JP2019502361A - 成長ホルモン受容体の細胞外結合ドメインを含む融合ポリペプチド - Google Patents

Abstract

本発明は、成長ホルモンではないポリペプチドに、直接的あるいは間接的に連結した、成長ホルモンの細胞外ドメインを含む融合ポリペプチドに関する。【選択図】図１９

Description

本発明は、成長ホルモン受容体の細胞外結合ドメインを含む融合ポリペプチド、当該融合ポリペプチドを含む医薬組成物、および当該融合ポリペプチドの投与から利益を得る疾患および症状の処置における当該融合ポリペプチドの使用に関する。

バイオ医薬品として使用される組換えタンパク質およびペプチドには、血清クリアランスの問題がある。循環系から投与されたタンパク質が除去される要因は、腎臓濾過とタンパク質分解という２つの要素がある。典型的には、７０ｋＤａを超える分子量を有するタンパク質は、大きすぎて単純には濾過されないため、糸球体濾過によって除去されない。小さな分子量の特定のタンパク質は、糸球体により濾過され、尿中に検出される。 例えば、成長ホルモン（ＧＨ）は２２．１ｋＤａの分子量を有し、腎臓はヒトでは６０〜７０％のＧＨの除去を担っている。腎臓によって濾過される比較的低分子量のタンパク質の他の例には、レプチン、エリスロポエチン、およびＩＬ−６等がある。

当分野では、タンパク質の生物医薬品を改変して血清クリアランスを遅らせることが知られている。例えば、Syedら［Blood, 89, 3243-3252（1997）］は、アルブミンとヒルジンを融合させた抗凝血性融合タンパク質を構築した。この融合タンパク質は、強力な抗トロンビン（抗凝固剤）活性を維持しながら、延長された血漿半減期を示した。しかしながら、この戦略には、ヒルジンが強力な免疫応答を引き起こすことが知られている外来タンパク質であるという問題がある。同様に、血液凝固第ＶＩＩ因子および第ＶＩＩａ因子をアルブミンに融合させて血清半減期を延長させた［国際公開２００７／０９０５８４およびWeimerら、Thromb Haemost, 99：659-667（2008）]。

タンパク質の有効分子量を増加させ、免疫原性を低下させた産物を産生するさらなる方法は、タンパク質をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にコートすることである。ＧＨのインビボ半減期は、「ペグ化」と称される、ポリエチレングリコールとＧＨとをコンジュゲートさせることによって増加されている［Abuchowskiら、J.Biol Chem, 252：3582-3586（1977）参照］。ＰＥＧは、典型的には非免疫原性の非荷電ポリマーとして特徴付けられる。ＰＥＧは、ペグ化タンパク質に流体力学的体積の増加をもたらすことによって腎クリアランスを遅らせると考えられている［Maxfieldら、Polymer, 16：505-509（1975）］。米国特許第５８４９５３５号はまた、１つ以上のポリオールにコンジュゲートさせたヒトＧＨ（ｈＧＨ）変異体を記載している。

ＧＨのペグ化には、ペグ化されたＧＨのその受容体に対する親和性が低下し、それによって高投与量レジメンの投与が必要となるという問題がある。これは他のペグ化タンパク質、例えば顆粒球コロニー刺激ホルモン（ＧＣＳＦ）、インターフェロンおよびソマトスタチンにも当てはまる。有害な免疫応答または低下した生物学的活性をもたらさないタンパク質生物医薬品のクリアランスを減少させることが望まれている。

ＧＨは、小児期の線形成長および成人の正常な身体組成にとって重要な同化作用性サイトカインホルモンである。ＧＨは、細胞表面１型サイトカイン受容体（ＧＨＲ）を介して働く。他のサイトカイン受容体と同様に、ＧＨＲの細胞外ドメインは、タンパク分解性に切断され、結合タンパク質（ＧＨＢＰ）として循環する。生理学的条件下では、ＧＨは、ＧＨＢＰと１：１のモル比で循環内で一部結合しており、この複合体は、生物学的に不活性であり、クリアランスおよび分解から保護されている。ＧＨは、部位１および部位２と称されるＧＨ上の２つの別々の部位を介して、２つの膜結合性成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）と連続的に結合する。部位１は、高親和性結合部位であり、部位２は、低親和性部位である。単一のＧＨ分子は、部位１を介して１ＧＨＲに結合する。次いで第２のＧＨＲが、部位２を介して動員されて、ＧＨＲ：ＧＨ：ＧＨＲ複合体を形成する。次いで複合体は、内部移行され、遺伝子発現における変化につながるシグナル伝達カスケードを活性化する。ＧＨＲの細胞外ドメインは、それぞれ約１００アミノ酸（ＳＤ−１００）の２つの連結したドメインである、細胞表面の最も近くにあるＣ末端ＳＤ−１００ドメインと最も遠くにあるＮ末端ＳＤ−１００ドメインとして存在する。三量体の複合体ＧＨＲ−ＧＨ−ＧＨＲの形成とともにホルモン結合時に起こるのは、これら２つのドメインにおける立体構造変化である。成長ホルモンのようなサイトカインホルモンは血漿半減期が短く、頻繁な投与が必要である。例えば、ＧＨ置換は毎日の注射が必要である。他のサイトカインと共通して、細胞外ドメインＧＨ受容体は、結合タンパク質として循環し、ＧＨの生物学的半減期を自然に延長する。

国際公開２００９／０１３４６１において、発明者らはＧＨ融合タンパク質を開示している。これらＧＨ分子は、ＧＨＲの細胞外ドメインに融合して二量体を形成するリガンド／受容体融合体を形成する。本明細書では、通常はＧＨＲに結合しないポリペプチド（つまり成長ホルモンでないもの）に融合させたＧＨＲの細胞外ドメインを含む融合タンパク質を記載する。ＧＨＲとの融合によりこれらタンパク質には、変更した薬物動態および生物学的活性といった特性が付与される。

本発明の一態様によれば、成長ホルモンではないアミノ酸配列を含むポリペプチドに、直接的あるいは間接的に連結した、成長ホルモン受容体の細胞外結合ドメインまたはその活性な結合部位のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドが提供される。

本発明の好ましい実施形態では、前記ポリペプチドは、ヒト成長ホルモン受容体の細胞外結合ドメインを含むかあるいはそれからなる。

本発明の好ましい実施形態では、前記ポリペプチドは、図１ａ（配列番号１または配列番号２１）に示されるアミノ酸配列を含むかあるいはそれからなる。

本発明の好ましい実施形態では、細胞外結合ドメインを含む前記ポリペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失または置換によって修飾され、前記修飾ポリペプチドは実質的に成長ホルモン結合活性を欠くか、または成長ホルモン結合活性が低下している。

本発明の好ましい実施形態では、前記ポリペプチドは、前記細胞外結合ドメインの成長ホルモン結合ドメインにおいて修飾されている。

本発明の好ましい実施形態では、前記修飾は、Ｗ１６９、Ｒ４３、Ｅ４４、Ｉ１０３、Ｗ１０４、Ｉ１０５、Ｐ１０６、Ｉ１６４およびＤ１６５からなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸配列である。

本発明の好ましい実施形態では、前記修飾は、配列番号１または配列番号２１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基トリプトファン１０４の欠失を含むかあるいはそれからなる。

本発明の好ましい実施形態では、前記アミノ酸残基トリプトファン１０４は、１つまたは複数のアミノ酸残基で置換されている。

本発明の好ましい実施形態では、トリプトファン１０４は、配列番号２または配列番号２２に示されるようにアラニンに置換される。

本発明の別の好ましい実施形態では、前記修飾は、配列番号１または配列番号２１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１２５〜１３１の修飾を含む。

好ましくは、前記修飾は、配列番号１または配列番号２１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１２５〜１３１の全部または一部の欠失である。

本発明の好ましい実施形態では、ポリペプチドは、成長ホルモン受容体の細胞外結合ドメインに連結され、前記融合ポリペプチド中の受容体結合ドメインのアミノ末端に位置する。

本発明の別の好ましい実施形態では、ポリペプチドは、成長ホルモン受容体の細胞外結合ドメインに連結され、前記融合ポリペプチド内の受容体結合ドメインに対してカルボキシル末端に位置する。

本発明の一実施形態では、天然アミノ末端シグナルペプチドを含む前記融合ポリペプチドは、非天然アミノ末端シグナルペプチドで置換される。

本発明は、場合によって代替アミノ末端シグナルペプチドの使用を含む、翻訳効率を高める融合ポリペプチドの改変を含む。例えば、サイトカインは、通常、配列特異的プロテアーゼ切断によって前駆体ポリペプチドからプロセシングされるアミノ末端シグナルペプチドを有する。本開示の非限定的な例において、これは、ＧＳＣＦまたはレプチンアミノ末端シグナルペプチドの、成長ホルモンのアミノ末端シグナルペプチドによる置換を含み得る。

本発明の好ましい実施形態では、前記融合ポリペプチドは、アミノ酸配列MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA（配列番号：３９）を含むアミノ末端シグナルペプチドとともに提供されるか、またはこれに代わるものである。

本発明の好ましい実施形態では、前記ポリペプチドは、ペプチドリンカー、 好ましくはフレキシブルペプチドリンカーによって受容体結合ドメインに連結されている。

本発明の好ましい実施形態では、前記ペプチド連結分子は、ペプチドＧｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒの少なくとも１つのコピーを含む。

本発明の好ましい実施形態では、前記ペプチド連結分子は、ペプチドＧｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒの２、３、４、５、６または７つのコピーを含む。

本発明のなおさらなる別の実施形態では、前記融合ポリペプチドは、ペプチド連結分子を含まず、ポリペプチドと受容体結合ドメインとの直接的な融合物である。

本発明のさらなる実施形態では、前記融合ポリペプチドはサイトカインを含む。

サイトカインは、多くの多様な細胞機能に関与している。 これらには、免疫系の調節、エネルギー代謝の制御、および成長や発生の制御が含まれる。サイトカインは、標的細胞上の細胞表面で発現される受容体を介してその効果を媒介する。 サイトカイン受容体は、3つの異なるサブグループに分けることができる。タイプ１（成長ホルモン（ＧＨ）ファミリー）受容体は、その細胞外ドメインのアミノ末端部分に４つの保存されたシステイン残基とＣ末端部分に保存されたＴｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒモチーフの存在を特徴とする。繰り返されるＣｙｓモチーフは、タイプ２（インターフェロンファミリー）およびタイプＩＩＩ（腫瘍壊死因子ファミリー）にも存在する。

本発明の好ましい実施形態では、前記サイトカインは、レプチン、エリスロポイエチン、プロラクチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、カルディオトロフィン−１（ＣＴ−１）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）およびオンコスタチンＭ（ＯＳＭ ）からなる群から選択される。

本発明の好ましい実施形態では、前記融合ポリペプチドはＧＣＳＦを含む。

本発明の好ましい実施形態では、前記融合ポリペプチドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む。

本発明の好ましい実施形態では、前記融合ポリペプチドに、非天然アミノ末端シグナルペプチドが提供される。

好ましくは、前記非天然アミノ末端シグナルペプチドは、アミノ酸配列MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA（配列番号：３９）を含む。

本発明の好ましい実施形態では、前記融合ポリペプチドは、配列番号９または配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含む。

本発明の好ましい実施形態では、前記融合ポリペプチドは、配列番号１７または配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む。

本発明のさらに好ましい実施形態では、前記融合ポリペプチドは、配列番号３２、３４、３６または３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

本発明の好ましい実施形態では、前記融合ポリペプチドに、非天然アミノ末端シグナルペプチドが提供される。

好ましくは、前記非天然アミノ末端シグナルペプチドは、アミノ酸配列MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA （配列番号：３９）を含む。

本発明の好ましい実施形態では、前記融合ポリペプチドはレプチンを含む。

本発明の好ましい実施形態では、前記融合ポリペプチドは、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む。

本発明の好ましい実施形態では、前記融合ポリペプチドは、配列番号５または配列番号７または配列番号１９または配列番号２０の群から選択されるアミノ酸配列を含む。

本発明の好ましい実施形態では、前記融合ポリペプチドは、配列番号２４、２６、２８または３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

本発明の好ましい実施形態では、前記融合ポリペプチドに、非天然アミノ末端シグナルペプチドが提供される。

好ましくは、前記非天然アミノ末端シグナルペプチドは、アミノ酸配列MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA（配列番号：３９）を含む。

本発明の一態様によれば、本発明に係る融合ポリペプチドをコードする核酸分子、または、核酸分子にハイブリダイズし、かつ、関連する生物学的活性を有するポリペプチドをコード化する核酸分子が提供される。

本発明の好ましい実施形態では、本発明に係る融合ポリペプチドをコード化する核酸分子が提供される。

核酸分子のハイブリダイゼーションは、２つの相補核酸分子が互いに一定量、水素結合される場合に起こる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、核酸を囲んでいる環境条件、ハイブリダイゼーション方法の性質、および使用する核酸分子の組成および長さに従って、変動しうる。ストリンジェンシーの特定の程度を達成するために必要なハイブリダイゼーション条件に関する計算は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、２００１）；およびＴｉｊｓｓｅｎ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐａｒｔ Ｉ、Ｃｈａｐｔｅｒ ２（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３）において考察されている。Ｔ_ｍは、核酸分子の所与の鎖の５０％が、その相補鎖にハイブリダイズされる温度である。以下のものは、ハイブリダイゼーション条件の典型的な設定であり、限定するものではない。

非常に高いストリンジェンシー（少なくとも90％、95％、96％、97％、98％または99％の同一性を共有する配列がハイブリダイズすることを可能にする）
ハイブリダイゼーション：５×ＳＳＣ、６５℃で１６時間
２回洗浄：それぞれ、２×ＳＳＣ、室温（ＲＴ）で１５分間
２回洗浄：それぞれ、０．５×ＳＳＣ、６５℃で２０分間
高いストリンジェンシー（少なくとも８０％の同一性を共有する配列がハイブリダイズすることを可能にする）
ハイブリダイゼーション：５×〜６×ＳＳＣ、６５℃〜７０℃で１６〜２０時間
２回洗浄：それぞれ、２×ＳＳＣ、ＲＴで５〜２０分間
２回洗浄：それぞれ、１×ＳＳＣ、５５℃〜７０℃で３０分間
低いストリンジェンシー（少なくとも５０％の同一性を共有する配列がハイブリダイズすることを可能にする）
ハイブリダイゼーション：６×ＳＳＣ、ＲＴから５５℃で１６〜２０時間
少なくとも２回洗浄：それぞれ、２×〜３×ＳＳＣ、ＲＴから５５℃で２０〜３０分間。

本発明のさらなる態様によれば、本発明に係る核酸分子を含むベクターが提供される。

本発明の好ましい実施形態では、前記ベクターは、本発明に係る核酸分子を発現するように構成された発現ベクターである。

本発明に係る核酸（複数可）を含むベクターは、特に、ベクターが、安定なトランスフェクションのためにゲノム中への組換えのために細胞中に核酸を導入するために使用される場合、プロモーターまたは他の制御配列を含むことを必要としない。好ましくは、ベクターにおける核酸は、宿主細胞における転写のための適切なプロモーターまたは他の調節エレメントに作動可能に連結している。ベクターは、複数の宿主において機能する二機能発現ベクターとすることができる。「プロモーター」とは、転写開始部位から上流にあり、転写のために必要なすべての調節領域を含有するヌクレオチド配列を意味する。好適なプロモーターには、真核または原核細胞における発現のための、構成的、組織特異的、誘導性、発生的なプロモーターまたは他のプロモーターが包含される。「作動可能に連結している」とは、プロモーターから開始される転写に関して適切に位置し方向付けられた、同じ核酸分子の一部として結合していることを意味する。プロモーターに作動可能に連結しているＤＮＡは、プロモーターの「転写開始調節下」にある。

好ましい実施形態では、プロモーターは、構成的、誘導性または、調節可能なプロモーターである。

本発明のさらなる態様によれば、本発明による核酸分子またはベクターをトランスフェクトされたまたはそれで形質転換された細胞が提供される。

好ましくは、前記細胞は真核細胞である。あるいは、前記細胞は原核細胞である。

本発明の好ましい実施形態では、前記細胞は、真菌細胞（例えばピキア種、サッカロミセス種、ニューロスポラ種）、昆虫細胞（例えばスポドプテラ種）、哺乳類細胞（例えばＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞）、植物細胞からなる群から選択される。

本発明の好ましい実施形態では、前記細胞は、安定にトランスフェクトされる。本発明の代替的な好ましい実施形態では、前記細胞は、一過性にトランスフェクトされる。

本発明の一態様によれば、医薬として使用するための本発明に係る融合ポリペプチドが提供される。

本発明のさらなる態様によれば、賦形剤または担体を含有する、本発明に係るポリペプチドを含む医薬組成物が提供される。

本発明の好ましい実施形態では、前記医薬組成物は、さらなる治療薬と組み合わされる。

投与する場合、本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される製剤において投与される。かかる製剤は、薬学的に許容される濃度の塩、緩衝剤、防腐剤、適合性の担体、および任意選択の他の治療薬、例えば化学療法剤を、常法に従って含有することができる。

本発明の医薬組成物は、注射を含めた、任意の従来法の経路によって投与することができる。投与および適用は、例えば、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、関節内、皮下、局所（眼）、真皮（例えば皮膚または粘膜中へのクリーム脂質可溶性挿入物）、経皮、または鼻腔内とすることができる。

本発明の医薬組成物は、有効量で投与する。「有効量」は、単独で、またはさらなる用量もしくは相乗的薬物と共に、所望の応答をもたらす医薬品／組成物の量である。これは、疾患の進行を一時的に遅くすることのみを伴うことができるが、より好ましくは、それは、疾患の進行を永久に停止することを伴う。これは、通例の方法によってモニターすることができるかまたは診断法に従ってモニターすることができる。

対象に投与する医薬品組成物の用量は、種々のパラメーターに従って、特に、使用する投与の様式および対象の状況（すなわち年齢、性別）に従って選択することができる。投与する場合、本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される量および薬学的に許容される組成物において適用する。医薬において使用する場合、塩は、薬学的に許容されるべきであるが、薬学的に許容されない塩は、好都合に使用してその薬学的に許容される塩を調製することができ、本発明の範囲から除外されない。かかる薬理学的におよび薬学的に許容される塩は、以下の酸：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸などから調製されるものを含むが、これらに限定されない。また、薬学的に許容される塩は、ナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩などの、アルカリ金属またはアルカリ土類塩として、調製することができる。

医薬組成物は、所望の場合、薬学的に許容される担体と組み合わせることができる。「薬学的に許容される担体」という用語は、本明細書では、ヒトへの投与に適した１つまたは複数の適合性の固体ないしは液体増量剤、賦形剤またはカプセル化物質を意味する。「担体」という用語は、活性成分がそれと組み合わされて適用を促進する、天然または合成、有機または無機成分を意味する。医薬組成物の構成成分は、所望の薬学的効率を実質的に損なう相互作用がないように、本発明の分子と、および互いに、混合されることもできる。

医薬組成物は、塩中に酢酸、塩中にクエン酸、塩中にホウ酸、および塩中にリン酸を含む、適した緩衝剤を含有することができる。

医薬組成物は、任意選択で、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンおよびチメロサールなどの、適した防腐剤も含有することができる。

医薬組成物は、単位剤形で好都合に提供することができ、薬学の分野でよく知られている任意の方法によって、調製することができる。すべての方法は、活性薬剤を、１つまたは複数の副成分を構成する担体と結合させるステップを含む。一般に、組成物は、活性化合物を液体担体、微粉化した固体担体、または両方と均一におよび本質的に結合させ、次いで必要な場合、生成物を付形することによって、調製される。

経口投与に適した組成物は、それぞれ所定の量の活性化合物を含有する、カプセル剤、錠剤、トローチ剤などの、別々の単位として提供することができる。他の組成物は、シロップ剤、エリキシル剤またはエマルションなどの、水性液体または非水性液体における懸濁剤を含む。

非経口投与に適した組成物は、レシピエントの血液と好ましくは等張である無菌水性または非水性製剤を好都合に含む。この製剤は、適した分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用して、既知の方法に従って、製剤化することができる。無菌の注射用製剤は、例えば、１，３−ブタンジオール中溶液として、無毒の非経口的に許容される賦形剤または溶媒における無菌の注射用溶液または懸濁液とすることもできる。用いることができる許容される溶媒としては、水、リンガー溶液、および等張食塩水が挙げられる。さらに、無菌の固定油が、溶媒または懸濁媒として従来用いられている。この目的のために、合成モノ−またはジ−グリセリドを含めた、任意の無刺激性の固定油（bland fixed oil）を用いることができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸を、注射薬の製剤において使用することができる。経口、皮下、静脈内、筋肉内などの投与に適した担体製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡにおいて見出すことができる。

本明細書の記載および特許請求の範囲を通して、「含む（comprise）」および「含有する」という言葉およびその言葉の変形物、例えば「含むこと（comprising）」および「含む（comprises）」は、「を含むが限定されない」を意味し、他の部分、追加物、構成成分、整数またはステップを排除することは意図されていない（および排除しない）。

本明細書の記載および特許請求の範囲を通して、単数形は、文脈が要求しない限り、複数形を包含する。特に、不定冠詞が使用されるところで、明細書は、文脈が要求しない限り、複数および単数を企図しているものと理解されるべきである。

本発明の特定の態様、実施形態または例とともに記載された特色、整数、特徴、化合物、化学部分または基は、それとともに不適合でない限り、本明細書で記載した任意の他の態様、実施形態または例に適用可能であると理解されるべきである。

本発明の実施形態を、ここで、例のみによっておよび以下の図を参照して記載する。

図１ａは、ヒトＧＨＲ細胞外ドメイン（配列番号２１）のアミノ酸配列である。 図１ｂ（配列番号２２）はＷ１０４で改変されたヒトＧＨＲ細胞外ドメインであり、シグナルペプチドは太字で示されており、任意である。図１ｃはＧＣＳＦ（配列番号３）である。図１ｄはレプチン（配列番号４）である。図１ｅ（配列番号１）は、シグナル配列を持たないヒトＧＨＲ細胞外ドメインのアミノ酸配列である。図１ｆ（配列番号２）は、Ｗ１０４で改変されたシグナル配列を持たないヒトＧＨＲ細胞外ドメインのアミノ酸配列である。 Ａ）レプチン結合ＧＨＢＰ（２Ｎ１）の概略図。Ｂ）２Ｎ１のアミノ酸配列（配列番号：５）。Ｃ）２Ｎ１のヌクレオチド配列（配列番号：６）。 Ａ）レプチン結合ＧＨＢＰ−Ｈｉｓ（２Ｎ１−Ｈｉｓｔ）の概略図。Ｂ）２Ｎ１−Ｈｉｓｔのアミノ酸配列（配列番号７）。Ｃ）２Ｎ１−Ｈｉｓｔのヌクレオチド配列（配列番号８）。 Ａ）２Ｎ１および２Ｎ１−Ｈｉｓｔの一過性発現のウエスタンブロット。レーン１：レプチン（５０ｎｇ／レーン）、レーン２：レプチン（１０ｎｇ／レーン）、レーン３：ＭＷ基準、レーン４：２Ｎ１（ｃｌｏｎｅ １＿１）、レーン５：２Ｎ１（ｃｌｏｎｅ １＿３）、レーン６：２Ｎ１−Ｈｉｓｔ（ｃｌｏｎｅ ２＿２）、レーン７：ネガティブコントロール。Ｂ）安定なＣＨＯ Ｆｌｐ Ｉｎ細胞株由来の２Ｎ１の発現のウエスタンブロット。（両方のウエスタンブロットにはレプチンを認識する抗体を用いた。） ２Ｎ１のインビトロバイオアッセイ−２Ｎ１を一時的に発現する細胞からの０．２ｍｌ培地を１ｍｌの反応容量に使用した。 Ａ）ＧＣＳＦ結合ＧＨＢＰの概略図。Ｂ）ＧＣＳＦ結合ＧＨＢＰのアミノ酸配列（配列番号９）。Ｃ）ＧＣＳＦ結合ＧＨＢＰのヌクレオチド配列（配列番号１０）。シグナル配列に下線を付す。 Ａ）ＧＣＳＦ結合ＧＨＢＰ（Ｗ１０４Ａ）の概略図。Ｂ）ＧＣＳＦ結合ＧＨＢＰ（Ｗ１０４Ａ）のアミノ酸配列（配列番号１１）。Ｗ１０４Ａ突然変異は太字と下線で示す。Ｃ）ＧＣＳＦ結合ＧＨＢＰ（Ｗ１０４Ａ）のヌクレオチド配列（配列番号１２）。シグナル配列に下線を付し、Ｗ１０４Ａ突然変異は太字と下線で示す。 Ａ）一時的に発現されたＧＣＳＦ結合ＧＨＢＰおよびＧＣＳＦ結合ＧＣＳＦ（Ｗ１０４Ａ）のウエスタンブロット。レーン１：ＧＣＳＦ結合ＧＨＢＰ＃１、レーン２：ＧＣＳＦ結合ＧＨＢＰ＃２、レーン３：ＧＣＳＦ結合ＧＨＢＰ（Ｗ１０４Ａ）＃１、レーン４：ＧＣＳＦ結合ＧＨＢＰ（Ｗ１０４Ａ）＃２、レーン５：ポジティブコントロール（ＧＣＳＦ結合ＧＣＳＦＲ）＃１、レーン６：ポジティブコントロール（ＧＣＳＦ結合ＧＣＳＦＲ）＃２、レーン７：ネガティブコントロール（培地のみ）＃１、レーン８：ネガティブコントロール（培地のみ）＃２。Ｂ）安定に発現されたＧＣＳＦ結合ＧＨＢＰおよびＧＣＳＦ結合ＧＣＳＦ（Ｗ１０４Ａ）のウエスタンブロット。レーン１：接着細胞由来のＧＣＳＦ結合ＧＨＢＰ、レーン２：接着細胞由来のＧＣＳＦ結合ＧＨＢＰ（Ｗ１０４Ａ）、レーン３：懸濁細胞由来のＧＣＳＦ結合ＧＨＢＰ、レーン４：懸濁細胞由来のＧＣＳＦ結合ＧＨＢＰ（Ｗ１０４Ａ）。 ＧＣＳＦ結合ＧＣＳＦ（Ｗ１０４Ａ）の精製。融合タンパク質は、Ｎｉ−樹脂カラムを用いたＩＭＡＣによって精製した。写真は、この精製からの関連する溶出画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。 ＧＣＳＦ結合ＧＣＳＦ（Ｗ１０４Ａ）の精製。融合タンパク質は、Ｎｉ−樹脂カラムを用いたＩＭＡＣによって精製した。写真は、この精製からの関連する溶出画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。 ＧＣＳＦ融合ポリペプチドの温度安定性（非還元ゲル）。 温度安定性（還元ゲル）。レーン１：未処理ＧＣＳＦ＿ＧＨＢＰ、レーン２：室温、レーン３：４℃、レーン４：−８０℃（凍結／解凍）、レーン５：未処理ＧＣＳＦ＿Ｗ１０４Ａ＿ＧＨＢＰ、レーン６：室温、レーン７：４℃ 、レーン８：−８０℃（凍結／解凍）。 延長安定性試験（非還元ゲル）。レーン１：未処理ＧＣＳＦ＿ＧＨＢＰ、レーン２：室温、レーン３：４℃、レーン４：−８０℃（冷凍／解凍）、レーン５：未処理ＧＣＳＦ＿Ｗ１０４Ａ＿ＧＨＢＰ、レーン６：室温、レーン７：４℃ 、レーン８：−８０℃（冷凍／解凍）。 ＡＭＬ−１９３増殖アッセイ。ＡＭＬ１９３（末梢血；急性単球性白血病）細胞は、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦまたはＧＣＳＦで刺激すると増殖する。 ＦＡＣＳ分析。コントロール、フィルグラスチムおよび４Ｆ１の注入後２４時間、４８時間、７２時間および９６時間で測定した血液中の％好中球。 ＦＡＣＳ分析。コントロール、フィルグラスチムおよび４Ｆ１の注入後２４時間、４８時間、７２時間および９６時間で測定した骨髄（ＢＭ）中の％好中球。 ＦＡＣＳ分析。コントロール、フィルグラスチムおよび４Ｆ１の注入後２４時間、４８時間、７２時間および９６時間で測定した血液へのＨＰＣの動員。 ＦＡＣＳ分析。コントロール、フィルグラスチムおよび４Ｆ１の注入後２４時間、４８時間、７２時間および９６時間で測定したＢＭにおけるＨＰＣの動員。 ＰＫ試験。５０時間以上の血清中で測定したフィルグラスチムおよび４Ｆ１の濃度。 クーマシー染色１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元性）。精製産物２Ｎ２の分析（実験＃２から）、レーン１：最終精製産物（１レーンあたり約５μｇ）、レーン２：広範囲のＢｉｏＲａｄ基準。 二重ルシフェラーゼレポーターアッセイで分析した２Ｎ２の生物活性； Ｗ１０４Ａ転移を含む２Ｎ２のタンパク質配列（配列番号１９）。 ２Ｎ２のタンパク質配列（配列番号２０）。 ２Ｎ３のヌクレオチド配列（配列番号２３）。 ２Ｎ３の翻訳されたタンパク質配列（配列番号２４）。 ２Ｎ４のヌクレオチド配列（配列番号２５）。 ２Ｎ４の翻訳されたタンパク質配列（配列番号２６）。 ２Ｎ５のヌクレオチド配列（配列番号２７）。 ２Ｎ５の翻訳されたタンパク質配列（配列番号２８）。 ２Ｎ６のヌクレオチド配列（配列番号２９）。 ２Ｎ６の翻訳されたタンパク質配列（配列番号３０）。 ４Ｆ２のヌクレオチド配列（配列番号３１）。 ４Ｆ２の翻訳されたタンパク質配列（配列番号３２）。 ４Ｆ２＿Ｗ１０４Ａのヌクレオチド配列（配列番号３３）。 ４Ｆ２＿Ｗ１０４Ａの翻訳されたアミノ酸配列（配列番号３４）。 ４Ｆ３のヌクレオチド配列（配列番号３５）。 ４Ｆ３の翻訳されたタンパク質配列（配列番号３６）。 ４Ｆ３＿Ｗ１０４Ａのヌクレオチド配列（配列番号３７）。 ４Ｆ３＿Ｗ１０４Ａの翻訳されたアミノ酸配列（配列番号３８）。

材料および方法
発現プラスミドの作製
レプチンとＧＣＳＦ融合タンパク質はいずれも、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてリガンド遺伝子のいずれかの末端にＮｈｅＩおよびＮｏｔＩ制限部位を導入し、次いでＧＨ結合ＧＨＢＰのためにこれを前記遺伝子に挿入してこの遺伝子のＧＨ配列を置換することによって構築された遺伝子から発現させた。遺伝子操作は、プラスミドベクターｐＧＨＳｅｃＴａｇ１Ｂ８ｖ０（＋／−Ｈｉｓ６タグ）（ＧＨ結合ＧＨＢＰの遺伝子を含むｐＳｅｃＴａｇ／ＦＲＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ ＴＯＰＯ（インビトロジェン））内で行った。 以下のプライマーを用いた。

レプチンプライマー
（配列番号１３）フォワードプライマー
5’-GGGAAAGCTAGCCACCATGCATTGGGGAACCCTGTG-3’
（配列番号１４）リバースプライマー
5’-ATTGATTAGCGGCCGCCGCACCCAGGGCTGAGGTCC-3’

ＧＣＳＦプライマー
（配列番号１５）フォワードプライマー
5’-AAGCTGGCTAGCCACCATGGC-3’
（配列番号１６）リバースプライマー
5’-AATTAATAGCGGCCGCCGGGCTGGGCAAG-3’

先に合成したＧＨＢＰＷ１０４Ａ遺伝子をＡｖｒＩＩおよびＥｃｏＲＶを用いて消化することによって融合タンパク質にＷ１０４Ａ変異を導入し、次いで、変異を含む断片を、融合タンパク質配列のＧＨＢＰの同じ制限酵素部位の間に挿入した。

プラスミドを大腸菌ＸＬ１ブルー細胞で維持し、哺乳動物チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現を行った。

融合タンパク質の発現
融合タンパク質の一過性発現は、トランスフェクション剤（ＭｉｒｉｕｓまたはＦｕｇｅｎｅ−６）を用いて発現プラスミドをＣＨＯ Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞（インビトロジェン）に導入することによって行った。ＣＨＯ細胞を、最初に２４ウェル培養プレートのウェルに２×１０^５細胞／ｍｌで１ｍｌ／ウェル用いて播種し、プレートを３７℃／５％ＣＯ_２で一晩インキュベートして細胞を付着させた。翌日、６μｌのＦｕｇｅｎｅ−６またはＭｉｒｉｕｓを１００μｌの無血清培地に加え、混合した。次いで、４μｇのプラスミドＤＮＡを添加し［形質転換体：ＤＮＡ比３：２］、溶液を混合した。室温で１５分後、トランスフェクション混合物をＣＨＯ細胞を含む個々のウェルに滴下して加えた。細胞を３７℃／５％ＣＯ_２で一晩インキュベートし、培地を無血清培地と交換した。培地を７２時間後に回収し、目的のタンパク質の発現について分析した。

融合タンパク質の安定な発現は、一過性発現の場合と同じ方法で行った。ただし、トランスフェクション後一晩インキュベートした後、培地を６００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを含む培地と交換した。この選択圧を、ほとんどの細胞が死滅し、安定にトランスフェクトされた細胞のみが再増殖し始めるまで維持した。ＣＨＯ細胞の安定して発現する集団が得られたら、これをより低い濃度のハイグロマイシンＢを用いて維持した。その後、細胞をＨｙｃｌｏｎｅ ＳＦＭ４ＣＨＯユーティリティ培養培地中の懸濁増殖に適合させ、この懸濁培養を精製用融合タンパク質の製造に用いた。

ウエスタンブロット／イムノブロット
タンパク質試料をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離し、次いで、ゲル上のタンパク質を電気転写によってＰＶＤＦまたはニトロセルロース膜に移した。５％（ｗ／ｖ）の粉乳でブロッキングした後、目的のタンパク質（レプチンまたはＧＣＳＦ）を認識する一次抗体で膜をプローブした。次いで膜を洗浄し、その後一次抗体に結合した二次ＨＲＰコンジュゲート抗体を使用した。もう一度洗浄した後、膜をＥＣＬ試薬に暴露し、暗室でＸ線フィルムに感光させた。これにより、対象のタンパク質の位置に抗体が連続的に結合した黒色バンドを生じさせた。

ＥＬＩＳＡを用いた検出／定量
サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して、レプチンおよびＧＣＳＦ融合タンパク質の両方を検出および定量した。レプチンの場合、抗レプチン捕捉抗体を９６ウェルプレートのウェルに結合させ、次いでプレートを３％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンでブロックし、タンパク質試料（標準曲線および未知数）をウェルに添加し、次いで別の抗レプチン検出抗体をウェルに添加した。その後、二次ＨＲＰコンジュゲート抗体をウェルに添加し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に反応する比色試薬を用いてレプチンの量を測定した。比色変化は、タンパク質試料中のレプチンの量に比例する。ＧＣＳＦ融合物は同じ方法で測定したが、ただし抗ＧＣＳＦ捕捉抗体および検出抗体を使用した。

タンパク質精製
対象のタンパク質を安定に発現するＣＨＯ細胞株を約０．５×１０^６／ｍｌの密度で播種し、最大容量５００ｍｌ／瓶のローラーボトル中３７℃／５％ＣＯ_２で増殖させた。細胞の生存率が約２０〜３０％に低下したら、培養培地を採取し、およそ１０倍濃縮した。濃縮した培養培地を等容量の４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１Ｍ ＮａＣｌ、２０％グリセロール、２０ｍＭイミダゾールで希釈し、１０カラム容量の２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０％グリセロール（緩衝液Ａ）にて予め平衡化した５ｍｌのＮｉ−キレートカラムに充填した。カラムは、１０ｍＭイミダゾールを含む１０カラム容量の緩衝液Ａの後、１０カラム体積の２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０％グリセロール（ｐＨ６）（緩衝液Ｂ）にて洗浄した。次に、漸増濃度のイミダゾールを含む緩衝液Ｂを用いて、結合したタンパク質を溶出させた。使用前に全ての緩衝液をろ過し、充填前に遠心分離により試料を浄化した。

レプチンバイオアッセイ
レプチン結合ＧＨＢＰ融合物の生物活性を、二重ルシフェラーゼバイオアッセイを用いて測定した。簡潔に述べると、ＨＥＫ２９３細胞に、レプチン受容体を発現するプラスミド、ＳＩＥの制御下にホタルルシフェラーゼを発現するプラスミド（レポータープラスミド）、ＣＭＶプロモーターの制御下にレニラルシフェラーゼを発現するプラスミド（コントロールプラスミド）、およびＳＴＡＴ３を発現するプラスミド（細胞内の内因性ＳＴＡＴ３レベルを増加させるため）をトランスフェクトした。これらを飢餓培地中で一晩増殖させ、次いで異なる濃度のレプチンまたはレプチン結合ＧＨＢＰ融合物を発現する細胞からの培地で刺激した。刺激レベルを増加すると、ＳＩＥレポータープラスミドを介したホタルルシフェラーゼの発現の増加がもたらされた。

６時間の刺激の後、細胞を溶解し、ルミノメーターで二重ルシフェラーゼアッセイキット（プロメガ）を用いてホタルおよびレニラルシフェラーゼ活性のレベルを測定した。ホタルルシフェラーゼシグナルをレニラルシフェラーゼシグナルで除算して試料間の変動を補正し、次にこれを非刺激試料のシグナルで除算してバックグラウンドに対する倍数的誘導を求めた。

ＧＣＳＦバイオアッセイ
ＧＣＳＦ結合ＧＨＢＰの生物活性は、細胞増殖アッセイを用いて測定した。簡潔に述べると、ＡＭＬ−１９３細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで５×１０^５細胞／ｍｌの培養培地（ＧＭ−ＣＳＦなし）に再懸濁した。５０μｌの細胞を９６ウェルプレートのウェルにピペットで入れ、次いで５０μｌの用量範囲のＧＣＳＦまたはＧＣＳＦ結合ＧＨＢＰにて刺激した。その後、プレートを３７℃／５％ＣＯ_２で３日間インキュベートした。その後、２０μｌのＣｅｌｌＴｉｔｒｅ９６ＡＱｕｅｏｕｓ非放射性増殖アッセイ試薬（プロメガ）をウェルに添加した。ＣｅｌｌＴｉｔｒｅ試薬によって引き起こされた比色変化は、分光光度計プレートリーダーを用いて測定し、測定されたＯＤはウェル中の細胞の数に比例し、細胞の数は同様にＧＣＳＦまたは融合分子の活性に比例していた。

タンパク質安定性試験
タンパク質構築物について安定性試験を行い、８日間にわたって高次構造の分解および形成を探索した。各構築物の試料を室温、４℃（冷蔵庫）および−８０℃（凍結／融解）に保った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびネイティブＰＡＧＥ、続いてクマシー染色およびウエスタンブロッティングを用いて分析を行った。

長期安定性試験
長期間にわたるタンパク質試料の安定性を評価するために、４℃、ＲｍＴおよび−８０℃Ｆ／Ｔ試料も、３か月のインキュベーション後に分析した。この実験からの試料は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてクマシー染色によってのみ分析した。

動物
特定の病原体を含まない（ＢＤＦ１）雄マウス（６〜９週齢の）を有効性および薬物動態試験に使用する。Ｇ−ＣＳＦの薬物動態が使用されるマウスの系統に依存することが知られており、ＢＤＦ１マウスがＧ−ＣＳＦに対して強い応答を有することが示されているので、ＢＤＦ１マウスをこれら試験に選択した（Haanら2000、Halpernら2002 、Lordら2001、Molineux ら1999）。実験開始前の１週間、マウスを順応させる。すべての動物の取り扱いおよび実験手順は、ユナイテッドキングダムアニマルズの規定に従ってホームオフィスライセンスの下で実施される。

タンパク質の調製
試験すべきタンパク質およびそれらの濃度を表１に示す。４Ｆ１−Ｗ１０４試料はＰＢＳ緩衝液中にある。

薬物動態学的および薬力学的試験のための４−Ｆ１−Ｗ１０４の実施濃度は、必要に応じてリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で希釈することによって得られる。フィルグラスチムの実施濃度は、必要に応じて５％デキストロースで希釈することによって得られる。

タンパク質投与
試験タンパク質のモル当量は、４Ｆ１−Ｗ１０４については４６．９ｋＤの平均分子量に基づき、フィルグラスチムについては１９ｋＤのＭＷとして報告されている。表５では、これらの試験で使用した用量投与のモル数（ｎｍｏｌ単位）をまとめた。

薬力学的試験のための試料の分析
Ｇ−ＣＳＦは好中球系細胞に作用し成熟好中球を活性化する造血サイトカインであるため、組換えＧ−ＣＳＦは補助化学療法に広く用いられている。構築物の生物学的活性は、増加するＷＢＣ数のＧ−ＣＳＦ活性を測定することによって評価することができる。

末梢血塗抹標本
尾静脈から血液をヘパリンで前処理したキャピラリーチューブに集め、Ｃａｐｉｊｅｃｔエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）チューブに移す。
全白血球（ＷＢＣ）の計数のために、１０μｌの血液を、赤血球（ＲＢＣ）溶解のために４滴のザポグロビンＩＩを含む１０ｍＬのＩｓｏｔｏｎＩＩ緩衝液に直接添加する。ＷＢＣ数はコールターカウンターを介して決定される。

顆粒球および造血前駆細胞の数は、Ｇｒ−１（顆粒球）およびｃ−ｋｉｔ（造血前駆細胞）抗体マーカーを用いたフローサイトメトリーによって評価した。染色のために、２０〜５０μｌの全血を、ＦＩＴＣコンジュゲートＧｒ．１／８Ｃ５、Ｒ−ＰＥにコンジュゲートしたｃ−ｋｉｔ／ＣＤ１１７、およびＰＥ−Ｃｙ５にコンジュゲートしたＭａｃ−１／ＣＤ１１ｂを含む抗体混合物に加える。細胞を室温で２０分間インキュベートした。
赤血球を、０．５ｍＬのＡＣＫ溶解緩衝液で簡単にインキュベートすることによって溶解する。溶解反応を２ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液で停止させ、細胞を遠心分離によってペレット化する。細胞をＦＡＣＳ緩衝液（０．１％アジ化ナトリウムおよび０．１％ＢＳＡを含むｄ−ＰＢＳ）に再懸濁し、ＦＡＣＳｃａｎ上に得た（Halpernら2002）。

骨髄生検
骨髄の大規模なピペッティングによって骨髄を調製した。

薬物動態試験
０．２５ｍｇ／ｋｇのフィルグラスチム、４Ｆ１−Ｗ１０４およびビヒクルコントロールマウス用のＰＢＳを、マウスの肩甲骨中央部に皮下（Ｓ．Ｃ）注射する。注射後２、６、１２、２４、３６、４８、７２および９６時間に、下大静脈を介して血液を採取する。血液試料を３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離（１６０００ｇ、１０分間）して血清を得、その後分析まで−８０℃で保存した。Ｇ−ＣＳＦおよび４Ｆ１−Ｗ１０４の血清濃度を、マウス血清の存在下でヒトＧ−ＣＳＦ ＥＬＩＳＡキットによって決定した。

ビヒクルコントロールマウスは、ＰＢＳの単回ＳＣ注射を受けた。 実験マウスは、０．２５ｍｇ／ｋｇの用量レベルのフィルグラスチムおよび４Ｆ１−Ｗ１０４の単回投与を受けた。マウスの末梢顆粒球および造血前駆細胞の数を連続して５回（０、２４、４８、７２、９６時間）毎日評価する。

２Ｎ２の発現と精製
安定したＣＨＯ細胞株が産生され、タンパク質はローラーボトル培養において分泌された産物として発現された。タンパク質は、抗ＧＨＢＰ抗体カラムを用いて細胞培養培地から精製し、ＰＢＳに透析し、濃縮した。

実施例１：レプチン結合ＧＨＢＰ（２Ｎ１）
タンパク質融合構築物であるレプチン結合ＧＨＢＰ（２Ｎ１）は、Ｈｉｓ×６タグなし（図２ｂ、配列番号５）およびＨｉｓ×６タグありで設計した。これら構築物の発現遺伝子を作製し、発現ベクターであるｐＳｅｃＴａｇに、従来の分子生物学技術、例えばＰＣＲ、制限酵素消化およびライゲーションを用いて挿入した。

発現は、形質転換体としてＦｕｇｅｎｅ−６および２：３のＤＮＡ：形質転換体比を使用して、ＣＨＯ ＦｌｐＩｎ細胞における一過性形質転換として最初に確立した。トランスフェクションを達成するために製造者の指示に従った。発現は、トランスフェクションの７２時間後に接着細胞培養物からの培地を用いたウェスタンブロット（図４Ａ）によって確認した。ウエスタンブロットのプローブには抗レプチン抗体を用いた。

ハイグロマイシンＢの存在下でトランスフェクトしたＣＨＯ ＦｌｐＩｎ細胞を増殖させることにより、２Ｎ１を発現する安定な細胞株を確立した。ハイグロマイシンＢの選択圧により、発現ベクターにより安定にトランスフェクトされたＣＨＯ ＦｌｐＩｎ細胞のみが生存することを確認した。これら細胞からの発現もウェスタンブロッティングによって確認した（図４Ｂ）。

融合タンパク質がレプチン様生物活性を有することを実証するために、一過的に発現するＣＨＯ ＦｌｐＩｎ細胞由来の培地をレプチンバイオアッセイに使用した。レプチン受容体を発現し、ホタルルシフェラーゼレポータープラスミドを含有する細胞を、２Ｎ１を一過的に発現する細胞由来の培地０．２ｍｌで刺激した。レプチン受容体の刺激により、レポータープラスミドからのホタルルシフェラーゼの産生が生じるシグナルカスケードが開始された。ホタルルシフェラーゼの産生は、レプチン受容体の刺激に比例していた。レニラルシフェラーゼを産生した構造的発現プラスミドを用いて、アッセイ間変動を補正した。レプチンはまた、ポジティブコントロールとして、また用量応答を示すためにアッセイに使用した。この二重ルシフェラーゼアッセイをルミノメーターを用いて測定し、レプチンおよび２Ｎ１の活性を、バックグラウンド光度に対する倍数的誘導として算出した（図５）。
このように、本発明者らは、レプチン結合ＧＨＢＰを製造することができ、この融合タンパク質が生物活性を有することを示す。

実施例２：レプチン結合ＧＨＢＰ（ＧＨＢＰ中のＷ１０４Ａ）（２Ｎ２）
２回の精製操作（実験＃１および実験＃２）から精製したタンパク質を、二重ルシフェラーゼレポーターアッセイで分析した。両方の調製物は、当該アッセイにおいてＰＢＳコントロールと比較して生物学的活性を示す。約４５０ｎＭの試料濃度をアッセイで使用した調製物はいずれも生物学的活性を示す（図２２）。

実施例３：ＧＣＳＦ結合ＧＨＢＰ
タンパク質融合構築物であるＧＣＳＦ結合ＧＨＢＰは、ＧＨＢＰ中にＷ１０４Ａ変異なし（図６ｂ、配列番号９）およびＷ１０４Ａ変異あり（図７Ｂ、配列番号１１）で設計した。これら構築物の発現遺伝子を作製し、発現ベクターであるｐＳｅｃＴａｇに、従来の分子生物学技術、例えばＰＣＲ、制限酵素消化およびライゲーションを用いて挿入した。

発現は、形質転換体としてＦｕｇｅｎｅ−６またはＭｉｒｕｓトランスフェクション試薬および２：３のＤＮＡ：形質転換体比を使用して、ＣＨＯ ＦｌｐＩｎ細胞における一過性形質転換として最初に確立した。トランスフェクションを達成するために製造者の指示に従った。発現は、トランスフェクションの７２時間後に接着細胞培養物からの培地を用いたウェスタンブロット（図８Ａ）によって確認した。ウエスタンブロットのプローブには抗ＧＣＳＦ抗体を用いた。

ハイグロマイシンＢの存在下でトランスフェクトしたＣＨＯ ＦｌｐＩｎ細胞を増殖させることにより、ＧＣＳＦ結合ＧＨＢＰ＋／−Ｗ１０４Ａを発現する安定な細胞株を確立した。ハイグロマイシンＢの選択圧により、発現ベクターにより安定にトランスフェクトされたＣＨＯ ＦｌｐＩｎ細胞のみが生存することを確認した。これら細胞からの発現もウェスタンブロッティングによって確認した（図８Ｂ）。

ＨｉｓタグＧＣＳＦ結合ＧＨＢＰ（Ｗ１０４Ａ）は、懸濁培養中で増殖した、大量の安定発現ＣＨＯ ＦｌｐＩｎ細胞から産生された。次いで、ＧＣＳＦ結合ＧＨＢＰ（Ｗ１０４Ａ）を、Ｎｉ−樹脂を用いた固定化金属イオンクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって精製した（図９）。

融合タンパク質がＧＣＳＦ様生物活性を有することを実証するために、一定範囲の濃度の融合タンパク質を用いてＡＭＬ−１９３細胞の増殖を刺激した。７２時間の刺激の後、ＣｅｌｌＴｉｔｒｅ試薬（プロメガ）を用いて細胞の増殖を測定した。ＣｅｌｌＴｉｔｒｅ試薬により、試料中の細胞の数に比例した比色変化が引き起こされる。そして試料中の細胞の数はＧＣＳＦの活性に比例する。ＧＣＳＦの用量範囲もポジティブコントロールとして、また融合タンパク質の活性を比較するために使用した。ＧＣＳＦおよびＧＣＳＦ結合ＧＨＢＰ（Ｗ１０４Ａ）の活性をタンパク質濃度に対する吸光度としてプロットし（図１０）、ＥＣ５０を算出した。ＧＣＳＦおよびＧＣＳＦ結合ＧＨＢＰ（Ｗ１０４Ａ）は、それぞれ４ｎｇ／ｍｌ（２１５ｐＭ；１８．６ｋＤａのＭｗ）および２ｎｇ／ｍｌ（４３ｐＭ；４６．７ｋＤａのＭｗを仮定する）のＥＣ ５０を有する。これらの計算は、融合タンパク質が天然（ネイティブ）ＧＣＳＦよりもおよそ５倍活性が高いことを示している。
このように、本発明者らは、ＧＣＳＦ結合ＧＨＢＰ＋／−Ｗ１０４Ａを製造することができ、ＧＣＳＦ結合ＧＨＢＰ（Ｗ１０４Ａ）を精製することができ、当該融合タンパク質がＧＣＳＦに匹敵する生物活性を有することを示す。

実施例４：タンパク質安定性試験
Ａ．非還元ゲル： 試験試料を室温、４℃および−８０℃（凍結／融解）でインキュベートした。試料を０、２、４および８日目に採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてクーマシー染色（１レーンあたり５μｇタンパク質を充填）によって分析した。ＧＣＳＦ＿ＧＨＢＰ（上）およびＧＣＳＦ＿Ｗ１０４Ａ＿ＧＨＢＰ（下）はいずれも、８日間にわたり試験したすべての条件下で、目に見える劣化の徴候がなかった（図１１）。

Ｂ．還元ゲル： 試験試料を室温、４℃および−８０℃（凍結／融解）でインキュベートした。試料を８日目に採取し、ネイティブＰＡＧＥ、続いてクマシー染色（１レーンあたり４μｇのタンパク質を充填）によって分析した。すべての条件下で目に見える劣化の兆候は見られなかった（図１２）。

Ｃ．非還元ゲル： 試験試料を室温、４℃および−８０℃（凍結／融解）で３か月間インキュベートした。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてクマシー染色（１レーンあたり４μｇのタンパク質を充填）によって分析した。−８０℃の試料について目に見える劣化の兆候はなかった。室温および４℃の試料についてはわずかな劣化がみられた（図１３）。

実施例５：ＡＭＬ−１９３細胞ベースの増殖アッセイを用いたタンパク質のインビトロ生物活性評価
ＡＭＬ１９３（末梢血、急性単球性白血病）細胞は、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦまたはＧＣＳＦで刺激すると増殖する。増殖は用量依存的であり、ＧＣＳＦ溶液の活性を評価するために使用することができる。精製されたタンパク質はいずれも、天然ＧＣＳＦと比較してすべての標準曲線が左にシフトし、生物活性の増加を示した（図１４、表６）。

実施例６：インビボ分析
ＦＡＣＳ分析
Ａ： フィルグラスチム群では、末梢好中球の最大動員は注射後１日目であったが、４Ｆ１では２日目であった（図１５）。

Ｂ： フィルグラスチムの単回投与後、ＢＭ中の好中球数は２４時間で減少し、その後４８時間で正常レベルに戻った。４Ｆ１の単回投与後、ＢＭ中の好中球数は２４時間で減少し始めた。そして４８時間で最低数に達した。その後、９６時間で正常レベルに戻った（図１６）。ＨＰＣの最大動員は、フィルグラスチムについては１日目に起こり、４Ｆ１群については２日目に起こった。ＨＰＣは、フィルグラスチムについては２日目までに正常レベルに戻り、４Ｆ１群については３日目に正常レベルに戻った（図１７）。フィルグラスチムおよび４Ｆ１の単回投与後、ＢＭ中のＨＰＣ数は２４時間で減少し、次いで９６時間までに正常なレベルに回復し始めた。（図１８）。

ＰＫ試験
図１９は、４Ｆ１−Ｗ１０４はピーク濃度が約１２〜２４時間であり、フィルグラスチムと比較してずっと良好な遅延クリアランスを有することを示し、また遅い吸光度速度であることも示す。

Claims (35)

1. 成長ホルモンではないアミノ酸配列を含むポリペプチドに、直接的あるいは間接的に連結した、成長ホルモン受容体の細胞外結合ドメインまたはその活性な結合部位のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド。
2. 前記ポリペプチドが、ヒト成長ホルモン受容体の細胞外結合ドメインを含むかあるいはそれからなる、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
3. 前記ポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むかあるいはそれからなる、請求項１または２に記載の融合ポリペプチド。
4. 細胞外結合ドメインを含む前記ポリペプチドが、少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失または置換によって修飾され、前記修飾されたポリペプチドが実質的に成長ホルモン結合活性を欠くか、または成長ホルモン結合活性が低下している、請求項１から３のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
5. 前記ポリペプチドが、前記細胞外結合ドメインの成長ホルモン結合ドメインにおいて修飾されている、請求項４に記載の融合ポリペプチド。
6. 前記修飾が、Ｗ１６９、Ｒ４３、Ｅ４４、Ｉ１０３、Ｗ１０４、Ｉ１０５、Ｐ１０６、Ｉ１６４およびＤ１６５からなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸配列である、請求項４または５に記載の融合ポリペプチド。
7. 前記修飾が、配列番号１または配列番号２１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基トリプトファン１０４の欠失を含むかあるいはそれからなる、請求項６に記載の融合ポリペプチド。
8. 前記アミノ酸残基トリプトファン１０４が、１つまたは複数のアミノ酸残基で置換されている、請求項７に記載の融合ポリペプチド。
9. トリプトファン１０４が、配列番号２または配列番号２２に示されるようにアラニンに置換されている、請求項８に記載の融合ポリペプチド。
10. 前記修飾が、配列番号１または配列番号２１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１２５〜１３１の修飾を含む、請求項４または５に記載の融合ポリペプチド。
11. 前記修飾が、配列番号１または配列番号２２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１２５〜１３１の全部または一部の欠失である、請求項１０に記載の融合ポリペプチド。
12. 前記ポリペプチドが、成長ホルモン受容体の細胞外結合ドメインに連結され、前記融合ポリペプチド中の受容体結合ドメインのアミノ末端に位置する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
13. 前記ポリペプチドが、成長ホルモン受容体の細胞外結合ドメインに連結され、前記融合ポリペプチド内の受容体結合ドメインに対してカルボキシル末端に位置する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
14. 前記ポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記受容体結合ドメインに連結している、請求項１から１３のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
15. 前記ペプチドリンカーが、フレキシブルペプチドリンカーである、請求項１４に記載の融合ポリペプチド。
16. 前記ペプチド連結分子が、ペプチドＧｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒの少なくとも１つのコピーを含む、請求項１５に記載の融合ポリペプチド。
17. 前記ペプチド連結分子が、ペプチドＧｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒの２、３、４、５、６または７つのコピーを含む、請求項１６に記載の融合ポリペプチド。
18. 前記融合ポリペプチドが、ペプチド連結分子を含まず、ポリペプチドと受容体結合ドメインとの直接的な融合物である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
19. 前記融合ポリペプチドがサイトカインを含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
20. 前記融合ポリペプチドがＧＣＳＦを含む、請求項１９に記載の融合ポリペプチド。
21. 前記融合ポリペプチドが、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の融合ポリペプチド。
22. 前記融合ポリペプチドが、配列番号９または配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２０または２１に記載の融合ポリペプチド。
23. 前記融合ポリペプチドが、配列番号３２、３４、３６または３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２０または２１に記載の融合ポリペプチド。
24. 前記融合ポリペプチドがレプチンを含む、請求項１９に記載の融合ポリペプチド。
25. 前記融合ポリペプチドが、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載の融合ポリペプチド。
26. 前記融合ポリペプチドが、配列番号５、配列番号７、配列番号１９または配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２４または２５に記載の融合ポリペプチド。
27. 前記融合ポリペプチドが、配列番号２４、２６、２８または３０に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２４または２５に記載の融合ポリペプチド。
28. 前記融合ポリペプチドに、非天然アミノ末端シグナルペプチドが提供される、請求項１から２７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
29. 前記非天然アミノ末端シグナルペプチドが、アミノ酸配列MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA（配列番号：３９）を含む、請求項２８に記載の融合ポリペプチド。
30. 請求項１から２９のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドをコード化する核酸分子。
31. 請求項３０に記載の核酸分子を含むベクター。
32. 前記ベクターが、発現ベクターである、請求項３１に記載のベクター。
33. 請求項３０から３２のいずれか一項に記載の核酸分子またはベクターによりトランスフェクトまたは形質転換された単離された細胞。
34. 賦形剤または担体を含有する請求項１から２９のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む医薬組成物。
35. 医薬として使用するための、請求項１から２９のいずれか一項に記載のポリペプチド。