JP2019206581A - スキンケア組成物およびこれの使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
脂肪組織は、脂肪をトリグリセリドの形態で貯蔵するための主要な部位として機能する、特殊な結合組織である。脂質生成は、脂肪合成の結果としての最終的な沈着であり、沈着は脂肪組織と肝臓で起こる過程である。食事で消費される炭水化物とタンパク質を脂肪に変換することができる。
「ヘテロシクリルアルキル」は、式−RbReの基を示し、Rbは上で定義したようなアルキレン鎖であり、Reは上で定義したようなヘテロシクリル基であり、ヘテロシクリルが窒素含有ヘテロシクリルである場合、ヘテロシクリルは、窒素原子にてアルキル基に結合されてよい。本明細書に別途特に示さない限り、ヘテロシクリルアルキル基は場合により置換されてよい。
(A)R1−L−R2−R3
式中、R1は、0から10個の−OH、−C(=O)Rg、−C(=O)ORgによって場合により置換され、0から2個の二重結合を含有する直鎖C5−20であり;
Rgは同じであるか、または異なり、独立して水素またはC1−5アルキルであり;
Lは、構造(B)のテトラヒドロフラン基、構造(C)のエポキシ基、構造(D)の複素環基、
Rは、Hまたは−OHであり、Xは、−OHによって場合により置換されたC0−5アルキルであり;
R2は、場合によりヒドロキシル化またはカルボキシル化され、0から2個の二重結合を含有する直鎖C5−20であり;
R3は、
アンノナ・スクアモサ(Annona squamosa)のエチルアセテート抽出物の調製
アンノナ・スクアモサ(Annona squamosa)の全果実を乾燥させ、粒径2ミリメートル(mm)以下に粉砕した。乾燥粉砕植物材料(100グラム(g)を次に三角フラスコに移し、エチルアセテート(700ミリリットル(mL))を添加した。混合物を4時間振とうし、ろ過して、バイオマスを再度、エチルアセテート(700mL)で4時間抽出した。これらの抽出溶液を合せ、真空下で蒸発させて、アンノナ・スクアモサ(Annona squamosa)エチルアセテート抽出物AS−EA1 6.59gを得た。抽出収率は約6.5%(重量/重量)であった。
アンノナ・スクアモサ(Annona squamosa)のヘキサン抽出物の調製
アンノナ・スクアモサ(Annona squamosa)の乾燥全果実を粒径2ミリメートル以下に粉砕した。乾燥粉砕植物材料(100g)を次に三角フラスコに移し、ヘキサン(700mL)を添加した。混合物を4時間振とうし、ろ過して、バイオマスを再度、ヘキサン(700mL)で4時間抽出した。これらの抽出溶液を合せ、真空下で蒸発させて、アンノナ・スクアモサ(Annona squamosa)ヘキサン抽出物AS−HX2 5.73gを得た。抽出収率は約5.7%(重量/重量)であった。
アンノナ・スクアモサ(Annona squamosa)のエタノール抽出物の調製
アンノナ・スクアモサ(Annona squamosa)の乾燥全果実を粒径2ミリメートル以下に粉砕した。乾燥粉砕植物材料(100g)を次に三角フラスコに移し、エタノール(700mL)を添加した。混合物を4時間振とうし、ろ過して、バイオマスを再度、エタノール(700mL)で4時間抽出した。これらの抽出溶液を合せ、真空下で蒸発させて、アンノナ・スクアモサ(Annona squamosa)エタノール抽出物AS−EE3 26.2gを得た。抽出収率は約26.2%(重量/重量)であった。
アンノナ・スクアモサ(Annona squamosa)の70%EtOH抽出物の調製
アンノナ・スクアモサ(Annona squamosa)の全果実を乾燥させ、粒径2ミリメートル以下に粉砕した。乾燥粉砕植物材料(100g)を次に三角フラスコに移し、70%エタノール(700mL)を添加した。混合物を4時間振とうし、ろ過して、バイオマスを再度、70%エタノール(700mL)で4時間抽出した。これらの抽出溶液を合せ、真空下で蒸発させて、アンノナ・スクアモサ(Annona squamosa)70%エタノール抽出物AS−EE4 35.2gを得た。抽出収率は約35.1%(重量/重量)であった。
アンノナ・スクアモサ(Annona squamosa)抽出物からのスクアモシンの単離
アンノナ・スクアモサ(Annona squamosa)(シュガーアップル)AS−EA1抽出沈殿物の合計1gをメタノールに溶解させて、次に20分間音波破砕した。懸濁物を13,000rpmにて1分間遠心分離して、油画分を除去した。メタノール可溶性画分を0.45μm PTFEシリンジフィルタでろ過して、ろ液を分取HPLCシステム(JAI、LC−9104、日本)への注入によりRP−HPLCカラム(YMC−ODS)5μm、C18(250×30mm)に供し、H2O中80%アセトニトリルで20.9分間、UV波長210nmで溶離させて、化合物SA1(スクアモシン)19mgを得た。
アンノナ・スクアモサ(Annona squamosa)抽出物からのカウレン酸の単離
脱色アンノナ・スクアモサ(Annona squamosa)(シュガーアップル)抽出物の合計2gをメタノールに溶解させ、次に20分間音波破砕した。懸濁物を13,000rpmにて1分間遠心分離して、油を除去し、次に0.45μm PTFEシリンジフィルタを使用してメタノール可溶性部分をろ過して、ろ液を分取HPLCシステム(JAI、LC−9104、日本)への注入によりRP−HPLC カラム(YMC−ODS)5μm、C18(250×30mm)に供し、H2O中85%アセトニトリルで10分間、UV波長200nmで溶離させて、化合物SA2(カウレン酸)260mgを得た。
SA1およびSA2アンノナ・スクアモサ(Annona squamosa)画分のHPLC定量
アンノナ・スクアモサ(Annona squamosa)抽出物中の同定構成成分のスクアモシン(SA1)およびカウレン酸(SA2)を、Luna C−18逆相カラム(Phenomenex、10μm、250mm×4.6mm)を使用してAgilent HPLCシステムで210nmにて定量した。水(移動相A)およびアセトニトリル(移動相B)のバイナリグラジエントを用いて、流速1ml/分およびカラム温度35℃にてカラムを溶離した。
アンノナ(Annona)のEtOAc抽出物の調製
アンノナ・スクアモサ(Annona squamosa)の乾燥全果実を粒径2ミリメートル以下に粉砕した。乾燥粉砕植物材料(2kg)を三角フラスコに移し、次にエチルアセテート(EtOAc)14Lを添加した。混合物を4時間振とうし、ろ過して、バイオマスを再度、7L EtOAcでさらに2時間抽出した。これらの抽出溶液を合せ、真空下で蒸発させて、初期エチルアセテート抽出物を得た。これらの初期EtOAc抽出物は黄色粘性液体であり、室温での貯蔵後に沈殿層を形成した。EtOAc抽出物の上清および沈殿物を遠心分離によって分離した。表2に4バッチのEtOAc抽出結果をまとめる。
アンノナ(Annona)からの超臨界流体CO2抽出物の調製
アンノナ・スクアモサ(Annona squamosa)の乾燥全果実を粒径2ミリメートル以下に粉砕した。乾燥粉砕植物材料(100kg)を次に超臨界流体抽出装置(圧力25MPa、温度50℃、CO2流70mL/分、2時間)に移し、エチルアルコール(95%食品グレードエタノール、量は原材料の30%である。)を添加した。超臨界流体CO2抽出物を真空下で蒸発させた。表3に5つの異なるバッチ実験による抽出結果を示す。
脱色アンノナ(Annona)CO2抽出物の調製
アンノナ・スクアモサ(Annona squamosa)超臨界流体CO2抽出物(AS−SC2)の合計250gを、エチルアセテート(3,750mL)で15倍に希釈した。懸濁物を180rpm、室温にて30分間撹拌し、活性炭(250g;Merck、食品グレード)を添加して、混合物をさらに1時間撹拌して、ろ紙(Hyundai、285mm)を通過させ、次にろ液をメンブレンフィルタ(Whatman GF/C)に通過させた。残渣をエチルアセテート(3,750mL)で再度、1時間抽出し、ろ紙、次にメンブレンフィルタを通過させた。これらの溶液を合せ、真空下で蒸発させて、脱色アンノナ・スクアモサ(Annona squamosa)抽出物(AS−SCd2−EA)188.9gを得た。脱色収率は75.56%であった。
アンノナ・スクアモサ(Annona squamosa)EtOAc抽出物中の活性化合物の定量
アンノナ・スクアモサ(Annona squamosa)全果実を、中国(CN)およびインド(IN)の異なる場所(表4に場所A、BまたはCと記載)から収集した。乾燥果実を粒径2ミリメートル以下に粉砕した。乾燥粉砕植物材料(100g)を三角フラスコに入れ、エチルアセテート700mLを添加し、混合物を4時間振とうして、ろ過し、次にバイオマスをエチルアセテート350mLで再度、さらに2時間抽出した。これらの抽出溶液を合せ、真空下で蒸発させて、エチルアセテート抽出物を得た。
ロスマリヌス(Rosmarinus)(ローズマリー)EtOH抽出物の調製
ロスマリヌス・オフィシナリス(Rosmarinus officinalis)(ローズマリー)乾燥葉粉末をエタノールまたはエタノール−水で抽出した。得られた溶液をろ過して上清を得て、続いて蒸発器で濃縮した。濃縮した上清を真空下で乾燥させて、約30%から約60%のカルノシン酸を含有するローズマリー抽出物を得た。
ローズマリー抽出物中のカルノシン酸のHPLC定量
ローズマリー葉抽出物中のカルノシン酸を、Agilent HPLC システムのLuna C18逆相カラム(Phenomenex、5μm、250mm×4.6mm)および206nm UV検出装置を使用して定量した。水中0.1%リン酸(移動相A)およびアセトニトリル(移動相B)のバイナリグラジエントを用いて、流速1ml/分およびカラム温度40℃にてカラムを溶離した。
脱色ローズマリー抽出物の調製
60%カルノシン酸を含有するローズマリー抽出物の合計0.5kgを15倍量のメタノール(7.5L)に溶解させた。溶液を180rpm、室温にて1時間撹拌した。次に活性炭(Merck、食品グレード)1kgを溶液中に添加した。混合物を1時間撹拌し、ろ紙(Hyundai、285mm)でろ過して、次にメンブレンフィルタ(Whatman GF/C、カタログ番号1822 047)でろ過した。残渣をメタノール(7.5L)で再度、1時間抽出した。溶液をろ紙でろ過し、次にメンブレンフィルタでろ過した。これらの溶液を合せ、真空下で蒸発させて、脱色ローズマリー抽出物(RO−EEdl2)384.9gを得た。脱色収率は約74%から76%であった。同じ脱色法を3回反復した。
ザントキシラム(Zanthoxylum)EtOH抽出物および水抽出物の調製
乾燥ザントキシラム・アメリカヌム(Zanthoxylum americanum)M.またはザントキシラム・クラバ−ヘリクリス(Zanthoxylum clava−herculis)L.(シュガーアップル)樹皮の合計800kgを乾燥、切断、粉砕し、次におよそ3倍(2,400L)の水中90%エチルアルコール(体積/体積)で抽出した。抽出を90℃にて8時間行った。エタノール溶液をろ過して上清を得て、上清を次に真空下、40℃にて蒸発器で濃縮した。これらの抽出および濃縮手順を3回反復した。最終抽出溶液を次に合せて、共に濃縮した。濃縮した溶液を冷蔵庫で24時間貯蔵して、上清を得た。上清を真空乾燥させて、ザントキシラム(Zanthoxylum)EtOH抽出物粉末ZA−EE15 87.5kgを得た。抽出収率は約10.9%(重量/重量)であった。
ザントキシラム(Zanthoxylum)EtOH抽出物のシリカカラム画分
Z.アメリカヌム(americanum)抽出物ZA−EE15(実施例15に記載)の合計100.8グラムをシリカゲルカラムに装填して、MeOH:水の線形グラジエントを含有する溶媒混合物(5:1から1:4および100%水)を段階的に添加して溶離させ、9つの画分を生成した。重量分布を表7に示す。
ザントキシラム(Zanthoxylum)抽出物からのマグノフロリンおよびラウリホリンのHPLC定量
ザントキシラム(Zanthoxylum)EtOH抽出物中の活性構成成分マグノフロリンおよびラウリホリンをAgilent 1200HPLCシステムのLuna C18逆相カラム(Phenomenex、5μm、250mm×4.6mm)で275nmにて定量した。水(移動相A)およびアセトニトリル(移動相B)のバイナリグラジエントを用いて、流速1ml/分およびカラム温度35℃にてカラムを溶離した。
脱色ザントキシラム(Zanthoxylum)抽出物の調製
実施例15により生成したザントキシラム(Zanthoxylum)抽出物の合計1kgを15倍量のメタノール(15L)に溶解させ、180rpm、室温にて1時間撹拌し、次に活性炭(Merck、食品グレード)1kgを懸濁物中に添加した。混合物をさらに1時間撹拌し、ろ紙(Hyundai、285mm)でろ過して、次にメンブレンフィルタ(Whatman GF/C、カタログ番号1822 047)でろ過した。回収した残渣を再度、15Lメタノールで1時間抽出し、ろ紙で、次にメンブレンフィルタでろ過した。これらの溶液を合せ、真空下で蒸発させて、脱色ザントキシラム(Zanthoxylum)抽出物ZA−EEdl8 0.7kgを得た。脱色収率は70重量%であった、脱色ザントキシラム(Zanthoxylum)抽出物ZA−EEdl8の合計0.7kgをマルトデキストリン1.4kgと共に1:2の比で、ほぼ6Lの水に溶解させた。スプレー乾燥機を使用して懸濁物を乾燥させ、ザントキシラム(Zanthoxylum)組成物ZA−EEdml8.1の収量は1,948gであった。スプレー乾燥法の収率は92.8%であった。この方法を3回反復して、処理したザントキシラム(Zanthoxylum)抽出物の3つのバッチの活性成分の含有率を表9に示す。
ローズマリー抽出物の脱色効率の測定
脱色ローズマリー抽出物の吸光度を測定するために、1%メタノール溶液を調製し、次に0.45μmナイロンシリンジフィルタでろ過した。1mlの量の溶液を1cm石英容器(Bioteck biocell)に入れ、分光光度計(PowerWave XS Microplate分光光度計)を使用して、660nmのUV波長における吸光度を測定した。ローズマリー抽出物の効率的な脱色を、0.3より低いUV 660nm値と見なした。ローズマリー抽出物粉末の目視による色外観を薄黄色または薄緑がかった色と定義した。実施例14による3種類の異なる脱色ローズマリー抽出物を分析した。
ザントキシラム(Zanthoxylum)抽出物の脱色効率の測定
脱色ザントキシラム(Zanthoxylum)抽出物の吸光度を測定するために、50%メタノール水溶液中の1%溶液(50%MeOH:50%H20)を調製し、次に0.45μmナイロンシリンジフィルタでろ過した。1mlの量の溶液を1cm石英容器(Bioteck biocell)に入れ、分光光度計(PowerWave XS Microplate分光光度計)を使用して、450から900nmに及ぶUV波長における吸光度を測定して、未脱色ザントキシラム(Zanthoxylum)抽出物の吸光度と比較した。ザントキシラム(Zanthoxylum)抽出物の効率的な脱色は、0.7より低いUV450nm、550nmおよび650nm値であると見なした。ザントキシラム(Zanthoxylum)抽出物粉末の目視による色外観を薄ベージュ色と定義した。実施例18による3種類の異なる脱色ザントキシラム(Zanthoxylum)抽出物を分析した。
アンノナ(Annona):ローズマリー:ザントキシラム(Zanthoxylum)ブレンド(ARZ−21)の調製
脱色アンノナ(Annona)抽出物、ローズマリー抽出物および脱色ザントキシラム(Zanthoxylum)抽出物のブレンドを1:2:20(重量/重量/重量)の比で調製した。脱色ザントキシラム(Zanthoxylum)組成物ZA−EEdml8.1の合計800gを5Lスケールのリボンブレンダ(Han−Seong F&C、韓国)に入れ、次に脱色アンノナ(Annona)抽出物40gを滴下により添加した。2つの抽出物を20rpmの速度で撹拌して1時間ブレンドした。続いて、ローズマリー抽出物80gをザントキシラム(Zanthoxylum)/アンノナ(Annona)ミックスに添加して、さらに2時間ブレンドして、最終生成物ARZ−21 899.4g(回収収率97.8%)を得た。方法を3回反復した。ARZ−21中の活性成分含有率を表12に示す。
脂肪細胞中の脂質蓄積アッセイ
マウス胎児線維芽細胞3T3−L1細胞(American Type Culture Collectionより購入)を、10%仔ウシ血清を含有するダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)(GIBCO)中でコンフルエントまで培養した。コンフルエント2日後(D0)に、10%ウシ胎児血清(FBS)、5μg/mlインスリン、0.5mM 3−イソブチル−1−メチルキサンチン(IBMX)および1μMデキサメタゾンを含有するDMEMを添加することによって、2日間(D2)にわたって細胞を刺激し脂肪細胞様表現型に分化させた。次に細胞を、5μg/mlインスリンを含む10%FBS/DMEM培地中でさらに2日間維持し(D4)、続いて10%FBS/DMEM培地で4日間培養した(D8)。様々な濃度の試験サンプルを脂肪生成の第0日から第8日まで細胞に添加し、この間、培地を、試験サンプルを含有する新しい培地と2日ごとに交換した。第8日に、細胞中の脂質滴をオイルレッドO(ORO)で染色し、シグナルを510nmにて測定した。
アンノナ(Annona)抽出物、画分および活性化合物の脂質蓄積に対する効果
実施例19の脂質蓄積アッセイを、(それぞれ実施例3および4で生成したような)アンノナ・スクアモサ(Annona squamosa)エタノール抽出物AS−EE3およびAS−EE4を用いて行った。簡潔には、アンノナ(Annona)AS−EE3(100%EtOH)抽出物およびAS−EE4(70%EtOH)抽出物の3種類の濃度(0.1、0.5および1μg/ml)および正の対照TNF−α(10ng/mL)を使用して、分化期間(脂肪生成の第0日から第8日)の間に3T3−L1細胞を処置した。抽出物を含有する細胞培養培地を2日ごとに交換して、ORO染色を使用して細胞中の脂質滴蓄積を検出した。
ローズマリー抽出物の脂質蓄積に対する効果
ローズマリーのEtOH抽出物およびH2O/EtOH抽出物を実施例12に記載したように製造した。各抽出物を2つの用量(0.05μg/mlおよび0.1μg/ml)で試験して、脂質蓄積に対する抽出物の効果を評価した。
アンノナ(Annona):ローズマリー抽出物の組み合わせの脂質蓄積に対する効果
実施例10、12および14で調製したような抽出物を使用して、アンノナ・スクアモサ(Annona squamosa)およびカルノシン酸高濃度化ローズマリーからの抽出物の組み合わせを製造した。より詳細には、30%カルノシン酸または60%カルノシン酸(脱色)のどちらかを含有するローズマリー抽出物を、2%、1%または0.5%スクアモシンを含有するアンノナ・スクアモサ(Annona squamosa)抽出物(SA1)と組み合わせた。各組み合わせの以下のような4つの濃度2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/mlおよび15μg/mlを、脂質蓄積(accumulaton)に対する組み合わせの効果について試験した。
ザントキシラム(Zanthoxylum)抽出物および画分の脂質蓄積に対する効果
実施例15に記載するように製造したザントキシラム(Zanthoxylum)90%EtOH抽出物を、実施例16に記載するようにMeOH可溶性画分とMeOH不溶部に分けた。各抽出物を3つの濃度(20μg/ml、40μg/ml、80μg/mlおよび160μg/ml)で試験して、ザントキシラム(Zanthoxylum)抽出物の脂質蓄積に対する効果を調べた。
アンノナ(ANNONA):ローズマリー抽出物−ザントキシラム(Zanthoxylum)組み合わせの脂質蓄積に対する効果
アンノナ・スクアモサ(Annona squamosa)抽出物AS−SCd2−EA(実施例10に記載したように調製)、カルノシン酸高濃度化ローズマリー抽出物RO−EEd2(実施例14に記載したように調製)およびザントキシラム(Zanthoxylum)抽出物ZA−EEdl8(実施例18に記載したように調製)の組み合わせを作り、個々の抽出物および組み合わせそれぞれについて、以下の4つの濃度:0.9μg/ml、1.875μg/ml、3.75μg/mlおよび7.5μg/mlにて実施例19の脂質蓄積アッセイで試験した。
ヒト皮下脂肪細胞における分化アッセイ
脂質蓄積抑制アッセイおよび分化アッセイによって、化合物がヒト皮下前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化を抑制する能力について調べた。すべての細胞が同期して次に分化するように、細胞をコンフルエントまで増殖させた。前駆脂肪細胞培地(PM−1)を用いて、低温保存した前駆脂肪細胞を継代した。細胞にコンフルエントまで1日おきにPM−1を供給した。分化を誘導するために、第2日に、PM−1培地を、インスリン、デキサメタゾン、イソブチルメチルキサンチン、PPAR−γアゴニスト、TNF−αおよび試験化合物を含む分化培地(DM−2)と交換した。7日後、培地を、試験化合物を含まない脂肪細胞培地に変更した。アッセイの第16日に、細胞毒性および脂質蓄積を測定した。培地を除去して、各ウェルに50μlを残した。Cell Titer Blue試薬10μlを各ウェルに添加した。細胞を37℃にて2時間インキュベートした。条件培地の50μlサンプルを新たなソリッド・ブラック・プレートに取り除いた。蛍光を励起560nm/発光590nmにて測定した。次に細胞をPBSで洗浄して、溶解緩衝剤によって溶解させた。試薬Bを各ウェルに添加して、細胞を37℃にて2時間インキュベートした。溶解液の一定分量をPBSで希釈し、次に試薬Aを各ウェルに添加した。15分後に、540nmにて光学密度を読み取った。試薬は、トリグリセリドから遊離したグリセロールの量を測定する。
アンノナ(Annona)抽出物のヒト前駆脂肪細胞分化に対する効果
実施例28の脂質蓄積アッセイを、アンノナ・スクアモサ(Annona squamosa)抽出物を用いて行った。簡潔には、6つの濃度のアンノナ(Annona)抽出物(0.1、0.5、1、5、10および15μg/ml)ならびにDMSO 0.10%、対照としてのTNF−α(0.01μg/mL)およびPPAR−γアゴニスト(10μMΜ)を使用して、分化期間のヒト皮下脂肪細胞を処置した。処置の2週間後、細胞をPBSで洗浄し、溶解させ、トリグリセリドを総TGアッセイキット(Zen−bio)によって測定した。試薬は微生物リパーゼを含有し、トリグリセリドから遊離したグリセロールの量を測定した。
アンノナ(Annona):ローズマリー:ザントキシラム(Zanthoxylum)組み合わせ(ARZ−21)のヒト前駆脂肪細胞分化に対する効果
実施例28の脂質蓄積アッセイを、アンノナ(Annona)、ローズマリーおよびザントキシラム(Zanthoxylum)の組み合わせ(ARZ−21)を用いて行った。簡潔には、6つの濃度の組み合わせ(1、5、10、15、20および25μg/ml)ならびに対照としてのDMSO(0.10%)、TNF−α(0.01μg/mL)およびPPAR−γアゴニスト(10μM)を使用して分化期間のヒト皮下脂肪細胞を処置した。処置の2週間後、細胞をPBSで洗浄し、溶解させ、トリグリセリドを総TGアッセイキット(Zen−bio)によって測定した。試薬は微生物リパーゼを含有し、トリグリセリドから遊離したグリセロールの量を測定した。
アンノナ(ANNONA):ローズマリー抽出物組み合わせの細胞間トリグリセリド含有率に対する効果
トリグリセリド(TG)含有率アッセイのために、6ウェルプレート内で3T3−L1前駆脂肪細胞を脂肪細胞分化中に、2.5、5および10μg/mlの濃度の組み合わせによって8日間処置した。細胞をPBSで洗浄して、ホモジナイズ溶液を用いて擦り取った。残留細胞溶解液を3000gにて5分間遠心分離して、脂肪層を除去した。上清をアッセイした。市販のキット(#10010303、Cayman Chem.、米国)を製造者の説明書に従って使用して、トリグリセリドレベルを測定した。脂肪細胞が分化すると、これらの細胞間のトリグリセリドレベルが連続的に上昇する。
カルノシン酸高濃度化ローズマリー抽出物の抗酸化(ANT−OXIDANT)効果
安定なフリーラジカル1,1−ジフェニル−2−ピクリル−ヒドラジル(DPPH)を使用して、ローズマリー抽出物サンプルのフリーラジカル捕捉活性を調べた。簡潔には、DPPHの0.2mM溶液をDMSO中で調製し、該溶液を1、5、10、20および40μg/mlの濃度の各サンプルと混合した。暗所での30分間のインキュベーションの後、517nmにて吸光度を分光光度計によって測定した。溶液吸光度の低下は、DPPHの低下および抗酸化効果を示す。抗酸化活性を抑制パーセントとして表す。
ラット大動脈環を使用した血管弛緩アッセイ
オスのスプラーグ・ドーリー・ラットから単離した大動脈環を、クレブス緩衝溶液(37℃、pH7.4)中に配置して、95%O2/5%CO2を通気させた。付着した脂肪および癒着性外膜周囲組織を慎重に除去して、血管を長さ2−3mmの環4個に切り分けた。大動脈環を三角形ステンレス鋼線試料ホルダー2個に取り付け、クレブス緩衝溶液を満たした7.5mLオーガンバスに移し、95%O2/5%CO2(37℃、pH7.4)を通気させた。等尺性力を測定するために、各環を組織バス内の固定ガラスフックに、および無重量ワイヤフックを介して、4チャネルミオグラフ(DMT DK/610M、デンマーク)に連結された力変換器に取り付けた。システムインテグレータのソフトウェアプログラム(アナログ−デジタルコンバータ、Powerlab 8/30,Adinstruments Co.)およびデータ取込ソフトウェア(Chart 6.0、Adinstruments Co.)を使用して、パーソナルコンピュータで記録した。環を受動張力下に置いて2.0gの前負荷を生じさせ、この張力で1時間平衡にさせた。この期間中に、組織を新たな通気緩衝液で2回洗浄し、設定した2.0gの前負荷が維持されるまで、環に対する静止力を調整した。300nMフェニレフリンの蓄積適用により、各環を収縮させた。フェニレフリンの存在下でアセチルコリン(ACh、1nMから約10μM)が80%を超える環の緩和を誘発する能力を判定することによって、すべての調製物における生存内皮の存在を判定した。
ザントキシラム(Zanthoxylum)抽出物のラット大動脈環の収縮に対する効果
ザントキシラム(Zanthoxylum)抽出物(実施例18に記載したように製造)の、以下のような4つの異なる用量:30μg/ml、100μg/ml、300μg/mlおよび1,000μg/mlで、大動脈環を処置した。ザントキシラム(Zanthoxylum)抽出物の各用量による処置の後、大動脈環を30分間の期間にわたってクレブス緩衝剤(37℃、pH7.4)で3回洗浄して、大動脈圧を元の前負荷レベルとするか、または元の前負荷レベルよりやや低くした。ザントキシラム(Zanthoxylum)抽出物の血管弛緩効果を、単離ラット大動脈調製物におけるフェニレフリン(300nM)による前処置によって誘発された収縮の抑制パーセントとして測定した。
アンノナ(Annona)抽出物のラット大動脈環収縮に対する効果
大動脈環を以下のような4つの異なる量のアンノナ・スクアモサ(Annona squamosa)(シュガーアップル)抽出物上清AS−EA8S組成物:0.0030%、0.01%、0.03%および0.1%(すべて体積/体積)で処置した。アンノナ(Annona)抽出物の各用量による処置の後、大動脈環を30分間の期間にわたってクレブス緩衝剤(37℃、pH7.4)で3回洗浄して、大動脈圧を元の前負荷レベルとするか、または元の前負荷レベルよりやや低くした。アンノナ(Annona)抽出物処置の血管弛緩効果を、単離ラット大動脈調製物のフェニレフリン(300nM)による前処置によって誘発された収縮の抑制パーセントとして測定した。
抗血小板凝集アッセイ
オスのスプラーグ・ドーリー・ラットの全血を、抗凝固性クエン酸/デキストロース溶液(ACD、85mMトリナトリウムシトレート、83mMデキストロースおよび21mMクエン酸)1mLを含有する15mL試験管に収集した。血液を170×gにて7分間遠心分離して多血小板血漿を得て、さらに120×gにて7分間遠心分離して残留赤血球を除去した。この多血小板血漿を洗浄緩衝液と共に350×gにて10分間、さらに2回遠心分離してACD溶液を除去し、次に血小板沈殿を凝集アッセイのために、タイロード緩衝剤(NaCl 137mM、NaHCO3 12mM、グルコース5.5mM、KCl 2mM、MgCl2 1mM、NaHPO4 0.3mMおよびpH7.4)で(3×108/mL)に調整した。血小板凝集計(Chronolog、ヘイバータウン、ペンシルベニア州、米国)で発光を測定することによって、凝集を監視した。洗浄した血小板を試験サンプルまたはビヒクル(<0.1%)のどちらかで37℃にて2分間プレインキュベートし、次にアゴニストで刺激した。反応混合物を170×gにて撹拌しながら、さらに5分間インキュベートした。
ザントキシラム(Zanthoxylum)抽出物の血小板凝集に対する効果
実施例33に記載したように調製した洗浄血小板を、ザントキシラム(Zanthoxylum)抽出物ZA−EEdl8またはビヒクル(<0.1%)のどちらかで37℃にて2分間プレインキュベートし、次にアデノシンジホスフェート(ADP)によって刺激した。ADPは、血小板凝集および血栓形成の周知の可溶性アゴニストである。反応混合物を170×gにて撹拌しながら、さらに5分間インキュベートした。
アンノナ(Annona)抽出物の血小板凝集に対する効果
実施例36に記載したように調製した洗浄血小板を、アンノナ(Annona)抽出物上清AS−EA8Sまたはビヒクル(<0.1%)のどちらかで37℃にて2分間プレインキュベートし、ADPで刺激して、次に170×gにて撹拌しながらさらに5分間インキュベートした。
ローズマリー抽出物の血小板凝集に対する効果
洗浄血小板をカルノシン酸高濃度化ローズマリー抽出物(30%もしくは60%)(実施例14に記載したように調製)またはビヒクル(<0.1%)のどちらかで37℃にて2分間プレインキュベートして、ADPで刺激して、次に170×gにて撹拌しながらさらに5分間インキュベートした。
酸化窒素アッセイ
RAW264.7(Korean Cell Line Bank、韓国)を5%CO2の湿潤雰囲気中37℃にて、10%熱不活性化ウシ胎児血清(WelGene Co.、韓国)、100μg/mlストレプトマイシンおよび100U/mlペニシリン(Lonza、メリーランド州、米国)によって強化したダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)(Dalseogu、韓国)中で培養および維持した。培養したRAW264.7細胞(4×105)を96ウェルプレートにて、試験サンプル(1、3、10μg/ml)を用いてまたは用いずに30分間前処置して、次にリポ多糖(LPS、0.1μg/ml)によって18時間刺激した。細胞培養上清(100μl)を等量のグリース試薬(5%リン酸(H3PO4)中1%スルファニルアミドおよび脱イオン蒸留水中0.1%N−1−ナフチレンジアミンジヒドロクロリド(NEDHC) と混合し、次にプレートをELISAリーダーで540nmにて読み取った。NaNO2の標準(1mM)を使用して、培養培地中の蓄積亜硝酸塩を定量した。
アンノナ(Annona)抽出物の酸化窒素産生に対する効果
マクロファージにおけるNOの過剰産生は、炎症の特徴である。
ローズマリー抽出物の酸化窒素産生に対する効果
マクロファージにおけるNOの過剰産生は、炎症の特徴である。
アンノナ(Annona)、ローズマリーおよびザントキシラム(Zanthoxylum)抽出物のクリーム製剤およびローション製剤
抽出物
アンノナ(Annona)(実施例10に従って調製)、ザントキシラム(Zanthoxylum)(実施例18に従って調製)、ローズマリー(実施例14に従って調製)またはこれらのいずれかの組み合わせからの活性植物抽出物を、以下の表に示すような液体製剤、クリーム製剤およびローション製剤に処方した。
抗セルライト外用クリームの効果を評価するランダム化比較ヒト臨床研究
ランダム化比較研究を含む8週間の臨床試験において、抗セルライト外用クリーム(アンノナ(Annona)、ローズマリーおよびザントキシラム(Zanthoxylum)からの抽出物を含む。)の効果を評価する。使用4週間および8週間後、以下の:(a)セルライト外観の低減、(b)胴部、腕、腰部および大腿部の皮膚の輪郭および色むらの外観の改善、(c)よりスリムな胴部、腰部および大腿部の外観の補助、(d)ボディマス指数(BMI)の改善、(e)胴部、腰部および大腿部における体脂肪含有率の改善(キャリパー法)、(f)皮膚の弾性およびハリの改善ならびに(g)皮膚保湿性の増加(水分計)があるか否かを評価する。外観のセルライトおよび関連パラメータの改善は、視覚的診断基準、機器測定およびアンケートによって測定する。試験は一般に、20名の2群(一つの群に試験製品を投与、他方の群にはプラセボを投与)より構成された、任意の人種または皮膚タイプの健康な女性(n=40)に対して行う。ベースラインセルライトは、第0日(視覚的アナログ尺度(VAS)≧2を有する必要がある。)、第1週、第2週、第4週および第8週に測定する。
8週間の単純盲検ランダム化比較研究において、実施例21に記載したARZ−21ローション組成物をコホートの対象40名で評価した。試験製品または実対照薬をランダム化コードに従って各対象に割り付けた。各対象は、8週間の期間にわたって、提供された説明書に従って製品を使用した。対象の大腿部の皮膚の病状を、標準順序尺度および視覚的アナログ尺度(VAS)を使用して専門臨床診断基準によって評価した。キャリパー測定、インボディ(INBODY)、キュートメーター、コルネオメーターならびにシリコーン複製キャスティングおよび解析を含む機器判定を行った。全対象の大腿部の皮膚の写真も撮影した。対象のアンケートを利用して、製品効力の消費者意識を収集した。来院は、ベースラインと、製品使用の2週間後、4週間後および8週間後に行った。
1.セルライトの外観低減
2.大腿上部の皮膚の輪郭および色むらの外観の改善(ハリ)
3.よりスリムな大腿上部の外観の補助;
4.ボディマス指数(BMI)の改善(インボディBMI測定によって判定)
5.大腿上部の体脂肪含有率の改善(体脂肪判定;各領域でのキャリパー法によって判定)
6.皮膚の弾性およびハリ(視覚的診断基準、キュートメーターによって判定)の改善
7.皮膚保湿性の上昇(コルネオメーターによって判定)
1.登録時を含めて18歳から59歳であり、全身健康状態が良好の、任意の人種および皮膚タイプの女性。
2.インフォームドコンセントを読み取り、理解し、署名すること、研究指示を理解して従うことに特に依存はない、簡単な個人/病歴を記入することが可能。
3.ベースライン判定における標準順序尺度でスコアが2以上の、軽度から重度の大腿部のセルライト。
4.研究期間にわたって、両大腿部の皮膚の長期間の日光暴露および人工タンニング剤のあらゆる使用を控えることに特に依存はない。
5.研究期間にわたって、割り付けられた試験物質以外の、保湿剤、クリームおよび洗浄剤を含むいずれの皮膚処置製品の大腿部に対する使用開始を控えることに特に依存はない。
6.黒色の(研究来院ごとに同じ)肌着を着用して来院することに特に依存はなく、ゆったりしたショーツ(対象が準備)に着替えることに特に依存はない、判定および撮影のためにショーツを取ることに特に依存はない。
1.研究期間中に妊娠中、授乳中または妊娠の可能性がある。
2.他の何らかの臨床研究に参加している。
3.皮膚処置製品に対する過敏症またはパーソナルケア製品に対する既知のアレルギーの何らかの病歴(自己報告)。
4.疾患、負傷、アルコール依存、薬物乱用、精神病、アンタゴニスト(antagonistic)パーソナリティ、モチベーションの不足、虚弱障害、感情的、知的、心理的または社会的であり得る他の問題などの、対象の本試験への参加同意を無効にするおよび/または対象が研究診療すべてを定期的に受けるもしくは他のすべてのプロトコル要件に従う能力を制限するおそれのある、登録時に明らかであるまたは登録後に認識された何らかの病状。
5.試験担当医師が、研究への登録が不適格である妥当な理由と見なす、他の何らかの病状。
機器評価および視覚的評価:
すべての来院による機器スコアおよび視覚的スコアの平均および標準偏差を得て、対応のないt検定を利用して群間で比較した。有意性はp<0.05に設定した。
応答度数パーセントを各来院時の質問ごとに作表して、製品群データを、アンケートの構造に応じてウィルコクソンの順位和検定またはカイ二乗検定を利用して比較した。
機器判定−キュートメーター
皮膚のハリの平均ベースラインスコアからの統計的に有意な改善は、両方の製品群で第2週、第4週および第8週の来院時に認められた。皮膚弾性の平均ベースラインスコアからの統計的に有意な改善は、両方の群で第8週の来院時のみに認められた。実対照薬ローションの皮膚弾性の平均ベースラインスコアからの統計的に有意な低減(悪化)は、第2週の来院で認められた。
平均粗さ(Ra)の平均ベースラインスコアからの統計的に有意な改善は、実対照薬ローション群で第4週のみに認められた。ベースラインと比較して、他の有意な変化は認められなかった。両方の群の結果の比較解析によって、統計的に有意な差は示されなかった。
ARZ−21ローションおよび実対照薬ローションの両方で、時間および製品使用の関数として、肯定的な回答が増加した。第2週、第4週および第8週に、ARZ−21ローション群の対象の大部分(>50%)が、試験製品によって皮膚の水和度/保湿性が改善したことと、皮膚のキメ/滑らかさが改善されたことを認めた。第4週および第8週に、ARZ−21ローション群の対象の大半(>50%)が、試験製品によって皮膚のキメ/滑らかさが改善し、大腿上部の皮膚の輪郭および色むらの外観が改善したことを認めた。B群では第4週および第8週において、大半が、ARZ−21製品によって、セルライトの外観が低減され、大腿上部の皮膚の輪郭および色むらの外観が改善され、皮膚のハリ/弾性が改善されたことも示した。第8週に、ARZ−21ローション群の対象の大半(>50%)が、試験製品によって皮膚のハリ/弾性が改善したことを認めた。
Claims (30)
- 皮膚のたるみまたはゆるみを引き締めハリを付与する、皮膚老化の影響を管理または制御または低減または防止する、皮膚色むらを改善する、皮膚弾性を改善する、皮膚を滑らかにするもしくは皮膚色むら調整する、皮膚の回復を促進する、より滑らかで引き締まった皮膚のために保水量を低減する、フリーラジカルのダメージから保護する、脂肪合成を低減する、細胞における脂肪含有率を低減する、脂肪細胞のサイズを低減する、脂肪細胞への細胞分化を低減または抑制する、脂肪細胞のアポトーシスを促進する、脂肪分解を促進する、脂肪除去を改善する、健全な脂質プロフィールを維持または促進または補助する、健全なコレステロールレベルを維持または促進または補助するための、もしくはこれらのいずれかの組み合わせのための方法であって、以下の式(A)による構造を有する1種類以上のアセトゲニンを含む組成物の有効量を投与する工程を含む方法:
(A) R1−L−R2−R3
式中、R1は、0から10個の−OH、−C(=O)Rg、−C(=O)ORgによって場合により置換され、および0から2個の二重結合を含有する直鎖C5−20であり;
Rgは同じであるかまたは異なり、および独立して水素またはC1−5アルキルであり;
Lは、構造(B)のテトラヒドロフラン基、構造(C)のエポキシ基、構造(D)の複素環基、
Rは、Hまたは−OHであり、およびXは、−OHによって場合により置換されたC0−5アルキルであり;
R2は、場合によりヒドロキシル化またはカルボキシル化され、および0から2個の二重結合を含有する直鎖C5−20であり;
R3は、
- 組成物が、1種類以上のアセトゲニンが高濃度化されたアンノナ(Annona)抽出物を含む、請求項1または2に記載の方法。
- アンノナ(Annona)抽出物がアンノナ・スクアモサ(Annona squamosa)抽出物である、請求項3に記載の方法。
- アンノナ(Annona)抽出物がアンノナ(Annona)果実抽出物である、請求項3または4に記載の方法。
- アンノナ(Annona)抽出物が脱色されている、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- アンノナ(Annona)抽出物がスクアモシン、モトリリンまたは両方について高濃度化されている、請求項3から6のいずれか一項に記載の方法。
- アンノナ(Annona)抽出物が約0.1%から約30%のアセトゲニンを含む、請求項3から7のいずれか一項に記載の方法。
- 組成物がアジュバントをさらに含む、請求項3から8のいずれか一項に記載の方法。
- アジュバントがコントアリング剤(contouring agent)、スキントナー、脂肪分解促進剤、循環改善剤またはこれらのいずれかの組み合わせを含む、請求項9に記載の方法。
- コントアリング剤(contouring agent)がコラーゲン、エラスチンまたは両方である、請求項10に記載の方法。
- スキントナーがハス抽出物、ケロシア・クリスタタ(celosia cristata)、バッカリス(baccharis)、アクアティックミント、中国紅茶、リコピン、ヒアルロン酸、レモン、レモン精油、カフェインと組み合わせたレモン精油、サリチル酸、ジュニパーベリーの精油、ゼラニウムの精油、ローズマリーの精油、コーラアット(kola aut)、カフェイン、ビバマタ類海藻(bladderwrack marine algae)、プニカ・グラナトゥム(punica granatum)、DMAE(ジメチルアミノエタノール)、レバン分子、アボカド種子抽出物、エンドウ抽出物、ビタミンEまたはこれらのいずれかの組み合わせである、請求項10に記載の方法。
- 脂肪分解促進剤がアミノフィリン、ハス抽出物、ブルー・ボタン・フラワー(スカビオウス(Scabious))、ゼラニウム、ソウジュツ、カフェイン、紅茶、バーバナ(verbana)抽出物、共役リノール酸、ラウロイルプロリン、キノア抽出物、コエンザイムA、カルニチン、マイクロパッチカフェイン、TEA−ヒドロヨージド、レモンおよびレモングラスの精油、ショウガ抽出物、ユズ種子抽出物、小麦タンパク質、メチルキサンチン、シクロヘキシルカルバメート化合物、ブチレングリコール、グロブラリア・コルディフォリア(globularia cordifolia)カルス培養抽出物、ジンギベル・ゼルムベット(Zingiber zerumbet)抽出物、生シアバター抽出物、活性グラウシンコンプレックス、エルダー抽出物小麦タンパク質アルコール非含有、セイヨウシロヤナギ、天然アカトウガラシ油、海藻エッセンス、カルボポール、茶、ガラナまたはこれらのいずれかの組み合わせである、請求項10に記載の方法。
- 循環改善剤がセージ抽出物、紅藻類抽出物、カイガンショウ抽出物、エスシン(escine)、ツタ、ツタ抽出物、センテッラ(centella)、ルスクス(ruscus)、カイエンペッパー、スクアレン、アーモンドタンパク質、ケイ素、イモーテルの精油、ペパーミントの精油、パルマローザの精油、カプサイシン、サイプレスの精油、中鎖トリグリセリド(MCT)、アーティチョーク抽出物、ピタヤ抽出物、プリックリー・アッシュ樹皮抽出物またはこれらのいずれかの組み合わせである、請求項10に記載の方法。
- 組成物が、テルペンが高濃度化されたローズマリー抽出物をさらに含む、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
- 組成物が、1種類以上のイソキノリンアルカロイドが高濃度化されたザントキシラム(Zanthoxylum)抽出物をさらに含む、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
- 組成物が外用投与される、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
- 1種類以上のアセトゲニンが高濃度化されたアンノナ(Annona)抽出物のバイオマーカーがカウレン酸である、請求項3から17のいずれか一項に記載の方法。
- アンノナ(Annona)抽出物およびザントキシラム(Zanthoxylum)抽出物の混合物を含む、スキンケア組成物。
- アンノナ(Annona)抽出物が1種類以上のアセトゲニンについて高濃度化され、およびザントキシラム(Zanthoxylum)抽出物が1種類以上のイソキノリンアルカロイドについて高濃度化されている、請求項19に記載のスキンケア組成物。
- アンノナ(Annona)抽出物がアンノナ(Annona)果実抽出物であり、およびザントキシラム(Zanthoxylum)抽出物がザントキシラム(Zanthoxylum)樹皮抽出物である、請求項19または20に記載のスキンケア組成物。
- アンノナ(Annona)抽出物がスクアモシン、モトリリンまたは両方について高濃度化され、およびザントキシラム(Zanthoxylum)抽出物がマグノフロリン、ラウリフロリン(lauriflorine)または両方について高濃度化されている、請求項19から21のいずれかに記載のスキンケア組成物。
- 組成物が、カルノシン酸、カルノソール、ウルソール酸またはこれらのいずれかの組み合わせを含むテルペンが高濃度化されているローズマリー抽出物をさらに含む、請求項19から22のいずれか一項に記載のスキンケア組成物。
- 一方または両方の抽出物が脱色されている、請求項19から23のいずれか一項に記載のスキンケア組成物。
- 組成物が、薬学的に、皮膚科学的にまたは化粧品的に許容される担体、希釈剤または賦形剤をさらに含む、請求項19から24のいずれか一項に記載のスキンケア組成物。
- 医薬製剤、皮膚科製剤または化粧品製剤が、約1.0重量%のアセトゲニンを含む約0.05重量%から約0.5重量%のアンノナ(Annona)抽出物、約3.0重量%のアポルフィンアルカロイドを含む約1.0重量%から約6.0重量%のザントキシラム(Zanthoxylum)抽出物、および約60重量%のカルノシン酸を含む約0.1重量%から約2重量%のローズマリー抽出物を含む、請求項25に記載のスキンケア組成物。
- アンノナ(Annona)抽出物、ザントキシラム(Zanthoxylum)抽出物およびローズマリー抽出物がそれぞれ約5:10:1から約1:120:2の重量比でブレンドされる、請求項23から26のいずれか一項に記載のスキンケア組成物。
- 組成物がコントアリング剤(contouring agent)、スキントナー、脂肪分解促進剤、循環改善剤またはこれらのいずれかの組み合わせから選択されるアジュバントをさらに含む、請求項19から27のいずれか一項に記載のスキンケア組成物。
- 組成物が溶媒、増粘剤、消泡剤、皮膚軟化剤、保存剤またはこれらのいずれかの組み合わせをさらに含む、請求項19から28のいずれか一項に記載のスキンケア組成物。
- 組成物が粉末、液体、ゲル、エマルジョン、クリームまたはローションとして処方される、請求項19から29のいずれか一項に記載のスキンケア組成物。
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