JP2019001805A - 二重グリカン結合性ａａｖベクターのための方法および組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】細胞侵入および形質導入のための代替的経路を利用するために、多重グリカン結合能を有するウイルスベクターの提供。【解決手段】ＡＡＶカプシドタンパク質中に新規のグリカン結合部位を導入するために、１つまたは複数のアミノ酸置換を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質を有するウイルスベクター。前記アミノ酸置換は、特定の配列を有するＡＡＶ２中のアミノ酸２６６、アミノ酸４６３〜４７５およびアミノ酸４９９〜５０２に存在するか、または、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８もしくはＡＡＶ１０における対応するアミノ酸位置中に存在する。【選択図】図１

Description

［優先権の申立］
本出願は、米国特許法第１１９（ｅ）の下で、その全内容が参照により本明細書の一部
をなす２０１３年３月１５日出願の米国仮特許出願第６１／８０２，１１１号の利益を主
張する。

［政府支援の明示］
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金第Ｒ０１ＨＬ０８９２２１号、第
Ｐ０１ＨＬ１１２７６１号および第Ｒ０１ＡＩ０７２１７６号の下で、政府の支援により
行われたものである。合衆国政府は、本発明において一定の権利を有する。

［発明の分野］
本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来の改変されたカプシドタンパク質、それ
を含むウイルスカプシドおよびウイルスベクター、ならびにそれらの使用の方法に関する
。

ウイルス−グリカン相互作用は、宿主細胞侵入の重要な決定因子である。シアル酸、ガ
ングリオシドまたはヘパラン硫酸などの細胞表面炭水化物は、膨大な数のウイルス、例え
ばインフルエンザ、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０、ポリオーマウイルス、パピローマウイ
ルスおよび他の病原体によって利用されている^１、２。ほとんどの場合、単一のクラスの
グリカンが、ウイルスに対する細胞表面結合因子として主に作用し、細胞侵入のための他
の受容体／共受容体の連続的または並行した係合をもたらす。アデノ随伴ウイルス（ＡＡ
Ｖ）は、細胞表面結合のための主な受容体として、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、ガラクトース
（Ｇａｌ）またはシアル酸（Ｓｉａ）を利用する、ヘルパー依存的パルボウイルスである
^３、４。例えば、ＡＡＶ血清型２および３ｂは、ＨＳを利用し、ＡＡＶ１、４および５は
、異なる連結特異性でＳｉａに結合し、一方、ＡＡＶ９は、宿主細胞結合のためにＧａｌ
を利用する。異なるＡＡＶ株は、細胞取り込みのために、共受容体、例えばインテグリン
αＶβ５もしくはα５β１、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）、血小板由来増殖因
子受容体（ＰＤＧＦＲ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、肝細胞増殖因子受容体（Ｈ
ＧＦＲ）またはラミニン受容体との引き続く相互作用もまた必要とする^３、４。

特定のＡＡＶ株と単一のクラスの炭水化物との間の１対１の（ｍｏｎｏｇａｍｏｕｓ）
関係からの顕著な例外は、ＳｉａおよびＨＳの両方を認識するＡＡＶ血清型６である^５。
しかし、Ｓｉａのみが、ウイルス形質導入に必須であることが示されている。構造研究に
より、現在、ＡＡＶ６カプシドのＶＰ３サブユニット中のＲ４８８、Ｋ５２８およびＫ５
３３と合わせたＫ５３１残基が、ＨＳグリコサミノグリカンの静電気的認識のための連続
的塩基性パッチを形成することが確立されている^６〜８。同様に、ＡＡＶ２およびＡＡＶ
３ｂによるＨＳ認識の構造的基礎は、周知であり、三回対称軸に位置する塩基性アミノ酸
残基の類似のクラスターに帰せられる^９〜１２。ＡＡＶ１、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５およびＡ
ＡＶ６についてのＳｉａ結合フットプリントは、いまだ決定されていない。より最近、Ａ
ＡＶ９カプシドによるＧａｌ認識に関与する重要なアミノ酸残基が、分子ドッキングおよ
び部位特異的変異誘発の組み合わせを使用することによって同定された^１３。細胞侵入お
よび形質導入のための代替的経路を利用するために、多重グリカン結合能を有するウイル
スベクターが必要とされている。

本発明は、複数のグリカン結合部位を有する改変されたカプシドタンパク質、これらの
カプシドタンパク質を含むＡＡＶベクター、および治療ベクターとしてのそれらの使用の
ための方法を提供することによって、当該分野における以前の欠陥を克服するものである
。

一態様では、本発明は、１つまたは複数のアミノ酸置換を含むアデノ随伴ウイルス（Ａ
ＡＶ）カプシドタンパク質を提供し、前記置換は、このＡＡＶカプシドタンパク質中に新
規のグリカン結合部位を導入する。いくつかの実施形態では、前記アミノ酸置換は、ＡＡ
Ｖ２中のアミノ酸２６６、アミノ酸４６３〜４７５およびアミノ酸４９９〜５０２、また
は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８もしくは
ＡＡＶ１０における対応するアミノ酸位置中に存在する。

いくつかの実施形態では、新規のグリカン結合部位は、ヘキソース結合部位であり得、
前記ヘキソースは、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、グルコース（Ｇｌ
ｕ）またはフコース（ｆｕｃ）である。

いくつかの実施形態では、前記新規のグリカン結合部位は、シアル酸（Ｓｉａ）結合部
位であり得、前記Ｓｉａ残基は、Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）またはＮ−
グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）である。

いくつかの実施形態では、前記新規のグリカン結合部位は、二糖結合部位であり得、前
記二糖は、Ｓｉａ（α２，３）ＧａｌまたはＳｉａ（α２，６）Ｇａｌの形態の、ガラク
トースに連結されたシアル酸である。

いくつかの実施形態では、前記置換は、第１のＡＡＶ血清型由来の新しいグリカン結合
部位を、この第１のＡＡＶ血清型とは異なる第２のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質中
に導入する。

本発明は、本発明のＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶカプシドもまた提供する。

本発明のＡＡＶカプシドを含むウイルスベクター、ならびに薬学的に許容される担体中
に本発明のＡＡＶカプシドタンパク質、ＡＡＶカプシドおよび／またはウイルスベクター
を含む組成物が、本明細書中でさらに提供される。

本発明は、細胞を本発明のウイルスベクターと接触させるステップを含む、細胞中に核
酸を導入する方法をさらに提供する。この細胞は、対象中に存在し得、いくつかの実施形
態では、この対象はヒト対象であり得る。

本発明のこれらおよび他の態様は、以下に示す本発明の説明においてより詳細に扱われ
る。

ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９のＶＰ３モノマーの構造的アラインメントを示す図である。（ａ）ループＩ〜ＩＸが標識され、対称軸が示された、ＡＡＶ１（青紫色）、ＡＡＶ２（藍色）、ＡＡＶ６（明るいマゼンタ）、ＡＡＶ８（緑色）およびＡＡＶ９（茶色）のＶＰ３モノマーの重ね合わせ。（ｂ）ＡＡＶ９上のガラクトース結合部位ならびにＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６およびＡＡＶ８上の等価な残基のオーバーレイのクローズアップ図。アミノ酸残基は、（ａ）中の色コードでマークされている。座標は、ＶＰモノマーのＸ線結晶学構造から得た（ＰＤＢ受託番号：ＡＡＶ１−３ＮＧ９、ＡＡＶ２−１ＬＰ３、ＡＡＶ６−３ＯＡＨ、ＡＡＶ８−２ＱＡ０、ＡＡＶ９−３ＵＸ１）。構造的アラインメントを実施し、ＰｙＭＯＬを使用して可視化した。 Ｇ−変異体が、インビトロで細胞を形質導入するための新規グリカン受容体としてＧａｌを利用することを示す図である。（ａ）チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株に対するＡＡＶ１、１Ｇ９およびＡＡＶ９の形質導入効率。Ｐｒｏ５およびＬｅｃ２細胞を、４℃で６０分間の１０００ｖｇ／細胞のＭＯＩでのＡＡＶ−ＣＢＡ−ルシフェラーゼ感染の前に、４℃に３０分間予め冷却した。氷冷ＰＢＳによる３回の洗浄によって未結合ビリオンを除去した後、感染細胞を、３７℃インキュベーター中で２４時間培養した。発光分析を実施して、細胞溶解物からのルシフェラーゼ導入遺伝子発現効率を定量した。（ｂ）Ｐｒｏ５およびＬｅｃ２細胞に対するＡＡＶ２ｉ８、２ｉ８Ｇ９およびＡＡＶ９の形質導入効率。（ｃ）Ｐｒｏ５およびＬｅｃ２細胞に対するＡＡＶ６、６Ｇ９およびＡＡＶ９の形質導入効率。（ｄ）Ｐｒｏ５およびＬｅｃ２細胞に対するＡＡＶ８、８Ｇ９およびＡＡＶ９の形質導入効率。結果は、平均±標準誤差として示される（ｎ＝４）。統計的有意性を、片側スチューデントｔ検定を使用して評価した（ｎ．ｓ．、有意性なし；^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１）。 二重グリカン結合性ＡＡＶ２Ｇ９キメラならびにその親株ＡＡＶ２およびＡＡＶ９の三次元モデルを示す図である。（Ａ）それぞれ紫色および橙色に着色した既存のＨＳおよび「移植された」Ｇａｌ結合部位を有する、インタクトなＡＡＶ２Ｇ９カプシドの三次元構造モデル。（Ｂ〜Ｄ）ＡＡＶ２（Ｂ）、ＡＡＶ９（Ｃ）およびＡＡＶ２Ｇ９（Ｄ）カプシドの三回対称軸におけるＶＰ３トリマーの三次元表面モデルの図解。ＨＳ結合に関与する残基（ＡＡＶ２ ＶＰ１の番号付け：Ｒ４８７、Ｋ５２７、Ｋ５３２、Ｒ５８５、Ｒ５８８）およびＧａｌ結合に関与する残基（ＡＡＶ９ ＶＰ１の番号付け：Ｄ２７１、Ｎ２７２、Ｙ４４６、Ｎ４７０、Ａ４７２、Ｖ４７３、Ｗ５０３）は、（Ａ）と同様に強調している。黒色三角形は、三回対称軸を示す。 二重グリカン結合性ＡＡＶ２Ｇ９キメラのインビトロ特徴付けを示す図である。（Ａ〜Ｃ）ＦＩＴＣ−ＥＣＬおよび可溶性ヘパリンを用いた、ＣＨＯ Ｌｅｃ２細胞に対するＡＡＶ２（Ａ）、ＡＡＶ９（Ｂ）およびＡＡＶ２Ｇ９（Ｃ）形質導入の阻害。ＣＨＯ Ｌｅｃ２細胞を、４℃で予め冷却し、ＣＢＡ−ルシフェラーゼレポーター導入遺伝子カセットをパッケージングするＡＡＶ２、ＡＡＶ９またはＡＡＶ２Ｇ９による感染の前に、ＦＩＴＣ−ＥＣＬ、可溶性ヘパリンまたはその両方と共にインキュベートした。形質導入効率を、相対的光単位（ＲＬＵ）でのルシフェラーゼ活性として、感染の２４時間後に測定した。導入遺伝子発現の百分率を、対照由来のＲＬＵに対して形質導入効率を正規化することによって計算した。結果は、平均±標準誤差として示される（ｎ＝４）。（Ｄ〜Ｆ）ＦＩＴＣ−ＥＣＬおよび可溶性ヘパリンを用いた、ＣＨＯ Ｌｅｃ２細胞に対するＡＡＶ２（Ｄ）、ＡＡＶ９（Ｅ）およびＡＡＶ２Ｇ９（Ｆ）の細胞表面結合の競合的阻害。異なるＡＡＶ粒子を、４℃で予め冷却した細胞に結合させ、未結合ビリオンを、冷ＰＢＳによる洗浄によって除去した。結合ビリオンを、ウイルスゲノム抽出後にｑＰＣＲを使用して定量した。結合ビリオンの百分率を、対応する対照のものに対して、結合ビリオンの数を正規化することによって決定した。結果は、平均±標準誤差として示される（ｎ＝５）。統計的有意性を、片側スチューデントｔ検定を使用して分析した（^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１）。 感染後時間（ｈｐｉ）０時間における、Ｌｅｃ２細胞表面上の結合ビリオンの免疫蛍光を示す図である。ＣＨＯ Ｌｅｃ２細胞を、５×１０^４細胞／カバーガラスの密度で、１２ｍｍカバーガラス上で一晩プレートした。４℃で３０分間予め冷却した後に、Ｌｅｃ２細胞に、４℃で３０分間、１０００ｖｇ／細胞のＭＯＩで、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２Ｇ９およびＡＡＶ９を感染させた。未結合ビリオンの除去後、細胞を、１×ＰＢＳ中２％パラホルムアルデヒドで固定した。対応するハイブリドーマ培養物の培地上清として得られたモノクローナル抗体（ＡＡＶ２／ＡＡＶ２Ｇ９についてはＡ２０およびＡＡＶ９についてはＡＤＫ９）を、免疫蛍光洗浄緩衝液（ＩＦＷＢ）中１：１０希釈で使用して、インタクトなビリオンを検出した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４（登録商標）ヤギ抗マウスＩｇＧを、免疫蛍光検出のための二次抗体として、ＩＦＷＢ中１：１０００の希釈で利用した。次いで、カバーガラスを、ＤＡＰＩと共にＰｒｏｌｏｎｇ（登録商標）Ｇｏｌｄ退色防止試薬中で、スライドガラス上に乗せた。蛍光顕微鏡写真を、６３×油浸対物レンズおよびスペクトル検出システムを備えたＺｅｉｓｓ（登録商標）７１０共焦点レーザー走査顕微鏡を使用して取得した。画像処理を、ＬＳＭ（登録商標）ビューアーおよびＩｍａｇｅ Ｊ（登録商標）ソフトウェアを使用して実施した。白色のスケールバーは、１０μｍを示す。 ＡＡＶ２カプシドまたはＡＡＶ９カプシドによるＬｅｃ２細胞に対するＡＡＶ２Ｇ９形質導入の競合的阻害を示す図である。Ｌｅｃ２細胞を、ＡＡＶ２Ｇ９−ＣＢＡ−Ｌｕｃ粒子（ＭＯＩ＝１０００ｖｇ／細胞）による感染の前に、２時間にわたって５００〜１００，０００ｖｇ／細胞の範囲の感染多重度（ＭＯＩ）で、（Ａ）ＡＡＶ２または（Ｂ）ＡＡＶ９−ＣＢＡ−ｔｄＴｏｍａｔｏと共に予めインキュベートした。ＡＡＶ２Ｇ９形質導入の百分率阻害を、未処理対照のものに対してルシフェラーゼ導入遺伝子発現レベルを正規化することによって計算した。結果は、平均±標準誤差として示される（ｎ＝４）。統計的有意性を、片側スチューデントｔ検定を使用して分析した（^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１）。 感染後の示された時点での、Ｌｅｃ２細胞に対する、親ＡＡＶ２およびＡＡＶ９と比較したＡＡＶ２Ｇ９の形質導入効率プロファイルの動態を示す図である。予め冷却したＬｅｃ２細胞に、記載したように、１０００ｖｇ／細胞のＭＯＩで、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２Ｇ９またはＡＡＶ９−ＣＢＡ−ルシフェラーゼベクターを感染させた。感染後の示された時点（１８、２４、２８、４２および５４時間）において、細胞を、発光分析前に溶解させた。ルシフェラーゼ導入遺伝子発現を、相対的光単位（ＲＬＵ）での細胞溶解物のルシフェラーゼ活性によって測定した（ｎ＝５）。統計的有意性を、片側スチューデントｔ検定を使用して評価した（^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１）。 ＡＡＶ２Ｇ９が、インビボの迅速な開始および増強された導入遺伝子発現を媒介することを示す図である。（Ａ）ＣＢＡ−ルシフェラーゼ導入遺伝子カセットをパッケージングするＡＡＶ２、ＡＡＶ２Ｇ９およびＡＡＶ９ベクターのインビボ導入遺伝子発現動態。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝４）に、１×１０^１１ｖｇ／動物の用量で、尾静脈を介してＡＡＶベクターを投与し、生物発光画像を、Ｘｅｎｏｇｅｎ（登録商標）Ｌｕｍｉｎａ画像化システムを使用して、注射の３日後、７日後および１８日後に収集した。代表的生動物画像は、虹色スケールで生物発光で示される（１×１０^５〜１×１０^６フォトン／秒／ｃｍ^２／ステラジアン）。ＡＡＶ２Ｇ９は、ＡＡＶ２の肝指向性を維持するが、両方の親ＡＡＶ株よりも迅速かつ強いルシフェラーゼシグナルを実証する。（ＢおよびＣ）光シグナルアウトプット（フォトン／秒／ｃｍ^２／ステラジアンとして表される）の動態の定量を、異なる時間間隔において得た（Ｂ）肝臓領域および（Ｃ）動物全体の画像の周囲に関心領域（ＲＯＩ）をマークすることによって実施した（ｎ＝４）。統計的有意性を、片側スチューデントｔ検定を使用して評価した（ｎ．ｓ．、有意性なし；^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１）。 マウスにおけるＡＡＶ２Ｇ９の導入遺伝子発現の定量および生体内分布プロファイルを示す図である。（Ａ）３日目および１８日目におけるＡＡＶ２（黒色）、ＡＡＶ２Ｇ９（灰色）またはＡＡＶ９（白色）処理動物の心臓および肝臓の組織溶解物からのルシフェラーゼ導入遺伝子発現の定量（ｎ＝４）。（Ｂ）３日目および１８日目におけるＡＡＶ２（黒色）、ＡＡＶ２Ｇ９（灰色）またはＡＡＶ９（白色）を投与したＢＡＬＢ／ｃマウスから得た肝臓および心臓の溶解物におけるベクターゲノムの生体内分布（ｎ＝４）。示された時点において、宿主ゲノムＤＮＡおよびウイルスゲノムを、組織溶解物から単離し、マウスラミン遺伝子およびルシフェラーゼ導入遺伝子に特異的なプライマーセットを用いたｑＰＣＲを使用して定量した。結果は、平均±標準誤差として示される（ｎ＝４）。統計的有意性を、片側スチューデントｔ検定を使用して評価した（ｎ．ｓ．、有意性なし；^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１）。 ＣＢＡ−ルシフェラーゼ導入遺伝子カセットをパッケージングするＡＡＶ２ｉ８、２ｉ８Ｇ９およびＡＡＶ９ベクターのインビボ導入遺伝子発現動態を示す図である。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝４）に、１×１０^１１ｖｇ／動物の用量で、尾静脈を介してＡＡＶベクターを投与し、生物発光画像を、Ｘｅｎｏｇｅｎ（登録商標）Ｌｕｍｉｎａ画像化システムを使用して、注射後３日目、７日目および１８日目に収集した。代表的生動物画像は、虹色スケールで表される生物発光で示される（１０^５〜１０^６フォトン／秒／ｃｍ^２／ステラジアン）。 新生児マウスにおける代表的ＡＡＶ「Ｇ９」株のＣＮＳ指向性プロファイルを示す図である。生後０（Ｐ０）子（ｎ＝３）に、ハイブリッドニワトリβアクチン（ＣＢｈ）プロモーターによって駆動されるＧＦＰ導入遺伝子を含む３．５×１０ｅ９のＡＡＶベクターゲノムを、左脳室中に片側性に注射した。注射の２週間後、ＧＦＰ免疫組織化学により、マウス脳内の各ＡＡＶ「Ｇ９」株についての示差的伝播、領域的指向性および細胞指向性が明らかになった。

本発明は、本発明の代表的な実施形態が示された添付の図面を参照してここに記載され
る。しかし本発明は、異なる形態で具体化してもよく、本明細書中に示される実施形態に
限定されると解釈すべきではない。むしろ、これらの実施形態は、この開示が徹底的かつ
完全となり、本発明の範囲を当業者に完全に伝達するように提供されるものである。

特に規定しない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発
明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中
で発明の説明において使用される術語は、特定の実施形態だけを記載することを目的とし
ており、本発明を限定することを意図しない。本明細書中で言及される全ての刊行物、特
許出願、特許および他の参考文献は、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる。

本発明は、グリカン認識フットプリントを規定するＡＡＶカプシドタンパク質上の「ポ
ケット」の発見に基づいている。このポケットを規定する特定のアミノ酸は同定されてお
り、例えばＡＡＶ９のガラクトース結合部位について、本明細書中に記載されている。本
発明では、このＡＡＶ９ガラクトース結合フットプリントをＡＡＶ２カプシドタンパク質
鋳型中に移植し、その結果、移植されたＡＡＶ２カプシドタンパク質鋳型における新しい
グリカン結合部位を導入した。このＡＡＶガラクトース結合フットプリントは、例えば、
本明細書の表３に示される対応するアミノ酸を置換することによって、任意の他のＡＡＶ
血清型中に導入され得る。

従って、本発明は、構造モデル化研究によって手引きされ、部位特異的変異誘発によっ
て達成される、１つのＡＡＶ株から別のＡＡＶ株へのグリカン認識フットプリントの分子
移植に関する。レポーターカセットをパッケージングする（これらの新しい株から誘導し
た）組換えベクターは、細胞培養物および動物モデルにおいて、迅速な開始および増強さ
れた導入遺伝子発現を示す。鋳型として天然に存在する血清型／単離体を使用して、この
普遍的戦略は、ヒト遺伝子療法臨床試験において観察された用量依存的免疫毒性などの課
題に取り組むことができる合成二重グリカン結合性ＡＡＶ株のパネルを生成するために適
用され得る。

従って、一態様では、本発明は、１つまたは複数のアミノ酸置換を含むアデノ随伴ウイ
ルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質を提供し、これらの置換は、ＡＡＶカプシドタンパク
質中に新しいグリカン結合部位を導入する。いくつかの実施形態では、これらのアミノ酸
置換は、ＡＡＶ２中のアミノ酸２６６、アミノ酸４６３〜４７５およびアミノ酸４９９〜
５０２、またはＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ
８、ＡＡＶ１０もしくは表３中に同定される任意の他のＡＡＶ血清型中の対応するアミノ
酸位置中に存在する。

いくつかの実施形態では、新しいグリカン結合部位は、ヘキソース結合部位であり得、
ヘキソースは、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、グルコース（Ｇｌｕ）
またはフコース（ｆｕｃ）である。

いくつかの実施形態では、新しいグリカン結合部位は、シアル酸（Ｓｉａ）結合部位で
あり得、Ｓｉａ残基は、Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）またはＮ−グリコリ
ルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）である。

いくつかの実施形態では、新しいグリカン結合部位は、二糖結合部位であり得、二糖は
、Ｓｉａ（α２，３）ＧａｌまたはＳｉａ（α２，６）Ｇａｌの形態の、ガラクトースに
連結されたシアル酸である。

いくつかの実施形態では、これらの置換は、第１のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質
（「ドナー」）由来の新しいグリカン結合部位を、第１のＡＡＶ血清型とは異なる第２の
ＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質（「鋳型」）中に導入する。

本発明は、本発明のＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶカプシドもまた提供する。

本発明のＡＡＶカプシドを含むウイルスベクター、ならびに薬学的に許容される担体中
に本発明のＡＡＶカプシドタンパク質、ＡＡＶカプシドおよび／またはウイルスベクター
を含む組成物が、本明細書中でさらに提供される。

本発明は、細胞を本発明のウイルスベクターと接触させるステップを含む、細胞中に核
酸を導入する方法をさらに提供する。この細胞は、対象中に存在し得、いくつかの実施形
態では、この対象はヒト対象であり得る。

いくつかの例示的な実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質ドナーは、ＡＡＶ血清型
９であり得、ＡＡＶカプシドタンパク質鋳型は、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ血
清型２（ＡＡＶ２）、ＡＡＶ血清型３ａ（ＡＡＶ３ａ）、ＡＡＶ血清型３ｂ（ＡＡＶ３ｂ
）、ＡＡＶ血清型４（ＡＡＶ４）、ＡＡＶ血清型５（ＡＡＶ５）、ＡＡＶ血清型６（ＡＡ
Ｖ６）、ＡＡＶ血清型７（ＡＡＶ７）、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）またはＡＡＶ血清型
１０（ＡＡＶ１０）であり得る。

いくつかの例示的な実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質鋳型は、ＡＡＶ２由来で
あり得、ａ）アミノ酸２６６における置換は、Ａ２６６Ｓであり；ｂ）アミノ酸４６３〜
４７５における置換は、ＳＱＡＧＡＳＤＩＲＤＱＳＲ４６３〜４７５ＳＸ_１ＡＧＸ_２ＳＸ
_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６ＱＸ_７Ｒであり、式中、Ｘ_１〜７は、任意のアミノ酸であり得；かつｃ）
アミノ酸４９９〜５０２における置換は、ＥＹＳＷ４９９〜５０２ＥＸ_８Ｘ_９Ｗであり、
式中、Ｘ_８〜９は、任意のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、Ｘ_１はＶであ
り得；Ｘ_２はＰであり得；Ｘ_３〜６はＮＭＡＶであり得；Ｘ_７はＧであり得、配列ＳＶＡ
ＧＰＳＮＭＡＶＱＧＲを生じる。いくつかの実施形態では、Ｘ_８はＦであり得、Ｘ_９はＷ
であり得、配列ＥＦＡＷを生じる。

上記例は、ＡＡＶ９ドナー由来のガラクトース結合部位をＡＡＶ２鋳型中に導入するこ
とが可能な置換を実証するために提供される。表３は、これらの対応するアミノ酸が同定
されたいくつかのＡＡＶ血清型、およびＡＡＶ９のガラクトース結合部位を導入するため
にこれらの血清型の各々においてなされ得る例示的置換を列挙している。特定のアミノ酸
位置が保存され、他のアミノ酸位置が置換されることが、表３中に示され、本明細書中に
詳細に記載される。置換が示される場合、表３に示される置換セットが、これらの残基位
置においてなされ得る種々の置換の例示である。本発明の実施形態は、ＡＡＶ９以外の他
のドナーＡＡＶ血清型およびガラクトース結合部位以外の他のグリカン結合部位を包含す
ることが、企図される。

表２は、ＡＡＶの非限定的な例示的血清型および本発明によって包含され得るゲノムお
よびカプシド配列の受託番号を列挙する。ドナーおよび鋳型のＡＡＶ血清型は、ヒトＡＡ
Ｖに限定されないが、これには、非ヒトＡＡＶ、例えば、トリＡＡＶまたはウシＡＡＶ、
ならびに非ヒト霊長類ＡＡＶが含まれ得、これらの例は、表１中に示される。

上記例は、ＡＡＶ９ドナー由来のガラクトース結合部位の導入のためのＡＡＶ２鋳型中
の可能なアミノ酸置換を示す。別の例では、鋳型は、ＡＡＶ１またはＡＡＶ６であり得、
ＡＡＶ２の４６３〜４７５位に対応するアミノ酸位置における置換は、ＳＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｐ
Ｘ_４Ｘ_５ＭＸ_６ＶＱＸ_７Ｘ_８であり得、式中、Ｘ_１〜８は、任意のアミノ酸であり得る。
特定の一実施形態では、Ｘ_１〜３はＶＡＧであり；Ｘ_４はＳであり；Ｘ_５はＮであり；Ｘ
_６はＡであり；Ｘ_７はＧであり、Ｘ_８はＲであり、配列ＳＶＡＧＰＳＮＭＡＶＱＧＲを生
じる。さらなる実施形態では、ＡＡＶ２中の４９９〜５０２位に対応するアミノ酸位置に
おける置換は、Ｘ_９ＦＸ_１０Ｗであり得、式中、Ｘ_９およびＸ_１０は、任意のアミノ酸で
あり得る。特定の一実施形態では、Ｘ_９はＥであり、Ｘ_１０はＷであり、配列ＥＦＡＷを
生じる。

別の例では、鋳型はＡＡＶ３ａまたはＡＡＶ３ｂであり得、ＡＡＶ２の４６３〜４７５
位に対応するアミノ酸位置における置換は、ＳＸ_１ＡＧＰＸ_２Ｘ_３ＭＸ_４Ｘ_５ＱＸ_６Ｒで
あり得、式中、Ｘ_１〜６は、任意のアミノ酸であり得る。特定の一実施形態では、Ｘ_１は
Ｖであり；Ｘ_２はＳであり；Ｘ_３はＮであり；Ｘ_４はＡであり；Ｘ_５はＮであり；Ｘ_６は
Ｇであり、配列ＳＶＡＧＰＳＮＭＡＶＱＧＲを生じる。さらなる実施形態では、ＡＡＶ２
中の４９９〜５０２位に対応するアミノ酸位置における置換は、Ｘ_７ＦＸ_８Ｗであり得、
式中、Ｘ_７およびＸ_８は、任意のアミノ酸であり得る。特定の一実施形態では、Ｘ_７はＥ
であり、Ｘ_８はＷであり、配列ＥＦＡＷを生じる。

別の例では、鋳型はＡＡＶ４であり得、ＡＡＶ２の４６３〜４７５位に対応するアミノ
酸位置における置換は、Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＰＸ_５ＮＸ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０Ｘ_１１であり
得、式中、Ｘ_１〜１１は、任意のアミノ酸であり得る。特定の一実施形態では、Ｘ_１はＳ
であり；Ｘ_２はＶであり；Ｘ_３はＡであり；Ｘ_４はＧであり；Ｘ_５はＳであり；Ｘ_６はＭ
であり；Ｘ_７はＡであり；Ｘ_８はＶであり；Ｘ_９はＱであり；Ｘ_１０はＧであり；Ｘ_１１
はＲであり、配列ＳＶＡＧＰＳＮＭＡＶＱＧＲを生じる。さらなる実施形態では、ＡＡＶ
２中の４９９〜５０２位に対応するアミノ酸位置における置換は、Ｘ_１２Ｘ_１３Ｘ_１４Ｘ
_１５であり得、式中、Ｘ_{１２〜１５}は、任意のアミノ酸であり得る。特定の一実施形態で
は、Ｘ_１２はＥであり；Ｘ_１３はＦであり；Ｘ_１４はＡであり；Ｘ_１５はＷであり、配列
ＥＦＡＷを生じる。

別の例では、鋳型はＡＡＶ５であり得、ＡＡＶ２の４６３〜４７５位に対応するアミノ
酸位置における置換は、Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８ＡＸ_９Ｘ_１０Ｘ_１１Ｘ_１２で
あり得、式中、Ｘ_１〜１２は、任意のアミノ酸であり得る。特定の一実施形態では、Ｘ_１
はＳであり；Ｘ_２はＶであり；Ｘ_３はＡであり；Ｘ_４はＧであり；Ｘ_５はＰであり；Ｘ_６
はＳであり；Ｘ_７はＮであり；Ｘ_８はＭであり；Ｘ_９はＶであり；Ｘ_１０はＱであり；Ｘ
_１２はＧであり；Ｘ_１２はＲであり、配列ＳＶＡＧＰＳＮＭＡＶＱＧＲを生じる。さらな
る実施形態では、ＡＡＶ２中の４９９〜５０２位に対応するアミノ酸位置における置換は
、Ｘ_１３Ｘ_１４ＡＸ_１５であり得、式中、Ｘ_{１３〜１５}は、任意のアミノ酸であり得る。
特定の一実施形態では、Ｘ_１３はＥであり；Ｘ_１４はＦであり；Ｘ_１５はＡであり；Ｘ_１
６はＷであり、配列ＥＦＡＷを生じる。

別の例では、鋳型はＡＡＶ７であり得、ＡＡＶ２の４６３〜４７５位に対応するアミノ
酸位置における置換は、Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３ＧＰＳＸ_４ＭＡＸ_５ＱＸ_６Ｘ_７であり得、式中、Ｘ
_１〜７は、任意のアミノ酸であり得る。特定の一実施形態では、Ｘ_１はＳであり；Ｘ_２は
Ｖであり；Ｘ_３はＡであり；Ｘ_４はＮであり；Ｘ_５はＶであり；Ｘ_６はＧであり；Ｘ_７は
Ｒであり、配列ＳＶＡＧＰＳＮＭＡＶＱＧＲを生じる。さらなる実施形態では、ＡＡＶ２
中の４９９〜５０２位に対応するアミノ酸位置における置換は、Ｘ_８ＦＡＷであり得、式
中、Ｘ_８は、任意のアミノ酸であり得る。特定の一実施形態では、式中、Ｘ_８はＥであり
、配列ＥＦＡＷを生じる。

別の例では、鋳型はＡＡＶ８であり得、ＡＡＶ２の４６３〜４７５位に対応するアミノ
酸位置における置換は、ＳＸ_１Ｘ_２ＧＰＸ_３Ｘ_４ＭＡＸ_５ＱＸ_６Ｘ_７であり得、式中、Ｘ
_１〜７は、任意のアミノ酸であり得る。特定の一実施形態では、Ｘ_１はＶであり；Ｘ_２は
Ａであり；Ｘ_３はＳであり；Ｘ_４はＮであり；Ｘ_５はＶであり；Ｘ_６はＧであり；Ｘ_７は
Ｒであり、配列ＳＶＡＧＰＳＮＭＡＶＱＧＲを生じる。さらなる実施形態では、ＡＡＶ２
中の４９９〜５０２位に対応するアミノ酸位置における置換は、Ｘ_８ＦＡＷであり得、式
中、Ｘ_８は、任意のアミノ酸であり得る。特定の一実施形態では、Ｘ_８はＥであり得、配
列ＥＦＡＷを生じる。

別の例では、鋳型はＡＡＶ１０であり得、ＡＡＶ２の４６３〜４７５位に対応するアミ
ノ酸位置における置換は、Ｘ_１Ｘ_２ＡＧＰＸ_３ＮＭＸ_４Ｘ_５ＱＸ_６Ｘ_７であり得、式中、
Ｘ_１〜７は、任意のアミノ酸であり得る。特定の一実施形態では、Ｘ_１はＳであり；Ｘ_２
はＶであり；Ｘ_３はＳであり；Ｘ_４はＡであり；Ｘ_５はＶであり；Ｘ_６はＧであり；Ｘ_７
はＲであり、配列ＳＶＡＧＰＳＮＭＡＶＱＧＲを生じる。さらなる実施形態では、ＡＡＶ
２中の４９９〜５０２位に対応するアミノ酸位置における置換は、Ｘ_８ＦＡＷであり得、
式中、Ｘ_８は、任意のアミノ酸であり得る。特定の一実施形態では、Ｘ_８は、Ｅであり得
、配列ＥＦＡＷを生じる。

上記例は、ＡＡＶ９由来のガラクトース結合部位の、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３
ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８またはＡＡＶ１０であり得るカプシドタン
パク質鋳型中への導入を記載する。限定することを意図しないこれらの例は、本明細書中
に記載される「ポケット」を規定する残基を改変することによって、ドナーＡＡＶ血清型
由来のグリカン結合部位が、異なるＡＡＶ血清型（例えば、表３中に列挙される）のカプ
シドタンパク質鋳型中に導入され得るというこの普遍的原理を実証している。新規のグリ
カン結合部位を含む、かかる改変されたまたはキメラのカプシドタンパク質は、増加した
細胞表面結合ならびにより迅速かつ増強されたインビボ導入遺伝子発現の有益な表現型を
有するウイルスベクターとして使用され得るウイルス粒子を構成するカプシドへとアセン
ブルされ得る。

本明細書中で使用する場合、用語「アデノ随伴ウイルス」（ＡＡＶ）には、１型ＡＡＶ
、２型ＡＡＶ、３型ＡＡＶ（３Ａ型および３Ｂ型を含む）、４型ＡＡＶ、５型ＡＡＶ、６
型ＡＡＶ、７型ＡＡＶ、８型ＡＡＶ、９型ＡＡＶ、１０型ＡＡＶ、１１型ＡＡＶ、トリＡ
ＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、クレードＦ ＡＡＶ、およ
び現在公知のまたは後に発見される任意の他のＡＡＶが含まれるが、これらに限定されな
い。例えば、ＢＥＲＮＡＲＤ Ｎ．ＦＩＥＬＤＳら、ＶＩＲＯＬＯＧＹ、第２巻、第６９
章（第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照のこと
。多数の比較的新しいＡＡＶ血清型およびクレードが同定されている（例えば、Ｇａｏら
（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７８：６３８１〜６３８８頁；および表１を参照の
こと）。

ＡＡＶの種々の血清型のゲノム配列、ならびにネイティブ末端反復（ＴＲ）、Ｒｅｐタ
ンパク質およびカプシドサブユニットの配列が、当該分野で公知である。かかる配列の例
示的ではあるが非限定的な例は、文献中またはＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベース
などの公的データベース中で見出され得る。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データ
ベース受託番号ＮＣ＿００２０７７．１、ＮＣ＿００１４０１．２、ＮＣ＿００１７２９
．１、ＮＣ＿００１８６３．１、ＮＣ＿００１８２９．１、ＮＣ＿００６１５２．１、Ｎ
Ｃ＿００１８６２．１、ＡＦ５１３８５１．１、ＡＦ５１３８５２．１を参照のこと；そ
の開示は、パルボウイルスおよびＡＡＶの核酸配列およびアミノ酸配列を教示するために
、参照により本明細書中に組み込まれる。例えば以下もまた参照のこと：Ｓｒｉｖｉｓｔ
ａｖａら（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４５：５５５頁；Ｃｈｉｏｒｉｎｉら（１
９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１：６８２３頁；Ｃｈｉｏｒｉｎｉら（１９９９）Ｊ
．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：１３０９頁；Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌら（１９９９）Ｊ
．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：９３９頁；Ｘｉａｏら（１９９９）Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
７３：３９９４頁；Ｍｕｒａｍａｔｓｕら（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２１：２
０８頁；Ｓｈａｄｅら（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５８：９２１頁；Ｇａｏら（２００
２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１１８５４頁；国際特許公開
公報ＷＯ ００／２８０６１、ＷＯ ９９／６１６０およびＷＯ ９８／１１２４４；な
らびに米国特許第６，１５６，３０３号；これらの開示は、パルボウイルスおよびＡＡＶ
の核酸配列およびアミノ酸配列を教示するために、参照により本明細書の一部をなすもの
とする。

自律的パルボウイルスおよびＡＡＶのカプシド構造は、ＢＥＲＮＡＲＤ Ｎ．ＦＩＥＬ
ＤＳら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２巻、第６９章および第７０章（第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃ
ｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）中により詳細に記載されている。ＡＡＶ２
（Ｘｉｅら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９：１０４０５〜１０
頁）、ＡＡＶ４（Ｐａｄｒｏｎら（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：５０４７〜５８頁
）、ＡＡＶ５（Ｗａｌｔｅｒｓら（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：３３６１〜７１頁
）およびＣＰＶ（Ｘｉｅら（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６：４９７〜５２０頁お
よびＴｓａｏら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１４５６〜６４頁）の結晶構造の
説明もまた参照のこと。

［定義］
単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他を示さない限り、複数
形も同様に含むことが意図される。

さらに、用語「約」は、本明細書中で使用する場合、ポリヌクレオチドまたはポリペプ
チド配列の長さ、用量、時間、温度などの量などの測定可能な値をいう場合、特定された
量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％またはさらには±０．１％の変動
を包含することを意味する。

また、本明細書中で使用する場合、「および／または」は、関連する列挙された項目の
うち１つまたは複数の、任意のおよび全ての可能な組み合わせ、ならびに代替として解釈
される場合（「または」）には組み合わせの欠如をいい、かつこれらを包含する。

文脈が他を示さない限り、本明細書中に記載される本発明の種々の特徴が任意の組み合
わせで使用され得ることが、具体的に意図される。

さらに、本発明は、本明細書中に示される本発明のいくつかの実施形態、任意の特徴ま
たは特徴の組み合わせが排除または割愛できることも企図している。

例えば、特定のアミノ酸がＡ、Ｇ、Ｉ、Ｌおよび／またはＶから選択できることを本明
細書が示す場合をさらに説明するために、この言葉は、各かかる下位の組み合わせが本明
細書中に明示的に示されるかのように、例えばＡ、Ｇ、ＩまたはＬ；Ａ、Ｇ、ＩまたはＶ
；ＡまたはＧ；Ｌのみなどの、これらの（１つまたは複数の）アミノ酸の任意のサブセッ
トからアミノ酸を選択できることもまた示す。さらに、かかる言葉は、１つまたは複数の
特定されたアミノ酸が放棄され得ることもまた示す。例えば、特定の実施形態では、各か
かる可能な放棄が明示的に示されるかのように、アミノ酸は、Ａ、ＧまたはＩではなく；
Ａではなく；ＧまたはＶではない、など。

本明細書中で使用する場合、用語「低下する（ｒｅｄｕｃｅ／ｒｅｄｕｃｅｓ）」、「
低下」および類似の用語は、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３５
％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１０
０％またはそれ以上の減少を意味する。

本明細書中で使用する場合、用語「増強する（ｅｎｈａｎｃｅ／ｅｎｈａｎｃｅｓ）」
「増強」および類似の用語は、少なくとも約１０％、２０％、２５％、５０％、７５％、
１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％またはそれ以上の増加を
示す。

本明細書中で使用する場合、用語「ポリペプチド」は、特に示さない限り、ペプチドお
よびタンパク質の両方を包含する。

「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド塩基の配列であり、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＤＮ
Ａ−ＲＮＡハイブリッド配列（天然に存在するヌクレオチドおよび天然に存在しないヌク
レオチドの両方を含む）であり得るが、代表的な実施形態では、一本鎖または二本鎖のい
ずれかのＤＮＡ配列である。

本明細書中で使用する場合、「単離された」ポリヌクレオチド（例えば、「単離された
ＤＮＡ」または「単離されたＲＮＡ」）は、天然に存在する生物またはウイルスの他の成
分、例えば、そのポリヌクレオチドと一般的には関連して見出される細胞もしくはウイル
スの構造成分または他のポリペプチドもしくは核酸の少なくともいくつかから少なくとも
部分的に分離されたポリヌクレオチドを意味する。代表的な実施形態では、「単離された
」ヌクレオチドは、出発材料と比較して、少なくとも約１０倍、１００倍、１０００倍、
１０，０００倍またはそれ以上富化されている。

同様に、「単離された」ポリペプチドとは、天然に存在する生物またはウイルスの他の
成分、例えば、そのポリペプチドと一般的には関連して見出される細胞もしくはウイルス
の構造成分または他のポリペプチドもしくは核酸の少なくともいくつかから少なくとも部
分的に分離されたポリペプチドを意味する。代表的な実施形態では、「単離された」ポリ
ペプチドは、出発材料と比較して、少なくとも約１０倍、１００倍、１０００倍、１０，
０００倍またはそれ以上富化されている。

本明細書中で使用する場合、ウイルスベクターを「単離する」もしくは「精製する」（
または文法的等価物）とは、そのウイルスベクターが、出発材料中の他の成分の少なくと
もいくつかから少なくとも部分的に分離されることを意味する。代表的な実施形態では、
「単離された」または「精製された」ウイルスベクターは、出発材料と比較して、少なく
とも約１０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍またはそれ以上富化されている。

「治療用ポリペプチド」は、細胞または対象中のタンパク質の非存在または欠損から生
じる症状を緩和、低下、予防、遅延および／または安定化できるポリペプチド、ならびに
／あるいは抗がん効果または移植生存率における改善などの利益を他の方法で対象に付与
するポリペプチドである。

用語「治療する（ｔｒｅａｔ／ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「〜の治療」（およびその
文法的な変形）は、対象の状態の重症度が低下され、少なくとも部分的に改善または安定
化されること、および／あるいは少なくとも１つの臨床症状における幾分かの緩和、軽減
、減少または安定化が達成されること、および／あるいは疾患または障害の進行の遅延が
存在することを意味する。

用語「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ／ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」および「予防」（および
その文法的な変形）とは、対象における疾患、障害および／または（複数の）臨床症状の
発症の予防および／または遅延、ならびに／あるいは本発明の方法の非存在下で生じるも
のと比較した、疾患、障害および／または（複数の）臨床症状の発症の重症度における低
下をいう。予防は、疾患、障害および／または（複数の）臨床症状の完全な非存在のよう
に、完全であり得る。予防は部分的でもあり得、その結果、対象における疾患、障害およ
び／または（複数の）臨床症状の出現ならびに／あるいは発症の重症度は、本発明の非存
在下で生じるものよりも低くなる。

「治療有効」または「有効」量は、本明細書中で使用する場合、いくらかの改善または
利益を対象に提供するのに充分な量である。代替的に述べると、「治療有効」または「有
効」量は、対象における少なくとも１つの臨床症状におけるいくらかの緩和、軽減、減少
または安定化を提供する量である。いくらかの利益が対象に提供される限り、治療効果は
完全である必要も治癒的である必要もないことを、当業者は理解するであろう。

「予防有効」量は、本明細書中で使用する場合、対象における疾患、障害および／また
は臨床症状の発症を予防および／または遅延するのに充分な量、ならびに／あるいは本発
明の方法の非存在下で生じるものと比較して、対象における疾患、障害および／または臨
床症状の発症の重症度を低下および／または遅延させるのに充分な量である。いくらかの
利益が対象に提供される限り、予防のレベルが完全である必要がないことを、当業者は理
解するであろう。

用語「異種ヌクレオチド配列」および「異種核酸」は、本明細書中で互換的に使用され
、ウイルス中に天然には存在しない配列をいう。一般に、異種核酸は、対象のポリペプチ
ドまたは非翻訳ＲＮＡ（例えば、細胞または対象への送達のための）をコードするオープ
ンリーディングフレームを含む。

本明細書中で使用する場合、用語「ウイルスベクター」、「ベクター」または「遺伝子
送達ベクター」とは、核酸送達ビヒクルとして機能し、ビリオン内にパッケージングされ
たベクターゲノム（例えば、ウイルスＤＮＡ［ｖＤＮＡ］）を含む、ウイルス（例えば、
ＡＡＶ）粒子をいう。あるいは、いくつかの文脈では、用語「ベクター」は、ベクターゲ
ノム／ｖＤＮＡ単独をいうために使用され得る。

本発明のウイルスベクターは、さらに、国際特許公開公報ＷＯ００／２８００４および
Ｃｈａｏら、（２０００）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：６１９頁に記載さ
れるように、「標的化された」ウイルスベクター（例えば、指向性指向性を有する）およ
び／または「ハイブリッド」パルボウイルス（即ち、ウイルスＴＲおよびウイルスカプシ
ドが異なるパルボウイルスに由来するもの）であり得る。

本発明のウイルスベクターは、さらに、国際特許公開公報ＷＯ０１／９２５５１（その
開示は、その全体が参照により本明細書の一部をなすものとする）に記載されるように、
二重鎖パルボウイルス粒子であり得る。従って、いくつかの実施形態では、二本鎖（二重
鎖）ゲノムが、本発明のウイルスカプシド中にパッケージングされ得る。

［ウイルスベクターを生成する方法］
本発明は、本発明の改変されたカプシドタンパク質およびカプシドを含むウイルスベク
ターもまた包含する。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、パルボウイルスベクタ
ー（例えば、パルボウイルスカプシドおよび／またはベクターゲノムを含んでいる）、例
えば、ＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶカプシドおよび／またはベクターゲノムを含んで
いる）である。代表的な実施形態では、ウイルスベクターは、本発明の改変されたカプシ
ドサブユニットを含む改変されたＡＡＶカプシドとベクターゲノムとを含む。

例えば、代表的な実施形態では、ウイルスベクターは、（ａ）本発明の改変されたカプ
シドタンパク質を含む改変されたウイルスカプシド（例えば、改変されたＡＡＶカプシド
）と、（ｂ）末端反復配列（例えば、ＡＡＶ−ＴＲ）を含む核酸とを含み、この末端反復
配列を含む核酸は、改変されたウイルスカプシドによってカプシド封入されている。核酸
は、２つの末端反復（例えば、２つのＡＡＶ−ＴＲ）を任意選択で含み得る。

代表的な実施形態では、ウイルスベクターは、対象のポリペプチドまたは機能的ＲＮＡ
をコードする異種核酸を含む組換えウイルスベクターである。組換えウイルスベクターは
、以下により詳細に記載される。

特定の実施形態では、本発明のウイルスベクターは、改変されたカプシドタンパク質な
しのウイルスベクターによる形質導入のレベルと比較して、肝臓の形質導入が減少してい
る。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、筋肉に対する全身性形質導入を有し、例
えば、ベクターは、体中の複数の骨格筋群を形質導入し、任意選択で、心筋および／また
は横隔膜筋を形質導入する。

本発明の改変されたカプシドタンパク質、ウイルスカプシドおよびウイルスベクターは
、そのネイティブ状態において特定の位置に示されたアミノ酸を有するカプシドタンパク
質、カプシドおよびウイルスベクター（即ち、変異体ではない）を排除することが、当業
者に理解されるであろう。

本発明は、本発明のウイルスベクターを生成する方法をさらに提供する。１つの代表的
な実施形態では、本発明は、ウイルスベクターを生成する方法を提供し、この方法は、（
ａ）少なくとも１つのＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ−ＴＲ配列）を含む核酸鋳型と、（ｂ）
核酸鋳型の複製およびＡＡＶカプシド中へのカプシド封入に充分なＡＡＶ配列（例えば、
本発明のＡＡＶカプシドをコードするＡＡＶ−ｒｅｐ配列およびＡＡＶ−ｃａｐ配列）と
を、細胞に提供するステップを含む。任意選択で、核酸鋳型は、少なくとも１つの異種核
酸配列をさらに含む。特定の実施形態では、核酸鋳型は２つのＡＡＶ−ＩＴＲ配列を含み
、これらは、（存在する場合）異種核酸配列に対して５’側および３’側に位置するが、
異種核酸配列と直接隣接している必要はない。

核酸鋳型ならびにＡＡＶ−ｒｅｐおよびｃａｐ配列は、ＡＡＶカプシド内にパッケージ
ングされた核酸鋳型を含むウイルスベクターが細胞中で生成されるような条件下で提供さ
れる。この方法は、細胞からウイルスベクターを回収するステップをさらに含み得る。ウ
イルスベクターは、培地からおよび／または細胞を溶解することによって回収され得る。

細胞は、ＡＡＶウイルスの複製を許容する細胞であり得る。当該分野で公知の任意の適
切な細胞が使用され得る。特定の実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。別の選択肢
として、細胞は、複製欠損ヘルパーウイルスから欠失した機能を提供するトランス補完性
（ｔｒａｎｓ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ）パッケージング細胞株、例えば、２９３細
胞または他のＥ１ａトランス補完性細胞であり得る。

ＡＡＶ複製およびカプシド配列は、当該分野で公知の任意の方法によって提供され得る
。現在のプロトコールは典型的に、単一のプラスミド上のＡＡＶ−ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子
を発現する。ＡＡＶ複製およびパッケージング配列は、一緒に提供される必要はないが、
一緒に提供するのが簡便であり得る。ＡＡＶ−ｒｅｐおよび／またはｃａｐ配列は、任意
のウイルスベクターまたは非ウイルスベクターによって提供され得る。例えば、ｒｅｐ／
ｃａｐ配列は、ハイブリッドアデノウイルスまたはヘルペスウイルスベクターによって提
供され得る（例えば、欠失型アデノウイルスベクターのＥ１ａ領域またはＥ３領域中に挿
入される）。ＥＢＶベクターもまた、ＡＡＶ−ｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子を発現するため
に使用され得る。この方法の１つの利点は、ＥＢＶベクターがエピソームであるが、連続
的な細胞分裂の間中、高コピー数をなおも維持することである（即ち、「ＥＢＶベースの
核エピソーム（ＥＢＶ ｂａｓｅｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｅｐｉｓｏｍｅ）」と称される染
色体外エレメントとして細胞中に安定に組み込まれる、Ｍａｒｇｏｌｓｋｉ（１９９２）
Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎ．１５８：６７頁を参照のこと）。

さらなる代替として、ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、細胞中に安定に取り込まれ得る。

典型的には、ＡＡＶ−ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、これらの配列のレスキューおよび／また
はパッケージングを防止するために、ＴＲと隣接して配置されない。

核酸鋳型は、当該分野で公知の任意の方法を使用して細胞に提供され得る。例えば、鋳
型は、非ウイルスベクター（例えば、プラスミド）またはウイルスベクターによって供給
され得る。特定の実施形態では、核酸鋳型は、ヘルペスウイルスベクターまたはアデノウ
イルスベクターによって供給される（例えば、欠失型アデノウイルスのＥ１ａ領域または
Ｅ３領域中に挿入される）。別の説明として、Ｐａｌｏｍｂｏら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ ７２：５０２５頁は、ＡＡＶ−ＴＲが隣接するレポーター遺伝子を保有する
バキュロウイルスベクターを記載している。ＥＢＶベクターもまた、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝
子に関して上記したように、鋳型を送達するために使用され得る。

別の代表的な実施形態では、核酸鋳型は、複製するｒＡＡＶウイルスによって提供され
る。なお他の実施形態では、核酸鋳型を含むＡＡＶプロウイルスは、細胞の染色体中に安
定に組み込まれる。

ウイルス力価を増強するために、増殖性ＡＡＶ感染を促進するヘルパーウイルス機能（
例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）が、細胞に提供され得る。ＡＡＶ複製
に必要なヘルパーウイルス配列は、当該分野で公知である。典型的には、これらの配列は
、ヘルパーアデノウイルスベクターまたはヘルペスウイルスベクターによって提供される
。あるいは、アデノウイルス配列またはヘルペスウイルス配列は、例えば、Ｆｅｒｒａｒ
ｉら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．３：１２９５頁；ならびに米国特許第６，０４
０，１８３号および同第６，０９３，５７０号によって記載されるような、効率的なＡＡ
Ｖ生成を促進するヘルパー遺伝子の全てを保有する非感染性アデノウイルスミニプラスミ
ドとして、別の非ウイルスベクターまたはウイルスベクターによって提供され得る。

さらに、ヘルパーウイルス機能は、染色体中に埋め込まれたまたは安定な染色体外エレ
メントとして維持されるヘルパー配列を有するパッケージング細胞によって提供され得る
。一般に、ヘルパーウイルス配列は、ＡＡＶビリオン中にパッケージングすることはでき
ず、例えば、ＴＲが隣接していない。

単一のヘルパー構築物上のＡＡＶ複製およびカプシド配列ならびにヘルパーウイルス配
列（例えば、アデノウイルス配列）を提供することが有利であり得ることを、当業者は理
解するであろう。このヘルパー構築物は、非ウイルス構築物でもウイルス構築物でもよい
。１つの非限定的説明として、ヘルパー構築物は、ＡＡＶ−ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を含む
ハイブリッドアデノウイルスまたはハイブリッドヘルペスウイルスであり得る。

１つの特定の実施形態では、ＡＡＶ−ｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパ
ー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって供給される。このベクターは
、核酸鋳型をさらに含み得る。ＡＡＶ−ｒｅｐ／ｃａｐ配列および／またはｒＡＡＶ鋳型
は、アデノウイルスの欠失した領域（例えば、Ｅ１ａ領域またはＥ３領域）中に挿入され
得る。

さらなる実施形態では、ＡＡＶ−ｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配
列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって供給される。この実施形態によれ
ば、ｒＡＡＶ鋳型は、プラスミド鋳型として提供され得る。

別の例示的実施形態では、ＡＡＶ−ｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー
配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって提供され、ｒＡＡＶ鋳型は、プ
ロウイルスとして細胞中に取り込まれる。あるいは、ｒＡＡＶ鋳型は、染色体外エレメン
ト（例えば、ＥＢＶベースの核エピソーム）として細胞内で維持されるＥＢＶベクターに
よって提供される。

さらなる例示的な実施形態では、ＡＡＶ−ｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘ
ルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーによって提供される。ｒＡＡＶ鋳型は、別
個の複製するウイルスベクターとして提供され得る。例えば、ｒＡＡＶ鋳型は、ｒＡＡＶ
粒子または第２の組換えアデノウイルス粒子によって提供され得る。

上述の方法によれば、ハイブリッドアデノウイルスベクターは典型的に、アデノウイル
スの複製およびパッケージングに充分なアデノウイルスの５’および３’のシス配列（即
ち、アデノウイルス末端反復およびＰＡＣ配列）を含む。ＡＡＶ−ｒｅｐ／ｃａｐ配列お
よび存在する場合にはｒＡＡＶ鋳型は、アデノウイルス骨格中に埋め込まれ、５’および
３’のシス配列がそれに隣接しており、その結果これらの配列は、アデノウイルスカプシ
ド中にパッケージングされ得る。上記のように、アデノウイルスヘルパー配列およびＡＡ
Ｖ−ｒｅｐ／ｃａｐ配列には一般に、これらの配列がＡＡＶビリオン中にパッケージング
されないように、ＴＲが隣接していない。

Ｚｈａｎｇら（（２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１８：７０４〜１２頁）は、アデノ
ウイルスならびにＡＡＶ−ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の両方を含むキメラヘルパーを記載
している。

ヘルペスウイルスもまた、ＡＡＶパッケージング法においてヘルパーウイルスとして使
用され得る。ＡＡＶ−Ｒｅｐタンパク質（複数でもよい）をコードするハイブリッドヘル
ペスウイルスは、拡大縮小可能なＡＡＶベクター生成スキームを有利に促進し得る。ＡＡ
Ｖ−２のｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を発現するハイブリッド単純ヘルペスウイルスＩ型（
ＨＳＶ−１）ベクターが、Ｃｏｎｗａｙら（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：
９８６頁およびＰＣＴ公開公報ＷＯ００／１７３７７号に記載されている。

さらなる代替として、本発明のウイルスベクターは、例えばＵｒａｂｅら（２００２）
Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １３：１９３５〜４３頁に記載されるように、
ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子およびｒＡＡＶ鋳型を送達するためのバキュロウイルスベクターを
使用して昆虫細胞中で生成され得る。

混入するヘルパーウイルスを含まないＡＡＶベクターストックは、当該分野で公知の任
意の方法によって得られ得る。例えば、ＡＡＶおよびヘルパーウイルスは、サイズに基づ
いて容易に識別され得る。ＡＡＶはまた、ヘパリン基質に対する親和性に基づいて、ヘル
パーウイルスから分離され得る（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎら（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅ
ｒａｐｙ ６：９７３頁）。任意の混入するヘルパーウイルスが複製コンピテントになら
ないように、欠失型複製欠損ヘルパーウイルスが使用され得る。アデノウイルス初期遺伝
子発現のみがＡＡＶウイルスのパッケージングを媒介するために必要なので、さらなる代
替として、後期遺伝子発現を欠くアデノウイルスヘルパーが使用され得る。後期遺伝子発
現が欠損したアデノウイルス変異体は当該分野で公知である（例えば、ｔｓ１００Ｋおよ
びｔｓ１４９アデノウイルス変異体）。

［組換えウイルスベクター］
本発明のウイルスベクターは、インビトロ、エクスビボおよびインビボで細胞に核酸を
送達するために有用である。特に、ウイルスベクターは、例えば哺乳動物細胞を含む動物
細胞に核酸を送達または移入するために有利に使用され得る。

対象の任意の異種核酸配列（複数であってもよい）は、本発明のウイルスベクター中で
送達され得る。対象の核酸には、治療用（例えば、医療用途または獣医学用途のため）ポ
リペプチドまたは免疫原性（例えば、ワクチンのため）ポリペプチドを含むポリペプチド
をコードする核酸が含まれる。

治療用ポリペプチドには以下が含まれるがこれらに限定されない：嚢胞性線維症膜貫通
制御タンパク質（ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅ
ｇｕｌａｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＦＴＲ））、ジストロフィン（ミニジストロフィン
およびマイクロジストロフィンが含まれる。例えば、Ｖｉｎｃｅｎｔら（１９９３）Ｎａ
ｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ５：１３０頁；米国特許公開公報２００３０１７１３１号
；ＰＣＴ公開公報ＷＯ／２００８／０８８８９５号、Ｗａｎｇら Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１３７１４〜１３７１９頁（２０００）；およびＧｒ
ｅｇｏｒｅｖｉｃら Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６：６５７〜６４頁（２００８）を参照のこ
と）、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン、アクチビンＩＩ型可溶性受容体、Ｉ
ＧＦ−１、抗炎症性ポリペプチド（例えば、ＩκＢ優性変異体）、サルコスパン、ユート
ロフィン（Ｔｉｎｓｌｅｙら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８４：３４９頁）、ミニユー
トロフィン、凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子など）、エリス
ロポエチン、アンジオスタチン、エンドスタチン、カタラーゼ、チロシンヒドロキシラー
ゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、ＬＤＬ受容体、リポタンパク質リパーゼ
、オルニチントランスカルバミラーゼ、β−グロビン、α−グロビン、スペクトリン、α
_１−アンチトリプシン、アデノシンデアミナーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシ
ルトランスフェラーゼ、β−グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、リソソ
ームヘキソサミニダーゼＡ、分岐鎖ケト酸脱水素酵素、ＲＰ６５タンパク質、サイトカイ
ン（例えば、α−インターフェロン、β−インターフェロン、インターフェロン−γ、イ
ンターロイキン−２、インターロイキン−４、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、
リンホトキシンなど）、ペプチド増殖因子、神経栄養因子およびホルモン（例えば、ソマ
トトロピン、インスリン、インスリン様増殖因子１および２、血小板由来増殖因子、上皮
増殖因子、線維芽細胞増殖因子、神経増殖因子、神経栄養因子−３および−４、脳由来神
経栄養因子、骨形態形成（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ）タンパク質［ＲＡＮＫＬ
およびＶＥＧＦが含まれる］、グリア由来増殖因子、形質転換増殖因子−αおよび−βな
ど）、リソソーム酸α−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、受容体（例えば、腫
瘍壊死増殖因子α可溶性受容体）、Ｓ１００Ａ１、パルブアルブミン、アデニリルシクラ
ーゼ６型、カルシウムハンドリングをモジュレートする分子（例えば、ＳＥＲＣＡ_２Ａ、
ＰＰ１のインヒビター１およびそれらの断片［例えば、ＰＣＴ公開公報ＷＯ２００６／０
２９３１９号およびＷＯ２００７／１００４６５号］）、短縮型の構成的に活性なｂＡＲ
ＫｃｔなどのＧタンパク質共役型受容体キナーゼ２型ノックダウンをもたらす分子、ＩＲ
ＡＰなどの抗炎症性因子、抗ミオスタチンタンパク質、アスパルトアシラーゼ、モノクロ
ーナル抗体（単鎖モノクローナル抗体が含まれる；例示的なＭａｂは、Ｈｅｒｃｅｐｔｉ
ｎ（登録商標）Ｍａｂである）、ニューロペプチドおよびその断片（例えば、ガラニン、
ニューロペプチドＹ（米国特許第７，０７１，１７２号を参照のこと）、バソヒビンなど
の血管新生インヒビターならびに他のＶＥＧＦインヒビター（例えば、バソヒビン２［Ｐ
ＣＴ公開公報ＷＯ：ＪＰ２００６／０７３０５２号を参照のこと］）。他の例示的な異種
核酸配列は、自殺遺伝子産物（例えば、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフ
テリア毒素、および腫瘍壊死因子）、がん療法において使用される薬物に対する耐性を付
与するタンパク質、腫瘍抑制遺伝子産物（例えば、ｐ５３、Ｒｂ、Ｗｔ−１）、ＴＲＡＩ
Ｌ、ＦＡＳ−リガンド、およびそれを必要とする対象において治療効果を有する任意の他
のポリペプチドをコードする。ＡＡＶベクターは、モノクローナル抗体および抗体断片、
例えば、ミオスタチンに対する抗体または抗体断片を送達するためにも使用され得る（例
えば、Ｆａｎｇら Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：５８４〜５９０
頁（２００５）を参照のこと）。

ポリペプチドをコードする異種核酸配列には、レポーターポリペプチド（例えば酵素）
をコードする異種核酸配列が含まれる。レポーターポリペプチドは当該分野で公知であり
、緑色蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラー
ゼおよびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれるがこれらに
限定されない。

任意選択的に、異種核酸は、分泌型ポリペプチド（例えば、そのネイティブ状態で分泌
型ポリペプチドであるポリペプチド、または例えば当該分野で公知の分泌シグナル配列と
の作動可能な関連によって分泌されるように操作されたポリペプチド）をコードする。

あるいは、本発明の特定の実施形態では、異種核酸は、アンチセンス核酸、リボザイム
（例えば、米国特許第５，８７７，０２２号に記載される）、スプライソソーム介在性の
トランススプライシングをもたらすＲＮＡ（Ｐｕｔｔａｒａｊｕら（１９９９）Ｎａｔｕ
ｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：２４頁６；米国特許第６，０１３，４８７号；米国特許第
６，０８３，７０２号を参照のこと）、遺伝子サイレンシングを仲介するｓｉＲＮＡ、ｓ
ｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを含む干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）（Ｓｈａｒｐら（２０００）Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２８７：２４３１頁を参照のこと）および「ガイド」ＲＮＡなどの他の非
翻訳ＲＮＡ（Ｇｏｒｍａｎら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９５：４９２９頁；Ｙｕａｎらに対する米国特許第５，８６９，２４８号）などをコー
ドし得る。例示的な非翻訳ＲＮＡには、多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子産物に対するＲＮＡｉ
（例えば、腫瘍を治療および／もしくは予防するため、ならびに／または化学療法による
損傷を予防するために心臓に投与するため）、ミオスタチンに対するＲＮＡｉ（例えば、
デュシェンヌ型筋ジストロフィーのため）、ＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ（例えば、腫瘍を
治療および／または予防するため）、ホスホランバンに対するＲＮＡｉ（例えば、心血管
疾患を治療するため、例えば、Ａｎｄｉｎｏら Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１０：１３２〜
１４２頁（２００８）およびＬｉら Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｉｎ．２６：５
１〜５５頁（２００５）を参照のこと）；ホスホランバンＳ１６Ｅなどのホスホランバン
阻害分子またはドミナントネガティブ分子（例えば、心血管疾患を治療するため、例えば
、Ｈｏｓｈｉｊｉｍａら Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：８６４〜８７１頁（２００２）を参照の
こと）、アデノシンキナーゼに対するＲＮＡｉ（例えば、癲癇のため）、ならびに病原性
生物およびウイルス（例えば、Ｂ型および／またはＣ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイ
ルス、ＣＭＶ、単純ヘルペスウイルス、ヒトパピローマウイルスなど）に対するＲＮＡｉ
が含まれる。

さらに、選択的スプライシングを指示する核酸配列が送達され得る。説明するために、
ストロフィンエクソン５１の５’および／または３’スプライス部位に相補的なアンチセ
ンス配列（または他の阻害配列）が、このエクソンの読み飛ばしを誘導するためにＵ１ま
たはＵ７低分子核内（ｓｎ）ＲＮＡプロモーターと合わせて送達され得る。例えば、アン
チセンス／阻害配列（複数可）に対して５’側に位置するＵ１またはＵ７−ｓｎＲＮＡプ
ロモーターを含むＤＮＡ配列は、本発明の改変されたカプシド中にパッケージングされて
送達され得る。

ウイルスベクターは、宿主染色体上の遺伝子座と相同性を共有し、宿主染色体上の遺伝
子座と組み換わる異種核酸もまた含み得る。このアプローチは、例えば、宿主細胞中の遺
伝的欠陥を修正するために利用され得る。

本発明は、例えばワクチン接種のための免疫原性ポリペプチドを発現するウイルスベク
ターもまた提供する。核酸は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス
（ＳＩＶ）、インフルエンザウイルス、ＨＩＶまたはＳＩＶのｇａｇタンパク質、腫瘍抗
原、がん抗原、細菌抗原、ウイルス抗原など由来の免疫原が含まれるがこれらに限定され
ない、当該分野で公知の対象の任意の免疫原をコードし得る。

ワクチンベクターとしてのパルボウイルスの使用は当該分野で公知である（例えば、Ｍ
ｉｙａｍｕｒａら、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１：
８５０７頁；Ｙｏｕｎｇらに対する米国特許第５，９１６，５６３号、Ｍａｚｚａｒａら
に対する米国特許第５，９０５，０４０号、米国特許第５，８８２，６５２号、Ｓａｍｕ
ｌｓｋｉらに対する米国特許第５，８６３，５４１号を参照のこと）。抗原は、パルボウ
イルスカプシド中に存在し得る。あるいは、抗原は、組換えベクターゲノム中に導入され
た異種核酸から発現され得る。本明細書中に記載されるおよび／または当該分野で公知の
対象の任意の免疫原は、本発明のウイルスベクターによって提供され得る。

免疫原性ポリペプチドは、免疫応答を惹起するのに適した、ならびに／または微生物、
細菌、原生動物、寄生生物、真菌および／もしくはウイルスの感染および疾患が含まれる
がこれらに限定されない感染および／もしくは疾患に対して対象を保護するのに適した任
意のポリペプチドであり得る。例えば、免疫原性ポリペプチドは、オルソミクソウイルス
免疫原（例えば、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）表面タンパク質もしく
はインフルエンザウイルス核タンパク質、またはウマインフルエンザウイルス免疫原など
の、インフルエンザウイルス免疫原）もしくはレンチウイルス免疫原（例えば、ＨＩＶも
しくはＳＩＶのエンベロープＧＰ１６０タンパク質、ＨＩＶもしくはＳＩＶのマトリック
ス／カプシドタンパク質ならびにＨＩＶもしくはＳＩＶのｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺
伝子産物などの、ウマ感染性貧血ウイルス免疫原、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）免疫
原またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）免疫原）であり得る。免疫原性ポリペプチドは
、アレナウイルス免疫原（例えば、ラッサ熱ウイルス核カプシドタンパク質および／また
はラッサ熱エンベロープ糖タンパク質などのラッサ熱ウイルス免疫原）、ポックスウイル
ス免疫原（例えば、ワクシニアＬ１またはＬ８遺伝子産物などのワクシニアウイルス免疫
原）、フラビウイルス免疫原（例えば、黄熱病ウイルス免疫原または日本脳炎ウイルス免
疫原）、フィロウイルス免疫原（例えば、ＮＰおよびＧＰ遺伝子産物などの、エボラウイ
ルス免疫原またはマールブルグウイルス免疫原）、ブニヤウイルス免疫原（例えば、ＲＶ
ＦＶ、ＣＣＨＦおよび／またはＳＦＳウイルス免疫原）、またはコロナウイルス免疫原（
例えば、ヒトコロナウイルスエンベロープ糖タンパク質などの感染性ヒトコロナウイルス
免疫原、またはブタ伝染性胃腸炎ウイルス免疫原またはトリ感染性気管支炎ウイルス免疫
原）でもあり得る。免疫原性ポリペプチドはさらに、ポリオ免疫原、ヘルペスウイルス免
疫原（例えば、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＨＳＶ免疫原）ムンプスウイルス免疫原、麻疹ウイルス
免疫原、風疹ウイルス免疫原、ジフテリア毒素もしくは他のジフテリア免疫原、百日咳抗
原、肝炎（例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎など）免疫原、および／または当該分
野で現在公知のまたは免疫原として後に同定される任意の他のワクチン免疫原であり得る
。

あるいは、免疫原性ポリペプチドは、任意の腫瘍細胞またはがん細胞の抗原であり得る
。任意選択で、腫瘍抗原またはがん抗原は、がん細胞の表面上に発現される。例示的なが
んおよび腫瘍細胞の抗原は、Ｓ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０：２
８１頁（１９９１））に記載されている。他の例示的ながん抗原および腫瘍抗原には、以
下が含まれるがこれらに限定されない：ＢＲＣＡ１遺伝子産物、ＢＲＣＡ２遺伝子産物、
ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＧＡＧＥ−１／２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ、ＮＹ−
ＥＳＯ−１、ＣＤＫ−４、β−カテニン、ＭＵＭ−１、カスパーゼ−８、ＫＩＡＡ０２０
５、ＨＰＶＥ、ＳＡＲＴ−１、ＰＲＡＭＥ、ｐ１５、メラノーマ腫瘍抗原（Ｋａｗａｋａ
ｍｉら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３５１５頁
；Ｋａｗａｋａｍｉら（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：３４７頁；Ｋａｗａｋ
ａｍｉら（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：３１２４頁）、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ
１００ ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＣＥＡ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２
、Ｐ−１５、チロシナーゼ（Ｂｒｉｃｈａｒｄら（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７
８：４８９頁）；ＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子産物（米国特許第４，９６８，６０３号）、
ＣＡ１２５、ＬＫ２６、ＦＢ５（エンドシアリン）、ＴＡＧ７２、ＡＦＰ、ＣＡ１９−９
、ＮＳＥ、ＤＵ−ＰＡＮ−２、ＣＡ５０、ＳＰａｎ−１、ＣＡ７２−４、ＨＣＧ、ＳＴＮ
（シアリルＴｎ抗原）、ｃ−ｅｒｂＢ−２タンパク質、ＰＳＡ、Ｌ−ＣａｎＡｇ、エスト
ロゲン受容体、乳脂肪グロブリン、ｐ５３腫瘍抑制因子タンパク質（Ｌｅｖｉｎｅ、（１
９９３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：６２３頁）；ムチン抗原（ＰＣＴ公開
公報ＷＯ ９０／０５１４２号）；テロメラーゼ；核マトリックスタンパク質；前立腺酸
性ホスファターゼ；パピローマウイルス抗原；および／あるいは現在公知のまたは以下の
がんに関連することが後に発見される抗原：メラノーマ、腺がん腫、胸腺腫、リンパ腫（
例えば、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫）、肉腫、肺がん、肝臓がん、結腸がん
、白血病、子宮がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頚がん、膀胱がん、腎臓がん
、膵臓がん、脳がん、および現在公知のまたは後に同定される任意の他のがんまたは悪性
状態（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、（１９９６）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．４７：４８
１〜９１頁を参照のこと）。

さらなる代替として、異種核酸は、インビトロ、エクスビボまたはインビボにおいて細
胞中で生成されることが望ましい任意のポリペプチドをコードし得る。例えば、ウイルス
ベクターは、培養細胞中に導入され得、発現された遺伝子産物がそこから単離される。

対象の異種核酸（複数でもよい）が適切な制御配列と作動可能に関連し得ることが、当
業者に理解されよう。例えば、異種核酸は、発現制御エレメント、例えば転写／翻訳制御
シグナル、複製起点、ポリアデニル化シグナル、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）
、プロモーターおよび／またはエンハンサーなどと、作動可能に関連し得る。

さらに、対象の異種核酸（複数でもよい）の調節された発現は、転写後レベルで、例え
ば、オリゴヌクレオチド、小分子および／または特定の部位におけるスプライシング活性
を選択的に遮断する他の化合物（例えば、ＰＣＴ公開公報ＷＯ ２００６／１１９１３７
号に記載される）の存在または非存在によって、異なるイントロンの選択的スプライシン
グを調節することによって、達成され得る。

種々のプロモーター／エンハンサーエレメントが、所望されるレベルおよび組織特異的
発現に依存して使用され得ることを、当業者は理解するであろう。プロモーター／エンハ
ンサーは、所望の発現パターンに依存して、構成的または誘導性であり得る。プロモータ
ー／エンハンサーは、ネイティブまたは外来であり得、天然配列または合成配列であり得
る。外来とは、転写開始領域が、その転写開始領域が導入される野生型宿主において見出
されないものであることを意図する。

特定の実施形態では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、標的細胞または治療
される対象にとってネイティブであり得る。代表的な実施形態では、プロモーター／エン
ハンサーエレメントは、異種核酸配列にとってネイティブであり得る。プロモーター／エ
ンハンサーエレメントは一般に、対象の標的細胞（複数でもよい）において機能するよう
に選択される。さらに、特定の実施形態では、プロモーター／エンハンサーエレメントは
、哺乳動物のプロモーター／エンハンサーエレメントである。プロモーター／エンハンサ
ーエレメントは、構成的でも誘導性でもよい。

誘導性発現制御エレメントは典型的に、異種核酸配列（複数でもよい）の発現の調節を
提供することが望ましい適用において有利である。遺伝子送達のための誘導性プロモータ
ー／エンハンサーエレメントは、組織特異的プロモーター／エンハンサーエレメントまた
は好ましいプロモーター／エンハンサーエレメントであり得、筋特異的または好ましい（
心筋、骨格筋および／または平滑筋特異的または好ましいものが含まれる）、神経組織特
異的または好ましい（脳特異的または好ましいものが含まれる）、眼特異的または好まし
い（網膜特異的および角膜特異的なものが含まれる）、肝臓特異的または好ましい、骨髄
特異的または好ましい、膵臓特異的または好ましい、脾臓特異的または好ましい、および
／あるいは肺特異的または好ましいプロモーター／エンハンサーエレメントが含まれる。
他の誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントには、ホルモン誘導性エレメントおよ
び金属誘導性エレメントが含まれる。例示的な誘導性プロモーター／エンハンサーエレメ
ントには、Ｔｅｔオン／オフエレメント、ＲＵ４８６誘導性プロモーター、エクジソン誘
導性プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーターおよびメタロチオネインプロモータ
ーが含まれるが、これらに限定されない。

異種核酸配列（複数であってもよい）が標的細胞において転写され、次いで翻訳される
実施形態では、特異的開始シグナルが一般に、挿入されたタンパク質コード配列の効率的
な翻訳のために含まれる。ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含み得るこれらの外因性翻
訳制御配列は、天然および合成の両方の、種々の起源のものであり得る。

本発明に従うウイルスベクターは、分裂細胞および非分裂細胞を含む広範な細胞中に異
種核酸を送達する手段を提供する。ウイルスベクターは、例えば、インビトロでポリペプ
チドを生成するためまたはエクスビボの遺伝子療法のために、対象の核酸をインビトロで
細胞に送達するために使用され得る。ウイルスベクターは、例えば、免疫原性もしくは治
療用ポリペプチドまたは機能的ＲＮＡを発現するために、それを必要とする対象に核酸を
送達する方法において、さらに有用である。この様式で、ポリペプチドまたは機能的ＲＮ
Ａは、対象中においてインビボで生成され得る。対象は、ポリペプチドの欠乏症を有する
ので、そのポリペプチドを必要とし得る。さらに、対象におけるポリペプチドまたは機能
的ＲＮＡの生成は、いくらかの有益な効果を付与し得るので、この方法が実施され得る。

ウイルスベクターは、（例えば、スクリーニング方法と合わせて、例えばポリペプチド
を生成するためまたは対象に対する機能的ＲＮＡの影響を観察するためのバイオリアクタ
として対象を使用して）培養細胞または対象において対象のポリペプチドまたは機能的Ｒ
ＮＡを生成するためにも使用され得る。

一般に、本発明のウイルスベクターは、治療用ポリペプチドまたは機能的ＲＮＡを送達
することが有利な任意の疾患状態を治療および／または予防するために、ポリペプチドま
たは機能的ＲＮＡをコードする異種核酸を送達するために使用され得る。例示的な疾患状
態には、以下が含まれるがこれらに限定されない：嚢胞性線維症（嚢胞性線維症膜貫通制
御タンパク質）および他の肺の疾患、血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子）、血友病Ｂ（第ＩＸ因
子）、サラセミア（β−グロビン）、貧血（エリスロポエチン）および他の血液障害、ア
ルツハイマー病（ＧＤＦ；ネプリライシン）、多発性硬化症（β−インターフェロン）、
パーキンソン病（グリア細胞株由来神経栄養因子［ＧＤＮＦ］）、ハンチントン病（反復
を除去するためのＲＮＡｉ）、筋萎縮性側索硬化症、癲癇（ガラニン、神経栄養因子）お
よび他の神経学的障害、がん（エンドスタチン、アンジオスタチン、ＴＲＡＩＬ、ＦＡＳ
−リガンド、インターフェロンを含むサイトカイン；ＶＥＧＦまたは多剤耐性遺伝子産物
に対するＲＮＡｉを含むＲＮＡｉ、ｍｉｒ−２６ａ［例えば、肝細胞癌腫のため］）、真
正糖尿病（インスリン）、デュシェンヌ型（ジストロフィン、ミニジストロフィン、イン
スリン様増殖因子Ｉ、サルコグリカン［例えば、α、β、γ］、ミオスタチンに対するＲ
ＮＡｉ、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン、アクチビンＩＩ型可溶性受容体、
抗炎症性ポリペプチド、例えば、ＩκＢ優性変異体、サルコスパン、ユートロフィン、ミ
ニユートロフィン、エクソン読み飛ばしを誘導するためのジストロフィン遺伝子中のスプ
ライスジャンクションに対するアンチセンスまたはＲＮＡｉ［例えば、ＰＣＴ公開公報Ｗ
Ｏ／２００３／０９５６４７号を参照のこと］、エクソン読み飛ばしを誘導するためのＵ
７−ｓｎＲＮＡに対するアンチセンス［例えば、ＰＣＴ公開公報ＷＯ／２００６／０２１
７２４号を参照のこと］、およびミオスタチンまたはミオスタチンプロペプチドに対する
抗体または抗体断片）およびベッカー型を含む筋ジストロフィー、ゴーシェ病（グルコセ
レブロシダーゼ）、ハーラー病（α−Ｌ−イズロニダーゼ）、アデノシンデアミナーゼ欠
乏症（アデノシンデアミナーゼ）、糖原貯蔵疾患（例えば、ファブリー病［α−ガラクト
シダーゼ］およびポンペ病［リソソーム酸α−グルコシダーゼ］）および他の代謝障害、
先天性肺気腫（α１−アンチトリプシン）、レッシュ・ナイハン症候群（ヒポキサンチン
グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）、ニーマン・ピック病（スフィンゴミエリ
ナーゼ）、テイ・サックス病（Ｔａｙｓ Ｓａｃｈｓ ｄｉｓｅａｓｅ）（リソソームヘ
キソサミニダーゼＡ）、メープルシロップ尿症（分岐鎖ケト酸脱水素酵素）、網膜変性疾
患（ならびに眼および網膜の他の疾患；例えば、黄斑変性症についてＰＤＧＦ、および／
あるいは例えばＩ型糖尿病における網膜障害を治療／予防するためのバソヒビンもしくは
ＶＥＧＦの他のインヒビターまたは他の血管新生インヒビター）、固形臓器の疾患、例え
ば脳（パーキンソン病［ＧＤＮＦ］、星状細胞腫［エンドスタチン、アンジオスタチン、
および／またはＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ］、膠芽腫［エンドスタチン、アンジオスタチ
ン、および／またはＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ］が含まれる）、肝臓、腎臓、うっ血性心
不全または末梢動脈疾患（ＰＡＤ）を含む心臓（例えば、プロテインホスファターゼイン
ヒビターＩ（Ｉ−１）およびその断片（例えば、Ｉ１Ｃ）、ｓｅｒｃａ２ａ、ホスホラン
バン遺伝子を調節するジンクフィンガータンパク質、Ｂａｒｋｃｔ、β２アドレナリン受
容体、β２アドレナリン受容体キナーゼ（ＢＡＲＫ）、ホスホイノシチド−３キナーゼ（
ＰＩ３キナーゼ）、Ｓ１００Ａ１、パルブアルブミン、アデニリルシクラーゼ６型、短縮
型の構成的に活性なｂＡＲＫｃｔなどのＧタンパク質共役型受容体キナーゼ２型ノックダ
ウンをもたらす分子；カルサルシン（ｃａｌｓａｒｃｉｎ）、ホスホランバンに対するＲ
ＮＡｉ；ホスホランバンＳ１６Ｅなどのホスホランバン阻害分子またはドミナントネガテ
ィブ分子などを送達することによる）、関節炎（インスリン様増殖因子）、関節障害（イ
ンスリン様増殖因子１および／または２）、内膜過形成（例えば、ｅｎｏｓ、ｉｎｏｓを
送達することによる）、心臓移植物の生存の改善（スーパーオキシドジスムターゼ）、Ａ
ＩＤＳ（可溶性ＣＤ４）、筋消耗（インスリン様増殖因子Ｉ）、腎臓欠損症（ｋｉｄｎｅ
ｙ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）（エリスロポエチン）、貧血（エリスロポエチン）、関節炎
（ＩＲＡＰおよびＴＮＦα可溶性受容体などの抗炎症性因子）、肝炎（α−インターフェ
ロン）、ＬＤＬ受容体欠乏症（ＬＤＬ受容体）、高アンモニア血症（オルニチントランス
カルバミラーゼ）、クラッベ病（ガラクトセレブロシダーゼ）、バッテン病、ＳＣＡ１、
ＳＣＡ２およびＳＣＡ３を含む脊髄性大脳性運動失調症（ｓｐｉｎａｌ ｃｅｒｅｂｒａ
ｌ ａｔａｘｉａｓ）、フェニルケトン尿症（フェニルアラニンヒドロキシラーゼ）、自
己免疫疾患など。本発明はさらに、移植の成功率を増加させるためおよび／または臓器移
植もしくは補助療法の負の副作用を低下させるために、臓器移植後に使用され得る（例え
ば、サイトカイン生成を遮断するために免疫抑制剤または阻害核酸を投与することによっ
て）。別の例として、骨形態形成タンパク質（ＢＮＰ２、７など、ＲＡＮＫＬおよび／ま
たはＶＥＧＦを含む）が、例えば、がん患者における破壊（ｂｒｅａｋ）または外科的除
去後に、骨同種移植片と共に投与され得る。

本発明は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）を生成するためにも使用され得る。例えば、本
発明のウイルスベクターは、例えば成人線維芽細胞、皮膚細胞、肝臓細胞、腎細胞、脂肪
細胞、心臓細胞、神経細胞、上皮細胞、内皮細胞などの非多能性細胞中に、幹細胞関連核
酸（複数であってもよい）を送達するために使用され得る。幹細胞に関連する因子をコー
ドする核酸は、当該分野で公知である。かかる幹細胞および多能性に関連する因子の非限
定的な例には、Ｏｃｔ−３／４、ＳＯＸファミリー（例えば、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＳＯ
Ｘ３および／またはＳＯＸ１５）、Ｋｌｆファミリー（例えば、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋ
ｌｆ４および／またはＫｌｆ５）、Ｍｙｃファミリー（例えば、Ｃ−ｍｙｃ、Ｌ−ｍｙｃ
および／またはＮ−ｍｙｃ）、ＮＡＮＯＧおよび／またはＬＩＮ２８が含まれる。

本発明はまた、代謝障害、例えば糖尿病（例えば、インスリン）、血友病（例えば、第
ＩＸ因子または第ＶＩＩＩ因子）、リソソーム蓄積症、例えば、ムコ多糖症障害（例えば
、スライ症候群［β−グルクロニダーゼ］、ハーラー症候群［α−Ｌ−イズロニダーゼ］
、シャイエ症候群［α−Ｌ−イズロニダーゼ］、ハーラー・シャイエ症候群［α−Ｌ−イ
ズロニダーゼ］、ハンター症候群［イズロン酸スルファターゼ］、サンフィリポ症候群Ａ
［ヘパランスルファミダーゼ］、Ｂ［Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ］、Ｃ［アセチル
−ＣｏＡ：α−グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼ］、Ｄ［Ｎ−アセチルグルコ
サミン６−スルファターゼ］、モルキオ症候群Ａ［ガラクトース−６−硫酸スルファター
ゼ］、Ｂ［β−ガラクトシダーゼ］、マロトー・ラミー症候群［Ｎ−アセチルガラクトサ
ミン−４−スルファターゼ］など）、ファブリー病（α−ガラクトシダーゼ）、ゴーシェ
病（グルコセレブロシダーゼ）、または糖原貯蔵障害（例えば、ポンペ病；リソソーム酸
α−グルコシダーゼ）を治療および／または予防するために実施され得る。

遺伝子移入は、疾患状態のための療法を理解および提供するためのかなり有望な用途を
有する。欠損した遺伝子が既知でありクローニングされている多数の遺伝性疾患が存在す
る。一般に、上記疾患状態は２つのクラスに入る（劣性様式で一般に遺伝する、通常は酵
素の欠乏状態、および、調節タンパク質または構造タンパク質が関与し得、典型的には優
性様式で遺伝するバランスを欠いた状態）。欠乏状態の疾患について、遺伝子移入は、補
充療法のために罹患組織中に正常な遺伝子をもたらすため、ならびにアンチセンス変異を
使用して疾患の動物モデルを創出するために使用され得る。バランスを欠いた疾患状態に
ついて、遺伝子移入は、モデル系において疾患状態を創出するために使用され得、このモ
デル系は次いで疾患状態に対抗するための試みにおいて使用され得る。従って、本発明に
従うウイルスベクターは、遺伝疾患の治療および／または予防を可能にする。

本発明に従うウイルスベクターは、機能的ＲＮＡをインビトロまたはインビボで細胞に
提供するためにも使用され得る。細胞における機能的ＲＮＡの発現は、例えば、細胞によ
る特定の標的タンパク質の発現を減少させ得る。従って、機能的ＲＮＡは、それを必要と
する対象において特定のタンパク質の発現を減少させるために投与され得る。機能的ＲＮ
Ａはまた、遺伝子発現および／または細胞生理学を調節するため、例えば、細胞もしくは
組織培養系を最適化するために、またはスクリーニング方法において、インビトロで細胞
に投与され得る。

さらに、本発明に従うウイルスベクターは、診断方法およびスクリーニング方法におい
て用途を見出し、それにより、対象の核酸が、細胞培養系において、あるいはトランスジ
ェニック動物モデルにおいて、一過的にまたは安定に発現される。

本発明のウイルスベクターは、当業者に明らかなように、遺伝子の標的化、クリアラン
ス、転写、翻訳などを評価するためのプロトコールにおける使用が含まれるがこれらに限
定されない種々の非治療的目的のためにも使用され得る。ウイルスベクターは、安全性（
伝播、毒性、免疫原性など）を評価する目的のためにも使用され得る。かかるデータは、
例えば、臨床的有効性の評価の前に、通常の承認プロセスの一部として、米国食品医薬品
局によって検討される。

さらなる態様として、本発明のウイルスベクターは、対象において免疫応答を生成する
ために使用され得る。この実施形態によれば、免疫原性ポリペプチドをコードする異種核
酸配列を含むウイルスベクターが対象に投与され得、その免疫原性ポリペプチドに対する
能動免疫応答が、対象によって開始される。免疫原性ポリペプチドは、本明細書中で上記
したとおりである。いくつかの実施形態では、防御免疫応答が惹起される。

あるいは、ウイルスベクターは、エクスビボで細胞に投与され得、変更された細胞が対
象に投与される。異種核酸を含むウイルスベクターが細胞中に導入され、その細胞が対象
に投与され、ここで、免疫原をコードする異種核酸が発現され得、対象においてその免疫
原に対する免疫応答を誘導し得る。特定の実施形態では、細胞は抗原提示細胞（例えば、
樹状細胞）である。

「能動免疫応答」または「能動免疫」は、「免疫原との遭遇後の宿主組織および細胞の
関与」を特徴とし、「これは、抗体の合成もしくは細胞媒介反応性の発生またはそれら両
方を導く、リンパ細網組織における免疫担当細胞の分化および増殖に関与する。」Ｈｅｒ
ｂｅｒｔ Ｂ．Ｈｅｒｓｃｏｗｉｔｚ、Ｉｍｍｕｎｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ：Ｃｅｌｌ
Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｙ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ、ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ：ＢＡＳＩＣ ＰＲＯＣＥＳ
ＳＥＳ １１７（Ｊｏｓｅｐｈ Ａ．Ｂｅｌｌａｎｔｉ編、１９８５）。代替的に述べる
と、能動免疫応答は、感染またはワクチン接種による免疫原への曝露後に宿主によって開
始される。能動免疫は受動免疫と対比され得、受動免疫は、「能動免疫された宿主から非
免疫宿主への、予め形成された物質（抗体、トランスファー因子、胸腺移植片、インター
ロイキン−２）の移入」を介して達成される（同文献）。

「防御」免疫応答または「防御」免疫は、本明細書中で使用される場合、疾患の発生率
を予防するまたは低下させるという点で、免疫応答が対象にいくらかの利益を付与するこ
とを示す。あるいは、防御免疫応答または防御免疫は、疾患、特にがんまたは腫瘍の治療
および／または予防において有用であり得る（例えば、がんまたは腫瘍の形成を予防する
ことによって、がんまたは腫瘍の退縮を引き起こすことによって、および／あるいは転移
を予防することによって、および／あるいは転移性小結節の増殖を予防することによって
）。防御効果は、治療の利益がその任意の不利益を上回る限り、完全でも部分的でもよい
。

特定の実施形態では、異種核酸を含むウイルスベクターまたは細胞は、本明細書中に記
載される免疫原的に有効な量で投与され得る。

本発明のウイルスベクターは、１つまたは複数のがん細胞抗原（または免疫学的に類似
の分子）あるいはがん細胞に対する免疫応答を生成する任意の他の免疫原を発現するウイ
ルスベクターの投与によるがん免疫療法のためにも投与され得る。説明するために、例え
ばがんを有する患者を治療するためおよび／または対象においてがんの発生を予防するた
めに、がん細胞抗原をコードする異種核酸を含むウイルスベクターを投与することによっ
て、対象においてがん細胞抗原に対する免疫応答が生成され得る。ウイルスベクターは、
本明細書中で記載されるように、インビボでまたはエクスビボ方法を使用することによっ
て、対象に投与され得る。あるいは、がん抗原は、ウイルスカプシドの一部として発現さ
れ得るか、またはウイルスカプシドと他の方法で関連し得る（例えば、上記されるように
）。

別の代替として、当該分野で公知の任意の他の治療的核酸（例えば、ＲＮＡｉ）または
ポリペプチド（例えば、サイトカイン）が、がんを治療および／または予防するために投
与され得る。

本明細書中で使用する場合、用語「がん」は、腫瘍形成がんを包含する。同様に、用語
「がん性組織」は腫瘍を包含する。「がん細胞抗原」は腫瘍抗原を包含する。

用語「がん」は、当該分野で理解される意味を有し、例えば、身体の離れた部位に伝播
する能力を有する組織の制御されない増殖（即ち、転移）である。例示的ながんには、メ
ラノーマ、腺癌腫、胸腺腫、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫
）、肉腫、肺がん、肝臓がん、結腸がん、白血病、子宮がん、乳がん、前立腺がん、卵巣
がん、子宮頚がん、膀胱がん、腎臓がん、膵臓がん、脳がんならびに現在公知のまたは後
に同定される任意の他のがんまたは悪性状態が含まれるが、これらに限定されない。代表
的な実施形態では、本発明は、腫瘍形成がんを治療および／または予防する方法を提供す
る。

用語「腫瘍」もまた、例えば、多細胞生物内の未分化細胞の異常な塊として、当該分野
で理解される。腫瘍は悪性または良性であり得る。代表的な実施形態では、本明細書中に
開示される方法は、悪性腫瘍を予防および治療するために使用される。

用語「がんを治療する」、「がんの治療」および等価な用語は、がんの重症度が低下さ
れもしくは少なくとも部分的に排除されること、ならびに／または疾患の進行が減速され
るおよび／もしくは制御されること、ならびに／または疾患が安定化されることを意図す
る。特定の実施形態では、これらの用語は、がんの転移が予防もしくは低下もしくは少な
くとも部分的に排除されること、ならびに／または転移性小結節の増殖が予防もしくは低
下もしくは少なくとも部分的に排除されることを示す。

用語「がんの予防」または「がんを予防する」および等価な用語は、その方法が、がん
の発症の発生率および／または重症度を、少なくとも部分的に排除または低下および／ま
たは遅延させることを意図する。代替的に述べると、対象におけるがんの発症は、尤度も
しくは確率において低下され得る、および／または遅延され得る。

特定の実施形態では、細胞は、がんを有する対象から取り出され得、本発明に従うがん
細胞抗原を発現するウイルスベクターと接触され得る。次いで、改変された細胞が対象に
投与され、それにより、がん細胞抗原に対する免疫応答が惹起される。この方法は、イン
ビボで充分な免疫応答を開始できない（即ち、充分な量で促進抗体を生成できない）易感
染性対象と共に有利に使用され得る。

免疫応答は、免疫調節性サイトカイン（例えば、α−インターフェロン、β−インター
フェロン、γ−インターフェロン、ω−インターフェロン、τ−インターフェロン、イン
ターロイキン−１α、インターロイキン−１β、インターロイキン−２、インターロイキ
ン−３、インターロイキン−４、インターロイキン５、インターロイキン−６、インター
ロイキン−７、インターロイキン−８、インターロイキン−９、インターロイキン−１０
、インターロイキン−１１、インターロイキン１２、インターロイキン−１３、インター
ロイキン−１４、インターロイキン−１８、Ｂ細胞増殖因子、ＣＤ４０リガンド、腫瘍壊
死因子−α、腫瘍壊死因子−β、単球走化性因子タンパク質−１、顆粒球マクロファージ
コロニー刺激因子およびリンホトキシン）によって増強され得ることが、当該分野で公知
である。従って、免疫調節性サイトカイン（好ましくは、ＣＴＬ誘導性サイトカイン）が
、ウイルスベクターと合わせて対象に投与され得る。

サイトカインは、当該分野で公知の任意の方法によって投与され得る。外因性サイトカ
インが対象に投与され得るか、あるいはサイトカインをコードする核酸が適切なベクター
を使用して対象に送達され得、サイトカインがインビボで生成され得る。

［対象、医薬製剤および投与様式］
本発明に従うウイルスベクターおよびカプシドは、獣医学適用および医療適用の両方に
おいて用途を見出す。適切な対象には、トリおよび哺乳動物の両方が含まれる。用語「ト
リ」には、本明細書中で使用する場合、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、シチメン
チョウ、キジ、オウム、インコなどが含まれるがこれらに限定されない。用語「哺乳動物
」には、本明細書中で使用する場合、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、
ネコ、イヌ、ウサギなどが含まれるがこれらに限定されない。ヒト対象には、新生児、乳
幼児、若年、成人および老人の対象が含まれる。

代表的な実施形態では、対象は、本発明の方法「を必要とする」、従っていくつかの実
施形態では、「それを必要とする対象」であり得る。

特定の実施形態では、本発明は、薬学的に許容される担体中に本発明のウイルスベクタ
ーおよび／またはカプシドを含み、任意選択で、他の薬剤、医薬品、安定化剤、緩衝剤、
担体、補助剤、希釈剤などを含む、医薬組成物を提供する。注射について、担体は典型的
には液体である。他の投与方法について、担体は固体または液体のいずれかであり得る。
吸入投与について、担体は呼吸用であり、任意選択で、固体または液体の粒状形態であり
得る。

「薬学的に許容される」とは、毒性でなくその他の点でも望ましくない材料、即ち、そ
の材料が、望ましくない生物学的影響をいずれも引き起こすことなしに対象に投与され得
ることを意味する。

本発明の一態様は、核酸をインビトロで細胞に移入する方法である。ウイルスベクター
は、特定の標的細胞に適した標準的な形質導入法に従って、適切な感染多重度で細胞中に
導入され得る。投与するウイルスベクターの力価は、標的細胞の型および数、ならびに特
定のウイルスベクターに依存して変動し得、過度の実験なしに当業者によって決定され得
る。代表的な実施形態では、少なくとも約１０^３感染単位、任意選択で少なくとも約１０
^５感染単位が、細胞に導入される。

ウイルスベクターが導入される細胞（複数でもよい）は、任意の型の細胞であり得、以
下が含まれるがこれらに限定されない：神経細胞（末梢神経系および中枢神経系の細胞、
特に、ニューロンおよびオリゴデンドロサイトなどの脳細胞が含まれる）、肺細胞、眼の
細胞（網膜細胞、網膜色素上皮および角膜細胞が含まれる）、上皮細胞（例えば、腸およ
び呼吸器の上皮細胞）、筋細胞（例えば、骨格筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞および／ま
たは横隔膜筋細胞）、樹状細胞、膵臓細胞（島細胞が含まれる）、肝細胞、心筋細胞、骨
細胞（例えば、骨髄幹細胞）、造血幹細胞、脾臓細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、内
皮細胞、前立腺細胞、生殖細胞など。代表的な実施形態では、細胞は任意の前駆細胞であ
り得る。さらなる実施形態として、細胞は幹細胞（例えば、神経幹細胞、肝臓幹細胞）で
あり得る。なおさらなる実施形態として、細胞はがん細胞または腫瘍細胞であり得る。さ
らに、細胞は、上で示したような任意の種起源であり得る。

ウイルスベクターは、改変された細胞を対象に投与する目的のために、インビトロで細
胞中に導入され得る。特定の実施形態では、細胞は、対象から取り出されたものであり、
ウイルスベクターがその細胞に導入され、次いでその細胞が対象中に戻し投与される。エ
クスビボでの操作のために対象から細胞を取り出し、その後対象中に戻し導入する方法は
、当該分野で公知である（例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照のこと）。あ
るいは、組換えウイルスベクターは、ドナー対象由来の細胞中に、培養細胞中に、または
任意の他の適切な供給源由来の細胞中に導入され得、この細胞が、それを必要とする対象
（即ち、「レシピエント」対象）に投与される。

エクスビボ核酸送達に適した細胞は上記のとおりである。対象に投与する細胞の投薬量
は、対象の年齢、状態および種、細胞の型、細胞が発現する核酸、投与様式などに応じて
変動する。典型的には、少なくとも約１０^２〜約１０^８細胞または少なくとも約１０^３〜
約１０^６細胞が、１投薬当たり薬学的に許容される担体中で投与される。特定の実施形態
では、ウイルスベクターで形質導入された細胞は、医薬担体と組み合わせて、治療有効量
または予防有効量で対象に投与される。

いくつかの実施形態では、ウイルスベクターが細胞中に導入され、（例えば、導入遺伝
子として発現されたまたはカプシド中にて）送達されたポリペプチドに対する免疫原性応
答を惹起するために、その細胞が対象に投与され得る。典型的には、免疫原的に有効な量
のポリペプチドを発現する細胞の量が、薬学的に許容される担体と組み合わせて投与され
る。「免疫原的に有効な量」は、医薬製剤が投与される対象において、そのポリペプチド
に対する能動免疫応答を誘起するのに充分な、発現されたポリペプチドの量である。特定
の実施形態では、投薬量は、（上で定義したような）防御免疫応答を生成するのに充分で
ある。免疫原性ポリペプチドを投与することの利益がその任意の不利益を上回る限り、付
与される保護の程度は、完全または永続的である必要はない。

本発明のさらなる態様は、ウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドを対象に
投与する方法である。それを必要とするヒト対象または動物への、本発明に従うウイルス
ベクターおよび／またはカプシドの投与は、当該分野で公知の任意の手段によってであり
得る。任意選択で、ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、薬学的に許容される担
体中で、治療有効用量または予防有効用量で送達され得る。

本発明のウイルスベクターおよび／またはカプシドはさらに、（例えば、ワクチンとし
て）免疫原性応答を惹起するために投与され得る。典型的には、本発明の免疫原性組成物
は、薬学的に許容される担体と組み合わせて、免疫原的に有効な量のウイルスベクターお
よび／またはカプシドを含む。任意選択で、投薬量は、（上で定義したような）防御免疫
応答を生成するのに充分である。

対象に投与されるウイルスベクターおよび／またはカプシドの投薬量は、投与様式、治
療および／または予防される疾患または状態、個々の対象の状態、特定のウイルスベクタ
ーまたはカプシド、送達される核酸などに依存し、慣用的な様式で決定され得る。治療効
果を達成するための例示的な用量は、少なくとも約１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１
０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^３、１０^１４、１０^１５形質導入単位、任意
選択的に約１０^８〜１０^１３形質導入単位の力価である。

特定の実施形態では、１回より多い投与（例えば、２回、３回、４回またはそれ以上の
投与）が、例えば、毎日、週１回、月１回、年１回などの種々の間隔の期間にわたって、
所望のレベルの遺伝子発現を達成するために使用され得る。

例示的な投与様式には、経口、直腸、経粘膜、鼻腔内、吸入（例えば、エアロゾルを介
して）、頬側（例えば、舌下）、膣、髄腔内、眼内、経皮、子宮内（または胚内）、非経
口（例えば、静脈内、皮下、皮内、筋内［骨格筋、横隔膜筋および／または心筋への投与
が含まれる］、皮内、胸膜内、脳内および関節内）、外用（例えば、気道表面を含む皮膚
表面および粘膜表面の両方への、ならびに経皮投与）、リンパ内など、ならびに直接的な
組織または臓器への注射（例えば、肝臓、骨格筋、心筋、横隔膜筋または脳への）が含ま
れる。投与は、腫瘍への投与であり得る（例えば、腫瘍またはリンパ節の中または近傍）
。任意の所与の場合における最も適切な経路は、治療および／または予防される状態の性
質および重症度、ならびに使用されている特定のベクターの性質に依存する。

本発明に従う骨格筋への投与には、四肢（例えば、上腕、前腕、大腿および／または下
腿）、背部、頚部、頭部（例えば、舌）、胸郭、腹部、骨盤／会陰部および／または指の
骨格筋への投与が含まれるが、これらに限定されない。適切な骨格筋には以下が含まれる
がこれらに限定されない。小指外転筋（手の）、小趾外転筋（足の）、母趾外転筋、第五
中足骨外転筋（ａｂｄｕｃｔｏｒ ｏｓｓｉｓ ｍｅｔａｔａｒｓｉ ｑｕｉｎｔｉ）、
短母指外転筋、長母指外転筋、短内転筋、母趾内転筋、長内転筋、大内転筋、母指内転筋
、肘筋、前斜角筋、膝関節筋、上腕二頭筋、大腿二頭筋、上腕筋、腕橈骨筋、頬筋、烏口
腕筋、皺眉筋、三角筋、口角下制筋、下唇下制筋、顎二腹筋、背側骨間筋（手の）、背側
骨間筋（足の）、短橈側手根伸筋、長橈側手根伸筋、尺側手根伸筋、小指伸筋、指伸筋、
短趾伸筋、長趾伸筋、短母趾伸筋、長母趾伸筋、示指伸筋、短母指伸筋、長母指伸筋、橈
側手根屈筋、尺側手根屈筋、短小指屈筋（手の）、短小趾屈筋（足の）、短趾屈筋、長趾
屈筋、深指屈筋、浅指屈筋、短母趾屈筋、長母趾屈筋、短母指屈筋、長母指屈筋、前頭筋
、腓腹筋、オトガイ舌骨筋、大臀筋、中臀筋、小臀筋、薄筋、頸腸肋筋、腰腸肋筋、胸腸
肋筋、腸骨筋（ｉｌｌｉａｃｕｓ）、下双子筋、下斜筋、下直筋、棘下筋、棘間筋、横突
間筋（ｉｎｔｅｒｔｒａｎｓｖｅｒｓｉ）、外側翼突筋、外直筋、広背筋、口角挙筋、上
唇挙筋、上唇鼻翼挙筋、上眼瞼挙筋、肩甲挙筋、長回旋筋（ｌｏｎｇ ｒｏｔａｔｏｒｓ
）、頭最長筋、頸最長筋、胸最長筋、頭長筋、頸長筋、虫様筋（手の）、虫様筋（足の）
、咬筋、内側翼突筋、内直筋、中斜角筋、多裂筋、顎舌骨筋、下頭斜筋、上頭斜筋、外閉
鎖筋、内閉鎖筋、後頭筋、肩甲舌骨筋、小指対立筋、母指対立筋、眼輪筋、口輪筋、掌側
骨間筋、短掌筋、長掌筋、恥骨筋、大胸筋、小胸筋、短腓骨筋、長腓骨筋、第三腓骨筋、
梨状筋、底側骨間筋、足底筋、広頸筋、膝窩筋、後斜角筋、方形回内筋、円回内筋、大腰
筋、大腿方形筋、足底方形筋、前頭直筋、外側頭直筋、大後頭直筋、小後頭直筋、大腿直
筋、大菱形筋、小菱形筋、笑筋、縫工筋、最小斜角筋、半膜様筋、頭半棘筋、頸半棘筋、
胸半棘筋、半腱様筋、前鋸筋、短回旋筋（ｓｈｏｒｔ ｒｏｔａｔｏｒｓ）、ヒラメ筋、
頭棘筋、頸棘筋、胸棘筋、頭板状筋、頸板状筋、胸鎖乳突筋、胸骨舌骨筋、胸骨甲状筋、
茎突舌骨筋、鎖骨下筋、肩甲下筋、上双子筋、上斜筋、上直筋、回外筋、棘上筋、側頭筋
、大腿筋膜張筋、大円筋、小円筋、胸部の筋、甲状舌骨筋、前脛骨筋、後脛骨筋、僧帽筋
、上腕三頭筋、中間広筋、外側広筋、内側広筋、大頬骨筋および小頬骨筋、ならびに当該
分野で公知の任意の他の適切な骨格筋。

ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、
四肢灌流（任意選択で、下肢および／または腕の孤立した四肢灌流；例えば、Ａｒｒｕｄ
ａら（２００５）Ｂｌｏｏｄ １０５：３４５８〜３４６４頁を参照のこと）、および／
または直接的筋内注射によって骨格筋に送達され得る。特定の実施形態では、ウイルスベ
クターおよび／またはカプシドは、四肢灌流、任意選択で孤立した四肢灌流（例えば、静
脈内投与または関節内投与による）によって、対象（例えば、ＤＭＤなどの筋ジストロフ
ィーを有する対象）の四肢（腕および／または下肢）に投与される。本発明の実施形態で
は、本発明のウイルスベクターおよび／またはカプシドは、「水力学的」技術を使用する
ことなく有利に投与され得る。ベクターの組織送達（例えば、筋肉への）は、脈管構造中
の圧力を増加させ、内皮細胞障壁を横切るベクターの能力を促進する水力学的技術（例え
ば、大容量での静脈内／静脈内投与）によって増強されることが多い。特定の実施形態で
は、本発明のウイルスベクターおよび／またはカプシドは、高容量注入および／または上
昇した血管内圧力（例えば、正常な収縮期血圧より高い、例えば、血管内圧力における５
％以下、１０％以下、１５％以下、２０％以下、２５％以下の、正常な収縮期血圧を超え
た増加）などの水力学的技術の非存在下で投与され得る。かかる方法は、浮腫、神経損傷
および／またはコンパートメント症候群などの、水力学的技術に関連する副作用を低下ま
たは回避し得る。

心筋への投与には、左心房、右心房、左心室、右心室および／または中隔への投与が含
まれる。ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、静脈内投与、大動脈内投与などの
動脈内投与、直接的心臓注射（例えば、左心房、右心房、左心室、右心室中への）および
／または冠状動脈灌流によって、心筋に送達され得る。

横隔膜筋への投与は、静脈内投与、動脈内投与および／または腹腔内投与を含む任意の
適切な方法によるものであり得る。

標的組織への送達は、ウイルスベクターおよび／またはカプシドを含むデポーを送達す
ることによっても達成され得る。代表的な実施形態では、ウイルスベクターおよび／また
はカプシドを含むデポーは、骨格筋、心筋および／または横隔膜筋組織中に移植され、あ
るいは組織が、ウイルスベクターおよび／またはカプシドを含むフィルムまたは他のマト
リックスと接触され得る。かかる移植可能なマトリックスまたは基材は、例えば米国特許
第７，２０１，８９８号中に記載されている。

特定の実施形態では、本発明に従うウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシド
は、（例えば、筋ジストロフィー、心臓疾患［例えば、ＰＡＤまたはうっ血性心不全］を
治療および／または予防するために）骨格筋、横隔膜筋および／または心筋に投与される
。

代表的な実施形態では、本発明は、骨格筋、心筋および／または横隔膜筋の障害を治療
および／または予防するために使用される。

代表的な実施形態では、本発明は、それを必要とする対象において筋ジストロフィーを
治療および／または予防する方法を提供し、この方法は、治療有効量または予防有効量の
本発明のウイルスベクターを哺乳動物対象に投与するステップを含み、このウイルスベク
ターは、以下をコードする異種核酸を含む。ジストロフィン、ミニジストロフィン、ミク
ロジストロフィン、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン、アクチビンＩＩ型可溶
性受容体、ＩＧＦ−１、抗炎症性ポリペプチド、例えば、ＩκＢ優性変異体、サルコスパ
ン、ユートロフィン、ミクロジストロフィン、ラミニン−α２、α−サルコグリカン、β
−サルコグリカン、γ−サルコグリカン、δ−サルコグリカン、ＩＧＦ−１、ミオスタチ
ンまたはミオスタチンプロペプチドに対する抗体または抗体断片、および／あるいはミオ
スタチンに対するＲＮＡｉ。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、本明細書中の別
の箇所に記載するように、骨格筋、横隔膜筋および／または心筋に投与され得る。

あるいは、本発明は、骨格筋、心筋または横隔膜筋に核酸を送達するために実施され得
、これらの筋肉は、正常に血中を循環するポリペプチド（例えば、酵素）または機能的Ｒ
ＮＡ（例えば、ＲＮＡｉ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）の生成のための、ある
いは障害（例えば、代謝障害、例えば糖尿病［例えば、インスリン］、血友病［例えば、
第ＩＸ因子または第ＶＩＩＩ因子］、ムコ多糖障害［例えば、スライ症候群、ハーラー症
候群、シャイエ症候群、ハーラー・シャイエ症候群、ハンター症候群、サンフィリポ症候
群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、モルキオ症候群、マロトー・ラミー症候群など］、またはリソソーム
蓄積症、例えば、ゴーシェ病［グルコセレブロシダーゼ］もしくはファブリー病［α−ガ
ラクトシダーゼＡ］、またはポンペ病［リソソーム酸αグルコシダーゼ］などの糖原貯蔵
障害）を治療および／または予防するための他の組織への全身送達のための、プラットフ
ォームとして使用される。代謝障害を治療および／または予防するのに適した他のタンパ
ク質は、本明細書中に記載されている。対象の核酸を発現するためのプラットフォームと
しての筋肉の使用は、米国特許公開公報２００２０１９２１８９号に記載されている。

従って、一態様として、本発明はさらに、それを必要とする対象において代謝障害を治
療および／または予防する方法を包含し、この方法は、治療有効量または予防有効量の本
発明のウイルスベクターを対象の骨格筋に投与するステップを含み、このウイルスベクタ
ーはポリペプチドをコードする異種核酸を含み、この代謝障害は、ポリペプチドの欠乏お
よび／または欠損の結果である。例示的な代謝障害およびポリペプチドをコードする異種
核酸は、本明細書中に記載されている。任意選択的に、ポリペプチドは分泌される（例え
ば、そのネイティブ状態で分泌されたポリペプチドであるポリペプチド、あるいは例えば
当該分野で公知の分泌シグナル配列との作動可能な関連によって分泌されるように操作さ
れたポリペプチド）。本発明の任意の特定の理論に限定されず、この実施形態によれば、
骨格筋への投与は、全身循環中へのポリペプチドの分泌および標的組織（複数でもよい）
への送達を生じ得る。ウイルスベクターを骨格筋に送達する方法は、本明細書中でより詳
細に記載される。

本発明は、全身送達のためのアンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉまたは他の機能的ＲＮＡ（
例えば、リボザイム）を生成するためにも実施され得る。

本発明は、それを必要とする対象において先天性心不全またはＰＡＤを治療および／ま
たは予防する方法もまた提供し、この方法は、治療有効量または予防有効量の本発明のウ
イルスベクターを哺乳動物対象に投与するステップを含み、このウイルスベクターは、例
えば以下をコードする異種核酸を含む。筋小胞体（ｓａｒｃｏｐｌａｓｍｉｃ ｅｎｄｏ
ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）Ｃａ^２＋−ＡＴＰａｓｅ（ＳＥＲＣＡ２ａ）、血管新生因子、ホス
ファターゼインヒビターＩ（Ｉ−１）およびその断片（例えば、Ｉ１Ｃ）、ホスホランバ
ンに対するＲＮＡｉ；ホスホランバンＳ１６Ｅなどのホスホランバン阻害分子またはドミ
ナントネガティブ分子、ホスホランバン遺伝子を調節するジンクフィンガータンパク質、
β２アドレナリン受容体、β２アドレナリン受容体キナーゼ（ＢＡＲＫ）、ＰＩ３キナー
ゼ、カルサルカン（ｃａｌｓａｒｃａｎ）、βアドレナリン受容体キナーゼインヒビター
（βＡＲＫｃｔ）、プロテインホスファターゼ１のインヒビター１およびその断片（例え
ば、Ｉ１Ｃ）、Ｓ１００Ａ１、パルブアルブミン、アデニリルシクラーゼ６型、短縮型の
構成的に活性なｂＡＲＫｃｔなどのＧタンパク質共役型受容体キナーゼ２型ノックダウン
をもたらす分子、Ｐｉｍ−１、ＰＧＣ−１α、ＳＯＤ−１、ＳＯＤ−２、ＥＣ−ＳＯＤ、
カリクレイン、ＨＩＦ、チモシン−β４、ｍｉｒ−１、ｍｉｒ−１３３、ｍｉｒ−２０６
、ｍｉｒ−２０８および／またはｍｉｒ−２６ａ。

注射剤は、液体溶液もしくは懸濁液、注射の前に液体中で溶液もしくは懸濁液にするの
に適した固体形態、または乳濁液のいずれかとして、従来の形態で調製され得る。あるい
は、本発明のウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドを、全身様式ではなく局
所様式で、例えば、デポー製剤または徐放性製剤で、投与し得る。さらに、ウイルスベク
ターおよび／またはウイルスカプシドは、外科的に移植可能なマトリックスに付着して送
達され得る（例えば、米国公開公報２００４００１３６４５号に記載される）。

本明細書中に開示されるウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドは、対象が
吸入する、ウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドから構成される呼吸用粒子
のエアロゾル懸濁液を任意選択で投与することによって、任意の適切な手段で対象の肺に
投与され得る。呼吸用粒子は、液体または固体であり得る。ウイルスベクターおよび／ま
たはウイルスカプシドを含む液体粒子のエアロゾルは、圧力駆動式エアロゾルネブライザ
ーまたは超音波ネブライザーなどの任意の適切な手段によって、当業者に公知のように生
成され得る。例えば、米国特許第４，５０１，７２９号を参照のこと。ウイルスベクター
および／またはカプシドを含む固体粒子のエアロゾルも同様に、医薬分野で公知の技術に
よって、任意の固体粒状医薬エアロゾル生成器を用いて生成され得る。

ウイルスベクターおよびウイルスカプシドは、中枢神経系（ＣＮＳ）の組織（例えば、
脳、眼）に投与され得、本発明の非存在下で観察されるものよりも広い分布のウイルスベ
クターまたはカプシドを有利に生じ得る。

特定の実施形態では、本発明の送達ベクターは、遺伝性障害、神経変性障害、精神障害
および腫瘍を含むＣＮＳの疾患を治療するために投与され得る。ＣＮＳの例示的疾患には
、以下が含まれるがこれらに限定されない。アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチ
ントン病、カナバン病、リー病、レフサム病、トゥレット症候群、原発性側索硬化症、筋
萎縮性側索硬化症、進行性筋萎縮症、ピック病、筋ジストロフィー、多発性硬化症、重症
筋無力症、ビンスワンガー病、脊髄および頭部の損傷に起因する外傷、テイ・サックス病
、レッシュ・ナイハン病（Ｌｅｓｃｈ−Ｎｙａｎ ｄｉｓｅａｓｅ）、癲癇、脳梗塞、気
分障害（例えば、うつ病、双極性感情障害、持続性感情障害、二次的気分障害）、統合失
調症、薬物依存性（例えば、アルコール依存症および他の物質の依存性）、神経症（例え
ば、不安症、強迫障害、身体表現性障害、解離性障害、悲嘆、産後うつ病）、精神病（例
えば、幻覚および妄想）、認知症、パラノイア、注意欠陥障害、精神性的障害、睡眠障害
、疼痛性障害、摂食障害もしくは体重障害（例えば、肥満症、悪液質、神経性食欲不振症
および過食症（ｂｕｌｅｍｉａ））を含む精神障害、ならびにＣＮＳのがんおよび腫瘍（
例えば、原発性腫瘍）。

ＣＮＳの障害には、網膜、後方路（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｔｒａｃｔ）および視神経に
関与する眼科障害（例えば、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症および他の網膜変性疾患、
ブドウ膜炎、加齢性黄斑変性症、緑内障）が含まれる。

全部ではないが殆どの眼科の疾患および障害は、３つの型の指標のうち１つまたは複数
と関連する：（１）血管新生、（２）炎症および（３）変性。本発明の送達ベクターは、
抗血管新生因子；抗炎症性因子；細胞変性を遅延させ、細胞温存（ｓｐａｒｉｎｇ）を促
進し、または細胞増殖を促進する因子、および上述の組み合わせを送達するために使用さ
れ得る。

例えば、糖尿病性網膜症は、血管新生によって特徴付けられる。糖尿病性網膜症は、眼
内（例えば、硝子体中）または眼窩周囲（例えば、テノン下領域中）のいずれかに、１つ
または複数の抗血管新生因子を送達することによって治療され得る。１つまたは複数の神
経栄養因子もまた、眼内（例えば、硝子体内）または眼窩周囲のいずれかに同時送達され
得る。

ブドウ膜炎は炎症に関与する。１つまたは複数の抗炎症因子が、本発明の送達ベクター
の眼内（例えば、硝子体または前房）投与によって投与され得る。

比較として、網膜色素変性症は、網膜変性によって特徴付けられる。代表的な実施形態
では、網膜色素変性症は、１つまたは複数の神経栄養因子をコードする送達ベクターの眼
内（例えば、硝子体）投与によって治療され得る。

加齢性黄斑変性症は、血管新生および網膜変性の両方に関与する。この障害は、１つま
たは複数の神経栄養因子をコードする本発明の送達ベクターを眼内（例えば、硝子体）に
、および／あるいは１つまたは複数の抗血管新生因子をコードする本発明の送達ベクター
を眼内または眼窩周囲（例えば、テノン下領域中）に投与することによって、治療され得
る。

緑内障は、眼圧の増加および網膜神経節細胞の喪失によって特徴付けられる。緑内障の
治療には、本発明の送達ベクターを使用して興奮毒性損傷から細胞を保護する１つまたは
複数の神経保護剤の投与が含まれる。かかる薬剤には、眼内に、任意選択で硝子体内に送
達される、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）アンタゴニスト、サイトカイン
および神経栄養因子が含まれる。

他の実施形態では、本発明は、発作を治療するため、例えば、発作の発症、発生率およ
び／または重症度を低下させるために使用され得る。発作の治療的処置の効力は、行動的
手段（例えば、眼または口の震え、チック（ｔｉｃｋ））および／または電気記録手段（
殆どの発作は、顕著な電気記録の異常を有する）によって評価され得る。従って、本発明
は、経時的な複数の発作を特徴とする癲癇を治療するためにも使用され得る。

１つの代表的な実施形態では、ソマトスタチン（またはその活性断片）が、下垂体腫瘍
を治療するために、本発明の送達ベクターを使用して脳に投与される。この実施形態によ
れば、ソマトスタチン（またはその活性断片）をコードする送達ベクターは、微量注入に
よって下垂体中に投与される。同様に、かかる治療は、先端巨大症（下垂体からの異常な
成長ホルモン分泌）を治療するために使用され得る。ソマトスタチンの核酸配列（例えば
、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ００３０６）およびアミノ酸配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ
受託番号Ｐ０１１６６；プロセシングされた活性ペプチドソマトスタチン−２８およびソ
マトスタチン−１４を含む）は、当該分野で公知である。

特定の実施形態では、ベクターは、例えば米国特許第７，０７１，１７２号に記載され
た分泌シグナルを含み得る。

本発明の代表的な実施形態では、ウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドは
、ＣＮＳに（例えば、脳にまたは眼に）投与される。ウイルスベクターおよび／またはカ
プシドは、脊髄、脳幹（延髄、脳橋）、中脳（視床下部、視床、視床上部、下垂体、黒質
、松果体）、小脳、終脳（線条体、後頭葉皮質、側頭葉皮質、頭頂葉皮質および前頭葉皮
質、基底核、海馬ならびに扁桃体（ｐｏｒｔａａｍｙｇｄａｌａ）を含む大脳）、辺縁系
、新皮質、線条体、大脳および／または下丘中に導入され得る。ウイルスベクターおよび
／またはカプシドは、網膜、角膜および／または視神経などの眼の異なる領域にも投与さ
れ得る。

ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、送達ベクターのより分散した投与のため
に、脳脊髄液中に（例えば、腰椎穿刺によって）送達され得る。ウイルスベクターおよび
／またはカプシドはさらに、血液脳関門が撹乱された状況（例えば、脳腫瘍または脳梗塞
）において、ＣＮＳに血管内投与され得る。

ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、髄腔内、脳内、脳室内、静脈内（例えば
、マンニトールなどの糖の存在下）、鼻腔内、耳内、眼内（例えば、硝子体内、網膜下、
前房）および眼窩周囲（例えば、テノン下領域）送達、ならびに運動ニューロンへの逆行
性送達と合わせた筋内送達が含まれるがこれらに限定されない当該分野で公知の任意の経
路によって、ＣＮＳの所望の領域（複数であってよい）に投与され得る。

特定の実施形態では、ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、ＣＮＳ中の所望の
領域または区画への直接的注射（例えば、定位注射）によって、液体製剤で投与される。
他の実施形態では、ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、所望の領域への外用適
用によって、またはエアロゾル製剤の鼻腔内投与によって提供され得る。眼への投与は、
液滴の外用適用によるものであり得る。さらなる代替として、ウイルスベクターおよび／
またはカプシドは、固体の持続放出製剤として投与され得る（例えば、米国特許第７，２
０１，８９８号を参照のこと）。

なおさらなる実施形態では、ウイルスベクターは、運動ニューロンに関与する疾患およ
び障害（例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）など）を治
療および／または予防するための逆行性輸送に使用され得る。例えば、ウイルスベクター
は、筋肉組織に送達され得、そこからニューロン中に移動し得る。

本発明を説明してきたが、同内容は以下の実施例においてさらに詳細に説明され、以下
の実施例は、本発明の説明目的のためだけに本明細書中に含まれるものであり、本発明を
限定する意図ではない。

［二重グリカン結合性ＡＡＶの操作］
構造モデル化。ＡＡＶ２およびＡＡＶ９のウイルスタンパク質（ＶＰ）結晶構造につい
ての座標を、ＲＣＳＢ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａｂａｎｋから得た（それぞれ、ＰＤＢ
受託番号１ＬＰ３および３ＵＸ１）^{３０、３１}。ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬタンパク質構造
モデル化サーバー（ｈｔｔｐ：／／ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／）^３
２を使用して、２Ｇ９−ＶＰ３モノマーの相同性モデルを、ＡＡＶ２−ＶＰ３の結晶構造
を鋳型として用いて生成した。インタクトな２Ｇ９カプシドの三次元正二十面体モデルを
、ＶＩＰＥＲｄｂ−Ｖｉｒｕｓ Ｐａｒｔｉｃｌｅ ＥｘｐｌｏｒｅＲ２においてＯｌｉ
ｇｏｍｅｒ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒユーティリティを使用して創出した^３３。同様に、ＡＡ
Ｖ２−ＶＰ３トリマー、２Ｇ９トリマーおよびＡＡＶ９トリマーの図解を、Ｏｌｉｇｏｍ
ｅｒ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒユーティリティを使用して得た。全ての構造モデルを、それぞ
れ橙色および紫色で強調したガラクトース結合部位を形成する残基（ＡＡＶ９−ＶＰ１で
の番号付け：Ｄ２７１、Ｎ２７２、Ｙ４４６、Ｎ４７０、Ａ４７２、Ｖ４７３、Ｗ５０３
）^１３およびヘパラン硫酸結合部位を形成する残基（ＡＡＶ２−ＶＰ１での番号付け：Ｒ
４８７、Ｋ５２７、Ｋ５３２、Ｒ５８５、Ｒ５８８）^{１０〜１２、３４}と共にＰｙＭＯＬ
を使用して可視化した。異なるモノマーを、淡緑色、明るい青色および明るい桃色で着色
した。

二重グリカン結合性ＡＡＶ株の生成。ヘルパープラスミドｐＸＲ１、２、６、８および
９を、ＵＮＣベクターコアから得た。ＡＡＶ９カプシドタンパク質サブユニット上のＧａ
ｌ認識部位に直接関与するまたは隣接するアミノ酸残基を、ＡＡＶ２のカプシドサブユニ
ット上の対応する残基上に置換することによって（ＡＡＶ２ ＶＰ１の番号付け：Ａ２６
６Ｓ、Ｑ４６４Ｖ、Ａ４６７Ｐ、Ｄ４６９Ｎ、Ｉ４７０Ｍ、Ｒ４７１Ａ、Ｄ４７２Ｖ、Ｓ
４７４Ｇ、Ｙ５００Ｆ、Ｓ５０１Ａ）、原型ｐＸＲ２Ｇ９キメラプラスミド構築物を生成
した。置換を、以下のプライマー（ＩＤＴ）を使用し、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標
）Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ部位特異的変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して生成した
：５’−ＧＧＡＡＣＣＡＣＣＡ ＣＧＣＡＧＴＣＡＡＧ ＧＣＴＴＣＡＧＴＴＴ ＴＣＴ
ＧＴＧＧＣＣＧ ＧＡＣＣＣＡＧＴＡＡ ＣＡＴＧＧＣＴＧＴＣ ＣＡＧＧＧＡＡＧＧＡ
ＡＣＴＧＧＣＴＴＣＣＴ ＧＧＡＣＣＣＴＧＴＴ ＡＣＣＧＣ−３’および５’−ＧＡ
ＣＡＴＣＴＧＣＧ ＧＡＴＡＡＣＡＡＣＡ ＡＣＡＧＴＧＡＡＴＴＴ ＧＣＴＴＧＧＡＣ
ＴＧ ＧＡＧＣＴＡＣＣＡＡ ＧＴＡＣＣＡＣＣＴ−３’。ＣＢＡ−Ｌｕｃ導入遺伝子カ
セットをパッケージングする組換えＡＡＶベクターを、以前に記載されたように生成した
^１４。ウイルス力価を、定量的ＰＣＲによって得た。

インビトロ結合、形質導入および競合的阻害アッセイ。ＣＨＯ−Ｌｅｃ２細胞を、１０
％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（Ｃｅｌｌｇｒｏ）、１００μ
ｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｃｅｌｌｇｒｏ）および２．５μｇ／ｍｌのアンホテリ
シンＢ（Ｓｉｇｍａ）を補充したαＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で
培養した。細胞を、２４ウェルプレート中１×１０^５細胞／ウェルの密度で播種した。競
合的阻害アッセイのために、細胞を、４℃で３０分間予め冷却し、αＭＥＭ中１００μｇ
／ｍｌのＦＩＴＣ標識アメリカデイゴ（Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ Ｃｒｉｓｔａｇａｌｌｉ）
レクチン（ＦＩＴＣ−ＥＣＬ、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）と共に、４℃で１時間インキュ
ベートした。あるいは、異なるウイルスカプシドを、室温で１時間、１００μｇ／ｍｌの
可溶性ヘパリン（Ｓｉｇｍａ）または１×ＰＢＳ（対照）と共にインキュベートした。次
いで、模擬処理またはＦＩＴＣ−ＥＣＬ処理した細胞に、１０００ベクターゲノム（ｖｇ
）コピー／細胞のＭＯＩで、ＣＢＡ−Ｌｕｃ導入遺伝子カセットをパッケージングする、
ＨＳ結合したまたは模擬処理したＡＡＶ２、ＡＡＶ２Ｇ９またはＡＡＶ９カプシドを感染
させた。低温室中で１時間のインキュベーション後、未結合ビリオンを、氷冷１×ＰＢＳ
での３回の洗浄によって除去した。細胞表面結合アッセイのために、結合ビリオンの数を
、定量的ＰＣＲを使用して、各ウェル中のベクターゲノムコピー数／細胞を定量すること
によって測定した。形質導入アッセイのために、感染Ｌｅｃ２細胞を、３７℃に移動させ
、細胞溶解物からのルシフェラーゼ導入遺伝子発現の定量前に２４時間インキュベートし
た。

親ＡＡＶ２またはＡＡＶ９カプシドとの競合的阻害のために、ＣＢＡプロモーター駆動
性ｔｄＴｏｍａｔｏ導入遺伝子カセットをパッケージングするベクターを利用した。簡潔
に述べると、Ｌｅｃ２細胞を、１×１０^５細胞／ウェルの密度で、２４ウェルプレート中
に一晩播種した。４℃で３０分間予め冷却した後、Ｌｅｃ２細胞を、５００〜１００，０
００ｖｇ／細胞の範囲の感染多重度（ＭＯＩ）で、ＡＡＶ２−ｔｄＴｏｍａｔｏまたはＡ
ＡＶ９−ｔｄＴｏｍａｔｏベクターのいずれかと共に、４℃でもう３０分間予めインキュ
ベートした。次いで、細胞に、４℃で４５分間、１０００ｖｇ／細胞のＭＯＩでＡＡＶ２
Ｇ９−ＣＢＡ−Ｌｕｃを重感染させ、その後、氷冷ＰＢＳを使用して未結合ビリオンを除
去した。次いで、感染細胞を、ルシフェラーゼ発現分析前に３７℃で２４時間インキュベ
ートした。対照は、ＡＡＶ２−ＣＢＡ−ＬｕｃまたはＡＡＶ９−ＣＢＡ−Ｌｕｃベクター
を含んだ。

インビボでの導入遺伝子発現の動態。雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）を、Ｊａ
ｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、ＵＮＣ Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌに
おいて、ＮＩＨガイドラインに従って、ＩＡＣＵＣ承認されたプロトコールを使用して取
り扱った。ＣＢＡ−Ｌｕｃカセットをパッケージングする異なるＡＡＶベクターを、１×
１０^１１ｖｇ／マウスの用量で、尾静脈中に静脈内注射した。投与後の示された時間間隔
（３日、７日および１８日）において、マウスに、ルシフェリン（１２０ｍｇ／ｋｇ；Ｎ
ａｎｏｌｉｇｈｔ）を腹腔内注射し、生物発光画像を、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ（登録
商標）Ｌｕｍｉｎａシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して
得た。肝臓および動物全体の画像からの光アウトプットの定量を、ＷＡＶＥＭＥＴＲＩＣ
Ｓ（登録商標）ソフトウェアを使用して実施した。異なる組織におけるルシフェラーゼ導
入遺伝子発現のさらなる定量およびベクターゲノム生体内分布を、ベクター投与後３日目
および１８日目に屠殺した２つの異なる群のマウスにおいて実施した。ルシフェラーゼ導
入遺伝子発現を、上に記載したように、異なる組織溶解物においてモニタリングした。ベ
クターゲノム生体内分布を、ＤＮｅａｓｙ（登録商標）Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用し
て、組織溶解物からゲノムＤＮＡを最初に抽出することによって決定した。ルシフェラー
ゼ導入遺伝子のコピー数を、ｑＰＣＲを使用して決定し、マウスラミン遺伝子のコピー数
に対して正規化して、各組織中のｖｇ／細胞を決定した。特異的プライマーセットは、そ
れぞれ、５’−ＡＧＧＧＣＡＣＣＴＣ ＣＡＴＣＴＣＧＧＡＡ ＡＣ−３’／５’−ＧＧ
ＡＣＣＣＡＡＧＧ ＡＣＴＡＣＣＴＣＡＡ ＧＧＧ−３’（マウスラミンに対して）およ
び５’−ＡＡＡＡＧＣＡＣＴＣ ＴＧＡＴＴＧＡＣＡＡ ＡＴＡＣ−３’／５’−ＣＣＴ
ＴＣＧＣＴＴＣ ＡＡＡＡＡＡＴＧＧＡ ＡＣ−３’（ＣＢＡ−Ｌｕｃに対して）であっ
た。

統計分析。全てのデータを、平均±標準誤差として表し、各実験についての複製の数を
、対応する図の説明文中に提供する。特に示さない限り、統計的有意性を、対応なし片側
スチューデントｔ検定を使用して決定し、０．０５未満のｐ値を、異なる実験について統
計的に有意であるとみなした。

［結果］
ＡＡＶ９のＧａｌフットプリントをいくつかのＡＡＶ株上に「移植すること」の実行可
能性を調査するために、本発明者らは、最初に、ＡＡＶ血清型１、２、６および８のＶＰ
３サブユニットトリマーの三次元構造を、ＡＡＶ９のＶＰ３のものとアラインさせて比較
した（図１）。結合に直接関与するまたはＧａｌ受容体フットプリントに直接隣接する対
応するＡＡＶ９のＶＰ３残基と重複する鋳型カプシド上のアミノ酸残基を、複数ラウンド
の部位特異的変異誘発によって改変した。生成された全てのキメラＡＡＶ株を、以前に確
立されたプロトコール^１４を使用して、ニワトリβ−アクチンプロモーター駆動性ホタル
ルシフェラーゼ（ＣＢＡ−Ｌｕｃ）レポーター導入遺伝子カセットをパッケージングする
組換えベクターとして調製した。ＡＡＶ９由来のＧａｌ認識に関与するアミノ酸残基およ
び他の隣接する残基は、異なるＡＡＶ血清型カプシド上でも顕著に良好に許容され、これ
らのＡＡＶキメラのパッケージング効率が親株と匹敵するものであった。ＡＡＶ血清型１
、２、６、８および以前に操作されたＡＡＶ２ｉ８変異体^１５に基づく複数のＡＡＶキメ
ラを取得したところ（５×１０^１１〜５×１０^１２ウイルスゲノムコピー／ｍＬの範囲の
力価で）、これらは、ＣＨＯ−Ｌｅｃ２細胞をインビトロにおいて形質導入する際の新規
の主な受容体としてＧａｌを利用することが観察された（図２）。次いで、本発明者らは
、原型二重グリカン結合性ＡＡＶキメラの詳細な特徴付けを実施し、ＡＡＶ２Ｇ９と命名
した（Ｇは、Ｇａｌフットプリントを示し、数字は、それぞれレシピエントおよびドナー
のカプシド血清型を同定する）。

強調した推定二重グリカン受容体結合部位（ＨＳおよびＧａｌ）を有する、合成により
操作されたＡＡＶ２Ｇ９の三次元モデル（図３Ａ中に完全カプシドおよび図３Ｄ中にＶＰ
３トリマー）を、Ｓｗｉｓｓ Ｍｏｄｅｌ（登録商標）を使用した相同性モデル化によっ
て生成した。ＡＡＶ２Ｇ９完全カプシドの分子モデルは、正二十面体カプシド上の三回対
称軸の周囲に位置するＨＳおよびＧａｌ結合部位の幾何学的分布および直交性を実証して
いる。三回対称軸からのＨＳおよびＧａｌ受容体フットプリントのクローズアップ図は、
ＡＡＶ２カプシドの骨格上に直交性Ｇａｌ結合部位を移植することが、カプシドアセンブ
リに関して許容され得るという観察をさらに支持する。ＨＳ認識に関与する正に荷電した
残基の側鎖を有するＡＡＶ２のＶＰ３サブユニットトリマーの三次元構造（図３Ａ）なら
びにＡＡＶ９のＶＰ３サブユニットトリマー上のＧａｌ認識部位を含むアミノ酸残基の側
鎖を有するＡＡＶ２のＶＰ３サブユニットトリマーの三次元構造（図３Ｃ）もまた示され
る。

ＡＡＶ２Ｇ９は、ＨＳ受容体およびＧａｌ受容体を、インビトロで互換的に利用する。
ＡＡＶ２Ｇ９による二重グリカン受容体の使用を支持する最も重要な証拠が、可溶性ヘパ
リンおよび末端ガラクトシル化グリカンに選択的に結合するアメリカデイゴレクチン（Ｅ
ＣＬ）が関与する細胞表面上のウイルス結合の競合的阻害アッセイから得られた。図４Ａ
〜Ｂに示すように、ＨＳは、ＣＨＯ−Ｌｅｃ２細胞においてＡＡＶ２形質導入を顕著に阻
害するがＥＣＬは阻害せず（暗灰色のバー）、一方でＥＣＬは、ほぼ２ｌｏｇ単位、ＡＡ
Ｖ９形質導入を選択的に遮断する（白色のバー）。これらの結果は、ＡＡＶ２およびＡＡ
Ｖ９について予測された形質導入プロファイルと一致する^{１６〜１８}。対照的に、ＡＡＶ
２Ｇ９は、ＥＣＬおよびＨＳの両方の組み合わせによる予めの処理によってのみ効率的に
中和され得る（明るい灰色のバー、図４Ｃ）。小さいが顕著な阻害効果が、ＥＣＬについ
て観察される。

ＡＡＶ２およびＡＡＶ９についての形質導入プロファイルを、ＥＣＬまたはＨＳを使用
した、各株による細胞表面結合の阻害によってさらに補強した（図４Ｄ〜Ｅ）。キメラＡ
ＡＶ株の独自の細胞表面結合は、いずれかの試薬単独ではなく、排他的にＥＣＬおよびＨ
Ｓの組み合わせによるＡＡＶ２Ｇ９の細胞表面結合の競合的阻害によってさらに支持され
る（図４Ｆ）。さらに、異なるＡＡＶカプシドに対するモノクローナル抗体を使用して得
られた共焦点免疫蛍光顕微鏡写真（図５）は、ＡＡＶ２Ｇ９が、ＡＡＶ２またはＡＡＶ９
よりも強く、ＣＨＯ−Ｌｅｃ２細胞の表面に結合することを示唆している。かかるシナリ
オは、２つの異なるグリカンと互換的に結合するＡＡＶ２Ｇ９の見かけの能力に基づいて
予測され得る。

ＡＡＶ２Ｇ９による代替的形質導入経路の利用をさらに調査するために、本発明者らは
、親血清型ＡＡＶ２およびＡＡＶ９との競合アッセイを実施した。図６Ａ〜Ｂに示される
ように、５００〜１００，０００ｖｇ／細胞の範囲のＭＯＩでのＡＡＶ２−ＣＢＡ−ｔｄ
ＴｏｍまたはＡＡＶ９−ＣＢＡ−ｔｄＴｏｍ競合ベクターとの予めのインキュベーション
は、ルシフェラーゼ導入遺伝子発現によって測定されるように、それぞれＡＡＶ２−ＣＢ
Ａ−ＬｕｃまたはＡＡＶ９−ＣＢＡ−Ｌｕｃによる形質導入を効率的に遮断する。しかし
、ＡＡＶ２およびＡＡＶ９は両方とも、１０倍過剰の感染多重度（ＭＯＩ）では、ＡＡＶ
２Ｇ９形質導入を効率的に遮断することはできない。より高いＭＯＩ（１００倍過剰）で
は、ＡＡＶ２は、ＡＡＶ２Ｇ９形質導入を中和するにあたり、ＡＡＶ９よりも低い効率で
競合するように見える。合わせて考えると、これらの結果は、ＡＡＶ２Ｇ９が実際に、形
質導入のための主な受容体としてＨＳおよびＧａｌの両方を利用する独自の能力を有する
新規二重グリカン結合性株であるという意見を支持する。

ＡＡＶ２Ｇ９は、導入遺伝子発現の迅速な開始をもたらす。次いで、本発明者らは、二
重グリカン結合が、インビトロおよびインビボのウイルス形質導入に特定の利益を付与す
るかどうかを調査した。ＣＨＯ−Ｌｅｃ２細胞中のルシフェラーゼレポーター発現の時間
過程をモニタリングすることにより、ＡＡＶ２Ｇ９がインビトロにおいて迅速な開始およ
び改善された遺伝子移入を媒介することが明らかになった（図７）。次いで、生動物画像
化研究を実施して、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける異なるＡＡＶ株の全身性投与後のルシフ
ェラーゼ導入遺伝子発現をモニタリングした（図８Ａ）。注射後３日目、７日目および１
８日目に得た肝臓および動物全体内の光アウトプットの生物発光画像および定量的評価は
、インビトロデータと相関し、ＡＡＶ２Ｇ９が迅速な開始および増強された遺伝子発現を
媒介し得るという意見を支持する（図８Ｂ〜Ｃ）。興味深いことに、ＡＡＶ２Ｇ９によっ
て示される動態プロファイルは、ＡＡＶ９の動態プロファイルと酷似するが、ＡＡＶ２の
動態プロファイルとは似ていない。対照的に、ＡＡＶ２Ｇ９の形質導入プロファイル／組
織指向性は、以前に確立されたように^{４、１９〜２１}、ＡＡＶ２とは類似するが、ＡＡＶ
９によって示される全身性指向性とは異なって、主に肝臓指向性のようである。従って、
二重グリカン受容体係合は、ＡＡＶ株の形質導入効率を改善するが、組織指向性を変更し
ないようである。

ＡＡＶ２Ｇ９ベクターのインビボでの形質導入および生体内分布プロファイル。ＡＡＶ
２Ｇ９のインビボ形質導入および生体内分布プロファイルをさらに評価するために、ＢＡ
ＬＢ／ｃマウス由来の組織溶解物の定量的分析を、投与後３日目および１８日目に実施し
た。具体的には、ＡＡＶ２Ｇ９は、投与後３日目に、ＡＡＶ２（ほぼ２ｌｏｇ単位）およ
びＡＡＶ９（約１ｌｏｇ単位）と比較して、肝臓において顕著により高いルシフェラーゼ
導入遺伝子の発現を示す（図９Ａ）。ＡＡＶ９は、心臓においてＡＡＶ２Ｇ９よりも１０
倍よりも高い形質導入効率を示すが、ＡＡＶ２と比較してＡＡＶ２Ｇ９による心臓形質導
入における中程度の増加もまた観察される。１８日目に、ＡＡＶ２Ｇ９で処理したマウス
から回収した心組織および肝臓組織は、導入遺伝子のより高い発現を実証し続けるが、Ａ
ＡＶ９は、この段階において、最も効率的な株として現れる。具体的には、ＡＡＶ２、Ａ
ＡＶ２Ｇ９およびＡＡＶ９による心組織における形質導入効率は、投与後３日目に観察さ
れたのと類似の傾向を維持する。肝臓では、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２Ｇ９およびＡＡＶ９によ
るルシフェラーゼ導入遺伝子発現間の差異は、注射後１８日目まで、進行に際して縮小す
る。具体的には、ＡＡＶ９は、それぞれＡＡＶ２Ｇ９およびＡＡＶ２と比較した場合、５
〜１０倍の間のより高い導入遺伝子発現を実証する。

投与後３日目のＡＡＶ２Ｇ９株および親ＡＡＶ株による肝臓および心臓におけるベクタ
ーゲノムコピー数の定量的分析（図９Ｂ）は、図５Ａに示される形質導入効率について観
察された傾向と一致する。具体的には、ＡＡＶ２Ｇ９は、ＡＡＶ２と比較して、心組織に
おいてより高い程度まで蓄積したが、ＡＡＶ９よりも、なお約２ｌｏｇ単位低かった。肝
臓では、ＡＡＶ２Ｇ９のコピー数は、ＡＡＶ９のコピー数と匹敵するが、ＡＡＶ２よりも
１ｌｏｇ単位を超えてより高い。１８日目に、全ての血清型についてのコピー数は、以前
に報告されたように^{２２、２３}、連続的細胞ターンオーバーおよび一本鎖ＡＡＶゲノムの
分解におそらくは起因して減少した。

図１０は、ＣＢＡ−ルシフェラーゼ導入遺伝子カセットをパッケージングするＡＡＶ２
ｉ８、２ｉ８Ｇ９およびＡＡＶ９ベクターのインビボ導入遺伝子の発現動態を示す。ＢＡ
ＬＢ／ｃマウス（ｎ＝４）に、１×１０^１１ｖｇ／動物の用量で、尾静脈を介してＡＡＶ
ベクターを投与し、生物発光画像を、Ｘｅｎｏｇｅｎ（登録商標）Ｌｕｍｉｎａ画像化シ
ステムを使用して、注射後３日目、７日目および１８日目に収集した。代表的生動物画像
は、虹色スケールで表される生物発光で示される（１０^５〜１０^６フォトン／秒／ｃｍ^２
／ステラジアン）。

図１１は、新生児マウスにおける代表的ＡＡＶ−Ｇ９株の中枢神経系（ＣＮＳ）指向性
プロファイルを示す。生後０（Ｐ０）子（ｎ＝３）に、ハイブリッドニワトリβアクチン
（ＣＢｈ）プロモーターによって駆動されるＧＦＰ導入遺伝子を含む３．５×１０ｅ９の
ＡＡＶベクターゲノムを、左脳室中に片側性に注射した。注射の２週間後、ＧＦＰ免疫組
織化学により、マウス脳内の各ＡＡＶ「Ｇ９」株についての示差的伝播、領域的指向性お
よび細胞指向性が明らかになった。

上記は、本発明の例示であり、本発明の限定として解釈すべきではない。

［参考文献］

Claims (18)

1. １つまたは複数のアミノ酸置換を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク
   質であって、前記置換が、前記ＡＡＶカプシドタンパク質中に新規のグリカン結合部位を
   導入する、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質。
2. 前記アミノ酸置換が、ＡＡＶ２中のアミノ酸２６６、アミノ酸４６３〜４７５およびア
   ミノ酸４９９〜５０２、またはＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、Ａ
   ＡＶ７、ＡＡＶ８もしくはＡＡＶ１０における対応するアミノ酸位置に存在する、請求項
   １に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
3. 前記新規のグリカン結合部位が、ヘキソース結合部位であり、前記ヘキソースが、ガラ
   クトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、グルコース（Ｇｌｕ）またはフコース（ｆ
   ｕｃ）である、請求項１に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
4. 前記新規のグリカン結合部位が、シアル酸（Ｓｉａ）結合部位であり、Ｓｉａ残基が、
   Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）またはＮ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ
   ５Ｇｃ）である、請求項１に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
5. 前記新規のグリカン結合部位が、二糖結合部位であり、前記二糖が、Ｓｉａ（α２，３
   ）ＧａｌまたはＳｉａ（α２，６）Ｇａｌの形態の、ガラクトースに連結されたシアル酸
   である、請求項１に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
6. 前記新規のグリカン結合部位が、ガラクトース結合部位である、請求項２に記載のＡＡ
   Ｖカプシドタンパク質。
7. 前記置換が、第１のＡＡＶ血清型由来の新規のグリカン結合部位を、前記第１のＡＡＶ
   血清型とは異なる第２のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質中に導入する、請求項１に記
   載のＡＡＶカプシドタンパク質。
8. 前記第２のＡＡＶ血清型の血清型が、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ血清型２（
   ＡＡＶ２）、ＡＡＶ血清型３ａ（ＡＡＶ３ａ）、ＡＡＶ血清型３ｂ（ＡＡＶ３ｂ）、ＡＡ
   Ｖ血清型４（ＡＡＶ４）、ＡＡＶ血清型５（ＡＡＶ５）、ＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６）、
   ＡＡＶ血清型７（ＡＡＶ７）、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）またはＡＡＶ血清型１０（Ａ
   ＡＶ１０）である、請求項７に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
9. 前記新規のグリカン結合部位が、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）由来のガラクトース結合
   部位である、請求項７に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
10. 前記ＡＡＶカプシドタンパク質が、ＡＡＶ２由来であり、
    ａ）アミノ酸２６６における前記置換がＡ２６６Ｓであり、
    ｂ）アミノ酸４６３〜４７５における前記置換が、ＳＱＡＧＡＳＤＩＲＤＱＳＲ４６３
    〜４７５ＳＸ_１ＡＧＸ_２ＳＸ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６ＱＸ_７Ｒであり、式中、Ｘ_１〜７は、任意の
    アミノ酸であり得、かつ
    ｃ）アミノ酸４９９〜５０２における前記置換が、ＥＹＳＷ４９９〜５０２ＥＸ_８Ｘ_９
    Ｗであり、式中、Ｘ_８〜９は、任意のアミノ酸であり得る、
    請求項２に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
11. Ｘ_１がＶであり、Ｘ_２がＰであり、Ｘ_３〜６がＮＭＡＶであり、Ｘ_７がＧである、請求
    項１０に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
12. Ｘ_８がＦであり、Ｘ_９がＷである、請求項１０に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
13. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＡＡＶカプシドタンパク質を含む、ＡＡＶカプ
    シド。
14. （ａ）請求項１３に記載のＡＡＶカプシドと、
    （ｂ）少なくとも１つの末端反復配列を含む核酸と、
    を含むウイルスベクターであって、前記核酸が、前記ＡＡＶカプシドによってカプシド封
    入されている、ウイルスベクター。
15. 薬学的に許容される担体中に、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＡＡＶカプシド
    タンパク質、請求項１３に記載のＡＡＶカプシドまたは請求項１４に記載のウイルスベク
    ターを含む、組成物。
16. 細胞を請求項１４に記載のウイルスベクターと接触させるステップを含む、細胞中に核
    酸を導入する方法。
17. 前記細胞が対象中に存在する、請求項１６記載の方法。
18. 前記対象がヒト対象である、請求項１７に記載の方法。