JP2019501926A

JP2019501926A - 家塵ダニ由来アレルゲンによる過敏反応免疫調節剤

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Publication number: JP2019501926A
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Authority: JP
Inventors: クチ、ヨン; キム、ユン−クン; パク、ハンキ
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Priority date: 2016-01-15
Filing date: 2016-11-04
Publication date: 2019-01-24
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Abstract

本発明は、家塵ダニ由来アレルゲンによるアレルギー疾患の予防または治療用免疫調節剤に関し、具体的に、北アメリカ家塵ダニあるいはヨーロッパ家塵ダニ由来アレルゲン含有細菌由来細胞外小胞を有効成分として含む免疫調節用薬学的組成物、およびその製造方法などを提供する。
【選択図】図１５

Description

本発明は、家塵ダニ由来アレルゲンによるアレルギー疾患の予防または治療用免疫調節剤に関し、より具体的には、家塵ダニ由来アレルゲンを含有する細菌由来細胞外小胞を含む薬学的組成物、およびその製造方法などに関する。

アトピーは、頻繁に露出する有害でない抗原（アレルゲン）に過度な免疫反応（過敏反応）が起こる症候群であり、これによる疾患がアトピー疾患である。アトピーがある人には、アトピー皮膚炎、アレルギー鼻炎、アレルギー結膜炎、アレルギー喘息などのアトピー疾患が頻繁に発生する。アトピーの免疫学的病因と関連して少なくとも第１型過敏反応のアレルギー反応と関連している。たとえアトピーが多様に定義されているが、血液中にアレルゲンに対するＩｇＥの濃度が高く現れることが特徴である。

アレルギーは、周辺の抗原に露出時に、身体に後天的な免疫反応が発生し、抗原に対する記憶により抗原に反復露出時に免疫反応の様相が変わる現象であると定義することができる。有害な抗原に露出時に発生するアレルギー現象は、身体に有益な効果を示し、ワクチンを用いた免疫反応を誘導することが代表的である。反面、有害でない抗原に免疫反応が過度に誘導されて過敏反応が発生すると、身体に炎症反応が発生してアレルギー疾患を起こすようになる。喘息は、気道の慢性炎症を特徴とする疾患であって、炎症による構造的な変化とこれに伴う機能的な変化によって喘鳴、呼吸困難などの症状が発生する疾患である。喘息に現れる慢性炎症の病因として周辺環境に存在するアレルゲンに対する過敏反応が重要な免疫機序であり、特に家塵ダニに由来するアレルゲンに対する過敏反応が喘息の重要な原因因子として知られている。

家塵ダニ（ｈｏｕｓｅｄｕｓｔｍｉｔｅ）は、ヒトが居住する地域で棲息する節足動物に属する動物である。家塵ダニは、ヒトの鱗屑を食べて棲息し、主として都市型家屋のベッドマットレス、カーペット、家具などに多量で存在し、全世界的にアレルギー喘息のようなアレルギー疾患の病因に最も重要なアレルゲンであると知られている。家塵ダニの消化器官には、様々な消化酵素が存在し、これは、家塵ダニが排泄する糞を通じて空気中に広がって、これを吸入すると、アトピー素因があるヒトに過敏反応が発生し、その後、家塵ダニ由来アレルゲンに反復露出時に、くしゃみ、鼻水のような鼻炎症状、あるいは喘鳴、呼吸困難のような喘息症上、かゆみ症のようなアトピー皮膚炎症状が誘発される。アレルギー疾患を起こす重要な家塵ダニには、ヨーロッパ家塵ダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）と北アメリカ家塵ダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓｆａｒｉｎａｅ）が代表的である。ヨーロッパ家塵ダニ由来アレルゲンとして、Ｄｅｒｐ１、Ｄｅｒｐ２、Ｄｅｒｐ３、Ｄｅｒｐ４、Ｄｅｒｐ６、Ｄｅｒｐ９、およびＤｅｒｐ１５等が知られており、北アメリカ家塵ダニ由来アレルゲンとして、Ｄｅｒｆ１、Ｄｅｒｆ２、Ｄｅｒｆ１１、およびＤｅｒｆ１８等が重要であると知られている。韓国内で調査された疫学研究結果を見ると、大都市地域の室内塵には、ヨーロッパ家塵ダニよりは北アメリカ家塵ダニに由来するアレルゲンが主に存在し、北アメリカ家塵ダニ由来アレルゲンのうち、主にＤｅｒｆ２アレルゲンが室内塵に最も多く存在すると報告された（ソンジョンヨル外、一部の住宅で家塵ダニアレルゲン調査、韓国大気環境学会誌２００６；２２（５）：７１９−２３）。

免疫療法には、疾病を起こす抗原物質を体内に直接投与して体内に存在する免疫細胞活性を誘導する能動免疫療法（ａｃｔｉｖｅｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）と、単クローン抗体のように体外で生産した物質を投与して免疫反応を調節する受動免疫療法（ｐａｓｓｉｖｅｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）に分けられる。疾病を予防するための方法として、受動免疫療法に比べて能動免疫療法が費用や投与回数の側面においてさらに効率的な方法として認識されている。能動免疫療法は、後天性免疫の特徴である抗原特異的な臓器防御記憶を誘導する能力を有する後天性免疫反応を誘導する戦略を使用することにより、防御免疫が誘導されるようにするものである。アレルギー反応を調節するための重要｛じゅうよう｝な要素は、体液性（または抗体媒介）および細胞性（Ｔ−細胞媒介）免疫のようなアレルゲンに対する免疫学的過敏反応をアレルゲン特異的に調節することが核心である。

細菌で分泌される細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｖｅｓｉｃｌｅｓ；ＥＶｓ）は、球形のリン脂質二重膜で２０〜１００ｎｍの直径を有し、生化学およびプロテオーム研究を通じて外膜蛋白質、リポポリサッカライド（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；ＬＰＳ）、外膜脂質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および細胞質内蛋白質などを含んでいることが報告された。最近、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、アシネトバクターバウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｂａｕｍａｎｎｉｉ）、ポルフィロモナスジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、サルモネラエンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｅｎｔｅｒｉｃａ）、セロバチフィムリウム（ｓｅｒｏｖａｒＴｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ）、およびビブリオコレラ（Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ）のようなグラム陰性細菌が細胞外小胞を分泌して細菌感染に対する防御免疫を誘導し、黄色葡萄状球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）のようにグラム陽性細菌も細胞外小胞を通じて細菌感染に対する防御免疫を誘導できることが報告された。

抗原伝達体としてグラム陰性細菌に由来する小胞は、それ自体の優れた免疫誘導効果にもかかわらず、敗血症のような深刻な毒性を誘導する問題がある。これは、グラム陰性細菌の細胞外膜に内毒素として知られたリポポリサッカライド（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、ＬＰＳ）が存在し、これは、血管内皮細胞に多量で存在するＴＬＲ４受容体を通じて全身的な血管炎症を誘導して敗血症を誘導することが最近明らかにされた。グラム陰性細菌由来細胞外小胞による毒性問題を解決するための方法として、細胞外小胞に存在するＬＰＳを除去したり、あるいはＬＰＳ活性を抑制する化合物を処理して抗原伝達体として使用することができる。原形質体（ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ）は、植物または細菌の生きている細胞物質であり、これら細胞の細胞外膜と細胞壁を機械的／酵素的な方法で除去した形態であって、細菌の外膜に存在する内毒素の含量が除去されて、小胞自体の毒性問題を解決することができる。また、ポリミキシンＢのような薬物を処理して細胞外小胞内に存在する内毒素の活性を除去することができる。

現在まで家塵ダニアレルゲン免疫療法は、主に家塵ダニからアレルゲンを抽出したり、組換え蛋白質の形態で使用しており、まだ細胞外小胞のような抗原伝達体にアレルゲンを発現させて使用した例は一度もない状態である。

これより、本発明は、家塵ダニ由来アレルゲンを発現する細菌、およびこれに由来する細胞外小胞を含む薬学的組成物、およびその製造方法などを提供する。

また、本発明は、前記組成物を利用して家塵ダニ由来アレルゲンによる過敏反応を調節する方法などを提供する。

本発明が達成しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていないさらに他の課題は、下記の記載から当業者に明確に理解され得る。

本発明は、細菌由来細胞外小胞を有効成分として含有するアレルギー疾患予防または治療用薬学的組成物を提供する。前記細菌は、家塵ダニ由来アレルゲン遺伝子を過発現させた細菌であり、前記アレルギー疾患は、家塵ダニ由来アレルゲンによるアレルギー疾患であることを特徴とする。

本発明の一具現例において、前記細菌は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）あるいはサルモネラ属細菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｓｐｐ．）であることを特徴とする。

本発明の他の具現例において、前記家塵ダニは、ヨーロッパ家塵ダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）または北アメリカ家塵ダニであることを特徴とする。

本発明のさらに他の具現例において、前記家塵ダニ由来アレルゲンは、Ｄｅｒｐ１、Ｄｅｒｐ２、Ｄｅｒｐ３、Ｄｅｒｐ４、Ｄｅｒｐ６、Ｄｅｒｐ９、Ｄｅｒｐ１５、Ｄｅｒｆ１、Ｄｅｒｆ２、Ｄｅｒｆ１１、およびＤｅｒｆ１８よりなる群から選択されることを特徴とする。

また、本発明は、（ａ）家塵ダニ由来アレルゲン遺伝子を細菌に過発現させる段階と；（ｂ）前記過発現された細菌を培養する段階と；（ｃ）前記細菌培養液から小胞を分離する段階と；（ｄ）前記細菌由来小胞の外膜内毒素の活性を除去する段階とを含む、家塵ダニ由来アレルゲンによるアレルギー疾患予防または治療用細菌由来小胞の製造方法を提供する。

本発明の一具現例において、前記（ｃ）段階で小胞を分離する方法は、自然的に分泌された小胞をフィルター法、および／あるいは超遠心分離法で分離したり、あるいは人工的な方法で小胞を形成した後、フィルター法、および／あるいは超遠心分離法などで分離することを含む。

本発明の他の具現例において、前記（ｄ）段階で内毒素の活性を除去する方法は、小胞内毒素（ＬＰＳ、ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎなど）をリゾチーム等で除去したり、内毒素（ＬＰＳ）をポリミキシン（ｐｏｌｙｍｙｘｉｎＢ）のような薬物で活性を抑制する方法を含む。

本発明のさらに他の具現例において、前記家塵ダニによるアレルギー疾患は、喘息、鼻炎、アトピー皮膚炎よりなる群から選択されることを特徴とする。

また、本発明は、前記方法で製造された細菌由来細胞外小胞を有効成分として含む、家塵ダニによるアレルギー疾患予防または治療用免疫調節剤を提供する。

本発明の一具現例において、前記免疫調節剤は、細菌由来細胞外小胞の内腔（ｌｕｍｅｎ）に家塵ダニアレルゲン（Ｄｅｒｆ２等）が過発現されて存在することを特徴とする。

本発明のさらに他の具現例において、前記細菌由来小胞は、平均直径が１０〜２００ｎｍであることを特徴とする。

また、本発明は、細菌由来小胞を利用して家塵ダニ由来アレルゲンによるアレルギー疾患を予防または治療する方法を提供する。具体的に、細菌由来細胞外小胞を有効成分として含有する薬学的組成物を個体に投与する段階を含む、アレルギー疾患の予防または治療方法を提供する。

前記細菌は、家塵ダニ由来アレルゲン遺伝子を過発現させた細菌であり、前記アレルギー疾患は、家塵ダニ由来アレルゲンによるアレルギー疾患であることを特徴とする。

また、本発明は、前記細菌由来細胞外小胞の、家塵ダニ由来アレルゲンによるアレルギー疾患予防または治療用途を提供する。

本発明は、家塵ダニ由来アレルゲン（Ｄｅｒｆ２等）を含有する細菌由来小胞を家塵ダニ由来アレルゲン免疫調節剤として利用して、アレルゲンによる過敏反応を調節することにより、究極的に家塵ダニにより発生するアレルギー疾患を効率的に予防または治療できるものと期待される。

図１は、北アメリカ家塵ダニ（Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ）アレルゲン（Ｄｅｒｆ２）をクローニングして、細菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）にローディングした後、培養過程でリゾチームで処理して原形質体を形成した後、押出法（ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ）で人工的な細胞外小胞を製造して免疫調節剤を製造する方法を図式化した図である。図２は、Ｄｅｒｆ２アレルゲンがローディングされた細胞外小胞を透過電子顕微鏡（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）で撮影した写真である。図３は、Ｄｅｒｆ２アレルゲンがローディングされた細胞外小胞を動的光散乱法（ｄｙｎａｍｉｃｌｉｇｈｔｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）でサイズを測定した結果である。図４は、Ｄｅｒｆ２アレルゲンがローディングされた細胞外小胞を骨髄細胞由来抗原提示細胞（ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌ）に処理してｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＣＤ８６）の発現を測定した結果である。図５は、Ｄｅｒｆ２アレルゲンがローディングされた細胞外小胞を骨髄細胞由来抗原提示細胞（ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌ）に処理してＩＬ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ、インターロイキン）−１２およびＩＬ−６の分泌量を測定した結果である。図６は、細菌に存在するｓｍａｌｌＲＮＡをクローニングして、細菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）にローディングした後、細菌を培養して細胞外小胞を分離した後、小胞の外膜に存在するリポポリサッカライド（ＬＰＳ）の活性を除去するためにポリミキシンＢ（ＰＭＢ）を処理して免疫調節剤を製造する方法を図式化した図である。図７は、ＭｉｃＡｓｍａｌｌＲＮＡ過発現菌株由来細胞外小胞の形態学的特性を動的光散乱法および電子顕微鏡で観察した図である。図８は、細菌に存在するｓｍａｌｌＲＮＡ過発現菌株（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）由来小胞を腹腔に３回注射した後、局所リンパ節から免疫細胞を分離してａｎｔｉ−ＣＤ３／ａｎｔｉ−ＣＤ２８で刺激を与えた後、ガンマインターフェロン、ＩＬ−４、ＩＬ−１７の分離量を測定した図である。図９は、ＭｉｃＡｓｍａｌｌＲＮＡ過発現菌株（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）由来小胞を炎症細胞（大食細胞株ＲＡＷ２６４．７）に投与する過程でポリミキシンＢ（ＰＭＢ）を多様な濃度で混ぜて投与した後、炎症性媒介体（ＩＬ−６、ＴＮＦ−ａｌｐｈａ）の分泌量を測定した図である。図１０は、ＭｉｃＡｓｍａｌｌＲＮＡ過発現菌株（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）由来小胞を炎症細胞（大食細胞株ＲＡＷ２６４．７）に投与する過程でポリミキシンＢ（ＰＭＢ）の濃度をさらに細部的に区分して混ぜて投与した後、ＩＬ−６の分泌量を測定した図である。図１１は、Ｄｅｒｆ２アレルゲンがローディングされた細胞外小胞の免疫原性をマウスで評価するための実験プロトコルである。ＩＭ：筋肉注射；ＩＮ：鼻腔投与；ＢＡＬ：気管支肺胞洗浄液図１２ａおよび図１２ｂは、Ｄｅｒｆ２アレルゲンがローディングされた細胞外小胞を図１１の方法で投与した後、マウス血清内抗原特異的ＩｇＧ抗体と気管支肺胞洗浄液内抗原特異的ＩｇＡ抗体生成能を測定した結果である。図１３は、Ｄｅｒｆ２アレルゲンがローディングされた細胞外小胞を図６の方法で投与した後、マウス肺組織からＴ細胞を分離してａｎｔｉ−ＣＤ３／ＣＤ２８で刺激を与えた後、ガンマ−インターフェロン、ＩＬ−１７、ＩＬ−４、ＩＬ−１０を測定した結果である。図１４は、北アメリカ家塵ダニ抽出液抗原と免疫補強剤（ａｌｕｍｉｎｕｍｈｙｄｒｏｘｉｄｅ、ａｌｕｍ）で誘導したマウス喘息モデルにおいて、Ｄｅｒｆ２アレルゲンがローディングされた細胞外小胞の免疫調節効能をマウスで評価するためのプロトコルである。ＩＭ：筋肉注射；ＩＮ：鼻腔投与；ＩＰ：腹腔投与図１５は、家塵ダニアレルゲンで誘導されたマウス喘息モデルにおいて、Ｄｅｒｆ２アレルゲンがローディングされた細胞外小胞の抗炎症効果を気管支肺胞洗浄液内炎症細胞数で評価した結果である。

抗原特異的免疫調節剤を開発するためには、抗原の選定と所望の免疫反応を誘導する免疫補強剤の選定が重要である。本発明では、家塵ダニ由来アレルゲンに対する過敏反応を調節するための免疫調節剤候補抗原として、韓国内で最も多く存在するＤｅｒｆ２アレルゲンをターゲットとした。

一方、細菌由来細胞外小胞が宿主に多様な免疫反応を誘導することができるという事実に基づいて、細菌に由来する細胞外小胞を免疫補強剤として利用する試みがあるが、細菌由来細胞外小胞は、ＬＰＳ、ペプチドグリカンなどのような毒素を含有していて、細胞外小胞による毒性問題を解決しなければならない問題がある。これより、本発明では、従来、細菌由来細胞外小胞を薬物伝達体として使用するに際して、細胞外小胞が持っている毒性問題を除去するために、細胞外小胞の外膜（ｏｕｔｅｒｍｅｍｂｒａｎｅ）とペプチドグリカン層（ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ）を含む細胞壁（ｃｅｌｌｗａｌｌ）を除去して形成された原形質体（ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ）を製造した後、人工的に細胞外小胞を製造して使用した。また、細菌を培養した後、自然的に分泌される小胞に小胞外膜に存在するＬＰＳの活性を阻害するポリミキシンＢを併用投与して毒性を減少させようとした。

その後、抗原がローディングされた候補細胞外小胞の免疫原性を体外および体内実験を通じて評価して、効能評価のための投与経路と投与容量を決定した。これにより、前記抗原がローディングされた細胞外小胞が有効なワクチンであることが分かった。

また、前記の免疫調節剤の効能を疾病モデルで評価するために、北アメリカ家塵ダニ抽出液とａｌｕｍを腹腔に注入してアレルゲンで感作させた後、鼻腔にダニ抽出液だけを投与して喘息動物モデルを製作して使った。

本発明において「家塵ダニアレルギー疾患」とは、家塵ダニ由来アレルゲンにより発生し得る疾患であれば、特に制限はないが、喘息、鼻炎、アトピー皮膚炎よりなる群から選択されることが好ましい。

本発明において「アレルギー疾患の治療または予防」とは、アレルギー疾患の軽減、緩和および症状の改善を含み、また、アレルギー疾患にかかる可能性を低減することを含む意味である。

本発明において、遺伝子を過発現させることができる細菌には特に制限はないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、またはサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｓｐｐ．）であることが好ましい。

本発明において、細胞外小胞を分離する段階には、自然的に分泌された細胞外小胞を使用することができ、細胞外小胞を分離する方法に特に制限はないが、フィルターで濃縮して得ることができ、その後、超遠心分離などの工程を含むことができる。

本発明において、人工的に細胞外小胞を製造することができ、その製造する方法に特に制限はないが、フィルターで押出して得ることができ、遠心分離、超遠心分離などの工程をさらに含むことができる。

本発明において細胞外小胞を分離する方法は、細菌由来細胞外小胞を含む場合、特に制限されず、例えば培養液から、遠心分離、超高速遠心分離、フィルターによる濾過、ゲル濾過クロマトグラフィー、フリーフロー電気泳動、毛細管電気泳動などの方法およびこれらの組合せを利用して細胞外小胞を分離することができる。また、不純物の除去のための洗浄、収得された細胞外小胞の濃縮などの過程をさらに含むことができる。前記細胞外小胞は、自然的に分泌されたものであるか、あるいは人工的に分泌された細胞外小胞を含む。

本発明において、前記方法により製造された細胞外小胞の内腔（ｌｕｍｅｎ）に家塵ダニ由来アレルゲンが発現していて、この際、発現蛋白質としては、Ｄｅｒｆ２、Ｄｅｒｐ２等が好ましく、Ｄｅｒｆ２が最も好ましい。

本発明において、前記方法により製造された免疫調節剤の細胞外小胞は、平均直径が１０〜２００ｎｍであってもよいが、好ましくは２０〜１００ｎｍである。

本発明において、前記アレルギー疾患の治療または予防用免疫調節剤は、薬学的組成物で製造され得る。治療および予防に使用するために、本発明の細菌由来細胞外小胞自体を投与することが可能であるが、薬学的組成物の活性成分として前記細胞外小胞が含まれることが好ましい。

前記薬学的組成物は、前記分離した細胞外小胞を有効成分として含有し、薬学的に許容可能な担体を含むことができる。前記薬学的に許容可能な担体は、製剤時に通常利用されるものであって、食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝食塩水、シクロデキストリン、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、リポソームなどを含むが、これに限定されず、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液など他の通常の添加剤をさらに含むことができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、潤滑剤などを付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤で製剤化することができる。適合した薬学的に許容される担体および製剤化に関しては、レミントンの文献（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ、ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ、ＥａｓｔｏｎＰＡ）に開示されている方法を利用して各成分によって好ましく製剤化することができる。本発明の薬学的組成物は、剤形に特別な制限はないが、注射剤、吸入剤、皮膚外用剤などで製剤化することができる。

本発明の薬学的組成物の投与方法は、特に制限されるものではないが、目的とする方法によって筋肉注射、皮下、吸入、鼻腔、舌下、皮膚塗布のように非経口投与したり、経口投与することができる。

投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率および疾患の重症度などによってその範囲が多様である。一日投与量は、治療を必要とする個体に投与されることにより、軽減された疾病状態に対する治療に十分な本発明の治療用物質の量を意味する。治療用物質の効果的な量は、特定の化合物、疾病状態およびその深刻度、治療を必要とする個体によって変わり、これは、当業者によって通常的に決定され得る。非制限的な例として、本発明による組成物の人体に対する投与量は、患者の年齢、体重、性別、投与形態、健康状態および疾患程度によって異なる。

以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。

［実施例１：Ｄｅｒｆ２抗原がローディングされた細胞外小胞の製造（図１参照）］
北アメリカ家塵ダニの主なアレルゲンであるＤｅｒｆ２クローニングのためにＤｅｒｆ２遺伝子（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＧｅｎｅＢａｎｋＡＢ１９５５８０）をのｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法により合成した。ＰＣＲ産物は、Ｔ−ｂｌｕｎｔＰＣＲベクター（Ｔ−ｂｌｕｎｔＰＣＲｃｌｏｎｉｎｇｋｉｔ、Ｓｏｌｇｅｎｔ）に挿入した後、それぞれのプラスミドをＥｃｏＲＩ（ＯｍｐＡ、ＡＢＣｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）およびＢｇｌＩＩ（ＦｅｐＡ）で切断した。切片を電気泳動で分離した後、ｐＥＴ−３０ａプラスミドに挿入し、大腸菌ＤＨ５ａにヒートショック法で形質転換して、最終的に前記遺伝子をクローニングした。

前記実施例で得られたＤｅｒｆ２クローンを３７℃、２００ｒｐｍ、１２時間ルリア−ベルターニ培地（Ｍｅｒｃｈ）で培養した後、Ｅｘｐｒｅｐｐｌａｓｍｉｄｍｉｎｉｐｒｅｐ．Ｋｉｔ（ＧｅｎｅＡｌｌ）を利用してそれぞれのプラスミドを分離して大腸菌ＢＬ２１（ＲｅａｌＢｉｏｔｅｃｈ）にトランスフェクションさせた。

ＢＬ２１をＯＤ値が０．３になるまで２００ｒｐｍ、３７℃、１００ｍｌのＬＢ培地（１ｍＭのＩＰＴＧ）で３時間培養した後、３，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離して得られたバクテリアペレットをトリスバッファー（０．０１ＭのＴｒｉｓＨＣｌ、０．５Ｍのスクロース）で洗浄し、４℃、３，０００×ｇで１０分間遠心分離した後、トリスバッファーで再懸濁した。再懸濁したバクテリアを３７℃、１００ｒｐｍで３０分間０．０１ＭのＥＤＴＡで処理し、４℃、３，０００×ｇで１０分間ペレット化した後、トリスバッファーで洗浄してペレット化した。

次に、バクテリアペレットをトリスバッファーで再懸濁し、原形質体を得るために３７℃、１００ｒｐｍ、２時間１ｍｇ／ｍｌのリゾチーム（Ｓｉｇｍａ）を処理した後、１０μｍ、５μｍ、および１μｍ気孔のサイズの膜を通じて順にＬｉｐｏｓｏＦａｓｔエクストルーダー（Ａｖｅｓｔｉｎ）で押出した。最終的に、１０％および５０％ｏｐｔｉ−ｐｒｅｐ密度勾配培地（ＯｐｔｉＰｒｅｐ）で超遠心分離して、Ｄｅｒｆ２抗原がローディングされた細胞外小胞を得た。

［実施例２：Ｄｅｒｆ２抗原がローディングされた細胞外小胞の物理的特性の分析］
実施例１で得たＤｅｒｆ２抗原がローディングされた細胞外小胞をＰＢＳで希釈（５０μｇ／ｍｌ）させ、３００メッシュのＣｕグリッド（ＥＭＳ）に１０μｌローディングした。陰性染色（ｎｅｇａｔｉｖｅｓｔａｉｎ）のためにウラニルアセテート（２％）をグリッドに落とし、ＪＥＭ１０１１電子顕微鏡（ＪＥＯＬ）で観察した。その結果、図２に示されたように、前記細胞外小胞は、球形であって、脂質二重層で囲まれていることを確認した。

実施例１で得たＤｅｒｆ２抗原がローディングされた細胞外小胞のサイズを測定するために、細胞外小胞をＰＢＳで希釈（５００ｎｇ／ｍｌ）させ、ＺｅｔａｓｉｚｅｒＮａｎｏＺＳ（ＭａｌｖｅｒｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を利用して動的光散乱法で直径サイズ分布を測定し、ＤｙｎａｍｉｃＶ６ｓｏｆｔｗａｒｅを利用して結果を分析した。その結果、図３に示されたように、細胞外小胞の直径が１００〜３００ｎｍであることが分かった。

［実施例３：Ｄｅｒｆ２抗原がローディングされた小胞による先天性免疫反応］
Ｄｅｒｆ２抗原がローディングされた細胞外小胞を免疫調節剤として利用するためには、免疫反応を誘導できなければならないので、Ｄｅｒｆ２抗原がローディングされた細胞外小胞による先天性免疫反応誘導水準を評価するために、骨髄細胞に由来する樹枝状細胞（ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌ、ＢＭＤＣ）を使用してｉｎｖｉｔｒｏ実験を行った。

まず、ＢＭＤＣ（５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を１０％ＦＢＳと抗生剤（１００ｕｎｉｔ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン）を含有するＤＭＥＭで３７℃で２４時間２４ウェル組織培養プレート（ＴＰＰ）で培養した。培地除去後、Ｄｅｒｆ２抗原がローディングされた細胞外小胞を０．１および１ｕｇ／ｍｌの濃度で添加した無血清ＤＭＥＭ培地に交替した。１５時間後、ＢＭＤＣでＣＤ８６発現程度と前記培養培地でＥＬＩＳＡａｓｓａｙを行って、Ｔ細胞分化サイトカインであるＩＬ−１２およびＩＬ−６の発現水準を測定した。

その結果、図４のようにＤｅｒｆ２抗原がローディングされた細胞外小胞により抗原提示細胞におけるＣＤ８６の発現が大きく増加した（図４参照）。また、図５に示されたように、Ｄｅｒｆ２抗原がローディングされた細胞外小胞が処理された抗原提示細胞は、Ｔｈ１細胞への分化に重要なＩＬ−１２およびＴｈ１７細胞への分化に重要なＩＬ−６の分泌を有意に増加させた（図５参照）。

［実施例４：ＭｉｃＡｓＲＮＡ過発現菌株由来小胞の物理的特性の分析］
Ｈｆｑ−結合ｓＲＮＡのうち種保存性に優れたｓＲＮＡを活用して大腸菌ｓＲＮＡ塩基配列と同じＭｉｃＡｓＲＮＡ（ＣＡＴＣＴＣＴＧＡＡＴＴＣＡＧＧＧＡＴＧＡＴＧＡＴＡＡＣＡＡＡＴＧＣＧＣＧＴＣＴＴＴ）が含まれたｐＢＲｐｌａｃ−ｓＲＮＡプラスミドをサルモネラ菌に導入した。具体的に、サルモネラチフィムリウム（ＳａｌｍｏｎｅｌｌａＴｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）１４０２８Ｓ種にｐＢＲｐｌａｃ−ｓＲＮＡを電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を利用して導入した。

前記実施例においてｓＲＮＡ過発現菌株を体外で培養して、小胞を分離して小胞の物理的特性を動的光散乱法（Ｄｙｎａｍｉｃｌｉｇｈｔｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）と電子顕微鏡（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を使用して確認した。その結果、下記表１および図７に示されたように、ＭｉｃＡｓＲＮＡ過発現菌株由来細胞外小胞が、対照群であるｐＢＲｐｌａｃと類似した２０ｎｍ前後のサイズであり、形状も類似していることを確認した（図７）。

［実施例５：ＭｉｃＡｓＲＮＡ過発現サルモネラ菌（ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）由来小胞の免疫原性］
サルモネラ菌株は、腸炎を誘発してＴｈ１免疫反応を誘導することが知られている。これにより、ｓＲＮＡ過発現を通じて得た細胞外小胞のＴｈ１免疫反応誘導能を確認した。具体的に、グループ当たり５個体のマウス（Ｃ６７ＢＬ／６）に腹腔経路を通じて細胞外小胞１００ｕｇ／ｈｄを２日間隔で投与した。そして、５日目になる日に解剖して腹腔内リンパ節から細胞を分離した後、抗−ＣＤ３およびＣＤ２８を使用して１２時間Ｔ細胞再刺激を実施した後、Ｔ細胞で分泌されるサイトカイン量を測定した。

その結果、図８に示されたように、Ｔｈ１、Ｔｈ１７免疫反応に関連したサイトカインであるＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７は、ｓＲＮＡ過発現菌株由来細胞外小胞を投与した時、対照群に比べて増加し、Ｔｈ２免疫反応に関連したサイトカインであるＩＬ−４は、ｓＲＮＡ過発現菌株由来細胞外小胞を投与した時、対照群と差異がないことを確認した（図８）。

これを通じて、ｓＲＮＡ過発現菌株サルモネラ由来細胞外小胞を利用して生菌感染と類似したＴｈ１、Ｔｈ１７免疫反応を誘導することができることを確認した。

［実施例６：ＭｉｃＡｓＲＮＡ過発現サルモネラ菌（ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）由来小胞の最適化］
サルモネラ菌由来小胞自体は、免疫原性が良いが、細胞外膜に存在するＬＰＳによる毒性が問題になる。これを解決するための方案として、ＬＰＳの活性を抑制するＰＭＢをＭｉｃＡｓＲＮＡ過発現サルモネラ菌由来小胞と混ぜて先天性免疫反応誘導水準を評価した。

具体的に、炎症細胞（大食細胞株ＲＡＷ２６４．７、５ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を１０％ＦＢＳと抗生剤（１００ｕｎｉｔ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン）を含有するＤＭＥＭで、３７℃で２４時間２４ウェル組織培養プレート（ＴＰＰ）で培養した。培地除去後、ＰＭＢ含有細胞外小胞を１ｕｇ／ｍｌの濃度で添加した無血清ＤＭＥＭ培地に交替した。１５時間後、炎症細胞でＩＬ−６とＴＮＦ−ａｌｐｈａの分泌量を測定した。

その結果、図９に示されたように、細胞外小胞にＰＭＢ１ｕｇ／ｍｌあるいは１０ｕｇ／ｍｌの濃度で混ぜて投与した時、ＩＬ−６分泌量が減少し、ＴＮＦ−ａｌｐｈａ分離量は、ＰＭＢ１０ｕｇ／ｍｌの濃度により抑制されることを確認した。これは、前記の方法で製造した小胞に対する最適のＰＭＢ希釈濃度は、１ｕｇ／ｍｌ〜１０ｕｇ／ｍｌの間に存在することを意味する。

最適のＰＭＢ希釈濃度を決定するために、前記の方法でＰＭＢ濃度を１、２、４、８、１０ｕｇ／ｍｌの濃度で細分して小胞とともに大食細胞に投与した。その結果、大食細胞におけるＩＬ−６の分泌量が２ｕｇ／ｍｌの濃度以上ではこれ以上減少しないことが明らかにされ、したがって、希釈するＰＭＢ濃度を別にして候補物質を最適化することができることを確認した（図１０参照）。

［実施例７：Ｄｅｒｆ２抗原がローディングされた小胞による抗体免疫反応］
生体内（ｉｎｖｉｖｏ）でＤｅｒｆ２抗原がローディングされた細胞外小胞による抗体免疫反応誘導能を確認し、Ｄｅｒｆ２抗原がローディングされた細胞外小胞の有効量を決定するために、Ｄｅｒｆ２抗原がローディングされた細胞外小胞をマウスに投与して免疫を誘導した。また、免疫反応を誘導した後、対照群（ＰＢＳ）およびＤｅｒｆ２抗原がローディングされた細胞外小胞を投与したマウスから血液を採取してＤｅｒｆ２特異的ＩｇＧ抗体を測定し、気管支肺胞洗浄液を採取してＤｅｒｆ２特異的ｓＩｇＡ抗体の濃度を測定した。

具体的に、１００ｎｇのＤｅｒｆ２が含まれた１００μｌのＰＢＳを４℃で９６ウェルブラックプレート（ＧｒｅｉｎｅｒＢｉｏ−ｏｎｅ）に２４時間コートした。Ｄｅｒｆ２でコートされたプレートをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳで希釈した１％ＢＳＡ溶液を１時間処理してブロッキング過程を行い、ＰＢＳでさらに洗浄した。

対照群（ＰＢＳ）とＤｅｒｆ２抗原がローディングされた細胞外小胞を投与したマウスから血液と血清と細胞層を分離した後、血清を分離し、気管支肺胞洗浄液で細胞層と上層液を分離し、血清と気管支肺胞洗浄液の上層液を１％ＢＳＡ溶液で希釈し、Ｄｅｒｆ２抗原でコートされたプレートで２時間反応させた。培養後、プレートを洗浄し、ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄｇｏａｔａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＩｇＧおよびＩｇＡ（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）２００ｎｇ／ｍｌを添加して２時間反応させた。さらにプレートを洗浄した後、ＥＣＬ基質（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、ＶｉｃｔｏｒＷａｌｌａｃ１４２０ａｐｐａｒａｔｕｓ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を利用してＩｇＧおよびｓＩｇＡ抗体力価を分析した。

その結果、図１１に示されたように、Ｄｅｒｆ２抗原がローディングされた細胞外小胞に筋肉注射で免疫反応を誘導したマウス血清には、Ｄｅｒｆ２抗原がローディングされた細胞外小胞の鼻腔投与の有無に関係なくＤｅｒｆ２抗原特異的ＩｇＧ抗体生成が増加した。反面、気管支肺胞洗浄液内Ｄｅｒｆ２抗原特異的ｓＩｇＡ生成は、Ｄｅｒｆ２抗原がローディングされた細胞外小胞を筋肉注射した後、鼻腔に投与した場合にのみ増加した（図１２ａおよび図１２ｂ参照）。

［実施例８：Ｄｅｒｆ２抗原がローディングされた細胞外小胞によるＴ細胞免疫反応］
生体内（ｉｎｖｉｖｏ）でＤｅｒｆ２抗原がローディングされた細胞外小胞を投与して免疫反応を誘導した後、対照群（ＰＢＳ）およびＤｅｒｆ２抗原がローディングされた細胞外小胞を投与したマウスにおいてＴ細胞で生成されるサイトカインの量を測定してＴ細胞反応を評価した。

すなわち、摘出した肺組織を５ｍｌのシリンジ洗浄バッファー（２．５％のＦＢＳ、０．０１ＭのＨＥＰＥＳ含有ＤＭＥＭ）で１００μｍのセルストレーナー（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に通過させて分解させた。分離した細胞にアンモニウムクロリド溶液（ＳＴＥＭＣＥＬＬ）を４℃で１０分間処理して赤血球細胞が溶解するようにした。得られた細胞を洗浄バッファーで洗浄し、４０μｍのセルストレーナー（ＢＤ）でフィルタリングした後、１０％ＦＢＳ、５０μＭの２−ＭＥ、０．０１ＭのＨＥＰＥＳおよび抗生剤（１００ｕｎｉｔ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン）が含まれたＲＰＭＩ１６４０培地を利用して２４−ウェルプレートで１２時間培養した。この際、２４−ウェルプレートは、Ｔ細胞を再刺激させるために１μｇ／ｍｌの抗−ＣＤ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と１μｇ／ｍｌの抗−ＣＤ２８（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）抗体でコートされたものを利用した。

その結果、図１３に示されたように、Ｔｈ１細胞により生成される主なサイトカインであるＩＦＮ−γの量は、Ｄｅｒｆ２抗原がローディングされた細胞外小胞投与群は、対照群と比較して増加し、Ｄｅｒｆ２抗原がローディングされた細胞外小胞の鼻腔投与時に用量依存的に減少した。Ｔｈ１７で生成される主なサイトカインであるＩＬ−１７の場合、Ｄｅｒｆ２抗原がローディングされた細胞外小胞投与群は、鼻腔投与と関係なく対照群と比較して増加した（図１３参照）。

［実施例９：北アメリカ家塵ダニ抽出アレルゲンで誘導された喘息動物モデルにおいてＤｅｒｆ２抗原がローディングされた細胞外小胞の抗炎症効果］
家塵ダニアレルゲンで誘導されたマウス喘息モデルにおいてＤｅｒｆ２抗原がローディングされた細胞外小胞の効能を評価するために、次のような実験を行った（図１４参照）。図１４に示されたように、喘息モデルを製作するために北アメリカ家塵ダニからアレルゲンを抽出した後、アレルゲン７５μｇにａｌｕｍを混ぜて腹腔に２回投与した後、アレルゲン５０μｇを単独で２回鼻腔に投与して喘息モデルを製作した（図１４参照）。

Ｄｅｒｆ２抗原がローディングされた細胞外小胞で免疫反応を誘導するためには、実施例５の方法で設定された濃度で図９に示されたように、喘息モデルを製作する前にＤｅｒｆ２抗原がローディングされた細胞外小胞を３回筋肉注射と鼻腔投与し、喘息モデルを製作する間には、鼻腔にのみＤｅｒｆ２抗原がローディングされた細胞外小胞を投与した（図１４参照）。

その結果、図１５に示されたように、Ｄｅｒｆ２抗原がローディングされた細胞外小胞を投与しない陽性対照群マウスでは、家塵ダニアレルゲンで喘息を誘導した時、気管支肺胞洗浄液内炎症細胞の数が顕著に増加した。喘息モデルの製作前にＤｅｒｆ２抗原がローディングされた細胞外小胞で免疫反応を誘導したマウスでは、気管支肺胞洗浄液内炎症細胞の数が、陽性対照群に比べて顕著に減少し、Ｄｅｒｆ２抗原がローディングされた細胞外小胞を喘息モデルの製作前と製作後に持続的に投与したマウスでは、陽性対照群だけでなく、喘息モデルの製作前にＤｅｒｆ２抗原がローディングされた細胞外小胞を投与した場合に比べて炎症細胞数が顕著に減少した（図１５参照）。

したがって、Ｄｅｒｆ２抗原がローディングされた細胞外小胞を鼻腔に投与した時、北アメリカ家塵ダニアレルゲンによる喘息を効率的に抑制することができることが分かった。

前述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で容易に変形が可能であることを理解することができる。したがって、以上で記述した実施例は、すべての面において例示的なものであり、限定的でないものと理解されなければならない。

Claims

細菌由来細胞外小胞を有効成分として含有するアレルギー疾患予防または治療用薬学的組成物であって、前記細菌は、家塵ダニ由来アレルゲン遺伝子を過発現させた細菌であり、前記アレルギー疾患は、家塵ダニ由来アレルゲンによるアレルギー疾患であることを特徴とする、薬学的組成物。
前記細菌は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはサルモネラ菌であることを特徴とする、請求項１に記載の薬学的組成物。
前記家塵ダニは、ヨーロッパ家塵ダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）または北アメリカ家塵ダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓｆａｒｉｎａｅ）であることを特徴とする、請求項１に記載の薬学的組成物。
前記家塵ダニは、北アメリカ家塵ダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓｆａｒｉｎａｅ）であることを特徴とする、請求項３に記載の薬学的組成物。
前記家塵ダニ由来アレルゲンは、Ｄｅｒｐ１、Ｄｅｒｐ２、Ｄｅｒｐ３、Ｄｅｒｐ４、Ｄｅｒｐ６、Ｄｅｒｐ９、Ｄｅｒｐ１５、Ｄｅｒｆ１、Ｄｅｒｆ２、Ｄｅｒｆ１１、およびＤｅｒｆ１８よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の薬学的組成物。
前記家塵ダニ由来アレルゲンは、Ｄｅｒｆ２であることを特徴とする、請求項５に記載の薬学的組成物。
（ａ）家塵ダニ由来アレルゲン遺伝子を細菌に過発現させる段階と；
（ｂ）前記過発現された細菌を培養する段階と；
（ｃ）前記細菌培養液から小胞を分離する段階と；
（ｄ）前記細菌由来小胞の外膜内毒素の活性を除去する段階とを含む、家塵ダニ由来アレルゲンによるアレルギー疾患予防または治療用細菌由来小胞の製造方法であって、
前記（ａ）段階の家塵ダニ由来アレルゲンは、Ｄｅｒｆ２であることを特徴とする、方法。
前記家塵ダニは、北アメリカ家塵ダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓｆａｒｉｎａｅ）であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
前記細菌は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはサルモネラ菌であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
請求項１に記載の薬学的組成物を個体に投与する段階を含む、アレルギー疾患の治療方法。
請求項１に記載の、薬学的組成物のアレルギー疾患予防または治療用途。