JP2019189826A - 粒子、粒子の製造方法、アフィニティー粒子、及び、これを含む検査試薬及び検査キット、並びに標的物質の検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 非特異吸着を抑制する能力が高く、且つ、粒子表面にリガンドを化学結合するための官能基を有する粒子、及び、この粒子を高収率で製造するための新規手法を提供する。【解決手段】 カルボキシル基を有する第１のラジカル重合性単量体を溶解させた水溶液を用意する工程と、前記水溶液と、エポキシ基を有する第２のラジカル重合性単量体と、ラジカル重合開始剤とを混合し、ラジカル重合することによって粒状重合体を形成させる工程を含むことを特徴とする粒子の製造方法。【選択図】 なし

Description

本発明は、粒子、粒子の製造方法、アフィニティー粒子、及び、これを含む検査試薬及び検査キット、並びに標的物質の検出方法に関する。

近年、標的物質に対して親和性を有するリガンドと粒子が化学結合して成るアフィニティー粒子を使用して、標的物質を精製したり、定量したりする研究が広く行われている。このような目的に使用される粒子には、標的物質以外の物質と吸着する特性、いわゆる非特異吸着性が小さいことが望まれる。例えば、非特許文献１では、スチレンとグリシジルメタクリレートの両モノマーを用い、乳化重合によって表面がポリグリシジルメタクリレートで被覆された樹脂粒子（以下、ＳＧ粒子）が開示されている。また、特許文献１では、ＳＧ粒子の粒径制御方法が開示されている。

ＳＧ粒子は、ポリグリシジルメタクリレート由来のエポキシ基が一部開環してグリコールとなっており、このグリコールの親水性に起因して非特異吸着が抑制される。一方、ＳＧ粒子表面にリガンドを化学結合する場合、ポリグリシジルメタクリレート由来のエポキシ基をそのまま利用することも可能である。しかし、通常は、エポキシ基をカルボキシル基、アミノ基、チオール基等の別の反応性官能基に変換する工程を経た後、この反応性官能基とリガンドを化学反応させる方法が一般的である。中でもＳＧ粒子のエポキシ基をカルボキシル基に変換した粒子が、粒子表面にリガンドを化学結合する上で汎用性があり、好ましい形態である。

特開２０１４−１９３９７２号公報 特開２０１４−１５３１４０号公報

アフィニティーラテックスを用いたバイオセパレーション（１９９５）ｐ１１−ｐ３０

しかし、ＳＧ粒子のポリグリシジルメタクリレート由来のエポキシ基をカルボキシル基に変換する工程は、複数回の遠心精製をともなう非常に煩雑なものであり、このことがＳＧ粒子の工業生産の阻害要因となっている。スチレンとグリシジルメタクリレートを乳化重合する際、カルボキシル基を有するラジカル重合性単量体を共重合することにより、複数回の遠心精製をともなうことなく、ＳＧ粒子にカルボキシル基を導入することは理屈上可能である。しかし、重合反応中にグリシジルメタクリレート由来のエポキシ基とラジカル重合性単量体由来のカルボキシル基が化学反応し、多量の凝集物が生じる結果、収率が極めて低くなることが課題であった。

本発明は、これらの背景技術、及び、課題を鑑みてなされたものである。本発明の目的は、ＳＧ粒子と同等、或いはそれ以上に非特異吸着を抑制する能力が高く、且つ、粒子表面にリガンドを化学結合するためのカルボキシル基を有する粒子、及び、この粒子を高収率で製造するための新規手法を提供することである。

本発明に係る粒子の製造方法は、
カルボキシル基を有する第１のラジカル重合性単量体を溶解させた水溶液を用意する工程と、
前記水溶液と、エポキシ基を有する第２のラジカル重合性単量体と、ラジカル重合開始剤とを混合し、ラジカル重合することによって粒状重合体を形成させる工程を含むことを特徴とする。

また、本発明に係る粒子は、
下記一般式（３）で表される繰り返し単位Ａと、下記一般式（４）で表される繰り返し単位Ｂとを有する共重合体を含む、

上記一般式（３）においてＲ_１は、ＨあるいはＣＨ_３を表し、
Ｌ１は、炭素数１から３のアルキレン基を表し、
上記一般式（４）においてＲ_２は、ＨあるいはＣＨ_３を表し、
Ｌ２及びＬ３は、互いに独立に炭素数１から３のアルキレン基を表し、
前記Ｌ１と前記Ｌ２の炭素数の和に１を足した数が、前記Ｌ３の炭素数以上である。

本発明によれば、非特異吸着を抑制する能力が高く、且つ、粒子表面にリガンドを化学結合するための官能基を有する粒子、及び、この粒子を高収率で製造するための新規手法を提供することができる。

以下、本発明を実施形態について詳しく説明するが、本発明の技術範囲はこれらの実施形態に限定されない。

（粒子の製造方法）
本発明の実施形態に係る粒子の製造方法について説明する。

本実施形態に係る粒子の製造方法は、以下の工程を有する。

カルボキシル基を有する第１のラジカル重合性単量体を溶解させた水溶液を用意する工程。
前記水溶液と、エポキシ基を有する第２のラジカル重合性単量体と、ラジカル重合開始剤とを混合し、第１のラジカル重合性単量体と第２のラジカル重合性単量体とをラジカル重合することによって粒状重合体を形成させる工程。

ここで粒状重合体とは、単量体の重合によって生成した重合体が、粒子形状をなしたものを意味する。粒状重合体は単に粒子と呼ぶこともできる。

本実施形態に係る製造方法によって得られる粒子は、第１のラジカル重合性単量体に由来するカルボキシル基と、第２のラジカル重合性単量体の有するエポキシ基に由来するグリコールに起因して、親水性が高い。そのため、非特異吸着を抑制する能力が高い。なお、第１のラジカル重合性単量体に由来するカルボキシル基はリガンドと結合する反応性官能基である。

（ラジカル重合）
本実施形態に係る粒状重合体を形成させる方法は、本発明の目的を達成可能な範囲において、ラジカル重合を行うこと以外の工程を有していてもよい。ラジカル重合の例として、乳化重合、ソープフリー乳化重合、懸濁重合等が挙げられる。ラジカル重合の中で、乳化重合あるいはソープフリー乳化重合を用いることが好ましく、ソープフリー乳化重合を用いることがさらに好ましい。一般に、懸濁重合と比較して乳化重合とソープフリー乳化重合は、粒径分布がシャープな粒状重合体を得ることができる。また、粒子を、後述するリガンドと化学結合させる場合、乳化重合で一般的に用いるようなアニオン性界面活性剤が存在すると、リガンドを変性させてしまうおそれがある。よって、本実施形態に係る粒状重合体を形成させる方法は、ソープフリー乳化重合が最も好ましい。

（油性のラジカル重合性単量体）
本実施形態に係る粒子の製造方法において、第１のラジカル重合性単量体と第２のラジカル重合性単量体に加え、さらに油性のラジカル重合性単量体をラジカル重合の反応場に共存させることが好ましい。それにより、形成する粒状重合体は、第１のラジカル重合性単量体に由来する繰り返し単位Ａと、第２のラジカル重合性単量体に由来する繰り返し単位Ｂと、油性のラジカル重合性単量体に由来する疎水性の繰り返し単位Ｃを有する共重合体となる。なお、油性のラジカル重合性単量体が、スチレン類、（メタ）アクリレート類の群から選択される少なくとも一種であることが好ましい。ここで、ラジカル重合の反応場とは、ラジカル重合性単量体と、ラジカル重合開始剤とが共存している溶液を意味する。

疎水性の繰り返し単位Ｃを有すると、繰り返し単位Ａと、繰り返し単位Ｂのみを有する共重合体から成る粒状重合体よりも物理的に強固である。そのため、精製時に遠心操作を繰り返しても割れや欠けが抑制される。 以下、本実施形態に係る製造方法に用いることのできる油性のラジカル重合性単量体の事例を列挙するが、本発明はこれらに限定されない。また、２種類以上の油性のラジカル重合性単量体を用いても良い。

スチレン類：スチレン、α−メチルスチレン、β−メチルスチレン、ｏ−メチルスチレン、ｍ−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、２，４−ジメチルスチレン、ｐ−ｎ−ブチルスチレン、ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルスチレン、ｐ−ｎ−ヘキシルスチレン、ｐ−ｎ−オクチルスチレン、ｐ−ｎ−ノニルスチレン、ｐ−ｎ−デシルスチレン、ｐ−ｎ−ドデシルスチレン、ｐ−メトキシスチレン、及び、ｐ−フェニルスチレン等。

（メタ）アクリレート類：メチルアクリレート、エチルアクリレート、ｎ−プロピルアクリレート、ｉｓｏ−プロピルアクリレート、ｎ−ブチルアクリレート、ｉｓｏ−ブチルアクリレート、ｔｅｒｔ−ブチルアクリレート、ｎ−アミルアクリレート、ｎ−ヘキシルアクリレート、２−エチルヘキシルアクリレート、ｎ−オクチルアクリレート、ｎ−ノニルアクリレート、シクロヘキシルアクリレート、ベンジルアクリレート、ジメチルフォスフェートエチルアクリレート、ジエチルフォスフェートエチルアクリレート、ジブチルフォスフェートエチルアクリレート、及び、２−ベンゾイルオキシエチルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、ｎ−プロピルメタクリレート、ｉｓｏ−プロピルメタクリレート、ｎ−ブチルメタクリレート、ｉｓｏ−ブチルメタクリレート、ｔｅｒｔ−ブチルメタクリレート、ｎ−アミルメタクリレート、ｎ−ヘキシルメタクリレート、２−エチルヘキシルメタクリレート、ｎ−オクチルメタクリレート、ｎ−ノニルメタクリレート、ジエチルフォスフェートエチルメタクリレート、及び、ジブチルフォスフェートエチルメタクリレート等。

例示したラジカル重合性単量体において、スチレン類ではスチレン、（メタ）アクリレート類ではメチルメタクリレートを用いることが好ましい。スチレンやメチルメタクリレートから成るなる重合体はガラス転移温度が高く、形成する粒状重合体に十分な強度を付与することができる。

（架橋性のラジカル重合性単量体）
割れや欠けが抑制された強固な粒状重合体を得るために、粒状重合体を得る工程において、第１のラジカル重合性単量体と第２のラジカル重合性単量体に加え、さらに架橋性のラジカル重合性単量体を共存させることが好ましい。架橋性のラジカル重合性単量体と上記油性のラジカル重合性単量体の両方を共存させておいてもよい。

以下、本実施形態に係る製造方法で用いることのできる架橋性のラジカル重合性単量体を列挙するが、本発明はこれらに限定されない。また、２種類以上の、油性のラジカル重合性単量体を用いても良い。例示したラジカル重合性単量体において、理由は明らかでないが、ジビニルベンゼンを用いる場合に、ラジカル重合反応時のハンドリング性に優れ、好ましい。

架橋性のラジカル重合性単量体：ジエチレングリコールジアクリレート、トリエチレングリコールジアクリレート、テトラエチレングリコールジアクリレート、ポリエチレングリコールジアクリレート、１，６−ヘキサンジオールジアクリレート、ネオペンチルグリコールジアクリレート、トリプロピレングリコールジアクリレート、ポリプロピレングリコールジアクリレート、２，２’−ビス（４−（アクリロキシジエトキシ）フェニル）プロパン、トリメチロールプロパントリアクリレート、テトラメチロールメタンテトラアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、ジエチレングリコールジメタクリレート、トリエチレングリコールジメタクリレート、テトラエチレングリコールジメタクリレート、ポリエチレングリコールジメタクリレート、１，３−ブチレングリコールジメタクリレート、１，６−ヘキサンジオールジメタクリレート、ネオペンチルグリコールジメタクリレート、ポリプロピレングリコールジメタクリレート、２，２’−ビス（４−（メタクリロキシジエトキシ）フェニル）プロパン、２，２’−ビス（４−（メタクリロキシポリエトキシ）フェニル）プロパン、トリメチロールプロパントリメタクリレート、テトラメチロールメタンテトラメタクリレート、ジビニルベンゼン、ジビニルナフタリン、及び、ジビニルエーテル等。

本実施形態における粒状重合体を形成させる過程において、第２のラジカル重合性単量体をさらに混合し、前記粒状重合体の表面を第２のラジカル重合性単量体に由来する重合体で被覆する工程をさらに含むことが好ましい。この工程を経て得た粒子は、第２のラジカル重合性単量体のエポキシ基に由来するグリコールを表面に高密度で有するため、非特異吸着の抑制能力が非常に優れる（高い）ことが発明者らの検討により明らかになっている。

（ラジカル重合の反応場のｐＨ）
本実施形態に係る粒子の製造方法においては、粒状重合体を形成させる工程のラジカル重合の反応場のｐＨを、第１のラジカル重合性単量体のｐｋａ以下にすることが好ましい。具体的には、ラジカル重合の反応場のｐＨは、４以下が好ましく、３．６以下がより好ましく、２以下が好ましい。ラジカル重合の反応場のｐＨを第１のラジカル重合性単量体のｐｋａ以下に調整するための工程を有していても良く、ｐＨを調整する工程は酸を添加する工程を含んでいても良い。

本実施形態において第１のラジカル重合性単量体はカルボキシル基を有するため、そのｐｋａは酸性領域となる。酸性領域の水中では、カルボキシル基とエポキシ基の化学反応よりも、水とエポキシ基の化学反応が優先される。そのため、第１のラジカル重合性単量体の有するカルボキシル基と、第２のラジカル重合性単量体の有するエポキシ基の化学反応が生じにくく、粒状重合体の凝集を抑制し、粒子の収率を高めることができる。さらに、ラジカル重合の反応場のｐＨを、第１のラジカル重合性単量体のｐｋａ以下に保持することで、第１のラジカル重合性単量体の有するカルボキシル基の解離が抑制される。そのため、ラジカル重合性開始剤や界面活性剤に由来する電荷と干渉することがなく、粒径分布がシャープな粒子が得られやすい。また、ラジカル重合性反応場のｐＨを２以下に保持する場合、第２のラジカル重合性単量体のエポキシ基と水との化学反応が生じやすい。そのため、粒状重合体を形成させる工程と並行して、前記エポキシ基を開環してグリコールに変換でき、粒子を製造するためのタクトを短くできる。

（エポキシ基の開環）
本実施形態に係る粒子の製造方法においては、第２のラジカル重合性単量体に由来するエポキシ基を開環させ、グリコールに変換する工程を含むことができる。前記エポキシ基を開環させる方法は、本発明の目的を達成可能な範囲において特に限定されない。上述のように、ラジカル重合性反応場のｐＨを酸性領域に保持することによって、粒状重合体を形成させる工程と並行して、エポキシ基をグリコールに変換しても良い。また、粒状重合体を形成させた後、粒状重合体を酸性水溶液中、或いは塩基性水溶液中に分散させ、加熱することによって、エポキシ基をグリコールに変換しても良い。

（第１のラジカル重合性単量体）
本実施形態における第１のラジカル重合性単量体について説明する。

本実施形態における第１のラジカル重合性単量体はカルボキシル基を有する重合体単量体であれば良く、本発明の目的を達成可能な範囲においてその化学構造は限定されない。本実施形態における第１のラジカル重合性単量体は下記一般式（１）で表される化学構造であることが好ましい。ここで、Ｒ_１はＨ（水素）あるいはＣＨ_３（メチル基）の何れかであり、Ｌ１及びＬ２は互いに独立に、炭素数１から３のアルキレン基である。第１のラジカル重合性単量体は水溶性であり、一般式（１）で表される構造であれば嵩高い化学構造を有する。嵩高い化学構造を有することにより、粒状重合体を形成させる工程において、排除体積効果によって粒状重合体の分散安定性に寄与し、粒子の収率向上、及び、粒子の粒度分布をシャープにする上で有利に働く。

（第２のラジカル重合性単量体）
本実施形態における第２のラジカル重合性単量体について説明する。本実施形態における第２のラジカル重合性単量体はエポキシ基を有するラジカル重合性単量体していれば良く、本発明の目的を達成可能な範囲においてその化学構造は限定されない。実施形態における第２のラジカル重合性単量体は、一般式（２）で表される化学構造であることが好ましい。ここで、Ｒ_２はＨ（水素）あるいはＣＨ_３（メチル基）の何れかであり、Ｌ３は炭素数１から３のアルキレン基である。

一般式（１）と一般式（２）の関係において、Ｌ１とＬ２の炭素数の和に１を足した数が、Ｌ３の炭素数以上であることが好ましい。このような関係を満たす場合、上述の第１のラジカル重合性単量体に由来する排除体積効果が効果的に機能する。また、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３の何れの炭素数も１の場合、一般式（１）及び一般式（２）で表される構造が最も親水性になるため、得られる粒子の非特異吸着の抑制能力が最大となる。

以上のことから、第１のラジカル重合性単量体が２−（メタ）アクリロイロキシエチルコハク酸であり、第２のラジカル重合性単量体がグリシジル（メタ）アクリレートであることが最も好ましい。

本発明の目的を達成可能な範囲において、第１のラジカル重合性単量体と第２のラジカル重合性単量体の仕込み割合は限定されない。好ましくは［第１のラジカル重合性単量体（質量）］／［第２のラジカル重合性単量体（質量）］が、０．００１以上１以下、好ましくは、０．０１以上０．５以下、より好ましくは、０．０５以上０．２以下である。

また、油性のラジカル重合性単量体を用いる場合、本発明の目的を達成可能な範囲において、第２のラジカル重合性単量体との仕込みの割合は限定されない。好ましくは［第２のラジカル重合性単量体（質量）］／［油性のラジカル重合性単量体（質量）］が、１以上２０以下、好ましくは１．５以上１０以下、より好ましくは、１．５以上５以下である。

（ラジカル重合開始剤）
本実施形態におけるラジカル重合開始剤について説明する。本実施形態におけるラジカル重合開始剤は、本発明の目的を達成可能な範囲において限定されないが、カチオン性ラジカル重合開始剤を用いることが好ましい。アニオン性ラジカル重合開始剤を用いて得た粒子のゼータ電位は負に大きく、静電的な要因による非特異吸着が発生するおそれがある。また、ノニオン性ラジカル重合開始剤を用いる場合、粒状重合体の粒径が粗大化しやすく、界面活性剤の併用が必要になる場合がある。一方、カチオン性ラジカル重合開始剤を用いて得た粒子のゼータ電位は一般的に正、かつ小さく、静電要因による非特異吸着のおそれが少ない。

以下、本実施形態に係る製造方法で用いることのできるカチオン性ラジカル重合開始剤の事例を列挙するが、本発明はこれらに限定されない。また、２種類以上のカチオン性ラジカル重合開始剤を用いても良い。

カチオン性ラジカル重合開始剤：４，４’―Ａｚｏｂｉｓ（４−ｃｙａｎｏｖａｌｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、２，２’−Ａｚｏｂｉｓ［２−ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｅ、２，２’−Ａｚｏｂｉｓ［Ｎ−（２−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）−２−ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｉｎｅ］ｔｅｔｒａｈｙｄｒａｔｅ、２，２’−Ａｚｏｂｉｓ（２−ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｉｎｅ）ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（Ｖ−５０（和光純薬株式会社））、２，２’−Ａｚｏｂｉｓ［２−（２−ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎ−２−ｙｌ）ｐｒｏｐａｎｅ］、２，２’−Ａｚｏｂｉｓ［２−（２−ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎ−２−ｙｌ）ｐｒｏｐａｎｅ］ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、２，２’−Ａｚｏｂｉｓ［２−（２−ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎ−２−ｙｌ）ｐｒｏｐａｎｅ］ｄｉｓｕｌｆａｔｅ ｄｉｈｙｄｒａｔｅ等。

（粒子）
本実施形態に係る粒子について説明する。本実施形態に係る粒子は、下記一般式（３）で表される繰り返し単位Ａと、下記一般式（４）で表される繰り返し単位Ｂを有する共重合体を含み構成される粒子である。一般式（３）と一般式（４）の関係において、Ｌ１とＬ２の炭素数の和に１を足した数が、Ｌ３の炭素数以上であることが好ましい。このような関係を満たす場合、繰り返し単位Ａに由来するカルボキシル基とリガンドを化学結合するための化学反応の反応効率が高まるからである。また、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３の何れの炭素数も１の場合、一般式（３）及び一般式（４）が最も親水性になるため、得られる粒子の非特異吸着の抑制能力が最大となる。

本実施形態に係る粒子は、上記共重合体が、更に疎水性の繰り返し単位Ｃを有することが好ましい。共重合体が、更に疎水性の繰り返し単位Ｃを有することにより、繰り返し単位Ａと繰り返し単位Ｂのみの共重体から成る粒子よりも、物理的に強固になり、遠心操作を繰り返しても割れや欠けが少ない。

本実施形態において、疎水性の繰り返し単位Ｃは、本発明の目的を達成可能な範囲においてその化学構造は限定されないが、好ましくはスチレン類、（メタ）アクリレート類に由来する群から選択される少なくとも一種であることが好ましい。すなわち、繰り返し単位Ｃが、スチレン類の重合体を構成する繰り返し単位、及び（メタ）アクリレート類の重合体を構成する繰り返し単位から選択される少なくとも一種であることが好ましい。
なお、繰り返し単位Ｃがポリスチレンを構成する繰り返し単位、或いは、ポリメチルメタクリレートを構成する繰り返し単位、或いはその両方を含む場合、繰り返し単位Ｃのガラス転移温度が高く、粒子が十分な強度を有するため好ましい。

本発明の目的を達成可能な範囲において、繰り返し単位Ａと繰り返し単位Ｂの組成比率は限定されない。好ましくは［繰り返し単位Ａ（質量）］／［繰り返し単位Ｂ（質量）］が、０．００１以上１以下、好ましくは、０．０１以上０．５以下、より好ましくは、０．０５以上０．２以下である。この好ましい範囲は、粒子が、繰り返し単位Ａに由来するカルボキシル基とリガンドを化学結合するための化学反応の反応効率と、繰り返し単位Ｂに由来する非特異吸着を抑制する能力との関係で決まる数値である。そして、上記関係を満たす場合、粒子の、反応効率と非特異吸着を抑制する能力とのバランスが良い。

また、疎水性の繰り返し単位Ｃを用いる場合、本発明の目的を達成可能な範囲において、繰り返し単位Ｂとの組成比率は限定されない。好ましくは［繰り返し単位Ｂ（質量）］／［繰り返し単位Ｃ（質量）］が、１以上２０以下、好ましくは１．５以上１０以下、より好ましくは、１．５以上５以下である。この好ましい範囲は、粒子が、繰り返し単位Ｂに由来する非特異吸着を抑制する能力と、粒子の強度との関係で決まる数値であり、上記関係を満たす場合、粒子の、非特異吸着を抑制する能力と強度のバランスが良い。

本実施形態に係る粒子の粒径は、水中における個数平均粒子径で０．０５μｍ以上１μｍ以下、好ましくは０．１μｍ以上０．５μｍ以下、より好ましくは０．１５μｍ以上０．３μｍ以下である。０．１５μｍ以上０．３μｍ以下である場合、遠心操作におけるハンドリング性に優れ、且つ、粒子の非表面積が大きい。本実施形態に係る粒子の粒径は、動的光散乱法によって評価されたものである。

（リガンド・アフィニティー粒子）
本実施形態では、本実施形態に係る粒子と、上記繰り返し単位Ａに含まれる（由来する）カルボキシル基に化学結合したリガンドとを有するアフィニティー粒子を提供できる。本実施形態において、リガンドとは、特定の標的物質が有する受容体に特異的に結合する化合物のことである。リガンドが標的物質と結合する部位は決まっており、選択的または特異的に高い親和性を有する。例えば、抗原と抗体、酵素タンパク質とその基質、ホルモンや神経伝達物質などのシグナル物質とその受容体、核酸などが例示されるが、本実施形態におけるリガンドはこれらに限定されない。核酸としてはデオキシリボ核酸等が挙げられる。本実施形態におけるアフィニティー粒子とは、標的物質に対して選択的または特異的に高い親和性（アフィニティー）を有する。本実施形態におけるリガンドが、抗体、抗原、及び核酸のいずれかであることが好ましい。

本実施形態において、本実施形態に係る粒子が有する繰り返し単位Ａに由来するカルボキシル基とリガンドとを化学結合する化学反応の方法は、本発明の目的を達成可能な範囲において、従来公知の方法を適用することができる。例えば、カルボジイミド媒介性反応やＮＨＳエステル活性化反応は、良く用いられる化学反応の方法であるが、本実施形態に係る粒子が有する繰り返し単位Ａに由来するカルボキシル基とリガンドとを化学結合する化学反応の方法はこれらに限定されない。また、リガンドをアミド結合させる場合は、１−［３−（ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド］等の触媒を適宜用いることができる。

本実施形態におけるアフィニティー粒子が、リガンドとして抗体（抗原）、標的物質として抗原（抗体）を用いる場合、臨床検査、生化学研究等の領域において広く活用されている免疫ラテックス凝集測定法に好ましく適用できる。一般的な粒子を免疫ラテックス凝集測定法に適用した場合、標的物質である抗原（抗体）や血清中の異物等が粒子表面に非特異吸着し、このことに起因して意図しない粒子凝集が検出されてしまい正確な測定の妨げになること（欺様性なノイズ）が課題になっている。

そのため、欺様性なノイズを低減することを目的として、通常、アルブミンなどの生物由来物質をブロッキング剤として粒子にコーティングし、粒子表面への非特異吸着を抑制して用いられている。しかし、このような生物由来物質は、ロットによってその特性が少しずつ異なる。そのため、これらによってコーティングされた粒子は、コーティング処理ごとに非特異吸着の抑制能力が異なるため、非特異吸着を抑制する能力が同水準の粒子を安定的に供給することに課題がある。また、粒子表面にコーティングされた生物由来物質は、変性によって疎水性を呈することがあり、必ずしも非特異吸着を抑制する能力に優れるわけではない。また、生物汚染も課題として挙げられる。

特許文献２では、スルフェニル基を側鎖に有する繰り返し単位を有する重合体をブロッキング剤として粒子にコーティングすることを特徴とする体外診断に用いるアフィニティー粒子を開示している。しかし、スルフェニル基を側鎖に有する繰り返し単位を有する重合体は、水溶性で、物理的吸着によって粒子表面をコーティングしていることから、本質的に、希釈によって遊離する懸念がある。また、発明者らは非特許文献１に記載の方法に従って得たＳＧ粒子と、特許文献２に記載の方法に従って得たポリスチレン粒子に吸着させた粒子の、乳ビ中における非特異吸着の抑制能力を評価した。ここで、特許文献２に記載の方法に従って得た粒子は、具体的に、スルフェニル基を側鎖に有する繰り返し単位を有する重合体を、ソープフリー乳化重合によって得た。

その結果、非特許文献１を完全に再現できていない可能性はあるが、ＳＧ粒子の方が非特異吸着の抑制能力に優れていた。ここで、ＳＧ粒子は、酸性水溶液中で加熱してグリシジルメタクリレート由来のエポキシ基をグリコールに変換した粒子である。

（体外診断用の検査試薬）
本実施形態における体外診断用の検査試薬、すなわち体外診断による検体中の標的物質の検出に用いるための検査試薬は、本実施形態に係るアフィニティー粒子と、アフィニティー粒子を分散させる分散媒を有する。本実施形態における試薬中に含有される本実施形態に係るアフィニティー粒子の量は、０．００１質量％から２０質量％が好ましく、０．０１質量％から１０質量％がより好ましい。本実施形態に係る試薬は、本発明の目的を達成可能な範囲において、本実施形態に係るアフィニティー粒子の他に、溶剤やブロッキング剤などの第三物質を含んでも良い。溶剤やブロッキング剤などの第三物質は２種類以上を組み合わせて含んでも良い。本実施形態において用いる溶剤の例としては、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、グッド緩衝液、トリス緩衝液、アンモニア緩衝液などの各種緩衝液が例示されるが、本実施形態における試薬に含まれる溶剤はこれらに限定されない。

ラテックス凝集法による検体中の抗原または抗体の検出に用いる場合は、リガンドは、抗体または抗原を用いることができる。

（検査キット）
本実施形態における体外診断による検体中の標的物質の検出に用いるためのキットは、上記試薬と、上記試薬を内包する筐体とを有する。本実施形態に係るキットとしては、本実施形態に係る試薬（以下、試薬１）に加えて、アルブミンを含有する反応緩衝液（以下、試薬２）を更にそなえるものが好ましい。前記アルブミンとしては血清アルブミン等が挙げられ、プロテアーゼ処理されたものでも良い。試薬２に含有されるアルブミンの量は、０．００１質量％から５質量％を目安とするが、本発明に係るキットはこれに限定されない。試薬１と試薬２の両方、或いは何れか一方に、ラテックス凝集測定用増感剤を含有させても良い。ラテックス凝集測定用増感剤として、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアルギン酸等が挙げられるが、本発明はこれらに限定されない。また、本実施形態に係るキットは、試薬１、試薬２に加え、陽性コントロール、陰性コントロール、血清希釈液等を備えていても良い。陽性コントロール、陰性コントロールの媒体として、測定しうる標的物質が含まれていない血清、生理食塩水の他、溶剤を用いても良い。本実施形態に係るキットは、通常の体外診断による検体中の標的物質の検出に用いるためのキットと同様にして、本実施形態に係る標的物質の検出方法に使用できる。また、従来公知の方法によって標的物質の濃度も測定することができ、特に、ラテックス凝集法による検体中の標的物質の検出に用いることが好適である。

（検出方法）
本実施形態における体外診断による検体中の標的物質の検出方法は、本実施形態に係るアフィニティー粒子と、標的物質を含む可能性のある検体とを混合する工程を有する。また、本実施形態に係るアフィニティー粒子と検体との混合は、ｐＨ３．０からｐＨ１１．０の範囲で行われることが好ましい。また、混合温度は２０℃から５０℃の範囲であり、混合時間は１分から２０分の範囲である。また、本検出方法は、溶剤を使用することが好ましい。また、本実施形態に係る検出方法における本実施形態に係るアフィニティー粒子の濃度は、反応系中、好ましくは０・００１質量％から５質量％、より好ましくは０．０１質量％から１質量％である。本実施形態に係る検出方法は、本実施形態に係るアフィニティー粒子と検体との混合の結果として生じる凝集反応を光学的に検出すること、すなわちラテックス凝集法により検体中の標的物質を検出することが好ましい。具体的には、検査試薬に、検体を混合して混合液を得る工程と、混合液に、光を照射する工程と、混合液に照射された光の、透過光または散乱光の少なくともいずれかを検出する工程を有する。混合液において生じる上記凝集反応を光学的に検出することで、検体中の標的物質が検出され、更に標的物質の濃度も測定することができる。前記凝集反応を光学的に検出する方法としては、散乱光強度、透過光強度、吸光度等を検出可能な光学機器を用いて、これらの値の変化量を測定すれば良い。

以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

（実施例１ 粒子１の合成）
２００ｍｌのフラスコに０．３ｇの２−メタクリロイロキシエチルコハク酸（共栄化学株式会社）を秤とり、１００ｇのイオン交換水、及び１Ｎ塩酸水溶液を加え、ｐＨ３．５の２−メタクリロイロキシエチルコハク酸が溶解した水溶液を調製した。次に、１．２ｇのスチレン（キシダ化学株式会社）、１．８ｇのグリシジルメタクリレート（キシダ化学株式会社）、０．０４ｇのジビニルベンゼン（キシダ化学株式会社）を前記水溶液と混合した。その後、この混合液を２００ｒｐｍで撹拌しながら７０℃に保持し、窒素バブリングを３０分間行った。次に、窒素バブリングを窒素フローに切り替え、別途調整しておいた０．０６ｇのＶ−５０（和光純薬株式会社）を３ｇの純水に溶解させた溶解液を前記混合液に加えることで、ラジカル重合（ソープフリー乳化重合）を開始した。重合開始から２時間後、ラジカル重合の反応場に０．３ｇのグリシジルメタクリレートを加え、さらに８時間、２００ｒｐｍで撹拌しながら７０℃で保持することで粒状重合体（粒子）の分散液を得た。この間、ラジカル重合の反応場のｐＨをモニタリングし、ｐＨが３．５以下に保たれるよう、必要に応じて１Ｎ塩酸水溶液を加えた。ラジカル重合終了後、プロトンＮＭＲ、ガスクロマトグラフィー、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーを用いてラジカル重合転化率を評価したところ、実質的に１００％であることを確認した。また、ラジカル重合中に凝集塊などは生じなかった。

得られた粒状重合体の分散液に、１Ｎ塩酸水溶液をさらに加えてｐＨ１．５に調製し、３時間、７０℃で加温することによって、グリシジルメタクリレート由来のエポキシ基を水と化学反応させて開環させ、グリコールに変換することで粒子１を得た。粒子１は、限外濾過によって精製し、粒子１を分散させている分散媒体をリン酸緩衝液に置換して保存した（分散媒体の置換も限外濾過を用いて行った）。動的光散乱法（ＤＬＳ−８０００：大塚電子株式会社）を用いて粒子１の粒子径を評価したところ、個数平均粒径が２５２ｎｍであった。

（実施例２ 粒子２の合成）
実施例１のスチレンをメチルメタクリレート（東京化成株式会社）に変更した以外は、実施例１と同様の実験操作によって粒子２を得た。精製、保存方法も同様である。動的光散乱法（ＤＬＳ−８０００：大塚電子株式会社）を用いて粒子２の粒子径を評価したところ、個数平均粒径が２９８ｎｍであった。

（実施例３ 粒子３の合成）
実施例１の２−メタクリロイロキシエチルコハク酸をメタクリル酸（東京化成株式会社）に変更した以外は、実施例１と同様の実験操作によって粒子３を得た。精製、保存方法も同様である。動的光散乱法（ＤＬＳ−８０００：大塚電子株式会社）を用いて粒子２の粒子径を評価したところ、個数平均粒径が１９５ｎｍであった。

（実施例４ 粒子４の合成）
実施例１の２−メタクリロイロキシエチルコハク酸をメタクリル酸に、スチレンをメチルメタクリレートに変更した以外は、実施例１と同様の実験操作によって粒子４を得た。精製、保存方法も同様である。動的光散乱法（ＤＬＳ−８０００：大塚電子株式会社）を用いて粒子２の粒子径を評価したところ、個数平均粒径が２２４ｎｍであった。

（比較例１ ＳＧ粒子の合成）
２００ｍｌフラスコに１．２ｇのスチレンと１．８ｇのグリシジルメタクリレート、０．０４ｇのジビニルベンゼン、１００ｇのイオン交換水を秤とり、混合液を得た。その後、この混合液を２００ｒｐｍで撹拌しながら７０℃に保持し、窒素バブリングを３０分間行った。次に、窒素バブリングを窒素フローに切り替え、別途調整しておいた０．０６ｇのＶ−５０（和光純薬株式会社）を３ｇの純水に溶解させた溶解液を前記混合液に加えることで、ラジカル重合（ソープフリー乳化重合）を開始した。重合開始から２時間後、ラジカル重合の反応場に０．３ｇのグリシジルメタクリレートを加え、さらに８時間、２００ｒｐｍで撹拌しながら７０℃で保持することでＳＧ粒子の分散液を得た。次に、この分散液に、ＳＧ粒子の合成に用いたグリシジルメタクリレートと等ｍｏｌのグリシンを加え、２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ１０に調製し、３時間、７０℃で加温した。それによって、ＳＧ粒子の有するグリシジルメタクリレート由来のエポキシ基とグリシン由来のアミノ基を化学反応させ、ＳＧ粒子にグリシン由来のカルボキシル基を導入した。この化学反応の過程で、ＳＧ粒子の一部が凝集塊を形成したため、デカンテーションによって凝集塊を除去した。カルボキシル基を導入したＳＧ粒子を限外濾過によって精製し、カルボキシル基を導入したＳＧ粒子の水分散液を得た。得られた水分散液に、１Ｎ塩酸水溶液を加えてｐＨ１．５に調製し、３時間、７０℃で加温することによって、グリシジルメタクリレート由来のエポキシ基を水と反応させ、グリコールに変換した。これら一連の工程を経て得た粒子をＳＧ粒子改と表現する。ＳＧ粒子改は、限外濾過によって精製し、分散媒体をリン酸緩衝液に置換して保存した（分散媒体の置換も限外濾過を用いて行った）。動的光散乱（ＤＬＳ−８０００：大塚電子株式会社）を用いてＳＧ粒子改の粒子径を評価したところ、個数平均粒径が２１３ｎｍであった。

（比較例２ 粒子５の合成）
２００ｍｌフラスコに０．３ｇの２−メタクリロイロキシエチルコハク酸、１．２ｇのスチレンと１．８ｇのグリシジルメタクリレート、０．０４ｇのジビニルベンゼンを秤とり、均一に混合した。次に、１００ｇのイオン交換水を加えて、混合液を得た。その後、この混合液を２００ｒｐｍで撹拌しながら７０℃に保持し、窒素バブリングを３０分間行った。次に、窒素バブリングを窒素フローに切り替え、別途調整しておいた０．０６ｇのＶ−５０（和光純薬株式会社）を３ｇの純水に溶解させた溶解液を前記混合液に加えることで、ラジカル重合（ソープフリー乳化重合）を開始した。重合開始から２時間後に、ラジカル重合反応液を観察したところ、凝集が顕著で粒子を回収することができなかった。

（比較例３ 粒子６の合成）
２００ｍｌフラスコに０．３ｇの２−メタクリロイロキシエチルコハク酸、１．２ｇのスチレンと１．８ｇのグリシジルメタクリレート、０．０４ｇのジビニルベンゼンを秤とり、均一に混合した。次に、予め０．１Ｎ塩酸水溶液を用いてｐＨ３．５に調製した１００ｇの塩酸水溶液を加えて、混合液を得た後、この混合液を２００ｒｐｍで撹拌しながら７０℃に保持し、窒素バブリングを３０分間行った。次に、窒素バブリングを窒素フローに切り替え、別途調整しておいた０．０６ｇのＶ−５０（和光純薬株式会社）を３ｇの純水に溶解させた溶解液を前記混合液に加えることで、ラジカル重合（ソープフリー乳化重合）を開始した。重合開始から２時間後に、ラジカル重合反応液を観察したところ、凝集が顕著で粒子を回収することができなかった。

（比較例４ 粒子７の合成）
２００ｍｌフラスコに０．３ｇのメタクリル酸、１．２ｇのスチレンと１．８ｇのグリシジルメタクリレート、０．０４ｇのジビニルベンゼンを秤とり、均一に混合した。次に、１００ｇのイオン交換水を加えて、混合液を得た後、この混合液を２００ｒｐｍで撹拌しながら７０℃に保持し、窒素バブリングを３０分間行った。次に、窒素バブリングを窒素フローに切り替え、別途調整しておいた０．０６ｇのＶ−５０（和光純薬株式会社）を３ｇの純水に溶解させた溶解液を前記混合液に加えることで、ラジカル重合（ソープフリー乳化重合）を開始した。重合開始から２時間後に、ラジカル重合反応液を観察したところ、比較例２ほど顕著ではないが、凝集塊が生じたため粒子を回収することができなかった。

（比較例５ 粒子８の合成）
２００ｍｌフラスコに０．３ｇのメタクリル酸、１．２ｇのスチレンと１．８ｇのグリシジルメタクリレート、０．０４ｇのジビニルベンゼンを秤とり、均一に混合した。次に、予め０．１Ｎ塩酸水溶液を用いてｐＨ３．５に調製した１００ｇの塩酸水溶液を加えて、混合液を得た後、この混合液を２００ｒｐｍで撹拌しながら７０℃に保持し、窒素バブリングを３０分間行った。次に、窒素バブリングを窒素フローに切り替え、別途調整しておいた０．０６ｇのＶ−５０（和光純薬株式会社）を３ｇの純水に溶解させた溶解液を前記混合液に加えることで、ラジカル重合（ソープフリー乳化重合）を開始した。重合開始から２時間後に、ラジカル重合反応液を観察したところ、比較例３ほど顕著ではないが、凝集塊が生じたため粒子を回収することができなかった。

（小括）
上記実施例１から４では、予め水溶液に溶解させたカルボキシル基を有するラジカル重合性単量体と、エポキシ基を有するラジカル重合性単量体をラジカル重合させたため、凝集が起きず、粒子（粒状重合体）を１００％近くの高収率で得られた。
一方、上記比較例１から５では、粒子が凝集して塊を形成してしまったため、粒子の回収ができなかった。これは、粒状重合体を形成した後にカルボキシル基を導入しようとしたこと、カルボキシル基を有するラジカル重合性単量体を予め水溶液に溶解させておかなかったこと、が原因と考えられる。

（実施例６ 非特異吸着の抑制能力の評価）
粒子１、粒子２、粒子３、粒子４、ＳＧ粒子改をそれぞれ、０．１ｗｔ％となるようにリン酸緩衝液に分散させた分散液を調製した。次に、それぞれの分散液３０μｌに対して、トリオレイン、レシチン、遊離脂肪酸、ウシアルブミン、トリス緩衝液から成る乳ビ液を６０μｌ添加し、撹拌した直後の分散液に対して、波長５７２ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光度測定はＢｉｏｃｈｒｏｍ社製分光光度計ＧｅｎｅＱｕａｎｔ １３００を用いた。そして、これらの分散液を３７℃で５分静置した後、再び波長５７２ｎｍにおける吸光度を測定し、吸光度の変化量ΔＡＢＳ×１００００を算出した。その結果、粒子１、粒子２、粒子３、粒子４、ＳＧ粒子改の順に、ΔＡＢＳ×１００００は、２０、１０１、５５、１２８、５６２となった。分散液の吸光度変化は、分散液中の粒子に非特異吸着が生じた結果、粒子間凝集が生じることに起因すると考察できることから、本実施例に係る粒子は、ＳＧ粒子と比較して非特異吸着を抑制する能力に優れることが確認された。

（実施例７ アフィニティー粒子の合成、及び抗体の結合）
粒子１、粒子２、粒子３、粒子４、ＳＧ粒子改をそれぞれ、１．０ｗｔ％となるようにリン酸緩衝液に分散させた分散液を１μｌずつ調製した。これらの分散液に、それぞれ、０．０５５ｍｇの１−［３−（ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド］（和光純薬株式会社）を１０μｌのリン酸緩衝液に溶解させた溶解液を加えた。その後、モノクローナル マウス アンチーヒューマン Ｃ−反応性タンパク（以下、ＣＲＰ抗体）のクローンＣ５（フナコシ株式会社）の４．９ｍｇ／ｍｌ分散液を５μｌとクローンＣ６（フナコシ株式会社）の５．８ｍｇ／ｍｌ分散液を５μｌ加えた。そして、室温で１８０時間振とうすることで、アフィニティー粒子を合成した。次に、遠心精製（１５０００ｒｐｍ）を３回行うことで、アフィニティー粒子を精製し、最終的に１ｍｌリン酸緩衝液に分散させた状態で保存した。以下、粒子１から得たアフィニティー粒子をアフィニティー粒子１、粒子２から得たアフィニティー粒子をアフィニティー粒子２、粒子３から得たアフィニティー粒子をアフィニティー粒子３、粒子４から得たアフィニティー粒子をアフィニティー粒子４と表現する。また、ＳＧ粒子改から得たアフィニティー粒子をＣＲＰ固定化ＳＧ粒子改と表現する。アフィニティー粒子１のＣＲＰ抗体結合量は９７８個／粒子、アフィニティー粒子２のＣＲＰ抗体結合量は１０２１個／粒子であった。そして、アフィニティー粒子３のＣＲＰ抗体結合量は５２個／粒子、アフィニティー粒子４のＣＲＰ抗体結合量は６３個／粒子、ＣＲＰ固定化ＳＧ粒子改のＣＲＰ抗体結合量は２４８個／粒子であった。アフィニティー粒子１とアフィニティー粒子２に対し、アフィニティー粒子３とアフィニティー粒子４ではＣＲＰ抗体結合量に明確な差が表れた。これは、繰り返し単位Ａと繰り返し単位Ｂの側鎖長に起因していると考えられる。アフィニティー粒子１とアフィニティー粒子２は、繰り返し単位Ａの側鎖長が２−メタクリロイロキシエチルコハク酸に由来する。そのため、グリシジルメタクリレートに由来する繰り返し単位Ｂの側鎖長より長く、ＣＲＰ抗体との化学反応の反応効率に優れていたと考えられる。一方、繰り返し単位Ａの側鎖長がメタクリル酸に由来するため、グリシジルメタクリレートに由来する繰り返し単位Ｂの側鎖長より短く、ＣＲＰ抗体との化学反応の反応効率に劣ったと考えられる。

（実施例８ ヒトＣＲＰ抗原に対する抗原抗体反応性評価）
ヒトＣＲＰ （シグマ社製Ｃ４０６３、Ｃ反応性タンパク質 ヒト血漿由来、３２ｍ／ｄｌ）を１μｌと、緩衝液（デンカ生研 ＣＲＰ−Ｌ オート「ＴＢＡ」の緩衝液（Ｒ−１））を５０μｌとを混合し混合液とし、３７℃で５分間、加温した。次に、実施例７で得たアフィニティー粒子の分散液を５０μｌと前記混合液とを混合し、撹拌した直後の分散液に対して、波長５７２ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光度測定はＢｉｏｃｈｒｏｍ社製分光光度計ＧｅｎｅＱｕａｎｔ １３００を用いた。そして、この分散液を３７℃で５分静置した後、再び波長５７２ｎｍにおける吸光度を測定し、吸光度の変化量ΔＡＢＳ×１００００を算出した。アフィニティー粒子１、アフィニティー粒子２、アフィニティー粒子３、アフィニティー粒子４、ＣＲＰ固定化ＳＧ粒子改それぞれについて評価したところ、順に、ΔＡＢＳ×１００００は、１２７１、１１００、３１２、５３７、７２３となった。また、これらの吸光度変化が欺様性か否かを検証するため、次のような実験を行った。上記デンカ生研の緩衝液を５１μｌと、実施例７で得たアフィニティー粒子の分散液を５０μｌとを混合し、撹拌した直後の分散液に対して、波長５７２ｎｍにおける吸光度を測定した。そして、この分散液を３７℃で５分間静置した後、再び波長５７２ｎｍにおける吸光度を測定し、吸光度の変化量ΔＡＢＳ×１００００を算出した。アフィニティー粒子１、２、３、４、ＣＲＰ固定化ＳＧ粒子改それぞれについて評価した。その結果、アフィニティー粒子１と３のΔＡＢＳ×１００００はほとんど変化せず、アフィニティー粒子２と４のΔＡＢＳ×１００００は軽微に上昇した。そして、ＣＲＰ固定化ＳＧ粒子改のΔＡＢＳ×１００００は５５２と陽性の値（７２３）に対して大きな割合となった。つまり、本実施例に係るアフィニティー粒子を含有することを特徴とする体外診断による検体中の標的物質の検出に用いるための試薬の優位性が検証された。

Claims (26)

1. 粒子の製造方法であって、
   カルボキシル基を有する第１のラジカル重合性単量体を溶解させた水溶液を用意する工程と、
   前記水溶液と、エポキシ基を有する第２のラジカル重合性単量体と、ラジカル重合開始剤とを混合し、前記第１のラジカル重合性単量体と前記第２のラジカル重合性単量体とをラジカル重合することによって、粒状重合体を形成させる工程と、を有することを特徴とする粒子の製造方法。
2. 前記粒状重合体を形成させる工程において、油性のラジカル重合性単量体を共存させることを特徴とする請求項１に記載の粒子の製造方法。
3. 前記油性のラジカル重合性単量体がスチレン類、（メタ）アクリレート類の群から選択される少なくとも一種であることを特徴とする請求項１または２に記載の粒子の製造方法。
4. 前記油性のラジカル重合性単量体が、スチレン、メチルメタクリレート、メタクリル酸のいずれかであることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の粒子の製造方法。
5. 前記粒状重合体を形成させる工程において、架橋性のラジカル重合性単量体を共存させることを特徴とする請求項１及至４のいずれか１項に記載の粒子の製造方法。
6. 前記粒状重合体を形成させる過程において、前記第２のラジカル重合性単量体をさらに混合し、前記粒状重合体の表面を前記第２のラジカル重合性単量体に由来する重合体で被覆する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１及至５のいずれか１項に記載の粒子の製造方法。
7. 前記粒状重合体を得る工程の反応場のｐＨが、前記第１のラジカル重合性単量体のｐｋａ以下であることを特徴とする請求項１及至６のいずれか１項に記載の粒子の製造方法。
8. 前記粒状重合体を得る工程の反応場のｐＨを、前記第１のラジカル重合性単量体のｐｋａ以下に調整するために酸を添加する工程を含むことを特徴とする請求項７に記載の粒子の製造方法。
9. 前記エポキシ基を開環させ、グリコールに変換する工程を含むことを特徴とする請求項１及至８のいずれか１項に記載の粒子の製造方法。
10. 前記第１のラジカル重合性単量体が下記一般式（１）で表されることを特徴とする請求項１及至９のいずれか１項に記載の粒子の製造方法、
    

    

    
    上記一般式（１）において、Ｒ_１はＨあるいはＣＨ_３を表し、
    Ｌ１及びＬ２は、互いに独立に炭素数１から３のアルキレン基を表す。
11. 前記第２のラジカル重合性単量体が下記一般式（２）で表されることを特徴とする請求項１及至１０のいずれか１項に記載の粒子の製造方法、
    

    

    
    上記一般式（２）においてＲ_２はＨあるいはＣＨ_３を表し、
    Ｌ３は炭素数１から３のアルキレン基を表す。
12. 前記第１のラジカル重合性単量体が下記一般式（１）で表され、前記第２のラジカル重合性単量体が下記一般式（２）で表され、かつ、
    前記Ｌ１と前記Ｌ２の炭素数の和に１を足した数が、Ｌ３の炭素数以上であることを特徴とする請求項１及至１１のいずれか１項に記載の粒子の製造方法、
    

    

    
    

    

    
    上記一般式（１）において、Ｒ_１はＨあるいはＣＨ_３を表し、
    Ｌ１及びＬ２は、互いに独立に炭素数１から３のアルキレン基を表し、
    上記一般式（２）においてＲ_２はＨあるいはＣＨ_３を表し、
    Ｌ３は炭素数１から３のアルキレン基を表す。
13. 前記第１のラジカル重合性単量体が２−（メタ）アクリロイロキシエチルコハク酸である請求項１及至１２のいずれか１項に記載の粒子の製造方法。
14. 前記第２のラジカル重合性単量体がグリシジル（メタ）アクリレートであることを特徴とする請求項１及至１３のいずれか１項に記載の粒子の製造方法。
15. 前記ラジカル重合開始剤が、カチオン性ラジカル重合開始剤であることを特徴とする請求項１及至１４のいずれか１項に記載の粒子の製造方法。
16. 前記ラジカル重合開始剤が、４，４’―Ａｚｏｂｉｓ（４−ｃｙａｎｏｖａｌｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、２，２’−Ａｚｏｂｉｓ［２−ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｅ、２，２’−Ａｚｏｂｉｓ［Ｎ−（２−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）−２−ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｉｎｅ］ｔｅｔｒａｈｙｄｒａｔｅ、２，２’−Ａｚｏｂｉｓ（２−ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｉｎｅ）ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、２，２’−Ａｚｏｂｉｓ［２−（２−ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎ−２−ｙｌ）ｐｒｏｐａｎｅ］、２，２’−Ａｚｏｂｉｓ［２−（２−ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎ−２−ｙｌ）ｐｒｏｐａｎｅ］ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、２，２’−Ａｚｏｂｉｓ［２−（２−ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎ−２−ｙｌ）ｐｒｏｐａｎｅ］ｄｉｓｕｌｆａｔｅ ｄｉｈｙｄｒａｔｅで構成される群から選択される少なくとも一種であることを特徴とする請求項１及至１５のいずれか１項に記載の粒子の製造方法。
17. 下記一般式（３）で表される繰り返し単位Ａと、下記一般式（４）で表される繰り返し単位Ｂとを有する共重合体を含み構成される粒子、
    

    

    
    

    

    
    上記一般式（３）においてＲ_１は、ＨあるいはＣＨ_３を表し、
    Ｌ１は、炭素数１から３のアルキレン基を表し、
    上記一般式（４）においてＲ_２は、ＨあるいはＣＨ_３を表し、
    Ｌ２及びＬ３は、互いに独立に炭素数１から３のアルキレン基を表し、
    前記Ｌ１と前記Ｌ２の炭素数の和に１を足した数が、前記Ｌ３の炭素数以上である。
18. 前記共重合体が、更に疎水性の繰り返し単位Ｃを有することを特徴とする請求項１７に記載の粒子。
19. 前記繰り返し単位Ｃが、スチレン類の重合体を構成する繰り返し単位、及び（メタ）アクリレート類の重合体を構成する繰り返し単位から選択される少なくとも一種であることを特徴とする請求項１７または１８に記載の粒子。
20. 請求項１７及至１９のいずれか１項に記載の粒子と、前記繰り返し単位Ａに含まれるカルボキシル基に結合したリガンドと、を有するアフィニティー粒子。
21. 前記リガンドが、抗体、抗原、及び核酸のいずれかであることを特徴とする請求項２０に記載のアフィニティー粒子。
22. 請求項２０または２１に記載のアフィニティー粒子と、前記アフィニティー粒子を分散させる分散媒と、を有することを特徴とする体外診断用の検査試薬。
23. 前記リガンドが抗体または抗原であり、ラテックス凝集法による検体中の抗原または抗体の検出に用いられる請求項２２に記載の検査試薬。
24. 請求項２２または２３に記載の検査試薬と、前記検査試薬を内包する筐体とを有することを特徴とする体外診断用の検査キット。
25. 検体中の標的物質の検出方法であって、
    請求項２２または２３に記載の検査試薬に、検体を混合する工程を有することを特徴とする検出方法。
26. ラテックス凝集法による検体中の標的物質の検出方法であって、
    請求項２２または２３に記載の検査試薬に、検体を混合して混合液を得る工程と、
    前記混合液に、光を照射する工程と、
    前記混合液に照射された光の、透過光または散乱光の少なくともいずれかを検出する工程と、
    を有することを特徴とする検出方法。