JP2019099504A - 毛包細胞賦活剤 - Google Patents

Abstract

【課題】毛髪の成長と再生を担う毛包幹細胞や毛乳頭細胞そのものを活性化する新たな因子を見出し、これを脱毛症を予防及び／又は改善するための薬剤として提供することを課題とする。【解決手段】トリュフの抽出物及び／又は蒸気加熱処理後、加熱乾燥処理されたオタネニンジンの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする、毛包幹細胞や毛乳頭細胞などの毛包を構成する細胞の賦活化剤、ならびに毛髪用組成物。【選択図】なし

Description

本発明は、毛包細胞の賦活化剤及びその使用に関する。

近年、加齢、ストレス、紫外線等の様々な要因により、薄毛や脱毛といった毛髪のトラブルが増加している。毛髪は体表面を覆っており、皮膚の付属器官のひとつであり、毛髪の中でも頭髪は美容上極めて重要な要素である。よって、薄毛や脱毛は、心理面にもマイナスの影響を与え、生活の質（Quality of Life, QOL）を大きく低下させる要因となる（非特許文献１）。

毛髪は複数種の細胞からなる複雑な構造をとっているが、主にバルジ領域に存在する毛包幹細胞によって生み出されている。毛周期の休止期から成長期にかけて、このバルジ領域に存在する毛包幹細胞が、細胞分裂をすることで、毛母細胞が形成され、この毛母細胞から毛髪が形成される。

薄毛や脱毛の詳細なメカニズムは解明に至っていないが、最近の研究により、薄毛や脱毛は、毛包幹細胞が加齢によって老化し、自己複製能がなくなって、毛包の縮小が起こることや、毛包幹細胞が環境ストレス等によって長年ダメージを受け、機能低下や維持メカニズムが破綻することによって発生すると考えられている。また、毛髪の再生にはバルジ領域に存在する毛包幹細胞と、その細胞の成長と再生を支持する毛乳頭細胞の相互作用によって恒常性が維持されるが、これらの細胞の数の減少や機能の低下が薄毛の原因となることが明らかとなってきた（非特許文献２）。さらに、このような細胞の劣化現象は加齢に伴って血中で増加することが知られている炎症性サイトカイン類（非特許文献３）などの外的因子が影響していると考えられる。

一方、細胞増殖因子は、毛髪の成長、毛母細胞の増殖や分裂、毛周期の調節、頭皮の血管新生に関わり、発毛や育毛のための重要な因子である。例えば、毛乳頭細胞から産生されるFGF-2やFGF-7等の細胞増殖因子は、毛髪の再生と恒常性維持に関与していることが知られている（非特許文献４）。

以上のことから、発毛や育毛には、毛髪の成長と再生を担う毛包幹細胞や毛乳頭細胞を活性化して、外界からの様々な刺激に対する防御機能を向上させ、発毛や育毛に関連する種々の細胞増殖因子の産生を促進させることが重要である。これまで、細胞増殖因子を有効成分とする育毛剤の開発も行われているが、細胞増殖因子は動物由来成分で分子量が大きいために、外用塗布による経皮吸収が困難である等の問題があった。また、毛包幹細胞や毛乳頭細胞の相互作用を生体内で制御することも困難である。よって、毛包幹細胞や毛乳頭細胞そのものを活性化する方法や因子の探索が期待されている。

トリュフ（学名：Tuber spp.)はセイヨウショウロ目セイヨウショウロ科に属する子嚢菌で、様々な生理活性があることが知られている。例えば、生体の老化抑制効果（特許文献１）、ＩｇＡ分泌促進効果・免疫バランス改善効果・抗高脂血症効果（特許文献２）、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）産生促進効果（特許文献３）などが知られている。また、トリュフは、哺乳動物の幹細胞の未分化状態を維持させたまま増殖させる機能を有することも確認されている（特許文献４）。オタネニンジン（学名：Panax ginseng C.A.Mey）は、ウコギ科トチバニンジン属に属する多年草であり、生薬の人参（ニンジン）は、オタネニンジンの根を乾燥させたもので、サポニンのジンセノサイドなどを含み、強壮、鎮静、抗疲労、強心、利尿等の作用を有する漢方薬に用いられている。人参（ニンジン）はまた、単独で又は他の植物抽出物と組み合わせて、血糖降下作用（特許文献５）、アンジオテンシンII活性阻害作用（特許文献６）などがあることが報告されている。しかしながら、トリュフ、オタネニンジンの毛包細胞の賦活化作用についてはこれまで何ら知られていない。

特開２００２−２４９４３８号公報 特開２０１０−２２２２６５号公報 特開２０１３−１１２６５１号公報 特開２００９−２３２７２８号公報 特開平６−２３７７３５号公報 特開２０１３−１１９５３４号公報

Sawant N et al., Androgenetic Alopecia: Quality-of-life and Associated Lifestyle Patterns, Int J Trichology. 2010 Jul;2(2):81-5 Chi W, et al., Dermal papilla cell number specifies hair size, shape and cycling and its reduction causes follicular decline. Development. 2013 Apr;140(8):1676-83 Cruz-Almeida Y, et al., Age differences in cytokine expression under conditions of health using experimental pain models. Exp Gerontol. 2015 Dec;72:150-6. Rosenquist TA et al., Fibroblast growth factor signalling in the hair growth cycle:expression of the fibroblast growth factor receptor and ligand genes in the murine hair follicle. Dev Dyn. 1996 Apr;205(4):379-86.

本発明は、上述した実情に鑑み、毛髪の成長と再生を担う毛包幹細胞や毛乳頭細胞そのものを活性化する新たな因子を見出し、これを脱毛症を予防及び／又は改善するための薬剤として提供することを課題とする。

本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、トリュフ抽出物と、所定の前処理をしたオタネニンジンの抽出物が、毛乳頭細胞において細胞増殖因子の遺伝子発現を促進し、炎症性サイトカインなどの外的刺激による毛包幹細胞の損傷を抑制する作用を有することを見出した。よって、上記の抽出物は、毛包を構成する細胞の賦活化剤として脱毛症の予防及び／又は改善に有効である。本発明はかかる知見より完成されたものである。

すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）トリュフの抽出物及び／又は蒸気加熱処理後、加熱乾燥処理されたオタネニンジンの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする、毛包を構成する細胞の賦活化剤。
（２）前記オタネニンジンが、乾燥又は生のオタネニンジンである、（１）に記載の賦活化剤。
（３）前記細胞が毛乳頭細胞である、（１）又は（２）に記載の賦活化剤。
（４）前記細胞が毛包幹細胞である、（１）又は（２）に記載の賦活化剤。
（５）（１）〜（４）のいずれかに記載の賦活化剤を含む、毛髪用組成物。
（６）（１）〜（４）のいずれかに記載の賦活化剤からなる、毛包を構成する細胞の賦活化用培地添加剤。

本発明によれば、発毛や毛髪の成長を担う、毛乳頭細胞や毛包幹細胞といった毛包を構成する細胞の賦活化剤が提供される。本発明の細胞賦活化剤は、ＦＧＦやＶＥＧＦなどの発毛や毛周期の制御に必要な細胞増殖因子の遺伝子発現を促進し、炎症性サイトカインなどの外的刺激による毛包の損傷を抑制することができる。

本発明の毛包を構成する細胞の賦活化剤は、トリュフの抽出物及び／又は蒸気加熱処理後、加熱乾燥処理されたオタネニンジン（以下、「修治オタネニンジン」と記載する場合がある）の抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。

本発明に用いるトリュフ（学名：Tuber spp.)は、セイヨウショウロ目（Tuberales)、セイヨウショウロ科（Tuberaceae)に属する子嚢菌であり、塊状で地中に発生し、子実層は外に開いていない。子実体の多くは強い香りを持ち、リスやウサギのような動物が掘り出して食用とする。トリュフは、世界３大珍味のひとつであり高級フランス料理に使用される。本発明に用いるトリュフの種類としては、白トリュフ（Tuber magnatum Pico）、黒トリュフ（Tuber melanosporum Vitt）が好ましい。

本発明において、トリュフの抽出物は、子実体または菌糸体の抽出物をいうが、子実体の抽出物が好ましい。また、抽出には、子実体または菌糸体をそのまま使用してもよく、乾燥、粉砕、細切等の処理を行ってもよい。

抽出方法は、特に限定されないが、水もしくは熱水、または水と有機溶媒の混合溶媒を用い、攪拌またはカラム抽出する方法により行うことができる。有機溶媒としては、低級アルコール類（メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール等）、液状多価アルコール類（１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン等）、アセトニトリル、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチル等）、炭化水素類（ヘキサン、ヘプタン、流動パラフィン等）、エーテル類（エチルエーテル、テトラヒドロフラン、プロピルエーテル等）が挙げられる。なかでも、低級アルコール、液状多価アルコール等の極性溶媒が好ましく、エタノール、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール等の水溶性有機溶媒がより好ましく、これらの一種又は二種以上を用いてもよい。特に好ましい抽出溶媒としては、水、または水−エタノール系の混合極性溶媒が挙げられる。溶媒の使用量については、特に限定はなく、例えば上記トリュフ（乾燥重量）に対し、１０倍以上、好ましくは２０倍以上であればよいが、抽出後に濃縮を行なったり、単離したりする場合の操作の便宜上１００倍以下であることが好ましい。また、抽出温度や時間は、用いる溶媒の種類によるが、例えば、１０〜１００℃、好ましくは３０〜９０℃で、３０分〜２４時間、好ましくは１〜１０時間を例示することができる。また、抽出物は、抽出した溶液のまま用いてもよいが、必要に応じて、その効果に影響のない範囲で、濃縮（有機溶媒、減圧濃縮、膜濃縮などによる濃縮）、希釈、濾過、活性炭等による脱色、脱臭、エタノール沈殿等の処理を行ってから用いてもよい。さらには、抽出した溶液を濃縮乾固、噴霧乾燥、凍結乾燥等の処理を行い、乾燥物として用いてもよい。

本発明において用いるオタネニンジン（学名：Panax ginseng C.A.Mey、別名：高麗人参、朝鮮人参、薬用人参）は、ウコギ科(Araliaceae)トチバニンジン属（Panax）に属する多年草で、生薬の「ニンジン」（和名：人参、学名：Ginseng Radix)の基原植物である。オタネニンジンの根を乾燥させたものが生薬として用いられているが、その製造方法の違いから、根の皮を剥ぎ、乾燥させた「白参」と、皮を付けたまま蒸して乾燥させた「紅参」に大別される。

本発明において、オタネニンジンは、その葉、茎、果実、果皮、花、花芽、種子、全草、根、根茎等の植物体の一部又は植物体全体、それらの混合物のいずれも用いることができるが、根が好ましく、根の側根部分がより好ましい。

本発明においてオタネニンジンは、乾燥オタネニンジン又は生のオタネニンジンのいずれも用いることができるが、乾燥オタネニンジンが好ましい。乾燥オタネニンジンの場合、水分含量が２０％以下、好ましくは１０％以下となるまで乾燥させたものが好ましい。水分含量は、日本薬局方の乾燥減量などの方法を用いて測定することができる。乾燥方法としては、植物体の乾燥方法として通常用いられ、水分含量が上記の範囲となる方法であれば特に限定はされないが、例えば、自然乾燥（風乾）、天日乾燥、通風乾燥、熱風乾燥、噴霧乾燥、減圧乾燥、真空乾燥等が挙げられる。

本発明において、上記の乾燥オタネニンジン又は生のオタネニンジンを抽出する前に、生薬の加工の際に行われる修治処理（蒸して乾かすという加工処理）に相当する蒸気加熱処理と加熱乾燥処理を行う。蒸気加熱処理は、熱水、飽和水蒸気、過熱蒸気、減圧（真空）蒸気等を熱媒体とし、高湿度雰囲気下、例えば、湿度８０％以上の雰囲気下で対象物を加熱する処理をいう。蒸気加熱は熱媒体を対象物に直接接触させることによって行ってもよく、または対象物を熱交換機を通じて間接的に加熱してもよい。また加熱は常圧下および加圧下のいずれで行ってもよい。蒸気加熱処理の条件としては、温度は、７０〜１８０℃が好ましく、１００〜１５０℃がより好ましい。時間は、温度によって異なるが、１〜１５時間が好ましく、２〜１０時間がより好ましく、２〜６時間がさらに好ましい。これらの温度及び時間の条件はあくまで例示であり、温度及び時間の相互の関係で適宜変更できる。また、本発明における蒸気加熱処理は、連続式またはバッチ式のスチーマー（蒸し機）やオートクレーブなどを用いて行えばよい。

蒸気加熱処理されたオタネニンジンは、水分を含んでいるため、加熱乾燥処理を行なう。加熱乾燥の温度としては、４０〜８５℃が好ましく、５０〜７０℃がより好ましい。乾燥方法としては、通風乾燥、熱風乾燥、マイクロ波乾燥等を用いることができる。乾燥時間（加熱時間）は、加熱温度、蒸気加熱処理後のオタネニンジンの水分含量、乾燥する総量によって異なり、特定はできないが、約６〜２４時間の範囲である。

上記のようにして蒸気加熱処理後、加熱乾燥処理を施したオタネニンジンを抽出する。抽出方法は、前記のトリュフの抽出と同様にして行えばよく、抽出溶媒の種類、抽出温度・時間、抽出後の処理については、前記のトリュフの抽出方法に従えばよい。

本発明において、トリュフの抽出物、修治オタネニンジンの抽出物は、いずれか１種を用いてもよいが、両者を併用すると毛包を構成する細胞の賦活化効果が増強するので好ましい。トリュフの抽出物と修治オタネニンジンの抽出物を併用する場合、混合比率は限定されないが、好ましくは１：１０〜１０：１であり、より好ましくは１：５〜５：１であり、さらに好ましくは１：２〜２：１であり、最も好ましくは１：１である。

上記のトリュフの抽出物、オタネニンジンの抽出物は、毛包を構成する細胞の賦活化作用を有するので、毛包を構成する細胞の賦活化剤として使用できる。ここで、毛包を構成する細胞としては、毛包（毛嚢）を構成する任意の細胞をいい、例えば、毛包幹細胞、毛乳頭細胞、毛母細胞、内毛根鞘細胞、外毛根鞘細胞、あるいはこれらの培養細胞等が含まれる。

本発明において、毛包を構成する細胞の賦活化とは、当該細胞の増殖促進、減少又は枯渇の抑制、機能維持をいう。毛包を構成する細胞の賦活化には、具体的には、毛髪の成長と再生を担う毛包幹細胞や毛乳頭細胞の外的ストレスに対する防御機能の促進、発毛や育毛に関連する種々の細胞増殖因子の産生の促進などが含まれる。ここで、発毛や育毛に関連する細胞増殖因子には、毛乳頭細胞や外毛根鞘細胞等から産生される線維芽細胞増殖因子（FGF)、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）、インシュリン様増殖因子（IGF)、上皮細胞成長因子(EGF)、肝細胞増殖因子(HGF)等が含まれる。具体的には、FGFとしては、FGF-7、FGF-5、FGF-10、FGF-1（aFGF）、FGF-2（bFGF）、FGF-3、FGF-3(int-2)、FGF-4(hst-1/kaposi- FGF) 、FGF-5、FGF-6(hst-2) 、FGF-8、FGF-9が挙げられ、VEGFとしては、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-Eが挙げられ、IGFとしては、IGF-1、IGF-2が挙げられる。

また、本発明の毛包を構成する細胞の賦活化剤は、毛包幹細胞や毛乳頭細胞等を再生医療に使用するために培養する際に、当該細胞を賦活化するための培地添加剤としても使用することができる。

本発明の毛包を構成する細胞の賦活化剤は、そのまま使用することも可能であるが、本発明の効果を損なわない範囲で適当な添加物等と混合し、医薬品、医薬部外品、化粧品などの組成物の形態とすることができる。なかでも、頭皮や毛髪に使用するのに適した製剤形態に製剤化した毛髪用組成物が好ましく、当該毛髪用組成物は、脱毛症の予防及び／又は改善のために使用することができる。

本発明において、「脱毛症の予防及び／又は改善」には、脱毛や薄毛の発生の阻止、脱毛や薄毛の程度（本数や範囲）の改善、脱毛や薄毛の進行速度の低下、脱毛や薄毛に伴う毛髪の光沢や弾性の減少の抑制などが含まれる。また、脱毛症の予防及び／又は改善効果は、頭髪に直接な作用機序を示す場合と頭部における経皮的な作用機序を示す場合の両方を含む。

本発明において、脱毛症とは、例えば、加齢、疾患、紫外線や過労などの種々のストレスなどにより、毛髪の一部又は全部が抜けて、頭皮の一部又は全体が透けて見える症状をいう。脱毛症には、例えば、男性型脱毛症（ＡＧＡ）、びまん性脱毛症（ＦＡＧＡ）、円形脱毛症、老人性脱毛症、脂漏性脱毛症、粃糠性脱毛症、産後（分娩後）脱毛症、機械性（圧迫性若しくは牽引性）脱毛症、先天性脱毛症、火傷または外傷後の脱毛症、抗がん剤による薬剤性脱毛症、瘢痕性脱毛症（毛孔性扁平苔癬、紅斑性狼瘡、禿髪性毛包炎、頭部乳頭状皮膚炎等）、トリコチロマニア（抜毛症）などが含まれるが、これらに限定はされない。

毛髪用組成物は、皮膚外用組成物において通常使用されている各種の成分、添加剤、基剤等をその種類に応じて選択し、適宜配合し、当分野で公知の手法に従って製造することができる。配合する成分、添加剤、基材としては、例えば、希釈剤（精製水、エタノール等）、油脂類（オリーブ油、ヤシ油、月見草油、ホホバ油、ヒマシ油、硬化ヒマシ油等）、ロウ類（ラノリン、ミツロウ、カルナウバロウ等）、炭化水素類（流動パラフィン、スクワレン、スクワラン、ワセリン等）、脂肪酸類（ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘニン酸等）、高級アルコール類（ミリスチルアルコール、セタノール、セトステアリルアルコール、ステアリルアルコール、ベヘニルアルコール等）、エステル類（ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、オクタン酸セチル、トリオクタン酸グリセリン、ミリスチン酸オクチルドデシル、ステアリン酸オクチル、ステアリン酸ステアリル等）、有機酸類（クエン酸、乳酸、α-ヒドロキシ酢酸、ピロリドンカルボン酸等）、糖類（マルチトール、ソルビトール、キシロビオース、N-アセチル-D-グルコサミン等）、界面活性剤、シリコーン油、保湿剤、増粘剤、紫外線吸収剤、金属イオン封鎖剤、清涼化剤、抗酸化剤、安定化剤、防腐剤、消炎剤、殺菌剤、香料、着色料等が挙げられる。

また、上記毛髪用組成物には、本発明の効果に悪影響を及ぼさない限り、育毛料・養毛料の成分として従来より知られている成分を含めてもよい。例えば、センブリエキス、柑橘類エキス等の植物抽出エキス、ビタミンＢ_６、ビタミンＥ及びその誘導体、ビオチン等のビタミン類、パントテン酸及びその誘導体、グリチルリチン酸及びその誘導体、ニコチン酸エステル、セリン、メチオニン等のアミノ酸類、セフォランチン、塩化カプロニウム、ミノキシジル、ニコランジル、アセチルコリン誘導体、サイクロスポリン類、及びエストラジオール等の女性ホルモン剤等、ならびにこれらの混合物が挙げられる。

本発明において、毛髪用組成物は、頭皮や毛髪に使用するものを広く指し、頭皮や毛髪に適用可能なものであればいずれでもよく、剤型は特に問わない。例えば、液状、乳液状、クリーム状、ゲル状、ペースト状、スプレー状等のいずれであってもよい。具体的な製品形態としては、クリーム、ローション、乳剤、軟膏、ゲル、ヘアシャンプー、ヘアリンス、ヘアトリートメント、ヘアコンディショナー、スカルプトリートメント、ヘアスプレー、ヘアパック、ヘアエッセンス、ヘアトニック、ヘアリキッド、ヘアムースなどが挙げられる。

これらの製品形態をとる毛髪用組成物中のトリュフの抽出物及び／又は修治オタネニンジンの抽出物の含有量は、形態に応じて異なるので特定することはできないが、一般に、当該組成物の総重量に対し、０．０００１〜２０重量％（ｗ／ｗ）、好ましくは０．００１〜１０重量％（ｗ／ｗ）である。トリュフの抽出物及び／又は修治オタネニンジンの抽出物の添加の方法については、予め加えておいても、製造途中で添加しても良く、作業性を考えて適宜選択すれば良い。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。

[実施例１] トリュフ、オタネニンジンの抽出物の製造例
トリュフ、オタネニンジンの抽出物を以下のとおり製造した。

（製造例１）トリュフの熱水抽出物の調製
トリュフの粉砕物１００ｇに精製水１Ｌを加え、９０〜１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥してトリュフの熱水抽出物を５．１ｇ得た。

（製造例２）生オタネニンジンの根（蒸気加熱：１０５℃、加熱乾燥：５０℃）の熱水抽出物の調製
収穫後の生のオタネニンジン（水分量８０％）を１０５℃で８時間蒸した後、５０℃で乾燥させた（日本薬局方の「紅参」に適合）。このオタネニンジンの乾燥物４０ｇに精製水８００ｍＬを加え、９５〜１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、蒸気加熱処理（１０５℃）された生オタネニンジンの根の熱水抽出物を１７．５ｇ得た。

（製造例３）乾燥オタネニンジンの根（蒸気加熱：１０５℃、加熱乾燥：５０℃）の熱水抽出物の調製
乾燥したオタネニンジンの根（水分量９％）を１０５℃で８時間蒸した後、５０℃で乾燥させた。このオタネニンジンの乾燥物４０ｇに精製水８００ｍＬを加え、９５〜１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥して蒸気加熱処理（１０５℃）された乾燥オタネニンジンの根の熱水抽出物を１８．７ｇ得た。

（製造例４）乾燥オタネニンジンの根（蒸気加熱：１２１℃、加熱乾燥：６０℃）の熱水抽出物の調製
乾燥したオタネニンジンの根（水分量７％）を１２１℃で４時間蒸した後、６０℃で乾燥させた。このオタネニンジンの乾燥物４０ｇに精製水８００ｍＬを加え、９５〜１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥して蒸気加熱処理（１２１℃）された乾燥オタネニンジンの根の熱水抽出物を１６．２ｇ得た。

（比較製造例１）生オタネニンジンの根（蒸気加熱処理なし）の熱水抽出物の調製
収穫後の生のオタネニンジンの根を６５℃で乾燥させたもの４０ｇに精製水８００ｍＬを加え、９５〜１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥して生オタネニンジンの根の熱水抽出物を１２．５ｇ得た。

［実施例２］トリュフの抽出物、オタネニンジンの抽出物の毛乳頭細胞及び毛包幹細胞の賦活化効果の評価
実施例１において製造したトリュフの抽出物、オタネニンジンの各抽出物を用いて毛乳頭細胞における細胞増殖因子遺伝子発現促進効果、炎症性サイトカインの刺激による毛包幹細胞の損傷の抑制効果の評価を行った。

（実験例１）毛乳頭細胞における細胞増殖因子遺伝子発現促進効果の評価
（１）ヒト毛乳頭細胞の培養
ヒトの毛髪を毛抜きで採取し、メス等を用いて毛包組織の毛乳頭を含む組織を回収した。PBS(-)にて洗浄した後、ピンセット等を用いて毛母に包まれている毛乳頭を摘出した。摘出した毛乳頭を培養プレートにスクラッチし、その後、10%FBS含有DMEM培地(SIGMA社製)を用いてコンフルエントになるまで維持した。コンフルエントになった細胞を回収し、同培養プレートに再び播種し、その後生着し、増殖している細胞を毛乳頭細胞として以下の試験に用いた。
（２）トリュフの抽出物、オタネニンジンの抽出物の毛乳頭細胞における細胞増殖因子遺伝子発現促進効果の評価
毛乳頭細胞に対して上記製造例で得られた各抽出物を最終濃度が100μg/mlとなるように添加した。ただし、トリュフ抽出物とオタネニンジン抽出物の混合抽出物については２種の抽出物を50μg/ml ずつ添加し、混合抽出物の最終濃度が100μg/mlとなるようにした。抽出物を添加して、48時間後の細胞を回収し、毛乳頭細胞における細胞増殖因子産生量をFGF-7及びVEGF-Aの遺伝子発現量を指標として解析した。

遺伝子発現解析は次の通り行った。抽出物添加後の毛乳頭細胞をPBS(-)にて2回洗浄した後、Trizol Reagent(Invitrogen社製)によって細胞からRNAを抽出した。2-STEPリアルタイムPCRキット(Applied Biosystems社製)を用いて、抽出したRNAをcDNAに逆転写した後、ABI7300(Applied Biosystems社製)により、下記プライマーセットを用いてリアルタイムPCR(95℃:15秒間、60℃:30秒間、40cycles)を実施し、FGF-7とVEGF-Aの発現を確認した。その他の操作は定められた方法に従って実施した。
FGF-7用プライマーセット：
5'-AGGGACCCAAGAGATGAAGAATAA-3' (配列番号１)
5'-TGATTGCCACAATTCAACTG-3' (配列番号２)
VEGF-A用プライマーセット：
5'-CTCTCTCCCTGATCGGTGACA-3' (配列番号３)
5'-GGAGGGCAGAGCTGAGTGTT-3' (配列番号４)
18srRNA(内部標準)用プライマーセット：
5'-CCGAGCCGCCTGGATAC-3' (配列番号５）
5'-CAGTTCCGAAAACCAACAAAATAGA-3'(配列番号６）

FGF-7とVEGF-Aの発現促進効果については、抽出物を添加せずに培養した毛乳頭細胞（コントロール）におけるFGF-7又はVEGF-AのmRNAの発現量を内部標準である18s ribosomal RNA（18srRNA)の発現量に対する割合として算出したFGF-7又はVEGF-A遺伝子相対発現量(FGF-7又はVEGF-A遺伝子発現量/18srRNA遺伝子発現量)の値を1とし、これに対し、抽出物を添加して培養した毛乳頭細胞におけるFGF-7又はVEGF-A遺伝子相対発現量の値を算出し、評価した。その結果を下記の表１に示す。

表１に示すように、トリュフ抽出物（製造例１）、蒸気加熱処理後、加熱乾燥処理を行った(修治)オタネニンジン抽出物（製造例２〜４）を添加した培地で培養した毛乳頭細胞では、蒸気加熱処理を行っていないオタネニンジンの抽出物（比較製造例１）に比べ、FGF-7とVEGF-Aを指標とする細胞増殖因子遺伝子の発現量が亢進し、上記抽出物は細胞増殖因子遺伝子の発現促進効果を有することが示された。また、蒸気加熱処理前に乾燥させたオタネニンジン（製造例３、４）を用いた方が、生のオタネニンジン（製造例２）を用いるよりも当該効果が高かった。さらに、製造例３（蒸気加熱温度：105℃）と製造例４（蒸気加熱温度：121℃）を比較するとより高温で蒸気加熱処理した製造例４の方が効果が高かった。また、トリュフ抽出物（製造例１）とオタネニンジン抽出物（製造例２〜４）を併用すると、格別に効果が高まることが確認できた。

（実験例２）炎症性サイトカインの刺激による細胞ダメージ抑制効果
（１）ヒト毛包幹細胞の培養
ヒトの毛髪を毛抜きで採取し、メス等を用いて毛包組織のバルジ領域を含む組織を回収した。PBS(-)にて洗浄した後、トリプシン(BD Biosciences社製)処理を行った。その後、セルストレイナー(FALCON社製)を用いて、細胞を単離し、回収した。回収した細胞を培養プレートに播種し、KG2培地(KURABO社製)を用いてコンフルエントになるまで維持した。コンフルエントになった細胞を回収し、同培養プレートに再び播種し、その後生着し、増殖している細胞を毛包幹細胞として以下の試験に用いた。
（２）炎症性サイトカイン存在下でトリュフ及びオタネニンジン抽出物を添加した際の細胞ダメージ抑制効果
培養プレートに播種した毛包幹細胞に対して各炎症性サイトカイン（IL-1a、IL-1b、IL-6、TNF-α）を最終濃度が10ng/mlとなるように添加した。炎症性サイトカイン添加後8時間後に、上記製造例で得られた各抽出物を最終濃度が100μg/mlとなるように添加した。ただし、トリュフ抽出物とオタネニンジン抽出物の混合抽出物については２種の抽出物を50μg/mlずつ添加し、混合抽出物の最終濃度が100μg/mlとなるようにした。抽出物を添加して、48時間後の細胞について、PBS(-)にて洗浄し、細胞増殖測定キット(Cell Counting Kit-8、同仁科学研究所製)を用いて細胞生存率を定められた方法に従って測定した。

細胞ダメージの抑制効果は、炎症性サイトカイン非添加／抽出物非添加で培養した細胞（コントロール）の生存数を100％とし、炎症性サイトカイン添加／抽出物添加又は非添加で培養した細胞の生存数の相対値を算出し、評価した。その結果を下記の表２に示す。

表２に示すように、炎症性サイトカイン添加によって毛包幹細胞の細胞生存率が低下したが、蒸気加熱処理を行っていないオタネニンジンの抽出物（比較製造例１）に比べ、トリュフ抽出物（製造例１）、蒸気加熱処理後、加熱乾燥処理を行った(修治)オタネニンジン抽出物（製造例２〜４）を添加した培地で培養した毛包幹細胞の細胞生存率は、上昇し、上記抽出物は炎症性サイトカイン刺激による細胞ダメージの抑制効果を有することが示された。また、蒸気加熱処理前に乾燥させたオタネニンジン（製造例３、４）を用いた方が、生のオタネニンジン（製造例２）を用いるよりも当該効果が高かった。さらに、製造例３（蒸気加熱温度：105℃）と製造例４（蒸気加熱温度：121℃）を比較するとより高温で蒸気加熱処理した製造例４の方が効果が高かった。また、トリュフ抽出物（製造例１）と修治オタネニンジン抽出物（製造例２〜４）を併用すると、格別に効果が高まることが確認できた。

本発明は、脱毛症の予防及び／又は改善を目的とした医薬品、医薬部外品、又は化粧品の製造分野において利用できる。

Claims (6)

1. トリュフの抽出物及び／又は蒸気加熱処理後、加熱乾燥処理されたオタネニンジンの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする、毛包を構成する細胞の賦活化剤。
2. 前記オタネニンジンが、乾燥又は生のオタネニンジンである、請求項１に記載の賦活化剤。
3. 前記細胞が毛乳頭細胞である、請求項１又は２に記載の賦活化剤。
4. 前記細胞が毛包幹細胞である、請求項１又は２に記載の賦活化剤。
5. 請求項１〜４のいずれか1項に記載の賦活化剤を含む、毛髪用組成物。
6. 請求項１〜４のいずれか1項に記載の賦活化剤からなる、毛包を構成する細胞の賦活化用培地添加剤。