JP2019142845A - マトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制用組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
物に関する。
特に皮膚の老化や関節炎の障害などにMMPが関与することが知られており、MMPの阻害作用を示す物質の探索が積極的に行なわれている。本出願人もMMP阻害作用を有する物質の探索を行なっており、タイソウ、ゼニアオイ、サボテン、ケイヒ、サーチ、ニンジン、ビワ、シークワシャー、ハス、ホソバヤマジソなどの植物由来のエキスに、強いMMP阻害作用を見いだし、すでに特許出願を行なっている(特許文献1)。
特許文献2には、Gly−Pro−Hypのアミノ酸配列を有するコラーゲンペプチドを含む組成物に生体コラーゲン合成促進作用を見出し、生体コラーゲン合成促進剤として使用することが記載されている。
特許文献3には、コラーゲントリペプチドとシリマリン及びリンゴ抽出物を有効成分とするコラーゲンゲル収縮剤の発明が記載されている。
また、特許文献4には、コラーゲントリペプチドを含むティラピアの皮のプロテアーゼ加水分解物に強いメラニン産生抑制作用を見いだし、これをメラニン産生抑制剤とすることが記載されている。
しかしコラーゲンペプチドに何らかのMMP産生抑制作用が存在することは知られていない。
特許文献6には、特許文献5と同様のエキスであって、ドッグローズ、アポテカリーズローズ、スイートブライヤー、ダマスクバラ、セイヨウバラ及びハマナシから選ばれる少なくとも1種のバラ科植物のつぼみ又は花弁を水、親水性有機溶媒又はこれらの混合液により抽出処理して得られたエキスが記載されている。そして、このエキスに抗インフルエンザウィルス作用を見いだし、これを有効成分とする抗インフルエンザウィルス剤及びこれを配合した飲食品の発明が記載されている。
すなわち、本発明は、MMP産生抑制作用を有する組成物を提供することを課題とする。
(1)バラ科バラ属の植物の花弁及び/又はつぼみのエキスとトリペプチド5質量%以上を含むコラーゲンペプチドを含有するマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制用組成物。
(2)コラーゲンペプチドが、トリペプチドを10〜20質量%含有するものである(1)に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制用組成物。
(3)バラ科バラ属の植物が、ガリカローズ、ドッグローズ、アポテカリーズローズ、スイートブライヤー、ダマスクバラ、セイヨウバラ及びハマナシから選ばれる1種以上である(1)又は(2)に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制用組成物。
(4)バラ科バラ属の植物の花弁及び/又はつぼみのエキスが水、親水性有機溶媒又はこれらの混合液により抽出処理して得られたエキスである(1)〜(3)のいずれかに記載のマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制用組成物。
(5)トリペプチド5質量%以上を含むコラーゲンペプチドが、コラーゲン又はゼラチンをコラゲナーゼにより酵素加水分解した酵素加水分解物である(1)〜(4)のいずれかに記載のマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制用組成物。
(6)バラ科バラ属の植物の花弁及び/又はつぼみのエキス1質量部に対し、トリペプチド5質量%以上を含むコラーゲンペプチドを50〜400質量部の比率で含有する(1)〜(5)のいずれかに記載のマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制用組成物。
本発明の組成物について説明する。
本発明の組成物にあっては、バラ科バラ属の植物の花弁及び/又はつぼみのエキスとコラーゲンペプチドの相乗作用によってMMPの産生を抑制する。
バラ科バラ属の植物の花弁及び/又はつぼみは、どのような品種から採取したものでもかまわないが、園芸種として大量に栽培されているものが産業上好ましい。このようなものとして特にガリカローズ(Rosa gallica)、ドッグローズ(Rosacanina)、アポテカリーズローズ(Rosa gallica officinalis)、スイートブライヤー(Rosa rubiginosa)、ダマスクバラ(Rosa damascena trigintipetala)、セイヨウバラ(Rosa centifolia)及びハマナシ(Rosa rugosarubra)が好ましい。
本発明に用いるバラ科バラ属の植物のエキスは、市販されているものを使用することができる。本発明に適した、ガリカローズのつぼみのエキスの噴霧乾燥品である「ローズバッツエキスパウダーMF」を例示できる。
本発明に用いるバラ科バラ属の植物エキスは、ポリフェノールとして5質量%以上含有し、好ましくは10〜80質量%、特に好ましくは10〜20質量%含有するものである。
本発明に用いるコラーゲンペプチドは、豚、ウシなどの動物由来、魚由来いずれも使用可能である。
その他、ジュースのような飲料、ゼリーに配合することもできる。
<試験1> MMP産生抑制試験
バラ科バラ属の植物の花弁及び/又はつぼみのエキスとして、丸善製薬株式会社が販売しているローズバッツエキスパウダーMFを用いた。またコラーゲンペプチドとして、ゼライス株式会社が販売するトリペプチドを10〜20質量%含有するHACP−01を用いた。
・使用細胞
正常ヒト皮膚繊維芽細胞(NHDF)(ロンザジャパン株式会社)
・使用サンプル
コラーゲンペプチド(HACP−01:ゼライス株式会社:トリペプチド10〜20質量%含有品)、バラつぼみエキス(ローズバッツエキスパウダーMF:丸善製薬株式会社:ポリフェノール10〜20質量%含有品)を試験サンプルとした。
細胞は37℃、5%二酸化炭素、95%空気の条件下で培養を行った。培地は非働化したウシ胎児血清(FBS)(Hyclone laboratories)10%、penicilin−Streptmycin(Sigma Aldrich)1%を添加したDMEM,high glucose(life technologies)を用いた。以降、この培地を基礎培地と表記する。通常培養には10cmまたは15cmディッシュを用い、継代時の細胞剥離には0.05%Trypsin−EDTA(Sigma Aldrich)を使用した。
各サンプルは培地で溶解した。UVA照射前は基礎培地を用い、UVA照射後はFBS不含基礎培地を用いた。
サンプルの最終濃度
バラつぼみエキス(ローズバッツエキスパウダーMF) 6.25(μg/mL)
コラーゲンペプチド(HACP−01) 500(μg/mL)
コラーゲンペプチド(HACP−01) 1000(μg/mL)
併用 各濃度の組合せ
下記の表1に示す添加濃度で試験を実施した。
形態観察には倒立型システム顕微鏡(OLYMPUS IX70)を用いて行った。
24wellプレートに細胞を2×105cells/mL/500μL/wellで播種した。1日前培養の後、サンプル入り基礎培地500μLと交換して1日培養した。
その後、ハンクス平衡塩溶液(HBSS,calcium,magnesium,no phenol red、Thermo Fisher SCIENTIFIC)500μLに置換し、蓋を取ったディッシュをUVA照射ランプの下に一列に置いて15J/cm2照射した(約159分)。照射後、HBSSを取り除き、サンプル入りのFBS不含基礎培地500μLと交換して2日間培養した。培養上清を回収し、−80度中に保存した。培養上清回収後、ディッシュを500μLのPhosphate Buffered Saline(和光純薬株式会社)で3回洗浄し、0.1N水酸化ナトリウム溶液200μLで細胞を懸濁し、タンパク定量に用いた。
上清を15000×g,10分遠心し、その上清を用いて培地中に分泌されたMMP−1量を「Human Total MMP−1(R&D SYSTEMS)」を用いて測定した。細胞懸濁液は10000×g,10分遠心し、その上清を用いて「Pierce BCA Protein Assay kit」(Thermo SCIENTIFIC)を用いてタンパク量を測定した。培地中MMP−1量は細胞タンパク量で補正した。
結果を図1に示す。
コラーゲンペプチド(HACP−01)はMMP−1の産生を抑制しなかった。一方バラつぼみエキス6.25μg添加により、MMP−1産生量は88%に減少した。
バラつぼみエキスによるMMP産生抑制作用は、コラーゲンペプチドの添加によって顕著に増強された。すなわちコラーゲンペプチド500μgを併用するとMMP−1産生量は23%に減少し、コラーゲンペプチド1000μgを併用するとMMP−1産生量は18%に減少した。なお、各試験群において、コラーゲンペプチド及びバラつぼみエキスの添加は、細胞の生育や形態には影響しないことをWST−8アッセイ(CellCountingKit−8、株式会社同仁化学研究所)と顕鏡観察により確認している。
以上の試験結果から、バラ科バラ属の植物の花弁及び/又はつぼみのエキスとコラーゲンペプチドを含有する組成物は、細胞の生育に影響を及ぼさずにMMPの産生を抑制することが明らかとなった。またバラ科バラ属の植物の花弁及び/又はつぼみのエキスとコラーゲンペプチドの配合比は、バラ科バラ属の植物の花弁及び/又はつぼみのエキス1質量部に対してコラーゲンペプチドを50〜400質量部含むように調製することが効果的であるものと考えられた。
コラーゲンペプチドに含有されているトリペプチド及びトリペプチドの含有量が5%未満のコラーゲン加水分解ペプチドを用いたMMP産生抑制試験
コラーゲンペプチドのMMP産生抑制作用を確認した。
・使用細胞
細胞株:正常ヒト皮膚繊維芽細胞(NHDF)(ロンザジャパン株式会社)
・試験試料
ローズバッツエキスパウダーMF(以下「バラつぼみ」丸善製薬株式会社)低分子コラーゲン(平均分子量5000、トリペプチド含量5質量%以下、ゼライス社)を試験試料とした。
細胞は37℃、5%二酸化炭素、95%空気の条件下で培養を行った。培地は非働化したウシ胎児血清(FBS)(Hyclone laboratories)10%、penicilin−Streptmycin (Sigma Aldrich)1%を添加したDMEM,high glucose,liquid (DMEM)(life technologies)を用いた。以降、この培地を基礎培地と表記する。通常培養には10cmディッシュに細胞を起こしたのちコンフルエント時に0.05%Trypsin−EDTA(Sigma Aldrich)、にて剥離し15cmディッシュに継代を行った。
サンプルは培地で溶解した。培養は基礎培地を用い、サンプル添加時(UVA照射前後)はFBSを含まない基礎培地を用いた。
試験サンプルの培地中最終濃度
バラつぼみエキス 6.25, 12.5μg/mL
低分子コラーゲン 1000μg/mL
併用 各濃度の組合せ
細胞形態観察には倒立型システム顕微鏡(OLYMPUS IX70)を用いて行った。
24wellプレートに細胞を2×105cells/mL/500μL/wellで播種した。1日間前培養の後、サンプル入りFBSを含まない基礎培地500μLと交換して1日間培養した。その後、ハンクス液(HBSS,calcium,magnesium,no phenol red、Thermo Fisher SCIENTIFIC)500μLに置換し、蓋を取ったディッシュをUVA照射ランプの下に一列に置いて15J/cm2照射した(約159分)。照射後、ハンクス液を取り除き、サンプル入りのFBSを含まない基礎培地500μLと交換して2日間培養した。上清を回収し、−80度中に保存した。上清回収後、ディッシュを500μLのPhosphate Buffered Saline(和光純薬株式会社)で3回洗浄し、0.1N NaOH 200μLで細胞を懸濁し、タンパク定量に用いた。
上清を10000×g,10分遠心し、その上清を用いて培地中に分泌されたMMP−1量をHuman Tltal MMP−1(R&D SYSTEMS,DY901B)を用いて測定した。細胞懸濁液は10000×g,10分遠心し、その上清を用いてPierce BCA Protein Assay kit(Thermo SCIENTIFIC)を用いてタンパク量を測定した。培地中MMP−1量は細胞タンパク量で補正した。
下記表2に各試験試料の添加濃度と、無添加の場合のMMP−1産生量を100としたMMP−1の産生率を示す。また図2にMMP−1産生率のグラフを示す。
しかしバラつぼみエキスによるMMP−1産生抑制作用は、低分子コラーゲンの添加によって殆ど増強されなかった。
なお、各試験群において低分子コラーゲン及びバラつぼみエキスの添加は、細胞の生育や形態には影響しないことをWST−8アッセイ(CellCountingKit−8、株式会社同仁化学研究所)と顕鏡観察により確認している。
コラーゲンペプチド(ゼライス株式会社)6g、ローズバッツエキス(丸善製薬株式会社)0.01g、ビタミンC300mgを用い、常法によりドリンク剤を製造した。
バラ科バラ属の植物のつぼみのエキスの製造例
バラのつぼみ(Rosa gallica officinalis)300gに50重量%エタノールを2000mL加え、還流冷却器を付けて、80℃にて1時間抽出した後濾紙で濾過して抽出液1を得た。また、抽出残渣に50重量%エタノール1500mLを加え、同様に還流冷却器を付けて、80℃にて1時間抽出した後、濾紙で濾過して抽出液2を得た。得られた抽出液1、2を合わせて減圧下で濃縮、乾燥させて粉末エキス100gを得た(収率33.3%)。
バラ科バラ属の植物のつぼみのエキスの製造例
バラのつぼみ(Rosa centifolia)300gに水2000mLを加え、90℃にて1時間抽出を行った後、濾紙にて濾過し、抽出液を得た。得られた抽出液を減圧下で濃縮、乾燥させて、製造例2の粉末エキス100gを得た(収率33.3%)。
コラーゲンペプチドの製造例
コラーゲンタンパクとして、ウシ真皮より調製したゼラチン30gを蒸留水300mLに加温溶解し、0.45μmのフィルターで滅菌濾過した。
このゼラチン30gを蒸留水300mLに加温溶解した。コラゲナーゼタイプI(Worthington Biochemical Corp.)300mgを加え、アンモニア水にてpHを7.5に調整した後37℃で1時間放置した。反応終了後、反応液を100℃で3分間加熱しコラゲナーゼを失活させ、次いで0.45μmのフィルターで滅菌濾過した。この濾液をCDP−0とした。この濾液CDP−0を蒸留水で平衡化したSephadex LH−20(GEヘルスケア・ジャパン株式会社)によるゲル濾過を行い2つの画分(CDP−1,CDP−2)に分け、それぞれを凍結乾燥した。それぞれのピークをSuperdex Peptide HR10/30(Pharmacia)を用いて、0.3M NaClを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝溶液(pH7.2)を溶出液に用いて分子量を求めたところ、CDP−1が約12000〜500に分布し、CDP−2が約350だった。CDP−2の約50%がGly−Pro−Hypであった。
(1)バラ科バラ属の植物の花弁及び/又はつぼみのエキスとトリペプチド5質量%以上を含むコラーゲンペプチドを含有するマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制用組成物であって、バラ科バラ属の植物の花弁及び/又はつぼみのエキス1質量部に対し、トリペプチド5質量%以上を含むコラーゲンペプチドを50〜400質量部の比率で含有する、マトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制用組成物(化粧品を除く)。
(2)コラーゲンペプチドが、トリペプチドを10〜20質量%含有するものである(1)に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制用組成物。
(3)バラ科バラ属の植物が、ガリカローズ、ドッグローズ、アポテカリーズローズ、スイートブライヤー、ダマスクバラ、セイヨウバラ及びハマナシから選ばれる1種以上である(1)又は(2)に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制用組成物。
(4)バラ科バラ属の植物の花弁及び/又はつぼみのエキスが水、親水性有機溶媒又はこれらの混合液により抽出処理して得られたエキスである(1)〜(3)のいずれかに記載のマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制用組成物。
(5)トリペプチド5質量%以上を含むコラーゲンペプチドが、コラーゲン又はゼラチンをコラゲナーゼにより酵素加水分解した酵素加水分解物である(1)〜(4)のいずれかに記載のマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制用組成物。
Claims (6)
- バラ科バラ属の植物の花弁及び/又はつぼみのエキスとトリペプチド5質量%以上を含むコラーゲンペプチドを含有するマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制用組成物。
- コラーゲンペプチドが、トリペプチドを10〜20質量%含有するものである請求項1に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制用組成物。
- バラ科バラ属の植物が、ガリカローズ、ドッグローズ、アポテカリーズローズ、スイートブライヤー、ダマスクバラ、セイヨウバラ及びハマナシから選ばれる1種以上である請求項1又は2に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制用組成物。
- バラ科バラ属の植物の花弁及び/又はつぼみのエキスが水、親水性有機溶媒又はこれらの混合液により抽出処理して得られたエキスである請求項1〜3のいずれかに記載のマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制用組成物。
- トリペプチド5質量%以上を含むコラーゲンペプチドが、コラーゲン又はゼラチンをコラゲナーゼにより酵素加水分解した酵素加水分解物である請求項1〜4のいずれかに記載のマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制用組成物。
- バラ科バラ属の植物の花弁及び/又はつぼみのエキス1質量部に対し、トリペプチド5質量%以上を含むコラーゲンペプチドを50〜400質量部の比率で含有する請求項1〜5のいずれかに記載のマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制用組成物。
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