JP2018536432A - 神経変性疾患、例えばとりわけ、パーキンソン病およびハンチントン病の治療における、aav/upr−プラスウイルス、upr−プラス融合たんぱく質、遺伝子治療、およびその使用 - Google Patents
神経変性疾患、例えばとりわけ、パーキンソン病およびハンチントン病の治療における、aav/upr−プラスウイルス、upr−プラス融合たんぱく質、遺伝子治療、およびその使用 Download PDFInfo
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Abstract
【選択図】 図14
Description
本発明は、中枢神経系(CNS)のニューロンにおいて、XBP1s、リンカーペプチド、およびATF6fの間の融合たんぱく質を過剰発現する、アデノ随伴ウイルス(AAV)の使用を介して、特に神経変性疾患の治療において、医学分野に適用され、神経変性問題、好ましくはパーキンソン病およびハンチントン病を回復および改善する。
CNS疾患に関する科学研究は、近年、特に認知および運動疾患に関連する疾患に大きな関心を集めている。神経変性問題に関連する疾患の治療は、現在、症状を軽減するための遺伝子治療アプローチを有していない。
最近の研究は、ER(小胞体)におけるたんぱく質恒常性の慢性的変化が、とりわけ、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症などのたんぱく質フォールディング障害に関連する、事実上すべての神経変性疾患において観察される、横断的病理学的事象であることを示している。
(i)シャペロンおよびフォールダーゼ(foldase)の発現の増加;
(ii)たんぱく質品質管理の改善;および、
(iii)欠陥たんぱく質の大量除去。
(1)PERK(小胞体キナーゼなどの二本鎖RNA活性化プロテインキナーゼ[PKR]);
(2)ATF6(活性化転写因子6);および、
(3)IRE1(イノシトール要求キナーゼ1)。
プラスミドpAAV_ATF6f−LFG−XBP1s−HAは、寄託番号第RGM2232号として、国際生物寄託機関である、Instituto de Investigaciones Agropecuarias de Chile(INIA)に、2015年10月7日に寄託された。
本発明は、本明細書に記載の特定の方法論、複合体、材料、製造技術、使用、および適用に限定されず、これらは変更してもよいことに留意されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の表現を説明するだけの目的のために使用され、本発明の見方および可能性を制限することを意図するものではないことも、理解されるべきである。
本明細書で使用される用語「アデノ随伴ウイルス」、「AAVウイルス」、「AAVビリオン」、「AAVウイルス粒子」、および「AAV粒子」は、互換性がある。これらは、少なくとも1つのAAVカプシドたんぱく質(好ましくは、特定のAAV血清型の全カプシドたんぱく質)、および1つのカプセル化AAVゲノムポリヌクレオチドからなるウイルス粒子を指す。粒子がAAVの末端逆位配列に隣接する異種ポリヌクレオチド(すなわち、哺乳類細胞に送達される導入遺伝子のような天然型AAVゲノム以外のポリヌクレオチド)を含んでなる場合、典型的には「AAV粒子ベクター」または「AAVベクター」と呼ばれる。AAVとは、パルボウイルス科のディペンドウイルス属に属するウイルスを指す。AAVゲノムはおよそ4.7キロベース長であり、陽性または陰性として数えることができる一本鎖デオキシリボ核酸(ssDNA)からなる。ゲノムは、DNA鎖の両端に末端逆位配列(ITR)、ならびに2つのオープンリーディングフレーム(ORF)であるREPおよびCAP(レプリカーゼおよびカプシド)を含んでなる。REPフレームワークは、AAVのライフサイクルに必要とされるREPたんぱく質(REP78、REP68、REP52、およびREP40)をコードする、4つの重なり合う遺伝子からなる。CAPフレームは、相互に作用して正二十面体対称カプシドを形成する、20個のカプシドたんぱく質配列:VP1、VP2、およびVP3の重なり合うヌクレオチドを含有する。
その薬理学的特性を含有するウイルスの特性は、例えば、リガンドの導入によって影響され、調整され得る。さらに、ウイルス剤の薬理学的特性は、リガンドを薬剤製剤およびウイルスに組み込むことによって改善することができる。
8gのNaCl
0.2gのKCl
1.44gのNa2HPO4
0.24gのKH2PO4。
2.pHをHClで7.4まで調節する。
3.追加の蒸留水H2Oを用いて量を1Lに設定する。
4.滅菌および高圧蒸気滅菌。
UPRplus分子変種の作成。
本特許の目的の1つは、XBP1sと呼ばれる活性型のXBP1、およびATF6fと呼ばれるATF6の活性型の、ヒト配列から構成される組換えDNAの6つの変種を作製することである。UPRplus変種は、その設計に2つの変数、すなわち、2つの配列間のXBP1sおよびATF6f分子(XBP1s−ATF6fおよびATF6f−XBP1s)、ならびに結合ペプチド(リンカーとしても知られる)の順序を含む。使用するリンカーは以下の通りである:
・19−AAグリシンフレキシブルリンカー(「GFL」);
・25−AAアルファヘリックスリンカー(「AHL4」);および、
・50−AA可動性リンカー(「FL」)。
第1組 XBP1s−リンカー−ATF6f
SnaBI_XBP1s−LFG−ATF6f_FseI
BspEI_XBPS1s−LF−ATF6f_KpnI
BspEI_XBPs−L4H4−Atf6f_KpnI
第2組 ATF6−リンカー−XBP1s
SnaBI_ATF6−LFG−XBP1s_FseI
KpnI_ATF6−L4H4−XBP1s_SfiI
KpnI_ATF6−LF−XBP1s_SfiI
ウイルスの投与経路は、標的ニューロンを感染させるために血液脳関門を通過させる。
Ulusoy et al,.によると、ベクター滴定は、1010〜1012gc/mlの実証された用量で、1mlあたり109〜1013ゲノムコピー(GC)の範囲を必要とする。他方で、評価されるベクターのあらゆる希釈倍率においては、1011gc/mlの低い中程度の範囲を有さなければならないため、毒性が消失する。
ヒトにおける用量範囲は、この範囲を異なる年齢群の適用に制限することなく、または年齢もしくは病態による分布の変更量で制限することなく、109〜1030ウイルス単位/体重kgの間で見出される。
rAAV2ベクターを、約60〜80ミクロンの先端直径を有するガラスキャピラリーを備えた5μLのHamiltonシリンジを使用して、NSに左右に注入した。適切な濃度のウイルス粒子を含有する2マイクロリットルの緩衝液を、0.4μl/分の速度で注入した。注射完了の5分後に針をゆっくりと抜いた。
パーキンソン病およびハンチントン病は、黒質のドーパミン作動性ニューロンにおいて優先的に、選択的な神経細胞死を引き起こすたんぱく質凝集体の形成に関連する。これらの影響を観察するために、図17に示すように、ウエスタンブロット試験を行った。
UPRplus、XBP1s、およびATF6fたんぱく質を24時間発現させると、N2A細胞におけるポリQ79−EGFPたんぱく質の凝集率は減少した。UPRplus、XBP1s、およびATF6fたんぱく質の発現は、それぞれ、WBを用いて決定された凝集率である23.2%、47%、および51.4%にまで減少した。
アデノ随伴ベクター産生
AAVウイルス血清型2(AAV2/6)粒子は、293−AAV細胞(Agilent Technologies、カリフォルニア州サンタクララ)の形質移入によって産生され、イオジキサノール勾配、続いてカラムアフィニティークロマトグラフィーで精製された。ゲノムが懸濁液中に含有するAAV粒子の数、ならびにHEK293T細胞におけるベクターの懸濁液の感染力を、TaqMan qPCRアッセイによって決定した。
この標的の開発のために、XBP1s配列、ヒトATF6f配列、およびそれぞれのリンカーを新規合成し、CMVプロモーターの下で、トランスジーンを発現するアデノウイルスプラスミドpAAV−CMV−MCSにクローニングした。HAタグ配列(図17/17A)は、生成した構築物の全てに包含されているため、形質導入された細胞を同定することができた。空のアデノウイルスプラスミドpAAV−CMV−MCSを対照として使用した。
異なるプラスミドでトランスフェクトしたHEK293細胞から全RNAを単離した。PBS中でホモジナイズした後、製造者が推奨するTrizol RNA抽出プロトコールに従った。cDNAは、高容量cDNA逆転写キット(Applied Biosystems)を用いて合成した。SYBRグリーンおよびMx3005P QPCRシステム(Stratagene)を定量的RT−PCRに使用した。mRNAの相対定量は対照としてのβ−アクチンを用いた比較閾値サイクル法により計算した。配列のプライマーは、PrimerBankから得た(表XV)。
本技術は実験1にて詳述する。
Neuro2A細胞およびHEK293T細胞をATCCから入手し、それぞれ10%または5%ウシ血清、および抗生物質(10000U/mlペニシリン、10mg/mlストレプトマイシン)を補充したDMEM培地中、37℃および5%CO2で培養した。
フィルタートラップアッセイ:全たんぱく質25μgを、酢酸セルロースフィルターを含有する真空ポンプ(Microfiltration Apparatus、bio-rad、http://www.bio-rad.com/en-us/applications-technologies/protein-blotting-equipment-cells-power-supplies#3)に連結された、96ウェルプレートに適用する。
データは、平均およびSEMとして表される。実験に応じて、結果は、スチューデントのT検定、またはマンホイットニー検定、2元配置分散分析、その後、ポストホック検定としてホルム−シダックまたはボンフェローニ、もしくはランク上の1元配置分散分析によるクラスカル・ワリス、続いてポストホック検定としてダン試験またはボンフェローニを用いて、統計的に比較した。
Claims (78)
- 組換えウイルスゲノムを含んでなり、そのようなゲノムは、融合たんぱく質をコードする目的のUPRplusポリヌクレオチドと動作可能に結合する神経組織の特異的転写の調節領域を含んでなる発現カセットを含んでなる、アデノ随伴ベクター(AAV)。
- 前記AAVの血清型が、AAV2、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、および偽型AAVを含んでなる群から選択される、請求項1に記載のアデノ随伴ベクター。
- 前記AAVの前記血清型が、AAV2である、請求項2に記載のアデノ随伴ベクター。
- 転写調節領域が、とりわけ、CMV、PGK1、CAMKII、THY1、GAD34を含んでなる群から選択されたプロモーター領域を包含する、請求項1、2、および3に記載のアデノ随伴ベクター。
- 前記群の前記選択されたプロモーター領域が、CMVである、請求項4に記載のアデノ随伴ベクター。
- とりわけ、Ha、Flag、Gfp、His、およびMyc群から選択された免疫応答部位に対する翻訳領域を含んでなる、請求項1、2、および3に記載のアデノ随伴ベクター。
- 免疫応答部位に対する前記翻訳領域が、Haである、請求項6に記載のアデノ随伴ベクター。
- 前記アデノ随伴ベクターの血清型が、各血清型の指向性により導入遺伝子が発現する細胞型の特異性を提供する、請求項4に記載のアデノ随伴ベクター。
- 前記アデノ随伴ベクターの血清型が、特定の神経細胞型に特異的である、請求項8に記載のアデノ随伴ベクター。
- 前記アデノ随伴ベクターの血清型が、第2番、および/または第2/6番偽型ベクターの型である、請求項9に記載のアデノ随伴ベクター。
- 前記発現カセットが、転写後調節領域を含んでなる、請求項1〜10のいずれか一項に記載のアデノ随伴ベクター。
- 前記転写後調節領域が、ウッドチャック肝炎ウイルス(WHP)の転写後調節エレメントである、請求項11に記載のアデノ随伴ベクター。
- アデノ随伴ウイルスのIRTが、AAV2、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、および偽型AAV、優先的にはAAV2に由来するIRTである、請求項1〜12に記載のアデノ随伴ベクター。
- 転写されるUPRplus標的配列が、XBP1s、ATF6f、および架橋またはリンカー配列を含んでなる、請求項1〜13に記載のアデノ随伴ベクター。
- 架橋配列が、前記LGF、L4H4、およびLF配列を含んでなる、請求項14に記載のアデノ随伴ベクター。
- 転写される前記標的配列が、XBP1s−LGF−ATF6f−HAである、請求項14および15に記載のアデノ随伴ベクター。
- 転写される前記標的配列が、XBP1s−LF−ATF6f−HAである、請求項14および15に記載のアデノ随伴ベクター。
- 転写される前記標的配列が、XBP1s−L4H4−ATF6f−HAである、請求項14および15に記載のアデノ随伴ベクター。
- 転写される前記標的配列が、ATF6f−LGF−XBP1s−HAである、請求項14および15に記載のアデノ随伴ベクター。
- 転写される前記標的配列が、ATF6f−LF−XBP1s−HAである、請求項14および15に記載のアデノ随伴ベクター。
- 転写される前記標的配列が、ATF6f−L4H4−XBP1s−HAである、請求項14および15に記載のアデノ随伴ベクター。
- 目的の前記ポリヌクレオチドが、神経細胞に対して全身的に近接して作用するかまたは神経細胞で作用する、XBP1s−LGF−ATF6f−HA、XBP1s−LF−ATF6f−HA、XBP1s−L4H4−ATF6f−HA、ATF6f−LGF−XBP1s−HA、ATF6f−LF−XBP1s−HA、およびATF6f−L4H4−XBP1s−HAを含んでなる群の中で融合たんぱく質をコードする、請求項1〜21に記載のアデノ随伴ベクター。
- 目的の前記ポリヌクレオチドが、前記融合たんぱく質XBP1s−LGF−ATF6f−HAをコードする、請求項22に記載のアデノ随伴ベクター。
- 目的の前記ポリヌクレオチドが、前記融合たんぱく質XBP1s−LF−ATF6f−HAをコードする、請求項22に記載のアデノ随伴ベクター。
- 目的の前記ポリヌクレオチドが、前記融合たんぱく質XBP1s−L4H4−ATF6f−HAをコードする、請求項22に記載のアデノ随伴ベクター。
- 目的の前記ポリヌクレオチドが、前記融合たんぱく質ATF6f−LGF−XBP1s−HAをコードする、請求項22に記載のアデノ随伴ベクター。
- 目的の前記ポリヌクレオチドが、前記融合たんぱく質ATF6f−LF−XBP1s−HAをコードする、請求項22に記載のアデノ随伴ベクター。
- 目的の前記ポリヌクレオチドが、前記融合たんぱく質ATF6f−L4H4−XBP1s−HAをコードする、請求項22に記載のアデノ随伴ベクター。
- 神経細胞に対して全身的に近接して作用するかまたは神経細胞で作用する目的の前記ポリヌクレオチドが、神経変性に関与する細胞に特異的である、請求項22に記載のアデノ随伴ベクター。
- 神経細胞に対して全身的に近接して作用するかまたは神経細胞で作用する目的の前記ポリヌクレオチドが、パーキンソン病およびハンチントン病に関与する細胞に特異的である、請求項22および29に記載のアデノ随伴ベクター。
- 神経細胞に対して全身的に近接して作用するかまたは神経細胞で作用する目的の前記ポリヌクレオチドが、優先的には黒質のドーパミン作動性ニューロンにおいて、パーキンソン病に関与する細胞に特異的であり、またハンチントン病に関して、線条体の中型有棘神経細胞(MSN)と称されるGABA作動性の神経細胞にも特異的である、請求項30に記載のアデノ随伴ベクター。
- 請求項1〜31に記載のアデノ随伴ベクター、および薬剤的に許容可能な賦形剤を含んでなる、医薬組成物。
- 化合物1ml当たり109〜1013個のゲノムコピー(GC)の範囲のウイルスの用量を含んでなる、請求項32に記載の医薬組成物。
- 神経変性疾患の治療のための薬物の調製に有用である、請求項32に記載の医薬組成物の使用。
- 哺乳類における、神経変性疾患の治療のための薬物の調製に有用である、請求項1に記載のアデノ随伴ベクターの使用。
- パーキンソン病および/またはハンチントン病の治療のための薬物の調製に有用である、請求項35に記載のアデノ随伴ベクターの使用。
- この哺乳類が、ヒトである、請求項35に記載のアデノ随伴ベクターの使用。
- 前記アデノ随伴ベクターまたは前記医薬組成物が、全身的または局所的に投与される、請求項35に記載のアデノ随伴ベクターの使用。
- 前記アデノ随伴ベクターまたは前記医薬組成物が、前記神経組織における目的の前記ポリヌクレオチドの発現を必要とする、請求項35に記載のアデノ随伴ベクターの使用。
- 請求項1に記載のアデノ随伴ベクターを用いる治療方法であって:
a:神経細胞を請求項1〜31に記載のアデノ随伴ウイルスと接触させること;および、
b:神経細胞におけるウイルスの発現、を含んでなる、治療方法。 - とりわけ、直接的な脳室内および/またはくも膜下腔内注射によって、投与経路が血液脳関門の前記ウイルスの通過を受けやすく、鼻経路を含んでなる、請求項40に記載のアデノ随伴ベクターを用いる治療方法。
- アデノ随伴ウイルスのITRに隣接する発現カセットを含んでなり、そのような発現カセットは、プロモーター、免疫応答に対する翻訳領域、および融合たんぱく質をコードする目的のポリヌクレオチドを含んでなる、ポリヌクレオチド。
- 前記プロモーター領域が、とりわけ、CMV、PGK1、CAMKII、THY1、およびGAD34を含んでなる群から選択される、請求項42に記載のポリヌクレオチド。
- 前記群から選択された前記プロモーター領域が、CMVである、請求項43に記載のポリヌクレオチド。
- とりわけ、Ha、Flag、Gfp、His、およびMycの群から選択された免疫応答部位に対する翻訳領域を含んでなる、請求項42に記載のポリヌクレオチド。
- 免疫応答部位に対する前記翻訳領域が、Haである、請求項45に記載のポリヌクレオチド。
- 前記アデノ随伴ベクターの血清型の前記型が、各血清型の前記指向性を与えられた前記導入遺伝子を発現する前記細胞型の特異性を提供する、請求項42に記載のポリヌクレオチド。
- 前記アデノ随伴ベクターの血清型の前記型が、特定の神経細胞型に特異的である、請求項47に記載のポリヌクレオチド。
- 前記アデノ随伴ベクターの血清型の前記型が、第2番および/または第2/6番偽型ベクターの型である、請求項48に記載のポリヌクレオチド。
- 前記発現カセットがまた、転写後調節領域も含んでなる、請求項42〜49に記載のポリヌクレオチド。
- 前記転写後調節領域が、前記ウッドチャック肝炎ウイルス(WHP)の前記転写後調節エレメントである、請求項50に記載のポリヌクレオチド。
- 転写される前記標的配列が、XBP1s−LGF−ATF6f−HA、XBP1s−LF−ATF6f−HA、XBP1s−L4H4−ATF6f−HA、ATF6f−LGF−XBP1s−HA、ATF6f−LF−XBP1s−HA、およびATF6f−L4H4−XBP1s−HAを含んでなり、神経細胞に対して全身的に近接して作用するかまたは神経細胞で作用する、請求項42〜51に記載のポリヌクレオチド。
- 転写される前記標的配列が、XBP1s−LGF−ATF6f−HAである、請求項52に記載のポリヌクレオチド。
- 転写される前記標的配列が、XBP1s−LF−ATF6f−HAである、請求項52に記載のポリヌクレオチド。
- 転写される前記標的配列が、XBP1s−L4H4−ATF6f−HAである、請求項52に記載のポリヌクレオチド。
- 転写される前記標的配列が、ATF6f−LGF−XBP1s−HAである、請求項52に記載のポリヌクレオチド。
- 転写される前記標的配列が、ATF6f−LF−XBP1s−HAである、請求項52に記載のポリヌクレオチド。
- 転写される前記標的配列が、ATF6f−L4H4−XBP1s−HAである、請求項52に記載のポリヌクレオチド。
- 目的の前記ポリヌクレオチドが、XBP1s−LGF−ATF6f−HA、XBP1s−LF−ATF6f−HA、XBP1s−L4H4−ATF6f−HA、ATF6f−LGF−XBP1s−HA、ATF6f−LF−XBP1s−HA、およびATF6f−L4H4−XBP1s−HAを含んでなる群を有するたんぱく質をコードし、神経細胞に対して全身的に近接して作用するかまたは神経細胞で作用する、請求項42〜58に記載のポリヌクレオチド。
- 目的の前記ポリヌクレオチドが、前記たんぱく質XBP1s−LGF−ATF6f−HAをコードする、請求項59に記載のポリヌクレオチド。
- 目的の前記ポリヌクレオチドが、前記たんぱく質XBP1s−LF−ATF6f−HAをコードする、請求項59に記載のポリヌクレオチド。
- 目的の前記ポリヌクレオチドが、前記たんぱく質XBP1s−L4H4−ATF6f−HAをコードする、請求項59に記載のポリヌクレオチド。
- 目的の前記ポリヌクレオチドが、前記たんぱく質ATF6f−LGF−XBP1s−HAをコードする、請求項59に記載のポリヌクレオチド。
- 目的の前記ポリヌクレオチドが、前記たんぱく質ATF6f−LF−XBP1s−HAをコードする、請求項59に記載のポリヌクレオチド。
- 目的の前記ポリヌクレオチドが、前記たんぱく質ATF6f−L4H4−XBP1s−HAをコードする、請求項59に記載のポリヌクレオチド。
- 目的の前記ポリヌクレオチドが、前記黒質のドーパミン作動性ニューロンに対して全身的に近接して作用する、請求項42に記載のポリヌクレオチド。
- 目的の前記ポリヌクレオチドが、前記黒質のドーパミン作動性ニューロンに対して全身的に近接して作用するかまたは神経細胞で作用する、請求項66に記載のポリヌクレオチド。
- 生物学的寄託の国際機関である、INIA、Instituto de Investigaciones Agropecuarias de Chileに寄託番号第RGM2231号として寄託されたプラスミドなどの、アデノ随伴の配列、アデノ随伴ウイルスのITRと隣接する発現カセットを含んでなり、発現カセットは、プロモーター、免疫応答に対する翻訳領域、および目的のポリヌクレオチドを含んでなる、プラスミド。
- 生物学的寄託の国際機関である、INIA、Instituto de Investigaciones Agropecuarias de Chileに寄託番号第RGM2232号として寄託されたプラスミドなどの、アデノ随伴の配列、アデノ随伴ウイルスのITRと隣接する発現カセットを含んでなり、発現カセットは、プロモーター、免疫応答に対する翻訳領域、および目的のポリヌクレオチドを含んでなる、プラスミド。
- 生物学的寄託の国際機関である、INIA、Instituto de Investigaciones Agropecuarias de Chileに寄託番号第RGM2233号として寄託されたプラスミドなどの、アデノ随伴の配列、アデノ随伴ウイルスのITRと隣接する発現カセットを含んでなり、発現カセットは、プロモーター、免疫応答に対する翻訳領域、および目的のポリヌクレオチドを含んでなる、プラスミド。
- 生物学的寄託の国際機関である、INIA、Instituto de Investigaciones Agropecuarias de Chileに寄託番号第RGM2234号として寄託されたプラスミドなどの、アデノ随伴である配列、アデノ随伴ウイルスのITRと隣接する発現カセットを含んでなり、発現カセットは、プロモーター、免疫応答に対する翻訳領域、および目的のポリヌクレオチドを含んでなる、プラスミド。
- 生物学的寄託の国際機関である、INIA、Instituto de Investigaciones Agropecuarias de Chileに寄託番号第RGM2235号として寄託されたプラスミドなどの、アデノ随伴の配列、アデノ随伴ウイルスのITRと隣接する発現カセットを含んでなり、発現カセットは、プロモーター、免疫応答に対する翻訳領域、および目的のポリヌクレオチドを含んでなる、プラスミド。
- 生物学的寄託の国際機関である、INIA、Instituto de Investigaciones Agropecuarias de Chileに寄託番号第RGM2236号として寄託されたプラスミドなどの、アデノ随伴の配列、アデノ随伴ウイルスのITRと隣接する発現カセットを含んでなり、発現カセットは、プロモーター、免疫応答に対する翻訳領域、および目的のポリヌクレオチドを含んでなる、プラスミド。
- 請求項42〜64に記載のウイルスゲノムを含んでなる、アデノ随伴ウイルス。
- アデノ随伴ウイルスベクターを得る方法であって、以下のステップ:
a.AAVがその複製に依存する、AAV Capたんぱく質、AAV Repたんぱく質、およびウイルスたんぱく質を有する、請求項42〜64のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含んでなる細胞を、提供すること、
b.AAVの構築のために適切な条件下において細胞を維持すること;ならびに、
c.細胞によって産生されたアデノ随伴ウイルスベクターを精製すること、を含んでなる、方法。 - 前記AAVが、アデノウイルスに由来する複製に依存する、請求項75に記載の方法。
- 前記アデノ随伴ウイルスの前記CapおよびRepたんぱく質が、前記血清型AAV2、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、および偽型AAVから選択されるAAVに由来する、請求項68および75に記載の方法。
- 前記アデノ随伴ウイルスの前記CapおよびRepたんぱく質が、前記血清型AAV2に由来する、請求項77に記載の方法。
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