JP2019031527A

JP2019031527A - ジンセノサイドＦ１またはＲｇ３を有効成分として含むグリベック耐性白血病の予防または治療用薬学組成物

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Publication number: JP2019031527A
Application number: JP2018193654A
Authority: JP
Inventors: チャンキム、ソン; Sun Chang Kim; シクキム、フン; Hun Sik Kim
Original assignee: Intelligent Synthetic Biology Center
Current assignee: Intelligent Synthetic Biology Center
Priority date: 2015-05-06
Filing date: 2018-10-12
Publication date: 2019-02-28
Also published as: US10376530B2; KR101733665B1; EP3181137A4; CN107073024B; KR20160132194A; WO2016178510A3; CA2961744A1; JP2017529350A; CA2961744C; US20180071327A1; JP6457074B2; EP3181137A2; WO2016178510A2; CN107073024A

Abstract

【課題】グリベック耐性白血病に対して優れた予防、治療又は改善効果を示す組成物を提供する。
【解決手段】本発明のグリベック耐性白血病の予防または治療用薬学組成物及びグリベック耐性白血病の予防または改善用食品組成物は、ジンセノサイドＲｇ３を含むか、あるいはジンセノサイドＲｇ３の薬学的に許容可能な塩を含む。前記白血病は慢性骨髄性白血病または急性リンパ性白血病である。
【選択図】図５ｂ

Description

本発明は、ジンセノサイドＦ１またはＲｇ３を有効成分として含むグリベック耐性白血病の予防または治療用薬学組成物に関する。より具体的には、本発明はグリベック耐性白血病に対して予防または治療効果を示すジンセノサイドＦ１、Ｒｇ３またはそれらの薬学的に許容可能な塩を有効成分として含むグリベック耐性白血病の予防または治療用薬学組成物、前記薬学組成物を投与する段階を含むグリベック耐性白血病の治療方法及びグリベック耐性白血病の予防または改善用食品組成物に関する。

がんの治療において、主に使用されている方法には外科的手術、抗がん化学療法、放射線療法などがある。この中で、手術及び放射線治療は切除部位または照射部位だけに効果がある局所療法であり、抗がん剤治療法は全身に対して効果を示す全身療法である。ほとんどのがんは、局所で発病して全身に転移する疾患であり、非常に早期に発見された場合を除いては、すでに微細な全身転移が存在するため、効果的な局所療法にもかかわらず再発する場合が多く、ほとんどのがん治療には局所療法だけでなく全身に広がったがんに対してより効果のある抗がん剤治療法を共に使用している。がん治療法において、抗がん剤の投与は外科的にがんの部位を除去した後に、肉眼で観察するのに難しい極めて小さいがん組織または原発性部位から他組織に転移したがん細胞を除去する重要な治療法である。しかし、がん種類別に特定の抗がん剤に対して耐性を有していたり、または長期的に特定の抗がん剤を投与する時、がん細胞が薬物耐性を獲得して、抗がん効果を正しく発揮することができない場合が発生することがある。

慢性骨髄性白血病（Chronic myeloid leukemia、CML）は、骨髄での骨髄細胞クローンの製造の増加と非調節が特徴的な悪性骨髄腫瘍である。国際がん研究所によると、ＣＭＬは９番目の染色体のｃ−ａｂ１原発がん遺伝子が２２番目の染色体のＢｃｒ遺伝子の２番目のエクソン（exon）の新しいダウンストリームの位置に移動して、フィラデルフィア染色体（Ph：Philadelphia chromosome）を形成し、これからキメラタンパク質であるＢｃｒ−Ａｂ１融合タンパク質を発現させて、前記発現された融合タンパク質は一連の不適合な造血細胞の増殖をもたし、白血病変換に寄与すると報告した。このようなＣＭＬの最も効果的な治療剤としてグリベック（gleevec）が知られているが、前記グリベックはＡＴＰ−結合位置での競争的阻害を通じて作用して、Ｂｃｒ−Ａｂ１を発現する細胞の成長を抑制したり、または細胞自滅を誘導してＣＭＬを治療する効果を示すと知られている。しかし、多数のＣＭＬ患者は、前記グリベックに耐性を示すことが報告されることにより（特許文献１）、前記グリベックに対する耐性を示すＣＭＬを治療することができる新たな抗がん剤の開発が求められ、このための研究が活発に進められている。

例えば、特許文献２にはキンマ(Piper betle)葉の抽出物を含むグリベック−耐性白血病の治療用薬学組成物が開示されており、特許文献３には3-ヒドロキシフラボンを有効成分として含むグリベック耐性白血病の治療用薬学組成物が開示されており、特許文献４にはユリノキの樹皮抽出物を含むグリベック耐性白血病の治療用薬学組成物が開示されている。これらの薬学組成物は、概して天然物から由来して、副作用を最小限に抑えながら、グリベック耐性白血病を治療する効果を示すという利点があるが、前記グリベック耐性白血病に対する治療効果が低いため、長期間の投与時間が必要であるという短所があった。これに対し、副作用を最小限に抑えながら、グリベック耐性白血病に対して優れた治療効果を示すことができる治療剤の開発が求められている。

米国公開特許第２００３−０１５８１０５号国際公開特許第２００８−０７８２０３号韓国公開特許第２０１１−００５５８３３号韓国公開特許第２０１４−０１２７９８５号

本発明者らは副作用を最小限に抑えながら、グリベック耐性白血病に対して優れた治療効果を示すことができる治療剤を開発するために鋭意努力した結果、ジンセノサイドの一種であるＦ１またはＲｇ３が副作用を最小限に抑えながら、グリベック耐性白血病に対して優れた治療効果を示すことを確認し、本発明を完成した。

本発明の一つの目的は、ジンセノサイドの一種であるＦ１、Ｒｇ３またはそれらの薬学的に許容可能な塩を含むグリベック耐性白血病の予防または治療用薬学組成物を提供することにある。

本発明の他の目的は、前記薬学組成物を投与する段階を含むグリベック耐性白血病の治療方法を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、ジンセノサイドの一種であるＦ１またはＲｇ３を含むグリベック耐性白血病の予防または改善用食品組成物を提供することにある。

本発明の薬学組成物を利用すると、従来のグリベックにより耐性を示す白血病を効果的に治療することができるため、白血病の効果的な治療に広く活用することができる。

ＰＢＭＣにＮＫ細胞を処理した場合、ＣＤ１０７ａのレベルを増加させるジンセノサイドを発掘した結果を示したグラフ及びフローサイトメトリー分析の結果を示したグラフである。前記７種のジンセノサイドの処理によるＩＦＮ−γの発現レベルの変化を示したグラフである。ＮＫ細胞にグリベック耐性白血病の細胞であるＫＣＬ−２２細胞の変異株を反応させて発現レベルが増加されたＣＤ１０７ａのレベルに及ぼすジンセノサイドの効果を示したグラフである。ジンセノサイドＦ１の処理濃度によるＮＫ細胞で発現されたＣＤ１０７ａのレベル変化を示したグラフである。ジンセノサイドＲｇ３の処理濃度によるＮＫ細胞で発現されたＣＤ１０７ａのレベル変化を示したグラフである。ジンセノサイドＦ１が処理されたＮＫ細胞のＫＣＬ−２２細胞の変異株に対する細胞傷害活性を示したグラフである。ジンセノサイドＲｇ３が処理されたＮＫ細胞のＫＣＬ−２２細胞の変異株に対する細胞傷害活性を示したグラフである。

本発明者らは副作用を最小限に抑えながら、グリベック耐性白血病に対する優れた治療効果を示すことができる治療剤を開発するため、多様な研究を実施する中で、ナチュラルキラー細胞（natural killer cell、NK cell）に注目することになった。前記ＮＫ細胞はがん及びウィルス感染疾患を中心に様々な人体疾患の発病に重要な役割を行うことが知られていて、他の免疫細胞とは異なり、がん細胞及びウィルス感染細胞をすぐに感知して除去することができ、ＩＦＮ−γのような免疫活性因子の発現を通じて免疫反応を調節し、がん細胞の発生、増殖、転移を抑制するだけでなく、抗がん剤に対して耐性を示すがん及びがんの再発に重要ながん幹細胞を除去する効果を示すと知られている。このようなＮＫ細胞の細胞傷害活性を向上させると、前記ＮＫ細胞によりグリベック耐性白血病を誘発することができる血液内の非正常的な血球細胞を分解することができると仮定し、前記ＮＫ細胞の活性を向上させることができる成分を調べた結果、ジンセノサイドに注目することになった。高麗人参から抽出した成分であるジンセノサイドはその安定性が知られているだけでなく、薬理活性に対する多様な研究が行われたことがあって、一部のジンセノサイドは各種のがんに対して優れた抗がん活性を示すことが知られていて、前記ジンセノサイドの中でもグリベック耐性白血病に対する治療効果を示す成分を導出しようとする研究を行った。その結果、一部ジンセノサイドが生体内のＮＫ細胞の細胞傷害活性を向上させて、グリベック耐性白血病を誘発する変異された血球細胞を分解することにより、グリベック耐性白血病に対する抗がん活性を示すことを確認した。特に、プロトパナキサジオール（protopanaxadiol）に属するジンセノサイドの一種であるＲｇ３及びプロトパナキサトリオール（protopanaxatriol）に属するジンセノサイドの一種であるＦ１をグリベック耐性白血病を誘発するがん細胞に処理して、これにＮＫ細胞を加えた場合、グリベック耐性白血病を誘発する変異された血球細胞を効果的に除去してグリベック耐性白血病に対して優秀な抗がん活性を示すことを確認した。

前述したように、ジンセノサイドＦ１またはＲｇ３はグリベック耐性白血病の治療剤の有効成分として使用することができるが、このようなジンセノサイドＦ１またはＲｇ３のグリベック耐性白血病に対する治療効果は今まで全く知られておらず、本発明者により最初に究明された。

これにより、本発明て提供する薬学組成物を白血病が発生した個体に投与する場合、ジンセノサイドＦ１またはＲｇ３がグリベック耐性白血病を誘発させる変異した血球細胞に直接的に作用するのではなく、ＮＫ細胞の細胞傷害活性を増大させて、前記変異した血球細胞を分解する間接的な方法で抗がん活性を示すため、グリベックに対して耐性を示す白血病患者に優れた治療効果を与えることができるということを利点にする。このような利点により、本発明で提供する薬学組成物は、グリベック耐性白血病が発病した個体に単独で投与されてもよく、白血病に対して治療効果を示す他の治療剤（例えば、イマチニブ、ニロチニブ、ラドチニブ、イブルチニブ等）と併用して投与されてもよい。

前述した目的を達成するために、本発明は一つの態様として、ジンセノサイドの一種であるＦ１、Ｒｇ３またはそれらの薬学的に許容可能である塩を含むグリベック耐性白血病の予防または治療用薬学組成物を提供する。

本発明における用語、「ジンセノサイドＦ１（ginsenoside F1）」とは、２０-０-β-Ｄ-グルコピラノシル−２０（Ｓ）−プロトパナキサトリオールとも言い、下記化学式（１）の構造を有するＰＰＴ系のジンセノサイド化合物の一種を意味する。前記ジンセノサイドＦ１はがん細胞の増殖抑制、抗がん剤の抗がん活性の増大作用、アレルギの抑制及び紫外線Ｂの照射によるアポトーシス（apoptosis）からヒトＨａＣａＴ角質細胞を保護することができると知られている。しかし、ナチュラルキラー細胞の細胞傷害活性を向上させる効果に関しては知られていない。

本発明における用語、「ジンセノサイドＲｇ３（ginsenoside Rg3）」とは、２０（Ｓ）−プロトパナキサジオール−３−０−β−Ｄ-グルコピラノシル（１、２）−β−Ｄ−グルコピラノサイドとも言い、下記化学式（２）の構造を有するＰＰＤ系ジンセノサイド化合物の一種を意味する。前記ジンセノサイドＲｇ３は様々なジンセノサイドの中でも、特に優れた抗がん活性を示すと知られている。また、このような抗がん活性だけでなく、神経保護活性、血小板凝集抑制活性、抗酸化活性、抗炎症活性、腎臓保護活性などの様々な薬理活性を示すと知られている。しかし、ナチュラルキラー細胞の細胞傷害活性を向上させる効果に関しては知られていない。

本発明における用語、「薬学的に許容可能な塩」とは、陽イオンと陰イオンが静電引力により結合している物質である塩の中でも、薬剤学的に使用することができる形態の塩を意味するが、一般的に金属塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性とのアミノ酸塩などがなり得る。例えば、金属塩としては、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土金属塩（カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩など）、アルミニウム塩などがなることができ；有機塩基との塩としては、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ、Ｎ−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩になることができ；無機酸との塩としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩になることができ；有機酸との塩としては、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸などとの塩になることができ；塩基性とのアミノ酸塩としては、アルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩になることができ；酸性のアミノ酸塩としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩になり得る。

特に好ましい塩としては、化合物内に酸性の作用基を有する場合、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土金属塩（例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩など）などのような無機塩、及びアンモニウム塩のような有機塩があり、化合物内に塩基性の作用基を有する場合、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などのような無機酸塩、酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸などのような有機酸との塩がある。

本発明における用語、「白血病（leukemia）」とは、白血球が腫瘍に増殖する疾患を意味する。前記白血病の種類は白血病が起因する白血球に応じて骨髄性白血病とリンパ性白血病とに分けられ、進行速度により急性白血病と慢性白血病に区分し得る。前記白血病の臨床的様相は疾患の種類と侵犯された細胞の性質に応じて様々な様相を示し、例えば、リンパ性白血病はリンパ系血液細胞が変異されて、骨髄性白血病は骨髄系血液細胞が変異され、慢性骨髄性白血病は成熟期にある骨髄細胞が変異されて、急性骨髄性白血病は比較的初期段階の造血過程で分化を開始する骨髄系親細胞が変異されて発病すると知られている。

本発明において、前記白血病はグリベック耐性白血病を意味するものとして解釈することができるが、前記グリベック耐性白血病は、本発明で提供する薬学組成物の投与により治療することができる。

本発明における用語、「グリベック耐性白血病」とは、慢性骨髄性白血病（Chronic myeloid leukemia、CML）の治療剤として開発されたグリベックに対して治療耐性を示す白血病を意味する。

前述したように、本発明で提供するグリベック耐性白血病の予防または治療用薬学組成物はジンセノサイドＦ１またはＲｇ３を含み、生体内ＮＫ細胞の細胞傷害活性を向上させて、前記細胞傷害活性が増進されたＮＫ細胞がグリベック耐性白血病を誘発させた変異された血球細胞を分解することができるため、グリベック耐性白血病に治療効果を示すだけでなく、副作用がなく安全に投与することができる。ここで、本発明で提供する薬学組成物はグリベック耐性白血病が発病された個体に単独で投与されてもよく、白血病に対する治療効果を示す他の治療剤（例えば、グリベック（イマチニブ、imatinib）、ニロチニブ（nilotinib）、ラドチニブ（radotinib）、イブルチニブ（ibrutinib）など）と共に併用して投与されてもよい。

本発明の一実施例では、総１５種（Ｃ−Ｋ、Ｆ２、ＰＰＤ、Ｒｂ１、Ｒｂ２、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｇ３、Ｒｈ２、Ｆ１、ＰＰＴ、Ｒｅ、Ｒｇ１、Ｒｇ２及びＲｈ１）のジンセノサイドから血液内のＮＫ細胞の細胞傷害活性（cytotoxicity）を向上させるジンセノサイドをスクリニングした結果、７種のジンセノサイド（Ｆ２、Ｒｂ１、Ｒｇ３、Ｒｈ２、Ｆ１、Ｒｇ１及びＲｇ２）を見出し（図１）、前記７種のジンセノサイドの中で免疫活性因子（IFN-γ）の発現を増強させる４種のジンセノサイド(Ｒｇ３、Ｒｈ２、Ｆ１及びＲｇ１)を選別し（図２）、前記４種のジンセノサイドの中でも２種のジンセノサイド（Ｆ１及びＲｇ３）がＮＫ細胞を活性化させ（図３）、濃度依存的にＮＫ細胞を活性化させることを確認した（図４ａ及び４ｂ）。ここで、前記２種のジンセノサイドがＮＫ細胞の細胞傷害活性に及ぼす効果を検証した結果、グリベック耐性白血病細胞に対するＮＫ細胞の細胞傷害活性を増加させることができることを確認した（図５ａ及び５ｂ）。

本発明の薬学組成物は、薬学的組成物の製造に一般的に使用する適切な担体、賦形剤または希釈剤をさらに含むことができ、前記担体は非自然的担体(non-naturally occuring carrier)を含むことができる。具体的には、前記薬学組成物はそれぞれ通常の方法により散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾルなどの経口型剤型、外用剤、坐剤、及び滅菌注射溶液の形で剤形化して使用することができる。本発明において、前記薬学組成物に含むことができる担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び鉱物油を挙げることができる。製剤化する場合には、通常使用している充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調剤される。経口投与用の固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、これらの固形製剤は、少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム（calcium carbonate）、スクロース（sucrose）またはラクトース（lactose）、ゼラチンなどを混ぜて調剤される。また、単純な賦形剤以外にステアリン酸マグネシウム、タルクなどの潤滑剤も使用される。経口用液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当し、よく使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などを含むことができる。非経口投与用の製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤などが含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（propylene glycol）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどを使用することができる。坐剤の基剤は、ウィテプソール（witepsol）、マクロゴール、ツイン（tween）61、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどを使用することができる。

本発明の一実施例における薬学組成物に含まれた前記製剤の含量は、特にこれに制限されないが、最終組成物の総重量を基準にして、０．０００１〜５０重量％、より好ましくは０．０１〜１０重量％の含量で含むことができる。

前記本発明の薬学組成物は薬学的に有効な量で投与することができるが、本発明における用語、「薬学的に有効な量」とは、医学的治療または予防に適用可能な合理的な受益／リスク比で疾患を治療または予防するのに十分な量を意味し、有効容量レベルは疾患の重症度、薬物の活性、患者の年齢、体重、健康、性別、患者の薬物に対する敏感度、使用された本発明の組成物の投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、使用された本発明の組成物と配合または同時に使用される薬物を含む要素及びその他の医学分野でよく知られている要素により決定してもよい。本発明の薬学組成物は個別に治療剤として投与するか、または他の治療剤と併用して投与することができ、従来の治療剤とは順次的または同時に投与してもよい。そして、単一または多重投与してもよい。前記要素をすべて考慮して副作用なく、最小限の量で最大の効果を得ることができる量を投与することが重要である。

本発明の薬学組成物の投与量は使用目的、疾患の重症度、患者の年齢、体重、性別、既往力または有効成分として使用される物質の種類などを考慮して当業者が決定することができる。例えば、本発明の薬学組成物をヒトを含む哺乳動物に１日あたり１０〜１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１０〜３０ｍｇ／ｋｇで投与することができ、本発明の組成物の投与頻度は、特にこれに制限されないが、１日１回〜３回で投与するか、または容量を分割して数回投与することができる。

前述した目的を達成するための他の実施態様として、本発明は前記薬学組成物を薬剤学的に有効な量でグリベック耐性白血病が発病された個体に投与する段階を含むグリベック耐性白血病を治療する方法を提供する。この時、前記薬学組成物を個体に単独で投与してもよく、本発明の薬学組成物と他の白血病治療用の薬学組成物（例えば、イマチニブ、ニロチニブ、ラドチニブ、イブルチニブなど）とを併用して投与してもよい。

本発明における用語、「個体」とは、前記グリベック耐性白血病が発病されたヒトを含むすべての動物を意味する。本発明の組成物を個体に投与することにより、グリベック耐性白血病を治療することができる。

本発明における用語、「治療」とは、本発明の薬学組成物を投与することにより、グリベック耐性白血病が好転したり、有利に変更するすべての行為を意味する。
本発明における用語、「投与」とは、ある適切な方法で対象に本発明の薬学組成物を導入する行為を意味し、投与経路は、目的組織に到達することができる限り、経口または非経口の様々な経路を介して投与することができる。

本発明のグリベック耐性白血病を治療する方法において、前記薬学組成物の投与経路は目的組織に到達することができる限り、いかなる一般的な経路を介しても投与することができる。本発明の薬学組成物は、特にこれに制限されないが、目的とするところによって腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、鼻内投与、肺内投与、直腸内投与することができる。また、前記組成物は、活性物質が標的細胞に移動することができる任意の装置によって投与することができる。

本発明の他の様態として、ジンセノサイドの一種であるＦ１またはＲｇ３を含むグリベック耐性白血病の予防または改善用食品組成物を提供する。
前記ジンセノサイドＦ１またはＲｇ３は古来から食用または薬用として使用されてきた高麗人参から由来した化合物であるため、グリベック耐性白血病の発病を予防したり、または発病されたグリベック耐性白血病を改善させる効果を示すことができる食品の形態として製造されて摂取することができる。ここで、前記食品に含まれる前記ジンセノサイドＦ１またはＲｇ３の含量は、特にこれに制限されないが、食品組成物の総重量に対して０．００１〜１０重量％、より好ましくは０．１〜１重量％で含まれてもよい。食品が飲料の場合は、１００ｍｌを基準にして、１〜１０ｇ、好ましくは２〜７ｇの比率で含まれてもよい。また、前記組成物は食品組成物に一般的に使用され、香り、味、視覚などを向上させることができる追加の成分を含むことができる。例えば、ビタミンＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ６、Ｂ１２、ナイアシン（niacin）、ビオチン（biotin）、葉酸（folate）、パントテン酸（panthotenic acid）などを含むことができる。また、亜鉛（Zn）、鉄（Fe）、カルシウム（Ca）、クロム（Cr）、マグネシウム（Mg）、マンガン（Mn）、銅（Cu）などのミネラルを含むことができる。また、リジン、トリプトファン、システイン、バリンなどのアミノ酸を含むことができる。また、防腐剤（ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、サリチル酸、デヒドロ酢酸ナトリウムなど）、殺菌剤（さらし粉と高度さらし粉、次亜塩素酸ナトリウムなど）、酸化防止剤（ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）など）、着色剤（タール色素など）、発色剤（亜硝酸ナトリウム、亜酢酸ナトリウムなど）、漂白剤（亜硫酸ナトリウム）、調味料（ＭＳＧグルタミン酸ナトリウムなど）、甘味料（ズルチン、サイクラミン酸ナトリウム、サッカリン、ナトリウムなど）、香料（バニリン、ラクトン類など）、膨張剤（ミョウバン、Ｄ−酒石酸水素カリウムなど）、強化剤、乳化剤、増粘剤（糊料）、皮膜剤、ガム基礎剤、泡抑制剤、溶剤、改良剤などの食品添加物を添加することができる。前記添加物は、食品の種類に応じて選別され、適切な量で使用される。

一方、前記ジンセノサイドＦ１またはＲｇ３を含むグリベック耐性白血病の予防または改善用食品組成物を利用して、グリベック耐性白血病の予防または改善用健康機能性食品を製造することができる。

具体的な例として、前記食品組成物を利用してグリベック耐性白血病を予防または改善することができる加工食品を製造することができるが、例えば、菓子、飲料、酒類、発酵食品、缶詰、牛乳加工食品、食肉加工食品または麺加工食品の形態である健康機能性食品として製造することができる。この時、お菓子はビスケット、パイ、ケーキ、パン、キャンディ、ゼリー、ガム、シリアル（穀物フレークなどの食事代用品類を含む）などを含む。飲料は飲用水、炭酸飲料、機能性イオン飲料、ジュース（例えば、リンゴ、梨、ブドウ、アロエ、柑橘類、桃、ニンジン、トマトジュースなど）、甘酒などを含む。酒類は清酒、ウイスキー、焼酎、ビール、洋酒、果実酒などを含む。発酵食品は、醤油、味噌、コチュジャンなどを含む。缶詰は水産物の缶詰（例えば、マグロ、サバ、サンマ、サザエの缶詰など）、畜産物缶詰（牛肉、豚肉、鶏肉、七面鳥缶詰など）、農産物缶詰（トウモロコシ、桃、パインアップル缶詰など）を含む。乳加工食品は、チーズ、バター、ヨーグルトなどを含む。食肉加工食品は、とんかつ、ビーフカツ、チキンカツ、ソーセージ、酢豚、ナゲット類、ノビアニなどを含む。密封包装生麺などの麺を含む。この他にも、前記組成物は、レトルト食品、スープ類などに使用することができる。

本発明における用語、機能性食品（functional food）とは、特定保健用食品（food for special health use, FoSHU）と同義であり、栄養供給以外に生体調節機能を効率的に示すように加工された医学、医療的効果の高い食品を意味し、前記食品は白血病の予防または改善に有用な効果を得るために、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、液状、丸剤などの様々な形態に製造することができる。

以下、本発明を実施例を通じてより詳しく説明する。しかし、これら実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１：ＮＫ細胞の細胞傷害活性を向上させるジンセノサイドの発掘
ＮＫ細胞の細胞傷害活性に影響を及ぼすジンセノサイドを発掘するため、ＰＢＭＣ(peripheral blood mononuclear cell)に１５種（Ｃ−Ｋ、Ｆ２、ＰＰＤ、Ｒｂ１、Ｒｂ２、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｇ３、Ｒｈ２、Ｆ１、ＰＰＴ、Ｒｅ、Ｒｇ１、Ｒｇ２及びＲｈ１）のジンセノサイドを処理して、ＮＫ細胞で発現される細胞殺害効果を示すマーカータンパク質であるＣＤ１０７ａのレベルをフローサイトメトリー分析により測定した（図１）。

この時、前記ＰＢＭＣは次のように選別されたものを使用した。即ち、採血された血液をＶａｃｕｔａｉｎｅｒＣｅｌｌＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎＴｕｂｅ(sodium heparin; BD Biosciences)に入れて、遠心分離し、バフィーコート(buffy coat, lymphocytes and monocyte band)を回収して、回収されたバフィーコートをＰＢＳで洗浄した後、ｈｕｍａｎＮＫｃｅｌｌｎｅｇａｔｉｖｅｓｅｌｅｃｔｉｏｎｋｉｔ(Miltenyl Biotech)に適用してＰＢＭＣを分離した。前記分離されたＰＢＭＣを抗−ＣＤ３抗体、抗−ＣＤ１６抗体及び抗−ＣＤ５６抗体を用いたフローサイトメトリー分析に適用して、前記ＰＢＭＣに含まれたＮＫ細胞の純度が９５％以上の試料を次の実施例で使用した。

また、前記ＣＤ１０７ａのレベルは次のように測定した。即ち、前記ＮＫ細胞の純度が９５％以上のＰＢＭＣ試料に前記のそれぞれのジンセノサイドを処理して、標的細胞（Ｋ５６２細胞）を処理しＮＫ細胞を刺激した。続いて、抗−ＣＤ３抗体及び抗−ＣＤ５６抗体を用いてフローサイトメトリー分析を行い、ＮＫ細胞を分離して、抗−ＣＤ１０７ａ抗体を使用してＮＫ細胞を免疫染色した後、ＣＤ１０７ａのレベルを特定した。

図１は、ＰＢＭＣにＮＫ細胞を処理した場合、ＣＤ１０７ａのレベルを増加させるジンセノサイドを発掘した結果を示すグラフ及びフローサイトメトリー分析の結果を示すグラフである。図１で示したように、７種のジンセノサイド（Ｆ２、Ｒｂ１、Ｒｇ３、Ｒｈ２、Ｆ１、Ｒｇ１及びＲｇ２）がＮＫ細胞で発現されるＣＤ１０７ａのレベルを増加させることができることを確認した。

実施例２：ＮＫ細胞の免疫活性因子（IFN-γ）の発現を向上させるジンセノサイドの選別
前記実施例１で発掘された７種のジンセノサイドを処理し、ＮＫ細胞の免疫活性因子（IFN-γ）の発現レベルを増加させるジンセノサイドを選別した（図２）。この時、ＩＦＮ-γの発現レベルは次のように測定した。即ち、前記実施例１で分離したＰＢＭＣに前記それぞれのジンセノサイドを処理して、同様の細胞数の標的細胞（ＫＣＬ−２２細胞の変異株）を処理して刺激を与えた後、ＢｒｅｆｅｌｄｉｎＡ（GolgiPlug; BD Biosciences）を処理した。続いて、抗−ＣＤ３抗体及び抗−ＣＤ５６抗体を用いてフローサイトメトリー分析を行い、ＰＢＭＣから由来したＮＫ細胞を分離し、前記分離したＮＫ細胞にＣｙｔｏｆｉｘ/Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（BD Biosicences）を処理して穿孔した後、抗−ＩＦＮ-γ抗体で免疫染色してＩＦＮ-γのレベルを測定した（図２）。

図２は前記７種のジンセノサイドの処理による、ＩＦＮ-γの発現レベルの変化を示すグラフである。図２で示したように、前記７種のジンセノサイドの中で４種のジンセノサイド（Ｒｇ３、Ｒｈ２、Ｆ１またはＲｇ１）を処理した場合、ＩＦＮ-γの発現レベルが増加することを確認した。

実施例３：非活性化されたＮＫ細胞においてＣＤ１０７ａのレベルを増加させるジンセノサイドの選別
前記実施例２で選別された４種のジンセノサイド（Ｒｇ３、Ｒｈ２、Ｆ１またはＲｇ１）の中で、非活性化されたＮＫ細胞においてＣＤ１０７ａのレベルの増加を誘導するジンセノサイドを選別しようとした。

具体的には、ＰＢＭＣから分離したＮＫ細胞に前記４種のジンセノサイドを処理して活性化させ、ここにグリベック耐性白血病の細胞であるＫＣＬ−２２細胞の変異株を加えた後、ＣＤ１０７ａのレベルを測定して比較した（図３）。この時、対照群としてはジンセノサイドの代わりにＤＭＳＯを処理したＮＫ細胞を使用した。

図３はＮＫ細胞にグリベック耐性白血病の細胞であるＫＣＬ−２２細胞の変異株を反応させ、発現レベルが増加されたＣＤ１０７ａのレベルに及ぼすジンセノサイドの効果を示すグラフである。図３で示したように、グリベック耐性白血病の細胞であるＫＣＬ−２２細胞の変異株に反応させる場合にＣＤ１０７ａのレベルが著しく増加し、すべての実験条件においてジンセノサイドの中、Ｆ１を処理した場合に最も高いレベルのＣＤ１０７ａを示し、Ｒｇ３が２番目に高いレベルのＣＤ１０７ａを示すことを確認した。

実施例４：ＮＫ細胞のＣＤ１０７ａのレベル増加に及ぼすジンセノサイドＦ１またはＲｇ３の濃度別効果
前記実施例３で選別されたＣＤ１０７ａのレベルを最も高いレベルに増加させるＦ１と２番目の高いレベルに増加させるＲｇ３とをＰＢＭＣから分離されたＮＫ細胞に濃度（５〜２０ｕＭ）別に処理し、処理濃度によるＣＤ１０７ａのレベルの変化を測定した（図４ａ及び４ｂ）。この時、対照群としてはジンセノサイドの代わりにＤＭＳＯを処理したＮＫ細胞を使用した。

図４ａはジンセノサイドＦ１の処理濃度によるＮＫ細胞で発現されたＣＤ１０７ａのレベルの変化を示したグラフであり、図４ｂはジンセノサイドＲｇ３の処理濃度によるＮＫ細胞で発現されたＣＤ１０７ａのレベル変化を示したグラフである。図４ａ及び４ｂで示したように、ジンセノサイドＦ１及びＲｇ３のいずれも濃度依存的にＮＫ細胞でＣＤ１０７ａの発現レベルを増加させることができることを確認した。

従って、ジンセノサイドＦ１またはＲｇ３がグリベック耐性白血病の細胞に対するＮＫ細胞の細胞傷害活性を促進させる効果を示すと分析された。
実施例５：ジンセノサイドＦ１またはＲｇ３の処理におけるＮＫ細胞の細胞傷害活性
前記実施例１で分離したＰＢＭＣに前記ジンセノサイドＦ１またはＲｇ３を処理し、ユーロピウム蛍光染料で標識された標的細胞（ＫＣＬ−２２細胞の変異株）を様々なＥ：Ｔ比率（ＰＢＭＣの細胞数：標的細胞の細胞数比率＝０．６２５：１、１．２５：１、２．５：１または５：１）に加えて反応させることにより、前記ジンセノサイドにより活性化されたＮＫ細胞で前記標的細胞を分解し、標的細胞に標識されたユーロピウム蛍光染料を反応液に放出した。反応が終了した後、前記反応液に含まれたユーロピウム蛍光染料のレベルを測定し、ＮＫ細胞の細胞傷害活性を比較した（図５ａ及び５ｂ）。この時、対照群はジンセノサイドの代わりにＤＭＳＯを処理したＮＫ細胞を使用した。

図５ａはジンセノサイドＦ１が処理されたＮＫ細胞のＫＣＬ−２２細胞の変異株に対した細胞傷害活性を示し、図５ｂはジンセノサイドＲｇ３が処理されたＮＫ細胞のＫＣＬ−２２細胞の変異株に対する細胞傷害活性を示す。図５ａ及び５ｂで示したように、ジンセノサイドＦ１またはＲｇ３がＫＣＬ−２２細胞の変異株に対するＮＫ細胞の細胞傷害活性を促進することができることを確認した。

前述したことを総合すると、ジンセノサイドＦ１またはＲｇ３はＮＫ細胞を活性化させ、グリベック耐性白血病の細胞に対する細胞傷害活性を増進させることが分かった。
従って、前記ジンセノサイドＦ１またはＲｇ３はグリベック耐性白血病の予防または治療用薬学組成物の有効成分として使用できることが分かった。

Claims

ジンセノサイドＲｇ３を含むか、あるいはジンセノサイドＲｇ３の薬学的に許容可能な塩を含む、グリベック耐性白血病の予防または治療用薬学組成物であって、前記白血病が慢性骨髄性白血病または急性リンパ性白血病である、組成物。
前記ジンセノサイドＲｇ３がナチュラルキラー細胞（natural killer cell）の細胞傷害活性を増進させるものである、請求項１に記載の組成物。
前記組成物が白血病治療剤をさらに含むものである、請求項１に記載の組成物。
前記治療剤がイマチニブ（imatinib）、ニロチニブ（nilotinib）、ラドチニブ（radotinib）、イブルチニブ（ibrutinib）及びそれらの組み合わせで構成された群から選択されるものである、請求項３に記載の組成物。
前記組成物が薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤をさらに含むものである、請求項１に記載の組成物。
ジンセノサイドＲｇ３を含むか、あるいはジンセノサイドＲｇ３の薬学的に許容可能な塩を含む、グリベック耐性白血病の予防または改善用食品組成物であって、前記白血病が慢性骨髄性白血病または急性リンパ性白血病である、組成物。