコードする核酸のためのプロモーターは、約１：１０〜約１：５、約１：５〜約１：３、約１：４〜約１：２、約１：２〜約１：１、約１：１〜約２：１、約２：１〜約４：１、約３：１〜約５：１、約５：１〜約１０：１、約１：２〜約２：１、約１：３〜約３：１、約１：５〜約５：１、または約１：１０〜約１０：１のいずれかの強度比を有する。

従って、一部の実施形態において、ａ）免疫調節抗体をコードする異種核酸を含む改変哺乳類（ヒト等）細胞であって、前記異種核酸がプロモーターに機能的に連結した、改変哺乳類細胞；およびｂ）薬理学的に許容される賦形剤、を含む医薬組成物が提供される。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は免疫細胞（ＰＢＭＣ、ＮＫ細胞、またはＴ細胞等）である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は幹細胞である。一部の実施形態において、前記プロモーターは誘導性である。一部の実施形態において、前記免疫調節抗体は免疫チェックポイント阻害剤である。一部の実施形態において、前記免疫調節抗体は免疫賦活剤である。一部の実施形態において、前記免疫調節抗体は一本鎖抗体（例えば単一ドメイン抗体、ｓｃＦｖ、または重鎖のみ抗体）である。一部の実施形態に
おいて、前記免疫調節抗体は重鎖と軽鎖とを含む。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、腫瘍抗原を認識するターゲティング分子をその表面上に発現する。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、治療用タンパク質（例えば第２の免疫調節剤、または免疫調節剤ではない治療用タンパク質）をコードする第２の異種核酸を含む。

前記異種核酸から発現される免疫調節剤としては、免疫系を調節する（例えば阻害または活性化する）、任意のタンパク質またはペプチドに基づいた薬剤が挙げられる。免疫調節剤は、前記チェックポイント分子のような特定の分子を標的にすることができるか、あるいは免疫応答を非特異的に調節することができる。賦活剤の例は、抗原提示細胞を活性化し、細胞性免疫応答を刺激する分子を含む。例えば、賦活剤は免疫刺激ペプチドでありうる。賦活剤は、Ｔｏｌｌ様受容体ＴＬＲ−２、３、４、６、７、８、もしくは９のアゴニスト、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＴＮＦ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ−２８、ＦＬＴ−３リガンド、またはＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、もしくはＩＬ−２１等のサイトカインを含むが、それらに限定されない。賦活剤は、Ｔ細胞上の活性化受容体（共刺激受容体等）のアゴニスト、例えばＣＤ−２８、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＣＤ４０、またはＨＶＥＭのアゴニスト（アゴニスト抗体等）を含む。また、賦活剤は、免疫抑制因子の活性を阻害するタンパク質、例えば免疫抑制因子ＩＬ−１０、ＩＬ−３５、ＴＧＦ−β、もしくはＩＤＯの阻害剤；または、免疫チェックポイントの活性を阻害するタンパク質、例えばＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＬＡＧ−３、Ｂ７−１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、もしくはＴＩＭ−３のアンタゴニスト（アンタゴニスト抗体等）を含む。また、賦活剤は、ＣＤ４０、ＣＤ８０、またはＣＤ８６等の共刺激分子も含む。また、免疫調節剤は、免疫系を下方制御する薬剤、例えば、ＩＬ−１２ｐ７０に対する抗体、Ｔｏｌｌ様受容体ＴＬＲ−２、３、４、５、６、８、もしくは９のアンタゴニスト、または免疫機能の一般的なサプレッサーを含む。これらの薬剤（例えば賦活剤または下方制御剤）を組み合わせて最適な免疫応答を達成することができる。一部の実施形態において、前記免疫調節剤はサイトカインである。一部の実施形態において、前記免疫調節剤はケモカインである。

本発明で特に興味深い免疫調節剤は、免疫チェックポイントタンパク質の調節剤（例えば阻害剤および賦活剤）を含む。免疫チェックポイントは、シグナルを強化する（刺激分子）か、あるいは弱める（抑制分子）、免疫系の分子である。免疫チェックポイントタンパク質は、自己寛容、ならびに生理学的免疫応答の持続期間および程度を調節および維持する。刺激性チェックポイント分子は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーに属する、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、およびＣＤ１３７；ならびに、Ｂ７−ＣＤ−２８スーパーファミリーに属する、ＣＤ−２８およびＩＣＯＳを含むが、これらに限定されない。抑制性チェックポイント分子は、プログラム細胞死１（program death 1）（ＰＤ−１）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（Cytotoxic T-Lymphocyte-Associated protein 4）（ＣＴＬＡ−４）、リンパ球活性化遺伝子３（Lymphocyte Activation Gene-3）（ＬＡＧ−３）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３（T-cell Immunoglobulin domain and Mucin domain 3）（ＴＩＭ−３）、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇサプレッサー（V-domain Ig suppressor of T cell activation）（ＶＩＳＴＡ）、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター（B and T Lymphocyte Attenuator）（ＢＴＬＡ）、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（Indoleamine 2,3-dioxygenase）（ＩＤＯ）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor）（ＫＩＲ）、アデノシンＡ２Ａ受容体、およびそれらのリガンドを含むが、これらに限定されない。ＣＴＬＡ−４とそのリガンドＣＤ８０およびＣＤ８６、ならびにＰＤ−１とそのリガンドＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２など、多数のチェックポイントタンパク質が広範に研究されている（例えばPardoll, Natur
e Reviews Cancer 12: 252-264 (2012)を参照のこと）。前記免疫調節剤は、前記免疫チェックポイント分子に特異的に結合する抗体、天然リガンド、または改変タンパク質でありうる。

一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、単一の免疫賦活剤または単一の免疫チェックポイント阻害剤等の、単一の免疫調節剤を発現する。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は少なくとも２つの免疫調節剤を発現する。一部の実施形態において、前記少なくとも２つの免疫調節剤は免疫賦活剤である。一部の実施形態において、前記少なくとも２つの免疫調節剤は免疫チェックポイント阻害剤である。一部の実施形態において、前記少なくとも２つの免疫調節剤は免疫賦活剤と免疫チェックポイント阻害剤の両者を含む。一部の実施形態において、前記少なくとも２つの免疫調節剤は同一の異種核酸によって発現される。一部の実施形態において、前記少なくとも２つの免疫調節剤は異なる異種核酸によって発現される。例えば、それぞれの免疫調節剤が異なる異種核酸によって発現される。

一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫賦活剤である。本明細書が企図する免疫賦活剤の例は、刺激性チェックポイント分子の賦活剤を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態において、前記免疫賦活剤は、刺激性免疫チェックポイント分子の天然または改変リガンドであり、その例は、ＯＸ４０のリガンド（ＯＸ４０Ｌ等）、ＣＤ−２８のリガンド（ＣＤ８０、ＣＤ８６等）、ＩＣＯＳのリガンド（Ｂ７ＲＰ１等）、４−１ＢＢのリガンド（４−１ＢＢＬ、Ｕｌｔｒａ４−１ＢＢＬ等）、ＣＤ２７のリガンド（ＣＤ７０等）、ＣＤ４０のリガンド（ＣＤ４０Ｌ等）、およびＴＣＲのリガンド（ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子、ＩＭＣｇｐ１００等）を含む。一部の実施形態において、前記免疫賦活剤は分泌タンパク質である。一部の実施形態において、前記免疫賦活剤は、抗ＣＤ−２８（ＴＧＮ−１４１２等）、抗ＯＸ４０（ＭＥＤＩ６４６９、ＭＥＤＩ−０５６２等）、抗ＩＣＯＳ（ＭＥＤＩ−５７０等）、抗ＧＩＴＲ（ＴＲＸ５１８、ＩＮＢＲＸ−１１０、ＮＯＶ−１２０３０１等）、抗４−１ＢＢ（ＢＭＳ−６６３５１３、ＰＦ−０５０８２５６６等）、抗ＣＤ２７（ＢＩＯＮ−１４０２、バルリルマブ（Varlilumab）、ｈＣＤ２７．１５等）、抗ＣＤ４０（ＣＰ８７０、８９３、ＢＩ−６５５０６４、ＢＭＳ−９８６０９０、ＡＰＸ００５、およびＡＰＸ００５Ｍ等）、抗ＣＤ３（ブリナツモマブ（blinatumomab）、ムロモナブ（muromonab）等）、および抗ＨＶＥＭからなる群より選択される抗体（例えばアゴニスト抗体）である。

一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫チェックポイント阻害剤である。「免疫チェックポイント阻害剤」という語は、Ｔ細胞の活性化および機能を制御することができる１つまたは複数の抑制性チェックポイントタンパク質を完全にまたは部分的に減少させ、阻害し、または妨げる分子のことを指す。一部の実施形態において、前記免疫チェックポイント阻害剤はＴ細胞を標的とする。一部の実施形態において、前記免疫チェックポイント阻害剤は腫瘍細胞を標的とする。例えば、一部の例では、腫瘍細胞は、特定のＴ細胞受容体に付着することにより、活性化したＴ細胞を不活性化（turn off）することができる。しかし、免疫チェックポイント阻害剤は、腫瘍細胞のＴ細胞への付着を妨げ、Ｔ細胞を活性化されたままにすることができる（例えばHoward West, JAMA Oncol. 1(1):115 (2015)を参照のこと）。一部の実施形態において、前記免疫チェックポイント阻害剤は、抑制性免疫チェックポイント分子の天然または改変リガンドであり、その例は、ＣＴＬＡ−４のリガンド（Ｂ７．１、Ｂ７．２等）、ＴＩＭ−３のリガンド（ガレクチン−９等）、Ａ２ａ受容体のリガンド（アデノシン、レガデノソン等）、ＬＡＧ−３のリガンド（ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子等）、ＢＴＬＡのリガンド（ＨＶＥＭ、Ｂ７−Ｈ４等）、ＫＩＲのリガンド（ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子等）、ＰＤ−１のリガンド（ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２等）、ＩＤＯのリガンド（ＮＫＴＲ−２１８、インドキシモド、ＮＬＧ９１９等）、およびＣＤ４７のリガンド（ＳＩＲＰ−アルファ受容
体等）を含む。一部の実施形態において、前記免疫チェックポイント阻害剤は分泌性である。一部の実施形態において、前記免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ−４（イピリムマブ（Ipilimumab）、トレメリムマブ（Tremelimumab）、ＫＡＨＲ−１０２等）、抗ＴＩＭ−３（Ｆ３８−２Ｅ２、ＥＮＵＭ００５等）、抗ＬＡＧ−３（ＢＭＳ−９８６０１６、ＩＭＰ７０１、ＩＭＰ３２１、Ｃ９Ｂ７Ｗ等）、抗ＫＩＲ（リリルマブ（Lirilumab）およびＩＰＨ２１０１等）、抗ＰＤ−１（ニボルマブ（Nivolumab）、ピディリズマブ（Pidilizumab）、ペムブロリズマブ（Pembrolizumab）、ＢＭＳ−９３６５５９、アテゾリズマブ（atezolizumab）、ラムブロリズマブ（Lambrolizumab）、ＭＫ−３４７５、ＡＭＰ−２２４、ＡＭＰ−５１４、ＳＴＩ−Ａ１１１０、ＴＳＲ−０４２等）、抗ＰＤ−Ｌ１（ＫＹ−１００３（ＥＰ２０１２０１９４９７７）、ＭＣＬＡ−１４５、ＲＧ７４４６、ＢＭＳ−９３６５５９、ＭＥＤＩ−４７３６、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ＡＵＲ−０１２、ＳＴＩ−Ａ１０１０、ＰＣＴ／ＵＳ２００１／０２０９６４、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＡＭＰ−２２４、ダピロリズマブ・ペゴル（Dapirolizumab pegol）（ＣＤＰ−７６５７）、ＭＥＤＩ−４９２０等）、抗ＣＤ７３（ＡＲ−４２（ＯＳＵ−ＨＤＡＣ４２、ＨＤＡＣ−４２、ＡＲ４２、ＡＲ４２、ＯＳＵ−ＨＤＡＣ４２、ＯＳＵ−ＨＤＡＣ−４２、ＮＳＣＤ７３６０１２、ＨＤＡＣ−４２、ＨＤＡＣ４２、ＨＤＡＣ４２、ＮＳＣＤ７３６０１２、ＮＳＣ−Ｄ７３６０１２）、ＭＥＤＩ−９４４７等）、抗Ｂ７−Ｈ３（ＭＧＡ２７１、ＤＳ−５５７３ａ、８Ｈ９等）、抗ＣＤ４７（ＣＣ−９０００２、ＴＴＩ−６２１、ＶＬＳＴ−００７等）、抗ＢＴＬＡ、抗ＶＩＳＴＡ、抗Ａ２ａＲ、抗Ｂ７−１、抗Ｂ７−Ｈ４、抗ＣＤ５２（アレムツズマブ（alemtuzumab）等）、抗ＩＬ−１０、抗ＩＬ−３５、および抗ＴＧＦ−β（フレソルミマブ（Fresolumimab）等）からなる群より選択される、抑制性免疫チェックポイントタンパク質を標的とする抗体（例えばアンタゴニスト抗体）である。一部の実施形態において、前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、ＢＬＴＡ、ＴＩＭ−３、およびＬＡＧ−３からなる群より選択される抑制性チェックポイント分子の阻害剤である。

一部の実施形態において、前記免疫チェックポイント阻害剤はＣＴＬＡ−４の阻害剤である。一部の実施形態において、前記ＣＴＬＡ−４の阻害剤は抗ＣＴＬＡ−４抗体である。一部の実施形態において、前記抗ＣＴＬＡ−４抗体はイピリムマブ（Ipilimumab）である。イピリムマブは抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体（商品名ＹＥＲＶＯＹ（登録商標）、以前はＭＤＸ−０１０およびＭＤＸ−１０１として知られる）であり、転移を伴うまたは外科的に除去できない末期メラノーマを有する患者の治療用として、２０１１年３月付けで米国ＦＤＡに認可された。このｍＡｂ薬は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、膀胱癌、および転移性ホルモン抵抗性前立腺癌の治療のための臨床試験においても有望な反応を示した。

従って、一部の実施形態において、ａ）ＣＴＬＡ−４の阻害剤（イピリムマブ等の抗ＣＴＬＡ−４抗体など）をコードする異種核酸を含む改変哺乳類（ヒト等）細胞であって、前記異種核酸がプロモーターに機能的に連結した、改変哺乳類細胞；およびｂ）薬理学的に許容される賦形剤、を含む医薬組成物が提供される。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は免疫細胞（ＰＢＭＣ、ＮＫ細胞、またはＴ細胞等）である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は幹細胞である。一部の実施形態において、前記プロモーターは誘導性である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、腫瘍抗原を認識するターゲティング分子をその表面上に発現する。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、治療用タンパク質（例えばＣＴＬＡ−４の阻害剤ではない第２の免疫調節剤、または免疫調節剤ではない治療用タンパク質）をコードする第２の異種核酸を含む。

一部の実施形態において、前記免疫チェックポイント阻害剤はＰＤ−１の阻害剤である。一部の実施形態において、前記ＰＤ−１の阻害剤は抗ＰＤ−１抗体である。一部の実施
形態において、前記抗ＰＤ−１抗体はラムブロリズマブ（Lambrolizumab）である。ラムブロリズマブ（ペムブロリズマブ（Pembrolizumab）またはＭＫ−３４７５とも呼ばれる；商品名ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標））は、２０１４年９月４日付けで米国ＦＤＡに認可されたヒト化抗ＰＤ−１ＩｇＧ４ｍＡｂである。この薬剤は当初、転移性メラノーマの治療に使用された。ペムブロリズマブは、ＰＤ−Ｌ１を発現する腫瘍を有し、他の化学療法剤による治療に失敗した患者における転移性非小細胞肺癌の治療に対して、２０１５年１０月２日付けで米国ＦＤＡに認可された。

従って、一部の実施形態において、ａ）ＰＤ−１の阻害剤（ラムブロリズマブ等の抗ＰＤ−１抗体など）をコードする異種核酸を含む改変哺乳類（ヒト等）細胞であって、前記異種核酸がプロモーターに機能的に連結した、改変哺乳類細胞；およびｂ）薬理学的に許容される賦形剤、を含む医薬組成物が提供される。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は免疫細胞（ＰＢＭＣ、ＮＫ細胞、またはＴ細胞等）である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は幹細胞である。一部の実施形態において、前記プロモーターは誘導性である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、腫瘍抗原を認識するターゲティング分子をその表面上に発現する。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、治療用タンパク質（例えばＰＤ−１の阻害剤ではない第２の免疫調節剤、または免疫調節剤ではない治療用タンパク質）をコードする第２の異種核酸を含む。

他の治療用タンパク質
一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、治療用タンパク質をコードする第２の異種核酸を含む。本明細書が企図する治療用タンパク質の例は、治療効果を有する、任意のタンパク質またはポリペプチドに基づいた薬剤を含む。従って、免疫調節剤は治療用タンパク質の１種であると考えられる。前記改変哺乳類細胞は、前記免疫調節剤に加え、治療用タンパク質を任意の数（例えば１個、２個、３個、４個、５個、もしくは６個のいずれか、またはそれ以上）発現してよい。一部の実施形態において、前記治療用タンパク質は免疫調節剤である。一部の実施形態において、前記治療用タンパク質は免疫調節剤ではない。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、前記免疫調節剤に加え、２つ以上のさらなる免疫調節剤、２つ以上の免疫調節剤ではない治療用タンパク質、またはさらなる免疫調節剤と免疫調節剤ではない治療用タンパク質との組み合わせなどを含む、２つ以上の治療用タンパク質を発現する。

前記免疫調節剤をコードする核酸、および前記さらなる治療用タンパク質をコードする核酸（免疫調節剤および非免疫調節剤を含む）は、同一または異なるプロモーターで駆動されるものであってよい。一部の実施形態において、前記免疫調節剤をコードする異種核酸と、前記治療用タンパク質をコードする前記第２の異種核酸とが、同一のプロモーターに機能的に連結される（例えばポリシストロニックなコード配列において）。一部の実施形態において、前記異種核酸が複数のタンパク質（例えば免疫調節剤、治療用タンパク質、キメラエフェクター分子等）をコードするポリシストロニックなコード配列である場合、自己切断ペプチド、例えば口蹄疫（foot-and-mouse disease）ウイルスＦ２Ａ、ウマ鼻炎ＡウイルスＥ２Ａ、ゾセア・アシグナ（Thosea asigna）ウイルスＴ２Ａ、またはブタテッショウウイルス（teschovirus）−１Ｐ２Ａ等の２Ａペプチド、をコードする核酸配列を、２個の異なるタンパク質をコードする配列間に配置することができる。一部の実施形態において、前記免疫調節剤をコードする異種核酸と、前記治療用タンパク質をコードする前記第２の異種核酸とが、異なるプロモーターに機能的に連結される。異なるプロモーターによる制御によって、前記免疫調節剤および前記さらなる治療用タンパク質の発現の量およびタイミング、ならびに誘導条件を別々のものとすることができる。一部の実施形態において、前記免疫調節剤をコードする異種核酸と、前記治療用タンパク質をコードする第２の異種核酸とが、同一の異種遺伝子発現カセットを介して前記改変哺乳類細胞
に導入される。一部の実施形態において、前記免疫調節剤をコードする異種核酸と、前記治療用タンパク質をコードする第２の異種核酸とが、別々の異種遺伝子発現カセットを介して前記改変哺乳類細胞に導入される。

従って、一部の実施形態において、ａ）免疫調節剤をコードする異種核酸と、免疫調節剤ではない治療用タンパク質をコードする第２の異種核酸とを含む改変哺乳類（ヒト等）細胞であって、前記免疫調節剤をコードする異種核酸がプロモーターに機能的に連結した、改変哺乳類細胞；およびｂ）薬理学的に許容される賦形剤、を含む医薬組成物が提供される。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は幹細胞である。一部の実施形態において、前記プロモーターは誘導性である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫チェックポイント阻害剤（ＣＴＬＡ−４の阻害剤またはＰＤ−１の阻害剤等）である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫賦活剤である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は分泌タンパク質である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は抗体である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、腫瘍抗原を認識するターゲティング分子をその表面上に発現する。一部の実施形態において、前記治療用タンパク質をコードする第２の異種核酸は、前記プロモーターに機能的に連結している。一部の実施形態において、前記治療用タンパク質をコードする第２の異種核酸は、前記免疫調節剤をコードする異種核酸に機能的に連結したプロモーターとは異なるプロモーターに機能的に連結している。

一部の実施形態において、ａ）免疫調節剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類（ヒト等）細胞であって、前記免疫調節剤をコードする異種核酸がプロモーターに機能的に連結し、前記改変哺乳類細胞がさらに２つ以上の治療用タンパク質を発現する、改変哺乳類細胞；およびｂ）薬理学的に許容される賦形剤、を含む医薬組成物が提供される。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は幹細胞である。一部の実施形態において、前記プロモーターは誘導性である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫チェックポイント阻害剤（ＣＴＬＡ−４の阻害剤またはＰＤ−１の阻害剤等）である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫賦活剤である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は分泌タンパク質である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は抗体である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、腫瘍抗原を認識するターゲティング分子をその表面上に発現する。一部の実施形態において、前記２つ以上の治療用タンパク質は免疫調節剤ではない。一部の実施形態において、前記２つ以上の治療用タンパク質は１つまたは複数の免疫調節剤を含む。一部の実施形態において、前記２つ以上の治療用タンパク質は、それぞれが、プロモーターに機能的に連結した異種核酸によってコードされる。一部の実施形態において、前記２つ以上の治療用タンパク質のためのプロモーターは同一である。一部の実施形態において、前記２つ以上の治療用タンパク質のためのプロモーターは異なったものである。一部の実施形態において、前記２つ以上の治療用タンパク質のためのプロモーターの１つまたは複数は、前記免疫調節剤のためのプロモーターと同一である。

当該分野で公知の任意の治療用タンパク質を、前記異種核酸によって発現してよい。本明細書が企図する治療用タンパク質は、次の機能のうちいずれか１つまたは複数を有していてよい：（１）欠損した、もしくは異常なタンパク質を置換すること；（２）既存の経路を増強すること；（３）新規機能または活性を提供すること；（４）分子または生物に干渉すること；および（５）他の化合物またはタンパク質を送達すること。

一部の実施形態において、前記治療用タンパク質は酵素である。一部の実施形態において、前記治療用タンパク質は調節タンパク質である。一部の実施形態において、前記治療用タンパク質はシグナル伝達タンパク質である。一部の実施形態において、前記治療用タンパク質は細胞表面分子を標的とする。一部の実施形態において、前記治療用タンパク質
は細胞表面分子のリガンドである。一部の実施形態において、前記治療用タンパク質は細胞表面分子の阻害剤である。一部の実施形態において、前記治療用タンパク質は細胞表面分子の賦活剤である。一部の実施形態において、前記治療用タンパク質は細胞表面分子である。一部の実施形態において、前記治療用タンパク質は化学療法剤である。一部の実施形態において、前記治療用タンパク質は腫瘍抗原に特異的に結合する。

一部の実施形態において、前記治療用タンパク質は免疫調節剤ではない。本出願における特に興味深い、非免疫調節剤の治療用タンパク質は、化学療法抗体等の抗癌剤である。本明細書が企図する化学療法抗体の例は、アレムツズマブ（alemtuzumab）、ベバシズマブ（bevacizumab）；セツキシマブ（cetuximab）；パニツムマブ（panitumumab）、リツキシマブ（rituximab）、ペルツズマブ（pertuzumab）、トラスツズマブ（trastuzumab）、トシツモマブ（tositumomab）、アポリズマブ（apolizumab）、アセリズマブ（aselizumab）、アトリズマブ（atlizumab）、バピネオズマブ（bapineuzumab）、ビバツズマブ・メルタンシン（bivatuzumab mertansine）、カンツズマブ・メルタンシン（cantuzumab mertansine）、セデリズマブ（cedelizumab）、セルトリズマブ・ペゴル（certolizumab pegol）、シドフシツズマブ（cidfusituzumab）、シドツズマブ（cidtuzumab）、ダクリズマブ（daclizumab）、エクリズマブ（eculizumab）、エファリズマブ（efalizumab）、エプラツズマブ（epratuzumab）、エルリズマブ（erlizumab）、フェルビズマブ（felvizumab）、フォントリズマブ（fontolizumab）、ゲムツズマブ・オゾガマイシン（gemtuzumab
ozogamicin）、イノツズマブ・オゾガマイシン（inotuzumab ozogamicin）、イピリムマブ（ipilimumab）、ラベツズマブ（labetuzumab）、リンツズマブ（lintuzumab）、マツズマブ（matuzumab）、メポリズマブ（mepolizumab）、モタビズマブ（motavizumab）、モトビズマブ（motovizumab）、ナタリズマブ（natalizumab）、ニモツズマブ（nimotuzumab）、ノロビズマブ（nolovizumab）、ヌマビズマブ（numavizumab）、オクレリズマブ（ocrelizumab）、オマリズマブ（omalizumab）、パリビズマブ（palivizumab）、パスコリズマブ（pascolizumab）、ペクフシツズマブ（pecfusituzumab）、ペクツズマブ（pectuzumab）、ペキセリズマブ（pexelizumab）、ラリビズマブ（ralivizumab）、ラニビズマブ（ranibizumab）、レスリビズマブ（reslivizumab）、レスリズマブ（reslizumab）、レシビズマブ（resyvizumab）、ロベリズマブ（rovelizumab）、ルプリズマブ（ruplizumab）、シブロツズマブ（sibrotuzumab）、シプリズマブ（siplizumab）、ソンツズマブ（sontuzumab）、タカツズマブ・テトラキセタン（tacatuzumab tetraxetan）、タドシズマブ（tadocizumab）、タリズマブ（talizumab）、テフィバズマブ（tefibazumab）、トシリズマブ（tocilizumab）、トラリズマブ（toralizumab）、ツコツズマブ・セルモロイキン（tucotuzumab celmoleukin）、ツクシツズマブ（tucusituzumab）、ウマビズマブ（umavizumab）、ウルトキサズマブ（urtoxazumab）、ウステキヌマブ（ustekinumab）、ビシリズマブ（visilizumab）、および抗インターロイキン−１２（ＡＢＴ−８７４／Ｊ６９５、Wyeth Research and Abbott Laboratories）を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態において、前記治療用タンパク質は抗ＨＥＲ２抗体である。一部の実施形態において、前記抗ＨＥＲ２抗体はＨＥＲ２に結合し、ＨＥＲ２^＋癌細胞の細胞増殖または成長を阻害する。一部の実施形態において、前記抗ＨＥＲ２抗体はＨＥＲ２に結合し、ＨＥＲ２が他のＨＥＲ受容体と二量体化することを阻害する。一部の実施形態において、前記抗ＨＥＲ２抗体はトラスツズマブ（trastuzumab）またはペルツズマブ（pertuzumab）である。一部の実施形態において、前記抗ＨＥＲ２抗体はトラスツズマブまたはペルツズマブではない。

本明細書が企図する治療用タンパク質は、免疫調節剤のための上記の任意の分子特性を有していてよい。一部の実施形態において、前記治療用タンパク質は分泌性である。例えば、前記治療用タンパク質は抗体であってよく、その例は全長抗体、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、重鎖のみ抗体、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体（Ｖ_ＨＨ等）、および重鎖と軽鎖とを有する抗体断片（Ｆａｂ等）を含む。該治療用タンパク質をコードする異種核酸と
、該治療用タンパク質のためのプロモーターは、本明細書に記載した免疫調節剤のそれらのための任意の特性を有していてよい。

プロモーター
前記免疫調節剤をコードする異種核酸、前記細胞表面分子（ＣＡＲもしくはＴＣＲ）、または本明細書に記載される任意の他の治療用タンパク質は、プロモーターに機能的に連結していてよい。一部の実施形態において、前記免疫調節剤、細胞表面分子（ＣＡＲまたはＴＣＲ等）、および他の治療用タンパク質のそれぞれは、異なるプロモーターにより駆動されるものであってよい。一部の実施形態において、前記免疫調節剤、細胞表面分子（ＣＡＲまたはＴＣＲ等）、および他の治療用タンパク質は、同一のプロモーターによって駆動されるものであってよい。

一部の実施形態において、前記プロモーターは内在性プロモーターである。例えば、前記免疫調節剤（または本明細書に記載される他の治療用タンパク質）をコードする核酸は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法等の当該分野で公知の任意の方法を用いて、前記改変哺乳類細胞のゲノム中、内在性プロモーターの下流にノックインしてよい。一部の実施形態において、前記内在性プロモーターは、ベータアクチン等の豊富なタンパク質のためのプロモーターである。一部の実施形態において、前記内在性プロモーターは誘導性プロモーターであり、例えば、前記改変哺乳類細胞の内在性活性化シグナルによって誘導可能である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞がＴ細胞である場合、前記プロモーターはＴ細胞活性化依存プロモーター（例えばＩＬ−２プロモーター、ＮＦＡＴプロモーター、またはＮＦκＢプロモーター）である。

一部の実施形態において、前記プロモーターは異種プロモーターである。

哺乳類細胞における遺伝子発現のために各種プロモーターが研究されてきたが、当該分野で公知の任意のプロモーターを本発明で使用してよい。プロモーターは構成的プロモーターと、誘導性プロモーター等の調節性プロモーター（regulated promoter）とに大きく分けられる。一部の実施形態において、前記免疫調節剤をコードする異種核酸は、構成的プロモーターに機能的に連結している。一部の実施形態において、前記免疫調節剤をコードする異種核酸は、誘導性プロモーターに機能的に連結している。一部の実施形態において、構成的プロモーターが第１の治療用タンパク質（免疫調節剤等）をコードする核酸に機能的に連結され、誘導性プロモーターが第２の治療用タンパク質（非免疫調節剤等）をコードする核酸に機能的に連結される。一部の実施形態において、第１の誘導性プロモーターが第１の治療用タンパク質（免疫調節剤等）またはポリペプチド鎖をコードする核酸に機能的に連結され、第２の誘導性プロモーターが第２の治療用タンパク質（非免疫調節剤等）またはポリペプチド鎖をコードする核酸に機能的に連結される。一部の実施形態において、第１の誘導性プロモーターは第１の誘導条件によって誘導可能であり、第２の誘導性プロモーターは第２の誘導条件によって誘導可能である。一部の実施形態において、第１の誘導条件は第２の誘導条件と同一である。一部の実施形態において、第１の誘導性プロモーターと第２の誘導性プロモーターは同時に誘導される。一部の実施形態において、第１の誘導性プロモーターと第２の誘導性プロモーターは順次誘導される。例えば、第１の誘導性プロモーターが第２のプロモーターよりも先に誘導されるか、または第１の誘導性プロモーターが第２のプロモーターよりも後に誘導される。

構成的プロモーターは異種遺伝子（導入遺伝子とも呼ぶ）を宿主細胞中で構成的に発現させることができる。本明細書が企図する構成的プロモーターの例は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ヒト伸長因子−１アルファ（ｈＥＦ１α）、ユビキチンＣプロモーター（ＵｂｉＣ）、ホスホグリセロキナーゼプロモーター（ＰＧＫ）、シミアンウイルス４０初期プロモーター（ＳＶ４０）、およびニワトリβ−アクチンプロモーター
とＣＭＶ初期エンハンサーとの組み合わせ（ＣＡＧＧ）を含むが、これらに限定されない。導入遺伝子の発現の駆動に対するこのような構成的プロモーターの有効性は、極めて多数の研究によって広範に比較されてきた。例えば、Michael C. Miloneらは、初代ヒトＴ細胞におけるキメラ抗原受容体発現の駆動に対するＣＭＶ、ｈＥＦ１α、ＵｂｉＣ、およびＰＧＫの有効性を比較し、その結果、ｈＥＦ１αプロモーターが導入遺伝子の最高レベルの発現を誘導しただけではなく、ＣＤ４およびＣＤ８ヒトＴ細胞において最適に維持されたと結論づけた（Molecular Therapy, 17(8): 1453-1464 (2009)）。一部の実施形態において、前記異種核酸中のプロモーターはｈＥＦ１αプロモーターである。構成的プロモーターに機能的に連結した免疫チェックポイント阻害剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類細胞であって、該免疫チェックポイント阻害剤が、腫瘍細胞上に発現する抑制性免疫チェックポイント分子を遮断するものである例を、図１に示す。構成的プロモーターに機能的に連結した免疫チェックポイント阻害剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類細胞であって、該免疫チェックポイント阻害剤が、該改変哺乳類細胞および非改変免疫細胞上に発現する抑制性免疫チェックポイント分子を遮断するものである例を、図２に示す。

一部の実施形態において、前記プロモーターは誘導性プロモーターである。誘導性プロモーターは調節性プロモーターのカテゴリーに属する。該誘導性プロモーターは、物理的な状態、前記改変哺乳類細胞の微小環境、もしくは前記改変哺乳類細胞の生理学的状態、誘導物質（すなわち誘導剤）、またはこれらの組み合わせ、等の１つまたは複数の条件によって誘導されうる。一部の実施形態において、前記誘導条件は、前記改変哺乳類細胞中および／または前記医薬組成物を投与される対象中で内在性遺伝子の発現を誘導しない。一部の実施形態において、前記誘導条件は、誘導物質、照射（電離放射線、光等）、温度（熱等）、酸化還元状態、腫瘍環境、および前記改変哺乳類細胞の活性化状態からなる群より選択される。誘導性プロモーターに機能的に連結した免疫チェックポイント阻害剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類細胞であって、該免疫チェックポイント阻害剤が、腫瘍細胞上に発現する抑制性免疫チェックポイント分子を遮断するものである例を、図３に示す。誘導性プロモーターに機能的に連結した免疫チェックポイント阻害剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類細胞であって、該免疫チェックポイント阻害剤が、該改変哺乳類細胞および非改変免疫細胞上に発現する抑制性免疫チェックポイント分子を遮断するものである例を、図４に示す。

従って、一部の実施形態において、ａ）免疫調節剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類（ヒト等）細胞であって、前記異種核酸が誘導性プロモーターに機能的に連結した、改変哺乳類細胞；およびｂ）薬理学的に許容される賦形剤、を含む医薬組成物が提供される。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は免疫細胞（ＰＢＭＣ、ＮＫ細胞、またはＴ細胞等）である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は幹細胞である。一部の実施形態において、前記プロモーターは、誘導物質（例えばテトラサイクリンまたはドキシサイクリンなどの小分子等）、照射、温度、酸化還元状態、腫瘍環境、および前記改変哺乳類細胞の活性化状態、から選択される誘導条件によって誘導可能である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫チェックポイント阻害剤（ＣＴＬＡ−４の阻害剤またはＰＤ−１の阻害剤等）である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫賦活剤である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は分泌タンパク質である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は抗体（全長抗体、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、重鎖のみ抗体、またはＦａｂ等）である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、腫瘍抗原を認識するターゲティング分子をその表面上に発現する。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、治療用タンパク質（例えば第２の免疫調節剤、または免疫調節剤ではない治療用タンパク質、例えば化学療法抗体等）をコードする第２の異種核酸を含む。

一部の実施形態において、前記プロモーターは誘導物質によって誘導可能である。一部
の実施形態において、前記誘導物質は化合物等の小分子である。一部の実施形態において、前記小分子は、ドキシサイクリン、テトラサイクリン、アルコール、金属、またはステロイド類からなる群より選択される。化学的に誘導されるプロモーターが最も広範に研究されてきた。このようなプロモーターの例は、ドキシサイクリン、テトラサイクリン、アルコール、ステロイド類、金属、および他の化合物等の小分子化学物質の有無によって転写活性が調節されるプロモーターを含む。リバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子（reverse tetracycline-controlled transactivator）（ｒｔＴＡ）およびテトラサイクリン応答エレメントプロモーター（tetracycline-responsive element promoter）（ＴＲＥ）を用いたドキシサイクリン誘導系が、現在のところ最も成熟した系である。ＷＯ９４２９４４２は、テトラサイクリン応答性プロモーターによる真核細胞中の遺伝子発現の厳格な制御について記載している。ＷＯ９６０１３１３は、テトラサイクリンによって制御される転写モジュレーターを開示している。さらに、Ｔｅｔ−ｏｎ系などのＴｅｔ技術が、例えばＴｅｔＳｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍのウェブサイト上に記載されている。公知の化学的に制御される任意のプロモーターを用いて本出願の治療用タンパク質の発現を駆動してよい。

一部の実施形態において、前記誘導物質は、成長因子、ホルモン、または細胞表面受容体に対するリガンド、等のポリペプチドであり、その例は、腫瘍抗原に特異的に結合するポリペプチドを含む。一部の実施形態において、前記ポリペプチドは前記改変哺乳類細胞によって発現される。一部の実施形態において、前記ポリペプチドは前記異種核酸中の核酸によってコードされる。ポリペプチド誘導物質も多数のものが当該分野で公知であり、これらは本発明における使用に適したものである可能性がある。例えば、エクジソン受容体に基づいた遺伝子スイッチ、プロゲステロン受容体に基づいた遺伝子スイッチ、およびエストロゲン受容体に基づいた遺伝子スイッチは、ステロイド受容体に由来するトランス活性化因子を利用した遺伝子スイッチに属する（ＷＯ９６３７６０９およびＷＯ９７３８１１７等）。

一部の実施形態において、前記誘導物質は、小分子成分と１つまたは複数のポリペプチドとの両者を含む。例えば、ポリペプチドの二量体化に依存した誘導性プロモーターが当該分野で公知であり、本発明における使用に適したものである可能性がある。１９９３年に開発された最初の小分子ＣＩＤ系は、薬剤ＦＫ５０６の誘導体であるＦＫ１０１２を使用し、ＦＫＢＰのホモ二量体化を誘導した。同様の戦略を用いて、Wuらは、ラパログ（Rapalog）／ＦＫＰＢ−ＦＲＢ^＊およびジベレリン（Gibberelline）／ＧＩＤ１−ＧＡＩ二量体化依存遺伝子スイッチを使用し、ＯＮ−スイッチ様式で滴定可能なＣＡＲ−Ｔ細胞を作製することに成功した（C.-Y. Wu et al., Science 350, aab4077 (2015)）。他の二量体化依存スイッチ系の例は、クーママイシン（Coumermycin）／ＧｙｒＢ−ＧｙｒＢ（Nature 383 (6596): 178-81）およびＨａＸＳ／Ｓｎａｐ−ｔａｇ−ＨａｌｏＴａｇ（Chemistry and Biology 20 (4): 549-57）を含む。

一部の実施形態において、前記プロモーターは光誘導性プロモーターであり、誘導条件は光である。哺乳類細胞における遺伝子発現の調節のための光誘導性プロモーターも当該分野で周知である（例えば、Science 332, 1565-1568 (2011)；Nat. Methods 9, 266-269
(2012)；Nature 500: 472-476 (2013)；Nature Neuroscience 18:1202-1212 (2015)を参照のこと）。このような遺伝子調節系は、（１）ＤＮＡ結合、または（２）転写活性化ドメインのＤＮＡ結合タンパク質へのリクルート、の制御に基づき大きく２つのカテゴリーに分けることができる。例えば、青色光（４８０ｎｍ）に応答して細胞内カルシウムの増加を引き起こし、その結果ＮＦＡＴのカルシニューリン媒介動員が起こる、メラノプシンに基づいた合成哺乳類青色光制御転写系が開発され、哺乳類細胞において試験された。より最近、Motta-Menaらは、ヒト細胞株およびゼブラフィッシュ胚において転写開始の高レベルの青色光感受性制御を可能にする、天然ＥＬ２２２転写因子から開発された新規誘導
性遺伝子発現系を記載した（Nat. Chem. Biol. 10(3):196-202 (2014)）。さらに、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａの光受容体フィトクロムＢ（ＰｈｙＢ）とフィトクロム相互作用因子６（ＰＩＦ６）の赤色光誘導相互作用が、赤色光誘導型の遺伝子発現調節のために利用された。さらに、紫外線Ｂ（ＵＶＢ）誘導性遺伝子発現系も開発され、哺乳類細胞における標的遺伝子転写において有効であることが示された（Gene and Cell Therapy: Therapeutic Mechanisms and Strategies, Fourth Edition CRC Press, Jan. 20^th, 2015の第２５章）。本明細書に記載される任意の光誘導性プロモーターを用いて本発明の治療用タンパク質の発現を駆動してよい。

一部の実施形態において、前記プロモーターは、光誘導性分子と光との組み合わせによって誘導される光誘導性プロモーターである。例えば、化学誘導物質上の光切断性光ケージド基（light-cleavable photocaged group）は、該光ケージド基が照射または他の手段によって除去されない限り、該誘導物質を不活性に保つ。このような光誘導性分子の例は、小分子化合物、オリゴヌクレオチド、およびタンパク質を含む。例えば、ケージドエクジソン、ｌａｃオペロンと共に使用するためのケージドＩＰＴＧ、リボザイム媒介性遺伝子発現のためのケージドトヨカマイシン、Ｔｅｔ−ｏｎ系と共に使用するためのケージドドキシサイクリン、および光媒介性ＦＫＢＰ／ＦＲＢ二量体化のためのケージドラパログ（Rapalog）が開発されている（例えば、Curr Opin Chem Biol. 16(3-4): 292-299 (2012)を参照のこと）。

一部の実施形態において、前記プロモーターは放射線誘導性プロモーターであり、誘導条件は電離放射線等の放射線である。放射線誘導性プロモーターによる導入遺伝子発現の制御も当該分野で公知である。遺伝子発現の改変が細胞への照射によって起こる。例えば、「前初期遺伝子」として知られる一群の遺伝子は、電離放射の際に即座に反応することができる。前初期遺伝子の例は、Ｅｒｇ−１、ｐ２１／ＷＡＦ−１、ＧＡＤＤ４５アルファ、ｔ−ＰＡ、ｃ−Ｆｏｓ、ｃ−Ｊｕｎ、ＮＦ−カッパＢ、およびＡＰ１を含むが、これらに限定されない。これらの前初期遺伝子はプロモーター領域に放射線応答性配列を有する。Ｅｒｇ−１プロモーターにはコンセンサス配列が見出されており、血清応答エレメントと呼ばれるか、またはＣＡｒＧエレメントとして知られる。放射線誘導性プロモーターと導入遺伝子との組み合わせは広く研究されており、治療上の利益を有効にもたらすことが示されている。例えば、Cancer Biol Ther. 6(7):1005-12 (2007)、およびGene and Cell Therapy: Therapeutic Mechanisms and Strategies, Fourth Edition CRC Press, Jan. 20^th, 2015の第２５章を参照のこと。任意の前初期遺伝子プロモーター、または血清応答エレメントもしくはＣＡｒＧエレメントを含む任意のプロモーターが、本発明の治療用タンパク質の発現を駆動する放射線誘導性プロモーターとして有用な可能性がある。

一部の実施形態において、前記プロモーターは熱誘導性プロモーターであり、誘導条件は熱である。導入遺伝子の発現を駆動する熱誘導性プロモーターも、当該分野において広く研究されてきた。Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ４０、およびＨｓｐ１０等の熱ショックまたはストレスタンパク質（ＨＳＰ）は、熱または他の物理的および化学的ストレスのもとで細胞を保護する重要な役割を担う。熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）プロモーター、ならびに増殖停止およびＤＮＡ損傷（growth arrest and DNA damage）（ＧＡＤＤ）１５３プロモーター、等のいくつかの熱誘導性プロモーターが、前臨床試験において試みられてきた。１９８５年に初めて記載されたヒトｈｓｐ７０Ｂ遺伝子のプロモーターは、最も高効率な熱誘導性プロモーターの１つのようである。Huangらは、ｈｓｐ７０Ｂ−ＥＧＦＰ、ｈｓｐ７０Ｂ−ＴＮＦアルファ、およびｈｓｐ７０Ｂ−ＩＬ１２のコード配列の導入後、腫瘍細胞が熱処理した際に極めて高い導入遺伝子発現を示す一方で、熱処理を行わなかった場合、導入遺伝子の発現は検出されなかったことを報告した。そして、ｉｎｖｉｖｏにおいて、マウスのＩＬ１２導入遺伝子＋熱処理群で腫瘍増殖が有意に遅延した（Cancer Res. 60:3435 (2000)）。科学者の別のグループは、ＨＳＶ−ｔｋ
自殺遺伝子をｈｓｐ７０Ｂプロモーターに連結し、マウス乳癌を有するヌードマウスでこの系を試験した。ｈｓｐ７０Ｂ−ＨＳＶｔｋコード配列を腫瘍に投与し、熱処理したマウスは、熱処理を行わなかった対照と比較して、腫瘍の退縮と有意な生存率の向上を示した（Hum. Gene Ther. 11:2453 (2000)）。当該分野で公知のさらなる熱誘導性プロモーターを、例えばGene and Cell Therapy: Therapeutic Mechanisms and Strategies, Fourth Edition CRC Press, Jan. 20^th, 2015の第２５章に見出すことができる。本明細書に議論される任意の熱誘導性プロモーターを用いて本発明の治療用タンパク質の発現を駆動してよい。

一部の実施形態において、前記プロモーターは酸化還元状態によって誘導可能である。酸化還元状態によって誘導可能なプロモーターの例は、誘導性プロモーターおよび低酸素誘導性プロモーターを含む。例えば、Post DEらは、ＨＩＦ活性化腫瘍細胞における導入遺伝子の発現を特異的かつ強力に誘導する、低酸素誘導性因子（ＨＩＦ）応答性プロモーターを開発した（Gene Ther. 8: 1801-1807 (2001);Cancer Res. 67: 6872-6881 (2007)）。

一部の実施形態において、前記プロモーターは、前記改変哺乳類細胞の内在性活性化シグナル等の生理学的状態によって誘導可能である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞がＴ細胞である場合、前記プロモーターは、該改変哺乳類細胞の内在性活性化シグナルによって誘導可能なＴ細胞活性化依存プロモーターである。一部の実施形態において、前記改変Ｔ細胞は、ＰＭＡ、イオノマイシン（ionomycin）、またはフィトヘマグルチニン等の誘導物質によって活性化される。一部の実施形態において、前記改変Ｔ細胞は、内在性Ｔ細胞受容体または改変受容体（組換えＴＣＲまたはＣＡＲ等）を介した腫瘍細胞上の腫瘍抗原の認識によって活性化される。一部の実施形態において、前記改変Ｔ細胞は、免疫チェックポイントの遮断により、例えば該改変Ｔ細胞または第２の改変哺乳類細胞によって発現される免疫調節剤により、活性化される。一部の実施形態において、前記Ｔ細胞活性化依存プロモーターはＩＬ−２プロモーターである。一部の実施形態において、前記Ｔ細胞活性化依存プロモーターはＮＦＡＴプロモーターである。一部の実施形態において、前記Ｔ細胞活性化依存プロモーターはＮＦκＢプロモーターである。

どのような理論または仮説にも拘束されるものではないが、ＩＬ−２プロモーターからの遺伝子転写によって開始されるＩＬ−２発現はＴ細胞活性化の主要な活動である。ホルボール１２−ミリスチン酸１３−アセテート（ＰＭＡ）、またはイオノマイシン、またはフィトヘマグルチニンによるヒトＴ細胞の非特異的刺激の結果、刺激されたＴ細胞からのＩＬ−２分泌が起こる。遺伝子操作されたＴ細胞における活性化誘導性導入遺伝子発現のため、ＩＬ−２プロモーターが研究された（Virology Journal 3:97 (2006)）。本願発明者らは、ヒトＴ細胞株において、ＩＬ−２プロモーターが、ＰＭＡ／ＰＨＡ−Ｐによる活性化の存在下で、レポーター遺伝子の発現を開始するのに有効であることを見出した。Ｔ細胞受容体刺激は細胞内応答のカスケードを開始し、細胞質カルシウム濃度を上昇させ、その結果ＮＦＡＴおよびＮＦκＢの両者の核翻訳（nuclear translation）を引き起こす。活性化Ｔ細胞核内因子（Nuclear Factor of Activated T cells）（ＮＦＡＴ）のメンバーは、Ｔリンパ球の免疫応答を媒介するＣａ^２＋依存性転写因子である。ＮＦＡＴは、活性化Ｔ細胞内の誘導性インターロイキン−２（ＩＬ−２）発現にとって重要であることが示されている（Mol Cell Biol. 15(11):6299-310 (1995)；Nature Reviews Immunology
5:472-484 (2005)）。本願発明者らは、ヒトＴ細胞株において、ＮＦＡＴプロモーターが、ＰＭＡ／ＰＨＡ−Ｐ活性化の存在下でレポーター遺伝子の発現を開始するのに有効であることを見出した。核内因子カッパＢ（ＮＦκＢ）を含む他の経路も、Ｔ細胞活性化を介した導入遺伝子発現の制御に用いることができる。

ＣＡＲまたはＴＣＲ
上記改変哺乳類細胞のいずれも、細胞表面分子をさらに発現してよい。該細胞表面分子は細胞外ドメインと膜貫通ドメインとを有する。一部の実施形態において、前記細胞表面分子は、さらに、一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび／または共刺激シグナル伝達ドメイン等の、細胞内エフェクタードメインを有する。一部の実施形態において、前記細胞表面分子は内在性分子である。一部の実施形態において、前記細胞表面分子は異種分子である。一部の実施形態において、前記細胞表面分子は改変分子である。一部の実施形態において、前記細胞表面分子は前記改変哺乳類細胞の異種核酸によってコードされる。一部の実施形態において、前記細胞表面分子は、プロモーター（構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター等）に機能的に連結した第２の異種核酸によってコードされる。一部の実施形態において、前記細胞表面分子は、細胞をＣＥＬＬＳＱＵＥＥＺＥ（登録商標）等のマイクロ流体システムに通過させながらタンパク質を細胞膜に挿入することによって、前記改変哺乳類細胞に導入される（例えば、米国特許出願公開第２０１４０２８７５０９号を参照のこと）。前記細胞表面分子は、例えば該改変哺乳類細胞をターゲティングすることにより、シグナルを変換することにより、および／または該改変哺乳類細胞の細胞毒性を増強することにより、前記改変哺乳類細胞の機能を増強するものであってよい。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、ＣＡＲまたはＴＣＲ等の細胞表面分子を発現しない。

一部の実施形態において、前記細胞表面分子は、前記改変哺乳類細胞を腫瘍細胞に対してターゲティングする。一部の実施形態において、前記細胞表面分子は、腫瘍細胞の細胞表面受容体のリガンドである。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、腫瘍抗原を認識するターゲティング分子をその表面上に発現する。一部の実施形態において、前記ターゲティング分子は、腫瘍抗原に対する抗体断片（ｓｃＦｖまたは単一ドメイン抗体等）を有する。腫瘍抗原の例は、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＶＥＧＦＲ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ等）、ＧＤ２、ＨＥＲ２、ＩＧＦ１Ｒ、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＷＴ１、および臨床的に重要な他の腫瘍抗原を含む。一部の実施形態において、前記細胞表面分子は、前記改変哺乳類細胞を、腫瘍細胞にリクルートされた免疫細胞等の腫瘍細胞の微小環境に対してターゲティングする。

一部の実施形態において、前記細胞表面分子はキメラエフェクター分子である。一部の実施形態において、前記キメラエフェクター分子は、少なくとも１つの腫瘍抗原を標的とする１つまたは複数の特異的結合ドメインと、１つまたは複数の細胞内エフェクタードメイン、例えば１つまたは複数の一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび／または共刺激シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態において、前記細胞表面分子はＣＡＲまたはＴＣＲではない。

一部の実施形態において、前記細胞表面分子はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。本発明のＣＡＲは、少なくとも１つの腫瘍抗原に特異的に結合する少なくとも１つのターゲティングドメインを含んだ細胞外ドメインと、膜貫通（ＴＭ）ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。一部の実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲ−Ｔ細胞等のＣＡＲ含有細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成する。「免疫エフェクター機能または免疫エフェクター応答」とは、標的細胞の免疫攻撃を増強または促進する、免疫エフェクター細胞等による機能または応答のことを表す。例えば、免疫エフェクター機能または応答とは、標的細胞の死滅、または成長もしくは増殖の阻害、を促進するＴまたはＮＫ細胞の特性のことを表しうる。免疫エフェクター機能の例は、例えばＣＡＲ−Ｔ細胞においては、細胞溶解活性（抗体依存性細胞障害、すなわちＡＤＣＣ等）およびヘルパー活性（サイトカイン類の分泌等）を含む。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、免疫エフェクター機能が無効化または減弱化した細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、全長の野生型ＣＤ３ζお
よび任意に１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインを有するＣＡＲと比べ、約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、またはそれ未満、のいずれかの免疫エフェクター機能（標的細胞に対する細胞溶解機能等）しか有しない細胞内シグナル伝達ドメインを有する。一部の実施形態において、前記ＣＡＲ単独では標的細胞の細胞溶解を誘発しない。一部の実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲ含有細胞の増殖および／または生存を促進するシグナルを生成する。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、ＣＤ−２８、ＣＤ１３７、ＣＤ３、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、およびＯＸ４０のシグナル伝達ドメインから選択される１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。天然に存在する分子のシグナル伝達ドメインは、該分子の細胞内（すなわち細胞質）部分全体もしくは天然の細胞内シグナル伝達ドメイン全体、またはその断片もしくは誘導体を含みうる。

一部の実施形態において、前記ＣＡＲのターゲティングドメインは、抗体；あるいは、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）_２、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ＶＨもしくはＶＬドメイン、またはＶ_ＨＨドメイン、等の抗体断片である。一部の実施形態において、前記ＣＡＲの１つまたは複数のターゲティングドメインは、特異的に単一の腫瘍抗原に結合する。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、２つ以上の腫瘍抗原に結合するターゲティングドメインを有する二重特異性または多重特異性ＣＡＲである。一部の実施形態において、前記腫瘍抗原は、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＶＥＧＦＲ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ等）、ＧＤ２、ＨＥＲ２、ＩＧＦ１Ｒ、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＷＴ１、および臨床的に重要な他の腫瘍抗原、ならびにこれらの組み合わせ、からなる群より選択される。

一部の実施形態において、前記ＣＡＲの膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ、またはゼータ鎖、ＣＤ−２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦｌ）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ−２Ｒベータ、ＩＬ−２Ｒガンマ、ＩＬ−７Ｒａ、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤＩＯＯ（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、および／またはＮＫＧ２Ｃの膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態において、前記ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ８α、またはＣＤ−２８膜貫通ドメインである。一部の実施形態において、前記ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８αの膜貫通ドメインを含む。

一部の実施形態において、前記ターゲティングドメインは、ヒンジ領域によって膜貫通ドメインに接続される。一実施形態において、該ヒンジ領域はＣＤ８αのヒンジ領域を含む。

一部の実施形態において、前記ＣＡＲはＣＤ８α ＳＰ等のシグナルペプチド（ＳＰ）を含む。

一部の実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。「一次細胞内シグナル伝達ドメイン」とは、刺激性の様式で作用して免疫エフェクター機能を誘導する、細胞質シグナル伝達配列のことを表す。一部の実施形態において、前記一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based activation motif）、すなわちＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含む。一部の実施形態において、前記一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、コモンＦｃＲガンマ（common FcR gamma）（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃＲベータ（ＦｃイプシロンＲｉｂ）、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＦｃガンマＲＩＩａ、ＤＡＰ１０、およびＤＡＰ１２からなる群より選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態において、前記一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、コモンＦｃＲガンマ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃＲベータ（ＦｃイプシロンＲｉｂ）、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＦｃガンマＲＩＩａ、ＤＡＰ１０、およびＤＡＰ１２からなる群より選択されるタンパク質の非機能的または減弱化シグナル伝達ドメインを含む。該非機能的または減弱化シグナル伝達ドメインは、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）を含む細胞溶解活性またはヘルパー活性等の、１つまたは複数の免疫エフェクター機能を減弱化または無効化する、点突然変異、挿入、または欠失を有する変異シグナル伝達ドメインでありうる。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、非機能的または減弱化ＣＤ３ゼータ（すなわちＣＤ３ζまたはＣＤ３ｚ）シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。本明細書において、一次細胞内シグナル伝達ドメインを有しない、または非機能的もしくは減弱化一次細胞内シグナル伝達ドメインを有するＣＡＲを、「短縮型ＣＡＲ」という。野生型一次細胞内シグナル伝達ドメインを有する以外は同一の構成を持つＣＡＲと比べ、減弱化した一次細胞内シグナル伝達ドメインは、約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、またはそれ未満、のいずれかの免疫エフェクター機能（標的細胞に対する細胞溶解機能等）しか誘導しないものであってよい。短縮型ＣＡＲを発現する改変細胞単独で標的細胞の細胞溶解を誘導することができなくともよい。短縮型ＣＡＲを有する改変細胞は、ｏｎ−ｔａｒｇｅｔｏｆｆ−ｃａｎｃｅｒ毒性等の毒性および副作用が減少したものであってよい。

一部の実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは１つまたは複数（例えば１個、２個、もしくは３個のいずれか、またはそれ以上）の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。「共刺激シグナル伝達ドメイン」は共刺激分子の細胞内部分でありうる。「共刺激分子」という語は、共刺激リガンドに特異的に結合し、増殖および生存等であるが限定されない免疫細胞による共刺激応答を媒介する、該免疫細胞（Ｔ細胞等）上の同族の（cognate）結合パートナーのことを表す。共刺激分子は、効率的な免疫応答に貢献する、抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激分子の代表的なタンパク質ファミリーは次の通りである：ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（signaling lymphocytic activation molecules）（ＳＬＡＭタンパク質）、および活性化ＮＫ細胞受容体（activating NK cell receptors）。共刺激分子の例は、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡ、およびＴｏｌｌリガンド受容体、ならびにＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ−２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）を含むが、これらに限定されない。このような共刺激分子のさらなる例は、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ−２Ｒベータ
、ＩＬ−２Ｒガンマ、ＩＬ−７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡｌ、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬｌ、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦｌ、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、およびＣＤ１９ａ；ならびに、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンドを含む。

一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、単一の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、２つまたはそれ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、機能的一次細胞内シグナル伝達ドメインと、１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインとを含む。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、短縮型ＣＡＲである。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、機能的一次細胞内シグナル伝達ドメイン（ＣＤ３ζ等）を含まない。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインからなる、または本質的になる、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、非機能的または減弱化一次細胞内シグナル伝達ドメイン（変異ＣＤ３ζ等）と、１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインと、からなる、または本質的になる、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。前記ＣＡＲの共刺激シグナル伝達ドメインは、前記ターゲティングドメインの腫瘍抗原への結合の際、該ＣＡＲを有する改変細胞（Ｔ細胞等）の、強化された増殖、生存、および分化のためのシグナルを伝達し、活性化誘導細胞死（activation induced cell death）を阻害するものであってよい。一部の実施形態において、前記共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ−２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（lymphocyte function-associated antigen-1）（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ−２Ｒベータ、ＩＬ−２Ｒガンマ、ＩＬ−７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、またはＮＫＧ２Ｄの１つまたは複数から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む。

一部の実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３７の細胞質ドメイン等のＣＤ１３７の機能的シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータの機能的一次シグナル伝達ドメインと
、ＣＤ１３７の機能的シグナル伝達ドメインとを含む。一部の実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータの非機能的または減弱化一次シグナル伝達ドメインと、ＣＤ１３７の機能的シグナル伝達ドメインとを含む。一部の実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３７の機能的シグナル伝達ドメインからなる、または本質的になる。

一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、ＣＤ８α ＳＰ、腫瘍抗原（ＥＧＦＲｖＩＩＩなどのＥＧＦＲ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、またはＢＣＭＡ等）に特異的に結合するターゲティングドメイン、ＣＤ８αヒンジおよび膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７細胞質ドメイン、ならびにＣＤ３ζを含む。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、ＣＤ８α ＳＰ、腫瘍抗原（ＥＧＦＲｖＩＩＩなどのＥＧＦＲ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、またはＢＣＭＡ等）に特異的に結合するターゲティングドメイン、ＣＤ８αヒンジおよび膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ１３７細胞質ドメインを含む。

当該分野では多数のキメラ抗原受容体が公知であり、本発明の改変哺乳類細胞にとって適したものである可能性がある。ＣＡＲはまた、抗体分子等の抗原結合断片または抗体可変領域を利用することにより、任意の細胞表面マーカーに対する特異性を有するように構築されうる。本明細書においては、ＣＡＲを製造するための任意の方法を使用してよい。例えば、米国特許第６，４１０，３１９号、米国特許第７，４４６，１９１号、米国特許第７，５１４，５３７号、ＷＯ２００２／０７７０２９、ＷＯ２０１５／１４２６７５、ＵＳ２０１０／０６５８１８、ＵＳ２０１０／０２５１７７、ＵＳ２００７／０５９２９８、およびBerger C. et al., J. Clinical Investigation 118: 1 294-308 (2008)を参照のこと（これらは参照により本明細書に組み込まれるものとする）。一部の実施形態において、前記改変哺乳類免疫細胞はＣＡＲ−Ｔ細胞である。

従って、一部の実施形態において、ａ）免疫調節剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類（ヒト等）免疫細胞であって、前記異種核酸がプロモーターに機能的に連結し、前記改変哺乳類免疫細胞がさらにＣＡＲを発現する、改変哺乳類免疫細胞；およびｂ）薬理学的に許容される賦形剤、を含む医薬組成物が提供される。一部の実施形態において、前記改変哺乳類免疫細胞はＰＢＭＣ、Ｔ細胞、またはＮＫ細胞である。一部の実施形態において、前記プロモーターは、例えばＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメイン等による、誘導性である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫チェックポイント阻害剤（ＣＴＬＡ−４の阻害剤またはＰＤ−１の阻害剤等）である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫賦活剤である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は分泌タンパク質である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は抗体（全長抗体、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、重鎖のみ抗体、またはＦａｂ等）である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、治療用タンパク質（第２の免疫調節剤、例えば免疫賦活剤；または、免疫調節剤ではない治療用タンパク質、例えば化学療法抗体等）をコードする第２の異種核酸を含む。一部の実施形態において、前記免疫賦活剤はＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−１２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ２ｂ、ヘパラナーゼ、ＣＤ１３７Ｌ、ＬＥＭ、およびＢｃｌ−２からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、第２のプロモーターに機能的に連結した第３の異種核酸によってコードされる。一部の実施形態において、前記第２のプロモーターは構成的プロモーターである。一部の実施形態において、前記第２のプロモーターは、例えば、誘導物質（例えばテトラサイクリンまたはドキシサイクリンなどの小分子等）、照射、温度、酸化還元状態、腫瘍環境、および前記改変哺乳類免疫細胞の活性化状態、から選択される誘導条件によって誘導可能である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤（免疫チェックポイント阻害剤等）をコードする異種核酸と前記ＣＡＲをコードする異種核酸とは、ｈＥＦ１αなどの構成的プロモーター等の、同一のプロモーターに機能的に連結する。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、Ｃ
ＥＡ、ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ等）、ＧＤ２、ＨＥＲ２、ＩＧＦ１Ｒ、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、およびＷＴ１からなる群より選択される腫瘍抗原を標的とする。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、前記改変哺乳類免疫細胞が腫瘍細胞に結合した際に、および該改変哺乳類免疫細胞による免疫調節剤の分泌の際に、免疫細胞（該改変哺乳類免疫細胞を含む）の細胞溶解機能、サイトカイン分泌、および／または増殖を引き起こす。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、免疫エフェクター機能が無効化または減弱化した細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、短縮型ＣＡＲである。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、一次細胞内シグナル伝達ドメイン（ＣＤ３ζ等）を含まない。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、非機能的な、または減弱化した一次細胞内シグナル伝達ドメイン（変異ＣＤ３ζ等）を含む。一部の実施形態において、前記ＣＡＲ単独では標的細胞の細胞溶解を誘発しない。

一部の実施形態において、ａ）免疫調節剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類（ヒト等）ＣＡＲ−Ｔ細胞であって、前記異種核酸がプロモーターに機能的に連結した、改変哺乳類ＣＡＲ−Ｔ細胞；およびｂ）薬理学的に許容される賦形剤、を含む医薬組成物が提供される。一部の実施形態において、前記プロモーターは、例えばＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメイン等によって、誘導可能である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫チェックポイント阻害剤（ＣＴＬＡ−４の阻害剤またはＰＤ−１の阻害剤等）である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫賦活剤である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は分泌タンパク質である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は抗体（全長抗体、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、重鎖のみ抗体、またはＦａｂ等）である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、治療用タンパク質（第２の免疫調節剤、例えば免疫賦活剤；または、免疫調節剤ではない治療用タンパク質、例えば化学療法抗体等）をコードする第２の異種核酸を含む。一部の実施形態において、前記免疫賦活剤はＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−１２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ２ｂ、ヘパラナーゼ、ＣＤ１３７Ｌ、ＬＥＭ、およびＢｃｌ−２からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、第２のプロモーターに機能的に連結した第３の異種核酸によってコードされる。一部の実施形態において、前記第２のプロモーターは構成的プロモーターである。一部の実施形態において、前記第２のプロモーターは、例えば、誘導物質（例えばテトラサイクリンまたはドキシサイクリンなどの小分子等）、照射、温度、酸化還元状態、腫瘍環境、および前記改変哺乳類ＣＡＲ−Ｔ細胞の活性化状態、から選択される誘導条件によって誘導可能である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤（免疫チェックポイント阻害剤等）をコードする異種核酸と前記ＣＡＲをコードする異種核酸とは、ｈＥＦ１αなどの構成的プロモーター等の、同一のプロモーターに機能的に連結する。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＶＥＧＦＲ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ等）、ＧＤ２、ＨＥＲ２、ＩＧＦ１Ｒ、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、およびＷＴ１からなる群より選択される腫瘍抗原を標的とする。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、前記改変哺乳類ＣＡＲ−Ｔ細胞が腫瘍細胞に結合した際に、および該改変哺乳類ＣＡＲ−Ｔ細胞による免疫調節剤の分泌の際に、免疫細胞（例えば該改変哺乳類ＣＡＲ−Ｔ細胞）の細胞溶解機能、サイトカイン分泌、および／または増殖を引き起こす。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、免疫エフェクター機能が無効化または減弱化した細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは短縮型ＣＡＲである。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは一次細胞内シグナル伝達ドメイン（ＣＤ３ζ等）を含まない。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、非機能的な、または減弱化した一次細胞内シグナル伝達ドメイン（変異ＣＤ３ζ等）を含む。一部の実施形態において、前記ＣＡＲ単独では標的細胞の細胞溶解を誘発しない。

一部の実施形態において、前記細胞表面分子はＴ細胞受容体である。一部の実施形態に
おいて、前記改変哺乳類細胞がＴ細胞である場合、該Ｔ細胞受容体は内在性Ｔ細胞受容体である。一部の実施形態において、前記ＴＣＲを有する改変哺乳類細胞は前選択される（pre-selected）。一部の実施形態において、前記Ｔ細胞受容体は組換えＴＣＲである。一部の実施形態において、前記ＴＣＲは腫瘍抗原に対して特異的である。一部の実施形態において、前記腫瘍抗原は、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＶＥＧＦＲ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＶＥＧＦＲ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ等）、ＧＤ２、ＨＥＲ２、ＩＧＦ１Ｒ、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＷＴ１、および臨床的に重要な他の腫瘍抗原からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記腫瘍抗原は腫瘍細胞の細胞内タンパク質に由来する。腫瘍抗原（腫瘍関連抗原を含む）に対して特異的なＴＣＲは多数記載されており、それらの例は、ＮＹ−ＥＳＯ−１癌精巣抗原、ｐ５３腫瘍抑制抗原、ならびに、メラノーマ（ＭＡＲＴＩ、ｇｐ１００等）、白血病（ＷＴ１、副組織適合抗原等）、および乳癌（ＨＥＲ２、ＮＹ−ＢＲ１等）の腫瘍抗原に対するＴＣＲを含む。本出願においては、当該分野で公知の任意のＴＣＲを用いてよい。一部の実施形態において、前記ＴＣＲは腫瘍抗原に対して増強された親和性を有する。ＴＣＲの例、および該ＴＣＲを哺乳類細胞に導入する方法は、例えば、米国特許第５８３０７５５号およびKessels et al. Immunotherapy
through TCR gene transfer. Nat. Immunol. 2, 957-961 (2001)に記載されている。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞はＴＣＲ−Ｔ細胞である。

従って、一部の実施形態において、ａ）免疫調節剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類（ヒト等）免疫細胞であって、前記異種核酸がプロモーターに機能的に連結し、前記改変哺乳類免疫細胞がさらにＴＣＲを発現する、改変哺乳類免疫細胞；およびｂ）薬理学的に許容される賦形剤、を含む医薬組成物が提供される。一部の実施形態において、前記改変哺乳類免疫細胞はＰＢＭＣまたはＴ細胞である。一部の実施形態において、前記プロモーターは、例えばＴＣＲの細胞内シグナル伝達ドメイン等によって、誘導可能である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫チェックポイント阻害剤（ＣＴＬＡ−４の阻害剤またはＰＤ−１の阻害剤等）である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫賦活剤である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は分泌タンパク質である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は抗体（全長抗体、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、重鎖のみ抗体、またはＦａｂ等）である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類免疫細胞は、さらに、治療用タンパク質（第２の免疫調節剤、例えば免疫賦活剤；または、免疫調節剤ではない治療用タンパク質、例えば化学療法抗体等）をコードする第２の異種核酸を含む。一部の実施形態において、前記免疫賦活剤はＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−１２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ２ｂ、ヘパラナーゼ、ＣＤ１３７Ｌ、ＬＥＭ、およびＢｃｌ−２からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記ＴＣＲは、第２のプロモーターに機能的に連結した第３の異種核酸によってコードされる。一部の実施形態において、前記第２のプロモーターは構成的プロモーターである。一部の実施形態において、前記第２のプロモーターは、例えば、誘導物質（例えばテトラサイクリンまたはドキシサイクリンなどの小分子等）、照射、温度、酸化還元状態、腫瘍環境、および前記改変哺乳類免疫細胞の活性化状態、から選択される誘導条件によって誘導可能である。一部の実施形態において、前記ＴＣＲは、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＶＥＧＦＲ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ等）、ＧＤ２、ＨＥＲ２、ＩＧＦ１Ｒ、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、およびＷＴ１からなる群より選択される腫瘍抗原を標的とする。一部の実施形態において、前記ＴＣＲは、前記改変哺乳類免疫細胞が腫瘍細胞に結合した際に、および該改変哺乳類免疫細胞による免疫調節剤の分泌の際に、免疫細胞（例えば該改変哺乳類免疫細胞）の細胞溶解機能、サイトカイン分泌、および／または増殖を引き起こす。一部の実施形態において、前記ＴＣＲは免疫エフェクター機能が無効化または減弱化した細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態において、前記ＣＡＲ単独では標的細胞の細胞溶解を誘発しない。

一部の実施形態において、ａ）免疫調節剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類（ヒト等）ＴＣＲ−Ｔ細胞であって、前記異種核酸がプロモーターに機能的に連結した、改変哺乳類ＴＣＲ−Ｔ細胞；およびｂ）薬理学的に許容される賦形剤、を含む医薬組成物が提供される。一部の実施形態において、前記プロモーターは、例えばＴＣＲの細胞内シグナル伝達ドメイン等によって、誘導可能である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫チェックポイント阻害剤（ＣＴＬＡ−４の阻害剤またはＰＤ−１の阻害剤等）である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫賦活剤である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は分泌タンパク質である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は抗体（全長抗体、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、重鎖のみ抗体、またはＦａｂ等）である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類ＴＣＲ−Ｔ細胞は、さらに、治療用タンパク質（第２の免疫調節剤、例えば免疫賦活剤；または、免疫調節剤ではない治療用タンパク質、例えば化学療法抗体等）をコードする第２の異種核酸を含む。一部の実施形態において、前記免疫賦活剤はＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−１２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ２ｂ、ヘパラナーゼ、ＣＤ１３７Ｌ、ＬＥＭ、およびＢｃｌ−２からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記ＴＣＲは、第２のプロモーターに機能的に連結した第３の異種核酸によってコードされる。一部の実施形態において、前記第２のプロモーターは構成的プロモーターである。一部の実施形態において、前記第２のプロモーターは、例えば、誘導物質（例えばテトラサイクリンまたはドキシサイクリンなどの小分子等）、照射、温度、酸化還元状態、腫瘍環境、および前記改変哺乳類ＴＣＲ−Ｔ細胞の活性化状態、から選択される誘導条件によって誘導可能である。一部の実施形態において、前記ＴＣＲは、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＶＥＧＦＲ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ等）、ＧＤ２、ＨＥＲ２、ＩＧＦ１Ｒ、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、およびＷＴ１からなる群より選択される腫瘍抗原を標的とする。一部の実施形態において、前記ＴＣＲは、前記改変哺乳類ＴＣＲ−Ｔ細胞が腫瘍細胞に結合した際に、および該改変哺乳類ＴＣＲ−Ｔ細胞による免疫調節剤の分泌の際に、免疫細胞（例えば該改変哺乳類ＴＣＲ−Ｔ細胞）の細胞溶解機能、サイトカイン分泌、および／または増殖を引き起こす。一部の実施形態において、前記ＴＣＲは免疫エフェクター機能が無効化または減弱化した細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態において、前記ＴＣＲ単独では標的細胞の細胞溶解を誘発しない。

一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらにＣＡＲおよび組換えＴＣＲの両者を発現する。

一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらにＣＡＲまたはＴＣＲを発現し、前記免疫調節剤のためのプロモーターは該ＣＡＲまたは該ＴＣＲの細胞内シグナル伝達ドメインによって誘導可能である。一部の実施形態において、前記プロモーターはＴ細胞活性化依存プロモーターである。例えば、本発明の改変ＣＡＲ−ＴまたはＴＣＲ−Ｔ細胞は、腫瘍細胞上の腫瘍抗原への結合の際、該ＣＡＲまたはＴＣＲの細胞内シグナル伝達ドメインを介した活性化シグナルの伝達を行ってよい。該活性化シグナルは、次いで免疫チェックポイント阻害剤をコードする核酸に機能的に連結したプロモーターを誘導し、腫瘍部位において該改変ＣＡＲ−ＴまたはＴＣＲ−Ｔ細胞による該免疫チェックポイント阻害剤の分泌を増加させるものであってよい。免疫チェックポイントの遮断によって、さらに該ＣＡＲ−ＴおよびＴＣＲ−Ｔ細胞が活性化され、腫瘍細胞に対するそれらの細胞毒性が増強され、同時に該ＣＡＲ−ＴおよびＴＣＲ−Ｔ細胞の増殖が誘導され、ケモカインおよびサイトカインの放出が刺激され、それによってさらに内在性Ｔ細胞と他の免疫細胞が前記腫瘍部位にリクルートされる。結果として、前記改変Ｔ細胞のＣＡＲまたはＴＣＲと、前記免疫チェックポイント阻害剤をコードする異種遺伝子が、前記腫瘍部位における局所免疫応答を増強することのできる正のフィードバックループを形成する。ＣＡＲ誘導性プ
ロモーターに機能的に連結した免疫チェックポイント阻害剤をコードする異種核酸と、構成的プロモーターに機能的に連結したＣＡＲをコードする第２の異種核酸と、を含む改変哺乳類細胞であって、該免疫チェックポイント阻害剤が、腫瘍細胞上に発現した抑制性免疫チェックポイント分子を遮断する、改変哺乳類細胞の例を、図５に示す。ＣＡＲ誘導性プロモーターに機能的に連結した免疫チェックポイント阻害剤をコードする異種核酸と、構成的プロモーターに機能的に連結したＣＡＲをコードする第２の異種核酸を含む改変哺乳類細胞であって、該免疫チェックポイント阻害剤が、該改変哺乳類細胞および非改変免疫細胞上に発現した抑制性免疫チェックポイント分子を遮断する、改変哺乳類細胞の例を、図６に示す。

従って、一部の実施形態において、ａ）免疫調節剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類（ヒト等）ＣＡＲ−Ｔ細胞であって、前記異種核酸がＴ細胞活性化依存プロモーターに機能的に連結した、改変哺乳類ＣＡＲ−Ｔ細胞；およびｂ）薬理学的に許容される賦形剤、を含む医薬組成物が提供される。一部の実施形態において、前記Ｔ細胞活性化依存プロモーターは、ＩＬ−２プロモーター、ＮＦＡＴプロモーター、およびＮＦκＢプロモーターから選択される。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫チェックポイント阻害剤（ＣＴＬＡ−４の阻害剤またはＰＤ−１の阻害剤等）である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫賦活剤である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は分泌タンパク質である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は抗体（全長抗体、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、重鎖のみ抗体、またはＦａｂ等）である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類ＣＡＲ−Ｔ細胞は、さらに、治療用タンパク質（第２の免疫調節剤、例えば免疫賦活剤；または、免疫調節剤ではない治療用タンパク質、例えば化学療法抗体等）をコードする第２の異種核酸を含む。一部の実施形態において、前記免疫賦活剤はＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−１２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ２ｂ、ヘパラナーゼ、ＣＤ１３７Ｌ、ＬＥＭ、およびＢｃｌ−２からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、第２のプロモーターに機能的に連結した第３の異種核酸によってコードされる。一部の実施形態において、前記第２のプロモーターは構成的プロモーターである。一部の実施形態において、前記第２のプロモーターは、例えば、誘導物質（例えばテトラサイクリンまたはドキシサイクリンなどの小分子等）、照射、温度、酸化還元状態、腫瘍環境、および前記改変哺乳類ＣＡＲ−Ｔ細胞の活性化状態、から選択される誘導条件によって誘導可能である。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＶＥＧＦＲ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ等）、ＧＤ２、ＨＥＲ２、ＩＧＦ１Ｒ、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、およびＷＴ１からなる群より選択される腫瘍抗原を標的とする。

一部の実施形態において、ａ）免疫調節剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類（ヒト等）ＴＣＲ−Ｔ細胞であって、前記異種核酸がＴ細胞活性化依存プロモーターに機能的に連結した、改変哺乳類ＴＣＲ−Ｔ細胞；およびｂ）薬理学的に許容される賦形剤、を含む医薬組成物が提供される。一部の実施形態において、前記Ｔ細胞活性化依存プロモーターは、ＩＬ−２プロモーター、ＮＦＡＴプロモーター、およびＮＦκＢプロモーターから選択される。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫チェックポイント阻害剤（ＣＴＬＡ−４の阻害剤またはＰＤ−１の阻害剤等）である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫賦活剤である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は分泌タンパク質である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は抗体（全長抗体、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、重鎖のみ抗体、またはＦａｂ等）である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類ＴＣＲ−Ｔ細胞は、さらに、治療用タンパク質（第２の免疫調節剤、例えば免疫賦活剤；または、免疫調節剤ではない治療用タンパク質、例えば化学療法抗体等）をコードする第２の異種核酸を含む。一部の実施形態において、前記免疫賦活剤はＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−１２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ２ｂ、ヘパラナ
ーゼ、ＣＤ１３７Ｌ、ＬＥＭ、およびＢｃｌ−２からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記ＴＣＲは、第２のプロモーターに機能的に連結した第３の異種核酸によってコードされる。一部の実施形態において、前記第２のプロモーターは構成的プロモーターである。一部の実施形態において、前記第２のプロモーターは、例えば、誘導物質（例えばテトラサイクリンまたはドキシサイクリンなどの小分子等）、照射、温度、酸化還元状態、腫瘍環境、および前記改変哺乳類ＴＣＲ−Ｔ細胞の活性化状態、から選択される誘導条件によって誘導可能である。一部の実施形態において、前記ＴＣＲは、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＶＥＧＦＲ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ等）、ＧＤ２、ＨＥＲ２、ＩＧＦ１Ｒ、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、およびＷＴ１からなる群より選択される腫瘍抗原を標的とする。

一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞により発現される細胞表面分子（ＣＡＲおよびＴＣＲ等）は、１つまたは複数の腫瘍抗原を標的とする。腫瘍抗原は免疫応答、特にＴ細胞媒介性免疫応答を誘発しうる、腫瘍細胞によって産生されるタンパク質である。本発明の標的抗原の選択は、治療すべき具体的な種類の癌に依存するであろう。腫瘍抗原の例は、例えば、グリオーマ関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、プロスターゼ（prostase）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−ｌａ、ｐ５３、プロステイン（prostein）、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、サバイビン（survivin）およびテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、ｅｐｈｒｉｎＢ２、ＣＤ２２、インシュリン増殖因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ならびにメソテリンを含む。

一部の実施形態において、前記腫瘍抗原は、悪性腫瘍と関連した１つまたは複数の抗原性癌エピトープを含む。悪性腫瘍は、免疫攻撃のための標的抗原となりうるタンパク質を多数発現する。これらの分子は、メラノーマにおけるＭＡＲＴ−１、チロシナーゼ、およびｇｐ１００や、前立腺癌における前立腺酸性フォスファターゼ（ＰＡＰ）および前立腺特異抗原（ＰＳＡ）等の、組織特異的抗原を含むが、これらに限定されない。別の標的分子は、癌遺伝子ＨＥＲ２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ−２等の形質転換関連分子（transformation-related molecules）のグループに属する。標的抗原のさらなる別のグループは、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）等の腫瘍胎児性抗原である。Ｂ細胞リンパ腫においては、腫瘍特異的イディオタイプ免疫グロブリンが、個々の腫瘍に固有の、真に腫瘍特異的な（truly tumor-specific）免疫グロブリン抗原を構成する。ＣＤ１９、ＣＤ２０、およびＣＤ３７等のＢ細胞分化抗原は、Ｂ細胞リンパ腫における標的抗原のための他の候補である。

一部の実施形態において、前記腫瘍抗原は、腫瘍特異抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。ＴＳＡは腫瘍細胞に固有であり、体内の他の細胞上には存在しない。ＴＡＡ関連抗原は腫瘍細胞に固有ではなく、該抗原に対する免疫寛容状態の誘導に失敗する条件下で正常細胞上にも発現する。腫瘍上での前記抗原の発現は、免疫系が該抗原に応答することを可能にする条件下で起こりうる。ＴＡＡは、免疫系が未熟で応答が不可能な胎児発生の途中で正常細胞上に発現する抗原であってもよく、あるいは、正常細胞上に通常極めて低レベルで存在するが、腫瘍細胞上には非常に高いレベルで発現する抗原であってもよい。

ＴＳＡまたはＴＡＡ抗原の限定されない例は、次のものを含む：ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ−Ｉ）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ１７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２等の分化抗原、および、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−
１、ＧＡＧＥ−２、ｐ１５等の腫瘍特異的多系列抗原（tumor-specific multilineage antigens）；ＣＥＡ等の過剰発現胎児性抗原；ｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ等の過剰発現腫瘍遺伝子および変異腫瘍抑制遺伝子；染色体転座の結果生ずる固有の腫瘍抗原；ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲなど；ならびに、エプスタイン・バーウイルス抗原ＥＢＶＡならびにヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６およびＥ７等のウイルス抗原。他の大型の、タンパク質に基づいた抗原の例は、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３ＨＩ、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、ベータカテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、ｐ１５、ｐ１６、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、アルファ−フェトプロテイン、ベータ−ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３＼ＣＡ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼Ｐ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３＼ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０＼Ｍａｃ−２結合タンパク質＼シクロフィリンＣ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、およびＴＰＳを含む。

一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞によって発現される前記細胞表面分子（ＣＡＲまたはＴＣＲ等）の標的となる腫瘍抗原は、ＥＧＦＲである。

従って、一部の実施形態において、ａ）免疫調節剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類（ヒト等）ＣＡＲ−Ｔ細胞であって、前記異種核酸がプロモーターに機能的に連結し、前記改変ＣＡＲ−Ｔ細胞がＥＧＦＲを標的とするＣＡＲを発現する、改変哺乳類ＣＡＲ−Ｔ細胞；およびｂ）薬理学的に許容される賦形剤、を含む医薬組成物が提供される。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫チェックポイント阻害剤（ＣＴＬＡ−４の阻害剤またはＰＤ−１の阻害剤等）である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫賦活剤である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は分泌タンパク質である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は抗体（全長抗体、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、重鎖のみ抗体、またはＦａｂ等）である。一部の実施形態において、前記改変ＣＡＲ−Ｔ細胞は、さらに、治療用タンパク質（第２の免疫調節剤、例えば免疫賦活剤；または、免疫調節剤ではない治療用タンパク質、例えば化学療法抗体等）をコードする第２の異種核酸を含む。一部の実施形態において、前記免疫賦活剤はＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−１２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ２ｂ、ヘパラナーゼ、ＣＤ１３７Ｌ、ＬＥＭ、およびＢｃｌ−２からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、第２のプロモーターに機能的に連結した第３の異種核酸によってコードされる。一部の実施形態において、前記第２のプロモーターは構成的プロモーターである。一部の実施形態において、前記第２のプロモーターは、例えば、誘導物質（例えばテトラサイクリンまたはドキシサイクリンなどの小分子等）、照射、温度、酸化還元状態、腫瘍環境、および前記改変哺乳類ＣＡＲ−Ｔ細胞の活性化状態、から選択される誘導条件によって誘導可能である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤（免疫チェックポイント阻害剤等）をコードする異種核酸と前記ＣＡＲをコードする異種核酸とは、ｈＥＦ１αなどの構成的プロモーター等の、同一のプロモーターに機能的に連結する。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、前記改変哺乳類ＣＡＲ−Ｔ細胞が腫瘍細胞に結合した際に、および該改変ＣＡＲ−Ｔ細胞による免疫調節剤の分泌の際に、該改変ＣＡＲ−Ｔ細胞を含むＴ細胞の細胞溶解機能、サイトカイン分泌、および／または増殖を引き起こす。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは免疫エフェクター機能が無効化または減弱化した細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは短縮型ＣＡＲである。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは一次細胞内シグナル伝達ドメイン（ＣＤ３ζ等）を含まない。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、非機能的な、または減弱化した一次細
胞内シグナル伝達ドメイン（変異ＣＤ３ζ等）を含む。一部の実施形態において、前記ＣＡＲ単独では標的細胞の細胞溶解を誘発しない。一部の実施形態において、前記医薬組成物はＮＳＣＬＣ等の肺癌を治療するのに有用である。

一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞によって発現される前記細胞表面分子（ＣＡＲまたはＴＣＲ等）の標的となる腫瘍抗原は、ＥＧＦＲｖＩＩＩである。ＥＧＦＲｖＩＩＩは上皮成長因子受容体の変異型であり、アミノ末端近傍のエクソン２〜７の８０１塩基対のインフレーム欠失によって特徴付けられる。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、ＥＧＦＲｖＩＩＩを標的とするＣＡＲを発現する。

膠芽腫（ＧＢＭ）は成人における原発性悪性脳腫瘍の最も一般的な種類であり、依然として最も致死的な癌の一つである。外科的切除、化学療法、および放射線療法を含む集学的療法による治療を受けても、患者の全生存率中央値は１５ヶ月に過ぎない。上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）は、ＧＢＭ上の最も興味深い腫瘍特異抗原の１つである。ＥＧＦＲｖＩＩＩは、野生型ＥＧＦＲ受容体のインフレーム欠失変異体である。ＥＧＦＲｖＩＩＩは、ＧＢＭ細胞表面および各種の癌にのみ発現するが、正常組織および正常細胞上には発現しない。Miao H et al (2014)の報告では、ＥＧＦＲｖＩＩＩに対するＣＡＲ−ＴがＧＢＭの治療において大きな潜在的可能性を有することが示された。

従って、一部の実施形態において、ａ）免疫調節剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類（ヒト等）ＣＡＲ−Ｔ細胞であって、前記異種核酸がプロモーターに機能的に連結し、前記改変ＣＡＲ−Ｔ細胞がＥＧＦＲｖＩＩＩを標的とするＣＡＲを発現する、改変哺乳類ＣＡＲ−Ｔ細胞；およびｂ）薬理学的に許容される賦形剤、を含む医薬組成物が提供される。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫チェックポイント阻害剤（ＣＴＬＡ−４の阻害剤またはＰＤ−１の阻害剤等）である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫賦活剤である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は分泌タンパク質である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は抗体（全長抗体、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、重鎖のみ抗体、またはＦａｂ等）である。一部の実施形態において、前記改変ＣＡＲ−Ｔ細胞は、さらに、治療用タンパク質（第２の免疫調節剤、例えば免疫賦活剤；または、免疫調節剤ではない治療用タンパク質、例えば化学療法抗体等）をコードする第２の異種核酸を含む。一部の実施形態において、前記免疫賦活剤はＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−１２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ２ｂ、ヘパラナーゼ、ＣＤ１３７Ｌ、ＬＥＭ、およびＢｃｌ−２からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、第２のプロモーターに機能的に連結した第３の異種核酸によってコードされる。一部の実施形態において、前記第２のプロモーターは構成的プロモーターである。一部の実施形態において、前記第２のプロモーターは、例えば、誘導物質（例えばテトラサイクリンまたはドキシサイクリンなどの小分子等）、照射、温度、酸化還元状態、腫瘍環境、および前記改変哺乳類ＣＡＲ−Ｔ細胞の活性化状態、から選択される誘導条件によって誘導可能である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤（免疫チェックポイント阻害剤等）をコードする異種核酸と前記ＣＡＲをコードする異種核酸とは、ｈＥＦ１αなどの構成的プロモーター等の、同一のプロモーターに機能的に連結する。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、前記改変哺乳類ＣＡＲ−Ｔ細胞が腫瘍細胞に結合した際に、および該改変ＣＡＲ−Ｔ細胞による免疫調節剤の分泌の際に、該改変ＣＡＲ−Ｔ細胞を含むＴ細胞の細胞溶解機能、サイトカイン分泌、および／または増殖を引き起こす。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは免疫エフェクター機能が無効化または減弱化した細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは短縮型ＣＡＲである。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは一次細胞内シグナル伝達ドメイン（ＣＤ３ζ等）を含まない。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、非機能的な、または減弱化した一次細胞内シグナル伝達ドメイン（変異ＣＤ３ζ等）を含む。一部の実施形態において
、前記ＣＡＲ単独では標的細胞の細胞溶解を誘発しない。一部の実施形態において、前記医薬組成物は膠芽腫の治療に有用である。

一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞（ＣＡＲ−Ｔ等）は、さらに１つまたは複数（例えば１個、２個、もしくは３個のいずれか、またはそれ以上）の、Ｔ細胞の持続および／または組織ホーミングなどのＴ細胞機能を促進する免疫賦活剤を発現する。免疫賦活剤とその例示される機能のリストを表１に示す。

例えば、多数のサイトカイン類が、Ｔ細胞の発生、分化、および恒常性に潜在的に影響することが報告されている（Blood (2010) 115: 17）。ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、およびＩＬ−２１は、そのヘテロマー受容体が共通γ鎖（γ_ｃ）を共有する、サイトカインファミリーのメンバーである。各サイトカインはＴ細胞増殖因子として記載され、それぞれＴ細胞の抗腫瘍免疫応答を増強させるために用いられてきた（特にＩＬ−２）。しかし、より細かいレベルでは、各サイトカインは非冗長な機能を有し、それによって引き起こされるＴ細胞応答には差異がある。ＩＬ−２は制御性Ｔ細胞の発生と維持に重要な役割を担い、この機能は他のγｃ−サイトカイン類には共有されていない。ＩＬ−７はナイーブならびにメモリーＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の恒常性を媒介する。ＩＬ−１５はＣＤ８^＋メモリーＴ細胞サブセットの維持に必須である。Ｔ細胞媒介腫瘍免疫におけるＩＬ−２１の役割はそれほど明確には定義されていないが、単一因子としての、またはＩＬ−１５との相乗的な組み合わせにおける、抗腫瘍効果を示す報告がある。ＩＬ−１５およびＩＬ−２１も、異なるメカニズムを介してＴ細胞の長期維持を促進しうる。また、ＩＬ
−１２およびＩＬ−１５と共に培養したＵＣＢ由来Ｔ細胞が、固有のセントラルメモリー／エフェクター表現型で１５０倍を超える増殖を引き起こしたことを示す報告もある（Leukemia (2015) 29: 415-422）。さらに、ＬＥＭはミトコンドリア呼吸に対する効果を介してＣＤ８＋Ｔ細胞免疫を促進し（Science (2015) 348(6238): 995-1001）、ヘパラナーゼはＣＡＲリダイレクトＴリンパ球（CAR-redirected T-lymphocytes）の腫瘍浸潤と抗腫瘍活性を促進する（Nat. Med. (2015) 21(5): 524-529）。

腫瘍部位への組織ホーミングまたはＴ細胞遊走も、特に固形腫瘍のための、養子Ｔ細胞療法にとって極めて重要である。少なくとも２種のケモカイン受容体が、ＣＡＲ−Ｔ細胞の腫瘍細胞への輸送（trafficking）の強化を可能にすることが報告されている。John A Craddockらは、ＣＣＲ２ｂ発現活性化Ｔ細胞（ＡＴＣ）が、ＣＣＲ２陰性ＡＴＣとの比較において、ＣＣＬ２分泌神経芽細胞腫への改善されたホーミング（１０倍超）を示すことを報告した（J. Immunother. (2010) 33(8):780-788）。Antonio Di Stasiらは、ＣＣＲ４と、ＣＤ３０を標的とするキメラ抗原受容体とを共発現するＴリンパ球は、ホジキン腫瘍モデルにおいて改善されたホーミングおよび抗腫瘍活性を有することを報告した（Blood (2009) 113(25)）。

活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）は、Ｆａｓ受容体（Ｆａｓ、ＣＤ９５）とＦａｓリガンド（ＦａｓＬ、ＣＤ９５リガンド）との相互作用によって引き起こされるプログラム細胞死の過程である。ＡＩＣＤは、ｃ−ＭｙｃのダウンレギュレーションおよびＣＦＬＡＲ（カスパーゼおよびＦＡＤＤ様アポトーシス調節因子（caspase and FADD-like apoptosis regulator)）の過剰発現によって遮断することができる。Ｂｃｌ−ｘＬは、プロアポトーシス条件下のｉｎｖｉｔｒｏリンパ球生存を促進する（Gene Therapy (2002) 9: 527-535）。他の報告によれば、Ｂｃｌ−２の過剰発現は、腫瘍特異的なＴ細胞の生存を強化することが分かった（Cancer Res (2005) 65(5):2001-2008）。

本明細書に記載の免疫賦活剤のいずれか１つまたは複数をさらに改変し、キメラエフェクター分子（ＣＡＲまたはＴＣＲ等）と同一のまたは異なるベクター上で上記改変哺乳類細胞により共発現されるようにすることによって、該改変哺乳類細胞の標的細胞への結合で引き起こされる免疫応答を増強するようにしてもよい。一部の実施形態において、前記免疫チェックポイント阻害剤および／または前記１つまたは複数の免疫賦活剤、ならびに前記キメラエフェクター分子（ＣＡＲまたはＴＣＲ等）は、異なるプロモーターに駆動される異なる異種核酸によってコードされる。一部の実施形態において、前記免疫チェックポイント阻害剤および／または前記１つまたは複数の免疫賦活剤、ならびに前記キメラエフェクター分子（ＣＡＲまたはＴＣＲ等）は、同一のプロモーターに駆動されるポリシストロニックな核酸によってコードされる。一部の実施形態において、前記プロモーターは誘導性プロモーターである。一部の実施形態において、前記プロモーターは構成的プロモーターである。一部の実施形態において、前記プロモーターはｈＥＦ１αプロモーターである。一部の実施形態において、免疫調節剤、ＣＡＲ（またはＴＣＲ）、および任意に他の治療用タンパク質、をコードする単一のベクターを含む改変哺乳類細胞を含む、医薬組成物が提供される。一部の実施形態において、免疫調節剤、ＣＡＲ（またはＴＣＲ）、および任意に他の治療用タンパク質、をコードする単一の異種核酸を含んだ改変哺乳類細胞であって、前記単一の異種核酸が同一のプロモーターに機能的に連結された改変哺乳類細胞、を含む医薬組成物が提供される。一部の実施形態において、免疫調節剤、ＣＡＲ（またはＴＣＲ）、および任意に他の治療用タンパク質、をコードする単一のベクターまたは単一の異種核酸を医薬組成物において使用することは、例えば、改善された薬効、均質性、および低コストといったいくつかの利点を有する。

従って、一部の実施形態において、ａ）免疫チェックポイント阻害剤（単一ドメイン抗体等）および／または免疫賦活剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類（ヒト等）ＣＡ
Ｒ−Ｔ細胞であって、前記異種核酸がプロモーターに機能的に連結し、前記改変ＣＡＲ−Ｔ細胞がＣＡＲを発現する、改変哺乳類ＣＡＲ−Ｔ細胞；およびｂ）薬理学的に許容される賦形剤、を含む医薬組成物が提供される。一部の実施形態において、前記異種核酸は免疫チェックポイント阻害剤と免疫賦活剤の両者をコードする。一部の実施形態において、前記異種核酸は少なくとも２個の免疫賦活剤をコードする。一部の実施形態において、前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、ＢＬＴＡ、ＴＩＭ−３、またはＬＡＧ−３からなる群より選択される免疫チェックポイント分子の阻害剤である。一部の実施形態において、前記免疫チェックポイント阻害剤は抗体（全長抗体、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、重鎖のみ抗体、またはＦａｂ等）である。一部の実施形態において、前記免疫賦活剤はＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−１２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ２ｂ、ヘパラナーゼ、ＣＤ１３７Ｌ、ＬＥＭ、およびＢｃｌ−２からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ等のＥＧＦＲ、ＢＣＭＡ、またはＮＹ−ＥＳＯ−１等の腫瘍抗原を標的とする。一部の実施形態において、前記改変ＣＡＲ−Ｔ細胞は、さらに、治療用タンパク質（第２の免疫調節剤；または、免疫調節剤ではない治療用タンパク質、例えば化学療法抗体等）をコードする第２の異種核酸を含む。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、前記プロモーターに機能的に連結した異種核酸によってコードされる。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、第２のプロモーターに機能的に連結した第２の異種核酸によってコードされる。一部の実施形態において、前記プロモーターおよび／または前記第２のプロモーターは、ｈＥＦ１αプロモーター等の構成的プロモーターである。一部の実施形態において、前記プロモーターおよび／または第２のプロモーターは、例えば、誘導物質（例えばテトラサイクリンまたはドキシサイクリンなどの小分子等）、照射、温度、酸化還元状態、腫瘍環境、および前記改変哺乳類ＣＡＲ−Ｔ細胞の活性化状態、から選択される誘導条件によって誘導可能である。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、前記改変哺乳類ＣＡＲ−Ｔ細胞が腫瘍細胞に結合した際に、および該改変ＣＡＲ−Ｔ細胞による免疫調節剤の分泌の際に、該改変ＣＡＲ−Ｔ細胞を含むＴ細胞の細胞溶解機能、サイトカイン分泌、および／または増殖を引き起こす。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは免疫エフェクター機能が無効化または減弱化した細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは短縮型ＣＡＲである。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは一次細胞内シグナル伝達ドメイン（ＣＤ３ζ等）を含まない。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、非機能的な、または減弱化した一次細胞内シグナル伝達ドメイン（変異ＣＤ３ζ等）を含む。一部の実施形態において、前記ＣＡＲ単独では標的細胞の細胞溶解を誘発しない。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、ＣＤ８α ＳＰ、腫瘍抗原（ＥＧＦＲｖＩＩＩなどのＥＧＦＲ、ＢＣＭＡ、またはＮＹ−ＥＳＯ−１等）に特異的に結合するターゲティングドメイン、ＣＤ８αヒンジおよび膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ１３７細胞質ドメインを含む。

一部の実施形態において、ａ）免疫チェックポイント阻害剤および／または免疫賦活剤ならびにＣＡＲをコードするベクターを含む改変哺乳類（ヒト等）免疫細胞；およびｂ）薬理学的に許容される賦形剤、を含む医薬組成物が提供される。一部の実施形態において、前記ベクターは、前記免疫チェックポイント阻害剤、前記免疫賦活剤、および前記ＣＡＲをコードする。一部の実施形態において、前記ベクターは、少なくとも２個の免疫賦活剤をコードする。一部の実施形態において、前記改変哺乳類免疫細胞はＰＢＭＣ、Ｔ細胞、またはＮＫ細胞である。一部の実施形態において、前記ベクターは、前記免疫チェックポイント阻害剤をコードする第１の核酸と前記ＣＡＲをコードする第２の核酸とを含み、前記第１の核酸と前記第２の核酸は同一のプロモーターに機能的に連結されている。一部の実施形態において、前記ベクターは、前記免疫チェックポイント阻害剤をコードする第１の核酸と前記ＣＡＲをコードする第２の核酸とを含み、前記第１の核酸と前記第２の核酸は異なるプロモーターに機能的に連結されている。一部の実施形態において、前記プロモーターは、ｈＥＦ１αプロモーター等の構成的プロモーターである。一部の実施形態に
おいて、前記プロモーターは誘導性である。一部の実施形態において、前記プロモーターは、ＩＬ−２プロモーター、ＮＦＡＴプロモーター、またはＮＦκＢプロモーター等の、Ｔ細胞活性化依存プロモーターである。一部の実施形態において、前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、ＢＬＴＡ、ＴＩＭ−３、またはＬＡＧ−３からなる群より選択される免疫チェックポイント分子の阻害剤である。一部の実施形態において、前記免疫チェックポイント阻害剤は抗体（全長抗体、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、重鎖のみ抗体、またはＦａｂ等）である。一部の実施形態において、前記免疫賦活剤はＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−１２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ２ｂ、ヘパラナーゼ、ＣＤ１３７Ｌ、ＬＥＭ、およびＢｃｌ−２からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ等のＥＧＦＲ、ＢＣＭＡ、またはＮＹ−ＥＳＯ−１等の腫瘍抗原を標的とする。

一部の実施形態において、ａ）免疫チェックポイント阻害剤および／または免疫賦活剤ならびにＣＡＲをコードする異種核酸を含む改変哺乳類（ヒト等）免疫細胞であって、前記異種核酸がプロモーターに機能的に連結した、改変哺乳類免疫細胞；およびｂ）薬理学的に許容される賦形剤、を含む医薬組成物が提供される。一部の実施形態において、前記異種核酸は、前記免疫チェックポイント阻害剤、前記免疫賦活剤、および前記ＣＡＲをコードする。一部の実施形態において、前記異種核酸は少なくとも２個の免疫賦活剤をコードする。一部の実施形態において、前記改変哺乳類免疫細胞はＰＢＭＣ、Ｔ細胞、またはＮＫ細胞である。一部の実施形態において、前記プロモーターは、ｈＥＦ１αプロモーター等の構成的プロモーターである。一部の実施形態において、前記プロモーターは誘導性である。一部の実施形態において、前記プロモーターは、ＩＬ−２プロモーター、ＮＦＡＴプロモーター、またはＮＦκＢプロモーター等の、Ｔ細胞活性化依存プロモーターである。一部の実施形態において、前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、ＢＬＴＡ、ＴＩＭ−３、またはＬＡＧ−３からなる群より選択される免疫チェックポイント分子の阻害剤である。一部の実施形態において、前記免疫チェックポイント阻害剤は抗体（全長抗体、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、重鎖のみ抗体、またはＦａｂ等）である。一部の実施形態において、前記免疫賦活剤はＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−１２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ２ｂ、ヘパラナーゼ、ＣＤ１３７Ｌ、ＬＥＭ、およびＢｃｌ−２からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ等のＥＧＦＲ、ＢＣＭＡ、またはＮＹ−ＥＳＯ−１等の腫瘍抗原を標的とする。

一部の実施形態において、ａ）免疫チェックポイント阻害剤および／または免疫賦活剤、ならびに免疫エフェクター機能が無効化または減弱化した細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲ、をコードする異種核酸を含む改変哺乳類（ヒト等）免疫細胞であって、前記異種核酸がプロモーターに機能的に連結した、改変哺乳類免疫細胞；およびｂ）薬理学的に許容される賦形剤、を含む医薬組成物が提供される。一部の実施形態において、前記異種核酸は、前記免疫チェックポイント阻害剤、前記免疫賦活剤、および前記ＣＡＲをコードする。一部の実施形態において、前記異種核酸は少なくとも２個の免疫賦活剤をコードする。一部の実施形態において、前記改変哺乳類免疫細胞はＰＢＭＣ、Ｔ細胞、またはＮＫ細胞である。一部の実施形態において、前記プロモーターは、ｈＥＦ１αプロモーター等の構成的プロモーターである。一部の実施形態において、前記プロモーターは誘導性である。一部の実施形態において、前記プロモーターは、ＩＬ−２プロモーター、ＮＦＡＴプロモーター、またはＮＦκＢプロモーター等の、Ｔ細胞活性化依存プロモーターである。一部の実施形態において、前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、ＢＬＴＡ、ＴＩＭ−３、またはＬＡＧ−３からなる群より選択される免疫チェックポイント分子の阻害剤である。一部の実施形態において、前記免疫チェックポイント阻害剤は抗体（全長抗体、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、重鎖のみ抗体、またはＦａｂ等）である。一部の実施形態において、前記免疫賦活剤はＩＬ−２、
ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−１２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ２ｂ、ヘパラナーゼ、ＣＤ１３７Ｌ、ＬＥＭ、およびＢｃｌ−２からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ等のＥＧＦＲ、ＢＣＭＡ、またはＮＹ−ＥＳＯ−１等の腫瘍抗原を標的とする。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは短縮型ＣＡＲである。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは一次細胞内シグナル伝達ドメイン（ＣＤ３ζ等）を含まない。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、非機能的な、または減弱化した一次細胞内シグナル伝達ドメイン（変異ＣＤ３ζ等）を含む。一部の実施形態において、前記ＣＡＲ単独では標的細胞の細胞溶解を誘発しない。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、ＣＤ８α ＳＰ、腫瘍抗原（ＥＧＦＲｖＩＩＩなどのＥＧＦＲ；ＮＹ−ＥＳＯ−１；またはＢＣＭＡ等）に特異的に結合するターゲティングドメイン、ＣＤ８αヒンジおよび膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ１３７細胞質ドメインを含む。

細胞混合物
一部の実施形態において、前記医薬組成物はさらに第２の細胞を含み、該第２の細胞は、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現する哺乳類免疫細胞（Ｔ細胞等）である。上節に記載のＣＡＲまたはＴＣＲのうち任意のものが該第２の細胞によって発現されてよく、その場合に前記改変哺乳類細胞は前記免疫調節剤および任意の１つまたは複数のさらなる治療用タンパク質（他の免疫調節剤または非免疫調節剤等）のみを発現するものであってよい。腫瘍部位において、前記医薬組成物の改変哺乳類細胞は、免疫調節剤を分泌することによって抑制性免疫チェックポイントを遮断するか、あるいは刺激性免疫チェックポイントを活性化することが可能である一方で、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現する前記第２の哺乳類免疫細胞は、腫瘍細胞へのリクルートが可能である。前記免疫調節剤および前記ＣＡＲまたはＴＣＲからのシグナルの組み合わせによって、前記第２の哺乳類免疫細胞の活性化が可能となり、腫瘍細胞に対する強固な免疫応答が引き起こされうる。これら二成分の医薬組成物によって、前記改変哺乳類細胞による前記免疫調節剤およびさらなる治療用タンパク質の分泌と、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現する前記第２の哺乳類免疫細胞の活性化と、を独立に制御（タイミングや量など）することが可能となる。前記２種の細胞の正確な制御は、前記免疫調節剤またはＣＡＲもしくはＴＣＲによって引き起こされる望ましくない副作用を軽減することにおいて有用であろう。

従って、一部の実施形態において、ａ）免疫調節剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類（ヒト等）細胞であって、前記異種核酸が誘導性プロモーターに機能的に連結する、改変哺乳類細胞；ｂ）ＣＡＲを発現する第２の哺乳類（ヒト等）免疫細胞；および、ｃ）薬理学的に許容される賦形剤、を含む医薬組成物が提供される。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は免疫細胞（ＰＢＭＣ、ＮＫ細胞、またはＴ細胞等）である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は幹細胞である。一部の実施形態において、前記プロモーターは、誘導物質（例えばテトラサイクリンまたはドキシサイクリンなどの小分子等）、照射、温度、酸化還元状態、腫瘍環境、および前記改変哺乳類細胞の活性化状態、から選択される誘導条件によって誘導可能である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫チェックポイント阻害剤（ＣＴＬＡ−４の阻害剤またはＰＤ−１の阻害剤等）である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫賦活剤である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は分泌タンパク質である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は抗体（全長抗体、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、重鎖のみ抗体、またはＦａｂ等）である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、腫瘍抗原を認識するターゲティング分子をその表面上に発現する。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、治療用タンパク質（第２の免疫調節剤、例えば免疫賦活剤；または、免疫調節剤ではない治療用タンパク質、例えば化学療法抗体等）をコードする第２の異種核酸を含む。一部の実施形態において、前記免疫賦活剤はＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−１２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ２ｂ、ヘパラナーゼ、ＣＤ１３７Ｌ、ＬＥＭ、およびＢｃｌ−２からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記
第２の哺乳類免疫細胞はＰＢＭＣ、Ｔ細胞、またはＮＫ細胞である。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ等の腫瘍抗原を標的とする。

一部の実施形態において、ａ）免疫調節剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類（ヒト等）細胞であって、前記異種核酸が誘導性プロモーターに機能的に連結する、改変哺乳類細胞；ｂ）ＴＣＲを発現する第２の哺乳類（ヒト等）免疫細胞；および、ｃ）薬理学的に許容される賦形剤、を含む医薬組成物が提供される。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は免疫細胞（ＰＢＭＣ、ＮＫ細胞、またはＴ細胞等）である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は幹細胞である。一部の実施形態において、前記プロモーターは、誘導物質（例えばテトラサイクリンまたはドキシサイクリンなどの小分子等）、照射、温度、酸化還元状態、腫瘍環境、および前記改変哺乳類細胞の活性化状態、から選択される誘導条件によって誘導可能である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫チェックポイント阻害剤（ＣＴＬＡ−４の阻害剤またはＰＤ−１の阻害剤等）である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫賦活剤である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は分泌タンパク質である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は抗体（全長抗体、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、重鎖のみ抗体、またはＦａｂ等）である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、腫瘍抗原を認識するターゲティング分子をその表面上に発現する。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、治療用タンパク質（第２の免疫調節剤、例えば免疫賦活剤；または、免疫調節剤ではない治療用タンパク質、例えば化学療法抗体等）をコードする第２の異種核酸を含む。一部の実施形態において、前記免疫賦活剤はＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−１２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ２ｂ、ヘパラナーゼ、ＣＤ１３７Ｌ、ＬＥＭ、およびＢｃｌ−２からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記第２の哺乳類免疫細胞はＴ細胞またはＴＣＲ−Ｔである。一部の実施形態において、前記ＴＣＲは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ等の腫瘍抗原を標的とする。

前記第２の哺乳類免疫細胞は、前記改変哺乳類細胞と同一のまたは異なる供給源に由来するものであってよい。また、前記第２の哺乳類免疫細胞は、前記改変哺乳類細胞と同一の種類（サブポピュレーションを含む）または異なる種類のものであってよい。一部の実施形態において、前記第２の哺乳類免疫細胞および前記改変哺乳類細胞の両者は、自己由来である。一部の実施形態において、前記第２の哺乳類免疫細胞および前記改変哺乳類細胞の両者は、同種異系である。一部の実施形態において、前記第２の哺乳類免疫細胞および前記改変哺乳類細胞の両者は、同一個体から得られたものである。一部の実施形態において、前記第２の哺乳類免疫細胞および前記改変哺乳類細胞の両者は、異なる個体から得られたものである。一部の実施形態において、前記第２の哺乳類免疫細胞は自己由来であり、前記改変哺乳類細胞は同種異系である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は自己由来であり、前記第２の哺乳類免疫細胞は同種異系である。

前記第２の哺乳類免疫細胞および前記改変哺乳類細胞は、任意の適した比率で前記医薬組成物中に存在していてよい。一部の実施形態において、前記医薬組成物中の前記第２の哺乳類免疫細胞および前記改変哺乳類細胞の比率は、約１：１００、１：５０、１：２０、１：１０、１：５、１：２、１：１、２：１、５：１、１０：１、２０：１、または１００：１のいずれかである。一部の実施形態において、前記医薬組成物中の前記第２の哺乳類免疫細胞および前記改変哺乳類細胞の比率は、約１：１００〜約１：５０、約１：５０〜約１：１０、約１：２０〜約１：１０、約１：１０〜約１：５、約１：５〜約１：２、約１：２〜約１：１、約１：２〜約２：１、約１：１〜約２：１、約２：１〜約５：１、約５：１〜約１０：１、約１０：１〜約２０：１、約１０：１〜約５０：１、約５０：１〜約１００：１、約１：１０〜約１０：１、または約１：１００〜約１００：１のいずれかである。

賦形剤
本発明の医薬組成物は治療目的に対して有用である。従って、免疫調節剤または他の治療用タンパク質を発現する産生細胞等の改変哺乳類細胞を含む他の組成物とは異なり、本発明の医薬組成物は、個体への投与に適した薬理学的に許容される賦形剤を含む。

適した薬理学的に許容される賦形剤は、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水等の緩衝液；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトール等の炭水化物；タンパク質；ポリペプチド、またはグリシン等のアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡ等のキレート剤、またはグルタチオン；アジュバント（水酸化アルミニウム等）；および保存剤を含んでよい。一部の実施形態において、前記薬理学的に許容される賦形剤は、自己血清を含む。一部の実施形態において、前記薬理学的に許容される賦形剤は、ヒト血清を含む。一部の実施形態において、前記薬理学的に許容される賦形剤は、非毒性、生体適合性、非免疫原性、生分解性であり、宿主の防御機構による認識を回避することができる。前記賦形剤は、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤等の補助剤を含んでもよい。一部の実施形態において、前記薬理学的に許容される賦形剤は、前記改変哺乳類細胞、またはそれが分泌する前記免疫調節剤または他の治療用タンパク質の安定性を増強する。一部の実施形態において、前記薬理学的に許容される賦形剤は、前記改変哺乳類細胞によって分泌される前記免疫調節剤または他の治療用タンパク質の凝集を減少させる。最終形態は無菌であってよく、また、中空針等の注射器具を容易に通過できるものであってよい。賦形剤の適切な選択により、適切な粘性を達成および維持してよい。

一部の実施形態において、前記医薬組成物は、約４．５〜約９．０の範囲のｐＨ、例えば、約５．０〜約８．０、約６．５〜約７．５、または約６．５〜約７．０のいずれかのｐＨ範囲を有するように調製される。一部の実施形態において、前記医薬組成物は、グリセロール等の適した浸透圧調節剤（tonicity modifier）の添加により、血液と等張にすることもできる。

一部の実施形態において、前記医薬組成物はヒトへの投与に適したものである。一部の実施形態において、前記医薬組成物は非経口投与によるヒトへの投与に適したものである。非経口投与に適した製剤は、水性または非水性の等張滅菌注射液であって、該注射液が抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および、該製剤を対象レシピエントの血液に適合させる溶質を含みうるもの、ならびに、水性または非水性の滅菌懸濁液であって、懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、および保存剤を含みうるもの、を含む。前記製剤は単位用量または複数回用量の密閉容器内、例えばアンプルまたはバイアル内に提供することができ、使用の直前に、注射のための本明細書に記載の治療方法、投与方法、および投薬レジメンにおいて、前記滅菌液体賦形剤（すなわち水）を添加することのみを要求する条件で保管されうる。一部の実施形態において、前記医薬組成物は使い捨てバイアル、例えば使い捨て密閉バイアル内に含まれる。一部の実施形態において、前記医薬組成物は複数回使用（multi-use）バイアル内に含まれる。一部の実施形態において、前記医薬組成物は容器内にまとめて含まれる。一部の実施形態において、前記医薬組成物は凍結保存される。

一部の実施形態において、前記医薬組成物は静脈内投与のために製剤される。一部の実施形態において、前記医薬組成物は皮下投与のために製剤される。一部の実施形態において、前記医薬組成物は腫瘍部位への局所投与のために製剤される。一部の実施形態において、前記医薬組成物は腫瘍内注射のために製剤される。

一部の実施形態において、前記医薬組成物は個体への投与のための一定の基準を満たすものである。例えば、米国食品医薬品局は２１ＣＦＲ６１０および２１ＣＦＲ６１０．１３を含む、細胞に基づいた免疫療法製品のための基準を定める規制ガイドラインを発令した。医薬組成物の外観、同一性、純度、安全性、および／または有効性を評価す
る方法が当該分野で公知である。一部の実施形態において、前記医薬組成物は、細胞培養において使用される前記改変哺乳類免疫細胞以外の動物源のタンパク質など、アレルギー性の効果をもたらしうる外来タンパク質を実質的に含まない。一部の実施形態において、「実質的に含まない」とは、医薬組成物の総容量または重量に対し約１０％、５％、１％、０．１％、０．０１％、０．００１％、１ｐｐｍ、またはそれ未満、のいずれかよりも少ないことを意味する。一部の実施形態において、前記医薬組成物はＧＭＰレベルの工場で調製される。一部の実施形態において、非経口投与用の前記医薬組成物に含まれるエンドトキシンは、約５ＥＵ／ｋｇ体重／時間（EU/kg body weight/hr）未満である。一部の実施形態において、静脈内投与用の前記医薬組成物中の改変哺乳類細胞の少なくとも約７０％は生存している。一部の実施形態において、前記医薬組成物は、米国薬局方（ＵＳＰ）に記載の１４日間直接接種試験法（14-day direct inoculation test method）を用いた評価において、「増殖なし（no growth）」の結果となる。一部の実施形態において、前記医薬組成物の投与に先立って、前記改変哺乳類細胞および前記薬理学的に許容される賦形剤の両者を含んだ試料を、最終採取の約４８〜７２時間前に（または培養物の最後の再供給と同時に）無菌性試験のために採取すべきである。一部の実施形態において、前記医薬組成物にはマイコプラズマの混入がない。一部の実施形態において、前記医薬組成物は検出可能な微生物因子を含まない。一部の実施形態において、前記医薬組成物は、ＨＩＶ−Ｉ型、ＨＩＶ−ＩＩ型、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ヒトＴリンパ好性ウイルスＩ型、およびヒトＴリンパ好性ウイルスＩＩ型等の感染症因子を含まない。

ＩＩＩ．調製法
本明細書に記載される医薬組成物のいずれかを調製する方法がさらに提供され、該方法は、前記異種核酸を含むベクターを哺乳類細胞に導入することを含む。

「ベクター」は、単離された核酸を含み、該単離核酸を細胞の内部に送達するために使用されうる組成物である。当該分野においては多数のベクターが公知であり、直鎖ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と関連したポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスを含むが、これらに限定されない。一般に、適したベクターは、少なくとも１つの生物において機能する複製起点と、プロモーター配列と、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位と、１つまたは複数の選択マーカーとを含む。「ベクター」という語は、例えばポリリジン化合物やリポソーム等の、核酸の細胞内への移行を促進する非プラスミドかつ非ウイルスの化合物を含むとも解釈されるべきである。

一部の実施形態において、前記ベクターはウイルスベクターである。ウイルスベクターの例は、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、およびそれらの誘導体を含むが、これらに限定されない。ウイルスベクター技術は当該分野で周知であり、例えば、Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)、ならびに他のウイルス学および分子生物学のマニュアルに記載されている。

ウイルスに基づいた多数の系が、哺乳類細胞への遺伝子導入のために開発されてきた。例えば、レトロウイルスは遺伝子送達系のための好都合なプラットフォームを提供する。当該分野で公知の技術を使用して、前記異種核酸をベクターに挿入し、レトロウイルス粒子にパッケージングすることができる。その後、組換えウイルスを単離し、前記改変哺乳類細胞にｉｎｖｉｔｒｏまたはｅｘｖｉｖｏで送達することができる。当該分野では多数のレトロウイルス系が公知である。一部の実施形態において、アデノウイルスベクターが使用される。当該分野では多数のアデノウイルスベクターが公知である。一部の実施形態において、レンチウイルスベクターが使用される。一部の実施形態において、自己不活性化レンチウイルスベクターが使用される。例えば、免疫調節剤（免疫チェックポイン
ト阻害剤等）をコードする配列を有する自己不活性化レンチウイルスベクター、および／またはキメラ抗原受容体を有する自己不活性化レンチウイルスベクターを、当該分野で公知のプロトコルによりパッケージングすることができる。得られたレンチウイルスベクターを、当該分野で公知の手法を用いて哺乳類細胞（初代ヒトＴ細胞等）の形質導入に使用することができる。

宿主細胞は、当該分野で公知の各種方法を用いて調製することができる。例えば、Ｔ細胞等の初代免疫細胞を、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含む多数の供給源から得ることができる。一部の実施形態において、個体から採取した単位量の血液から、ＦＩＣＯＬＬ（商標）分離等の当該分野で公知の任意の数の技術を使用し、免疫細胞（Ｔ細胞等）を得ることができる。一部の実施形態において、個体の循環血液からアフェレーシスによって細胞が得られる。該アフェレーシス産物は典型的には、Ｔ細胞等のリンパ球、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含む。一部の実施形態において、アフェレーシスによって採取された前記細胞を洗浄することによって、血漿画分を除去し、また次の処理工程のために該細胞を適切な緩衝液または培地中に配置してよい。一部の実施形態において、前記細胞は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）により、またはカルシウムやマグネシウム等の二価カチオンを欠く洗浄溶液により、洗浄される。当業者は、洗浄工程が当業者に公知の手法により、例えば半自動化「フロースルー」遠心分離器（例えばＣｏｂｅ２９９１ｃｅｌｌｐｒｏｃｅｓｓｏｒ、ＢａｘｔｅｒＣｙｔｏＭａｔｅ、またはＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓＣｅｌｌＳａｖｅｒ５）を使用説明書に従い使用することにより、達成できることを容易に理解するであろう。洗浄後、細胞を、Ｃａ^２＋不含・Ｍｇ^２＋不含ＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅＡ、または緩衝液を含む、または含まない他の塩類溶液等の、各種生体適合性緩衝液に再懸濁してよい。あるいはアフェレーシス試料の望ましくない成分を除去し、細胞を培地に直接再懸濁してもよい。

一部の実施形態においては、赤血球を溶解し、単球を、例えばＰＥＲＣＯＬＬ（商標）グラジエントを用いた遠心分離によって、または対向流遠心溶出法（counterflow centrifugal elutriation）によって除去することで、末梢血リンパ球から初代Ｔ細胞を単離する。ＣＤ３^＋、ＣＤ−２８^＋、ＣＤ４^＋、ＣＤ８^＋、ＣＤ４５ＲＡ、およびＣＤ４５ＲＯ細胞等のＴ細胞の特定のサブポピュレーションを、正または負の選択技術によってさらに単離することができる。例えば、一実施形態においては、Ｔ細胞を、ＤＹＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０ＣＤ３／ＣＤ−２８Ｔ等の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（すなわち３×２８）結合ビーズと共に、所望のＴ細胞の正の選択に十分な時間インキュベートすることにより、単離する。

一部の実施形態においては、負の選択対象となる細胞固有の表面マーカーに対する抗体の組み合わせを用いて負の選択を行うことにより、Ｔ細胞集団をさらに濃縮してもよい。例えば、１つの方法では、負の選択対象となる細胞上に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のカクテルを使用した、負の磁気免疫付着（negative magnetic immunoadherence）またはフローサイトメトリーによる、細胞選別および／または選択を行う。例えば、ＣＤ４^＋細胞を負の選択により濃縮するためには、モノクローナル抗体のカクテルは典型的にはＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＣＤ８に対する抗体を含む。一部の実施形態においては、ＣＤ４^＋、ＣＤ２５^＋、ＣＤ６２Ｌ^ｈｉ、ＧＩＴＲ^＋、およびＦｏｘＰ３^＋を典型的に発現する制御性Ｔ細胞を濃縮する、または該細胞の正の選択を行うことが望ましい場合がある。あるいは、一部の実施形態においては、抗ＣＤ２５結合ビーズまたは他の同様な選択方法により制御性Ｔ細胞が除去される。

ベクターを哺乳類細胞に導入する方法は当該分野で公知である。ベクターは、物理的、
化学的、または生物学的方法で宿主細胞に導入することができる。

ベクターを宿主細胞に導入するための物理的方法は、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、マイクロインジェクション、およびエレクトロポレーションなどを含む。ベクターおよび／または外来核酸を含む細胞を製造する方法は当該分野で周知である。例えば、Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New Yorkを参照のこと。一部の実施形態において、前記ベクターはエレクトロポレーションによって前記細胞に導入される。

異種核酸を宿主細胞に導入するための生物学的方法は、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターの使用を含む。ウイルスベクターは、ヒト等の哺乳類細胞に遺伝子を挿入するための、最も広く用いられる方法になった。

ベクターを宿主細胞に導入するための化学的手段は、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ等のコロイド分散系、ならびに、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソーム等の、脂質に基づいた系を含む。ｉｎｖｉｔｒｏの送達ビヒクルとしての使用のためのコロイド系の例は、リポソームを含む（例えば人工膜小胞）。

一部の実施形態において、前記形質導入またはトランスフェクトされた哺乳類細胞を、異種核酸の導入後にｅｘｖｉｖｏで増殖させる。一部の実施形態において、前記形質導入またはトランスフェクトされた哺乳類細胞を、少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１２日、または１４日のいずれかの間、培養により増殖させる。一部の実施形態において、前記形質導入またはトランスフェクトされた哺乳類細胞を、約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１２日、または１４日のいずれか以下の間、培養する。一部の実施形態において、前記形質導入またはトランスフェクトされた哺乳類細胞を、改変哺乳類細胞の選択のため、さらに評価またはスクリーニングする。

レポーター遺伝子を用いて、トランスフェクトされた可能性のある細胞を識別し、また調節配列の機能性を評価してもよい。一般にレポーター遺伝子は、レシピエントの生物または組織に存在していないか、または発現しておらず、かつ、酵素活性等の容易に検出可能な何らかの特性によってその発現が明らかにされるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、レシピエントの細胞にそのＤＮＡが導入された後、適切なタイミングで評価される。適したレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、もしくは分泌アルカリフォスファターゼをコードする遺伝子、または緑色蛍光タンパク質遺伝子を含んでもよい（例えばUi-Tei et al. FEBS Letters 479: 79-82 (2000)）。適した発現系は周知であり、公知の技術を用いて調製するか、または市販のものを入手してもよい。

哺乳類細胞中の異種核酸の存在を確認する他の方法は、当業者に周知の分子生物学的アッセイ、例えば、サザンおよびノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲ、ならびにＰＣＲ；生化学的アッセイ、例えば、特定のペプチドの有無を免疫学的方法などによって検出すること等（ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロッティング等）などを含む。

例えば、形質導入哺乳類細胞（初代Ｔ細胞等）の培養物中の免疫調節剤（免疫チェックポイント阻害剤等）の分泌の検出を、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはフローサイトメトリーによって行うことができる。さらに、分泌された免疫調節剤（免疫チェックポイント阻害剤等）の生物学的機能を、レポーターアッセイまたはサイトカイン放出アッセイを用いて、ｉｎｖｉｔｒｏでアッセイすることができる。このよう
なレポーターアッセイは、自家開発の安定なレポーター腫瘍細胞に対して行うことができる。改変Ｔ細胞の場合、サイトカイン放出アッセイを、該改変Ｔ細胞による免疫チェックポイント阻害剤の分泌に応じたＴ細胞回復レベルの検出のために行うことができる。改変ＣＡＲ−Ｔ細胞の場合、腫瘍細胞へのＣＡＲ−Ｔ細胞毒性の増強に対する免疫調節剤（免疫チェックポイント阻害剤等）分泌の能力をｉｎｖｉｔｒｏ共培養アッセイによりアッセイすることができ、該アッセイにおいては、Ｔ細胞と腫瘍細胞の共培養をいくつかの比率で一定時間行う。

ＩＶ．癌の治療法
本出願の一側面は、上記医薬組成物のいずれかを使用した癌の治療方法に関する。

一部の実施形態において、ａ）免疫調節剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類細胞であって、前記異種核酸がプロモーターに機能的に連結した、改変哺乳類細胞；およびｂ）薬理学的に許容される賦形剤、を含むを含む医薬組成物の有効量を個体に投与することを含む、個体（ヒト個体等）における癌の治療法が提供される。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は免疫細胞（ＰＢＭＣ、ＮＫ細胞、またはＴ細胞等）である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は幹細胞である。一部の実施形態において、前記プロモーターは、誘導物質（例えばテトラサイクリンまたはドキシサイクリンなどの小分子等）、照射、温度、酸化還元状態、腫瘍環境、および前記改変哺乳類細胞の活性化状態、から選択される誘導条件によって誘導可能である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫チェックポイント阻害剤（ＣＴＬＡ−４の阻害剤またはＰＤ−１の阻害剤等）である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫賦活剤である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は分泌タンパク質である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は抗体（全長抗体、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、重鎖のみ抗体、またはＦａｂ等）である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、腫瘍抗原（ＥＧＦＲｖＩＩＩなどのＥＧＦＲ、ＢＣＭＡ、またはＮＹ−ＥＳＯ−１等）を認識するターゲティング分子をその表面上に発現する。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現しない。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、治療用タンパク質（第２の免疫調節剤、例えば免疫賦活剤；または、免疫調節剤ではない治療用タンパク質、例えば化学療法抗体等）をコードする第２の異種核酸を含む。一部の実施形態において、前記免疫賦活剤はＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−１２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ２ｂ、ヘパラナーゼ、ＣＤ１３７Ｌ、ＬＥＭ、およびＢｃｌ−２からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は前記個体から得られる。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は前記個体に対し同種異系である。

一部の実施形態において、ａ）免疫調節剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類（ヒト等）免疫細胞であって、前記異種核酸がプロモーターに機能的に連結し、前記改変哺乳類免疫細胞がさらにＣＡＲまたはＴＣＲを発現する、改変哺乳類免疫細胞；およびｂ）薬理学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物の有効量を個体に投与することを含む、個体（ヒト個体等）における癌の治療法が提供される。一部の実施形態において、前記改変哺乳類免疫細胞はＰＢＭＣ、Ｔ細胞、またはＮＫ細胞である。一部の実施形態において、前記プロモーターは、例えばＣＡＲまたはＴＣＲの細胞内シグナル伝達ドメイン等によって、誘導可能である。一部の実施形態において、前記プロモーターは、ＩＬ−２プロモーター、ＮＦＡＴプロモーター、またはＮＦκＢプロモーター等の、Ｔ細胞活性化依存プロモーターである。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫チェックポイント阻害剤（ＣＴＬＡ−４の阻害剤またはＰＤ−１の阻害剤等）である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫賦活剤である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は分泌タンパク質である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は抗体（全長抗体、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、重鎖のみ抗体、またはＦａｂ等）である。一部の実施形態において
、前記改変哺乳類細胞は、さらに、治療用タンパク質（第２の免疫調節剤、例えば免疫賦活剤；または、免疫調節剤ではない治療用タンパク質、例えば抗ＨＥＲ２抗体などの化学療法抗体等）をコードする第２の異種核酸を含む。一部の実施形態において、前記免疫賦活剤はＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−１２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ２ｂ、ヘパラナーゼ、ＣＤ１３７Ｌ、ＬＥＭ、およびＢｃｌ−２からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、第２のプロモーターに機能的に連結した第３の異種核酸によってコードされる。一部の実施形態において、前記第２のプロモーターは構成的プロモーターである。一部の実施形態において、前記第２のプロモーターは、例えば、誘導物質（例えばテトラサイクリンまたはドキシサイクリンなどの小分子等）、照射、温度、酸化還元状態、腫瘍環境、および前記改変哺乳類免疫細胞の活性化状態、から選択される誘導条件によって誘導可能である。一部の実施形態において、前記ＣＡＲまたはＴＣＲは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ等のＥＧＦＲ、ＢＣＭＡ、またはＮＹ−ＥＳＯ−１等の腫瘍抗原を標的とする。一部の実施形態において、前記改変哺乳類免疫細胞は前記個体から得られる。一部の実施形態において、前記改変哺乳類免疫細胞は前記個体に対し同種異系である。

一部の実施形態において、ａ）免疫チェックポイント阻害剤および／または免疫賦活剤ならびにＣＡＲをコードする異種核酸を含む改変哺乳類（ヒト等）免疫細胞であって、前記異種核酸がプロモーターに機能的に連結した、改変哺乳類免疫細胞；およびｂ）薬理学的に許容される賦形剤、を含む医薬組成物の有効量を個体に投与することを含む、個体（ヒト個体等）における癌の治療法が提供される。一部の実施形態において、前記異種核酸は、前記免疫チェックポイント阻害剤、前記免疫賦活剤、および前記ＣＡＲをコードする。一部の実施形態において、前記異種核酸は少なくとも２個の免疫賦活剤をコードする。一部の実施形態において、前記改変哺乳類免疫細胞はＰＢＭＣ、Ｔ細胞、またはＮＫ細胞である。一部の実施形態において、前記プロモーターは、ｈＥＦ１αプロモーター等の構成的プロモーターである。一部の実施形態において、前記プロモーターは誘導性である。一部の実施形態において、前記プロモーターは、ＩＬ−２プロモーター、ＮＦＡＴプロモーター、またはＮＦκＢプロモーター等の、Ｔ細胞活性化依存プロモーターである。一部の実施形態において、前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、ＢＬＴＡ、ＴＩＭ−３、またはＬＡＧ−３からなる群より選択される免疫チェックポイント分子の阻害剤である。一部の実施形態において、前記免疫チェックポイント阻害剤は抗体（全長抗体、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、重鎖のみ抗体、またはＦａｂ等）である。一部の実施形態において、前記免疫賦活剤はＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−１２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ２ｂ、ヘパラナーゼ、ＣＤ１３７Ｌ、ＬＥＭ、およびＢｃｌ−２からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ等のＥＧＦＲ、ＢＣＭＡ、またはＮＹ−ＥＳＯ−１等の腫瘍抗原を標的とする。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは免疫エフェクター機能が無効化または減弱化した細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは短縮型ＣＡＲである。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは一次細胞内シグナル伝達ドメイン（ＣＤ３ζ等）を含まない。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、非機能的な、または減弱化した一次細胞内シグナル伝達ドメイン（変異ＣＤ３ζ等）を含む。一部の実施形態において、前記ＣＡＲ単独では標的細胞の細胞溶解を誘発しない。一部の実施形態において、前記改変哺乳類免疫細胞は前記個体から得られる。一部の実施形態において、前記改変哺乳類免疫細胞は前記個体に対し同種異系である。

一部の実施形態において、ａ）免疫調節剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類細胞であって、前記異種核酸がプロモーターに機能的に連結した、改変哺乳類細胞；ｂ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する第２の哺乳類免疫細胞；およびｃ）薬理学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物の有効量を個体に投与することを含む、個体（ヒト個体等）における癌の治療法が提供される。一部の実施形態
において、前記改変哺乳類細胞は免疫細胞（ＰＢＭＣ、ＮＫ細胞、またはＴ細胞等）である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は幹細胞である。一部の実施形態において、前記プロモーターは、誘導物質（例えばテトラサイクリンまたはドキシサイクリンなどの小分子等）、照射、温度、酸化還元状態、腫瘍環境、および前記改変哺乳類細胞の活性化状態、から選択される誘導条件によって誘導可能である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫チェックポイント阻害剤（ＣＴＬＡ−４の阻害剤またはＰＤ−１の阻害剤等）である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫賦活剤である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は分泌タンパク質である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は抗体（全長抗体、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、重鎖のみ抗体、またはＦａｂ等）である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、腫瘍抗原を認識するターゲティング分子をその表面上に発現する。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、治療用タンパク質（第２の免疫調節剤、例えば免疫賦活剤；または、免疫調節剤ではない治療用タンパク質、例えば化学療法抗体；等）をコードする第２の異種核酸を含む。一部の実施形態において、前記免疫賦活剤はＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−１２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ２ｂ、ヘパラナーゼ、ＣＤ１３７Ｌ、ＬＥＭ、およびＢｃｌ−２からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記第２の哺乳類免疫細胞はＰＢＭＣ、Ｔ細胞、またはＮＫ細胞である。一部の実施形態において、前記ＣＡＲまたはＴＣＲは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ等のＥＧＦＲ、ＢＣＭＡ、またはＮＹ−ＥＳＯ−１等の腫瘍抗原を標的とする。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞および／または前記第２の哺乳類免疫細胞は、前記個体から得られる。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞および／または前記第２の哺乳類免疫細胞は、前記個体に対し同種異系である。

一部の実施形態において、ａ）免疫調節剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類細胞であって、前記異種核酸がプロモーターに機能的に連結した、改変哺乳類細胞、を含む医薬組成物の有効量を個体に投与すること；およびｂ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する第２の哺乳類免疫細胞を含む医薬組成物の有効量を、前記個体に投与することを含む、個体（ヒト個体等）における癌の治療法が提供される。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞を含む医薬組成物は、前記第２の改変哺乳類免疫細胞を含む医薬組成物の投与よりも先に投与される。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞を含む医薬組成物は、前記第２の改変哺乳類免疫細胞を含む医薬組成物の投与よりも後に投与される。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は免疫細胞（ＰＢＭＣ、ＮＫ細胞、またはＴ細胞等）である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は幹細胞である。一部の実施形態において、前記プロモーターは、誘導物質（例えばテトラサイクリンまたはドキシサイクリンなどの小分子等）、照射、温度、酸化還元状態、腫瘍環境、および前記改変哺乳類細胞の活性化状態、から選択される誘導条件によって誘導可能である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫チェックポイント阻害剤（ＣＴＬＡ−４の阻害剤またはＰＤ−１の阻害剤等）である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫賦活剤である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は分泌タンパク質である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は抗体（全長抗体、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、重鎖のみ抗体、またはＦａｂ等）である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、腫瘍抗原を認識するターゲティング分子をその表面上に発現する。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、治療用タンパク質（第２の免疫調節剤、例えば免疫賦活剤；または、免疫調節剤ではない治療用タンパク質、例えば化学療法抗体等）をコードする第２の異種核酸を含む。一部の実施形態において、前記免疫賦活剤はＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−１２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ２ｂ、ヘパラナーゼ、ＣＤ１３７Ｌ、ＬＥＭ、およびＢｃｌ−２からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記第２の哺乳類免疫細胞はＰＢＭＣ、Ｔ細胞、またはＮＫ細胞である。一部の実施形態において、前記ＣＡＲまたはＴＣＲは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ等のＥＧＦＲ、ＢＣＭＡ、またはＮＹ−ＥＳＯ−１等の腫瘍抗
原を標的とする。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞および／または前記第２の哺乳類免疫細胞は、前記個体から得られる。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞および／または前記第２の哺乳類免疫細胞は、前記個体に対し同種異系である。

本明細書に記載される方法は、固形癌および液性癌の両者を含む各種癌の治療に適したものである。本方法は、初期、進行期、および転移性癌を含む、あらゆるステージの癌に適用可能である。本明細書に記載される方法は、アジュバントを使用する環境またはアジュバント不使用の環境で、第１療法、第２療法、第３療養、または化学療法、手術、放射線療法、遺伝子治療、免疫療法、骨髄移植、幹細胞移植、標的療法、寒冷療法、超音波療法、光線力学的治療、もしくはラジオ波焼灼療法等の当該分野で公知の他の種類の癌治療との併用療法として使用してもよい。

一部の実施形態において、前記癌は固形癌である。一部の実施形態において、前記癌は血液癌等の液性癌である。本明細書に記載される方法によって治療しうる癌の例は、副腎皮質癌（adenocortical carcinoma）、原発性骨髄線維症、肛門癌、虫垂癌、星細胞腫（小脳および大脳等）、基底細胞癌、胆管癌（肝外等）、膀胱癌、骨癌（骨肉腫および悪性線維性組織球腫）、脳腫瘍（神経膠腫、脳幹神経膠腫、小脳または大脳星細胞腫（毛様細胞性星細胞腫、びまん性星細胞腫、未分化（悪性）星細胞腫等）、悪性神経膠腫、上衣腫、乏突起膠腫（oligodenglioma）、髄膜腫、頭蓋咽頭腫、血管芽細胞腫、髄芽腫、テント上未分化神経外胚葉性腫瘍、視覚路および視床下部神経膠腫、ならびに膠芽腫）、乳癌、気管支腺腫／カルチノイド、カルチノイド腫瘍（消化管カルチノイド腫瘍等）、原発不明の癌、中枢神経系リンパ腫、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、慢性骨髄増殖性疾患、子宮内膜癌（子宮癌等）、上衣腫、食道癌、ユーイングファミリー腫瘍、眼癌（眼内黒色腫および網膜芽腫等）、胆嚢癌、胃（gastric (stomach)）癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍（頭蓋外、性腺外、卵巣等）、妊娠性絨毛性腫瘍、頭頸部癌、肝細胞（肝臓）癌（肝癌およびヘパトーマ等）、下咽頭癌、島細胞癌（内分泌膵）、喉頭癌、喉頭癌、白血病（Ｔ細胞白血病を除く）、口唇口腔癌、口腔癌（oral
cancer）、肝臓癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、および肺扁平上皮癌等）、リンパ腫（Ｔ細胞リンパ腫を除く）、髄芽腫、メラノーマ、中皮腫、転移性扁平上皮頸部癌、口腔癌（mouth cancer）、多発性内分泌腫瘍症候群、骨髄異形成症候群、骨髄異形成性／骨髄増殖性疾患、鼻腔および副鼻腔癌、上咽頭癌、神経芽細胞腫、神経内分泌癌、口腔咽頭癌、卵巣癌（卵巣上皮癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍等）、膵臓癌、副甲状腺癌、陰茎癌、腹膜癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体芽腫およびテント上未分化神経外胚葉腫瘍、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫（小膠細胞腫）、肺リンパ管筋腫症、直腸癌、腎臓癌、腎盂尿管癌（移行細胞癌）、横紋筋肉腫、唾液腺癌、皮膚癌（非メラノーマ（扁平上皮癌（squamous cell carcinoma）等）、メラノーマ、およびメルケル細胞癌等）、小腸癌、扁平上皮癌（squamous cell cancer）、精巣癌、咽喉癌、甲状腺癌、結節性硬化症、尿道癌、腟癌、外陰癌、ウィルムス腫瘍、母斑症関連異常血管増殖、浮腫（脳腫瘍関連等）、ならびにメーグス症候群を含むが、これらに限定されない。

前記医薬組成物の投与は、注射、摂取、輸液、埋め込み（implantation）、または移植（transplantation）を含む任意の好都合な様式で行ってよい、前記組成物は、経動脈、皮下、皮内、腫瘍内、節内、髄内、筋肉内、静脈内、または腹腔内投与により患者に投与されてよい。一部の実施形態において、前記医薬組成物は全身投与される。一部の実施形態において、前記医薬組成物は、静脈内注入等の輸液により、個体に投与される。免疫療法のための輸液の技術は当該分野で公知である（例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319: 1676 (1988)を参照のこと）。一部の実施形態において、前記医薬組成物は、皮内または皮下注射により、個体に投与される。一実施形態において、前記組成物は静脈内注射によって投与される。一実施形態において、前記組成物は腫瘍またはリンパ節
に直接注射される。一部の実施形態において、前記医薬組成物は腫瘍部位に局所的に、例えば直接腫瘍細胞に、または腫瘍細胞を有する組織に投与される。

一部の実施形態において、ａ）免疫調節剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類細胞であって、前記異種核酸がプロモーターに機能的に連結した、改変哺乳類細胞；およびｂ）薬理学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物の有効量を個体に投与（全身投与、または腫瘍部位への局所投与等）することを含む、個体（ヒト個体等）における固形癌の治療法が提供される。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は免疫細胞（ＰＢＭＣ、ＮＫ細胞、またはＴ細胞等）である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は幹細胞である。一部の実施形態において、前記プロモーターは、誘導物質（例えばテトラサイクリンまたはドキシサイクリンなどの小分子等）、照射、温度、酸化還元状態、腫瘍環境、および前記改変哺乳類細胞の活性化状態、から選択される誘導条件によって誘導可能である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫チェックポイント阻害剤（ＣＴＬＡ−４の阻害剤またはＰＤ−１の阻害剤等）である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫賦活剤である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は分泌タンパク質である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は抗体（全長抗体、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、重鎖のみ抗体、またはＦａｂ等）である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、腫瘍抗原（ＥＧＦＲｖＩＩＩ等）を認識するターゲティング分子をその表面上に発現する。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現しない。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、治療用タンパク質（第２の免疫調節剤、例えば免疫賦活剤；または、免疫調節剤ではない治療用タンパク質、例えば化学療法抗体等）をコードする第２の異種核酸を含む。一部の実施形態において、前記免疫賦活剤はＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−１２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ２ｂ、ヘパラナーゼ、ＣＤ１３７Ｌ、ＬＥＭ、およびＢｃｌ−２からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は前記個体から得られる。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は前記個体に対し同種異系である。一部の実施形態において、前記固形癌は、メラノーマ、乳癌、肺癌、肝臓癌、白血病、リンパ腫、胃癌、結腸癌、骨癌、脳腫瘍、膵臓癌、および卵巣癌からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記医薬組成物は輸液により投与される。一部の実施形態において、前記医薬組成物は腫瘍内注射により投与される。

一部の実施形態において、ａ）免疫調節剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類（ヒト等）免疫細胞であって、前記異種核酸がプロモーターに機能的に連結し、前記改変哺乳類免疫細胞がさらにＣＡＲまたはＴＣＲを発現する、改変哺乳類免疫細胞；およびｂ）薬理学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物の有効量を個体に投与（全身投与、または腫瘍部位に局所投与、等）することを含む、個体（ヒト個体等）における固形癌の治療法が提供される。一部の実施形態において、前記改変哺乳類免疫細胞はＰＢＭＣ、Ｔ細胞、またはＮＫ細胞である。一部の実施形態において、前記プロモーターは、例えばＣＡＲまたはＴＣＲの細胞内シグナル伝達ドメイン等によって、誘導可能である。一部の実施形態において、前記プロモーターは、ＩＬ−２プロモーター、ＮＦＡＴプロモーター、またはＮＦκＢプロモーター等の、Ｔ細胞活性化依存プロモーターである。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫チェックポイント阻害剤（ＣＴＬＡ−４の阻害剤またはＰＤ−１の阻害剤等）である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫賦活剤である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は分泌タンパク質である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は抗体（全長抗体、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、重鎖のみ抗体、またはＦａｂ等）である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、治療用タンパク質（第２の免疫調節剤、例えば免疫賦活剤；または、免疫調節剤ではない治療用タンパク質、例えば抗ＨＥＲ２抗体などの化学療法抗体等）をコードする第２の異種核酸を含む。一部の実施形態において、前記免疫賦活剤はＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−１２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ２ｂ、ヘパラナーゼ、ＣＤ１３７Ｌ、Ｌ
ＥＭ、およびＢｃｌ−２からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、第２のプロモーターに機能的に連結した第３の異種核酸によってコードされる。一部の実施形態において、前記第２のプロモーターは構成的プロモーターである。一部の実施形態において、前記第２のプロモーターは、例えば、誘導物質（例えばテトラサイクリンまたはドキシサイクリンなどの小分子等）、照射、温度、酸化還元状態、腫瘍環境、および前記改変哺乳類免疫細胞の活性化状態、から選択される誘導条件によって誘導可能である。一部の実施形態において、前記ＣＡＲまたはＴＣＲは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ等の腫瘍抗原を標的とする。一部の実施形態において、前記改変哺乳類免疫細胞は前記個体から得られる。一部の実施形態において、前記改変哺乳類免疫細胞は前記個体に対し同種異系である。一部の実施形態において、前記固形癌は、メラノーマ、乳癌、肺癌、肝臓癌、白血病、リンパ腫、胃癌、結腸癌、骨癌、脳腫瘍、膵臓癌、および卵巣癌からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記医薬組成物は輸液により投与される。一部の実施形態において、前記医薬組成物は腫瘍内注射により投与される。

一部の実施形態において、ａ）免疫調節剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類細胞であって、前記異種核酸がプロモーターに機能的に連結した、改変哺乳類細胞；ｂ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する第２の哺乳類免疫細胞；およびｃ）薬理学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物の有効量を個体に投与（全身投与、または腫瘍部位に局所投与、等）することを含む、個体（ヒト個体等）における固形癌の治療法が提供される。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は免疫細胞（ＰＢＭＣ、ＮＫ細胞、またはＴ細胞等）である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は幹細胞である。一部の実施形態において、前記プロモーターは、誘導物質（例えばテトラサイクリンまたはドキシサイクリンなどの小分子等）、照射、温度、酸化還元状態、腫瘍環境、および前記改変哺乳類細胞の活性化状態、から選択される誘導条件によって誘導可能である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫チェックポイント阻害剤（ＣＴＬＡ−４の阻害剤またはＰＤ−１の阻害剤等）である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫賦活剤である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は分泌タンパク質である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は抗体（全長抗体、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、重鎖のみ抗体、またはＦａｂ等）である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、腫瘍抗原を認識するターゲティング分子をその表面上に発現する。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、治療用タンパク質（第２の免疫調節剤、例えば免疫賦活剤；または、免疫調節剤ではない治療用タンパク質、例えば化学療法抗体等）をコードする第２の異種核酸を含む。一部の実施形態において、前記免疫賦活剤はＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−１２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ２ｂ、ヘパラナーゼ、ＣＤ１３７Ｌ、ＬＥＭ、およびＢｃｌ−２からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記第２の哺乳類免疫細胞はＰＢＭＣ、Ｔ細胞、またはＮＫ細胞である。一部の実施形態において、前記ＣＡＲまたはＴＣＲは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ等の腫瘍抗原を標的とする。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞および／または前記第２の哺乳類免疫細胞は、前記個体から得られる。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞および／または前記第２の哺乳類免疫細胞は、前記個体に対し同種異系である。一部の実施形態において、前記固形癌は、メラノーマ、乳癌、肺癌、肝臓癌、白血病、リンパ腫、胃癌、結腸癌、骨癌、脳腫瘍、膵臓癌、および卵巣癌からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記医薬組成物は輸液により投与される。一部の実施形態において、前記医薬組成物は腫瘍内注射により投与される。

一部の実施形態において、ａ）免疫調節剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類細胞であって、前記異種核酸がプロモーターに機能的に連結した、改変哺乳類細胞、を含む医薬組成物の有効量を個体に投与すること；およびｂ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する第２の哺乳類免疫細胞、を含む医薬組成物の有効量を、前記個体に投与することを含む、個体（ヒト個体等）における固形癌の治療法が
提供される。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞を含む医薬組成物は、前記第２の改変哺乳類免疫細胞を含む医薬組成物の投与よりも先に投与される。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞を含む医薬組成物は、前記第２の改変哺乳類免疫細胞を含む医薬組成物の投与よりも後に投与される。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は免疫細胞（ＰＢＭＣ、ＮＫ細胞、またはＴ細胞等）である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は幹細胞である。一部の実施形態において、前記プロモーターは、誘導物質（例えばテトラサイクリンまたはドキシサイクリンなどの小分子等）、照射、温度、酸化還元状態、腫瘍環境、および前記改変哺乳類細胞の活性化状態、から選択される誘導条件によって誘導可能である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫チェックポイント阻害剤（ＣＴＬＡ−４の阻害剤またはＰＤ−１の阻害剤等）である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫賦活剤である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は分泌タンパク質である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は抗体（全長抗体、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、重鎖のみ抗体、またはＦａｂ等）である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、腫瘍抗原を認識するターゲティング分子をその表面上に発現する。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、治療用タンパク質（第２の免疫調節剤、例えば免疫賦活剤；または、免疫調節剤ではない治療用タンパク質、例えば化学療法抗体等）をコードする第２の異種核酸を含む。一部の実施形態において、前記免疫賦活剤はＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−１２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ２ｂ、ヘパラナーゼ、ＣＤ１３７Ｌ、ＬＥＭ、およびＢｃｌ−２からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記第２の哺乳類免疫細胞はＰＢＭＣ、Ｔ細胞、またはＮＫ細胞である。一部の実施形態において、前記ＣＡＲまたはＴＣＲは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ等の腫瘍抗原を標的とする。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞および／または前記第２の哺乳類免疫細胞は、前記個体から得られる。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞および／または前記第２の哺乳類免疫細胞は、前記個体に対し同種異系である。一部の実施形態において、前記固形癌は、メラノーマ、乳癌、肺癌、肝臓癌、白血病、リンパ腫、胃癌、結腸癌、骨癌、脳腫瘍、膵臓癌、および卵巣癌からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記医薬組成物は輸液により投与される。一部の実施形態において、前記医薬組成物は腫瘍内注射により投与される。

一部の実施形態において、ａ）免疫調節剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類細胞であって、前記異種核酸がプロモーターに機能的に連結した、改変哺乳類細胞；およびｂ）薬理学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物の有効量を個体に全身投与することを含む、個体（ヒト個体等）における液性癌の治療法が提供される。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は免疫細胞（ＰＢＭＣ、ＮＫ細胞、またはＴ細胞等）である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は幹細胞である。一部の実施形態において、前記プロモーターは、誘導物質（例えばテトラサイクリンまたはドキシサイクリンなどの小分子等）、照射、温度、酸化還元状態、腫瘍環境、および前記改変哺乳類細胞の活性化状態、から選択される誘導条件によって誘導可能である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫チェックポイント阻害剤（ＣＴＬＡ−４の阻害剤またはＰＤ−１の阻害剤等）である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫賦活剤である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は分泌タンパク質である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は抗体（全長抗体、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、重鎖のみ抗体、またはＦａｂ等）である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、ＢＣＭＡまたはＮＹ−ＥＳＯ−１等の腫瘍抗原を認識するターゲティング分子をその表面上に発現する。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現しない。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、治療用タンパク質（第２の免疫調節剤、例えば免疫賦活剤；または、免疫調節剤ではない治療用タンパク質、例えば化学療法抗体等）をコードする第２の異種核酸を含む。一部の実施形態において、前記免疫賦活剤はＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−１２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ
２ｂ、ヘパラナーゼ、ＣＤ１３７Ｌ、ＬＥＭ、およびＢｃｌ−２からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は前記個体から得られる。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は前記個体に対し同種異系である。一部の実施形態において、前記液性癌は白血病またはリンパ腫である。一部の実施形態において、前記医薬組成物は輸液により投与される。

一部の実施形態において、ａ）免疫調節剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類（ヒト等）免疫細胞であって、前記異種核酸がプロモーターに機能的に連結し、前記改変哺乳類免疫細胞がさらにＣＡＲまたはＴＣＲを発現する、改変哺乳類免疫細胞；およびｂ）薬理学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物の有効量を個体に全身投与することを含む、個体（ヒト個体等）における液性癌の治療法が提供される。一部の実施形態において、前記改変哺乳類免疫細胞はＰＢＭＣ、Ｔ細胞、またはＮＫ細胞である。一部の実施形態において、前記プロモーターは、例えばＣＡＲまたはＴＣＲの細胞内シグナル伝達ドメイン等によって、誘導可能である。一部の実施形態において、前記プロモーターは、ＩＬ−２プロモーター、ＮＦＡＴプロモーター、またはＮＦκＢプロモーター等の、Ｔ細胞活性化依存プロモーターである。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫チェックポイント阻害剤（ＣＴＬＡ−４の阻害剤またはＰＤ−１の阻害剤等）である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫賦活剤である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は分泌タンパク質である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は抗体（全長抗体、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、重鎖のみ抗体、またはＦａｂ等）である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、治療用タンパク質（第２の免疫調節剤、例えば免疫賦活剤；または、免疫調節剤ではない治療用タンパク質、例えば化学療法抗体等）をコードする第２の異種核酸を含む。一部の実施形態において、前記免疫賦活剤はＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−１２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ２ｂ、ヘパラナーゼ、ＣＤ１３７Ｌ、ＬＥＭ、およびＢｃｌ−２からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、第２のプロモーターに機能的に連結した第３の異種核酸によってコードされる。一部の実施形態において、前記第２のプロモーターは構成的プロモーターである。一部の実施形態において、前記第２のプロモーターは、例えば、誘導物質（例えばテトラサイクリンまたはドキシサイクリンなどの小分子等）、照射、温度、酸化還元状態、腫瘍環境、および前記改変哺乳類免疫細胞の活性化状態、から選択される誘導条件によって誘導可能である。一部の実施形態において、前記ＣＡＲまたはＴＣＲは、ＢＣＭＡまたはＮＹ−ＥＳＯ−１等の腫瘍抗原を標的とする。一部の実施形態において、前記改変哺乳類免疫細胞は前記個体から得られる。一部の実施形態において、前記改変哺乳類免疫細胞は前記個体に対し同種異系である。一部の実施形態において、前記液性癌は白血病またはリンパ腫である。一部の実施形態において、前記医薬組成物は輸液により投与される。

一部の実施形態において、ａ）免疫調節剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類細胞であって、前記異種核酸がプロモーターに機能的に連結した、改変哺乳類細胞；ｂ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する第２の哺乳類免疫細胞；およびｃ）薬理学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物の有効量を個体に全身投与することを含む、個体（ヒト個体等）における液性癌の治療法が提供される。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は免疫細胞（ＰＢＭＣ、ＮＫ細胞、またはＴ細胞等）である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は幹細胞である。一部の実施形態において、前記プロモーターは、誘導物質（例えばテトラサイクリンまたはドキシサイクリンなどの小分子等）、照射、温度、酸化還元状態、腫瘍環境、および前記改変哺乳類細胞の活性化状態、から選択される誘導条件によって誘導可能である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫チェックポイント阻害剤（ＣＴＬＡ−４の阻害剤またはＰＤ−１の阻害剤等）である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫賦活剤である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は分泌タンパク質である。一部の実施形
態において、前記免疫調節剤は抗体（全長抗体、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、重鎖のみ抗体、またはＦａｂ等）である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、腫瘍抗原を認識するターゲティング分子をその表面上に発現する。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、治療用タンパク質（第２の免疫調節剤、例えば免疫賦活剤；または、免疫調節剤ではない治療用タンパク質、例えば化学療法抗体等）をコードする第２の異種核酸を含む。一部の実施形態において、前記免疫賦活剤はＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−１２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ２ｂ、ヘパラナーゼ、ＣＤ１３７Ｌ、ＬＥＭ、およびＢｃｌ−２からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記第２の哺乳類免疫細胞はＰＢＭＣ、Ｔ細胞、またはＮＫ細胞である。一部の実施形態において、前記ＣＡＲまたはＴＣＲは、ＢＣＭＡまたはＮＹ−ＥＳＯ−１等の腫瘍抗原を標的とする。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞および／または前記第２の哺乳類免疫細胞は、前記個体から得られる。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞および／または前記第２の哺乳類免疫細胞は、前記個体に対し同種異系である。一部の実施形態において、前記液性癌は白血病またはリンパ腫である。一部の実施形態において、前記医薬組成物は輸液により投与される。

一部の実施形態において、ａ）免疫調節剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類細胞であって、前記異種核酸がプロモーターに機能的に連結した、改変哺乳類細胞、を含む医薬組成物の有効量を、個体に全身投与すること；およびｂ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する第２の哺乳類免疫細胞を含む医薬組成物の有効量を、前記個体に全身投与することを含む、個体（ヒト個体等）における液性癌の治療法が提供される。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞を含む医薬組成物は、前記第２の改変哺乳類免疫細胞を含む医薬組成物の投与よりも先に投与される。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞を含む医薬組成物は、前記第２の改変哺乳類免疫細胞を含む医薬組成物の投与よりも後に投与される。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は免疫細胞（ＰＢＭＣ、ＮＫ細胞、またはＴ細胞等）である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は幹細胞である。一部の実施形態において、前記プロモーターは、誘導物質（例えばテトラサイクリンまたはドキシサイクリンなどの小分子等）、照射、温度、酸化還元状態、腫瘍環境、および前記改変哺乳類細胞の活性化状態、から選択される誘導条件によって誘導可能である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫チェックポイント阻害剤（ＣＴＬＡ−４の阻害剤またはＰＤ−１の阻害剤等）である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫賦活剤である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は分泌タンパク質である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は抗体（全長抗体、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、重鎖のみ抗体、またはＦａｂ等）である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、腫瘍抗原を認識するターゲティング分子をその表面上に発現する。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、治療用タンパク質（第２の免疫調節剤、例えば免疫賦活剤；または、免疫調節剤ではない治療用タンパク質、例えば化学療法抗体等）をコードする第２の異種核酸を含む。一部の実施形態において、前記免疫賦活剤はＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−１２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ２ｂ、ヘパラナーゼ、ＣＤ１３７Ｌ、ＬＥＭ、およびＢｃｌ−２からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記第２の哺乳類免疫細胞はＰＢＭＣ、Ｔ細胞、またはＮＫ細胞である。一部の実施形態において、前記ＣＡＲまたはＴＣＲは、ＢＣＭＡまたはＮＹ−ＥＳＯ−１等の腫瘍抗原を標的とする。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞および／または前記第２の哺乳類免疫細胞は、前記個体から得られる。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞および／または前記第２の哺乳類免疫細胞は、前記個体に対し同種異系である。一部の実施形態において、前記液性癌は白血病またはリンパ腫である。一部の実施形態において、前記医薬組成物は輸液により投与される。

一部の実施形態において、前記プロモーターは誘導性であり、前記方法はさらに免疫調
節剤および／または他の治療用タンパク質の発現を誘導することを含む。前記改変哺乳類細胞および／または前記第２の哺乳類免疫細胞の誘導は、個体への投与前に、または個体への投与後に行われうる。一部の実施形態において、前記プロモーターは誘導条件によって誘導可能であり、前記方法はさらに該誘導条件を個体に適用することを含む。一部の実施形態において、前記プロモーターは誘導物質（例えばテトラサイクリンまたはドキシサイクリンなどの小分子等）によって誘導可能であり、前記方法はさらに、該誘導物質の有効量を個体に投与して免疫調節剤および／または他の治療用タンパク質の発現を誘導することを含む。一部の実施形態において、前記誘導物質は全身投与される。一部の実施形態において、前記誘導物質は腫瘍部位に局所的に、例えば直接腫瘍細胞に、または腫瘍細胞を有する組織に、投与される。一部の実施形態において、前記プロモーターは照射（光または電離放射線等）によって誘導可能であり、前記方法はさらに、個体に、例えば全身に、または腫瘍部位に局所的に、照射を適用することを含む。一部の実施形態において、前記プロモーターは熱によって誘導可能であり、前記方法はさらに、個体に、例えば腫瘍部位に局所的に、熱を加えることを含む。

従って、一部の実施形態において、（１）ａ）免疫調節剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類細胞であって、前記異種核酸が誘導性プロモーターに機能的に連結した、改変哺乳類細胞；およびｂ）薬理学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物の有効量を個体に投与することと、（２）前記免疫調節剤の発現を誘導することを含む、個体（ヒト個体等）における癌の治療法が提供される。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は免疫細胞（ＰＢＭＣ、ＮＫ細胞、またはＴ細胞等）である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は幹細胞である。一部の実施形態において、前記プロモーターは、誘導物質（例えばテトラサイクリンまたはドキシサイクリンなどの小分子等）、照射、温度、酸化還元状態、腫瘍環境、および前記改変哺乳類細胞の活性化状態、から選択される誘導条件によって誘導可能である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫チェックポイント阻害剤（ＣＴＬＡ−４の阻害剤またはＰＤ−１の阻害剤等）である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫賦活剤である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は分泌タンパク質である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は抗体（全長抗体、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、重鎖のみ抗体、またはＦａｂ等）である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、腫瘍抗原（ＥＧＦＲｖＩＩＩなどのＥＧＦＲ、ＢＣＭＡ、またはＮＹ−ＥＳＯ−１等）を認識するターゲティング分子をその表面上に発現する。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現しない。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、治療用タンパク質（第２の免疫調節剤、例えば免疫賦活剤；または、免疫調節剤ではない治療用タンパク質、例えば化学療法抗体等）をコードする第２の異種核酸を含む。一部の実施形態において、前記免疫賦活剤はＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−１２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ２ｂ、ヘパラナーゼ、ＣＤ１３７Ｌ、ＬＥＭ、およびＢｃｌ−２からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は前記個体から得られる。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は前記個体に対し同種異系である。一部の実施形態において、前記癌は、白血病、リンパ腫、メラノーマ、乳癌、肺癌、肝臓癌、白血病、リンパ腫、胃癌、結腸癌、骨癌、脳腫瘍、膵臓癌、および卵巣癌からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記医薬組成物は（輸液等により）全身投与され、前記プロモーターは腫瘍部位で（例えば誘導物質の局所投与により、または局所的な加熱もしくは照射により）局所的に誘導される。

一部の実施形態において、（１）ａ）免疫調節剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類（ヒト等）免疫細胞であって、前記異種核酸が誘導性プロモーターに機能的に連結し、前記改変哺乳類免疫細胞がさらにＣＡＲまたはＴＣＲを発現する、改変哺乳類免疫細胞；およびｂ）薬理学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物の有効量を個体に投与することと、（２）前記免疫調節剤の発現を誘導することを含む、個体（ヒト個体等）における癌
の治療法が提供される。一部の実施形態において、前記改変哺乳類免疫細胞はＰＢＭＣ、Ｔ細胞、またはＮＫ細胞である。一部の実施形態において、前記プロモーターは、例えばＣＡＲまたはＴＣＲの細胞内シグナル伝達ドメイン等によって、誘導可能である。一部の実施形態において、前記プロモーターは、ＩＬ−２プロモーター、ＮＦＡＴプロモーター、またはＮＦκＢプロモーター等の、Ｔ細胞活性化依存プロモーターである。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫チェックポイント阻害剤（ＣＴＬＡ−４の阻害剤またはＰＤ−１の阻害剤等）である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫賦活剤である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は分泌タンパク質である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は抗体（全長抗体、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、重鎖のみ抗体、またはＦａｂ等）である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、治療用タンパク質（第２の免疫調節剤、例えば免疫賦活剤；または、免疫調節剤ではない治療用タンパク質、例えば抗ＨＥＲ２抗体などの化学療法抗体等）をコードする第２の異種核酸を含む。一部の実施形態において、前記免疫賦活剤はＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−１２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ２ｂ、ヘパラナーゼ、ＣＤ１３７Ｌ、ＬＥＭ、およびＢｃｌ−２からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、第２のプロモーターに機能的に連結した第３の異種核酸によってコードされる。一部の実施形態において、前記第２のプロモーターは構成的プロモーターである。一部の実施形態において、前記第２のプロモーターは、例えば、誘導物質（例えばテトラサイクリンまたはドキシサイクリンなどの小分子等）、照射、温度、酸化還元状態、腫瘍環境、および前記改変哺乳類免疫細胞の活性化状態、から選択される誘導条件によって誘導可能である。一部の実施形態において、前記ＣＡＲまたはＴＣＲは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ等のＥＧＦＲ、ＢＣＭＡ、またはＮＹ−ＥＳＯ−１等の腫瘍抗原を標的とする。一部の実施形態において、前記改変哺乳類免疫細胞は前記個体から得られる。一部の実施形態において、前記改変哺乳類免疫細胞は前記個体に対し同種異系である。一部の実施形態において、前記癌は、白血病、リンパ腫、メラノーマ、乳癌、肺癌、肝臓癌、白血病、リンパ腫、胃癌、結腸癌、骨癌、脳腫瘍、膵臓癌、および卵巣癌からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記医薬組成物は（輸液等により）全身投与され、前記プロモーターは腫瘍部位で（例えば誘導物質の局所投与により、または局所的な加熱もしくは照射により）局所的に誘導される。

一部の実施形態において、（１）ａ）免疫調節剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類細胞であって、前記異種核酸が誘導性プロモーターに機能的に連結した、改変哺乳類細胞；ｂ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する第２の哺乳類免疫細胞；およびｃ）薬理学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物の有効量を個体に投与することと、（２）前記免疫調節剤の発現を誘導することを含む、個体（ヒト個体等）における癌の治療法が提供される。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は免疫細胞（ＰＢＭＣ、ＮＫ細胞、またはＴ細胞等）である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は幹細胞である。一部の実施形態において、前記プロモーターは、誘導物質（例えばテトラサイクリンまたはドキシサイクリンなどの小分子等）、照射、温度、酸化還元状態、腫瘍環境、および前記改変哺乳類細胞の活性化状態、から選択される誘導条件によって誘導可能である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫チェックポイント阻害剤（ＣＴＬＡ−４の阻害剤またはＰＤ−１の阻害剤等）である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫賦活剤である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は分泌タンパク質である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は抗体（全長抗体、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、重鎖のみ抗体、またはＦａｂ等）である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、腫瘍抗原を認識するターゲティング分子をその表面上に発現する。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、治療用タンパク質（第２の免疫調節剤、例えば免疫賦活剤；または、免疫調節剤ではない治療用タンパク質、例えば化学療法抗体等）をコードする第２の異種核酸を含む。一部の実施形態において、前記免疫賦活剤はＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２
１、ＩＬ−１２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ２ｂ、ヘパラナーゼ、ＣＤ１３７Ｌ、ＬＥＭ、およびＢｃｌ−２からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記第２の哺乳類免疫細胞はＰＢＭＣ、Ｔ細胞、またはＮＫ細胞である。一部の実施形態において、前記ＣＡＲまたはＴＣＲは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ等のＥＧＦＲ、ＢＣＭＡ、またはＮＹ−ＥＳＯ−１等の腫瘍抗原を標的とする。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞および／または前記第２の哺乳類免疫細胞は、前記個体から得られる。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞および／または前記第２の哺乳類免疫細胞は、前記個体に対し同種異系である。一部の実施形態において、前記癌は、白血病、リンパ腫、メラノーマ、乳癌、肺癌、肝臓癌、白血病、リンパ腫、胃癌、結腸癌、骨癌、脳腫瘍、膵臓癌、および卵巣癌からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記医薬組成物は（輸液等により）全身投与され、前記プロモーターは腫瘍部位で（例えば誘導物質の局所投与により、または局所的な加熱もしくは照射により）局所的に誘導される。

一部の実施形態において、ａ）免疫調節剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類細胞であって、前記異種核酸が誘導性プロモーターに機能的に連結した、改変哺乳類細胞、を含む医薬組成物の有効量を個体に投与すること；ｂ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する第２の哺乳類免疫細胞、を含む医薬組成物の有効量を、前記個体に投与すること；および、ｃ）前記免疫調節剤の発現を誘導することを含む、個体（ヒト個体等）における癌の治療法が提供される。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞を含む医薬組成物は、前記第２の改変哺乳類免疫細胞を含む医薬組成物の投与よりも先に投与される。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞を含む医薬組成物は、前記第２の改変哺乳類免疫細胞を含む医薬組成物の投与よりも後に投与される。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は免疫細胞（ＰＢＭＣ、ＮＫ細胞、またはＴ細胞等）である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は幹細胞である。一部の実施形態において、前記プロモーターは、誘導物質（例えばテトラサイクリンまたはドキシサイクリンなどの小分子等）、照射、温度、酸化還元状態、腫瘍環境、および前記改変哺乳類細胞の活性化状態、から選択される誘導条件によって誘導可能である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫チェックポイント阻害剤（ＣＴＬＡ−４の阻害剤またはＰＤ−１の阻害剤等）である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫賦活剤である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は分泌タンパク質である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は抗体（全長抗体、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、重鎖のみ抗体、またはＦａｂ等）である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、腫瘍抗原を認識するターゲティング分子をその表面上に発現する。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、治療用タンパク質（第２の免疫調節剤、例えば免疫賦活剤；または、免疫調節剤ではない治療用タンパク質、例えば化学療法抗体等）をコードする第２の異種核酸を含む。一部の実施形態において、前記免疫賦活剤はＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−１２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ２ｂ、ヘパラナーゼ、ＣＤ１３７Ｌ、ＬＥＭ、およびＢｃｌ−２からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記第２の哺乳類免疫細胞はＰＢＭＣ、Ｔ細胞、またはＮＫ細胞である。一部の実施形態において、前記ＣＡＲまたはＴＣＲは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ等のＥＧＦＲ、ＢＣＭＡ、またはＮＹ−ＥＳＯ−１等の腫瘍抗原を標的とする。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞および／または前記第２の哺乳類免疫細胞は、前記個体から得られる。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞および／または前記第２の哺乳類免疫細胞は、前記個体に対し同種異系である。一部の実施形態において、前記癌は、白血病、リンパ腫、メラノーマ、乳癌、肺癌、肝臓癌、白血病、リンパ腫、胃癌、結腸癌、骨癌、脳腫瘍、膵臓癌、および卵巣癌からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞を含む医薬組成物は（輸液等により）全身投与され、前記プロモーターは腫瘍部位で（例えば誘導物質の局所投与により、または局所的な加熱もしくは照射により）局所的に誘導される。

一部の実施形態において、前記医薬組成物は、体重１ｋｇあたり少なくとも約１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、または１０^９細胞のいずれかの投与量で投与される。一部の実施形態において、前記医薬組成物は、体重１ｋｇあたり約１０^４〜約１０^５、約１０^５〜約１０^６、約１０^６〜約１０^７、約１０^７〜約１０^８、約１０^８〜約１０^９、約１０^４〜約１０^９、約１０^４〜約１０^６、約１０^６〜約１０^８、または約１０^５〜約１０^７細胞のいずれかの投与量で投与される。

一部の実施形態において、複数種類の改変哺乳類細胞が投与される場合、これら異なる種類の改変哺乳類細胞は、例えば単一組成物として同時に、または任意の適した順番で順次に、個体に投与してよい。

一部の実施形態において、前記医薬組成物は単回投与される。一部の実施形態において、前記医薬組成物は複数回（例えば２、３、４、５、もしくは６回のいずれか、またはそれ以上の回数）投与される。一部の実施形態において、前記医薬組成物は、週１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、４ヶ月に１回、５ヶ月に１回、６ヶ月に１回、７ヶ月に１回、８ヶ月に１回、９ヶ月に１回、または年１回、投与される。一部の実施形態において、投与間隔は、約１週間〜２週間、２週間〜１ヶ月、２週間〜２ヶ月、１ヶ月〜２ヶ月、１ヶ月〜３ヶ月、３ヶ月〜６ヶ月、または６ヶ月〜１年のいずれかである。医学分野の当業者は、患者の疾患の兆候をモニタリングし、それに従って治療を調整することによって、その特定の患者のための最適用量および治療レジメンを、容易に決定することができる。

Ｖ．キットおよび製品
本明細書に記載される医薬組成物のいずれかを含有するキット、単位用量（unit dosages）、および製品がさらに提供される。

一部の実施形態において、（１）ａ）免疫調節剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類細胞であって、前記異種核酸がプロモーターに機能的に連結した、改変哺乳類細胞；およびｂ）薬理学的に許容される賦形剤、を含む医薬組成物と、（２）該医薬組成物を使用するための説明書と、を含むキットが提供される。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は幹細胞である。一部の実施形態において、前記プロモーターは、誘導物質（例えばテトラサイクリンまたはドキシサイクリンなどの小分子等）、照射、温度、酸化還元状態、腫瘍環境、および前記改変哺乳類細胞の活性化状態、から選択される誘導条件によって誘導可能である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫チェックポイント阻害剤（ＣＴＬＡ−４の阻害剤またはＰＤ−１の阻害剤等）である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫賦活剤である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は分泌タンパク質である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は抗体（全長抗体、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、重鎖のみ抗体、またはＦａｂ等）である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、腫瘍抗原（ＥＧＦＲｖＩＩＩなどのＥＧＦＲ、ＢＣＭＡ、またはＮＹ−ＥＳＯ−１等）を認識するターゲティング分子をその表面上に発現する。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現しない。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、治療用タンパク質（第２の免疫調節剤、例えば免疫賦活剤；または、免疫調節剤ではない治療用タンパク質、例えば化学療法抗体等）をコードする第２の異種核酸を含む。一部の実施形態において、前記免疫賦活剤はＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−１２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ２ｂ、ヘパラナーゼ、ＣＤ１３７Ｌ、ＬＥＭ、およびＢｃｌ−２からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記キットはさらに誘導物質を含む。

一部の実施形態において、（１）ａ）免疫調節剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類（ヒト等）免疫細胞であって、前記異種核酸がプロモーターに機能的に連結し、前記改
変哺乳類免疫細胞がさらにＣＡＲまたはＴＣＲを発現する、改変哺乳類免疫細胞；およびｂ）薬理学的に許容される賦形剤、を含む医薬組成物と、（２）該医薬組成物を使用するための説明書と、を含むキットが提供される。一部の実施形態において、前記改変哺乳類免疫細胞はＰＢＭＣ、Ｔ細胞、またはＮＫ細胞である。一部の実施形態において、前記プロモーターは、例えばＣＡＲまたはＴＣＲの細胞内シグナル伝達ドメイン等によって、誘導可能である。一部の実施形態において、前記プロモーターは、ＩＬ−２プロモーター、ＮＦＡＴプロモーター、またはＮＦκＢプロモーター等の、Ｔ細胞活性化依存プロモーターである。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫チェックポイント阻害剤（ＣＴＬＡ−４の阻害剤またはＰＤ−１の阻害剤等）である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫賦活剤である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は分泌タンパク質である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は抗体（全長抗体、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、重鎖のみ抗体、またはＦａｂ等）である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、治療用タンパク質（第２の免疫調節剤、例えば免疫賦活剤；または、免疫調節剤ではない治療用タンパク質、例えば抗ＨＥＲ２抗体などの化学療法抗体等）をコードする第２の異種核酸を含む。一部の実施形態において、前記免疫賦活剤はＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−１２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ２ｂ、ヘパラナーゼ、ＣＤ１３７Ｌ、ＬＥＭ、およびＢｃｌ−２からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、第２のプロモーターに機能的に連結した第３の異種核酸によってコードされる。一部の実施形態において、前記第２のプロモーターは構成的プロモーターである。一部の実施形態において、前記第２のプロモーターは、例えば、誘導物質（例えばテトラサイクリンまたはドキシサイクリンなどの小分子等）、照射、温度、酸化還元状態、腫瘍環境、および前記改変哺乳類免疫細胞の活性化状態、から選択される誘導条件によって誘導可能である。一部の実施形態において、前記ＣＡＲまたはＴＣＲは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ等のＥＧＦＲ、ＢＣＭＡ、またはＮＹ−ＥＳＯ−１等の腫瘍抗原を標的とする。一部の実施形態において、前記キットはさらに誘導物質を含む。

一部の実施形態において、（１）ａ）免疫チェックポイント阻害剤および／または免疫賦活剤ならびにＣＡＲをコードする異種核酸を含む改変哺乳類（ヒト等）免疫細胞であって、前記異種核酸がプロモーターに機能的に連結した、改変哺乳類免疫細胞；およびｂ）薬理学的に許容される賦形剤、を含む医薬組成物と、（２）該医薬組成物を使用するための説明書と、を含むキットが提供される。一部の実施形態において、前記異種核酸は、前記免疫チェックポイント阻害剤、前記免疫賦活剤、および前記ＣＡＲをコードする。一部の実施形態において、前記異種核酸は少なくとも２個の免疫賦活剤をコードする。一部の実施形態において、前記改変哺乳類免疫細胞はＰＢＭＣ、Ｔ細胞、またはＮＫ細胞である。一部の実施形態において、前記プロモーターは、ｈＥＦ１αプロモーター等の構成的プロモーターである。一部の実施形態において、前記プロモーターは誘導性である。一部の実施形態において、前記プロモーターは、ＩＬ−２プロモーター、ＮＦＡＴプロモーター、またはＮＦκＢプロモーター等の、Ｔ細胞活性化依存プロモーターである。一部の実施形態において、前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、ＢＬＴＡ、ＴＩＭ−３、またはＬＡＧ−３からなる群より選択される免疫チェックポイント分子の阻害剤である。一部の実施形態において、前記免疫チェックポイント阻害剤は抗体（全長抗体、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、重鎖のみ抗体、またはＦａｂ等）である。一部の実施形態において、前記免疫賦活剤はＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−１２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ２ｂ、ヘパラナーゼ、ＣＤ１３７Ｌ、ＬＥＭ、およびＢｃｌ−２からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ等のＥＧＦＲ、ＢＣＭＡ、またはＮＹ−ＥＳＯ−１等の腫瘍抗原を標的とする。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは免疫エフェクター機能が無効化または減弱化した細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは短縮型ＣＡＲである。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは一次細胞内シグナル伝達ドメイン（ＣＤ３ζ等）を含まない。一部の実施形態において、前記ＣＡＲは、非
機能的な、または減弱化した一次細胞内シグナル伝達ドメイン（変異ＣＤ３ζ等）を含む。

一部の実施形態において、（１）ａ）免疫調節剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類細胞であって、前記異種核酸がプロモーターに機能的に連結した、改変哺乳類細胞；ｂ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する第２の哺乳類免疫細胞；およびｃ）薬理学的に許容される賦形剤、を含む医薬組成物と、（２）該医薬組成物を使用するための説明書と、を含むキットが提供される。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は免疫細胞（ＰＢＭＣ、ＮＫ細胞、またはＴ細胞等）である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は幹細胞である。一部の実施形態において、前記プロモーターは、誘導物質（例えばテトラサイクリンまたはドキシサイクリンなどの小分子等）、照射、温度、酸化還元状態、腫瘍環境、および前記改変哺乳類細胞の活性化状態、から選択される誘導条件によって誘導可能である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫チェックポイント阻害剤（ＣＴＬＡ−４の阻害剤またはＰＤ−１の阻害剤等）である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫賦活剤である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は分泌タンパク質である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は抗体（全長抗体、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、重鎖のみ抗体、またはＦａｂ等）である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、腫瘍抗原を認識するターゲティング分子をその表面上に発現する。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、治療用タンパク質（第２の免疫調節剤、例えば免疫賦活剤；または、免疫調節剤ではない治療用タンパク質、例えば化学療法抗体等）をコードする第２の異種核酸を含む。一部の実施形態において、前記免疫賦活剤はＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−１２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ２ｂ、ヘパラナーゼ、ＣＤ１３７Ｌ、ＬＥＭ、およびＢｃｌ−２からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記第２の哺乳類免疫細胞はＰＢＭＣ、Ｔ細胞、またはＮＫ細胞である。一部の実施形態において、前記ＣＡＲまたはＴＣＲは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ等のＥＧＦＲ、ＢＣＭＡ、またはＮＹ−ＥＳＯ−１等の腫瘍抗原を標的とする。一部の実施形態において、前記キットはさらに誘導物質を含む。

一部の実施形態において、（１）ａ）免疫調節剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類細胞であって、前記異種核酸がプロモーターに機能的に連結した、改変哺乳類細胞；およびｂ）薬理学的に許容される賦形剤、を含む医薬組成物と、（２）ＣＡＲまたはＴＣＲを発現する第２の哺乳類免疫細胞を含む組成物と、（３）前記医薬組成物を使用するための説明書と、を含むキットが提供される。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は免疫細胞（ＰＢＭＣ、ＮＫ細胞、またはＴ細胞等）である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は幹細胞である。一部の実施形態において、前記プロモーターは、誘導物質（例えばテトラサイクリンまたはドキシサイクリンなどの小分子等）、照射、温度、酸化還元状態、腫瘍環境、および前記改変哺乳類細胞の活性化状態、から選択される誘導条件によって誘導可能である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫チェックポイント阻害剤（ＣＴＬＡ−４の阻害剤またはＰＤ−１の阻害剤等）である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は免疫賦活剤である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は分泌タンパク質である。一部の実施形態において、前記免疫調節剤は抗体（全長抗体、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、重鎖のみ抗体、またはＦａｂ等）である。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、腫瘍抗原を認識するターゲティング分子をその表面上に発現する。一部の実施形態において、前記改変哺乳類細胞は、さらに、治療用タンパク質（第２の免疫調節剤、例えば免疫賦活剤；または、免疫調節剤ではない治療用タンパク質、例えば化学療法抗体等）をコードする第２の異種核酸を含む。一部の実施形態において、前記免疫賦活剤はＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−１２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ２ｂ、ヘパラナーゼ、ＣＤ１３７Ｌ、ＬＥＭ、およびＢｃｌ−２からなる群より選択される。一部の実施形態において、前記第２の哺乳類免疫細胞
はＰＢＭＣ、Ｔ細胞、またはＮＫ細胞である。一部の実施形態において、前記ＣＡＲまたはＴＣＲは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ等のＥＧＦＲ、ＢＣＭＡ、またはＮＹ−ＥＳＯ−１等の腫瘍抗原を標的とする。一部の実施形態において、前記医薬組成物と、前記第２の哺乳類免疫細胞を含む組成物とが、投与の前に混合される。一部の実施形態において、前記キットはさらに誘導物質を含む。

前記キットは、前記改変哺乳類細胞および任意に前記第２の哺乳類免疫細胞の増殖または誘導を可能にするために、容器、試薬、培地、誘導物質、サイトカイン、緩衝液、および抗体等の１つまたは複数のさらなる構成物を含んでいてよい。前記キットは、前記医薬組成物および／または前記第２の哺乳類免疫細胞を含む組成物を腫瘍部位に局所投与（腫瘍内注射等）するための装置を含んでもよい。

前記医薬組成物、および任意に前記第２の哺乳類免疫細胞を含む組成物、の使用に関する説明書は、一般に、対象となる治療のための用量、投与計画、および投与経路に関する情報を含む。一部の実施形態において、前記説明書はさらに、前記免疫調節剤および／または他の治療用タンパク質の発現の誘導のための、誘導物質の用量、投与計画、および投与経路等の情報を含む。前記容器は単位用量（unit doses）、バルクパッケージ（例えば複数回用量パッケージ）、または単位未満の用量（sub-unit doses）であってよい。一部の実施形態において、前記組成物（医薬組成物、第２の哺乳類免疫細胞を含む組成物、および／または誘導物質等）の総量は、単回の局所投与（腫瘍内注射等）のための全量に十分な量である。一部の実施形態において、前記組成物（医薬組成物、第２の哺乳類免疫細胞を含む組成物、および／または誘導物質等）の総量は、複数の腫瘍部位のうちの１つへの単回の局所投与（腫瘍内注射等）のための分割用量に十分な量である。一部の実施形態において、前記組成物（医薬組成物、第２の哺乳類免疫細胞を含む組成物、および／または誘導物質等）の総量は、１つの腫瘍部位への単回の局所投与（腫瘍内注射等）と複数の腫瘍部位での複数回の分割用量投与との組み合わせを含む、複数回の局所投与に対して十分な量である。

例えば、本明細書に開示されるように前記医薬組成物の十分な用量を含むキットを提供してよく、それによって、例えば１週間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、２週間、３週間、４週間、６週間、８週間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、もしくは９ヶ月間のいずれか、またはそれ以上、等の長期間、個体の有効な治療が提供されてよい。キットは、前記医薬組成物の複数回単位用量および使用説明書も含んでいてよく、それらは病院薬局や調剤薬局等の薬局における保管と使用にとって十分な量で包装されてよい。

本発明のキットは適切に包装される。適した包装の例は、バイアル、ボトル、ジャー、フレキシブル包装（密閉されたマイラー（Mylar）またはプラスチック袋等）等を含むが、これらに限定されない。キットは任意に緩衝液および解説情報（interpretative information）等のさらなる構成物を提供してよい。本出願は、従って、バイアル（密閉バイアル等）、ボトル、ジャー、フレキシブル包装等を含む製品も提供する。

該製品は、容器、および該容器上の、または該容器に付随する、ラベルまたは添付文書を含みうる。適した容器は、ボトル、バイアル、注射器等を含む。該容器はガラスまたはプラスチック等の各種材料から形成されてよい。一般に、該容器は、本明細書に記載の疾患または障害を治療するのに有効な組成物を保持し、無菌のアクセスポートを有していてよい（例えば、該容器は、静脈注射用溶液袋、または皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアル等であってよい）。前記ラベルまたは添付文書は、前記組成物が個体における特定の状態を治療するために使用される旨を示すものである。該ラベルまたは添付文書はさらに、該個体に該組成物を投与するための説明を含みうる。本明細書に記
載の併用療法を含む製品およびキットも企図される。

添付文書とは、治療用製品の使用に関する、適応症、用法、用量、投与、禁忌、および／または警告についての情報を含む、該治療用製品の市販包装に慣例的に含められる説明書のことを表す。一部の実施形態において、添付文書は、前記組成物が固形腫瘍（膠芽腫等）の治療に使用されることを示すものである。

また、前記製品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンガー溶液、およびデキストロース溶液等の薬理学的に許容される緩衝剤を含む、第２の容器をさらに含んでいてよい。また、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、および注射器等、商業上および利用者の立場から望ましい他の構成要素を含んでいてよい。

以下の実施例は純粋に本発明の例示を意図するものであり、従って、どのような面からも本発明を限定するものと考えるべきではない。次の実施例および詳細な説明は説明の目的で提供されるものであり、限定の目的で提供されるものではない。

実施例１：初代Ｔ細胞および他の哺乳類細胞における機能的抗体の発現
構成的プロモーターｈＥＦ１α、ドキシサイクリン誘導性プロモーター（ＴＥＴＯＮ（登録商標）等）、ＮＦＡＴ依存誘導性プロモーター、または熱誘導性プロモーター（ヒト熱ショックタンパク質７０プロモーターＨＳＰ７０ｐ等）によって駆動される抗体遺伝子を有する自己不活性化レンチウイルスベクターを設計および調製した。各抗体遺伝子は、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、および任意の他の目的とする標的から選択される、固有の抗原に対して特異的に抗体を発現することができる。初代ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、健常ドナー由来の末梢血を密度勾配遠心することで調製した。磁気ビーズ分離を用いてＰＢＭＣからヒト初代Ｔ細胞を精製し、プレ活性化した。次いで、プレ活性化されたＴ細胞に前記レンチウイルスベクターを形質導入し、ｅｘｖｉｖｏで数日間増殖させた。あるいは、２９３−６Ｅ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、間葉系幹細胞、精製ヒトＢ細胞、および他のＰＢＭＣ細胞等の他の宿主細胞に前記レンチウイルスベクターを形質導入し、抗体の発現に使用することができる。抗体の分泌を、均一性時間分解蛍光（homogenous time-resolved fluorescence）（ＨＴＦＲ）法を用いて検出した。あるいは、分泌された抗体の検出を、組換え抗原タグタンパク質により、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）で行うことができる。分泌された抗体の生物活性を、ｉｎｖｉｔｒｏレポーターアッセイを用いて評価した。

これらの実験に用いた材料および方法を以下に記載する。

自己不活性化レンチウイルスベクターの調製
ｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ（Ａｄｄｇｅｎｅ＃１２２５１）、ｐＲＳＶ−Ｒｅｖ（Ａｄｄｇｅｎｅ＃１２２５３）、およびｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ＃１２２５９）を含むレンチウイルスパッケージングプラスミド混合物を、抗体発現プラスミドｐＬＬＶ−プロモーター−抗ＰＤ−１ベクター（すなわち、ｐＬＬＶ−ｈＥＦ１α−抗ＰＤ−１、ｐＬＬＶ−ＴｅｔＯｎ−抗ＰＤ−１、ｐＬＬＶ−ＮＦＡＴ−抗ＰＤ−１、もしくはｐＬＬＶ−ＨＳＰ７０ｐ−抗ＰＤ−１）、またはｐＬＬＶ−プロモーター−抗ＣＴＬＡ−４ベクター（すなわち、ｐＬＬＶ−ｈＥＦ１α−抗ＣＴＬＡ−４、ｐＬＬＶ−ＴｅｔＯｎ−抗ＣＴＬＡ−４、ｐＬＬＶ−ＮＦＡＴ−抗ＣＴＬＡ−４、もしくはｐＬＬＶ−ＨＳＰ７０ｐ−抗ＣＴＬＡ−４）と、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）と共に、あらかじめ最適化された比率で予備混合した後、適切に混合して室温で５分間インキュベートした。次いで、トランスフェクション混合物をＨＥＫ２９３細胞に滴下し、おだやかに混合した。その後、細胞を３７℃の５％ＣＯ_２細胞インキュベーター内で一晩インキュベートした。４℃にて５００ｇ
で１０分間遠心分離した後、上清を回収した。

該上清を０．４５μｍのＰＥＳフィルターに通し、ウイルス上清を２０％ショ糖密度勾配超遠心により濃縮した。遠心分離後、上清を注意深く捨て、あらかじめ冷やしたＤＰＢＳでウイルスのペレットを慎重にリンスした。その後、ウイルスの濃度を測定した。ウイルスを適切に分注し、すぐに−８０℃で保管した。ウイルス力価を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって開発されたＨＴＲＦキットでｐ２４によって測定した。

ＰＢＭＣ調製
白血球を回収し、細胞濃度をＲ１０培地内で５×１０^６細胞／ｍＬに調整した。その後、白血球を０．９％ＮａＣｌ溶液と１：１（ｖ／ｖ）の比率で混合した。３ｍＬのｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ培地を１５ｍＬの遠心管に加え、ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ上に６ｍＬの希釈リンパ球混合物をゆっくりと重層した。リンパ球混合物を８００ｇで３０分間、２０℃にてブレーキ無しで遠心分離した。その後、リンパ球のバフィーコートを２００μＬのピペットで回収した。回収した画分を、少なくとも６倍の０．９％ＮａＣｌまたはＲ１０で希釈し、溶液の密度を低下させた。その後、回収した画分を２５０ｇで１０分間、２０℃にて遠心分離した。上清を完全に吸引し、１０ｍＬのＲ１０を細胞ペレットに加えた。該混合物をさらに２５０ｇで１０分間、２０℃にて遠心分離した。その後、上清を吸引した。３７℃にあらかじめ温めた２ｍＬのＲ１０と共に１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を細胞ペレットに加え、該細胞ペレットを静かに再懸濁した。細胞数を計数し、後の実験で使用可能なＰＢＭＣ試料とした。

Ｔ細胞精製
ＭｉｌｔｅｎｙｉＰａｎＴｃｅｌｌｉｓｏｌａｔｉｏｎｋｉｔ（Ｃａｔ＃１３０−０９６−５３５）を用いて、製造者が提供するプロトコルに従い、次のようにＰＢＭＣからヒトＴ細胞を精製した。細胞数を最初に測定した。細胞懸濁物を３００ｇで１０分間遠心分離した。上清を完全に吸引し、細胞ペレットを１０^７個の全細胞あたり４０μＬの緩衝液に再懸濁した。１０^７個の全細胞あたり１０μＬのＰａｎＴＣｅｌｌＢｉｏｔｉｎ−ＡｎｔｉｂｏｄｙＣｏｃｋｔａｉｌを添加し、十分に混合し、約５分間冷蔵庫（２〜８℃）内でインキュベートした。その後、１０^７個の細胞あたり３０μＬの緩衝液を添加した。１０^７個の細胞あたり２０μＬのＰａｎＴＣｅｌｌＭｉｃｒｏＢｅａｄＣｏｃｋｔａｉｌを添加した。該混合物をよく混合し、冷蔵庫（２〜８℃）内でさらに１０分間インキュベートした。最低でも５００μＬが磁気分離に必要であった。ＬＳカラムを適したＭＡＣＳ分離装置の磁場に設置した。３ｍＬの緩衝液でリンスすることでカラムの準備を行った。その後、細胞懸濁物を該カラム上にアプライし、濃縮されたＴ細胞画分に相当する非標識細胞を含むフロースルーを回収した。次いで、３ｍＬの緩衝液でカラムを洗浄することによりＴ細胞を回収し、その際、濃縮されたＴ細胞に相当する通過分の非標識細胞を回収して、先の工程のフロースルーと合わせた。その後、Ｔ細胞をＲ１０＋１００ＩＵ／ｍＬＩＬ−２中に再懸濁した。ｈｕｍａｎＴＣｅｌｌＡｃｔｉｖａｔｉｏｎ／ＥｘｐａｎｓｉｏｎＫｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ＃１３０−０９１−４４１）を用いて、該初代Ｔ細胞を形質導入に先立って３日間プレ活性化した。

Ｂ細胞精製
初代ヒトＢ細胞も磁気ビーズ分離法により調製した。ＰＢＭＣを上記の通り密度勾配遠心分離によって調製した。ＭｉｌｔｅｎｙｉＨｕｍａｎＢｃｅｌｌｉｓｏｌａｔｉｏｎｋｉｔ（Ｃａｔ＃１３０−０９１−１５１）を用いて、上記ヒトＴ細胞の調製と類似のプロトコルに従い、ＰＢＭＣからヒトＢ細胞を精製した。単離されたヒトＢ細胞を、ｅｘｖｉｖｏで、組換えＣＤ４０とＩＬ４タンパク質を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（Martina et al. PLoS ONE 3(1): e1464 (2008)）中で培養した。

ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞精製
初代ヒトＮＫ細胞を磁気ビーズ分離法により調製した。ＰＢＭＣを上記の通り密度勾配遠心によって調製した。ＭｉｌｔｅｎｙｉＨｕｍａｎＮＫｃｅｌｌｉｓｏｌａｔｉｏｎｋｉｔ（Ｃａｔ＃１３０−０９２−６５７）を用いて、上記ヒトＴ細胞の調製と類似のプロトコルに従い、ＰＢＭＣからヒトＮＫ細胞を精製した。単離されたヒトＮＫ細胞を、ｅｘｖｉｖｏで、２００ＩＵ／ｍＬの組換えＩＬ２タンパク質を添加したα−ＭＥＭ培地中で培養した。

間葉系幹細胞の調製
ヒトドナーの骨髄を局所麻酔下で腸骨稜から吸引によって採取し、次いで単核球をＦｉｃｏｌｌ分離法により単離する。その後、細胞を洗浄し、ＭＳＣ培地（ダルベッコ改変イーグル培地−低グルコース／ペニシリン／ストレプトマイシン／１０％ウシ胎児血清）中に再懸濁し、組織培養フラスコに播種して、３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートする。ＭＳＣを、ＭＳＣ増殖のための標準化ＬＵＭＣプロトコルに従い増殖させる。週に２回、培養物を顕微鏡観察し、培地を入れ替える。＞７０％コンフルエンスに達したら細胞をトリプシン処理し、各種サイズのＭＳＣの半製品（half products）（継代１）を１０％ジメチルスルホキシドと共に凍結保存する。

宿主細胞における抗体遺伝子の発現
初代ヒトＴ細胞、精製ヒトＢ細胞、および精製ヒトＮＫ細胞を含む宿主細胞への、段階希釈したウイルスストックによる形質導入を、７μｇ／ｍＬのポリブレンの存在下で、１２００ｇ、３２℃、１．５時間の遠心分離によって行った。その後、トランスフェクトされた細胞を細胞培養インキュベーターに移し、適した誘導条件下で導入遺伝子の発現を行う。具体的には、ｐＬＬＶ−ｈＥＦ１α−抗ＰＤ−１またはｐＬＬＶ−ｈＥＦ１α−抗ＣＴＬＡ−４を形質導入した宿主細胞を、誘導物質または誘導条件無しで４８時間インキュベートした。ｐＬＬＶ−ＴｅｔＯｎ−抗ＰＤ−１またはｐＬＬＶ−ＴｅｔＯｎ−抗ＣＴＬＡ−４を形質導入した宿主細胞を、各種濃度（０〜１２μｇ／ｍＬ）のドキシサイクリンと共に４８時間インキュベートした。ｐＬＬＶ−ＮＦＡＴ−抗ＰＤ−１またはｐＬＬＶ−ＮＦＡＴ−抗ＣＴＬＡ−４を形質導入した宿主細胞を、各種濃度（０〜５０ｎｇ／ｍＬＰＭＡ・１０００ｎｇ／ｍＬＰＨＡ−Ｐ）のＴ細胞活性化組成物ＰＭＡ／ＰＨＡ−Ｐと共に４８時間インキュベートした。ｐＬＬＶ−ＨＳＰ７０ｐ−抗ＰＤ−１またはｐＬＬＶ−ＨＳＰ７０ｐ−抗ＣＴＬＡ−４を形質導入した宿主細胞に、形質導入直後、温度を制御したウォーターバス中で、３７℃、３９℃、４１℃、４３℃、または４４℃の２０分間の熱ショックを加えた。熱ショック後、細胞を６ウェルプレートに播種し直し、３７℃、５％ＣＯ_２の細胞培養インキュベーターでさらに３日間増殖させた。温度誘導性プロモーターを有する他の構築物については、宿主細胞を２４〜７２時間インキュベートした後、最適温度（３７℃〜４５℃等）において一定時間（例えば１０分間、２０分間または３０分間等）誘導することができる。

導入遺伝子の発現の誘導後、宿主細胞の各バッチからの分泌抗体を、例えば均一性時間分解蛍光法（homogenous time-resolved fluorescence）（ＨＴＲＦ、時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（Time resolved-fluorescence resonance energy transfer）すなわちＴＲ−ＦＲＥＴとしても知られる）またはＥＬＩＳＡ等の各種方法を用いて検出することができる。ＥＬＩＳＡについては、簡単に記載すると、ＭＡＸＩ−ＳＯＲＰ（登録商標）ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ、ｃａｔ＃４４−２４０４−２１）をヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＵＮＬＢでプレコーティングする。ブロッキングと洗浄の後、形質導入細胞からの上清を順次プレートに加える。洗浄後、ヤギ抗ヒトκ−ＨＲＰを該プレートに加え、ＨＲＰの基質であるＤＡＢを標準的なＥＬＩＳＡの手順に従って加える。その後、プレートをＦＬＥＸＳＴＡＴＩＯＮ（商標）３等のマイクロプレートリーダー上で読み取る。

ここで、宿主細胞の各バッチから分泌された抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ−４抗体を、ＬＡＮＰＯＷＥＲ（商標）ＨｕｍａｎＦｃＤｅｔｅｃｔｉｏｎｋｉｔ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ＃Ｌ００６５６−１０００）を用いて均一性時間分解蛍光法（ＨＴＲＦ）により検出した。該キットは試料中のヒトＦｃタグ化タンパク質またはヒトＩｇＧを検出するために使用することができる。該キットは競合イムノアッセイであり、ユーロピウム（ＬＡＮＰＯＷＥＲ（商標）Ｅｕ）で標識したポリクローナル抗体（Ｆｃ特異的）、およびＧＳ６６５色素で標識したヒトＩｇＧを含む。Ｅｕ標識ポリクローナル抗体がＧＳ６６５標識ヒトＩｇＧのＦｃ領域に結合すると、ＦＲＥＴが発生する。ヒトＩｇＧまたはヒトＦｃタグ化タンパク質を含む試料を加えると、ＦＲＥＴシグナルが減少することになる。検出されたＦＲＥＴシグナルは、加えた試料中のヒトＩｇＧまたはヒトＦｃタグ化タンパク質の濃度と逆相関する。簡単に記載すると、ヒトＩｇＧ−ＧＳ６６５、抗ヒトＦｃ抗体−Ｅｕ、および抗体試料または対照をアッセイプレート中で混合し、１．５時間インキュベートした。プレートをＨＴＲＦ対応機器（ＰＨＥＲＳＴＡＲ（商標）ｐｌｕｓｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｒｅａｄｅｒ、Ｅｘ：３２０〜３４０ｎｍ、Ｅｍ：６２０ｎｍおよび６６５ｎｍ）上で読み取った。

レンチウイルスベクターｐＬＬＶ−ｈＥＦ１α−抗ＰＤ−１（またはｐＬＬＶ−ｈＥＦ１α−抗ＣＴＬＡ−４）によって形質導入した際、宿主細胞（初代ヒトＴ細胞、精製ヒトＢ細胞、および精製ヒトＮＫ細胞）は抗ＰＤ−１抗体（または抗ＣＴＬＡ−４抗体）を構成的に分泌し、これを形質導入４８時間後にＨＴＲＦによって検出することができた（図８Ａ〜８Ｃ）。抗ＰＤ−１抗体は、形質導入Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびＮＫ細胞から、それぞれ、９．４５±１．１７μｇ／ｍＬ、３．３１±０．０１μｇ／ｍＬ、および８．５１±０．８３μｇ／ｍＬの濃度で分泌された。抗ＣＴＬＡ−４抗体の発現量は、同一種類の宿主細胞中で抗ＰＤ−１抗体よりもはるかに高かった。形質導入Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびＮＫ細胞の上清中に検出された抗ＣＴＬＡ−４抗体の濃度は、それぞれ、２６．８９±２．７４μｇ／ｍＬ、２９．６６±３．０６μｇ／ｍＬ、および１２２．１２±１１．０９μｇ／ｍＬであった。

初代ヒトＴ細胞にレンチウイルスベクターｐＬＬＶ−ＴｅｔＯｎ−抗ＰＤ−１（またはｐＬＬＶ−ＴｅｔＯｎ−抗ＣＴＬＡ−４）を形質導入した際、抗ＰＤ−１抗体（または抗ＣＴＬＡ−４抗体）が誘導剤であるドキシサイクリンに対して用量依存的に分泌された（図９Ａ〜９Ｂ）。１２μｇ／ｍＬのドキシサイクリンによる４８時間の誘導期間の後、７．５３±０．８９μｇ／ｍＬの抗ＰＤ−１抗体および５３．６７±６．７４μｇ／ｍＬの抗ＣＴＬＡ−４抗体が、それぞれ対応する形質導入Ｔ細胞の上清中に検出された。ドキシサイクリン無しの場合、抗ＰＤ−１抗体および抗ＣＴＬＡ−４抗体の両者の自然発現は、ドキシサイクリン処理した対応する形質導入細胞のものよりもずっと低かった。

初代ヒトＴ細胞にレンチウイルスベクターｐＬＬＶ−ＮＦＡＴ−抗ＰＤ−１（またはｐＬＬＶ−ＮＦＡＴ−抗ＣＴＬＡ−４）を形質導入した際、抗ＰＤ−１抗体（または抗ＣＴＬＡ−４抗体）がＰＭＡ／ＰＨＡ−Ｐ等のＴ細胞賦活剤に対して用量依存的に分泌された（図１０Ａ〜１０Ｂ）。上記結果と同様、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、抗ＰＤ−１抗体よりもずっと高い濃度で形質導入初代ヒトＴ細胞から分泌された。５０ｎｇ／ｍＬのＰＭＡおよび１０００ｎｇ／ｍＬのＰＨＡ−Ｐによる４８時間の誘導期間の後、抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ−４抗体の分泌は、それぞれ９．５７±１．２４μｇ／ｍＬおよび４９．３９±５．５３μｇ／ｍＬに達した。誘導剤ＰＭＡ／ＰＨＡ−Ｐ無しの場合、抗体の自然発現は、ＰＭＡ／ＰＨＡ−Ｐで処理した対応する宿主細胞と比べて低かった。

図１１に示す通り、初代Ｔ細胞をレンチウイルスベクターｐＬＬＶ−ＨＳＰ６０ｐ−抗ＰＤ−１によって形質導入し、温度を上昇させて熱ショックを行った場合、抗ＰＤ−１抗体は、生理学的温度でインキュベートした対応する形質導入宿主細胞における場合（３７
℃で６０８．４ｎｇ／ｍＬ）と比べ、有意に高い濃度で分泌された（３９℃で７０９．５ｎｇ／ｍＬ、４１℃で８４４．２ｎｇ／ｍＬ、４３℃で８６６．８ｎｇ／ｍＬ、４４℃で９５７．８ｎｇ／ｍＬ）。

実施例２：改変宿主細胞によるｉｎｖｉｔｒｏ分泌抗体の機能アッセイ
レポーター細胞株の作製
安定的にＰＤ−１を発現するレポーター細胞株を確立した。簡単に記載すると、レンチウイルスベクターの改変を、ｐＬＶＸ−Ｐｕｒｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ＃６３２１６４）を用いて、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔにより、本来のプロモーターをヒト伸長因子１αプロモーター（ｈＥＦ１α）で置き換え、ピューロマイシン耐性遺伝子をＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩを有するＴ２Ａ連結Ｇ４１８耐性遺伝子で置き換えることによって行った。該ベクターは、ｐＬＬＶ−ｈＥＦ１α−Ｔ２Ａ−Ｇ４１８Ｒと命名され、分子クローニングの際にいくつかの新たな制限部位ＭｌｕＩ、ＨｐａＩ、およびＢａｍＨＩが該ベクターに加えられた。ヒトＰＤ−１遺伝子（ＮＣＢＩ参照配列番号：ＮＭ＿００５０１８．２）配列を、ＥｃｏＲＩ／ＨｐａＩを介して、ｐＬＬＶ−ｈＥＦ１α−Ｔ２Ａ−Ｇ４１８Ｒベクターにクローニングし、ｐＬＬＶ−ｈＥＦ１α−ＰＤ−１−Ｔ２Ａ−Ｇ４１８Ｒを提供した。これをさらに、上記実施例中に記載されるようにレンチウイルスパッケージング手順で処理した。研究室内で以前に確立した宿主細胞株Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ．Ｌｕｃ（ピューロマイシン耐性）への、ＰＤ−１遺伝子を有するレンチウイルスによる形質導入を、７μｇ／ｍＬのポリブレンの存在下で、１２００ｇ、３２℃、１．５時間の遠心分離によって行った。その後、形質導入された細胞を細胞培養インキュベーターに移し、適した誘導条件下で導入遺伝子の発現を行った。陽性細胞をネオマイシン（Ｇ４１８）により選択し、単一クローンを限界希釈法によって選択した。最良のクローンを、抗ＰＤ−１抗体を用いてＦＡＣＳにより選別した。図１２Ａに示す通り、Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ．Ｌｕｃ−ＰＤ−１と命名された陽性クローン（Ｊｕｒｋａｔ．ＮＦＡＴ．Ｌｕｃ．ＰＤ１としても知られる）の例では９５．２％がＰＤ−１タンパク質を発現した。

安定的にＰＤ−Ｌ１を発現するレポーター細胞株も作製した。簡単に記載すると、ヒトＰＤ−Ｌ１遺伝子（ＮＣＢＩ参照配列番号：ＮＭ＿０１４１４３．３）配列を、ＥｃｏＲＩ／ＨｐａＩを介して、ｐＬＬＶ−ｈＥＦ１α−Ｔ２Ａ−Ｇ４１８Ｒにクローニングし、ベクターｐＬＬＶ−ｈＥＦ１α−ＰＤ−Ｌ１−Ｔ２Ａ−Ｇ４１８Ｒを提供した。これをさらに、上記実施例中に記載されるようにレンチウイルスパッケージング手順で処理した。その後、宿主細胞株ＣＨＯへの、ＰＤ−Ｌ１遺伝子を有するレンチウイルスによる形質導入を行い、上記のようにＧ４１８による選択を行った。ＣＨＯ／ＰＤ−Ｌ１安定細胞を、１．２５μｇ／ｍｌのＰＤ−１−Ｆｃ融合タンパク質による染色、ＤＰＢＳによる３回の洗浄、その後、２μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ標識抗ヒトＦｃによる染色によって、ＦＡＣＳにより選択した。図１２Ｂに示す通り、ＣＨＯ／ＰＤ−Ｌ１と命名された陽性クローン（ＣＨＯ．ＰＤＬ１としても知られる）の例では９５．２％がＰＤ−Ｌ１タンパク質を発現した。

安定的にＣＴＬＡ−４を発現するレポーター細胞株も確立した。ヒトＣＴＬＡ−４遺伝子（ＮＣＢＩ参照配列番号：ＮＭ＿００５２１４．４）配列を、ＥｃｏＲＩ／ＨｐａＩを介して、ｐＬＬＶ−ｈＥＦ１α−Ｔ２Ａ−Ｇ４１８Ｒにクローニングし、ベクターｐＬＬＶ−ｈＥＦ１α−ＣＴＬＡ４−Ｔ２Ａ−Ｇ４１８Ｒを提供した。これをさらに、上記実施例中に記載されるようにレンチウイルスパッケージング手順で処理した。ヒトＣＴＬＡ−４遺伝子を有するレンチウイルスを、以前に研究室内で作製したＪｕｒｋａｔ．ＩＬ−２プロモーターＡ．Ｌｕｃ安定細胞に導入した。陽性細胞をネオマイシン（Ｇ４１８）により選択し、単一クローンを限界希釈法によって選択した。最良のクローンを、抗ＣＴＬＡ−４抗体を用いてＦＡＣＳにより選別した。図１２Ｃに示す通り、Ｊｕｒｋａｔ／ＩＬ−２プロモーター．Ｌｕｃ−ＣＴＬＡ−４と命名されたクローン（Ｊｕｒｋａｔ．ＩＬ２ｐ
Ａ．Ｌｕｃ．ＣＴＬＡ４としても知られる）の例では３０．６％がＣＴＬＡ−４タンパク質を発現した。

直接ＦＡＣＳ結合アッセイ
分泌された抗ＰＤ−１抗体の結合親和性を、安定細胞株Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ．Ｌｕｃ−ＰＤ−１上で発現するＰＤ−１タンパク質への結合によって測定した。簡単に記載すると、５×１０^５個のＪｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ．Ｌｕｃ−ＰＤ−１細胞を、実施例１の改変宿主細胞から分泌された抗ＰＤ−１抗体（０、０．１、０．３、１、３、１０μｇ／ｍＬ）を含む段階希釈した上清と共に、室温で２時間インキュベートした。細胞洗浄を数サイクル行った後、ヒトＩｇＧに対するフルオロフォア標識二次抗体を加え、細胞に結合した抗ＰＤ−１抗体をＦＡＣＳにより検出した。Ｊｕｒｋａｔ／ＣＴＬＡ−４細胞を陰性対照として使用した。

分泌された抗ＣＴＬＡ−４抗体の結合親和性を、研究室内で作製した安定細胞株Ｊｕｒｋａｔ／ＩＬ−２プロモーター．Ｌｕｃ−ＣＴＬＡ−４上で発現するＣＴＬＡ−４タンパク質への結合によって測定した。５×１０^５個のＪｕｒｋａｔ／ＩＬ−２プロモーター．Ｌｕｃ−ＣＴＬＡ−４細胞を、実施例１の改変宿主細胞から分泌された抗ＣＴＬＡ−４抗体を含む段階希釈した上清と共に、室温で２時間インキュベートした。細胞洗浄を数サイクル行った後、ヒトＩｇＧに対するフルオロフォア標識二次抗体を加え、細胞に結合した抗ＣＴＬＡ−４抗体をＦＡＣＳにより検出した。Ｊｕｒｋａｔ／ＰＤ−１細胞を陰性対照として使用した。

図１３Ａに示すように、改変宿主細胞から分泌された抗ＰＤ−１抗体はＪｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ．Ｌｕｃ−ＰＤ−１安定細胞に用量依存的に結合し、０．２μｇ／ｍＬの濃度において９９．５％の結合が達成された。一方、抗ＰＤ−１抗体はＪｕｒｋａｔ／ＩＬ−２プロモーター．Ｌｕｃ−ＣＴＬＡ−４細胞に結合しなかった。図１３Ｂに示すように、改変宿主細胞から分泌された抗ＣＴＬＡ−４抗体はＪｕｒｋａｔ／ＩＬ−２プロモーター．Ｌｕｃ−ＣＴＬＡ−４安定細胞に用量依存的に結合（０．１μｇ／ｍＬで３．７７％、１μｇ／ｍＬで６．４９％、１０μｇ／ｍＬで１３．２０％）したが、Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ．Ｌｕｃ−ＰＤ−１細胞には結合しなかった（＜２％）。

形質導入安定細胞株が発現した抗体の機能的活性
Ｔ細胞活性化の回復に対する抗ＰＤ−１抗体の効果を評価するため、１〜５×１０^５個のＪｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ．Ｌｕｃ−ＰＤ−１レポーター細胞を、ＣＨＯ／ＰＤ−Ｌ１細胞と共に、異なるＥ／Ｔ比（１：１、１０：１、２０：１、１：１０、１：２０等）で、実施例１の改変宿主細胞から分泌された抗ＰＤ−１抗体（例えば、world wide web.Drugbank.ca上のアクセッション番号ＤＢ０９０３７の配列を有するペムブロリズマブ等）の存在下で、一定時間（４時間から７２時間等）インキュベートする。並行して、無関係な遺伝子を有するレンチウイルスベクターを同一の細胞株に形質導入し、陰性対照とする。

１×１０^５〜５×１０^５個のＪｕｒｋａｔ／ＩＬ−２プロモーター．Ｌｕｃ−ＣＴＬＡ−４レポーター細胞を、ＣＤ８０／ＣＤ８６を発現する抗原提示細胞（ＲａｊｉまたはＵ８７ＭＧ等）と共に、異なるＥ／Ｔ比（１：１、１０：１、２０：１、１：１０、１：２０等）で、実施例１の改変宿主細胞から分泌された抗ＣＴＬＡ−４抗体の存在下で、一定時間（４時間から７２時間等）インキュベートする。並行して、無関係な遺伝子を有するレンチウイルスベクターを同一の細胞株に形質導入し、陰性対照とする。

抗ＣＤ３／ＣＤ−２８ビーズまたはＰＭＡ／ＰＨＡ−Ｐ等の非抗原特異的Ｔ細胞賦活剤を加え、Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ．Ｌｕｃ−ＰＤ−１またはＪｕｒｋａｔ／ＩＬ−２プロモーター．Ｌｕｃ−ＣＴＬＡ−４レポーター細胞を活性化する。インキュベートした後、
ＯＮＥ−ＧＬＯ（商標）ルシフェラーゼアッセイ試薬を、共培養した細胞に加える。相対発光単位（relative light unit）（ＲＬＵ）で測定したアッセイウェルからのルシフェラーゼ活性を、各レポーター細胞の活性化の度合いとする。

改変宿主細胞から分泌された抗ＰＤ−１抗体は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用を遮断することによって、ヒトＩｇＧ抗体を発現する陰性対照との比較におけるＲＬＵの増加によって示唆される、Ｔ細胞活性化の回復をもたらす可能性がある。そして、このような効果は、抗ＰＤ−１抗体の濃度に依存する可能性がある。

改変宿主細胞から分泌された抗ＣＴＬＡ−４抗体は、ＣＴＬＡ−４／ＣＤ８０−ＣＤ８６相互作用を遮断することによって、ヒトＩｇＧ抗体を発現する陰性対照との比較におけるＲＬＵの増加によって示唆される、Ｔ細胞活性化の回復をもたらす可能性がある。そして、このような効果は、抗ＣＴＬＡ−４抗体の濃度に依存する可能性がある。

形質導入安定細胞株によるＣＴＬＡ−４遮断のレポーターアッセイ
ヒトリンパ腫細胞株Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ、＃ＣＣＬ８６）を、使用説明書に従い、１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。Ｒａｊｉ細胞は、ＣＴＬＡ−４リガンドであるＣＤ８０およびＣＤ８６を高レベルで発現することが示されている（International Immunology 10(4):499-506. May 1998）。抗ＣＴＬＡ−４抗体を、ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞への、イピリムマブ全長ＩｇＧコード配列（world wide web.Drugbank.ca、アクセッション番号：ＩｐｉｌｉｍｕｍａｂＤＢ０６１８６）を有するレンチウイルスベクターの形質導入によって得た。該形質導入細胞を抗ＣＴＬＡ４の分泌に適した条件下で培養し、上清を回収して、細胞に基づいたアッセイに用いた。１×１０^５個のＪｕｒｋａｔ／ＩＬ−２プロモーター．Ｌｕｃ．ＣＴＬＡ−４細胞を９６ウェルアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３６１０）に播種し、次いで最終濃度２０μｇ／ｍＬで抗ＲＯＲ１または抗ＣＴＬＡ−４を加え、３７℃の細胞培養インキュベーター内で１時間インキュベートした。その後、３．２×１０^５個のＲａｊｉ細胞を各ウェルに加え、共培養アッセイをさらに２４または４８時間継続した。共培養完了後、各ウェル内のルシフェラーゼ活性を、ＯＮＥ−ＧＬＯ（商標）ルシフェラーゼ活性アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｅ６１１０）を用いて、使用説明書に従い測定した。プレートをＰＨＥＲＳＴＡＲ（商標）Ｐｌｕｓマイクロプレートリーダー上で読み取った。図１４に示すように、前記共培養アッセイを４８時間行った場合、抗ＣＴＬＡ−４（イピリムマブ）は、関連の無い抗体（抗ＲＯＲ１）との比較において、約２．４倍高いＲＬＵシグナルを示した（２７，９１４．００±３４３１．００ＲＬＵ対１１，５８５．００±３０３．００、平均値±標準誤差）。このデータは、上記ＣＴＬＡ−４レポーターアッセイにおいて、ＣＴＬＡ−４遮断がＩＬ−２プロモーター駆動ルシフェラーゼ遺伝子発現を強力に回復させることができたことを示唆する。

改変初代ヒトＴ細胞がｉｎｖｉｔｒｏで発現した抗体の機能的活性
ＰＤ−Ｌ１遺伝子および１個の標的遺伝子（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ならびにルシフェラーゼ遺伝子を、レンチウイルスベクターを用いて、ヒト膠芽腫腫瘍細胞株（Ｕ８７ＭＧ）に導入した。簡単に記載すると、ヒトＰＤ−Ｌ１遺伝子（ＮＣＢＩ参照配列番号：ＮＭ＿０１４１４３．３）配列を、ＥｃｏＲＩ／ＨｐａＩを介して、ｐＬＬＶ−ｈＥＦ１α−Ｔ２Ａ−Ｇ４１８Ｒベクターにクローニングし、ベクターｐＬＬＶ−ｈＥＦ１α−ＰＤ−Ｌ１−Ｔ２Ａ−Ｇ４１８Ｒを提供した。これをさらに、上記のようにレンチウイルスパッケージング手順で処理した。ヒト上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）ヌクレオチド配列を、野生型ＥＧＦＲ（ＮＭ＿００５２２８）からエクソン２〜７を欠失させ、それによってコード配列の８０１塩基対をインフレーム欠失させ、繋ぎ目で新規グリシン残基を生成することによって得た（Endocrine-Related Cancer(2001)883-96）。ＥＧＦＲｖＩＩＩヌクレオチド配列を、ＸｈｏＩ／ＸｂａＩ制限酵素でｐＬＶＸ−Ｐ
ｕｒｏベクターにクローニングし、ｐＬＶＸ−ＥＧＦＲｖＩＩＩベクターを提供した。これをさらに、上記のようにレンチウイルスパッケージング処理した。陽性細胞をＧ４１８とピューロマイシンによりスクリーニングし、単一クローンを限界希釈法によって得た。

細胞をセツキシマブに結合し、次いで、３×１ｍＬＤＢＰＳ洗浄、抗ヒトＩｇＧ検出抗体による染色、およびＡＴＴＵＮＥＮＸＴ（商標）フローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）上でのＦＡＣＳ分析を行うことにより、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現を確認した。図１５Ａに示すように、ＥＧＦＲｖＩＩＩ導入遺伝子の発現が細胞上で検出された（４５．９％発現）。細胞をＰＥ標識抗ＰＤ−Ｌ１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃３２９７０２）で染色し、ＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲ（商標）（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でＦＡＣＳを行うことでＰＤ−Ｌ１発現を確認した。図１５Ｂに示すように、ＰＤ−Ｌ１の発現が８８．３％の細胞上で検出された。ルシフェラーゼ遺伝子の発現をＯＮＥ−ＧＬＯ（商標）ルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）で確認し、ＰＨＥＲＳＴＡＲ（商標）ｐｌｕｓマイクロプレートリーダー（ＢＭＧＬａｂｔｅｃｈ）上で読み取った。Ｕ８７ＭＧ／ＶＩＩＩ−Ｌｕｃ−ＰＤ−Ｌ１と命名された最適クローン（Ｕ８７ＭＧ．ＥＧＦＲＶ３．Ｌｕｃ．ＰＤＬ１またはＵ８７ＭＧ．ＶＩＩＩ−Ｌｕｃ．ＰＤＬ１としても知られる）の例では、形質導入していない細胞と比べ、相対発光単位シグナルで示されたルシフェラーゼ活性で９８．８９倍の増加が見られた。

同様に、ＣＴＬＡ−４リガンド遺伝子（ＣＤ８０／ＣＤ８６）および本願発明者らの目的の１個の標的遺伝子、ならびにルシフェラーゼ遺伝子を、レンチウイルスベクターを用いて、ヒト腫瘍細胞株（Ｕ８７ＭＧ）に導入する。最適クローンの一つはＵ８７ＭＧ／ＶＩＩＩ−Ｌｕｃ−ＣＤ８０／ＣＤ８６と命名されている。

抗ＰＤ−１遺伝子を有するレンチウイルスベクター（すなわち、ｐＬＬＶ−ｈＥＦ１α−抗ＰＤ−１、ｐＬＬＶ−ＴｅｔＯｎ−抗ＰＤ−１、ｐＬＬＶ−ＮＦＡＴ−抗ＰＤ−１、またはｐＬＬＶ−ＨＳＰ７０ｐ−抗ＰＤ−１）を形質導入した初代Ｔ細胞と、ＰＤ−Ｌ１を過剰発現するＵ８７ＭＧ／ＶＩＩＩ−Ｌｕｃ−ＰＤ−Ｌ１細胞とを、異なるＥ／Ｔ比（１：１、１０：１、２０：１、１：１０、１：２０等）で、適した誘導条件下、一定時間（４時間から７２時間等）共培養する。抗ＣＴＬＡ−４遺伝子を有するレンチウイルスベクター（すなわち、ｐＬＬＶ−ｈＥＦ１α−抗ＣＴＬＡ−４、ｐＬＬＶ−ＴｅｔＯｎ−抗ＣＴＬＡ−４、ｐＬＬＶ−ＮＦＡＴ−ＣＴＬＡ−４、またはｐＬＬＶ−ＨＳＰ７０ｐ−ＣＴＬＡ−４）を形質導入した初代ヒトＴ細胞と、ＣＴＬＡ−４リガンドを過剰発現するＵ８７ＭＧ／ＶＩＩＩ−Ｌｕｃ−ＣＤ８０／ＣＤ８６細胞とを、各種誘導条件下で共培養する。抗体分泌初代ヒトＴ細胞の、腫瘍細胞に対する細胞毒性効果を、残存ルシフェラーゼ活性によってモニタリングする。

並行して、無関係の遺伝子を形質導入した初代ヒトＴ細胞を前記アッセイに含め、陰性対照とする。同様なアッセイ形式により、前記共培養アッセイにおけるＩＬ−２分泌を、ＨＴＲＦキットを用いてアッセイする。同様なアッセイ形式により、前記共培養アッセイにおけるＩＦＮ−ガンマ分泌を、ＨＴＲＦキットを用いてアッセイする。

改変初代Ｔ細胞によって分泌された抗ＰＤ−１抗体は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用を遮断することによって、ウェル内の残存ルシフェラーゼ活性によって示されるように、また、陰性対照との比較におけるＩＬ−２またはＩＦＮ−ガンマの分泌の増加によって示されるように、Ｔ細胞活性化と細胞毒性の回復をもたらす可能性がある。このような効果はエフェクター／標的細胞比に対して用量依存的である可能性がある。

改変初代Ｔ細胞によって分泌された抗ＣＴＬＡ−４抗体は、ＣＴＬＡ−４／ＣＤ８０−ＣＤ８６相互作用を遮断することによって、ウェル内の残存ルシフェラーゼ活性によって
示されるように、また、陰性対照との比較におけるＩＬ−２またはＩＦＮ−ガンマの分泌の増加によって示されるように、Ｔ細胞活性化と細胞毒性の回復をもたらす可能性がある。このような効果はエフェクター／標的細胞比に対して用量依存的である可能性がある。

実施例３：改変初代ヒトＴ細胞が発現した抗ＰＤ−１抗体は腫瘍細胞に対するＣＡＲ−Ｔ細胞毒性をｉｎｖｉｔｒｏで増強する
抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲ構築物（ＧＳＩ０２６）を設計し、レンチウイルスベクターに導入した。該抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲ遺伝子は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＣＤ８αシグナルペプチド、ヒト化抗ＥＧＦＲｖＩＩＩｓｃＦｖ、ＣＤ８αヒンジおよび膜貫通（ＴＭ）領域、ＣＤ１３７細胞質ドメイン（ＣＤ１３７ｃｙｔｏ）、およびＣＤ３ζを含んだ全長抗ＥＧＦＲｖＩＩＩＣＡＲを含む。中国特許出願第ＣＮ２０１６１１０３９８５５．０号を参照のこと。次のＴ細胞の実験群を作製した：（１）Ｔ／ＧＳＩ０２６：抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲ遺伝子（ＧＳＩ０２６）を有するレンチウイルスベクターを形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞；（２）Ｔ／抗ＰＤ−１：ＮＦＡＴプロモーターの制御下の抗ＰＤ−１抗体（ペムブロリズマブ）遺伝子を有するレンチウイルスベクターを形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞；（３）Ｔ／ＧＳＩ０２６・抗ＰＤ−１：抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲ遺伝子（ＧＳＩ０２６）とＮＦＡＴプロモーターの制御下の抗ＰＤ−１抗体（ペムブロリズマブ）遺伝子との両者を有するレンチウイルスベクターを形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞；および（４）ＵｎＴ：陰性対照としての無関係の遺伝子を形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞。さらに、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲ遺伝子を有するレンチウイルスベクターを形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞と、ＮＦＡＴプロモーターの制御下の抗ＰＤ−１抗体遺伝子を有するレンチウイルスベクターを形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞との混合物を作製し、腫瘍細胞に対する細胞毒性について評価することができる。

各群の改変初代ヒトＴ細胞（「エフェクター細胞」）を、ＰＤ−Ｌ１を過剰発現するＵ８７ＭＧ／ＶＩＩＩ−Ｌｕｃ−ＰＤ−Ｌ１細胞（「標的細胞」）と共に、異なるＥ／Ｔ比（５：１、１０：１、２０：１等）で、５日間共培養した。腫瘍細胞に対する抗体分泌初代ヒトＴ細胞の細胞毒性のモニタリングを、ＯＮＥ−ＧＬＯ（商標）発光アッセイキットを使用説明書に従って使用し、残存ルシフェラーゼ活性を測定することによって行った。該アッセイにおける低いＲＬＵ値は、Ｕ８７ＭＧ／ＶＩＩＩ−Ｌｕｃ−ＰＤ−Ｌ１細胞に対する改変Ｔ細胞の強い細胞毒性効果を表す。同様なアッセイ形式により、前記共培養アッセイにおける抗ＰＤ−１抗体およびＩＦＮ−ガンマ分泌を、対応するＨＴＲＦキットを用いて測定した。さらに、ＩＬ−２分泌を前記共培養アッセイにおいてモニタリングすることができる。

図１６Ａに示すように、標的細胞と共に５日間共培養した場合、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲと抗ＰＤ−１抗体の両者を発現するＣＡＲ−Ｔ細胞（Ｔ／ＧＳＩ０２６・抗ＰＤ−１）は、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲのみを発現するＣＡＲ−Ｔ細胞（Ｔ／ＧＳＩ０２６、ＲＬＵ＝５７，４７４±１９２２）または抗ＰＤ−１抗体のみを発現するＴ細胞（Ｔ／抗ＰＤ−１、ＲＬＵ＝１３８，５４９±５６２５）と比べて、Ｕ８７ＭＧ／ＶＩＩＩ−Ｌｕｃ−ＰＤ−Ｌ１腫瘍細胞に対する、より強力な細胞毒性（ＲＬＵ＝４５，１５１±７３８５）を示した。図１６Ｂに示すように、共培養５日後には、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲと抗ＰＤ−１抗体の両者を発現するＣＡＲ−Ｔ細胞（Ｔ／ＧＳＩ０２６・抗ＰＤ−１）は、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲのみを発現するＣＡＲ−Ｔ細胞（５４８．９８±１２．３９ｐｇ／ｍＬ）または抗ＰＤ−１抗体のみを発現するＴ細胞（３１４．０６±３８．６４ｐｇ／ｍＬ）と比べて、高い濃度のＩＦＮ−ガンマ（８２０．６６±３．２４ｐｇ／ｍＬ）を分泌した。

抗ＰＤ−１抗体分泌を図１６Ｃに示す。Ｕ８７ＭＧ／ｖＩＩＩ−ｌｕｃ−ＰＤ−Ｌ１細胞と共に１０：１のＥ／Ｔ比で３日間培養した場合、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲと抗Ｐ
Ｄ−１抗体の両者を発現するＣＡＲ−Ｔ細胞は、抗ＰＤ−１のみを発現するＴ細胞（０．４０±０．０４μｇ／ｍＬ）または標的細胞と共培養しなかったＣＡＲ−Ｔ細胞（０．４２±０．０１μｇ／ｍＬ）と比べて、より多くの抗ＰＤ−１抗体（０．５０±０．０２μｇ／ｍＬ）を分泌した。この結果は、前記標的細胞との共培養がＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＮＦＡＴプロモーターを誘導し、これによって該ＮＦＡＴプロモーターにより駆動される抗ＰＤ−１抗体遺伝子の発現が強化され、ひいては前記標的細胞に対する改変Ｔ細胞の細胞毒性が強化されることを示唆している。

ＮＦＡＴプロモーターに駆動される抗ＰＤ−１抗体遺伝子を発現するＣＡＲ−Ｔのこのような強化された細胞毒性は、ＣＡＲの標的が別の腫瘍抗原ＢＣＭＡである他のｉｎｖｉｔｒｏＣＡＲ−Ｔ死滅モデル（killing model）においても観察された。図１７に示すように、抗ＢＣＭＡ−ＣＡＲ遺伝子および抗ＰＤ−１抗体遺伝子の両者を有するレンチウイルスベクターを形質導入したヒト初代Ｔ細胞（Ｔ／ＢＣＭＡ−ＣＡＲ・抗ＰＤ−１）は、腫瘍関連抗原ＢＣＭＡと抑制性チェックポイント分子リガンドＰＤ−Ｌ１とを高度に発現したＲＰＭＩ−８２２６／Ｌｕｃ−ＰＤ−Ｌ１腫瘍細胞の増殖を強力に阻害した。抗ＢＣＭＡ−ＣＡＲおよび抗ＰＤ−１抗体の両者を発現するＣＡＲ−Ｔ細胞は、抗ＢＣＭＡ−ＣＡＲのみを発現するＣＡＲ−Ｔ細胞（ＲＬＵ：７４２９±９７１）または抗ＰＤ−１抗体のみを発現するＴ細胞（ＲＬＵ：２４，３９８±１８７５）よりも高い細胞毒性（ＲＬＵ：４８０７±６９８）を有していた。

これらのデータは、改変初代ヒトＴ細胞が発現した抗ＰＤ−１抗体が、腫瘍細胞に対するＣＡＲ−Ｔ細胞毒性をｉｎｖｉｔｒｏで強化することを示している。

同様に、抗ＰＤ−１抗体のための他のプロモーターの、改変Ｔ細胞の抗腫瘍効果に対する効果を評価するため、ｈＥＦ１αプロモーター、ドキシサイクリン誘導性プロモーター（例えばＴＥＴＯＮ（登録商標））、または熱誘導性プロモーター（例えばＨＳＰ７０ｐ）等の他のプロモーターを、上記実験におけるＮＦＡＴプロモーターの代わりに使用することができる。このようなプロモーターのもとで抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲおよび抗ＰＤ−１の両者を発現するＣＡＲ−Ｔ細胞も、Ｕ８７ＭＧ／ＶＩＩＩ−Ｌｕｃ−ＰＤ−Ｌ１腫瘍細胞を死滅させる効果が、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲのみを発現するＣＡＲ−Ｔ細胞または抗ＰＤ−１抗体のみを発現する初代Ｔ細胞よりも高い可能性がある。このような効果は、形質導入された抗ＰＤ−１遺伝子がＴｅｔ−Ｏｎ系の制御下である場合、ドキシサイクリン等の誘導物質に対して用量依存的である可能性がある。このような効果は、形質導入された抗ＰＤ−１遺伝子がＨＳＰ７０ｐの制御下である場合、熱ショックの温度または時間に依存する可能性がある。

実施例４：改変初代ヒトＴ細胞が発現した抗ＣＴＬＡ−４抗体はヒト腫瘍細胞に対するＣＡＲ−Ｔ細胞毒性をｉｎｖｉｔｒｏで増強する
次のＴ細胞の実験群を作製した：（１）Ｔ／ＧＳＩ０２６：抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲ遺伝子（ＧＳＩ０２６）を有するレンチウイルスベクターを形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞；（２）Ｔ／抗ＣＴＬＡ−４：ＮＦＡＴプロモーターの制御下の抗ＣＴＬＡ−４抗体（イピリムマブ）遺伝子を有するレンチウイルスベクターを形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞；（３）Ｔ／ＧＳＩ０２６抗ＣＴＬＡ−４：抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲ遺伝子（ＧＳＩ０２６）とＮＦＡＴプロモーターの制御下の抗ＣＴＬＡ−４抗体（イピリムマブ）遺伝子との両者を有するレンチウイルスベクターを形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞；および（４）ｕｎＴ：陰性対照としての無関係の遺伝子を形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞。さらに、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲ遺伝子を有するレンチウイルスベクターを形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞と、ＮＦＡＴプロモーターの制御下の抗ＣＴＬＡ−４抗体遺伝子を有するレンチウイルスベクターを形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞との混合物を作製し、腫瘍細胞に対する細胞毒性について評価することができる。

各群の改変初代ヒトＴ細胞（「エフェクター細胞」）を、ＣＤ８０／ＣＤ８６を過剰発現するＵ８７ＭＧ／ＶＩＩＩ−Ｌｕｃ−ＣＤ８０／ＣＤ８６細胞（「標的細胞」）と共に、異なるＥ／Ｔ比（５：１、１０：１、２０：１等）で、５日間共培養した。腫瘍細胞に対する抗体分泌初代ヒトＴ細胞の細胞毒性のモニタリングを、ＯＮＥ−ＧＬＯ（商標）発光アッセイキットを使用説明書に従って使用し、残存ルシフェラーゼ活性を測定することによって行った。該アッセイにおける低いＲＬＵ値は、Ｕ８７ＭＧ／ＶＩＩＩ−Ｌｕｃ−ＣＤ８０／ＣＤ８６細胞に対する改変Ｔ細胞の強い細胞毒性効果を表す。同様なアッセイ形式により、前記共培養アッセイにおける抗ＣＴＬＡ−４抗体、ＩＦＮ−ガンマ、およびＩＬ−２分泌を、対応するＨＴＲＦキットを用いて測定することができる。

図１８に示すように、標的細胞と共に５日間共培養した場合、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲと抗ＣＴＬＡ−４抗体の両者を発現するＣＡＲ−Ｔ細胞（Ｔ／ＧＳＩ０２６・抗ＣＴＬＡ−４）は、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲのみを発現するＣＡＲ−Ｔ細胞（Ｔ／ＧＳＩ０２６、ＲＬＵ＝６４，５７５±４７０６）または抗ＣＴＬＡ−４抗体のみを発現するＴ細胞（Ｔ／抗ＣＴＬＡ−４、ＲＬＵ：１２０，８３６±１０，４２４）と比べて、Ｕ８７ＭＧ／ＶＩＩＩ−Ｌｕｃ−ＣＤ８０／ＣＤ８６腫瘍細胞に対する、より強力な細胞毒性（ＲＬＵ＝４８，９８０±７０６３）を示した。これらのデータは、改変初代ヒトＴ細胞が発現した抗ＣＴＬＡ−４抗体が、腫瘍細胞に対するＣＡＲ−Ｔ細胞毒性をｉｎｖｉｔｒｏで強化することを示している。

同様に、抗ＣＴＬＡ−４抗体のための他のプロモーターの、改変Ｔ細胞の抗腫瘍効果に対する効果を評価するため、ｈＥＦ１αプロモーター、ドキシサイクリン誘導性プロモーター（例えばＴＥＴＯＮ（登録商標））、または熱誘導性プロモーター（例えばＨＳＰ７０ｐ）等の他のプロモーターを、上記実験におけるＮＦＡＴプロモーターの代わりに使用することができる。このようなプロモーターのもとで抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲおよび抗ＣＴＬＡ−４の両者を発現する初代Ｔ細胞も、Ｕ８７ＭＧ／ＶＩＩＩ−Ｌｕｃ−ＣＤ８０／ＣＤ８６腫瘍細胞を死滅させる効果が、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲのみを発現するＣＡＲ−Ｔ細胞、または抗ＣＴＬＡ−４抗体のみを発現するＴ細胞よりも、高い可能性がある。このような効果は、形質導入された抗ＣＴＬＡ−４遺伝子がＴｅｔ−Ｏｎ系の制御下である場合、ドキシサイクリン等の誘導物質に対して用量依存的である可能性がある。このような効果は、形質導入された抗ＣＴＬＡ−４遺伝子がＨＳＰ７０ｐの制御下である場合、熱ショックの温度または時間に依存する可能性がある。

実施例５：改変初代ヒトＴ細胞が発現した抗ＰＤ−１抗体はヒト固形腫瘍に対するＣＡＲ−Ｔ細胞毒性をｉｎｖｉｖｏで増強する
抗ＰＤ−１抗体のみ、または該抗体とキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）との組み合わせを発現する改変ヒト初代Ｔ細胞のｉｎｖｉｖｏでの有効性を、ヒト腫瘍細胞を移植したマウス異種移植モデル内で評価することができる。例えば、Ｕ８７ＭＧ／ＶＩＩＩ−Ｌｕｃ−ＰＤ−Ｌ１腫瘍細胞を一群のＮＳＧマウスに移植し、ヒト膠芽腫のマウス異種移植モデルが提供される。

改変ヒト初代Ｔ細胞を、実施例１に記載のように、各種形質導入プロトコルにより作製する。前記のモデル化されたマウスに、次の群の治療用細胞をそれぞれ注入する：（１）抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲ遺伝子を有するレンチウイルスベクターを形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞；（２）抗ＰＤ−１抗体遺伝子を有するレンチウイルスベクターを形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞；（３）抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲ遺伝子を有するレンチウイルスベクターを形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞と、抗ＰＤ−１抗体遺伝子を有するレンチウイルスベクターを形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞との混合物；（４）抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲ遺伝子および抗ＰＤ−１抗体遺伝子の両者を有するレンチウイルスベク
ターを形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞；ならびに（５）陰性対照としての無関係の遺伝子を形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞。前記抗ＰＤ−１抗体遺伝子はドキシサイクリン誘導性プロモーター（ＴＥＴＯＮ（登録商標）等）またはＮＦＡＴプロモーターの転写制御下にある。各処理条件における抗ＰＤ−１抗体の分泌は、マウスへの投与前に、またはマウスへの投与後に、適した条件で誘導される。

各処理条件の有効性を、腫瘍細胞の減少を含むいくつかのパラメーターにより評価する。処理前後に、ｉｎｖｉｖｏ生物発光イメージングによって腫瘍サイズをモニタリングしてもよい。

抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲおよび抗ＰＤ−１抗体の両者を発現する初代Ｔ細胞は、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲのみを発現する初代Ｔ細胞、または抗ＰＤ−１抗体のみを発現する初代Ｔ細胞よりも、Ｕ８７ＭＧ／ＶＩＩＩ−Ｌｕｃ−ＰＤ−Ｌ１腫瘍細胞を死滅させることにおいて、より強力である可能性がある。このような効果は、形質導入された抗ＰＤ−１遺伝子がＴｅｔ−ｏｎ系の制御下である場合、ドキシサイクリン対して用量依存的である可能性がある。このような効果は、形質導入された抗ＰＤ−１遺伝子の発現がＮＦＡＴ依存誘導性プロモーターの制御下である場合、ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗原特異的ＣＡＲ−Ｔの存在に依存する可能性がある。このような効果は、形質導入された抗ＰＤ−１遺伝子がＨＳＰ７０ｐの制御下である場合、熱ショックの温度または時間に依存する可能性がある。

実施例６：改変初代ヒトＴ細胞が発現した抗ＣＴＬＡ−４抗体はヒト固形腫瘍に対するＣＡＲ−Ｔ細胞毒性をｉｎｖｉｖｏで増強する
抗ＣＴＬＡ−４抗体のみ、または該抗体とキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）との組み合わせを発現する改変ヒト初代Ｔ細胞のｉｎｖｉｖｏでの有効性を、ヒト腫瘍細胞を移植したマウス異種移植モデル内で評価することができる。例えば、Ｕ８７ＭＧ／ＶＩＩＩ−Ｌｕｃ−ＣＤ８０／ＣＤ８６腫瘍細胞を一群のＮＳＧマウスに移植し、ヒト膠芽腫のマウス異種移植モデルが提供される。

改変ヒト初代Ｔ細胞を、実施例１に記載のように、各種形質導入プロトコルにより作製する。モデル化されたマウスに、次の群の治療用細胞をそれぞれ注入する：（１）抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲ遺伝子を有するレンチウイルスベクターを形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞；（２）抗ＣＴＬＡ−４抗体遺伝子を有するレンチウイルスベクターを形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞；（３）抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲ遺伝子を有するレンチウイルスベクターを形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞と、抗ＣＴＬＡ−４抗体遺伝子を有するレンチウイルスベクターを形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞との混合物；（４）抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲ遺伝子および抗ＣＴＬＡ−４抗体遺伝子の両者を有するレンチウイルスベクターをい形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞；ならびに（５）陰性対照としての無関係の遺伝子を形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞。前記抗ＣＴＬＡ−４抗体遺伝子はドキシサイクリン誘導性プロモーター（ＴＥＴＯＮ（登録商標）等）またはＮＦＡＴプロモーターの転写制御下にある。各処理条件における抗ＣＴＬＡ−４抗体の分泌は、マウスへの投与前に、またはマウスへの投与後に、適した条件で誘導される。

抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲおよび抗ＣＴＬＡ−４抗体の両者を発現する初代Ｔ細胞は、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲのみを発現する初代Ｔ細胞、または抗ＣＴＬＡ−４抗体のみを発現する初代Ｔ細胞よりも、Ｕ８７ＭＧ／ＶＩＩＩ−Ｌｕｃ−ＣＤ８０／ＣＤ８６腫
瘍細胞を死滅させることにおいて、より強力である可能性がある。このような効果は、形質導入された抗ＣＴＬＡ−４遺伝子がＴｅｔ−ｏｎ系の制御下である場合、ドキシサイクリン対して用量依存的である可能性がある。このような効果は、形質導入された抗ＣＴＬＡ−４遺伝子の発現がＮＦＡＴ依存誘導性プロモーターの制御下である場合、ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗原特異的ＣＡＲ−Ｔの存在に依存する可能性がある。このような効果は、形質導入された抗ＣＴＬＡ−４遺伝子がＨＳＰ７０ｐの制御下である場合、熱ショックの温度または時間に依存する可能性がある。

実施例７：改変初代ヒトＴ細胞が発現した抗ＰＤ−１抗体はヒト液性腫瘍に対するＣＡＲ−Ｔ細胞毒性をｉｎｖｉｖｏで増強する
抗ＰＤ−１抗体のみ、または該抗体とＣＡＲとの組み合わせを発現する改変ヒト初代Ｔ細胞のｉｎｖｉｖｏでの有効性を、ヒト腫瘍細胞を移植したマウス異種移植モデル内で評価することができる。例えば、ルシフェラーゼ導入遺伝子を発現するように改変されたヒト多発性骨髄腫細胞であるＲＰＭＩ−８２２６細胞を一群のＮＳＧマウスに移植し、ヒト多発性骨髄腫のマウス異種移植モデルが提供される。

改変ヒト初代Ｔ細胞を、実施例１に記載のように、各種形質導入プロトコルにより作製する。前記のモデル化されたマウスに、次の群の治療用細胞をそれぞれ注入する：（１）抗ＢＣＭＡ−ＣＡＲ遺伝子を有するレンチウイルスベクターを形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞；（２）抗ＰＤ−１抗体遺伝子を有するレンチウイルスベクターを形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞；（３）抗ＢＣＭＡ−ＣＡＲ遺伝子を有するレンチウイルスベクターを形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞と、抗ＰＤ−１抗体遺伝子を有するレンチウイルスベクターを形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞との混合物；（４）抗ＢＣＭＡ−ＣＡＲ遺伝子および抗ＰＤ−１抗体遺伝子の両者を有するレンチウイルスベクターを形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞；ならびに（５）陰性対照としての無関係の遺伝子を形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞。前記抗ＰＤ−１抗体遺伝子はドキシサイクリン誘導性プロモーター（ＴＥＴＯＮ（登録商標）等）またはＮＦＡＴプロモーターの転写制御下にある。各処理条件における抗ＰＤ−１抗体の分泌は、マウスへの投与前に、またはマウスへの投与後に、適した条件で誘導される。

抗ＢＣＭＡ−ＣＡＲおよび抗ＰＤ−１抗体の両者を発現する初代Ｔ細胞は、抗ＢＣＭＡ−ＣＡＲのみを発現する初代Ｔ細胞、または抗ＰＤ−１抗体のみを発現する初代Ｔ細胞よりも、ＲＰＭＩ−８２２６−Ｌｕｃ腫瘍細胞を死滅させることにおいて、より強力である可能性がある。このような効果は、形質導入された抗ＰＤ−１遺伝子がＴｅｔ−ｏｎ系の制御下である場合、ドキシサイクリン対して用量依存的である可能性がある。このような効果は、形質導入された抗ＰＤ−１遺伝子の発現がＮＦＡＴ依存誘導性プロモーターの制御下である場合、ＢＣＭＡ抗原特異的ＣＡＲ−Ｔの存在に依存する可能性がある。このような効果は、形質導入された抗ＰＤ−１遺伝子がＨＳＰ７０ｐの制御下である場合、熱ショックの温度または時間に依存する可能性がある。

実施例８：改変初代ヒトＴ細胞が発現した抗ＣＴＬＡ−４抗体はヒト液性腫瘍に対するＣＡＲ−Ｔ細胞毒性をｉｎｖｉｖｏで増強する
抗ＣＴＬＡ−４抗体のみ、または該抗体とＣＡＲとの組み合わせを発現する改変ヒト初代Ｔ細胞のｉｎｖｉｖｏでの有効性を、ヒト腫瘍細胞を移植したマウス異種移植モデル内で評価することができる。例えば、ルシフェラーゼ導入遺伝子を発現するように改変されたヒト多発性骨髄腫細胞であるＲＰＭＩ−８２２６細胞を一群のＮＳＧマウスに移植し
、ヒト多発性骨髄腫のマウス異種移植モデルが提供される。

改変ヒト初代Ｔ細胞を、実施例１に記載のように、各種形質導入プロトコルにより作製する。前記のモデル化されたマウスに、次の群の治療用細胞をそれぞれ注入する：（１）抗ＢＣＭＡ−ＣＡＲ遺伝子を有するレンチウイルスベクターを形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞；（２）抗ＣＴＬＡ−４抗体遺伝子を有するレンチウイルスベクターを形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞；（３）抗ＢＣＭＡ−ＣＡＲ遺伝子を有するレンチウイルスベクターを形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞と、抗ＣＴＬＡ−４抗体遺伝子を有するレンチウイルスベクターを形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞との混合物；（４）抗ＢＣＭＡ−ＣＡＲ遺伝子および抗ＣＴＬＡ−４抗体遺伝子の両者を有するレンチウイルスベクターを形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞；ならびに（５）陰性対照としての無関係の遺伝子を形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞。前記抗ＣＴＬＡ−４抗体遺伝子はドキシサイクリン誘導性プロモーター（ＴＥＴＯＮ（登録商標）等）またはＮＦＡＴプロモーターの転写制御下にある。各処理条件における抗ＣＴＬＡ−４抗体の分泌は、マウスへの投与前に、またはマウスへの投与後に、適した条件で誘導される。

抗ＢＣＭＡ−ＣＡＲおよび抗ＣＴＬＡ−４抗体の両者を発現する初代Ｔ細胞は、抗ＢＣＭＡ−ＣＡＲのみを発現する初代Ｔ細胞、または抗ＣＴＬＡ−４抗体のみを発現する初代Ｔ細胞よりも、ＲＰＭＩ−８２２６−Ｌｕｃ腫瘍細胞を死滅させることにおいて、より強力であってもよい。このような効果は、形質導入された抗ＣＴＬＡ−４遺伝子がＴｅｔ−ｏｎ系の制御下である場合、ドキシサイクリン対して用量依存的であってもよい。このような効果は、形質導入された抗ＣＴＬＡ−４遺伝子の発現がＮＦＡＴ依存誘導性プロモーターの制御下である場合、ＢＣＭＡ抗原特異的ＣＡＲ−Ｔの存在に依存してもよい。このような効果は、形質導入された抗ＣＴＬＡ−４遺伝子がＨＳＰ７０ｐの制御下である場合、熱ショックの温度または時間に依存してもよい。

実施例９：改変初代ヒトＴ細胞が発現した抗ＰＤ−１抗体は腫瘍細胞に対するＴＣＲ−Ｔ細胞毒性をｉｎｖｉｔｒｏで増強する
ＮＹ−ＥＳＯ−１は予後不良な多発性骨髄腫において高度に発現されている（例えば、Blood 105:3939-3944 (2005)を参照のこと）。ＮＹ−ＥＳＯ−１に対するＴＣＲを用いた細胞療法が、例えばWO/2005/113595に記載されている。ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１拘束性ＮＹ−ＥＳＯ−１に対する高親和性ＴＣＲを形質導入した自己由来ＰＢＭＣの養子移入が、転移性滑膜細胞肉腫および転移性メラノーマの患者に対し、臨床現場で試験されている（例えば、J. Clin. Oncol. 29:917-24 (2011)およびClinical Cancer Research 21:5 (2014)を参照のこと）。また、Rapoport APら（Nat. Med. 21 (8): 914-21 (2015)）は、多発性骨髄腫に対する第Ｉ／ＩＩ相臨床試験において有望な臨床結果を報告しており、該臨床試験においては、癌精巣抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＬＡＧＥ−１によって共有される天然に加工されたペプチド（naturally processed peptide）を認識する、親和性が強化されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように改変された自己Ｔ細胞を利用している。他の進行中のＴＣＲ−Ｔ免疫療法の臨床試験は、ＨＬＡ−ＤＰ０４０１陽性の転移性癌患者に対する、ＭＡＧＥ−Ａ３を標的としたＴＣＲ免疫療法（ＮＣＴ０２１１１８５０）などを含む。

ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１クラスＩ拘束エレメントとの関連において、ＮＹ−ＥＳＯ−１の残基１５７〜１６５（ＮＹ−ＥＳＯ−１：１５７−１６５）に相当するペプチドＳＬＬＭＷＩＴＱＣを認識するＴＣＲ（下記表２記載のＬＩＴ−００１〜ＬＩＴ−００６）をコー
ドする、６個のレンチウイルスベクターを設計した。ＶアルファおよびＶベータ配列（野生型バリアント１Ｇ４および親和性成熟バリアント１１３−１Ｇ４）を、Li Y, Nature biotechnology. 2005;23:349-354およびRobbins P.F. et al, J Immunol. 2008 May 1;180(9): 6116-6131に従って設計した。両鎖の定常領域の配列を、ＵｎｉＰｒｏｔ：ＴＣＡ：アクセッション番号Ｐ０１８４８；ＴＲＢＣ１：アクセッション番号Ｐ０１８５０；およびＴＲＢＣ２：アクセッション番号Ａ０Ａ５Ｂ９からの配列に従って設計した。ＴＣＲアルファ鎖およびＴＣＲベータ鎖配列を、Ｔ２Ａペプチド（PLoS ONE 6(4): e18556）により連結した。１Ｇ４天然シグナルペプチドまたはＣＤ８αシグナルペプチド配列を両鎖に先行させた。さらに、設計された前記ＴＣＲ配列のコドン最適化を行い、ヒト細胞上での最適な発現を可能にした。前記ヌクレオチド配列の合成後、それを、ＰＬＶＸ−Ｐｕｒｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ＃６３２１６４）の本来のプロモーターをヒト伸長因子１αプロモーター（ｈＥＦ１α）と置き換え、ピューロマイシン耐性遺伝子を欠失させるように改変したレンチウイルスベクターにクローニングした。前記ＴＣＲをコードするベクター（ｐＬＬＶ−ＬＩＴ００１〜ｐＬＬＶ−ＬＩＴ００６）は、上述の実施例に記載のように、２９３Ｔ細胞におけるレンチウイルスパッケージング系で生成した。

ドナーのアフェレーシス血液試料由来のＰＢＭＣより、初代ヒトＴ細胞を、磁気ビーズ分離によって使用説明書に従い単離した（ＨｕｍａｎＰａｎＴｉｓｏｌａｔｉｏｎｋｉｔ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ＃１３０−０９６−５３５）。初代Ｔ細胞を、ｈｕｍａｎＴＣｅｌｌＡｃｔｉｖａｔｉｏｎ／ＥｘｐａｎｓｉｏｎＫｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ
＃１３０−０９１−４４１）を用いて２日間プレ活性化した。その後、プレ活性化されたＴ細胞に、上記ＴＣＲをコードするレンチウイルスベクターを形質導入し、ＴＣＲであるＬＩＴ−００１〜ＬＩＴ−００６を発現するＴＣＲ−Ｔ細胞を作製した。

ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１、およびＰＤ−Ｌ１、ならびにレポータールシフェラーゼを発現する、ヒト悪性神経膠腫細胞株であるＵ８７ＭＧ細胞を作製した。これを本明細書においてＵ８７ＭＧ／ＥＳＯ１−ｌｕｃ−ＰＤ−Ｌ１腫瘍細胞と呼ぶ。ＮＹ−ＥＳＯ−１を発現する別の腫瘍細胞株も記載されている。例えば、J. Immunother. 37:135-16 (2014)を参照のこと。このような細胞株を、改変初代ヒトＴ細胞の評価のために、同様な細胞毒性アッセイにおいて使用することができる。例えば、ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＨＬＡ−Ａ^＊０２０１、ならびにレポータールシフェラーゼを発現する、ヒト多発性骨髄腫細胞株であるＲＰＭＩ８２２６細胞を作製し、ＴＣＲ−Ｔ細胞の細胞毒性評価のためのレポーター腫瘍細胞株ＲＰＭＩ８２２６−Ｌｕｃ／ＮＹ−ＥＳＯ−１−Ａ２を提供することができる。

前記ＴＣＲ−Ｔ細胞の細胞毒性を評価するため、該ＴＣＲ−Ｔ細胞をそれぞれＵ８７ＭＧ／ＥＳＯ１−ｌｕｃ−ＰＤ−Ｌ１腫瘍細胞と共に、２０：１のＥ／Ｔ比で４８時間共培養した。腫瘍細胞に対するＴＣＲ−Ｔ細胞の細胞毒性を、ＯＮＥ−ＧＬＯ（商標）発光アッセイキットを用いて上記のように測定した。図１９Ａに示すように、ＬＩＴ−００１〜ＬＩＴ−００６を発現するＴＣＲ−Ｔ細胞は、Ｕ８７ＭＧ／ＥＳＯ１−ｌｕｃ−ＰＤ−Ｌ１腫瘍細胞に対して様々な強度の細胞毒性を示した。この６種のＴＣＲ構築物のうち、ＬＩＴ−００６Ｔ細胞は２８．２５％の細胞毒性に相当する最高の強度（ＲＬＵ＝２５５，１７１±１９，２５１）を有していた。従って、ＬＩＴ−００６ＴＣＲを発現するＴＣＲ−Ｔ細胞を、腫瘍細胞に対するＴＣＲ−Ｔの有効性に対する、抗ＰＤ−１発現の効果を評価するための例として選択した。

また、ｈＥＦ１αプロモーターの転写制御下の抗ＰＤ−１遺伝子を有するレンチウイルスベクター（すなわちｐＬＬＶ−ｈＥＦ１α−抗ＰＤ−１）を、実施例１に記載のようにレンチウイルスパッケージング系で生成した。

改変初代ヒトＴ細胞が発現した抗ＰＤ−１抗体がＴＣＲ−Ｔの細胞毒性を増強できるか決定するため、次の群の改変初代ヒトＴ細胞を、Ｕ８７ＭＧ／ＥＳＯ１−ｌｕｃ−ＰＤ−Ｌ１腫瘍細胞と共に、２０：１のＥ／Ｔ比で４８時間共培養した：（１）Ｔ／ＴＣＲ：抗ＮＹ−ＥＳＯ−１−ＴＣＲ遺伝子を有するレンチウイルスベクターｐＬＬＶ−ＬＩＴ−００６を形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞；（２）Ｔ／抗ＰＤ−１：ｈＥＦ１αプロモーターの転写制御下の抗ＰＤ−１抗体遺伝子を有するレンチウイルスベクターを形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞；（３）Ｔ／ＴＣＲ・抗ＰＤ−１：抗ＮＹ−ＥＳＯ−１−ＴＣＲ遺伝子（ｐＬＬＶ−ＬＩＴ−００６）とｈＥＦ１αプロモーターの転写制御下の抗ＰＤ−１抗体遺伝子との両者を有するレンチウイルスベクターを形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞；および（４）ｕｎＴ：陰性対照としての無関係の遺伝子を形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞。さらに、抗ＮＹ−ＥＳＯ−１−ＴＣＲ遺伝子を有するレンチウイルスベクターを形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞と、抗ＰＤ−１抗体遺伝子を有するレンチウイルスベクターを形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞との混合物を作製し、腫瘍細胞に対する細胞毒性について評価することができる。

図１９Ｂに示すように、抗ＮＹ−ＥＳＯ−１−ＴＣＲおよび抗ＰＤ−１の両者を発現するＴＣＲ−Ｔ細胞（Ｔ／ＴＣＲ・抗ＰＤ−１）は、抗ＮＹ−ＥＳＯ−１−ＴＣＲのみを発現するＴＣＲ−Ｔ細胞（ＲＬＵ＝２５５，１７１±１９，２５１）または抗ＰＤ−１抗体のみを発現するＴ細胞（ＲＬＵ＝３５５，１０９±１０，５１０）と比べて、Ｕ８７ＭＧ／ＥＳＯ１−ｌｕｃ−ＰＤ−Ｌ１腫瘍細胞を死滅させることにおいて、より強力であった（ＲＬＵ＝２３２，５６７±１５，４６４）。これに対応して、図１９Ｃに示すように、Ｕ８７ＭＧ／ＥＳＯ１−ｌｕｃ−ＰＤ−Ｌ１腫瘍細胞との４８時間の共培養後、抗ＮＹ−ＥＳＯ−１−ＴＣＲおよび抗ＰＤ−１の両者を発現するＴＣＲ−Ｔ細胞（Ｔ／ＴＣＲ・抗ＰＤ−１）は、抗ＮＹ−ＥＳＯ−１−ＴＣＲのみを発現するＴＣＲ−Ｔ細胞（１７７．５
２±７．６８ｐｇ／ｍＬ）または抗ＰＤ−１抗体のみを発現するＴ細胞（７３．１９±１．８８ｐｇ／ｍＬ）と比べて、より高濃度のＩＦＮ−ガンマを分泌した（２００．７７±１．１３ｐｇ／ｍＬ）。

これらのデータは、改変初代ヒトＴ細胞が発現した抗ＰＤ−１抗体が、腫瘍細胞に対するＴＣＲ−Ｔ細胞毒性をｉｎｖｉｔｒｏで強化することを示している。

同様に、抗ＰＤ−１抗体のための他のプロモーターの、改変Ｔ細胞の抗腫瘍効果に対する効果を評価するため、ドキシサイクリン誘導性プロモーター（例えばＴＥＴＯＮ（登録商標））、熱誘導性プロモーター（例えばＨＳＰ７０ｐ）、またはＮＦＡＴプロモーター等の他のプロモーターを、上記実験におけるｈＥＦ１αプロモーターの代わりに使用することができる。このようなプロモーターのもとで抗ＮＹ−ＥＳＯ−１−ＴＣＲおよび抗ＰＤ−１の両者を発現するＴＣＲ−Ｔ細胞も、腫瘍細胞を死滅させる効果が、抗ＮＹ−ＥＳＯ−１−ＴＣＲのみを発現するＴＣＲ−Ｔ細胞または抗ＰＤ−１抗体のみを発現する初代Ｔ細胞よりも高い可能性がある。このような効果は、形質導入された抗ＰＤ−１遺伝子がＴｅｔ−Ｏｎ系の制御下である場合、ドキシサイクリン等の誘導物質に対して用量依存的である可能性がある。このような効果は、形質導入された抗ＰＤ−１遺伝子がＨＳＰ７０ｐの制御下である場合、熱ショックの温度または時間に依存する可能性がある。

実施例１０：改変初代ヒトＴ細胞が発現した抗ＣＴＬＡ−４抗体は腫瘍細胞に対するＴＣＲ−Ｔ細胞毒性をｉｎｖｉｔｒｏで増強する
ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１クラスＩ拘束エレメントとの関連において、ＮＹ−ＥＳＯ−１の残基１５７〜１６５（ＮＹ−ＥＳＯ−１：１５７−１６５）に相当するペプチドＳＬＬＭＷＩＴＱＣを認識するＴＣＲ（ＬＩＴ−００６）をコードするレンチウイルスベクターを、２９３−６Ｅ細胞におけるレンチウイルスパッケージング系で生成した。また、ｈＥＦ１αプロモーターの転写制御下にある抗ＣＴＬＡ−４遺伝子を有するレンチウイルスベクター（すなわちｐＬＬＶ−ｈＥＦ１α−抗ＣＴＬＡ−４）を、実施例１に記載のようにレンチウイルスパッケージング系で生成した。

初代ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、健常ドナー由来の末梢血を密度勾配遠心することで調製した。磁気ビーズ分離を用いてＰＢＭＣからヒト初代Ｔ細胞を精製した。

ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１、およびＣＤ８０／ＣＤ８６、ならびにレポータールシフェラーゼを発現する、ヒト悪性神経膠腫細胞株であるＵ８７ＭＧ細胞を作製した。これを本明細書においてＵ８７ＭＧ／ＥＳＯ１−ｌｕｃ−ＣＤ８０／ＣＤ８６腫瘍細胞と呼ぶ。ＲＰＭＩ８２２６−Ｌｕｃ／ＮＹ−ＥＳＯ−１−Ａ２などの、ＮＹ−ＥＳＯ−１を発現する他の腫瘍細胞株を用いて、ＴＣＲ−Ｔ細胞の細胞毒性の評価のために使用することができる。

次の群の改変初代ヒトＴ細胞を、それぞれＵ８７ＭＧ／ＥＳＯ１−ｌｕｃ−ＣＤ８０／ＣＤ８６腫瘍細胞と４８時間共培養した：（１）Ｔ／ＴＣＲ：抗ＮＹ−ＥＳＯ−１−ＴＣＲ遺伝子を有するレンチウイルスベクターｐＬＬＶ−ＬＩＴ−００６を形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞；（２）Ｔ／抗ＣＴＬＡ−４：ｈＥＦ１αプロモーターの転写制御下の抗ＣＴＬＡ−４抗体遺伝子を有するレンチウイルスベクターを形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞；（３）Ｔ／ＴＣＲ抗ＣＴＬＡ−４：抗ＮＹ−ＥＳＯ−１−ＴＣＲ遺伝子（ｐＬＬＶ−ＬＩＴ−００６）とｈＥＦ１αプロモーターの転写制御下の抗ＣＴＬＡ−４抗体遺伝子との両者を有するレンチウイルスベクターを形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞；ならびに（４）ｕｎＴ：陰性対照としての無関係の遺伝子を形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞。さらに、抗ＮＹ−ＥＳＯ−１−ＴＣＲ遺伝子を有するレンチウイルスベクターを形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞と、抗ＣＴＬＡ−４抗体遺伝子を有するレンチウイルスベクター
を形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞との混合物を作製し、腫瘍細胞に対する細胞毒性について評価することができる。

図２０に示すように、抗ＮＹ−ＥＳＯ−１−ＴＣＲおよび抗ＣＴＬＡ−４の両者を発現するＴＣＲ−Ｔ細胞（Ｔ／ＴＣＲ・抗ＣＴＬＡ−４）は、抗ＮＹ−ＥＳＯ−１−ＴＣＲのみを発現するＴＣＲ−Ｔ細胞（ＲＬＵ＝２５５，１７１±１９，２５１）または抗ＣＴＬＡ−４抗体のみを発現するＴ細胞（ＲＬＵ＝３５５，１０９±１０，５１０）と比べて、Ｕ８７ＭＧ／ＥＳＯ１−ｌｕｃ−ＣＤ８０／ＣＤ８６腫瘍細胞を死滅させることにおいて、より強力であった（ＲＬＵ＝２３２，５６７±１５，４６４）。これらのデータは、改変初代ヒトＴ細胞が発現した抗ＣＴＬＡ−４抗体が、腫瘍細胞に対するＴＣＲ−Ｔ細胞毒性をｉｎｖｉｔｒｏで強化することを示している。

同様に、抗ＣＴＬＡ−４抗体のための他のプロモーターの、改変Ｔ細胞の抗腫瘍効果に対する効果を評価するため、ドキシサイクリン誘導性プロモーター（例えばＴＥＴＯＮ（登録商標））、熱誘導性プロモーター（例えばＨＳＰ７０ｐ）、またはＮＦＡＴプロモーター等の他のプロモーターを、上記実験におけるｈＥＦ１αプロモーターの代わりに使用することができる。このようなプロモーターのもとで抗ＮＹ−ＥＳＯ−１−ＴＣＲおよび抗ＣＴＬＡ−４抗体の両者を発現するＴＣＲ−Ｔ細胞も、腫瘍細胞を死滅させる効果が、抗ＮＹ−ＥＳＯ−１−ＴＣＲのみを発現するＴＣＲ−Ｔ細胞または抗ＣＴＬＡ−４抗体のみを発現する初代Ｔ細胞よりも高い可能性がある。このような効果は、形質導入された抗ＣＴＬＡ−４遺伝子がＴｅｔ−Ｏｎ系の制御下である場合、ドキシサイクリン等の誘導物質に対して用量依存的である可能性がある。このような効果は、形質導入された抗ＣＴＬＡ−４遺伝子がＨＳＰ７０ｐの制御下である場合、熱ショックの温度または時間に依存する可能性がある。

実施例１１：改変初代ヒトＴ細胞による抗ＨＥＲ２抗体および免疫チェックポイント阻害剤の共発現は、ｉｎｖｉｔｒｏで腫瘍細胞に対する強力な細胞毒性を示す
初代ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、健常ドナー由来の末梢血を密度勾配遠心することで調製した。磁気ビーズ分離を用いてＰＢＭＣからヒト初代Ｔ細胞を精製した。抗ＨＥＲ２抗体の軽鎖および重鎖をコードする配列を設計し、２個のｐｃＤＮＡ３．１プラスミドベクターにそれぞれクローニングした。４μｇの各プラスミドを、４３ｍｓのパルス時間を用いた６６５Ｖのエレクトロポレーションにより、１×１０^７個のヒト初代Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトされたＴ細胞をｅｘｖｉｖｏで３日間増殖させた。その後、トランスフェクトされたＴ細胞の一部に抗ＰＤ−１抗体（または抗ＣＴＬＡ−４抗体）遺伝子を有するレンチウイルスベクターを形質導入し、抗ＨＥＲ２および抗ＰＤ−１（または抗ＣＴＬＡ−４）抗体を発現させた。抗体の分泌は、ＬＡＮＰＯＷＥＲ（商標）ＨｕｍａｎＦｃＤｅｔｅｃｔｉｏｎｋｉｔ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ＃Ｌ００６５６−１０００）を用いたＨＴＲＦ法で検出することができる。

図２１Ａ〜２１Ｂに示すように、抗ＨＥＲ２抗体遺伝子をコードするプラスミドをトランスフェクトした改変ヒト初代Ｔ細胞は、４８時間の培養で１．０２±０．１３６μｇ／ｍＬの抗ＨＥＲ２抗体を発現および分泌した。抗ＨＥＲ２および抗ＰＤ−１（または抗ＣＴＬＡ−４）抗体を共発現するように改変したＴ細胞は、両抗体を、合計発現量において、抗ＨＥＲ２＋抗ＰＤ−１については３．０７±０．０４６μｇ／ｍＬ（図２１Ａ）、抗ＨＥＲ２＋抗ＣＴＬＡ−４については３４．２４±０．６４μｇ／ｍＬ（図２１Ｂ）分泌した。

分泌された抗体の生物活性を、ＨＥＲ２を過剰発現するヒト乳癌細胞株ＳＫ−ＢＲ−３を用いたｉｎｖｉｔｒｏ腫瘍細胞増殖阻害アッセイにおいて評価した。ここで、ＳＫ−ＢＲ−３細胞はルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するように改変されており（以後
、「ＳＫ−ＢＲ−３／Ｌｕｃ細胞」と呼ぶ）、これによってルシフェラーゼ活性のアッセイにより生腫瘍細胞の定量が可能となる。ハーセプチン（トラスツズマブ）として知られる抗ＨＥＲ２抗体は、ＳＫ−ＢＲ−３／Ｌｕｃ細胞に対する強力な細胞毒性を有する。

抗ＰＤ−１抗体（または抗ＣＴＬＡ−４抗体）および抗ＨＥＲ２抗体をコードするベクターを形質導入することにより、４群の改変ヒト初代Ｔ細胞を作製した：（１）Ｔ／抗ＨＥＲ２：抗ＨＥＲ２抗体遺伝子をコードするプラスミドをトランスフェクトした改変ヒト初代Ｔ細胞；（２）Ｔ／抗ＰＤ−１（またはＴ／抗ＣＴＬＡ−４）：抗ＰＤ−１抗体（または抗ＣＴＬＡ−４抗体）遺伝子を有するレンチウイルスベクターを形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞；（３）Ｔ／抗ＨＥＲ２・抗ＰＤ−１（またはＴ／抗ＨＥＲ２・抗ＣＴＬＡ−４）：抗ＨＥＲ２抗体遺伝子をコードするプラスミドをトランスフェクトし、さらに抗ＰＤ−１（または抗ＣＴＬＡ４）遺伝子を有するレンチウイルスベクターを形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞；ならびに（４）ｕｎＴ：陰性対照としての形質導入していない初代ヒトＴ細胞。この実験では、抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ−４抗体遺伝子はｈＥＦ１αプロモーターのもとで駆動され、抗ＨＥＲ２抗体遺伝子はｈＣＭＶｉｅプロモーターのもとで駆動された。

形質導入３日後、各群の改変Ｔ細胞を、２０：１のＥ：Ｔ比でＳＫ−ＢＲ−３／Ｌｕｃ細胞をあらかじめ播種した９６ウェルプレートに加え、７日間共培養を行った。ウェル内の残存ルシフェラーゼ活性を、ＯＮＥ−ＧＬＯ（商標）ルシフェラーゼアッセイキットを用いて測定し、腫瘍細胞に対する前記改変Ｔ細胞の細胞毒性を評価した。低い値の相対発光単位（ＲＬＵ）は、ＳＫ−ＢＲ−３／Ｌｕｃ細胞に対して前記改変Ｔ細胞の細胞毒性が強いことを表す。

図２２Ａに示すように、一方または両方の抗体（抗ＨＥＲ２および／または抗ＰＤ−１）を発現する改変Ｔ細胞は、非形質導入Ｔ細胞（ＵｎＴ）と比べ、ＳＫ−ＢＲ−３／Ｌｕｃ細胞に対する高い細胞毒性を有していた。抗ＨＥＲ２および抗ＰＤ−１抗体の両者を発現する改変Ｔ細胞（ＲＬＵ＝６９，７１９±１３，３８２、ＵｎＴとの比較において９３．７８％の阻害）は、抗ＨＥＲ２のみ（ＲＬＵ＝４１４，３１７±２４，８９４、６３．０１％の阻害）または抗ＰＤ−１のみ（ＲＬＵ＝２５３，６１６±５３９２、７７．３６％の阻害）を発現するＴ細胞と比べ、ＳＫ−ＢＲ−３／Ｌｕｃ細胞に対する強化された抗腫瘍効果を示した。また、抗ＨＥＲ２および抗ＰＤ−１抗体の両者を発現するＴ細胞は、抗ＰＤ−１のみを発現するＴ細胞（Ｔ／抗ＰＤ−１）と２０μｇ／ｍＬのハーセプチンとの組み合わせと比べても、優れた抗腫瘍効果を有していた。これらのデータは、改変初代Ｔ細胞による抗ＨＥＲ２抗体と免疫チェックポイント阻害剤（抗ＰＤ−１抗体等）の共発現が、ｉｎｖｉｔｒｏで腫瘍細胞に対して強力な細胞毒性を有することを示している。

図２２Ｂに示すように、一方または両方の抗体（抗ＨＥＲ２および／または抗ＣＴＬＡ−４）を発現する改変Ｔ細胞は、非形質導入Ｔ細胞（ＵｎＴ）と比べ、ＳＫ−ＢＲ−３／Ｌｕｃ細胞に対する高い細胞毒性を有していた。しかし、抗ＨＥＲ２および抗ＣＴＬＡ−４抗体の両者を発現する改変Ｔ細胞は、抗ＨＥＲ２のみもしくは抗ＣＴＬＡ−４のみを発現するＴ細胞、または抗ＣＴＬＡ−４を発現するＴ細胞と２０μｇ／ｍＬのハーセプチンとの組み合わせと比べて、ＳＫ−ＢＲ−３／Ｌｕｃ細胞に対する強化された抗腫瘍効果を示さなかった。

同様に、抗ＨＥＲ２および抗ＰＤ−１（または抗ＣＴＬＡ−４）抗体のための他のプロモーターの、改変Ｔ細胞の抗腫瘍効果に対する効果を評価するため、ドキシサイクリン誘導性プロモーター（例えばＴＥＴＯＮ（登録商標））、熱誘導性プロモーター（例えばＨＳＰ７０ｐ）、またはＮＦＡＴプロモーター等の他のプロモーターを、上記実験におけるｈＥＦ１αプロモーターの代わりに使用することができる。

実施例１２：肺癌の治療のための免疫チェックポイント阻害剤を発現する抗ＥＧＦＲＣＡＲ−Ｔの設計
序論
肺癌は世界的に最も多い癌死の原因であり、癌関連死の５件あたり約１件、または推定１６０万人が関与している。米国および中国の両者で、肺癌は、男性と女性の両者における癌関連死の原因として、群を抜いて第１位となっている。米国癌協会によると、２２１，０００人より多くの米国人が２０１５年中に肺癌と診断され、ＮＳＣＬＣが全ての肺癌のうち８５％を占めている。肺癌と診断された米国内の患者のうち、全体で１７．４％が診断後に５年間生存するが、発展途上国においては平均的な臨床成績は低下する。

肺癌患者の大部分が末期疾患（第ＩＩＩｂ／ＩＶ期）と診断される。これらの患者において、手術、化学療法、および放射線療法を含む従来の治療選択肢は、生存を有意に改善し、症状の軽減をもたらしうるものの、それらが治癒に結びつく可能性は低い。特定の遺伝子変異を有する患者は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）遮断薬であるエルロチニブ（erlotinib）（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））、アファチニブ（afatinib）（ＧＩＬＯＴＲＩＦ（登録商標））、およびゲフィチニブ（gefitinib）（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標））等の標的療法による恩恵を受ける可能性がある。これらの薬剤はＥＧＦＲからのプロ増殖シグナル（pro-growth signals）を遮断する。これらの薬剤はＥＧＦＲ遺伝子に特定の変異を有する患者に使用することができ、これらは、女性や、喫煙経験の無い患者により一般的である。

免疫療法は、他の治療が有効でない患者を含む肺癌患者に、有意な利益を提供する可能性がある。ベバシズマブ（bevacizumab）（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））は、新生血管の増殖を補助するタンパク質である血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を標的とするモノクローナル抗体である。ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）は、腫瘍における新生血管の増殖、すなわち血管新生と呼ばれるプロセスを防ぐことにより、該腫瘍細胞における栄養飢餓を引き起こす。ラムシルマブ（Ramucirumab）（ＣＹＲＡＭＺＡ（登録商標））は、ＮＳＣＬＣを治療するために使用することができる他の血管新生阻害剤である。２０１５年には、２種の新たな免疫療法薬、ニボルマブ（nivolumab）（ＯＰＤＩＶＯ（登録商標））およびペムブロリズマブ（pembrolizumab）（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標））が、肺癌の治療用としてＦＤＡに認可された。ニボルマブおよびペムブロリズマブの両者は、ヒトＰＤ−１分子を標的とする。より最近の２０１６年には、別の新たな免疫療法薬、アテゾリズマブ（atezolizumab）（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（商標））が膀胱癌の治療用として認可された。アテゾリズマブは、ＰＤ−Ｌ１分子と名付けられた、主要なＰＤ−１リガンドの一つを標的とする。アテゾリズマブは現在、数件の第ＩＩＩ相肺癌臨床試験において試験中である。臨床試験におけるその有効性と安全性により、アテゾリズマブは肺癌の治療に対してまもなく認可されると信じられている。

養子細胞療法、より具体的にはキメラ抗原受容体改変Ｔ細胞療法が、近年、肺癌の治療のための多くの臨床試験において試験されてきた。ＮＹ−ＥＳＯ−１（ＮＣＴ０１６９７５２７、ＮＣＴ０１９６７８２３）、ＶＥＧＦＲ２（ＮＣＴ０１２１８８６７）、ＭＡＧＥ−Ａ３（ＮＣＴ０２１１１８５０）、メソテリン（ＮＣＴ０１５８３６８６、ＮＣＴ０２４１４２６９）、およびＷＴ１（ＮＣＴ０２４０８０１６）を含むいくつかの標的が研究されている。また、ＮＹ−ＥＳＯ−１を標的とするように遺伝的に改変されたＴ細胞と、チェックポイント阻害剤イピリムマブ（ipilimumab）（ＮＣＴ０２０７０４０６）との組み合わせの第Ｉ相研究もある。これまでのところ、このような抗原を標的とするＣＡＲ−Ｔについてはわずかな進展しかない。

ＥｒｂＢ−１またはＨＥＲ１としても知られるＥＧＦＲは、４つの密接に関連した受容
体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）：ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ−１）、ＨＥＲ２／ｃ−ｎｅｕ（ＥｒｂＢ−２）、Ｈｅｒ３（ＥｒｂＢ−３）、およびＨｅｒ４（ＥｒｂＢ−４）からなるサブファミリーである上皮成長因子受容体における、受容体の１つである。ＥＧＦＲの主要な天然リガンドの一つはＥＧＦである。

ＥＧＦＲは約４０％〜８０％のＮＳＣＬＣで過剰発現されている（Cancer (2002) 94: 1593-1611;Lancet Oncol. (2003) 4:397-406）。各種組織型の肺癌の中で、ＥＧＦＲ過剰発現は扁平上皮癌（８４％）および大細胞癌（６８％）において最も頻度が高く、小細胞肺癌において最も頻度が低い（The Oncologist (2006) 11:358-373）。

多くの治療方法がＥＧＦＲを標的としている。セツキシマブ（cetuximab）およびパニツムマブ（panitumumab）は、ＥＧＦＲに対するモノクローナル抗体阻害剤の例である。臨床開発中の他の抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体としては、ザルツムマブ（zalutumumab）、ニモツズマブ（nimotuzumab）、およびマツズマブ（matuzumab）が挙げられる。これらのモノクローナル抗体はＥＧＦＲの細胞外リガンド結合ドメインを遮断する。

しかし、ＥＧＦＲは各種の正常組織においても低発現量で広範に発現している。従って、ＥＧＦＲを標的とする細胞治療戦略は慎重な設計が必要である。例えば、他の例において、ＣＡＲ−Ｔ開発の初期段階で、ヒト化ｍＡｂトラスツズマブ由来のｓｃＦｖを使用して構築されたＥＲＢＢ２特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の輸液を行ったところ、肺における致死的な炎症性サイトカイン放出を引き起こした（Morgan RA et al, Mol. Ther. (2010) 18: 843-851）。この毒性は、肺上皮細胞上の低濃度のＥＲＢＢ２発現に対するｏｎ−ｔａｒｇｅｔｏｆｆ−ｔｕｍｏｒ認識に起因するものであった。

肺癌などのＥＧＦＲを過剰発現する腫瘍に対する安全で効果的な細胞療法は、未だその必要性が満たされないままである。

実験設計
本実施例では、単一のベクターにコードされる、ＥＧＦＲを標的とするＣＡＲと、免疫チェックポイント阻害剤を共発現するように、初代Ｔ細胞を改変した（図７Ａ）。前記抗ＥＧＦＲＣＡＲは、ＥＧＦＲを過剰発現する肺癌部位にＴ細胞を誘導し、その肺癌部位で前記免疫チェックポイント阻害剤の部位特異的発現を引き起こす。前記抗ＥＧＦＲＣＡＲが腫瘍細胞上のＥＧＦＲへ結合することにより、該ＣＡＲの短縮型または変異型細胞内シグナル伝達ドメインが活性化され、それによって前記改変Ｔ細胞による減弱化された下流の免疫応答が引き起こされ、宿主内の非改変免疫細胞のリクルートによって腫瘍細胞が死滅するが、低濃度のＥＧＦＲを発現する正常細胞は死滅しない。この免疫応答はさらに、例えばＴ細胞メモリーや組織ホーミングを強化し、またＴ細胞の増殖および生存を促進する、１つまたは複数の免疫賦活剤（図７Ｂ）を過剰発現するように前記ＣＡＲ−Ｔを改変することで増強されうる。

抗ＥＧＦＲＣＡＲをコードするベクターのパネルを、ｉｎｖｉｖｏにおける安全性、持続性、および組織ホーミング能が改善されたＣＡＲ−Ｔの作製のために設計した（図２３）。ＥＧＦＲを発現する肺癌細胞における免疫チェックポイント阻害剤抗体の部位特異的発現を誘導するため、抗ＥＧＦＲＣＡＲのＥＧＦＲ結合ドメインは、ＥＧＦＲに対するヒト化モノクローナル抗体のクローン４２５（ｍＡｂ４２５）に基づいた。構築物ＧＳＩ０５２は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＣＤ８αシグナルペプチド、ｍＡｂ４２５
ｓｃＦｖ、ＣＤ８αヒンジおよび膜貫通（ＴＭ）領域、ＣＤ１３７細胞質ドメイン（ＣＤ１３７ｃｙｔｏ）、およびＣＤ３ζを含んだ全長抗ＥＧＦＲＣＡＲをコードする。

ｍＡｂ４２５は、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＥＧＦＲを高度に過剰発現することが知られ
る細胞株であるヒトＡ４３１細胞で免疫することにより作製した。ｍＡｂ４２５をさらにヒト化し、マツズマブ（matuzumab）を提供した（米国特許第５，５５８，８６４号を参照のこと）。ｍＡｂ４２５は高い親和性でＥＧＦＲに結合する。前臨床試験において、ｍＡｂ４２５がＥＧＦＲ依存性腫瘍の増殖を阻害し、ＶＥＧＦの発現を阻害し、ＡＤＣＣを誘導することが示された。マツズマブは、２０００年代の初頭に、結腸直腸、肺、食道、および胃癌の治療に対する第ＩＩ相臨床試験が行われた。しかし、さらなる臨床試験は２００７年の第Ｉ相試験以降は行われなかった。２００８年２月１８日、タケダとメルクはマツズマブの開発をもはや続行しないことを発表した。

ＥＧＦＲは正常組織に広範に発現しているため、ＣＡＲ−Ｔ細胞のｉｎｖｉｖｏでの安全性を改善するため、ＣＤ３ζドメイン（すなわちＣＤ３ｚ）が欠失または変異した短縮型の抗ＥＧＦＲＣＡＲが設計された。例えば、構築物ＧＳＩ０５３はＧＳＩ０５２をもとに設計されたが、ＧＳＩ０５３はＣＤ３ζドメインを有しない。ＧＳＩ０５３は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＣＤ８αシグナルペプチド、ｍＡｂ４２５ｓｃＦｖ、ＣＤ８αヒンジ、およびＴＭ、ならびにＣＤ１３７細胞質ドメインを含む。

次に、免疫チェックポイント阻害剤抗体をコードする配列を、前記の短縮型抗ＥＧＦＲ
ＣＡＲをコードする配列の隣にクローニングした。例えば、構築物ＧＳＩ０５４においては、抗ＰＤ−１コード配列をＣＤ１３７細胞質ドメインの隣にクローニングした。従って、ＧＳＩ０５４は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＣＤ８αシグナルペプチド、ｍＡｂ４２５ｓｃＦｖ、ＣＤ８αヒンジおよびＴＭ、ならびにＣＤ１３７細胞質ドメインと、抗ＰＤ−１とを含む。

前記短縮型抗ＥＧＦＲＣＡＲは、免疫チェックポイント阻害剤抗体の発現を、ＥＧＦＲ発現組織、特にＥＧＦＲ過剰発現腫瘍部位に対して向けることができ、その一方で標的細胞の過度の殺傷を回避することができる。前記短縮型抗ＥＧＦＲＣＡＲ単体ではＥＧＦＲ発現細胞に対して有意な細胞毒性を引き出すことはできないが、該短縮型抗ＥＧＦＲ
ＣＡＲは、ＥＧＦＲを過剰発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する潜在的な能力を有する。

注入された改変ＣＡＲ−Ｔ細胞のｉｎｖｉｖｏでの持続性を強化するため、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、およびＢｃｌ２等の１つまたは複数の免疫賦活剤をベクター内に配置した。例えば、ＧＳＩ０５５〜ＧＳＩ０６０はＧＳＩ０５４をもとに設計されたが、ＧＳＩ０５５〜ＧＳＩ０５７にはＩＬ−７をコードするさらなる配列を加え、ＧＳＩ０５８〜ＧＳＩ０６９にはＩＬ−２１をコードするさらなる配列を加えた。ＩＬ−７はナイーブおよびメモリーＣＤ４^＋、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の恒常性を媒介することができ、また、ＩＬ−７は血液悪性腫瘍（急性リンパ性白血病またはＴ細胞リンパ腫等）を促進することもできる。ＩＬ−２１はＴ（ｅｆｆｓ）の維持を促進することができる。構築物ＧＳＩ０５７およびＧＳＩ０６０には、さらにＢｃｌ−２をコードする配列も加えた。Ｂｃｌ−２を過剰発現するＴ細胞は、活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）に対して、より耐性を有しうる。

組織ホーミングを強化するため、ＣＣＲ２ｂをコードする配列を構築物ＧＳＩ０５６およびＧＳＩ０５７に加え、ＣＣＲ４をコードする配列を構築物ＧＳＩ０５９およびＧＳＩ０６０に加えた。ＣＣＲ２ｂを発現する活性化Ｔ細胞（ＡＴＣ）は、ＣＣＲ２陰性ＡＴＣと比べ、ＣＣＬ２分泌神経芽細胞腫に対する改善されたホーミング（＞１０倍）を有する。ＣＣＲ４と、ＣＤ３０を標的とするキメラ抗原受容体とを共発現するＴリンパ球は、ホジキン腫瘍モデルにおいて改善されたホーミングおよび抗腫瘍活性を有する。

前記マルチシストロン性構築物において、前記ＣＡＲ、抗ＰＤ−１抗体、および任意に１つまたは複数の免疫賦活剤は同一のレンチウイルスベクターにコードされ、同一の構成的プロモーターｈＥＦ１αによって駆動された。異なるタンパク質コード配列間をＦ２Ａ
およびＴ２Ａ等の自己切断可能なリンカーで置換し、高効率の複数遺伝子共発現を可能にした。

ヒト初代Ｔ細胞に、構築物ＧＳＩ０５２〜ＧＳＩ０６０をそれぞれ含むレンチウイルスベクターを形質導入し、ＣＡＲ−Ｔ細胞を提供した。ｍＡｂ４２５に基づいた全長ＣＡＲ−Ｔ（ＧＳＩ０５２）または短縮型ＣＡＲ−Ｔ（ＧＳＩ０５３）のｉｎｖｉｔｒｏでの有効性を、ＥＧＦＲを過剰発現する肺癌細胞株であるＡ５４９−Ｌｕｃ細胞を用いて研究した。さらに、構築物（ＧＳＩ０５４〜ＧＳＩ０６０）を有するＣＡＲ−Ｔ細胞について、抗ＰＤ−１、ＩＬ−７／ＩＬ−２１、ＣＣＲ２ｂ／ＣＣＲ４、およびＢｃｌ２のｉｎｖｉｔｒｏでの発現を測定した。ｉｎｖｉｖｏでの抗腫瘍効果を、Ａ５４９−Ｌｕｃを移植したＮＳＧマウスモデルを用いて評価する。

非ヒト霊長類ＥＧＦＲは、ヒトＥＧＦＲ（例えばＮＰ＿００５２１９．２）に対して９９％超のタンパク質配列同一性を共有する。Carolina Bergerらは、ＣＡＲ改変Ｔ細胞で霊長類のＲＯＲ１を標的とすることの安全性について研究した（Cancer Immunol. Res. (2015) 3(2): 206）。本願発明者らも、非ヒト霊長類モデルにおいて、選択された抗ＥＧＦＲ短縮型ＣＡＲに誘導される抗ＰＤ−１発現ベクターを形質導入したＣＡＲ−Ｔ細胞のｉｎｖｉｖｏでの安全性の研究を設計した。

ＥＧＦＲを過剰発現する肺癌細胞株Ａ５４９に対する、抗ＥＧＦＲＣＡＲ−Ｔのｉｎｖｉｔｒｏ細胞毒性
Ａ５４９（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−１８５）は周知のヒト肺癌細胞株であり、ＥＧＦＲを過剰発現する。ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏアッセイを容易にするため、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を親Ａ５４９細胞に導入し、得られた細胞株をＡ５４９−Ｌｕｃと命名した。

まず、ｉｎｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイを行い、構築されたｍＡｂ４２５に基づいたＣＡＲ（全長および短縮型）の特異性および生物活性を評価した。レンチウイルスベクター（それぞれｐＬＬＶ−ＧＳＩ０５２、ｐＬＬＶ−ＧＳＩ０５３、ｐＬＬＶ−ＧＳＩ０５７、およびｐＬＬＶ−ＧＳＩ０６０）を上記実施例に記載のようにパッケージングした。超遠心分離を用いて上清を濃縮した後、レンチウイルスのストックを調製した。ＰａｎＴｃｅｌｌｉｓｏｌａｔｉｏｎｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ｃａｔ＃１３０−０９６−５３５）を使用し、ヒトＣＤ３^＋Ｔ細胞をＰＢＭＣから作製した。単離したＴ細胞を、Ｔｃｅｌｌａｃｔｉｖａｔｉｏｎａｎｄｅｘｐａｎｓｉｏｎｋｉｔを用いて３日間プレ活性化した。その後、プレ活性化したＴ細胞をＧＳＩ０５２、ＧＳＩ０５３、ＧＳＩ０５７、またはＧＳＩ０６０レンチウイルスストックで形質導入し、さらに３日間細胞増殖させた。Ａ５４９−Ｌｕｃ細胞を、１０％ＦＢＳと２μｇ／ｍｌのピューロマイシンを添加したＦ−１２Ｋ培地で通常通り培養した。

形質導入後３日目に、形質導入済のＴ細胞を回収し、Ａ５４９−Ｌｕｃ細胞と共に、エフェクター（ＣＡＲ−Ｔ）−標的細胞（Ａ５４９−Ｌｕｃ）比５：１で７日間コインキュベートした。ＯＮＥ−ＧＬＯ（商標）発光ルシフェラーゼアッセイ試薬を前記共培養細胞に加え、ウェル内の残存ルシフェラーゼ活性を検出した。ルシフェラーゼはＡ５４９−Ｌｕｃ細胞にのみ発現しているため、ウェル内の残存ルシフェラーゼ活性は該ウェル内の生細胞数と直接相関する。従って、前記アッセイにおける低い値の相対発光単位（ＲＬＵ）は、Ａ５４９／Ｌｕｃ細胞に対して前記ＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞毒性が強いことを表す。

図２４に示すように、全長の抗ＥＧＦＲ−ＣＡＲ（ＧＳＩ０５２）を発現するＣＡＲ−Ｔ細胞がＡ５４９−Ｌｕｃに対する有意な細胞毒性を引き出すことができた一方で、このような細胞毒性は、ＣＤ３ζドメインを欠く短縮型の抗ＥＧＦＲ−ＣＡＲ（ＧＳＩ０５３
）を発現するＣＡＲ−Ｔ細胞では大きく減弱化された。短縮型ＣＡＲ（ＧＳＩ０５３）を発現するＴ細胞はＥＧＦＲを過剰発現する細胞に対して有意な細胞毒性を引き出すことができなかったため、低濃度でＥＧＦＲを発現する正常細胞は前記ＣＡＲ−Ｔ細胞によって攻撃されず、改善されたｉｎｖｉｖｏ安全性が提供される可能性がある。ＧＳＩ０５７（短縮型ＣＡＲ＋抗ＰＤ−１＋ＩＬ−７＋ＣＣＲ２ｂ＋Ｂｃｌ２）を形質導入したＣＡＲ−Ｔ細胞は、Ａ５４９−ｌｕｃ細胞と７日間共培養した際、有意な細胞毒性を示さなかった。これは予期していなかったことである。ＩＬ−７はＡ５４９細胞の増殖を促進しうる（Int J Clin Exp Pathol. 2014 Feb 15;7(3):870）ため、ＧＳＩ０５５〜ＧＳＩ０５７（ＩＬ−７を発現する）導入Ｔ細胞は次の実験に含めなかった。ＧＳＩ０６０（短縮型ＣＡＲ＋抗ＰＤ−１＋ＩＬ−２１＋ＣＣＲ４＋Ｂｃｌ２）を形質導入したＴ細胞は、ＧＳＩ０５３導入Ｔ細胞または抗ＰＤ−１抗体のみを発現するＴ細胞（Ｔ／抗ＰＤ−１）と比べ、強化された細胞毒性を示した。

次に、ＧＳＩ０５２〜ＧＳＩ０５４およびＧＳＩ０５８〜ＧＳＩ０６０形質導入ＣＡＲ−Ｔ細胞を、同様な細胞毒性アッセイにおいて評価した。形質導入後３日目に、形質導入済のＴ細胞を回収し、Ａ５４９−Ｌｕｃ細胞と共に、５：１のＥ−Ｔ比でコインキュベートした。ＯＮＥ−ＧＬＯ（商標）発光ルシフェラーゼアッセイ試薬を１日目、３日目、５日目、または７日目に前記共培養細胞に加え、残存ルシフェラーゼ活性を検出した。予期されたように、短縮型ＣＡＲ（ＧＳＩ０５３）を発現するＴ細胞は、５日間以上の共培養を行った際、Ａ５４９−Ｌｕｃ肺癌細胞に対する弱い細胞毒性を引き出した（図２５Ａ〜２５Ｄ）。ＧＳＩ０５８〜ＧＳＩ０６０導入ＣＡＲ−Ｔ細胞は、非形質導入Ｔ細胞と比べ、恐らく抗ＰＤ−１抗体およびＩＬ−２１の発現のためと思われる強化された細胞毒性を示した。これらの結果は、短縮型抗ＥＧＦＲＣＡＲのみを発現するＴ細胞が、単独では標的細胞に対して有意な細胞毒性効果を有しなかったことを示した。前記免疫チェックポイント阻害剤（抗ＰＤ−１抗体）、およびＩＬ−２１等の免疫賦活剤の導入は、短縮型ＣＡＲ−Ｔ機能の強化を補助するであろう。

初代ヒトＴ細胞における抗ＰＤ−１、ＩＬ−７／ＩＬ−２１、ＣＣＲ２ｂ／ＣＣＲ４、Ｂｃｌ２のｉｎｖｉｔｒｏ発現
ヒト初代Ｔ細胞を調製し、プレ活性化し、構築物ＧＳＩ０５３、ＧＳＩ０５４、ＧＳＩ０５８〜ＧＳＩ０６０をそれぞれ形質導入した。Ａ５４９−ｌｕｃ細胞と３日間共培養した後、形質導入された各群の初代Ｔ細胞の上清を回収し、抗ＰＤ−１抗体の発現をＬＡＮＰＯＷＥＲ（商標）ＨｕｍａｎＦｃＤｅｔｅｃｔｉｏｎｋｉｔ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）によって検出した。簡単に記載すると、５μＬのヒトＩｇＧ−ＧＳ６６５、５μＬの抗ヒトＦｃ抗体−Ｅｕ、および１０μＬの抗体試料または対照をアッセイプレート中で混合し、室温で１．５時間インキュベートした。プレートをＨＴＲＦ対応機器（ＰＨＥＲＳＴＡＲ（商標）Ｐｌｕｓｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｒｅａｄｅｒ、Ｅｘ：３２０〜３４０ｎｍ、Ｅｍ：６２０ｎｍおよび６６５ｎｍ）上で読み取った。

図２６Ａに示すように、非形質導入Ｔ細胞（ＵｎＴ）および短縮型ＣＡＲ−Ｔ細胞（ＧＳＩ０５３）と比べ、抗ＰＤ−１抗体遺伝子と短縮型抗ＥＧＦＲ−ＣＡＲとを形質導入したＴ細胞（すなわち、ＧＳＩ０５４、ＧＳＩ０５８、ＧＳＩ０５９、ＧＳＩ０６０）は、抗ＰＤ−１抗体の分泌量が増加した。ＧＳＩ０５４、ＧＳＩ０５８、ＧＳＩ０５９、ＧＳＩ０６０ＣＡＲ−Ｔ細胞における抗ＰＤ−１抗体の発現は、それぞれ、０．７７±０．０６μｇ／ｍＬ、０．４８±０．１４μｇ／ｍＬ、０．３７±０．０８μｇ／ｍＬであった。ＧＳＩ０６０ＣＡＲ−Ｔ細胞における低い発現量は、その構築物がより長い（抗ＰＤ−１、ＩＬ−２１、ＣＣＲ４、およびＢｃｌ２）ことに起因する可能性がある。

ＧＳＩ０５８〜ＧＳＩ０６０改変初代Ｔ細胞のＩＬ−２１の発現を、ＨｕｍａｎＩＬ−２１ＥＬＩＳＡＭＡＸ（商標）Ｄｅｌｕｘｅｋｉｔ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ
＃４３３８０４）を用いて、使用説明書に従い検出した。非形質導入Ｔ細胞（ＵｎＴ）を陰性対照として用いた。図２６Ｂに示すように、ＧＳＩ０５８ＣＡＲ−Ｔ細胞は、Ａ５４９−ｌｕｃ細胞と３日間共培養した際に、１３５．０５±１．６８ｐｇ／ｍＬのＩＬ−２１を分泌した。一方、ＧＳＩ０５９およびＧＳＩ０６０ＣＡＲ−Ｔ細胞は、それぞれ１００．５８±０．８０ｐｇ／ｍＬおよび１８．６９±４．５８ｐｇ／ｍＬのＩＬ−２１を分泌した。

ＧＳＩ０５９およびＧＳＩ０６０形質導入Ｔ細胞の細胞表面上のＣＣＲ４の発現を、ＰＥ標識抗ヒトＣＣＲ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃３５９４１１）を使用説明書に従って用い、フローサイトメトリーによって評価した。簡単に記載すると、洗浄後、染色した細胞を２００μｌのＤＰＢＳに再懸濁し、暗所に置いた後、ＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲ（商標）（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはＡＴＴＵＮＥＮＸＴ（商標）フローサイトメーター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）上でのフローサイトメトリー分析にかけた。ＣＣＲ４の発現は、３９．０％のＧＳＩ０５９ＣＡＲ−Ｔ細胞および３７．３％のＧＳＩ０６０ＣＡＲ−Ｔ細胞上で検出された（図２７Ａ〜２７Ｂ）。

ＧＳＩ０６０導入Ｔ細胞におけるＢｃｌ２タンパク質の発現を、ＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８標識抗Ｂｃｌ−２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃６５８７０３）による細胞内染色により、使用説明書に従って測定した。簡単に記載すると、細胞をチューブあたり０．５ｍｌの固定緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃４２２６０１）中、暗所で２０分間室温にて固定した。固定後、細胞を３５０ｇで５分間、室温にて遠心分離し、上清を捨てた。細胞ペレットを、細胞内染色透過緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃４２２６０１）中に再懸濁し、３５０ｇで５分間遠心分離した。細胞を５回再洗浄した。固定・透過処理した細胞を、２００μＬのＩｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＳｔａｉｎｉｎｇＰｅｒｍＷａｓｈＢｕｆｆｅｒ中に再懸濁し、ＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８標識抗Ｂｃｌ−２抗体を該細胞に加え、暗所で室温にて２０分間インキュベートした。染色後、細胞を２ｍｌの細胞内染色透過緩衝液で２回洗浄し、３５０ｇで５分間、室温にて遠心分離した。洗浄後、染色された細胞を２００μＬのＤＰＢＳ中に再懸濁し、暗所に置いた後、ＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲ（商標）（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはＡＴＴＵＮＥＮＸＴ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）上でのフローサイトメトリー分析にかけた。図２７Ｃに示すように、Ｂｃｌ２の発現が１２．０％のＧＳＩ０６０ＣＡＲ−Ｔ細胞上で検出された。

形質導入Ｔ細胞または腫瘍細胞の細胞表面上のさらなるバイオマーカーを評価することができる。例えば、形質導入Ｔ細胞の細胞表面上でのＣＣＲ２ｂの発現を、ＰＥ標識抗ヒトＣＣＲ２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃３５７２０５）を使用説明書に従って用い、フローサイトメトリーによって評価する。Ａ５４９−Ｌｕｃ細胞上でのＰＤ−Ｌ１の発現を、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を用いてフローサイトメトリーによって測定する。

ヒト肺癌モデルにおける、抗ＰＤ−１抗体を発現するＣＡＲ−Ｔ細胞のｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍効果
短縮型抗ＥＧＦＲＣＡＲ（例えばＧＳＩ０５３〜ＧＳＩ０６０）によって誘導される、抗ＰＤ−１を発現する改変ヒト初代Ｔ細胞のｉｎｖｉｖｏでの有効性を、ヒト腫瘍細胞を移植したマウス異種移植モデル内で評価することができる。例えば、ＮＳＧマウスの一群に肺癌細胞Ａ５４９−Ｌｕｃを移植し、ヒト肺癌のマウス異種移植モデルを提供する。処理群において、前記モデル化されたマウスに、レンチウイルス構築物ＧＳＩ０５２〜ＧＳＩ０６０を形質導入したヒト初代Ｔ細胞の各群を注入する。対照群において、前記モデル化されたマウスに、非形質導入Ｔ細胞を注入する。

各処理条件の有効性を、腫瘍細胞の減少を含むいくつかのパラメーターにより評価する
。処理前後に、ｉｎｖｉｖｏ生物発光イメージングによって腫瘍サイズをモニタリングしてもよい。

カニクイザルにおける、短縮型抗ＥＧＦＲＣＡＲ誘導抗ＰＤ−１処理のｉｎｖｉｖｏでの安全性
短縮型抗ＥＧＦＲＣＡＲと抗ＰＤ−１とを発現するＣＡＲ−Ｔ細胞のｉｎｖｉｖｏでの安全性を、カニクイザルのモデルにおいて評価した。

ＰＢＭＣを２個体のサル（ＮＨＰ＃１およびＮＨＰ＃２、両個体ともオス、約４ｋｇ）の末梢血から得て、上記のように密度勾配遠心によって調製した。ｎｏｎ−ｈｕｍａｎｐｒｉｍａｔｅＰａｎＴＣｅｌｌＩｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ＃１３０−０９１−９９３）を使用説明書に従って用い、カニクイザルＴ細胞をＰＢＭＣから単離した。調製したサルＴ細胞を、ｎｏｎ−ｈｕｍａｎｐｒｉｍａｔｅＴＣｅｌｌＡｃｔｉｖａｔｉｏｎ／ＥｘｐａｎｓｉｏｎＫｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ＃１３０−０９２−９１９）およびヒトＩＬ−２により、自己サル血清を用いて、３日間プレ活性化した。その後、プレ活性化されたＴ細胞にＧＳＩ０６０レンチウイルスを形質導入し、さらに１０日間増殖させた。

調製したサルＧＳＩ０６０導入Ｔ細胞について、１対のＣＡＲ特異的プライマーを用いたリアルタイムＰＣＲにより、ＣＡＲ導入遺伝子の組み込みコピー数を試験した。表３に示すように、ＧＳＩ０６０ＣＡＲ配列は、１ｎｇのゲノムＤＮＡあたり３９，００８．９コピーでＮＨＰ＃２由来のＴ細胞のゲノム中に組み込まれた。タンパク質Ｌ結合により、または導入遺伝子の発現を（例えば抗ＣＣＲ２もしくは抗ＣＣＲ４抗体による染色後のＦＡＣＳによって）検出することにより、形質導入効率を分析することもできる。抗ＰＤ−１の発現は、上記のようにＨＴＲＦによって分析することができる。

また、前記形質導入Ｔ細胞をＡ５４９−Ｌｕｃ細胞と一晩共培養した。図２８に示すように、この共培養アッセイにおいて、調製したＧＳＩ０６０導入Ｔ細胞のＡ５４９．Ｌｕｃ細胞に対する有意な細胞毒性は無かった。

前記自己ＧＳＩ０６０改変Ｔ細胞の注入の３日前に、前記サルを、体重１ｋｇあたり２２ｍｇの投与量のシクロホスファミドの静脈注射によって前処理した。ＧＳＩ０６０改変Ｔ細胞の自己注入の日、細胞を３７℃のウォーターバス中でゆるやかに混ぜることによって融かし、その後すぐに前記動物に静脈輸液によって５分以内に注入した。ＮＨＰ＃２サルに、１ｋｇあたり３．２×１０^６個のＧＳＩ０６０改変Ｔ細胞を注入した。ＮＨＰ＃１サルに、無関係のＣＡＲ改変Ｔ細胞を注入した。

これらのサルは、前記Ｔ細胞投与後に、発熱、呼吸困難、食欲、下痢、および体重減少についてモニタリングされた。投与前および投与後の血液試料を得て、ＣＢＣ、血清化学値、およびサイトカイン濃度について調べた。例えば、ＩＦＮγとＩＬ−６の血漿中濃度
を、投与後１日目、２日目、３日目、４週間目まで、検出することができる。

図２９Ａ〜２９Ｄに示すように、ＧＳＩ０６０改変Ｔ細胞の自己注入の前後で、体重、体温、全血球計算値、またはサイトカイン濃度、血清化学値の有意な変化は無く、カニクイザルモデルにおけるＧＳＩ０６０の良好な寛容性が示された。

他のＣＡＲ−Ｔ細胞、例えばＧＳＩ０５２〜ＧＳＩ０５９を形質導入したものを、同様なカニクイザルモデルを用いて評価することができる。

実施例１３：改変初代ヒトＴ細胞が発現した単一ドメイン抗ＰＤ−１または抗ＣＴＬＡ−４抗体は腫瘍細胞に対するＣＡＲ−Ｔ細胞毒性をｉｎｖｉｔｒｏで増強する
ＬＰＤ−１−１６と命名された抗ＰＤ−１単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）と、前記抗ＥＧＦＲｖＩＩＩＣＡＲ（ＧＳＩ０２６、実施例３に記載）との両者をコードするレンチウイルスベクター（「ｐＬＩＣ−１０４２」）を設計した。ｐＬＩＣ−１０４２は、上記実施例に記載のように、２９３Ｔ細胞におけるレンチウイルスパッケージング系を用いて生成した。ＰａｎＴｃｅｌｌｉｓｏｌａｔｉｏｎｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ｃａｔ＃１３０−０９６−５３５）を使用し、ヒト初代Ｔ細胞をＰＢＭＣから作製した。単離したＴ細胞を、Ｔｃｅｌｌａｃｔｉｖａｔｉｏｎａｎｄｅｘｐａｎｓｉｏｎｋｉｔを用いて３日間プレ活性化した。Ｔ細胞の次の実験群を作製した：（１）Ｔ／ｐＬＩＣ−１０４２：抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲ遺伝子（ＧＳＩ０２６）とＮＦＡＴプロモーターの制御下の抗ＰＤ−１ｓｄＡｂ（ＬＰＤ−１−１６）遺伝子との両者を有するレンチウイルスベクターを形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞；（２）Ｔ／ＧＳＩ０２６・抗ＰＤ−１：抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲ遺伝子（ＧＳＩ０２６）とＮＦＡＴプロモーターの制御下のＩｇＧ抗ＰＤ−１抗体（ペムブロリズマブ）遺伝子との両者を有するレンチウイルスベクターを形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞（実施例３に記載の通り）；（３）Ｔ／ＧＳＩ０２６：抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲ遺伝子（ＧＳＩ０２６）を有するレンチウイルスベクターを形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞；および（４）ＵｎＴ：陰性対照としての無関係の遺伝子を形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞。

各群の改変初代ヒトＴ細胞（「エフェクター細胞」）を、Ｕ８７ＭＧ／ＶＩＩＩ−Ｌｕｃ−ＰＤ−Ｌ１細胞（「標的細胞」）と共に、２０：１のＥ／Ｔ比で３日間共培養した。腫瘍細胞に対する抗体分泌初代ヒトＴ細胞の細胞毒性のモニタリングを、ＯＮＥ−ＧＬＯ（商標）発光アッセイキットを使用説明書に従って使用し、残存ルシフェラーゼ活性を測定することによって行った。該アッセイにおける低いＲＬＵ値は、標的細胞に対する改変Ｔ細胞の強い細胞毒性効果を表す。

図３０Ａに示すように、標的細胞と３日間共培養した場合、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲと抗ＰＤ−１ｓｄＡｂとの両者を共発現する細胞（Ｔ／ｐＬＩＣ−１０４２）は、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲのみを発現する細胞（Ｔ／ＧＳＩ０２６、ＲＬＵ＝９８，８７４±６１９３）またはＩｇＧ抗ＰＤ−１抗体と抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲとを発現するＴ細胞（Ｔ／ＧＳＩ０２６・抗ＰＤ−１、ＲＬＵ＝９４，５９９±３５０７）と比べて、Ｕ８７ＭＧ／ＶＩＩＩ−Ｌｕｃ−ＰＤ−Ｌ１腫瘍細胞に対する、より強力な細胞毒性（ＲＬＵ＝７９，８４１±３６４６）を示した。

同様に、ＬＣＡ−１６と命名された抗ＣＴＬＡ−４単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）と、前記抗ＥＧＦＲｖＩＩＩＣＡＲ（ＧＳＩ０２６、実施例３に記載）との両者をコードするレンチウイルスベクター（「ｐＬＩＣ−１０４３」）を設計した。ｐＬＩＣ−１０４３は、上記実施例に記載のように、２９３Ｔ細胞におけるレンチウイルスパッケージング系を用いて生成した。ＰａｎＴｃｅｌｌｉｓｏｌａｔｉｏｎｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ｃａｔ＃１３０−０９６−５３５）を使用し、ヒト初代Ｔ細胞をＰＢＭＣから作製
した。単離したＴ細胞を、Ｔｃｅｌｌａｃｔｉｖａｔｉｏｎａｎｄｅｘｐａｎｓｉｏｎｋｉｔを用いて３日間プレ活性化した。Ｔ細胞の次の実験群を作製した：（１）Ｔ／ｐＬＩＣ−１０４３：抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲ遺伝子（ＧＳＩ０２６）とＮＦＡＴプロモーターの制御下の抗ＣＴＬＡ−４ｓｄＡｂ（ＬＣＡ−１６）遺伝子との両者を有するレンチウイルスベクターを形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞；（２）Ｔ／ＧＳＩ０２６・ＣＴＬＡ−４：抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲ遺伝子（ＧＳＩ０２６）とＮＦＡＴプロモーターの制御下のＩｇＧ抗ＣＴＬＡ−４抗体（イピリムマブ）遺伝子との両者を有するレンチウイルスベクターを形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞（実施例４に記載の通り）；（３）Ｔ／ＧＳＩ０２６：抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲ遺伝子（ＧＳＩ０２６）を有するレンチウイルスベクターを形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞；および（４）ＵｎＴ：陰性対照としての無関係の遺伝子を形質導入した改変ヒト初代Ｔ細胞。

各群の改変初代ヒトＴ細胞（「エフェクター細胞」）を、Ｕ８７ＭＧ／ＶＩＩＩ−Ｌｕｃ−ＣＤ８０／ＣＤ８６細胞（「標的細胞」）と共に、２０：１のＥ／Ｔ比で３日間共培養した。腫瘍細胞に対する抗体分泌初代ヒトＴ細胞の細胞毒性のモニタリングを、ＯＮＥ−ＧＬＯ（商標）発光アッセイキットを使用説明書に従って使用し、残存ルシフェラーゼ活性を測定することによって行った。該アッセイにおける低いＲＬＵ値は、標的細胞に対する改変Ｔ細胞の強い細胞毒性効果を表す。

図３０Ｂに示すように、Ｕ８７ＭＧ／ＶＩＩＩ−Ｌｕｃ−ＣＤ８０／ＣＤ８６細胞と３日間共培養した場合、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲと抗ＣＴＬＡ−４ｓｄＡｂとの両者を共発現するｐＬＩＣ−１０４３ベクターを形質導入したＣＡＲ−Ｔ細胞（Ｔ／ｐＬＩＣ−１０４３）は、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲのみを発現するＣＡＲ−Ｔ細胞（Ｔ／ＧＳＩ０２６、ＲＬＵ＝１１９，３７８±９６７０）またはＩｇＧ抗ＣＴＬＡ−４抗体と抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲとを発現するＴ細胞（Ｔ／ＧＳＩ０２６・抗ＣＴＬＡ−４、ＲＬＵ＝１０９，１３５±６６９５）と比べて、腫瘍細胞に対する、より強力な細胞毒性（ＲＬＵ＝９９，８１６±６２９５）を示した。

これらのデータは、全長ＩｇＧ抗ＰＤ−１（または抗ＣＴＬＡ−４）抗体と比べて、改変ＣＡＲ−Ｔ細胞によって発現された単一ドメイン抗ＰＤ−１（または抗ＣＴＬＡ−４）抗体は、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて、腫瘍細胞へのＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞毒性に対する、より顕著な増強効果を有していたことを示している。

Claims

ａ）免疫調節剤をコードする異種核酸を含む改変哺乳類細胞であって、前記異種核酸がプロモーターに機能的に連結した、改変哺乳類細胞；およびｂ）薬理学的に許容される賦形剤、を含む医薬組成物。
前記異種核酸が前記改変哺乳類細胞のゲノム中に存在する、請求項１に記載の医薬組成物。
前記改変哺乳類細胞が初代細胞である、請求項１または請求項２に記載の医薬組成物。
前記改変哺乳類細胞が細胞株由来である、請求項１または請求項２に記載の医薬組成物。
前記改変哺乳類細胞が免疫細胞である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
前記免疫細胞が末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはＮＫ細胞である、請求項５に記載の医薬組成物。
前記改変哺乳類細胞が幹細胞である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
前記改変哺乳類細胞がさらにキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する、請求項５〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
前記改変哺乳類細胞が、前記免疫調節剤をコードする前記異種核酸と、前記ＣＡＲまたは前記ＴＣＲをコードする第２の異種核酸を含むベクターを含む、請求項８に記載の医薬組成物。
前記ＣＡＲまたは前記ＴＣＲをコードする前記第２の異種核酸が前記プロモーターに機能的に連結した、請求項９に記載の医薬組成物。
前記プロモーターが前記キメラ抗原受容体または前記組換えＴ細胞受容体の細胞内シグナル伝達ドメインによって誘導可能である、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
前記ＣＡＲまたは前記ＴＣＲが、免疫エフェクター機能が無効化または減弱化した細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
前記医薬組成物がさらに第２の細胞を含み、前記第２の細胞はキメラ抗原受容体または組換えＴ細胞受容体を発現する哺乳類免疫細胞である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
前記プロモーターが内在性プロモーターである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
前記プロモーターが異種プロモーターである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
前記プロモーターが誘導条件によって誘導可能なプロモーターである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
前記誘導条件が、誘導物質、照射、温度、酸化還元状態、腫瘍環境、および前記改変哺乳類細胞の活性化状態からなる群より選択される、請求項１６に記載の医薬組成物。
前記プロモーターが前記改変哺乳類細胞の内在性活性化シグナルによって誘導可能である、請求項１７に記載の医薬組成物。
前記プロモーターがＴ細胞活性化依存プロモーターである、請求項１８に記載の医薬組成物。
前記プロモーターが誘導物質によって誘導可能である、請求項１７に記載の医薬組成物。
前記誘導物質が小分子である、請求項２０に記載の医薬組成物。
前記誘導物質がポリペプチドである、請求項２０に記載の医薬組成物。
前記ポリペプチドが前記改変哺乳類細胞によって発現される、請求項２２に記載の医薬組成物。
前記改変哺乳類細胞がさらに、腫瘍抗原を認識するターゲティング分子をその表面上に発現する、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
前記免疫調節剤が免疫チェックポイント阻害剤である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
前記免疫チェックポイント阻害剤がＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、ＢＬＴＡ、ＴＩＭ−３、またはＬＡＧ−３の阻害剤である、請求項２５に記載の医薬組成物。
前記免疫調節剤が免疫賦活剤である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
前記免疫賦活剤がＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−１２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ２ｂ、ヘパラナーゼ、ＣＤ１３７Ｌ、ＬＥＭ、およびＢｃｌ−２からなる群より選択される、請求項２７に記載の方法。
前記免疫調節剤が抗体である、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
前記抗体が一本鎖抗体である、請求項２９に記載の医薬組成物。
前記抗体が単一ドメイン抗体である、請求項２９に記載の医薬組成物。
前記抗体が重鎖と軽鎖とを含む、請求項２９または請求項３０に記載の医薬組成物。
前記重鎖をコードする核酸と前記軽鎖をコードする核酸が、同一のプロモーターに機能的に連結される、請求項３２に記載の医薬組成物。
前記重鎖をコードする核酸と前記軽鎖をコードする核酸が、異なるプロモーターに機能
的に連結される、請求項３２に記載の医薬組成物。
前記重鎖をコードする核酸のためのプロモーターと前記軽鎖をコードする核酸のためのプロモーターを同時に誘導することができる、請求項３４に記載の医薬組成物。
前記重鎖をコードする核酸のためのプロモーターと前記軽鎖をコードする核酸のためのプロモーターを順次誘導することができる、請求項３４に記載の医薬組成物。
前記重鎖をコードする核酸のためのプロモーターと前記軽鎖をコードする核酸のためのプロモーターが、約１０：１〜約１：１０の強度比を有する、請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
前記改変哺乳類細胞がさらに、治療用タンパク質をコードする第２の異種核酸を含む、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
前記免疫調節剤をコードする異種核酸と、前記治療用タンパク質をコードする第２の異種核酸が、同一のプロモーターに機能的に連結される、請求項３８に記載の医薬組成物。
前記免疫調節剤をコードする異種核酸と、前記治療用タンパク質をコードする第２の異種核酸が、異なるプロモーターに機能的に連結される、請求項３８に記載の医薬組成物。
前記治療用タンパク質が免疫調節剤ではない、請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
前記治療用タンパク質が免疫調節剤である、請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
前記改変哺乳類細胞が前記免疫調節剤と２種以上の治療用タンパク質を発現する、請求項４１または請求項４２に記載の医薬組成物。
個体における癌の治療法であって、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の医薬組成物の有効量を前記個体に投与することを含む、方法。
前記医薬組成物が全身投与される、請求項４４に記載の方法。
前記医薬組成物が輸液により投与される、請求項４５に記載の方法。
前記医薬組成物が腫瘍部位に局所投与される、請求項４４に記載の方法。
前記医薬組成物が注射により投与される、請求項４７に記載の方法。
前記免疫調節剤の発現を前記改変哺乳類細胞内で誘導することをさらに含む、請求項４４〜４８のいずれか１項に記載の方法。
前記癌が固形腫瘍である、請求項４４〜４９のいずれか１項に記載の方法。
前記癌が液性腫瘍である、請求項４４〜４９のいずれか１項に記載の方法。
前記改変哺乳類細胞が前記個体から得られる、請求項４４〜５１のいずれか１項に記載の方法。
前記改変哺乳類細胞が前記個体に対し同種異系である、請求項４４〜５１のいずれか１項に記載の方法。
前記個体がヒト個体である、請求項４４〜５３のいずれか１項に記載の方法。
前記免疫調節剤をコードする前記異種核酸を含んだベクターを哺乳類細胞に導入することを含む、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の医薬組成物を調製する方法。
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項５５に記載の方法。
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、およびそれらの誘導体からなる群より選択される、請求項５６に記載の方法。
前記ベクターがエレクトロポレーションによって前記細胞に導入される、請求項５５に記載の方法。
ａ）請求項１〜４３のいずれ１項に記載の医薬組成物；およびｂ）前記医薬組成物の使用のための説明書、を含むキット。
ｃ）キメラ抗原受容体または組換えＴ細胞受容体を発現する第２の哺乳類免疫細胞を含む組成物、をさらに含む、請求項５９に記載のキット。