JP2020517263A - がんを治療するための組成物及び方法 - Google Patents

Abstract

本明細書には、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びチェックポイント阻害剤をコードする核酸を含む遺伝子改変された組成物、及びがんを治療するための組成物の使用方法が記載されている。【選択図】図４Ｄ

Description

関連出願への相互参照
この出願には、２０１７年４月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／４８７，３５８号に対する米国特許法第３５条§１１９（ｅ）に基づく優先権の主張が含まれ、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。

連邦政府による資金提供を受けた研究または開発に関する声明
本発明は、国立衛生研究所により授与された助成金番号ＡＩ０６８９７８及びＥＢ０１７２０６の下での政府支援によりなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。

技術分野
本明細書には、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びチェックポイント阻害剤（ＣＰＩ）を含むＴ細胞を含む組成物、ならびにがんを治療するために組成物を使用する方法が記載されている。

背景
本明細書のすべての刊行物は、各個々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示された場合と同じ程度に参照により組み込まれる。以下の説明には、本発明を理解するのに有用な情報が含まれる。本明細書で提供される情報のいずれかが先行技術であるか、または現在請求されている発明に関連すること、または具体的または暗黙的に参照される刊行物が先行技術であることを認めるものではない。

がんの免疫療法の様式としての養子細胞移植（ＡＣＴ）は、血液悪性腫瘍及び悪性黒色腫の治療において顕著な成功を実証している。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する遺伝子改変Ｔ細胞を用いて、ＣＤ１９やＧＤ２などの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を特異的に標的とするＡＣＴの特に効果的な形態は、Ｂ細胞悪性腫瘍や神経芽細胞腫などの疾患を治療するための臨床試験で有望な結果が示されている。

天然のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）とは異なり、ＣＡＲは、細胞内Ｔ細胞シグナル伝達及び共刺激ドメインと融合した細胞外抗原認識ドメインからなる人工受容体である。ＣＡＲは、主要組織適合性クラス（ＭＨＣ）に依存しない方法で、細胞表面のＴＡＡを直接的及び選択的に認識できる。血液悪性腫瘍患者におけるＣＡＲ Ｔ細胞療法の成功が実証されているにもかかわらず、固形腫瘍ではわずかな反応のみが観察されている。これは、一部には、固形腫瘍における免疫抑制性微小環境の確立に起因し得る。このような環境には、腫瘍内の同族リガンドと反応するＴ細胞の抑制性受容体（ＩＲ）の発現の増加によって媒介される多くの内因性抑制経路のアップレギュレーションが含まれる。

これまでに、ＣＴＬＡ−４、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン３（ＴＩＭ−３）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ−３）、及びプログラム死−１（ＰＤ−１）などのいくつかのＩＲがＴ細胞において特徴付けられてきた。これらの分子は、慢性疾患及びがんにおけるＴ細胞の持続的活性化に続いてアップレギュレートされ、Ｔ細胞の機能不全と消耗を促進し、免疫監視から腫瘍を逃す。他のＩＲとは異なり、ＰＤ−１はＴ細胞活性化の直後にアップレギュレートされ、その２つのリガンドＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２との相互作用を介してＴ細胞エフェクター機能を発揮する。ＰＤ−Ｌ１は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞（ＤＣ）に恒常的に発現している。ＰＤ−Ｌ１は、様々な固形腫瘍で豊富に発現することも示されている。対照的に、正常組織におけるＰＤ−Ｌ１の発現は検出できない。免疫抑制におけるその重要な役割の結果として、ＰＤ−１はＴ細胞に対するその負の効果を中和し、抗腫瘍応答を強化することを目指して、最近の研究の焦点となっている。臨床研究により、ＰＤ−１の遮断は、結腸、腎臓、肺のがん及び黒色腫の腫瘍退縮を有意に増強することが実証されている。

従って、本発明の目的は、ＣＡＲ Ｔ細胞の腫瘍誘発性機能低下を調節し、阻害性受容体を逆転または阻害し得る組成物を提供することである。

本発明の別の目的は、ＣＡＲ Ｔ細胞の腫瘍誘発性機能低下を調節または回避する組成物を作製及び使用するプロセスを提供することである。

概要
以下の実施形態及びその態様は、範囲を限定するものではなく、模範的かつ例示的であることを意味するシステム、組成物、及び方法と併せて説明及び図示される。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びチェックポイント阻害剤（ＣＰＩ）の両方をコードする核酸を含む、またはＣＡＲをコードする核酸及びＣＰＩをコードする核酸を含む細胞が提供される。様々な実施形態において、チェックポイント阻害剤を分泌するＣＡＲ−Ｔ細胞が提供される。

種々の実施形態において、ＰＤ−１を標的とするチェックポイント阻害剤（ＣＰＩ）を分泌するＣＡＲ−Ｔ細胞（ＣＡＲ．αＰＤ１−Ｔ細胞として示される）が提供され、ヒト肺がん異種移植マウスモデルにおけるそれらの有効性が示される。血液悪性腫瘍患者における、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）操作Ｔ細胞療法の良好な反応にもかかわらず、結果は、部分的には免疫抑制性腫瘍微小環境の発達により、固形腫瘍の治療において満足のいくものではなかった。いくつかの態様では、ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＰＤ−１シグナル伝達の阻害効果を克服するために、抗ＰＤ−１抗体の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）型を継続的に産生する能力を備えた遺伝子操作されたＣＡＲ Ｔ細胞が使用される。腫瘍モデルでは、抗ＰＤ−１ ｓｃＦｖの発現と分泌により、ＰＤ−１とそのリガンドであるＰＤ−Ｌ１との結合が妨げられ、ＣＡＲ Ｔ細胞の抑制と枯渇が防止される。ＣＤ１９腫瘍モデルでは、ＣＡＲ Ｔ細胞による抗ＰＤ−１ ｓｃＦｖの分泌により、確立された固形腫瘍の根絶におけるＣＡＲ Ｔ細胞の能力が大幅に改善される。

典型的には、ＣＡＲ．αＰＤ１−Ｔ細胞は、抗原特異的刺激後のＩＦＮ−γの産生及びＴ細胞増殖により測定されるエフェクター機能及び拡大能力を示す。異種移植マウスモデルを使用した場合のＣＡＲ．αＰＤ１−Ｔ細胞の抗腫瘍効果は、ＣＡＲ−Ｔ細胞単独、または抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたＣＡＲ−Ｔ細胞よりも優れている。ＣＡＲ．αＰＤ１−Ｔ細胞の腫瘍根絶の強化は、腫瘍浸潤リンパ球の拡大と機能的能力によってさらにサポートされている。

種々の実施形態において、ＣＡＲ．αＰＤ１−Ｔ細胞は、ＰＤ−１に効率的に結合しＴ細胞機能に対するＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の阻害効果を逆転させるヒト抗ＰＤ−１ ＣＰＩを分泌する。継続的に分泌される抗ＰＤ−１によるＰＤ−１の遮断は、Ｔ細胞の枯渇を防ぎ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方でＴ細胞の拡大とエフェクター機能を大幅に強化する。異種移植マウスモデルでは、抗ＰＤ−１の分泌によりＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍活性が増強され、全体的な生存期間が延長される。構成的な抗ＰＤ−１分泌により、ＣＡＲ．αＰＤ１−Ｔ細胞は、親のＣＡＲ−Ｔ細胞よりも消耗が少なく、機能的で拡張性が高く、腫瘍根絶においてより効率的である。

ＣＡＲ及びＣＰＩをコードする核酸を含む細胞を、それを必要とする対象に投与して、抗腫瘍免疫を増強し、及び／またはがんを治療する（特に固形腫瘍を減らす）プロセスが提供される。

例示的な実施形態は、参照図に示されている。本明細書で開示される実施形態及び図は、限定的ではなく例示的であると見なされることを意図している。

１Ａ〜１Ｅは、ＣＡＲ１９及びＣＡＲ１９．αＰＤ１の構築及び特徴付けを示す。１Ａは、親の抗ＣＤ１９ ＣＡＲ（ＣＡＲ１９）及び抗ＰＤ−１分泌抗ＣＤ１９ ＣＡＲ（ＣＡＲ１９．αＰＤ１）構築物の模式図を示す。１Ｂは、ヒトＴ細胞における両方のＣＡＲの発現を示す。ＣＡＲ Ｔ細胞の２つの群をビオチン化プロテインＬで染色し、続いてＦＩＴＣ結合ストレプトアビジンで染色して、細胞表面のＣＡＲ発現を検出した。実行可能なＣＤ３^＋リンパ球ゲーティング戦略が使用された。ＮＴは、対照として使用された非形質導入Ｔ細胞を示す。１Ｃ及び１Ｄは、ウエスタンブロット（１Ｃ）及びＥＬＩＳＡ（１Ｄ）で解析したＣＡＲ１９またはＣＡＲ１９．αＰＤ１Ｔ細胞培養液のいずれかの上清における分泌型抗ＰＤ−１抗体の発現を示す。１Ｅは、指定された処理による総ＣＤ８^＋Ｔ細胞に対するＩＦＮ−γを発現するＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合を示す（ｎ＝４、平均値±ＳＥＭ；＊＊Ｐ＜０．０１）。 ２Ａ〜２Ｄは、抗ＰＤ−１の発現がＣＡＲ Ｔ細胞の抗原特異的免疫応答を増強したことを示す。２Ａは、ＣＡＲ１９とＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞の両方を、異なる期間Ｈ２９２−ＣＤ１９細胞と共培養したことを示す。ＩＦＮ−γ産生は、ＥＬＩＳＡで測定した（ｎ＝５、平均値±ＳＥＭ；ｎｓ、有意ではない、Ｐ＞０．０５；＊Ｐ＜０．０５）。２Ｂは、標的細胞に対する両方のＣＡＲの細胞毒性を示す。ＣＡＲ Ｔ細胞の２つの群を、Ｈ２９２−ＣＤ１９細胞と１：１、５：１、１０：１、及び２０：１のエフェクター対標的比で６時間共培養し、Ｈ２９２−ＣＤ１９に対する細胞毒性を測定した。非形質導入（ＮＴ）Ｔ細胞を対照として使用した。２Ｃは、抗原特異的刺激後の両方のＣＡＲの増殖を示す。ＣＡＲ Ｔ細胞の２つの群はＣＦＳＥで事前染色された。次いで、染色されたＴ細胞を１対１のエフェクター対標的比でＨ２９２−ＣＤ１９細胞と９６時間共培養し、ＣＦＳＥの強度を測定した。非形質導入（ＮＴ）Ｔ細胞を対照として使用した。２Ｄは、２Ｃに対応する非形質導入（ＮＴ）Ｔ細胞、ＣＡＲ１９ Ｔ細胞、及びＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞の増殖率の棒グラフで要約された統計を示す（ｎ＝４、平均±ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５）。 ３Ａ〜３Ｆは、抗ＰＤ−１ ｓｃＦｖを分泌することにより、ＣＡＲ Ｔ細胞が使い果たされないように保護することを示す。ＣＡＲ１９及びＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞の両方をＨ２９２−ＣＤ１９細胞と２４時間共培養した。３Ａは、フローサイトメトリーにより測定されたＰＤ−１の発現を示す。ＣＤ８^＋Ｔ細胞が各パネルに示された。ＰＤ−１を発現するＣＤ８ Ｔ細胞をゲーティングし、各散布図で総ＣＤ８^＋Ｔ細胞に対する割合を示した。３Ｂは、３連の要約した統計を棒グラフで示す（ｎ＝３、平均値±ＳＥＭ、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。３Ｃは、フローサイトメトリーにより測定されたＬＡＧ−３の発現を示す。総ＣＤ８^＋Ｔ細胞に対するＬＡＧ−３発現ＣＤ８ Ｔ細胞の割合を棒グラフで示した（ｎ＝３、平均値±ＳＥＭ；ｎｓ、有意ではない、Ｐ＞０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１）。３Ｄは、フローサイトメトリーで測定したＴＩＭ−３の発現を示す。合計ＣＤ８^＋Ｔ細胞に対するＴＩＭ−３発現ＣＤ８ Ｔ細胞の割合を棒グラフで示した（ｎ＝３、平均値±ＳＥＭ；ｎｓ、有意ではない、Ｐ＞０．０５）。３Ｅ及び３Ｆは、ＣＡＲ１９及びＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞の両方がＨ２９２−ＣＤ１９またはＳＫＯＶ３−ＣＤ１９細胞のいずれかと２４時間共培養されたことを示す。ＰＤ−Ｌ１発現は、フローサイトメトリーにより測定された。総ＣＤ８^＋Ｔ細胞に対するＰＤ−Ｌ１発現ＣＤ８ Ｔ細胞の割合（３Ｅ）及び総ＣＤ４^＋Ｔ細胞に対するＰＤ−Ｌ１発現ＣＤ４ Ｔ細胞の割合（３Ｆ）を棒グラフで示した（ｎ＝３、平均値±標準誤差；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１）。 ４Ａ〜４Ｄは、抗ＰＤ−１ ｓｃＦｖを分泌するＣＡＲ Ｔ細胞の養子移入が、確立された腫瘍の成長阻害を増強したことを示す。４Ａは、腫瘍負荷、Ｔ細胞養子移入及び抗体治療の実験手順の概略図を示す。ＮＳＧマウスには、３×１０^６のＨ２９２−ＣＤ１９腫瘍細胞をｓ．ｃ．で負荷した。２０日目に、腫瘍が約１００ｍｍ^３に成長すると、１×１０^６個のＣＡＲ１９またはＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞がｉ．ｖ．注入を通じて養子移入された。Ｔ細胞注入の１日後、抗ＰＤ−Ｌ１抗体治療が開始され、指定された日に治療が継続された。腫瘍体積は１日おきに測定された。４Ｂは、非形質導入（ＮＴ）、ＮＴプラス抗ＰＤ−１注射、ＣＡＲ１９、ＣＡＲ１９プラス抗ＰＤ−１注射、またはＣＡＲ１９．αＰＤ１で処置したマウスの腫瘍成長曲線を示す。データは、示された時点での平均腫瘍体積±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として提示された（ｎ＝８；＊Ｐ＜０．０５；＊＊＊Ｐ＜０．００１）。４Ｃは、様々な治療群の治療後１７日目の腫瘍縮小のウォーターフォールプロット解析を示す。４Ｄは、指示された治療後のＨ２９２−ＣＤ１９腫瘍を有するＮＳＧマウスの生存を示す。カプラン・マイヤー法を用いて全生存曲線をプロットし、ログランク（マンテルコックス）テストを用いて比較した（ｎ＝６；ｎｓ、有意ではない、Ｐ＞０．０５；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１）。 ５Ａ〜５Ｃは、抗ＰＤ−１を分泌するＣＡＲ Ｔ細胞が、ｉｎ ｖｉｖｏで親のＣＡＲ Ｔ細胞よりも効率的に増殖したことを示す。非形質導入（ＮＴ）、ＣＡＲ１９、またはＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞を養子移入したＨ２９２−ＣＤ１９腫瘍保有マウスの腫瘍、血液、脾臓、及び骨髄におけるヒトＣＤ４５^＋Ｔ細胞の割合を治療後２日目（５Ａ）または１０日目（５Ｂ）にフローサイトメトリーで調査した（ｎ＝３、平均値±ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５；＊＊＊Ｐ＜０．００１）。５Ｃは、異なる群の腫瘍、血液、脾臓、及び骨髄におけるヒトＣＤ４５^＋Ｔ細胞の割合の代表的なＦＡＣＳ散布図を示す。 ６Ａ〜６Ｇは、抗ＰＤ−１を分泌するＣＡＲ Ｔ細胞が、局所腫瘍部位で親のＣＡＲ Ｔ細胞よりも機能的であることを示す。６Ａは、腫瘍負荷、Ｔ細胞養子移入及び抗体治療の実験手順の概略図を示す。ＮＳＧマウスには、３×１０^６のＨ２９２−ＣＤ１９腫瘍細胞をｓ．ｃ．で負荷した。２０日目に、３×１０^６のＣＡＲ１９またはＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞がｉ．ｖ．注入を通じて養子移入された。Ｔ細胞養子移植の１日後、抗ＰＤ−１抗体治療が開始され、治療は指定された日数継続された。次いで、解析のために８日目にマウスを安楽死させた。６Ｂは、フローサイトメトリーによって特徴付けられる、ＣＡＲ１９またはＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞で養子移入された、または抗ＰＤ−１抗体の注射とともにＣＡＲ１９ Ｔ細胞で処理されたＨ２９２−ＣＤ１９腫瘍保有マウスの腫瘍、血液、脾臓及び骨髄におけるヒトＣＤ４５^＋Ｔ細胞の割合を示す。６Ｃは、腫瘍におけるＣＤ８^＋ＴＩＬとＣＤ４^＋ＴＩＬの比率を示す（ｎ＝３、平均値±ＳＥＭ；ｎｓ、有意ではない、Ｐ＞０．０５；＊Ｐ＜０．０５；＊＊＊Ｐ＜０．００１）。６Ｄは、総ＣＤ８^＋ＴＩＬに対するＰＤ−１発現ＣＤ８ ＴＩＬの割合を示す（ｎ＝３、平均値±ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５）。ＴＩＬを回収し、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体（６Ｅ）または標的細胞Ｈ２９２−ＣＤ１９（６Ｆ）のいずれかによりｅｘ ｖｉｖｏで６時間刺激した。細胞内ＩＦＮ−γを発現している腫瘍内のＣＡＲ Ｔ細胞の割合をフローサイトメトリーで調べた（ｎ＝３、平均±ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１）。６Ｇは、ＥＬＩＳＡを用いて評価された血清中の分泌された抗ＰＤ−１ ｓｃＦｖと注射された抗ＰＤ−１抗体を示す（ｎ＝３、平均±ＳＥＭ；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１）。 ７Ａは、ブレフェルジンＡを含むまたは含まない２４時間培養後のＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞（１×１０^６）からの抗ＰＤ−１ ｓｃＦｖの産生を示す。７Ｂは、ＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞の増殖過程における抗ＰＤ−１ ｓｃＦｖの発現を示す。分泌されたｓｃＦｖの濃度は、４、７、１０及び１２日目を含む、Ｔ細胞形質導入後の４つの異なる時点で測定された。Ｔ細胞の増殖中、細胞密度は１ｍＬあたり２〜４×１０^６個程度維持された。７Ｃは、ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで４８時間活性化し、１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ−２を添加したＴ細胞培地で２週間培養したことを示す。次いで、活性化されたＴ細胞を、アイソタイプ対照抗体または抗ＰＤ−１抗体で染色した。７Ｄは、活性化されたヒトＴ細胞が１ｍＬのＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞培養上清と３０分間インキュベートされたことを示す。Ｔ細胞をＰＢＳで１回洗浄した後、抗ＨＡ抗体で染色した。 フローサイトメトリーにより決定されたＨ２９２−ＣＤ１９及びＳＫＯＶ３−ＣＤ１９上のＰＤ−Ｌ１の発現を示す。 ９Ａは、ＣＡＲ１９及びＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞の両方が異なる期間にわたってＳＫＯＶ３−ＣＤ１９細胞と共培養されたことを示す。ＩＦＮ−γ産生はＥＬＩＳＡで測定した（ｎ＝５、平均値±ＳＥＭ；ｎｓ、有意ではない、Ｐ＞０．０５；＊Ｐ＜０．０５）。９Ｂは、抗ＰＤ−１（０．６μｇ／ｍＬ）を含むまたは含まないＣＡＲ１９ Ｔ細胞を示し、ＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞は、Ｈ２９２−ＣＤ１９細胞と２４時間または７２時間共培養された。ＩＦＮ−γ産生はＥＬＩＳＡで測定した（ｎ＝４、平均±ＳＥＭ；ｎｓ、有意ではない、Ｐ＞０．０５；＊＊＊Ｐ＜０．００１）。 ３日間の抗原特異的刺激による非形質導入（ＮＴ）、ＣＡＲ１９及びＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞の集団倍加を示す（ｎ＝３、平均±ＳＥＭ；＊＊Ｐ＜０．０１）。 １１Ａは、ＰＤ−１検出抗体の結合に対する抗ＰＤ−１ ｓｃＦｖの遮断活性を示す。ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで４８時間活性化し、次いで、１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ−２を補充したＴＣＭで２週間培養した。次いで、活性化されたＴ細胞を１ｍＬのＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞培養上清または対照培地とともに３０分間インキュベートした。Ｔ細胞をＰＢＳで１回洗浄した後、抗ＰＤ−１抗体で染色した。１１Ｂは、２４時間の抗原特異的刺激時のＣＡＲ１９及びＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞上のＰＤ−１の相対的転写発現を示す（ｎ＝３、平均±ＳＥＭ、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。 １２Ａ及び１２Ｂは、２４時間の抗原特異的刺激後のＣＤ８^＋ＰＤ−Ｌ１^＋Ｔ細胞（１２Ａ）ならびにＣＤ８^＋ＬＡＧ−３^＋及びＣＤ８^＋ＴＩＭ−３^＋Ｔ細胞（１２Ｂ）の代表的なゲーティングスキーム及びプロットを示す。 １３Ａ−１３Ｅは、ＣＡＲ１９及びＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞の両方がＨ２９２−ＣＤ１９細胞と２４時間共培養されたことを示す。ＰＤ−１（１３Ａ）、ＬＡＧ−３（１３Ｂ）、及びＴＩＭ−３（１３Ｃ）の発現をフローサイトメトリーで測定した。総ＣＤ４^＋Ｔ細胞に対するＰＤ−１−、ＬＡＧ−３−またはＴＩＭ−３発現ＣＤ４ Ｔ細胞の割合を棒グラフで示した（ｎ＝３、平均値±ＳＥＭ、ｎｓ、有意ではない、Ｐ＞０．０５； ＊＊Ｐ＜０．０１）。Ｔ細胞の増殖過程のＣＡＲ１９及びＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞の両方のＰＤ−１（１３Ｄ）及びＬＡＧ−３（１３Ｅ）の発現（Ｔ活性化及び形質導入後）。 １４Ａは、それらがマウスに養子移入される前の、ＣＤ８^＋Ｔ細胞とＣＤ４^＋Ｔ細胞の比率を示す。１４Ｂは、ＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞で処理したマウスのＣＤ８^＋Ｔ細胞とＣＤ４^＋Ｔ細胞の比率を示す（ｎ＝３、平均±ＳＥＭ、＊＊Ｐ＜０．０１）。１４Ｃは、血清中のＩＦＮ−γの発現がＥＬＩＳＡにより測定されたことを示す。

詳細な説明
本明細書に引用されるすべての参考文献は、完全に記載されているかのように、その全体が参照により組み込まれる。別に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２２ｎｄ ｅｄ．， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ （Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １５， ２０１２）； Ｈｏｒｎｙａｋ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｎａｎｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ （２００８）； Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ， Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３ｒｄ ｅｄ．， ｒｅｖｉｓｅｄ ｅｄ．， Ｊ． Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ ２００６）； Ｓｍｉｔｈ， Ｍａｒｃｈ’ｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ， Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ７ｔｈ ｅｄ．， Ｊ． Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ ２０１３）； Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ， Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３ｒｄ ｅｄ．， Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ （Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２８， ２０１２）； 及びＧｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ４ｔｈ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ ２０１２）は、本出願で使用される用語の多くに対する一般的なガイドを当業者に提供する。抗体の調製方法については、Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＮＹ， ２０１３）； Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｌｉｎｅｓ ｂｙ ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｏｎ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９７６ Ｊｕｌ， ６（７）：５１１−９； Ｑｕｅｅｎ ａｎｄ Ｓｅｌｉｃｋ， Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ， Ｕ． Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，５８５，０８９ （１９９６ Ｄｅｃ）；及びＲｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ， Ｎａｔｕｒｅ １９８８ Ｍａｒ ２４， ３３２（６１６２）：３２３−７を参照されたい。

当業者は、本明細書に記載されるものと類似または同等の多くの方法及び材料を認識し、それらは本発明の実施において使用され得る。本発明の他の特徴及び利点は、本発明の実施形態の様々な特徴を例として示す添付の図面と併せて、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。実際、本発明は、記載された方法及び材料に決して限定されない。便宜上、本明細書、実施例、及び添付の特許請求の範囲で使用される特定の用語は、ここに集められている。

特に明記しない限り、または文脈から暗黙的である場合を除き、以下の用語及び語句は、以下に提供される意味を含む。特に明記しない限り、または文脈から明らかでない限り、以下の用語及び語句は、その用語または語句が関連する技術分野で獲得した意味を排除しない。本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ制限されるため、定義は特定の実施形態の説明を支援するために提供され、特許請求される発明を限定することを意図するものではない。特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。

定義
本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、実施形態に有用であるか有用でないかどうかにかかわらず、不特定の要素の包含に対して開かれている組成物、方法、及びそれぞれの構成要素（複数可）に関して使用される。一般に、本明細書で使用される用語は一般に「オープン」用語として意図されていることを当業者は理解するであろう（例えば、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は「含むが、これに限定されない」と解釈されるべきであり、用語「持っている」は「少なくとも持っている」と解釈されるべきであり、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」は「含むがそれに限定されない」などと解釈されるべきである。）。

特に断りのない限り、出願の特定の実施形態を説明する文脈で（特に請求項の文脈で）使用される用語「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」及び類似の参照は、単数形と複数形の両方をカバーすると解釈され得る。本明細書における値の範囲の列挙は、その範囲内に入る個々の各値を個別に参照する速記方法として機能することのみを意図している。本明細書で特に明記しない限り、個々の値は、あたかも本明細書で個別に引用されているかのように明細書に組み込まれている。本明細書で説明されるすべての方法は、本明細書で特に指示がない限り、または文脈により明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施され得る。本明細書の特定の実施形態に関して提供されるありとあらゆる例、または例示的な言葉（例えば、「など」）の使用は、単に本出願をより良く照らすことを意図しており、他に請求される本出願の範囲を限定するものではない。略語「ｅ．ｇ．」はラテン語のｅｘｅｍｐｌｉ ｇｒａｔｉａに由来し、非限定的な例を示すためにここで使用される。従って、略語「ｅ．ｇ．」は用語「例えば」と同義である。本明細書中の言語は、本出願の実施に不可欠な非請求要素を示すと解釈されるべきではない。

本明細書で使用される場合、用語「約」は、量、持続時間などのような測定可能な値をいい、指定値から±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、または±０．１％の変動が含まれる。

本明細書で使用される「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」または「ＣＡＲ（複数可）」は、抗原特異性を細胞（例えば、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞またはそれらの組み合わせなどのＴ細胞）に移植する操作された受容体のことをいう。ＣＡＲは、人工Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、またはキメラ免疫受容体としても知られている。種々の実施形態において、ＣＡＲは、抗原特異的ドメイン（ＡＳＤ）、ヒンジ領域（ＨＲ）、膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）、共刺激ドメイン（ＣＳＤ）及び細胞内シグナル伝達ドメイン（ＩＳＤ）を含む組換えポリペプチドである。

「抗原特異的ドメイン」（ＡＳＤ）は、標的細胞上の抗原に特異的に結合するＣＡＲの部分のことをいう。いくつかの実施形態において、ＣＡＲのＡＳＤは、抗体またはその機能的等価物またはその断片またはその誘導体を含む。標的指向領域は、完全長重鎖、Ｆａｂフラグメント、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント、二価の一本鎖抗体またはダイアボディを含んでもよく、これらはそれぞれ標的抗原に特異的である。いくつかの実施形態において、当業者に理解されるように、所定の抗原に高親和性で結合するほぼすべての分子をＡＳＤとして使用され得る。いくつかの実施形態において、ＡＳＤはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはその部分を含む。

本明細書で使用される「ヒンジ領域」（ＨＲ）は、ＡＳＤとＴＭＤとの間にある親水性領域のことをいう。ヒンジ領域には、抗体またはそのフラグメントまたは誘導体のＦｃフラグメント、抗体またはそのフラグメントまたは誘導体のヒンジ領域、抗体のＣＨ２領域、抗体のＣＨ３領域、人工スペーサー配列またはその組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。ヒンジ領域の例には、ＣＤ８ａヒンジ、及び、例えばＩｇＧのＧｌｙ３またはＣＨ１及びＣＨ３ドメイン（ヒトＩｇＧ４など）ほど小さくてもよいポリペプチドで作られた人工スペーサーが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ヒンジ領域は、（ｉ）ＩｇＧ４のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域、（ｉｉ）ＩｇＧ４のヒンジ領域、（ｉｉｉ）ＩｇＧ４のヒンジ及びＣＨ２、（ｉｖ）ＣＤ８ａのヒンジ領域、（ｖ）ＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域、（ｖｉ）ＩｇＧ１のヒンジ領域、または（ｖｉ）ＩｇＧ１のヒンジ及びＣＨ２領域の１つ以上である。他のヒンジ領域は当業者には明らかであり、本発明の代替実施形態に関連して使用され得る。

本明細書で使用される「膜貫通ドメイン」（ＴＭＤ）は、原形質膜を通過するＣＡＲの領域のことをいう。本発明のＣＡＲの膜貫通ドメインは、膜貫通タンパク質（例えば、Ｉ型膜貫通タンパク質）、人工疎水性配列またはそれらの組み合わせの膜貫通領域である。他の膜貫通ドメインは、当業者には明らかであり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。いくつかの実施形態において、ＣＡＲのＴＭＤは、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖の膜貫通ドメイン、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒ ａ、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（触覚）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、及び／またはＮＫＧ２Ｃから選択される膜貫通ドメインを含む。

本明細書で使用される「共刺激ドメイン」（ＣＳＤ）は、メモリー細胞の増殖、生存及び／または発生を増強するＣＡＲの部分のことをいう。本発明のＣＡＲは、１つ以上の共刺激ドメインを含み得る。各共刺激ドメインは、例えば、ＴＮＦＲスーパーファミリー、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、Ｄａｐ１０、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ５、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ−Ｉ、ＴＮＦＲ−ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、またはそれらの組み合わせのいずれか１つ以上の共刺激ドメインを含む。他の共刺激ドメイン（例えば、他のタンパク質由来）は、当業者には明らかであり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。

本明細書で使用する「細胞内シグナル伝達ドメイン」（ＩＳＤ）または「細胞質ドメイン」は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞にその特殊な機能を実行するよう指示するＣＡＲの部分のことをいう。エフェクター機能シグナルを伝達するドメインの例には、Ｔ細胞受容体複合体のｚ鎖またはそのホモログ、（例えば、ｈ鎖、ＦｃｅＲ１ｇ及びｂ鎖、ＭＢ１（Ｉｇａ）鎖、Ｂ２９（Ｉｇｂ）鎖など）、ヒトＣＤ３ゼータ鎖、ＣＤ３ポリペプチド（Ｄ、ｄ及びｅ）、ｓｙｋファミリーチロシンキナーゼ（Ｓｙｋ、ＺＡＰ ７０など）、ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ（Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、Ｌｙｎなど）、及びＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ２８などのＴ細胞形質導入に関与する他の分子のいずれかが含まれるが、これらに限定されない。他の細胞内シグナル伝達ドメインは、当業者には明らかであり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。

本明細書で使用される「リンカー」（Ｌ）または「リンカードメイン」または「リンカー領域」は、長さ約１〜１００アミノ酸のオリゴまたはポリペプチド領域のことをいい、これは、本発明のＣＡＲのドメイン／領域のいずれかをリンクする。リンカーは、グリシンやセリンなどの柔軟な残基で構成されているため、隣接するタンパク質ドメインは互いに自由に移動できる。２つの隣接するドメインが互いに立体的に干渉しないようにすることが望ましい場合は、より長いリンカーが使用され得る。リンカーは、切断可能または切断不能であり得る。切断可能なリンカーの例には、２Ａリンカー（例えばＴ２Ａ）、２Ａ様リンカーまたはその機能的同等物、及びその組み合わせが含まれる。いくつかの実施形態において、リンカーは、ピコルナウイルス２Ａ様リンカー、ブタテスコウイルスのＣＨＹＳＥＬ配列（Ｐ２Ａ）、テセアアシグナウイルス（Ｔ２Ａ）、またはそれらの組み合わせ、バリアント及び機能的等価物を含む。他の実施形態において、リンカー配列は、Ａｓｐ−Ｖａｌ／Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ^（２Ａ）−Ｐｒｏ^（２Ｂ）（配列番号１）モチーフを含み、これにより、２Ａグリシンと２Ｂプロリンとの間で切断される。他のリンカーは、当業者には明らかであり、本発明の代替実施形態に関連して使用され得る。

本明細書で使用される「自己」細胞は、細胞が後に再投与されるのと同じ個体に由来する細胞のことをいう。

本明細書で使用される「遺伝子改変細胞（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｅｌｌｓ）」、「リダイレクト細胞」、「遺伝子操作細胞（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｃｅｌｌｓ）」または「改変細胞」は、ＣＡＲ及びチェックポイント阻害剤を発現する細胞のことをいう。いくつかの実施形態において、遺伝子改変細胞は、ＣＡＲをコードするベクター及び１つ以上のチェックポイント阻害剤をコードするベクターを含み、２つのベクターは異なる。いくつかの実施形態において、遺伝子改変細胞は、ＣＡＲ及び１つ以上のチェックポイント阻害剤をコードするベクターを含む。いくつかの実施形態において、遺伝子改変細胞は、ＣＡＲをコードする第１のベクター及びチェックポイント阻害剤をコードする第２のベクターを含む。一実施形態において、遺伝子改変細胞は、Ｔリンパ球細胞（Ｔ細胞）である。一実施形態において、遺伝子改変細胞はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。

本明細書で使用される「免疫細胞」は、抗原提示細胞、Ｂ細胞、好塩基球、細胞傷害性Ｔ細胞、樹状細胞、好酸球、顆粒球、ヘルパーＴ細胞、白血球、リンパ球、マクロファージ、マスト細胞、メモリー細胞、単球、ナチュラルキラー細胞、好中球、食細胞、形質細胞、及びＴ細胞を含むがこれらに限定されない哺乳動物免疫系の細胞のことをいう。

本明細書で使用される「免疫エフェクター細胞」は、Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のことをいう。

本明細書で使用される「免疫応答」は、自然免疫、体液性免疫、細胞性免疫、免疫、炎症反応、後天性（適応）免疫、自己免疫、及び／または過活動免疫を含むがこれらに限定されない免疫のことをいう。

本明細書で使用される「ＣＤ４リンパ球」は、ＣＤ４を発現するリンパ球、すなわちＣＤ４^＋であるリンパ球のことをいう。ＣＤ４リンパ球は、ＣＤ４を発現するＴ細胞であり得る。

本明細書で使用される「抗体」という用語は、インタクトな免疫グロブリン、または本明細書で「ＦＣフラグメント」または「ＦＣドメイン」というＦｃ（結晶化可能断片）領域またはＦｃ領域のＦｃＲｎ結合断片を有するモノクローナルまたはポリクローナル抗原結合断片のことをいう。抗原結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術によって、またはインタクトな抗体の酵素的または化学的切断によって生成され得る。抗原結合フラグメントには、とりわけ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、及び相補性決定領域（ＣＤＲ）フラグメント、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、キメラ抗体、ダイアボディ、及びポリペプチドに特異的な抗原結合を付与するのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部を含むポリペプチドが含まれる。Ｆｃドメインは、抗体の２つまたは３つのクラスに寄与する２つの重鎖の部分を含む。Ｆｃドメインは、組換えＤＮＡ技術により、または酵素（例えばパパイン切断）により、またはインタクトな抗体の化学的切断により生成され得る。

本明細書で使用される「抗体断片」という用語は、インタクトな抗体の一部のみを含むタンパク質断片のことをいい、一般にインタクトな抗体の抗原結合部位を含み、従って抗原に結合する能力を保持する。本定義に含まれる抗体フラグメントの例には、以下が含まれる：（ｉ）ＶＬ、ＣＬ、ＶＨ及びＣＨ１ドメインを有するＦａｂフラグメント、（ｉｉ）Ｆａｂ’断片、ＣＨ１ドメインのＣ末端に１つ以上のシステイン残基を有するＦａｂ断片、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインを有するＦｄフラグメント、（ｉｖ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインと、ＣＨ１ドメインのＣ末端に１つ以上のシステイン残基を有するＦｄ’フラグメント、（ｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインを有するＦｖフラグメント、（ｖｉ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３４１， ５４４−５４６ （１９８９））、（ｖｉｉ）分離されたＣＤＲ領域、（ｖｉｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ’フラグメントを含む二価フラグメント、（ｉｘ）単鎖抗体分子（例えば、単鎖Ｆｖ；ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６ （１９８８）； ａｎｄ Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ （ＵＳＡ） ８５：５８７９−５８８３ （１９８８））、（ｘ）同じポリペプチド鎖の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む２つの抗原結合部位を有する「ダイアボディ」（例えば、ＥＰ ４０４，０９７； ＷＯ ９３／１１１６１； ａｎｄ Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０：６４４４−６４４８ （１９９３））、（ｘｉ）一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含み、相補的な軽鎖ポリペプチドとともに、一対の抗原結合領域を形成する「直線状抗体」（Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ８（１０）：１０５７−１０６２ （１９９５）；及びＵ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ５，６４１，８７０）。

本明細書で使用される「単鎖可変断片」、「単鎖抗体可変断片」または「ｓｃＦｖ」抗体は、リンカーペプチドによって接続された重（Ｖ_Ｈ）鎖及び軽（Ｖ_Ｌ）鎖のみの可変領域を含む抗体の形態のことをいう。ｓｃＦｖは、単鎖ポリペプチドとして発現されることが可能である。ｓｃＦｖは、それが由来するインタクトな抗体の特異性を保持する。軽鎖及び重鎖は、標的抗原に対するｓｃＦｖの特異性が保持される限り、例えばＶ_Ｈ−リンカー−Ｖ_ＬまたはＶ_Ｌ−リンカー−Ｖ_Ｈなどの任意の順序であってよい。

本明細書で使用される「治療薬」とは、例えば、治療、阻害、予防、効果の緩和、重症度の低減、発症の可能性の低減、進行の遅延、及び／または治療法、病気に使用される薬剤のことをいう。治療薬が対象とする疾患には、感染症、がん腫、肉腫、リンパ腫、白血病、胚細胞腫瘍、芽細胞腫、様々な免疫細胞に発現する抗原、及び様々な血液疾患に関連する細胞に発現する抗原、及び／または炎症性疾患が含まれるが、これらに限定されない。

「がん」及び「がん性」とは、典型的には無秩序な細胞増殖を特徴とする哺乳動物の生理学的状態のことをいうかまたは説明する。「がん」という用語は、組織病理学的タイプまたは侵襲性の段階に関係なく、すべてのタイプのがん性増殖または発がんプロセス、転移組織または悪性に形質転換された細胞、組織、または臓器を含むことを意味する。固形腫瘍の例には、肝臓、肺、乳房、リンパ系、胃腸（例えば、結腸）、泌尿生殖路（例えば、腎、尿路上皮細胞）、前立腺及び咽頭に影響を及ぼすものなど、様々な臓器系の悪性腫瘍、例えば、肉腫、腺がん、及びがん腫が含まれる。腺がんには、ほとんどの結腸がん、直腸がん、腎細胞がん、肝臓がん、肺の非小細胞がん、小腸がん、及び食道がんなどの悪性腫瘍が含まれる。一実施形態において、がんは黒色腫、例えば、進行期黒色腫である。前述のがんの転移性病変も、本発明の方法及び組成物を用いて治療または予防され得る。治療可能な他のがんの例には、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部がん、胃がん、精巣がん、子宮がん、卵管がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膣がん、外陰がん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織の肉腫、尿道がん、陰茎がん、急性骨髄性白血病を含む慢性または急性白血病、慢性骨髄白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、小児固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱がん、腎臓または尿管のがん、腎がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮がん、扁平上皮がん、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストによって誘発されるものを含む環境的に誘発されるがん、及びこれらのがんの組み合わせが含まれる。転移性がん、例えば、ＰＤ−Ｌ１を発現する転移性がん（Ｉｗａｉ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７：１３３−１４４）の治療は、本明細書に記載の抗体分子を用いて行われ得る。

本明細書で使用される「単離された」という用語は、他の材料を実質的に含まない分子または生物学的材料または細胞材料のことをいう。一態様において、「単離された」という用語は、自然源に存在する、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸、またはタンパク質またはポリペプチド（例えば、抗体またはその誘導体）、または他のＤＮＡまたはＲＮＡから分離された細胞または細胞小器官、または組織または臓器、またはタンパク質またはポリペプチド、または細胞または細胞小器官、または組織または臓器それぞれのことをいう。「単離された」という用語は、組換えＤＮＡ技術によって産生される場合、細胞材料、ウイルス材料、または培地を実質的に含まない核酸またはペプチド、または化学合成される場合、化学前駆体または他の化学物質のことをいう。さらに、「単離された核酸」は、断片として天然に存在せず、自然状態では見られない核酸断片を含むことを意味する。本明細書で使用される「単離された」という用語も、他の細胞タンパク質から単離されたポリペプチドのことをいい、精製及び組換えポリペプチドの両方を包含することを意味する。本明細書で使用される「単離された」という用語も、他の細胞または組織から単離された細胞または組織のことをいい、培養及び操作された細胞または組織の両方を包含することを意味する。

本明細書で使用される「裸のＤＮＡ」は、発現のための適切な方向で適切な発現ベクターにクローン化されたＣＡＲをコードするＤＮＡのことをいう。使用され得るウイルスベクターには、ＳＩＮレンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、フォーミーウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ハイブリッドベクター及び／またはプラスミドトランスポゾン（例えば、スリーピングビューティートランスポゾンシステム）またはインテグラーゼベースのベクターシステムが含まれるが、これらに限定されない。本発明の代替実施形態に関連して使用され得る他のベクターは、当業者には明らかであろう。

本明細書で使用される「標的細胞」は、疾患に関与し、本発明の遺伝子改変細胞の標的となり得る細胞（遺伝子改変Ｔ細胞、ＮＫ細胞、造血幹細胞、多能性幹細胞、及び胚性幹細胞）のことをいう。他の標的細胞は、当業者には明らかであり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。

用語「Ｔ細胞」及び「Ｔリンパ球」は交換可能であり、本明細書で同義的に使用される。例には、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される「ベクター」、「クローニングベクター」及び「発現ベクター」は、ポリヌクレオチド配列（例えば、外来遺伝子）を宿主細胞に導入して宿主を形質転換し、導入された配列の発現（例えば、転写及び翻訳）を促進することができる媒体のことをいう。ベクターには、プラスミド、ファージ、ウイルスなどが含まれる。

本明細書で使用される「投与する」という用語は、所望の部位での薬剤の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路による、本明細書で開示される薬剤の対象への配置のことをいう。

「有益な結果」には、病状の重症度の軽減または緩和、病状の悪化の防止、病状の治癒、病状の発症の防止、患者が病状を発症する可能性の低下、及び患者の寿命または平均余命の延長が含まれるが、これらに限定されない。非限定的な例として、「有益な結果」または「望ましい結果」は、１つ以上の症状（複数可）の緩和、欠損の程度の減少、安定した（すなわち、悪化していない）がんの進行状態、転移または浸潤の遅延または減速、及びがんに関連する症状の改善または緩和であり得る。

本明細書で使用される「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、または「改善」という用語は、目的が、疾患または障害に関連する状態の進行または重症度を逆転、緩和、改善、阻害、減速または停止することである治療的治療のことをいう。「治療する」という用語は、がんなどの状態、疾患または障害の少なくとも１つの有害作用または症状を軽減または緩和することを含む。１つ以上の症状または臨床マーカーが減少した場合、治療は一般に「効果的」である。あるいは、疾患の進行が減少または停止した場合、治療は「有効」である。すなわち、「治療」には、症状またはマーカーの改善だけでなく、治療の非存在下で予想される症状の少なくとも進行の減速または悪化の停止も含まれる。有益なまたは望ましい臨床結果には、１つ以上の症状（複数可）の緩和、疾患の程度の減少、疾患の状態の安定化（すなわち、悪化しない）、疾患の進行の遅延または減速、疾患状態の改善または緩和、及び寛解（部分的または全体的）、検出可能または検出不能が含まれるが、これらに限定されない。疾患の「治療」という用語には、疾患の症状または副作用の緩和（緩和治療を含む）も含まれる。いくつかの実施形態において、がんの治療には、腫瘍体積の減少、がん細胞数の減少、がん転移の阻害、平均余命の増加、がん細胞増殖の減少、がん細胞の生存の減少、またはがん状態に関連する様々な生理学的症状の改善が含まれる。

本明細書で使用される「条件」及び「疾患状態」には、がん、腫瘍または感染症が含まれ得る。例示的な実施形態において、状態には、悪性新生物細胞増殖性障害または疾患の任意の形態が含まれるが、決してこれらに限定されない。例示的な実施形態において、状態には、腎がん、黒色腫、前立腺がん、乳がん、膠芽腫、肺がん、結腸がん、または膀胱がんのいずれか１つ以上が含まれる。

本明細書で使用される「有効量」または「治療有効量」という用語は、疾患または障害の少なくとも１つ以上の症状を軽減するため、本明細書で開示される１つ以上のペプチドまたはその変異体（ｍｕｔａｎｔ）、バリアント（ｖａｒｉａｎｔ）、類似体または誘導体を含む医薬組成物の量のことをいい、望ましい効果を提供するのに十分な量の薬理学的組成物に関する。本明細書で使用される語句「治療有効量」は、任意の医学的治療に適用可能な合理的な利益／リスク比で障害を治療するのに十分な組成物の量を意味する。

症状の治療的または予防的に有意な減少は、対照または治療していない対象、または本明細書に記載のオリゴペプチドを投与する前の対象の状態と比較した測定パラメーターにおいて、例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１２５％、少なくとも約１５０％以上である。測定または測定可能なパラメーターには、臨床的に検出可能な疾患マーカー、例えば、生物学的マーカーのレベルの上昇または低下、ならびに臨床的に認められた症状のスケールまたは糖尿病のマーカーに関連するパラメーターが含まれる。しかしながら、本明細書に開示されている組成物及び製剤の総１日使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されることが理解されよう。必要な正確な量は、治療する疾患の種類、性別、年齢、対象の体重などの要因によって異なる。

本明細書で使用される「哺乳動物」は、ヒト、及びチンパンジー及び他の類人猿及びサル種などの非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマなどの家畜、イヌやネコなどの家畜、マウス、ラット、モルモットなどのげっ歯類を含む実験動物を含むがこれらに限定されない哺乳類のクラスの任意のメンバーのことをいう。前記用語は、特定の年齢や性別を示すものではない。従って、成人（成体）または新生児（新生仔）の対象、及び胎児（胎仔）は、雄性であろうと雌性であろうと、この用語の範囲内に含まれることが意図される。

抗腫瘍活性を有するＣＡＲ−Ｔ細胞は、免疫抑制性腫瘍微小環境で頻繁に使い果たされる。ＰＤ−１受容体は、Ｔ細胞の消耗を媒介する主要なエフェクターである。以前の研究では、同系乳がんマウスモデルで抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ−Ｔ細胞と組み合わせた場合、抗ＰＤ−１抗体治療により抗腫瘍活性が増強されることが示された。しかしながら、実質的かつ持続的な有効性を達成するには、継続的な投与と大量の抗体が必要であり、しばしば重度の全身毒性を引き起こす。そのため、抗ＰＤ−１抗体を全身投与する代わりに、抗ＰＤ−１自己分泌型ＣＡＲ．αＰＤ１−Ｔ細胞を作製した。これはＣＡＲ−Ｔ細胞のみの注射、またはＣＡＲ−Ｔ細胞と抗ＰＤ−１抗体の併用注射と比較して、消耗が少なく、より機能的で拡張性があり、腫瘍根絶の媒介においてより効率的である。本発明者らの研究は、固形腫瘍の免疫療法のためのＣＰＩ治療とＣＡＲ−Ｔ細胞療法を組み合わせるための効率的で安全な戦略を提供する。

従って、本明細書で提供されるのは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びチェックポイント阻害剤の両方をコードする核酸、またはそれぞれＣＡＲ及びＣＰＩをコードする核酸を含む細胞（例えば、遺伝子改変細胞）である。様々な実施形態において、細胞はＣＡＲ及びチェックポイント阻害剤を発現する。一実施形態において、細胞はＴリンパ球細胞（Ｔ細胞）である。一実施形態において、細胞はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。様々な実施形態において、チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＰＤ−１ ｓｃＦｖ）は構成的に発現される。

いくつかの実施形態において、細胞（例えば、遺伝子改変細胞）は、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＭＰＬ、ＣＤ３０、ＣＤ３２、ＣＤ２０、ＣＤ７０、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７９ｂ、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７６、ＣＤ３２４、ＦｃＲＨ５、ＣＤ１７１、ＣＳ−１、ＣＬＬ−１（ＣＬＥＣＬ１）、ＣＤ３３、ＣＤＨ１、ＣＤＨ６、ＣＤＨ１６、ＣＤＨ１７、ＣＤＨ１９、ＥＧＦＲｖｉｉｉ、ＦｃＲＨ５、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＬＡ−Ａ２、ＢＣＭＡ、Ｔｎ Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ−１３Ｒａ２、ＩＬ１１Ｒａ、メソセリン、ＰＳＣＡ、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ−ベータ、ＰＲＳＳ２１、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ２０、免疫グロブリンのＦｃ領域、組織因子、葉酸受容体アルファ、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１ ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、Ｐｒｏｓｔａｓｅ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅａ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ−アセチル−ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＴＣＲ−ｂｅｔａ１定常鎖、ＴＣＲベータ２定常鎖、ＴＣＲガンマ−デルタ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−ｌａ、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、ＨＴＬＶ１−Ｔａｘ、ＫＳＨＶ Ｋ８．１タンパク質、ＥＢＢ ｇｐ３５０、ＨＩＶ１−エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０、ＭＡＧＥ−Ａｌ、ＭＡＧＥ Ａｌ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロスタイン、サバイビンテロメラーゼ、ＰＣＴＡ−１／ガレクチン８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、ＤＬＬ３、ＴＲＯＰ２、ＰＴＫ７、ＧＣＣ、ＡＦＰ、肉腫転位置ブレークポイント、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、Ｃｙｃｌｉｎ Ｂｌ、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ−１、ＲＵ１、ＲＵ２、腸内カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０−２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、ＩＧＬＬ１、ＦＩＴＣ、黄体形成ホルモン受容体（ＬＨＲ）、卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）、絨毛性ゴナドトロピンホルモン受容体（ＣＧＨＲ）、ＣＣＲ４、ＧＤ３、ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＡＭＦ４、ＦＩＴＣ、黄体形成ホルモン受容体（ＬＨＲ）、卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）、絨毛性ゴナドトロピンホルモン受容体（ＣＧＨＲ）、ＣＣＲ４、ＧＤ３、ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＡＭＦ４、またはそれらの組み合わせを含むがこれに限定されない疾患原因細胞または疾患関連細胞で発現される１つ以上の標的を標的とするＣＡＲを発現する。

一実施形態において、細胞（例えば、遺伝子改変細胞）は、ＣＤ１９を標的とするＣＡＲを発現する。

いくつかの実施形態において、細胞（例えば、遺伝子改変細胞）は、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ３、Ｂ７−Ｈ１、ＣＤ１６０、Ｐ１Ｈ、２Ｂ４、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、及び／またはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、及びＬＡＩＲ１のいずれか１つ以上を標的とするチェックポイント阻害剤を発現する。いくつかの実施形態において、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ３、Ｂ７−Ｈ１、ＣＤ１６０、Ｐ１Ｈ、２Ｂ４、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、及び／またはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、及びＬＡＩＲ１のいずれか１つ以上を標的とする抗体またはその断片である。

一実施形態において、細胞（例えば、遺伝子改変細胞）は、ＰＤ−１を標的とするチェックポイント阻害剤を発現する。一実施形態において、チェックポイント阻害剤は抗ＰＤ−１ ｓｃＦｖである。

一実施形態において、細胞（例えば、遺伝子改変細胞）は、ＣＤ１９を標的とするＣＡＲ、及びＰＤ−１を標的とするチェックポイント阻害剤を発現し、ＰＤ−１を標的とするチェックポイント阻害剤は抗ＰＤ−１−ｓｃＦｖである。

本明細書に記載のＣＡＲをコードする第１のポリヌクレオチド及び本明細書に記載のチェックポイント阻害剤をコードする第２のポリヌクレオチドを含む核酸も本明細書に提供される。本明細書に記載される１つ以上の核酸によってコードされるポリペプチドも本明細書に提供される。本明細書にさらに提供されるのは、本明細書に記載の１つ以上の核酸を含むベクターである。

本明細書ではさらに、がんの治療、阻害、転移の予防、及び／またはがんの重症度の軽減を必要とする対象のがんの治療、阻害、転移の予防、及び／またはがんの重症度の軽減のための方法が提供される。該方法は、該対象のがんの治療、阻害、転移の予防、及び／またはがんの重症度を軽減するために、処置を必要とする対象に、キメラ抗原受容体及びチェックポイント阻害剤をコードする核酸（つまりそれぞれＣＡＲ及びＣＰＩをコードする核酸）を含む治療有効量の細胞を投与することを含む。例示的な実施形態において、がんは肺がんである。

本明細書でさらに提供されるのは、がんの治療、阻害、転移の予防、及び／またはがんの重症度の軽減を必要とする対象におけるがんの治療、阻害、転移の予防、及び／またはがんの重症度の軽減のための方法である。該方法は、該対象のがんの治療、阻害、転移の予防、及び／またはがんの重症度を軽減するために、該対象に、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びチェックポイント阻害剤の両方をコードする核酸を含む細胞、またはそれぞれＣＡＲ及びチェックポイント阻害剤をコードする核酸を含む細胞を含む組成物の治療的有効量を投与することを含む。例示的な実施形態において、がんは肺がんである。

本明細書では、肺がんの治療、阻害、転移の予防、及び／または肺がんの重症度の軽減を必要とする対象の肺がんの治療、阻害、転移の予防、及び／または肺がんの重症度の軽減のための方法がさらに提供される。該方法は、該対象のがんの治療、阻害、転移の予防、及び／または肺がんの重症度を軽減するために、該対象に、ＣＤ１９特異的キメラ抗原受容体及びＰＤ−１特異的チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＰＤ−１−ｓｃＦｖ）の両方をコードする核酸、または、それぞれＣＤ１９特異的ＣＡＲ及びＰＤ−１特異的チェックポイント阻害剤をコードする核酸を含む細胞を含む組成物の治療的有効量を投与することを含む。

様々な実施形態において、前記方法は、治療有効量の既存の療法（既存の治療薬）を対象に施すことをさらに含み、前記既存の療法は、本明細書に記載の組成物と連続してまたは同時に施される。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細胞（遺伝子改変細胞）は、手術、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸、及びＦＫ５０６などの免疫抑制剤、ＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体または他の抗体療法などの抗体または他の免疫除去剤、サイトキシン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、及びＩｚｕｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ． ２００８ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ １０８：９６３−９７１に記載されているような照射、ペプチドワクチンを含むがこれらに限定されない既存の治療法と組み合わせて治療計画で使用されてもよい。一実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞は、化学療法剤と組み合わせて使用され得る。例示的な化学療法薬には、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン（例えば、リポソームドキソルビシン））、ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン）、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、デカルバジン、メルファラン、イフォスファミド、テモゾミド）、免疫細胞抗体（例えば、アレムツザマブ、ゲムツズマブ、リツキシマブ、オファツムマブ、トシツモマブ、ブレンツキシマブ）、代謝拮抗剤（例えば、葉酸拮抗薬、ピリミジン類似体、プリン類似体、及びアデノシンデアミナーゼ阻害剤（例えば、フルダラビン）を含む）、ｍＴＯＲ阻害剤、ＴＮＦＲ糖質コルチコイド誘発ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）アゴニスト、プロテアソーム阻害剤（例えば、アクラシノマイシンＡ、グリオトキシン、またはボルテゾミブ）、サリドマイドまたはサリドマイド誘導体（例えば、レナリドミド）などの免疫調節剤を含む。

「治療的有効量」が示される場合、投与される本発明の組成物の正確な量は、年齢、体重、腫瘍の大きさ、感染または転移の程度、及び患者（対象）の状態の個人差を考慮して医師によって決定され得る。いくつかの実施形態において、治療的に有効な量の遺伝子改変細胞は、１０^４〜１０^９細胞／ｋｇ体重、場合によっては１０^５〜１０^６細胞／ｋｇ体重の用量で投与され、これらの範囲内のすべての整数値を含む。Ｔ細胞組成物はまた、これらの投与量で複数回投与され得る。細胞は、免疫療法で一般的に知られている注入技術を用いて投与され得る（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｗ Ｅｎｇ． Ｊ． ｏｆ Ｍｅｄ． ３１９：１６７６， １９８８を参照）。細胞は、病変部位への注射（例えば、腫瘍内注射）により投与され得る。

一実施形態において、ＣＡＲ及びＣＰＩは、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を用いて免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）に導入され、対象（例えば、ヒト）は、本発明のＣＡＲ及びＣＰＩを含む免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の初期投与、及び本発明のＣＡＲ及びＣＰＩを含む免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の１回以上のその後の投与を受け、ここで、１回以上のその後の投与は、１５日未満、例えば、前の投与の１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２日後に投与される。一実施形態において、週に本発明のＣＡＲ及びＣＰＩを含む免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の１回以上の投与が、例えば、週に投与される本発明のＣＡＲ及びＣＰＩを含む免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）が２、３または４回である投与で、対象（例えば、ヒト）に投与される。一実施形態において、対象（例えば、ヒト対象）は、週に本発明のＣＡＲ及びＣＰＩを含む免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の１回以上の投与（例えば、週に２、３または４回の投与）（ここではサイクルともいう）を受け、その後、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を１週間投与し、次いで、本発明のＣＡＲ及びＣＰＩを含む免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）が１回以上追加投与される（例えば、週に１回以上の免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の投与が対象に投与される）。別の実施形態において、対象（例えば、ヒト対象）は、ＣＡＲ及びＣＰＩを含む免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の１回より多いサイクルを受け、各サイクル間の時間は１０、９、８、７、６、５、４、または３日未満である。一実施形態において、ＣＡＲ及びＣＰＩを含む免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）は、週に３回投与するために一日おきに投与される。一実施形態において、本発明のＣＡＲ及びＣＰＩを含む免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８またはそれ以上の週の間投与される。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の治療方法は、対象に、既存の療法を順次または同時に投与することをさらに含む。既存のがん治療の例には、積極的監視、観察、外科的介入、化学療法、免疫療法、放射線療法（外部ビーム放射線、定位放射線手術（ガンマナイフ）、及び分割定位放射線療法（ＦＳＲ）など）、局所療法、全身療法、ワクチン療法、ウイルス療法、分子標的療法、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、遺伝子改変細胞（本明細書に記載の１つ以上のＣＡＲ及び１つ以上のＣＰＩをコードする１つ以上の核酸を含む）を調製する方法は、細胞集団を得て、任意の１つ以上のＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、及び／またはＣＤ４５ＲＯを発現する細胞を選択することを含む。特定の実施形態において、提供される免疫エフェクター細胞の集団はＣＤ３＋及び／またはＣＤ２８＋である。

一実施形態において、遺伝子改変細胞（本明細書に記載の１つ以上のＣＡＲ及び１つ以上のＣＰＩをコードする１つ以上の核酸を含む）を調製する方法は、例えば、ＣＤ２５に特異的な抗体を用いて、細胞集団を得て、ＣＤ２５＋Ｔ調節細胞を濃縮することを含む。細胞集団からＣＤ２５＋Ｔ調節細胞を濃縮する方法は、当業者には明らかであろう。いくつかの実施形態において、Ｔｒｅｇ濃縮細胞は、３０％未満、２０％、１０％、５％以下の非Ｔｒｅｇ細胞を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲ及びＣＰＩをコードするベクターは、Ｔｒｅｇ濃縮細胞にトランスフェクトされる。ＣＡＲ及びＣＰＩを発現するＴｒｅｇ濃縮細胞を用いて、ＣＡＲが標的とする抗原に対する寛容性を誘導してもよい。

いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載のＣＡＲ及びＣＰＩをコードする核酸を含むベクターが細胞にトランスフェクトされた後、細胞集団を拡大することをさらに含む。実施形態において、細胞の集団は、８日以下の期間にわたって拡大される。特定の実施形態において、細胞の集団は、５日間の培養で拡大され、得られた細胞は、同じ培養条件下で９日間の培養で拡大された同じ細胞よりも強力である。他の実施形態において、細胞の集団は、５日間の培養で拡大され、同じ培養条件下で９日間の培養で拡大された同じ細胞と比較して、抗原刺激時に細胞の倍加が少なくとも１、２、３または４倍増加することを示す。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、フローサイトメトリーによる測定通り、１４日間の拡大期間にわたって、細胞の少なくとも２００倍、２５０倍、３００倍、または３５０倍の増加をもたらす１つ以上のインターロイキンを含む適切な培地で拡大される。

様々な実施形態において、拡大された細胞は、本明細書に記載の１つ以上のＣＡＲ及び１つ以上のＣＰＩを含む。

医薬組成物
様々な実施形態において、本発明は医薬組成物を提供する。医薬組成物は、本明細書に記載されるように、ＣＡＲ及びチェックポイント阻害剤をコードする核酸を含む細胞を含む。本発明の医薬組成物は、任意の薬学的に許容される賦形剤を含み得る。「薬学的に許容される賦形剤」とは、一般に安全、非毒性、及び望ましい医薬組成物の調製に有用な賦形剤を意味し、獣医学的使用及びヒトの薬学的使用に許容される賦形剤を含む。そのような賦形剤は、固体、液体、半固体、またはエアロゾル組成物の場合は気体であってもよい。賦形剤の例には、デンプン、糖、微結晶セルロース、希釈剤、造粒剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤、湿潤剤、乳化剤、着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味料、香料（ｆｌａｖｏｒｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）、香料（ｐｅｒｆｕｍｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）、防腐剤、酸化防止剤、可塑剤、ゲル化剤、増粘剤、硬化剤、硬化剤、懸濁剤、界面活性剤、保湿剤、担体、安定剤、及びそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。

様々な実施形態において、本発明による医薬組成物は、任意の投与経路を介した送達用に製剤化され得る。「投与経路」は、エアロゾル、鼻腔、経口、経粘膜、経皮、非経口または経腸を含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の任意の投与経路のことをいい得る。「非経口」とは、眼窩内、注入、動脈内、嚢内、心臓内、皮内、筋肉内、腹腔内、肺内、脊髄内、胸骨内、くも膜下腔内、子宮内、静脈内、くも膜下、嚢下、皮下、経粘膜、または経気管を含む、一般的に注射に関連する投与経路のことをいう。非経口経路を介して、組成物は、注入または注射用の溶液または懸濁液の形態、または凍結乾燥粉末の形態であり得る。非経口経路を介して、組成物は、注入または注射用の溶液または懸濁液の形態であり得る。経腸経路を介して、医薬組成物は、錠剤、ゲルカプセル、糖衣錠、シロップ、懸濁液、溶液、粉末、顆粒、エマルジョン、ミクロスフェアまたはナノスフェア、制御放出を可能にするまたは脂質小胞またはポリマー小胞の形態であり得る。典型的には、組成物は注射により投与される。これらの投与の方法は、当業者に知られている。

本発明による医薬組成物は、任意の薬学的に許容される担体を含むことができる。本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」は、ある組織、器官、または身体の一部から別の組織、器官、または身体の一部へ目的の化合物の運搬または輸送に関与する薬学的に許容される材料、組成物、または媒体のことをいう。例えば、担体は、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、またはカプセル化材料、またはそれらの組み合わせであり得る。担体の各成分は、製剤の他の成分と適合しなければならないという点で「薬学的に許容される」ものでなければならない。また、接触する可能性のある組織または臓器との接触での使用に適している必要があり、毒性、刺激、アレルギー反応、免疫原性、または治療上の利点を過度に上回るその他の合併症のリスクを負わないことを意味する。

本発明の医薬組成物は、経口投与のために、カプセル化、錠剤化、またはエマルジョンまたはシロップに調製され得る。薬学的に許容される固体または液体の担体は、組成物を強化または安定化するため、または組成物の調製を容易にするために、添加され得る。液体担体には、シロップ、落花生油、オリーブ油、グリセリン、生理食塩水、アルコール、水が含まれる。固体担体には、デンプン、乳糖、硫酸カルシウム、二水和物、白土、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸、タルク、ペクチン、アカシア、寒天またはゼラチンが含まれる。担体はまた、グリセリルモノステアレートまたはグリセリルジステアレートなどの徐放性物質を単独でまたはワックスとともに含み得る。

医薬製剤は、必要に応じて、錠剤形態については、製粉、混合、造粒、及び圧縮、または硬ゼラチンカプセル形態については、製粉、混合、及び充填を含む薬学の従来の技術に従って作製される。液体担体が使用される場合、製剤は、シロップ、エリキシル、エマルジョン、または水性または非水性懸濁液の形態である。そのような液体製剤は、経口で直接投与されるか、またはソフトゼラチンカプセルに充填され得る。

本発明による医薬組成物は、治療有効量で送達され得る。正確な治療有効量とは、所定の対象における治療の有効性に関して、最も効果的な結果をもたらす組成物の量である。この量は、治療化合物の特性（活性、薬物動態、薬力学、及び生物学的利用能を含む）、対象の生理学的状態（年齢、性別、病気の種類と病期、一般的な健康状態、所定の投与量に対する反応性、及び薬物の種類を含む）、薬学的に許容される担体または製剤中の担体の性質、及び投与経路を含むがこれらに限定されない、様々な要因によって異なる。臨床及び薬理学の分野の当業者は、例えば化合物の投与に対する対象の反応をモニターし、それに応じて投与量を調整するなど、日常的な実験を通じて治療有効量を決定することができる。追加のガイダンスについては、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ （Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄ． ２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ ＰＡ， ＵＳＡ） （２０００）を参照されたい。

患者への投与の前に、製剤は、ｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶベクターをトランスフェクトされた細胞、またはトランスフェクトされた細胞で調整された上清に添加され得る。液体製剤が好ましい場合がある。例えば、これらの製剤には、油、ポリマー、ビタミン、炭水化物、アミノ酸、塩、緩衝液、アルブミン、界面活性剤、増量剤またはそれらの組み合わせが含まれ得る。

炭水化物製剤には、単糖類、二糖類、または多糖類などの糖または糖アルコール、または水溶性グルカンが含まれる。糖類またはグルカンには、フルクトース、デキストロース、ラクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、スクロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、アルファ及びベータシクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、及びカルボキシメチルセルロース、またはそれらの混合物を含み得る。「糖アルコール」は、−ＯＨ基を有するＣ４〜Ｃ８炭化水素として定義され、ガラクチトール、イノシトール、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、グリセロール、及びアラビトールを含む。上記のこれらの糖または糖アルコールは、個々にまたは組み合わせて使用されてもよい。糖または糖アルコールが水性製剤に可溶である限り、使用量に一定の制限はない。一実施形態において、糖または糖アルコール濃度は、１．０ｗ／ｖ％〜７．０ｗ／ｖ％の間、より好ましくは２．０〜６．０ｗ／ｖ％の間である。

アミノ酸製剤は、カルニチン、アルギニン、及びベタインの左旋性（Ｌ）型を含むが、他のアミノ酸が追加されてもよい。

いくつかの実施形態において、処方剤としてのポリマーは、平均分子量が２，０００〜３，０００のポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、または平均分子量が３，０００〜５，０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。

組成物中に緩衝液を用いて、凍結乾燥前または再構成後の溶液のｐＨ変化を最小限にすることも好ましい。クエン酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、及びグルタミン酸塩緩衝液またはそれらの混合物を含むがこれらに限定されない、ほとんどの生理学的緩衝液が使用され得る。いくつかの実施形態において、濃度は、０．０１〜０．３モルである。製剤に添加され得る界面活性剤は、欧州特許第２７０，７９９号及び第２６８，１１０号に示される。

循環半減期を延長するための別の薬物送達システムはリポソームである。リポソーム送達システムの調製方法は、Ｇａｂｉｚｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （１９８２） ４２：４７３４； Ｃａｆｉｓｏ， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ （１９８１） ６４９：１２９；及びＳｚｏｋａ， Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｅｎｇ （１９８０） ９：４６７で議論されている。他の薬物送達システムは当技術分野で知られており、例えば、Ｐｏｚｎａｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ （Ｒ． Ｌ． Ｊｕｌｉａｎｏ， ｅｄ．， Ｏｘｆｏｒｄ， Ｎ．Ｙ． １９８０）， ｐｐ． ２５３−３１５； Ｍ． Ｌ． Ｐｏｚｎａｎｓｋｙ， Ｐｈａｒｍ Ｒｅｖｓ （１９８４） ３６：２７７に記載されている。

液体医薬組成物が調製された後、分解を防止し、無菌性を維持するために凍結乾燥され得る。液体組成物を凍結乾燥する方法は、当業者に知られている。使用の直前に、組成物は、追加の成分を含み得る滅菌希釈剤（例えば、リンゲル液、蒸留水、または滅菌生理食塩水）で再構成され得る。再構成すると、組成物は、当業者に知られている方法を用いて対象に投与される。

キット
様々な実施形態において、本発明は、本明細書に記載の１つ以上のＣＡＲ及び１つ以上のＣＰＩをコードする核酸を含む細胞を含む組成物を含む、がんを治療するためのキットを提供する。

キットは、本発明の組成物（例えば、本明細書に記載の１つ以上のＣＡＲ及び１つ以上のＣＰＩをコードする核酸を含む遺伝子改変細胞）の少なくとも１つを含む材料または成分の集合体である。従って、いくつかの実施形態において、キットは、上記のように、治療薬と複合体化した薬物送達分子を含む組成物を含む。

本発明のキットで構成される構成要素の正確な性質は、その意図する目的に依存する。一実施形態において、キットは、特にヒト対象のために構成される。さらなる実施形態において、キットは、家畜（ｆａｒｍ ａｎｉｍａｌｓ）、家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｉｍａｌｓ）、及び実験動物などであるが、これらに限定されない対象を治療する獣医学用途向けに構成される。

使用説明書は、キットに含まれていてもよい。「使用説明書」は、通常、キットの構成要素を用いて、対象のがんを治療、重症度を軽減、阻害するなど、所望の結果をもたらすために使用される技術を説明する具体的な表現を含む。さらに本発明によれば、「使用説明書」は、通常は意図された目的のために、組成物の調製、及び／または組成物の相対量、投与量要件、及び投与説明書などの少なくとも１つの方法パラメーターを記述する有形表現を含み得る。任意選択で、キットは、測定ツール、希釈剤、緩衝液、薬学的に許容される担体、注射器、または当業者によって容易に認識される他の有用な道具など、他の有用な成分も含む。

キットに組み立てられた材料または構成要素は、それらの操作性及び有用性を維持する任意の便利で適切な方法で保管され、施術者に提供され得る。例えば、成分は、溶解、脱水、または凍結乾燥された形であり得、それらは、室温、冷蔵または冷凍温度で提供され得る。構成要素は、通常、適切な包装材に含まれる。本明細書で使用される「包装材料」という語句は、本発明の組成物などのキットの内容物を収容するために使用される１つ以上の物理的構造のことをいう。包装材料は、好ましくは、無菌の、汚染物質のない環境を提供するために、よく知られた方法で構築される。本明細書で使用される「パッケージ」という用語は、ガラス、プラスチック、紙、ホイルなど、個々のキット構成要素を保持することができる適切な固体マトリックスまたは材料のことをいう。従って、例えば、パッケージは、ある量のＡＡＶ１−Ｐ０−ＩＣＥベクターを含む適切な量の組成物を含むために使用されるガラスバイアルであり得る。梱包材には一般に、キット及び／またはその構成要素の内容及び／または目的を示す外部ラベルが付いている。

以下の実施例は、特許請求の範囲を本発明に限定することを意図するものではなく、特定の実施形態を例示することを意図するものである。当業者が思いつく例示された方法のあらゆる変形は、本発明の範囲内に含まれることが意図される。

実施例１
実験方法
マウス
６〜８週齢の雌ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩＬ２Ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊ１}．Ｓｚ（ＮＳＧ）マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ， ＣＴ）から購入した。すべての動物実験は、ＮＩＨの動物管理及び使用委員会のガイドラインに従って実施され、ＮＣＩの動物管理及び使用委員会によって承認されたプロトコルの下で実施された。

細胞培養及び抗体
細胞株ＳＫＯＶ３及び２９３ＴはＡＴＣＣから入手した。肺がん株ＮＣＩ−Ｈ２９２は、Ｄｒ． Ｉｔｅ Ｌａｉｒｄ−Ｏｆｆｒｉｎｇａ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ， ＣＡ）から提供された。Ｈ２９２−ＣＤ１９及びＳＫＯＶ３−ＣＤ１９細胞株は、親ＮＣＩ−Ｈ２９２及びＳＫＯＶ３細胞に、ヒトＣＤ１９のｃＤＮＡをコードするレンチウイルスベクターで形質導入することにより生成された。形質導入されたＨ２９２及びＳＫＯＶ３細胞を抗ヒトＣＤ１９抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）で染色し、選別してＣＤ１９過剰発現細胞の比較的純粋な集団を得た。ＳＫＯＶ３、ＳＫＯＶ３−ＣＤ１９、ＮＣＩ−Ｈ２９２、及びＨ２９２−ＣＤ１９細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地からなるＲ１０培地で維持された。２９３Ｔ細胞は、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ培地からなるＤ１０培地で培養した。上記のすべての細胞培養培地及び補充物は、Ｈｙｃｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）から購入した。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、５％ヒトＡＢ血清（ＧｅｍＣｅｌｌ， Ｗｅｓｔ Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ， ＣＡ）、１％ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、１％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ）、１％ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｇｉｂｃｏ）、及び０．２％Ｎ−アセチルシステイン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を補充したＸ−Ｖｉｖｏ １５培地（Ｌｏｎｚａ， Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ， ＭＤ）で構成されるＴ細胞培地（ＴＣＭ）で培養した。

この研究で使用される一次抗体は、ビオチン化タンパク質Ｌ（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）、ＰＥ−抗ＣＤ４５、ＰＥ−Ｃｙ５．５−抗ＣＤ３、ＦＩＴＣ−抗ＣＤ４、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）−抗ＣＤ８、ＦＩＴＣ−抗ＣＤ８、ＰＥ−抗ＩＦＮ−γ、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１（商標）−抗ＰＤ −１、ＰＥ−抗ＰＤ−Ｌ１、ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５−抗ＬＡＧ−３、及びＰＥ−抗ＴＩＭ−３（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）、及びウサギ抗ＨＡタグ抗体（Ａｂｃａｍ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）を含む。使用した二次抗体は、ＦＩＴＣ結合ストレプトアビジン（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）及びヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）であった。ウエスタンブロット解析に使用されたＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）製であった。

プラスミド構築
抗ＣＤ１９ ＣＡＲ（ＣＡＲ）をコードするレトロウイルスベクターは、前述のようにＷｏｌｆｇａｎｇ Ｕｃｋｅｒｔ教授から頂いたＭＰ７１レトロウイルスベクターに基づいて構築された（Ｅｎｇｅｌｓ Ｂ， ｅｔ ａｌ． ２００３． Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ． Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １４： １１５５−６８）。次いで、抗ＰＤ−１ ｓｃＦｖ（ＣＡＲ．αＰＤ１）を含む抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードするベクターを、抗ＣＤ１９ ＣＡＲに基づいて生成した。ＣＡＲ．αＰＤ１ベクターの挿入物は、インフレームの５’末端から３’末端において以下の成分：抗ＣＤ１９ ＣＡＲ、ＥｃｏＲＩ部位、ヒトＩＬ−２由来のリーダー配列、抗ＰＤ−１ ｓｃＦｖ軽鎖可変領域、ＧＳリンカー、抗ＰＤ−１ ｓｃＦｖ重鎖可変領域、ＨＡタグ配列、及びＮｏｔＩ部位、から構成された。

ＣＡＲ．αＰＤ１ベクターの抗ＰＤ−１ ｓｃＦｖ部分は、ヒトＰＤ−１に特異的なヒトモノクローナル抗体５Ｃ４のアミノ酸配列に由来した（Ａｌａｎ Ｊ． Ｋｏｒｍａｎ ＭＳ， Ｃｈａｎｇｙｕ Ｗａｎｇ， Ｍａｒｋ Ｊ． Ｓｅｌｂｙ， Ｂｉｎｇｌｉａｎａ Ｃｈｅｎ， Ｊｏｓｅｐｈｉｎｅ Ｍ． Ｃａｒｄａｒｅｌｌｉ． ２０１１． Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ．）。ｓｃＦｖの対応するＤＮＡ配列は、オンラインコドン最適化ツールを用いて、ヒト細胞での最適な発現のためにコドン最適化され、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ， ＩＡ）によって合成された。次いで、抗ＰＤ−１ ｓｃＦｖをＧｉｂｓｏｎアセンブリー法によりＥｃｏＲＩ部位を介してＣＤ１９ ＣＡＲベクターに連結した。

レトロウイルスベクター産生
標準的なリン酸カルシウム沈殿プロトコルを用いて、２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによりレトロウイルスベクターを調製した。１５ｃｍ組織培養皿で培養した２９３Ｔ細胞に、３７．５μｇのレトロウイルスバックボーンプラスミド、１８．７５μｇのエンベローププラスミドｐＧＡＬＶ、及び３０μｇの、ｇａｇ−ｐｏｌをコードするパッケージングプラスミドをトランスフェクトした。ウイルス上清をトランスフェクションの４８時間後に回収し、使用前に０．４５μｍフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ， Ｃｏｒｎｉｎｇ， ＮＹ）で濾過した。

Ｔ細胞の形質導入及び拡大
凍結ヒトＰＢＭＣは、ＡｌｌＣｅｌｌｓ（Ａｌａｍｅｄａ， ＣＡ）から入手した。ＰＢＭＣをＴＣＭで解凍し、一晩休ませた。レトロウイルス形質導入の前に、５０ｎｇ／ｍｌ ＯＫＴ３、５０ｎｇ／ｍｌ抗ＣＤ２８抗体、及び１０ｎｇ／ｍｌ組換えヒトＩＬ−２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，ＮＪ）と培養することにより、ＰＢＭＣを２日間活性化させた。ウェルあたり１５μｇのレトロネクチン（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）でコーティングした、組織培養処理が無い１２ウェルプレートに、新鮮に回収したレトロウイルスの上清を、形質導入のために３２℃で２０００×ｇで２時間遠心分離することによってスピンロードした。新鮮なウイルス上清を用いて、ベクターのスピンローディングを１回繰り返した。活性化されたＰＢＭＣを５×１０^５細胞／ｍｌの濃度で、１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−２を補充した新しいＴＣＭで再懸濁し、ベクターをロードしたプレートに加えた。プレートを１０００×ｇ、３２℃で１０分間回転させ、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。同じ形質導入手順が翌日に繰り返された。ｅｘ ｖｉｖｏでの増殖中、培地を補充し、細胞密度を２日ごとに５×１０^５／ｍｌに調整した。

表面免疫染色及びフローサイトメトリー
細胞表面の抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現を検出するために、細胞をプロテインＬで染色した。ＦＡＣＳ染色の前に、５×１０^５個の細胞を回収し、ＦＡＣＳバッファー（５％ウシ血清アルブミン画分Ｖを含むＰＢＳ）で３回洗浄した。次いで、細胞を１μｇのビオチン化プロテインＬで４℃で３０分間染色した。細胞をＦＡＣＳバッファーで３回洗浄した後、ＦＡＣＳバッファー中の０．１μｇのＦＩＴＣ結合ストレプトアビジンとともに４℃で１０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、ＴｒａｎｓＦｉｘ細胞抗原安定化試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）で４℃で１０分間固定した。次いで、細胞を２回洗浄し、４℃で１０分間、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、及び抗ＣＤ８で染色した。細胞を洗浄し、ＰＢＳに再懸濁した。ＭＡＣＳｑｕａｎｔサイトメーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を用いて蛍光を評価し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ， Ａｓｈｌａｎｄ， ＯＲ）を用いてすべてのＦＡＣＳデータを解析した。

細胞内サイトカイン染色
Ｔ細胞（１×１０^６）を、９６ウェル丸底プレートで、ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）を用いて、３７℃、５％ＣＯ_２で６時間、１：１の比率で標的細胞とともに培養した。細胞内染色には、ＰＥ−Ｃｙ５．５−抗ＣＤ３、ＦＩＴＣ−抗ＣＤ４、パシフィックブルー−ＣＤ８、ＰＥ−抗ＩＦＮ−γ及びＰＥ−抗Ｋｉ６７抗体を用いた。Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ Ｆｉｘａｔｉｏｎ及びＰｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、細胞膜を透過性にし、製造元の指示に従って細胞内染色を行った。

ウエスタンブロット解析
細胞培養上清を回収し、製造元の指示に従って、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）抗ＨＡ磁気ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）で抗ＰＤ−１ ｓｃＦｖを精製した。次いで、精製された抗体をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ウエスタンブロット解析のためにニトロセルロース膜（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）に移した。前述のように、抗ＨＡタグ抗体（Ａｂｃａｍ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）でウエスタンブロットを解析した（Ｘｕ Ｓ ｅｔ ａｌ．２０１２． Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ａｎ ｏｒａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ ｆｏｒ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０９： １６３４８−５３）。

ＥＬＩＳＡ
ＩＦＮ−γは、製造元の指示に従って、ヒトＩＦＮ−γＥＬＩＳＡキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）を用いて測定した。手短に言えば、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）を４℃で一晩、示されたタンパク質に対する捕捉抗体２００ｎｇ／ウェルでコーティングした。翌日、プレートを洗浄バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ）で洗浄し、室温で２時間、アッセイバッファー（１０％ＦＢＳを含むＰＢＳ）でブロックした。等量の血清または細胞培養上清をプレートに加え、室温で２時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、検出抗体とともに室温で１時間インキュベートした。抗ＰＤ−１抗体及び分泌された抗ＰＤ−１ ｓｃＦｖを測定するために、組換えヒトＰＤ−１（ｒｈＰＤ−１）を用いてプレートをプレコートした。ヤギ抗マウスＩｇＧ１−ＨＲＰ及び抗ＨＡタグ抗体を、それぞれ検出抗体として用いた。

競合的ブロッキングアッセイ
９６ウェルアッセイプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）に３μｇ／ｍｌの抗ヒトＣＤ３抗体を４℃で一晩コーティングした。２日目に、ウェルの上清を吸引し、ウェルあたり１００μｌのＰＢＳで、ウェルを１回洗浄した。１００μｌのＰＢＳ中の１０μｇ／ｍｌのｒｈＰＤ−Ｌ１／Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）を添加した。次いで、各ウェルに、１０μｌのＰＢＳ中の１００μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体を加えた。アッセイプレートを３７℃で４時間インキュベートした。ヒトＴ細胞を採取し、１回洗浄し、次いで、ＴＣＭで１×１０^６細胞／ｍｌに再懸濁した。アッセイプレートのウェルを吸引した。次いで、１００μｌのヒトＴ細胞懸濁液（１×１０^５）と、ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を補充した、形質導入３日後のＣＡＲまたはＣＡＲ．αＰＤ１ Ｔ細胞培養物の上清１００μｌを各ウェルに加えた。プレートを覆い、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。インキュベーション後、Ｔ細胞を回収し、細胞内でＩＦＮ−γで染色した。

特定の細胞溶解アッセイ
標的細胞の溶解（Ｈ２９２−ＣＤ１９）は、標的細胞の生存を陰性対照細胞（ＮＣＩ−Ｈ２９２）の生存と比較することにより測定された。この方法は，以前に記載されている（Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ ＪＮ， ｅｔ ａｌ ２００９． Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ−ＣＤ１９ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ３２： ６８９−７０２）。ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞は、濃度１．５×１０^６細胞／ｍＬで、細胞運動をモニターする（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）ために、蛍光色素である５μＭ ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｏｒａｎｇｅ（５−（及び−６）−（（（４−クロロメチル）ベンゾイル）アミノ）テトラメチルローダミン）（ＣＭＴＭＲ）を有するＲ１０培地に懸濁することにより標識された。細胞を３７℃で３０分間インキュベートし、次いで、２回洗浄し、新鮮なＲ１０培地に懸濁した。Ｈ２９２−ＣＤ１９細胞は、０．１％ＢＳＡと５μＭ カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）蛍光色素を伴うＰＢＳに、１×１０^６細胞／ｍＬの濃度で懸濁することにより標識された。細胞を３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、同量のＦＢＳを細胞懸濁液に添加し、室温で２分間インキュベートした。次いで、細胞を２回洗浄し、新鮮なＲ１０培地に懸濁した。等量のＮＣＩ−Ｈ２９２及びＨ２９２−ＣＤ１９細胞（各５×１０^４個）を、エフェクターＣＡＲ−Ｔ細胞を有する各培養の同じウェルで組み合わせた。共培養は、次のエフェクター対標的比、１：１及び５：１で、丸底９６ウェルプレートに３連でセットアップされた。培養物を３７℃で４時間インキュベートした後、製造元の指示（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に従って、７−ＡＡＤ標識を行った。フローサイトメトリー解析を行って、残りの生（７−ＡＡＤ陰性）標的細胞を定量化した。それぞれの共培養について、Ｈ２９２−ＣＤ１９生細胞の割合をＮＣＩ−Ｈ２９２生細胞の割合で割ることにより、Ｈ２９２−ＣＤ１９細胞のパーセント生存率を決定した。エフェクター細胞を含まない標的細胞と陰性対照細胞のみを含むウェルでは、Ｈ２９２−ＣＤ１９細胞の割合とＮＣＩ−Ｈ２９２細胞の割合の比を計算し、開始細胞数と自発的な細胞死の変動を補正するために使用した。細胞毒性を３回測定し、平均±ＳＥＭで示した。

細胞増殖
３×１０^５個のＨ２９２−ＣＤ１９細胞をＤ１０培地に懸濁し、６ウェルプレートに播種した。標的細胞が付着したら、非形質導入Ｔ細胞、ＣＡＲ及びＣＡＲ．αＰＤ１ Ｔ細胞を回収し、ＰＢＳで２回洗浄した。次いで、細胞を、１０μＭ ＣＦＳＥを含むＰＢＳに１×１０^６細胞／ｍＬの濃度で懸濁することにより標識し、３７℃で６０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を２回洗浄し、新鮮なＴＣＭに懸濁した。共培養のために、同数のＴ細胞を標的細胞に加えた。共培養は、エフェクター対標的比、１：１で、３連で設定された。培養物を３７℃で９６時間インキュベートした。フローサイトメトリー解析を実施して、Ｔ細胞上のＣＦＳＥの強度を定量化した。増殖率を３回測定し、平均±ＳＥＭで示した。

腫瘍モデル及び養子移入
６〜８週齢で、マウスに３×１０^６のＨ２９２−ＣＤ１９細胞を皮下接種し、１０〜１３日後、平均腫瘍サイズが１００〜１２０ｍｍ^３に達したら、マウスを１００μｌ ＰＢＳ中の１×１０^６または３×１０^６ ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞のｉ．ｖ．による養子移入で治療した。ＣＡＲ発現は、ドナーに適合した非形質導入Ｔ細胞の添加により、両方のＣＡＲ群において２０％に正規化された。腫瘍の成長を週に２回モニターした。腫瘍サイズをキャリパーで測定し、次の式で計算した：Ｗ^２×Ｌ／２。明らかな体重減少、腫瘍の潰瘍形成、または腫瘍サイズが１０００ｍｍ^３を超えた場合に、マウスを安楽死させた。

統計解析
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン５．０１で統計解析を実行した。Ｔｕｋｅｙの多重比較による一元配置分散分析を実行して、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで異なる群間の違いを評価した。腫瘍成長曲線は、反復測定による一元配置分散分析を用いて解析した（Ｔｕｋｅｙの多重比較法）。マウス生存曲線は、カプラン・マイヤー解析（ボンフェローニ補正によるログランク検定）によって評価した。Ｐ値が０．０５未満の場合、統計的に有意と見なされた。調査結果の有意性は次のように定義された。ｎｓ＝有意ではない、Ｐ＞ ０．０５；＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１。

抗ＰＤ−１抗体を分泌する抗ＣＤ１９ ＣＡＲ−Ｔ細胞の特性評価
この研究で使用したレトロウイルスベクター構築物の概略図を図１Ａに示す。抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、ＣＤ８ヒンジ、ＣＤ２８膜貫通及び細胞内共刺激ドメイン、ならびに細胞内ＣＤ３ζドメインから構成される抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードするレトロウイルスベクターをＣＡＲ１９と命名した。抗ＣＤ１９ ＣＡＲ及び分泌抗ＰＤ−１ ｓｃＦｖの両方をコードするレトロウイルスベクターをＣＡＲ１９．αＰＤ１と命名した。ヒトＰＢＭＣに各構築物を形質導入して、初代リンパ球におけるＣＡＲの発現をテストした。図１Ｂに見られるように、ＣＡＲ発現はヒトＴ細胞の両方の構築物で観察されたが、抗ＰＤ−１分泌ＣＡＲ１９ Ｔ細胞は細胞表面でわずかに低いレベルのＣＡＲを発現した。抗ＰＤ−１の発現及び分泌を、形質導入の３日後に細胞上清でウエスタンブロット解析及びＥＬＩＳＡを行うことにより評価した。ＣＡＲ１９．αＰＤ１で形質導入されたＴ細胞により、抗ＰＤ−１が正常に発現及び分泌されることが観察された（図１Ｃ及び図１Ｄ）。

ＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞によって分泌される抗ＰＤ−１ ｓｃＦｖの結合活性及びブロッキング機能を評価するために、競合的結合及びブロッキングアッセイを実施した。Ｔ細胞の活性を評価するために、細胞内ＩＦＮ−γを測定した。図１Ｅに示すように、Ｔ細胞が抗ＣＤ３抗体によって刺激されるとＩＦＮ−γの発現がアップレギュレートされたが、組換えヒトＰＤ−Ｌ１（ｒｈＰＤ−Ｌ１）の存在はＩＦＮ−γの発現を著しく低下させた。しかしながら、ＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞の細胞培養上清を加えると、Ｔ細胞に対するｒｈＰＤ−Ｌ１の阻害効果が効果的に逆転し、ＩＦＮ−γ産生が著しく増加した（図１Ｅ）。

抗ＰＤ−１抗体を分泌すると、ＣＡＲ−Ｔ細胞の抗原特異的免疫応答が向上する
抗原特異的刺激を通じて抗ＰＤ−１分泌ＣＡＲ１９ Ｔ細胞のエフェクター機能をさらに評価するために、ＣＡＲ１９及びＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞の両方を、Ｈ２９２−ＣＤ１９またはＳＫＯＶ３−ＣＤ１９標的細胞と異なる期間共培養し、どちらもＰＤ−Ｌ１の表面発現が高いことが示された（図８）。次いで、異なる時点のＴ細胞を採取し、上清中の細胞機能マーカーＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡで測定した。２４時間抗原刺激すると、抗ＰＤ−１の分泌の有無にかかわらず、ＣＡＲ１９及びＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞の両方に同程度のＩＦＮ−γ分泌が見られた（図２Ａ及び図９Ａ）。しかしながら、７２時間後、ＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞は、Ｈ２９２−ＣＤ１９細胞による刺激後、親のＣＡＲ１９ Ｔ細胞と比較して、有意に高いＩＦＮ−γを分泌した（図２Ａ）。同様に、９６時間の抗原刺激後、抗ＰＤ−１を分泌するＣＡＲ１９ Ｔ細胞は、親のＣＡＲ１９ Ｔ細胞によって発現されるものよりも有意に多くのＩＦＮ−γを発現した（図２Ａ及び図９Ａ）。

次に、操作されたＴ細胞の細胞溶解機能を、６時間の細胞毒性アッセイにより調べた。Ｈ２９２−ＣＤ１９細胞に対するＣＡＲ１９及びＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞の細胞傷害活性を、エフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）比、１、５、１０及び２０で評価した。ＣＡＲ１９及びＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞の両方が、特に非形質導入Ｔ細胞と比較してより高いＥ／Ｔ比で、標的細胞の顕著な細胞溶解を媒介することがわかった。しかしながら、細胞溶解活性の点でＣＡＲ１９とＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞との間にはほとんど違いは見られなかった（図２Ｂ）。次いで、標的Ｈ２９２−ＣＤ１９細胞と操作されたＴ細胞の９６時間共培養後、カルボキシフルオレセイン二酢酸スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）ベースの増殖アッセイによりＴ細胞増殖を評価した。ＣＡＲ１９及びＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞の両方の抗原特異的刺激により、非形質導入Ｔ細胞と比較して著しく高いレベルの増殖がもたらされることが観察された。さらに、ＣＡＲ１９ Ｔ細胞（５７．９±１０．２％）と比較して、ＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞（７５．９±５．５％）の増殖率は有意に高かった（図２Ｃ及び図２Ｄ）。細胞増殖の可能性は、細胞増殖によりさらに評価された。抗原特異的刺激により、ＣＡＲ１９及びＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞の両方が非形質導入Ｔ細胞と比較して有意に拡大することが示された。驚くべきことに、親のＣＡＲ１９ Ｔ細胞（２．４±０．２）と比較して、細胞倍加の数はＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞（３．２±０．３）で有意に高かった（図１０）。

抗ＰＤ−１の分泌は、抗原刺激後のＣＡＲ Ｔ細胞の消耗を緩和する
ヒトＧＤ２及びマウスＨＥＲ２ ＣＡＲ Ｔ細胞でのＰＤ−１の発現は、抗原特異的活性化後に増加することが示されており、ＰＤ−１の遮断はＴ細胞でＰＤ−１の発現をダウンレギュレートすることがわかった。分泌された抗ＰＤ−１ ｓｃＦｖがヒトＴ細胞を消耗から保護する効果を評価するために、操作されたＣＡＲ Ｔ細胞を、Ｈ２９２−ＣＤ１９またはＳＫＯＶ３−ＣＤ１９標的細胞と２４時間共培養し、Ｔ細胞消耗マーカーのＰＤ−１について染色した。ＰＤ−１の発現は、抗原特異的刺激後、ＣＡＲ１９及びＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞の両方で有意にアップレギュレートされることがわかった。比較すると、ＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞でのアップレギュレートされたＰＤ−１の発現は、親のＣＡＲ１９ Ｔ細胞での発現よりも有意に低かった（図３Ａ、図３Ｂ、及び図１３Ａ−１３Ｃ）。しかしながら、抗原特異的刺激なしでは、ＣＡＲ１９及びＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞の両方でのＰＤ−１の発現は、Ｔ細胞増殖の過程で同様の安定したレベルを維持した（図１３Ｄ及び１３Ｅ）。

ＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞におけるＰＤ−１のより低い発現が、ＰＤ−１検出抗体の結合またはＰＤ−１のダウンレギュレーションに対する分泌された抗ＰＤ−１ ｓｃＦｖの遮断機能に起因するかどうかをさらに決定するために、活性化Ｔ細胞を対照培地またはＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞培養上清と３０分間インキュベートした後、抗ＰＤ−１抗体で染色した。分泌された抗ＰＤ−１ ｓｃＦｖは、ＰＤ−１検出抗体の結合の約２０％をブロックできることがわかった（図１１Ａ）。タンデムで、ＣＡＲ１９またはＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞のいずれかと、標的細胞Ｈ２９２−ＣＤ１９を２４時間共培養した。次いで、両方のＴ細胞を回収し、ＰＤ−１の転写発現をｑ−ＰＣＲで測定した。ＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞におけるＰＤ−１の発現は、親のＣＡＲ１９ Ｔ細胞におけるＰＤ−１の発現よりも有意に低かったことが観察された（図１１Ｂ）。これは、ＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞がＰＤ−１の発現をダウンレギュレートしたことを確かに確認する。

ＰＤ−１に加えて、リンパ球活性化遺伝子３タンパク質（ＬＡＧ−３）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン、及びムチンドメイン含有タンパク質３（ＴＩＭ−３；ＨＡＶＣＲ２としても知られる）を含む他の細胞表面阻害分子、及び細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）は、Ｔ細胞の消耗を誘発し、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の抗腫瘍効果を制限する上でも重要な役割を果たす。他のＴ細胞消耗マーカーの発現がＣＡＲ刺激によって調節されているかどうかを評価するために、ＣＡＲ操作Ｔ細胞のＬＡＧ−３及びＴＩＭ−３の発現を測定した。ＰＤ−１と同様に、ＬＡＧ−３及びＴＩＭ−３の発現は、形質導入されていないＴ細胞と比較して、抗原刺激後に、ＣＡＲ１９及びＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞の両方で有意にアップレギュレートされることがわかった。ＣＡＲ１９ Ｔ細胞と比較して、ＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞は、Ｈ２９２−ＣＤ１９細胞による刺激後にわずかに低いＬＡＧ−３とＴＩＭ−３を発現した。さらに、ＳＫＯＶ３−ＣＤ１９刺激では、ＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞はＬＡＧ−３発現がＣＡＲ１９ Ｔ細胞よりも有意に低かったのに対し、同様のＴＩＭ−３発現を示した（図３Ｃ、３Ｄ、１２Ａ、１３Ａ−１３Ｃ）。比較すると、抗原特異的刺激なしでは、ＣＡＲ１９及びＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞のＬＡＧ−３は同様のレベルで発現し、Ｔ細胞増殖の過程で安定したままであった（図１３Ｄ及び１３Ｅ）。

ＰＤ−１の遮断は、ＰＤ−Ｌ１陰性標的細胞での活性化後、ＧＤ２ ＣＡＲ Ｔ細胞の生存を促進できることが示されており、ＰＤ−１を発現するＴ細胞とＰＤ−Ｌ１などのＰＤ−１リガンドを発現するＴ細胞との相互作用がＴ細胞機能の抑制に寄与している可能性があることを示す（Ｇａｒｇｅｔｔ Ｔ， ｅｔ ａｌ ２０１６． ＧＤ２−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＡＲ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｕｎｄｅｒｇｏ Ｐｏｔｅｎｔ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｅｎｃｏｕｎｔｅｒ ｂｕｔ ｃａｎ ｂｅ Ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ Ｆｒｏｍ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ｂｙ ＰＤ−１ Ｂｌｏｃｋａｄｅ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２４： １１３５−４９）。従って、この実験では、ＣＡＲ１９及びＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞の両方でＰＤ−Ｌ１の発現も測定し、抗原特異的刺激後に有意に増加することがわかった。しかしながら、ＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞でのＰＤ−Ｌ１の発現は、ＣＡＲ１９ Ｔ細胞での発現よりも有意に低かった（図３Ｅ、３Ｆ、及び１２Ｂ）。

抗ＰＤ−１遺伝子操作ＣＡＲ Ｔ細胞は、抗腫瘍反応性の向上を示す
ＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞の抗腫瘍効果を評価するために、確立されたＨ２９２−ＣＤ１９皮下腫瘍（約１００ｍｍ^３）を有するＮＳＧマウスに１×１０^６個のＣＡＲ操作Ｔ細胞を養子移入した。動物実験の実験手順を図４Ａに示す。図４Ｂのデータは、３つの抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞群すべてが、実験中に、非形質導入Ｔ細胞、または抗ＰＤ−１抗体治療と併用した非形質導入Ｔ細胞と比較して、腫瘍サイズの減少を示したことを示す。しかしながら、親のＣＡＲ１９ Ｔ細胞、または抗ＰＤ−１抗体治療と組み合わせたＣＡＲ１９ Ｔ細胞と比較して、ＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞治療は抗腫瘍効果を有意に増強し、それはＴ細胞注入後１週間で明らかになった（図４Ｂ）。特に、養子細胞移植の１７日後、ＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞で処理したマウスの腫瘍がほぼ消失することが観察された。親のＣＡＲ１９ Ｔ細胞群または組み合わせ群では、６匹中４匹のマウス（約７０％）が依然として進行性または安定性の病状を示し、３０％未満の腫瘍サイズの減少のみを経験した（図４Ｃ）。担がんマウスの全生存率も評価された。親のＣＡＲ１９ Ｔ細胞治療単独（１７％）、または抗ＰＤ−１抗体とＣＡＲ１９ Ｔ細胞治療の組み合わせ（１７％）と比較して、ＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞治療が長期生存（１００％）を有意に延長したことが示された（図４Ｄ）。

抗ＰＤ−１操作ＣＡＲ Ｔ細胞は、親のＣＡＲ Ｔ細胞よりもｉｎ ｖｉｖｏで拡大し得る
次に、ＣＡＲ Ｔ細胞の生着及び拡大をｉｎ ｖｉｖｏで評価した。Ｔ細胞注入の２日後、マウスを安楽死させ、腫瘍、血液、脾臓、骨髄を含む様々な臓器や組織をヒトＴ細胞染色のために採取した。すべての群のＴ細胞がほとんど増殖せず、検査したすべての組織で２％未満のＴ細胞しか観察されないことがわかった。ほとんどのＴ細胞（１〜２％）が脾臓に帰巣し、特定の割合のＴ細胞（０．１〜０．５％）が血中を循環していた。転移したＴ細胞の浸潤レベルは、腫瘍及び骨髄では低かった。さらに、非形質導入Ｔ細胞とＣＡＲ形質導入Ｔ細胞との間のＴ細胞の割合は、検査したすべての組織でほとんど差がないことを示した（図５Ａ）。しかしながら、Ｔ細胞注入の１週間後の１０日目に、検査したすべての組織でＣＡＲ Ｔ細胞の有意な拡大が観察されたが、非形質導入Ｔ細胞はほとんど存在しなかった。特に、ｉｎ ｖｉｔｒｏデータと一致して、ＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞は、特に腫瘍、脾臓、血液において、親のＣＡＲ１９ Ｔ細胞と比較して有意に高い増殖率を示した（図５Ｂ及び図５Ｃ）。

抗ＰＤ−１操作ＣＡＲ Ｔ細胞は、確立された腫瘍部位でＴ細胞の枯渇の反転と、より高いＴ細胞エフェクター機能をもたらす
ＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞療法後に観察される抗腫瘍効果の増強が腫瘍部位でのＣＡＲ Ｔ細胞の機能の増加と相関するかどうかをさらに決定するために、３×１０^６個のＣＡＲ Ｔ細胞を受ける前に、マウスにＨ２９２−ＣＤ１９腫瘍を負荷した。実験計画を図６Ａに示す。Ｔ細胞注入の８日後、マウスを安楽死させ、フローサイトメトリーを用いて、腫瘍、血液、脾臓、骨髄のＴ細胞を解析した。ＣＡＲ Ｔ細胞治療と比較して、注入された抗ＰＤ−１抗体はｉｎ ｖｉｖｏでＴ細胞の拡大を促進する効果がほとんどないことが観察された。しかしながら、以前の観察結果と一致して（図５Ｂ）、ＣＡＲ１９．αＰＤ１レジメンで処理したマウスのＴ細胞は、腫瘍、血液、脾臓でより高い割合で増殖した（図６Ｂ）。腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の中の細胞傷害性ＣＤ８^＋Ｔ細胞の集団は、抗腫瘍免疫と自発的な腫瘍制御の誘発に重要であることが示されている。従って、ＣＤ８^＋Ｔ細胞とＣＤ４^＋Ｔ細胞の比率をＴＩＬ間で解析した。親のＣＡＲ１９ Ｔ細胞と比較して、ＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞はＣＤ８^＋Ｔ細胞とＣＤ４^＋Ｔ細胞の比が有意に高いことが示されたが、併用療法ではＣＡＲ Ｔ細胞単剤療法と比較してＣＤ８^＋Ｔ細胞とＣＤ４^＋Ｔ細胞の比は同様であった（図６Ｃ）。同様に、血液及び脾臓では、ＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞治療におけるＣＤ８^＋対ＣＤ４^＋の比率も、親のＣＡＲ１９ Ｔ細胞単剤療法及び併用療法群よりも有意に高かったが（図６Ｃ）、Ｔ細胞注入前のＣＡＲ１９とＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞との間のＣＤ８^＋Ｔ細胞比とＣＤ４^＋Ｔ細胞比との間でほとんど違いはなかった（図１４Ａ）。さらに、腫瘍浸潤ＣＤ８^＋Ｔ細胞でのＰＤ−１の発現を評価し、注入及び分泌された抗ＰＤ−１抗体の両方がＰＤ−１の発現を有意に減少させることができることがわかった（図６Ｄ）。また、ｅｘ ｖｉｖｏ培養を行い、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体または標的細胞Ｈ２９２−ＣＤ１９でＴＩＬを活性化した。親ＣＡＲ１９ Ｔ細胞または抗ＰＤ−１抗体の全身治療と組み合わせたＣＡＲ１９ Ｔ細胞のいずれかと比較して、養子移入されたＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞でＩＦＮ−γの有意に高い発現が観察された。ＣＡＲ Ｔ細胞単独療法と併用療法との間でＩＦＮ−γの発現にほとんど差は認められなかった（図６Ｅ及び図６Ｆ）。さらに、血清中のＩＦＮ−γ及び抗ＰＤ−１抗体の発現を測定したところ、すべての群でＩＦＮ−γの発現にほとんど差が見られなかった（図１４Ｃ）。特に、ＣＡＲ１９ Ｔ細胞治療と比較して、ＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞療法は血清中の抗ＰＤ−１濃度が有意に高かったが、その濃度は抗ＰＤ−１抗体の全身注射の場合よりも１５倍以上低かった（図６Ｇ）。

養子Ｔ細胞療法は、免疫療法の有望な方法となっている。造血器腫瘍を有する患者において、成功した応答を達成している。しかしながら、部分的には免疫抑制特性と免疫抑制微小環境の確立のために、固形腫瘍の治療の結果はそれほど期待されていない。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１調節経路は、ＴＩＬの抗腫瘍応答に対する特に拮抗的な効果を実証している。予後不良の固形腫瘍はＰＤ−Ｌ１の発現のアップレギュレーションを示したが、ＴＩＬはＰＤ−１のアップレギュレーションを有することが示された。これら２つの効果が組み合わさって、腫瘍が消える。しかしながら、これは、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路を標的とするチェックポイント阻害剤（ＣＰＩ）の使用により混乱する可能性がある。結果として、その後の研究は、活性化後にＰＤ−１のアップレギュレーションを示した注入ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断の効果を調査するために設計された。

細胞固有のＰＤ−１ ｓｈＲＮＡ及びＰＤ−１ドミナントネガティブ受容体などのＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１阻害の他の方法にもかかわらず、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１抗体による治療は長い間関心のあるトピックであり、動物モデルと臨床試験の両方で幅広く研究されている。実際、両方の抗体は、腫瘍成長の顕著な阻害をもたらした。しかしながら、抗体治療には複数の制限がある。例えば、持続的な効果を得るには、抗体を複数回連続して投与する必要がある。また、抗体のサイズが大きいため、抗体が腫瘍塊に入り込み浸潤したＰＤ−１陽性Ｔ細胞に遭遇するのが妨げられる。これらの非効率性を説明するために、免疫調節薬または抗体による複数の高用量治療が必要であるが、これにより、軽度の下痢から自己免疫性肝炎、肺炎、大腸炎に及ぶ副作用が生じる可能性がある。さらに、抗体のＦｃ部分は、通常ＦｃαＲＩ及びＦｃγＲＩＩＩＡ／ＦｃγＲＩＩＣをそれぞれ発現するマクロファージ及びナチュラルキラー細胞内の細胞傷害性シグナルを活性化することにより、免疫細胞の枯渇を引き起し得ることが示されている。従って、本研究では、免疫抑制性の腫瘍微小環境を変化させ、腫瘍誘発性機能低下を防ぎ、注入されたＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍免疫を強化することを目的として、ＰＤ−１に対して高濃度のヒトｓｃＦｖを分泌かつ送達を行うＣＡＲ Ｔ細胞の操作に注力した。

本明細書において、本発明者らは、ヒト抗ＰＤ−１ ｓｃＦｖを分泌するヒト抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞を作製し、抗ＰＤ−１ ｓｃＦｖが、ＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞によって効率的に発現及び分泌され得ることを実証した。分泌されたｓｃＦｖは、細胞表面上のＰＤ−１にうまく結合し、Ｔ細胞機能に対するＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の阻害効果を逆転させた。構成的に分泌された抗ＰＤ−１ ｓｃＦｖによるＰＤ−１の遮断は、Ｔ細胞の枯渇を減少させ、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＴ細胞の増殖とエフェクター機能を有意に増強した。異種移植マウスモデルを用いた本発明者らの研究は、親のＣＡＲ１９ Ｔ細胞と比較した場合、ＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞が抗腫瘍活性をさらに増強し、全生存期間を延長することも実証した。機構的には、本発明者らは、ＣＡＲ１９．αＰＤ１Ｔ細胞はｉｎ ｖｉｖｏでの拡大が大きいことを観察した。さらに、局所腫瘍部位では、ＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞は、親のＣＡＲ１９ Ｔ細胞よりも消耗が少なく機能的であることが示された。

ＰＤ−１及びそのリガンドＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２の関与は、ＴＣＲまたはＢＣＲ活性化の存在下で阻害シグナルを伝達し、Ｔ細胞機能を抑制する。この研究では、組換えヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質（ｒｈＰＤ−Ｌ１）の存在が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化アッセイでＴ細胞活性化を有意に抑制した。ＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞によって分泌された抗ＰＤ−１ ｓｃＦｖの結合及びブロッキング活性を調べるために、ｒｈＰＤ−Ｌ１タンパク質の存在下で、ＣＡＲ１９ Ｔ細胞またはＣＡＲ１９．αＰＤ−１ Ｔ細胞のいずれかの細胞培養上清とともにＴ細胞を培養した。ＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞からの上清がＴ細胞機能を救い、ＩＦＮ−γ産生を有意に増加させることが観察され、分泌された抗ＰＤ−１がＰＤ−１にうまく結合し、Ｔ細胞機能におけるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の阻害効果を逆転させることができることが示された。

ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路は、Ｔ細胞によるサイトカイン産生の調節を含み、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及びＩＬ−２の産生を阻害する。ヒトＧＤ２及び抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ Ｔ細胞のＰＤ−１の発現は、抗原特異的活性化後に増加することが示されており、ＰＤ−１の遮断はＴ細胞エフェクター機能を増強し、ＰＤ−Ｌ１^＋標的細胞の存在下でＩＦＮ−γの産生を増加させることが示されている。従って、この研究では、ＣＡＲ１９ ＴとＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞の機能的能力を比較するために、本発明者らは、Ｔ細胞をＰＤ−Ｌ１^＋がん細胞株、Ｈ２９２−ＣＤ１９またはＳＫＯＶ３−ＣＤ１９と共培養し、抗ＰＤ−１分泌ＣＡＲ１９ Ｔ細胞は、親のＣＡＲ１９ Ｔ細胞よりも有意に高いレベルのＩＦＮ−γを産生した。サイトカインの産生に加えて、ＰＤ−１はＴ細胞の増殖も阻害し得る。ＰＤ−Ｌ１^＋がん細胞の存在下でのＣＡＲ特異的刺激により、ＣＡＲ１９．αＰＤ１Ｔ細胞は、親のＣＡＲ１９ Ｔ細胞よりも有意に高い増殖率を示した。まとめると、これらのデータは、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達遮断により、ＣＡＲ１９ Ｔ細胞単独と比較して、より高い増殖能力を有するより機能的なＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞がもたらされることを意味する。

分泌された抗ＰＤ−１がＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞の機能にどのように影響するかをよりよく理解するために、ＣＡＲ１９ Ｔ細胞及びＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞をＰＤ−Ｌ１^＋標的細胞に曝露し、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、及びＴＩＭ−３を含む、Ｔ細胞消耗マーカーの発現を調べた。本発明者らは、親ＣＡＲ１９ Ｔ細胞と比較して、ＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞でのＰＤ−１の発現が有意に低く、ＬＡＧ−３などの他の消耗マーカーの発現が低いことを観察した。ＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞でのＰＤ−１の発現低下は、抗体遮断とＰＤ−１表面発現のダウンレギュレーションの二重の効果によって引き起こされ得る。腫瘍浸潤性Ｔ細胞のＰＤ−１アップレギュレーションは、高ＰＤ−Ｌ１発現腫瘍におけるＴ細胞枯渇の主要な原因であると報告された。ＰＤ−１のダウンレギュレーションは、ＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞のＩＦＮ−γ産生の増加によってサポートされるＴ細胞枯渇の回復とＴ細胞エフェクター機能の強化に寄与し得る。さらに、ＬＡＧ−３などの他の消耗メーカーの発現レベルが低いことも、抗原刺激時のＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞の高い機能に寄与し得る。本発明者らの観察は最近の研究と一致しており、複数の抑制性受容体の共発現がＴ細胞枯渇の主要な特徴であることを示している。さらに、本発明者らは、抗原特異的刺激によりＣＡＲ Ｔ細胞でＰＤ−Ｌ１発現が有意に増加し、Ｔ細胞−Ｔ細胞相互作用を介してＴ細胞の枯渇に寄与し得ることを発見した。特に、比較すると、本発明者らは、ＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞上のＰＤ−Ｌ１の発現レベルが有意に低いことを観察した。これらのデータは、ＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞上のＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１発現の抑制されたアップレギュレーションが、腫瘍細胞誘発性及び／またはＴ細胞誘発性の消耗の減少に寄与し得、それによってＴ細胞エフェクター機能とその抗腫瘍免疫をさらに強化する。

本発明者らのｉｎ ｖｉｖｏ研究は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断に関係なく、ＣＡＲ Ｔ細胞処理により腫瘍成長を阻害できることを示した。ＣＡＲ１９ Ｔ細胞治療またはＣＡＲ１９ Ｔ細胞と抗ＰＤ−１抗体の全身治療を組み合わせたマウスの６７％が依然として安定または進行性疾患を有していたのと比較して、本発明者らは、ＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞治療により、約２週間で９０％以上の腫瘍根絶が達成されたことを観察した。ＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞の強化された抗腫瘍効果の根底にあるメカニズムを理解するために、本発明者らはｉｎ ｖｉｖｏで養子移入されたＴ細胞の拡大を解析した。本発明者らのｉｎ ｖｉｖｏデータと一致して、本発明者らは、腫瘍、血液、脾臓、及び骨髄を含むすべての検査された組織で、抗ＰＤ−１分泌ＣＡＲ Ｔ細胞が親ＣＡＲ Ｔ細胞よりも大幅に拡大していることを見出した。さらに、ＴＩＬの中の細胞傷害性ＣＤ８^＋Ｔ細胞の集団は、抗腫瘍免疫を引き出すのに重要である。以前の研究では、ＰＤ−１シグナル伝達がＣＤ８^＋ＴＩＬの拡大と機能の調節に関与していることが示された。この研究では、ｅｘ ｖｉｖｏで刺激するとＣＤ８^＋ＴＩＬのより大きな集団がＩＦＮ−γを発現し、ＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞群におけるＣＤ８^＋ＴＩＬとＣＤ４^＋ＴＩＬの比率が高いことは、ＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞が親のＣＡＲ１９ Ｔ細胞と比較して、ｉｎ ｖｉｖｏでより機能的で拡張可能であることを意味する。

興味深いことに、この研究では、本発明者らは、抗ＰＤ−１抗体の全身注射が、ＣＡＲ Ｔ細胞療法の抗腫瘍効果の増強にほとんど効果がないことを実証した。同系のＨＥＲ２^＋自己抗原腫瘍モデルにおいて、最近の研究では、高用量（２５０μｇ／マウスの抗ＰＤ−１抗体）ＰＤ−１の遮断により、乳がんの治療における抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍活性を増強できることが示された。しかしながら、抗ＰＤ−１抗体の投与量が少ない（２００μｇ／マウス）場合、ＣＡＲ Ｔ細胞療法への影響は限定的であった。本研究では、低用量（１２５μｇ／マウス）の注射では、抗ＰＤ−１抗体は腫瘍の成長を阻害することも、ＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍効果を高めることもできなかった。この観察結果は、実質的な抗腫瘍効果を達成するために、しばしば全身毒性を引き起こす大量の抗ＰＤ−１抗体が必要になり得ることを示す。本発明者らは、抗ＰＤ−１抗体の循環量を測定したところ、併用治療群で有意な量の、循環している注射された抗体（約０．７μｇ／ｍｌ）を見出し、ＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞治療群で１５倍低い量を見出した。投与及び自己分泌抗ＰＤ−１抗体の両方がｉｎ ｖｉｖｏでＣＤ８^＋Ｔ細胞におけるＰＤ−１の発現を効率的に減少及び遮断したが、全身注射された抗ＰＤ−１抗体は、ｅｘ ｖｉｖｏ刺激時の細胞溶解性ＣＤ８^＋ＴＩＬの集団の増加またはＴＩＬのＩＦＮ−γ産生の増強にほとんど影響しなかった。この結果は、注入された抗体が、現在の用量で注入されたＴ細胞機能の増強にほとんど影響を及ぼさないことを示唆する。またこれは、ＣＡＲ Ｔ細胞療法の抗腫瘍活性の増強における注入されたＰＤ−１の遮断についての本発明者らの観察された失敗も説明している。低濃度の分泌抗ＰＤ−１と局所腫瘍組織での増強されたエフェクター機能を考えると、ＣＡＲ Ｔ細胞によって分泌される抗ＰＤ−１は、ＰＤ−１シグナル伝達を遮断し、ＣＡＲ Ｔ細胞の機能的能力を高める上で、より安全で強力なアプローチを提供し得る。

結論として、ＣＡＲ１９．αＰＤ１ Ｔ細胞は、異種移植マウスモデルにおけるヒト固形腫瘍について、Ｔ細胞枯渇の軽減、Ｔ細胞拡大の強化、及びＣＡＲ Ｔ細胞治療の改善を示した。免疫適格条件では、抗ＰＤ−１操作ＣＡＲ Ｔ細胞は、腫瘍微小環境の調節に対するＰＤ−１の遮断の永続的な効果を考えると、腫瘍根絶の誘導においてより強力であると推測される。さらに、本発明者らは、通常ＰＤ−Ｌ１の発現が高い卵巣がんまたは乳がんの治療のために、メソセリンやＨＥＲ−２などの他の腫瘍関連抗原を標的とするＣＡＲ構築物に抗ＰＤ−１ ｓｃＦｖを組み込むことが、優れた抗腫瘍免疫療法を達成するために検討すべき次のステップの１つであると想定している。

上述の様々な方法及び技術は、本出願を実施するためのいくつかの方法を提供する。もちろん、説明されたすべての目的または利点が、本明細書に説明された特定の実施形態に従って必ずしも達成できるわけではないことを理解されたい。従って、例えば、当業者は、本明細書で教示または示唆される他の目的または利点を必ずしも達成することなく、本明細書で教示される１つの利点または利点群を達成または最適化する方法で実行できることを認識するであろう。様々な選択肢が本明細書で言及されている。いくつかの好ましい実施形態は、具体的に１つ、別の、またはいくつかの特徴を含むが、他のものは具体的に１つ、別の、またはいくつかの特徴を除外し、さらに別のものは１つ、別の、またはいくつかの有利な特徴を含めることにより特定の特徴を緩和することを理解されたい。

さらに、当業者は、異なる実施形態からの様々な特徴の適用可能性を認識するであろう。同様に、上記の様々な要素、特徴、及びステップ、ならびにそのような要素、特徴、またはステップのそれぞれの他の既知の同等物は、説明された原理に従って方法を実行するために、当業者によって様々な組み合わせで使用され得る。様々な要素、特徴、及びステップの中で、いくつかは具体的に含まれ、他は様々な実施形態で具体的に除外される。

本出願は、特定の実施形態及び実施例の文脈で開示されているが、本出願の実施形態は、具体的に開示された実施形態を超えて、他の代替実施形態及び／またはその使用及び修正ならびに均等物にまで及ぶことを当業者は理解するであろう。

本明細書では、本出願を実施するために、本発明者らに知られている最良の形態を含む本出願の好ましい実施形態を説明する。それらの好ましい実施形態の変形は、前述の説明を読むことで当業者に明らかになるであろう。当業者はそのような変形を適宜使用することができ、本明細書に具体的に記載されている以外の用途を実施することができると考えられる。従って、本出願の多くの実施形態は、適用法で許可されるように、本明細書に添付された特許請求の範囲に列挙された主題のすべての修正及び同等物を含む。さらに、そのすべての可能な変形における上記要素の任意の組み合わせは、本明細書で特に明記しない限り、または文脈により明らかに矛盾しない限り、本出願に含まれる。

本明細書で参照されるすべての特許、特許出願、特許出願の刊行物、及び記事、書籍、仕様書、刊行物、文書、物などのその他の資料は、同じ、現在の文書と一致しない、または競合する同じもののいずれか、または現在または後に本文書に関連付けられる請求の範囲の最も広い範囲に関して限定的な影響を与える可能性のあるものに関連する検察ファイルの履歴を除き、あらゆる目的のために、この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例として、組み込まれた資料のいずれかに関連する説明、定義、及び／または用語の使用に矛盾または対立がある場合、本文書に関連するもの、本文書の用語の説明、定義、及び／または使用が優先するものとする。

本明細書に開示される本出願の実施形態は、本出願の実施形態の原理の例示であることを理解されたい。採用できる他の修正は、本出願の範囲内であり得る。従って、限定ではなく例として、本出願の実施形態の代替構成を本明細書の教示に従って利用され得る。従って、本出願の実施形態は、示され説明されたとおりのものに限定されない。

本発明の様々な実施形態は、詳細な説明において上述されている。これらの説明は上記の実施形態を直接説明しているが、当業者は、本明細書に示され説明されている特定の実施形態に対する修正及び／または変形を考え得ることが理解される。この説明の範囲内にあるそのような修正または変更は、その中に含まれることも意図されている。特に明記しない限り、明細書及び特許請求の範囲の単語及び語句には、適用可能な分野（複数可）の当業者に通常の慣習的な意味が与えられることが発明者の意図である。

出願を提出した時点で出願人に知られている本発明の様々な実施形態の前述の説明は、提示されており、例示及び説明の目的のために意図されている。本説明は、網羅的であることも、開示された正確な形態に本発明を限定することも意図されておらず、上記の教示に照らして多くの修正及び変形が可能である。記載された実施形態は、本発明の原理及びその実際の応用を説明し、他の当業者が、考えられる特定の用途に適した様々な実施形態及び様々な修正で本発明を利用できるようにする。従って、本発明は、本発明を実施するために開示された特定の実施形態に限定されないことが意図されている。

本発明の特定の実施形態を示して説明したが、本明細書の教示に基づいて、本発明及びそのより広い態様から逸脱することなく変更及び修正を行うことができることは当業者には明らかであり、従って、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の精神及び範囲内にあるすべてのそのような変更及び修正をその範囲内に包含するものである。

Claims (17)

1. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びチェックポイント阻害剤（ＣＰＩ）をコードする核酸、またはＣＡＲ及びＣＰＩをコードする複数の核酸を含む、細胞。
2. 前記ＣＡＲが、分化クラスター（ＣＤ）１９、ＣＤ２２、ＣＤ２３、骨髄増殖性白血病タンパク質（ＭＰＬ）、ＣＤ３０、ＣＤ３２、ＣＤ２０、ＣＤ７０、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７９ｂ、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７６、ＣＤ３２４、Ｆｃ受容体様５（ＦｃＲＨ５）、ＣＤ１７１、ＣＳ−１（シグナル伝達リンパ球活性化分子ファミリー７、ＳＬＡＭＦ７）、Ｃ型レクチン様分子１（ＣＬＬ−１）、ＣＤ３３、カドヘリン１、カドヘリン６、カドヘリン１６、カドヘリン１７、カドヘリン１９、上皮成長因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖｉｉｉ）、ガングリオシドＧＤ２、ガングリオシドＧＤ３、ヒト白血球抗原Ａ２（ＨＬＡ−Ａ２）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、Ｔｎ抗原、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、オーファン受容体１のような受容体チロシンキナーゼ（ＲＯＲ１）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、腫瘍関連糖タンパク質（ＴＡＧ）−７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、ＫＩＴ、インターロイキン−１３受容体サブユニットアルファ−２（ＩＬ−１３Ｒａ２）、インターロイキン−１１受容体サブユニットアルファ（ＩＬ１１Ｒａ）、メソセリン、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、血管上皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、ルイスＹ、ＣＤ２４、血小板由来成長因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲ−ベータ）、プロテアーゼセリン２１（ＰＲＳＳ２１）、シアリル糖脂質段階特異的胚抗原４（ＳＳＥＡ−４）、ＣＤ２０、免疫グロブリンのＦｃ領域、組織因子、葉酸受容体アルファ、上皮成長因子受容体２（ＥＲＢＢ２）、ムチン１（ＭＵＣ１）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、神経小付着分子（ＮＣＡＭ）、プロスターゼ、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、伸長因子２変異（ＥＬＦ２Ｍ）、エフリンＢ２、インスリン様成長因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−Ｉ受容体）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、潜伏膜タンパク質２（ＬＭＰ２）、メラニン細胞タンパク質ｇｐｌ００、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、エリスロポエチン産生肝細胞がんＡ２（ＥｐｈＡ２）、フコシル化モノシアロガングリオシド（フコシルＧＭ１）、シアリルルイスａ（ｓＬｅａ）、ガングリオシドＧＭ３、トランスグルタミナーゼ５（ＴＧＳ５）、高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）、ｏ−アセチル−ＧＤ２ガングリオシド、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、腫瘍内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）、クローディン６（ＣＬＤＮ６）、甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）−ベータ１定常鎖、ＴＣＲベータ２定常鎖、ＴＣＲガンマ−デルタ、Ｇタンパク質共役受容体クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）、ＣＸＯＲＦ６１タンパク質、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）、ポリシアル酸、胎盤特異的１（ＰＬＡＣ１）、炭水化物抗原ＧｌｏｂｏＨ、乳房分化抗原ＮＹ−ＢＲ−１、ウロプラキン−２（ＵＰＫ２）、Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）、アドレナリン受容体ベータ３（ＡＤＲＢ３）、パネキシン３（ＰＡＮＸ３）、Ｇタンパク質共役受容体２０（ＧＰＲ２０）、リンパ球抗原６ファミリーメンバーＫ（ＬＹ６Ｋ）、嗅覚受容体ファミリー５１サブファミリーＥメンバー２（ＯＲ５１Ｅ２）、Ｔ細胞受容体γ鎖代替リーディングフレームタンパク質（ＴＡＲＰ）、ウィルムス腫瘍抗原１タンパク質（ＷＴ１）、がん精巣抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１、がん精巣抗原ＬＡＧＥ−ｌａ、レグマイン、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６、ＨＰＶ Ｅ７、ヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ１）−Ｔａｘ、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス糖タンパク質（ＫＳＨＶ）Ｋ８．１タンパク質、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）にコードされた糖タンパク質３５０（ＥＢＢ ｇｐ３５０）、ＨＩＶ１−エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０、マルチプレックス自動ゲノムエンジニアリング（ＭＡＧＥ）−Ａｌ、転座−Ｅｔｓ−白血病ウイルス（ＥＴＶ）タンパク質６−ＡＭＬ、精子タンパク質１７、Ｘ抗原ファミリーメンバー（ＸＡＧＥ）１、膜貫通型チロシンタンパク質キナーゼ受容体Ｔｉｅ２、黒色腫がん精巣抗原ＭＡＤ−ＣＴ−１、黒色腫がん精巣抗原ＭＡＤ−ＣＴ−２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロスタイン、サバイビン及びテロメラーゼ、前立腺がん腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）／ガレクチン８、メランＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、デルタ様３（ＤＬＬ３）、トロホブラスト細胞表面抗原２（ＴＲＯＰ２）、タンパク質チロシンキナーゼ−７（ＰＴＫ７）、グアニル酸シクラーゼＣ（ＧＣＣ）、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、肉腫転座ブレークポイント、メラノーマ−アポトーシス阻害剤（ＭＬ−ＩＡＰ）、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（ＮＡ１７）、ペアボックスタンパク質Ｐａｘ−３（ＰＡＸ３）、アンドロゲン受容体、サイクリンＢｌ、ｖ−ｍｙｃ鳥類骨髄細胞腫ウイルスがん遺伝子神経芽細胞腫由来ホモログ（ＭＹＣＮ）、ＲａｓホモログファミリーメンバーＣ（ＲｈｏＣ）、チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ−２）、チトクロームＰ４５０１Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）、ＣＣＣＴＣ結合因子（亜鉛フィンガータンパク質）様（ＢＯＲＩＳまたはブラザー・オブ・ザ・レギュレーター・オブ・インプリンテッド・サイト）、Ｔ細胞３によって認識される扁平上皮がん抗原（ＳＡＲＴ３）、ＰＡＸ５、プロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２（ＯＹ−ＴＥＳ１）、リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ）、キナーゼアンカータンパク質４（ＡＫＡＰ−４）、滑膜肉腫、Ｘブレークポイント２（ＳＳＸ２）、高度糖化最終産物受容体（ＲＡＧＥ−１）、腎遍在１（ＲＵｌ）、ＲＵ２、腸内カルボキシルエステラーゼ、熱ショックタンパク質７０−２変異体（ｍｕｔ ｈｓｐ７０−２）、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）、ＩｇＡ受容体のＦｃフラグメント（ＦＣＡＲ）、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）、ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ（ＣＤ３００ＬＦ）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）、骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）、ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様２（ＥＭＲ２）、リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）、グリピカン３（ＧＰＣ３）、Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）、免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１（ＩＧＬＬ１）、ＦＩＴＣ、黄体形成ホルモン受容体（ＬＨＲ）、卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）、絨毛性ゴナドトロピンホルモン受容体（ＣＧＨＲ）、ＣＣケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）、ガングリオシドＧＤ３、シグナリングリンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）ファミリーメンバー６（ＳＬＡＭＦ６）、ＳＬＡＭＦ４、黄体形成ホルモン受容体（ＬＨＲ）、卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）、絨毛性ゴナドトロピンホルモン受容体（ＣＧＨＲ）、またはそれらの組み合わせを標的とする、請求項１に記載の細胞。
3. 前記チェックポイント阻害剤がＰＤ−１を標的とする、請求項１に記載の細胞。
4. 前記チェックポイント阻害剤が抗ＰＤ−１ ｓｃＦｖである、請求項４に記載の細胞。
5. 前記チェックポイント阻害剤が、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ３、Ｂ７−Ｈ１、ＣＤ１６０、Ｐ１Ｈ、２Ｂ４、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、ＣＥＡＣＡＭ−５、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、及びＬＡＩＲ１のいずれか１つ以上を標的とする、請求項１に記載の細胞。
6. 前記細胞がＴリンパ球細胞（Ｔ細胞）である、請求項１に記載の細胞。
7. 前記細胞がナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項１に記載の細胞。
8. 前記ＣＰＩが構成的に発現される、請求項１に記載の細胞。
9. 前記抗ＰＤ−１ ｓｃＦｖが構成的に発現される、請求項５に記載の細胞。
10. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１のポリヌクレオチドと、チェックポイント阻害剤（ＣＰＩ）をコードする第２のポリヌクレオチドとを含む、核酸。
11. 請求項１０に記載の核酸によりコードされる、ポリペプチド。
12. 請求項１０に記載の核酸を含む、ベクター。
13. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の細胞を含む、医薬組成物。
14. それを必要とする対象に、治療有効量の、請求項１〜９のいずれか一項に記載の細胞を投与することを含む、がんを治療する方法。
15. 前記がんが肺がんである、請求項１５に記載の方法。
16. 治療有効量の、化学療法または放射線照射を含む既存の療法を前記対象に施すことをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
17. 前記細胞及び前記既存の療法が連続的または同時に施される、請求項１７に記載の方法。

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