JP2019122380A - Cld18a2標的免疫エフェクター細胞及びその調製方法と使用 - Google Patents
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Abstract
Description
もう一つの好ましい例において、前記膜貫通ドメインはCD8またはCD28の膜貫通ドメインおよびヒンジドメインを含む配列である。
CLD18A2を特異的に認識する一本鎖抗体、CD8およびCD3ζ;
CLD18A2を特異的に認識する一本鎖抗体、CD8、CD137およびCD3ζ;
CLD18A2を特異的に認識する一本鎖抗体、CD28分子の膜貫通ドメイン(CD28a)、CD28分子の細胞内シグナルドメイン(CD28b)およびCD3ζ;或いは
CLD18A2を特異的に認識する一本鎖抗体、CD28分子の膜貫通ドメイン、CD28分子の細胞内シグナルドメイン、CD137およびCD3ζ;
の順番で連結する細胞外結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナルドメインとを含む。
もう一つの好ましい例において、前記免疫エフェクター細胞は、Tリンパ球、NK細胞またはNKT細胞を含む。
一つの好ましい例において、前記核酸は配列番号15〜18のいずれかに示されるヌクレオチド配列を有する。
一つの好ましい例において、前記発現ベクターはレンチウイルスプラスミドpWPT(またはpWPT−eGFP)に由来する。
本発明のもう一つは、前記キメラ抗原受容体、或いは前記核酸、或いは前記発現ベクター、或いは前記ウイルスの、CLD18A2標的遺伝子修飾免疫エフェクター細胞を調製するための使用を提供する。
本発明のもう一つは、その表面にキメラ抗原受容体が発現される遺伝子修飾免疫エフェクター細胞であって、前記キメラ抗原受容体のアミノ酸配列は配列番号19〜22のいずれかに示されるアミノ酸配列から選ばれる遺伝子修飾免疫エフェクター細胞を提供する。
もう一つの好ましい例において、前記CLD18A2陽性腫瘍は膵癌、胃癌を含む。
CLD18A2遺伝子
本発明者らは複数種の腫瘍特異性遺伝子を調査しておいた結果、このような遺伝子のうちのほとんどは一部の組織の正常細胞にも発現され、キメラ抗原受容体T細胞技術に適用できず、比較的に良好な腫瘍特異性発現特性を持つ腫瘍特異性遺伝子もあるけれども、それに基づいて設計したCAR修飾免疫エフェクター細胞は、相応の遺伝子が発現する蛋白質の抗原性が低い、若しくは発現箇所が不合理的である、若しくは発現量が足りないなどの原因で、或いは組換え・構築して得られるTリンパ球が影響を受けて、その腫瘍殺傷能が低減または喪失する原因で、腫瘍細胞殺傷活性を有しない若しくは活性が低い、ということを見出した。
本発明は、Tリンパ球表面に発現されるキメラ抗原受容体であって、CLD18A2(claudin 18.2)を特異的に認識する蛋白質を含む細胞外結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナルドメインとを順次に含むキメラ抗原受容体を提供する。該キメラ抗原受容体をTリンパ球の表面に発現させることで、CLD18A2高発現腫瘍細胞に対する高度に特異的な細胞傷害作用をTリンパ球に与えることができる。
scFv(CLD18A2)−CD8−CD3ζ、
scFv(CLD18A2)−CD8−CD137−CD3ζ、
scFv(CLD18A2)−CD28a−CD28b−CD3ζ、
scFv(CLD18A2)−CD28a−CD28b−CD137−CD3ζ、
およびそれらの組み合わせから選ばれるものであってもよく、ただし、関連するキメラ抗原受容体蛋白質におけるCD28aはCD28分子の膜貫通ドメインを示し、CD28bはCD28分子の細胞内シグナルドメインを示す。前記各種の抗CLD18A2キメラ抗原受容体はscFv(CLD18A2)−CARと併称する。
さらに、本発明は、前記Tリンパ球表面に発現するキメラ抗原受容体蛋白質をコードする核酸を含むベクターを提供する。一つの具体的な実施形態において、本発明に使用されるベクターはレンチウイルスプラスミドベクターpWPT−eGFPである。当該プラスミドは第3世代の自己不活性型レンチウイルスベクターシステムに属し、当該システムは、蛋白質Gag/Polをコードし、Rev蛋白質をコードするパッケージングプラスミドpsPAX2と、VSV−G蛋白質をコードするエンベローププラスミドPMD2.Gと、空ベクターpWPT−eGFPとの合計で三つのプラスミドを含み、目的核酸配列、即ちCARをコードする核酸配列の組換え・導入に用いることができる。空ベクターpWPT−eGFP(それ自身は次の試験におけるmockである)において、伸長因子−1α(elongation factor−1α、EF−1α)プロモーターにより強化型緑色蛍光蛋白質(enhanced green fluorescent protein、eGFP)の発現を調節・制御する。CARをコードする目的核酸配列を含む組み換え発現ベクターpWPT−eGFP−F2A−CARは、口蹄疫ウイルス(foot-and-mouth disease virus、FMDV)由来のリボソーム跳躍配列(ribosomal skipping sequence 2A)(単にF2Aと記す)によりeGFPとCARの共発現を実現する。
本発明者らは研究・分析を繰り返したところ、CLD18A2を認識するscfv抗体をいくつか同定し、単に125、163および175と記した。
1.CLD18A1とCLD18A2の発現ベクターの構築およびレンチウイルスの調製
ブリッジPCRに基づく遺伝子合成技術により、CLD18A1完全コード配列(GenBank:NM_016369)およびCLD18A1完全コード配列(GenBank:NM_001002026)を全配列合成し、コードのc末端にFlagタグ(DYKDDDK)を挿入し、且つ合成した遺伝子断片の両末端にそれぞれMluI/SalI(NEBより購入)の制限酵素切断部位を入れ、MluI/SalIで二重酵素切断し、T4 DNAリガーゼを用いて、同様にMluI/SalIで二重酵素切断されたベクタープラスミドpWPT(addgene社より購入)とライゲーションし、ホスト菌TOP10に形質転換し、クローニングを掻き取り、PCRによって同定し、且つシーケンシングによって正確なレンチウイルスベクタープラスミドPWPT−CLD18A1、PWPT−CLD18A2が得られたことを確認した。前記プラスミドをそれぞれパッケージングヘルパープラスミド(pGag−pol、pREV、pVsv−g(いずれもaddgene社より購入)と所定の比率で293T細胞にコトランスフェクトし、トランスフェクションから48hおよび72h後に、それぞれCLD18A1、CLD18A2ウイルス液を収集し、分注し、−80℃で保管した。
前記のように収集したCLD18A1またはCLD18A2ウイルス液をそれぞれ6cmウェル内で展開された293T細胞に加え、72h後に細胞を収集し、細胞溶解液を用いて溶解を行った。また、CLD18A2ウイルス液を用いてヒト胃癌BGC−823(中国科学院上海細胞ライブラリーより購入、TCHu 11)およびNCI−N87(ATCCより購入、CRL−5822)細胞系にそれぞれ感染させ、細胞が満杯になるまで成長した後、細胞を収集し、細胞溶解液を用いて溶解を行った。溶解されて収集された細胞蛋白質を40μg取り、SDS−PAGEゲル電気泳動を行い、その後ゲルに対してイムノブロッティングを行い、且つマウス抗Flag抗体(Sigma Aldrichより購入)で染色した。PBSで洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヒツジ抗マウス抗体(Santa Cluzより購入)とともにインキュベートした後、ECL試薬で発色し、最後に現像を行った。
蛍光活性化セルソーター(FACS)(BD社、FACSCalibur)により、一本鎖抗体scFv−125、scFv−163およびscFv−175のそれぞれの下記各細胞系との結合能を解析した。
1).対数増殖期にある293T、293T−CLD18A1、293T−CLD18A2、BGC−823、BGC−823−CLD18A2、NCI−N87、NCI−N87−CLD18A2腫瘍細胞を6cmウェルに、接種した細胞の密度が約90%になるように接種し、37℃インキュウベーターで一晩培養した。
4).受試抗体scFv−125、scFv−163およびscFv−175をそれぞれ加えるとともに、無関連抗体を陰性コントロールとして、抗体最終濃度を20μg/mlとし、1つのチューブにつき100ul加えた。45分間氷浴した。
6).上澄を捨て、1:50で希釈したFITC蛍光標識ヒツジ抗ヒト抗体(上海康成生物工程株式会社より購入)を、1つのチューブにつき100ul加えた。45分間氷浴した。
8).上澄を捨て、300ulの1%NBS PBS中に再懸濁させ、フローサイトメーターにより検出した。
フローサイトメトリーの結果から分かるように、一本鎖抗体scFv−125は、CLD18A1だけでなく、CLD18A2安定発現293T細胞にも結合できる(図5)ことにより、該一本鎖抗体がCLD18A2に対する結合特異性に乏しいことは分かった。幸いなことに、一本鎖抗体ScFv−163およびscFv−175はCLD8A2安定発現293Tを特異的に認識できるが、CLD18A1安定発現293T細胞と結合しないことにより、それらの2つの一本鎖抗体がCLD18A2を特異的に認識できることは分かった。また、それらの2つの一本鎖抗体はCLD18A2安定トランスフェクションBGC−823またはNCI−N87細胞系も特異的に認識できるが、CLD18A2がトランスフェクトされていないBGC−823またはNCI−N87細胞と結合しなかった。
表1では、本発明で例示されるキメラ抗原受容体の各部分の連結順番が説明され、それらの連結は図2にも示される。
(1)scFv(CLD18A2−163、CLD18A2−175)配列の増幅
V5−scFv−163−Fcプラスミドを鋳型として、一部の2A配列を含むフォワードプライマー(配列番号7)および一部のCD8 hinge配列を含むリバースプライマー(配列番号8)をプライマー対として採用し、PCR増幅によってscFv(CLD18A2−163)を得た;同様に、V5−scFv−175−Fcプラスミドを鋳型として、一部の2A配列を含むフォワードプライマー(配列番号9)および一部のCD8 hinge配列を含むリバースプライマー(配列番号10)をプライマー対として採用し、PCR増幅によってscFv(CLD18A2−175)を得た。
抗CLD18Aキメラ抗原受容体蛋白質のscFv(CLD18A2−163、CLD18A2−175)以外の他の部分の核酸配列はそれぞれ、中国特許出願番号201310164725.Xで開示された配列番号18、21の配列を鋳型として、PCR手段により得られた。
201310164725.Xにおける配列番号21は本発明における配列番号24の配列に相応する。
前記のように得られたeGFP−F2A核酸断片のそれぞれと、等モルのscFv(CLD18A2−163)またはscFv(CLD18A2−175)核酸断片と、及び等モルのCD8−CD3ζ(Z)またはCD28a−CD28b−CD137−CD3ζ(BBZ)核酸断片とを図2に示すように三つの断片でライゲーションし、且つPCRし、ライゲーション条件を以下のようにした:初期変性:94℃,4min;変性:94℃,40s;アニーリング:60℃,40s;伸長:68℃,140s;5サイクルを行い、その後最終伸長:68℃,10min、DNAポリメラーゼおよびフォワードプライマー(配列番号11)とリバースプライマー(配列番号14)を補充してから、PCR増幅を30リサイクル行い、増幅条件を、初期変性:94℃,4min;変性:94℃,40s;アニーリング:60℃,40s;伸長:68℃,140s;30サイクルを行い、その後最終伸長:68℃,10min、とした。増幅して得られた断片はそれぞれ(表2):
eGFP−scFv(CLD18A2)−163−Z (配列番号15、19)、
eGFP−scFv(CLD18A2)−163−BBZ (配列番号16、20)、
eGFP−scFv(CLD18A2)−175−Z (配列番号17、21)、
eGFP−scFv(CLD18A2)−175−BBZ (配列番号18、22)。
例示としての本発明にかかるレンチウイルスプラスミドベクターの構築に用いられるベクター系は、第3世代の自己不活性型レンチウイルスベクターシステムに属し、当該システムは、蛋白質Gag/Polをコードし、Rev蛋白質をコードするパッケージングプラスミドpsPAX2(addgeneより購入)と、VSV−G蛋白質をコードするエンベローププラスミドPMD2.G(addgeneより購入)と、空ベクターpWPT−eGFP(addgeneより購入)に基づき、目的遺伝子CARをコードする組換え発現ベクターとの合計で三つのプラスミドを含む。
pWPT−eGFP−F2A−scFv(CLD18A2)−163−Z;
pWPT−eGFP−F2A−scFv(CLD18A2)−163−BBZ;
pWPT−eGFP−F2A−scFv(CLD18A2)−175−Z;
pWPT−eGFP−F2A−scFv(CLD18A2)−175−BBZ。
6〜10代目まで培養したHEK−293T細胞(ATCC:CRL−11268)を10cm培養ディッシュに6×106の密度で接種し、37℃、5% CO2で一晩培養し、トランスフェクションに用いた。培地は10%牛胎児血清(PAA社より購入)含有DMEM(PAA社より購入)であり、翌日、トランスフェクションの約2時間前に、培地を無血清DMEMに変更した。
トランスフェクションのステップは以下の通りであった。
20μgの空プラスミドpWPT−eGFP(mockコントロール)または20μgの各目的遺伝子プラスミドpWPT−eGFP−F2A−CARをそれぞれ、15μgのパッケージングプラスミドPAX2および6μgのエンベローププラスミドpMD2.Gとともに500μL MillQ水中に溶解させ、均一に混合し、
4.2
62μL 2.5M CaCl2(Sigma社より購入)を滴下し、1200rpm/minで均一に渦流混合し、
4.3 最後に500μL 2×HeBS(280mM NaCl、10mM KCl、1.5mM Na2HPO4・2H2O、12mMグルコース、50mM Hepes(Sigma社より購入)、pH7.05、0.22μM濾過除菌)を滴下し、1200rpm/minで10s均一に渦流混合し、
4.4
直ちに培養ディッシュに滴下し、軽く振とうして均一にし、37℃、5% CO2で4〜6h培養した後、10%牛胎児血清含有DMEMに変更した。
1日目、1×105/mLの293T細胞を100μL/ウェルで96ウェル培養プレートに接種し、37℃、5% CO2で培養し、培地は10%牛胎児血清含有DMEMにした。2日目、50μL/ウェルの培養上清を捨て、最終濃度6μg/mLのポリブレンを含有する新鮮な前記培地を50μL/ウェルで追加し、37℃、5% CO2で30minインキュベートした。ウイルス原液を10μL/ウェルで、またはウイルス濃縮液を1μL/ウェルで加え,5倍に希釈し、勾配を4つにし、重複ウェルを2つにし、37℃、5% CO2で培養した。感染から48h後、フローサイトメーターによりeGFPを検出し、陽性率が5〜20%になる細胞数を好ましく選出し、力価(U/mL)=陽性率×希釈倍数×100×104で力価を算出した。リン酸カルシウムトランスフェクション法でパッケージングされた前記mock(即ち空ベクター)コントロールおよび各eGFP−F2A−CARを含むウイルスの力価はいずれも約0.5〜2×106U/mLのレベルであり、濃縮してから測定されたウイルスの力価は約2×107U/mLであった。
健常人末梢血から密度勾配遠心法によりヒト末梢血単核球(上海市血液センターから提供する)を獲得し、末梢血単核球からCTL細胞磁気ビーズ(Stem Cell Technologiesより購入)ネガティブ分離方法によりCTLを獲得し、分離されたCTL細胞について、フローサイトメトリーによりCTL細胞の純度を測定し、CTL細胞の陽性率≧95%のものを好ましく選出し、次の操作に進めた。Quantum 007リンパ球培地液(PAA社より購入)を約1×106/mLの密度で加えて培養し、且つ細胞:磁気ビーズの比率が1:1になるように抗CD3およびCD28抗体で共に覆われた磁気ビーズ(Invitrogen社より購入)と、最終濃度100U/mLの組換えヒトIL−2(上海華新生物高技術株式会社)とを加え、24h刺激培養した。そして、MOI≒5で前記レンチウイルスを用いてCTL細胞を感染した。感染された細胞を一日おきに5×105/mLの密度で継代するとともに、リンパ球培地に最終濃度100U/mLの組換えヒトIL−2を追加した。
キメラ抗原受容体を発現する細胞のインビトロ傷害性効果試験
インビトロ傷害性試験に用いられる材料は以下の通りであった。
各試験群:各標的細胞+異なるキメラ抗原受容体を発現するCTL、
コントロール群1:標的細胞最大放出LDH、
コントロール群2:標的細胞自発放出LDH、
コントロール群3:エフェクター細胞自発放出LDH。
具体的には表4および表5に示すように、本発明にかかるキメラ抗原受容体(一本鎖抗体163または175が融合発現された)CLD18A2−Z CAR+を発現するCTLおよびCLD18A2−28BBZ CAR+を発現するCTLは、CLD18A2高発現293T細胞に対して著しい殺傷作用を有するが、CLD18A1高発現293T細胞に対して殺傷作用を有しないことにより、それらがCLD18A2細胞を選択的に殺傷できることは分かった。また、本発明にかかるキメラ抗原受容体CLD18A2−Z CAR+を発現するCTLおよびCLD18A2−28BBZ CAR+を発現するCTLは、CLD18A2高発現の2種類の胃癌細胞系BGC−823およびNCI−N87に対しても著しい殺傷作用を有し(表4および表5を参照)、且つエフェクター細胞対標的細胞比勾配依存性、つまり、エフェクター細胞対標的細胞比が高いほど、細胞傷害作用が強いことを示すが、CLD18A2を発現しないBGC−823およびNCI−N87に対して特異的な細胞傷害作用を有しない。
エフェクター細胞対標的細胞比依存性のデータにより、本発明にかかる抗CLD18A2キメラ抗原受容体を発現するCTLの、CLD18A2高発現胃癌細胞に対する特異的な細胞傷害作用はさらに明らかになる。
現在、CAR T細胞は既に潜在の治療手段になった。しかし、多くの腫瘍、例えば胃癌について、CAR T細胞治療に関する報告はまだない。従来の研究から分かるように、CLD18A2は胃組織の特異性マーカーである可能性があることから、胃癌などの腫瘍の治療標的になるかもしれない。しかしながら、現在のところ、CLD18A2を治療標的とする薬物候補はモノクロナール抗体しかなく、それが相応の腫瘍の治療に成功に適用できるかどうかはまだ不明だ。よって、新規な治療手段を見つける必要がある。CLD18A2の組織特異性を考えて、本発明は、CAR T細胞を用いて標的治療を行うことができれば、新規な抗癌製剤が得られると予想する。しかしながら、CLD18A2抗原が密着結合蛋白質であることはよく知られており、CAR T細胞と接触して相応の標的細胞の殺傷を引き起こせるかどうかはまだ不明で。また、蛋白質の立体配座は、変化が少しでも生じると、その全体に大きな影響を与える可能性があることから、多くのモノクロナール抗体は一本鎖抗体になると、抗原結合活性または特異性を喪失してしまう。幸いなことに、本発明者らは、2つの一本鎖抗体(163および175)がモノクロナール抗体の抗原結合特異性を保持したことを見出した。更なる研究により、それらの2つの一本鎖抗体からなるCAR T細胞がCLD18A2陽性細胞に対する選択的な殺傷作用を保持したことは分かった。本発明の結果から分かるように、CLD18A2は確実にCAR T細胞治療の標的とすることができ、CLD18A2を標的とするCAR T細胞は腫瘍治療の新規な手段候補である。
Claims (14)
- 免疫エフェクター細胞表面に発現されるキメラ抗原受容体であって、前記キメラ抗原受容体は順次に連結する細胞外結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナルドメインとを含み、前記細胞外結合ドメインはclaudin 18.2(CLD18A2)を特異的に認識する蛋白質を含み、前記細胞外結合ドメインは、配列番号4および6のいずれかのアミノ酸配列を有することを特徴とするキメラ抗原受容体。
- 免疫エフェクター細胞表面に発現されるキメラ抗原受容体であって、前記キメラ抗原受容体は細胞外結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナルドメインとを含み、前記細胞外結合ドメインはCLD18A2を特異的に認識する蛋白質を含み、前記キメラ抗原受容体は配列番号19〜22のいずれかを含むことを特徴とするキメラ抗原受容体。
- 前記膜貫通ドメインはCD8またはCD28の膜貫通ドメインおよびヒンジドメインの配列を含むことを特徴とする請求項1または2に記載のキメラ抗原受容体。
- 前記細胞内シグナルドメイン配列は、CD3ζ、FcεRIγ、CD27、CD28、CD137、CD134の細胞内シグナルドメイン配列、或いはそれらの組み合わせからなる群から選ばれることを特徴とする請求項1〜3のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
- 前記キメラ抗原受容体は、
CLD18A2を特異的に認識する一本鎖抗体、CD8の膜貫通ドメインおよびCD3ζの細胞内シグナルドメイン;
CLD18A2を特異的に認識する一本鎖抗体、CD8の膜貫通ドメインおよびCD137およびCD3ζの細胞内シグナルドメイン;
CLD18A2を特異的に認識する一本鎖抗体、CD28の膜貫通ドメインおよびCD28およびCD3ζの細胞内シグナルドメイン;または
CLD18A2を特異的に認識する一本鎖抗体、CD28の膜貫通ドメイン;CD28およびCD137およびCD3ζの細胞内シグナルドメイン;
の順番で連結する細胞外結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナルドメインとを含むことを特徴とする請求項1〜4のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。 - 前記免疫エフェクター細胞は、Tリンパ球、NK細胞またはNKT細胞を含むことを特徴とする、請求項1に記載のキメラ抗原受容体。
- 免疫エフェクター細胞表面に発現されるキメラ抗原受容体をコードする核酸であって、前記キメラ抗原受容体は細胞外結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナルドメインとを含み、前記細胞外結合ドメインはCLD18A2を特異的に認識する蛋白質を含み、前記核酸は配列番号15〜18のいずれかを含むことを特徴とする核酸。
- 免疫エフェクター細胞表面に発現されるキメラ抗原受容体をコードする核酸を含む発現ベクターであって、前記キメラ抗原受容体は細胞外結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナルドメインとを含み、前記細胞外結合ドメインはCLD18A2を特異的に認識する蛋白質を含み、前記核酸は配列番号15〜18のいずれかを含むことを特徴とする発現ベクター。
- 前記発現ベクターはレンチウイルスプラスミドpWPTに由来することを特徴とする、請求項8に記載の発現ベクター。
- 免疫エフェクター細胞表面に発現されるキメラ抗原受容体をコードする核酸を含む発現ベクターを含むウイルスであって、前記キメラ抗原受容体は細胞外結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナルドメインとを含み、前記細胞外結合ドメインはCLD18A2を特異的に認識する蛋白質を含み、前記核酸は配列番号15〜18のいずれかを含むことを特徴とするウイルス。
- claudin 18.2(CLD18A2)標的遺伝子修飾免疫エフェクター細胞を調製する方法であって、請求項1または2に記載のキメラ抗原受容体、請求項7に記載の核酸、請求項8に記載の発現ベクター、または請求項10に記載のウイルスを用いることを含む方法。
- 請求項7に記載の核酸、請求項8に記載の発現ベクター、または請求項10に記載のウイルスが形質導入されたことを特徴とする、遺伝子修飾免疫エフェクター細胞。
- 請求項12に記載の遺伝子修飾免疫エフェクター細胞であって、前記免疫エフェクター細胞はTリンパ球、NK細胞またはNKT細胞を含むことを特徴とする遺伝子修飾免疫エフェクター細胞。
- 腫瘍を抑制する医薬を調製するための方法であって、前記方法は請求項12に記載の遺伝子修飾免疫エフェクター細胞を少なくとも1つ用いることを含み、前記腫瘍はclaudin 18.2(CLD18A2)陽性腫瘍であることを特徴とする方法。
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