JP2019502365A - インサイチュー生成マイクロ流体分離構造、そのキット、及びその使用方法 - Google Patents

インサイチュー生成マイクロ流体分離構造、そのキット、及びその使用方法 Download PDF

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Abstract

【課題】生物科学及び関連分野では、マイクロ流体デバイスのフロー領域をリアルタイムで再構成する能力を有することが有用であり得る。【解決手段】固化ポリマー網目構造を組み込んだインサイチュー生成マイクロ流体分離構造、その準備及び使用の方法、組成物、及びキットが記載される。ペン及びバリアを含む様々な分離構造をリアルタイムで導入可能であることは、マイクロ流体デバイスにおける改善された微小物体操作の方法を提供する。インサイチュー生成分離構造は、永久的又は一時的に設置され得る。【選択図】図６

Description

発明の背景
生物科学及び関連分野では、マイクロ流体デバイスのフロー領域をリアルタイムで再構成する能力を有することが有用であり得る。本発明の幾つかの実施形態は、マイクロ流体分離構造のインサイチュー生成のための装置及びプロセスを含む。
発明の概要
一態様では、マイクロ流体デバイスが提供され、本マイクロ流体デバイスは、エンクロージャを含み、エンクロージャは、基板と、エンクロージャ内に配置されるフロー領域と、基板に配置される少なくとも１つのインサイチュー生成分離構造とを含み、少なくとも１つのインサイチュー生成構造は、固化ポリマー網目構造を含む。幾つかの実施形態では、固化ポリマー網目構造は、シリコーンポリマーを含まない。幾つかの実施形態では、固化ポリマー網目構造は、ケイ素を含まない。固化ポリマー網目構造は、光開始ポリマーを含み得る。少なくとも１つのインサイチュー生成分離構造の全て又は少なくとも一部は、固化ポリマー網目構造からなり得る。
別の態様では、マイクロ流体デバイスが提供され、本マイクロ流体デバイスは、エンクロージャを含み、エンクロージャは、基板と、マイクロ流体チャネルと、少なくとも１つの隔離ペンと、インサイチュー生成バリアとを有する。隔離ペンは、分離領域及び接続領域を含み得、接続領域は、マイクロ流体チャネルへの基端開口部と、分離領域への先端開口部とを有する。インサイチュー生成バリアは、マイクロ流体チャネル及び／又は隔離ペンの少なくとも部分的な遮断を提供するように配置され得る。様々な実施形態では、インサイチュー生成バリアは、固化ポリマー網目構造を含み得る。固化ポリマー網目構造は、光開始ポリマーを含み得る。
更に別の実施形態では、マイクロ流体デバイスが提供され、本マイクロ流体デバイスは、エンクロージャを含み、エンクロージャは、基板と、流体媒体を含むように構成されるマイクロ流体チャネルを含むフロー領域と、各隔離ペンがマイクロ流体チャネルの第１の側において開くように、互いに隣接して配置される第１の複数の隔離ペンと、各隔離ペンがマイクロ流体チャネルの第２の側において開くように、互いに隣接して配置される第２の複数の隔離ペンとを有する。マイクロ流体チャネルの第１の側は、第１の流体媒体を受け取るように構成され得、及びマイクロ流体チャネルの第２の側は、第２の流体媒体を受け取るように構成され得る。様々な実施形態では、エンクロージャは、バリアを更に含み得る。バリアは、マイクロ流体チャネルを第１のサブチャネルと第２のサブチャネルとに分割するように構成され得、第１のサブチャネルは、第１の複数の隔離ペンを超えた流体媒体の第１のサブフローを提供するように構成され、及び第２のサブチャネルは、第２の複数の隔離ペンを超えた流体媒体の第２のサブフローを提供するように構成される。バリアは、インサイチュー生成バリアを含み得るか、それからなり得るか、又はそれから基本的になり得る。したがって、特定の実施形態では、バリアは、インサイチュー生成バリアである部分を含み得る。様々な実施形態では、バリアは、少なくとも１つのギャップによって中断され得る。ギャップは、第１の複数のペンの最初のペンの基端開口部と、第２の複数のペンの対応する最初のペンの基端開口部との間に位置合わせされ得る。様々な実施形態では、インサイチュー生成バリアは、細胞が第１のサブチャネルから第２のサブチャネルに及びその逆に移動することを阻止し得る。
別の態様では、マイクロ流体デバイスにおいて微小物体を分離する方法が提供され、本方法は、複数の微小物体を含む第１の流体媒体をマイクロ流体デバイスのエンクロージャに導入するステップであって、エンクロージャは、基板及びフロー領域を含む、ステップと、流動性ポリマーを含む溶液をエンクロージャに導入するステップと、フロー領域の少なくとも１つの選択されたエリアにおいて、流動性ポリマーの固化を活性化し、それによりインサイチュー生成分離構造を形成するステップと、インサイチュー生成分離構造を用いて、複数の微小物体の少なくとも１つを分離するステップとを含む。幾つかの実施形態では、流動性ポリマーの固化を開始するステップは、フロー領域の少なくとも１つの選択されたエリアを光学的に照明することを含み得る。幾つかの実施形態では、流動性ポリマーの固化は、流動性ポリマーのポリマーを重合化してポリマー網目構造にすることを含み得る。流動性ポリマーを導入するステップは、光活性化可能な重合化開始剤を導入することを更に含み得る。
別の態様では、マイクロ流体デバイスにおいて微小物体を分離する方法が提供され、本方法は、基板、マイクロ流体チャネルを含むフロー領域、及び複数の隔離ペンを有するエンクロージャを含むマイクロ流体デバイスを提供するステップと、複数の微小物体を含む第１の流体媒体をマイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネルに導入するステップと、複数の微小物体の微小物体を複数の隔離ペンの少なくとも一部に配置し、それにより少なくとも１つの微小物体をそれぞれ含む複数の移入済み隔離ペンを形成するステップと、第２の流体媒体をマイクロ流体チャネルに導入するステップであって、第２の流体媒体は、流動性ポリマーを含む、ステップと、複数の移入済み隔離ペンの少なくとも１つを選択するステップと、少なくとも１つの選択された隔離ペン内の又はそれに隣接する少なくとも第１の選択されたポイントにおいて、流動性ポリマーの重合化を開始するステップであって、流動性ポリマーの重合化ポリマーは、少なくとも１つの微小物体が少なくとも１つの選択された隔離ペンを出ることを阻止する少なくとも部分的なインサイチュー生成バリアを生成する、ステップとを含む。複数の隔離ペンのそれぞれは、分離領域及び接続領域を含み得、接続領域は、マイクロ流体チャネルへの基端開口部と、分離領域への先端開口部とを有する。特定の実施形態では、隔離ペン内の又はそれに隣接する選択されたポイントにおいて流動性ポリマーの重合化を開始することは、隔離ペンの接続領域又は分離領域内で重合化を開始すること、及び／又は接続領域の基端開口部の縁部において若しくはそれに隣接して重合化を開始することを含む。
別の態様では、マイクロ流体デバイスにおいて微小物体を集中させる方法が提供され得、本方法は、基板及び流体媒体を含むように構成されるフロー領域を有するエンクロージャを含むマイクロ流体デバイスを提供するステップと、フロー領域の第１のセクタにインサイチュー生成分離構造を導入するステップであって、インサイチュー生成分離構造は、インサイチュー生成分離構造を通して流体媒体を流し、一方、流体媒体中の少なくとも１つの微小物体がインサイチュー生成分離構造に入る、インサイチュー生成分離構造から出る、及び／又はインサイチュー生成分離構造を通ることを阻止するように構成される、ステップと、流体媒体の第１の容量での第１の複数の微小物体をフロー領域の第１のセクタに導入するステップと、第１の複数の微小物体の少なくとも第１のサブセットをフロー領域の第１のセクタに集中させるステップとを含む。様々な実施形態では、流体媒体の第１の容量は、フロー領域の第１のセクタの容量よりも大きい容量であり得る。
別の態様では、マイクロ流体デバイス内でクローン集団の細胞をアッセイする方法が提供され、本方法は、複数の細胞を含む第１の流体媒体をマイクロ流体デバイスのエンクロージャに導入するステップであって、エンクロージャは、基板、流体媒体を含むように構成されるマイクロ流体チャネルを含むフロー領域、各隔離ペンがマイクロ流体チャネルの第１の側において開くように、互いに隣接して配置される第１の複数の隔離ペン、及び各隔離ペンがマイクロ流体チャネルの第２の逆の側において開くように、互いに隣接して配置される第２の複数の隔離ペンを含む、ステップと、第１の流体媒体及び複数の細胞をマイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネルに流入させるステップと、第１の複数の隔離ペンの隔離ペンのそれぞれに細胞のクローン集団を導入するステップと、第１の複数の隔離ペン内の細胞のクローン集団ごとに、第２の複数の隔離ペンのそれぞれの隔離ペンに少なくとも１つの細胞を移動させるステップと、流動性ポリマーをマイクロ流体チャネルに導入するステップと、マイクロ流体チャネルの長さに沿って流動性ポリマーの固化を活性化し、それにより第１の複数の隔離ペンを超える流体媒体の第１のサブフローを提供するように構成される第１のサブチャネルと、第２の複数の隔離ペンを超える流体媒体の第２のサブフローを提供するように構成される第２のサブチャネルとにマイクロ流体チャネルを分割するインサイチュー生成バリアを形成するステップであって、インサイチュー生成バリアは、細胞が第１のサブチャネルから第２のサブチャネルに及びその逆に移動することを阻止する、ステップと、第２の流体媒体を第２のサブチャネルに流入させるステップであって、第２の流体媒体は、第２の複数の隔離ペンにおける細胞をアッセイするための試剤を含む、ステップと、第２の複数の各隔離ペンにおける細胞をアッセイするステップとを含む。クローン集団を導入するステップは、単一の細胞を第１の複数の隔離ペンのそれぞれに導入することを含み得、且つその単一の細胞を細胞のクローン集団に増殖させることを更に含み得る。
別の態様では、マイクロ流体デバイス内の微小物体を分離するキットが提供され、本キットは、基板及びエンクロージャ内に配置されるフロー領域を有するエンクロージャを含むマイクロ流体デバイスと、流動性ポリマー溶液とを含み、ポリマーは、重合化及び／又は熱誘導ゲル化が可能であり得る。幾つかの実施形態では、流動性ポリマーは、光開始によって重合化するように構成され得る。幾つかの実施形態では、キットは、光活性化可能な重合化開始剤を更に含み得る。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスは、少なくとも１つの隔離ペンを更に含み得る。様々な実施形態では、少なくとも１つの隔離ペンは、分離領域及び接続領域を含み得、接続領域は、フロー領域への基端開口部と、分離領域への先端開口部とを有する。
別の態様では、クローン集団の細胞をアッセイするキットが提供され、本キットは、基板、エンクロージャ内に配置されるチャネルを含むフロー領域、各隔離ペンがマイクロ流体チャネルの第１の側において開くように互いに隣接して配置される第１の複数の隔離ペン、各隔離ペンがマイクロ流体チャネルの第２の逆の側において開くように互いに隣接して配置される第２の複数の隔離ペンを有するエンクロージャを含むマイクロ流体デバイスと、流動性ポリマー溶液とを含み、ポリマーは、重合化及び／又は熱誘導ゲル化が可能である。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスは、マイクロ流体チャネルの第１の側をマイクロ流体チャネルの第２の側から分離するバリアを更に含み得る。幾つかの実施形態では、バリアは、第１の複数のペンの最初のペンのマイクロ流体チャネルへの基端開口部と、第２の複数のペンの最初のペンのマイクロ流体チャネルへの基端開口部との間で位置合わせされた少なくとも１つのギャップによって中断される。
本発明の幾つかの実施形態によるマイクロ流体デバイス及び関連する制御機器と併用されるシステムの例を示す。 本発明の幾つかの実施形態によるマイクロ流体デバイスを示す。 本発明の幾つかの実施形態によるマイクロ流体デバイスを示す。 本発明の幾つかの実施形態による隔離ペンを示す。 本発明の幾つかの実施形態による隔離ペンを示す。 本発明の幾つかの実施形態による詳細な隔離ペンを示す。 本発明の幾つかの他の実施形態による隔離ペンを示す。 本発明の幾つかの他の実施形態による隔離ペンを示す。 本発明の幾つかの他の実施形態による隔離ペンを示す。 本発明の実施形態によるマイクロ流体デバイスを示す。 本発明の実施形態によるマイクロ流体デバイスの被覆面を示す。 本発明の幾つかの実施形態による、マイクロ流体デバイスと併用されるシステム及び関連する制御機器の具体例を示す。 本発明の幾つかの実施形態による撮像デバイスを示す。 インサイチュー生成分離構造の一実施形態の写真表現である。 マイクロ流体（又はナノ流体）チャネル内のインサイチュー生成分離構造の別の実施形態の写真表現である。 マイクロ流体（又はナノ流体）チャネル内のインサイチュー生成分離構造の別の実施形態の写真表現である。 マイクロ流体（又はナノ流体）チャネル内のインサイチュー生成分離構造の別の実施形態のグラフ表現である。 マイクロ流体（又はナノ流体）チャネル内のインサイチュー生成分離構造の別の実施形態のグラフ表現である。 分離ペンの基端開口部に配置されたマイクロ流体（又はナノ流体）チャネルにおけるインサイチュー生成分離構造の別の実施形態のグラフ表現である。 分離ペンの基端開口部に配置されたマイクロ流体（又はナノ流体）チャネルにおけるインサイチュー生成分離構造の別の実施形態のグラフ表現である。 分離ペン内のインサイチュー生成分離構造の別の実施形態のグラフ表現である。 分離ペン内のインサイチュー生成分離構造の別の実施形態のグラフ表現である。 分離ペン内のインサイチュー生成分離構造の別の実施形態のグラフ表現である。 分離ペン内のインサイチュー生成分離構造の別の実施形態のグラフ表現である。 マイクロ流体（又はナノ流体）フロー領域内のインサイチュー生成分離構造の別の実施形態のグラフ表現である。 マイクロ流体（又はナノ流体）フロー領域内のインサイチュー生成分離構造の別の実施形態のグラフ表現である。 マイクロ流体（又はナノ流体）フロー領域内のインサイチュー生成分離構造の別の実施形態のグラフ表現である。 分離ペン内のインサイチュー生成分離構造の別の実施形態のグラフ表現である。 分離ペン内のインサイチュー生成分離構造の別の実施形態のグラフ表現である。 マイクロ流体（又はナノ流体）フロー領域内のインサイチュー生成分離構造の別の実施形態のグラフ表現である。 マイクロ流体（又はナノ流体）フロー領域内のインサイチュー生成分離構造の別の実施形態のグラフ表現である。 マイクロ流体（又はナノ流体）デバイスのフロー領域におけるマイクロ流体チャネル内のインサイチュー生成分離構造の別の実施形態のグラフ表現である。 マイクロ流体（又はナノ流体）デバイスのフロー領域におけるマイクロ流体チャネル内のインサイチュー生成分離構造の別の実施形態のグラフ表現である。 マイクロ流体（又はナノ流体）デバイスのフロー領域におけるマイクロ流体チャネル内のインサイチュー生成分離構造の別の実施形態のグラフ表現である。 マイクロ流体（又はナノ流体）チャネル内のインサイチュー生成分離構造の別の実施形態のグラフ表現である。 マイクロ流体（又はナノ流体）チャネル内のインサイチュー生成分離構造の別の実施形態のグラフ表現である。 マイクロ流体（又はナノ流体）チャネル内のインサイチュー生成分離構造の別の実施形態のグラフ表現である。 分離ペン内のインサイチュー生成分離構造の別の実施形態のグラフ表現である。 マイクロ流体（又はナノ流体）フロー領域内のインサイチュー生成分離構造の別の実施形態のグラフ表現である。 インサイチュー生成分離構造を使用する高速プロトタイプされたマイクロ流体（又はナノ流体）エンクロージャの写真表現である。 マイクロ流体（又はナノ流体）フロー領域内のインサイチュー生成分離構造の他の実施形態のグラフ表現である。 マイクロ流体（又はナノ流体）フロー領域内のインサイチュー生成分離構造の他の実施形態のグラフ表現である。 マイクロ流体（又はナノ流体）デバイスの分離ペン内のインサイチュー生成分離構造の他の実施形態のグラフ表現である。 マイクロ流体（又はナノ流体）デバイスの分離ペン内のインサイチュー生成分離構造の他の実施形態のグラフ表現である。 本発明の実施形態による、マイクロ流体（又はナノ流体）デバイスのインサイチュー生成分離構造の写真表現である。 本発明の実施形態による、マイクロ流体（又はナノ流体）デバイスのインサイチュー生成分離構造の写真表現である。 本発明の実施形態による、マイクロ流体（又はナノ流体）デバイスのインサイチュー生成分離構造の写真表現である。 マイクロ流体（又はナノ流体）デバイスの隔離ペン内のインサイチュー生成分離構造の実施形態の写真表現である。
発明の詳細な記述
本明細書は、本発明の例示的な実施形態及び適用を記載する。しかし、本発明は、これらの例示的な実施形態及び適用又は例示的な実施形態及び適用が動作する様式又は本明細書で記載される様式に限定されない。更に、図は簡易図又は部分図を示し得、図中の要素の寸法は、明確にするために、誇張又は他の方法で一定の縮尺ではないことがある。更に、「上」、「付着される」、又は「結合される」という用語が本明細書で使用される場合、ある要素（例えば、材料、層、基板等）は、直接他の要素上にあるか、付着されるか、若しくは結合されるか、それともある要素と他の要素との間に１つ又は複数の介在要素があるかに関係なく、他の要素「上」にあり、それに「付着され」、又はそれに「結合される」ことができる。また、方向（例えば、上方、下方、頂部、底部、横、アップ、ダウン、下、上、上部、下部、水平、垂直、「ｘ」、「ｙ」、「ｚ」等）は、提供される場合、相対的なものであり、限定としてではなく単なる例として、且つ説明及び考察を容易にするためにのみ提供される。更に、要素のリスト（例えば、要素ａ、ｂ、ｃ）が参照される場合、そのような参照は、それ自体により列挙される要素の任意の１つ、列挙された要素の全て未満の任意の組合せ、及び／又は列挙された要素の全ての組合せを含むことが意図される。
本明細書でのセクション分割は、検討を容易にするためのみのものであり、考察される要素のいかなる組合せも限定しない。
本明細書で使用される場合、「実質的に」は、意図される目的で十分に機能することを意味する。したがって、「実質的に」という用語は、当業者により予期されるが、全体性能にそれほど影響しない等の絶対的又は完全な状態、寸法、測定、結果等からの小さくわずかな変動を可能にする。数値又は数値として表現することができるパラメータ若しくは特徴に関して使用される場合、「実質的に」は、１０％以内を意味する。
本明細書で使用される場合、「１つ（one）」という用語は２つ以上を意味する。本明細書で使用される場合、「複数」という用語は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれを上回ることができる。
本明細書で使用される場合、μｍはマイクロメートルを意味し、μｍ３は立方マイクロメートルを意味し、ｐＬはピコリットルを意味し、ｎＬはナノリットルを意味し、μＬ（又はｕＬ）はマイクロリットルを意味する。
本明細書で使用される場合、「透明」という用語は、可視光が透過する際、可視光を実質的に変更せずに透過させる材料を指す。
本明細書で使用される場合、「配置される」という用語は、その意味内に「位置する」を含む。
本明細書で使用される場合、「ナノ流体デバイス」又は「ナノ流体装置」は、約１マイクロリットル未満、例えば、約７５０ｎＬ未満、約５００ｎＬ未満、約２５０ｎＬ未満、約２００ｎＬ未満、約１５０ｎＬ未満、約１００ｎＬ未満、約７５ｎＬ未満、約５０ｎＬ未満、約２５ｎＬ未満、約２０ｎＬ未満、約１５ｎＬ未満、約１０ｎＬ未満、約９ｎＬ未満、約８ｎＬ未満、約７ｎＬ未満、約６ｎＬ未満、約５ｎＬ未満、約４ｎＬ未満、約３ｎＬ未満、約２ｎＬ未満、約１ｎＬ未満、又はそれ未満の容量の流体を保持するように構成された、限定ではなく、領域、流路、チャネル、チャンバ、及び／又はペンを含む少なくとも１つ回路要素を含むマイクロ流体回路を有するタイプのマイクロ流体デバイスである。ナノ流体デバイスは、複数の回路要素（例えば、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１０００個、１５００個、２０００個、２５００個、３０００個、３５００個、４０００個、４５００個、５０００個、６０００個、７０００個、８０００個、９０００個、１０，０００個、又はこれを超える）を含み得る。特定の実施形態では、少なくとも１つの回路要素の１つ又は複数（例えば、全て）は、約２０ｎＬ〜２００ｎＬ、約１００ｐＬ〜１ｎＬ、約１００ｐＬ〜２ｎＬ、約１００ｐＬ〜５ｎＬ、約２５０ｐＬ〜２ｎＬ、約２５０ｐＬ〜５ｎＬ、約２５０ｐＬ〜１０ｎＬ、約５００ｐＬ〜５ｎＬ、約５００ｐＬ〜１０ｎＬ、約５００ｐＬ〜１５ｎＬ、約７５０ｐＬ〜１０ｎＬ、約７５０ｐＬ〜１５ｎＬ、約７５０ｐＬ〜２０ｎＬ、約１ｎＬ〜１０ｎＬ、約１ｎＬ〜１５ｎＬ、約１ｎＬ〜２０ｎＬ、約１ｎＬ〜２５ｎＬ、又は約１ｎＬ〜５０ｎＬの容量の流体を保持するように構成される。他の実施形態では、少なくとも１つの回路要素の１つ又は複数（例えば、全て）は、約１００ｎＬ〜２００ｎＬ、約１００ｎＬ〜３００ｎＬ、約１００ｖ〜４００ｎＬ、約１００ｎＬ〜５００ｎＬ、約２００ｎＬ〜３００ｎＬ、約２００ｎＬ〜４００ｎＬ、約２００ｎＬ〜５００ｎＬ、約２００ｎＬ〜６００ｎＬ、約２００ｎＬ〜７００ｎＬ、約２５０ｎＬ〜４００ｎＬ、約２５０ｎＬ〜５００ｎＬ、約２５０ｎＬ〜６００ｎＬ、又は約２５０ｎＬ〜７５０ｎＬの容量の流体を保持するように構成される。
本明細書で使用される場合、「流路」は、媒体の流れの軌道を画定し、媒体の流れの軌道を受ける１つ又は複数の流体的に接続された回路要素（例えば、チャネル、領域、及びチャンバ等）を指す。したがって、流路は、マイクロ流体デバイスの掃引領域の例である。他の回路要素（例えば、非掃引領域）は、流路における媒体の流れを受けることなく、流路を含む回路要素と流体的に接続し得る。
「マイクロ流体チャネル」又は「フローチャネル」は、本明細書では、水平寸法及び垂直寸法の両方よりもはるかに長い長さを有するマイクロ流体デバイスのフロー領域を指す。例えば、フローチャネルは、水平寸法又は垂直寸法のいずれか一方の長さの少なくとも５倍、例えば、長さの少なくとも１０倍、長さの少なくとも２５倍、長さの少なくとも１００倍、長さの少なくとも２００倍、長さの少なくとも５００倍、長さの少なくとも１，０００倍、長さの少なくとも５，０００倍、又はそれを超える長さであり得る。幾つかの実施形態では、フローチャネルの長さは、その間の任意の範囲を含む約１０，０００ミクロン〜約５００，０００ミクロンの範囲である。幾つかの実施形態では、水平寸法は約１００ミクロン〜約１０００ミクロン（例えば、約１５０ミクロン〜約５００ミクロン）の範囲であり、垂直寸法は約２５ミクロン〜約２００ミクロンの範囲、例えば、約４０ミクロン〜約１５０ミクロンの範囲である。なお、フローチャネルは、マイクロ流体デバイスにおいて様々な異なる空間構成を有し得、したがって、完全に線形の要素に限定されない。例えば、フローチャネルは、以下の構成を有する１つ又は複数のセクションであり得るか、又はそれを含み得る：曲線、湾曲、螺旋、傾斜、下降、フォーク形（例えば、複数の異なる流路）、及びそれらの任意の組合せ。加えて、フローチャネルは、経路に沿って異なる断面積を有し、広がり及び収縮して所望の流体フローを内部に提供し得る。
本明細書で使用される場合、「障害物」という用語は、一般に、マイクロ流体デバイス内の２つの異なる領域又は回路要素間の標的微小物体の移動を部分的に（完全にではなく）妨げるのに十分に大きいバンプ又は同様のタイプの構造物を指す。２つの異なる領域／回路要素は、例えば、マイクロ流体隔離ペンの接続領域及び分離領域であり得る。
本明細書で使用される場合、「狭窄」という用語は、一般に、マイクロ流体デバイスでの回路要素（又は２つの回路要素間の界面）の幅の狭まりを指す。狭窄は、例えば、隔離領域と本発明のマイクロ流体隔離ペンの接続領域との間の界面に配置することができる。
流体培地を参照して本明細書で使用される場合、「拡散する」及び「拡散」は、濃度勾配の低い方への流体培地の成分の熱力学的運動を指す。
「培地のフロー」という語句は、拡散以外の任意の機構に主に起因した流体培地のバルク移動を意味する。例えば、培地のフローは、ある箇所から別の箇所への、箇所間の圧力差に起因した流体培地の移動を含むことができる。そのようなフローは、液体の連続、パルス、周期的、ランダム、断続的、若しくは往復フロー、又はそれらの任意の組合せを含むことができる。ある流体培地が別の流体培地に流れる場合、培地の乱流又は混合が生じ得る。
「実質的にフローがない」という語句は、時間にわたり平均されて、流体培地内への又は流体培地内での材料（例えば、関心のある分析物）の成分の拡散率未満である流体培地の流量を指す。そのような材料の成分の拡散率は、例えば、温度、成分のサイズ、及び成分と流体培地との相互作用の強さに依存し得る。
マイクロ流体デバイス内の異なる領域を参照して本明細書で使用される場合、「流体接続される」という語句は、異なる領域が流体培地等の流体で実質的に充填される場合、各領域内の流体が連通して単一の流体を形成することを意味する。これは、異なる領域内の流体（又は流体培地）が必ずしも組成物内で同一であることを意味しない。むしろ、マイクロ流体デバイスの異なる流体接続領域内の流体は、流束内にある異なる組成物（例えば、タンパク質、炭水化物、鉄、又は他の分子等の異なる濃度の溶質）を有することができ、その理由は、溶質が各濃度勾配を下がって移動し、及び／又は流体がデバイスを通って流れるためである。
マイクロ流体（又はナノ流体）デバイスは、「掃引」領域及び「非掃引」領域を含むことができる。本明細書で使用される場合、「掃引」領域は、マイクロ流体回路の流体相互接続された１つ又は複数の回路要素で構成され、各回路要素は、流体がマイクロ流体回路を通って流れているとき、培地のフローを経験する。掃引領域の回路要素は、例えば、領域、チャネル、及びチャンバの全て又は部分を含むことができる。本明細書で使用される場合、「非掃引」領域は、マイクロ流体回路の流体的に相互接続された１つ又は複数の回路要素で構成され、各回路要素は、流体がマイクロ流体回路を通って流れているとき、流束を実質的に経験しない。非掃引領域は、流体接続が、拡散を可能にするが、掃引領域と非掃引領域との間で実質的に培地が流れないように構造化される場合、掃引領域に流体接続することができる。したがって、マイクロ流体デバイスは、実質的に掃引領域と非掃引領域との間での拡散連通のみを可能にしながら、非掃引領域を掃引領域での培地のフローから実質的に分離するように構造化することができる。例えば、マイクロ流体デバイスのフローチャネルは掃引領域の例であり、一方、マイクロ流体デバイスの分離領域（更に詳細に後述する）は非掃引領域の例である。
そのようなマイクロ流体デバイスにおいて、特定の生物学的材料（例えば、抗体等のタンパク質）を生成する生物学的微小物体（例えば、生体細胞）の能力をアッセイすることができる。アッセイの特定の実施形態では、対象となる検体の生成についてアッセイされる生物学的微小物体（例えば、細胞）を含む試料材料は、マイクロ流体デバイスの掃引領域に装填することができる。特定の特性について、生物学的微小物体（例えば、ヒト細胞等の哺乳類細胞）の微小物体を選択し、非掃引領域に配置することができる。次に、残りの試料材料を掃引領域から流出させることができ、アッセイ材料を掃引領域に流入させることができる。選択された生物学的微小物体は、非掃引領域にあるため、残りの試料材料の流出又はアッセイ材料の流入による影響を略受けない。選択された生物学的微小物体による対象となる検体の生成を可能にすることができ、検体は非掃引領域から掃引領域中に拡散することができ、掃引領域において、対象となる検体はアッセイ材料と反応して、検出可能な局所反応を生成することができ、各局所反応は特定の非掃引領域に相関付けることができる。選択された反応に関連する任意の非掃引領域を分析して、非掃引領域中の生物学的微小物体のうち、対象となる検体の十分な生産細胞がある場合、それがいずれであるかを特定することができる。
本明細書で使用される場合、「微小物体」という用語は、一般に、本発明により分離及び／又は操作し得る任意の顕微鏡的物体を指す。微小物体の非限定的な例としては、微粒子；微小ビーズ（例えば、ポリスチレンビーズ、Luminex（商標）ビーズ等）；磁性ビーズ；微小ロッド；微小ワイヤ；量子ドット等の無生物微小物体、細胞；生物学的細胞小器官；ベシクル又は複合体；合成ベシクル；リポソーム（例えば、合成又は膜標本由来）；脂質ナノクラフト（lipid nanocraft）等の生物学的微小物体、又は無生物微小物体と生物学的微小物体との組合せ（例えば、細胞に付着した微小ビーズ、リポソームコーティング微小ビーズ、リポソームコーティング磁性ビーズ等）が挙げられる。ビーズは、蛍光標識、タンパク質、炭水化物、抗原、小分子シグナリング部分、又はアッセイで使用可能な他の化学／生物種等の共有結合又は非共有結合した部分／分子を含み得る。脂質ナノクラフトは、例えば、Ritchieら著、（２００９）“Reconstitution of Membrane Proteins in Phospholipid Bilayer Nanodiscs”，Methods Enzymol.，464:211-231において説明されている。
本明細書で使用される場合、「細胞」という用語は「生体細胞」と同義で使用される。生体細胞の非限定的な例としては、真核細胞、植物細胞、哺乳類細胞、爬虫類細胞、鳥類細胞、魚類細胞等の動物細胞、原核細胞、細菌細胞、真菌細胞、原生細胞等、筋肉、軟骨組織、脂肪、皮膚、肝臓、肺、神経組織等の組織から解離された細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ等の免疫細胞、胚（例えば、接合子）、卵母細胞、卵子、精子細胞、ハイブリドーマ、培養細胞、細胞株からの細胞、がん細胞、感染細胞、トランスフェクト細胞及び／又は形質転換細胞、レポーター細胞等が挙げられる。哺乳類細胞は、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、霊長類等からの細胞であり得る。
生体細胞のコロニーは、生殖可能なコロニー内の生細胞の全てが単一の親細胞由来の娘細胞である場合、「クローン」である。特定の実施形態では、クローンコロニー内の全ての娘細胞は、１０以下の細胞分裂での単一の親細胞からのものである。他の実施形態では、クローンコロニー内の全ての娘細胞は、１４以下の細胞分裂での単一の親細胞からのものである。他の実施形態では、クローンコロニー内の全ての娘細胞は、１７以下の細胞分裂での単一の親細胞からのものである。他の実施形態では、クローンコロニー内の全ての娘細胞は、２０以下の細胞分裂での単一の親細胞からのものである。「クローン細胞」という用語は、同じクローンコロニーの細胞を指す。
本明細書で使用される場合、生体細胞の「コロニー」は、２つ以上の細胞（例えば、約２〜約２０個、約４〜約４０個、約６〜約６０個、約８〜約８０個、約１０〜約１００個、約２０〜約２００個、約４０〜約４００個、約６０〜約６００個、約８０〜約８００個、約１００〜約１０００個、又は約１０００個を超える細胞）を指す。
本明細書で使用される場合、「細胞を維持する」という用語は、細胞を生存した状態に保ち、及び／又は増殖させるのに必要な状況を提供する流体成分及びガス成分の両方並びに任意選択的に表面を含む環境を提供することを指す。
本明細書で使用される場合、「増殖」という用語は、細胞を指す場合、細胞数の増大を指す。
本明細書で使用される場合、「処理」という用語は、細胞の処理を指す場合、細胞の培養又は培養の継続、１つ又は複数のアッセイを使用した細胞のアッセイ、及び／又は溶解、融合、形質転換、任意の種類の遺伝子編集（例えば、標的遺伝子編集）、及び／又は遺伝子型判定等であるがこれに限定されない手順への細胞の準備を含み得る。
本明細書で使用される場合、「微小物体の分離」という用語は、マイクロ流体デバイス内の画定エリアに微小物体を閉じ込めることを意味する。微小物体は、それでもなお画定リア内（例えば、インサイチュー生成分離構造内）で動くことが可能であり得る。
本明細書で使用される場合、「抗体」は、免疫グロブリン（Ｉｇ）を指し、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方、霊長類化（例えば、ヒト化）抗体、ネズミ抗体、マウス−ヒト抗体、マウス−霊長類抗体、並びにキメラ抗体を含み、完全な分子、その断片（ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ）’２断片等）、又は完全な分子及び／又は断片の多量体若しくは凝集体であり得、天然に存在するか、又は免疫処置、合成若しくは遺伝子操作等によって製造することができる。本明細書で使用される場合、「抗体断片」は、抗原を結合する、抗体に由来又は抗体に関係する断片を指し、幾つかの実施形態では、例えば、ガラクトース残基の組み入れにより、クリアランス及び取り込みを容易にする構造上の特徴を示すように誘導体化し得る。これには、例えば、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）’２、ｓｃＦｖ、軽鎖可変領域（ＶＬ）、重鎖可変領域（ＶＨ）、及びそれらの組合せが含まれる。
流体媒体の「成分」は、溶媒分子、イオン、小分子、抗生物質、ヌクレオチド及びヌクレオシド、核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、糖、炭水化物、脂質、脂肪酸、コレステロール、代謝産物等を含む、媒体に存在する任意の化学分子又は生物分子である。
本明細書で使用される場合、「捕捉部分」は、微小物体の認識部位を提供する化学種、生物種、機能、又はモチーフである。選択されたクラスの微小物体は、捕捉部分を認識し得、捕捉部分に結合するか、又は捕捉部分への親和性を有し得る。非限定的な例として、抗原、抗体、及び細胞表面結合モチーフが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「流動性ポリマー」は、流体媒体内で溶解可能又は分散可能なポリマーモノマー又はマクロマーである。流動性ポリマーは、マイクロ流体フロー領域に流入し得、内部の流体媒体の他の成分と共に流れ得る。
本明細書で使用される場合、「光開始ポリマー」は、光に露出されると共有結合的に架橋し、特定の共有結合を形成し、硬質化化学モチーフの周囲の位置化学を変更し、又は物理的状態を変更させるイオン対を形成し、それによりポリマー網目構造を形成可能なポリマー（又はポリマーの生成に使用することができる単量体分子）を指す。幾つかの場合、光開始ポリマーは、共有結合的に架橋し、特定の共有結合を形成し、硬質化化学モチーフの周囲の位置化学を変更し、又は物理的状態を変更させるイオン対を形成することが可能な１つ又は複数の化学部分に結合するポリマーセグメントを含み得る。幾つかの場合、光開始ポリマーは、ポリマー網目構造の形成を開始する（例えば、ポリマーの重合化を介して）ために、光活性化可能なラジカル開始剤を必要とし得る。
マイクロ流体デバイス及びそのようなデバイスを操作し観測するシステム
図１Ａは、卵子、及び／又は卵母細胞、及び／又は精子の選択及び評価を含め、インビトロでの胚の生成に使用することができるマイクロ流体デバイス１００及びシステム１５０の例を示す。カバー１１０を一部切り欠き、マイクロ流体デバイス１００内の部分図を提供するマイクロ流体デバイス１００の斜視図を示す。マイクロ流体デバイス１００は、一般に、流路１０６を含むマイクロ流体回路１２０を含み、流路１０６を通って流体培地１８０が流れることができ、任意選択的に１つ又は複数の微小物体（図示せず）をマイクロ流体回路１２０内及び／又はマイクロ流体回路１２０を通して搬送する。１つのマイクロ流体回路１２０が図１Ａに示されているが、適するマイクロ流体デバイスは、複数（例えば、２又は３個）のそのようなマイクロ流体回路を含むことができる。それに関係なく、マイクロ流体デバイス１００はナノ流体デバイスであるように構成され得る。図１Ａに示されるように、マイクロ流体回路１２０は、複数のマイクロ流体隔離ペン１２４、１２６、１２８、及び１３０を含み得、ここで、各隔離ペンは、流路１０６に流体接続する１つ又は複数の開口部を有し得る。図１Ａのデバイスの幾つかの実施形態では、隔離ペンは、流路１０６と流通する１つのみの開口部を有し得る。更に以下で考察するように、マイクロ流体隔離ペンは、培地１８０が流路１０６を通って流れているときであっても、マイクロ流体デバイス１００等のマイクロ流体デバイスに微小物体を保持するように最適化された様々な特徴及び構造を含む。しかし、上記を参照する前に、マイクロ流体デバイス１００及びシステム１５０の概説を提供する。
図１Ａに概して示されるように、マイクロ流体回路１２０はエンクロージャ１０２により画定される。エンクロージャ１０２は異なる構成で物理的に構造化することができるが、図１Ａに示される例では、エンクロージャ１０２は、支持構造体１０４（例えば、基部）、マイクロ流体回路構造１０８、及びカバー１１０を含むものとして示されている。支持構造体１０４、マイクロ流体回路構造１０８、及びカバー１１０は、互いに取り付けることができる。例えば、マイクロ流体回路構造１０８は、支持構造体１０４の内面１０９に配置することができ、カバー１１０は、マイクロ流体回路構造１０８を覆って配置することができる。支持構造体１０４及びカバー１１０と一緒に、マイクロ流体回路構造１０８は、マイクロ流体回路１２０の要素を画定することができる。
図１Ａに示されるように、支持構造体１０４は、マイクロ流体回路１２０の下部にあり得、カバー１１０はマイクロ流体回路１２０の上部にあり得る。代替的に、支持構造体１０４及びカバー１１０は、他の向きで構成され得る。例えば、支持構造体１０４は、マイクロ流体回路１２０の上部にあり得、カバー１１０はマイクロ流体回路１２０の下部にあり得る。それに関係なく、それぞれがエンクロージャ１０２内又は外への通路を含む１つ又は複数のポート１０７があり得る。通路の例としては、弁、ゲート、貫通孔等が挙げられる。示されるように、ポート１０７は、マイクロ流体回路構造１０８のギャップにより作られる貫通孔である。しかし、ポート１０７は、カバー１１０等のエンクロージャ１０２の他の構成要素に配置することができる。１つのみのポート１０７が図１Ａに示されているが、マイクロ流体回路１２０は２つ以上のポート１０７を有することができる。例えば、流体がマイクロ流体回路１２０に入るための流入口として機能する第１のポート１０７があり得、流体がマイクロ流体回路１２０を出るための流出口として機能する第２のポート１０７があり得る。ポート１０７が流入口として機能するか、それとも流出口として機能するかは、流体が流路１０６を通って流れる方向に依存し得る。
支持構造体１０４は、１つ又は複数の電極（図示せず）と、基板又は複数の相互接続された基板を含むことができる。例えば、支持構造体１０４は、１つ又は複数の半導体基板を含むことができ、各半導体基板は電極に電気的に接続される（例えば、半導体基板の全て又はサブセットは、１つの電極に電気的に接続することができる）。支持構造体１０４は、プリント回路基板組立体（「ＰＣＢＡ」）を更に含むことができる。例えば、半導体基板はＰＣＢＡ上に搭載することができる。
マイクロ流体回路構造１０８は、マイクロ流体回路１２０の回路要素を画定することができる。そのような回路要素は、マイクロ流体回路１２０に流体が充填される場合、流体的に相互接続することができる、フロー領域（１つ又は複数のフローチャネルを含み得る）、チャンバ、ペン、トラップ等の空間又は領域を含むことができる。図１Ａに示されるマイクロ流体回路１２０では、マイクロ流体回路１０８は、枠１１４及びマイクロ流体回路材料１１６を含む。枠１１４は、マイクロ流体回路材料１１６を部分的又は完全に囲むことができる。枠１１４は、例えば、マイクロ流体回路材料１１６を実質的に囲む比較的剛性の構造であり得る。例えば、枠１１４は金属材料を含むことができる。
マイクロ流体回路材料１１６には、キャビティ等をパターニングして、マイクロ流体回路１２０の回路要素及び相互接続を画定することができる。マイクロ流体回路材料１１６は、ガス透過可能であり得る可撓性ポリマー（例えば、ゴム、プラスチック、エラストマー、シリコーン、ポリジメチルシロキサン（「ＰＤＭＳ」）等）等の可撓性材料を含むことができる。マイクロ流体回路材料１１６を構成することができる材料の他の例としては、成形ガラス、シリコーン（フォトパターニング可能シリコーン又は「ＰＰＳ」）等のエッチング可能材料、フォトレジスト（例えば、ＳＵ８）等が挙げられる。幾つかの実施形態では、そのような材料 − したがって、マイクロ流体回路材料１１６ − は、剛性及び／又はガスを実質的に不透過であり得る。それに関係なく、マイクロ流体回路材料１１６は、支持構造体１０４上及び枠１１４内部に配置することができる。
カバー１１０は、枠１１４及び／又はマイクロ流体回路材料１１６の一体部分であり得る。代替的に、カバー１１０は、図１Ａに示されるように、構造的に別個の要素であり得る。カバー１１０は、枠１１４及び／又はマイクロ流体回路材料１１６と同じ又は異なる材料を含むことができる。同様に、支持構造体１０４は、示されるように枠１１４若しくはマイクロ流体回路材料１１６とは別個の構造であってもよく、又は枠１１４若しくはマイクロ流体回路材料１１６の一体部分であってもよい。同様に、枠１１４及びマイクロ流体回路材料１１６は、図１Ａに示されるように別個の構造であってもよく、又は同じ構造の一体部分であってもよい。
幾つかの実施形態では、カバー１１０は剛性材料を含むことができる。剛性材料は、ガラス又は同様との特性を有する材料であり得る。幾つかの実施形態では、カバー１１０は変形可能材料を含むことができる。変形可能材料は、ＰＤＭＳ等のポリマーであり得る。幾つかの実施形態では、カバー１１０は、剛性材料及び変形可能材料の両方を含むことができる。例えば、カバー１１０の１つ又は複数の部分（例えば、隔離ペン１２４、１２６、１２８、１３０上に位置する１つ又は複数の部分）は、カバー１１０の剛性材料と界面を接する変形可能材料を含むことができる。幾つかの実施形態では、カバー１１０は１つ又は複数の電極を更に含むことができる。１つ又は複数の電極は、ガラス又は同様の絶縁材料でコーティングし得る、インジウム−錫−酸化物（ＩＴＯ）等の導電性酸化物を含むことができる。代替的に、１つ又は複数の電極は、ポリマー（例えば、ＰＤＭＳ）等の変形可能ポリマーに埋め込まれた単層ナノチューブ、多層ナノチューブ、ナノワイヤ、導電性ナノ粒子のクラスタ、又はそれらの組合せ等の可撓性電極であり得る。マイクロ流体デバイスで使用することができる可撓性電極は、例えば、米国特許出願公開第２０１２／０３２５６６５号（Chiouら）に記載されており、この内容は参照により本明細書に援用される。幾つかの実施形態では、カバー１１０は、細胞の接着、生存、及び／又は成長を支持するように変更することができる（例えば、マイクロ流体回路１２０に向かって内側に面する表面の全て又は部分を調整することにより）。変更は、合成ポリマー又は天然ポリマーのコーティングを含み得る。幾つかの実施形態では、カバー１１０及び／又は支持構造体１０４は、光を透過することができる。カバー１１０は、ガス透過可能な少なくとも１つの材料（例えば、ＰＤＭＳ又はＰＰＳ）を含むこともできる。
図１Ａは、マイクロ流体デバイス１００等のマイクロ流体デバイスを動作させ制御するシステム１５０も示す。システム１５０は、電源１９２、撮像デバイス１９４（撮像モジュール１６４内に組み込まれ、デバイス１９４自体は図１Ａに示されていない）、及び傾斜デバイス１９０（傾斜モジュール１６６の部分であり、デバイス１９０は図１に示されていない）を含む。
電源１９２は、電力をマイクロ流体デバイス１００及び／又は傾斜デバイス１９０に提供し、バイアス電圧又は電流を必要に応じて提供することができる。電源１９２は、例えば、１つ又は複数の交流（ＡＣ）及び／又は直流（ＤＣ）電圧源又は電流源を含むことができる。撮像デバイス１９４（以下で述べられる撮像モジュール１６４の一部）は、マイクロ流体回路１２０内部の画像を捕捉する、デジタルカメラ等のデバイスを含むことができる。幾つかの場合、撮像デバイス１９４は、高速フレームレート及び／又は高感度（例えば、低光用途用）を有する検出器を更に含む。撮像デバイス１９４は、刺激放射線及び／又は光線をマイクロ流体回路１２０内に向け、マイクロ流体回路１２０（又はマイクロ流体回路１２０内に含まれる微小物体）から反射されるか、又は発せられる放射線及び／又は光線を収集する機構を含むこともできる。発せられる光線は可視スペクトル内であり得、例えば、蛍光放射を含み得る。反射光線は、ＬＥＤ又は水銀灯（例えば、高圧水銀灯）若しくはキセノンアーク灯等の広域スペクトル灯から発せられた反射放射を含み得る。図３Ｂに関して考察するように、撮像デバイス１９４は顕微鏡（又は光学縦列）を更に含み得、これは接眼レンズを含んでもよく、又は含まなくてもよい。
システム１５０は、１つ又は複数の回転軸の周りでマイクロ流体デバイス１００を回転させるように構成される傾斜デバイス１９０（以下で述べられる傾斜モジュール１６６の一部）を更に含む。幾つかの実施形態では、傾斜デバイス１９０は、マイクロ流体デバイス１００（したがって、マイクロ流体回路１２０）を水平向き（すなわち、ｘ軸及びｙ軸に相対して０°）、垂直向き（すなわち、ｘ軸及び／又はｙ軸に相対して９０°）、又はそれらの間の任意の向きで保持することができるように、少なくとも１つの軸の周りでマイクロ流体回路１２０を含むエンクロージャ１０２を支持及び／又は保持するように構成される。軸に相対するマイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）の向きは、本明細書では、マイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）の「傾斜」と呼ばれる。例えば、傾斜デバイス１９０は、ｘ軸に相対して０．１°、０．２°、０．３°、０．４°、０．５°、０．６°、０．７°、０．８°、０．９°、１°、２°、３°、４°、５°、１０°、１５°、２０°、２５°、３０°、３５°、４０°、４５°、５０°、５５°、６０°、６５°、７０°、７５°、８０°、９０°、又はそれらの間の任意の度数でマイクロ流体デバイス１００を傾斜させることができる。水平向き（したがって、ｘ軸及びｙ軸）は、重力により定義される垂直軸に垂直なものとして定義される。傾斜デバイスは、マイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）をｘ軸及び／又はｙ軸に相対して９０°よりも大きい任意の角度に傾斜させるか、又はマイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）をｘ軸若しくはｙ軸に相対して１８０°に傾斜させて、マイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）を真逆にすることもできる。同様に、幾つかの実施形態では、傾斜デバイス１９０は、流路１０６又はマイクロ流体回路１２０の何らかの他の部分により定義される回転軸の周りでマイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）を傾斜させる。
幾つかの場合、マイクロ流体デバイス１００は、流路１０６が１つ又は複数の隔離ペンの上方又は下方に位置するように、垂直向きに傾斜する。「上方」という用語は、本明細書で使用される場合、流路１０６が、重力により定義される垂直軸上で１つ又は複数の隔離ペンよりも高く位置する（すなわち、流路１０６の上方の隔離ペン内の物体が流路内の物体よりも高い重力位置エネルギーを有する）ことを示す。「下方」という用語は、本明細書で使用される場合、流路１０６が、重力により定義される垂直軸上で１つ又は複数の隔離ペンよりも下に位置する（すなわち、流路１０６の下方の隔離ペン内の物体が流路内の物体よりも低い重力位置エネルギーを有する）ことを示す。
幾つかの場合、傾斜デバイス１９０は、流路１０６と平行な軸の周りでマイクロ流体デバイス１００を傾斜させる。更に、マイクロ流体デバイス１００は、流路１０６が、隔離ペンの真上又は真下に配置されずに、１つ又は複数の隔離ペンの上方又は下方に配置されるように、９０°未満の角度に傾斜することができる。他の場合、傾斜デバイス１９０は、流路１０６に直交する軸の周りでマイクロ流体デバイス１００を傾斜させる。更に他の場合、傾斜デバイス１９０は、流路１０６に平行でもなく直交もしない軸の周りでマイクロ流体デバイス１００を傾斜させる。
システム１５０は培地源１７８を更に含むことができる。培地源１７８（例えば、容器、リザーバ等）は、それぞれが異なる流体培地１８０を保持する複数のセクション又は容器を含むことができる。したがって、培地源１７８は、図１Ａに示されるように、マイクロ流体デバイス１００の外部にある、マイクロ流体デバイス１００とは別個のデバイスであり得る。代替的に、培地源１７８は、全体的又は部分的に、マイクロ流体デバイス１００のエンクロージャ１０２内部に配置することができる。例えば、培地源１７８は、マイクロ流体デバイス１００の部分であるリザーバを含むことができる。
図１Ａは、システム１５０の一部を構成し、マイクロ流体デバイス１００と併せて利用することができる制御及び監視機器１５２の例の簡易ブロック図表現も示す。示されるように、そのような制御及び監視機器１５２の例は、培地源１７８を制御する培地モジュール１６０と、マイクロ流体回路１２０での微小物体（図示せず）及び／又は培地（例えば、培地の液滴）の移動及び／又は選択を制御する原動モジュール１６２と、画像（例えば、デジタル画像）を捕捉する撮像デバイス１９４（例えば、カメラ、顕微鏡、光源、又はそれらの任意の組合せ）を制御する撮像モジュール１６４と、傾斜デバイス１９０を制御する傾斜モジュール１６６とを含むマスタコントローラ１５４を含む。制御機器１５２は、マイクロ流体デバイス１００に関する他の機能を制御、監視、又は実行する他のモジュール１６８を含むこともできる。示されるように、機器１５２は、表示デバイス１７０及び入／出力デバイス１７２を更に含むことができる。
マスタコントローラ１５４は、制御モジュール１５６及びデジタルメモリ１５８を含むことができる。制御モジュール１５６は、例えば、メモリ１５８内に非一時的データ又は信号として記憶される機械実行可能命令（例えば、ソフトウェア、ファームウェア、ソースコード等）に従って動作するように構成されるデジタルプロセッサを含むことができる。代替的に又は追加として、制御モジュール１５６は、ハードワイヤードデジタル回路及び／又はアナログ回路を含むことができる。培地モジュール１６０、原動モジュール１６２、撮像モジュール１６４、傾斜モジュール１６６、及び／又は他のモジュール１６８は、同様に構成され得る。したがって、マイクロ流体デバイス１００又は任意の他のマイクロ流体装置に関して実行されるものとして本明細書で考察される機能、プロセス、行動、動作、又はプロセスのステップは、上述したように構成されるマスタコントローラ１５４、培地モジュール１６０、原動モジュール１６２、撮像モジュール１６４、傾斜モジュール１６６、及び／又は他のモジュール１６８の任意の１つ又は複数により実行され得る。同様に、マスタコントローラ１５４、培地モジュール１６０、原動モジュール１６２、撮像モジュール１６４、傾斜モジュール１６６、及び／又は他のモジュール１６８は、通信可能に結合されて、本明細書において考察される任意の機能、プロセス、行動、動作、又はステップで使用されるデータを送受信し得る。
培地モジュール１６０は培地源１７８を制御する。例えば、培地モジュール１６０は、培地源１７８を制御して、選択された流体培地１８０をエンクロージャ１０２に入れる（例えば、流入口１０７を介して）ことができる。培地モジュール１６０は、エンクロージャ１０２からの培地の取り出し（例えば、流出口（図示せず）を通して）を制御することもできる。したがって、１つ又は複数の培地を選択的にマイクロ流体回路１２０に入れ、マイクロ流体回路１２０から搬出することができる。培地モジュール１６０は、マイクロ流体回路１２０内部の流路１０６での流体培地１８０のフローを制御することもできる。例えば、幾つかの実施形態では、培地モジュール１６０は、傾斜モジュール１６６が傾斜デバイス１９０に所望の傾斜角までマイクロ流体デバイス１００を傾斜させる前に、流路１０６内及びエンクロージャ１０２を通る培地１８０のフローを停止させる。
原動モジュール１６２は、マイクロ流体回路１２０での微小物体（図示せず）の選択、捕捉、及び移動を制御するように構成され得る。図１Ｂ及び図１Ｃに関して後述するように、エンクロージャ１０２は、誘電泳動（ＤＥＰ）構成、光電子ピンセット（ＯＥＴ）構成、及び／又は光電子ウェッティング（ＯＥＷ）構成（図１Ａに示されず）を含むことができ、原動モジュール１６２は、電極及び／又はトランジスタ（例えば、フォトトランジスタ）のアクティブ化を制御して、流路１０６及び／又は隔離ペン１２４、１２６、１２８、１３０で微小物体（図示せず）及び／又は培地の液滴（図示せず）を選択し移動させることができる。
撮像モジュール１６４は撮像デバイス１９４を制御することができる。例えば、撮像モジュール１６４は、撮像デバイス１９４から画像データを受信し、処理することができる。撮像デバイス１９４からの画像データは、撮像デバイス１９４により捕捉された任意のタイプの情報を含むことができる（例えば、微小物体、培地の液滴、蛍光標識等の標識の蓄積の有無等）。撮像デバイス１９４により捕捉された情報を使用して、撮像モジュール１６４は、物体（例えば、微小物体、培地の液滴）の位置及び／又はマイクロ流体デバイス１００内のそのような物体の移動速度を更に計算することができる。
傾斜モジュール１６６は、傾斜デバイス１９０の傾斜移動を制御することができる。代替的に又は追加として、傾斜モジュール１６６は、重力を介して１つ又は複数の隔離ペンへの微小物体の移送を最適化するように、傾斜率及びタイミングを制御することができる。傾斜モジュール１６６は、撮像モジュール１６４と通信可能に結合されて、マイクロ流体回路１２０での微小物体及び／又は培地の液滴の移動を記述するデータを受信する。このデータを使用して、傾斜モジュール１６６は、マイクロ流体回路１２０の傾斜を調整して、マイクロ流体回路１２０内で微小物体及び／又は培地の液滴が移動する率を調整し得る。傾斜モジュール１６６は、このデータを使用して、マイクロ流体回路１２０内での微小物体及び／又は培地の液滴の位置を繰り返し調整することもできる。
図１Ａに示される例では、マイクロ流体回路１２０は、マイクロ流体チャネル１２２及び隔離ペン１２４、１２６、１２８、１３０を含むものとして示されている。各ペンは、チャネル１２２への開口部を含むが、ペンがペン内部の微小物体を流体培地１８０及び／又はチャネル１２２の流路１０６又は他のペン内の微小物体から実質的に分離することができるように、その他では閉じられている。隔離ペンの壁は、ベースの内面１０９からカバー１１０の内面まで延び、エンクロージャを提供する。マイクロ流体チャネル１２２へのペンの開口部は、フロー１０６がペン内に向けられないように、フロー１０６に対して傾斜して向けられる。フローは、ペンの開口部の平面に対して接線方向にあり得るか又は直交し得る。幾つかの場合、ペン１２４、１２６、１２８、１３０は、１つ又は複数の微小物体をマイクロ流体回路１２０内に物理的に囲い入れるように構成される。本発明による隔離ペンは、以下に詳細に考察し示すように、ＤＥＰ、ＯＥＴ、ＯＥＷ、流体フロー、及び／又は重力との併用に最適化された様々な形状、表面、及び特徴を含むことができる。
マイクロ流体回路１２０は、任意の数のマイクロ流体隔離ペンを含み得る。５つの隔離ペンが示されているが、マイクロ流体回路１２０は、より少数又はより多数の隔離ペンを有し得る。示されるように、マイクロ流体回路１２０のマイクロ流体隔離ペン１２４、１２６、１２８、及び１３０は、ある卵子の隣接卵子からの分離等の胚を生成するに当たり有用な１つ又は複数の利点を提供し得る異なる特徴及び形状をそれぞれ含む。テスト、シミュレーション、及び受精は、全て個々単位で実行し得、幾つかの実施形態では、個々のタイムスケールで実行し得る。幾つかの実施形態では、マイクロ流体回路１２０は、複数の同一のマイクロ流体隔離ペンを含む。
幾つかの実施形態では、マイクロ流体回路１２０は、複数のマイクロ流体隔離ペンを含み、その場合、隔離ペンの２つ以上は、胚の生成において異なる利点を提供する異なる構造及び／又は特徴を含む。非限定的な一例として、あるタイプのペン内に卵子を維持しながら、異なるタイプのペン内に精子を維持することを挙げることができる、別の実施形態では、隔離ペンの少なくとも１つは、卵子に電気活性化を提供するのに適した電気接点を有するように構成される。更に別の実施形態では、異なるタイプの細胞（例えば、子宮細胞、子宮内膜細胞、卵管（uterine tube）（例えば、卵管（oviduct）若しくはファローピウス管）等）由来のＰＥＧ（介在）細胞、卵丘細胞、又はそれらの組合わせ）は、卵子を含む隔離ペンに隣接する隔離ペンに配置し得、それにより、周囲の隔離ペンからの分泌物は各ペンから出て、卵子を含むペン中に拡散し得、これは、マクロスケールでのインビトロ培養及び受精では不可能である。胚の生成に有用なマイクロ流体デバイスは、隔離ペン１２４、１２６、１２８、及び１３０又はそれらの変形形態のいずれかを含み得、及び／又は後述するように、図２Ｂ、図２Ｃ、図２Ｄ、図２Ｅ、及び図２Ｆに示されるように構成されるペンを含み得る。
図１Ａに示される実施形態では、１つのチャネル１２２及び流路１０６が示される。しかし、他の実施形態は、それぞれが流路１０６を含むように構成される複数のチャネル１２２を含み得る。マイクロ流体回路１２０は、流路１０６及び流体培地１８０と流体連通する流入弁又はポート１０７を更に含み、それにより、流体培地１８０は、流入口１０７を介してチャネル１２２にアクセスすることができる。幾つかの場合、流路１０６は１つの経路を含む。幾つかの場合、１つの経路はジグザグパターンで配置され、それにより、流路１０６は、交互になった方向で２回以上にわたってマイクロ流体デバイス１００にわたり移動する。
幾つかの場合、マイクロ流体回路１２０は、複数の平行チャネル１２２及び流路１０６を含み、各流路１０６内の流体培地１８０は同じ方向に流れる。幾つかの場合、各流路１０６内の流体培地は、順方向又は逆方向の少なくとも一方で流れる。幾つかの場合、複数の隔離ペンは、隔離ペンが標的微小物体と並列に配置されることができるように構成される（例えば、チャネル１２２に相対して）。
幾つかの実施形態では、マイクロ流体回路１２０は、１つ又は複数の微小物体トラップ１３２を更に含む。トラップ１３２は、一般に、チャネル１２２の境界を形成する壁に形成され、マイクロ流体隔離ペン１２４、１２６、１２８、１３０の１つ又は複数の開口部の逆に位置し得る。幾つかの実施形態では、トラップ１３２は、流路１０６から１つの微小物体を受け取り、又は捕捉するように構成される。幾つかの実施形態では、トラップ１３２は、流路１０６から複数の微小物体を受け取り、又は捕捉するように構成される。幾つかの場合、トラップ１３２は、１つの標的微小物体の容積に概ね等しい容積を含む。
トラップ１３２は、標的微小物体のトラップ１３２へのフローを支援するように構成される開口部を更に含み得る。幾つかの場合、トラップ１３２は、１つの標的微小物体の寸法に概ね等しい高さ及び幅を有する開口部を含み、それにより、より大きい微小物体が微小物体トラップに入らないようにされる。トラップ１３２は、トラップ１３２内への標的微小物体の保持を支援するように構成される他の特徴を更に含み得る。幾つかの場合、トラップ１３２は、微小流体隔離ペンの開口部と位置合わせされ、微小流体隔離ペンの開口部に関してチャネル１２２の逆側に配置され、それにより、チャネル１２２に平行な軸の周りでマイクロ流体デバイス１００を傾斜されると、捕捉された微小物体は、微小物体を隔離ペンの開口部に落とす軌道でトラップ１３２を出る。幾つかの場合、トラップ１３２は、標的微小物体よりも小さく、トラップ１３２を通るフローを促進し、それによりトラップ１３２内への微小物体の捕捉確率を増大させるサイド通路１３４を含む。
幾つかの実施形態では、誘電泳動（ＤＥＰ）力は、１つ又は複数の電極（図示せず）を介して流体培地１８０にわたり適用されて（例えば、流路及び／又は隔離ペンにおいて）、内部に配置された微小物体の操作、輸送、分離、及びソートを行う。例えば、幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力は、マイクロ流体回路１２０の１つ又は複数の部分に適用されて、１つの微小物体を流路１０６から所望のマイクロ流体隔離ペンに輸送する。幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力を使用して、隔離ペン（例えば、隔離ペン１２４、１２６、１２８、又は１３０）内の微小物体が隔離ペンから変位しないようにする。更に、幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力を使用して、本発明の教示により前に収集された微小物体を隔離ペンから選択的に取り出す。幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力は、光電子ピンセット（ＯＥＴ）力を含む。
他の実施形態では、光電子ウェッティング（ＯＥＷ）力が、１つ又は複数の電極（図示せず）を介してマイクロ流体デバイス１００の支持構造体１０４（及び／又はカバー１１０）での１つ又は複数の位置（例えば、流路及び／又は隔離ペンの画定に役立つ位置）に適用されて、マイクロ流体回路１２０に配置された液滴の操作、輸送、分離、及びソートを行う。例えば、幾つかの実施形態では、ＯＥＷ力は支持構造体１０４（及び／又はカバー１１０）の１つ又は複数の位置に適用されて、１つの液滴を流路１０６から所望のマイクロ流体隔離ペンに輸送する。幾つかの実施形態では、ＯＥＷ力を使用して、隔離ペン（例えば、隔離ペン１２４、１２６、１２８、又は１３０）内の液滴が隔離ペンから変位しないようにする。更に、幾つかの実施形態では、ＯＥＷ力を使用して、本発明の教示により前に収集された液滴を隔離ペンから選択的に取り出す。
幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力及び／又はＯＥＷ力は、フロー及び／又は重力等の他の力と組み合わせられて、マイクロ流体回路１２０内の微小物体及び／又は液滴の操作、輸送、分離、及びソートを行う。例えば、エンクロージャ１０２は傾斜して（例えば、傾斜デバイス１９０により）、流路１０６及び流路１０６内に配置された微小物体をマイクロ流体隔離ペンの上に位置決めすることができ、重力は、微小物体及び／又は液滴をペン内に輸送することができる。幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力及び／又はＯＥＷ力は、他の力の前に適用することができる。他の実施形態では、ＤＥＰ力及び／又はＯＥＷ力は、他の力の後に適用することができる。更に他の場合、ＤＥＰ力及び／又はＯＥＷ力は、他の力と同時に又は他の力と交互に適用することができる。
図１Ｂ、図１Ｃ及び図２Ａ〜図２Ｈは、本発明の実施に使用することができるマイクロ流体デバイスの様々な実施形態を示す。図１Ｂは、マイクロ流体デバイス２００が光学作動動電学的デバイスとして構成される実施形態を示す。光電子ピンセット（ＯＥＴ）構成を有するデバイス及び光電子ウェッティング（ＯＥＷ）構成を有するデバイスを含め、様々な光学作動動電学的デバイスが当技術分野で既知である。適するＯＥＴ構成の例は、以下の米国特許文献に示されており、各文献は全体的に参照により本明細書に援用される：米国特許第ＲＥ４４，７１１号（Wuら）（元々は米国特許第７，６１２，３５５号として発行された）；及び米国特許第７，９５６，３３９号（Ohtaら）。ＯＥＷ構成の例は、米国特許第６，９５８，１３２号（Chiouら）及び米国特許出願公開第２０１２／００２４７０８号（Chiouら）に示されており、これらは両方とも全体的に参照により本明細書に援用される。光学作動動電的デバイスの更に別の例は、ＯＥＴ／ＯＥＷ結合構成を含み、その例は、米国特許出願公開第２０１５０３０６５９８号（Khandrosら）及び同第２０１５０３０６５９９号（Khandrosら）並びにそれらの対応するＰＣＴ公報である国際公開第２０１５／１６４８４６号及び国際公開第２０１５／１６４８４７号に示されており、これらは全て全体的に参照により本明細書に援用される。
卵母細胞、卵子、又は胚を配置し、培養し、及び／又は監視することができる隔離ペンを有するマイクロ流体デバイスの例は、例えば、米国特許出願公開第２０１４／０１１６８８１号（出願番号１４／０６０，１１７、２０１３年１０月２２日出願）、米国特許出願公開第２０１５／０１５１２９８号（出願番号１４／５２０，５６８、２０１４年１０月２２日出願）、及び米国特許出願公開第２０１５／０１６５４３６号（出願番号１４／５２１，４４７、２０１４年１０月２２日出願）に記載されており、これらはそれぞれ全体的に参照により援用される。米国特許出願公開第１４／５２０，５６８号及び同第１４／５２１，４４７号は、マイクロ流体デバイスで培養された細胞の分泌物を分析する例示的な方法についても記載している。上記の各出願は、光電子ツイーザ（ＯＥＴ）等の誘電泳動（ＤＥＰ）力を生成するように構成されるか、又は光電子ウェッティング（ＯＥＷ）を提供するように構成されるマイクロ流体デバイスを更に記載している。例えば、米国特許出願公開第２０１４／０１１６８８１号の図２に示される光電子ツイーザデバイスは、本発明の実施形態で利用して、個々の生物学的微小物体又は生物学的微小物体のグループを選択し移動させることができるデバイスの例である。
原動マイクロ流体デバイス構成
上述したように、システムの制御及び監視機器は、マイクロ流体デバイスのマイクロ流体回路において微小物体又は液滴等の物体を選択し移動させる原動モジュールを含むことができる。マイクロ流体デバイスは、移動される物体のタイプ及び他の考慮事項に応じて様々な原動構成を有することができる。例えば、誘電泳動（ＤＥＰ）構成を利用して、マイクロ流体回路において微小物体を選択し移動させることができる。したがって、マイクロ流体デバイス１００の支持構造体１０４及び／又はカバー１１０は、マイクロ流体回路１２０内の流体培地１８０内の微小物体に対してＤＥＰ力を選択的に誘導し、それにより個々の微小物体又は微小物体群の選択、捕捉、及び／又は移動を行うＤＥＰ構成を含むことができる。代替的に、マイクロ流体デバイス１００の支持構造体１０４及び／又はカバー１１０は、マイクロ流体回路１２０内の流体培地１８０内の液滴に対して電子ウェッティング（ＥＷ）力を選択的に誘導し、それにより個々の液滴又は液滴群の選択、捕捉、及び／又は移動を行う電子ウェッティング（ＥＷ）構成を含むことができる。
ＤＥＰ構成を含むマイクロ流体デバイス２００の一例を図２１Ｂ及び図１Ｃに示す。簡潔にするために、図１Ｂ及び図１Ｃは、開放領域／チャンバ２０２を有するマイクロ流体デバイス２００のエンクロージャ１０２の部分の側面断面図及び上面断面図をそれぞれ示すが、領域／チャンバ２０２が、成長チャンバ、隔離ペン、フロー領域、又はフローチャネル等のより詳細な構造を有する流体回路要素の部分であり得ることを理解されたい。更に、マイクロ流体デバイス２００は他の流体回路要素を含み得る。例えば、マイクロ流体デバイス２００は、マイクロ流体デバイス１００に関して本明細書に記載される等の複数の成長チャンバ、或いは隔離ペン及び／又は１つ若しくは複数のフロー領域又はフローチャネルを含むことができる。ＤＥＰ構成は、マイクロ流体デバイス２００の任意のそのような流体回路要素に組み込み得るか、又はその部分を選択し得る。上記又は下記の任意のマイクロ流体デバイス構成要素及びシステム構成要素がマイクロ流体デバイス２００内に組みこまれ得、及び／又はマイクロ流体デバイス２００と組み合わせて使用し得ることを更に理解されたい。例えば、培地モジュール１６０、原動モジュール１６２、撮像モジュール１６４、傾斜モジュール１６６、及び他のモジュール１６８の１つ又は複数を含む上述した制御及び監視機器１５２を含むシステム１５０は、マイクロ流体デバイス２００と併用し得る。
図１Ｂにおいて見られるように、マイクロ流体デバイス２００は、下部電極２０４及び下部電極２０４に重なる電極活性化基板２０６を有する支持構造体１０４と、上部電極２１０を有するカバー１１０とを含み、上部電極２１０は下部電極２０４から離間される。上部電極２１０及び電極活性化基板２０６は、領域／チャンバ２０２の両面を画定する。したがって、領域／チャンバ２０２に含まれる培地１８０は、上部電極２１０と電極活性化基板２０６との間に抵抗接続を提供する。下部電極２０４と上部電極２１０との間に接続され、領域／チャンバ２０２でのＤＥＰ力の生成のために必要に応じて電極間にバイアス電圧を生成するように構成される電源２１２も示されている。電源２１２は、例えば、交流（ＡＣ）電源であり得る。
特定の実施形態では、図１Ｂ及び図１Ｃに示されるマイクロ流体デバイス２００は、光学作動ＤＥＰ構成を有することができる。したがって、原動モジュール１６２により制御し得る光源２１６からの光２１８の変更パターンは、電極活性化基板２０６の内面２０８の領域２１４においてＤＥＰ電極の変更パターンを選択的に活性化又は非活性化することができる。（以下ではＤＥＰ構成を有するマイクロ流体デバイスの領域２１４を「ＤＥＰ電極領域」と呼ぶ）。図１Ｃに示されるように、電極活性化基板２０６の内面２０８に向けられる光パターン２１８は、正方形等のパターンで、選択されたＤＥＰ電極領域２１４ａ（白色で示される）を照明することができる。照明されないＤＥＰ電極領域２１４（斜線が付される）を以下では「暗」ＤＥＰ電極領域２１４と呼ぶ。ＤＥＰ電極活性化基板２０６を通る相対電気インピーダンス（すなわち、下部電極２０４から、フロー領域１０６において培地１８０と界面を接する電極活性化基板２０６の内面２０８まで）は、各暗ＤＥＰ電極領域２１４での領域／チャンバ２０２において培地１８０を通る（すなわち、電極活性化基板２０６の内面２０８からカバー１１０の上部電極２１０まで）相対電気インピーダンスよりも大きい。しかし、照明ＤＥＰ電極領域２１４ａは、各照明ＤＥＰ電極領域２１４ａでの領域／チャンバ２０２での培地１８０を通る相対インピーダンス未満である電極活性化基板２０６を通る相対インピーダンスの低減を示す。
電源２１２が活性化されている場合、上記のＤＥＰ構成は、照明ＤＥＰ電極領域２１４ａと隣接する暗ＤＥＰ電極領域２１４との間に流体培地１８０内で電場勾配を生じさせ、次に、電場勾配は、流体培地１８０内の付近の微小物体（図示せず）を引き寄せるか、又は排斥する局所ＤＥＰ力を生成する。したがって、流体培地１８０内の微小物体を引き寄せるか、又は排斥するＤＥＰ電極は、光源２１６からマイクロ流体デバイス２００に投射される光パターン２１８を変更することにより、領域／チャンバ２０２の内面２０８での多くの異なるそのようなＤＥＰ電極領域２１４において選択的に活性化及び非活性化することができる。ＤＥＰ力が付近の微小物体を引き寄せるか、それとも排斥するかは、電源２１２の周波数並びに培地１８０及び／又は微小物体（図示せず）の誘電特性等のパラメータに依存し得る。
図１Ｃに示される照明ＤＥＰ電極領域２１４ａの正方形パターン２２０は単なる例である。デバイス２００に投射される光パターン２１８により、任意のパターンのＤＥＰ電極領域２１４を照明する（それにより活性化する）ことができ、照明／活性化されるＤＥＰ電極領域２１４のパターンは、光パターン２１８を変更又は移動させることにより繰り返し変更することができる。
幾つかの実施形態では、電極活性化基板２０６は、光伝導性材料を含むか、又は光導電性材料からなることができる。そのような実施形態では、電極活性化基板２０６の内面２０８は、特徴を有さないことができる。例えば、電極活性化基板２０６は、水素化非晶質シリコン（ａ−Ｓｉ：Ｈ）の層を含むか、又はａ−Ｓｉ：Ｈの層からなることができる。ａ−Ｓｉ：Ｈは、例えば、約８％〜４０％の水素を含むことができる（水素原子の数／水素及びケイ素原子の総数に１００を掛けたものとして計算）。ａ−Ｓｉ：Ｈの層は厚さ約５００ｎｍ〜約２．０μｍを有することができる。そのような実施形態では、ＤＥＰ電極領域２１４は、光パターン２１８により、電極活性化基板２０６の内面２０８上の任意の場所に任意のパターンで作成することができる。したがって、ＤＥＰ電極領域２１４の数及びパターンは、固定される必要がなく、光パターン２１８に対応することができる。上述したような光伝導層を含むＤＥＰ構成を有するマイクロ流体デバイスの例は、例えば、米国特許第ＲＥ４４，７１１号（Wuら）（元々は米国特許第７，６１２，３５５号として発行された）に記載されており、その内容全体は参照により本明細書に援用される。
他の実施形態では、電極活性化基板２０６は、半導体分野で既知等の半導体集積回路を形成する複数のドープ層、絶縁層（又は領域）、及び導電層を含む基板を含むことができる。例えば、電極活性化基板２０６は、例えば、横型バイポーラフォトトランジスタを含む複数のフォトトランジスタを含むことができ、各フォトトランジスタはＤＥＰ電極領域２１４に対応する。代替的に、電極活性化基板２０６は、フォトトランジスタスイッチにより制御される電極（例えば、導電性金属電極）を含むことができ、そのような各電極はＤＥＰ電極領域２１４に対応する。電極活性化基板２０６は、パターンになったそのようなフォトトランジスタ又はフォトトランジスタ制御される電極を含むことができる。パターンは、例えば、図２Ｂに示される等、行列に配置された実質的に正方形のフォトトランジスタ又はフォトトランジスタ制御される電極のアレイであり得る。代替的に、パターンは、六角形格子を形成する実質的に六角形のフォトトランジスタ又はフォトトランジスタ制御される電極のアレイであり得る。パターンに関係なく、電気回路素子は、電極活性化基板２０６の内面２０８におけるＤＥＰ電極領域２１４と下部電極２１０との間に電気接続を形成することができ、それらの電気接続（すなわち、フォトトランジスタ又は電極）は、光パターン２１８により選択的に活性化又は非活性化することができる。活性化されない場合、各電気接続は、電極活性化基板２０６を通る（すなわち、下部電極２０４から、領域／チャンバ２０２内の培地１８０と界面を接する電極活性化電極２０６の内面２０８まで）相対インピーダンスが、対応するＤＥＰ電極領域２１４における培地１８０を通る（すなわち、電極活性化基板２０６の内面２０８からカバー１１０の上部電極２１０まで）相対インピーダンスよりも大きいような高いインピーダンスを有することができる。しかし、光パターン２１８内の光により活性化される場合、電極活性化基板２０６を通る相対インピーダンスは、各照明ＤＥＰ電極領域２１４での培地１８０を通る相対インピーダンス未満であり、それにより、上述したように、対応するＤＥＰ電極領域２１４でのＤＥＰ電極を活性化する。したがって、培地１８０内の微小物体（図示せず）を引き寄せるか、又は排斥するＤＥＰ電極は、光パターン２１８により決まるように、領域／チャンバ２０２での電極活性化基板２０６の内面２０８での多くの異なるＤＥＰ電極領域２１４において選択的に活性化及び非活性化することができる。
フォトトランジスタを含む電極活性化基板を有するマイクロ流体デバイスの例は、例えば、米国特許第７，９５６，３３９号（Ohtaら）に記載されており（例えば、図２１及び図２２に示されるデバイス３００並びにその説明を参照されたい）、この内容全体は参照により本明細書に援用される。フォトトランジスタスイッチにより制御される電極を含む電極活性化基板を有するマイクロ流体デバイスの例は、例えば、米国特許出願公開第２０１４／０１２４３７０号（Shortら）に記載されており（例えば、図面全体を通して示されるデバイス２００、４００、５００、６００、及び９００並びにその説明を参照されたい）、これらの内容全体は参照により本明細書に援用される。
ＤＥＰ構成のマイクロ流体デバイスの幾つかの実施形態では、上部電極２１０はエンクロージャ１０２の第１の壁（又はカバー１１０）の一部であり、電極活性化基板２０６及び下部電極２０４は、エンクロージャ１０２の第２の壁（又は支持構造体１０４）の一部である。領域／チャンバ２０２は、第１の壁と第２の壁との間にあり得る。他の実施形態では、電極２１０は第２の壁（又は支持構造体１０４）の一部であり、電極活性化基板２０６及び／又は電極２１０の一方又は両方は、第１の壁（又はカバー１１０）の一部である。更に、光源２１６は代替的に、下からエンクロージャ１０２を照明するのに使用することができる。
ＤＥＰ構成を有する図１Ｂ及び図１Ｃのマイクロ流体デバイス２００を用いて、原動モジュール１６２は、光パターン２１８をデバイス２００に投射して、微小物体を囲み捕捉するパターン（例えば、正方形パターン２２０）で電極活性化基板２０６の内面２０８のＤＥＰ電極領域２１４ａでの第１の組の１つ又は複数のＤＥＰ電極を活性化することにより、領域／チャンバ２０２での培地１８０内の微小物体（図示せず）を選択することができる。次に、原動モジュール１６２は、光パターン２１８をデバイス２００に相対して移動させて、ＤＥＰ電極領域２１４での第２の組の１つ又は複数のＤＥＰ電極を活性化することにより、捕捉された微小物体を移動させることができる。代替的に、デバイス２００を光パターン２１８に相対して移動させることができる。
他の実施形態では、マイクロ流体デバイス２００は、電極活性化基板２０６の内面２０８でのＤＥＰ電極の光活性化に依存しないＤＥＰ構成を有することができる。例えば、電極活性化基板２０６は、少なくとも１つの電極を含む表面（例えば、カバー１１０）とは逆に位置する、選択的にアドレス指定可能且つエネルギー付与可能な電極を含むことができる。スイッチ（例えば、半導体基板のトランジスタスイッチ）を選択的に開閉して、ＤＥＰ電極領域２１４でのＤＥＰ電極を活性化又は非活性化し得、それにより、活性化されたＤＥＰ電極の近傍での領域／チャンバ２０２内の微小物体（図示せず）に対する正味ＤＥＰ力を生成する。電源２１２の周波数及び培地（図示せず）及び／又は領域／チャンバ２０２内の微小物体の誘電特性等の特徴に応じて、ＤＥＰ力は、付近の微小物体を引き寄せるか、又は排斥することができる。ＤＥＰ電極の組（例えば、正方形パターン２２０を形成するＤＥＰ電極領域２１４の組における）を選択的に活性化又は非活性化することにより、領域／チャンバ２０２における１つ又は複数の微小物体を捕捉し、領域／チャンバ２０２内で移動させることができる。図１Ａの原動モジュール１６２は、そのようなスイッチを制御し、したがって、ＤＥＰ電極の個々の電極を活性化及び非活性化して、領域／チャンバ２０２の周囲の特定の微小物体（図示せず）を選択、捕捉、及び移動させることができる。選択的にアドレス指定可能且つエネルギー付与可能な電極を含むＤＥＰ構成を有するマイクロ流体デバイスは、当技術分野で既知であり、例えば、米国特許第６，２９４，０６３号（Beckerら）及び同第６，９４２，７７６号（Medoro）に記載されており、これらの内容全体は参照により本明細書に援用される。
更なる別例として、マイクロ流体デバイス２００は電子ウェッティング（ＥＷ）構成を有することができ、ＥＷ構成は、ＤＥＰ構成の代わりであってもよく、又はＤＥＰ構成を有する部分とは別個のマイクロ流体デバイス２００の部分に配置されてもよい。ＥＷ構成は、光電子ウェッティング構成又は誘電体上の電子ウェッティング（ＥＷＯＤ）構成であり得、これらは両方とも当技術分野で既知である。幾つかのＥＷ構成では、支持構造体１０４は、以下に記載するように、誘電層（図示せず）と下部電極２０４との間に挟まれた電極活性化基板２０６を有する。誘電層は、疎水性材料を含むことができ、及び／又は疎水性材料でコーティングすることができる。ＥＷ構成を有するマイクロ流体デバイス２００の場合、支持構造体１０４の内面２０８は、誘電層の内面又はその疎水性コーティングである。
誘電層（図示せず）は、１つ又は複数の酸化物層を含むことができ、厚さ約５０ｎｍ〜約２５０ｎｍ（例えば、約１２５ｎｍ〜約１７５ｎｍ）を有することができる。特定の実施形態では、誘電層は、金属酸化物（例えば、酸化アルミニウム又は酸化ハフニウム）等の酸化物の層を含むことができる。特定の実施形態では、誘電層は、酸化ケイ素又は窒化物等の金属酸化物以外の誘電材料を含むことができる。厳密な組成及び厚さに関係なく、誘電層は約１０ｋオーム〜約５０ｋオームのインピーダンスを有することができる。
幾つかの実施形態では、領域／チャンバ２０２に向かって内側に面した誘電層の表面は、疎水性材料でコーティングされる。疎水性材料は、例えば、フッ素化炭素分子を含むことができる。フッ素化炭素分子の例としては、ポリテトラフルオロエチレン（例えば、TEFLON（登録商標）又はポリ（２，３−ジフルオロメチレニル−ペルフルオロテトラヒドロフラン）（例えば、CYTOP（商標））などのパーフルオロポリマーが挙げられる。疎水性材料を構成する分子は、誘電層の表面に共有結合され得る。例えば、疎水性材料の分子は、シロキサン基、ホスホン酸基、又はチオール基等のリンカーにより、誘電層の表面に共有結合され得る。したがって、幾つかの実施形態では、疎水性材料は、アルキル末端シロキサン、アルキル末端ホスホン酸、又はアルキル末端チオールを含むことができる。アルキル基は長鎖炭化水素（例えば、少なくとも１０個の炭素又は少なくとも１６個、１８個、２０個、２２個、若しくはそれを超える個数の炭素の鎖を有する）であり得る。代替的に、フッ素化（又はパーフルオロ化）炭素鎖をアルキル基の代わりに使用することができる。したがって、例えば、疎水性材料は、フルオロアルキル末端シロキサン、フルオロアルキル末端ホスホン酸、又はフルオロアルキル末端チオールを含むことができる。幾つかの実施形態では、疎水性コーティングは約１０ｎｍ〜約５０ｎｍの厚さを有する。他の実施形態では、疎水性コーティングは厚さ１０ｎｍ未満（例えば、５ｎｍ未満又は約１．５〜３．０ｎｍ）を有する。
幾つかの実施形態では、電子ウェッティング構成を有するマイクロ流体デバイス２００のカバー１１０も同様に疎水性材料（図示せず）でコーティングされる。疎水性材料は、支持構造体１０４の誘電層のコーティングに使用されるものと同じ疎水性材料であり得、疎水性コーティングは、支持構造体１０４の誘電層の疎水性コーティングの厚さと略同じである厚さを有することができる。更に、カバー１１０は、支持構造体１０４の様式で、誘電層と上部電極２１０との間に挟まれた電極活性化基板２０６を含むことができる。電極活性化基板２０６及びカバー１１０の誘電層は、電極活性化基板２０６及び支持構造体１０４の誘電層と同じ組成及び／又は寸法を有することができる。したがって、マイクロ流体デバイス２００は２つの電子ウェッティング表面を有することができる。
幾つかの実施形態では、電子活性化基板２０６は、上述した光伝導性材料等の光伝導性材料を含むことができる。したがって、特定の実施形態では、電極活性化基板２０６は、水素化非晶質シリコン（ａ−Ｓｉ：Ｈ）の層を含むか、又はａ−Ｓｉ：Ｈの層からなることができる。ａ−Ｓｉ：Ｈは、例えば、約８％〜４０％の水素を含むことができる（水素原子の総数及びケイ素原子の総数／水素原子の総数に１００を掛けたものとして計算）。ａ−Ｓｉ：Ｈの層は厚さ約５００ｎｍ〜約２．０μｍを有することができる。代替的に、電子活性化基板２０６は、上述したように、フォトトランジスタスイッチにより制御される電極（例えば、導電性金属電極）を含むことができる。光電子ウェッティング構成を有するマイクロ流体デバイスは当技術分野で既知であり、及び／又は当技術分野で既知の電極活性化基板を用いて構築することができる。例えば、内容全体が参照により本明細書に援用される米国特許第６，９５８，１３２号（Chiouら）には、ａ−Ｓｉ：Ｈ等の光伝導性材料を有する光電子ウェッティング構成が開示されており、一方、上記で引用した米国特許出願公開第２０１４／０１２４３７０号（Shortら）には、フォトトランジスタスイッチにより制御される電極を有する電極活性化基板が開示されている。
したがって、マイクロ流体デバイス２００は光電子ウェッティング構成を有することができ、光パターン２１８を使用して、電極活性化基板２０６での光応答性ＥＷ領域又は光応答性ＥＷ電極を活性化することができる。電極活性化基板２０６のそのような活性化されたＥＷ領域又はＥＷ電極は、支持構造体１０４の内面２０８（すなわち、重なった誘電層の内面又はその疎水性コーティング）において電子ウェッティング力を生成することができる。電子活性化基板２０６に入射する光パターン２１８を変更する（又は光源２１６に相対してマイクロ流体デバイス２００を移動させる）ことにより、支持構造体１０４の内面２０８に接触する液滴（例えば、水性培地、水溶液又は水性溶媒を含む）は、領域／チャンバ２０２内に存在する不混和流体（例えば、油媒体）を通って移動することができる。
他の実施形態では、マイクロ流体デバイス２００は、ＥＷＯＤ構成を有することができ、電極活性化基板２０６は、活性化のために光に依存しない、選択的にアドレス指定可能且つエネルギー付与可能な電極を含むことができる。したがって、電極活性化基板２０６は、パターンになったそのような電子ウェッティング（ＥＷ）電極を含むことができる。パターンは、例えば、図２Ｂに示される等の行列に配置された略正方形のＥＷ電極のアレイであり得る。代替的に、パターンは、六角形格子を形成する略六角形のＥＷ電極のアレイであり得る。パターンに関係なく、ＥＷ電極は、電気スイッチ（例えば、半導体基板のトランジスタスイッチ）により選択的に活性化（又は非活性化）することができる。電極活性化基板２０６でのＥＷ電極を選択的に活性化及び非活性化することにより、重なった誘電層の内面２０８又はその疎水性コーティングに接触する液滴（図示せず）は、領域／チャンバ２０２内で移動することができる。図１Ａの原動モジュール１６２は、そのようなスイッチを制御することができ、したがって、個々のＥＷ電極を活性化及び非活性化して、領域／チャンバ２０２の周囲で特定の液滴を選択し移動させることができる。選択的にアドレス指定可能且つエネルギー付与可能な電極を有するＥＷＯＤ構成を有するマイクロ流体デバイスは、当技術分野で既知であり、例えば、米国特許第８，６８５，３４４号（Sundarsanら）に記載されており、この内容全体は参照により本明細書に援用される。
マイクロ流体デバイス２００の構成に関係なく、電源２１２を使用して、マイクロ流体デバイス２００の電気回路に給電する電位（例えば、ＡＣ電源電位）を提供することができる。電源２１２は、図１で参照される電源１９２と同じ又は電源１９２の構成要素であり得る。電源２１２は、上部電極２１０及び下部電極２０４にＡＣ電圧及び／又は電流を提供するように構成され得る。ＡＣ電圧の場合、電源２１２は、上述したように、領域／チャンバ２０２内の個々の微小物体（図示せず）を捕捉して移動させ、及び／又はこれらも上述したように、領域／チャンバ２０２内の支持構造体１０４の内面２０８（すなわち、誘電層及び／又は誘電層上の疎水性コーティング）のウェッティング特性を変更するのに十分に強い正味ＤＥＰ力（又は電子ウェッティング力）を生成するのに十分な周波数範囲及び平均又はピーク電力（例えば、電圧又は電流）を提供することができる。そのような周波数範囲及び平均又はピーク電力範囲は、当技術分野で既知である。例えば、米国特許第６，９５８，１３２号（Chiouら）、米国特許第ＲＥ４４，７１１号（Wuら）（元々は米国特許第７，６１２，３５５号として発行された）、並びに米国特許出願公開第２０１４／０１２４３７０号（Shortら）、同第２０１５／０３０６５９８号（Khandrosら）、及び同第２０１５／０３０６５９９号（Khandrosら）を参照されたい。
隔離ペン。一般的な隔離ペン２２４、２２６、及び２２８の非限定的な例は、図２Ａ〜図２Ｃに示されるマイクロ流体デバイス２３０内に示されている。各隔離ペン２２４、２２６、及び２２８は、分離領域２４０と、分離領域２４０をチャネル１２２に流体接続する接続領域２３６とを画定する分離構造体２３２を含むことができる。接続領域２３６は、チャネル１２２への基端開口部２３４及び分離領域２４０への先端開口部２３８を含むことができる。接続領域２３６は、チャネル１２２から隔離ペン２２４、２２６、２２８内に流れる流体培地（図示せず）のフローの最大侵入深さが分離領域２４０内に及ばないように構成され得る。したがって、接続領域２３６に起因して、隔離ペン２２４、２２６、２２８の分離領域２４０内に配置された微小物体（図示せず）又は他の材料（図示せず）は、チャネル１２２内の培地１８０のフローから分離され、チャネル１２２内の培地１８０のフローにより実質的に影響されないことができる。
図２Ａ〜図２Ｃの隔離ペン２２４、２２６、及び２２８は、チャネル１２２に対して直接開く単一の開口部をそれぞれ有する。隔離ペンの開口部は、チャネル１２２から横に開く。電極活性化基板２０６がチャネル１２２及び隔離ペン２２４、２２６、及び２２８の両方の下にある。隔離ペンのフロアを形成する、隔離ペンのエンクロージャ内の電極活性化基板２０６の上面は、マイクロ流体デバイスのフローチャネル（又はそれぞれフロー領域）のフロアを形成する、チャネル１２２（又はチャネルが存在しない場合、フロー領域）内の電極活性化基板２０６の上面と同じ高さ又は略同じ高さに配置される。電極活性化基板２０６は、特徴を有さなくてもよく、又は約３μｍ未満、約２．５μｍ未満、約２μｍ未満、約１．５μｍ未満、約１μｍ未満、約０．９μｍ未満、約０．５μｍ未満、約０．４μｍ未満、約０．２μｍ未満、約０．１μｍ未満、又はそれを下回って最高隆起部から最低陥没部まで変化する不規則又はパターン化表面を有してもよい。チャネル１２２（図示せず）及び隔離ペンの両方にわたる基板の上面の隆起の変動は、隔離ペンの壁の高さ又はマイクロ流体デバイスの壁の高さの約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．９％未満、約０．８％未満、約０．５％未満、約０．３％未満、又は約０．１％未満であり得る。マイクロ流体デバイス２００について詳細に説明したが、これは、本明細書に記載される任意のマイクロ流体デバイス１００、２３０、２５０、２８０、２９０、３２０、４００、４５０、５００、７００にも当てはまる。
したがって、チャネル１２２は掃引領域の例であり得、隔離ペン２２４、２２６、２２８の分離領域２４０は非掃引領域の例であり得る。述べたように、チャネル１２２及び隔離ペン２２４、２２６、２２８は、１つ又は複数の流体培地１８０を含むように構成され得る。図２Ａ〜図２Ｂに示される例では、ポート２２２はチャネル１２２に接続され、流体培地１８０がマイクロ流体デバイス２３０内に導入又は外に取り出せるようにすることができる。流体培地１８０を導入する前に、マイクロ流体デバイスは、二酸化炭素ガス等のガスでプライミングし得る。マイクロ流体デバイス２３０が流体培地１８０を含むと、チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２は選択的に生成及び停止させることができる。例えば、示されるように、ポート２２２はチャネル１２２の異なる位置（例えば、両端部）に配置することができ、流入口として機能するあるポート２２２から流出口として機能する別のポート２２２への培地のフロー２４２を生成することができる。
図２Ｃは、本発明による隔離ペン２２４の例の詳細図を示す。微小物体２４６の例も示されている。
既知のように、隔離ペン２２４の基端開口部２３４を越えたマイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２は、隔離ペン２２４内及び／又は外への培地１８０の２次フロー２４４を生じさせることができる。隔離ペン２２４の分離領域２４０内の微小物体２４６を２次フロー２４４から分離するために、隔離ペン２２４の接続領域２３６の長さＬｃｏｎ（すなわち、基端開口部２３４から先端開口部２３８まで）は、接続領域２３６への２次フロー２４４の侵入深さＤｐよりも大きい値であるはずである。２次フロー２４４の侵入深さＤｐは、チャネル１２２内を流れる流体培地１８０の速度並びにチャネル１２２及びチャネル１２２への接続領域２３６の基端開口部２３４の構成に関連する様々なパラメータに依存する。所与のマイクロ流体デバイスでは、チャネル１２２及び開口部２３４の構成は固定され、一方、チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２の速度は可変である。したがって、隔離ペン２２４毎に、２次フロー２４４の侵入深さＤｐが接続領域２３６の長さＬｃｏｎを超えないことを保証するチャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２の最高速度Ｖｍａｘを識別することができる。チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２の流量が最大速度Ｖｍａｘを超えない限り、結果として生成される、チャネル１２２及び接続領域２３６への２次フロー２４４を制限することができ、分離領域２４０に入らないようにすることができる。したがって、チャネル１２２内の培地１８０のフロー２４２は、微小物体２４６を分離領域２４０外に引き込まない。むしろ、分離領域２４０内に配置された微小物体２４６は、チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２に関係なく、分離領域２４０内に留まる。
更に、チャネル１２２内の培地１８０のフロー２４２の流量がＶｍａｘを超えない限り、チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２は、様々な粒子（例えば、微粒子及び／又はナノ粒子）をチャネル１２２から隔離ペン２２４の分離領域２４０内に移動させない。したがって、接続領域２３６の長さＬｃｏｎを２次フロー２４４の最大侵入深さＤｐよりも大きくすることで、ある隔離ペン２２４の、チャネル１２２又は別の隔離ペン（例えば、図２Ｄの隔離ペン２２６、２２８）からの様々な粒子による汚染を回避することができる。
チャネル１２２及び隔離ペン２２４、２２６、２２８の接続領域２３６は、チャネル１２２内の培地１８０のフロー２４２により影響を及ぼすことができるため、チャネル１２２及び接続領域２３６は、マイクロ流体デバイス２３０の掃引（又はフロー）領域と見なすことができる。他方、隔離ペン２２４、２２６、２２８の分離領域２４０は、非掃引（又は非フロー）領域と見なすことができる。例えば、チャネル１２２内の第１の流体培地１８０中の成分（図示せず）は、実質的に、チャネル１２２から接続領域２３６を通り分離領域２４０内の第２の流体培地２４８への第１の培地１８０の成分の拡散によってのみ、分離領域２４０内の第２の流体培地２４８と混合することができる。同様に、分離領域２４０内の第２の培地２４８の成分（図示せず）は、実質的に、分離領域２４０から接続領域２３６を通り、チャネル１２２内の第１の培地１８０への第２の培地２４８の成分の拡散によってのみ、チャネル１２２内の第１の培地１８０と混合することができる。幾つかの実施形態では、拡散による隔離ペンの分離領域とフロー領域との間での流体媒体交換の程度は、流体交換の約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％よりも高い割合である。第１の培地１８０は、第２の培地２４８と同じ培地であってもよく、又は異なる培地であってもよい。更に、第１の培地１８０及び第２の培地２４８は、同じ培地として開始され、異なるようになることができる（例えば、分離領域２４０内の１つ又は複数の細胞により又はチャネル１２２を通って流れる培地１８０を変更することにより、第２の培地２４８を調整することを通して）。
チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２により生じる２次フロー２４４の最大侵入深さＤｐは、上述したように、幾つかのパラメータに依存し得る。そのようなパラメータの例としては、チャネル１２２の形状（例えば、チャネルは、培地を接続領域２３６に向けることができ、接続領域２３６から培地を逸らすことができ、又はチャネル１２２への接続領域２３６の基端開口部２３４に実質的に直交する方向に培地を向けることができる）、基端開口部２３４でのチャネル１２２の幅Ｗｃｈ（又は断面積）及び基端開口部２３４での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎ（又は断面積）、チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２の速度Ｖ、第１の培地１８０及び／又は第２の培地２４８の粘度等が挙げられる。
幾つかの実施形態では、チャネル１２２及び隔離ペン２２４、２２６、２２８の寸法は、チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２のベクトルに対して以下のように向けることができる：チャネル幅Ｗｃｈ（又はチャネル１２２の断面積）は、培地１８０のフロー２４２に略直交することができ、開口部２３４での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎ（又は断面積）は、チャネル１２２内の培地１８０のフロー２４２に略平行であり得、及び／又は接続領域の長さＬｃｏｎは、チャネル１２２内の培地１８０のフロー２４２に略直交することができる。上記は単なる例であり、チャネル１２２及び隔離ペン２２４、２２６、２２８の相対位置は、互いに対して他の向きであり得る。
図２Ｃに示されるように、接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎは、基端開口部２３４から先端開口部２３８まで均一であり得る。したがって、先端開口部２３８での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎは、基端開口部２３４での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎについて本明細書において識別された任意の範囲内にあり得る。代替的に、先端開口部２３８での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎは、基端開口部２３４での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎよりも大きい値であり得る。
図２Ｃに示されるように、先端開口部２３８での分離領域２４０の幅は、基端開口部２３４での基端領域２３６の幅Ｗｃｏｎと略同じであり得る。したがって、先端開口部２３８での分離領域２４０の幅は、基端開口部２３４での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎについて本明細書において識別された任意の範囲内であり得る。代替的に、先端開口部２３８での分離領域２４０の幅は、基端開口部２３４での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎよりも大きくてもよく、又は小さくてもよい。更に、先端開口部２３８は基端開口部２３４よりも小さくてよく、接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎは、基端開口部２３４と先端開口部２３８との間で狭め得る。例えば、接続領域２３６は、様々な異なるジオメトリ（例えば、接続領域を面取りする、接続領域に勾配を付ける）を使用して基端開口部と先端開口部との間で狭め得る。更に、接続領域２３６の任意の部分又はサブ部分を狭め得る（例えば、基端開口部２３４に隣接する接続領域の部分）。
図２Ｄ〜図２Ｆは、図１の各マイクロ流体デバイス１００、回路１３２、及びチャネル１３４の変形形態であるマイクロ流体回路２６２及びフローチャネル２６４を含むマイクロ流体デバイス２５０の別の例示的な実施形態を示す。マイクロ流体デバイス２５０は、上述した隔離ペン１２４、１２６、１２８、１３０、２２４、２２６、又は２２８の追加の変形形態である複数の隔離ペン２６６も有する。特に、図２Ｄ〜図２Ｆに示されるデバイス２５０の隔離ペン２６６をデバイス１００、２００、２３０、２８０、２９０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００での上述した隔離ペン１２４、１２６、１２８、１３０、２２４、２２６、又は２２８のいずれかで置換可能なことを理解されたい。同様に、マイクロ流体デバイス２５０は、マイクロ流体デバイス１００の別の変形形態であり、上述したマイクロ流体デバイス１００、２００、又はマイクロ流体デバイス２３０、２８０、２９０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００と同じ又は異なるＤＥＰ構成及び本明細書に記載される任意の他のマイクロ流体システム構成要素を有することもできる。
図２Ｄ〜図２Ｆのマイクロ流体デバイス２５０は、支持構造体（図２Ｄ〜図２Ｆでは見えないが、図１Ａに示されるデバイス１００の支持構造体１０４と同じ又は概して同様であり得る）、マイクロ流体回路構造２５６、及びカバー（図２Ｆ〜図２Ｆでは見えないが、図１Ａに示されるデバイス１００のカバー１２２と同じ又は概して同様であり得る）を含む。マイクロ流体回路構造２５６は枠２５２及びマイクロ流体回路材料２６０を含み、これらは図１Ａに示されるデバイス１００の枠１１４及びマイクロ流体回路材料１１６と同じ又は概して同様であり得る。図２Ｄに示されるように、マイクロ流体回路材料２６０により画定されるマイクロ流体回路２６２は複数のチャネル２６４（２つが示されるが、より多くのチャネルがあり得る）を含むことができ、チャネル２６４に複数の隔離ペン２６６が流体接続される。
各隔離ペン２６６は、分離構造２７２、分離構造２７２内の分離領域２７０、及び接続領域２６８を含むことができる。チャネル２６４の基端開口部２７４から分離構造２７２での先端開口部２７６まで、接続領域２６８はチャネル２６４を分離領域２７０に流体接続する。一般に、図２Ｂ及び図２Ｃの上記考察によれば、チャネル２６４内の第１の流体培地２５４のフロー２７８は、チャネル２６４から隔離ペン２６６の各接続領域２６８内及び／又は外への第１の培地２５４の２次フロー２８２をもたらすことができる。
図２Ｅに示されるように、各隔離ペン２６６の接続領域２６８は、一般に、チャネル２６４の基端開口部２７４と分離構造２７２の先端開口部２７６との間に延びるエリアを含む。接続領域２６８の長さＬｃｏｎは、２次フロー２８２の最大侵入深さＤｐよりも大きい値であり得、その場合、２次フロー２８２は、分離領域２７０に向かってリダイレクトされずに接続領域２６８内に延びる（図２Ｄに示されるように）。代替的に、図２Ｆに示されるように、接続領域２６８は、最大侵入深さＤｐよりも小さい長さＬｃｏｎを有することができ、その場合、２次フロー２８２は、接続領域２６８を通って延び、分離領域２７０に向かってリダイレクトされる。この後者の状況では、接続領域２６８の長さＬｃ１及びＬｃ２との和は最大侵入深さＤｐよりも大きく、したがって、２次フロー２８２は分離領域２７０内に延びない。接続領域２６８の長さＬｃｏｎが侵入深さＤｐよりも大きいか否か又は接続領域２６８の長さＬｃ１及びＬｃ２の和が侵入深さＤｐよりも大きいか否かに関係なく、最大速度Ｖｍａｘを超えないチャネル２６４内の第１の培地２５４のフロー２７８は、侵入深さＤｐを有する２次フローをもたらし、隔離ペン２６６の分離領域２７０内の微小物体（示されていないが、図２Ｃに示される微小物体２４６と同じ又は概して同様であり得る）は、チャネル２６４内の第１の培地２５４のフロー２７８により分離領域２７０外に引き出されない。チャネル２６４内のフロー２７８は、様々な材料（図示せず）もチャネル２６４から隔離ペン２６６の分離領域２７０内に引き込まない。したがって、チャネル２６４内の第１の培地２５４内の成分をチャネル２６４から隔離ペン２６６の分離領域２７０内の第２の培地２５８内に移動させることができる唯一の機構は、拡散である。同様に、隔離ペン２６６の分離領域２７０内の第２の培地２５８内の成分を分離領域２７０からチャネル２６４内の第１の培地２５４内に移動させることができる唯一の機構も拡散である。第１の培地２５４は、第２の培地２５８と同じ培地であり得、又は第１の培地２５４は、第２の培地２５８と異なる培地であり得る。代替的に、第１の培地２５４及び第２の培地２５８は、同じ培地から始まり、例えば、分離領域２７０内の１つ又は複数の細胞により又はチャネル２６４を通って流れる培地を変更することにより、第２の培地を調整することを通して異なるようになることができる。
図２Ｅに示されるように、チャネル２６４内のチャネル２６４の幅Ｗｃｈ（すなわち、図２Ｄにおいて矢印２７８で示されるチャネルを通る流体培地フローの方向を横断してとられる）は、基端開口部２７４の幅Ｗｃｏｎ１に略直交することができ、したがって、先端開口部２７６の幅Ｗｃｏｎ２に略平行であり得る。しかし、基端開口部２７４の幅ｃｏｎ１及び先端開口部２７６の幅Ｗｃｏｎ２は、互いに略直交する必要はない。例えば、基端開口部２７４の幅Ｗｃｏｎ１が向けられる軸（図示せず）と、先端開口部２７６の幅Ｗｃｏｎ２が向けられる別の軸との間の角度は、直交以外であり得、したがって、９０°以外であり得る。代替的に向けられる角度の例としては、以下の任意の範囲内の角度を含む：約３０°〜約９０°、約４５°〜約９０°、約６０°〜約９０°等。
隔離ペンの様々な実施形態（例えば、１２４、１２６、１２８、１３０、２２４、２２６、２２８、又は２６６）では、分離領域（例えば、２４０又は２７０）は、複数の微小物体を含むように構成される。他の実施形態では、分離領域は、１つのみ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は同様の相対的に少数の微小物体を含むように構成され得る。したがって、分離領域の容積は、例えば、少なくとも１×１０６立方μｍ、少なくとも２×１０６立方μｍ、少なくとも４×１０６立方μｍ、少なくとも６×１０６立方μｍ、又はこれを超える大きさであり得る。
隔離ペンの様々な実施形態では、基端開口部（例えば、２３４）でのチャネル（例えば、１２２）の幅Ｗｃｈは、以下の任意の範囲内であり得る：約５０〜１０００μｍ、約５０〜５００μｍ、約５０〜４００μｍ、約５０〜３００μｍ、約５０〜２５０μｍ、約５０〜２００μｍ、約５０〜１５０μｍ、約５０〜１００μｍ、約７０〜５００μｍ、約７０〜４００μｍ、約７０〜３００μｍ、約７０〜２５０μｍ、約７０〜２００μｍ、約７０〜１５０μｍ、約９０〜４００μｍ、９０〜３００μｍ、約９０〜２５０μｍ、約９０〜２００μｍ、約９０〜１５０μｍ、約１００〜３００μｍ、約１００〜２５０μｍ、約１００〜２００μｍ、約１００〜１５０μｍ、及び約１００〜１２０μｍ。幾つかの他の実施形態では、基端開口部（例えば、２３４）におけるチャネル（例えば、１２２）の幅Ｗｃｈは、約２００〜８００μｍ、約２００〜７００μｍ、又は約２００〜６００μｍの範囲であり得る。上記は単なる例であり、チャネル１２２の幅Ｗｃｈは、他の範囲（例えば、上記列挙された任意の端点により定義される範囲）であってもよい。更に、チャネル１２２の幅Ｗｃｈは、隔離ペンの基端開口部以外のチャネルの領域において、これらの任意の範囲であるように選択することができる。
幾つかの実施形態では、隔離ペンは、約３０〜約２００μｍ又は約５０〜約１５０μｍの高さを有する。幾つかの実施形態では、隔離ペンは、約１×１０４〜約３×１０６平方μｍ、約２×１０４〜約２×１０６平方μｍ、約４×１０４〜約１×１０６平方μｍ、約２×１０４〜約５×１０５平方μｍ、約２×１０４〜約１×１０５平方μｍ、又は約２×１０５〜約２×１０６平方μｍの断面積を有する。
隔離ペンの様々な実施形態において、基端開口部（例えば、２３４）におけるチャネル（例えば、１２２）の高さＨｃｈは、以下の任意の範囲内であり得る：２０〜１００μｍ、２０〜９０μｍ、２０〜８０μｍ、２０〜７０μｍ、２０〜６０μｍ、２０〜５０μｍ、３０〜１００μｍ、３０〜９０μｍ、３０〜８０μｍ、３０〜７０μｍ、３０〜６０μｍ、３０〜５０μｍ、４０〜１００μｍ、４０〜９０μｍ、４０〜８０μｍ、４０〜７０μｍ、４０〜６０μｍ、又は４０〜５０μｍ。上記は単なる例であり、チャネル（例えば、１２２）の高さＨｃｈは、他の範囲（例えば、上記列挙された任意の端点により定義される範囲）であってもよい。チャネル１２２の高さＨｃｈは、隔離ペンの基端開口部以外のチャネルの領域において、これらの任意の範囲であるように選択することができる。
隔離ペンの様々な実施形態において、基端開口部（例えば、２３４）におけるチャネル（例えば、１２２）の断面積は、以下の任意の範囲内であり得る：５００〜５０，０００平方μｍ、５００〜４０，０００平方μｍ、５００〜３０，０００平方μｍ、５００〜２５，０００平方μｍ、５００〜２０，０００平方μｍ、５００〜１５，０００平方μｍ、５００〜１０，０００平方μｍ、５００〜７，５００平方μｍ、５００〜５，０００平方μｍ、１，０００〜２５，０００平方μｍ、１，０００〜２０，０００平方μｍ、１，０００〜１５，０００平方μｍ、１，０００〜１０，０００平方μｍ、１，０００〜７，５００平方μｍ、１，０００〜５，０００平方μｍ、２，０００〜２０，０００平方μｍ、２，０００〜１５，０００平方μｍ、２，０００〜１０，０００平方μｍ、２，０００〜７，５００平方μｍ、２，０００〜６，０００平方μｍ、３，０００〜２０，０００平方μｍ、３，０００〜１５，０００平方μｍ、３，０００〜１０，０００平方μｍ、３，０００〜７，５００平方μｍ、又は３，０００〜６，０００平方μｍ。上記は単なる例であり、基端開口部（例えば、２３４）におけるチャネル（例えば、１２２）の断面積は、他の範囲（例えば、上記列挙された任意の端点により定義される範囲）であってもよい。
隔離ペンの様々な実施形態では、接続領域（例えば、２３６）の長さＬｃｏｎは、以下の任意の範囲内であり得る：約１〜６００μｍ、５〜５５０μｍ、１０〜５００μｍ、１５〜４００μｍ、２０〜３００μｍ、２０〜５００μｍ、４０〜４００μｍ、６０〜３００μｍ、８０〜２００μｍ、又は約１００〜１５０μｍ。上記は単なる例であり、接続領域（例えば、２３６）の長さＬｃｏｎは、上記例と異なる範囲（例えば、上記列挙される任意の終点により定義される範囲）内であることもできる。
隔離ペンの様々な実施形態では、基端開口部（例えば、２３４）での接続領域（例えば、２３６）の幅Ｗｃｏｎは、以下の任意の範囲内であり得る：２０〜５００μｍ、２０〜４００μｍ、２０〜３００μｍ、２０〜２００μｍ、２０〜１５０μｍ、２０〜１００μｍ、２０〜８０μｍ、２０〜６０μｍ、３０〜４００μｍ、３０〜３００μｍ、３０〜２００μｍ、３０〜１５０μｍ、３０〜１００μｍ、３０〜８０μｍ、３０〜６０μｍ、４０〜３００μｍ、４０〜２００μｍ、４０〜１５０μｍ、４０〜１００μｍ、４０〜８０μｍ、４０〜６０μｍ、５０〜２５０μｍ、５０〜２００μｍ、５０〜１５０μｍ、５０〜１００μｍ、５０〜８０μｍ、６０〜２００μｍ、６０〜１５０μｍ、６０〜１００μｍ、６０〜８０μｍ、７０〜１５０μｍ、７０〜１００μｍ、及び８０〜１００μｍ。上記は単なる例であり、基端開口部（例えば、２３４）の接続領域（例えば、２３６）の幅Ｗｃｏｎは、上記例と異なることができる（例えば、上記列挙される任意の終点により定義される範囲）。
隔離ペンの様々な実施形態において、基端開口部（例えば、２３４）における接続領域（例えば、２３６）の幅Ｗｃｏｎは、隔離ペンが意図される微小物体（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、卵子、又は胚であり得る生体細胞）の最大寸法と少なくとも同じ大きさであり得る。例えば、卵母細胞、卵子、又は胚が配置される隔離ペンの基端開口部２３４における接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎは、以下の任意の範囲であり得る：約１００μｍ、約１１０μｍ、約１２０μｍ、約１３０μｍ、約１４０μｍ、約１５０μｍ、約１６０μｍ、約１７０μｍ、約１８０μｍ、約１９０μｍ、約２００μｍ、約２２５μｍ、約２５０μｍ、約３００μｍ、又は約１００〜４００μｍ、約１２０〜３５０μｍ、約１４０〜２００〜２００ ３００μｍ、又は約１４０〜２００μｍ。上記は単なる例であり、基端開口部（例えば、２３４）における接続領域（例えば、２３６）の幅Ｗｃｏｎは、上記例と異なってもよい（例えば、上記列挙される任意の端点により定義される範囲）。
隔離ペンの様々な実施形態において、接続領域の基端開口部の幅Ｗｐｒは、隔離ペンが意図される微小物体（例えば、細胞等の生物学的微小物体）の最大寸法と少なくとも同じ大きさであり得る。例えば、幅Ｗｐｒは、約５０μｍ、約６０μｍ、約１００μｍ、約２００μｍ、約３００μｍ、又は約５０〜３００μｍ、約５０〜２００μｍ、約５０〜１００μｍ、約７５〜１５０μｍ、約７５〜１００μｍ、又は約２００〜３００μｍの範囲であり得る。
隔離ペンの様々な実施形態において、接続領域（例えば、２３６）の長さＬｃｏｎと基端開口部２３４における接続領域（例えば、２３６）の幅Ｗｃｏｎとの比率は、以下の任意の比率以上であり得る：０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、又はこれを超える比率。上記は単なる例であり、接続領域２３６の長さＬｃｏｎと基端開口部２３４における接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎとの比率は、上記例と異なってもよい。
マイクロ流体デバイスの様々な実施形態１００、２００、２３０、２５０、２８０、２９０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００において、Ｖｍａｘは、約０．２マイクロリッター／秒、約０．３マイクロリッター／秒、約０．４マイクロリッター／秒、約０．５マイクロリッター／秒、約０．６マイクロリッター／秒、約０．７マイクロリッター／秒、約０．８マイクロリッター／秒、約０．９マイクロリッター／秒、約１．０マイクロリッター／秒、約１．１マイクロリッター／秒、約１．２マイクロリッター／秒、約１．３マイクロリッター／秒、約１．４マイクロリッター／秒、又は約１．５マイクロリッター／秒に設定することができる。
隔離ペンを有するマイクロ流体デバイスの様々な実施形態において、隔離ペンの分離領域（例えば、２４０）の容積は、例えば、少なくとも５×１０５立方μｍ、少なくとも８×１０５立方μｍ、少なくとも１×１０６立方μｍ、少なくとも２×１０６立方μｍ、少なくとも４×１０６立方μｍ、少なくとも６×１０６立方μｍ、少なくとも８×１０６立方μｍ、少なくとも１×１０７立方μｍ、少なくとも５×１０７立方μｍ、少なくとも１×１０８立方μｍ、少なくとも５×１０８立方μｍ、少なくとも８×１０８立方μｍ、又はそれを超える容積であり得る。隔離ペンを有するマイクロ流体デバイスの様々な実施形態において、隔離ペンの容積は、約５×１０５立方μｍ、約６×１０５立方μｍ、約８×１０５立方μｍ、約１×１０６立方μｍ、約２×１０６立方μｍ、約４×１０６立方μｍ、約８×１０６立方μｍ、約１×１０７立方μｍ、約３×１０７立方μｍ、約５×１０７立方μｍ、又は約８×１０７立方μｍ、又はそれを超える容積であり得る。幾つかの他の実施形態では、隔離ペンの容積は、約１ナノリットル〜約５０ナノリットル、２ナノリットル〜約２５ナノリットル、２ナノリットル〜約２０ナノリットル、約２ナノリットル〜約１５ナノリットル、又は約２ナノリットル〜約１０ナノリットルであり得る。
様々な実施形態において、マイクロ流体デバイスは、本明細書に記載される任意の実施形態でのように構成された隔離ペンを有し、その場合、マイクロ流体デバイスは、約５〜約１０個の隔離ペン、約１０〜約５０個の隔離ペン、約１００〜約５００個の隔離ペン、約２００〜約１０００個の隔離ペン、約５００〜約１５００個の隔離ペン、約１０００〜約２０００個の隔離ペン、又は約１０００〜約３５００個の隔離ペンを有する。隔離ペンは、全て同じサイズである必要はなく、様々な構成（例えば、異なる幅、隔離ペン内の異なる特徴を含み得る。
図２Ｃは、一実施形態によるマイクロ流体デバイス２８０を示す。マイクロ流体デバイス２８０は図２Ｇに示され、マイクロ流体デバイス１００の定型化された図である。実際には、マイクロ流体デバイス２８０及びその構成回路要素（例えば、チャネル１２２及び隔離ペン１２８）は本明細書で考察された寸法を有する。図２Ｇに示されるマイクロ流体回路１２０は、２つのポート１０７、４つの別個のチャネル１２２、及び４つの別個の流路１０６を有する。マイクロ流体デバイス２８０は、各チャネル１２２に通じる複数の隔離ペンを更に含む。図２Ｇに示されるマイクロ流体デバイスでは、隔離ペンは、図２Ｃに示されるペンと同様のジオメトリを有し、したがって、接続領域及び分離領域の両方を有する。したがって、マイクロ流体回路１２０は、掃引領域（例えば、チャネル１２２及び２次フロー２４４の最大侵入深さＤｐ内の接続領域２３６の部分）及び非掃引領域（例えば、分離領域２４０及び２次フロー２４４の最大侵入深さＤｐ内にない接続領域２３６の部分）の両方を含む。
図３Ａ〜図３Ｂは、本発明によるマイクロ流体デバイス（例えば、１００、２００、２３０、２５０、２８０、２９０、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００）を動作させるため及び観測のために使用することができるシステム１５０の様々な実施形態を示す。図３Ａに示されるように、システム１５０は、マイクロ流体デバイス１００（図示せず）又は本明細書に記載される任意の他のマイクロ流体デバイスを保持するように構成された構造体（「ネスト」）３００を含むことができる。ネスト３００は、マイクロ流体デバイス３２０（例えば、光学的に作動される動電学的デバイス１００）と界面を接することができ、電源１９２からマイクロ流体デバイス３２０への電気接続を提供することができるソケット３０２を含むことができる。ネスト３００は、一体型電気信号生成サブシステム３０４を更に含むことができる。電気信号生成サブシステム３０４は、マイクロ流体デバイス３２０がソケット３０２により保持されているとき、バイアス電圧がマイクロ流体デバイス３２０内の電極の対にわたり印加されるように、バイアス電圧をソケット３０２に供給するように構成され得る。したがって、電気信号生成サブシステム３０４は電源１９２の部分であり得る。バイアス電圧をマイクロ流体デバイス３２０に印加する能力は、マイクロ流体デバイス３２０がソケット３０２により保持されている場合には常にバイアス電圧が印加されることを意味しない。むしろ、大半の場合、バイアス電圧は、断続的に、例えば、マイクロ流体デバイス３２０内での電気泳動又は電子ウェッティング等の動電力の生成を促進するために必要な場合にのみ印加される。
図３Ａに示されるように、ネスト３００は、プリント回路基板組立体（ＰＣＢＡ）３２２を含むことができる。電気信号生成サブシステム３０４は、ＰＣＢＡ３２２に搭載され、ＰＣＢＡ３２２に電気的に集積することができる。例示的な支持体は、同様にＰＣＢＡ３２２に搭載されるソケット３０２も含む。
通常、電気信号生成サブシステム３０４は波形生成器（図示せず）を含む。電気信号生成サブシステム３０４は、波形生成器から受信される波形を増幅するように構成されたオシロスコープ（図示せず）及び／又は波形増幅回路（図示せず）を更に含むことができる。オシロスコープは、存在する場合、ソケット３０２により保持されるマイクロ流体デバイス３２０に供給される波形を測定するように構成され得る。特定の実施形態では、オシロスコープは、マイクロ流体デバイス３２０の基端位置（及び波形生成器の先端位置）において波形を測定し、それにより、デバイスに実際に印加されている波形を測定するに当たりより大きい精度を保証する。オシロスコープ測定から得られるデータは、例えば、フィードバックとして波形生成器に提供され得、波形生成器は、そのようなフィードバックに基づいて出力を調整するように構成され得る。適する結合された波形生成器及びオシロスコープの例は、Red Pitaya（商標）である。
特定の実施形態では、ネスト３００は、電気信号生成サブシステム３０４の検知及び／又は制御に使用される、マイクロプロセッサ等のコントローラ３０８を更に含む。適するマイクロプロセッサの例としては、Arduino Nano（商標）等のArduino（商標）マイクロプロセッサが挙げられる。コントローラ３０８を使用して機能及び分析を実行し、又は外部マスタコントローラ１５４（図１Ａに示される）と通信して機能及び分析を実行し得る。図３Ａに示される実施形態では、コントローラ３０８は、インタフェース３１０（例えば、プラグ又はコネクタ）を通してマスタコントローラ１５４と通信する。
幾つかの実施形態では、ネスト３００は、Red Pitaya（商標）波形生成器／オシロスコープユニット（「Red Pitayaユニット」）を含む電気信号生成サブシステム３０４と、Red Pitayaユニットにより生成された波形を増幅し、増幅電圧をマイクロ流体デバイス１００に渡す波形増幅回路とを含むことができる。幾つかの実施形態では、Red Pitayaユニットは、マイクロ流体デバイス３２０での増幅電圧を測定し、次に、マイクロ流体デバイス３２０での測定電圧が所望の値であるように、必要に応じてそれ自体の出力電圧を調整するように構成される。幾つかの実施形態では、波形増幅回路は、ＰＣＢＡ３２２に搭載されるＤＣ−ＤＣコンバータの対により生成される＋６．５Ｖ〜−６．５Ｖ電源を有することができ、その結果、マイクロ流体デバイス１００において１３Ｖｐｐまでの信号が生成される。
図３Ａに示されるように、支持構造体３００は、熱制御サブシステム３０６を更に含むことができる。熱制御サブシステム３０６は、支持構造体３００により保持されるマイクロ流体デバイス３２０の温度を調整するように構成され得る。例えば、熱制御サブシステム３０６は、ペルチェ熱電デバイス（図示せず）及び冷却ユニット（図示せず）を含むことができる。ペルチェ熱電デバイスは、マイクロ流体デバイス３２０の少なくとも１つの表面と界面を接するように構成された第１の表面を有することができる。冷却ユニットは、例えば、液冷アルミニウムブロック等の冷却ブロック（図示せず）であり得る。ペルチェ熱電デバイスの第２の表面（例えば、第１の表面とは逆の表面）は、そのような冷却ブロックの表面と界面を接するように構成され得る。冷却ブロックは、冷却ブロックを通して冷却流体を循環させるように構成された流体路３１４に接続することができる。図３Ａに示される実施形態では、支持構造体３００は、流入口３１６及び流出口３１８を含む、外部リザーバ（図示せず）から冷却された流体を受け取り、冷却された流体を流体路３１４に導入し、冷却ブロックを通し、次に、冷却された流体を外部リザーバに戻す。幾つかの実施形態では、ペルチェ熱電デバイス、冷却ユニット、及び／又は流体路３１４は、支持構造体３００のケース３１２に搭載することができる。幾つかの実施形態では、熱制御サブシステム３０６は、ペルチェ熱電デバイスの温度を調整して、マイクロ流体デバイス３２０の標的温度を達成するように構成される。ペルチェ熱電デバイスの温度調整は、例えば、Pololu（商標）熱電電源（Pololu Robotics and Electronics Corp.）等の熱電電源により達成することができる。熱制御サブシステム３０６は、アナログ回路により提供される温度値等のフィードバック回路を含むことができる。代替的に、フィードバック回路はデジタル回路により提供され得る。
幾つかの実施形態では、ネスト３００は、抵抗（例えば、抵抗１ｋオーム＋／−０．１％、温度係数＋／−０．０２ｐｐｍ／Ｃ０）及びＮＴＣサーミスタ（例えば、公称抵抗１ｋオーム＋／−０．０１％を有する）を含むアナログ分圧回路（図示せず）であるフィードバック回路を有する熱制御サブシステム３０６を含むことができる。幾つかの場合、熱制御サブシステム３０６は、フィードバック回路からの電圧を測定し、次に、計算された温度値をオンボードＰＩＤ制御ループアルゴリズムへの入力として使用する。ＰＩＤ制御ループアルゴリズムからの出力は、例えば、Pololu（商標）モーター駆動デバイス（図示せず）上の方向信号及びパルス幅変調信号ピンの両方を駆動して熱電電源を作動させることができ、それにより、ペルチェ熱電デバイスを制御する。
ネスト３００はシリアルポート３５０を含むことができ、シリアルポート３２４により、コントローラ３０８のマイクロプロセッサは、インタフェース３１０（図示せず）を介して外部マスタコントローラ１５４と通信することができる。加えて、コントローラ３０８のマイクロプロセッサは、電気信号生成サブシステム３０４及び熱制御サブシステム３０６と通信することができる（例えば、Plinkツール（図示せず）を介して）。したがって、コントローラ３０８、インタフェース３１０、及びシリアルポート３２４の組合せを介して、電気信号生成サブシステム３０４及び熱制御サブシステム３０６は、外部マスタコントローラ１５４と通信することができる。このようにして、マスタコントローラ１５４は、特に、出力電圧調整のためにスケーリング計算を実行することにより電気信号生成サブシステム３０４を支援することができる。外部マスタコントローラ１５４に結合された表示デバイス１７０を介して提供されるグラフィカルユーザインタフェース（ＧＵＩ）（図示せず）は、熱制御サブシステム３０６及び電気信号生成サブシステム３０４からそれぞれ得られる温度データ及び波形データをプロットするように構成され得る。代替的に又は追加として、ＧＵＩは、コントローラ３０８、熱制御サブシステム３０６、及び電気信号生成サブシステム３０４への更新を可能にすることができる。
上述したように、システム１５０は撮像デバイス１９４を含むことができる。幾つかの実施形態では、撮像デバイス１９４は光変調サブシステム３３０（図３Ｂ参照）を含む。光変調サブシステム３３０は、デジタルミラーデバイス（ＤＭＤ）又はマイクロシャッタアレイシステム（ＭＳＡ）を含むことができ、これらのいずれかは、光源３３２から光を受け取り、受け取った光のサブセットを顕微鏡３５０の光学縦列に送るように構成され得る。代替的に、光変調サブシステム３３０は、有機発行ダイオードディスプレイ（ＯＬＥＤ）、液晶オンシリコン（ＬＣＯＳ）デバイス、強誘電性液晶オンシリコンデバイス（ＦＬＣＯＳ）、又は透過型液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）等のそれ自体の光を生成する（したがって、光源３３２の必要性をなくす）デバイスを含むことができる。光変調サブシステム３３０は、例えば、プロジェクタであり得る。したがって、光変調サブシステム３３０は、構造化光及び非構造化光の両方を発することが可能であり得る。適する光変調サブシステム４２２の一例は、Andor Technologies（商標）のMosaic（商標）システムである。特定の実施形態では、システム１５０の撮像モジュール１６４及び／又は原動モジュール１６２は、光変調サブシステム３３０を制御することができる。
特定の実施形態では、撮像デバイス１９４は顕微鏡３５０を更に含む。そのような実施形態では、ネスト３００及び光変調サブシステム３３０は、顕微鏡３５０に搭載されるように個々に構成され得る。顕微鏡３５０は、例えば、標準の研究等級の光学顕微鏡又は蛍光顕微鏡であるように構成され得る。したがって、ネスト３００は、顕微鏡３５０のステージ３４４に搭載するように構成され得、及び／又は光変調サブシステム３３０は、顕微鏡３５０のポートに搭載されるように構成され得る。他の実施形態では、本明細書に記載されるネスト３００及び光変調サブシステム３３０は、顕微鏡３５０の一体構成要素であり得る。
特定の実施形態では、顕微鏡３５０は１つ又は複数の検出器３４８を更に含むことができる。幾つかの実施形態では、検出器３４８は撮像モジュール１６４により制御される。検出器３４８は、接眼レンズ、電荷結合素子（ＣＣＤ）、カメラ（例えば、デジタルカメラ）、又はそれらの任意の組合せを含むことができる。少なくとも２つの検出器３４８が存在する場合、１つの検出器は、例えば、高速フレームレートカメラであり得、一方、他の検出器は高感度カメラであり得る。更に、顕微鏡３５０は、マイクロ流体デバイス３２０から反射された光及び／又は発せられた光を受け取り、反射光及び／又は放射光の少なくとも部分を１つ又は複数の検出器３４８に結像するように構成された光学縦列を含むことができる。顕微鏡の光学縦列は、各検出器での最終倍率が異なることができるように、異なる検出器で異なるチューブレンズ（図示せず）を含むこともできる。
特定の実施形態では、撮像デバイス１９４は、少なくとも２つの光源を使用するように構成される。例えば、第１の光源３３２は構造化光の生成（例えば、光変調サブシステム３３０を介した）に使用することができ、第２の光源３３４は非構造化光の提供に使用することができる。第１の光源３３２は、光学的に作動される動電学的及び／又は蛍光励起のために構造化光を生成することができ、第２の光源３３４は、明視野照明の提供に使用することができる。これらの実施形態では、原動モジュール１６４を使用して第１の光源３３２を制御することができ、撮像モジュール１６４を使用して第２の光源３３４を制御することができる。顕微鏡３５０の光学縦列は、（１）デバイスがネスト３００により保持されているとき、構造化光を光変調サブシステム３３０から受け取り、構造化光を光学作動式動電学的デバイス等のマイクロ流体デバイス内の少なくとも第１の領域で結像し、（２）マイクロ流体デバイスから反射された光及び／又は発せられた光を受け取り、そのような反射光及び／又は放射光の少なくとも部分を検出器３４８上に結像するように構成され得る。光学縦列は、デバイスがネスト３００により保持されているとき、非構造化光を第２の光源から受け取り、非構造化光をマイクロ流体デバイスの少なくとも第２の領域で結像するように更に構成され得る。特定の実施形態では、マイクロ流体デバイスの第１及び第２の領域は重複領域であり得る。例えば、第１の領域は、第２の領域のサブセットであり得る。
図３Ｂでは、光を光変調サブシステム３３０に供給している第１の光源３３２が示されており、光変調サブシステム３３０は構造化光をシステム３５５（図示せず）の顕微鏡３５０の光学縦列に提供する。ビームスプリッタ３３６を介して非構造化光を光学縦列に提供している第２の光源３３４が示される。光変調サブシステム３３０からの構造化光及びに示されるように、第２の光源３３４からの非構造化光は、ビームスプリッタ３３６から光学縦列を通って一緒に移動して、第２のビームスプリッタ（又は光変調サブシステム３３０によって提供される光に応じて、ダイクロイックフィルタ３３８）に到達し、ここで、光は反射し、対物レンズ３３６を通して試料面３４２まで下がる。次に、試料面３４２からの反射光及び／又は放射光は再び対物レンズ３４０を通って移動し、ビームスプリッタ及び／又はダイクロイックフィルタ３３８を通り、ダイクロイックフィルタ３４６に到達する。ダイクロイックフィルタ３４６に達する光の一部のみが透過され、検出器３４８に到達する。
幾つかの実施形態では、第２の光源３３４は青色光を発する。適切なダイクロイックフィルタ３４６を用いて、試料面３４２から反射された青色光は、ダイクロイックフィルタ３４６を透過し、検出器３４８に到達することが可能である。これとは対照的に、光変調サブシステム３３０から来る構造化光は、試料面３４２で反射されるが、ダイクロイックフィルタ３４６を透過しない。この例では、ダイクロイックフィルタ３４６は、４９５ｎｍよりも長い波長を有する可視光を濾波して除外する。光変調サブシステム３３０からの光のそのような濾波は、光変調サブシステムから発せられる光が４９５ｎｍよりも短いいかなる波長も含まない場合にのみ完了する（示されるように）。実際には、光変調サブシステム３３０から来る光が４９５ｎｍよりも短い波長（例えば、青色波長）を含む場合、光変調サブシステムからの光の幾らかがフィルタ３４６を透過して検出器３４８に到達する。そのような実施形態では、フィルタ３４６は、第１の光源３３２から検出器３４８に到達する光の量と第２の光源３３４から検出器３４８に到達する光の量とのバランスを変更する役割を果たす。これは、第１の光源３３２が第２の光源３３４よりもはるかに強力な場合、有益であり得る。他の実施形態では、第２の光源３３４は、赤色光を発することができ、ダイクロイックフィルタ３４６は、赤色光以外の可視光（例えば、６５０ｎｍよりも短い波長を有する可視光）を濾波して除外することができる。
被覆溶液及び被覆剤
理論による限定を意図せずに、マイクロ流体デバイス（例えば、ＤＥＰ構成及び／又はＥＷ構成マイクロ流体デバイス）内での生物学的微小物体（例えば、生体細胞）の維持は、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つ又は複数の内面が、マイクロ流体デバイスと内部に維持される生物学的微小物体との間の主な界面を提供する有機分子及び／又は親水性分子の層を提示するように調整又は被覆される場合に促進し得る（すなわち、生物学的微小物体は、マイクロ流体デバイス内で生存率の増大、より大きい増殖、及び／又はより大きい可搬性を示す）。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの内面の１つ又は複数（例えば、ＤＥＰ構成マイクロ流体デバイスの電極活性化基板の内面、マイクロ流体のカバー、及び／又は回路材料の表面）は、有機分子及び／又は親水性分子の所望の層を生成するように、被覆溶液及び／又は被覆剤により処理又は修飾し得る。
被覆は、生物学的微小物体を導入する前又は後に塗布してもよく、又は生物学的微小物体と同時に導入してもよい。幾つかの実施形態では、生物学的微小物体は、マイクロ流体デバイスの１つ又は複数の被覆剤を含む流体媒体中に搬入し得る。他の実施形態では、マイクロ流体デバイス（例えば、ＤＥＰ構成マイクロ流体デバイス）の内面は、生物学的微小物体をマイクロ流体デバイスに導入する前に、被覆剤を含む被覆溶液を用いて処理又は「プライミング」される。
幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの表面は、生物学的微小物体の維持及び／又は増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供する（例えば、後述するような調整面を提供する）被覆剤を含む。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの略全ての内面は被覆材料を含む。被覆された内面は、フロー領域（例えば、チャネル）の表面、チャンバの表面、隔離ペンの表面、又はそれらの組合わせを含み得る。幾つかの実施形態では、複数の隔離ペンのそれぞれは、被覆材料で被覆された少なくとも１つの内面を有する。他の実施形態では、複数のフロー領域又はチャネルのそれぞれは、被覆材料で被覆された少なくとも１つの内面を有する。幾つかの実施形態では、複数の隔離ペンのそれぞれ及び複数のチャネルのそれぞれの少なくとも１つの内面は、被覆材料で被覆される。
被覆剤／溶液
限定ではなく、血清又は血清因子、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ポリマー、洗剤、酵素、及びそれらの任意の組合わせを含む任意の従来の被覆剤／被覆溶液を使用することができる。
ポリマーベースの被覆材料
少なくとも１つの内面は、ポリマーを含む被覆材料を含み得る。ポリマーは、少なくとも１つの表面に共有結合又は非共有結合し得る（又は非特異的に付着し得る）。ポリマーは、ブロックポリマー（及びコポリマー）、星型ポリマー（星型コポリマー）、並びにグラフト又は櫛形ポリマー（グラフトコポリマー）に見られる等の多種多様な構造モチーフを有し得、これらは全て本明細書に開示される方法に適し得る。
ポリマーは、アルキレンエーテル部分を含むポリマーを含み得る。広範囲のアルキレンエーテル含有ポリマーが、本明細書に記載されるマイクロ流体デバイスでの使用に適し得る。アルキレンエーテル含有ポリマーの非限定的で例示的な一クラスは、ポリマー鎖内で異なる比率及び異なる場所にあるポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）サブユニット及びポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）サブユニットのブロックを含む両親媒性非イオンブロックコポリマーである。Pluronic（登録商標）ポリマー（ＢＡＳＦ）は、このタイプのブロックコポリマーであり、生細胞と接触する場合の使用に適することが当技術分野で既知である。ポリマーは、平均分子質量ＭＷで、約２０００Ｄａ〜約２０ＫＤａの範囲であり得る。幾つかの実施形態では、ＰＥＯ−ＰＰＯブロックコポリマーは、約１０よりも大きい（例えば、１２〜１８）の親水性親油性バランス（ＨＬＢ）を有することができる。被覆された表面をもたらすのに有用な特定のPluronic（登録商標）ポリマーは、Pluronic（登録商標）Ｌ４４、Ｌ６４、Ｐ８５、及びＦ１２７（Ｆ１２７ＮＦを含む）を含む。別のクラスのアルキレンエーテル含有ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ ＭＷ＜１００，０００Ｄａ）又は代替的にポリエチレンオキシド（ＰＥＯ、ＭＷ＞１００，０００）である。幾つかの実施形態では、ＰＥＧは約１０００Ｄａ、５０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、又は２０，０００ＤａのＭＷを有し得る。
他の実施形態では、被覆材料は、カルボン酸部分を含むポリマーを含み得る。カルボン酸サブユニットは、アルキル、アルケニル、又は芳香族部分含有サブユニットであり得る。非限定的な一例はポリ乳酸（ＰＬＡ）である。他の実施形態では、被覆材料は、ポリマー骨格の末端又はポリマー骨格からのペンダントのいずれかにリン酸部分を含むポリマーを含み得る。更に他の実施形態では、被覆材料は、スルホン酸部分を含むポリマーを含み得る。スルホン酸サブユニットは、アルキル、アルケニル、又は芳香族部分含有サブユニットであり得る。非限定的な一例はポリスチレンスルホン酸（ＰＳＳＡ）又はポリアネトールスルホン酸である。更なる実施形態では、被覆材料はアミン部分を含むポリマーを含み得る。ポリアミノポリマーは、天然ポリアミンポリマー又は合成ポリアミンポリマーを含み得る。天然ポリアミンの例としては、スペルミン、スペルミジン、及びプトレッシンが挙げられる。
他の実施形態では、被覆材料は、糖類部分を含むポリマーを含み得る。非限定的な例では、キサンタンガム又はデキストラン等のポリサッカリドが、マイクロ流体デバイスにおける細胞の突き刺しを低減又は阻止し得る材料を形成するのに適し得る。例えば、約３ｋＤａのサイズを有するデキストランポリマーを使用して、マイクロ流体デバイス内の表面に被覆材料を提供し得る。
他の実施形態では、被覆材料は、リボヌクレオチド部分又はデオキシリボヌクレオチド部分を有し、高分子電解質表面を提供し得る、ヌクレオチド部分、すなわち、核酸を含むポリマーを含み得る。核酸は、天然ヌクレオチド部分のみを含んでもよく、又は限定ではなく、７−デアザアデニン、ペントース、メチルホスホン酸、又はホスホロチオエート部分等の核酸塩基、リボース、リン酸塩部分類似物を含む非天然ヌクレオチド部分を含んでもよい。
更に他の実施形態では、被覆材料は、アミノ酸部分を含むポリマーを含み得る。アミノ酸部分を含むポリマーは、天然アミノ酸含有ポリマー又は非天然アミノ酸含有ポリマーを含み得、これらのいずれかはペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質を含み得る。非限定的な一例では、被覆剤として、タンパク質は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）並びに／或いはアルブミン及び／又は１つ又は複数の他の同様のタンパク質を含む血清（又は複数の異なる血清の組合わせ）であり得る。血清は、限定ではなく、ウシ胎仔血清、ヒツジ血清、ヤギ血清、ウマ血清等を含む任意の好都合のソースからのものであり得る。特定の実施形態では、被覆溶液中のＢＳＡは、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ、又はそれを超えるか、若しくはそれらの間の任意の値を含め、約１ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬの範囲で存在する。特定の実施形態では、被覆溶液中の血清は、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、又はそれを超えるか、若しくはそれらの間の任意の値を含め、約２０％（ｖ／ｖ）〜約５０％ｖ／ｖの範囲で存在し得る。幾つかの実施形態では、ＢＳＡは、５ｍｇ／ｍＬで被覆溶液中に被覆剤として存在し得、一方、他の実施形態では、ＢＳＡは、７０ｍｇ／ｍＬで被覆溶液中に被覆剤として存在し得る。特定の実施形態では、血清は、３０％で被覆溶液中に被覆剤として存在する。幾つかの実施形態では、フォスター細胞成長への細胞の付着を最適化するために、細胞外基質（ＥＣＭ）タンパク質を被覆材料内に提供し得る。被覆材料に包含し得る細胞基質タンパク質としては、限定ではなく、コラーゲン、エラスチン、ＲＧＤ含有ペプチド（例えば、フィブロネクチン）、又はラミニンを挙げることができる。更に他の実施形態では、成長因子、サイトカイン、ホルモン、又は他の細胞シグナリング種をマイクロ流体デバイスの被覆材料内に提供し得る。
幾つかの実施形態では、被覆材料は、アルキレンオキシド部分、カルボン酸部分、スルホン酸部分、リン酸塩部分、サッカリド部分、ヌクレオチド部分、又はアミノ酸部分の２つ以上を含むポリマーを含み得る。他の実施形態では、ポリマーの調整された表面は、被覆材料に独立して又は同時に組み込み得る、アルキレンオキシド部分、カルボン酸部分、スルホン酸部分、リン酸塩部分、サッカリド部分、ヌクレオチド部分、及び／又はアミノ酸部分をそれぞれ有する２つ以上のポリマーの混合物を含み得る。
共有結合される被覆材料
幾つかの実施形態では、少なくとも１つの内面は、マイクロ流体デバイス内の生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供して、そのような細胞に調整面を提供する共有結合分子を含む。
共有結合分子は結合基を含み、結合基は、後述するように、マイクロ流体デバイスの１つ又は複数の表面に共有結合する。結合基は、生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分にも共有結合する。
幾つかの実施形態では、生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される共有結合部分は、アルキル又はフルオロアルキル（ペルフルオロアルキルを含む）部分；モノ又はポリサッカリド（デキストランを含み得るが、これに限定されない）；アルコール（プロパルギルアルコールを含むが、これに限定されない）；ポリビニルアルコールを含むが、これに限定されないポリアルコール；ポリエチレングリコールを含み得るが、これに限定されないアルキレンエーテル；高分子電解質（ポリアクリル酸又はポリビニルホスホン酸を含むが、これに限定されない）；アミノ基（アルキル化アミン、モルホルニル又はピペラジニル等であるが、これらに限定されない非芳香族化された窒素環原子を含むヒドロキシアルキル化されたアミノ基、グアニジニウム基、及びヘテロ環基等であるが、これらに限定されないその誘導体）；プロピオル酸（カルボン酸塩アニオン表面を提供し得る）を含むが、これに限定されないカルボン酸；エチニルホスホン酸（ホスホン酸塩アニオン表面を提供し得る）を含むが、これに限定されないホスホン酸；スルホン酸アニオン；カルボキシベタイン；スルホベタイン；スルファミン酸；又はアミノ酸を含み得る。
様々な実施形態では、マイクロ流体デバイスにおける生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される共有結合部分は、アルキル部分、フルオロアルキル部分（ペルフルオロアルキル部分を含むが、これに限定されない）等の置換アルキル部分、アミノ酸部分、アルコール部分、アミノ部分、カルボン酸部分、ホスホン酸部分、スルホン酸部分、スルファミン酸部分、又はサッカリド部分等の非ポリマー部分を含み得る。代替的には、共有結合部分は、上述した任意の部分であり得るポリマー部分を含み得る。
幾つかの実施形態では、共有結合部分は、線状鎖（例えば、少なくとも１０個の炭素又は少なくとも１４、１６、１８、２０、２２、若しくはそれを超える個数の炭素の線状鎖）を形成する炭素原子を含むことができ、且つ直鎖アルキル部分であり得る。幾つかの実施形態では、アルキル基は置換アルキル基を含み得る（例えば、アルキル基の炭素の幾つかはフッ素化又はパーフルオロ化することができる）。幾つかの実施形態では、アルキル基は、非置換アルキル基を含み得る第２のセグメントに結合される、ペルフルオロアルキル基を含み得る第１のセグメントを含み得る。第１及び第２のセグメントは、直接又は間接的（例えば、エーテル結合により）に結合され得、ここで、アルキル基の第１のセグメントは、結合基の先端部に配置し得、アルキル基の第２のセグメントは、結合基の基端部に配置し得る。
他の実施形態では、共有結合部分は、２つ以上の種類のアミノ酸を含み得る少なくとも１つのアミノ酸を含み得る。したがって、共有結合部分は、ペプチド又はタンパク質を含み得る。幾つかの実施形態では、共有結合部分は、双性イオン性表面を提供して、細胞成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持し得るアミノ酸を含み得る。
他の実施形態では、共有結合部分は、少なくとも１つのアルキレンオキシド部分を含み得、上述した任意のアルキレンオキシドポリマーを含み得る。アルキレンエーテル含有ポリマーの有用な１クラスは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ Ｍｗ＜１００，０００Ｄａ）又は代替的にはポリエチレンオキシド（ＰＥＯ、Ｍｗ＞１００，０００）である。幾つかの実施形態では、ＰＥＧは約１０００Ｄａ、約５０００Ｄａ、約１０，０００Ｄａ、又は約２０，０００ＤａのＭｗを有し得る。
共有結合部分は１つ又は複数のサッカリドを含み得る。共有結合サッカリドはモノ、ジ、又はポリサッカリドであり得る。共有結合サッカリドは、表面に付着するような結合又は加工を可能にする反応ペア部分を導入するように修飾し得る。例示的な反応ペア部分は、アルデヒド、アルキン、又はハロ部分を含み得る。ポリサッカリドは、ランダムに修飾し得、各サッカリドモノマーが修飾されてもよく、又はポリサッカリド内のサッカリドモノマーの一部のみが、表面に直接若しくは間接的に結合され得る反応ペア部分を提供するように修飾される。一例は、直鎖リンカーを介して表面に間接的に結合され得るデキストランポリサッカリドを含み得る。
共有結合部分は１つ又は複数のアミノ基を含み得る。アミノ基は、置換アミン部分、グアニジン部分、窒素含有ヘテロ環部分又はヘテロアリール部分であり得る。アミノ含有部分は、マイクロ流体デバイス内及び任意選択的に隔離ペン及び／又はフロー領域（例えば、チャネル）内の環境のｐＨ変更を可能にする構造を有し得る。
調整面を提供する被覆材料は、一種のみの共有結合部分を含んでもよく、又は２つ以上の異なる種類の共有結合部分を含んでもよい。例えば、フルオロアルキル調整面（ペルフルオロアルキルを含む）は、全て同じ、例えば、表面への同じ結合基及び共有結合、同じ全体長、及びフルオロアルキル部分を含む同数のフルオロメチレン単位を有する複数の共有結合部分を有し得る。代替的には、被覆材料は、表面に付着する２種類以上の共有結合部分を有し得る。例えば、被覆材料は、指定された数のメチレン又はフルオロメチレン単位を有する共有結合アルキル又はフルオロアルキル部分を有する分子を含み得、被覆面においてより嵩張った部分を提示する能力をお提供し得る、より多数のメチレン又はフルオロメチレン単位を有するアルキル又はフルオロアルキル鎖に共有結合した荷電部分を有する更なる組の分子を更に含み得る。この場合、異なる、立体的に要求が余り厳しくない末端及びより少数の骨格原子を有する第１の組の分子は、基板表面全体を官能化し、それにより基板自体を構成するケイ素／酸化ケイ素、酸化ハフニウム、又はアルミナへの望ましくない付着又は接触を回避するのに役立つことができる。別の例では、共有結合部分は、表面上でランダムに交流電荷を提示する両性イオン表面を提供し得る。
調整面特性
調整された表面の組成以外で、疎水性材料の物理的厚さ等の他の要因がＤＥＰ力に影響し得る。調整された表面が基板に形成される様式（例えば、蒸着、液相堆積、スピンコーティング、フラッディング、及び静電コーティング）等の様々な要因が調整された表面の物理的厚さを変更し得る。幾つかの実施形態では、調整面は、約１ｎｍ〜約１０ｎｍ、約１ｎｍ〜約７ｎｍ、約１ｎｍ〜約５ｎｍ、又はそれらの間の任意の個々の値の厚さを有する。他の実施形態では、共有結合部分により形成される調整面は、約１０ｎｍ〜約５０ｎｍの厚さを有し得る。様々な実施形態では、本明細書において記載されるように準備される調整面は、１０ｎｍ未満の厚さを有する。幾つかの実施形態では、調整面の共有結合部分は、マイクロ流体デバイスの表面（例えば、ＤＥＰ構成基板表面）に共有結合した場合、単層を形成し得、１０ｎｍ未満（例えば、５ｎｍ未満又は約１．５ｎｍ〜３．０ｎｍ）の厚さを有し得る。これらの値は、約３０ｎｍの範囲の厚さを有するＣＹＴＯＰ（登録商標）（Asahi Glass Co., Ltd.、日本）フルオロポリマースピンコーティングの厚さとは対照的である。幾つかの実施形態では、調整面は、ＤＥＰ構成マイクロ流体デバイス内での動作に適宜機能的であるために、完全に形成された単層を必要としない。
様々な実施形態では、マイクロ流体デバイスの調整面を提供する被覆材料は、所望の電気特性を提供し得る。理論による限定を意図せずに、特定の被覆材料が被覆された表面の堅牢性に影響する一因子は、本質的に電荷捕獲である。異なる被覆材料は電子を捕獲し得、これは被覆材料の破壊に繋がる恐れがある。被覆材料の欠陥は、電荷捕獲を増大させ、被覆材料の更なる破壊に繋がる恐れがある。同様に、異なる被覆材料は異なる絶縁耐力（すなわち、絶縁破壊が生じる最小印加電場）を有し、これは電荷捕獲に影響を有し得る。特定の実施形態では、被覆材料は、その電荷捕獲量を低減又は制限する全体構造（例えば、高密度単層構造）を有することができる。
調整された表面は、その電気特性に加えて、生体分子との併用に有利な特性を有することもできる。例えば、フッ化（又はパーフルオロ化）炭素鎖を含む調整された表面は、表面ファウリング量を低減するに当たり、アルキル末端鎖と比較して利点を提供し得る。表面ファウリングは、本明細書で使用される場合、タンパク質及びその老廃物、核酸及び各老廃物等のバイオ材料の永久的又は半永久的な堆積を含み得る、マイクロ流体デバイスの表面への無差別材料堆積量を指す。
単一又は複数パートの調整面
共有結合被覆材料は、後述するように、マイクロ流体デバイスにおける生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分を既に含む分子の反応により形成し得る。代替的には、共有結合被覆材料は、生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分を、それ自体が表面に共有結合した表面修飾リガンドに結合することにより、２部シーケンスで形成し得る。
共有結合された被覆材料を準備する方法
幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの表面（例えば、隔離ペン及び／又はフロー領域の少なくとも１つの表面を含む）に共有結合した被覆材料は、式１又は式２の構造を有する。被覆材料は、表面に１ステップで導入される場合、式１の構造を有し、一方、被覆材料は、複数ステッププロセッサで導入される場合、式２の構造を有する。
Figure 2019502365
被覆材料は、ＤＥＰ構成又はＥＷ構成基板の表面の酸化物に供給結合し得る。ＤＥＰ又はＥＷ構成基板は、ケイ素、酸化ケイ素、アルミナ、又は酸化ハフニウムを含み得る。酸化物は、基板の元の化学構造の一部として存在してもよく、又は後述するように導入し得る。
被覆材料は、結合基（「ＬＧ」）を介して酸化物に結合し得、ＬＧは、シロキサン基又はホスホン酸基と酸化物との反応から形成されるシロキシ又はホスホネートエステル基であり得る。マイクロ流体デバイスにおける生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分は、本明細書に記載される任意の部分であり得る。結合基ＬＧは、マイクロ流体デバイスにおける生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分に直接又は間接的に接続し得る。結合基ＬＧがその部分に直接接続される場合、任意選択的なリンカーＬは存在せず、ｎは０である。結合基ＬＧが部分に間接的に接続される場合、リンカーＬが存在し、ｎは１である。リンカーＬは、線状部の骨格が、当技術分野で既知の化学結合制約を受けるケイ素原子、炭素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、及びリン原子の任意の組合せから選択される１〜２００個の非水素原子を含み得る線状部を有し得る。それは、エーテル基、アミノ基、カルボニル基、アミド基、又はリン酸基、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、又はヘテロ環基からなる群から選択される１つ又は複数の部分の任意の組合せで中断され得る。幾つかの実施形態では、リンカーＬの骨格は１０〜２０個の炭素を含み得る。他の実施形態では、リンカーＬの骨格は約５原子〜約２００原子、約１０原子〜約８０原子、約１０原子〜約５０原子、又は約１０原子〜約４０原子を含み得る。幾つかの実施形態では、骨格原子は全て炭素原子である。
幾つかの実施形態では、生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分は、複数ステッププロセスで基板の表面に追加し得、上で示された式２の構造を有する。この部分は、上述した任意の部分であり得る。
幾つかの実施形態では、結合基ＣＧは、反応部分Ｒｘとペアとなる反応部分Ｒｐｘ（すなわち、反応部分Ｒｘと反応するように構成される部分）との反応の結果生成される基を表す。例えば、典型的な１つの結合基ＣＧはカルボキサミジル（carboxamidyl）基を含み得、これは、アミノ基と、活性化エステル、酸クロリド等のカルボン酸の誘導体との反応の結果である。他のＣＧは、トリアゾリレン（triazolylene）基、カルボキサミジル（carboxamidyl）、チオアミジル、オキシム、メルカプチル（mercaptyl）、二硫化物、エーテル、又はアルケニル基、又は反応部分とペアとなる各反応部分との反応時に形成し得る任意の他の適する基を含み得、結合基ＣＧは、リンカーＬの第２の端部（すなわち、マイクロ流体デバイスにおける生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分に近い端部）に配置し得、これは上述した要素の任意の組合せを含み得る。幾つかの他の実施形態では、結合基ＣＧは、リンカーＬの骨格を中断し得る。結合基ＣＧは、トリアゾリレン（triazolylene）である場合、クリック結合反応からの結果である産物であり得、更に置換し得る（例えば、ジベンゾシクロオクチル溶融トリアゾリレン（triazolylene）基）。
幾つかの実施形態では、被覆材料（又は表面修飾リガンド）は、化学蒸着を使用してマイクロ流体デバイスの内面に堆積する。蒸着プロセスは任意選択的に、例えば、溶媒浴への露出、超音波処理、又はそれらの組合せにより、カバー１１０、マイクロ流体回路材料１１６、及び／又は基板（例えば、ＤＥＰ構成基板の電極活性化基板２０６の内面２０８又はＥＷ構成基板の支持構造体１０４の誘電層）を予めクリーニングすることにより改善することができる。代替又は追加として、そのような事前クリーニングは、カバー１１０、マイクロ流体回路材料１１６、及び／又は基板を酸素プラズマクリーナにおいて処理することを含むことができ、酸素プラズマクリーナは、様々な不純物を除去することができ、それと同時に酸化表面（例えば、表面における酸化物、本明細書に記載されるように共有結合的に修飾し得る）を導入することができる。代替的には、塩酸と過酸化水素との混合物又は硫酸と過酸化水素との混合物（例えば、硫酸と過酸化水素との比率が約３：１〜約７：１であり得るピラニア溶液）等の液相処理を酸素プラズマクリーナの代わりに使用することもできる。
幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイス２００が組み立てられて、マイクロ流体回路１２０を画定するエンクロージャ１０２を形成した後、蒸着を使用して、マイクロ流体デバイス２００の内面を被覆し得る。理論による限定を意図せずに、そのような被覆材料を完全に組み立てられたマイクロ流体回路１２０に堆積させることは、マイクロ流体回路材料１１６と電極活性化基板２０６の誘電層及び／又はカバー１１０との結合の弱化により生じる剥離を回避するに当たり有利であり得る。２ステッププロセスが利用される実施形態では、表面修飾リガンドは、上述したように蒸着を介して導入し得、続けて、生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分が導入される。続く反応は、表面修飾マイクロ流体デバイスを溶液中の適する結合試薬に露出させることにより実行し得る。
図２Ｈは、調整面を提供する例示的な共有結合被覆材料を有するマイクロ流体デバイス２９０の断面図を示す。示されるように、被覆材料２９８（概略的に示される）は、マイクロ流体デバイス２９０の基板２８６の内面２９４及びカバー２８８の内面２９２の両方に共有結合した高密度分子の単層を含むことができる。被覆材料２９８は、幾つかの実施形態では、上述したように、マイクロ流体デバイス２９０内の回路要素及び／又は構造の画定に使用されるマイクロ流体回路材料（図示せず）の表面を含む、マイクロ流体デバイス２９０のエンクロージャ２８４に近くエンクロージャ２８４に向かって内側に面する略全ての内面２９４、２９２に配置することができる。代替の実施形態では、被覆材料２９８は、マイクロ流体デバイス２９０の内面の１つのみ又は幾つかに配置することができる。
図２Ｈに示される実施形態では、被覆材料２９８は、オルガノシロキサン分子の単層を含むことができ、各分子は、シロキシリンカー２９６を介してマイクロ流体デバイス２９０の内面２９２、２９４に共有結合する。上記の被覆材料２９８のいずれかを使用することができ（例えば、アルキル末端、フルオロアルキル末端部分、ＰＥＧ末端部分、デキストラン末端部分、又はオルガノシロキサン部分に正電荷又は負電荷を含む末端部分）、末端部分は、エンクロージャに面する末端に配置される（すなわち、内面２９２、２９４に結合されず、エンクロージャ２８４に近い被覆材料２９８の単層の部分）。
他の実施形態では、マイクロ流体デバイス２９０の内面２９２、２９４の被覆に使用される被覆材料２９８はアニオン部分、カチオン部分、両性イオン部分、又はそれらの任意の組合せを含むことができる。理論による限定を意図せずに、カチオン部分、アニオン部分、及び／又は両性イオン部分をマイクロ流体回路１２０のエンクロージャ２８４の内面に提示することにより、被覆材料２９８は、その結果生成される水和の水が、生物学的微小物体を非生物学的分子（例えば、基板のケイ素及び／又は酸化ケイ素）との相互作用から分離する層（又は「シールド」）として機能するような、強力な水との水素結合を形成することができる。加えて、被覆材料２９８が被覆剤と併用される実施形態では、被覆材料２９８のアニオン、カチオン、又は両性イオンは、エンクロージャ２８４内の媒体１８０（例えば、被覆溶液）中に存在する非共有結合被覆剤（例えば、溶液中のタンパク質）の荷電部分とイオン結合を形成することができる。
更に他の実施形態では、被覆材料は、エンクロージャに面した末端において親水性被覆剤を含み得るか、又は提示するように化学的に修飾し得る。幾つかの実施形態では、被覆材料は、ＰＥＧ等のアルキレンエーテル含有ポリマーを含み得る。幾つかの実施形態では、被覆材料は、デキストラン等のポリサッカリドを含み得る。上述した荷電部分（例えば、アニオン部分、カチオン部分、及び両性イオン部分）のように、親水性被覆剤は、その結果生成される水和の水が、生物学的微小物体を非生物学的分子（例えば、基板のケイ素及び／又は酸化ケイ素）との相互作用から分離する層（又は「シールド」）として機能するような、強力な水との水素結合を形成することができる。
適切な被覆処理及び修飾の更なる詳細については、２０１６年４月２２日に出願された米国特許出願公開第１５／１３５，７０７号において見出し得、この特許出願は全体的に参照により本明細書に援用される。
マイクロ流体デバイスの隔離ペン内の細胞の生存性を維持する追加のシステム構成要素
細胞集団の成長及び／又は増殖を促進するために、システムの追加の構成要素により、機能的な細胞の維持を促す環境状況を提供し得る。例えば、そのような追加の構成要素は、栄養素、細胞成長シグナリング種、ｐＨ調整、ガス交換、温度制御、及び細胞からの老廃物の除去を提供することができる。
インサイチュー生成分離構造
マイクロ流体細胞操作の多くの用途では、そのような微小物体、細胞、ビーズ等マイクロ流体内容物の光学フィードバックに基づいて、マイクロ流体環境内で構造を変更する能力を有することが有用である。リアルタイム情報を使用して、マイクロ流体フィールド内で弁機能を変更し、培地フローを向け、マイクロ流体チップの選択された部分に細胞を向け、細胞を選択するようにマイクロ流体デバイスに変更を加えることは困難であった。加えて、微小物体を処理する方法の一環として、構造を除去することが望ましいことがある。光学的に作動する誘電泳動又はオプトエレクトロウェッティング細胞及び流体操作モードは、これらの機能の多くにとって非常に有用であるが、マイクロ流体デバイス内のマイクロ流体フロー領域及びペン環境を変更し、内部の細胞及び流体を選択し、分離し、方向付けるリアルタイムの能力を提供する更に別の微小物体及び培地フロー操作モードが望ましい。
本明細書に記載のように、驚くべきことに、多種多様な分離構造をマイクロ流体（又はナノ流体）デバイス内においてインサイチューで生成可能なことが発見された。多くの実施形態では、インサイチュー生成分離構造は、全体的な生存性を妨げずに、生体細胞が存在する状態で製作し得る。これらのインサイチュー分離構造は、特に、マイクロ流体デバイス内の細胞の組から１つの細胞を選択的に分離するか、培地フロー、試料含有フロー、若しくは試薬フローを選択的且つ可逆的に弁で調節するか、希釈入力ソースから細胞を濃縮させるか、同じデバイス内のクローン集団からの細胞をアッセイするか、層流を制御するか、層流を選択的に混合するか、又は細胞株の開発を指示するのに使用し得る。本出願人は、インサイチュー生成分離構造を有するこれらのクラスのデバイスのマイクロ流体デバイス、組成物、及び使用方法について説明する。
基板、エンクロージャ内に配置されるフロー領域、及び基板に配置される少なくとも１つのインサイチュー生成分離構造を含むエンクロージャを含むマイクロ流体（又はナノ流体）デバイスが提供される。インサイチュー生成分離構造は、固化ポリマー網目構造を含み得る。固化ポリマー網目構造は、光開始ポリマーを含み得る。幾つかの実施形態では、固化ポリマー網目構造は、シリコーンポリマーを含まない。幾つかの実施形態では、固化ポリマー網目構造は、ケイ素を含まない。幾つかの実施形態では、固化ポリマー網目構造は、感熱性ポリマーを含み得る。固化ポリマー網目構造は、インサイチューで固化し得る。インサイチュー生成分離構造の全て又は一部は、固化ポリマー網目構造からなり得る。
インサイチュー生成分離構造は、完全に閉じられた構造、微小物体の通過を許容するのに十分に大きい開口部を周縁の一部に有する構造、バリア、又はそれらの任意の組合せであり得る。幾つかの実施形態では、インサイチュー生成分離構造は、ペンのように構成され得る。幾つかの非限定的な例を図９Ｃ、図９Ｄ、及び図１１Ｂに示す。インサイチュー生成分離構造は、１つ又は複数の微小物体又は複数の微小物体のサブセットの分離に都合のよい任意の形状で構成され得る。インサイチュー生成分離構造は、単一の細胞を含むサイズであってもよく、又は複数の細胞を含んでもよい。インサイチュー生成分離構造は、分離領域及び接続領域を有し、接続領域がフロー領域（フローチャネルであり得る）への基端開口部を有し、且つ分離領域への先端開口部を有する、隔離ペンのように構成され得る。幾つかの実施形態では、インサイチュー生成分離構造は、フロー領域／チャネルへの開口部を有するペンであり得るが、インサイチュー生成ペンは、隔離ペンの接続領域を必ずしも有する必要はない。
インサイチュー生成分離構造は、インサイチュー生成バリアであることもできる。インサイチュー生成ペン又はバリアは、一緒になってペン又はバリアを形成する複数のインサイチュー生成モジュールを含み得る。様々な実施形態では、少なくとも１つのインサイチュー生成分離構造は、フロー領域に配置される複数のインサイチュー生成分離モジュールを含み得、インサイチュー生成分離モジュールは、少なくとも１つのインサイチュー生成分離構造に入る、少なくとも１つのインサイチュー生成分離構造から出る、及び／又は少なくとも１つのインサイチュー生成分離構造を通る微小物体の通過をサイズに応じて実質的に制限するように構成され得る。幾つかの実施形態では、複数のインサイチュー生成分離モジュールのそれぞれは、５ミクロン以上の直径を有する微小物体が少なくとも１つのインサイチュー生成分離構造に入る、少なくとも１つのインサイチュー生成分離構造から出る、及び／又は少なくとも１つのインサイチュー生成分離構造を通ることを実質的に阻止し得るように互いから離間され得る。幾つかの実施形態では、複数のインサイチュー生成分離モジュールは、２つの異なるタイプの生物学的微小物体を区別し、第１のタイプの生物学的微小物体を少なくとも１つのインサイチュー生成分離構造内外に通し、第２のタイプの生物学的微小物体が少なくとも１つのインサイチュー生成分離構造に入る、少なくとも１つのインサイチュー生成分離構造から出る、及び／又は少なくとも１つのインサイチュー生成分離構造を通ることを実質的に阻止するように構成され得る。様々な実施形態では、複数のインサイチュー生成分離モジュールは、微小ビーズが少なくとも１つのインサイチュー生成分離構造に入る、少なくとも１つのインサイチュー生成分離構造から出る、及び／又は少なくとも１つのインサイチュー生成分離構造を通ることを実質的に阻止するように構成され得る。
幾つかの実施形態では、２つ以上のインサイチュー生成分離構造をマイクロ流体デバイス内に生成し得る。マイクロ流体デバイスは、複数のインサイチュー生成分離構造を有し得る。２つ以上のインサイチュー生成分離構造がマイクロ流体デバイスにおいて生成される場合、２種類以上のインサイチュー生成分離構造を任意の組合せで生成し得る。
インサイチュー生成分離構造は、一時的であるように設計してもよく、又はマイクロ流体デバイスで実行中の実験／アッセイ／ソート／クローン化プロセスが終わるまで定位置に保持してもよい。インサイチュー生成分離構造の固化ポリマー網目構造は、フロー領域を通る増大した流体フロー、加水分解、タンパク質分解、浸透圧変更、温度変更、又は光学照明の適用により、少なくとも部分的に除去可能であり得る。幾つかの実施形態では、インサイチュー生成分離構造の少なくとも一部は、非限定的な一例として、フロー領域中の流体媒体のフローを使用して除去可能であり得る。
幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスは、複数のインサイチュー生成ペンを更に含み得る。複数のインサイチュー生成ペンのそれぞれは、互いに隣接して配置されるように配置し得る。複数のインサイチュー生成ペンのそれぞれは、互いに連続して配置される基端開口部を有し得る。幾つかの実施形態では、２つ以上の複数のインサイチュー生成ペンをフロー領域内に形成し得、又は各チャネルに沿って配置されるインサイチュー生成ペンを有する複数のチャネルがあり得る。図９Ｃ、図９Ｄ、及び図１１Ｂは、様々なインサイチュー生成ペンを示す。
マイクロ流体（又はナノ流体）デバイスは、少なくとも１つの隔離ペンを更に含み得、隔離ペンは、分離領域及び接続領域を含み得、接続領域は、フロー領域への基端開口部と、分離領域への先端開口部とを有する。幾つかの実施形態では、隔離ペンは、インサイチュー生成分離構造であり得る。様々な実施形態では、少なくとも１つの隔離ペンは、インサイチュー生成分離構造ではない。幾つかの実施形態では、インサイチュー生成分離構造は、インサイチュー生成バリアを含み得る。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスは、複数の隔離ペンを更に含み得る。デバイスは、マイクロ流体チャネルを更に含み得る。複数の隔離ペンは、チャネルに沿って互いに隣接して配置し得る。複数の隔離ペンのそれぞれは、行に並べられ得、複数の各隔離ペンは、マイクロ流体チャネルの１つの側において開く（例えば、マイクロ流体チャネルを画定する壁から共通の方向において開く）。幾つかの実施形態では、２つ以上の複数の隔離ペンがフロー領域内に存在してもよく、又は各チャネルに沿って配置される隔離ペンを有する複数のチャネルがあり得る。２つ以上の複数の隔離ペンがマイクロ流体デバイスのフロー領域内に存在する場合、複数の隔離ペンの１つ又は複数は、インサイチュー生成分離構造内にあり得る。代替的には、それぞれ複数の隔離ペン内において、隔離ペンの幾つか又は全ては、インサイチュー生成隔離ペン内にあり得る。
フロー領域への隔離ペンの基端開口部は、フロー領域における流体媒体のフローに略平行して向け得る。幾つかの実施形態では、フロー領域への隔離ペンの基端開口部は、流体媒体のフローを直接受け取らないように向け得る。フロー領域（又はフローチャネル）における流体媒体は、実質的に拡散のみにより隔離ペンの分離領域内の流体媒体と交換し得る。基端開口部は、微小物体が、いくらかの流れを受け取る場合であっても隔離ペンから出ることを阻止するように、流体フローに対して傾斜して向け得る。インサイチュー生成分離構造はリアルタイムで生成し得るため、向きは、フローに対して直角でなくてよく、又はフローに対して直角ではないように選択し得る。
幾つかの実施形態では、固化ポリマー網目構造は、微小物体のフローに対して透過性であるように構成され得る。固化ポリマー網目構造は、複数の微小物体の少なくともサブセットに対して透過性でなくてよい。幾つかの実施形態では、固化ポリマー網目構造は、約５００ｎｍ超、約６００ｎｍ超、約７００ｎｍ超、約８００ｎｍ超、約９００ｎｍ超、約１ミクロン超、約２ミクロン超、約３ミクロン超、約４ミクロン超、約５ミクロン超、約６ミクロン超、約７ミクロン超、約８ミクロン超、約９ミクロン超、約１０ミクロン超、約１１ミクロン超、約１２ミクロン超、約１３ミクロン超、約１４ミクロン超、約１５ミクロン超、又はそれよりも大きい直径を有する微小物体に対して略透過性ではない。
固化ポリマー網目構造は、光開始ポリマーから形成された少なくとも一部を更に有し得る。幾つかの実施形態では、固化ポリマー網目構造の全ては、光開始ポリマーから形成し得る。他の実施形態では、固化ポリマー網目構造は、感熱性ポリマーから形成された少なくとも一部を有し得る。幾つかの実施形態では、固化ポリマー網目構造のポリマーは、合成ポリマー、修飾合成ポリマー、又は生体ポリマーであり得る。生体ポリマーは、光又は温度で活性化可能であり得る。合成ポリマー修飾は、サイズ変更モチーフ、切断モチーフ、又は細胞認識モチーフを含み得る。幾つかの実施形態では、ポリマーは、修飾ポリエチレングリコールであり得る。固化ポリマー網目構造は、本明細書に記載され、より十分に後述する任意の適するポリマーであり得る。
マイクロ流体デバイスは熱パッドを更に含み得る。熱パッドは、基板のインサイチュー生成分離構造の位置に配置し得る。熱パッドは、高い熱伝導性を有し、任意選択的に可視及び／又は赤外線電磁放射線を吸収する材料を含み得る。熱パッドは、金属形状を基板上に退陣することにより製作し得る。熱パッドは、光源により励起して熱を生成することができる任意のタイプの金属を含むことができる。適する金属としては、クロム、金、銀、アルミニウム、インジウムスズ酸化物、又はそれらの任意の組合せが挙げられる。複数の金属、例えば、クロムの層、チタンの層、金の層は、多層熱パッドにおいて組み合せ得る。他の金属（及び合金）も当技術分野で既知である。熱パッドは、連続金属表面を含むこともでき、又は金属のパターン（例えば、ドット、正方形、線、円錐、不規則形等の金属形状）を含むこともできる。幾つかの実施形態では、熱パッドは、インサイチュー生成分離構造が生成されることになる／生成された位置の全て又は一部の下に配置し得る。熱パッドを使用して、インサイチュー生成分離構造をゲル化、膨張、縮小、又は除去するための熱を生成し得る。熱は、そのようなゲル化、膨張、縮小、又は除去が望まれるマイクロ流体デバイスの位置に光を向けることにより生成し得る。代替的には、熱は、電気的に（例えば、熱パッドの一部又は熱パッドに結合される電気抵抗により）生成し得る。
マイクロ流体デバイスはカバーを含み得、カバーは、インサイチュー生成分離構造の固化ポリマー網目構造を形成するためにポリマーを光活性化する範囲内の波長を有する照明を実質的に透過し得る。カバーは、インサイチュー生成分離構造の光切断及び光分解に適した範囲の照明を実質的に透過することもでき、それにより構造の縮小及び／又は削除を可能にする。様々な実施形態では、カバーは、カバーに向けられた光の約４０％超、約５０％超、約６０％超、約７０％超、約８０％超、又は約９０％超を透過し得る。カバーは、より低い光透過率を有してもよく、それもなお露出時間を増大させることにより利用することができる。
マイクロ流体（又はナノ流体）デバイスのエンクロージャは、選択セクタを更に含み得る。幾つかの実施形態では、エンクロージャは分離セクタを含むこともできる。フロー領域は、選択セクタの部分であり得、分離セクタ内に更に延在し得る。フロー領域は、選択セクタ、分離セクタ、又は両方に配置し得るチャネルとして構成され得る。幾つかの実施形態では、フロー領域は、選択セクタにチャネルを有さず、分離セクタにチャネルを有し得る。他の実施形態では、フロー領域は、選択セクタ及び分離セクタの両方を占める。インサイチュー生成分離構造は選択セクタに配置し得る。図５Ａ、図５Ｂ、図６、図７、図８、図９Ａ、図９Ｂ、図１１Ｂ、図１３Ａ〜図１３Ｃ、及び図１７は、選択セクタにおけるインサイチュー生成分離構造の幾つかの例である。
他の実施形態では、インサイチュー生成分離構造は分離セクタに配置し得る。図９Ｃ、図９Ｄ、図１０Ｃ、図１２Ｂ、図１６、及び図１９Ｂは、分離セクタに配置された分離構造の非限定的な例を示す。分離セクタは、チャネルに沿って更に配置し得る少なくとも１つの隔離ペンを含み得る。幾つかの実施形態では、分離セクションは複数の隔離ペンを含み得る。分離セクタ内の１つ又は複数の隔離ペンは、インサイチュー生成分離構造内にあり得る。例えば、図９Ｄ又は図１１Ｂのインサイチュー生成分離構造の構成及び寸法に応じて、これらの構造は隔離ペンと見なし得る。分離セクタは、インサイチュー生成分離構造内にない少なくとも１つの隔離ペンを含み得る。
インサイチュー生成分離構造は、フロー領域に配置され、複数の微小物体の少なくとも１つが出ることを阻止するように構成される複数のインサイチュー生成分離モジュールを有し得る。複数のインサイチュー生成分離モジュールは、インサイチュー生成バリアモジュールと同義で呼ばれ得、インサイチュー生成分離モジュールにより形成される全体的なインサイチュー生成分離構造は、本明細書ではインサイチュー生成バリアと呼ばれるインサイチュー生成分離構造のグループのメンバであり得る。図６、図７、図８Ａ、図８Ｂ、図９Ａ〜図９Ｃは非限定的な例を示す。インサイチュー生成分離モジュールを使用して、より大きい微小物体（例えば、生体細胞）を保持しながら、より小さい微小物体を差別的に透過させ得る。例えば、ビーズ又は微小ビーズ等の微小物体は、約１ミクロン〜約５ミクロン、約５ミクロン〜約１０ミクロン、又は約５ミクロン〜約１５ミクロンの範囲の直径を有し得る。これとは対照的に、生体細胞は、例えば、細菌細胞の場合、約２ミクロン〜約５ミクロン、真核動物体細胞の場合、約９ミクロン〜約３０ミクロン、真核植物細胞の場合、約１０ミクロン〜約１００ミクロン、及びヒト卵母細胞の場合、約１００ミクロンの直径を有し得る。各複数のインサイチュー生成分離モジュールは、特定の直径の微小物体が、そうして形成されたインサイチュー生成バリアに入る、インサイチュー生成バリアから出る、及び／又はインサイチュー生成バリアを通ることを阻止する距離で互いから離間され得る。インサイチュー生成バリアモジュール間の開口部のサイズは、複数の微小物体の少なくとも１つのサブセットがインサイチュー生成分離構造から出ることを阻止するようなサイズであり得る。非限定的な一例では、約１０ミクロン未満の直径を有するビーズ又は微小ビーズは、約１０ミクロン離間されたモジュールを有するインサイチュー生成バリアを通過し得、一方、１０ミクロン以上の直径を有するヒト細胞は、インサイチュー生成バリアモジュールに入る、インサイチュー生成バリアモジュールから出る、及び／又はインサイチュー生成バリアモジュールを通ることを阻止され得る。したがって、インサイチュー生成分離構造は、あるタイプの微小物体を第２のタイプの微小物体からソートするように機能するインサイチュー生成バリアであり得、ここで、微小物体は約１ミクロン〜約２０ミクロンの範囲の直径を有する。例えば、サイズの異なる生体細胞を含む複数のタイプの微小物体を含む試料は、試料をマイクロ流体デバイスのフロー領域の、バリアモジュールを含むインサイチュー生成バリアを有するセクタに導入することによりソートし得る。バリアは、より大きい細胞がインサイチュー生成バリアを通過することを阻止しながら、より小さい細胞にバリアのギャップを透過させるようなサイズであり得る。幾つかの実施形態では、インサイチュー生成バリアを通ることができる一種の微小物体は、生体細胞ではなくビーズであり得る。インサイチュー生成バリアモジュールを有するインサイチュー生成バリアは、選択セクタに配置し得る。
幾つかの実施形態では、エンクロージャは、フロー領域、マイクロ流体チャネルへの基端開口部を有する少なくとも１つの隔離ペン、及びインサイチュー生成バリアを含み得、フロー領域は、更にマイクロ流体チャネルであるか、又はマイクロ流体チャネルを更に有する。インサイチュー生成バリアは、インサイチュー生成分離構造の少なくとも一部であり得、隔離ペン内の微小物体を分離するか、又は選択された隔離ペンを他の隔離ペンから分離するように機能し得る。図４、図５Ａ、図５Ｂ、図８Ａ、図８Ｂ、図１０Ａ〜図１０Ｃ、図１２Ａ、図１２Ｂ、図１３Ａ〜図１３Ｃ、図１４Ａ、図１４Ｂ、図１５、図１６、図１７、図１９Ｂ、図２１Ａ〜図２１Ｃ、及び図２２は、そのような構成の非限定的な例を示す。
インサイチュー生成バリアは、エンクロージャ内の、選択セクタ又は分離セクタがある場合には選択セクタ又は分離セクタ内に配置されて、マイクロ流体チャネル又は隔離ペンの一方の少なくとも部分的な遮断を提供し得る。幾つかの実施形態では、インサイチュー生成バリアは、隔離ペンの分離領域に配置し得る。図１０Ａ〜図１０Ｃ及び図１２Ｂは、隔離ペンの分離領域におけるインサイチュー生成バリアの非限定的な例を示す。幾つかの実施形態では、インサイチュー生成バリアの幅は、分離領域の幅の約１／４〜約３／４、約１／４〜約１／２、又は１／４約〜約５／８である。分離領域にわたるインサイチュー生成バリアの幅は、約３ミクロン〜約５０ミクロン、約５ミクロン〜約４０ミクロン、約５ミクロン〜約３０ミクロン、約５ミクロン〜約２０ミクロン、又は約７ミクロン〜約２ミクロンであり得る。分離領域の幅は、約３０ミクロン〜約５０ミクロン、約２０ミクロン〜約４０ミクロン、約３０ミクロン〜約６０ミクロン、約３０ミクロン〜約９０ミクロン、約３０ミクロン〜約１２０ミクロン、又は約３０ミクロン〜約２５０ミクロンであり得る。インサイチュー生成バリアのサイズは、分離された微小物体が、低減されたインサイチュー生成バリアを通って出られるようにするのに十分な温度変更又は光学照明により低減し得る。
バリアは、隔離ペン内又はバリアが囲むセクタに配置された微小物体の少なくとも１つのサブセットを捕捉する方向された捕捉部分を更に含み得る。図１０Ａ〜図１０Ｃは、内部に組み込まれた捕捉部分を有するバリアの非限定的な一例を示し、捕捉部分は、限定ではなく、抗体、結合モチーフを含むペプチド／タンパク質、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖、又はそれらの任意の組合せを含み得る。
他の実施形態では、インサイチュー生成バリアは、隔離ペンの接続領域内に配置し得る。図４、図１６、図２１、及び図２２は、そのようなインサイチュー生成バリアの非限定的な例を示す。インサイチュー生成バリアは、隔離ペンの接続領域の幅にわたり、隔離ペンの分離領域に配置される複数の微小物体の少なくとも１つのサブセットの流出を遮断するサイズの寸法を有し得る。微小物体の少なくとも１つのサブセットは、生体細胞であり得、更に、インサイチュー生成バリアにより遮断される一種の生体細胞であり得る。他の実施形態では、バリアは、ビーズを流出させるサイズであり得る。バリアは、隔離ペン内（若しくはその接続領域内）又はバリアが囲むセクタ内に配置される微小物体の少なくとも１つのサブセットを捕捉するように構成される捕捉部分を更に含み得、捕捉部分は、抗体、結合モチーフを含むペプチド／タンパク質、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖、又はそれらの任意の組合せを含み得る。図１０Ａ〜図１０Ｃは内部に組み込まれた捕捉部分を有するバリアの非限定的な一例を示す。幾つかの実施形態では、インサイチュー生成バリアの部分は、接続領域内からマイクロ流体チャネルに延在し得る。幾つかの実施形態では、マイクロ流体チャネルに延在するインサイチュー生成バリアの部分は、インサイチュー生成バリアの容積の約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、又は約５％未満を含む。
幾つかの実施形態では、インサイチュー生成バリアの幅は、接続領域の幅の約１／４〜約３／４、約１／４〜約１／２、又は１／４約〜約５／８である。接続領域にわたるインサイチュー生成バリアの幅は、約３ミクロン〜約５０ミクロン、約５ミクロン〜約４０ミクロン、約５ミクロン〜約３０ミクロン、約５ミクロン〜約２０ミクロン、又は約７ミクロン〜約２５ミクロンであり得る。接続領域の幅は、約３０ミクロン〜約５０ミクロン、約２０ミクロン〜約４０ミクロン、約３０ミクロン〜約６０ミクロン、又は約３０ミクロン〜約９０ミクロンであり得る。幾つかの実施形態では、インサイチュー生成バリアは、第１の状態及び第２の状態を有するように構成され得、インサイチュー生成バリアは、第１の状態である場合、複数の微小物体の少なくとも１つのサブセットが隔離ペンから出ることを阻止するように構成され、第２の状態である場合、少なくとも１つのサブセットを隔離ペンから出るように通過させるように構成される。様々な実施形態では、インサイチュー生成バリアは、第１の状態及び第２の状態を有するように構成され、インサイチュー生成バリアは、第１の状態である場合、１ミクロン〜２０ミクロンの直径を有する複数の微小物体の少なくとも１つのサブセットが隔離ペンから出ることを阻止するように構成されるサイズを有し、第２の状態である場合、複数の微小物体の少なくとも１つのサブセットを隔離ペンから出るように通過させるサイズを有する。インサイチュー生成バリアのサイズは、分離された微小物体が、低減されたバリアを通って出られるようにするのに十分な温度変更又は光学照明により低減し得る。図４、図２１、及び図２２は、隔離ペンの接続領域におけるインサイチュー生成バリアの非限定的な例を示す。インサイチュー生成バリアの寸法の１つのサイズは、複数の微小物体の少なくとも１つのサブセットが出られるようにするのに十分に低減可能であるように構成され得る。インサイチュー生成バリアのサイズは、フロー領域を通る増大した流体フロー、加水分解、タンパク質分解、浸透圧変更、温度変更、又は光学照明の適用により低減可能であり得る。図１６は非限定的な一例を示す。
他の実施形態では、インサイチュー生成バリアはマイクロ流体チャネルに配置される。図５Ａ、図５Ｂ、図６、図７、図８Ａ、図８Ｂ、図１３Ａ〜図１３Ｃ、図１４Ａ、図１４Ｂ、及び図１５は、マイクロ流体デバイスのチャネルに配置されたインサイチュー生成バリアの非限定的な例を示す。幾つかの実施形態では、例えば、図５Ａ、図５Ｂ、図２１Ａ〜図２１Ｃ、及び図２２等のチャネルに配置されたインサイチュー生成バリアは、１つ又は複数の隔離ペンに延在し得る。
幾つかの実施形態では、インサイチュー生成バリアは、隔離ペンの基端開口部に又はその近傍に配置し得る。図５Ａ、図５Ｂ、図２１Ａ〜図２１Ｃ、及び図２２は非限定的な例を示す。インサイチュー生成バリアは、複数の隔離ペンの選択された隔離ペンの基端開口部の縁部に配置し得る。縁部は先端縁部（フロー領域／チャネル内の媒体の意図されるフロー方向に対して決められる）であり得る。非限定的な一例は図８Ａ〜図８Ｃであり、図８Ａ〜図８Ｃでは、インサイチュー生成モジュール８２２を有し、各インサイチュー生成バリアモジュール間にギャップ８２４を有するインサイチュー生成バリア８２０を使用して、より大きい微小物体６３０を保持しながら、より小さい微小物体６３２、６３４にギャップ８２４を通過させ、それにより所望の微小物体６３０を濃縮及び／又はソートし得る。インサイチュー生成バリアの固化部位として選択されるペンは、隔離ペンの行の端部に配置された隔離ペンであり得る。
複数の隔離ペンが存在する幾つかの実施形態では、複数の隔離ペンはチャネルに沿って行を形成し得る。インサイチュー生成バリアは、１ミクロン〜２０ミクロンの直径を有する複数の微小物体の少なくとも１つのサブセットがチャネル内のインサイチュー生成バリアを超えて移動することを阻止し得る。図５Ａ、図５Ｂ、図８Ａ、図８Ｂ、図１３Ａ〜図１３Ｃ、図１４Ｂ、及び図１５は、非限定的な例を示す。幾つかの実施形態では、インサイチュー生成バリアは、隔離ペンの行の端部に配置された隔離ペンの基端開口部の先端縁部に配置される。
幾つかの実施形態では、インサイチュー生成バリアは、チャネルに配置される複数のインサイチュー生成バリアモジュールを含み得る。インサイチュー生成バリアは、流体媒体のフローに対して透過性であり得るが、それでもなお微小物体の少なくとも１つのサブセットがバリアを超えて移動することを阻止し得る。インサイチュー生成バリアは、マイクロ流体チャネルに配置される複数のインサイチュー生成バリアモジュールを含み得、複数のインサイチュー生成バリアモジュールは、複数のインサイチュー生成バリアモジュール間のギャップを通して流体媒体を通過させる。代替的には、バリアは、流体媒体に対して透過性でありながら、マイクロ流体チャネル（又は隔離ペンの基端開口部）のある壁からマイクロ流体チャネルの対向する壁に延在し得る。図７は１つのそのようなインサイチュー生成バリアを示す。インサイチュー生成バリア７２０は、流体媒体に対して透過性であり得るが、少なくとも一種の微小物体がインサイチュー生成バリア７２０に入る、インサイチュー生成バリア７２０から出る、及び／又はインサイチュー生成バリア７２０を通ることを許容しない。インサイチュー生成バリアの孔は、図７に示されるように、インサイチュー生成多孔性インサイチュー生成バリアに隣接して隔離ペンがないマイクロ流体チャネル２６４内に配置し得、多孔性インサイチュー生成バリアは、異なるサイズの複数の微小物体を含む試料を濃縮及び／又はソートし得る。多孔性インサイチュー生成バリアはまた、マイクロ流体チャネルの１つの側（又は両側）において開いた１つ又は複数の隔離ペンを有するマイクロ流体チャネル内に配置することもでき、その場合、多孔性バリアは、微小物体を濃縮及び／又はソートし得、マイクロ流体チャネルに沿ってその多孔性インサイチュー生成バリアの位置の真上にある隔離ペン内に続けて配置するために、微小物体のサブセットを更に保持し得る。
インサイチュー生成バリアは、複数のペンの選択されたペンの基端開口部の一縁部に配置し得る。図８Ａ及び図８Ｂは非限定的な例を示す。代替的には、インサイチュー生成バリアは、ペンの行の最初（又は最も外側）の隔離ペンの基端開口部の先端縁部に配置し得る。図１３Ａ〜図１３Ｃは、ペンの行中の最初の隔離ペン及び最後の隔離ペンの両方の基端開口部の先端縁部に配置される。
幾つかの実施形態では、第１の複数のペン及び第１のチャネルがあり得、更に、第２のチャネルに沿って配置される少なくとも第２の複数のペンがあり得る。図１３Ａ〜図１３Ｃは非限定的な一例を示す。インサイチュー生成バリアは、第１のチャネル内の第１の複数のペンの最初の隔離ペンの先端縁部に配置し得、任意選択的に、非多孔性であり、第１のチャネル全体への流入を遮断し得る。バリアは、全てのフローをフロー領域内の第２の（又は第３以上の）チャネルに向け、したがって、フロー及びフローに含まれるあらゆる微小物体をエンクロージャの異なる部分に向け得る。このインサイチュー生成バリアは、フローを第１のチャネルから離れて向けることができ、もはや必要がない場合、除去し得る。第１のインサイチュー生成バリアが除去される前又は後、新しいインサイチュー生成バリアをフロー領域の別の部分（例えば、第２、第３等のチャネル）に導入して、フロー領域の別の部分にフローをリダイレクトし得る。微小物体を含む試料フローを含むフローをマイクロ流体デバイスのフロー領域又はチャネル内で方向付ける機構として、多くの他の構成がインサイチュー生成バリアの使用に可能である。
他の実施形態では、インサイチュー生成バリアは、少なくとも２つの連続した隔離ペンの基端開口部を遮断し得る。幾つかの実施形態では、インサイチュー生成バリアの一部は、チャネルから接続領域に延在し得る。図５Ａ及び図５Ｂは非限定的な一例を示す。
基端開口部を遮断するインサイチュー生成バリアは、少なくとも５０ミクロン〜約５００ミクロン、５０ミクロン〜約３００ミクロン、５０ミクロン〜約２００ミクロン、７０ミクロン〜約５００ミクロン、又は約７０ミクロン〜約４００ミクロンの直径を有し得る。幾つかの実施形態では、バリアは、約５０ミクロン、約７０ミクロン、約９０ミクロン、約１００ミクロン、約１２０ミクロン、約１４０ミクロン、約１６０ミクロン、約１８０ミクロン、約２００ミクロン、約２２０ミクロン、約２５０ミクロン、約２９０ミクロン、約３００ミクロン、約３２０ミクロン、約３４０ミクロン、約３６０ミクロン、約３８０ミクロン、約４００ミクロン、約４２０ミクロン、約４４０ミクロン、約４６０ミクロン、約４８０ミクロン、約５００ミクロン、又は上記の寸法の２つにより定義される任意の範囲の直径を有し得る。
様々な実施形態では、マイクロ流体デバイスが提供され、このマイクロ流体デバイスは、エンクロージャを含み、エンクロージャは、基板と、流体媒体を含むように構成されるマイクロ流体チャネルを含むフロー領域と、各隔離ペンがマイクロ流体チャネルの第１の側において開くように、互いに隣接して配置される第１の複数の隔離ペンと、各隔離ペンがマイクロ流体チャネルの第２の側において開くように、互いに隣接して配置される第２の複数の隔離ペンとを有する。非限定的な一例を図１４Ａに示す。第１の複数の及び第２の複数の隔離ペンの各隔離ペンは、分離領域及び接続領域を含むことができ、接続領域は、マイクロ流体チャネルへの基端開口部と、分離領域への先端開口部とを有する。マイクロ流体チャネルの第１の側は、第１の流体媒体を受け取るように構成され得、及びマイクロ流体チャネルの第２の側は、第２の流体媒体を受け取るように構成され得る。第１の流体媒体は、第１の流体流入口を介してマイクロ流体チャネルの第１の側に導入され得、及び第２の流体媒体は、第２の流体流入口を介してマイクロ流体チャネルの第２の側に導入される。第１の流体媒体は、第１の流出口を介してマイクロ流体チャネルの第１の側から流出し得、及び第２の流体媒体は、第２の流出口を介してマイクロ流体チャネルの第２の側から流出し得、代替的には、第１及び第２の流体媒体は１つの共通の流出口から流出し得る。第１の流体媒体及び第２の流体媒体は、マイクロ流体チャネルに沿って同じ方向に流れ得る。マイクロ流体チャネルへの各隔離ペンの基端開口部は、マイクロ流体チャネル内の流体媒体のフローに対して略平行に向け得る。
そうして構成されるマイクロ流体デバイスは、細胞のクローン集団の培養及びアッセイに使用し得るが、そのように限定されず、任意の培養、ソート、又はアッセイの方法に使用し得る。マイクロ流体デバイスは、クローン集団を第１の複数のペンの隔離ペンの少なくとも１つに配置し得、クローン集団の１つ又は複数の細胞を第２の複数の隔離ペンの各隔離ペンに配置し得るように構成される。
マイクロ流体デバイスは、第１の複数の隔離ペンを超える流体媒体の第１のサブフローを提供するように構成される第１のサブチャネルと、第２の複数の隔離ペンを超える流体媒体の第２のサブフローを提供するように構成される第２のサブチャネルとにマイクロ流体チャネルを分割するバリアを更に含み得、バリアは、第１の複数のペンの最初のペンの基端開口部（第１のサブチャネルへの）と、第２の複数のペンの最初のペンの基端開口部（第２のサブチャネルへの）との間に位置合わせされた少なくとも１つのギャップによって中断される。バリアは、マイクロ流体チャネル内のバリアの長さに沿って複数のギャップを更に含み得る。幾つかの実施形態では、各ギャップは、第１の複数のペンの各ペンの基端開口部（第１のサブチャネルへの）と、第２の複数のペンの各ペンの基端開口部（第２のサブチャネルへの）との間に位置合わせし得る。バリアの長さに沿った複数のギャップの他の配置も可能である。例えば、バリアに沿った複数のギャップのそれぞれは、第１の複数の隔離ペンの各隔離ペンの基端開口部（第１のサブチャネルへの）及び第２の複数の隔離ペンの各隔離ペンの基端開口部（第２のサブチャネルへの）からオフセットし得る。バリアは、チャネルの第１の端部からチャネルの第２の端部に延びる長さを有し得る。バリアは、永続的なバリアであってもよく、又は隔離ペン及び／若しくはチャネル壁を形成する同じマイクロ流体回路材料から形成してもよい。クローン集団の１つ又は複数の細胞は、第１の複数のペン及び第２の複数のペンと位置合わせされたギャップを通して輸送されることにより、親クローン集団の隔離ペンから第２の複数の隔離ペンの各ペンに移動させ得る。バリアが、チャネルにおいて長さに沿って１つ又は複数のギャップを有する永続的なバリアである場合、重合化を１つ又は複数のギャップにおいて活性化させて、その長さに沿った１つ又は複数のギャップを閉じる１つ又は複数のインサイチュー生成バリアを導入し得、インサイチュー生成バリアは、本明細書に記載される任意の固化ポリマー網目構造のような固化ポリマー網目構造を含み得る。１つ又は複数のギャップの固化は、第１のサブチャネルを第２のサブチャネルから分離し、細胞が第１のサブチャネルから第２のサブチャネルに及びその逆に移動することを阻止し得る。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスは、複数のギャップによって中断されたバリア内の複数のギャップを閉じる複数のインサイチュー生成バリアを含む。
他の実施形態では、マイクロ流体デバイスはインサイチュー生成バリアを含み、インサイチュー生成バリアは、マイクロ流体チャネルの長さに沿って配置され、第１の複数の隔離ペンを超える流体媒体の第１のサブフローを提供するように構成される第１のサブチャネルと、第２の複数の隔離ペンを超える流体媒体の第２のサブフローを提供するように構成される第２のサブチャネルとにマイクロ流体チャネルを分割する。幾つかの実施形態では、インサイチュー生成バリアは、細胞が第１のサブチャネルから第２のサブチャネルに及びその逆に移動することを阻止する。図１４Ｂは非限定的な一例を示す。他の実施形態では、インサイチュー生成バリアは、永続的なバリアに関して上述したように、１つ又は複数のギャップを含む。図１５は非限定的な一例を示す。
１つ又は複数の細胞（例えば、クローン集団からとられた１つ又は複数の細胞）の処理は、第２の複数の隔離ペンの隔離ペンにおいて実行し得る。処理は、第１の複数の隔離ペンの対応する隔離ペンに配置された親クローン集団の進行中の培養状況を妨げることなく実行し得る。
他の実施形態では、マイクロ流体デバイスが提供され、このマイクロ流体デバイスは、エンクロージャを有し、エンクロージャは、基板と、チャネルと、少なくとも１つの隔離ペンと、インサイチュー生成バリアとを有する。隔離ペンは、分離領域及び接続領域を含み得、接続領域は、チャネルへの基端開口部と、分離領域への先端開口部とを有する。図４、図５、図８Ａ、図８Ｂ、図１０Ａ〜図１０Ｃ、図１３Ａ〜図１３Ｃ、図１４Ａ、図１４Ｂ、図１５、図１６、図１９Ａ、図１９Ｂ、図２１Ａ〜図２１Ｃ、及び図２２は、非限定的な例を示す。インサイチュー生成バリアは、エンクロージャ内に配置されて、チャネル及び／又は少なくとも１つの隔離ペンの１つ又は複数の少なくとも部分的な遮断を提供し得る。インサイチュー生成バリアは、インサイチュー生成固化ポリマー網目構造を含み得る。固化ポリマー網目構造は、光開始ポリマーを含み得る。固化ポリマー網目構造は、感熱性ポリマーを含み得る。デバイスは、固化ポリマー網目構造の下の位置において基板上に配置された熱パッドを有する基板を更に含み得る。熱パッドを使用して、バリアのゲル化、膨張、縮小、又は除去を支援し得る。非限定的な一例では、図１３Ａ〜図１３Ｃに示されるデバイスは、金等の１つ又は複数の金属パッドを含み、示されるインサイチュー生成バリアの形成及び除去を支援し得る。
インサイチュー生成バリアは、隔離ペンの分離領域に配置し得る。隔離ペンの分離領域に配置されたインサイチュー生成バリアは、上述したようなサイズを有し得る。幾つかの実施形態では、インサイチュー生成バリアのサイズは、温度変更又は光学照明により低減し得る。インサイチュー生成バリアは、隔離ペンに配置された少なくとも１つの微小物体を捕捉するように構成される捕捉部分を更に含み得る。図１０Ｃはそのような１つの例示バリアを示す。
インサイチュー生成バリアは、隔離ペンの接続領域内に配置し得る。インサイチュー生成バリアは、隔離ペンの接続領域の幅にわたり、隔離ペンの分離領域に配置された複数の微小物体の少なくとも１つのサブセットが出るのを遮断するサイズの寸法を有し得る。インサイチュー生成バリアは、生物学的微小物体の流出を遮断するサイズであり得る。インサイチュー生成バリアは、ビーズを流出させるサイズであり得る。インサイチュー生成バリアは、隔離ペンに配置された少なくとも１つの微小物体を捕捉するように構成される捕捉部分を更に含み得る。隔離ペンの接続領域に配置されたインサイチュー生成バリアは、上述したようなサイズを有し得る。インサイチュー生成バリアの部分は、接続領域からチャネルに延在し得る。チャネルに延在するインサイチュー生成バリアの部分は、バリアの容積の５０％未満であり得る。
幾つかの実施形態では、インサイチュー生成バリアは、第１の状態及び第２の状態を有するように構成され得、インサイチュー生成バリアは、第１の状態である場合、複数の微小物体の少なくとも１つのサブセットが隔離ペンから出ることを阻止するように構成され、第２の状態である場合、少なくとも１つのサブセットを隔離ペンから出るように通過させるように構成される。第１の状態では、インサイチュー生成バリアは、より大きいサイズを有して、微小物体のサブセットの流出を阻止し得る。第２の状態では、インサイチュー生成バリアのサイズは、少なくとも複数の微小物体の少なくとも１つのサブセットを流出させるように低減し得る。インサイチュー生成バリアのサイズは、少なくとも、フロー領域を通る増大した流体フロー、加水分解、タンパク質分解、浸透圧変更、温度変更、又は光学照明の適用により縮小し得る。
様々な実施形態では、インサイチュー生成バリアは、マイクロ流体チャネルに配置し得る。バリアは、隔離ペンの基端開口部の一縁部に配置し得、基端開口部からマイクロ流体チャネルにわたり延在し得る。インサイチュー生成バリアは、１ミクロン〜２０ミクロンの直径を有する複数の微小物体の少なくとも１つのサブセットがマイクロ流体チャネル内のバリアを超えて移動することを阻止し得る。様々な実施形態では、インサイチュー生成バリアは、マイクロ流体チャネルに配置された複数のインサイチュー生成バリアモジュールを含み得る。インサイチュー生成バリアは、流体媒体に対して透過性であり得る。少なくとも１つの隔離ペンは、複数の隔離ペンを更に含み得る。複数の隔離ペンは、マイクロ流体チャネルに沿った行を形成し得る。インサイチュー生成バリアは、複数の隔離ペンの選択された隔離ペンの基端開口部の先端縁部に配置し得る。インサイチュー生成バリアの固化部位として選択されるペンは、隔離ペンの行の端部に配置された隔離ペンであり得る。バリアは、複数の隔離ペンの最初の隔離ペンの基端開口部の先端縁部に配置し得る。バリアは、複数の微小物体の少なくとも１つのサブセットがマイクロ流体内のバリアに入る、バリアから出る、及び／又はバリアを通ることを阻止し得る。
インサイチュー生成バリアは、マイクロ流体チャネルに配置された複数のインサイチュー生成バリアモジュールを含み得、複数のインサイチュー生成バリアモジュールは、流体媒体を複数のインサイチュー生成バリアモジュール間のギャップに通す。
複数のペンは、第１の複数のペンであり得、チャネルは、第１のチャネルであり、デバイスは、第２のチャネルに沿って配置される第２の複数のペンを更に含む。インサイチュー生成バリアは、複数の第１の隔離ペンの最初の隔離ペンの基端開口部の先端縁部に配置し得る。このように構成される場合、バリアは、第１のチャネルへのいかなる微小物体の流入も遮断し、流体媒体のフロー及びそれに含まれるいかなる微小物体もエンクロージャの異なる部分に向け得る。インサイチュー生成バリアは、追加又は代替として、第２の複数の隔離ペンの最初のペンの近傍に形成してもよく、その場合、バリアは、第２のチャネルへのいかなる微小物体の流入も遮断し得る。
インサイチュー生成バリアは、少なくとも２つの連続隔離ペンの基端開口部を遮断し得る。基端開口部を遮断するバリアは、基端開口部にわたり少なくとも５０ミクロン〜約５００ミクロンの寸法を有し得る。図５Ａ及び図５Ｂは非限定的な一例を示す。
更に別の実施形態では、マイクロ流体デバイスは、行に配置される第１の複数の隔離ペンであって、第１の複数の各隔離ペンは、マイクロ流体チャネルの第１の側において開く、第１の複数の隔離ペンと、行に配置される第２の複数の隔離ペンであって、第２の複数の各隔離ペンは、マイクロ流体チャネルの第２の側において開く、第２の複数の隔離ペンとを含み得、インサイチュー生成バリアは、マイクロ流体チャネルの長さに沿って配置され、第１の複数の隔離ペンを超える流体媒体の第１のサブフローを提供するように構成される第１のサブチャネルと、第２の複数の隔離ペンを超える流体媒体の第２のサブフローを提供するように構成される第２のサブチャネルとにマイクロ流体チャネルを分割し、バリアは、細胞が第１のサブチャネルから第２のサブチャネルに及びその逆に移動することを阻止する。インサイチュー生成バリアは、複数のインサイチュー生成バリアモジュールを含み得る。インサイチュー生成バリアモジュールは、２つのモジュール間の開口部が、約１ミクロン〜約２０ミクロンのサイズを有し得る選択された微小物体のサイズよりも小さくなるように互いから離間され得る。インサイチュー生成バリアは、流体媒体のフローに対して透過性であり得る。インサイチュー生成バリアは、流体媒体に対して透過性であり得るが、少なくとも１つの種類の微小物体がバリアに入る、バリアから出る、及び／又はバリアを通ることを許容しない。図１４Ｂは非限定的な一例を示す。チャネルの第１の側は、第１の流体媒体を受け取るように構成され得、チャネルの第２の側は、第２の流体媒体を受け取るように構成され得、第１の流体媒体及び第２の流体媒体はそれぞれ、インサイチュー生成バリアに沿ってデバイスのそれぞれの第１及び第２の出力に流れ得る。インサイチュー生成バリアは、微小物体が第１のサブチャネルから第２のサブチャネルに移動することを阻止するように構成され得る。インサイチュー生成バリアは、インサイチュー生成バリア又はその内部の部分を侵食し得る、フロー領域を通る増大した流体フロー、加水分解、タンパク質分解、浸透圧変更、温度変更、又は光学照明の適用により縮小し得る。図１５は非限定的な一例を示す。例えば、タンパク質分解は、バリアの外側を分解させ、浸食を生じさせ得る。バリアは、アリアのサイズを縮小することにより縮小可能であり得る。バリアがバリアモジュールで構成される場合、バリアは、モジュールの１つ又は複数を除去することにより縮小可能であり得る。バリアは、フロー領域を通る増大した流体フロー、加水分解、タンパク質分解、浸透圧変更、温度変更、又は光学照明の適用により収縮可能であり得る。個々のバリアモジュールを選択的に除去し、より制限性の低いバリアを所定位置に残し得る。インサイチュー生成バリアの部分／モジュールの縮小又は除去により、インサイチュー生成バリアを超えて、流体媒体の異なる成分を交換することが可能になり得、又は微小物体の異なるサブセットを交換することが可能になり得る。
少なくとも１つのインサイチュー生成分離構造を有するマイクロ流体デバイスの任意の実施形態では、基板は、マイクロ流体デバイス１００、２００、２３０、２５０、２８、２９０、３００等について本明細書で説明したように、エンクロージャ内に誘電泳動（ＤＥＰ）力を生成するように構成され得る。ＤＥＰ力は光学的に作動させ得る。他の実施形態では、マイクロ流体デバイスの基板は、本明細書に記載され、且つ２０１６年１０月２７日に出願された国際出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１６／０５９２３４号により詳細に説明されているように、オプトエレクトロウェッティング表面を含むように構成され得、この国際出願は全体的に参照により本明細書に援用される。オプトエレクトロウェッティング表面は、光応答性を有し得、光学的に作動し得る。幾つかの実施形態では、オプトエレクトロウェッティング表面は光伝導性を有し得る。
任意の実施形態において、マイクロ流体デバイスのエンクロージャの少なくとも１つの内面は、調整面を含み得る。少なくとも１つの内面は、基板の表面を含み得る。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスのエンクロージャの全ての内面は、調整面を含み得る。様々な実施形態では、調整面は共有結合的に修飾された表面であり得る。様々な実施形態では、共有結合的に修飾された表面は親水性であり得る。
以下の図において説明される実施形態の幾つかを参照することにより、本発明のより完全な理解を有し得る。
図４は、分離、ソート、又はアッセイの方法に利用し得る、ペンの上部から短い距離以内に配置し得るマイクロ流体デバイス４００の各隔離ペンの内部に配置される形成されたバリアを精密に示す。幾つかの場合、バリアは、その接続領域内に導入し得る。ポリマーバリアをマイクロ流体デバイス内に導入するプロセスの一例では、１０％ｗ／ｖ ＰＥＧＤＡ（５Ｋｄ）及び１％光開始剤（IRGACURE 2959、２００Ｄａ）を含む溶液をデバイスに流入させた。１０分未満にわたり平衡させた後、４００ｍＷ／ｃｍ２の電力を有する約３４０ｎｍ（＋／−２０ｎｍ）のＵＶ光で所望の領域を１秒間にわたり照明して、示されるもの等のバリアを作製する重合化を開始した。精密に形成されたバリアの幾つかは、白い円内に示されている（強調のため）。精密な位置にバリアを形成することは、インサイチュー生成バリアが存在している状態で、ペンを出ない第２の組の細胞の存在下において、選択された細胞を重力により搬出するのに特に有用であり得る。この別の変形形態は、チャネル内に突出したポリマーバリの小さい部分を含むこともでき、それにより、第１の組の細胞を搬出した後、チャネル内のフローを増大することにより除去することができる。幾つかの実施形態では、バリアは、あらゆるペン内に形成されるわけではなく、選択された隔離ペン内のみに形成し得る。これは、選択された隔離ペンの開口部内のみ又は選択された隔離ペンの開口部の近傍のみにインサイチュー生成バリアを生成することにより、デバイスの隔離ペン内に存在する複数の微小物体の選択された微小物体のみを分離するのに使用し得る。幾つかの実施形態では、分離されたペン（例えば、インサイチュー生成バリアを有するペン）は、微小物体の生物学的産物の生成又は分泌等の所望の特性を有さない微小物体を分離する。残りの非分離隔離ペン内に残っている微小物体は、隔離ペンから搬出し、マイクロ流体デバイスから更に搬出し得る。他の実施形態では、微小物体を分離するインサイチュー生成バリアを有する１つ又は複数の隔離ペン内の微小物体は、選択された特性を有する微小物体であり得る。この実施形態では、残りの非選択隔離ペン内に残っている微小物体は、非分離隔離ペンから搬出し得、マイクロ流体デバイスから更に搬出し得る。そのような搬出後、インサイチュー生成バリアを除去し得、前に分離された微小物体を更に処理できるようにする。
図５Ａ及び図５Ｂは、幾つかの連続ペンにわたり生成されたインサイチュー生成バリア５２０を示し、これらの図では、バリアはマイクロ流体チャネル内の白い円内に示されている。重合化可能ポリマーを導入するために、図４に示される実施形態と同じ状況を使用したが、この例での露出時間は７．５秒であり、ＵＶ光の電力は１００マイクロＷ／ｃｍ２であり、重合化可能ポリマーを導入する状況は以下の実施例１に更に詳細に考察されており、生体細胞数が各ペン内で増大した図５Ｂに示されるように、ポリマーインサイチュー生成バリア５２０を導入し、数日間、定位置に維持することができ、その間、それでもなお、インサイチュー生成バリアによって分離された隔離ペンのグループ内で細胞を成長させることが可能であったことを実証した。図５Ａ及び図５Ｂのようなインサイチュー生成バリアは、生体細胞の選択的に選ばれたグループを分離、ソート、又はアッセイする多種多様な方法で使用し得る。
図６は、マイクロ流体デバイス６００のチャネル壁６１０により画定されるチャネル２６４内に配置されたインサイチュー生成バリアモジュール６２２を有するインサイチュー生成バリア６２０の例を示す。各バリアモジュール６２２とそれと隣接するモジュール６２２との間にギャップ６２４を残すように、バリアモジュール６２２の固化を実行することができる。流動性ポリマーをマイクロ流体チャネル２６４内に導入し、マイクロ流体チャネル２６４内の選択されたポイントを照明して、インサイチュー生成バリア６２０のポリマー網目構造を固化することにより固化し得る。バリア６２０に向かうフロー２７８を用いて、微小物体６３０と共に望ましくない材料６３２及び６３４を含む試料をマイクロ流体デバイス６００に導入し得る。ギャップのサイズは、微小物体の幾つかの種にギャップ６２４を通過させながら、細胞６３０等のより大きい微小物体のバリア６２０の通過を阻止するように選択することができ、それにより細胞６３０をバリアの背後に分離する。より小さい微小物体は、ビーズ（図示せず）、より小さい微小物体（図示せず）、細胞残屑６３２、又は細胞小器官、不溶性タンパク質、核酸等の微小物体６３４を含み得る。したがって、バリア６２０は、マイクロ流体デバイス６００に装填された試料を濃縮させる篩い／ソート構造として使用し得る。試料が濃縮されると、例えば、所望の微小物体６３０がバリア６２０に収集されると、バリアは、更に培養又は処理するために、ＤＥＰ力等のフロー、重力、又は動電学的力の任意の組合せにより微小物体６３０をマイクロ流体デバイスの別の部分に移動できるようにするのに十分な程度に除去又は縮小し得る。代替的には、濃縮された微小物体６３０の組は、任意の適する原動手段によりマイクロ流体デバイス６００から搬出し得る。微小物体の濃縮は、微小物体６３０のみがバリア６２０により保持されることを必要とせず、望ましくない６３２、６３４材料の割合がマイクロ流体デバイス６００に導入された試料と比較して低減されることのみを必要とする。更に、幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイス６００に導入される材料の混合物は、望ましくない微小物体６３２、６３４を有さず、単純にかなり希釈されていることがある。バリア６２０は、例えば、希な細胞を含む希釈された試料を濃縮し、所望の微小物体の濃縮試料を分離又は搬出できるようにし得る。
図７は、マイクロ流体デバイス７００においてチャンバ壁７１０により画定されたチャネル２６４に実質的にわたり伸びるインサイチュー生成バリア７２０の例を示す。バリア７２０は、図６の実施形態と同様に行うが、違いとして、バリア７２０がギャップを有するバリアモジュールを有さず、代わりに、画定された多孔性を有し、フロー２７８と共に流れる試料の幾つかの成分（例えば、上記で定義した材料６３２、６３４）を、バリア７２０を超えて流すが、対象となる選択された微小物体６３０（例えば、生体細胞）はバリア７２０を超えて流さず、それにより所望の微小物体６３０を試料の他の成分から濃縮又はソートする。
図６及び／又は図７の実施形態では、所望の細胞６３０がインサイチュー生成バリアに隣接する領域に濃縮された後、インサイチュー生成バリアを除去し得る。例えば、インサイチュー生成バリアの固化ポリマー網目構造は、固化ポリマー網目構造の部分を切断するように構成される波長の光で照明された場合、光切断を受けやすいことができる。インサイチュー生成バリアの除去後、ＤＥＰ力（光学作動ＤＥＰ（ＯＥＴ）を含む）、重力、又は流体フローを含め、任意の適する原動手段を使用して、濃縮された細胞６３０を選択的に移動させ得る。
図８Ａ〜図８Ｃは、希釈試料を濃縮し、更にマイクロ流体デバイス８００における選択された隔離ペン８３０への微小物体６３０の選択的配置を支援することができるインサイチュー生成バリア８２０の別の例を示す。インサイチュー生成バリア８２０は、上述した図４〜図７と同様に、チャネル壁８１０及び隔離ペン壁材料８１２により画定されるチャネル２６４内にインサイチューで生成される。バリア８２０は、ギャップ８２４により互いから離間されたインサイチュー生成バリアモジュール８２２を含み、ギャップ８２４は、望ましくない材料６３２、６３４（ギャップ８２２のサイズよりも小さいサイズを有する、試料内の望ましくない任意の材料であり得る）を許容するように選択される。希釈試料は、フロー２７８と共にマイクロ流体チャネル２６４内に流入し、細胞はインサイチュー生成バリア８２０において濃縮される。フローは停止させることができ、次に、濃縮された細胞６３０は、例えば、フロー、重力、ＯＥＴ力、又は任意の他の適する方法によりバリア８２０近くの隔離ペン８３０に装填することができる。チャネルを通るフローを再開して、バリアモジュール８２２を取り除くことができ、又はバリアモジュール８２２は、光学照明、加水分解、タンパク質分解、又は温度変更のいずれかにより除去することができる。このプロセスは、第１の組のペンの位置と異なる第２以上の組のペンに配置される第２の新しく生成されたバリア８２０’（図示せず）に対して繰り返して、細胞含有試料を装填し、複数の希釈アリコートを濃縮することができる。細胞含有試料の複数のアリコートは、全て同じソース（例えば、同じ哺乳類、同じ細胞株等）由来であってもよく、又はそれぞれ哺乳類、細胞株等の異なるソース由来であってもよい。
図９Ａ〜図９Ｄは、流体流入口９３０及び流体流出口９３２を有するマイクロ流体デバイス９００を示す。流動性ポリマーは、流入口９３０において導入され、基板内のポイントまで流れる。バリアを形成するインサイチュー生成分離構造９２０が、基板２０８の選択された部分を照明することにより、各バリアモジュールと隣接するバリアモジュールとの間にギャップ９２４を有する複数のバリアモジュール９２２の固化を活性化させることで提供される。間隔は、細胞残屑６３２等の材料又は細胞小器官、不溶性タンパク質、核酸等の微小物体６３４を許容するように選択し得る。試料は、流入口９３０において導入し得る。フロー２７８がバリア９２０を通して続く際、バリアモジュール９２２間のギャップよりも小さいサイズを有する望ましくない材料６３２及び６３４は、分離構造９２０を通過し得、図９Ｂに示されるように、流体流出口９３２を介してマイクロ流体デバイスから更に搬出し得る。更なる実施形態では、インサイチュー生成ペン９４０は、図９Ｃに示されるように導入し得る。ペン９４０の寸法に応じて、ペン９４０はインサイチュー生成分離ペンであり得る。分離構造９２０は、光学照明（バリアモジュールの固化ポリマー網目構造が光切断を受けやすい場合）等の任意の適する方法により除去し得る。解放された微小物体６３０を選択し、更に処理するために、インサイチュー生成ペン９４０内に分離されるように移動させ得る。
図１０は、予め選択されたトラップとして機能する、小さい局所化されたインサイチュー生成バリア１０２０の使用を示す。バリアトラップは、抗体又はＲＧＤモチーフペプチド等の他の細胞表面認識モチーフ等の捕捉部分１０２４を有すことができる官能化インサイチュー生成バリアであり得る。簡明にするために、捕捉部分１０２４は抗体として示されているが、インサイチュー生成バリアトラップはそのように限定されない。望ましい細胞６３０及び他の望ましくない細胞６３６を含む試料は、マイクロ流体チャネル２６４内の流体フロー２７８に導入することができ、細胞のサブセット、例えば、捕捉部分１０２４に結合することができる細胞６３６は、局所化インサイチュー生成バリア１０２０上の捕捉部分１０２４との相互作用により不動化することができる。インサイチュー生成バリアトラップ（１０２０＋１０２４）は、ペン内のチャネルへの基端開口部の近く又は接続領域のより先端部分若しくはペンの分離領域内のいずれかに配置することができる。インサイチュー生成バリアトラップ（１０２０＋１０２４）に結合することができるいかなる細胞表面モチーフも有さない残りの細胞（例えば、細胞６３０）は、チャネル内の流量を上げることによりマイクロ流体デバイスから搬出することができ、又は更に処理するために、マイクロ流体デバイス内の別の領域に移し得る。他の実施形態では、細胞６３６は、導入された試料フローの所望の部分であり得、説明したように細胞６３６を分離した後、望ましくない細胞６３０は、マイクロ流体チャネルから及び任意選択的にマイクロ流体デバイスから搬出し得る。
インサイチュー生成バリアトラップ（１０２０＋１０２４）は、一方が、例えばＲＧＤペプチドモチーフを有する２つのポリマーを共重合化することにより、又はそのようなモチーフを有するように前駆体プレポリマーを修飾することにより形成することができる。別の代替は、バリアトラップが形成された後、インサイチュー生成バリアトラップ内で抗体を不動化させる、又は抗体を不動化させることである。一例では、ビオチン化又はストレプトアビジン部位をトラップ全体又はインサイチュー生成バリア１０２０の表面に導入することができ、ストレプトアビジン又はビオチン標識抗体をビオチンに関連付け得る。代替的には、インサイチュー生成バリアの形成と同時に又は形成後、ポリマーバリアの表面への光開始挿入を受け得る、ベンゾフェノン等の光活性化可能な機能を含む、修飾された抗体を考案し得る。
図１１Ａ及び図１１Ｂは、マイクロ流体デバイス１１００の壁１１１０により囲まれたフロー領域１１１４への細胞６３０の装填時、要求に応じて作られたペンを示す。細胞６３０の導入前に、導入と同時に、又は導入後に流動性ポリマーも導入される。インサイチュー生成分離構造１１２２及びインサイチュー生成ペン１１２０は、基板２０８の表面上の所望の位置を照明して、重合化を開始することにより形成し得る。インサイチュー生成ペン１１２０及び構造１１２２は、典型的なフロー方向２７８が、細胞を新しく包含しているペン／構造から細胞６３０を妨げないように向け得る。インサイチュー生成ペン１１２０又は構造１１２２において分離された細胞６３０に対して、テスト、ソート、及び培養を実行し得る。しかし、各細胞６３０の周囲に作られたペン１１２０又は構造１１２２のそれぞれの共通する一方向は開かれ得、したがって細胞をインサイチュー生成ペンから流し出すようにフロー方向を変更して、各細胞６３０を搬出できるようにする。代替的には、各細胞６３０は、例えば、光学的に作動し得るＤＥＰ力を使用して個々に選択し移動させ得る。
図１２Ａ及び図１２Ｂは、分離領域を細分するようにマイクロ流体デバイス１２００の隔離ペン８３０内に導入されたインサイチュー生成バリア１２２０を示す。例示的な一使用例は、他のサブセット６３０がペン内に保持されることを保証しながら、細胞集団６３６のサブセットを制御可能に除去することであり得る。細胞６３０及び６３６がフロー領域１２１４に導入され、次に隔離ペン内に配置される前に、導入及び配置と同時に、又は導入及び配置後に流動性ポリマーを隔離ペン８３０の分離領域に導入する。所望の位置における基板２０８の選択された部分を照明することにより、インサイチュー生成バリアの光開始重合化を実行する。熱可逆性（光作動熱可逆性を含むことができる）又は光切断可能なポリマーを利用して、インサイチュー生成バリアの部分を選択的に除去し得、それにより選択的な細胞の搬出を可能にする。
図１３Ａ〜図１３Ｃは、インサイチュー生成バリア１３２０の別の形態は弁型構造を含むことができることを示す。インサイチュー生成バリア１３２０を使用して、細胞を含むフローを、非選択領域への流れを遮断しながら、チップの予め選択された領域に向けることができる。インサイチュー生成バリア１３２０の選択的導入及び除去は、マイクロ流体デバイス１３００内で複数の実験を実行するのに有用であり得る。任意の細胞の導入前に流動性ポリマーを流入口９３０において導入し得る。全てが第１のチャネル１３０２に対して開く、隔離ペン１３１２の最初の行の最初のペン８３０の開口部の先端縁部及び隔離ペン８３０のその行の最後のペンの開口部の縁部における基板表面２０８の選択されたポイントにおける重合化の光開始により、インサイチュー生成バリア１３２０の組を形成し、第１のチャネル１３０２への細胞の流入を除外する。同様に、インサイチュー生成バリア１３２０は、第３の複数の（行に配置された）隔離ペン１３１６を有する第３のチャネル１３０６の入口及び出口にも導入される。図１３Ａに示されるように、細胞６３０のフローを導入し得、第２のチャネル１３０４に流入するように向けられる。細胞は、第１のチャネル１３０２及び第３のチャネル１３０６に入ることを阻止される。細胞６３０は、非遮断チャネル１３０４に入るように強いられ、チャネル１３０４内のペン８３０内に配置される。細胞６３０の送達が完了すると、第２の組のインサイチュー生成バリア１３２０を第２のチャネル１３０４の両端部に作製し得る。次に、本明細書に記載される任意の方法において、チャネル１３０２及び１３０６を遮断する第１の組のインサイチュー生成バリア１３２０を除去し得る。次に、流入口９３０を介して、細胞６３６を含む第２の流体フローを導入し得る。図１３Ｂに示されるように、細胞６３６は、チャネル１３０２及び１３０６に入るように強いられ得るが、チャネル１３０４に入ることはできない。いかなるチャネルにも入らない細胞は、流体フローを用いて流出口９３２に掃引し得る。チャネル１３０２及び１３０６における第１の組のインサイチュー生成バリア１３２０を除去し、チャネル１３０４を遮断する第２の組のインサイチュー生成バリア１３２０を生成する順序は逆にし得る。他の変形形態では、マイクロ流体デバイス１３００に流入する細胞が各チャネル１３０２、１３０４、１０６のそれぞれにアクセス可能であるようにし得る。
別の変形形態では、マイクロ流体デバイス１３００は、チャネル１３０２、１３０４、１３０６においてインサイチュー生成バリア１３２０を導入することを望むポイントに熱パッド（図示せず）を含み得る。感熱性ポリマーの存在下でレーザを用いて熱パッドを加熱して温度を上げることにより、熱パッド及びレーザにより画定されるエリアにヒドロゲルを形成することができる。光が除かれると、熱パッドは冷め、ヒドロゲルは溶解し得る。
図１３Ｃは、選択されたように、各チャネル内に異なる細胞を有する別様に装填されたチャネルを有するマイクロ流体デバイス１３００を示す。各チャネルの異なる細胞は、異なる試料から、例えば、異なる生検試料、異なるクローン集団、又は任意の種類の複合試料を由来とし得、マイクロ流体デバイス１３００に特に配置された細胞６３６に対して任意の種類の処理を実行し得る。
図１４Ａ及び図１４Ｂは、マイクロ流体デバイス１４００における層流をより精密に分割するのに使用し得るインサイチュー生成バリアの別の使用を示す。層流に伴う既知の問題は、フローの層の性質が距離に伴ってなくなることであり、とにかく機能するために厳格な性能基準が必要であり得ることである。層流依存方法を使用する場合、インサイチュー生成バリアがどのように利点を提供し得るかの非限定的な一例におけるものである。マイクロ流体デバイス１４００では、図１４Ａに示されるように、基板２０８；流体媒体フロー２７８を含むように構成されるマイクロ流体チャネル１２２を含むフロー領域；各隔離ペンがマイクロ流体チャネル１２２の第１の側において開くように互いに隣接して配置される第１の複数の隔離ペン（８３０、８３１、８３２）；各隔離ペンがマイクロ流体チャネル１２２の第２の逆の側において開くように互いに隣接して配置される第２の複数の隔離ペン（８３０’、８３１’、８３２’）があり得る。第１及び第２の複数のペン並びにマイクロ流体回路は、マイクロ流体回路材料１４６０で作られ得る。マイクロ流体チャネルの第１の側は、第１の流体媒体を受け取るように構成され得、マイクロ流体チャネルの第２の側は、第２の流体媒体を受け取るように構成され得る。第１の流体媒体は、第１の流体流入口９３０を介してマイクロ流体チャネルの第１の側に導入し得、第２の流体媒体は、第２の流体流入口９３０’を介してマイクロ流体チャネルの第２の側に導入される。１つ又は複数の細胞を第１の複数の隔離ペンのペン８３０、８３１、８３２に導入し得る。図１４Ａでは、細胞の第１のクローン集団６３１を隔離ペン８３０に配置し得、細胞の第２のクローン集団６３３を第２の隔離ペン８３１に配置し得、細胞の第３のクローン集団６３５を隔離ペン８３２に配置し得る。幾つかの実施形態では、１つのみの細胞６３１、６３３、６３５を各ペン８３０、８２、８３３に提供し得、各細胞を培養して、各クローン集団を提供し得る。各クローン集団の１つ（又は任意選択的により多数）の細胞を選択し、次にマイクロ流体チャネル１２２を横切ってマイクロ流体デバイスの逆側にある対応するペンに送り得る。例えば、隔離ペン８３０内の細胞のクローン集団６３０から細胞６３１’を選択し、ＤＥＰ力（光学的に作動し得る）を含む任意の適する原動手段を使用して、第２の複数の隔離ペンの対応する隔離ペン８３０’に移し得る。これは、ペン８３１内の細胞のクローン集団６３３の１つ又は複数の細胞６３３’のそれぞれに対して繰り返し得、細胞６３３’をペン８３１’に送り得、以下同様である。流動性ポリマーは、その時点で又は任意の先の時点でマイクロ流体チャネル１２２に導入し得る。次に、インサイチュー生成バリア１４２０をマイクロ流体チャネル１２２の長さに沿って導入して、第１の複数の隔離ペン８３０、８３１、８３２に隣接する第１のサブチャネルと、第２の複数の隔離ペン８３０’、８３１’、８３２’に隣接する第２のサブチャネルとにマイクロ流体チャネルを分割し、細胞が第１のサブチャネルから第２のサブチャネルに及びその逆に渡ることを阻止し得る。インサイチュー生成バリア１４２０は多孔性でなくてよく、第２の媒体を第２のフロー２７８’に導入できるようにし得、第２の媒体は、第１のサブチャネルにおける第１のフロー２７８内の第１の媒体と幾つかの点で異なり得る。第２の流体媒体は、第２の複数の隔離ペンの各ペン内の１つ又は複数のみの細胞に導入し得、クローン集団の残りには導入されない。第２の媒体は、細胞６３１’、６３３’、６３５’を評価するアッセイ試薬を含み得る。１つ若しくは複数のアッセイを第２の複数の隔離ペン内の細胞６３１’、６３３’、６３５’の組に対して実行し得、又は細胞６３１’、６３３’、６３５’の１つ若しくは複数を搬出し得る。細胞６３１’、６３３’、６３５’に対して、細胞６３１’、６３３’、６３５’が由来するクローン集団の選択された特性を識別し得る任意の種類の更なる処理を実行し得る。
幾つかの実施形態では、インサイチュー生成バリアを除去し得、第１の複数の隔離ペンの各クローン集団又は選択された数のクローン集団を由来とする１つ又は複数の細胞の第２の組を対向するペンに導入し得る。第２のインサイチュー生成バリアを導入し、続けてアッセイ又は他の処理を細胞に対して実行し得る。
幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスは、細胞が導入されるときに存在するバリアを有し得、その場合、バリアは１つ又は複数のギャップ（図示せず）で中断される。１つ又は複数のギャップで中断されるバリアは、インサイチュー生成バリアではなく、隔離ペン及びマイクロ流体チャネル壁を形成するものと同じマイクロ流体回路から形成し得る。ギャップは、第１の複数の隔離ペンの最初のペン（例えば、８３０）の開口部に隣接して位置合わせされ、且つ第２の複数の隔離ペンの最初の各ペン（例えば、８３０’）の開口部とも位置合わせされる。１つ又は複数のギャップは、第１のクローン集団の１つ又は複数の細胞を選択し、マイクロ流体チャネルの第１の側にある第１の複数のペンの最初のペンから、マイクロ流体チャネルの第２の逆の側にある第２の複数のペンの最初のペンに移せるように構成されるサイズを有する。細胞６３１’、６３３’、６３５’を送った後、１つ又は複数のギャップは、上述したように、１つ又は複数のインサイチュー生成バリアで閉じ得る。細胞６３１’、６３３’、６３５’は、本明細書に記載される任意の適する方法で更に処理し得、アッセイされて、細胞の所望のクローン集団を識別し得る。細胞の所望のクローン集団は、更に増殖又は成長させるために搬出し得、又はマイクロ流体デバイス１４００の隔離ペンの所定位置で培養し得る。望ましくないと識別されたクローン集団は、隔離ペンから搬出し得、更にマイクロ流体デバイス１４００から搬出し得る。
図１５は、マイクロ流体デバイス１４００の別の変形形態であるマイクロ流体デバイス１５００を示す。幾つかの実施形態では、インサイチュー生成バリア１５００は、バリア１５２０の小さい断裂又はバリア１５２０自体の多孔性の増大のいずれかにより達成される様々な程度の多孔性を更に有し得る。インサイチュー生成バリアは、間隔を増大させたインサイチュー生成バリアモジュール１５２２、１５２４、１５２６、１５２８を有するように中断し得る。この手法では、異なる量の、第１の流入口９３０において導入され、媒体フロー２７８で第１のサブチャネルに流入する第１の媒体及び第２の流入口９３０’において導入され、媒体フロー２７８’で第２のサブチャネルに流入する第２の媒体がバリアに浸透し、拡散を介してバリアの両側にあるペン内の細胞対６３１、６３１’；６３３、６３３’；６３５、６３５’に影響を及ぼすことができる。
これらの任意の層流インサイチュー生成バリア（図１４Ｂ又は図１５）は、指定された細胞株の成長に有用であり得る。
図１６は、媒体又は溶媒の変更を使用して膨張又は縮小し得るインサイチュー生成バリアを示す。細胞６３０がマイクロ流体回路材料１６６０（チャネル壁１６２０を形成するマイクロ流体回路材料と同じ又は異なる材料であり得る）で作られた隔離ペン８３０内に配置され、流動性ポリマーを流体チャネル２６４に導入した後、例えば、基板２０８上の選択されたポイントを照明することにより、バリア１６２０の重合化を達成することにより、インサイチュー生成バリア１６２０を導入し得る。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイス１６００内の他のペン（図示せず）に対して他のソート又は処理ステップを実行している間、光開始固化ポリマー網目構造を状態１６２０’まで膨張させ、細胞６３０の流出を阻止する。バリアは、また、処理ステップ中、可溶性媒体がペン８３０に入ることを阻止し、細胞６３０をシールドし得る。インサイチュー生成バリアは、状態１６２０に縮小し、細胞６３０が出られるようにし得る。
図１７は、微小物体６３０及び微小物体６３６の導入前又は導入後、複数のインサイチュー生成バリアモジュール１７２０〜１７３２を有するマイクロ流体デバイス１７００を示す。マイクロ流体デバイスのフィールドの各セクションは、所望の微小物体６３０について調べられ且つテストされ得る。本明細書に記載の適する方法により個々のバリアモジュールを除去し得、微小物体をマイクロ流体デバイス１７００の異なる部分にソートし得る。
図１８は、マイクロ流体デバイス１８００の特徴の試作に使用されるインサイチュー生成分離構造の例を示す。フロー領域壁１８１０、分離構造サブユニット１８２０及び１８２２、並びに試作されたチャネルユニット１８６４、１８６５等の要素を導入し、インサイチュー生成バリア／分離構造を介して新しい設計態様を追加することにより、高速で再結合して、新しい設計をテストし得る。これは、高価な実験マスクへの代替であり得る。
図１９Ａ及び図１９Ｂは、選択された細胞６３６を画定し分離するマイクロ流体デバイス１９００の隔離ペン内のインサイチュー生成エンクロージャ１９２０の例を示す。これは、形質転換を開始する試薬と細胞との分離に使用することもできる。幾つかの実施形態では、エンクロージャは、本明細書に記載されるように、膨張状態１９２０’まで膨張し得、任意選択的に、細胞６３６’’を透過可能になるまで十分に膨張し得る。図２０Ａ及び図２０Ｂは、任意の隔離ペン外部で同様のエンクロージャ２０２０を利用して、細胞を分離してその位置を識別し、任意選択的に膨張して（２０２０’）細胞６３６’’を透過可能になるマイクロ流体デバイス２０００を示す。
マイクロ流体デバイス４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００は、マイクロ流体デバイス１００、２００、２３０、２５０、２８０、２９０、３００について記載された特徴、構成要素、又は寸法の任意の組合せを有し得、記載される任意の方法に適宜使用し得る。マイクロ流体デバイス４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００は、任意の適する組み合わせにおいて、それぞれ他のマイクロ流体デバイス４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００について記載された任意の特徴と更に組み合せ得、当業者が選択する本明細書に記載される任意の適する方法で使用し得る。
インサイチュー生成分離構造の固化ポリマー網目構造で使用されるポリマー
分離構造の固化ポリマー網目構造の様々な実施形態において、固化ポリマー網目構造は、合成ポリマー、修飾合成ポリマー、又は光若しくは温度活性化可能な生体ポリマーであり得る。生体ポリマーは、温度又は光活性化可能であり、それにより固化ポリマー網目構造を形成するように構成され得る。幾つかの実施形態では、生体ポリマーは、温度又は光活性化可能である能力を提供する部分を組み込むように修飾し得る。合成ポリマー修飾は、サイズ変更モチーフ、切断モチーフ、反応末端モチーフ、及び／又は細胞認識モチーフを含み得る。
分離構造の固化ポリマー網目構造の幾つかの実施形態では、固化ポリマー網目構造は、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、修飾ポリ乳酸、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、修飾ポリグリコール酸、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、修飾ポリアクリルアミド、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡｍ）、修飾ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、修飾ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、修飾ポリアクリル酸、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、修飾ポリカプロラクトン、フィブロネクチン、修飾フィブロネクチン、コラーゲン、修飾コラーゲン、ラミニン、修飾ラミニン、ポリサッカリド、修飾ポリサッカリド、又は任意の組合わせのコポリマーの少なくとも１つを含み得る。他の実施形態では、ポリマーは、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、修飾ポリ乳酸、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、修飾ポリグリコール酸、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、修飾ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、修飾ポリアクリル酸、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、修飾ポリカプロラクトン、フィブロネクチン、修飾フィブロネクチン、コラーゲン、修飾コラーゲン、ラミニン、修飾ラミニン、ポリサッカリド、修飾ポリサッカリド、又は任意の組合わせのコポリマーの少なくとも１つを含み得る。更に他の実施形態では、ポリマーは、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、修飾ポリ乳酸、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、修飾ポリグリコール酸、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、修飾ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、修飾ポリアクリル酸、フィブロネクチン、修飾フィブロネクチン、コラーゲン、修飾コラーゲン、ラミニン、修飾ラミニン、又は任意の組合わせのコポリマーの少なくとも１つを含み得る。幾つかの実施形態では、固化ポリマー網目構造はシリコーンポリマーを含まない。幾つかの実施形態では、固化ポリマー網目構造は、ポリ乳酸（ＰＬＡ）又は修飾ポリ乳酸ポリマーを含まなくてよい。他の実施形態では、固化ポリマー網目構造は、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）又は修飾ポリグリコール酸ポリマーを含まなくてよい。幾つかの実施形態では、固化ポリマー網目構造は、ポリアクリルアミド又は修飾ポリアクリルアミドポリマーを含まなくてよい。更に他の実施形態では、固化ポリマー網目構造は、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）又は修飾ポリビニルアルコールポリマーを含まなくてもよい。幾つかの実施形態では、固化ポリマー網目構造は、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）又は修飾ポリアクリル酸ポリマーを含まなくてもよい。幾つかの他の実施形態では、固化ポリマー網目構造は、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）又は修飾ポリカプロラクトンポリマーを含まなくてもよい。他の実施形態では、固化ポリマー網目構造は、フィブロネクチン又は修飾フィブロネクチンポリマーから形成しなくてよい。幾つかの他の実施形態では、固化ポリマー網目構造は、コラーゲン又は修飾コラーゲンポリマーから形成しなくてよい。幾つかの他の実施形態では、固化ポリマー網目構造は、ラミニン又は修飾ラミニンポリマーから形成しなくてよい。
固化ポリマー網目構造で使用するポリマーの安定性を決める物理的特性及び化学的特性としては、分子量、疎水性、可溶性、拡散速度、粘度（例えば、媒体の）、励起、及び／又は放射範囲（例えば、内部で不動化された蛍光試薬の）、既知の背景蛍光、重合化に影響する特性、及び固化ポリマー網目構造の孔のサイズを挙げ得る。固化ポリマー網目構造は、流動性ポリマー（例えば、プレポリマー溶液）が重合化又は熱ゲル化されることで形成される。
使用し得る多くのポリマーの中でも特に、１つのタイプのポリマーは、ポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）である。光開始重合化のメカニズムを式１に示す。非常に効率的であり、無黄変ラジカルであり、αヒドロキシケトン光開始剤である遊離基開始剤Igracure（登録商標）２９５９（ＢＡＳＦ）は通常、ＵＶ領域（例えば、３６５ｎｍ）の波長での開始に使用されるが、他の開始剤を使用することも可能である。重合化反応に有用な別の光開始剤クラスの例は、リチウムアシルホスフィン酸塩（lithium acyl phosphinate salt）のグループであり、そのリチウムフェニル２，４，６，−トリメチルベンゾイルホスフィン酸塩は、αヒドロキシケトンクラスよりも長い波長（例えば、４０５ｎｍ）でのより効率的な吸収に起因して、特定の有用性を有する。
Figure 2019502365
光重合化し得る他のタイプのＰＥＧとしては、ＰＥＧジメチルアクリラート及び／又はマルチアームＰＥＧ（ｎ−ＰＥＧ）アクリラート（ｎ−ＰＥＧ−Ａｃｒ）が挙げられる。使用し得る他のポリマークラスとしては、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、又はポリカプロラクトン（ＰＣＬ）が挙げられる。
ポリマーの分子量範囲は、本発明の分離構造の性能の必要性に応じて様々であり得る。ポリマーの構造に応じて、広範囲の分子量の流動性ポリマーが適し得る。有用な星型ポリマーは、約５００Ｄａ〜約２０ｋＤａ（例えば、４アームポリマー）の範囲のＭｗ（重量平均分子量）、又は各アーム若しくは線状ポリマーに最高で約５ｋＤａ、又はそれらの間の任意の値を有し得る。幾つかの実施形態では、高い分子量範囲を有するポリマーほど、低い濃度で流動性ポリマーにおいて使用し得、それでもなお、本明細書に記載される方法で使用し得るインサイチュー生成バリア又は分離構造を提供し得る。
限定ではなく、上記で列挙したポリマー又はフィブロネクチン、コラーゲン、若しくはラミニン等の生体ポリマーを含め、様々なコポリマークラスが使用可能である。デキストラン又は修飾コラーゲン等のポリサッカリドが使用可能である。重合化に光活性化可能な機能を有する生体ポリマーを使用することも可能である。
架橋は、線状又は分岐ＰＥＧポリマーの放射、ＰＲＧアクリラートの遊離基重合化、及びマイケル付加、凝縮、クリック化学、ネイティブケミカルライゲーション、及び／又は酵素反応等の特に適合された化学反応により実行し得る。
ポリマーは、ポリマーの性質（星型、マルチアーム、又は櫛形ポリマー等の流動性ポリマーの構成、架橋可能な官能基間のポリマーセグメント長）及び重合化状況（温度又は光開始の程度、存在する光活性化開始剤の量、存在するラジカル停止種の量等）に基づいて、所望の範囲の架橋を有するように選択し得る。
幾つかの実施形態では、固化ポリマー網目構造のポリマーは修飾ＰＥＧポリマーであり得る。このポリマーは、星型、４アーム、又は２アームＰＥＧジアクリレートポリマーであり得る。
膨張可能ポリマー
ＰＥＧポリマーは、様々な条件下で膨張可能であり得、元の媒体／温度に戻すことにより元に戻し得る。ポリＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡｍ）は、温度を上げることにより膨張し、冷却により収縮し得る。
サイズ変更モチーフ
ポリＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡｍ）又はポリアクリルアミド（ＰＡＭ）を含む幾つかのヒドロゲルは、官能化ポリマーの表面が光に露出されると、シス／トランス配向を変化させるアゾベンゼン等の特定の部分を組み込むこともできる。このシフトは、ペン内の分離構造等のポリマーの部分のサイズの大幅な変更を提供することができる。これらのポリマーは代替的に、ＵＶ光に露出されると架橋する桂皮酸官能基を含み得、これは光をなくすと元に戻すことができる。架橋ポリマーは、非架橋状態と比較して細長い。これらのポリマーに導入し得る別の部分は、トリフェニルロイコメタン（triphenyl leucomethane）を含み、これは、光が適用されると、光に露出されると可逆的にイオン対を形成する。活性化光の波長は、三ナトリウム銅クロロフィリンがポリマーに組み込まれる場合、可視範囲にすることができる。
官能化のための他の修飾
ポリマー（例えば、ＰＥＧ）は、１つ又は複数の異なるモチーフを（ＰＥＧ）ポリマー内に組み込むことにより修飾し得る。モチーフは、サイズ変更モチーフ、切断モチーフ、反応末端モチーフ、及び／又は細胞認識モチーフを任意の組合せで含み得る。サイズ変更モチーフは、固化ポリマー網目構造の物理的サイズを変更させ、それにより物理構造のサイズを変更させ得る、周囲媒体の温度、イオン強度、又はｐＨの変化の受けやすさを含み得る。非限定的な例としては、ポリＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡｍ）等の下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）ポリマー又は上限臨界溶解温度（ＵＣＳＴ）ポリマーを挙げ得る。別の例は、ＰＥＢ等のポリマー内へのジスルフィド結合の組み込みである。
切断モチーフは、限定ではなく、細胞外基質分解酵素、コラーゲン分解酵素、又はプロテイナーゼＫ等のセリンプロテイナーゼを含む１つ又は複数のプロテアーゼの基板であるポリマーに挿入されるペプチド配列を含み得る。別のクラスの切断モチーフは、プレポリマーの選択された位置に挿入し得るニトロベンジル光切断可能リンカー等の光切断可能モチーフを含み得る。幾つかの実施形態では、ニトロベンジル光切断可能リンカーは、光切断可能なように構成される１−メチニル，２−ニトロベンジル部分を含み得る。他の実施形態では、光切断可能リンカーは、ベンゾイン部分、１，３ニトロフェノリル部分、クマリン−４−イルメチル部分、又は１−ヒドロキシ２−シンナモイル部分を含み得る。切断モチーフを利用して、分離構造の固化ポリマー網目構造を除去し得る。他の実施形態では、ポリマーは、インテグリンにより認識されるＲＧＤペプチドモチーフを含むが、これに限定されない細胞認識モチーフを含み得る。
インサイチュー生成分離構造の逆化／除去／最小化
インサイチュー生成分離構造に対する更なる目的がない場合、幾つかのメカニズムを使用して、インサイチュー生成分離構造を除去又は縮小し得る。例えば、アッセイが完了し、望ましい生体細胞が識別されると、望ましい活動又は特性を示している生体細胞を引き続き培養し増殖させるために、分離構造を除去することが有用であり得る。
機械力．分離構造の少なくとも一部がペンの分離領域とは対照的にフロー領域内に配置される場合、フローの増大を使用することができる。例えば、少なくとも１つの分離構造は、隔離ペンの分離領域内に配置し得、アッセイ完了後、隔離ペン又は隔離ペン内の分離領域は、分離領域を通って流れるように変更し得る。
加水分解への感受性：分離構造形成時、光開始ポリマーに化学的に結合することができないポリマーを含む粒子集合体が含まれ得る。形成されたヒドロゲル内の開口部の程度／サイズは、分離構造内のアクセス可能性を介して加水分解速度をカスタマイズすることができる）。他の実施形態では、形成された孔を利用して、分離構造に分泌材料又は化学試薬を透過させるが、分離構造に入る、分離構造から出る、及び／又は分離構造を通る細胞の移動を阻止し得る。他の実施形態では、ポリエステル、アセタール、フマル酸塩、ポリ（フマル酸プロピレン）、又はポリヒドロキシ酸等の分解可能なセグメントをポリマー（例えば、ＰＥＧポリマー）に導入することにより、これらのポリマーの分解性を上げることができる。
還元剤：ＰＥＧは、ランダム又は所定であり得る、マクロマーに沿った間隔でジスルフィド結合を用いて形成し得る。ジスルフィド結合は、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、メルカプトエタノール、又はＴＣＥＰにより破り得る。
熱：ポリＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡｍ）又は他の適するＬＣＳＴポリマーを使用して、加熱して分離構造を導入し得る。これらは、形成されたポリマー分離構造の温度を下げることにより除去し得る。ポリマーは、加水分解又はタンパク質分解等の他のメカニズムによる除去も可能にするＥＬＰ又は他のモチーフを含み得る。特に、ＰＮＩＰＡｍを使用して、付着細胞への表面を作製し得るが、次に搬出を可能にするように切り替え得る。
タンパク質分解への感受性：ヒドロゲルは、選択されたプロテアーゼによる選択されたモチーフへの選択的タンパク質分解がヒドロゲル分離構造を除去／逆化／又は最小化することができるように改変された任意に種類のペプチド配列を有し得る。幾つかのクラスの修飾ＰＥＧは、エラスチン様ペプチド（ＥＬＰ）モチーフ及び／又は様々なタンパク質分解感受性ペプチドモチーフ（酵素感受性ペプチドＥＳＰ）を有するＰＥＧを含む。多数のこれらのモチーフが既知である。１つの有用なモチーフは、環式であるように制約し得るＲＧＤである。
浸透圧変化感受性：カルシウム濃度／他の浸透圧方策を利用して、分離構造を分解及び除去することができる。上記のように、チャネル又はフロー領域を通って流れる媒体の変更は、分離構造を寸法的に膨張又は縮小させ得る。
光切断：上述したように、固化ポリマー網目構造のポリマーが光切断部分を含む場合、励起波長の照明を固化ポリマー網目構造に向けることにより、固化ポリマー網目構造のセクション内に切断を生じさせる。この切断は、固化ポリマー網目構造の完全又は部分的な崩壊を提供し得、それにより分離構造を除去又は縮小し得る。固化ポリマー網目構造の部分的な崩壊が光切断により提供される場合、流体媒体をチャネル又はフロー領域に流して、固化ポリマー網目構造の部分的に崩壊した部分を分離された１つ又は複数の微小物体から離れて掃引することにより、完全な崩壊（例えば、この分離構造の完全な除去）を達成し得る。
幾つかの用途では、分離構造は、除去されず、光又は媒体／溶媒の変更を使用して単に膨張又は縮小し得る。幾つかのタイプのヒドロゲルは、光に対して可逆的に応答する部分（例えば、剛性結合についての位置化学の変更、ポリマー内での可逆的架橋の形成、又はイオン対の形成／破断）を組み込み得る。
マイクロ流体（又はナノ流体）デバイス支援の加熱
マイクロ流体デバイスは、基板のインサイチュー生成分離構造の位置に配置された金属パッドを更に含み得る。金属パッドは、連続金属形状又は金属形状のパターンを基板上に退陣させることにより作製し得る。熱パッドは、光源により励起して、発熱することができる任意のタイプの金属を含むことができる。適する金属としては、クロム、金、銀、アルミニウム、インジウムスズ酸化物、又はそれらの任意の組合せが挙げられる。複数の金属、例えば、クロムの層、チタンの層、金の層は、多層熱パッドにおいて組み合せ得る。他の金属（及び合金）も当技術分野で既知である。熱パッドは、連続金属表面を含むこともでき、又は金属のパターン（例えば、ドット、正方形、線、円錐、不規則形等の金属形状）を含むこともできる。幾つかの実施形態では、金パッドを基板のインサイチュー生成分離構造が生成されることになる／生成された位置に配置し得る。熱パッドを使用して、インサイチュー生成分離構造をゲル化、膨張、縮小、又は除去するための熱を生成し得る。熱は、そのようなゲル化、膨張、縮小、又は除去が望まれるマイクロ流体デバイスの位置に光を向けることにより生成し得る。幾つかの実施形態では、固化ポリマー網目構造は感熱性ポリマーを含み得る。分離構造の固化ポリマー網目構造が感熱性ポリマーを含む場合、デバイスは、基板の、少なくとも１つのインサイチュー生成分離構造が導入されることになる位置の下に配置された熱パッドを更に含み得る。
方法
マイクロ流体デバイス内の領域を完全に囲むか、又はペン若しくは隔離ペンのように領域を部分的に囲み得、インサイチュー生成バリであり得るインサイチュー生成分離構造は、マイクロ流体（又はナノ流体）デバイスに細胞を導入する前又は後に導入し得る。インサイチュー生成分離構造は、一時的であるように設計することもでき、又は少なくとも、ソート及び／又は濃縮及び／又は処理手順の持続時間にわたり定位置に維持し得る。
インサイチュー生成分離構造は、マイクロ流体内に存在するポリマー溶液に、生体細胞又はビーズが分離構造を超えることを阻止し得る分離構造を形成させることができる光活性化、温度変更、又は浸透圧変更により導入し得る。ポリマーインサイチュー生成分離構造のメッシュサイズに応じて異なるカテゴリの化学種をバリアに通し得る。メッシュサイズが約２ｎｍであるように選ばれる場合、小さい分子成分のみが通過可能であり得るが、タンパク質等は分離構造／バリアにより隔離し得る。インサイチュー生成分離構造／バリアは、タンパク質、核酸、細胞小器官、又はシグナリング分子等のより小さい物質がバリアを渡ることを阻止しないより大きいメッシュサイズを有するポリマーで構成され得る。インサイチュー生成分離構造／バリアは、細胞又はビーズがインサイチュー生成構造／バリアに入る、インサイチュー生成構造／バリアから出る、インサイチュー生成構造／バリアを通ることを許容せずに、媒体を透過させ得る。インサイチュー生成分離構造／バリアは、ビーズ（限定ではなく、磁性ビーズ、ポリスチレンビーズ、又はガラスビーズを含む）を分離構造／バリア内へ、外へ、及び／又は分離構造／バリアを通して透過させながら、生体細胞を保持するメッシュサイズ（架橋されたポリマーストランド間の開口部又は空間の実効サイズ）を有し得る。
光活性化重合化を導入するプロセスは、マイクロ流体デバイス内で実行することができ、更に細胞の存在下で実行し得る。光活性化重合化開始剤は、流動性ポリマーの追加前に、それと同時に、又はその後に導入し得る。拡散は重合化プロセスと競合し得、したがって遊離基を迅速に作成する能力が有用であり得る。更に、遊離基は遊離酸素と迅速に結合することができる。光重合化は、媒体中に酸素がない場合、非常に有効で高速であり得るが、生体細胞が存在する（したがって酸素の存在を必要とする）場合、補償するように開始ラジカルの数への調整を行い得る。実際には、マイクロ流体デバイス内で有用な多くのタイプのバリアの導入のために、特に限られた量のポリマーを導入して、ペン又はチャネルを全体的には遮断しない小さいバリアを形成する場合、連鎖停止反応をより迅速に生じ得、形成される余分なポリマー量を制限し得るため、酸素の効果を制限することが役立ち得る。
本明細書に記載される任意の変形形態を含め、インサイチュー生成分離構造を用いて微小物体を分離する方法において、微小物体をソート、濃縮、及び／又はマイクロ流体デバイスの予め選択された領域又は隔離ペンに選択的に配置し得るマイクロ流体デバイスが提供される。本明細書に記載されるインサイチュー生成分離構造によって分離される微小物体は、マイクロ流体デバイス内に選択的に保持し得、一方、分離されない微小物体は搬出され、分離された微小物体は、その後、分離プロセスにより選択されない微小物体が存在しない状態で更に処理するために選択的に更に解放され得る。更に、分離された微小物体又は分離されなかった微小物体は、マイクロ流体デバイスにおいて選択的に更に処理し得、この処理は、任意のタイプのアッセイ又は溶解、遺伝子編集、若しくは遺伝子型判定等の更なる処理への準備を含み得る。
一態様では、マイクロ流体デバイスにおいて微小物体を分離する方法が提供され、この方法は、基板及びフロー領域を含むエンクロージャを含むマイクロ流体デバイスを提供するステップと、第１の流体媒体をマイクロ流体デバイスのエンクロージャに導入するステップと、流体媒体中の複数の微小物体をエンクロージャに導入するステップと、複数の微小物体の導入前又は後、流動性ポリマーをエンクロージャに導入するステップと、フロー領域の少なくとも１つの選択されたエリアにおける流動性ポリマーの固化を活性化し、それによりインサイチュー生成分離構造を形成するステップと、インサイチュー生成分離構造を用いて複数の微小物体の少なくとも１つを分離するステップとを含む。
方法の様々な実施形態では、方法は、複数の微小物体の残りをマイクロ流体デバイスから搬出することを更に含み得る。複数の微小物体の残りは、複数の微小物体の選択された部分であり得る。他の実施形態では、インサイチュー生成分離構造によって分離される少なくとも１つの微小物体は、複数の微小物体の選択された部分であり得る。
方法の様々な実施形態では、方法は、流体媒体のフローの増大、加水分解剤の導入、タンパク質分解剤の導入、流体媒体の浸透圧の増大／低減、インサイチュー生成分離構造の温度の変更、又はインサイチュー生成分離構造の光学的な照明により、インサイチュー生成分離構造（インサイチュー生成分バリア、１つ又は複数のインサイチュー生成バリアモジュール、及び／又は１つ又は複数のインサイチュー生成分離モジュールを含み得る）を縮小又は除去し、それにより少なくとも１つの微小物体を分離から解放するステップを更に含み得る。温度を変更するステップは、インサイチュー生成分離構造に隣接する又はインサイチュー生成分離構造の下にある基板上の熱パッドを光学的に照明することを更に含み得る。方法の様々な実施形態では、方法は、解放された少なくとも１つの微小物体をマイクロ流体デバイスから搬出するステップを更に含み得る。方法の様々な実施形態では、マイクロ流体デバイスから複数の微小物体の選択された部分を搬出することは、複数の微小物体の選択された部分をマイクロ流体デバイスの基板の異なる部分に移すことを更に含み得る。
方法の様々な実施形態では、インサイチュー生成分離構造は、流体媒体のフローに対して透過性であり得るが、一方で微小物体の幾つか又は全てのサブセットがインサイチュー生成分離構造に入る、インサイチュー生成分離構造から出る、及び／又はインサイチュー生成分離構造を通ることを阻止し得る。
方法の様々な実施形態では、流動性ポリマーの固化を活性化するステップは、インサイチュー生成ペンであり得るインサイチュー生成分離構造を形成し得る。図９Ｃは非限定的な一例を示す。インサイチュー生成ペンは、分離領域及び接続領域を含むインサイチュー生成隔離ペンであって、接続領域は、フロー領域への基端開口部及び分離領域への先端開口部を有する、インサイチュー生成隔離ペン；少なくとも１つの微小物体を完全に囲むインサイチュー生成壁；並びに少なくとも１つの微小物体を部分的に囲むインサイチュー生成ペンであって、少なくとも１つの微小物体の流入／流出を許容するのに十分に大きい１つの開口部を周縁に有する、インサイチュー生成ペンからなる群から選択し得る。幾つかの実施形態では、方法は、少なくとも１つの分離された微小物体の周りにインサイチュー生成ペンを膨張させ、それにより微小物体圧力を加え、微小物体を透過させるステップを更に含み得る。図２０Ａは非限定的な例を示す。
流動性ポリマーの固化を活性化するステップは、複数のインサイチュー生成ペンモジュールを有するインサイチュー生成ペンを形成することを更に含み得、複数のサブユニットのそれぞれは、少なくとも１つの分離された微小物体がペンから出ることを阻止する距離で互いから離間される。幾つかの実施形態では、複数のインサイチュー生成ペンモジュールは、複数の微小物体の微小物体の少なくとも１つのサブセットがインサイチュー生成ペンから出ることを阻止する距離で互いから離間され得る。微小物体は、約１ミクロン〜約２０ミクロンの直径を有し得る。幾つかの実施形態では、微小物体の少なくとも１つのサブセットは、少なくとも１つのタイプの生体細胞を含む。
幾つかの実施形態では、流動性ポリマーの固化を活性化するステップは、少なくとも１つの微小物体がバリアを通過することを阻止するように構成されるインサイチュー生成バリアを含むインサイチュー生成分離構造を形成し得る。幾つかの実施形態では、複数のバリアを導入し得、複数のバリアは、複数の微小物体の少なくとも１つの微小物体の各サブセットを分離できるようにするように構成され得る。方法は、インサイチュー生成分離構造のサイズを低減又はインサイチュー生成分離構造を除去し、それにより少なくとも１つの微小物体を解放するステップを含み得る。
方法の様々な実施形態では、方法は、少なくとも１つの解放された微小物体の１つ又は複数のサブセットをマイクロ流体デバイスから搬出するステップを更に含み得る。少なくとも１つの微小物体の１つ又は複数のサブセットを搬出することは、少なくとも１つの微小物体の１つ又は複数のサブセットをマイクロ流体デバイスの異なる部分に移すことを含み得る。マイクロ流体デバイスの他の部分は隔離ペンを含み得る。
方法の様々な実施形態では、固化を活性化するステップは、複数のインサイチュー生成バリアモジュールを有するインサイチュー生成バリアを形成することを更に含み得、複数のインサイチュー生成モジュールのそれぞれは、少なくとも１つの微小物体がインサイチュー生成バリアを透過することを阻止する距離で互いから離間される。方法の様々な実施形態では、方法は、複数のインサイチュー生成バリアモジュールを互いから離間させるステップであって、それにより、インサイチュー生成バリアは、複数の微小物体の微小物体の少なくとも１つのサブセットがインサイチュー生成バリアを透過することを阻止するインサイチュー生成バリアを形成する、ステップを更に含み得る。微小物体の少なくとも１つのサブセットは、少なくとも１つのタイプの生体細胞を含み得る。
方法の様々な実施形態では、マイクロ流体デバイスのエンクロージャは、分離領域及び接続領域を含む少なくとも１つの隔離ペンを更に含み得、接続領域は、フロー領域への基端開口部と、分離領域への先端開口部とを有する。エンクロージャは複数の隔離ペンを含み得る。複数の隔離ペンは、行に位置合わせし得、複数のそれぞれの隔離ペンの基端開口部は、互いと連続して配置し得る。幾つかの実施形態では、フロー領域はチャネルを含み得、複数のそれぞれの隔離ペンの基端開口部は、チャネルの１つの側において開き得る。
方法の様々な実施形態では、固化を活性化するステップは、隔離ペンの内部で実行し得る。幾つかの実施形態では、固化を活性化するステップは、分離領域又は接続領域内で実行し得る。図４、図１０Ａ〜図１０Ｃ、図１２Ｂ、図１６、図１９、図２１Ａ〜図２１Ｃ、及び図２２は非限定的な例を示す。幾つかの実施形態では、隔離ペン内で固化を活性化するステップは、インサイチュー生成ペンを形成し得る。インサイチュー生成ペンは、１つの生物学的微小物体を包含し得る。幾つかの実施形態では、方法は、インサイチュー生成ペンを膨張させ、それにより１つの生体細胞をより隙間なく囲むステップを更に含み得る。方法は、１つの生体細胞を透過可能になるまでインサイチュー生成ペンを膨張させるステップを更に含み得る。図２０Ａは非限定的な一例を示す。方法の様々な実施形態では、隔離ペン内の流動性ポリマーの固化を活性化するステップは、インサイチュー生成バリアを形成し得る。幾つかの実施形態では、インサイチュー生成バリアは、隔離ペンの分離領域に配置し得る。インサイチュー生成バリアは、分離領域の幅の約１／４〜約３／４であり得る分離領域にわたる幅を有し得る。分離領域にわたるインサイチュー生成バリアの幅は、約５ミクロン〜約２０ミクロンであり得る。分離領域の幅は、約３０ミクロン〜約５０ミクロンであり得る。図１２Ａ及び図１２Ｂは非限定的な一例を示す。方法は、マイクロ流体デバイスからバリアによって分離されない複数の微小物体の残りを搬出するステップを含み得る。方法の様々な実施形態では、方法は、インサイチュー生成バリアを光学的に照明するか又はその周囲の温度を変更することにより、インサイチュー生成バリアを縮小又は除去し、それにより少なくとも１つの微小物体を解放するステップを更に含み得る。方法の様々な実施形態では、方法は、少なくとも１つの微小物体をマイクロ流体デバイスから搬出するステップを更に含み得る。
幾つかの実施形態では、流動性ポリマーの固化を活性化するステップは、接続領域においてインサイチュー生成バリアを生成し得る。方法は、隔離ペンに配置された少なくとも１つの微小物体を捕捉するように構成される捕捉部分を含むように、インサイチュー生成バリアを修飾するステップを更に含み得る。インサイチュー生成バリアは、接続領域の約１／４〜約３／４であり得る接続領域にわたる幅を有し得る。幾つかの実施形態では、接続領域にわたるインサイチュー生成バリアの幅は、約５ミクロン〜約２０ミクロンであり得る。図１０Ａ〜図１０Ｃは非限定的な一例を示す。様々な実施形態では、接続領域は、約３０ミクロン〜約５ミクロンの幅を有し得る。
幾つかの実施形態では、方法は、インサイチュー生成バリアによって分離されない複数の微小物体の残りをマイクロ流体デバイスから搬出するステップを更に含み得る。
方法の様々な実施形態では、方法は、複数のインサイチュー生成バリアの１つ又は複数を縮小又は除去し、それにより少なくとも１つの微小物体を分離から解放するステップを更に含み得る。様々な実施形態では、方法は、インサイチュー生成バリアによる分離から解放された後、少なくとも１つの微小物体をマイクロ流体デバイスから搬出するステップを更に含み得る。
幾つかの実施形態では、流動性ポリマーの固化を活性化するステップは、チャネル内にインサイチュー生成バリアを形成し得る。様々な実施形態では、流動性ポリマーの固化を活性化するステップは、複数の隔離ペンの少なくとも１つの隔離ペンの基端開口部に隣接してインサイチュー生成バリアを配置し得る。複数の隔離ペンが存在し得、複数の隔離ペンが行を形成する幾つかの実施形態では、及び流動性ポリマーの固化を活性化するステップは、隔離ペンの行の端部に配置された隔離ペンの基端開口部の先端縁部に隣接してインサイチュー生成バリアを配置し得る。方法の幾つかの実施形態では、分離ステップは、複数の微小物体の少なくとも１つの微小物体がチャネル内のインサイチュー生成バリアを超えて移動することを阻止することを含み得る。他の実施形態では、分離ステップは、複数の微小物体の少なくとも１つのサブセットがチャネル内のインサイチュー生成バリアを超えて移動することを阻止することを含み得る。図６、図７、図８、及び図１３Ａ〜図１３Ｃは非限定的な例を示す。
方法の様々な実施形態では、流動性ポリマーの固化を活性化するステップは、複数のインサイチュー生成バリアモジュールを有するインサイチュー生成バリアを形成することを更に含み得る。複数のモジュールのそれぞれは、複数の微小物体の少なくとも１つの微小物体がチャネル内のバリアを超えて移動することを阻止する距離で互いから離間される。幾つかの実施形態では、流動性ポリマーの固化を活性化するステップは、複数の微小物体の微小物体の少なくとも１つサブセットがバリアを超えて移動することを阻止する距離に複数のインサイチュー生成バリアモジュールを形成することを更に含み得る。複数の隔離ペンが存在し得、複数の隔離ペンが行を形成する幾つかの実施形態では、及び流動性ポリマーの固化を活性化するステップは、隔離ペンの行の端部に配置された隔離ペンの基端開口部の先端縁部に隣接してバリアを配置し得る。様々な実施形態では、分離するステップは、少なくとも１つの微小物体が選択された隔離ペンを超えることを阻止することを含み得る。図９Ａ〜図９Ｄは非限定的な例を示す。幾つかの実施形態では、分離ステップは、少なくとも１つの微小物体を選択された隔離ペンに配置することを更に含み得る。少なくとも１つの微小物体は、複数の微小物体の全てであり得る。
幾つかの実施形態では、流動性ポリマーの固化を活性化するステップは、少なくとも２つの連続した隔離ペンの基端開口部を遮断するサイズのインサイチュー生成バリアを形成し得る。基端開口部を遮断するインサイチュー生成バリアは、少なくとも５０ミクロン〜約５００ミクロンの寸法を有し得る。図５Ａ及び図５Ｂは非限定的な一例を示す。様々な実施形態では、方法は、バリアによって分離されない複数の微小物体の残りの残りをマイクロ流体デバイスから搬出するステップを更に含み得る。
幾つかの実施形態では、流動性ポリマーの固化を活性化するステップは、複数のペンの最初の隔離ペンの基端開口部の先端縁部にバリアを形成し得る。図１３Ａ〜図１３Ｃは非限定的な一例を示す。幾つかの実施形態では、複数の隔離ペンは第１の複数の隔離ペンであり得、チャネルは第１のチャネルであり得、マイクロ流体デバイスは、第２のチャネルに沿って配置された第２の複数の隔離ペンを更に含み得、バリアは、少なくとも１つの微小物体がインサイチュー生成バリアを超えて第１のチャネルに入ることを阻止し得る。バリアは、流体媒体のフローをエンクロージャの別の部分に向け得る。幾つかの実施形態では、バリアは、複数の微小物体の全てがバリアを超えて第１のチャネルに入ることを阻止し得る。幾つかの実施形態では、分離するステップは、複数の微小物体を第２のチャネルに向けることを更に含み得る。幾つかの実施形態では、分離するステップは、複数の微小物体を第２のチャネル内の第２の複数の隔離ペンに配置することを更に含み得る。
方法の様々な実施形態では、マイクロ流体デバイスは、チャネルの第１の側に互いに隣接して配置される第１の複数の隔離ペンを含み得、マイクロ流体デバイスは、マイクロ流体チャネルの第２の逆の側に互いに隣接して配置される第２の複数の隔離ペンを更に含む。図１４Ａ、図１４Ｂ、及び図１５は非限定的な例を示す。幾つかの実施形態では、複数の微小物体を導入するステップは、複数の微小物体を第１の流体媒体において第１の複数の隔離ペンのそれぞれに導入することを含み得る。複数の微小物体のそれぞれは、生物学的微小物体のクローン集団であり得る。方法の様々な実施形態では、導入するステップは、第１のクローン集団の第１の生物学的微小物体を第１の流体媒体において第２の複数の隔離ペンの最初の隔離ペンに導入することを更に含み得る。幾つかの実施形態では、導入するステップは、第１の複数の隔離ペンの各隔離ペン内の各クローン集団の第１の生物学的微小物体を第１の流体媒体において第２の複数の隔離ペンの各隔離ペンに導入することを更に含み得る。
幾つかの実施形態では、流動性ポリマーの固化を活性化するステップは、マイクロ流体チャネルの長さに沿って流動性ポリマーの固化を活性化することであって、それにより第１の複数の隔離ペンを超える流体媒体の第１のサブフローを提供するように構成される第１のサブチャネルと、第２の複数のペンを超える流体媒体の第２のサブフローを提供するように構成される第２のサブチャネルとにマイクロ流体チャネルを分割する、インサイチュー生成バリアを含むインサイチュー生成分離構造を形成し、インサイチュー生成バリアは、微小物体が第１のサブチャネルから第２のサブチャネルに及びその逆に移動することを阻止する、活性化することを含み得る。
他の実施形態では、マイクロ流体デバイスは、第１の複数の隔離ペンを超える流体媒体の第１のサブフローを提供するように構成される第１のサブチャネルと、第２の複数のペンを超える流体媒体の第２のサブフローを提供するように構成される第２のサブチャネルとにマイクロ流体チャネルを分割するバリアを更に含み得、バリアは、第１の複数の隔離ペンの最初の隔離ペンの第１のサブチャネルの基端開口部及び第２の複数の隔離ペンの最初のペンの第２のサブチャネルへの基端開口部への基端開口部と位置合わせされた少なくとも１つのギャップで中断され、更に、重合化を活性化するステップは、少なくとも１つのギャップにおいて重合化を活性化して、少なくとも１つのギャップに少なくとも１つのインサイチュー生成バリアを形成し、それにより微小物体が第１のサブチャネルから第２のサブチャネルに及びその逆に移動することを阻止することを含み得る。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスが、少なくとも１つのギャップで中断されたバリアを含む場合、第１の複数の隔離ペン内の各クローン集団の少なくとも１つの細胞を移すステップは、少なくとも１つの細胞を、少なくとも１つのギャップを通して第２の複数のペンの各隔離ペンに移すことを含む。幾つかの実施形態では、バリアは複数のギャップを有する。各ギャップは、第１の複数の隔離ペンの各隔離ペンの基端開口部（マイクロ流体チャネルへの）からわたり位置合わせし得、且つ任意選択的に、マイクロ流体チャネルへの第２の複数の隔離ペンの各隔離ペンの基端開口部とも位置合わせし得る。固化を活性化するステップは、複数のギャップの１つ又は複数を閉じる１つ又は複数のインサイチュー生成バリアを形成することを含むことができる。方法の様々な実施形態では、方法は、第２の流体媒体を第２のサブチャネルに導入するステップを更に含み得る。方法は、インサイチュー生成バリアに沿って、第１のサブチャネル内の第１の流体媒体及び第２のサブチャネル内の第２の流体媒体をデバイスのそれぞれの第１及び第２の出力に流すステップを更に含み得る。幾つかの実施形態では、分離するステップは、第１の媒体が第２のサブチャネル内の第２の媒体と混合することを阻止することを更に含み得る。更なる実施形態では、分離するステップは、第２の流体媒体において各クローン集団の第１の生物学的微小物体のそれぞれを成長させることであって、それにより、第２の複数の隔離ペン内の第１の生物学的微小物体は、第１の複数の隔離ペン内の各クローン集団とは別様に成長する、成長させることを更に含み得る。方法は、第２の複数の隔離ペンのそれぞれ内の第１の生物学的微小物体のそれぞれを増殖させ、それにより生物学的微小物体の新しいクローン集団を提供するステップを更に含み得る。様々な実施形態では、流動性ポリマーの固化を活性化するステップは、複数のインサイチュー生成バリアモジュールを有するバリアを形成することを更に含み得、複数のモジュールのそれぞれは、少なくとも１つの微小物体がバリアを透過することを阻止する距離で互いから離間される。流動性ポリマーの固化を活性するステップは、複数のインサイチュー生成バリアモジュールを互いから離間することであって、それにより複数の微小物体の微小物体の少なくとも１つのサブセットがバリアを透過することを阻止するインサイチュー生成バリアを形成する、離間することを更に含み得る。インサイチュー生成バリアは、マイクロ流体チャネルに沿った長さを有する。幾つかの実施形態では、流動性ポリマーの固化を活性化するステップは、インサイチュー生成バリアの長さの少なくとも４０％の長さを有する複数のインサイチュー生成モジュールの第１のモジュールを形成することを更に含み得る。図１５は非限定的な一例を示す。他の実施形態では、流動性ポリマーの固化を活性化するステップは、バリアの長さの２０％以下の長さを有する複数のインサイチュー生成バリアモジュールの残りのそれぞれを形成することを更に含み得る。インサイチュー生成バリアは、第１の上流端部（例えば、流体流入口に近い）及び第２の下流端部（例えば、流体流出口に近い）並びにそれらの間の長さを有し得る。幾つかの実施形態では、流動性ポリマーの固化を活性化するステップは、バリアを形成することを更に含み得、インサイチュー生成バリアは、第１の端部において第１又は第２の流体媒体のフローを透過せず、インサイチュー生成バリアの長さの少なくとも４０％であるポイントにおいて、第１又は第２の流体媒体のフローの少なくとも一部を透過し得る。
方法の様々な実施形態では、方法は、インサイチュー生成バリアの寸法を低減又はインサイチュー生成バリアを除去するステップを更に含み得る。幾つかの実施形態では、インサイチュー生成バリアが複数のモジュールを含む場合、インサイチュー生成バリアは、複数のバリアモジュールの少なくとも一部を除去することにより縮小し得る。インサイチュー生成バリアモジュールのより少数又はより多数のモジュールを除去して、バリアを縮小し得る。方法の様々な実施形態では、方法は、第１の流体媒体と第２の流体媒体との混合の程度に応じて、異なる組成の流体媒体内で各クローン集団の第１の生物学的微小物体のそれぞれを成長させるステップを更に含み得る。
方法の任意の実施形態において、方法は、分離された微小物体を処理するステップを含み得る。代替的には、方法は、マイクロ流体デバイス内の別の微小物体は分離される一方、分離されなかった微小物体を処理するステップを含み得る。
別の態様では、マイクロ流体デバイスにおいて微小物体を分離する方法が提供され、この方法は、基板、チャネルを含むフロー領域、及び複数の隔離ペンを有するエンクロージャを含むマイクロ流体デバイスを提供するステップと、複数の微小物体を含む流体媒体をマイクロ流体デバイスのチャネルに配置するステップであって、流体媒体は、流動性ポリマーを含む、ステップと、複数の微小物体の選択された微小物体を複数の隔離ペンの少なくとも一部に配置し、それにより少なくとも１つの微小物体をそれぞれ含む複数の移入済み隔離ペンを形成するステップと、複数の移入済み隔離ペンの少なくとも１つを選択するステップと、接続領域内、分離領域内、又は少なくとも１つの選択された隔離ペンの接続領域の基端開口部内の選択されたポイントにおいて、流動性ポリマーの重合化を開始するステップであって、流動性ポリマーの重合化ポリマーは少なくとも部分的なインサイチュー生成バリアを生成する、ステップと、少なくとも１つの微小物体が少なくとも１つの選択された隔離ペンから出ることを阻止するステップとを含む。図４及び図５はこの方法の非限定的な例である。複数の隔離ペンのそれぞれは、分離領域及び接続領域を含み得、接続領域は、チャネルへの基端開口部及び分離領域への先端開口部を有する。幾つかの実施形態では、流動性ポリマーの重合化は、固化ポリマー網目構造を形成する。様々な実施形態では、方法は、１つ又は複数の選択されていない移入済み隔離ペンから複数の微小物体の少なくとも１つを除去するステップを更に含み得る。方法は、続けて、少なくとも１つの微小物体を少なくとも１つの選択された隔離ペンから出せるようにするステップを更に含み得る。
方法は、少なくとも１つの微小物体を少なくとも１つの選択された隔離ペンから出せるようにするステップを更に含み得、少なくとも部分的にインサイチュー生成バリアを少なくとも縮小することであって、それにより少なくとも１つの微小物体を解放する、少なくとも縮小することを更に含む。インサイチュー生成バリアを縮小することは、インサイチュー生成バリアのサイズを縮めることを含むことができ、又はより小さいサイズを有する第２の状態にインサイチュー生成バリアをシフトすることを含むことができる。縮小することは、バリアの残りの部分の多孔性を増大させることを含むこともできる。縮小することは、収縮したインサイチュー生成バリアにより、より多くのタイプの微小物体を縮小したインサイチュー生成バリア内外に透過させ得るように、インサイチュー生成バリアのモジュールの一部を除去することを更に含み得る。幾つかの実施形態では、方法は、流体媒体のフローの増大、加水分解剤の導入、タンパク質分解剤の導入、流体媒体の浸透圧の増大／低減、少なくとも部分的なバリアの温度の変更、又はインサイチュー生成バリアの光学的照明により、少なくとも部分的なインサイチュー生成バリアを縮小又は除去し、それにより少なくとも１つの微小物体を分離から解放するステップを更に含み得る。温度を変更するステップは、バリアに隣接するか又はバリアの下にある基板上の熱パッドを光学的に照明することを更に含み得る。幾つかの実施形態では、インサイチュー生成バリアを形成するステップは、実質的に完全なインサイチュー生成バリアを形成することを更に含み得る。様々な実施形態では、実質的に完全なインサイチュー生成バリアは、少なくとも１つの隔離ペンのチャネルへの基端開口部に形成し得る。形成するステップは、２つ以上の隔離ペンの基端開口部に実質的に完全なインサイチュー生成バリアを形成することを更に含み得る。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスのエンクロージャは、複数の連続した隔離ペンを更に含み得る。様々な実施形態では、実質的に完全なインサイチュー生成バリアは、チャネル内の流体媒体のフローの増大により除去し得る。
微小物体を含み得る流体フローの方向付け
別の態様では、マイクロ流体デバイス内で流体フローを方向付ける方法が提供され、この方法は、基板と、少なくとも第１のフロー領域及び第２のフロー領域に分かれる、流体媒体を含むように構成されるフロー領域とを有するエンクロージャを含むマイクロ流体デバイスを提供するステップと、第１のフロー領域への流体フローを遮断するインサイチュー生成バリアをインサイチューで生成するステップと、流体媒体をフロー領域に導入するステップと、インサイチュー生成バリアが第２のフロー領域を通るように流体媒体のフローを向けるように、流体媒体をエンクロージャに通して流すステップとを含む。様々な実施形態では、流体媒体は少なくとも１つの微小物体を含み得る。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの微小物体は、第２のフロー領域に向けられ得る。図１３Ａ〜図１３Ｃはこの方法の非限定的な一例を示す。
方法の様々な実施形態において、方法は、少なくとも１つの微小物体を第２のフロー領域内に配置された隔離ペン内に配置するステップを更に含み得る。隔離ペンは、分離領域及び接続領域を含み得、接続領域は、第２のフロー領域への基端開口部及び分離領域への先端開口部を有する。少なくとも第１の微小物体は、隔離ペンの分離領域内に配置し得る。
方法の様々な実施形態では、方法は、インサイチュー生成バリアを除去して、第１のフロー領域を実質的に遮断解除するステップを更に含み得る。フロー領域の第１の部分を実質的に遮断解除するステップは、微小物体を含む流体媒体を第１のフロー領域に流すことを更に含み得る。幾つかの実施形態では、インサイチュー生成バリアの少なくとも一部は、フロー領域でのフローの増大、加水分解、タンパク質分解、浸透圧変更、バリアの温度変更、又は光学照明の適用により除去可能であり得る。
方法の様々な実施形態では、方法は、第２のフロー領域を遮断するように構成される第２のインサイチュー生成バリアを導入するステップを更に含み得る。
幾つかの実施形態では、方法は、少なくとも１つの微小物体を第１のフロー領域に導入するステップを更に含み得る。方法は、フロー領域に流体媒体を流し、それにより少なくとも１つの微小物体を第１のフロー領域に向けるステップを更に含み得る。幾つかの実施形態では、向けるステップは、少なくとも１つの微小物体を第１のフロー領域内に配置される隔離ペン内に配置することを更に含み得る。隔離ペンは、分離領域及び接続領域を含み得、接続領域は、フロー領域への基端開口部及び分離領域への先端開口部を有し、更に、少なくとも１つの微小物体は、隔離ペンの分離領域内に配置される。方法の様々な実施形態では、方法は、第２のインサイチュー生成バリアを除去するステップを更に含み得る。
方法の様々な実施形態では、方法は、少なくとも１つの微小物体を処理するステップを更に含み得る。更なる処理するステップは、少なくとも１つの微小物体のアッセイ、ソート、透過化、形質転換、又は搬出を含み得る。
様々な実施形態では、生成するステップは、流体媒体に存在する流動性ポリマーの固化を開始することを含み得る。
方法の様々な実施形態では、少なくとも第１の微小物体及び／又は少なくとも第２の微小物体は生物学的微小物体であり得る。
生体細胞の濃縮を含み得る微小物体の濃縮
別の態様では、マイクロ流体デバイスにおいて微小物体を濃縮する方法を提供し得、この方法は、基板及び流体媒体を含むように構成されるフロー領域を有するエンクロージャを含むマイクロ流体デバイスを提供するステップと、フロー領域の第１のセクタにインサイチュー生成分離構造を導入するステップであって、インサイチュー生成分離構造は、流体媒体を、インサイチュー生成分離構造を通して流すが、流体媒体中の少なくとも１つの微小物体が分離構造を透過することを阻止するように構成される、ステップと、第１の容量の流体媒体中の第１の複数の微小物体をフロー領域の第１のセクタに導入するステップと、フロー領域の第１のセクタにおいて、第１の複数の微小物体の少なくとも第１のサブセットを濃縮するステップとを含む。図６、図７、図８Ａ、図８Ｂ、図９Ａ〜図９Ｄ、図１０Ａ〜図１０Ｃは、方法の幾つかの実施形態を示す。様々な実施形態では、第１の容量の流体媒体は、フロー領域の第１のセクタの容量よりも大きい容量であり得る。
幾つかの実施形態では、インサイチュー生成分離構造は、第１の複数の微小物体の第１のサブセットを透過させず、第１の複数の微小物体の第２のサブセットを透過させ得る。幾つかの実施形態では、第１のセクタにおいて第１の複数の微小物体の少なくとも第１のサブセットを濃縮するステップは、第１の複数の微小物体の微小物体の第１のサブセットから微小物体の第２のサブセットをソートすることを更に含み得る。
方法の様々な実施形態では、方法は、第１のセクタ内に配置された少なくとも１つの隔離ペン内において、第１の複数の微小物体の少なくとも第１のサブセットを配置するステップを更に含み得る。各隔離ペンは、分離領域及び接続領域を含み得、接続領域は、フロー領域への基端開口部及び分離領域への先端開口部を有する。
方法の様々な実施形態では、方法は、第２の複数の微小物体をフロー領域に導入し、第２の容量の流体媒体をフロー領域の第１のセクタに通して流すステップと、フロー領域の第１のセクタにおいて、第１の複数のうちの少なくとも第１のサブセットと共に第２の複数の微小物体の少なくとも第１のサブセットを濃縮するステップを更に含み得る。方法は、第１の複数の微小物体の少なくとも第１のサブセット及び第２の複数の微小物体の少なくとも第１のサブセットを第１のセクタ内に配置された少なくとも１つの隔離ペン内に配置するステップを更に含み得る。
方法の様々な実施形態では、方法は、第２の容量の流体媒体で第２の複数の微小物体をフロー領域の第１のセクタに導入し、それにより微小物体の第１のサブセットを第２の複数の微小物体の微小物体の第２のサブセットからソートするステップと、基板の第１のセクタにおいて、第１の複数の微小物体の少なくとも第１のサブセット及び第２の複数の微小物体の少なくとも第１のサブセットを濃縮するステップとを更に含み得る。
幾つかの実施形態では、方法は、第１の複数の微小物体の少なくとも第１のサブセット及び第２の複数の微小物体の第１のサブセットを第１のセクタ内に配置された少なくとも１つの隔離ペンに配置するステップを更に含み得、各隔離ペンは、分離領域及び接続領域を含み、接続領域は、フロー領域への基端開口部及び分離領域への先端開口部を有する。
方法の様々な実施形態では、方法は、分離構造の少なくとも一部を除去又は縮小し、それにより微小物体を含むある容量の流体媒体にフロー領域の少なくとも第２のセクタを透過させるステップを更に含み得る。方法の様々な実施形態では、方法は、第２のインサイチュー生成分離構造をフロー領域の第２のセクタに導入するステップを更に含み得る。方法の幾つかの実施形態では、方法は、第２の複数の微小物体を第２の容量の流体媒体でフロー領域の第１のセクタに導入するステップと、フロー領域の第２のセクタにおいて、複数の微小物体の少なくとも第１のサブセットを濃縮するステップとを更に含み得る。方法は、第２の複数の微小物体の少なくとも第１のサブセットをフロー領域の第２のセクタ内に配置された少なくとも１つの隔離ペン内に配置するステップを更に含み得る。方法は、第２の分離構造の少なくとも一部を除去又は縮小し、それにより制限のないフローにフロー領域全体を透過させるステップを更に含み得る。
方法の様々な実施形態では、インサイチュー生成分離構造は、選択された微小物体を包含する完全包囲ペン、微小物体の通過を許容するのに十分に大きい、周縁の一部におけるペン開口部、分離領域及び接続領域を含み、接続領域はフロー領域への基端開口部及び分離領域又はバリアへの先端開口部を有する隔離ペンであり得る。幾つかの実施形態では、インサイチュー生成バリアは、複数のインサイチュー生成バリアモジュールを含み得、各モジュールは、２つのインサイチュー生成モジュール間の開口部が、選択された微小物体のサイズよりも小さくなるように、複数のバリアモジュールの残りから離間される。微小物体は、約１ミクロン〜約２０ミクロンの直径を有し得る。
幾つかの実施形態では、インサイチュー生成分離構造は、インサイチュー生成バリア内にあり得、隔離ペンの分離領域又は接続領域内に実質的に配置し得る。他の実施形態では、インサイチュー生成分離構造は、インサイチュー生成バリア内にあり得、フロー領域内に実質的に配置し得る。
様々な実施形態では、第１の複数の微小物体は生物学的微小物体を含み得る。幾つかの実施形態では、第１の複数の微小物体の第１のサブセット及び第２のサブセットは、異なるタイプの微小物体を含み得る。様々な実施形態では、第２の複数の微小物体は、生物学的微小物体を含み得る。両方の複数の微小物体が生物学的微小物体である場合、第２の複数の微小物体の第１のサブセット及び第２のサブセットは、異なるタイプの微小物体を含み得る。
クローン集団の細胞のアッセイ
別の態様では、マイクロ流体デバイスにおいてクローン集団の細胞をアッセイする方法が提供され、この方法は、複数の細胞を含む第１の流体媒体をマイクロ流体デバイスのエンクロージャに導入するステップであって、エンクロージャは、基板と、流体媒体を含むように構成されるマイクロ流体チャネルを含むフロー領域と、各隔離ペンがマイクロ流体チャネルの第１の側において開くように互いに隣接して配置される第１の複数の隔離ペンと、各隔離ペンがマイクロ流体チャネルの第２の逆の側において開くように互いに隣接して配置される第２の複数の隔離ペンとを含む、ステップと、第１の流体媒体及び複数の細胞をマイクロ流体デバイスのチャネルに流すステップと、細胞のクローン集団を第１の複数の隔離ペンの各隔離ペンに導入するステップと、第１の複数の隔離ペン内の細胞のクローン集団ごとに、少なくとも１つの細胞を第２の複数の隔離ペンのそれぞれの隔離ペンに移すステップと、流動性ポリマーをチャネルに導入するステップと、マイクロ流体チャネルの長さに沿って流動性ポリマーの固化を活性化し、それにより第１の複数の隔離ペンを超えた流体媒体の第１のサブフローを提供するように構成される第１のサブチャネルと、第２の複数の隔離ペンを超えた流体媒体の第２のサブフローを提供するように構成される第２のサブチャネルとにマイクロ流体チャネルを分割するインサイチュー生成バリアを形成するステップであって、インサイチュー生成バリアは、細胞が第１のサブチャネルから第２のサブチャネルに及びその逆に移動することを阻止する、ステップと、第２の流体媒体を第２のサブチャネルに流すステップであって、第２の流体媒体は、第２の複数の隔離ペン内の細胞をアッセイする試薬を含む、ステップと、第２の複数の各隔離ペン内の細胞をアッセイするステップとを含む。図１４Ａ〜図１４Ｃは一実施形態を示す。様々な実施形態では、インサイチュー生成バリアは、チャネルの第１の端部からマイクロ流体チャネルの第２の端部までの長さを有し得る。第１の複数の隔離ペン及び第２の複数の隔離ペンの各隔離ペンは、マイクロ流体チャネルの各側への基端開口部を有し得る。
様々な実施形態では、流動性ポリマーは、複数の細胞を第１の複数の隔離ペンに導入するステップの前又は後に導入し得る。
幾つかの実施形態では、クローン集団を導入するステップは、単一の細胞を第１の複数の隔離ペンのそれぞれに導入することを含み得、且つその単一の細胞を増殖して細胞のクローン集団にすることを更に含み得る。
方法の様々な実施形態では、方法は、流体媒体を第１のサブチャネル及び第２のサブチャネルにおいてマイクロ流体デバイスのそれぞれの第１及び第２の出力に流すことを更に含み得る。第１のサブチャネルにおける流体媒体は、第２のサブチャネルにおける流体媒体と異なり得る。幾つかの実施形態では、インサイチュー生成バリアは、第１のサブチャネルにおける流体媒体の第１のサブフローが第２のサブチャネルにおける流体媒体の第２のサブフローと混合することを阻止し得る。
幾つかの実施形態では、アッセイするステップは、遺伝子型判定のために第２の複数の隔離ペン内の細胞を準備することを含み得る。幾つかの他の実施形態では、アッセイするステップは、第２の複数の各隔離ペン内の細胞及び／又は第１の複数の各隔離ペン内のクローン集団による生物学的産物の生成レベルを特定することを含み得る。
幾つかの実施形態では、アッセイのための試薬は、化学試薬、生物学的試薬、フィーダ細胞、刺激細胞、レポーター細胞、レポーター分子、及びビーズを含む群の１つ又は複数を含み得る。ビーズは、化学試薬、生物学的試薬、刺激試薬、又はレポーター分子を含み得る。
様々な実施形態では、アッセイするステップは、第２の複数の隔離ペンにおける細胞の少なくとも１つの細胞を識別することを更に含み、少なくとも１つの細胞は、選択された特性を含む。方法は、第２の複数の隔離ペンにおける細胞の少なくとも１つの細胞を搬出するステップを更に含み得、少なくとも１つの細胞は、選択された特性を含む。様々な実施形態では、方法は、第１の複数の隔離ペンの各ペンから、クローン集団のそれぞれを搬出するステップを更に含み得る。他の実施形態では、方法は、選択された特性を含まない、第２の複数の隔離ペンにおける細胞及び／又は第１の複数の隔離ペンにおける細胞のクローン集団を搬出するステップを更に含み得る。
方法の様々な実施形態では、方法は、細胞を搬出する前にインサイチュー生成バリアを除去するステップを更に含み得る。
様々な実施形態では、マイクロ流体チャネルの長さに沿って流動性ポリマーの固化を活性化するステップは、マイクロ流体チャネルの第１の端部からマイクロ流体チャネルの第２の端部に延在するバリアのギャップにおいて、流動性ポリマーの固化を活性化することを含み、バリアは、マイクロ流体チャネルを第１のサブチャネル及び第２のサブチャネルに分け、ギャップは、第１の複数の隔離ペンの各ペンの基端開口部及び第２の複数の隔離ペンのそれぞれのペンの基端開口部と位置合わせされ、それにより細胞が第１のサブチャネルから第２のサブチャネルに及びその逆に移動することを阻止するインサイチュー生成バリアを形成する。バリアは、第１の複数の隔離ペンの１つのペンの基端開口部及び第２の複数の隔離ペンのそれぞれのペンの基端開口部と位置合わせされた少なくとも１つのギャップを有し得る。幾つかの実施形態では、バリアは複数のギャップを有する。各ギャップは、第１の複数の隔離ペンの各隔離ペンの基端開口部（マイクロ流体チャネルへの）からわたり位置合わせされ得、且つ任意選択的に、マイクロ流体チャネルへの第２の複数の隔離ペンの各隔離ペンの基端開口部とも位置合わせされ得る。
細胞株の進化
別の態様では、マイクロ流体デバイスにおける細胞株進化の方法が提供され、この方法は、マイクロ流体デバイスを提供するステップであって、デバイスは、基板と、流体媒体を含むように構成されるチャネルを含むフロー領域と、各隔離ペンがマイクロ流体チャネルの第１の側において開くように互いに隣接して配置される第１の複数の隔離ペンと、各隔離ペンがマイクロ流体チャネルの第２の逆の側において開くように互いに隣接して配置される第２の複数の隔離ペンとを含むエンクロージャを含む、ステップと、第１の流体媒体をマイクロ流体デバイスのチャネルに導入するステップと、クローン集団の１つ又は複数の細胞を第１の複数の隔離ペンのそれぞれに導入するステップと、クローン集団の１つ又は複数の細胞を第２の複数の隔離ペンのそれぞれに導入するステップと、流動性ポリマーをチャネルに導入するステップと、マイクロ流体チャネルの長さに沿って流動性ポリマーの固化を活性化し、それにより第１の複数の隔離ペンを超えた流体媒体の第１のサブフローを提供するように構成される第１のサブチャネルと、第２の複数の隔離ペンを超えた流体媒体の第２のサブフローを提供するように構成される第２のサブチャネルとにマイクロ流体チャネルを分割するインサイチュー生成バリアを形成するステップであって、インサイチュー生成バリアは、細胞が第１のサブチャネルから第２のサブチャネルに及びその逆に移動することを阻止する、ステップと、第２の流体媒体をチャネルの第２の側に導入するステップと、第２の流体媒体の存在下において、第２の複数の隔離ペンの各隔離ペンにおいて１つ又は複数の細胞のそれぞれを成長させるステップとを含む。流動性ポリマーを導入するステップは、細胞の導入前又は後に実行し得る。
幾つかの実施形態では、第２の流体媒体は、第１の流体媒体の化学的又は生物学的成分と異なる化学的又は生物学的成分を含み得る。第２の流体媒体の化学的又は生物学的成分は、第２の複数の隔離ペンのそれぞれにおけるクローン集団の１つ又は複数の細胞の成長に選択的圧力をかけ得る。
方法の様々な実施形態では、方法は、チャネルの第１の側における第１の流体媒体及びチャネルの第２の側における第２の流体媒体をインサイチュー生成バリアに沿ってデバイスのそれぞれの第１及び第２の出力に流すステップを更に含み得る。幾つかの実施形態では、分離するステップは、第１の媒体がチャネルの第２の側における第２の媒体と混合することを阻止することを更に含み得る。
方法の様々な実施形態では、方法は、第２の複数の隔離ペンのそれぞれにおける１つの細胞のそれぞれを増殖させ、それにより第２の複数の隔離ペンの各隔離ペンにおいて新しいクローン集団を提供するステップを更に含み得る。
幾つかの実施形態では、インサイチュー生成バリアを形成するステップは、複数のインサイチュー生成バリアモジュールを有するインサイチュー生成バリアを形成することを更に含み得、複数のインサイチュー生成モジュールは、それぞれ少なくとも１つの微小物体がバリアを透過することを阻止する距離で互いから離間される。幾つかの実施形態では、インサイチュー生成バリアの透過を阻止される微小物体は、１〜２０ミクロンの直径を有し得る。他の実施形態では、インサイチュー生成バリアを形成するステップは、複数のインサイチュー生成バリアモジュールを互いから離間し、それにより複数の微小物体の微小物体の少なくとも１つサブセットがインサイチュー生成バリアを透過することを阻止することを更に含み得る。幾つかの実施形態では、パターン化するステップは、インサイチュー生成バリアの長さの少なくとも４０％の長さを有する複数のインサイチュー生成モジュールの第１のモジュールを形成することを更に含み得、インサイチュー生成バリアは、チャネルの長さに沿った長さを有し得る。インサイチュー生成バリアは、第１の端部及び第２の端部を更に有する。インサイチュー生成バリアの第１の端部は、第１の流体流入口及び／又は第２の流体流入口の近くにあり得る。幾つかの実施形態では、インサイチュー生成バリアを形成するステップは、インサイチュー生成バリアの長さの２０％以下の長さを有する複数のインサイチュー生成バリアモジュールの残りのそれぞれを形成することを更に含む。更に他の実施形態では、インサイチュー生成バリアを形成するステップは、インサイチュー生成バリアを形成することを更に含み得、インサイチュー生成バリアは、第１の端部において第１又は第２の流体媒体のフローを透過せず、インサイチュー生成バリアの長さの少なくとも４０％であるポイントにおいて、第１又は第２の流体媒体のフローを透過する。
方法の様々な実施形態では、方法は、フロー領域における増大した流体フロー、加水分解、タンパク質分解、浸透圧変更、インサイチュー生成バリアの温度変更、又は光学照明の適用により、インサイチュー生成バリアの少なくとも一部を縮小するステップを更に含み得る。インサイチュー生成バリアの少なくとも一部は、バリアのサイズを低減することにより縮小し得る。様々な実施形態では、インサイチュー生成バリアが複数のインサイチュー生成モジュールを含む場合、インサイチュー生成バリアは、複数のインサイチュー生成バリアモジュールの少なくとも一部を除去することにより少なくとも縮小し得る。複数のインサイチュー生成バリアモジュールの少なくとも一部を除去することは、複数のインサイチュー生成バリアモジュールの１つ又は任意の数のモジュールを除去することを含み得る。
方法の様々な実施形態では、方法は、マイクロ流体チャネルに沿った位置に応じた程度で第１の流体媒体と第２の流体媒体とを混合し、それにより第１の流体媒体及び第２の流体媒体のそれぞれの複数の異なる組成物を形成することを更に含み得る。幾つかの実施形態では、方法は、マイクロ流体チャネルに沿った１つ又は複数の細胞の位置に応じて異なる組成の流体媒体の存在下において、第１の複数の隔離ペン及び第２の複数の隔離ペンのそれぞれにおいて１つ又は複数の細胞のそれぞれを成長させるステップを更に含み得る。
方法の様々な実施形態では、方法は、第２の複数の隔離ペンの各隔離ペンにおいて１つ又は複数の細胞をアッセイするステップを更に含み得る。方法の様々な実施形態では、方法は、第２の複数の隔離ペンの各隔離ペンにおいて新しいクローン集団をアッセイするステップを更に含み得る。
アッセイするステップは、第３の流体媒体をチャネルの第２の側に流すことを更に含み得、第３の流体媒体は、第２の複数の隔離ペンの各ペンにおいて１つ又は複数の細胞をアッセイするための試薬を含む。アッセイするための試薬は、化学試薬、生物学的試薬、フィーダ細胞、刺激細胞、レポーター細胞、レポーター分子、及びビーズの１つ又は複数を含み得る。ビーズは、化学試薬、生物学的試薬、刺激試薬、又はレポーター分子を含み得る。
様々な実施形態では、アッセイするステップは、第２の複数の隔離ペンにおいて、選択された特性を有する少なくとも１つの細胞を識別することを更に含み得る。他の実施形態では、アッセイするステップは、選択された特性を有する少なくとも１つの新しいクローン集団を識別することと、そうして識別された新しいクローン集団を搬出することとを更に含み得る。
方法の様々な実施形態では、方法は、選択された特性を有する少なくとも１つの細胞をマイクロ流体デバイスから搬出するステップを更に含み得る。方法は、第１の複数の隔離ペンのペンからマイクロ流体デバイスにクローン集団を搬出することを更に含み得る。方法は、第２の複数の隔離ペンにおいて選択された特性を有さない細胞をマイクロ流体デバイスから搬出するステップを更に含み得る。方法の様々な実施形態では、方法は、細胞を搬出する前にインサイチュー生成バリアを除去するステップを更に含み得る。
プロトタイピング
別の態様では、高速マイクロ流体デバイスプロトタイピングの方法が提供され、この方法は、マイクロ流体デバイスを提供するステップであって、デバイスは、基板及びフロー領域を含むエンクロージャを含む、ステップと、第１の流体媒体をマイクロ流体デバイスのエンクロージャに導入するステップと、流動性ポリマーをエンクロージャに導入するステップと、エンクロージャの少なくとも１つのエリアを選択するステップと、活性化のパターンによりインサイチュー生成テスト構造が形成されるように、選択された各エリアにおいてポリマーの固化を活性化するステップと、マイクロ流体デバイスにおける微小物体の操作での使用について、インサイチュー生成テスト構造をテストするステップとを含む。幾つかの実施形態では、テスト構造がテストに合格しない場合、テスト構造を除去し得る。幾つかの実施形態では、テスト構造の少なくとも一部は、フロー領域でのフローの増大、加水分解、タンパク質分解、浸透圧変更、テスト構造への温度変更、又は光学照明の適用により除去可能であり得る。幾つかの実施形態では、テスト構造の少なくとも一部が温度変更により除去可能である場合、温度変更は、インサイチュー生成テスト構造の下にある基板上の熱パッドを光学的に照明することにより実行し得る。方法の様々な実施形態では、方法は、テストするステップの結果に基づいて調整された特性を有する第２のインサイチュー生成テスト構造をパターン化するステップを更に含み得る。
全ての方法について、本明細書に記載される任意の方法の様々な実施形態において、流動性ポリマーは、合成ポリマー、修飾合成ポリマー、又は生体ポリマーを含み得る。生体ポリマーは、光又は温度活性化可能であり得る。合成ポリマー修飾は、サイズ変更モチーフ、切断モチーフ、反応末端モチーフ、及び／又は細胞認識モチーフを任意の組合せで含み得る。様々な実施形態では、ポリマーは、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、修飾ポリ乳酸、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、修飾ポリグリコール酸、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、修飾ポリアクリルアミド、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡｍ）、修飾ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、修飾ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、修飾ポリアクリル酸、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、修飾ポリカプロラクトン、フィブロネクチン、修飾フィブロネクチン、コラーゲン、修飾コラーゲン、ラミニン、修飾ラミニン、ポリサッカリド、修飾ポリサッカリド、又は任意の組合わせのコポリマーの少なくとも１つを含み得る。他の実施形態では、ポリマーは、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、修飾ポリ乳酸、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、修飾ポリグリコール酸、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、修飾ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、修飾ポリアクリル酸、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、修飾ポリカプロラクトン、フィブロネクチン、修飾フィブロネクチン、コラーゲン、修飾コラーゲン、ラミニン、修飾ラミニン、ポリサッカリド、修飾ポリサッカリド、又は任意の組合わせのコポリマーの少なくとも１つを含み得る。幾つかの実施形態では、流動性ポリマーは、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、修飾ポリ乳酸、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、修飾ポリグリコール酸、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、修飾ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、修飾ポリアクリル酸、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、修飾ポリカプロラクトン、フィブロネクチン、修飾フィブロネクチン、コラーゲン、修飾コラーゲン、ラミニン、修飾ラミニン、ポリサッカリド、修飾ポリサッカリド、又は任意の組合わせのコポリマーの少なくとも１つを含み得る。
全ての方法について、本明細書に記載される任意の方法の様々な実施形態において、流動性ポリマーは修飾ポリエチレングリコールポリマーを含み得る。他の実施形態では、修飾ポリエチレングリコールポリマーは星型ポリマーを含み得る。幾つかの実施形態では、修飾ポリエチレングリコールポリマーはジアクリレート部分を含み得る。様々な実施形態では、修飾ポリエチレングリコールポリマーは光切断可能部分を含み得る。
全ての方法について、本明細書に記載される任意の方法の様々な実施形態において、流動性ポリマーの固化を活性化するステップは、基板の選択されたエリアを光学的に照明し、それによりポリマーを重合化することを含み得る。流動性ポリマーの重合化により、固化ポリマー網目構造を形成し得る。流動性ポリマーの固化を活性化するステップは、光活性化可能重合化開始剤を導入することを更に含み得る。
全ての方法について、本明細書に記載される任意の方法の様々な実施形態において、流動性ポリマーの固化を活性化するステップは、基板の選択されたエリアにおいて温度を変更し、それによりポリマーをゲル化することを含み得る。流動性ポリマーのゲル化により、固化ポリマー網目構造を形成し得る。基板の選択されたエリアにおいて温度を変更するステップは、基板上の熱パッドを光学的に照明することを更に含み得る。
全ての方法について、本明細書に記載される任意の方法の様々な実施形態において、インサイチュー生成分離構造／分離モジュール／バリア／バリアモジュールの少なくとも一部は、フロー領域を通る流体媒体のフローの増大、加水分解剤のフロー領域への導入、タンパク質分解剤のフロー領域への導入、フロー領域内の浸透圧を増大／低減する流体媒体のフロー領域への導入、インサイチュー生成分離構造の温度の変更、又は分離構造の光学的照明により除去可能であり得る。幾つかの実施形態では、インサイチュー生成分離構造／分離モジュール／バリア／バリアモジュールの少なくとも一部が温度変更により除去可能である場合、温度は、バリアの下にある基板上の熱パッドを光学的に照明することにより変更し得る。
全ての方法について、本明細書に記載される任意の方法の様々な実施形態において、基板は、エンクロージャ内の流体媒体中の微小物体に対して誘電泳動（ＤＥＰ）力を生成するように構成され得る。ＤＥＰ力を生成するように構成される基板は、光学的に作動し得る。方法の様々な実施形態では、基板は、エンクロージャ内の液滴に対してエレクトロウェッティング力を生成するように構成され得る。エレクトロウェッティング力は光学的に作動し得る。
全ての方法について、様々な実施形態において、マイクロ流体デバイスのエンクロージャの少なくとも１つの内面は、調整面を含み得る。少なくとも１つの内面は、基板の表面を含み得る。幾つかの実施形態では、エンクロージャの略全ての内面は、調整面を含み得る。調整面は共有結合的に修飾された表面であり得る。幾つかの実施形態では、共有結合的に修飾された表面は親水性であり得る。方法の幾つかの実施形態では、方法は、エンクロージャの少なくとも１つの内面に調整面を提供するステップを更に含み得る。調整面を提供するステップは、いかなる微小物体、生体細胞、又は流動性ポリマーも導入する前に実行し得る。
キット．更に別の実施形態において、マイクロ流体デバイス内で微小物体を分離するキットが提供され、このキットは、基板及びエンクロージャ内に配置されたフロー領域を含むエンクロージャを含むマイクロ流体デバイスと、流動性ポリマー溶液とを含み、ポリマーは、重合化及び／又は熱的誘導ゲル化が可能である。マイクロ流体デバイスは、本明細書に記載される任意のマイクロ流体デバイスであり得、特徴、構成要素、及び寸法の任意の組合せを有し得る。キットは、光活性化可能な重合化開始剤を更に含み得る。
別の態様では、クローン集団の細胞をアッセイするキットが提供され、このキットは、基板、エンクロージャ内に配置されるチャネルを含むフロー領域、チャネルの第１の側において互いに隣接して配置される第１の複数の隔離ペン、及びチャネルの第２の逆の側において互いに隣接して配置される第２の複数の隔離ペンを有するエンクロージャを有するマイクロ流体デバイスと、流動性ポリマー溶液とを含み、ポリマーは、重合化及び／又は熱的誘導ゲル化が可能である。様々な実施形態では、マイクロ流体デバイスは、チャネルの第１の側をチャネルの第２の側から分離するアリアを更に含み得る。バリアはインサイチュー生成バリアであり得る。様々な実施形態では、バリアは、インサイチュー生成バリアではなく、第１の複数のペンの最初のペンのチャネルへの基端開口部と、第２の複数のペンの最初のペンのチャネルへの基端開口部との間に位置合わせされた少なくとも１つのギャップによって中断し得る。基板、基板、エンクロージャ内に配置されるチャネルを含むフロー領域、チャネルの第１の側において互いに隣接して配置される第１の複数の隔離ペン、及びチャネルの第２の逆の側において互いに隣接して配置される第２の複数の隔離ペンを有するマイクロ流体デバイスを含むキットは、本明細書に記載されるマイクロ流体デバイスの特徴、構成要素、又は寸法の任意の組合せを有し得る。
本明細書に記載される任意のキットの様々な実施形態では、ポリマーは、合成ポリマー、修飾合成ポリマー、又は生体ポリマーを含み得る。生体ポリマーは、光又は温度活性化可能であり得る。合成ポリマー修飾は、サイズ変更モチーフ、切断モチーフ、反応末端モチーフ、及び／又は細胞認識モチーフを任意の組合せで含み得る。様々な実施形態では、ポリマーは、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、修飾ポリ乳酸、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、修飾ポリグリコール酸、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、修飾ポリアクリルアミド、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡｍ）、修飾ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、修飾ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、修飾ポリアクリル酸、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、修飾ポリカプロラクトン、フィブロネクチン、修飾フィブロネクチン、コラーゲン、修飾コラーゲン、ラミニン、修飾ラミニン、ポリサッカリド、修飾ポリサッカリド、又は任意の組合わせのコポリマーの少なくとも１つを含み得る。他の実施形態では、ポリマーは、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、修飾ポリ乳酸、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、修飾ポリグリコール酸、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、修飾ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、修飾ポリアクリル酸、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、修飾ポリカプロラクトン、フィブロネクチン、修飾フィブロネクチン、コラーゲン、修飾コラーゲン、ラミニン、修飾ラミニン、ポリサッカリド、修飾ポリサッカリド、又は任意の組合わせのコポリマーの少なくとも１つを含み得る。幾つかの実施形態では、流動性ポリマーは、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、修飾ポリ乳酸、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、修飾ポリグリコール酸、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、修飾ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、修飾ポリアクリル酸、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、修飾ポリカプロラクトン、フィブロネクチン、修飾フィブロネクチン、コラーゲン、修飾コラーゲン、ラミニン、修飾ラミニン、ポリサッカリド、修飾ポリサッカリド、又は任意の組合わせのコポリマーの少なくとも１つを含み得る。
本明細書に記載される任意のキットの様々な実施形態では、流動性ポリマーは修飾ポリエチレングリコールポリマーを含み得る。他の実施形態では、修飾ポリエチレングリコールポリマーは星型ポリマーを含み得る。幾つかの実施形態では、修飾ポリエチレングリコールポリマーはジアクリレート部分を含み得る。様々な実施形態では、修飾ポリエチレングリコールポリマーは光切断可能部分を含み得る。
本明細書に記載される任意のキットの様々な実施形態では、キットは、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの内面を共有結合的に修飾するように構成される試薬を更に含み得、試薬は、本明細書に記載される任意の共有結合的に修飾された内面を生成し得る。キットの様々な構成要素は、別個の容器に包装し得る。
実験
システム及びマイクロ流体デバイス：システム及びマイクロ流体デバイス：Berkeley Lights, Inc.製。システムは、少なくともフローコントローラ、温度コントローラ、流体媒体調整及びポンプ構成要素、光活性化ＤＥＰ構成用の光源、マイクロ流体デバイス、搭載ステージ、及びカメラを含んだ。隔離ペンは約２×１０７立方ミクロンの容積を有する。
プライミング手順：２５０マイクロリットルの１００％二酸化炭素を３マイクロリットル／秒の流量で流入させた。この後、２５０マイクロリットルのＰＢＳを３マイクロリットル／秒の流量で流入させた。プライミングの最終ステップは、０．１％のPluronic（登録商標）Ｆ２７（Life Technologies（登録商標）カタログ番号Ｐ６８６６）を含む２５０マイクロリットルの培地を３マイクロリットル／秒の流量で流入させた。
例１．幾つかのペンにわたる分離構造の設置
ヒドロゲル準備：ポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）、５ｋＤａ（Laysan Bio、カタログ番号ＡＣＲＬ−ＰＥＧ＿ＡＣＲＬ−５０００−１ｇ）、１０％ｗ／ｖ、及び１．２％ｗ／ｖ IGRACURE（登録商標）２９５９（Ciba（登録商標）、Sigma Aldrichカタログ番号４１０８９６）光開始剤をDulbeccoのリン酸緩衝食塩水中で混合して、プレポリマー溶液を作製した。
培地：ハイブリドーマ−ＳＦＭ（Life Technologies、カタログ番号１２０４５−０７６）；１０％ウシ胎仔血清；１％ペニシリン−ストレプトマイシン（１０００００Ｕ／ｍＬ、Life Technologiesカタログ番号１５１４０−１６３）；１ｍＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸（Life Technologiesカタログ番号10370−088）；２ｍＭ GlutaMAX（Life Technologiesカタログ番号３５０５０−０７９）；１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Life Technologiesカタログ番号１１３６０−０７０）。
上記の一般手順に従ってマイクロ流体デバイスをプライミングした。次に、培地を５分間にわたり流した。細胞をマイクロ流体デバイスに装填し、次に重力を使用して隔離ペン内に導入した。
プレポリマー溶液（６０マイクロリットル）を２マイクロリットル／秒でマイクロ流体デバイスに流入させ、５分間、隔離ペン内に存在する媒体と交換させた。１００マイクロＷを３４０ｎｍ＋／マイナス２０ｎｍにおいて使用して、細胞を含む、選択された隔離ペンの真上のチャネル内の選択された領域（２５ミクロン×６００ミクロン）の光開始重合化を実行し、７．５秒間、幾つかのペンの開口部にわたる分離構造を導入した。光重合化の完了後、培地を１マイクロリットル／秒で１０分間にわたり灌流させて、残留プレポリマーを隔離ペン及びフローチャネルから除去した。図５Ａは、分離構造５２０が導入された領域の明視野像を示す。固化ポリマー網目構造５２０は、この照明下では見えないが、細胞５３０は明らかに分離構造によって分離されたペン内に存在している。
次に、媒体を０．０２マイクロリットル／秒で灌流し続けた状態でマイクロ流体デバイス全体を２日間維持した。培養期間の終了時、明視野照明にＦＩＴＣオーバーレイを使用して、ペン内の細胞の流出を阻止する分離構造を有する隔離ペンを再び可視化し、これは図５Ｂに示されている。この照明状況下で分離構造５２０は明確に見えた。分離構造は、ペン内のいかなる細胞も流出から阻止した。隔離ペン内の細胞５３０は、なおも可視であり、成長し分割する能力を引き続き示した。
例２．マイクロ流体デバイス内の光切断可能なヒドロゲルバリアの導入及び除去
式１の構造を有する光切断可能なＰＥＧジアクリレートを合成した。
Figure 2019502365
Kloxinらの合成プロトコル（Kloxin, A. M.; Tibbitt, M. W.; Anseth, K. S. Synthesis of photodegradable hydrogels as dynamically tunable cell culture platforms. Nat. Protoc. 2010, 5 (12), 1867-1887）を使用して、より厳しく酸素を除外するように変更して式Ｉの化合物を合成した。光切断可能なＰＥＧジアクリレート溶液の準備及び処理は、全ての実験において低光状況下で実行された。全ての手順で反応産物をそのまま使用した。
プレポリマー溶液：７．５％ｗ／ｖのＰＥＧジアクリレートＭｎ７００（Sigma Aldrichカタログ番号４５５００８）、３．５％ｗ／ｖの光分解可能なＰＥＧジアクリレート（式Ｉ）；及び１％ｖ／ｖのＨ−ＮＵ ６０５ ＩＬ光開始剤（Spectra group Ltd）をリン酸緩衝食塩水／脱イオン水（比率１：３）で使用して、プレポリマー溶液を準備した。
バリアの導入：プレポリマー溶液の導入前に、上述したような隔離ペンを有するマイクロ流体デバイスをプライミングした。プレポリマー溶液をフローチャネルから隔離ペン内に流入させ、拡散させた。約４．５ｎＷ／ｃｍ２の電力を用いて、４５８ｎｍ照明（フィルタリングされた４５８可視光）への露出を使用して、精密且つ選択的に配置されたインサイチュー生成バリアの導入を実行した。図２１Ａに示されるように、露出時間を増大させると、選択されたペンの接続領域の部分を遮断し、フローチャネル内に延びる一層密なインサイチュー生成バリアが生成された。図２１Ａの左から右へのインサイチュー生成バリア２１２０〜２１２８は，以下の露出時間を有する。
Figure 2019502365
細胞がペンから出ることを阻止するように十分に形成されたゲルが、１０秒を超える露出の全ての時点で観測された。約６０秒の露出で形成されたゲルは非常に高密度であった。
バリアの除去：マイクロ流体デバイス内で上記のように形成され、４Ｃで一晩貯蔵したバリアを、２分間露出で、３８３ショートパスフィルタが設置されたOmnicure Series 2000ランプからの照明に露出した。図２１Ｂ及び図２１Ｃに示されるように、３０秒露出（例えば、バリア２１２８（コントロール）及び２１２９）を使用して形成されたバリアは、２分間露出（２１２９’’、バリア残留なし）を使用して完全に分解し、一方、コントロールバリア２１２８はなお残った。露出を長くすることにより、一層高密度のバリアが除去可能であった（データ図示せず）。
例３．細胞の存在下での光切断可能なヒドロゲルバリアの導入
細胞。ＯＫＴ３マウス骨髄腫（ＡＴＣＣ（登録商標）、ＣＲＬ−８００１ＴＭ）。
培地。ＩＭＤＭ（LifeTech（商標）、１２４４０−０６１）、２０％ＦＢＳ（Seradigm）、１００００Ｕ／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシン（LifeTech（商標）、１５１４０−１６３）。
細胞ペニング。ＯＫＴ３細胞をプライミングされたマイクロ流体デバイスに導入し、８ミクロン／秒で移動する光学作動誘電泳動力（光電子ツイーザ（ＯＥＴ））、５ボルト印加場を使用して隔離ペン内に配置した。プレポリマー導入の開始までデバイスを３７℃に維持した。マイクロ流体デバイスを培地で３回、洗い流した（３マイクロリットル／秒で２５０マイクロリットル）。
プレポリマー溶液の準備。全ての感光性化合物は低光状況下で準備した。１６０マイクロリットルのプレポリマーヒドロゲル溶液を０．１％Pluronic（登録商標）Ｆ２７（Life Technologies（登録商標）カタログ番号Ｐ６８６６）を含む培地で最終濃度３．７５％ｗ／ｖ Ａｃ星型ＰＥＧ星型固体（Laysan Bioからの４アームＰＥＧアクリラート（１０ｋ ＭＷ）（#4arm-PEG-ACRYL-10k-1g）、１．２５％ｗ／ｖ光分解可能ＰＥＧジアクリレート（式Ｉ、例２において上述したように合成された）；及び１％ｖ／ｖ Ｈ−ＮＵ ６０５ ＩＬ光開始剤（Spectra group Ltd）で準備した。
０．１％Pluronic（登録商標）Ｆ２７（Life Technologies（登録商標）カタログ番号Ｐ６８６６）を含む培地での１％ｖ／ｖでのＨ−ＮＵ ６０５ ＩＬ光開始剤の溶液を完全に可溶化するまでボルテックス及び３５℃で暖めることにより作製した。
選択された細胞の分離のためのインサイチュー生成バリアの導入。低光状況において、プライミングしたマイクロ流体デバイスに１４０マイクロリットルのプレポリマー溶液を０．０５マイクロリットル／秒で装填した。この速度は、マイクロ流体デバイスのペン内へのプレポリマーの拡散を許容した。プレポリマーの装填後、ＵＶ光（Omnicure（登録商標）Series 2000、Lumen Dynamics）への６０秒又は１２０秒の露出を使用して、細胞を含む選択されたペンの上部においてポリマー固化を開始した。
固化が開始された後、０．１％Pluronic（登録商標）Ｆ２７（Life Technologies登録商標カタログ番号Ｐ６８６６）を含む培地を有するリンス剤の組を使用して、室温での３マイクロリットル／秒で１×２５０マイクロリットル、３７℃での３マイクロリットル／秒で３×２５０マイクロリットルを含め、マイクロ流体デバイスのチャネルにおける余分な可溶性ポリマー及び開始剤を除去した。図２２の写真をこの時点で撮影した。
図２２に示されるように、インサイチュー生成分離構造は、細胞膜を妨げずに、特に隔離ペン開口部に選択的に設置された。幾つかの細胞は、分離された隔離ペン内で白い円で強調表示された。
マイクロ流体デバイス、方法、及びキットの幾つかの実施形態の記載
１．マイクロ流体デバイスであって、エンクロージャを含み、エンクロージャは、基板と、エンクロージャ内に配置されるフロー領域と、基板に配置される少なくとも１つのインサイチュー生成分離構造とを含み、少なくとも１つのインサイチュー生成構造は、固化ポリマー網目構造を含む、マイクロ流体デバイス。
２．固化ポリマー網目構造は、光開始ポリマーを含む、実施形態１に記載のマイクロ流体デバイス。
３．固化ポリマー網目構造は、シリコーンポリマーを含まない、実施形態１又は２に記載のマイクロ流体デバイス。
４．少なくとも１つのインサイチュー生成分離構造の全て又は少なくとも部分は、固化ポリマー網目構造からなる、実施形態１〜３のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
５．固化ポリマー網目構造は、感熱性ポリマーを含む、実施形態１〜４のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
６．基板の少なくとも１つのインサイチュー生成分離構造の下の位置に配置された熱パッドを更に含む、実施形態５に記載のマイクロ流体デバイス。
７．デバイスは少なくとも１つの隔離ペンを更に含む、実施形態１〜６のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
８．少なくとも１つの隔離ペンは、分離領域及び接続領域を含み、接続領域は、フロー領域への基端開口部及び分離領域への先端開口部を有する、実施形態７に記載のマイクロ流体デバイス。
９．フロー領域への隔離ペンの基端開口部は、フロー領域における流体媒体のフローに対して略平行に向けられる、実施形態８に記載のマイクロ流体デバイス。
１０．フロー領域は、マイクロ流体チャネルを含む、実施形態１〜９のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
１１．複数の隔離ペンを含む、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
１２．フロー領域は、マイクロ流体チャネルを含み、複数の隔離ペンは、行に位置合わせされ、複数の開口部の各隔離ペンは、マイクロ流体チャネルの共通の側において開く、実施形態１１に記載のマイクロ流体デバイス。
１３．インサイチュー生成分離構造は、流体媒体のフローを透過する、実施形態１〜１２のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
１４．インサイチュー生成分離構造は、複数の微小物体の１つ又は複数を保持するように構成される、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
１５．少なくとも１つのインサイチュー生成分離構造は、フロー領域に配置された複数のインサイチュー生成分モジュールを含み、複数のインサイチュー生成分離モジュールは、少なくとも１つの分離構造に入る、少なくとも１つの分離構造から出る、及び／又は少なくとも１つの分離構造を通る微小物体の通過をサイズに応じて実質的に制限するように構成される、実施形態１〜１４のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
１６．複数の各インサイチュー生成分離モジュールは、５ミクロン以上の直径を有する微小物体が少なくとも１つのインサイチュー生成分離構造に入る、少なくとも１つのインサイチュー生成分離構造から出る、及び／又は少なくとも１つのインサイチュー生成分離構造を通ることを実質的に阻止されするように、複数のうちの他のインサイチュー生成分離モジュールから離間される、実施形態１５に記載のマイクロ流体デバイス。
１７．複数のインサイチュー生成分離モジュールは、第１のタイプの生物学的微小物体を少なくとも１つの分離構造内へ、その外へ、及び／又はそれを通して移動させ、第２のタイプの生物学的微小物体が少なくとも１つの分離構造内へ、その外へ、及び／又はそれを通して渡ることを実質的に阻止するように構成される、実施形態１６に記載のマイクロ流体デバイス。
１８．複数のインサイチュー生成分離構造を更に含む、実施形態１〜１７のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
１９．マイクロ流体デバイスであって、エンクロージャを含み、エンクロージャは、マイクロ流体チャネルを含むフロー領域と、隔離ペンであって、マイクロ流体チャネルにおいて開く、隔離ペンと、基板に配置されるインサイチュー生成バリアを含むインサイチュー生成分離構造とを含み、インサイチュー生成バリアは、固化ポリマー網目構造を含む、マイクロ流体デバイス。
２０．固化ポリマー網目構造は、光開始ポリマーを含む、実施形態１９に記載のマイクロ流体デバイス。
２１．固化ポリマー網目構造は、シリコーンポリマーを含まない、実施形態１９又は２０に記載のマイクロ流体デバイス。
２２．インサイチュー生成バリアは、マイクロ流体チャネル及び／又は隔離ペンを少なくとも部分的に遮断する、実施形態１９〜２１のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
２３．インサイチュー生成バリアは、隔離ペンの接続領域内に配置される、実施形態１９〜２２のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
２４．インサイチュー生成バリアは、接続領域の幅Ｗｃｏｎの少なくとも部分にわたり延在する幅を有し、インサイチュー生成バリアは、少なくとも１つの微小物体が隔離ペン内に入り、及び／又はそれから出ることを実質的に遮断するように構成される、実施形態２３に記載のマイクロ流体デバイス。
２５．インサイチュー生成バリアの幅は、約５ミクロン〜約２０ミクロンである、実施形態２４に記載のマイクロ流体デバイス。
２６．インサイチュー生成バリアの部分は、接続領域からマイクロ流体チャネルに延在する、実施形態２３〜２５のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
２７．チャネルに延在するインサイチュー生成バリアの部分は、バリアの容積の５０％未満を含む、実施形態２６に記載のマイクロ流体デバイス。
２８．インサイチュー生成バリアは、チャネルに配置される、実施形態１９〜２７のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
２９．インサイチュー生成バリアは、隔離ペンの基端開口部の一縁部に隣接して配置される、実施形態２８に記載のマイクロ流体デバイス。
３０．複数の隔離ペンを更に含み、複数の隔離ペンは、行を形成し、インサイチュー生成バリアは、隔離ペンの行の端部に配置された隔離ペンの基端開口部の先端縁部に隣接して配置される、実施形態２８又は２９に記載のマイクロ流体デバイス。
３１．バリアは、複数の微小物体の少なくとも１つのサブセットがチャネル内のインサイチュー生成バリアを超えて移動することを阻止し、複数の微小物体は、１ミクロン〜２０ミクロンの範囲の直径を有する、実施形態２８〜３０のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
３２．インサイチュー生成バリアは、基板のチャネル内に配置される複数のインサイチュー生成バリアモジュールを含む、実施形態３１に記載のマイクロ流体デバイス。
３３．インサイチュー生成バリアは、流体媒体のフローを透過する、実施形態１９〜３２のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
３４．複数の隔離ペンを更に含み、複数の隔離ペンは、行を形成し、インサイチュー生成バリアは、隔離ペンの行の選択された隔離ペンの基端開口部の縁部に隣接して配置される、実施形態２８又は２９に記載のマイクロ流体デバイス。
３５．複数の隔離ペンを更に含み、複数の隔離ペンは、行を形成し、インサイチュー生成バリアは、少なくとも２つの連続した隔離ペンの基端開口部を遮断する、実施形態１９〜２８のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
３６．行に配置される第１の複数の隔離ペンであって、第１の複数の各隔離ペンは、マイクロ流体チャネルの第１の側において開く、第１の複数の隔離ペンと、行に配置される第２の複数の隔離ペンであって、第２の複数の各隔離ペンは、マイクロ流体チャネルの第２の逆の側において開く、第２の複数の隔離ペンとを更に含み、インサイチュー生成バリアは、マイクロ流体チャネルの長さに沿って配置され、第１の複数の隔離ペンを超える流体媒体の第１のサブフローを提供するように構成される第１のサブチャネルと、第２の複数の隔離ペンを超える流体媒体の第２のサブフローを提供するように構成される第２のサブチャネルとにマイクロ流体チャネルを分割し、インサイチュー生成バリアは、細胞が第１のサブチャネルから第２のサブチャネルに及びその逆に移動することを阻止する、実施形態１９〜２１のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
３７．インサイチュー生成バリアは、複数のインサイチュー生成バリアモジュールを含む、実施形態３６に記載のマイクロ流体デバイス。
３８．インサイチュー生成バリアモジュールは、インサイチュー生成されないバリアの１つ又は複数のギャップを充填するように構成される、実施形態３７に記載のマイクロ流体デバイス。
３９．インサイチュー生成バリアは、流体媒体のフローを透過する、実施形態３６〜３８のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
４０．マイクロ流体チャネルの第１の側は、第１の流体媒体を受け取るように構成され、及びマイクロ流体チャネルの第２の側は、第２の流体媒体を受け取るように構成される、実施形態３６〜３９のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
４１．インサイチュー生成バリアは、１ミクロンを超える直径を有する微小物体がマイクロ流体チャネルの第１の側からマイクロ流体の第２の側に又はその逆に移動することを阻止する、実施形態３６〜４０のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
４２．固化ポリマー網目構造は、合成ポリマー、修飾合成ポリマー、又は生体ポリマーを含む、実施形態１〜４１のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
４３．合成ポリマー修飾は、サイズ変更モチーフ、切断モチーフ、反応末端モチーフ、又は細胞認識モチーフを含む、実施形態４２に記載のマイクロ流体デバイス。
４４．固化ポリマー網目構造は、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、修飾ポリ乳酸、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、修飾ポリグリコール酸、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、修飾ポリアクリルアミド、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡｍ）、修飾ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、修飾ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、修飾ポリアクリル酸、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、修飾ポリカプロラクトン、フィブロネクチン、修飾フィブロネクチン、コラーゲン、修飾コラーゲン、ラミニン、修飾ラミニン、ポリサッカリド、修飾ポリサッカリド、又は任意の組合わせのコポリマーの少なくとも１つを含む、実施形態１〜４３のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
４６．固化ポリマー網目構造は、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、修飾ポリ乳酸、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、修飾ポリグリコール酸、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、修飾ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、修飾ポリアクリル酸、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、修飾ポリカプロラクトン、フィブロネクチン、修飾フィブロネクチン、コラーゲン、修飾コラーゲン、ラミニン、修飾ラミニン、ポリサッカリド、修飾ポリサッカリド、又は任意の組合わせのコポリマーの少なくとも１つを含む、実施形態１〜４５のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
４７．固化ポリマー網目構造は、修飾ポリエチレングリコールポリマーを含む、実施形態１〜４６のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
４８．修飾ポリエチレングリコールポリマーは、星型ポリマーを含む、実施形態４７に記載のマイクロ流体デバイス。
４９．修飾ポリエチレングリコールポリマーは、ジアクリレート部分を含む、実施形態４７又は４８に記載のマイクロ流体デバイス。
５０．修飾ポリエチレングリコールポリマーは、光切断可能部分を含む、実施形態４７〜４９のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
５１．固化ポリマー網目構造は、加水分解、タンパク質分解、浸透圧変更、温度変更、又は光学照明による分解を受けやすい、実施形態４２〜５０のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
５２．固化ポリマー網目構造は、増大した流体フローによる変位を受けやすい、実施形態４２〜５１のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
５３．エンクロージャの少なくとも１つの内面は、調整面を含む、実施形態１〜５２のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
５４．少なくとも１つの内面は、基板の表面を含む、実施形態５３に記載のマイクロ流体デバイス。
５５．調整面は、共有結合的に修飾された表面である、実施形態５３又は５４に記載のマイクロ流体デバイス。
５６．共有結合的に修飾された表面は、親水性である、実施形態５５に記載のマイクロ流体デバイス。
５７．基板は、エンクロージャ内に誘電泳動（ＤＥＰ）力を生成するように構成される、実施形態１〜５６のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
５８．ＤＥＰ力は、光学的に作動される、実施形態５７に記載のマイクロ流体デバイス。
５９．マイクロ流体デバイスのカバーは、透明である、実施形態１〜５９のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
６０．マイクロ流体デバイスにおいて微小物体を分離する方法であって、複数の微小物体を含む第１の流体媒体をマイクロ流体デバイスのエンクロージャに導入するステップであって、エンクロージャは、基板及びフロー領域を含む、ステップと、流動性ポリマーを含む溶液をエンクロージャに導入するステップと、フロー領域の少なくとも１つの選択されたエリアにおいて、流動性ポリマーの固化を活性化し、それによりインサイチュー生成分離構造を形成するステップと、インサイチュー生成分離構造を用いて、複数の微小物体の少なくとも１つを分離するステップとを含む、方法。
６１．流動性ポリマーを含む溶液を導入するステップは、複数の微小物体を含む第１の流体媒体を導入するステップの前に実行される、実施形態６０に記載の方法。
６２．流動性ポリマーの固化を開始するステップは、フロー領域の少なくとも１つの選択されたエリアを光学的に照明することを含み、更に、流動性ポリマーを固化するステップは、流動性ポリマーのポリマーを重合化してポリマー網目構造を形成することを含む、実施形態６１に記載の方法。
６３．流動性ポリマーを導入するステップは、光活性化可能な重合化開始剤を導入することを更に含む、実施形態６０〜６２のいずれか１つに記載の方法。
６４．流動性ポリマーの固化を開始するステップは、基板の少なくとも１つの選択されたエリアにおいて温度を変更することを含み、更に、ポリマーを固化するステップは、ポリマーをゲル化してポリマー網目構造を形成する、実施形態６０〜６２のいずれか１つに記載の方法。
６５．複数の微小物体の残りを処理することを更に含む、実施形態６０〜６４のいずれか１つに記載の方法。
６６．複数の微小物体の残りをマイクロ流体デバイスから搬出することを更に含む、実施形態６０〜６５のいずれか１つに記載の方法。
６７．インサイチュー生成分離構造によって分離される少なくとも１つの微小物体は、複数の微小物体の選択された部分である、実施形態６０〜６６のいずれか１つに記載の方法。
６８．フロー領域を通る流体媒体のフローを増大させるか、加水分解剤をフロー領域に導入するか、タンパク質分解剤をフロー領域に導入するか、フロー領域内の浸透圧を増大／低減する流体媒体をフロー領域に導入するか、インサイチュー生成分離構造の温度を変更するか、又は分離構造を光学的に照明することにより、分離構造を縮小又は除去するステップを更に含む、実施形態６０〜６７のいずれか１つに記載の方法。
６９．温度を変更するステップは、インサイチュー生成分離構造に隣接する又はインサイチュー生成分離構造の下にある基板上の熱パッドを光学的に照明することを更に含む、実施形態６８に記載の方法。
７０．解放された少なくとも１つの微小物体をマイクロ流体デバイスから搬出するステップを更に含む、実施形態６８又は６９に記載の方法。
７１．インサイチュー生成分離構造は、流体媒体のフローに対して少なくとも部分的に透過性である、実施形態６０〜７０のいずれか１つに記載の方法。
７２．流動性ポリマーの固化を活性化するステップは、インサイチュー生成分離構造内、その外、又はそれを通る少なくとも１つの微小物体の通過を阻止するように構成されるインサイチュー生成バリアを含むインサイチュー生成分離構造を形成することを含む、実施形態６０〜７１のいずれか１つに記載の方法。
７３．流動性ポリマーの固化を活性化するステップは、複数の微小物体のサブセットがインサイチュー生成分離構造内へ、その外へ、又はそれを通る通過を阻止するように構成される複数のインサイチュー生成バリアを形成することを含む、実施形態６０〜７２のいずれか１つに記載の方法。
７４．フロー領域を通る流体媒体のフローを増大させるか、加水分解剤をフロー領域に導入するか、タンパク質分解剤をフロー領域に導入するか、フロー領域内の浸透圧を増大／低減する流体媒体をフロー領域に導入するか、インサイチュー生成分離構造の温度を変更するか、又は分離構造を光学的に照明することにより、複数のインサイチュー生成バリアの１つ又は複数を縮小又は除去するステップと、それにより少なくとも１つの微小物体の１つ又は複数のサブセットをインサイチュー生成分離構造から解放するステップとを更に含む、実施形態７３に記載の方法。
７５．インサイチュー生成バリアの１つ又は複数を縮小又は除去するステップは、インサイチュー生成バリアを光学的に照明することを含む、実施形態７４に記載の方法。
７６．１つ又は複数のインサイチュー生成バリアの温度を変更するステップは、１つ又は複数のインサイチュー生成バリアに隣接する又はインサイチュー生成バリアの下にある基板上の熱パッドを光学的に照明することを更に含む、実施形態７４に記載の方法。
７７．少なくとも１つの解放された微小物体の１つ又は複数のサブセットをマイクロ流体デバイスから搬出するステップを更に含む、実施形態７４〜７６のいずれか１つに記載の方法。
７８．固化を活性化するステップは、複数のインサイチュー生成バリアモジュールを含むインサイチュー生成バリアを含むインサイチュー生成分離構造を形成することを更に含み、複数のインサイチュー生成バリアモジュールのそれぞれは、少なくとも１つの微小物体がインサイチュー生成分離構造を透過することを阻止する距離で互いから離間される、実施形態７２〜７７のいずれか１つに記載の方法。
７９．複数のインサイチュー生成バリアを離間させ、それにより複数の微小物体の微小物体の少なくとも１つのサブセットがインサイチュー生成分離構造を透過することを阻止するステップを更に含む、実施形態７８に記載の方法。
８０．微小物体の少なくとも１つのサブセットは、少なくとも１つのタイプの生体細胞を含む、実施形態７９に記載の方法。
８１．マイクロ流体デバイスのエンクロージャは、分離領域及び接続領域を含む少なくとも１つの隔離ペンを更に含み、接続領域は、フロー領域への基端開口部及び分離領域への先端開口部を有する、実施形態６０〜８０のいずれか１つに記載の方法。
８２．エンクロージャは、複数の隔離ペンを含む、実施形態８１に記載の方法。
８３．複数の隔離ペンは、行に配置され、複数の隔離ペンのそれぞれの基端開口部は、互いに連続して配置される、実施形態８２に記載の方法。
８４．フロー領域は、マイクロ流体チャネルを含み、複数の隔離ペンのそれぞれの基端開口部は、マイクロ流体チャネルの１つの側において開く、実施形態８２又は８３に記載の方法。
８５．固化を活性化するステップは、隔離ペンの内部で実行される、実施形態８１〜８４のいずれか１つに記載の方法。
８６．固化を活性化するステップは、分離領域又は接続領域内で実行される、実施形態８５に記載の方法。
８７．流動性ポリマーの固化を活性化するステップは、接続領域にインサイチュー生成バリアを含むインサイチュー生成分離構造を生成する、実施形態８５又は８６に記載の方法。
８８．インサイチュー生成バリアによって分離されない複数の微小物体の残りを処理するステップを更に含む、実施形態８１〜８７のいずれか１つに記載の方法。
８９．インサイチュー生成バリアによって分離されない複数の微小物体の残りをマイクロ流体デバイスから搬出するステップを更に含む、実施形態８１〜８７のいずれか１つに記載の方法。
９０．フロー領域を通る流体媒体のフローを増大させるか、加水分解剤をフロー領域に導入するか、タンパク質分解剤をフロー領域に導入するか、フロー領域内の浸透圧を増大又は低減する流体媒体をフロー領域に導入するか、インサイチュー生成バリアの温度を変更するか、又はバリアを光学的に照明することにより、インサイチュー生成バリアを縮小又は除去するステップと、それにより、少なくとも１つの微小物体を分離から解放するステップとを更に含む、実施形態８９に記載の方法。
９１．インサイチュー生成バリアを縮小又は除去するステップは、インサイチュー生成バリアを光学的に照明することを含む、実施形態９０に記載の方法。
９２．温度を変更することは、インサイチュー生成バリアに隣接する又はインサイチュー生成バリアの下にある基板上の熱パッドを光学的に照明することを更に含む、実施形態９０に記載の方法。
９３．少なくとも１つの微小物体をマイクロ流体デバイスから搬出するステップを更に含む、実施形態９０〜９２のいずれか１つに記載の方法。
９４．流動性ポリマーの固化を活性化するステップは、チャネルにインサイチュー生成バリアを含むインサイチュー生成分離構造を形成する、実施形態８４に記載の方法。
９５．流動性ポリマーの固化を活性化するステップは、複数の隔離ペンの少なくとも１つの隔離ペンの基端開口部においてインサイチュー生成バリアを配置する、実施形態９４に記載の方法。
９６．流動性ポリマーの固化を活性化するステップは、少なくとも２つの連続した隔離ペンの基端開口部を遮断するサイズのインサイチュー生成バリアを形成する、実施形態９４又は９５に記載の方法。
９７．インサイチュー生成バリアによって分離されない複数の微小物体の残りをマイクロ流体デバイスから搬出するステップを更に含む、実施形態９６に記載の方法。
９８．マイクロ流体デバイスは、各隔離ペンがマイクロ流体チャネルの第２の側において開くように互いに隣接して配置される第２の複数の隔離ペンを更に含み、流動性ポリマーの固化を活性化するステップは、マイクロ流体チャネルの長さに沿って流動性ポリマーの固化を活性化し、それにより第１の複数の隔離ペンを超える流体媒体の第１のサブフローを提供するように構成される第１のサブチャネルと、第２の複数のペンを超える流体媒体の第２のサブフローを提供するように構成される第２のサブチャネルとにマイクロ流体チャネルを分割するインサイチュー生成バリアを含むインサイチュー生成分離構造を形成することを更に含み、インサイチュー生成バリアは、微小物体が第１のサブチャネルから第２のサブチャネルに及びその逆に移動することを阻止する、実施形態９４に記載の方法。
９９．マイクロ流体デバイスは、第１の複数の隔離ペンを超える流体媒体の第１のサブフローを提供するように構成される第１のサブチャネルと、第２の複数のペンを超える流体媒体の第２のサブフローを提供するように構成される第２のサブチャネルとにマイクロ流体チャネルを分割するバリアを更に含み、バリアは、第１の複数の隔離ペンの最初の隔離ペンの第１のサブチャネルへの基端開口部と位置合わせされ、且つ第２の複数の隔離ペンの最初のペンの第２のサブチャネルへの基端開口部への基端開口部と位置合わせされた少なくとも１つのギャップによって中断され、更に、重合化を活性化するステップは、少なくとも１つのギャップの重合化を活性化して、少なくとも１つのギャップに少なくとも１つのインサイチュー生成バリアを形成し、それにより微小物体が第１のサブチャネルから第２のサブチャネルに及びその逆に移動することを阻止することを含む、実施形態９８に記載の方法。
１００．複数の微小物体を導入するステップは、第１の複数の隔離ペンの各隔離ペンにクローン集団を導入することと、第１の複数の隔離ペン内の細胞のクローン集団ごとに、少なくとも１つの細胞を第２の複数のそれぞれの隔離ペンに移すステップとを更に含む、実施形態９８又は９９に記載の方法。
１０１．マイクロ流体デバイスが、少なくとも１つのギャップで中断されるバリアを含む場合、第１の複数の隔離ペン内の各クローン集団の少なくとも１つの細胞を移すステップは、少なくとも１つのギャップを通して少なくとも１つの細胞を第２の複数のペンの各隔離ペンに移すことを含む、実施形態１００に記載の方法。
１０２．第２の複数の隔離ペン内の細胞を処理するステップを更に含む、実施形態１００又は１０１に記載の方法。
１０３．流動性ポリマーは、合成ポリマー、修飾合成ポリマー、又は生体ポリマーを含む、実施形態６０〜１０２のいずれか１つに記載の方法。
１０４．合成ポリマー修飾は、サイズ変更モチーフ、切断モチーフ、反応末端モチーフ、又は細胞認識モチーフを含む、実施形態１０３に記載の方法。
１０５．流動性ポリマーは、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、修飾ポリ乳酸、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、修飾ポリグリコール酸、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、修飾ポリアクリルアミド、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡｍ）、修飾ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、修飾ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、修飾ポリアクリル酸、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、修飾ポリカプロラクトン、フィブロネクチン、修飾フィブロネクチン、コラーゲン、修飾コラーゲン、ラミニン、修飾ラミニン、ポリサッカリド、修飾ポリサッカリド、又は任意の組合わせのコポリマーの少なくとも１つを含む、実施形態６０〜１０４のいずれか１つに記載の方法。
１０６．流動性ポリマーは、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、修飾ポリ乳酸、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、修飾ポリグリコール酸、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、修飾ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、修飾ポリアクリル酸、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、修飾ポリカプロラクトン、フィブロネクチン、修飾フィブロネクチン、コラーゲン、修飾コラーゲン、ラミニン、修飾ラミニン、ポリサッカリド、修飾ポリサッカリド、又は任意の組合わせのコポリマーの少なくとも１つを含む、実施形態６０〜１０５のいずれか１つに記載の方法。
１０７．固化ポリマー網目構造は、修飾ポリエチレングリコールポリマーを含む、実施形態６０〜１０６のいずれか１つに記載の方法。
１０８．修飾ポリエチレングリコールポリマーは、星型ポリマーを含む、実施形態１０７に記載の方法。
１０９．修飾ポリエチレングリコールポリマーは、ジアクリレート部分を含む、実施形態１０７又は１０８に記載の方法。
１１０．修飾ポリエチレングリコールポリマーは、光切断可能部分を含む、実施形態１０７〜１０９のいずれか１つに記載の方法。
１１１．エンクロージャの少なくとも１つの内面は、調整面を含む、実施形態６０〜１１０のいずれか１つに記載の方法。
１１２．少なくとも１つの内面は、基板の表面を含む、実施形態１１１に記載の方法。
１１３．調整面は、共有結合的に修飾された表面である、実施形態１１０〜１１２のいずれか１つに記載の方法。
１１４．共有結合的に修飾された表面は、親水性である、実施形態１１３に記載の方法。
１１５．複数の微小物体を導入するステップは、誘電泳動（ＤＥＰ）力を使用することを更に含む、実施形態６０〜１１４のいずれか１つに記載の方法。
１１６．複数の微小物体の１つ又は複数の微小物体を搬出するステップは、誘電泳動（ＤＥＰ）力を使用することを更に含む、実施形態６６〜１１５のいずれか１つに記載の方法。
１１７．ＤＥＰ力を光学的に作動させることを更に含む、実施形態１１５又は１１６に記載の方法。
１１８．マイクロ流体デバイス内でクローン集団の細胞をアッセイする方法であって、複数の細胞を含む第１の流体媒体をマイクロ流体デバイスのエンクロージャに導入するステップであって、エンクロージャは、基板、流体媒体を含むように構成されるマイクロ流体チャネルを含むフロー領域、各隔離ペンがマイクロ流体チャネルの第１の側において開くように、互いに隣接して配置される第１の複数の隔離ペン、及び各隔離ペンがマイクロ流体チャネルの第２の逆の側において開くように、互いに隣接して配置される第２の複数の隔離ペンを含む、ステップと、第１の流体媒体及び複数の細胞をマイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネルに流入させるステップと、第１の複数の隔離ペンの隔離ペンのそれぞれに細胞のクローン集団を導入するステップと、第１の複数の隔離ペン内の細胞のクローン集団ごとに、第２の複数の隔離ペンのそれぞれの隔離ペンに少なくとも１つの細胞を移動させるステップと、流動性ポリマーをチャネルに導入するステップと、マイクロ流体チャネルの長さに沿って流動性ポリマーの固化を活性化し、それにより第１の複数の隔離ペンを超える流体媒体の第１のサブフローを提供するように構成される第１のサブチャネルと、第２の複数の隔離ペンを超える流体媒体の第２のサブフローを提供するように構成される第２のサブチャネルとにマイクロ流体チャネルを分割するインサイチュー生成バリアを形成するステップであって、インサイチュー生成バリアは、細胞が第１のサブチャネルから第２のサブチャネルに及びその逆に移動することを阻止する、ステップと、第２の流体媒体を第２のサブチャネルに流入させるステップであって、第２の流体媒体は、第２の複数の隔離ペンにおける細胞をアッセイするための試剤を含む、ステップと、第２の複数の各隔離ペンにおける細胞をアッセイするステップとを含む、方法。
１１９．インサイチュー生成バリアは、チャネルの第１の端部からマイクロ流体チャネルの第２の端部までの長さを有する、実施形態１１８に記載の方法。
１２０．第１の複数の隔離ペン及び第２の複数の隔離ペンの各隔離ペンは、マイクロ流体チャネルの各側への基端開口部を有する、実施形態１１８又は１１９に記載の方法。
１２１．クローン集団を導入するステップは、単一の細胞を第１の複数の隔離ペンのそれぞれに導入することを含み、且つその単一の細胞を増殖させて細胞のクローン集団にすることを更に含む、実施形態１１８〜１２０のいずれか１つに記載の方法。
１２２．第１のサブチャネル及び第２のサブチャネルにおいて流体媒体をマイクロ流体デバイスのそれぞれの第１及び第２の出力に流入させることを更に含む、実施形態１２１に記載の方法。
１２３．アッセイするステップは、遺伝子型判定のために第２の複数の隔離ペンにおける細胞を準備することを含む、実施形態１１８〜１２２のいずれか１つに記載の方法。
１２４．アッセイするステップは、第２の複数の各隔離ペンにおける細胞及び／又は第１の複数の各隔離ペンにおけるクローン集団による生物由来物質の生成レベルを特定することを含む、実施形態１１８〜１２３のいずれか１つに記載の方法。
１２５．インサイチュー生成バリアは、第１のサブチャネルにおける流体媒体の第１のサブフローが第２のサブチャネルにおける流体媒体の第２のサブフローと混合することを阻止する、実施形態１１８〜１２４のいずれか１つに記載の方法。
１２６．アッセイのための試薬は、化学試薬、生物学的試薬、フィーダ細胞、刺激細胞、レポーター細胞、レポーター分子、及びビーズを含む群の１つ又は複数を含む、実施形態１１８〜１２５のいずれか１つに記載の方法。
１２７．ビーズは、化学試薬、生物学的試薬、刺激試薬、又はレポーター分子を含む、実施形態１２６に記載の方法。
１２８．アッセイするステップは、第２の複数の隔離ペンにおける細胞の少なくとも１つの細胞を識別することを更に含み、少なくとも１つの細胞は、選択された特性を含む、実施形態１１８〜１２７のいずれか１つに記載の方法。
１２９．第２の複数の隔離ペンにおける細胞の少なくとも１つの細胞を搬出するステップを更に含み得、少なくとも１つの細胞は、選択された特性を含む、実施形態１１８〜１２８のいずれか１つに記載の方法。
１３０．第１の複数の隔離ペンの各ペンから、各クローン集団を搬出するステップを更に含む、実施形態１２８又は１２９に記載の方法。
１３１．選択された特性を含まない、第２の複数の隔離ペンにおける細胞及び／又は第１の複数の隔離ペンにおける細胞のクローン集団を搬出するステップを更に含む、実施形態１１８〜１３０のいずれか１つに記載の方法。
１３２．細胞を搬出する前にインサイチュー生成バリアを除去するステップを更に含む、実施形態１２９〜１３１のいずれか１つに記載の方法。
１３３．ポリマーの固化を活性化するステップは、基板の選択されたエリアを光学的に照明し、それによりポリマーを重合化することを含む、実施形態１１８〜１３２のいずれか１つに記載の方法。
１３４．流動性ポリマーの固化を活性化するステップは、光活性化可能重合化開始剤を導入することを更に含む、実施形態１３３に記載の方法。
１３５．マイクロ流体チャネルの長さに沿って流動性ポリマーの固化を活性化するステップは、マイクロ流体チャネルの第１の端部からマイクロ流体チャネルの第２の端部に延在するバリアのギャップにおいて、流動性ポリマーの固化を活性化することを含み、バリアは、第１のサブチャネル及び第２のサブチャネルにマイクロ流体チャネルを分け、ギャップは、第１の複数の隔離ペンの各ペンの基端開口部及び第２の複数の隔離ペンのそれぞれのペンの基端開口部と位置合わせされ、それにより細胞が第１のサブチャネルから第２のサブチャネルに及びその逆に移動することを阻止するインサイチュー生成バリアを形成する、実施形態１１８〜１３４のいずれか１つに記載の方法。
１３６．ポリマーの固化を活性するステップは、基板の選択されたエリアにおいて温度を変更し、それによりポリマーをゲル化することを含む、実施形態１１８〜１３０のいずれか１つに記載の方法。
１３７．流動性ポリマーは、合成ポリマー、修飾合成ポリマー、又は生体ポリマーを含む、実施形態１１８〜１３６のいずれか１つに記載の方法。
１３８．合成ポリマー修飾は、サイズ変更モチーフ、切断モチーフ、反応末端モチーフ、及び／又は細胞認識モチーフを含む、実施形態１３７に記載の方法。
１３９．流動性ポリマーは、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、修飾ポリ乳酸、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、修飾ポリグリコール酸、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、修飾ポリアクリルアミド、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡｍ）、修飾ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、修飾ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、修飾ポリアクリル酸、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、修飾ポリカプロラクトン、フィブロネクチン、修飾フィブロネクチン、コラーゲン、修飾コラーゲン、ラミニン、修飾ラミニン、ポリサッカリド、修飾ポリサッカリド、又は任意の組合わせのコポリマーの少なくとも１つを含む、実施形態１１８〜１３８のいずれか１つに記載の方法。
１４０．流動性ポリマーは、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、修飾ポリ乳酸、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、修飾ポリグリコール酸、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、修飾ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、修飾ポリアクリル酸、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、修飾ポリカプロラクトン、フィブロネクチン、修飾フィブロネクチン、コラーゲン、修飾コラーゲン、ラミニン、修飾ラミニン、ポリサッカリド、修飾ポリサッカリド、又は任意の組合わせのコポリマーの少なくとも１つを含む、実施形態１１８〜１３９のいずれか１つに記載の方法。
１４１．固化ポリマー網目構造は、修飾ポリエチレングリコールポリマーを含む、実施形態１１８〜１４０のいずれか１つに記載の方法。
１４２．修飾ポリエチレングリコールポリマーは、星型ポリマーを含む、実施形態１４１に記載の方法。
１４３．修飾ポリエチレングリコールポリマーは、ジアクリレート部分を含む、実施形態１４１又は１４２に記載の方法。
１４４．修飾ポリエチレングリコールポリマーは、光切断可能部分を含む、実施形態１４１〜１４３のいずれか１つに記載の方法。
１４５．微小物体のクローン集団を導入するステップ又は単一の細胞を移動させるステップは、誘電泳動（ＤＥＰ）力を使用して実行される、実施形態１１６〜１４４のいずれか１つに記載の方法。
１４６．ＤＥＰ力を光学的に作動させることを更に含む、実施形態１４５に記載の方法。
１４７．エンクロージャの少なくとも１つの内面は、調整面を含む、実施形態１１８〜１４６のいずれか１つに記載の方法。
１４８．少なくとも１つの内面は、基板の表面を含む、実施形態１４７に記載の方法。
１４９．調整面は、共有結合的に修飾された表面である、実施形態１４７又は１４８に記載の方法。
１５０．共有結合的に修飾された表面は、親水性である、実施形態１４９に記載の方法。
１５１．実施形態１〜５９のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイスと流動性ポリマー溶液とを含むキットであって、ポリマーは、重合化及び／又は熱的誘導ゲル化が可能である、キット。
１５２．光活性化可能な重合化開始剤を更に含む、実施形態１５１に記載のキット。
１５３．流動性ポリマーは、合成ポリマー、修飾合成ポリマー、又は生体ポリマーを含む、実施形態１５１又は１５２に記載のキット。
１５４．修飾合成ポリマーは、サイズ変更モチーフ、切断モチーフ、反応末端モチーフ、又は細胞認識モチーフを含む、実施形態１５３に記載のキット。
１５５．流動性ポリマーは、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、修飾ポリ乳酸、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、修飾ポリグリコール酸、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、修飾ポリアクリルアミド、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡｍ）、修飾ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、修飾ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、修飾ポリアクリル酸、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、修飾ポリカプロラクトン、フィブロネクチン、修飾フィブロネクチン、コラーゲン、修飾コラーゲン、ラミニン、修飾ラミニン、ポリサッカリド、修飾ポリサッカリド、又は任意の組合わせのコポリマーの少なくとも１つを含む、実施形態１５１〜１５４のいずれか１つに記載のキット。
１５６．流動性ポリマーは、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、修飾ポリ乳酸、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、修飾ポリグリコール酸、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、修飾ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、修飾ポリアクリル酸、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、修飾ポリカプロラクトン、フィブロネクチン、修飾フィブロネクチン、コラーゲン、修飾コラーゲン、ラミニン、修飾ラミニン、ポリサッカリド、修飾ポリサッカリド、又は任意の組合わせのコポリマーの少なくとも１つを含む、実施形態１５１〜１５５のいずれか１つに記載のキット。
１５７．流動性ポリマーは、修飾ポリエチレングリコールポリマーを含む、実施形態１５１〜１５６のいずれか１つに記載のキット。
１５８．修飾ポリエチレングリコールポリマーは、星型ポリマーを含む、実施形態１５７に記載のキット。
１５９．修飾ポリエチレングリコールポリマーは、ジアクリレート部分を含む、実施形態１５７又は１５８に記載のキット。
１６０．修飾ポリエチレングリコールポリマーは、光切断可能部分を含む、実施形態１５３又は１５４のいずれか１つに記載のキット。
１６１．マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの内面を共有結合的に修飾するように構成される試薬を更に含む、実施形態１５１〜１６１のいずれか１つに記載のキット。
１６２．マイクロ流体デバイスであって、エンクロージャを含み、エンクロージャは、基板、流体媒体を含むように構成されるマイクロ流体チャネルを含むフロー領域、各隔離ペンがマイクロ流体チャネルの第１の側において開くように、互いに隣接して配置される第１の複数の隔離ペン、及び各隔離ペンがマイクロ流体チャネルの第２の逆の側において開くように、互いに隣接して配置される第２の複数の隔離ペンを含む、マイクロ流体デバイス。
１６３．マイクロ流体チャネルの第１の側は、第１の流体媒体を受け取るように構成され、及びマイクロ流体チャネルの第２の側は、第２の流体媒体を受け取るように構成される、実施形態１６２に記載のマイクロ流体デバイス。
１６４．第１の流体媒体は、第１の流体流入口を介してマイクロ流体チャネルの第１の側に導入され、及び第２の流体媒体は、第２の流体流入口を介してマイクロ流体チャネルの第２の側に導入される、実施形態１６３に記載のマイクロ流体デバイス。
１６５．第１の流体媒体は、第１の流出口を介してマイクロ流体チャネルの第１の側から流出し、及び第２の流体媒体は、第２の流出口を介してマイクロ流体チャネルの第２の側から流出する、実施形態１６３又は１６４に記載のマイクロ流体デバイス。
１６６．第１の複数の及び第２の複数の隔離ペンの各隔離ペンは、分離領域及び接続領域を含み、接続領域は、チャネルへの基端開口部と、分離領域への先端開口部とを有する、実施形態１６２〜１６５のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
１６７．チャネルへの各隔離ペンの基端開口部は、チャネル内の流体媒体のフローに対して略平行に向けられる、実施形態１６６に記載のマイクロ流体デバイス。
１６８．エンクロージャの少なくとも１つの内面は、調整面を含む、実施形態１６２〜１６７のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
１６９．少なくとも１つの内面は、基板の表面を含む、実施形態１６８に記載のマイクロ流体デバイス。
１７０．調整面は、共有結合的に修飾された表面である、実施形態１６８又は１６９に記載のマイクロ流体デバイス。
１７１．共有結合的に修飾された表面は、親水性である、実施形態１６８又は１６９に記載のマイクロ流体デバイス。
１７２．基板は、エンクロージャ内に誘電泳動（ＤＥＰ）力を生成するように構成される、実施形態１６２〜１７１のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
１７３．ＤＥＰ力は、光学的に作動される、実施形態１７２に記載のマイクロ流体デバイス。
１７４．マイクロ流体デバイスのカバーは、略透明である、実施形態１６２〜１７３のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
１７５．第１の複数の隔離ペンを超える流体媒体の第１のサブフローを提供するように構成される第１のサブチャネルと、第２の複数の隔離ペンを超える流体媒体の第２のサブフローを提供するように構成される第２のサブチャネルとにマイクロ流体チャネルを分割するバリアを更に含み、バリアは、第１の複数のペンの最初のペンの基端開口部と、第２の複数のペンの最初のペンの基端開口部との間に位置合わせされた少なくとも１つのギャップによって中断される、実施形態１６２〜１７４のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
１７６．バリアは、チャネルの第１の端部からチャネルの第２の端部に延びる長さを有する、実施形態１７５に記載のマイクロ流体デバイス。
１７７．第１の複数のペンの各ペンの第１のサブチャネルへの基端開口部と、第２の複数のペンの各ペンの第２のサブチャネルへの基端開口部との間に位置合わせされたギャップを更に含み、それにより、バリアは、マイクロ流体チャネルにおいてバリアの長さに沿って複数のギャップを含む、実施形態１７５又は１７６に記載のマイクロ流体デバイス。
１７８．第１のサブチャネルを第２のサブチャネルから分けるバリアのギャップを閉じるインサイチュー生成バリアを更に含む、実施形態１７５又は１７６に記載のマイクロ流体デバイス。
１７９．第１のサブチャネルを第２のサブチャネルから分けるバリアの複数のギャップのそれぞれを閉じるインサイチュー生成バリアを更に含み、それにより、バリアは、複数のインサイチュー生成バリアを含む、実施形態１７８に記載のマイクロ流体デバイス。
１８０．インサイチュー生成バリアを更に含み、インサイチュー生成バリアは、マイクロ流体チャネルの長さに沿って配置され、第１の複数の隔離ペンを超える流体媒体の第１のサブフローを提供するように構成される第１のサブチャネルと、第２の複数の隔離ペンを超える流体媒体の第２のサブフローを提供するように構成される第２のサブチャネルとにマイクロ流体チャネルを分割し、インサイチュー生成バリアは、細胞が第１のサブチャネルから第２のサブチャネルに及びその逆に移動することを阻止する、実施形態１６２〜１７４のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
１８１．インサイチュー生成バリアは、固化ポリマー網目構造を含む、実施形態１７８〜１８０のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
１８２．固化ポリマー網目構造は、合成ポリマー、修飾合成ポリマー、又は生体ポリマーを含む、実施形態１８１に記載のマイクロ流体デバイス。
１８３．合成ポリマー修飾は、サイズ変更モチーフ、切断モチーフ、反応末端モチーフ、又は細胞認識モチーフを含む、実施形態１８２に記載のマイクロ流体デバイス。
１８４．固化ポリマー網目構造は、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、修飾ポリ乳酸、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、修飾ポリグリコール酸、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、修飾ポリアクリルアミド、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡｍ）、修飾ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、修飾ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、修飾ポリアクリル酸、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、修飾ポリカプロラクトン、フィブロネクチン、修飾フィブロネクチン、コラーゲン、修飾コラーゲン、ラミニン、修飾ラミニン、ポリサッカリド、修飾ポリサッカリド、又は任意の組合わせのコポリマーの少なくとも１つを含む、実施形態１８１〜１８３のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
１８５．固化ポリマー網目構造は、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、修飾ポリ乳酸、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、修飾ポリグリコール酸、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、修飾ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、修飾ポリアクリル酸、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、修飾ポリカプロラクトン、フィブロネクチン、修飾フィブロネクチン、コラーゲン、修飾コラーゲン、ラミニン、修飾ラミニン、ポリサッカリド、修飾ポリサッカリド、又は任意の組合わせのコポリマーの少なくとも１つを含む、実施形態１８１〜１８４のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
１８６．固化ポリマー網目構造は、修飾ポリエチレングリコールポリマーを含む、実施形態１７６〜１８０のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
１８７．修飾ポリエチレングリコールポリマーは、星型ポリマーを含む、実施形態１８６に記載のマイクロ流体デバイス。
１８８．修飾ポリエチレングリコールポリマーは、ジアクリレート部分を含む、実施形態１８６又は１８７に記載のマイクロ流体デバイス。
１８９．修飾ポリエチレングリコールポリマーは、光切断可能部分を含む、実施形態１８６〜１８８のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
１９０．実施形態１６２〜１７７のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイスと、流動性ポリマー溶液とを含む、クローン集団の細胞をアッセイするキットであって、ポリマーは、重合化及び／又は熱的誘導ゲル化が可能である、キット。
１９１．光活性化可能な重合化開始剤を更に含む、実施形態１９０に記載のキット。
１９２．流動性ポリマーは、合成ポリマー、修飾合成ポリマー、又は生体ポリマーを含む、実施形態１９０又は１９１に記載のキット。
１９３．修飾合成ポリマーは、サイズ変更モチーフ、切断モチーフ、反応末端モチーフ、又は細胞認識モチーフを含む、実施形態１９２に記載のキット。
１９４．流動性ポリマーは、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、修飾ポリ乳酸、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、修飾ポリグリコール酸、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、修飾ポリアクリルアミド、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡｍ）、修飾ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、修飾ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、修飾ポリアクリル酸、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、修飾ポリカプロラクトン、フィブロネクチン、修飾フィブロネクチン、コラーゲン、修飾コラーゲン、ラミニン、修飾ラミニン、ポリサッカリド、修飾ポリサッカリド、又は任意の組合わせのコポリマーの少なくとも１つを含む、実施形態１９０〜１９３のいずれか１つに記載のキット。
１９５．流動性ポリマーは、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、修飾ポリ乳酸、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、修飾ポリグリコール酸、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、修飾ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、修飾ポリアクリル酸、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、修飾ポリカプロラクトン、フィブロネクチン、修飾フィブロネクチン、コラーゲン、修飾コラーゲン、ラミニン、修飾ラミニン、ポリサッカリド、修飾ポリサッカリド、又は任意の組合わせのコポリマーの少なくとも１つを含む、実施形態１９０〜１９４のいずれか１つに記載のキット。
１９６．流動性ポリマーは、修飾ポリエチレングリコールポリマーを含む、実施形態１９０〜１９５のいずれか１つに記載のキット。
１９７．修飾ポリエチレングリコールポリマーは、星型ポリマーを含む、実施形態１９６に記載のキット。
１９３．修飾ポリエチレングリコールポリマーは、ジアクリレート部分を含む、実施形態１９１又は１９２に記載のキット。
１９４．修飾ポリエチレングリコールポリマーは、光切断可能部分を含む、実施形態１９１〜１９３のいずれか１つに記載のキット。
１９５．マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの内面を共有結合的に修飾するように構成される試薬を更に含む、実施形態１８５〜１９４のいずれか１つに記載のキット。

Claims (88)

  1. マイクロ流体デバイスであって、エンクロージャを含み、前記エンクロージャは、基板と、前記エンクロージャ内に配置されるフロー領域と、前記基板に配置される少なくとも１つのインサイチュー生成分離構造とを含み、前記少なくとも１つのインサイチュー生成構造は、固化ポリマー網目構造を含む、マイクロ流体デバイス。
  2. 前記固化ポリマー網目構造は、光開始ポリマーを含む、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
  3. 前記固化ポリマー網目構造は、シリコーンポリマーを含まない、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
  4. 少なくとも１つの隔離ペンを更に含む、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
  5. 前記少なくとも１つの隔離ペンは、分離領域及び接続領域を含み、前記接続領域は、前記フロー領域への基端開口部と、前記分離領域への先端開口部とを有する、請求項４に記載のマイクロ流体デバイス。
  6. 前記フロー領域は、マイクロ流体チャネルを含む、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
  7. 複数の隔離ペンを含む、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
  8. 前記インサイチュー生成分離構造は、複数の微小物体の１つ又は複数を保持するように構成される、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
  9. 前記少なくとも１つのインサイチュー生成分離構造は、前記フロー領域に配置される複数のインサイチュー生成分離モジュールを含み、前記複数の前記インサイチュー生成分離モジュールは、前記少なくとも１つの分離構造に入る、前記少なくとも１つの分離構造から出る、及び／又は前記少なくとも１つの分離構造を通る微小物体の通過をサイズに応じて実質的に制限するように構成される、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
  10. 前記複数の各インサイチュー生成分離モジュールは、５ミクロン以上の直径を有する微小物体が前記少なくとも１つのインサイチュー生成分離構造に入る、前記少なくとも１つのインサイチュー生成分離構造から出る、及び／又は前記少なくとも１つのインサイチュー生成分離構造を通ることを実質的に阻止されるように、前記複数のうちの他のインサイチュー生成分離モジュールから離間される、請求項９に記載のマイクロ流体デバイス。
  11. 複数のインサイチュー生成分離構造を更に含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
  12. マイクロ流体デバイスであって、エンクロージャを含み、前記エンクロージャは、
    マイクロ流体チャネルを含むフロー領域と、
    隔離ペンであって、前記マイクロ流体チャネルにおいて開く、隔離ペンと、
    基板に配置されるインサイチュー生成バリアを含むインサイチュー生成分離構造であって、前記インサイチュー生成バリアは、固化ポリマー網目構造を含む、インサイチュー生成分離構造と
    を含む、マイクロ流体デバイス。
  13. 前記固化ポリマー網目構造は、光開始ポリマーを含む、請求項１２に記載のマイクロ流体デバイス。
  14. 前記固化ポリマー網目構造は、シリコーンポリマーを含まない、請求項１２に記載のマイクロ流体デバイス。
  15. 前記インサイチュー生成バリアは、前記マイクロ流体チャネル及び／又は前記隔離ペンを少なくとも部分的に遮断する、請求項１２に記載のマイクロ流体デバイス。
  16. 前記インサイチュー生成バリアは、前記隔離ペンの接続領域内に配置される、請求項１２に記載のマイクロ流体デバイス。
  17. 前記インサイチュー生成バリアの部分は、前記接続領域から前記マイクロ流体チャネル内に延びる、請求項１６に記載のマイクロ流体デバイス。
  18. 前記インサイチュー生成バリアは、前記マイクロ流体チャネルに配置される、請求項１２に記載のマイクロ流体デバイス。
  19. 前記インサイチュー生成バリアは、前記隔離ペンの基端開口部の一縁部に隣接して配置される、請求項１８に記載のマイクロ流体デバイス。
  20. 複数の隔離ペンを更に含み、前記複数の隔離ペンは、行を形成し、前記インサイチュー生成バリアは、前記隔離ペンの前記行の端部に配置される隔離ペンの基端開口部の先端縁部に隣接して配置される、請求項１８に記載のマイクロ流体デバイス。
  21. 前記インサイチュー生成バリアは、複数の微小物体の少なくとも１つのサブセットが前記マイクロ流体チャネル内で前記バリアを超えて移動することを阻止し、前記複数の微小物体は、１ミクロン〜２０ミクロンの範囲の直径を有する、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
  22. 行に配置される第１の複数の隔離ペンであって、前記第１の複数の各隔離ペンは、前記マイクロ流体チャネルの第１の側において開く、第１の複数の隔離ペンと、
    行に配置される第２の複数の隔離ペンであって、前記第２の複数の各隔離ペンは、前記マイクロ流体チャネルの第２の逆の側において開く、第２の複数の隔離ペンと
    を更に含み、
    前記インサイチュー生成バリアは、前記マイクロ流体チャネルの長さに沿って配置され、前記第１の複数の隔離ペンを超える流体媒体の第１のサブフローを提供するように構成される第１のサブチャネルと、前記第２の複数の隔離ペンを超える流体媒体の第２のサブフローを提供するように構成される第２のサブチャネルとに前記マイクロ流体チャネルを分割し、前記インサイチュー生成バリアは、細胞が前記第１のサブチャネルから前記第２のサブチャネルに及びその逆に移動することを阻止する、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
  23. 前記インサイチュー生成バリアは、複数のインサイチュー生成バリアモジュールを含む、請求項２２に記載のマイクロ流体デバイス。
  24. 前記インサイチュー生成バリアは、流体媒体の流れに対して透過性である、請求項２２に記載のマイクロ流体デバイス。
  25. 前記マイクロ流体チャネルの前記第１の側は、第１の流体媒体を受け取るように構成され、及び前記マイクロ流体チャネルの前記第２の側は、第２の流体媒体を受け取るように構成される、請求項２２に記載のマイクロ流体デバイス。
  26. 前記インサイチュー生成バリアは、１ミクロンを超える直径を有する微小物体が前記マイクロ流体チャネルの前記第１の側から前記マイクロ流体の前記第２の側に又はその逆に移動することを阻止する、請求項２２に記載のマイクロ流体デバイス。
  27. 前記固化ポリマー網目構造は、合成ポリマー、修飾合成ポリマー、又は生体ポリマーを含む、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
  28. 合成ポリマー修飾は、サイズ変更モチーフ、切断モチーフ、反応末端モチーフ、及び／又は細胞認識モチーフを含む、請求項２７に記載のマイクロ流体デバイス。
  29. 前記固化ポリマー網目構造は、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、修飾ポリ乳酸、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、修飾ポリグリコール酸、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、修飾ポリアクリルアミド、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡｍ）、修飾ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、修飾ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、修飾ポリアクリル酸、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、修飾ポリカプロラクトン、フィブロネクチン、修飾フィブロネクチン、コラーゲン、修飾コラーゲン、ラミニン、修飾ラミニン、ポリサッカリド、修飾ポリサッカリド、又は任意の組合わせのコポリマーの少なくとも１つを含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
  30. 前記固化ポリマー網目構造は、修飾ポリエチレングリコールポリマーを含む、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
  31. 前記固化ポリマー網目構造は、加水分解、タンパク質分解、浸透圧変化、温度変化、又は光学照明による分解を受けやすい、請求項２９に記載のマイクロ流体デバイス。
  32. 前記固化ポリマー網目構造は、増大した流体フローによる変位を受けやすい、請求項２９に記載のマイクロ流体デバイス。
  33. 前記エンクロージャの少なくとも１つの内面は、調整面を含む、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
  34. 前記基板は、前記エンクロージャ内に誘電泳動（ＤＥＰ）力を生成するように構成される、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
  35. 前記ＤＥＰ力は、光学的に作動される、請求項３４に記載のマイクロ流体デバイス。
  36. マイクロ流体デバイスにおいて微小物体を分離する方法であって、
    複数の微小物体を含む第１の流体媒体を前記マイクロ流体デバイスのエンクロージャに導入するステップであって、前記エンクロージャは、基板及びフロー領域を含む、ステップと、
    流動性ポリマーを含む溶液を前記エンクロージャに導入するステップと、
    前記フロー領域の少なくとも１つの選択されたエリアにおいて、前記流動性ポリマーの固化を活性化し、それによりインサイチュー生成分離構造を形成するステップと、
    前記インサイチュー生成分離構造を用いて、前記複数の微小物体の少なくとも１つを分離するステップと
    を含む、方法。
  37. 前記流動性ポリマーの固化を開始する前記ステップは、前記フロー領域の前記少なくとも１つの選択されたエリアを光学的に照明することを含み、更に、前記流動性ポリマーを固化する前記ステップは、前記流動性ポリマーのポリマーを重合化してポリマー網目構造を形成することを含む、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記流動性ポリマーを導入する前記ステップは、光活性化可能な重合化開始剤を導入することを更に含む、請求項３６に記載の方法。
  39. 前記複数の微小物体の残りを処理することを更に含む、請求項３６に記載の方法。
  40. 前記マイクロ流体デバイスから前記複数の微小物体の残りを搬出することを更に含む、請求項３６に記載の方法。
  41. 前記フロー領域を通る流体媒体のフローを増大させるか、加水分解剤を前記フロー領域に導入するか、タンパク質分解剤を前記フロー領域に導入するか、前記フロー領域内の浸透圧を増大／低減する流体媒体を前記フロー領域に導入するか、前記インサイチュー生成分離構造の温度を変更するか、又は前記分離構造を光学的に照明することにより、前記分離構造を縮小又は除去するステップと、
    それにより、前記少なくとも１つの微小物体を前記インサイチュー生成分離構造から解放するステップと
    を更に含む、請求項３６に記載の方法。
  42. 前記少なくとも１つの解放された微小物体を前記マイクロ流体デバイスから搬出するステップを更に含む、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記インサイチュー生成分離構造は、流体媒体のフローに対して少なくとも部分的に透過性である、請求項３６に記載の方法。
  44. 前記流動性ポリマーの固化を活性化する前記ステップは、インサイチュー生成分離構造であって、前記インサイチュー生成分離構造に入る、前記インサイチュー生成分離構造から出る、又は前記インサイチュー生成分離構造を通る前記少なくとも１つの微小物体の通過を阻止するように構成されるインサイチュー生成バリアを含むインサイチュー生成分離構造を形成することを含む、請求項３６に記載の方法。
  45. 前記流動性ポリマーの固化を活性化する前記ステップは、前記インサイチュー生成分離構造に入る、前記インサイチュー生成分離構造から出る、又は前記インサイチュー生成分離構造を通る前記複数の微小物体のサブセットの通過を阻止するように構成される複数のインサイチュー生成バリアを形成することを含む、請求項３６に記載の方法。
  46. 前記フロー領域を通る流体媒体の流れを増大させるか、加水分解剤を前記フロー領域に導入するか、タンパク質分解剤を前記フロー領域に導入するか、前記フロー領域内の浸透圧を増大／低減する流体媒体を前記フロー領域に導入するか、前記インサイチュー生成バリアの温度を変更するか、又は前記インサイチュー生成バリアを光学的に照明することにより、前記複数のインサイチュー生成バリアの１つ又は複数を縮小又は除去するステップと、
    それにより、前記少なくとも１つの微小物体の１つ又は複数のサブセットを前記インサイチュー生成分離構造から解放するステップと
    を更に含む、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記マイクロ流体デバイスから、前記少なくとも１つの解放された微小物体の前記１つ又は複数のサブセットを搬出するステップを更に含む、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記マイクロ流体デバイスの前記エンクロージャは、分離領域及び接続領域を含む少なくとも１つの隔離ペンを更に含み、前記接続領域は、前記フロー領域への基端開口部と、前記分離領域への先端開口部とを有する、請求項３６に記載の方法。
  49. 前記エンクロージャは、複数の隔離ペンを含む、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記フロー領域は、マイクロ流体チャネルを含み、及び前記複数の隔離ペンのそれぞれの前記基端開口部は、前記マイクロ流体チャネルの１つの側において開く、請求項４９に記載の方法。
  51. 固化を活性化する前記ステップは、隔離ペンの内部で実行される、請求項４８に記載の方法。
  52. 前記流動性ポリマーの固化を活性化する前記ステップは、前記接続領域にインサイチュー生成バリアを含むインサイチュー生成分離構造を生成する、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記インサイチュー生成バリアによって分離されない前記複数の微小物体の残りを前記マイクロ流体デバイスから搬出するステップを更に含む、請求項４８に記載の方法。
  54. 前記フロー領域を通る流体媒体の流れを増大させるか、加水分解剤を前記フロー領域に導入するか、タンパク質分解剤を前記フロー領域に導入するか、前記フロー領域内の浸透圧を増大／低減する流体媒体を前記フロー領域に導入するか、前記インサイチュー生成バリアの温度を変更するか、又は前記インサイチュー生成バリアを光学的に照明することにより、前記インサイチュー生成バリアを縮小又は除去し、それにより前記少なくとも１つの微小物体を前記インサイチュー生成分離構造から解放するステップを更に含む、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記少なくとも１つの微小物体を前記マイクロ流体デバイスから搬出するステップを更に含む、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記流動性ポリマーの固化を活性化する前記ステップは、前記マイクロ流体チャネルにインサイチュー生成バリアを含むインサイチュー生成分離構造を形成する、請求項５０に記載の方法。
  57. 前記流動性ポリマーの固化を活性化する前記ステップは、前記インサイチュー生成バリアを前記複数の隔離ペンの少なくとも１つの隔離ペンの基端開口部に配置する、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記流動性ポリマーの固化を活性化する前記ステップは、少なくとも２つの連続した隔離ペンの前記基端開口部を遮断するサイズのインサイチュー生成バリアを含むインサイチュー生成分離構造を形成する、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記インサイチュー生成バリアによって分離されない前記複数の微小物体の残りを前記マイクロ流体デバイスから搬出するステップを更に含む、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記流動性ポリマーは、合成ポリマー、修飾合成ポリマー、又は生体ポリマーを含む、請求項３６〜５９のいずれか一項に記載の方法。
  61. 合成ポリマー修飾は、サイズ変更モチーフ、切断モチーフ、反応末端モチーフ、及び／又は細胞認識モチーフを含む、請求項６０に記載の方法。
  62. 前記複数の微小物体を導入する前記ステップは、誘電泳動（ＤＥＰ）力を使用することを更に含む、請求項３６に記載の方法。
  63. 前記ＤＥＰ力を光学的に作動させることを更に含む、請求項６２に記載の方法。
  64. マイクロ流体デバイス内でクローン集団の細胞をアッセイする方法であって、
    複数の細胞を含む第１の流体媒体を前記マイクロ流体デバイスのエンクロージャに導入するステップであって、前記エンクロージャは、
    基板、
    流体媒体を含むように構成されるマイクロ流体チャネルを含むフロー領域、
    各隔離ペンが前記マイクロ流体チャネルの第１の側において開くように、互いに隣接して配置される第１の複数の隔離ペン、及び
    各隔離ペンが前記マイクロ流体チャネルの第２の逆の側において開くように、互いに隣接して配置される第２の複数の隔離ペン
    を含む、ステップと、
    前記第１の流体媒体及び前記複数の細胞を前記マイクロ流体デバイスの前記マイクロ流体チャネルに流入させるステップと、
    前記第１の複数の隔離ペンの前記隔離ペンのそれぞれに細胞のクローン集団を導入するステップと、
    前記第１の複数の隔離ペン内の細胞のクローン集団ごとに、前記第２の複数の隔離ペンのそれぞれの隔離ペンに少なくとも１つの細胞を移動させるステップと、
    流動性ポリマーを前記マイクロ流体チャネルに導入するステップと、
    前記マイクロ流体チャネルの長さに沿って前記流動性ポリマーの固化を活性化し、それにより前記第１の複数の隔離ペンを超える流体媒体の第１のサブフローを提供するように構成される第１のサブチャネルと、前記第２の複数の隔離ペンを超える流体媒体の第２のサブフローを提供するように構成される第２のサブチャネルとに前記マイクロ流体チャネルを分割するインサイチュー生成バリアを形成するステップであって、前記インサイチュー生成バリアは、細胞が前記第１のサブチャネルから前記第２のサブチャネルに及びその逆に移動することを阻止する、ステップと、
    第２の流体媒体を前記第２のサブチャネルに流入させるステップであって、前記第２の流体媒体は、前記第２の複数の隔離ペンにおける前記細胞をアッセイするための試剤を含む、ステップと、
    前記第２の複数の各隔離ペンにおける前記細胞をアッセイするステップと
    を含む、方法。
  65. 前記クローン集団を導入する前記ステップは、単一の細胞を前記第１の複数の隔離ペンのそれぞれに導入することを含み、且つ前記単一の細胞を細胞のクローン集団に増殖させることを更に含む、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記第１のサブチャネルにおける流体媒体及び前記第２のサブチャネルにおける流体媒体を前記マイクロ流体デバイスのそれぞれの第１及び第２の出力に流入させることを更に含む、請求項６５に記載の方法。
  67. 前記アッセイするステップは、遺伝子型判定のために前記第２の複数の隔離ペンにおける前記細胞を準備することを含む、請求項６４に記載の方法。
  68. 前記アッセイするステップは、前記第２の複数の各隔離ペンにおける前記細胞及び／又は前記第１の複数の各隔離ペンにおける前記クローン集団による生物由来物質の生成レベルを特定することを含む、請求項６４に記載の方法。
  69. 前記アッセイのための試薬は、化学試薬、生物学的試薬、フィーダ細胞、刺激細胞、レポーター細胞、レポーター分子、及びビーズを含む群の１つ又は複数を含む、請求項６４に記載の方法。
  70. 前記アッセイするステップは、前記第２の複数の隔離ペンにおける前記細胞の少なくとも１つの細胞を識別することを更に含み、前記少なくとも１つの細胞は、選択された特性を含む、請求項６４に記載の方法。
  71. 前記第２の複数の隔離ペンにおける前記細胞の少なくとも１つの細胞を搬出するステップを更に含み、前記少なくとも１つの細胞は、選択された特性を含む、請求項６４に記載の方法。
  72. 前記第１の複数の隔離ペンの前記それぞれのペンから前記それぞれのクローン集団を搬出するステップを更に含む、請求項７０に記載の方法。
  73. 選択された特性を含まない、前記第２の複数の隔離ペンにおける前記細胞及び／又は前記第１の複数の隔離ペンにおける細胞のクローン集団を搬出するステップを更に含む、請求項６４に記載の方法。
  74. 前記ポリマーの固化を活性化する前記ステップは、前記基板の選択されたエリアを光学的に照明し、それにより前記ポリマーを重合化することを含む、請求項６４に記載の方法。
  75. 前記流動性ポリマーの固化を活性化する前記ステップは、光活性化可能な重合化開始剤を導入することを更に含む、請求項７４に記載の方法。
  76. 前記マイクロ流体チャネルの長さに沿って前記流動性ポリマーの固化を活性化する前記ステップは、前記マイクロ流体チャネルの第１の端部から前記マイクロ流体チャネルの第２の端部に延びるバリアのギャップにおいて前記流動性ポリマーの固化を活性化することを含み、前記バリアは、前記マイクロ流体チャネルを前記第１のサブチャネル及び前記第２のサブチャネルに分け、前記ギャップは、前記第１の複数の隔離ペンの各ペンの基端開口部及び前記第２の複数の隔離ペンの前記それぞれのペンの基端開口部と位置合わせされ、それにより細胞が前記第１のサブチャネルから前記第２のサブチャネルに及びその逆に移動することを阻止するインサイチュー生成バリアを形成する、請求項６５に記載の方法。
  77. 前記流動性ポリマーは、合成ポリマー、修飾合成ポリマー、又は生体ポリマーを含む、請求項６４に記載の方法。
  78. 合成ポリマー修飾は、サイズ変更モチーフ、切断モチーフ、反応末端モチーフ、及び／又は細胞認識モチーフを含む、請求項７６に記載の方法。
  79. 前記流動性ポリマーは、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、修飾ポリ乳酸、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、修飾ポリグリコール酸、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、修飾ポリアクリルアミド、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡｍ）、修飾ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、修飾ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、修飾ポリアクリル酸、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、修飾ポリカプロラクトン、フィブロネクチン、修飾フィブロネクチン、コラーゲン、修飾コラーゲン、ラミニン、修飾ラミニン、ポリサッカリド、修飾ポリサッカリド、又は任意の組合わせのコポリマーの少なくとも１つを含む、請求項６４に記載の方法。
  80. 微小物体の前記クローン集団を導入する前記ステップ又は前記１つの細胞を移動させる前記ステップは、誘電泳動（ＤＥＰ）力を使用して実行される、請求項６４〜７８のいずれか一項に記載の方法。
  81. 前記ＤＥＰ力を光学的に作動させることを更に含む、請求項７９に記載の方法。
  82. 前記エンクロージャの少なくとも１つの内面は、調整面を含む、請求項６４に記載の方法。
  83. 請求項１に記載のマイクロ流体デバイスと、流動性ポリマー溶液とを含むキットであって、前記ポリマーは、重合化及び／又は熱誘導ゲル化が可能である、キット。
  84. 光活性化可能な重合化開始剤を更に含む、請求項８２に記載のキット。
  85. 前記流動性ポリマーは、合成ポリマー、修飾合成ポリマー、又は生体ポリマーを含む、請求項８２に記載のキット。
  86. 前記修飾合成ポリマーは、サイズ変更モチーフ、切断モチーフ、反応末端モチーフ、又は細胞認識モチーフを含む、請求項８４に記載のキット。
  87. 前記流動性ポリマーは、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、修飾ポリ乳酸、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、修飾ポリグリコール酸、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、修飾ポリアクリルアミド、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡｍ）、修飾ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、修飾ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、修飾ポリアクリル酸、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、修飾ポリカプロラクトン、フィブロネクチン、修飾フィブロネクチン、コラーゲン、修飾コラーゲン、ラミニン、修飾ラミニン、ポリサッカリド、修飾ポリサッカリド、又は任意の組合わせのコポリマーの少なくとも１つを含む、請求項８２に記載のキット。
  88. 前記マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの内面を共有結合的に修飾するように構成される試剤を更に含む、請求項８２〜８８のいずれか一項に記載のキット。
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