JP2019092527A - Cd40l発現哺乳動物細胞およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
異なる種に由来する単離されたB細胞、形質芽球、および形質細胞がインビトロで培養しにくいことが報告されている。実際には、これは、通常、初代B細胞をハイブリドーマパートナーと融合する、すなわち不死化することによって不死B細胞株を作製することによって克服される。ウサギでも形質細胞腫融合パートナーが開発されたが(Spieker-Polet, H., et. al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 9348-9352(非特許文献1))、このハイブリドーマ法はウサギではうまくいかない。インビトロでウサギB細胞が持続的に生存するために、必要不可欠な活性化刺激および生存因子を供給することが必要である。様々な化合物、例えば、IL-2、IL-4、IL-10、およびその他が述べられている(例えば、Zubler, R., et al., Eur. J. Immunol. 14 (1984) 357-363(非特許文献2)、およびJ. Exp. Med. 160 (1984) 1170-1183(非特許文献3)を参照されたい)。
(i)分裂促進刺激剤の存在下での該B細胞およびCD40L発現哺乳動物細胞の第1の共存培養、ならびに
(ii)これに続く、抗体産生刺激剤の存在下での該B細胞および該CD40L発現哺乳動物細胞の第2の共存培養。
(a)抗体分泌B細胞のプールまたは単一の付着させた抗体分泌B細胞をCD40L発現哺乳動物細胞と共存培養する工程、
(b)抗原に特異的に結合する抗体の可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列をコードする核酸を単離する工程、および可変重鎖ドメインのアミノ酸配列をコードする核酸を単離する工程、
(c)(b)において単離された核酸、または軽鎖可変ドメインおよび/もしくは重鎖可変ドメインのヒト化バージョンをコードするそのバリアントを1つまたは複数の発現カセット内に含む細胞を培養する工程、
(d)該細胞または該培養培地から抗体を回収し、それによって、抗原に特異的に結合する抗体を産生する工程。
(a)(実験動物またはヒトの血液から得られた)抗体分泌(成熟)B細胞の集団を準備する工程、
(b)該B細胞集団の細胞を少なくとも1種類の蛍光色素(1つの態様では1〜3種類または2〜3種類の蛍光色素)で染色する工程、
(c)染色されたB細胞集団または染色されたB細胞集団からの細胞のプールの中の単一細胞を個別の容器(1つの態様では、容器はマルチウェルプレートのウェルである)の中に付着させる工程、
(d)CD40L発現哺乳動物細胞、ならびに任意でIL-2および/またはIL-21および/またはIL-6の存在下で、付着させた個々のB細胞を培養する工程、
(e)個々のB細胞の培養物において分泌された抗体の結合特異性を決定する工程、
(f)逆転写PCRおよびヌクレオチド配列決定によって、特異的に結合する抗体の可変軽鎖ドメインおよび可変重鎖ドメインのアミノ酸配列を決定し、それによって、モノクローナル抗体の可変軽鎖ドメインおよび可変重鎖ドメインをコードする核酸を得る工程、
(g)抗体の発現のために、該モノクローナル抗体の軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインをコードする核酸を、発現カセットに導入する工程、
(h)細胞に該核酸を導入する工程、
(i)該細胞を培養し、該細胞または該細胞培養上清から抗体を回収し、それによって、抗原に特異的に結合する抗体を産生する工程。
(a)抗体分泌(成熟)ウサギB細胞集団を準備する工程、
(b)該ウサギB細胞集団の細胞を少なくとも1種類の蛍光色素(1つの態様では1〜3種類または2〜3種類の蛍光色素)で染色する工程、
(c)染色されたウサギB細胞集団または染色されたウサギB細胞集団からの細胞のプールの中の単一細胞を個別の容器(1つの態様では、容器はマルチウェルプレートのウェルである)の中に付着させる工程、
(d)ウサギCD40L発現哺乳動物細胞ならびにIL-2およびIL-21の存在下で、付着させたウサギB細胞を培養する工程、
(e)ウサギB細胞の培養物において分泌された抗体の結合特異性を決定する工程、
(f)逆転写PCRおよびヌクレオチド配列決定によって、特異的に結合する抗体の可変軽鎖ドメインおよび可変重鎖ドメインのアミノ酸配列を決定し、それによって、モノクローナル抗体の可変軽鎖ドメインおよび可変重鎖ドメインをコードする核酸を得る工程、
(g)抗体の発現のために、該モノクローナル抗体の軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインをコードする核酸を、発現カセットに導入する工程、
(h)細胞に該核酸を導入する工程、
(i)該細胞を培養し、該細胞または該細胞培養上清から抗体を回収し、それによって、抗原に特異的に結合する抗体を産生する工程。
(a)抗体分泌(成熟)ヒトB細胞集団を準備する工程、
(b)該ヒトB細胞集団の細胞を少なくとも1種類の蛍光色素(1つの態様では1〜3種類または2〜3種類の蛍光色素)で染色する工程、
(c)染色されたヒトB細胞集団または染色されたヒトB細胞集団からの細胞のプールの中の単一細胞を個別の容器(1つの態様では、容器はマルチウェルプレートのウェルである)の中に付着させる工程、
(d)ヒトCD40L発現哺乳動物細胞ならびにIL-2および/またはIL-21および/またはIL-6の存在下で、付着させたヒトB細胞を培養する工程、
(e)ヒトB細胞の培養物において分泌された抗体の結合特異性を決定する工程、
(f)逆転写PCRおよびヌクレオチド配列決定によって、特異的に結合する抗体の可変軽鎖ドメインおよび可変重鎖ドメインのアミノ酸配列を決定し、それによって、モノクローナル抗体の可変軽鎖ドメインおよび可変重鎖ドメインをコードする核酸を得る工程、
(g)抗体の発現のために、モノクローナル抗体の軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインをコードする核酸を、発現カセットに導入する工程、
(h)細胞に該核酸を導入する工程、
(i)該細胞を培養し、該細胞または該細胞培養上清から抗体を回収し、それによって、抗原に特異的に結合する抗体を産生する工程。
(a)抗体分泌ウサギB細胞のプールまたは単一の付着させた抗体分泌ウサギB細胞をウサギCD40L発現哺乳動物細胞ならびにIL-2およびIL-21と共存培養する工程、
(b)抗原に特異的に結合する抗体の可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列をコードする核酸を単離する工程、および可変重鎖ドメインのアミノ酸配列をコードする核酸を単離する工程、
(c)(b)において単離された核酸、または軽鎖可変ドメインおよび/もしくは重鎖可変ドメインのヒト化バージョンをコードするそのバリアントを1つまたは複数の発現カセット内に含む細胞を培養する工程、
(d)該細胞または該培養培地から抗体を回収し、それによって、抗原に特異的に結合する抗体を産生する工程。
(a)抗体分泌(成熟)ウサギB細胞の集団を準備する工程、
(b)該B細胞集団の細胞を少なくとも1種類の蛍光色素(1つの態様では1〜3種類または2〜3種類の蛍光色素)で染色する工程、
(c)染色されたB細胞集団または染色されたB細胞集団からの細胞のプールの中の単一細胞を個別の容器(1つの態様では、容器はマルチウェルプレートのウェルである)の中に付着させる工程、
(d)CD40L発現哺乳動物細胞、ならびに任意でIL-2およびIL-21の存在下で、付着させた個々のB細胞を培養する工程、
(e)個々のB細胞の培養物において分泌された抗体の結合特異性を決定する工程、
(f)逆転写PCRおよびヌクレオチド配列決定によって、特異的に結合する抗体の可変軽鎖ドメインおよび可変重鎖ドメインのアミノ酸配列を決定し、それによって、モノクローナル抗体の可変軽鎖ドメインおよび可変重鎖ドメインをコードする核酸を得る工程、
(g)抗体の発現のために、該モノクローナル抗体の軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインをコードする核酸または該軽鎖可変ドメインおよび/もしくは該重鎖可変ドメインのヒト化バージョンをコードするそのバリアントを、発現カセットに導入する工程、
(h)細胞に該核酸を導入する工程、
(i)該細胞を培養し、該細胞または該細胞培養上清から抗体を回収し、それによって、抗原に特異的に結合する抗体を産生する工程。
(a)抗体分泌(成熟)ウサギB細胞の集団を準備する工程、
(b)該ウサギB細胞集団の細胞を少なくとも1種類の蛍光色素(1つの態様では1〜3種類または2〜3種類の蛍光色素)で染色する工程、
(c)染色されたウサギB細胞集団または染色されたウサギB細胞集団からの細胞のプールの中の単一細胞を個別の容器(1つの態様では、容器はマルチウェルプレートのウェルである)の中に付着させる工程、
(d)ウサギCD40L発現哺乳動物細胞ならびにIL-2およびIL-21の存在下で、付着させたウサギB細胞を培養する工程、
(e)ウサギB細胞の培養物において分泌された抗体の結合特異性を決定する工程、
(f)逆転写PCRおよびヌクレオチド配列決定によって、特異的に結合する抗体の可変軽鎖ドメインおよび可変重鎖ドメインのアミノ酸配列を決定し、それによって、モノクローナル抗体の可変軽鎖ドメインおよび可変重鎖ドメインをコードする核酸を得る工程、
(g)抗体の発現のために、該モノクローナル抗体の軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインをコードする核酸を、発現カセットに導入する工程、
(h)細胞に該核酸を導入する工程、
(i)該細胞を培養し、該細胞または該細胞培養上清から抗体を回収し、それによって、抗原に特異的に結合する抗体を産生する工程。
[本発明1001]
IL-2およびIL-21の存在下でウサギB細胞をウサギCD40L発現哺乳動物細胞と共存培養する工程を含む、抗体を産生するための方法。
[本発明1002]
B細胞が非成熟B細胞であることを特徴とする、本発明1001の方法。
[本発明1003]
IL-2がヒトIL-2であり、IL-21がマウスIL-21であることを特徴とする、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1004]
B細胞が単一の付着させたB細胞であることを特徴とする、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1005]
B細胞がIgG陽性B細胞(IgG+B細胞)であることを特徴とする、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1006]
ウサギB細胞をフィーダー細胞と共存培養するための、IL-2および/またはIL-21の使用。
[本発明1007]
フィーダー細胞がウサギCD40L発現哺乳動物細胞であることを特徴とする、本発明1006の使用。
[本発明1008]
IL-2およびIL-21の存在下でのウサギB細胞およびウサギCD40L発現哺乳動物細胞の共存培養を含む、T細胞表面抗原に特異的に結合しかつT細胞に対する負の刺激を媒介する抗体を分泌するウサギB細胞を培養するための方法。
[本発明1009]
以下の順序で以下を含む、抗体分泌ウサギB細胞を培養するための方法:
(i)分裂促進刺激剤の存在下での該ウサギB細胞およびウサギCD40L発現哺乳動物細胞の第1の共存培養、ならびに
(ii)これに続く、抗体産生刺激剤の存在下での該ウサギB細胞および該ウサギCD40L発現哺乳動物細胞の第2の共存培養。
[本発明1010]
分裂促進刺激剤が、CD40相互作用化合物およびCD40L相互作用化合物、ICOS相互作用化合物およびICOS-L相互作用化合物、APRIL、BAFF、CR2、CXCL9、CXCL12(SDF-1)、CXCL13、CXCL16、Flt-3L、インターロイキン-1(α/β)、インターロイキン-2、インターロイキン-3、インターロイキン-4、インターロイキン-5、インターロイキン-7、インターロイキン-10、インターロイキン-14、インターロイキン-21、SAP(シグナル伝達リンパ球活性化分子[SLAM]関連タンパク質)、スタフィロコッカスA(Staphylococcus A)Cowan1株粒子(SAC;加熱殺菌、ホルマリン固定)、TLRリガンド、例えば、LPS、様々なCpG ODN、またはレシキモド(R-848)、TSLP、腫瘍壊死因子(TNF)α、I型インターフェロン(例えば、IFNα/β)、ならびにII型インターフェロン(例えば、IFNγ)を含む群より選択されることを特徴とする、本発明1009の方法。
[本発明1011]
抗体産生刺激剤が、CD40相互作用化合物およびCD40L相互作用化合物、ICOS相互作用化合物および:ICOS-L相互作用化合物、APRIL、BAFF、CR2、CXCL9、CXCL12(SDF-1)、CXCL13、CXCL16、Flt-3L、インターロイキン-1(α/β)、インターロイキン-2、インターロイキン-3、インターロイキン-4、インターロイキン-5、インターロイキン-6、インターロイキン-9、インターロイキン-10、インターロイキン-13、インターロイキン-21、インターロイキン-33、SAP(シグナル伝達リンパ球活性化分子[SLAM]関連タンパク質)、スタフィロコッカスA Cowan1株粒子(SAC;加熱殺菌、ホルマリン固定)、TLRリガンド、例えば、LPS、様々なCpG ODN、またはレシキモド(R-848)、TSLP、腫瘍壊死因子(TNF)α、I型インターフェロン(例えば、IFNα/β)、ならびにII型インターフェロン(例えば、IFNγ)を含む群より選択されることを特徴とする、本発明1009または1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
以下の工程を含む、抗原に特異的に結合する抗体を産生するための方法:
(a)IL-2およびIL-21の存在下で抗体分泌ウサギB細胞のプールまたは単一の抗体分泌ウサギB細胞をウサギCD40L発現哺乳動物細胞と共存培養する工程、
(b)工程(a)において共存培養されたウサギB細胞によって分泌された抗体の可変領域をコードする核酸またはそのヒト化バリアントを1つまたは複数の発現カセット内に含む細胞を培養する工程、
(c)該細胞または該培養培地から抗体を回収し、それによって、抗原に特異的に結合する抗体を産生する工程。
[本発明1013]
以下の工程を含むことを特徴とする、本発明1012の方法:
(a)(実験動物またはヒトの血液から得られた)抗体分泌(成熟)ウサギB細胞の集団を準備する工程、
(b)該ウサギB細胞集団の細胞を少なくとも1種類の蛍光色素(1つの態様では1〜3種類または2〜3種類の蛍光色素)で染色する工程、
(c)染色されたB細胞集団の中の単一細胞を個別の容器(1つの態様では、容器はマルチウェルプレートのウェルである)の中に付着させる工程、
(d)ウサギCD40L発現哺乳動物細胞ならびにIL-2およびIL21の存在下で、付着させた個々のウサギB細胞を培養する工程、
(e)個々のウサギB細胞の培養物において分泌された抗体の結合特異性を決定する工程、
(f)逆転写PCRおよびヌクレオチド配列決定によって、特異的に結合する抗体の可変軽鎖ドメインおよび可変重鎖ドメインのアミノ酸配列を決定し、それによって、モノクローナル抗体の可変軽鎖ドメインおよび可変重鎖ドメインをコードする核酸を得る工程、
(g)抗体の発現のために、該モノクローナル抗体の軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインをコードする核酸または該軽鎖可変ドメインおよび/もしくは該重鎖可変ドメインのヒト化バージョンをコードするそのバリアントを、発現カセットに導入する工程、
(h)細胞に該核酸を導入する工程、
(i)該細胞を培養し、該細胞または該細胞培養上清から抗体を回収し、それによって、抗原に特異的に結合する抗体を産生する工程。
[本発明1014]
抗体分泌ウサギB細胞の共存培養における、ウサギCD40L発現哺乳動物細胞、IL-2、およびIL-21の使用。
[本発明1015]
CD40L発現哺乳動物細胞および/またはIL-2および/またはIL-21および/またはIL-6を任意で用いる抗体分泌B細胞の共存培養におけるSACの使用。
[本発明1016]
IL-2またはIL-21またはIL-6またはそれらの組み合わせの存在下でヒトB細胞をヒトCD40L発現哺乳動物細胞と共存培養する工程を含む、抗体を産生するための方法。
[本発明1017]
B細胞が非成熟B細胞であることを特徴とする、本発明1016の方法。
[本発明1018]
共存培養が、IL-2、またはIL-2およびIL-21、またはIL-2およびIL-21およびIL-6の存在下で行われることを特徴とする、本発明1016〜1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
B細胞が単一の付着させたB細胞であることを特徴とする、本発明1016〜1018のいずれかの方法。
[本発明1020]
B細胞がIgG陽性B細胞(IgG+B細胞)であることを特徴とする、本発明1016〜1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
ヒトB細胞をフィーダー細胞と共存培養するための、IL-2および/またはIL-21および/またはIL-6の使用。
[本発明1022]
フィーダー細胞がヒトCD40L発現哺乳動物細胞であることを特徴とする、本発明1021の使用。
[本発明1023]
IL-2、またはIL-2およびIL-21、またはIL-2およびIL-21およびIL-6が使用されることを特徴とする、本発明1021〜1022のいずれかの使用。
[本発明1024]
IL-2および/またはIL-21および/またはIL-6の存在下でのヒトB細胞およびヒトCD40L発現哺乳動物細胞の共存培養を含む、T細胞表面抗原に特異的に結合しかつT細胞に対する負の刺激を媒介する抗体を分泌するヒトB細胞を培養するための方法。
[本発明1025]
以下の工程を含む、抗原に特異的に結合する抗体を産生するための方法:
(a)IL-2および/またはIL-21および/またはIL-6の存在下で抗体分泌ヒトB細胞のプールまたは単一の抗体分泌ヒトB細胞をヒトCD40L発現哺乳動物細胞と共存培養する工程、
(b)工程(a)において共存培養されたヒトB細胞によって分泌された抗体の可変領域をコードする核酸またはそのバリアントを1つまたは複数の発現カセット内に含む細胞を培養する工程、
(c)該細胞または該培養培地から抗体を回収し、それによって、抗原に特異的に結合する抗体を産生する工程。
[本発明1026]
以下の工程を含むことを特徴とする、本発明1025の方法:
(a)抗体分泌(成熟)ヒトB細胞の集団を準備する工程、
(b)該ヒトB細胞集団の細胞を少なくとも1種類の蛍光色素(1つの態様では1〜3種類または2〜3種類の蛍光色素)で染色する工程、
(c)染色されたB細胞集団の中の単一細胞を個別の容器(1つの態様では、容器はマルチウェルプレートのウェルである)の中に付着させる工程、
(d)ヒトCD40L発現哺乳動物細胞ならびにIL-2および/またはIL21および/またはIL-6の存在下で、付着させた個々のヒトB細胞を培養する工程、
(e)個々のヒトB細胞の培養物において分泌された抗体の結合特異性を決定する工程、
(f)逆転写PCRおよびヌクレオチド配列決定によって、特異的に結合する抗体の可変軽鎖ドメインおよび可変重鎖ドメインのアミノ酸配列を決定し、それによって、モノクローナル抗体の可変軽鎖ドメインおよび可変重鎖ドメインをコードする核酸を得る工程、
(g)抗体の発現のために、該モノクローナル抗体の軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインをコードする核酸を、発現カセットに導入する工程、
(h)細胞に該核酸を導入する工程、
(i)該細胞を培養し、該細胞または該細胞培養上清から抗体を回収し、それによって、抗原に特異的に結合する抗体を産生する工程。
[本発明1027]
共存培養が、IL-2、またはIL-2およびIL-21、またはIL-2およびIL-21およびIL-6の存在下で行われることを特徴とする、本発明1025〜1026のいずれかの方法。
[本発明1028]
抗体分泌ヒトB細胞の共存培養における、ヒトCD40L発現哺乳動物細胞、IL-2および/またはIL-21および/またはIL-6の使用。
[本発明1029]
IL-2、またはIL-2およびIL-21、またはIL-2およびIL-21およびIL-6が使用されることを特徴とする、本発明1028の使用。
本明細書において報告される事項は、ウサギ(またはヒト)B細胞から出発し、少なくとも1つの培養工程を含む、ウサギ(またはヒト)抗体を迅速に、効率的に、かつ再現可能に作製するための一般に適用可能な方法を提供する。
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」とは、以下で定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン(VL)フレームワークまたは重鎖可変ドメイン(VH)フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含んでもよく、アミノ酸配列変化を含有してもよい。一部の態様において、アミノ酸変化の数は、10個以下、9個以下、8個以下、7個以下、6個以下、5個以下、4個以下、3個以下、または2個以下である。一部の態様において、VLアクセプターヒトフレームワークは、VLヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
本明細書において報告される方法では、例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはヒトから得られたB細胞を使用/処理することができる。
免疫された実験動物またはワクチン接種されたヒトの血液から多種多様な抗体産生B細胞が得られる。免疫された実験動物またはワクチン接種されたヒトの血液から得られたB細胞は、CDR内のアミノ酸配列がほとんど同じでない、または重複しない、従って、高度の多様性を示す抗体を分泌する。
末梢血単核球(PBMC)から、抗原に特異的に結合する抗体を産生するB細胞を濃縮することができる。従って、本明細書において報告される全ての方法の1つの態様において、B細胞は末梢血単核球(PBMC)から得られるか、または末梢血単核球(PBMC)からB細胞のプールが濃縮される。
本明細書において報告される方法は、1つの態様において、単一細胞としてB細胞集団のB細胞を付着させる工程を含む。
本明細書において報告される方法は、1つの態様において、B細胞のプールを付着させる工程を含む。このB細胞のプールにおいて、末梢血からの磁気親和性ビーズまたはFACS単離後に全ての数のB細胞をウェルごとに付着させる。
抗体産生B細胞およびCD40L発現哺乳動物細胞、例えば、CHO細胞またはBHK細胞の共存培養が本明細書において報告される。
共存培養後に分泌IgGを(定性的および定量的に)測定するために、一般的に、ELISAなどの当業者に公知の全ての方法を使用することができる。本明細書において報告される全ての方法の1つの態様において、ELISAが用いられる。ヒトIgGレベルを求めるために、Cytometric Bead Array(CBA)-技術(BD Biosciencesから入手可能)が用いられている。
細胞の拡大を(定性的および定量的に)測定するために、共存培養されたB細胞の増殖または生存を、様々な測定(readout)系(市販の細胞活性試験「cell titer glow」(Promega)、CFSE希釈法、3Hチミジン取り込み、または細胞培養画像)を用いて評価することができる。
高い抗体価を生じるB細胞クローンを使用すると、縮重PCRプライマーの使用を可能にする量の、(コグネイト)モノクローナル軽鎖可変領域および重鎖可変領域をコードするmRNAが得られ、高度に特異的なPCRプライマーが不要になる。また、必要とされるPCRサイクル数も少なくなる。従って、1つの態様において、逆転写PCRは、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインに対する縮重PCRプライマーを用いて行われる。
(i)放射線照射済み哺乳動物細胞、例えば、CHO(チャイニーズハムスター卵巣)細胞またはBHK(ベビーハムスター腎臓)細胞、CD40Lでトランスフェクトされたフィーダー細胞、例えば、ウサギもしくはヒト由来のCD40Lでトランスフェクトされたフィーダー細胞を用いたCD40/CD40L(CD154)経路を介した、ならびに(ii)培養培地への個々のサイトカインまたはフィーダーミックス、例えば、ヒトもしくはマウスのインターロイキン2(IL-2)および21(IL-21)、ならびに/あるいは加熱殺菌されホルマリン固定されたスタフィロコッカスA Cowan1株粒子(SAC)を含むフィーダーミックスの添加を介した抗体分泌B細胞の同時刺激が本明細書において報告される。
本明細書において報告される1つの局面は、IL-2およびIL-21の存在下でウサギB細胞をウサギCD40L発現哺乳動物細胞と共存培養する工程を含む、抗体を産生するための方法である。
-免疫されたウサギからB細胞を得る工程、および/または
-B細胞を1つ1つ付着させる工程、および/または
-B細胞をウサギCD40L発現哺乳動物細胞と共存培養する工程、および/または
-共培養されたウサギB細胞からウサギ抗体の可変ドメインをコードする核酸を得る工程、および/または
-ウサギ抗体の可変ドメインをヒト化する工程、および/または
-抗体の可変ドメインをコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養し、細胞または培養培地から抗体を回収する工程。
-免疫されたヒト、もしくはワクチン接種されたヒト、もしくは疾患を有するヒト、もしくは疾患から生存したヒトの血液からB細胞を得る工程、および/または
-B細胞を1つ1つ付着させる工程、および/または
-B細胞をヒトCD40L発現哺乳動物細胞と共存培養する工程、および/または
-共培養されたヒトB細胞からヒト抗体の可変ドメインをコードする核酸を得る工程、および/または
-ヒト抗体の可変ドメインをコードする核酸、任意で、ヒト抗体の定常領域をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養し、細胞または培養培地から抗体を回収する工程。
(i)分裂促進刺激剤の存在下での該B細胞およびCD40L発現哺乳動物細胞の第1の共存培養、ならびに
(ii)これに続く、抗体産生刺激剤の存在下での該B細胞および該CD40L発現哺乳動物細胞の第2の共存培養。
(a)抗体分泌B細胞のプールまたは単一の付着させた抗体分泌B細胞をCD40L発現哺乳動物細胞と共存培養する工程、
(b)工程(a)において共存培養されたB細胞によって分泌された抗体の可変領域をコードする核酸またはそのバリアントを1つまたは複数の発現カセット内に含む細胞を培養する工程、
(c)該細胞または該培養培地から抗体を回収し、それによって、抗原に特異的に結合する抗体を産生する工程。
(i)分裂促進刺激剤の存在下でのB細胞およびCD40L発現哺乳動物細胞の第1の共存培養、ならびに
(ii)これに続く、抗体産生刺激剤の存在下でのB細胞およびCD40L発現哺乳動物細胞の第2の共存培養
を含む。
(ab)抗原に特異的に結合する抗体の可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列をコードする核酸を単離する工程、および可変重鎖ドメインのアミノ酸配列をコードする核酸を単離する工程。
(a)抗体分泌(成熟)B細胞の集団を準備する工程、
(b)該B細胞集団の細胞を少なくとも1種類の蛍光色素で染色する工程、
(c)染色されたB細胞集団の中の単一細胞を個別の容器の中に付着させる工程、
(d)CD40L発現哺乳動物細胞ならびにIL-2およびIL21の存在下で、付着させた個々のB細胞を培養する工程、
(e)個々のB細胞の培養物において分泌された抗体の結合特異性を決定する工程、
(f)逆転写PCRおよびヌクレオチド配列決定によって、特異的に結合する抗体の可変軽鎖ドメインおよび可変重鎖ドメインのアミノ酸配列を決定し、それによって、モノクローナル抗体の可変軽鎖ドメインおよび可変重鎖ドメインをコードする核酸を得る工程、
(g)抗体の発現のために、該モノクローナル抗体の軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインをコードする核酸を、発現カセットに導入する工程、
(h)細胞に該核酸を導入する工程、
(i)該細胞を培養し、該細胞または該細胞培養上清から抗体を回収し、それによって、抗原に特異的に結合する抗体を産生する工程。
SEQ ID NO:01 ウサギ CD40Lのアミノ酸配列
SEQ ID NO:02 ヒト CD40Lのアミノ酸配列
SEQ ID NO:03 マウス CD40Lのアミノ酸配列
組換えDNA法
DNAを操作するために、Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York(1989)に記載のように標準的な方法を使用した。分子生物学試薬は製造業者の説明書に従って使用した。
DNA配列を、SequiServe GmbH(Vaterstetten, Germany)において実施した二本鎖配列決定によって決定した。
配列の作成、マッピング、分析、アノテーション、および図解のために、GCG(Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin)ソフトウェアパッケージバリアント(variant)10.2およびInfomaxのVector NTI Advance suiteバリアント8.0を使用した。
Geneart GmbH (Regensburg, Germany)がウサギCD40Lの望ましい遺伝子セグメントをコードするcDNAを調製した。発現構築物クローニングを容易にするために、下記のように、この遺伝子セグメントには独特の制限エンドヌクレアーゼ切断部位が隣接する。サブクローニングされた遺伝子断片のDNA配列をDNA配列決定によって確認した。
Zublerミックス:2ng/mlマウスIL-1β、50ng/mlマウスIL-2、10ng/mlマウスIL-10、および2ng/mlマウスTNFα(最終濃度)
野生型ニュージーランドホワイトウサギを血液の供給源として使用した。ウサギを、実験動物委員会ガイドライン(Institutional Animal Care and Use committee guidelines)および実験動物管理公認協会(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care)(Germany, Europe)に従って収容および維持した。
滅菌したストレプトアビジンコーティング6ウェルプレート(細胞培養グレード)を、PBSに溶解した0.5〜1μg/mlの濃度のビオチン化抗原と室温で1時間インキュベートした。滅菌した細胞培養6ウェルプレートを、炭酸緩衝液(0.1M重炭酸ナトリウム、34mM炭酸水素二ナトリウム(Disodiumhydrogencarbonate)、pH9.55)に溶解した2μg/ml非ビオチン化タンパク質抗原で4℃で一晩コーティングした。プレートを使用する前に滅菌PBSで3回洗浄した。
EDTAを含有する全血を1xPBSで2倍に希釈した後に、lympholyte mammal(Cedarlane Laboratories)またはFicoll Paque Plus(GE Healthcare, カタログ番号17-1440-03)によって密度遠心分離を行った。密度遠心分離はウサギPBMCを分離するために行った。PBMCを2回洗浄した後に、抗体で染色した。
10%FCS(Hyclone, Logan, UT, USA)、2mMグルタミン、1%ペニシリン/ストレプトマイシン溶液(PAA, Pasching, Austria)、2mMピルビン酸ナトリウム、10mM HEPES(PAN Biotech, Aidenbach, Germany)、および0.05mM β-メルカプトエタノール(Gibco, Paisley, Scotland)を添加したRPMI1640(Pan Biotech, Aidenbach, Germany)。
滅菌した6ウェルプレート(細胞培養グレード)を用いて、非特異的接着によりマクロファージおよび単球を枯渇させた。それぞれのウェルを最大4mlの培地および免疫されたウサギに由来する6x106個までの末梢血単核球で満たし、インキュベーターに入れて37℃で1時間、結合させた。上清中の細胞の50%をパニング工程に使用した。細胞の残り50%を免疫蛍光染色まで氷上に置いた。
タンパク質抗原でコーティングした6ウェル組織培養プレートに、4ml培地あたり6x106個までの細胞を播種し、インキュベーターに入れて37℃で1時間、結合させた。タンパク質抗原上での濃縮工程後に、ウェルを1xPBSで1〜2回、注意深く洗浄することによって非付着細胞を除去した。残っている粘着性の細胞を、インキュベーターに入れてトリプシンによって37℃で10分間、剥がし、次いで、培地で2回洗浄した。免疫蛍光染色まで細胞を氷上で保った。
シングルセルソーティングに使用した抗ウサギ IgG FITCを、AbD Serotec(STAR121F, Dusseldorf, Germany)から入手した。
a)Cell Titer Glo(CTG)生存アッセイ
CTG生存アッセイ(Promega; #G7571)を製造業者の説明書に従って使用した。
6日間インキュベートした後、3H-チミジンを添加し(0.5μCi/ウェル)、さらに16時間インキュベートした。細胞増殖中の3H-チミジンの取り込みを、マイクロプレートシンチレーションカウンター(Wallac)を用いて確かめた。
顕微鏡画像を習得するために、高解像度カメラ(Leica DFC290 HD)と組み合わせたLeica位相差顕微鏡(Leica DM IL)を使用した。
単離されたB細胞を滅菌リン酸緩衝液食塩水(PBS)で洗浄した。1x107個までの細胞を1mlのタンパク質フリーPBSに再懸濁し、最終濃度2.5μMのCFSE(#C34554, Invitrogen/Molecular Probes)と37℃で3〜10分間インキュベートした。過剰なFCS添加培地を添加することによってCFSEローディングを止めた。FCS含有培地で大規模に洗浄した後に、B細胞を共培養実験において使用した。示された時点後に、CFSE希釈の結果としてのCD19+でゲーティングされた(B)細胞の増殖をフローサイトメトリー分析(FL-1チャンネル)によって確かめた。
B細胞培養物を、Zubler, et al.(例えば、Eur. J. Immunol. 14 (1984) 357-363; J. Exp. Med. 160 (1984) 1170-1183を参照されたい)に記載の方法と同様の方法によって調製した。簡単に述べると、シングルソーティングされたB細胞を、Pansorbin Cell(1:20000)(Calbiochem(Merck), Darmstadt, Deutschland)、5%ウサギ胸腺細胞上清、およびγ線照射済みEL4-B5マウス胸腺腫細胞(2x104/ウェル)と共に、210μl/ウェルのEL4 B5培地を含む96ウェルプレートに入れてインキュベーター内で5%CO2の雰囲気中、37℃で7日間、培養した。スクリーニングのためにB細胞培養上清を除去し、可変領域遺伝子回収のために細胞をすぐに採取した、または100μlのRLT緩衝液(Qiagen, Hilden, Germany)に入れて-80℃で凍結した。
完全長ウサギCD40L用発現プラスミドの作製
ウサギCD40L遺伝子のアミノ酸配列をGenBank, アクセッション番号XP 002720374(SEQ ID NO:01)から入手した。
ウサギ CD40L CDNA 配列 XP 002720374 - SEQ ID NO:01
遺伝子セグメントをコードする合成ウサギCD40L cDNAをcDNA発現ベクターにクローニングした。この発現ベクター内で、その発現は、ヒト重鎖免疫グロブリン5'非翻訳領域(UTR)を含む、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)に由来する短縮されたイントロンA欠失最初期エンハンサーおよびプロモーターによって制御される。この発現ベクターには、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位を有するイントロンA、完全長ウサギCD40L遺伝子とそのシグナルアンカー配列、および強力なウシ成長ホルモン由来ポリアデニル化シグナルが含まれる。この発現プラスミドは、大腸菌内でのプラスミド増幅のためにベクターpUC18に由来する複製起点およびβ-ラクタマーゼ遺伝子も含有する。
プラスミド番号7111と同様にプラスミド番号7112を構築したが、安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞株の作製/選択のためにプラスミド番号7112はさらなるハイグロマイシン耐性遺伝子を含有する。
ウサギCD40L発現CHO-K1細胞の作製
製造業者の説明書に従って、(例えば、リポフェクション法またはNucleofectorキットT(Lonza、以前は Amaxa, VCA-1002)とNucleofectorプログラム U-17を用いて)CHO-K1(ATCC CCL-61)細胞をウサギCD40Lコードプラスミド(#7112)でトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を6ウェルプレート中で24時間、培養してから、選択圧を確立するために0.5mg/mlハイグロマイシンを添加した。トランスフェクションして2週間後に、培地に10%FCS(v/v)を添加した。5週間の拡大および選択期の後に、トランスフェクトされた細胞を、交差反応性ポリクローナルヤギ抗マウスCD40L一次抗体(R&D Systems; AF1163)および抗ヤギIgG二次抗体(Alexa488標識; Molecular Probes; #A11055)を用いてFACS Ariaで分析した。平均蛍光強度が最も高かった(上位5%)細胞をU底96ウェルプレートにおけるシングルセルソーティングに使用した。拡大をさらに2週間行った後に、クローンのウサギCD40L発現をFACSによって分析した。
共培養のためのフィーダー細胞への放射線照射
ウサギCD40Lを安定発現するCHOクローンを、CHO rbCD40L培地中で選択圧(0.5mg/mlハイグロマイシン)下で増殖させ、さらに使用するまで液体窒素中に保存した。
ウサギ末梢血に由来する初代抗体分泌細胞(ASC)の単離手順-
ウサギB細胞を単離するために、免疫されていないニュージーランドホワイトウサギの全血を使用した。
共培養系の樹立
予備実験では、スティミュレーター細胞およびウサギB細胞を主に2:1の比で共培養した。
IgG特異的ELISAによって可視化した抗体産生
共培養後、後でウサギIgGを確かめるために150μlの培養上清を移した。拡大されたウサギB細胞を、FCSおよびDMSOを添加することによって96ウェル形式で液体窒素中に保存した。
IgG+ウサギB細胞の培養
シングルソーティングされたIgG+ウサギB細胞を、マウス胸腺腫細胞株EL4-B5およびウサギ胸腺細胞上清(TSN)およびSACと組み合わせて、またはウサギCD40L発現CHO細胞株(10,000個の細胞/ウェル;+/-さらなるSAC)の存在下で1週間、培養した。TSNを組換えサイトカインIL-2およびIL-21と交換した。
ウサギCD40L発現CHO細胞ならびにIL-2およびIL-21の混合物を含む共培養系を使用した時にウサギIgG+ウェルのパーセントは高かった(7.1%対6.7%(EL4-B5細胞を用いた場合))。この差は、ウサギCD40L発現CHO細胞にSACを添加した場合にも増加した(17.9%対6.7%)。以下の表に示したように異なる抗原に対する異なる免疫キャンペーン(campaign)からのウサギB細胞を使用することによって同様の結果が得られた。
合成ウサギB細胞培養系
TSNを添加することなく、2,500個のウサギIgG+B細胞/ウェルを放射線照射済みウサギCD40L発現CHO細胞またはEL4-B5細胞(それぞれ5,000個)と共存培養した。サプリメントの無い共存培養に加えて、組換えヒトIL-2対Zublerミックスの添加の影響を試験した。7日間、共存培養した後に、前記のようにCTGアッセイを用いてB細胞の増殖を確かめた。rbCD40L細胞を含む共存培養によってB細胞が増殖した(以下の表および図1を参照されたい)。いわゆるZublerミックスの添加と比較して、IL-2の添加によって増殖が改善したことが分かる。
T細胞阻害抗体を作製するための系
T細胞特異的抗原を用いた免疫後に、ある特定の抗原に結合するだけでなく、潜在的なアゴニスト作用も示し得る抗体のプールが生じる。得られた抗体はT細胞の生物学的性質をマイナスに妨害し、 (胸腺腫細胞株EL4-B5と同様に)培養系がT細胞に基づくのであれば、フィーダー系も妨害する。
連続したB細胞培養系の作製
免疫された哺乳動物に由来するシングルソーティングされたB細胞を放射線照射済みCD40L発現細胞と共培養する。第1の培養期において、様々な分裂促進因子(例えば、サイトカイン)を添加し(以下のリストを参照されたい)、分裂促進因子の存在下で共存培養を1〜14日間、続ける。第1の培養期後に、(培養培地を分裂促進因子フリー培地用と交換することによって、および/または細胞を洗浄することによって、または透析もしくは遠心分離/沈降によって)分裂促進因子を培養培地から除去し、抗体産生刺激剤(以下のリストを参照されたい)の存在下で培養を続ける。3日間または5日間または7日間または21日間、共存培養した後に、第2の培養期において培養上清中のIgG濃度を試験する。
ヒト抗体を作製するための共存培養系
前記実施例に記載のように、ヒトCD40L発現BHK細胞の存在下でのヒトB細胞増殖の促進における様々なサイトカインの効果を試験した。
SACを使用したB細胞培養系
単離されたヒトB細胞(1ウェルにつき5x104個の細胞、ネガティブB細胞アイソレーションキット(negative B-cell isolation kit)(#113.13D, Invitrogen)を用いてナイーブヒトPBMCから単離した)を96ウェル丸底プレート中で培養し、示されたサプリメントの存在下で6日間インキュベートした後に、増殖(CTGアッセイ)またはヒトIgG産生(ELISA)を確かめた。結果を以下の表に示した。
ウサギB細胞共存培養
TSNを添加することなく、1ウェルにつき500個のウサギIgG+B細胞をγ線照射済みウサギCD40L発現CHO細胞またはγ線照射済みCHO-K1細胞(それぞれ、10,000個)と共存培養した。サプリメントの無い共存培養に加えて、組換えヒトIL-2、組換えマウスIL-2、組換えヒトIL-21、組換えマウスIL-21、およびそれらの組み合わせの添加の影響を試験した。共存培養して7日後に、前記のようにELISAを用いてB細胞上清中の抗体価を求めた。IL-2およびIL-21の存在下でのrbCD40L細胞を含む共存培養によってB細胞が増殖し、抗体が分泌された(図7および図8を参照されたい)。
ウサギB細胞共存培養
TSNを添加することなく、凍結解凍したウサギIgG+PBMCから単離した1ウェルにつき500個のB細胞をγ線照射済みウサギCD40L発現CHO細胞またはγ線照射済みCHO-K1細胞(それぞれ、10,000個)と共存培養した。サプリメントの無い共存培養に加えて、組換えヒトIL-2、組換えマウスIL-2、組換えヒトIL-21、組換えマウスIL-21、およびそれらの組み合わせの添加の影響を試験した。共存培養して7日後に、前記のようにELISAを用いてB細胞上清中の抗体価を求めた。IL-2およびIL-21の存在下でのrbCD40L細胞を含む共存培養によってB細胞が増殖し、抗体が分泌された(図9および図10を参照されたい)。
合成ウサギB細胞培養系
低いB細胞密度:
TSNを添加することなく、1ウェルにつき500個のウサギIgG+B細胞(NZWウサギから単離した)をγ線照射済みウサギCD40L発現CHO細胞またはγ線照射済みCHO-K1細胞(それぞれ、10,000個)と共存培養した。サプリメントの無い共存培養に加えて、組換えヒトIL-2、組換えマウスIL-2、組換えヒトIL-21、組換えマウスIL-21、およびそれらの組み合わせの添加の影響を試験した。共存培養して7日後に、前記のようにELISAを用いてB細胞上清中の抗体価を求めた。IL-2およびIL-21の存在下でのrbCD40L細胞を含む共存培養によってB細胞が増殖し、抗体が分泌された(図11および図12を参照されたい)。
TSNを添加することなく、1ウェルにつき2,500個のウサギIgG+B細胞(以前の低密度実験と同じNZWウサギに由来する)をγ線照射済みウサギCD40L発現CHO細胞またはγ線照射済みCHO-K1細胞(それぞれ、10,000個)と共存培養した。サプリメントの無い共存培養に加えて、組換えヒトIL-2、組換えマウスIL-2、組換えヒトIL-21、組換えマウスIL-21、およびそれらの組み合わせの添加の影響を試験した。共存培養して7日後に、前記のようにELISAを用いてB細胞上清中の抗体価を求めた。IL-2およびIL-21の存在下でのrbCD40L細胞を含む共存培養によってB細胞が増殖し、抗体が分泌された(図14を参照されたい)。
合成B細胞培養系の動態解析
実施例4に記載のように、ウサギIgG+細胞をNZWウサギ全血のPBMCから磁気的に濃縮する。IL-2、IL-21、またはIL-2およびIL-21の組み合わせ(起源が同じまたは異なる。例えば、マウスおよびヒト)の非存在下または存在下で、1ウェルにつき500個のウサギB細胞をγ線照射済みウサギCD40L+CHOフィーダー細胞または対照であるγ線照射済みCHO-K1フィーダー細胞(それぞれ、10,000個;実施例1〜3に記載のように作製)と1:20の比で培養する。1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、および7日間、培養した後に(d1〜d7)、ウサギB細胞とウサギCD40L発現CHO細胞との共培養を上清中のウサギIgG産生および細胞増殖について評価する。これらのデータを、CD40L発現の無いフィーダー細胞と共に、および/またはさらなる外因性刺激(同じ1種類のインターロイキンもしくはインターロイキンの組み合わせ)の非存在下で共存培養された細胞と比較する。成長および増殖の動態をCTGアッセイおよび顕微鏡分析を介して確かめる(前記を参照されたい)。
-50U/mlのマウスIL-2(Roche Diagnostics GmbH, カタログ番号11271164001)
-50U/mlのヒトIL-2(Roche Diagnostics GmbH, カタログ番号11147528001)
-IL-21バッチ(eBioscience, カタログ番号14-8219)に応じて10〜100ng/mlの間で変化する、ED50濃度の1倍〜3倍の範囲のヒトIL-21
-100ng/mlのマウスIL-21(R&D Systems, カタログ番号594-ML)。
Claims (29)
- IL-2およびIL-21の存在下でウサギB細胞をウサギCD40L発現哺乳動物細胞と共存培養する工程を含む、抗体を産生するための方法。
- B細胞が非成熟B細胞であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- IL-2がヒトIL-2であり、IL-21がマウスIL-21であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- B細胞が単一の付着させたB細胞であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- B細胞がIgG陽性B細胞(IgG+B細胞)であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- ウサギB細胞をフィーダー細胞と共存培養するための、IL-2および/またはIL-21の使用。
- フィーダー細胞がウサギCD40L発現哺乳動物細胞であることを特徴とする、請求項6に記載の使用。
- IL-2およびIL-21の存在下でのウサギB細胞およびウサギCD40L発現哺乳動物細胞の共存培養を含む、T細胞表面抗原に特異的に結合しかつT細胞に対する負の刺激を媒介する抗体を分泌するウサギB細胞を培養するための方法。
- 以下の順序で以下を含む、抗体分泌ウサギB細胞を培養するための方法:
(i)分裂促進刺激剤の存在下での該ウサギB細胞およびウサギCD40L発現哺乳動物細胞の第1の共存培養、ならびに
(ii)これに続く、抗体産生刺激剤の存在下での該ウサギB細胞および該ウサギCD40L発現哺乳動物細胞の第2の共存培養。 - 分裂促進刺激剤が、CD40相互作用化合物およびCD40L相互作用化合物、ICOS相互作用化合物およびICOS-L相互作用化合物、APRIL、BAFF、CR2、CXCL9、CXCL12(SDF-1)、CXCL13、CXCL16、Flt-3L、インターロイキン-1(α/β)、インターロイキン-2、インターロイキン-3、インターロイキン-4、インターロイキン-5、インターロイキン-7、インターロイキン-10、インターロイキン-14、インターロイキン-21、SAP(シグナル伝達リンパ球活性化分子[SLAM]関連タンパク質)、スタフィロコッカスA(Staphylococcus A)Cowan1株粒子(SAC;加熱殺菌、ホルマリン固定)、TLRリガンド、例えば、LPS、様々なCpG ODN、またはレシキモド(R-848)、TSLP、腫瘍壊死因子(TNF)α、I型インターフェロン(例えば、IFNα/β)、ならびにII型インターフェロン(例えば、IFNγ)を含む群より選択されることを特徴とする、請求項9に記載の方法。
- 抗体産生刺激剤が、CD40相互作用化合物およびCD40L相互作用化合物、ICOS相互作用化合物および:ICOS-L相互作用化合物、APRIL、BAFF、CR2、CXCL9、CXCL12(SDF-1)、CXCL13、CXCL16、Flt-3L、インターロイキン-1(α/β)、インターロイキン-2、インターロイキン-3、インターロイキン-4、インターロイキン-5、インターロイキン-6、インターロイキン-9、インターロイキン-10、インターロイキン-13、インターロイキン-21、インターロイキン-33、SAP(シグナル伝達リンパ球活性化分子[SLAM]関連タンパク質)、スタフィロコッカスA Cowan1株粒子(SAC;加熱殺菌、ホルマリン固定)、TLRリガンド、例えば、LPS、様々なCpG ODN、またはレシキモド(R-848)、TSLP、腫瘍壊死因子(TNF)α、I型インターフェロン(例えば、IFNα/β)、ならびにII型インターフェロン(例えば、IFNγ)を含む群より選択されることを特徴とする、請求項9または10のいずれか一項に記載の方法。
- 以下の工程を含む、抗原に特異的に結合する抗体を産生するための方法:
(a)IL-2およびIL-21の存在下で抗体分泌ウサギB細胞のプールまたは単一の抗体分泌ウサギB細胞をウサギCD40L発現哺乳動物細胞と共存培養する工程、
(b)工程(a)において共存培養されたウサギB細胞によって分泌された抗体の可変領域をコードする核酸またはそのヒト化バリアントを1つまたは複数の発現カセット内に含む細胞を培養する工程、
(c)該細胞または該培養培地から抗体を回収し、それによって、抗原に特異的に結合する抗体を産生する工程。 - 以下の工程を含むことを特徴とする、請求項12に記載の方法:
(a)(実験動物またはヒトの血液から得られた)抗体分泌(成熟)ウサギB細胞の集団を準備する工程、
(b)該ウサギB細胞集団の細胞を少なくとも1種類の蛍光色素(1つの態様では1〜3種類または2〜3種類の蛍光色素)で染色する工程、
(c)染色されたB細胞集団の中の単一細胞を個別の容器(1つの態様では、容器はマルチウェルプレートのウェルである)の中に付着させる工程、
(d)ウサギCD40L発現哺乳動物細胞ならびにIL-2およびIL21の存在下で、付着させた個々のウサギB細胞を培養する工程、
(e)個々のウサギB細胞の培養物において分泌された抗体の結合特異性を決定する工程、
(f)逆転写PCRおよびヌクレオチド配列決定によって、特異的に結合する抗体の可変軽鎖ドメインおよび可変重鎖ドメインのアミノ酸配列を決定し、それによって、モノクローナル抗体の可変軽鎖ドメインおよび可変重鎖ドメインをコードする核酸を得る工程、
(g)抗体の発現のために、該モノクローナル抗体の軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインをコードする核酸または該軽鎖可変ドメインおよび/もしくは該重鎖可変ドメインのヒト化バージョンをコードするそのバリアントを、発現カセットに導入する工程、
(h)細胞に該核酸を導入する工程、
(i)該細胞を培養し、該細胞または該細胞培養上清から抗体を回収し、それによって、抗原に特異的に結合する抗体を産生する工程。 - 抗体分泌ウサギB細胞の共存培養における、ウサギCD40L発現哺乳動物細胞、IL-2、およびIL-21の使用。
- CD40L発現哺乳動物細胞および/またはIL-2および/またはIL-21および/またはIL-6を任意で用いる抗体分泌B細胞の共存培養におけるSACの使用。
- IL-2またはIL-21またはIL-6またはそれらの組み合わせの存在下でヒトB細胞をヒトCD40L発現哺乳動物細胞と共存培養する工程を含む、抗体を産生するための方法。
- B細胞が非成熟B細胞であることを特徴とする、請求項16に記載の方法。
- 共存培養が、IL-2、またはIL-2およびIL-21、またはIL-2およびIL-21およびIL-6の存在下で行われることを特徴とする、請求項16〜17のいずれか一項に記載の方法。
- B細胞が単一の付着させたB細胞であることを特徴とする、請求項16〜18のいずれか一項に記載の方法。
- B細胞がIgG陽性B細胞(IgG+B細胞)であることを特徴とする、請求項16〜19のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトB細胞をフィーダー細胞と共存培養するための、IL-2および/またはIL-21および/またはIL-6の使用。
- フィーダー細胞がヒトCD40L発現哺乳動物細胞であることを特徴とする、請求項21に記載の使用。
- IL-2、またはIL-2およびIL-21、またはIL-2およびIL-21およびIL-6が使用されることを特徴とする、請求項21〜22のいずれか一項に記載の使用。
- IL-2および/またはIL-21および/またはIL-6の存在下でのヒトB細胞およびヒトCD40L発現哺乳動物細胞の共存培養を含む、T細胞表面抗原に特異的に結合しかつT細胞に対する負の刺激を媒介する抗体を分泌するヒトB細胞を培養するための方法。
- 以下の工程を含む、抗原に特異的に結合する抗体を産生するための方法:
(a)IL-2および/またはIL-21および/またはIL-6の存在下で抗体分泌ヒトB細胞のプールまたは単一の抗体分泌ヒトB細胞をヒトCD40L発現哺乳動物細胞と共存培養する工程、
(b)工程(a)において共存培養されたヒトB細胞によって分泌された抗体の可変領域をコードする核酸またはそのバリアントを1つまたは複数の発現カセット内に含む細胞を培養する工程、
(c)該細胞または該培養培地から抗体を回収し、それによって、抗原に特異的に結合する抗体を産生する工程。 - 以下の工程を含むことを特徴とする、請求項25に記載の方法:
(a)抗体分泌(成熟)ヒトB細胞の集団を準備する工程、
(b)該ヒトB細胞集団の細胞を少なくとも1種類の蛍光色素(1つの態様では1〜3種類または2〜3種類の蛍光色素)で染色する工程、
(c)染色されたB細胞集団の中の単一細胞を個別の容器(1つの態様では、容器はマルチウェルプレートのウェルである)の中に付着させる工程、
(d)ヒトCD40L発現哺乳動物細胞ならびにIL-2および/またはIL21および/またはIL-6の存在下で、付着させた個々のヒトB細胞を培養する工程、
(e)個々のヒトB細胞の培養物において分泌された抗体の結合特異性を決定する工程、
(f)逆転写PCRおよびヌクレオチド配列決定によって、特異的に結合する抗体の可変軽鎖ドメインおよび可変重鎖ドメインのアミノ酸配列を決定し、それによって、モノクローナル抗体の可変軽鎖ドメインおよび可変重鎖ドメインをコードする核酸を得る工程、
(g)抗体の発現のために、該モノクローナル抗体の軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインをコードする核酸を、発現カセットに導入する工程、
(h)細胞に該核酸を導入する工程、
(i)該細胞を培養し、該細胞または該細胞培養上清から抗体を回収し、それによって、抗原に特異的に結合する抗体を産生する工程。 - 共存培養が、IL-2、またはIL-2およびIL-21、またはIL-2およびIL-21およびIL-6の存在下で行われることを特徴とする、請求項25〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 抗体分泌ヒトB細胞の共存培養における、ヒトCD40L発現哺乳動物細胞、IL-2および/またはIL-21および/またはIL-6の使用。
- IL-2、またはIL-2およびIL-21、またはIL-2およびIL-21およびIL-6が使用されることを特徴とする、請求項28に記載の使用。
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