CN116507730A - 封闭端dna载体及其用于表达苯丙氨酸羟化酶（pah）的用途 - Google Patents

封闭端dna载体及其用于表达苯丙氨酸羟化酶（pah）的用途 Download PDF

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Abstract

本文描述了用于递送和表达转基因的具有线性和连续结构的ceDNA载体。这些ceDNA载体包含侧接两个ITR序列的表达盒，其中该表达盒包含编码PAH蛋白的经密码子优化的核酸序列以及特定的启动子序列和顺式调节元件。本文还提供了使用这些ceDNA载体进行可靠的体外、离体和体内PAH蛋白基因表达的方法和细胞系。本文还提供了包含可用于在细胞、组织或受试者中表达PAH蛋白的ceDNA载体的方法和组合物，以及用表达PAH蛋白的所述ceDNA载体治疗疾病的方法。这种PAH蛋白可被表达以治疗疾病，例如苯丙酮尿症(PKU)。

Description

封闭端DNA载体及其用于表达苯丙氨酸羟化酶(PAH)的用途
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序列表
本申请含有序列表，其已经以ASCII格式电子提交并且据此全文以引用方式并入。创建于2021年9月16日的所述ASCII副本命名为131698-08120_SL.txt，并且大小为633,329字节。
技术领域
本公开涉及基因疗法领域，所述基因疗法包括用于在受试者或细胞中表达转基因或经分离多核苷酸的非病毒载体。本公开还涉及核酸构建体、启动子、载体和宿主细胞，包括多核苷酸以及将外源DNA序列递送至靶细胞、组织、器官或生物体的方法。例如，本公开提供了使用非病毒封闭端DNA(ceDNA)载体表达苯丙氨酸羟化酶(PAH)以通过在对其有需要的受试者的细胞或组织中表达PAH来治疗疾病的方法。
背景技术
基因疗法旨在改善患有因基因表达谱畸变引起的基因突变或获得性疾病的患者的临床结果。基因疗法包括治疗或预防由可能导致病症、疾病、恶性病等的缺陷基因或异常调节或表达，例如表达不足或过表达导致的医学病况。例如，由缺陷基因造成的疾病或病症可以通过向患者递送矫正性遗传物质来加以治疗、预防或改善，或可以通过例如对患者用矫正性遗传物质改变缺陷基因或使缺陷基因沉默，从而引起遗传物质在患者体内进行治疗性表达来加以治疗、预防或改善。
基因疗法的基础是向转录盒提供活性基因产物(有时称为转基因)，例如能够产生正向功能获得效应、负向功能丧失效应或另一结果的活性基因产物。此类结果可归因于治疗蛋白(例如抗体、功能性酶或融合蛋白)的表达。基因疗法也可以用于治疗由其他因素引起的疾病或恶性疾病。人类单基因病症可以通过将正常基因递送给目标细胞并表达来治疗。矫正基因在患者目标细胞中的递送和表达可以通过多种方法进行，包括使用工程化病毒和病毒基因递送载体。在许多可用的病毒来源载体(例如，重组逆转录病毒、重组慢病毒、重组腺病毒等)当中，重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus；rAAV)作为基因疗法中的多用途载体越来越受到欢迎。
腺相关病毒(AAV)属于细小病毒科(Parvoviridae family)，并且更具体地说，构成依赖病毒属。源自AAV的载体(即，重组AAV(rAVV)或AAV载体)对于递送遗传物质是有吸引力的，因为(i)它们能够感染(转导)各种各样的非分裂和分裂细胞类型，包括肌细胞和神经元；(ii)它们缺乏病毒结构基因，从而减少宿主细胞对病毒感染的反应，例如干扰素介导的反应；(iii)野生型病毒被认为在人类中是非病理性的；(iv)与能够整合到宿主细胞基因组中的野生型AAV不同，复制缺陷型AAV载体缺乏rep基因并且通常持续作为附加体，因此限制了插入诱变或基因毒性的风险；并且(v)与其他载体系统相比，AAV载体通常被认为是相对较差的免疫原，因此不会触发显著的免疫反应(参见ii)，从而获得载体DNA的持久性以及潜在地治疗性转基因的长期表达。
然而，使用AAV粒子作为基因递送载体存在几个主要缺陷。与rAAV相关的一个主要缺点是其病毒包装容量有限，为约4.5kb的异源DNA(Dong等人，1996；Athanasopoulos等人，2004；Lai等人，2010)，因此，AAV载体的使用仅限于小于150,000Da的蛋白质编码能力。第二个缺点是，由于人群中野生型AAV感染盛行，所以必须筛查rAAV基因疗法候选者中从患者消除所述载体的中和抗体的存在。第三个缺点与衣壳免疫原性有关，所述免疫原性阻止了对未从初始治疗中排除的患者进行再施用。患者的免疫系统可以对有效充当“强化”注射的所述载体作出反应，以刺激免疫系统产生高滴度的抗AAV抗体，从而杜绝了进一步治疗。最近的一些报告指出在高剂量情况下对免疫原性的顾虑。另一个值得注意的缺点是，鉴于在异源基因表达之前必须将单链AAV DNA转化为双链DNA，所以AAV介导的基因表达的启动相对较慢。
另外，通过引入一种或多种含有AAV基因组、rep基因和cap基因的质粒，产生具有衣壳的常规AAV病毒粒子(Grimm等人,1998)。然而，发现这种衣壳化AAV病毒载体不能有效地转导某些细胞和组织类型，并且衣壳还诱导免疫反应。
相应地，由于单次施用于患者(因患者免疫反应)、适于AAV载体递送的转基因遗传物质的范围因最小病毒包装容量(约4.5kb)而受限，以及AAV介导的基因表达缓慢，因此基因疗法使用腺相关病毒(AAV)载体受到限制。
苯丙酮尿症(PKU)是一种罕见的遗传性先天性代谢缺陷，由PAH基因突变引起。苯丙酮尿症(PKU)导致苯丙氨酸的代谢降低。未经治疗，PKU可导致智力障碍、癫痫发作、行为问题和精神障碍。它还可能导致发霉的气味和较浅色的皮肤。PKU治疗不佳的母亲所生的婴儿可能有心脏问题、小头和低出生体重。PKU是由于PAH基因的突变引起的，突变导致苯丙氨酸羟化酶(PAH)水平低，即患有PKU的受试者的PAH发生突变，导致其酶活性不足。PKU是常染色体隐性遗传，这意味着该基因的两个拷贝都必须发生突变才能使病情发展。有两种主要类型，经典PKU和变异PKU，取决于是否保留任何酶功能。那些携带一个突变PAH基因拷贝的人通常没有症状。
PAH是一种酶，通常在肝脏中表达，是将膳食苯丙氨酸(phe)代谢为酪氨酸所必需的，酪氨酸是一种负责产生神经递质的氨基酸。PAH催化苯丙氨酸羟基化为酪氨酸。有缺陷的PAH酶会导致膳食苯丙氨酸积累到潜在的毒性水平。
PKU可由苯丙氨酸羟化酶(PAH)中的单基因缺陷引起，从而导致血清phe水平升高。PAH在脊椎动物中将phe转化为酪氨酸。在没有PAH的情况下，去除Phe的唯一其他机制是蛋白质合成和轻微的降解途径，涉及丙氨酸侧链的脱氨基和氧化脱羧，从而产生PKU患者尿液中所见的特征性苯乳酸和乙酸苯酯。不幸的是，典型的饮食中含有的Phe比在没有PAH的情况下可以消除的多。PKU患者体内Phe的累积导致许多症状，包括大脑发育异常和严重的智力低下。(Kaufman,Proc Nat’l Acad Sci USA 96:3160-3164,1999)。
目前的护理标准是严格限制饮食(限制苯丙氨酸(Phe))，但并不总是有效，因为这种饮食限制难以维持并且不能纠正潜在的缺陷。目前对PKU的治疗是减少含有苯丙氨酸和特殊补充剂的食物的饮食。严格的饮食必须在出生后尽快开始，并至少持续10年(如果不是终生的话)。如果不及时治疗，PKU会导致进行性和严重的神经功能障碍。在美国有大约16,500人患有PKU，并且迄今为止没有解决PKU遗传缺陷的可用治疗。
尽管在理解PKU的生物化学、分子生物学和遗传学方面取得了巨大进展，但在开发该病症的新治疗方法方面进展甚微。对PKU的疾病改善疗法的巨大需求尚未得到满足。首先，目前的疗法不能改变疾病，仅对一部分患者有效，并且仍然需要严格的饮食限制，不依从性会导致神经元损伤。其次，PKU尚无获批的基因疗法，而且由于预先存在的抗体，25％至40％的患者无法使用基于AAV的疗法。此外，AAV只能施用一次，并且所产生的PAH水平可能不够高而无效，或可能为超常的，无法滴定剂量水平。
因此，本领域需要允许治疗性PAH蛋白在细胞、组织或受试者中表达以治疗PKU的技术。
发明内容
本文所述的技术涉及通过从具有共价封闭端的无衣壳(例如，非病毒)DNA载体(在本文中称为“封闭端DNA载体”或“ceDNA载体”)表达苯丙氨酸羟化酶(PAH)来治疗苯丙酮尿症(PKU)的方法和组合物，其中ceDNA载体包含已进行密码子优化并与特定顺式元件(例如，特异性启动子、特异性增强子以及特异性启动子和增强子的组合)组合的PAH核酸序列，并且该PAH核酸序列已在PKU小鼠模型中测试了苯丙氨酸水平的最佳校正(例如，表达和持续时间)。根据一些实施方案，当与特异性启动子序列和/或特异性增强子序列组合时，特定的经密码子优化的PAH核酸序列与相同的经密码子优化的PAH核酸序列与另一启动子序列和/或特异性增强子序列的组合相比表现更好。如本公开所述，包含经密码子优化的序列的构建体表现得比天然hPAH cDNA序列好得多，并且包含经密码子优化的序列和特定顺式作用元件的某些构建体在整个28天研究期间显示出延长的校正，证明表达和功效的持久性。令人惊讶地发现，在PAHenu2小鼠模型中，包含某些启动子(例如，hAAT CpG最小化启动子)的构建体在某些开放阅读框(ORF)(ceDNA412 codop 2ORF)下体内表现更好，而hAAT启动子通常被VD启动子(VD)或3X VD在体外或在其他ORF(例如，萤光素酶)下胜过。
可以使用这些ceDNA载体产生用于治疗、监测和诊断的PAH蛋白。将表达PAH的ceDNA载体应用于受试者进行PKU的治疗可用于：(i)提供疾病改善水平的PAH酶，(ii)在递送中具微创性，(iii)可重复并且给药时生效，(iv)具有快速起效的治疗作用，(v)引起矫正性PAH酶在肝中持久表达，(vi)恢复尿素循环功能苯丙氨酸代谢，和/或(vii)可滴定以实现适当药理学水平的有缺陷的酶。
因此，本文所述的公开内容涉及具有共价封闭端的无衣壳(例如，非病毒)DNA载体(在本文中称为“封闭端DNA载体”或“ceDNA载体”)，其包含已进行密码子优化并与特定顺式作用元件(例如，特异性启动子、特异性增强子以及特异性启动子和增强子的组合)组合的PAH核酸序列，以允许PAH治疗蛋白在细胞中表达。
在一个方面，本文公开了一种封闭端DNA(ceDNA)载体，其包含编码至少一种PAH蛋白的至少一个核酸序列，其中所述至少一个核酸序列选自与表1A中所示的序列中的任何序列具有至少90％同一性的序列，其中所述至少一个核酸序列是经密码子优化的，并且其中所述至少一个核酸序列位于侧接反向末端重复序列(ITR)之间；可操作地连接到编码至少一种PAH蛋白的至少一个核酸序列的启动子，其中启动子选自由VD启动子、人α1-抗胰蛋白酶(hAAT)启动子(包括与hAAT(979)启动子(hAAT_core_C10)或其他CpG最小化(CpGmin)_hAAT启动子具有至少96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，所述CpGmin_hAAT启动子如hAAT_core_C06、hAAT_core_C07、hAAT_core_C08和hAAT_core_C09)和运甲状腺素蛋白(TTR)肝特异性启动子组成的组。
在一个实施方案中，编码至少一种PAH蛋白的至少一个核酸序列选自与表1A中所示的序列中的任一序列具有至少95％同一性的序列。在一个实施方案中，编码至少一种PAH蛋白的至少一个核酸序列选自与表1A中所示的序列中的任一序列具有至少96％同一性的序列。在一个实施方案中，编码至少一种PAH蛋白的至少一个核酸序列选自与表1A中所示的序列中的任一序列具有至少97％同一性的序列。在一个实施方案中，编码至少一种PAH蛋白的至少一个核酸序列选自与表1A中所示的序列中的任一序列具有至少98％同一性的序列。在一个实施方案中，编码至少一种PAH蛋白的至少一个核酸序列选自与表1A中所示的序列中的任一序列具有至少99％同一性的序列。在一个实施方案中，编码至少一种PAH蛋白的至少一个核酸序列选自包含表1A中所示的序列中的任一序列的序列。
根据另一方面，本公开提供了一种封闭端DNA(ceDNA)载体，其包含编码至少一种PAH蛋白的核酸序列，其中核酸序列选自与表1A中所示的序列中的任何序列具有至少95％同一性的序列，其中所述至少一个核酸序列位于侧接反向末端重复序列(ITR)之间；以及可操作地连接到编码至少一种PAH蛋白的核酸序列的启动子，其中启动子选自由VD启动子、人α1-抗胰蛋白酶(hAAT)启动子和运甲状腺素蛋白(TTR)肝特异性启动子组成的组。
根据另一方面，本公开提供了一种封闭端DNA(ceDNA)载体，其包含编码至少一种PAH蛋白的核酸序列，其中核酸序列选自与表1A中所示的序列中的任何序列具有至少96％同一性的序列，其中所述至少一个核酸序列位于侧接反向末端重复序列(ITR)之间；以及可操作地连接到编码至少一种PAH蛋白的核酸序列的启动子，其中启动子选自由VD启动子、人α1-抗胰蛋白酶(hAAT)启动子和运甲状腺素蛋白(TTR)肝特异性启动子组成的组。
根据另一方面，本公开提供了一种封闭端DNA(ceDNA)载体，其包含编码至少一种PAH蛋白的核酸序列，其中核酸序列选自与表1A中所示的序列中的任何序列具有至少97％同一性的序列，其中所述至少一个核酸序列位于侧接反向末端重复序列(ITR)之间；以及可操作地连接到编码至少一种PAH蛋白的核酸序列的启动子，其中启动子选自由VD启动子、人α1-抗胰蛋白酶(hAAT)启动子和运甲状腺素蛋白(TTR)肝特异性启动子组成的组。
根据另一方面，本公开提供了一种封闭端DNA(ceDNA)载体，其包含编码至少一种PAH蛋白的核酸序列，其中核酸序列选自与表1A中所示的序列中的任何序列具有至少98％同一性的序列，其中所述至少一个核酸序列位于侧接反向末端重复序列(ITR)之间；以及可操作地连接到编码至少一种PAH蛋白的核酸序列的启动子，其中启动子选自由VD启动子、人α1-抗胰蛋白酶(hAAT)启动子和运甲状腺素蛋白(TTR)肝特异性启动子组成的组。
根据另一方面，本公开提供了一种封闭端DNA(ceDNA)载体，其包含编码至少一种PAH蛋白的核酸序列，其中核酸序列选自与表1A中所示的序列中的任何序列具有至少99％同一性的序列，其中所述至少一个核酸序列位于侧接反向末端重复序列(ITR)之间；以及可操作地连接到编码至少一种PAH蛋白的核酸序列的启动子，其中启动子选自由VD启动子、人α1-抗胰蛋白酶(hAAT)启动子和运甲状腺素蛋白(TTR)肝特异性启动子组成的组。
在一个实施方案中，编码至少一种PAH蛋白的至少一个核酸序列是与SEQ ID NO:382所示的序列具有至少98％同一性的序列。在一个实施方案中，编码至少一种PAH蛋白的至少一个核酸序列是与SEQ ID NO:382所示的序列具有至少99％同一性的序列。在一个实施方案中，编码至少一种PAH蛋白的至少一个核酸序列包含SEQ ID NO:382或由SEQ ID NO:382组成。
在一个实施方案中，编码至少一种PAH蛋白的至少一个核酸序列是与SEQ ID NO:425所示的序列具有至少99％同一性的序列。在一个实施方案中，编码至少一种PAH蛋白的至少一个核酸序列如SEQ ID NO:425所示。在一个实施方案中，编码至少一种PAH蛋白的至少一个核酸序列是与SEQ ID NO:431所示的序列具有至少99％同一性的序列。在一个实施方案中，编码至少一种PAH蛋白的至少一个核酸序列如SEQ ID NO:431所示。在一个实施方案中，编码至少一种PAH蛋白的至少一个核酸序列是与SEQ ID NO:435所示的序列具有至少99％同一性的序列。在一个实施方案中，编码至少一种PAH蛋白的至少一个核酸序列如SEQID NO:435所示。
在一个实施方案中，启动子包含与SEQ ID NO:441-448中的任一者和/或表7A中列出的序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ IDNO:441-448中的任一者和/或表7A中列出的序列或者由它们组成。
在一个实施方案中，启动子包含具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的核酸序列或者包含SEQ ID NO:191。
在本文的各方面和实施方案中的一个实施方案中，启动子包含与SEQ ID NO:443具有至少98％同一性的核酸序列。在本文的各方面和实施方案中的一个实施方案中，启动子包含与SEQ ID NO:444具有至少99％同一性的核酸序列。在本文的各方面和实施方案中的一个实施方案中，启动子包含与SEQ ID NO:445具有至少99％同一性的核酸序列。在本文的各方面和实施方案中的一个实施方案中，启动子包含与SEQ ID NO:446具有至少99％同一性的核酸序列。在本文的各方面和实施方案中的一个实施方案中，启动子包含与SEQ IDNO:447具有至少96％同一性的核酸序列。在本文的各方面和实施方案中的一个实施方案中，启动子是包含与SEQ ID NO:462具有至少85％同一性的核酸序列的启动子组。在本文的各方面和实施方案中的一个实施方案中，启动子是包含与SEQ ID NO:467具有至少85％同一性的核酸序列的启动子组。在本文的各方面和实施方案中的一个实施方案中，启动子是包含与SEQ ID NO:470具有至少85％同一性的核酸序列的启动子组。在本文的各方面和实施方案中的一个实施方案中，启动子是包含与SEQ ID NO:470具有至少90％同一性的核酸序列的启动子组。在本文的各方面和实施方案中的一个实施方案中，启动子是包含与SEQID NO:470具有至少95％同一性的核酸序列的启动子组。
在一个实施方案中，ceDNA载体还包含增强子。在一个实施方案中，增强子包含与SEQ ID NO:449-461中的任一者和/或表8A中列出的序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:449-461中的任一者和/或表8A中列出的序列或者由它们组成。在一个实施方案中，增强子选自由丝氨酸蛋白酶抑制剂增强子、3xHNF1-4_ProEnh_10mer和5xHNF1_ProEnh_10mer组成的组。在一个实施方案中，增强子包含与SEQ ID NO:450具有至少85％同一性的核酸序列。在一个实施方案中，增强子包含与SEQ ID NO:586具有至少85％同一性的核酸序列。在一个实施方案中，增强子包含与SEQ IDNO:587具有至少85％同一性的核酸序列。
在一个实施方案中，ceDNA载体还包含一个或多个内含子。在一个实施方案中，所述一个或多个内含子包含与SEQ ID NO:509-516和1000中的任一者和/或表11A中列出的序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:509-516和1000中的任一者和/或表11A中列出的序列或者由它们组成。在一个实施方案中，所述一个或多个内含子是小鼠微小病毒(MVM)。
在一个实施方案中，ceDNA载体包含3'非翻译区(3'UTR)。在一个实施方案中，3'UTR包含与SEQ ID NO:517-525中的任一者和/或表12中列出的序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:517-525中的任一者和/或表12中列出的序列或者由它们组成。
在一个实施方案中，ceDNA载体包含5'非翻译区(5'UTR)。在一个实施方案中，5'UTR包含与SEQ ID NO:482-508中的任一者和/或表10中列出的序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，包含SEQ ID NO:482-508中的任一者和/或表10中列出的序列或者由它们组成。
在一个实施方案中，ceDNA载体包含至少一个polyA序列。
在一个实施方案中，VD启动子包含SERP增强子。在一个实施方案中，VD启动子包含3xSERP增强子。
在一个实施方案中，启动子是TTR肝启动子，并且ceDNA还包含MVM内含子。
在一个实施方案中，ceDNA载体包含与选自由以下组成的组的核酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列、包含选自由以下组成的组的核酸序列或者由选自由以下组成的组的核酸序列组成：SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:199、SEQ IDNO:200、SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:210、SEQ IDNO:211、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:541、SEQ ID NO:542、SEQ ID NO:543、SEQ ID NO:544、SEQ ID NO:545、SEQ ID NO:546、SEQ ID NO:547、SEQ ID NO:548、SEQ IDNO:549、SEQ ID NO:550、SEQ ID NO:551、SEQ ID NO:552、SEQ ID NO:553、SEQ ID NO:554、SEQ ID NO:555、SEQ ID NO:556、SEQ ID NO:557、SEQ ID NO:558、SEQ ID NO:559、SEQ IDNO:560、SEQ ID NO:561、SEQ ID NO:562、SEQ ID NO:563、SEQ ID NO:564、SEQ ID NO:565、SEQ ID NO:566、SEQ ID NO:567、SEQ ID NO:570、SEQ ID NO:571、SEQ ID NO:572、SEQ IDNO:573、SEQ ID NO:574、SEQ ID NO:575、SEQ ID NO:576、SEQ ID NO:577、SEQ ID NO:578、SEQ ID NO:579、SEQ ID NO:580、SEQ ID NO:581、SEQ ID NO:582、SEQ ID NO:583和SEQ IDNO:584。
在一个实施方案中，所述至少一个核酸序列是PAH的cDNA。
在一个实施方案中，至少一个ITR包含功能末端解析位点(TRS)和Rep结合位点。在一个实施方案中，所述ITR中的一个或两个来自病毒，所述病毒选自细小病毒、依赖病毒和腺相关病毒(AAV)。在一个实施方案中，侧接ITR是对称的或不对称的。在一个实施方案中，侧接ITR是对称的或基本上对称的。在一个实施方案中，侧接ITR是不对称的。在一个实施方案中，所述ITR中的一个或两个是野生型的，或者其中两个ITR都是野生型的。在一个实施方案中，侧接ITR来自不同病毒血清型。在一个实施方案中，侧接ITR来自表2中所示的一对病毒血清型。在一个实施方案中，所述ITR中的一个或两个包含选自表3、表5A、表5B或表6中的序列的序列。
在一个实施方案中，所述ITR中的至少一个由野生型AAV ITR序列通过影响ITR的整体三维构象的缺失、添加或取代而变成。在一个实施方案中，所述ITR中的一个或两个源自选自以下的AAV血清型：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。
在一个实施方案中，所述ITR中的一个或两个是合成的。在一个实施方案中，所述ITR中的一个或两个不是野生型的ITR，或者其中两个ITR都不是野生型的。
在一个实施方案中，所述ITR中的一个或两个通过在选自A、A'、B、B'、C、C'、D和D'的至少一个ITR区域中的缺失、插入和/或取代而被修饰。在一个实施方案中，缺失、插入和/或取代导致通常由A、A'、B、B'、C或C'区域形成的茎-环结构的全部或一部分缺失。
在一个实施方案中，所述ITR中的一个或两个通过缺失、插入和/或取代而被修饰，所述缺失、插入和/或取代导致通常由B和B'区域形成的茎-环结构的全部或一部分缺失。在一个实施方案中，所述ITR中的一个或两个通过缺失、插入和/或取代而被修饰，所述缺失、插入和/或取代导致通常由C和C'区域形成的茎-环结构的全部或一部分缺失。在一个实施方案中，所述ITR中的一个或两个通过缺失、插入和/或取代而被修饰，所述缺失、插入和/或取代导致通常由B和B'区域形成的茎-环结构的一部分和/或通常由C和C'区域形成的茎-环结构的一部分缺失。在一个实施方案中，所述ITR中的一个或两个在通常包含由B和B'区域形成的第一茎-环结构以及由C和C'区域形成的第二茎-环结构的区域中包含单个茎-环结构。在一个实施方案中，所述ITR中的一个或两个在通常包含由B和B'区域形成的第一茎-环结构以及由C和C'区域形成的第二茎-环结构的区域中包含单个茎和两个环。
在一个实施方案中，所述ITR中的一个或两个在通常包含由B和B'区域形成的第一茎-环结构以及由C和C'区域形成的第二茎-环结构的区域中包含单个茎和单个环。
在一个实施方案中，两个ITR以使得当ITR相对于彼此呈反向时产生整体三维对称性的方式改变。
在一个实施方案中，ceDNA载体包含与SEQ ID NO:382-440或SEQ ID NO:1011-1015具有至少90％同一性的核酸序列。在一个实施方案中，ceDNA载体包含与SEQ ID NO:382-440或SEQ ID NO:1011-1015具有至少95％同一性的核酸序列。在一个实施方案中，ceDNA载体包含与SEQ ID NO:382-440或SEQ ID NO:1011-1015具有至少96％同一性的核酸序列。在一个实施方案中，ceDNA载体包含与SEQ ID NO:382-440或SEQ ID NO:1011-1015具有至少97％同一性的核酸序列。在一个实施方案中，ceDNA载体包含与SEQ ID NO:382-440或SEQ ID NO:1011-1015具有至少98％同一性的核酸序列。在一个实施方案中，ceDNA载体包含与SEQ ID NO:382-440或SEQ ID NO:1011-1015具有至少99％同一性的核酸序列。
在另一方面，本文公开了一种在细胞中表达PAH蛋白的方法，该方法包括使细胞内与本文所公开的ceDNA载体接触。在一个实施方案中，细胞是感光细胞或RPE细胞。在一个实施方案中，使细胞在体外或体内接触。
在另一方面，本文公开了一种治疗患有苯丙酮尿症(PKU)的受试者的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的ceDNA载体。在一个实施方案中，编码至少一种PAH蛋白的至少一个核酸序列选自与表1A中所示的序列中的任何序列具有至少90％同一性的序列。在一个实施方案中，与施用前受试者的血清苯丙氨酸水平相比，受试者表现出至少约50％的血清苯丙氨酸水平降低。在一个实施方案中，与施用前的PAH活性水平相比，受试者表现出施用后至少约10％的PAH活性增加。
在一个实施方案中，ceDNA载体被配制在脂质纳米粒子中。在一个实施方案中，将ceDNA载体静脉内施用。在一个实施方案中，将ceDNA载体肌内施用。在一个实施方案中，将ceDNA载体通过输注施用。
在另一方面，本文公开了一种包含ceDNA载体的药物组合物。
在另一方面，本文公开了一种包含ceDNA载体和脂质的组合物。在一个实施方案中，脂质是脂质纳米粒子(LNP)。
在另一方面，本文公开了一种试剂盒，该试剂盒包括本文所公开的ceDNA载体、本文所公开的药物组合物或本文所公开的组合物。在一个实施方案中，试剂盒包括使用说明书。
下文进一步详细描述本公开的这些和其他方面。
附图说明
本专利或申请文件含有至少一张彩色附图。在请求并支付必要的费用后，官方将会提供带有彩色附图的本专利或专利申请公布的副本。
通过参考在附图中描绘的本公开的例示性实施方案，可以理解上面简要概述并且在下面更详细论述的本公开的实施方案。但是，附图仅示出了本公开的典型实施方案，因此不应视为对范围的限制，因为本公开可以允许其他等效的实施方案。
图1A提供了AAV2的野生型左ITR(SEQ ID NO:52)的T形茎-环结构，以及A-A'臂、B-B'臂、C-C'臂、两个Rep结合位点(RBE和RBE')的标识，并且还显示了末端解链位点(TRS)。RBE含有一连串4个双链体四聚体，它们被认为与Rep 78或Rep 68相互作用。另外，RBE'也被认为与在所述构建体中的野生型ITR或突变的ITR上装配的Rep复合物相互作用。D和D'区含有转录因子结合位点和其他保守结构。图1B显示了所提出的Rep催化的在野生型左ITR(SEQID NO:53)中产生的切割和接合活性，所述野生型左ITR包括AAV2的野生型左ITR的T形茎-环结构以及A-A'臂、B-B'臂、C-C'臂、两个Rep结合位点(RBE和RBE')的标识，并且还显示了末端解析位点(TRS)以及包含若干转录因子结合位点和另一保守结构的D和D'区域。
图2A提供了野生型左AAV2 ITR(SEQ ID NO:54)的A-A'臂的含RBE部分以及C-C'和B-B'臂的一级结构(多核酸序列)(左)和二级结构(右)。图2B显示了左ITR的示例性突变ITR(也称为经修饰的ITR)序列。显示的是示例性突变左ITR(ITR-1，左)(SEQ ID NO:113)的A-A'臂的RBE部分、C臂和B-B'臂的一级结构(左)和预测的二级结构(右)。图2C显示了野生型右AAV2 ITR(SEQ ID NO:55)的A-A'环的含RBE部分以及B-B'和C-C'臂的一级结构(左)和二级结构(右)。图2D显示了示例性右修饰ITR。显示的是示例性突变右ITR(ITR-1，右)(SEQ IDNO:114)的A-A'臂的含RBE部分、B-B'和C臂的一级结构(左)和预测的二级结构(右)。可以如本文所教示，使用左ITR和右ITR的任何组合(例如，AAV2 ITR或其他病毒血清型ITR或合成ITR)。图2A-图2D的多核苷酸序列中的每一个是指在用于产生如本文所述的ceDNA的质粒或杆粒/杆状病毒基因组中所用的序列。图2A-图2D每一个中还包含从质粒或杆粒/杆状病毒基因组中的ceDNA载体构型推断出的相应ceDNA二级结构以及预测的吉布斯自由能(Gibbsfree energy)值。
图3A为绘示了用于制造感染杆状病毒的昆虫细胞(BIIC)的上游过程的示意图，所述细胞可用于在图3B的示意图中所描述的过程中产生本文所公开的用于表达PAH的ceDNA载体。图3B是ceDNA产生的一种示例性方法的示意图，图3C示出了证实ceDNA载体产生的一种生化方法和过程。图3D和图3E是描述了用于鉴定从在图3B的ceDNA产生过程期间获得的细胞集结粒收获的DNA中ceDNA的存在的过程的示意图。图3D显示未切割或用限制性核酸内切酶消化并然后在天然凝胶或变性凝胶上进行电泳的示例性ceDNA的示意性预期色带。最左边的示意图是天然凝胶，并显示多个色带，表明以其双链体和未切割形式的ceDNA以至少单体和二聚体状态存在，可看到呈迁移较快的较小单体和迁移较慢的二聚体，二聚体的大小是单体的两倍。左起第二个示意图显示，当用限制性核酸内切酶切割ceDNA时，原始色带消失并出现了迁移较快(例如较小)的色带，与切割后剩余的预期片段大小相对应。在变性条件下，原始双链体DNA是单链的，并且因为互补链是共价连接的，所以作为两倍于天然凝胶上观察到的大小的物种进行迁移。因此，在右起第二个示意图中，经过消化的ceDNA展示出与在天然凝胶上观察到的相似的带分布，但所述带作为其天然凝胶对应物大小的两倍的片段进行迁移。最右边的示意图显示，在变性条件下未切割的ceDNA作为单链开环进行迁移，因此观察到的色带是在不开环的天然条件下观察到的色带大小的两倍。在此图中，“kb”用于指示核苷酸分子的相对大小，取决于背景，其基于核苷酸链长(例如，对于在变性条件下观察到的单链分子)或碱基对数量(例如，对于在天然条件下观察到的双链分子)。图3E显示了具有不连续结构的DNA。ceDNA可以通过在ceDNA载体上具有单个识别位点的限制性核酸内切酶切割，并在中性和变性两种条件下产生两个大小不同(1kb和2kb)的DNA片段。图3E还示出了具有线性且连续结构的ceDNA。所述ceDNA载体可被限制性核酸内切酶切割，并产生两个DNA片段，所述片段在中性条件下以1kb和2kb迁移，但在变性条件下，链保持连接并产生以2kb和4kb迁移的单链。
图4是用核酸内切酶(用于ceDNA构建体1和2的EcoRI；用于ceDNA构建体3和4的BamH1；用于ceDNA构建体5和6的SpeI；以及用于ceDNA构建体7和8的XhoI)进行(+)或不进行(-)消化的ceDNA载体的变性凝胶电泳示例的示例性图片。构建体1-8描述于国际专利申请号PCT/US18/49996的实施例1中，该专利申请全文以引用方式并入本文。确定了用星号突出显示的色带的大小，并提供在图片的底部。
图5A-图5E是描绘实施例6所述的实验结果的图。包含已进行密码子优化的PAH核酸序列的ceDNA载体(ceDNA412；hPAH_codop_ORF_v2)或包含已进行密码子优化的PAH核酸序列的ceDNA载体(ceDNA1530；hPAH-r5-s29)与3xHS-CRM8_SERP_增强子、TTR-启动子-d5pUTR和MVM_内含子对苯丙氨酸浓度(“PHEμM”)的校正的影响在各个小鼠中以0.5μg和5μg流体动力学剂量进行评估，历时21天。
图6A-图6B是描绘实施例7所述的实验结果的图。包含已进行密码子优化的PAH核酸序列的ceDNA载体(ceDNA412、ceDNA1132、ceDNA1274和ceDNA1527)对苯丙氨酸浓度(“PHEμM”)的校正的影响在各个小鼠中以0.5μg和5μg流体动力学剂量进行评估，并且每组中所有五只小鼠的平均校正示于图6A-图6B的图中。对照动物中的PHE浓度未降低(PAHenu2：媒介物)。
图7A-图7G是描绘实施例7所述的各个小鼠的实验结果的图。
图8A-图8B是描绘实施例8所述的实验结果的图。7天后，包含已进行密码子优化的PAH核酸序列的ceDNA载体(ceDNA1416、ceDNA1428和ceDNA1528、ceDNA1414)对苯丙氨酸浓度(“PHEμM”)的校正的影响在各个小鼠中以0.5μg和5μg流体动力学剂量进行评估，并且每组中所有五只小鼠的平均校正示于图8A-图8B的图中。对照动物中的PHE浓度未降低(PAHenu2：媒介物)。
图9A-图9E是描绘实施例8所述的实验结果的图。7天后，包含已进行密码子优化的PAH核酸序列的ceDNA载体(ceDNA1416、ceDNA1428、ceDNA1414和ceDNA1528)对苯丙氨酸浓度(“PHEμM”)的校正的影响在各个小鼠中以0.5μg流体动力学剂量进行评估。
图10A-图10E是描绘实施例8所述的实验结果的图。7天后，包含已进行密码子优化的PAH核酸序列的ceDNA载体(ceDNA1416、ceDNA1428、ceDNA1414和ceDNA1528)对苯丙氨酸浓度(“PHEμM”)的校正的影响在各个小鼠中以5μg流体动力学剂量进行评估。
图11A-图11B是描绘实施例8所述的实验结果的图。28天后，包含已进行密码子优化的PAH核酸序列的ceDNA载体(ceDNA1416、ceDNA1428、ceDNA1414和ceDNA1528)对苯丙氨酸浓度(“PHEμM”)的校正的影响在各个小鼠中以0.5μg和5μg流体动力学剂量进行评估，并且每组中所有五只小鼠的平均校正示于图11A-图11B的图中。对照动物中的PHE浓度未降低(PAHenu2：媒介物)。
图12A-图12E是描绘实施例8所述的实验结果的图。28天后，包含已进行密码子优化的PAH核酸序列的ceDNA载体(ceDNA1416、ceDNA1428、ceDNA1414和ceDNA1528)对苯丙氨酸浓度(“PHEμM”)的校正的影响在各个小鼠中以0.5μg流体动力学剂量进行评估。
图13A-图13E是描绘实施例8所述的实验结果的图。28天后，包含已进行密码子优化的PAH核酸序列的ceDNA载体(ceDNA1416、ceDNA1428、ceDNA1414和ceDNA1528)对苯丙氨酸浓度(“PHEμM”)的校正的影响在各个小鼠中以5μg流体动力学剂量进行评估。
图14A-图14I是描绘实施例8所述的实验结果的图。7天后，包含已进行密码子优化的PAH核酸序列的ceDNA载体(ceDNA412、ceDNA1430、ceDNA1432、ceDNA1473、ceDNA1474、ceDNA1436、ceDNA1471、ceDNA1472)对苯丙氨酸浓度(“PHEμM”)的校正的影响在各个小鼠中以5μg流体动力学剂量进行评估。
图15A-图15I是描绘实施例9所述的实验结果的图。28天后，包含已进行密码子优化的PAH核酸序列的ceDNA载体(ceDNA412、ceDNA1476、ceDNA1479、ceDNA1939、ceDNA1940、ceDNA1941、ceDNA1942、ceDNA1943、ceDNA1944)对血清苯丙氨酸水平(“PHEμM”)的校正的影响在各个小鼠中以0.5μg流体动力学剂量进行评估。
图16A-图16D是描绘实施例10所述的实验结果的图。28天后，包含已进行密码子优化的PAH核酸序列的ceDNA载体(ceDNA412、ceDNA1939、ceDNA1955、ceDNA62)对血清苯丙氨酸水平(“PHEμM”)的校正的影响在各个小鼠中以0.5μg流体动力学剂量进行评估。
图17A-图17H是描绘实施例11所述的实验结果的图。28天后，包含已进行密码子优化的PAH核酸序列的ceDNA载体(ceDNA412、ceDNA2409、ceDNA2410、ceDNA2415、ceDNA2418、ceDNA2416、ceDNA2419、ceDNA2420)对血清苯丙氨酸水平(“PHEμM”)的校正的影响在各个小鼠中以0.5μg流体动力学剂量进行评估。
图18A-图18D是描绘实施例11所述的实验结果的图。28天后，包含已进行密码子优化的PAH核酸序列的ceDNA载体(ceDNA2415、ceDNA2418)对血清苯丙氨酸水平(“PHEμM”)的校正的影响在各个小鼠中以0.1μg流体动力学剂量进行评估。
图19A-图19F是描绘实施例12所述的实验结果的图。28天后，包含已进行密码子优化的PAH核酸序列的ceDNA载体(ceDNA412、ceDNA34、ceDNA36、ceDNA41、ceDNA42、ceDNA43)对血清苯丙氨酸水平(“PHEμM”)的校正的影响在各个小鼠中以0.5μg流体动力学剂量进行评估。
图20A和图20B是将内含子示例性插入PAH CDS的示意图。在PAH CDS的内含子1的天然位置处插入具有功能性剪接供体和受体位点的嵌合PAH内含子。衍生自PAH cDNA序列的内含子侧接区(33bp)代替PAH CDS中的经密码子优化的序列。附图公开了SEQ ID NO:1022。
图21是将内含子示例性插入PAH CDS的示意图。在PAH CDS的内含子1的天然位置处插入具有功能性剪接供体和受体位点的嵌合PAH内含子。改变内含子剪接位点侧接区域的序列以更好地匹配共有序列。附图按出现顺序分别公开了SEQ ID NO:1023和1024。
具体实施方式
本文提供了使用包含编码PAH治疗蛋白或其片段的一种或多种经密码子优化的核酸的ceDNA载体治疗苯丙酮尿症(PKU)的方法。本文还提供了如本文所述的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体，该ceDNA载体包含编码PAH蛋白或其片段的一种或多种经密码子优化的核酸。本公开的一个令人惊讶的发现是，当与特定顺式作用元件(例如，特异性启动子和/或调节元件)组合时，编码PAH治疗蛋白或其片段的经密码子优化的核酸提供受试者中苯丙氨酸水平的最佳校正(例如，表达和持续时间)。
根据一些实施方案，苯丙氨酸水平的最佳校正是能治疗有效地治疗由苯丙氨酸羟化酶(PAH)缺陷引起的疾病或病症的水平。如本公开所述，包含经密码子优化的序列的构建体表现得比天然hPAH cDNA序列显著更好，并且包含经密码子优化的序列和特定顺式作用元件的某些构建体显示出扩展的表达和苯丙氨酸水平的校正。在一些实施方案中，PAH蛋白的表达可以包括治疗蛋白从表达它的细胞中分泌出来，或者在一些实施方案中，表达的PAH蛋白可以在表达它的细胞内起作用或发挥作用(例如发挥其作用)。在一些实施方案中，ceDNA载体在受试者的肝脏、肌肉(例如，骨骼肌)或其他身体部位中表达PAH蛋白，其可以充当PAH治疗蛋白生产和分泌到许多全身性腔室的储槽。
I.定义
除非本文另有定义，否则结合本申请使用的科学和技术术语应具有本公开所属领域的普通技术人员通常所了解的含义。应理解，本公开不限于本文所描述的特定方法、方案和试剂等，并且因此可以变化。本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而无意于限制本公开的范围，本公开的范围仅由权利要求书限定。免疫学和分子生物学中常用术语的定义可见于The Merck Manual of Diagnosis and Therapy，第19版，Merck SharpDohme Corp.出版，2011(ISBN 978-0-911910-19-3)；Robert S.Porter等人(编)，FieldsVirology，第6版，由Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,PA,USA出版(2013)，Knipe,D.M.和Howley,P.M.(编)，The Encyclopedia of Molecular Cell Biology andMolecular Medicine，由Blackwell Science Ltd.出版，1999-2012(ISBN9783527600908)；以及Robert A.Meyers(编)，Molecular Biology and Biotechnology:aComprehensive Desk Reference，由VCH Publishers,Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)；Werner Luttmann的Immunology，由Elsevier出版，2006；Janeway'sImmunobiology,Kenneth Murphy,Allan Mowat,Casey Weaver(编)，Taylor&FrancisLimited，2014(ISBN 0815345305，9780815345305)；Lewin′s Genes XI，由Jones&BartlettPublishers出版，2014(ISBN-1449659055)；Michael Richard Green and JosephSambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第4版，Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,USA(2012)(ISBN 1936113414)；Davis等人，Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier Science Publishing,Inc.,NewYork,USA(2012)(ISBN 044460149X)；Laboratory Methods in Enzymology:DNA,JonLorsch(编)Elsevier,2013(ISBN 0124199542)；Current Protocols in MolecularBiology(CPMB),Frederick M.Ausubel(编)，John Wiley and Sons,2014(ISBN047150338X，9780471503385)，Current Protocols in Protein Science(CPPS),John E.Coligan(编辑)，John Wiley and Sons,Inc.，2005；以及Current Protocols inImmunology(CPI)(John E.Coligan,ADA M Kruisbeek,David HMargulies,Ethan MShevach,Warren Strobe(编)John Wiley and Sons,Inc.,2003(ISBN 0471142735，9780471142737)，这些文献的内容均全文以引用方式并入本文。
如本文所用，术语“施用(administration/administering)”及其变化形式是指将组合物或药剂(例如，如本文所述的治疗性核酸或免疫抑制剂)引入受试者中并且包括同时和依序引入一种或多种组合物或药剂。“施用”可以指例如，治疗、药代动力学、诊断、研究、安慰剂以及实验方法。“施用”还涵盖体外和离体治疗。将组合物或药剂引入受试者中是通过任何适合的途径，包括经口、经肺、经鼻、肠胃外(静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下)、经直肠、淋巴内、瘤内或局部。通过电穿孔将组合物或药剂引入受试者中。施用包括自我施用和由另一个人施用。可以通过任何适合的途径进行施用。适合的施用途径使得组合物或药剂执行其预期功能。例如，如果合适的途径是静脉内，则通过将组合物或药剂引入受试者的静脉中来施用组合物。
如本文所用，短语“核酸治疗性”、“治疗性核酸”和“TNA”可互换地使用，并且是指使用核酸作为治疗疾病或病症的治疗剂的活性组分的治疗的任何模态。如本文所用，这些短语是指基于RNA的治疗剂和基于DNA的治疗剂。基于RNA的治疗剂的非限制性示例包括mRNA、反义RNA和寡核苷酸、核酶、适体、干扰RNA(RNAi)、切丁酶-底物dsRNA、小发夹RNA(shRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、引导RNA(gRNA)和微RNA(miRNA)。基于DNA的治疗剂的非限制性示例包括小环DNA、小基因、病毒DNA(例如，慢病毒或AAV基因组)或非病毒合成DNA载体、封闭端线性双链体DNA(ceDNA/CELiD)、质粒、杆粒、doggybone(dbDNATM)DNA载体、简约的免疫学定义的基因表达(MIDGE)-载体、非病毒辅助DNA载体(线性共价封闭DNA载体)或哑铃形DNA最小载体(“哑铃DNA”)。
如本文所用，治疗剂(诸如PAH治疗蛋白或其片段)的“有效量”或“治疗有效量”是足以产生所需效果的量，例如提供疾病改善水平的PAH酶，引起矫正性PAH酶在肝中持久表达，恢复尿素循环功能苯丙氨酸代谢，和/或实现适当药理学水平的有缺陷的酶。用于测量目标基因或目标序列的表达的适合的分析包括例如使用所属领域的技术人员已知的技术检查蛋白质或RNA水平，所述技术如斑点印迹、北方印迹法、原位杂合、ELISA、免疫沉淀、酶功能以及所属领域的技术人员已知的表型分析。然而，剂量水平是基于多种因素，包括损伤类型、年龄、体重、性别、患者的医学病状、病状的严重程度、施用途径和所采用的特定活性剂。因此，剂量方案可以在很大范围内变化，但可以由医生使用标准方法常规地确定。另外，术语“治疗量”、“治疗有效量”和“药学上有效量”包括所描述的本公开的组合物的防治或预防量。在所描述的本公开的防治性或预防性应用中，以足以消除或降低疾病、病症或病状的风险、减轻严重程度或延迟发病的量向易患有疾病、病症或病状或以其他方式处于疾病、病症或病状风险中的患者施用药物组合物或药剂，所述疾病、病症或病状包括疾病、病症或病状的生物化学、组织学和/或行为症状，其并发症和在疾病、病症或病状的发展期间呈现的中间病理学表型。通常优选使用最大剂量，即，根据一些医学判断的最高安全剂量。根据一些实施方案，疾病、障碍或病症是PKU。术语“剂量(dose/dosage)”在本文中可互换地使用。
如本文所用，术语“治疗效果”是指治疗的结果，其结果被判定为合乎需要并且有益的。治疗效果可以直接或间接地包括疾病表现的遏制、减少或消除。治疗效果还可以直接或间接地包括疾病表现的进展的遏制减少或消除。
对于本文所描述的任何治疗剂，治疗有效量可以初始地根据初步的体外研究和/或动物模型来确定。治疗有效剂量也可以根据人数据来确定。可以基于相对生物利用度和施用的化合物的效力调节施用剂量。基于上述方法和其他熟知的方法调整剂量以实现最大功效在普通技术人员的能力内。下文总结了用于测定治疗有效性的一般原理，其可见于Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics，第10版，McGraw-Hill(New York)(2001)的第1章，该文献以引用方式并入本文。
药代动力学原理为修改剂量方案以获得期望程度的治疗功效并且具有最小的不可接受的副作用提供了基础。在可以测量药物的血浆浓度并且与治疗窗口有关的情况下，可以获得针对剂量修改的另外的指导。
如本文所用，术语“异源核苷酸序列”和“转基因”可互换使用，并且是指并入如本文公开的ceDNA载体中并可以由其递送和表达的所关注的核酸(除编码衣壳多肽的核酸外)。在一个实施方案中，编码至少一种PAH蛋白的至少一个核酸序列是异源核酸序列。
如本文所用，术语“表达盒”和“转录盒”可互换使用，并且是指一段线性核酸，其包括与一个或多个启动子或足以引导转基因转录的其他调节序列可操作地连接的转基因，但是不包含衣壳编码序列、其他载体序列或反向末端重复区域。表达盒可以另外包含一个或多个顺式作用序列(例如启动子、增强子或阻遏子)、一个或多个内含子和一个或多个转录后调节元件。
本文可互换使用的术语“多核苷酸”和“核酸”是指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合物形式。因此，该术语包括单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交物、或包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然、化学或生物化学修饰的、非天然的或衍生化的核苷酸碱基的聚合物。“寡核苷酸”通常是指单链或双链DNA的约5至约100个核苷酸之间的多核苷酸。然而，出于本公开的目的，寡核苷酸的长度没有上限。寡核苷酸也称为“寡聚物(oligomer)”或“oligo”，并且可以从基因中分离出来，或通过所属领域已知的方法化学合成。应当了解，术语“多核苷酸”和“核酸”包括单链(诸如有义或反义)和双链多核苷酸(如果所描述的实施方案适用的话)。DNA可以呈例如反义分子、质粒DNA、DNA-DNA双链体、预缩合DNA、PCR产物、载体(P1、PAC、BAC、YAC、人工染色体)、表达盒、嵌合序列、染色体DNA或这些组的衍生物和组合的形式。DNA可以呈小环、质粒、杆粒、小基因、辅助DNA(线性共价封闭DNA载体)、封闭端线性双链体DNA(CELiD或ceDNA)、doggybone(dbDNATM)DNA、哑铃形DNA、简约的免疫学定义的基因表达(MIDGE)-载体、病毒载体或非病毒载体的形式。RNA可以呈小干扰RNA(siRNA)、切丁酶-底物dsRNA、小发夹RNA(shRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)、mRNA、gRNA、rRNA、tRNA、病毒RNA(vRNA)以及它们的组合的形式。核酸包括含有已知核苷酸类似物或经修饰主链残基或键的核酸，它们是合成的、天然存在的和非天然存在的，并且具有与参考核酸相似的结合特性。所述类似物和/或经修饰残基的示例包括但不限于硫代磷酸酯、磷酰二胺吗啉代寡聚体(吗啉代)、氨基磷酸酯、膦酸甲酯、手性膦酸甲酯、2'-O-甲基核糖核苷酸、锁核酸(LNATM)和肽核酸(PNA)。除非特别限定，否则该术语涵盖含有天然核苷酸已知类似物的核酸，其具有与参考核酸相似的结合特性。除非另有说明，特定核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、SNP和互补序列以及明确指出的序列。
如本文所使用的，“核苷酸”含有糖脱氧核苷(DNA)或核糖(RNA)、碱基和磷酸酯基。核苷酸通过磷酸酯基连接在一起。
“碱基”包括嘌呤和嘧啶，所述嘌呤和嘧啶进一步包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷和天然类似物，以及嘌呤和嘧啶的合成衍生物，其包括但不限于放置新的反应性基团(诸如但不限于胺、醇、硫醇、羧化物和烷基卤化物)的修饰。
如本文所用，术语“干扰RNA”或“RNAi”或“干扰RNA序列”包括当干扰RNA在与目标基因或序列相同的细胞中时能够减少或抑制目标基因或序列的表达(例如，通过介导与干扰RNA序列互补的mRNA的降解或抑制与干扰RNA序列互补的mRNA的翻译)的单链RNA(例如，成熟的miRNA、ssRNAi寡核苷酸、ssDNAi寡核苷酸)、双链RNA(即，双螺旋RNA，诸如siRNA、切丁酶-底物dsRNA、shRNA、aiRNA或前miRNA)、DNA-RNA杂交物(参见例如，国际专利申请公布WO 2004/078941)或DNA-DNA杂交物(参见例如，PCT公布WO 2004/104199)。因此，干扰RNA是指与目标mRNA序列或与由两条互补链或由一条单一自身互补链形成的双链RNA互补的单链RNA。干扰RNA可能与目标基因或序列具有实质或完全同一性，或可能包括错配区域(即，错配基序)。干扰RNA的序列可对应于全长目标基因或其子序列。优选地，干扰RNA分子是化学合成的。出于所有目的，将每个上述专利文件的公开内容全文以引用方式并入本文。
干扰RNA包括“小干扰RNA”或“siRNA”，例如长度为约15-60个、15-50个或15-40个(双螺旋)核苷酸，更通常地长度为约15-30个、15-25个或19-25个(双螺旋)核苷酸的干扰RNA，并且优选地长度为约20-24个、21-22个或21-23个(双螺旋)核苷酸(例如，双链siRNA的每个互补序列的长度为15-60个、15-50个、15-40个、15-30个、15-25个或19-25个核苷酸，优选地长度为约20-24个、21-22个或21-23个核苷酸，并且双链siRNA的长度为约15-60个、15-50个、15-40个、15-30个、15-25个或19-25个碱基对，优选地长度为约18-22个、19-20个或19-21个碱基对)。siRNA双螺旋可包含约1个至约4个核苷酸或约2个至约3个核苷酸的3'突出端和5'磷酸末端。siRNA的示例包括但不限于由两个单独的链分子组装的双链多核苷酸分子，其中一条链是有义链，另一条链是互补反义链；由单链分子组装的双链多核苷酸分子，其中有义区和反义区通过基于核酸或非基于核酸的接头连接；具有发夹二级结构的双链多核苷酸分子，其具有自互补的有义区和反义区；以及环状单链多核苷酸分子，其具有两个或更多个环结构和具有自互补的有义区和反义区的茎，其中环状多核苷酸可被体内或体外加工以产生活性双链siRNA分子。如本文所用，术语“siRNA”包括RNA-RNA双螺旋以及DNA-RNA杂交物(参见，例如，PCT公开号WO 2004/078941，全文以引用方式并入本文)。
如本文所使用的，术语“核酸构建体”是指单链或双链的核酸分子，其是从天然基因中分离的，或者以自然界中不另外存在或合成的方式进行修饰以含有核酸的节段。当核酸构建体包含表达本公开的编码序列所需的控制序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。“表达盒”包括可操作地连接至启动子的DNA编码序列。
“可杂交的”或“互补的”或“基本上互补的”意指核酸(例如RNA)包括使其能够在体外和/或体内适当的温度和溶液离子强度的条件下与另一核酸序列以序列特异性的反向平行方式(即，核酸特异性地结合互补核酸)非共价结合，即形成沃森-克里克碱基对(Watson-Crick base pair)和/或G/U碱基对、“退火”或“杂交”的核苷酸序列。如所属领域已知的，标准的沃森-克里克碱基对包含：腺嘌呤(A)与胸苷(T)配对，腺嘌呤(A)与尿嘧啶(U)配对，以及鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)配对。另外，在所属领域中还已知对于两个RNA分子(例如dsRNA)之间的杂交，鸟嘌呤(G)碱基与尿嘧啶(U)配对。例如，在与mRNA中的密码子进行tRNA反密码子碱基配对的情况下，G/U碱基配对部分负责遗传密码的简并性(即，冗余)。在本公开的上下文中，靶向主题DNA的RNA分子的蛋白质结合区段(dsRNA双链体)的鸟嘌呤(G)被认为与尿嘧啶(U)互补，反之亦然。这样，当可以在靶向主题DNA的RNA分子的蛋白质结合节段(dsRNA双链体)的给定核苷酸位置形成G/U碱基对时，所述位置不被认为是非互补的，而是被认为是互补的。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，是指任何长度的氨基酸的聚合物形式，其可以包含编码和非编码的氨基酸、经过化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸和具有修饰的肽主链的多肽。
“编码”特定PAH蛋白的DNA序列为转录到特定RNA和/或蛋白质中的DNA核酸序列。DNA多核苷酸可以编码被翻译成蛋白质的RNA(mRNA)，或者DNA多核苷酸可以编码未被翻译成蛋白质的RNA(例如，tRNA、rRNA或靶向DNA的RNA；也称为“非编码”RNA或“ncRNA”)。
如本文所用，如本文所用的术语“融合蛋白”是指包含来自至少两种不同蛋白质的蛋白质域的多肽。例如，融合蛋白可包含(i)PAH或其片段和(ii)至少一种非GOI蛋白。本文中涵盖的融合蛋白包括但不限于抗体、或与PAH蛋白融合的抗体的Fc或抗原结合片段，例如受体、配体、酶或肽的胞外域。作为融合蛋白的一部分的PAH蛋白或其片段可以为单特异性抗体或双特异性抗体或多特异性抗体。
如本文所用，术语“基因组安全港基因”或“安全港基因”是指可以插入核酸序列以使得所述序列可以以可预测的方式整合和起作用(例如表达所关注蛋白质)且对内源基因活性没有明显的负面影响或不促进癌症的基因或基因座。在一些实施方案中，安全港基因也是可有效地表达所插入的核酸序列并且表达水平比非安全港位点高的基因座或基因。
如本文所用，术语“基因递送”意指将外来DNA转移到宿主细胞中以施加基因疗法的方法。
如本文所用，术语“末端重复”或“TR”包括任何包含至少一个最低需要的复制起点和包含回文发夹结构的区域的病毒末端重复或合成序列。Rep结合序列(“RBS”)(也称为RBE(Rep结合元件))和末端解链位点(“TRS”)共同构成“最低需要的复制起点”，并且因此TR包括至少一个RBS和至少一个TRS。在给定的一段多核苷酸序列内彼此是反向互补序列的TR通常各自被称为“反向末端重复”或“ITR”。在病毒的背景下，ITR介导复制、病毒包装、整合和原病毒拯救。正如在本文的公开中意外发现的，在全长上不是反向互补序列的TR仍然可以执行ITR的传统功能，因此术语ITR在本文中用于指ceDNA基因组或ceDNA载体中能够介导ceDNA载体复制的TR。所属领域的普通技术人员将了解，在复杂的ceDNA载体构型中，可以存在超过两个ITR或不对称的ITR对。ITR可以是AAV ITR或非AAV ITR，或可以来源于AAV ITR或非AAV ITR。例如，ITR可以源自于细小病毒科，其涵盖细小病毒和依赖病毒(例如犬细小病毒、牛细小病毒、小鼠细小病毒、猪细小病毒、人细小病毒B-19)，或可以将充当SV40复制起点的SV40发夹用作ITR，其可以通过截断、取代、缺失、插入和/或添加而被进一步修饰。细小病毒科病毒由两个亚科组成：感染脊椎动物的细小病毒亚科(Parvovirinae)以及感染无脊椎动物的浓核病毒亚科(Densovirinae)。依赖病毒属包含腺相关病毒(AAV)的病毒家族，其能够在脊椎动物宿主中复制，所述宿主包括但不限于人、灵长类动物、牛、犬、马和羊物种。本文中为了方便起见，将位于ceDNA载体中表达盒的5’(上游)的ITR称为“5’ITR”或“左ITR”，并将位于ceDNA载体中表达盒的3’(下游)的ITR称为“3’ITR”或“右ITR”。
“野生型ITR”或“WT-ITR”是指AAV或其他依赖病毒中天然存在的ITR序列的序列，其保留例如Rep结合活性和Rep切口产生能力。由于遗传密码的简并性或漂移，来自任何AAV血清型的WT-ITR的核苷酸序列可能与典型的天然存在的序列略有不同，因此，本文涵盖使用的WT-ITR序列包括由于在产生过程中发生的天然存在的变化(例如，复制误差)而产生的WT-ITR序列。
如本文所用，术语“基本上对称的WT-ITR”或“基本上对称的WT-ITR对”是指单个ceDNA基因组或ceDNA载体内的一对WT-ITR，它们都是在整个长度上具有反向互补序列的野生型ITR。例如，ITR即使具有一个或多个偏离典型的天然存在的序列的核苷酸，只要变化并不影响所述序列的特性和整体三维结构，所述ITR也可以被认为是野生型序列。在一些方面，偏离的核苷酸代表保守的序列变化。作为一个非限制性示例，序列与典型序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性(例如使用默认设置下的BLAST所测量)，并且还与另一个WT-ITR具有对称的三维空间组构，使得它们的3D结构在几何空间中具有相同的形状。基本上对称的WT-ITR在3D空间中具有相同的A、C-C'和B-B'环。通过确定具有与合适的Rep蛋白配对的可操作的Rep结合位点(RBE或RBE')和末端解离位点(TRS)，可以在功能上将基本上对称的WT-ITR确认为WT。可以任选地测试其他功能，包括在许可条件下的转基因表达。
如本文所使用的，短语“经修饰ITR(modified ITR/mod-ITR)”或“突变ITR”在本文中可互换使用，并且是指与来自相同血清型的WT-ITR相比在至少一个或多个核苷酸中具有突变的ITR。所述突变可以引起ITR中的A、C、C'、B、B'区中的一个或多个发生变化，并且可以使得三维空间组构(即，其几何空间中的3D结构)相较于相同血清型的WT-ITR的3D空间组构发生变化。
如本文所使用的，术语“不对称ITR”也称为“不对称ITR对”，是指单个ceDNA基因组或ceDNA载体内在全长上不反向互补的一对ITR。作为一个非限制性示例，不对称的ITR与其同源ITR不具有对称的三维空间组构，使得其3D结构在几何空间中具有不同的形状。换句话说，不对称的ITR对具有不同的整体几何结构，即它们在3D空间中具有不同的A、C-C'和B-B'环组织(例如，一个ITR与同源ITR相比可能具有短的C-C'臂和/或短的B-B'臂)。两个ITR之间的序列差异可能是由于一个或多个核苷酸添加、缺失、截断或点突变引起的。在一个实施方案中，不对称ITR对中的一个ITR可以是野生型AAV ITR序列，另一个ITR是如本文定义的经修饰的ITR(例如，非野生型或合成ITR序列)。在另一个实施方案中，不对称ITR对中的ITR皆不是野生型AAV序列，并且两个ITR是在几何空间中具有不同形状的经修饰的ITR(即，不同的整体几何结构)。在一些实施方案中，不对称ITR对中的一个经修饰ITR可具有短C-C'臂，而另一个ITR可具有不同的修饰(例如，单臂或短B-B'臂等)，使得它们与同源不对称经修饰ITR相比具有不同的三维空间组构。
如本文所用，术语“对称ITR”是指在单个ceDNA基因组或ceDNA载体内的、为野生型或突变型(例如相对于野生型被修饰的)依赖病毒ITR序列并且在其全长上反向互补的一对ITR。在一个非限制性示例中，两个ITR都是来自AAV2的野生型ITR序列。在另一个实施方案中，这两个ITR皆不是野生型ITR AAV2序列(即，它们是经修饰的ITR，也称为突变型ITR)，并且由于核苷酸添加、缺失、取代、截断或点突变而在序列上与野生型ITR不同。本文中为了方便起见，将位于ceDNA载体中表达盒的5’(上游)的ITR称为“5’ITR”或“左ITR”，并将位于ceDNA载体中表达盒的3’(下游)的ITR称为“3’ITR”或“右ITR”。
如本文所使用的，术语“基本上对称的修饰ITR”或“基本上对称的经修饰ITR对”是指单个ceDNA基因组或ceDNA载体中的一对修饰ITR，它们在其全长上具有反向互补序列。例如，经修饰的ITR即使具有一些偏离反向互补序列的核苷酸序列，但只要变化不影响特性和整体形状，也可以认为其是基本上对称的。作为一个非限制性示例，序列与典型序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性(如使用默认设置下的BLAST所测量)，并且还与其同源经修饰的ITR具有对称的三维空间组构，使得其3D结构在几何空间中具有相同的形状。换句话说，基本上对称的经修饰的ITR对具有在3D空间中组织的相同的A、C-C'和B-B'环。在一些实施方案中，来自经修饰的ITR对的ITR可具有不同的反向互补核苷酸序列，但仍具有相同的对称三维空间组构，即两个ITR都具有产生相同的整体3D形状的突变。例如，经修饰的ITR对中的一个ITR(例如5'ITR)可以来自一种血清型，而另一个ITR(例如3'ITR)可以来自不同血清型，然而，两者均能够具有相同的相应突变(例如，如果5'ITR在C区域中具有缺失，则来自不同血清型的经修饰的同源3'ITR在C'区域中的相应位置具有缺失)，使得经修饰的ITR对具有相同的对称三维空间组构。在此类实施方案中，经修饰的ITR对中的每个ITR可以来自不同血清型(例如，AAV1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12)，诸如AAV2与AAV6的组合，其中一个ITR中的修饰反映在来自不同血清型的同源ITR中的对应位置中。在一个实施方案中，基本上对称的经修饰的ITR对是指一对经修饰的ITR(mod-ITR)，只要ITR之间的核苷酸序列的差异不影响特性或整体形状并且其在3D空间中具有基本上相同的形状即可。作为非限制性示例，如通过本领域中熟知的标准方法诸如默认设置下的BLAST(基本局部比对搜索工具)或BLASTN所测量，mod-ITR与典型的mod-ITR具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且还具有对称的三维空间组构，使得其3D结构在几何空间中的形状相同。基本上对称的经修饰ITR对在3D空间中具有相同的A、C-C'和B-B'环，例如，如果基本上对称的经修饰ITR对中的经修饰的ITR缺失C-C'臂，那么同源经修饰ITR对应缺失C-C'环，并且还具有在其同源经修饰ITR的几何空间中呈相同形状的剩余A和B-B’环的类似3D结构。
术语“侧接”是指一个核酸序列相对于另一核酸序列的相对位置。一般来讲，在序列ABC中，B与A和C侧接。这同样适用于AxBxC布置。因此，侧接序列在所侧接的序列之前或之后，但不必与所侧接的序列相邻或紧邻。在一个实施方案中，术语侧接是指在线性双链体ceDNA载体的每个末端处的末端重复序列。
如本文所用，术语“治疗(treat/treating/treatment)”包括减轻、基本上抑制、减缓或逆转病状的进展，基本上改善病状的临床症状或基本上预防病状的临床症状的出现，获得有益或期望的临床结果。根据一些实施方案，病症是PKU。治疗还指完成以下一项或多项：(a)降低病症的严重程度；(b)限制所治疗病症的特征性症状的发展；(c)限制所治疗病症的特征性症状的恶化；(d)限制病症在先前患有该病症的患者中的复发；以及(e)限制先前对于病症无症状的患者的症状复发。有益或期望的临床结果诸如药理学和/或生理学作用包括但不限于预防可能易患有疾病、病症或病状但尚未经历或展现疾病的症状的受试者出现所述疾病、病症或病状(防治性治疗)；缓解所述疾病、病症或病状的症状；减轻所述疾病、病症或病状的程度；稳定所述疾病、病症或病状(即，不恶化)；预防所述疾病、病症或病状的扩散；延迟或减缓所述疾病、病症或病状进展；改善或缓和所述疾病、病症或病状；以及它们的组合，以及与如果不接受治疗所预期的存活期相比，延长存活期。
如本文所用，术语“增加”、“增强”、“提高”(以及类似术语)通常是指相对于自然条件、预期条件或平均条件、或者相对于对照条件直接地或间接地增加浓度、水平、功能、活性或行为的作用。
如本文所用，术语“最小化”、“减少”、“降低”和/或“抑制”(以及类似术语)通常是指直接或间接地降低相对于自然条件、预期条件或平均条件，或相对于对照条件的浓度、水平、功能、活动或行为的行为。
如本文所使用的，术语“ceDNA基因组”是指还并入了至少一个反向末端重复区域的表达盒。ceDNA基因组还可以包括一个或多个间隔区。在一些实施方案中，所述ceDNA基因组作为DNA的分子间双链体多核苷酸并入质粒或病毒基因组中。
如本文所使用的，术语“ceDNA间隔区”是指分隔ceDNA载体或ceDNA基因组中的功能元件的间插序列。在一些实施方案中，ceDNA间隔区将两个功能元件保持在对于最优功能性来说所期望的距离上。在一些实施方案中，ceDNA间隔区提供或增加了ceDNA基因组在例如质粒或杆状病毒内的遗传稳定性。在一些实施方案中，ceDNA间隔区通过提供克隆位点等的便利位置，促进ceDNA基因组的就绪遗传操作。例如，在某些方面，含有若干限制性核酸内切酶位点的寡核苷酸“多接头”或设计成不具有已知蛋白质(例如转录因子)结合位点的非开放阅读框序列可定位于ceDNA基因组中以分离顺式作用因子，例如将2聚体、3聚体、5聚体、6聚体、10聚体、11聚体、12聚体、18聚体、24聚体、30聚体、48聚体、86聚体、176聚体等插入末端解链位点与上游转录调节元件之间。类似地，可以在聚腺苷酸化信号序列和3'-末端解链位点之间并入间隔区。
如本文所用，术语“Rep结合位点”、“Rep结合元件”、“RBE”和“RBS”可互换使用并且是指Rep蛋白(例如AAV Rep 78或AAV Rep 68)的结合位点，其在Rep蛋白结合后允许Rep蛋白在并入了所述RBS的序列上发挥其位点特异性核酸内切酶活性。RBS序列和其反向互补序列一起形成单个RBS。RBS序列是本领域已知的，并且包含例如5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ ID NO:60)，这是在AAV2中鉴定的RBS序列。在本公开的实施方案中可以使用任何已知的RBS序列，包括其他已知的AAV RBS序列和其他天然已知的或合成的RBS序列。不受理论的束缚，据信Rep蛋白的核酸酶结构域与双螺旋核苷酸序列GCTC结合，因此所述两个已知的AAV Rep蛋白直接结合并稳定地组装在双螺旋寡核苷酸5'-(GCGC)(GCTC)(GCTC)(GCTC)-3'(SEQ ID NO:60)上。另外，可溶性聚集性构象异构体(即，数目未定的相互缔合的Rep蛋白)解离并结合到含有Rep结合位点的寡核苷酸。每个Rep蛋白都与每个链上的含氮碱基和磷酸二酯骨架相互作用。与含氮碱基的相互作用提供序列特异性，而与磷酸二酯主链的相互作用是非序列特异性的或较少序列特异性的，并稳定了蛋白质-DNA复合物。
如本文所使用，术语“末端解链位点”和“TRS”在本文中可互换使用并且指一个区域，在所述区域Rep与5'胸苷形成酪氨酸-磷酸二酯键，从而产生3'OH，其充当用于通过细胞DNA聚合酶，例如DNA polδ或DNA polε进行DNA延伸的底物。另选地，Rep-胸苷复合物可以参与配位接合反应。在一些实施方案中，TRS最低限度地涵盖非碱基配对的胸苷。在一些实施方案中，TRS的切口产生效率可以至少部分地由其在同一分子内距RBS的距离来控制。当受体底物是互补ITR时，所产生的产物是分子内双螺旋。TRS序列在所属领域中已知，并且包括例如5'-GGTTGA-3'(SEQ ID NO:61)，AAV2中所鉴定的六核苷酸序列。本公开的实施方案中可以使用任何已知的TRS序列，包括其他已知的AAV TRS序列和其他天然已知的或合成的TRS序列，诸如AGTT(SEQ ID NO:62)、GGTTGG(SEQ ID NO:63)、AGTTGG(SEQ ID NO:64)、AGTTGA(SEQ ID NO:65)和其他基序如RRTTRR(SEQ ID NO:66)。
如本文所用，术语“ceDNA-质粒”是指一种包含作为分子间双链体的ceDNA基因组的质粒。
如本文所使用的，术语“ceDNA-杆粒”是指一种包括作为分子间双链体的ceDNA基因组的感染性杆状病毒基因组，其能够作为质粒在大肠杆菌中增殖，因此可以作为杆状病毒的穿梭载体操作。
如本文所用，术语“ceDNA-杆状病毒”是指一种在杆状病毒基因组内包含作为分子间双链体的ceDNA基因组的杆状病毒。
如本文所用，术语“ceDNA-杆状病毒感染的昆虫细胞”和“ceDNA-BIIC”可互换使用，是指被ceDNA-杆状病毒感染的无脊椎动物宿主细胞(包括但不限于昆虫细胞(例如Sf9细胞))。
如本文所用，术语“ceDNA”是指用于非病毒基因转移、合成或其他目的的无衣壳封闭端线性双链(ds)双螺旋DNA。ceDNA的详细描述描述于2017年3月3日提交的PCT/US2017/020828的国际申请中，所述申请的全部内容以引用方式明确地并入本文。使用基于细胞的方法产生包括各种反向末端重复(ITR)序列和构型的ceDNA的某些方法描述于2018年9月7日提交的国际专利申请PCT/US18/49996和2018年12月6日提交的PCT/US2018/064242的实施例1中，所述申请中的每一个全文以引用方式并入本文。用于产生包括各种ITR序列和构型的合成ceDNA载体的某些方法描述于例如，2019年1月18日提交的国际申请PCT/US2019/14122中，所述申请的全部内容以引用方式并入本文。
如本文所用，术语“封闭端DNA载体”是指具有至少一个共价封闭端的无衣壳DNA载体，其中所述载体的至少一部分具有分子内双链体结构。
如本文所使用的，术语“ceDNA载体”与“ceDNA”可互换地使用并且指包括至少一个末端回文结构的末端封闭式DNA载体。在一些实施方案中，ceDNA包含两个共价封闭端。
如本文所使用的，术语“neDNA”或“带切口的ceDNA”是指在开放阅读框(例如，待表达的启动子和转基因)上游的茎区或间隔区5'中具有1-100个碱基对的切口或间隙的封闭端DNA。
如本文所用，术语“间隙”和“切口”可互换地使用，并且是指本公开的合成DNA载体的中断部分，其在另外双链ceDNA中产生单链DNA部分的延伸。在双链体DNA的一个链中，间隙的长度可以是1个碱基对到100个碱基对。由本文所描述的方法以及由所述方法产生的合成载体设计和产生的典型间隙的长度可以是例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60bp。本公开中的示例性间隙的长度可以是1bp到10bp、1bp到20bp、1bp到30bp。
如本文中所定义，“报告体”是指可用于提供可检测的读出数的蛋白质。报告体通常产生可测量的信号，例如荧光、颜色或发光。报告蛋白编码序列编码在细胞或生物体中的存在易于观察到的蛋白质。例如，荧光蛋白当被特定波长的光激发时会导致细胞发荧光，荧光素酶引起细胞催化产生光的反应，以及如β-半乳糖苷酶的酶将底物转化为有色产物。可用于实验或诊断目的的示例性报告多肽包括但不限于β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶(AP)、胸苷激酶(TK)、绿色荧光蛋白(GFP)和其他荧光蛋白、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶和其他在所属领域中公知的报告多肽。
如本文所用，术语“有义”和“反义”是指多核苷酸上结构元件的取向。元件的有义和反义型式彼此反向互补。
如本文所用，术语“合成AAV载体”和“AAV载体的合成产生”是指在完全无细胞环境中的AAV载体和其合成产生方法。
如本文所用，“报告子”是指可用于提供可检测的读出数的蛋白质。报告体通常产生可测量的信号，例如荧光、颜色或发光。报告蛋白编码序列编码在细胞或生物体中的存在易于观察到的蛋白质。例如，荧光蛋白当被特定波长的光激发时会导致细胞发荧光，荧光素酶引起细胞催化产生光的反应，以及如β-半乳糖苷酶的酶将底物转化为有色产物。可用于实验或诊断目的的示例性报告多肽包括但不限于β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶(AP)、胸苷激酶(TK)、绿色荧光蛋白(GFP)和其他荧光蛋白、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶和其他在所属领域中公知的报告多肽。
如本文所用，术语“效应蛋白”是指一种提供可检测的读出数的多肽，例如作为报告多肽，或更适当地，作为杀伤细胞的多肽，例如毒素，或致使细胞易用所选作用剂或因缺乏所选作用剂而被杀伤的作用剂。效应蛋白包括直接靶向或损害宿主细胞的DNA和/或RNA的任何蛋白质或肽。例如，效应子蛋白可以包含但不限于：靶向宿主细胞DNA序列(无论是基因组的还是在染色体外元件上的)的限制性核酸内切酶；降解细胞存活所必需的多肽目标的蛋白酶；DNA旋转酶抑制剂；以及核糖核酸酶型毒素。在一些实施方案中，由如本文所描述的合成生物回路控制的效应子蛋白表达可作为一个因子参与另一个合成生物回路，从而扩大了生物回路系统反应性的范围和复杂度。
转录调节因子是指活化或抑制感兴趣的基因转录的转录活化子和抑制因子，例如PAH。启动子是启动特定基因转录的核酸区域。转录活化因子通常在附近与转录启动子结合并募集RNA聚合酶来直接启动转录。阻遏子与转录启动子结合，并在空间上阻碍RNA聚合酶启动转录。其他转录调节子可取决于它们的结合位置以及细胞和环境条件来充当活化子或阻遏子。转录调节子类别的非限制性示例包括但不限于同源域蛋白、锌指蛋白、翼状螺旋(叉头)蛋白和亮氨酸拉链蛋白。
如本文所使用的，“阻遏蛋白”或“诱导蛋白”是与调节序列元件结合并分别阻遏或活化与调节序列元件操作性连接的序列的转录的蛋白质。如本文所描述的优选阻遏和诱导蛋白对至少一种输入剂或环境输入物的存在或不存在敏感。如本文所描述的优选蛋白质是模块的形式，包括例如可分离的DNA结合和输入剂结合或反应元件或结构域。
如本文所使用的，“载剂(carrier)”包含任何和所有的溶剂、分散介质、媒介物、包衣、稀释剂、抗细菌和抗真菌剂、等张和吸收延迟剂、缓冲液、载剂溶液、悬液、胶体等。此类介质和药剂用于药学上活性物质的用途是所属领域熟知的。补充性活性组分也可以并入组合物中。短语“药学上可接受的”是指当施用宿主时不会产生毒性、过敏性或类似的不良反应的分子实体和组合物。
如本文所用，“输入剂反应结构域”是转录因子的一个结构域，其以致使连接的DNA结合融合结构域对条件或输入剂的存在作出反应的方式与所述条件或输入剂结合或以其他方式作出反应。在一个实施方案中，条件或输入剂的存在导致输入剂反应结构域或其融合的蛋白质发生构象变化，从而改变转录因子的转录调制活性。
术语“体内”是指在生物体，如多细胞动物中或内部进行的分析或过程。在本文描述的一些方面中，当使用单细胞生物例如，细菌时，可以说方法或用途是在“体内”发生的。术语“离体”是指使用在多细胞动物体或植物体之外的具有完整膜的活细胞进行的方法和用途，所述活细胞例如外植体、培养细胞(包括原代细胞和细胞系)、转化的细胞系、以及提取的组织或细胞(包括血细胞)等等。术语“体外”是指不需要存在具有完整膜的细胞的分析和方法，如细胞提取物，并且可以指在非细胞系统，如不包含细胞或细胞系统的介质，如细胞提取物中引入可编程的合成生物回路。
如本文所用，术语“启动子”是指通过驱动核酸序列的转录来调节另一核酸序列表达的任何核酸序列，其可以是编码蛋白质或RNA的目标基因，例如异源目标基因。启动子可以是组成型的、诱导型的、阻遏型的、组织特异性的或其任何组合。启动子是核酸序列的控制区域，在所述核酸序列的其余部分的引发和转录速率是受控的。启动子还可以含有可以结合调节蛋白和分子的遗传元件，例如，RNA聚合酶和其他转录因子。在本文所述的方面的一些实施方案中，启动子可以驱动调节启动子本身的表达的转录因子的表达。在启动子序列内将发现转录起始位点，以及负责RNA聚合酶结合的蛋白质结合域。真核启动子将经常但并非总是含有“TATA”框和“CAT”框。各种启动子，包括诱导型启动子，可用于驱动本文所公开的ceDNA载体中转基因的表达。启动子序列可以在其3'末端以转录起始位点为界并且向上游延伸(5'方向)以包括为了在高于背景的可检测水平上引发转录所必需的最少数目个碱基或元件。根据一些实施方案，启动子选自由VD启动子、人α1-抗胰蛋白酶(hAAT)启动子(包括hAAT(979)启动子和CpGmin_hAAT启动子，诸如hAAT_core_C06、hAAT_core_C07、hAAT_core_C08、hAAT_core_C09、hAAT_core_C10或hAAT_core truncated)和运甲状腺素蛋白(TTR)肝特异性启动子(包括最小TTR(TTRm))组成的组。
如本文所使用，术语“增强子”是指结合一种或多种蛋白质(例如，活化蛋白或转录因子)以增加核酸序列的转录活化的顺式作用调节序列(例如，50-1,500个碱基对)。增强子可以位于其所调节的基因起始位点上游或基因起始位点下游最多1,000,000个碱基对处。增强子可以位于内含子区域内，或无关基因的外显子区中。根据一些实施方案，增强子选自由以下组成的组：人来源或其他哺乳动物来源如婴猴或中国树鼩的丝氨酸蛋白酶抑制剂增强子(SerpEnh)、TTR增强子(TTRe)、肝核因子1结合位点(HNF1)、肝核因子4结合位点(HNF4)、人载脂蛋白E/C-I肝特异性增强子(ApoE Enh)、来自前白蛋白基因的增强子区(ProEnh)、CpG最小化的ApoE增强子(例如，如本文所述的ApoE增强子C03、ApoE增强子C04、ApoE增强子C09或ApoE增强子C10)、HCR1 footprint123(嵌入的HCR1 footprint123)、肝核因子增强子阵列(嵌入的增强子HNF阵列)和人载脂蛋白E/C-I肝特异性增强子的衍生物(例如，ApoE Enh v2)。根据一些实施方案，增强子可以是多种(例如，串联重复)单一增强子元件，或不同类型的增强子，如ceDNA1471中的3xHNF1-4_前白蛋白增强子(其中增强子与TTR启动子连接)或5xHNF1_前白蛋白增强子(如ceDNA1473中，其中增强子与TTR启动子连接)。根据一些实施方案，多种增强子诸如HNF1和/或HNF4可以在每两个增强子元件之间含有例如1-20个核苷酸或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸的间隔区。
启动子可以被说成驱动其调节的核酸序列的表达或驱动其转录。短语“操作性地连接”、“操作性定位”、“操作性连接”，“在控制下”和“在转录控制下”指示启动子相对于其调节的核酸序列处于正确的功能位置和/或取向，以控制该序列的转录启动和/或表达。如本文所用，“反向启动子”是指其中核酸序列处于相反的取向，使得编码链现在成为非编码链的启动子，并且反之亦然。反向启动子序列可以在各种实施方案中用于调节开关的状态。另外，在各种实施方案中，启动子可以与增强子结合使用。
启动子可以是与基因或序列天然结合的启动子，如可以通过分离位于编码区段上游的5'非编码序列和/或给定基因或序列的外显子来获得。此类启动子可以称为“内源性的”。类似地，在一些实施方案中，增强子可以是与核酸序列天然相关的增强子，位于所述序列的下游或上游。
在一些实施方案中，编码核酸区段定位在“重组启动子”或“异源启动子”的控制下，所述启动子均指在其天然环境中通常不与其可操作地连接的编码核酸序列关联的启动子。重组或异源增强子是指在天然环境中正常不与给定核酸序列关联的增强子。此类启动子或增强子可包括其他基因的启动子或增强子；由任何其他原核、病毒或真核细胞分离的启动子或增强子；以及非“天然存在”(即，包含不同转录调控区的不同元件和/或通过本领域已知的遗传工程方法改变表达的突变)的合成启动子或增强子。除了通过合成产生启动子和增强子的核酸序列之外，还可以结合本文所公开的合成生物回路和模块，使用重组克隆和/或核酸扩增技术(包括PCR)来产生启动子序列(参见例如美国专利4,683,202、美国专利5,928,906，各自以引用方式并入本文)。此外，经考虑也可以采用指导序列在例如，线粒体、叶绿体等非核细胞器内的转录和/或表达的控制序列。这种重组或异源启动子/增强子的非限制性示例包括具有TTR启动子的丝氨酸蛋白酶抑制剂增强子(称为“Vandendriessche启动子”(VD)或Vandendriesche(VD)启动子组，参见例如美国专利10149914，该专利以引用方式并入本文)或具有TTR启动子的3X丝氨酸蛋白酶抑制剂增强子(称为“3X VD”启动子组；参见例如美国专利申请公布US 2018/0071406A1，该专利申请以引用方式并入本文)。
在一些实施方案中，启动子可以是启动子组。如本文所用，术语“启动子组”是指包含一个或多个如本文所定义的启动子(或启动子序列)和一个或多个如本文所定义的增强子(或增强子序列)的系统。如本文所用的术语“启动子组”涵盖这样的序列，其中启动子和增强子元件或序列被长度为约1-50个核苷酸(例如，约2、5、7、8、10、11、12、13、15、17、18、20、22、23、25、27、28、30、32、33、35、37、38、40、42、43、45、47、48或50个核苷酸)的间隔区或序列分开。
本文可互换使用的术语“DNA调节序列”、“控制元件”和“调节元件”是指提供和/或调节非编码序列(例如靶向DNA的RNA)或编码序列(例如定点修饰多肽或Cas9/Csn1多肽)的转录和/或调节所编码多肽的翻译的转录和翻译控制序列，诸如启动子、增强子、聚腺苷酸化信号、终止子、蛋白质降解信号等。
“可操作地连接”是指一种并置，其中所描述的组分处于允许它们以预期方式起作用的关系中。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，那么所述启动子可操作地连接到所述编码序列。“表达盒”包括DNA序列，例如异源DNA序列，其可操作地连接到启动子或足以引导转基因在ceDNA载体中转录的其他调节序列。合适的启动子包括例如，组织特异性启动子。启动子也可以是AAV起源的。
如本文所使用，术语“受试者”是指向其提供用本公开的ceDNA载体进行的治疗，包括预防性治疗的人类或动物。通常，动物为脊椎动物，例如但不限于灵长类动物、啮齿动物、家养动物或猎获的动物。灵长类动物包括但不限于黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴，例如恒河猴。啮齿动物包括小鼠、大鼠、旱獭、雪貂、兔和仓鼠。家养和野生动物包括但不限于：牛、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫科物种如家猫、犬科物种如狗、狐狸、狼、禽类物种如鸡、鸸鹋、鸵鸟，以及鱼如鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼。在本文所述方面的某些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如灵长类动物或人。受试者可以是雄性或雌性。另外，受试者可以是婴儿或儿童。在一些实施方案中，受试者可以是新生儿或未出生的受试者，例如，受试者还在子宫内。优选地，受试者是哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实施方案。人以外的哺乳动物可以有利地用作代表疾病和病症的动物模型的受试者。另外，本文所描述的方法和组合物可以用于家养动物和/或宠物。人类受试者可以是任何年龄、性别、种族或人种群组，例如，高加索人(白人)、亚洲人、非洲人、黑人、非裔美国人、非裔欧洲人、西班牙人、中东人等。在一些实施方案中，受试者可以是临床环境中的患者或其他受试者。在一些实施方案中，受试者已进行治疗。在一些实施方案中，受试者是胚胎、胎儿、新生儿、婴儿、儿童、青少年或成人。在一些实施方案中，受试者是人类胎儿、人类新生儿、人类婴儿、人类儿童、人类青少年或人类成人。在一些实施方案中，受试者是动物胚胎，或非人类胚胎或非人类灵长类动物胚胎。在一些实施方案中，受试者是人胚胎。
如本文所用，术语“宿主细胞”包括易于被本公开的核酸构建体或ceDNA表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。作为非限制性示例，宿主细胞可以是分离的原代细胞、多能干细胞、CD34+细胞、诱导的多能干细胞或许多永生化细胞系(例如HepG2细胞)中的任何一种。另选地，宿主细胞可以是组织、器官或生物体中的原位或体内细胞。
术语“外源”是指存在于除天然来源外的细胞中的物质。当在本文中使用时，术语“外源”可以指已经通过涉及人手的过程被引入如细胞或生物体的生物系统中的核酸(例如，编码多肽的核酸)或多肽，通常在所述细胞或生物体中未发现所述核酸或多肽，并且希望将核酸或多肽引入此类细胞或生物体中。另选地，“外源”可以指已经通过涉及人手的过程被引入如细胞或生物体的生物系统中的核酸或多肽，在所述细胞或生物体中发现核酸或多肽的量相对较低，并且希望增加细胞或生物体中核酸或多肽的量，例如，以产生异位表达或水平。与此相反，术语“内源”是指对于生物系统或细胞而言天然的物质。
术语“序列同一性”是指两个核酸序列之间的相关性。出于本公开的目的，使用如在EMBOSS软件包的Needle程序(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，Rice等人，2000，同上)，优选版本3.0.0或更高版本中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，同上)确定两个脱氧核糖核酸序列之间的序列一致性程度。使用的任选参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)替换矩阵。标记为“最长一致性”的Needle的输出(使用-nobrief选项获得)用作一致性百分比，并按以下计算：(相同的脱氧核糖核苷酸乘以100)/(比对长度-比对空位总数)。比对的长度优选为至少10个核苷酸、优选为至少25个核苷酸、更优选为至少50个核苷酸并且最优选为至少100个核苷酸。
如本文所用，术语“同源性”或“同源”被定义为，在比对序列且必要时引入空位以实现最大序列同一性百分比之后，与靶染色体上的相应序列中的核苷酸残基相同的核苷酸残基的百分比。出于确定核酸序列同源性百分比的比对可以用所属技术领域中的各种方式来实现，例如使用公开可用的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ClustalW2或Megalign(DNASTAR)软件。所属领域的技术人员可以确定用于比对序列的合适参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。在一些实施方案中，当同源臂的例如核酸序列(例如DNA序列)与宿主细胞的相应原生或未经编辑的核酸序列(例如基因组序列)具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更多同一性时，所述序列被视为“同源”。
如本文所用，术语“异源”意指分别在天然核酸或蛋白质中未发现的核酸或多肽序列。异源核酸序列可以与天然存在的核酸序列(或其变异体)连接(例如通过基因工程)以产生编码嵌合多肽的嵌合核酸序列。异源核酸序列可以连接到变异多肽(例如通过基因工程改造)以产生编码融合变异多肽的核酸序列。
“载体”或“表达载体”为可以与另一DNA区段，即“插入片段”附接以便使所附接的区段在细胞中复制的复制子，例如质粒、杆粒、噬菌体、病毒、病毒粒子或粘质体。载体可以是设计用于递送到宿主细胞或用于在不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。如本文所用，载体在起源和/或最终形式上可以是病毒或非病毒的，但是出于本公开的目的，“载体”通常是指ceDNA载体，如本文所用。术语“载体”涵盖与适当的控制元件结合时能够复制并且可以将基因序列转移至细胞的任何遗传元件。在一些实施方案中，载体可以是表达载体或重组载体。
如本文所用，术语“表达载体”是指引导RNA或多肽从与载体上的转录调节序列连接的序列的表达的载体。表达的序列通常但不一定与细胞异源。表达载体可以包括其他元件，例如，表达载体可以具有两个复制系统，从而使其可以在两种生物体中维持，例如，在人类细胞中进行表达，以及在原核宿主中进行克隆和扩增。术语“表达”是指涉及产生RNA和蛋白质以及适当时分泌蛋白质的细胞过程，在适用时包括但不限于例如转录、转录物加工、翻译和蛋白质折叠、修饰和加工。“表达产物”包括从基因转录的RNA和通过翻译从基因转录的mRNA所获得的多肽。术语“基因”意指当与适当的调节序列可操作地连接时在体外或在体内转录为RNA的核酸序列(DNA)。基因可以包括或可以不包括编码区前后的区域，例如5'非翻译(5'UTR)或“前导”序列和3'UTR或“尾区”序列，以及单个编码区段(外显子)之间的插入序列(内含子)。
“重组载体”意指包含能够在体内表达的核酸序列如异源核酸或“转基因”的载体。应当了解，在一些实施方案中，本文所述的载体可以与其他合适的组合物和疗法组合。在一些实施方案中，载体是游离型的。合适的游离型载体的使用提供了一种以高拷贝数的染色体外DNA维持受试者中的所关注核苷酸，从而消除染色体整合的潜在影响的方式。
如本文所用的短语“遗传性疾病”是指部分或完全、直接或间接地由基因组中的一种或多种异常引起的疾病，尤其是从出生起出现的病状。异常可以是突变、插入或缺失。异常可能影响基因的编码序列或其调节序列。遗传疾病可以是(但不限于)PKU、DMD、血友病、囊肿性纤维化、亨廷顿氏舞蹈病、家族性高胆固醇血症(LDL受体缺陷)、肝母细胞瘤、威尔逊氏疾病(Wilson's disease)、先天性肝卟啉症(hepatic porphyria)、遗传性肝代谢病症、勒什尼汗综合症(Lesch Nyhan syndrome)、镰状细胞贫血、地中海贫血、着色性干皮病、范克尼氏贫血(Fanconi's anemia)、色素性视网膜炎、共济失调毛细血管扩张症、布鲁氏综合症、视网膜母细胞瘤，和泰伊-萨克斯二氏病(Tay-Sachs disease)。
如本文所使用的，术语“包括(comprising/comprises)”在提及组合物、方法以及对所述方法或组合物来说必不可少的其相应组分时使用，但对于包括未指明的要素，无论是否必要，仍然是开放的。
如本文所用，术语“基本上由……组成”是指给定实施方案所需的那些要素。所述术语允许存在不实质影响所述实施方案的基本和新颖或功能性特征的要素。“包含”的使用表示包含而不是限制。
术语“由……组成”是指如本文所描述的组合物、方法和其相应组分，其排除在所述实施方案的描述中未叙述的任何要素。
如本文所用，术语“基本上由……组成”是指给定实施方案所需的那些要素。该术语允许存在不实质影响本发明的那个实施方案的一种或多种基本和新颖或功能特征的另外要素。
如本说明书和所附权利要求书所用，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一种/一个(a/an)”和“所述”包含多个提及物。因此，例如，提到“方法”包括本文所描述的和/或在阅读本公开等之后对于所属领域技术人员而言将变得显而易见的类型的一个或多个方法和/或步骤。类似地，除非上下文另有明确规定，否则单词“或”旨在包括“和”。尽管与本文所描述的方法和材料相似或等效的那些方法和材料可以用于实施或测试本公开，但在下文描述适合的方法和材料。缩写“例如(e.g.)”衍生自拉丁文exempli gratia，并且在本文中用以指示非限制性示例。因此，缩写“例如(e.g.)”与术语“例如(for example)”同义。
本文所公开的本公开的另选要素或实施方案的分组不应视为限制。每个组成员可以单独提及和要求，或以与所述组的其他成员或本文存在的其他要素的任何组合提及和要求。出于方便和/或可专利性的原因，一个组中的一个或多个成员可以包括在一个组中或从中删除。当发生任何这样的包括或删除时，在本文中认为说明书含有修改的组，从而满足所附权利要求书中使用的所有马库什组(Markush group)的书面描述。
在任何方面的一些实施方案中，本文描述的公开内容不涉及克隆人的方法、用于修饰人的种系遗传身份的方法、用于工业或商业目的的人胚胎的使用、或用于修饰动物的基因身份，可能导致其遭受痛苦而对人或动物没有任何实质性医学益处的方法，以及由这类方法产生的动物。
其他术语在本文中限定于本公开的各个方面的描述内。
本申请全文中引用的所有专利和其他出版物；包括参考文献、授权专利、公布的专利申请和共同未决的专利申请；以引用方式明确并入本文，以描述和公开例如在此类出版物中描述的可以与本文所述的技术结合使用的方法。提供这些出版物仅仅是出于其在本申请的提交日期之前的公开内容而提供。关于这一点，任何内容都不应被解释为承认发明者无权借助先前公开或出于任何其他原因而提前所述公开。关于这些文件的日期的所有声明或关于内容的陈述都是基于申请人可获得的信息，并且不等同于承认这些文件的日期或内容的正确性。
本公开的实施方案的描述并非旨在穷举或将本公开限制于所公开的精确形式。尽管本文出于说明性目的描述了本公开的特定实施方案和实施例，但是如相关领域的技术人员将认识到的，在本公开的范围内可以进行各种等效修改。例如，虽然方法步骤或功能以给定的顺序呈现，但是另选的实施方案可以以不同的顺序执行功能，或者功能可以基本上同时执行。本文提供的本公开的教导可以适当地应用于其他程序或方法。本文描述的各种实施方案可以进行组合以提供其他实施方案。如果需要，可以修改本公开的各方面以采用上述参考文献和申请的组合物、功能和概念来提供本公开的又一实施方案。而且，由于生物学功能等效性的考虑，可以在不影响生物学或化学作用的种类或数量的情况下对蛋白质结构进行一些改变。可以根据详细描述对本公开进行这些和其他改变。意图所有这些修改包括在所附权利要求书的范围内。
任何前述实施方案的特定要素都可以进行组合或替代其他实施方案中的要素。此外，尽管已经在这些实施方案的上下文中描述了与本公开的某些实施方案相关联的优点，但是其他实施方案也可以表现出这样的优点，并且并非所有实施方案都需要为了落入本公开的范围内而表现出这样的优点。
通过以下实施例进一步说明本文所述的技术，这些实施例决不应视为进一步限制。应理解，本公开不限于本文所描述的特定方法、方案和试剂等，并且因此可以变化。本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而无意于限制本公开的范围，本公开的范围仅由权利要求书限定。
II.从封闭端DNA(ceDNA)载体表达PAH蛋白
本文所描述的技术大体上涉及由非病毒DNA载体，例如本文所描述的ceDNA载体在细胞中表达和/或产生PAH蛋白。用于表达PAH蛋白的ceDNA载体描述于本文中的标题为“通用ceDNA载体”的章节中。具体地说，用于表达PAH蛋白的ceDNA载体包含一对ITR(例如对称或不对称的，如本文所述)以及介于所述ITR对之间的编码PAH蛋白的核酸，其中核酸可操作地连接到启动子或调节序列。用于表达PAH蛋白的ceDNA载体相对于传统AAV载体和甚至慢病毒载体的独特优势为对编码期望蛋白的核酸序列不存在大小约束。因此，甚至全长6.8kbPAH蛋白也可以由单个ceDNA载体表达。因此，本文所述的ceDNA载体能够用于在有需要的受试者(例如，患有PKU的受试者)中表达治疗性PAH蛋白。
如人们将了解，本文所描述的ceDNA载体技术可以适于任何复杂程度或可以模块化方式使用，其中可以独立方式控制PAH蛋白的不同组分的表达。例如，特别预期本文中所设计的ceDNA载体技术可以与使用单个ceDNA载体表达单个基因序列(例如PAH蛋白)一样简单，或可以与使用多个ceDNA载体一样复杂，其中每个载体表达各自独立地由不同启动子控制的多个PAH蛋白或相关辅因子或辅助蛋白。本文特别涵盖以下实施方案且所属领域的技术人员能够按需要对其进行调适。
在一个实施方案中，单个ceDNA载体可以用于表达PAH蛋白的单个组分。或者，单个ceDNA载体可以用于在单个启动子(例如强启动子)的控制下，任选地使用(多个)IRES序列表达PAH蛋白的多个组分(例如至少2个)，以确保所述组分中的每一者，例如辅因子或辅助蛋白适当地表达。
根据本公开，对编码人PAH蛋白的核酸进行密码子优化。
所属领域的技术人员能够设想ceDNA载体技术的其他变化形式或能够使用常规载体通过蛋白质产生方法对其进行调适。
A.核酸
本文提供了用于潜在治疗用途的核酸分子的表征和开发。如本文所述，用于治疗用途的核酸编码PAH蛋白，其中核酸是经密码子优化的。在一些实施方案中，在适当情况下描述了出于改变和改善的体内性质(递送、稳定性、寿命、折叠、靶标特异性)以及其与治疗应用直接相关的生物学功能和机制的目的对寡核苷酸进行化学修饰。
可具有免疫刺激作用并需要使用本文所公开的免疫抑制剂的本公开的例示性治疗性核酸可包括但不限于：小基因、质粒、小环、小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、反义寡核苷酸(ASO)、核酶、封闭端双链DNA(例如，ceDNA、CELiD、线性共价封闭DNA(“辅助”)、doggybone(dbDNATM)、前端粒封闭端DNA或哑铃线性DNA)、切丁酶-底物dsRNA、小发夹RNA(shRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、引导RNA(gRNA)、微RNA(miRNA)、mRNA、tRNA、rRNA和DNA病毒载体、病毒RNA载体以及它们的任何组合。
根据一些实施方案，治疗性核酸是封闭端双链DNA，例如ceDNA。根据一些实施方案，细胞中治疗性蛋白质的表达和/或产生来自非病毒DNA载体，例如ceDNA载体。与传统AAV载体甚至慢病毒载体相比，ceDNA载体用于治疗性蛋白质表达的一个明显优势是编码期望蛋白质的核酸序列如异源核酸序列不存在大小约束。因此，即使是大的治疗性蛋白质也可以从单个ceDNA载体中表达出来。因此，ceDNA载体可用于在有需要的受试者中表达治疗性蛋白质。
一般来说，如本文所公开的用于表达治疗性蛋白质的ceDNA载体在5'到3'方向上包含：第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)、所关注的核酸序列(例如本文所述的表达盒)和第二AAV ITR。ITR序列选自以下任一项：(i)至少一个WT ITR和至少一个经修饰的AAV反向末端重复序列(mod-ITR)(例如，不对称的经修饰ITR；(ii)两个经修饰的ITR，其中mod-ITR对相对于彼此具有不同的三维空间组构(例如，不对称的经修饰ITR)；或(iii)对称或基本上对称的WT-WT ITR对，其中每个WT-ITR具有相同的三维空间组构；或(iv)对称或基本上对称的经修饰ITR对，其中每个mod-ITR具有相同的三维空间组构。
在一些实施方案中，编码PAH蛋白的转基因还可以编码分泌序列，使得PAH蛋白被引导到高尔基体(Golgi)设备和内质网，在此PAH蛋白在其穿过ER并且离开细胞时通过伴护分子折叠成正确构象。示例性分泌序列包括但不限于VH-02(SEQ ID NO:88)和VK-A26(SEQID NO:89)和Igκ信号序列(SEQ ID NO:126)，以及允许标记的蛋白质从胞溶质中分泌出来的Gluc分泌信号(SEQ ID NO:188)、将标记的蛋白质引导到高尔基体的TMD-ST分泌序列(SEQ ID NO:189)。
调节开关还可以用于微调PAH蛋白的表达以使得PAH蛋白按期望进行表达，包括但不限于以期望表达水平或量表达PAH蛋白，或者，当存在或不存在特定信号时，包括细胞信号传导事件。例如，如本文所述，当出现特定病状时，可以开启或关闭ceDNA载体对PAH蛋白的表达，如本文中的标题为调节开关的章节中所述。
例如并且仅出于说明的目的，PAH蛋白可以用于关闭不期望的反应，诸如PAH蛋白的过高的产生水平。PAH基因可以含有用于将PAH蛋白带到期望细胞的信号肽标记物。然而，在任一种情况下，都可能期望调节PAH蛋白的表达。ceDNA载体容易适应调节开关的使用。
ceDNA载体相对于传统AAV载体和甚至慢病毒载体的独特优势是，编码PAH蛋白的核酸序列如异源核酸序列不存在大小约束。因此，甚至全长PAH以及任选的任何辅因子或辅助蛋白可以由单个ceDNA载体表达。另外，取决于必要的立体化学，人们可以表达同一PAH蛋白的多个区段，并且可以使用相同或不同启动子，并且还可以使用调节开关来微调每个区域的表达。例如，如实施例中所示，可以使用包含双启动子系统的ceDNA载体，使得不同启动子用于PAH蛋白的每个结构域。使用ceDNA质粒产生PAH蛋白可以包括用于表达PAH蛋白结构域的启动子的独特组合，这引起适当比率的每个结构域用于形成功能性PAH蛋白。因此，在一些实施方案中，ceDNA载体可以单独地(例如，在不同启动子的控制下)用于表达PAH蛋白的不同区域。
在另一个实施方案中，由ceDNA载体表达的PAH蛋白还包含额外功能，诸如荧光、酶活性、分泌信号或免疫细胞活化子。
在一些实施方案中，编码PAH蛋白的ceDNA还可包含例如接头结构域。如本文所使用，“接头结构域”是指长度为约2到100个氨基酸的寡肽或多肽区，其使如本文所描述的PAH蛋白的任一个结构域/区域连接在一起。在一些实施方案中，接头可包括柔性残基(诸如甘氨酸和丝氨酸)或由所述柔性残基构成，使得相邻的蛋白质结构域相对于彼此自由移动。当希望确保两个相邻结构域在空间上彼此无干扰时，可以使用较长接头。接头可以是可裂解的或不可裂解的。可裂解接头的示例包括2A接头(例如T2A)、2A样接头或其功能等效物以及它们的组合。接头可以是来源于明脉扁刺蛾病毒(Thosea asigna virus)的T2A的接头区域。
获取例如PAH等的已知和/或可公开获得的蛋白质序列以及对cDNA序列进行反向工程改造以编码此类蛋白质充分属于本领域的技术人员的能力范围内。然后可以对cDNA进行密码子优化以与预定的宿主细胞匹配，并且插入如本文所述的ceDNA载体中。
B.表达PAH蛋白的ceDNA载体
具有一个或多个编码期望PAH的序列的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可以包含调节序列，例如启动子、分泌信号、polyA区和增强子。至少，ceDNA载体包含编码PAH蛋白的一个或多个核酸序列例如异源核酸序列，其中核酸序列是经密码子优化的。根据一些实施方案，将经密码子优化的核酸与特定的顺式作用元件(例如，特异性启动子和/或特异性增强子)组合以实现最佳的转基因表达和持续时间。
根据一些实施方案，PAH蛋白包含内质网ER前导序列以将其引导至ER，在此发生蛋白质折叠。例如，序列将所表达的蛋白质引导到ER进行折叠。
在一些实施方案中，细胞或细胞外定位信号(例如分泌信号、核定位信号、线粒体定位信号等)包含于ceDNA载体中以引导PAH的分泌或期望亚细胞定位，使得PAH蛋白可以结合到细胞内靶标(例如胞内抗体)或细胞外靶标。
在一些实施方案中，如本文所述的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体允许以模块化方式装配和表达任何期望PAH蛋白。如本文所用，术语“模块化”是指能够轻松地从构建体中去除的ceDNA表达质粒中的元件。
在一些实施方案中，用于表达PAH的ceDNA载体可具有编码全长PAH蛋白的序列。在一些其他实施方案中，用于表达PAH的ceDNA载体可具有编码截短的PAH蛋白的序列。例如，截短的PAH可以在N末端处具有缺失以去除PAH的自我调节区域(例如，全长PAH的氨基酸1-19)。在一个实施方案中，用于表达PAH的ceDNA载体具有氨基酸1-19的N末端截短。
在一些实施方案中，ceDNA载体可具有在功能性PAH的开放阅读框内部具有内含子的PAH序列。在一些其他实施方案中，ceDNA可具有含异源信号序列(SS)的PAH序列。在另一些其他实施方案中，ceDNA可具有带DNA核靶向序列的PAH序列。在另一些其他实施方案中，经密码子优化的PAH的ceDNA载体可具有5'UTR序列。在另一些其他实施方案中，经密码子优化的PAH的ceDNA载体可具有内含子序列。在另一些其他实施方案中，经密码子优化的PAH的ceDNA载体可具有3'UTR序列。在另一些其他实施方案中，经密码子优化的PAH的ceDNA载体可具有一个或多个增强子序列。在另一些其他实施方案中，经密码子优化的PAH的ceDNA载体可具有启动子序列。在另一些其他实施方案中，经密码子优化的PAH的ceDNA载体可具有Kozak序列。在另一些其他实施方案中，经密码子优化的PAH的ceDNA载体可以在两个顺式作用元件(例如，增强子元件)之间或在顺式作用元件与开放阅读框(ORF)之间具有接头/间隔序列。
C.由ceDNA载体表达的示例性PAH蛋白
具体地说，如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可以编码例如用于治疗、预防和/或改善苯丙酮尿症(PKU)的一种或多种症状的PAH蛋白以及其变异体和/或活性片段。在一个方面，苯丙酮尿症(PKU)是人苯丙酮尿症(PKU)。
(i)PAH治疗蛋白及其片段
本公开提供了PAH治疗蛋白或其片段(例如，功能片段)，其由经密码子优化的核酸编码并且在如本文所述的ceDNA载体中且从如本文所述的ceDNA载体表达。本领域技术人员将理解PAH治疗蛋白包括PAH蛋白的所有剪接变体和直向同源物。PAH治疗蛋白包括完整分子及其截短片段(例如，功能性的)。
ceDNA载体相对于传统AAV载体和甚至慢病毒载体的独特优势是，编码期望蛋白质的核酸序列如异源核酸序列不存在大小约束。因此，可以从单个ceDNA载体表达多种全长PAH治疗蛋白。
PAH蛋白和基因：PAH基因位于12q22-q24.2条带中的12号染色体上。截至2000年，在PAH基因中发现了大约400个致病突变。苯丙氨酸羟化酶(PAH)也可称为苯丙氨酸4-单加氧酶、苯丙氨酸-4-羟化酶、Phe-4-单加氧酶、EC 1.14.16.1、EC 1.14.16、PKU1、PKU或PH。
PAH的蛋白质序列如下：Homo sapiens PAH酶翻译(450个氨基酸)，入藏号NM_000277.3。
MSTAVLENPGLGRKLSDFGQETSYIEDNCNQNGAISLIFSLKEEVGALAKVLRLFEENDVNLTHIESRPSRLKKDEYEFFTHLDKRSLPALTNIIKILRHDIGATVHELSRDKKKDTVPWFPRTIQELDRFANQILSYGAELDADHPGFKDPVYRARRKQFADIAYNYRHGQPIPRVEYMEEEKKTWGTVFKTLKSLYKTHACYEYNHIFPLLEKYCGFHEDNIPQLEDVSQFLQTCTGFRLRPVAGLLSSRDFLGGLAFRVFHCTQYIRHGSKPMYTPEPDICHELLGHVPLFSDRSFAQFSQEIGLASLGAPDEYIEKLATIYWFTVEFGLCKQGDSIKAYGAGLLSSFGELQYCLSEKPKLLPLELEKTAIQNYTVTEFQPLYYVAESFNDAKEKVRNFAATIPRPFSVRYDPYTQRIEVLDNTQQLKILADSINSEIGILCSALQK(SEQ ID NO:1025)
PAH主要在肝脏中表达，在肾脏和胆囊中适度表达。在前列腺、肾上腺中也可以检测到低水平的PAH表达。在胎儿发育过程中，PAH可在肾上腺、心脏、肠、肺和胃中表达。因此，可以将表达PAH的ceDNA载体施用于选自以下的任何一种或多种组织：肝脏、肾脏、胆囊、前列腺、肾上腺。在一些实施方案中，当将表达PAH的ceDNA载体施用于婴儿或施用于子宫内的受试者时，可以将表达PAH的ceDNA载体施用于选自以下的任何一种或多种组织：肝脏、肾上腺、心脏、肠、肺和胃。
由ceDNA载体表达PAH治疗蛋白或其片段可以使用一个或多个如本文所述的启动子在空间上和时间上实现。在一些实施方案中，启动子选自由VD启动子、人α1-抗胰蛋白酶(hAAT)启动子(包括hAAT(979)启动子和CpGmin_hAAT启动子)和运甲状腺素蛋白(TTR)肝特异性启动子组成的组。
根据一些实施方案，对编码PAH蛋白的核酸进行密码子优化，并将其插入如本文所述的ceDNA载体中。
如本文所用，术语“经密码子优化的”或“密码子优化”是指通过用如小鼠或人等所关注脊椎动物的基因中使用频率较高或最高的密码子替换天然序列(例如，原核序列)的至少一个、多于一个或大量密码子来修饰核酸序列以增强其在所述脊椎动物的细胞中的表达的过程。各种物种对特定氨基酸的某些密码子表现出特定的偏好。通常，密码子优化不会改变原始翻译蛋白质的氨基酸序列。优化的密码子可以使用例如Aptagen的GENE密码子优化和定制基因合成平台(Aptagen,Inc.,2190Fox Mill Rd.Suite 300,Herndon,Va.20171)或其他公开可用的数据库来确定。在一些实施方案中，编码PAH蛋白的核酸经优化用于人类表达，并且/或者是人类PAH或其功能片段。本文公开了为了ceDNA表达而改变的示例性PAH序列以及各种顺式作用元件。
(ii)表达PAH治疗蛋白的ceDNA载体
如本文所述的ceDNA载体包含编码PAH治疗蛋白或其功能片段的一个或多个经密码子优化的核酸序列如异源核酸序列。在一个实施方案中，ceDNA载体包含编码选自本文的表1A中所示那些的PAH序列的经密码子优化的核酸序列。
表1A：用于治疗PKU的示例性人PAH序列
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表1B.示例性小鼠PAH序列
在一个实施方案中，ceDNA载体包含本文的表1中列出的经密码子优化的人PAH序列。在一个实施方案中，ceDNA载体包含与表1A中所示的序列具有至少90％同一性的经密码子优化的PAH序列。在一个实施方案中，ceDNA载体包含与表1A中所示的序列具有至少91％同一性的经密码子优化的PAH序列。在一个实施方案中，ceDNA载体包含与表1A中所示的PAH序列具有至少92％同一性的经密码子优化的PAH序列。在一个实施方案中，ceDNA载体包含与表1A中所示的PAH序列具有至少93％同一性的经密码子优化的PAH序列。在一个实施方案中，ceDNA载体包含与表1A中所示的PAH序列具有至少94％同一性的经密码子优化的PAH序列。在一个实施方案中，ceDNA载体包含与表1A中所示的PAH序列具有至少95％同一性的经密码子优化的PAH序列。在一个实施方案中，ceDNA载体包含与表1A中所示的PAH序列具有至少96％同一性的经密码子优化的PAH序列。在一个实施方案中，ceDNA载体包含与表1A中所示的PAH序列具有至少97％同一性的经密码子优化的PAH序列。在一个实施方案中，ceDNA载体包含与表1A中所示的PAH序列具有至少98％同一性的经密码子优化的PAH序列。在一个实施方案中，ceDNA载体包含与表1A中所示的PAH序列具有至少99％同一性的经密码子优化的PAH序列。
在一个实施方案中，PAH序列与SEQ ID NO:382、SEQ ID NO:383、SEQ ID NO:384、SEQ ID NO:385、SEQ ID NO:386、SEQ ID NO:387、NO:389、SEQ ID NO:390、SEQ ID NO:391、SEQ ID NO:392、SEQ ID NO:393、SEQ ID NO:394、SEQ ID NO:395、SEQ ID NO:396、SEQ IDNO:397、SEQ ID NO:398、SEQ ID NO:399、SEQ ID NO:400、SEQ ID NO:401、SEQ ID NO:402、SEQ ID NO:403、SEQ ID NO:404、SEQ ID NO:405、SEQ ID NO:406、SEQ ID NO:407、SEQ IDNO:408、SEQ ID NO:409、SEQ ID NO:410、SEQ ID NO:411、SEQ ID NO:412、SEQ ID NO:413、SEQ ID NO:414、SEQ ID NO:415、SEQ ID NO:416、SEQ ID NO:417、SEQ ID NO:418、SEQ IDNO:419、SEQ ID NO:420、SEQ ID NO:421、SEQ ID NO:422、SEQ ID NO:423、SEQ ID NO:424、SEQ ID NO:425、SEQ ID NO:426、SEQ ID NO:427、SEQ ID NO:428、SEQ ID NO:429、SEQ IDNO:430、SEQ ID NO:431、SEQ ID NO:432、SEQ ID NO:433、SEQ ID NO:434、SEQ ID NO:435、SEQ ID NO:436、SEQ ID NO:437、SEQ ID NO:438、SEQ ID NO:439、SEQ ID NO:440、SEQ IDNO:1011、SEQ ID NO:1012、SEQ ID NO:1013、SEQ ID NO:1014或SEQ ID NO:1015具有至少90％同一性。在一个实施方案中，PAH序列与SEQ ID NO:382-440或SEQ ID NO:1011-1015中的任一者具有至少91％同一性。在一个实施方案中，PAH序列与SEQ ID NO:382-440或SEQID NO:1011-1015中的任一者具有至少92％同一性。在一个实施方案中，PAH序列与SEQ IDNO:382-440或SEQ ID NO:1011-1015中的任一者具有至少93％同一性。在一个实施方案中，PAH序列与SEQ ID NO:382-440或SEQ ID NO:1011-1015中的任一者具有至少94％同一性。在一个实施方案中，PAH序列与SEQ ID NO:382-440或SEQ ID NO:1011-1015中的任一者具有至少95％同一性。在一个实施方案中，PAH序列与SEQ ID NO:382-440或SEQ ID NO:1011-1015中的任一者具有至少96％同一性。在一个实施方案中，PAH序列与SEQ ID NO:382-440或SEQ ID NO:1011-1015中的任一者具有至少97％同一性。在一个实施方案中，PAH序列与SEQ ID NO:382-440或SEQ ID NO:1011-1015中的任一者具有至少98％同一性。在一个实施方案中，PAH序列与SEQ ID NO:382-440或SEQ ID NO:1011-1015中的任一者具有至少99％同一性。在一个实施方案中，PAH序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:382、SEQID NO:383、SEQ ID NO:384、SEQ ID NO:385、SEQ ID NO:386、SEQ ID NO:387、NO:389、SEQID NO:390、SEQ ID NO:391、SEQ ID NO:392、SEQ ID NO:393、SEQ ID NO:394、SEQ ID NO:395、SEQ ID NO:396、SEQ ID NO:397、SEQ ID NO:398、SEQ ID NO:399、SEQ ID NO:400、SEQID NO:401、SEQ ID NO:402、SEQ ID NO:403、SEQ ID NO:404、SEQ ID NO:405、SEQ ID NO:406、SEQ ID NO:407、SEQ ID NO:408、SEQ ID NO:409、SEQ ID NO:410、SEQ ID NO:411、SEQID NO:412、SEQ ID NO:413、SEQ ID NO:414、SEQ ID NO:415、SEQ ID NO:416、SEQ ID NO:417、SEQ ID NO:418、SEQ ID NO:419、SEQ ID NO:420、SEQ ID NO:421、SEQ ID NO:422、SEQID NO:423、SEQ ID NO:424、SEQ ID NO:425、SEQ ID NO:426、SEQ ID NO:427、SEQ ID NO:428、SEQ ID NO:429、SEQ ID NO:430、SEQ ID NO:431、SEQ ID NO:432、SEQ ID NO:433、SEQID NO:434、SEQ ID NO:435、SEQ ID NO:436、SEQ ID NO:437、SEQ ID NO:438、SEQ ID NO:439、SEQ ID NO:440、SEQ ID NO:1011、SEQ ID NO:1012、SEQ ID NO:1013、SEQ ID NO:1014和SEQ ID NO:1015。在一个实施方案中，PAH序列由以下组成：SEQ ID NO:382、SEQ ID NO:383、SEQ ID NO:384、SEQ ID NO:385、SEQ ID NO:386、SEQ ID NO:387、NO:389、SEQ ID NO:390、SEQ ID NO:391、SEQ ID NO:392、SEQ ID NO:393、SEQ ID NO:394、SEQ ID NO:395、SEQID NO:396、SEQ ID NO:397、SEQ ID NO:398、SEQ ID NO:399、SEQ ID NO:400、SEQ ID NO:401、SEQ ID NO:402、SEQ ID NO:403、SEQ ID NO:404、SEQ ID NO:405、SEQ ID NO:406、SEQID NO:407、SEQ ID NO:408、SEQ ID NO:409、SEQ ID NO:410、SEQ ID NO:411、SEQ ID NO:412、SEQ ID NO:413、SEQ ID NO:414、SEQ ID NO:415、SEQ ID NO:416、SEQ ID NO:417、SEQID NO:418、SEQ ID NO:419、SEQ ID NO:420、SEQ ID NO:421、SEQ ID NO:422、SEQ ID NO:423、SEQ ID NO:424、SEQ ID NO:425、SEQ ID NO:426、SEQ ID NO:427、SEQ ID NO:428、SEQID NO:429、SEQ ID NO:430、SEQ ID NO:431、SEQ ID NO:432、SEQ ID NO:433、SEQ ID NO:434、SEQ ID NO:435、SEQ ID NO:436、SEQ ID NO:437、SEQ ID NO:438、SEQ ID NO:439或SEQ ID NO:440、SEQ ID NO:1011、SEQ ID NO:1012、SEQ ID NO:1013、SEQ ID NO:1014或SEQ ID NO:1015。
(iii)PAH治疗蛋白及其用于治疗PKU的用途
本文所述的ceDNA载体可用于递送治疗性PAH蛋白以治疗与PAH蛋白的不当表达和/或PAH蛋白内的突变相关的PKU。
如本文所描述的ceDNA载体可以用于表达任何期望PAH治疗蛋白。示例性治疗性PAH治疗蛋白包括但不限于由如本文的表1A中所示的序列表达的任何PAH蛋白。
在一个实施方案中，表达的PAH治疗蛋白具有治疗苯丙酮尿症(PKU)的功能。在一些实施方案中，PAH治疗蛋白不引起免疫系统反应。
在一些实施方案中，ceDNA载体包含编码PAH的截短(片段)的经密码子优化的序列。在一个实施方案中，ceDNA载体包含编码截短的PAH的经密码子优化的序列，所述截短的PAH具有N末端自我调节区域(例如，从全长PAH蛋白的氨基酸1至29)的缺失。在一个实施方案中，ceDNA载体包含SEQ ID NO:394。
在另一个实施方案中，编码PAH治疗蛋白或其片段(例如，功能片段)的ceDNA载体可用于产生嵌合蛋白。因此，本文特别考虑可将表达嵌合蛋白的ceDNA载体施用于例如任何一种或多种选自以下的组织：肝、肾、胆囊、前列腺、肾上腺。在一些实施方案中，当将表达PAH的ceDNA载体施用于婴儿或施用于子宫内的受试者时，可以将表达PAH的ceDNA载体施用于选自以下的任何一种或多种组织：肝脏、肾上腺、心脏、肠、肺和胃，或其肝干细胞前体，以用于体内或离体治疗苯丙酮尿症(PKU)。
PKU：PKU是一种罕见的遗传性先天性代谢缺陷，由PAH基因突变引起。PAH是一种酶，通常在肝脏中表达，是将膳食苯丙氨酸代谢为酪氨酸所必需的，酪氨酸是一种负责产生神经递质的氨基酸。PKU由导致其酶活性不足的PAH突变引起。因此，表达PAH蛋白的ceDNA载体可以在肝脏中表达PAH。在一些实施方案中，ceDNA载体在肝细胞中表达至少一种PAH蛋白。
PAH通常在PR和RPE细胞类型中内源性表达。据报道，正常视网膜功能也可能需要RPE中低水平的PAH表达。因此，有时可能需要通过ceDNA载体在PR以及任选的RPE细胞中低水平或高水平表达PAH蛋白以防止视网膜变性。这种表达水平可以通过本文所述的启动子和/或调节开关进行微调。
因此，在一些实施方案中，ceDNA载体用于从内源性启动子(约1kb)表达PAH蛋白(为6.8kb蛋白)，以恢复光感受器和RPE中的正常类视黄醇加工。在一些实施方案中，表达PAH蛋白的ceDNA载体经由脉络膜上或玻璃体内施用途径来治疗较大面积的视网膜。在一些实施方案中，ceDNA载体通过以下任何一种或多种施用：视网膜下注射、脉络膜上注射或玻璃体内注射。
所述方法包含向受试者施用有效量的包含如本文所描述的编码PAH治疗蛋白或其片段(例如功能片段)的ceDNA载体的组合物。如熟练的从业者将了解，术语“有效量”是指ceDNA组合物的施用量，引起蛋白以治疗疾病的“治疗有效量”表达。
包含编码PAH治疗蛋白或其片段(例如，功能片段)的ceDNA载体的组合物的剂量范围取决于效力(例如，启动子的效率)，并且包括足以产生期望效果(例如表达期望的PAH治疗蛋白)的量以治疗苯丙酮尿症(PKU)。剂量不应大到引起不可接受的副作用。通常，剂量将随ceDNA载体的特定特征、表达效率以及随患者的年龄、病状和性别而变化。剂量可以由所属领域的技术人员确定，并且与传统的AAV载体不同，在任何并发症的情况下，也可以由个别医师来调节，因为ceDNA载体不包含阻止重复给药的免疫活化衣壳蛋白。
可以在有限的时间段内重复施用本文所述的ceDNA组合物。在一些实施方案中，定期或通过脉冲施用进行给药。在一个优选的实施方案中，上述剂量被施用数月。治疗持续时间视受试者的临床进展和对治疗的反应而定。预期随着时间的推移加强治疗。此外，表达水平可以随着受试者的成长而滴定。
PAH治疗蛋白可以在受试者中表达至少1周、至少2周、至少1个月、至少2个月、至少6个月、至少12个月/一年、至少2年、至少5年、至少10年、至少15年、至少20年、至少30年、至少40年、至少50年或更长时间。通过在预定或期望的间隔时间反复施用本文所述的ceDNA载体能够达成长期表达。
如本文所用，术语“治疗有效量”是所表达的PAH治疗蛋白或其功能片段足以产生疾病生物标志物的表达的统计学上显著的可测量变化或既定疾病症状的减轻的量(参见下文的“功效测量”)。指定的ceDNA组合物的此类有效量能够在临床试验以及动物研究中加以调整。
需要施用的ceDNA载体的精确量取决于从业者的判断并且因个体而异。合适的施用方案也是可变的，但以初始施用为代表，随后通过后续注射或其他施用以一个或多个间隔重复给药。或者，考虑持续静脉内输注足以将血液中的浓度维持在体内治疗规定的范围内，特别是用于治疗急性疾病/病症。
可用于本文所述的方法和组合物的药剂可通过体表、静脉内(通过团注或连续输注)、细胞内注射、组织内注射、口服、通过吸入、腹膜内、肌内、皮下、腔内施用，并且必要时可通过蠕动方式或通过所属领域的技术人员已知的其他方式递送。如果如此期望，那么可以全身施用所述药剂。它也可以在子宫内施用。
苯丙酮尿症(PKU)的给定治疗的功效可由熟练的临床医生确定。然而，在本文使用“有效治疗”时，如果在用编码PAH或其功能片段的ceDNA载体治疗之后疾病或病症的任一种或所有体征或症状以有益方式改变、或疾病的其他临床上接受的症状或标志物改良或改善例如至少10％，那么认为治疗是“有效治疗”。还可以根据个体未发生恶化来测量功效，如通过疾病的稳定或对医疗干预的需求(即，疾病的进展停止或至少减缓)所评估。测量这些指标的方法是所属领域的技术人员已知的和/或描述于本文中。治疗包括个体或动物(一些非限制性示例包括人或哺乳动物)中的疾病的任何治疗，并且包括：(1)抑制疾病，例如阻止或减缓疾病或病症的进展；或者(2)缓解疾病，例如使症状消退；或者(3)预防或降低疾病发展的可能性，或预防与疾病相关的继发性疾病/病症，诸如肝或肾衰竭。当本文定义有效治疗时，治疗疾病的有效量意味着当施用于有需要的哺乳动物时足以对所述疾病产生有效治疗的量。
药剂功效能够通过评估苯丙酮尿症(PKU)所特有的身体指标来测定。分析PKU指标的标准方法是本领域已知的。
在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体还可以编码辅因子或其他多肽、有义或反义寡核苷酸或RNA(编码或非编码；例如，siRNA、shRNA、gRNA、微RNA和它们的反义对应物(例如，antagoMiR)，其可与从ceDNA表达的PAH蛋白结合使用。另外，包含编码PAH蛋白的序列的表达盒还可以包括外源序列，所述外源序列编码待用于实验或诊断目的的报告蛋白，例如β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶、胸苷激酶、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶和所属领域中熟知的其他蛋白质。
在一个实施方案中，ceDNA载体包含核酸序列以表达具有PKU治疗功能的PAH蛋白。在一个优选的实施方案中，治疗性PAH蛋白不引起免疫系统反应，除非期望如此。
III.一般用于产生PAH治疗蛋白的ceDNA载体
本公开的实施方案基于包含可以表达PAH转基因的封闭端线性双链(ceDNA)载体的方法和组合物。在一些实施方案中，转基因是编码PAH蛋白的经密码子优化的序列(参见例如SEQ ID NO:382-440或SEQ ID NO:1011-1015)。如本文所描述的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体不受大小限制，从而准许例如表达由单个载体表达转基因所需的所有组分。用于表达PAH蛋白的ceDNA载体优选地为双链体，例如在分子的至少一部分上为自互补的，诸如表达盒(例如，ceDNA不为双链环状分子)。ceDNA载体具有共价封闭端，并且因此抵抗核酸外切酶消化(例如，核酸外切酶I或核酸外切酶III)，例如在37℃下维持超过一小时。
一般来说，如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体在5'到3'方向上包含：第一腺病毒相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)、感兴趣的核酸序列(例如本文所描述的表达盒)和第二AAV ITR。ITR序列选自以下任一项：(i)至少一个WT ITR和至少一个经修饰的AAV反向末端重复序列(mod-ITR)(例如，不对称的经修饰ITR；(ii)两个经修饰的ITR，其中mod-ITR对相对于彼此具有不同的三维空间组构(例如，不对称的经修饰ITR)；或(iii)对称或基本上对称的WT-WT ITR对，其中每个WT-ITR具有相同的三维空间组构；或(iv)对称或基本上对称的经修饰ITR对，其中每个mod-ITR具有相同的三维空间组构。用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可从基于细胞(例如，Sf9或HEK293)的生产或在无细胞环境中使用多种寡核苷酸以合成方式制备。
本文涵盖包含用于产生PAH蛋白的ceDNA载体的方法和组合物，其还可包括递送系统，诸如脂质体纳米粒子递送系统。本文公开了非限制示例性脂质体纳米粒子系统。在一些方面中，本公开提供了包含ceDNA和可电离脂质的脂质纳米粒子。例如，经制造并且装载通过所述方法获得的ceDNA载体的脂质纳米粒子配制物公开于2018年9月7日提交的国际申请PCT/US2018/050042和2020年9月3日提交的国际申请PCT/US2020/049266中，所述国际申请中每一篇全文以引用方式并入本文。
如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体不具有由病毒衣壳内的有限空间所强加的包装约束。与经囊封的AAV基因组相反，ceDNA载体代表原核生物产生的质粒DNA载体的活的真核生物产生的替代物。这允许插入控制元件，例如本文所公开的调节开关、大的转基因、多个转基因等。
用于表达PAH蛋白的ceDNA载体是无衣壳的，并且可以从以如下顺序编码的质粒获得：第一ITR、包含转基因的表达盒和第二ITR。表达盒可包含一种或多种允许且/或控制转基因表达的调节序列，例如其中表达盒可按照如下顺序包含以下中的一个或多个：增强子/启动子、ORF(编码PAH的转基因)、转录后调节元件(例如WPRE)以及聚腺苷酸化和终止信号(例如BGH polyA)。
表达盒还可包含内部核糖体进入位点(IRES)和/或2A元件。顺式调节元件包含但不限于启动子、核糖开关、绝缘子、mir可调节元件、转录后调节元件、组织和细胞类型特异性启动子以及增强子。在一些实施方案中，ITR可以充当用于转基因例如PAH蛋白的启动子。在一些实施方案中，ceDNA载体包含用于调节转基因的表达的额外组分，例如调节开关，其在本文中标题为用于控制和调节PAH蛋白表达的“调节开关”的章节中描述，并且如果期望，可包含作为使包含ceDNA载体的细胞能够控制细胞死亡的杀伤开关的调节开关。
表达盒可包含超过4000个核苷酸、5000个核苷酸、10,000个核苷酸或20,000个核苷酸、或30,000个核苷酸、或40,000个核苷酸、或50,000个核苷酸，或在约4000-10,000个核苷酸或10,000-50,000个核苷酸之间的任何范围，或超过50,000个核苷酸。在一些实施方案中，表达盒可包含长度在500至50,000个核苷酸范围内的转基因。在一些实施方案中，表达盒可包含长度在500至75,000个核苷酸范围内的转基因。在一些实施方案中，表达盒可包含长度在500至10,000个核苷酸范围内的转基因。在一些实施方案中，表达盒可包含长度在1000至10,000个核苷酸范围内的转基因。在一些实施方案中，表达盒可包含长度在500至5,000个核苷酸范围内的转基因。ceDNA载体不存在衣壳化AAV载体的尺寸限制，从而能够递送大尺寸表达盒以提供有效的转基因表达。在一些实施方案中，ceDNA载体缺乏原核生物特异性甲基化。
ceDNA表达盒能够包括例如所编码的蛋白质在接受的受试者中不存在、无活性或活性不充分的可表达的外源序列(例如开放阅读框架)或转基因，或所编码的蛋白质具有所期望的生物或治疗作用的基因。转基因能够编码能够用以校正缺陷基因或转录物表达的基因产物。原则上，表达盒可包括编码因突变而减少或不存在或在本公开的范围内认为过度表达时会展现治疗益处的蛋白质、多肽或RNA的任何基因。
表达盒可包含任何转基因(例如，编码PAH蛋白)，例如可用于治疗受试者的PKU的PAH蛋白，即治疗性PAH蛋白。根据如本文所述的本公开的各方面，表达盒包含经密码子优化的转基因。根据另外的实施方案，经密码子优化的转基因选自表1A中所示的核酸序列。
ceDNA载体可以用于单独或与编码多肽的核酸或非编码核酸(例如RNAi、miRs等)以及外源基因和核酸序列(包括受试者基因组中的病毒序列，例如HIV病毒序列等等)组合来在受试者中递送和表达任何感兴趣的PAH蛋白。优选地，本文所公开的ceDNA载体用于治疗目的(例如用于医学、诊断或兽医学用途)或免疫原性多肽。在某些实施方案中，ceDNA载体可用于表达受试者中的任何所关注的基因，包括一种或多种多肽、肽、核酶、肽核酸、siRNA、RNAi、反义寡核苷酸、反义多核苷酸或RNA(编码或非编码；例如，siRNA、shRNA、gRNA、微RNA和它们的反义对应物(例如，antagomiR))、抗体、融合蛋白或它们的任何组合。
表达盒还可以编码多肽、有义或反义寡核苷酸或RNA(编码或非编码)；例如，siRNA、shRNA、gRNA、微RNA和它们的反义对应物(例如，antagomiR))。表达盒可包含外源序列，该外源序列编码用于实验或诊断目的的报告蛋白，诸如β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶、胸苷激酶、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶和所属领域中熟知的其他报告蛋白。
通过本文所提供的方法产生的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体优选地具有线性且连续结构，而非非连续结构，如限制酶消化分析所测定(图3D)。相信线性和连续结构在受到细胞核酸内切酶攻击时更稳定，并且不太可能重组并引起诱变。因此，线性和连续结构的ceDNA载体是优选的实施方案。连续、线性、单链的分子内双链体ceDNA载体可以具有共价结合的末端，而不具有编码AAV衣壳蛋白的序列。这些ceDNA载体在结构上不同于质粒(包括本文所述的ceDNA质粒)，所述质粒是细菌来源的环状双链体核酸分子。质粒的互补链在变性后可以分离，从而产生两个核酸分子，而相比之下，ceDNA载体虽具有互补链，却是单个DNA分子，并且因此即使变性，也仍保持是单个分子。在一些实施方案中，与质粒不同，如本文所述的ceDNA载体的产生可以没有原核类型的DNA碱基甲基化。因此，在结构方面(特别是线性对比环形)以及还根据用于产生和纯化这些不同物体的方法方面，以及还根据它们的DNA甲基化方面，即ceDNA-质粒属于原核类型而ceDNA载体属于真核类型，ceDNA载体和ceDNA质粒是不同的。
与基于质粒的表达载体相比，如本文所述使用ceDNA载体表达PAH蛋白有若干优点，此类优点包括但不限于:1)质粒含有细菌DNA序列并且进行原核生物特异性甲基化例如6-甲基腺苷和5-甲基胞嘧啶甲基化，而无衣壳AAV载体序列是真核来源的并且不进行原核生物特异性甲基化；因此，与质粒相比，无衣壳AAV载体不太可能诱导炎性和免疫反应；2)虽然质粒在生产过程中需要抗性基因的存在，但ceDNA载体不需要；3)虽然环状质粒在引入细胞内时不被递送至细胞核并且需要过载以绕过细胞核酸酶引起的降解，但ceDNA载体含有病毒顺式元件，即ITR，其赋予对核酸酶的抗性并且可被设计成靶向并递送至细胞核。假设对于ITR功能不可或缺的最小限定元件是Rep结合位点(RBS；AAV2的5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ ID NO:60))和末端解链位点(TRS；AAV2的5'-AGTTGG-3'(SEQ ID NO:64))加上允许发夹形成的可变回文序列；以及4)ceDNA载体不具有通常存在于原核生物来源的质粒中的CpG二核苷酸的过度表达，所述原核生物来源的质粒据报道结合Toll样受体家族的成员，引发T细胞介导的免疫反应。相比之下，用本文所公开的无衣壳AAV载体进行的转导可以有效地靶向难以使用各种递送试剂用常规AAV病毒粒子转导的细胞和组织类型。
IV.反向末端重复序列(ITR)
如本文所公开，用于表达PAH蛋白的ceDNA载体含有位于两个反向末端重复(ITR)序列之间的核酸如转基因或异源核酸序列(例如，经密码子优化的异源核酸序列)，其中ITR序列可以是不对称ITR对或者对称或基本上对称的ITR对，这些术语如本文所定义。如本文所公开的ceDNA载体可包含选自以下任一项的ITR序列：(i)至少一个WT ITR和至少一个经修饰的AAV反向末端重复序列(mod-ITR)(例如，不对称的经修饰ITR)；(ii)两个经修饰的ITR，其中mod-ITR对相对于彼此具有不同的三维空间组构(例如，不对称的经修饰ITR)；或(iii)对称或基本上对称的WT-WT ITR对，其中每个WT-ITR具有相同的三维空间组构；或(iv)对称或基本上对称的经修饰ITR对，其中每个mod-ITR具有相同的三维空间组构，或者(iv)对称或基本对称的经修饰ITR对，其中每个mod-ITR具有相同的三维空间组构，其中本公开的方法还可包括递送系统，诸如但不限于脂质体纳米粒子递送系统。
在一些实施方案中，ITR序列可以来自细小病毒科的病毒，细小病毒科包括两个亚科：感染脊椎动物的细小病毒亚科和感染昆虫的浓核病毒亚科。细小病毒亚科(称为细小病毒)包含依赖病毒属，所述依赖病毒属的成员在大多数情况下需要与辅助病毒例如腺病毒或疱疹病毒共同感染以用于生产性感染。依赖病毒属包括通常感染人类(例如，血清型2、3A、3B、5和6)或灵长类动物(例如，血清型1和4)的腺相关病毒(AAV)以及感染其他温血动物的相关病毒(例如，牛、犬、马和绵羊腺相关病毒)。细小病毒和细小病毒科的其他成员一般描述于Kenneth I.Berns，FIELDS VIROLOGY中的第69章“Parvoviridae:The Viruses andTheir Replication,”(第3版，1996)中。
尽管在说明书和本文的实施例中举例说明的ITR是AAV2 WT-ITR，但是所属领域的普通技术人员知道如上所述，可以使用来自任何已知的细小病毒，例如依赖病毒，诸如AAV(例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV 5、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV 11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAV-DJ和AAV-DJ8基因组。例如，NCBI:NC 002077、NC 001401、NC001729、NC001829、NC006152、NC 006260、NC 006261)、嵌合ITR或来自任何合成AAV的ITR。在一些实施方案中，AAV可以感染温血动物，例如禽类(AAAV)、牛(BAAV)、犬、马和绵羊腺相关病毒。在一些实施方案中，ITR来自B19细小病毒(GenBank登录号：NC 000883)、小鼠微小病毒(MVM)(GenBank登录号：NC 001510)；鹅细小病毒(GenBank登录号NC 001701)；蛇细小病毒1(GenBank登录号NC 006148)。在一些实施方案中，5'WT-ITR可以来自一种血清型，而3'WT-ITR来自不同血清型，如本文所论述。
普通技术人员知道，ITR序列具有双链霍利迪连结体(Holliday junction)的共同结构，所述结构通常为T形或Y形发夹结构，其中每个WT-ITR由嵌入较大的回文臂(A-A')中的两个回文臂或环(B-B'和C-C')和单链D序列形成(其中这些回文序列的顺序限定了ITR的翻转或翻动取向)。参见例如来自不同AAV血清型(AAV1-AAV6)的ITR的结构分析和序列比较，并且描述于Grimm等人，J.Virology,2006；80(1)；426-439；Yan等人，J.Virology,2005；364-379；Duan等人，Virology 1999；261；8-14。所属领域的技术人员基于本文提供的示例性AAV2 ITR序列，可以容易地确定用于ceDNA载体或ceDNA质粒的来自任何AAV血清型的WT-ITR序列。参见例如来自不同AAV血清型(AAV1-AAV6，和禽AAV(AAAV)和牛AAV(BAAV))的ITR的序列比较，如Grimm等人，J.Virology,2006；80(1)；426-439中所述，其显示了AAV2的左ITR与来自其他血清型的左ITR的同一性％：AAV-1(84％)、AAV-3(86％)、AAV-4(79％)、AAV-5(58％)、AAV-6(左ITR)(100％)和AAV-6(右ITR)(82％)。
A.对称ITR对
在一些实施方案中，如本文所描述的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体在5'到3'方向上包含：第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)、感兴趣的核酸序列(例如本文所描述的表达盒)和第二AAV ITR，其中第一ITR(5'ITR)和第二ITR(3'ITR)相对于彼此对称或基本上对称-也就是说，ceDNA载体可以包含具有对称三维空间组构以使得其结构在几何空间中为相同形状或在3D空间中具有相同的A、C-C'和B-B'环的ITR序列。在这样的实施方案中，对称的ITR对或基本上对称的ITR对可以是非野生型ITR的经修饰ITR(例如，mod-ITR)。一个mod-ITR对可以具有相同的相对于野生型ITR具有一个或多个修饰的序列，并且彼此反向互补(反向)。在另选的实施方案中，经修饰的ITR对如本文所定义是基本上对称的，也就是说，经修饰的ITR对可以具有不同的序列，但是具有对应或相同的对称的三维形状。
(i)野生型ITR
在一些实施方案中，对称的ITR或基本上对称的ITR是如本文所描述的野生型(WT-ITR)。也就是说，两个ITR都具有野生型序列，但不一定必须为来自相同AAV血清型的WT-ITR。也就是说，在一些实施方案中，一个WT-ITR可以来自一种AAV血清型，而另一WT-ITR可以来自不同的AAV血清型。在这样的实施方案中，WT-ITR对如本文所定义是基本上对称的，即，它们可以具有一个或多个保守核苷酸修饰，同时仍然保留对称的三维空间组构。
因此，如本文所公开，ceDNA载体含有位于两个侧接野生型反向末端重复(WT-ITR)序列之间的核酸序列例如转基因或异源核酸序列，所述两个野生型反向末端重复序列彼此反向互补(逆向)，或者另选地，相对于彼此基本对称，即，WT-ITR对具有对称的三维空间组构。在一些实施方案中，野生型ITR序列(例如AAV WT-ITR)包含功能Rep结合位点(RBS；例如AAV2的5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'，SEQ ID NO:60)和功能末端解链位点(TRS；例如5’-AGTT-3’，SEQ ID NO:62)。
在一个方面，用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可从编码核酸例如异源核酸的载体多核苷酸获得，所述核酸操作性地位于两个WT反向末端重复序列(WT-ITR)(例如AAV WT-ITR)之间。也就是说，两个ITR都具有野生型序列，但不一定必须为来自相同AAV血清型的WT-ITR。也就是说，在一些实施方案中，一个WT-ITR可以来自一种AAV血清型，而另一WT-ITR可以来自不同的AAV血清型。在这样的实施方案中，WT-ITR对如本文所定义是基本上对称的，即，它们可以具有一个或多个保守核苷酸修饰，同时仍然保留对称的三维空间组构。在一些实施方案中，5'WT-ITR来自一种AAV血清型，而3'WT-ITR来自相同或不同的AAV血清型。在一些实施方案中，5'WT-ITR和3'WT-ITR是彼此的镜像，即它们是对称的。在一些实施方案中，5'WT-ITR和3'WT-ITR来自相同的AAV血清型。
WT ITR是众所周知的。在一个实施方案中，两个ITR来自相同的AAV2血清型。在某些实施方案中，可以使用来自其他血清型的WT。存在许多同源血清型，例如AAV2、AAV4、AAV6、AAV8。在一个实施方案中，可以使用紧密同源的ITR(例如具有类似环结构的ITR)。在另一个实施方案中，可以使用较多样化的AAV WT ITR，例如AAV2和AAV5，并且在又一个实施方案中，可以使用基本上呈WT的ITR，也就是说，其不仅具有WT的基本环结构，而且具有不改变或不影响所述特性的一些保守核苷酸变化。当使用来自相同病毒血清型的WT-ITR时，可以进一步使用一种或多种调节序列。在某些实施方案中，调节序列为允许调节ceDNA活性，例如所编码的PAH蛋白的表达的调节开关。
在一些实施方案中，本文所述的技术的一个方面涉及用于表达PAH蛋白的ceDNA载体，其中ceDNA载体包含可操作地位于两个野生型反向末端重复序列(WT-ITR)之间的至少一个编码PAH蛋白的核酸序列例如异源核酸序列，其中WT-ITR可以来自相同血清型、不同血清型或相对于彼此基本上对称(即，具有对称三维空间组构，使得其结构在几何空间中为相同形状，或者在3D空间中具有相同的A、C-C’和B-B’环)。在一些实施方案中，对称的WT-ITR包含功能末端解链位点和Rep结合位点。在一些实施方案中，核酸例如异源核酸序列编码转基因，并且其中载体不在病毒衣壳中。
在一些实施方案中，WT-ITR是相同的，但是彼此反向互补。例如，5'ITR中的序列AACG可以是3'ITR中相应位点处的CGTT(即，反向互补)。在一个实施方案中，5'WT-ITR有义链包含ATCGATCG(SEQ ID NO:605)的序列，而相应的3'WT-ITR有义链包含CGATCGAT(SEQ IDNO:606)(即与ATCGATCG(SEQ ID NO:607)反向互补)。在一些实施方案中，WT-ITR ceDNA还包含末端解链位点和复制蛋白结合位点(RPS)(有时称为复制性蛋白结合位点)，例如Rep结合位点。
在本文的表3中显示了用于表达PAH蛋白的ceDNA载体中的示例性WT-ITR序列，所述载体包含WT-ITR，其显示成对的WT-ITR(5'WT-ITR和3'WT-ITR)。
在一些实施方案中，侧接WT-ITR相对于彼此相同且对称。在一些实施方案中，侧接WT-ITR相对于彼此基本上对称。在该实施方案中，5'WT-ITR可以来自AAV的一种血清型，而3'WT-ITR可以来自AAV的另一种血清型，使得WT-ITR不是相同的反向互补序列。例如，5'WT-ITR可以来自AAV2，并且3'WT-ITR来自不同血清型，例如AAV1、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12。在一些实施方案中，WT-ITR可以选自从以下任一种中选择的两种不同细小病毒：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、蛇细小病毒(例如巨蟒细小病毒)、牛细小病毒、山羊细小病毒、禽类细小病毒、犬细小病毒、马细小病毒、虾细小病毒、猪细小病毒或昆虫AAV。在一些实施方案中，WT ITR的这种组合是来自AAV2和AAV6的WT-ITR的组合。在一个实施方案中，当一个相对于另一个ITR反向时，基本上对称的WT-ITR具有至少90％同一性，至少95％同一性，至少96％…97％…98％…99％....99.5％以及其间的所有点的同一性，并具有相同的对称三维空间组织。在一些实施方案中，WT-ITR对由于其具有对称的三维空间组构，例如具有A、C-C'、B-B'和D臂的相同3D组织，因此是基本对称的。在一个实施方案中，基本上对称的WT-ITR对相对于彼此呈反向，并且彼此具有至少95％、至少96％…97％…98％…99％....99.5％以及其间的所有点的同一性，并且一个WT-ITR保留了5’-GCGCGCTCGCTCGCTC-3’(SEQ ID NO:60)的Rep结合位点(RBS)和末端解链位点(trs)。在一些实施方案中，基本上对称的WT-ITR对相对于彼此呈反向，并且彼此具有至少95％、至少96％…97％…98％…99％....99.5％以及其间的所有点的同一性，并且一个WT-ITR保留了5’-GCGCGCTCGCTCGCTC-3’(SEQ ID NO:60)的Rep结合位点(RBS)和末端解链位点(trs)，并且另外保留了允许发夹二级结构形成的可变回文序列。同源性可以通过所属领域熟知的标准方法来确定，如默认设置下的BLAST(基本局部比对搜索工具)、BLASTN。
在一些实施方案中，ITR的结构元件可以是参与ITR与大的Rep蛋白(例如Rep 78或Rep 68)的功能性相互作用的任何结构元件。在某些实施方案中，结构元件为ITR与大的Rep蛋白的相互作用提供了选择性，即，至少部分确定哪种Rep蛋白与ITR功能性相互作用。在其他实施方案中，当Rep蛋白与ITR结合时，结构元件与大的Rep蛋白物理上相互作用。每个结构元件可以为例如ITR的二级结构、ITR的核酸序列、在两个或更多个元件之间的间距或以上中的任一者的组合。在一个实施方案中，结构元件选自由A和A'臂、B和B'臂、C和C'臂、D臂、Rep结合位点(RBE)和RBE'(即互补RBE序列)以及末端解链位点(trs)组成的组。
仅举例而言，表2指示WT-ITR的示例性组合。
表2：来自相同血清型或不同血清型或不同细小病毒的WT-ITR的示例性组合。显示的顺序并不表示ITR位置，例如，“AAV1，AAV2”表明ceDNA可以在5'位置包含WT-AAV1 ITR，而在3'位置包含WT-AAV2 ITR，反之亦然，WT-AAV2 ITR位于5'位置，WT-AAV1 ITR位于3'位置。缩写：AAV血清型1(AAV1)、AAV血清型2(AAV2)、AAV血清型3(AAV3)、AAV血清型4(AAV4)、AAV血清型5(AAV5)、AAV血清型6(AAV6)、AAV血清型7(AAV7)、AAV血清型8(AAV8)、AAV血清型9(AAV9)、AAV血清型10(AAV10)、AAV血清型11(AAV11)或AAV血清型12(AAV12)；AAVrh8、AAVrh10、AAV-DJ和AAV-DJ8基因组(例如，NCBI:NC 002077、NC 001401、NC001729、NC001829、NC006152、NC 006260、NC 006261)、来自温血动物的ITR(禽AAV(AAAV)、牛AAV(BAAV)、犬、马和绵羊AAV)、来自B19细小病毒的ITR(GenBank登录号：NC 000883)、小鼠微小病毒(MVM)(GenBank登录号NC 001510)；鹅：鹅细小病毒(GenBank登录号NC 001701)；蛇：蛇细小病毒1(GenBank登录号NC 006148)。
表2
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仅举例而言，表3显示来自一些不同AAV血清型的示例性WT-ITR的序列。
表3
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在一些实施方案中，WT-ITR序列的核酸序列可以经修饰(例如通过修饰1、2、3、4或5个或更多个核苷酸或者其中的任何范围)，其中所述修饰为互补核苷酸取代，例如，G替代C，反之亦然，T替代A，反之亦然。
在本公开的某些实施方案中，用于表达PAH蛋白的ceDNA载体不具有由选自SEQ IDNO:1、2、5-14中的任一者的核酸序列组成的WT-ITR。在本公开的另选实施方案中，如果ceDNA载体具有包含选自SEQ ID NO:1、2、5-14中的任一者的核酸序列的WT-ITR，那么侧接ITR也为WT，并且ceDNA载体包含调节开关，例如本文和国际专利申请PCT/US18/49996(例如，参见PCT/US18/49996的表11，其全文以引用方式并入)中所公开。在一些实施方案中，用于表达PAH蛋白的ceDNA载体包含如本文所公开的调节开关和经选择具有选自由SEQ IDNO:1、2、5-14组成的组中的任一者的核酸序列的WT-ITR。
如本文所描述的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可以包括保留可操作的RBE、trs和RBE'部分的WT-ITR结构。出于示例性目的使用野生型ITR，图1A和图1B示出了关于ceDNA载体的野生型ITR结构部分内的trs位点操作的一种可能机制。在一些实施方案中，用于表达PAH蛋白的ceDNA载体包含一个或多个功能性WT-ITR多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包含Rep结合位点(RBS；AAV2的5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ ID NO:60))和末端解链位点(TRS；5’-AGTT(SEQ ID NO:62))。在一些实施方案中，至少一个WT-ITR是功能性的。在另选实施方案中，其中用于表达PAH蛋白的ceDNA载体包含彼此基本上对称的两个WT-ITR，至少一个WT-ITR是功能性的并且至少一个WT-ITR是非功能性的。
B.通常用于包含不对称ITR对或对称ITR对的ceDNA载体的经修饰ITR(modified ITR/mod-ITR)
如本文所讨论，用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可以包含对称的ITR对或不对称的ITR对。在两种情况下，ITR中的一个或两个可以是经修饰的ITR，差异在于，在第一种情况(即，对称的经修饰ITR)下，经修饰ITR具有相同的三维空间组织(即，具有相同的A-A'、C-C'和B-B'臂构形)，而在第二种情况(即，不对称的经修饰ITR)下，经修饰ITR具有不同的三维空间组织(即，具有A-A'、C-C'和B-B'臂的不同构形)。
在一些实施方案中，相较于野生型ITR序列(例如AAV ITR)，经修饰ITR为通过缺失、插入和/或取代进行修饰的ITR。在一些实施方案中，ceDNA载体中的至少一个ITR包含功能性Rep结合位点(RBS；例如AAV2的5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'，SEQ ID NO:60)和功能末端解链位点(TRS；例如5’-AGTT-3’，SEQ ID NO:62)。在一个实施方案中，所述ITR中的至少一个ITR是非功能性ITR。在一个实施方案中，不同的或经修饰的ITR不是各自来自不同血清型的野生型ITR。
在本文中详细描述了ITR中的特定改变和突变，但是在ITR的情况下，“改变”或“突变”或“修饰”表明相对于野生型、参考或原始ITR序列，插入、缺失和/或取代核苷酸。改变或突变的ITR可以是工程化ITR。如本文所使用的，“工程化”是指通过人手进行操纵的方面。例如，当多肽的至少一个方面例如其序列通过人手进行操纵而不同于其自然存在的方面时，则认为所述多肽是“经工程改造”的。
在一些实施方案中，经修饰的ITR可以是合成的。在一个实施方案中，合成的ITR是基于来自一种以上AAV血清型的ITR序列。在另一个实施方案中，合成ITR不包括基于AAV的序列。在又一个实施方案中，合成的ITR尽管仅具有一些或不具有源自AAV的序列，但是保留了上述的ITR结构。在一些方面，合成的ITR可以优先与野生型Rep或特定血清型的Rep相互作用，或者在某些情况下，野生型Rep将不识别其，而仅突变的Rep可识别其。
技术人员可以通过已知手段确定其他血清型的相应序列。例如，确定改变是否在A、A'、B、B'、C、C'或D区域中，并确定另一种血清型中的相应区域。可以在默认状态下使用(基本局部比对搜索工具)或其他同源性比对程序确定相应序列。本公开进一步提供了包含来自不同AAV血清型的组合的经修饰ITR的ceDNA载体群体和多个所述ceDNA载体-也就是说，一个经修饰ITR可以来自一种AAV血清型，而另一个经修饰ITR可以来自不同血清型。不希望受理论的束缚，在一个实施方案中，一个ITR可以来自或基于AAV2 ITR序列，而ceDNA载体的另一个ITR可以来自或基于以下任一种或多种ITR序列：AAV血清型1(AAV1)、AAV血清型4(AAV4)、AAV血清型5(AAV5)、AAV血清型6(AAV6)、AAV血清型7(AAV7)、AAV血清型8(AAV8)、AAV血清型9(AAV9)、AAV血清型10(AAV10)、AAV血清型11(AAV11)或AAV血清型12(AAV12)。
任何细小病毒ITR都可以用作ITR或用于修饰的基础ITR。优选地，细小病毒是依赖病毒。更优选是AAV。选择的血清型可以是基于血清型的组织嗜性。AAV2具有广泛的组织嗜性，AAV1优先靶向神经元和骨骼肌，而AAV5优先靶向神经元、视网膜色素上皮和光感受器。AAV6优先靶向骨骼肌和肺。AAV8优先靶向肝脏、骨骼肌、心脏和胰腺组织。AAV9优先靶向肝脏、骨骼和肺组织。在一个实施方案中，经修饰的ITR基于AAV2ITR。
更具体地说，可以通过修饰结构元件来改变结构元件与特定的大Rep蛋白功能性相互作用的能力。例如，与ITR的野生型序列相比，结构元件的核酸序列可以经修饰。在一个实施方案中，可以去除ITR的结构元件(例如A臂、A'臂、B臂、B'臂、C臂、C'臂、D臂、RBE、RBE'和trs)并用来自不同细小病毒的野生型结构元件替代。例如，替代结构可以来自：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、蛇细小病毒(例如巨蟒细小病毒)、牛细小病毒、山羊细小病毒、禽类细小病毒、犬细小病毒、马细小病毒、虾细小病毒、猪细小病毒或昆虫AAV。例如，ITR可以是AAV2 ITR，并且A或A'臂或RBE可以用来自AAV5的结构元件替代。又如，ITR可以是AAV5 ITR，并且C或C'臂、RBE和trs可以用来自AAV2的结构元件替代。又如，AAV ITR可以是B和B'臂被AAV2 ITR B和B'臂替代的AAV5 ITR。
仅举例而言，表4显示经修饰的ITR的区域中的至少一个核苷酸的示例性修饰(例如缺失、插入和/或取代)，其中X表示那个区段中的至少一个核酸相对于相应野生型ITR的修饰(例如缺失、插入和/或取代)。在一些实施方案中，在C和/或C'和/或B和/或B'的任何区域中的至少一个核苷酸的任何修饰(例如缺失、插入和/或取代)在至少一个末端环中保留三个连续的T核苷酸(即，TTT)。例如，如果修饰引起以下任一种：单臂ITR(例如，单个C-C'臂或单个B-B'臂)或修饰的C-B'臂或C'-B臂、或具有至少一个截断臂(例如截断的C-C'臂和/或截断的B-B'臂)的两臂ITR，那么至少所述单臂、或两臂ITR(其中一个臂可以是截断的)的至少一个臂在至少一个末端环中保留三个连续的T核苷酸(即TTT)。在一些实施方案中，截断的C-C'臂和/或截断的B-B'臂在末端环中具有三个连续的T核苷酸(即TTT)。
表4：ITR的不同B-B'和C-C'区域或臂的至少一个核苷酸的修饰的示例性组合(例 如，缺失、插入和/或取代)(X指示核苷酸修饰，例如所述区域中的至少一个核苷酸的添加、 缺失或取代)。
在一些实施方案中，在用于表达PAH蛋白的ceDNA载体中使用的mod-ITR包含如本文所公开的不对称ITR对或对称mod-ITR对，可包含表4中所示的任一种修饰组合，以及选自以下的任一个或多个区域中的至少一种核苷酸的修饰：在A'与C之间、在C与C'之间、在C'与B之间、在B与B'之间以及在B'与A之间。在一些实施方案中，在C或C'区或B或B'区中的至少一种核苷酸的任何修饰(例如缺失、插入和/或取代)仍然保留了茎-环的末端环。在一些实施方案中，C与C'之间和/或B与B'之间的至少一个核苷酸的任何修饰(例如缺失、插入和/或取代)在至少一个末端环中保留三个连续的T核苷酸(即，TTT)。在另选的实施方案中，C与C'之间和/或B与B'之间的至少一个核苷酸的任何修饰(例如缺失、插入和/或取代)在至少一个末端环中保留三个连续的A核苷酸(即，AAA)。在一些实施方案中，本文中使用的经修饰的ITR可包含表4中所示的修饰组合中的任一个，并且还包含选自以下的任一个或多个区域中的至少一个核苷酸的修饰(例如缺失、插入和/或取代)：A'、A和/或D。例如，在一些实施方案中，本文中使用的经修饰的ITR可包含表4中所示的修饰组合中的任一个，并且还包含A区域中的至少一个核苷酸的修饰(例如缺失、插入和/或取代)。在一些实施方案中，本文中使用的经修饰的ITR可包含表4中所示的修饰组合中的任一个，并且还包含A'区域中的至少一个核苷酸的修饰(例如缺失、插入和/或取代)。在一些实施方案中，本文中使用的经修饰的ITR可包含表4中所示的修饰组合中的任一个，并且还包括A和/或A’区域中的至少一个核苷酸的修饰(例如缺失、插入和/或取代)。在一些实施方案中，本文中使用的经修饰的ITR可包含表4中所示的修饰组合中的任一个，并且还包含D区含中的至少一个核苷酸的修饰(例如缺失、插入和/或取代)。
在一个实施方案中，可以修饰结构元件的核酸序列(例如修饰1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个或更多个核苷酸或者其中的任何范围)，以产生经修饰的结构元件。在一个实施方案中，对ITR的特异性修饰例示于本文中(例如，SEQ IDNO:3、4、15-47、101-116或165-187)，或示于2018年12月6日提交的PCT/US2018/064242的图7A-图7B中(例如PCT/US2018/064242中的SEQ ID NO:97-98、101-103、105-108、111-112、117-134、545-54)。在一些实施方案中，可以修饰ITR(例如通过修饰1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个或更多个核苷酸或者其中的任何范围)。在其他实施方案中，ITR与SEQ ID NO:3、4、15-47、101-116或165-187的经修饰的ITR之一或SEQ IDNO:3、4、15-47、101-116或165-187的A-A'臂和C-C'和B-B'臂的含RBE区段或国际专利申请PCT/US18/49996的表2-9中所示(即，SEQ ID NO:110-112、115-190、200-468)可具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大序列一致性，所述国际专利申请全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，经修饰的ITR可包含例如所有特定臂(例如A-A'臂的全部或一部分，或B-B'臂的全部或一部分，或C-C'臂的全部或一部分)的去除或缺失，或另选地，形成环茎的1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多个碱基对的去除，只要对茎(例如单臂)进行封端的最终环仍然存在(例如参见2018年12月6日提交的国际专利申请PCT/US2018/064242的图7A中的ITR-21，该国际专利申请全文以引用方式并入本文)。在一些实施方案中，经修饰的ITR可包含从B-B'臂去除1、2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个碱基对。在一些实施方案中，经修饰的ITR可包含从C-C'臂去除1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多个碱基对(参见例如2018年12月6日提交的国际专利申请PCT/US2018/064242的图3B中的ITR-1或图7A中的ITR-45，该国际专利申请全文以引用方式并入本文)。在一些实施方案中，经修饰的ITR可包含从C-C'臂去除1、2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个碱基对和从B-B'臂去除1、2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个碱基对。设想去除碱基对的任何组合，例如可以在C-C'臂中去除6个碱基对以及在B-B'臂中去除2个碱基对。作为说明性示例，图3B展示了示例性的经修饰的ITR，其从C部分和C'部分各缺失至少7个碱基对，C和C'区域之间的环中的核苷酸被取代，以及从B区域和B'区域各自缺失至少一个碱基对，使得经修饰的ITR包含至少一个臂(例如C-C')截断的两个臂。在一些实施方案中，经修饰的ITR还包含从B区域和B'区域各自缺失至少一个碱基对，使得B-B'臂相对于WTITR也截断。
在一些实施方案中，相对于全长野生型ITR序列，经修饰的ITR可具有1至50个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50)核苷酸缺失。在一些实施方案中，相对于全长WT ITR序列，经修饰的ITR可具有1至30个核苷酸缺失。在一些实施方案中，相对于全长野生型ITR序列，经修饰的ITR可具有2至20个核苷酸缺失。
在一些实施方案中，经修饰的ITR在A或A'区域的含RBE部分中不含任何核苷酸缺失，以便不干扰DNA复制(例如，通过Rep蛋白结合到RBE，或在末端解链位点切割)。在一些实施方案中，预期用于本文中的经修饰ITR在如本文所述的B、B'、C和/或C区域中具有一个或多个缺失。
在一些实施方案中，包含对称ITR对或不对称ITR对的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体包含如本文所公开的调节开关和至少一个经选择具有选自由SEQ ID NO:3、4、15-47、101-116或165-187组成的组中的任一者的核苷酸序列的经修饰ITR。
在另一个实施方案中，结构元件的结构可以为经修饰的。例如，结构元件改变了茎高和/或环中核苷酸的数量。例如，茎高可以是约2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个或更多个核苷酸或者其中的任何范围。在一个实施方案中，茎高度可为约5个核苷酸至约9个核苷酸并且与Rep功能性地相互作用。在另一个实施方案中，茎高度可为约7个核苷酸并且与Rep功能性地相互作用。又如，环可具有3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个或更多个核苷酸或者其中的任何范围。
在另一个实施方案中，RBE或扩展RBE内GAGY结合位点或GAGY相关结合位点的数量可以增加或减少。在一个实施方案中，RBE或扩展RBE可包含1、2、3、4、5或6个或更多个GAGY结合位点或者其中的任何范围。每个GAGY结合位点可以独立地是精确的GAGY序列或类似于GAGY的序列，只要所述序列足以结合Rep蛋白即可。
在另一个实施方案中，可以改变(例如增加或减少)两个元件(诸如但不限于RBE和发夹)之间的间距，以改变与大Rep蛋白的功能性相互作用。例如，间距可以是约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个或更多个核苷酸或者其中的任何范围。
如本文所述的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可包含ITR结构，所述ITR结构相对于本文所公开的野生型AAV2 ITR结构经修饰，但仍然保留可操作的RBE、trs和RBE'部分。在一些实施方案中，用于表达PAH蛋白的ceDNA载体包含一个或多个功能性ITR多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包含Rep结合位点(RBS；AAV2的5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ ID NO:60))和末端解链位点(TRS；5’-AGTT(SEQ ID NO:62))。在一些实施方案中，至少一个ITR(wt或经修饰的ITR)是功能性的。在另选实施方案中，其中用于表达PAH蛋白的ceDNA载体包含彼此不同或不对称的两个经修饰的ITR，至少一个经修饰的ITR是功能性的并且至少一个经修饰的ITR是非功能性的。
在一些实施方案中，如本文所述的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的经修饰ITR(例如，左或右ITR)在环臂、截短臂或间隔子内具有修饰。具有环臂、截断臂或间隔子内的修饰的ITR的示例性序列列于国际申请PCT/US18/49996的表2(即，SEQ ID NO:135-190、200-233)、表3(例如，SEQ ID NO:234-263)、表4(例如，SEQ ID NO:264-293)、表5(例如，本文的SEQ ID NO:294-318)、表6(例如，SEQ ID NO:319-468)和表7-9(例如，SEQ ID NO:101-110、111-112、115-134)或表10A或10B(例如，SEQ ID NO:9、100、469-483、484-499)中，所述国际申请全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，包含不对称ITR对或对称mod-ITR对的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体中使用的经修饰的ITR选自国际申请PCT/US18/49996的表2、3、4、5、6、7、8、9和10A-图10B中所示的那些修饰中的任一个或组合，所述国际申请全文以引用方式并入本文。
用于以上类别中的每一者中的包含不对称ITR对或对称mod-ITR对的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体中的额外示例性经修饰ITR提供于表5A和5B中。表5A中的经修饰的右ITR的预测二级结构显示于2018年12月6日提交的国际申请PCT/US2018/064242的图7A中，并且表5B中的经修饰的左ITR的预测二级结构显示于2018年12月6日提交的国际申请PCT/US2018/064242的图7B中，所述国际申请全文以引用方式并入本文。
表5A和表5B展示了示例性的经修饰的右和左ITR。
表5A：示例性经修饰的右ITR。这些示例性经修饰的ITR可包含GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ ID NO:60)的RBE、ACTGAGGC(SEQ ID NO:69)的间隔子、间隔子互补序列GCCTCAGT(SEQ ID NO:70)和GAGCGAGCGAGCGCGC(SEQ ID NO:71)的RBE’(即，RBE的互补序列)。
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表5B：示例性的经修饰的左ITR。这些示例性经修饰的左ITR可包含GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ ID NO:60)的RBE、ACTGAGGC(SEQ ID NO:69)的间隔子、间隔子互补序列GCCTCAGT(SEQ ID NO:70)和GAGCGAGCGAGCGCGC(SEQ ID NO:71)的RBE互补序列(RBE')。
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在一个实施方案中，用于表达PAH蛋白的ceDNA载体在5'到3'方向上包含：第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)、所关注的核酸序列(例如包含如本文所述的经密码子修饰的核酸的表达盒)和第二AAV ITR，其中第一ITR(5'ITR)和第二ITR(3'ITR)相对于彼此不对称-也就是说，其具有彼此不同的3D空间构型。作为示例性实施方案，第一ITR可以是野生型ITR，并且第二ITR可以是突变的或经修饰的ITR，或反过来，其中第一ITR可以是突变的或经修饰的ITR，并且第二ITR可以是野生型ITR。在一些实施方案中，第一ITR和第二ITR都是mod-ITR，但具有不同序列或具有不同修饰，因此不是相同的经修饰的ITR，并且具有不同的3D空间构型。换句话说，具有不对称ITR的ceDNA载体包含这样的ITR，其中一个ITR相对于WT-ITR的任何变化不反映在另一个ITR中；或者，在不对称ITR具有经修饰的不对称ITR对的情况下，可以具有彼此不同的序列和不同的三维形状。用于表达PAH蛋白并且用于产生ceDNA质粒的ceDNA载体中的示例性不对称ITR示于表5A和5B中。
在一个另选的实施方案中，用于表达PAH蛋白的ceDNA载体包含两个对称mod-ITR，也就是说，两个ITR都具有相同序列，但为彼此的反向互补序列(反向)。在一些实施方案中，相对于来自相同AAV血清型的野生型ITR序列，对称的经修饰ITR对包含缺失、插入或取代中的至少一种或任何组合。对称ITR中的添加、缺失或取代是相同的，但彼此反向互补。例如，在5’ITR的C区域中插入3个核苷酸将反映为在3’ITR的C'区域中的相应部分中插入3个反向互补核苷酸。仅出于说明目的，如果在5'ITR中添加AACG，那么在3'ITR中相应位点处添加CGTT。例如，如果5'ITR有义链为ATCGATCG(SEQ ID NO:608)，在G与A之间添加AACG，以产生序列ATCGAACGATCG(SEQ ID NO:51)。相应的3'ITR有义链为CGATCGAT(SEQ ID NO:606)(ATCGATCG(SEQ ID NO:607)的反向互补序列)，其中在T与C之间添加CGTT(即，AACG的反向互补序列)以产生序列CGATCGTTCGAT(SEQ ID NO:49)(ATCGAACGATCG的反向互补序列)(SEQID NO:51)。
在另选的实施方案中，经修饰的ITR对如本文所定义是基本上对称的，也就是说，经修饰的ITR对可具有不同的序列，但是具有对应或相同的对称三维形状。例如，一个经修饰的ITR可以来自一种血清型，而另一个经修饰的ITR可以来自不同血清型，但它们在相同区域中具有相同突变(例如核苷酸插入、缺失或取代)。换句话说，仅出于说明目的，5'经修饰ITR可以来自AAV2并在C区域有一个缺失，而3'经修饰ITR可以来自AAV5并在C'区域中有相应的缺失，并且如果5'经修饰ITR和3'经修饰ITR具有相同或对称的三维空间组织，那么其作为修饰ITR对涵盖用于在本文中。
在一些实施方案中，基本上对称的mod-ITR对在3D空间中具有相同的A、C-C'和B-B'环，例如，如果基本上对称的经修饰ITR对中的经修饰ITR缺失C-C'臂，那么同源mod-ITR相应缺失C-C'环，并且在其同源mod-ITR的几何空间呈相同形状下，剩余A和B-B'环具有相似3D结构。仅作为示例，基本上对称的ITR可以具有对称的空间组织，使得它们的结构在几何空间中是相同的形状。例如，当将GC对修饰为例如CG对，反之亦然，或者将AT对修饰为TA对，反之亦然时，可能会发生这种情况。因此，使用上述经修改的5'ITR的示例性示例作为ATCGAACGATCG(SEQ ID NO:51)并且使用经修饰的3'ITR作为CGATCGTTCGAT(SEQ ID NO:49)(即，ATCGAACGATCG(SEQ ID NO:51)的反向互补序列)，如果例如5'ITR具有ATCGAACCATCG的序列(SEQ ID NO:50)，则这些经修饰的ITR仍然是对称的，其中添加的G被修饰为C，并且基本上对称的3'ITR具有CGATCGTTCGAT的序列(SEQ ID NO:49)，除a外没有T的相应修饰。在一些实施方案中，这种经修饰的ITR对是基本上对称的，因为经修饰的ITR对具有对称的立体化学。
表6显示对称修饰的示例性ITR对(即，经修饰的左ITR和经修饰的对称右ITR)，其用在用于表达PAH蛋白的ceDNA载体中。序列的黑体部分鉴定了部分ITR序列(即A-A'、C-C'和B-B'环的序列)。这些示例性经修饰ITR可包含GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ ID NO:60)的RBE、ACTGAGGC(SEQ ID NO:69)的间隔子、间隔子互补序列GCCTCAGT(SEQ ID NO:70)和GAGCGAGCGAGCGCGC(SEQ ID NO:71)的RBE’(即，RBE的互补序列)。
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在一些实施方案中，包含不对称ITR对的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可包含具有修饰的ITR，所述修饰对应于以下序列中的任一修饰：本文表5A-图5B中的任一者或多者中所示的ITR序列或ITR部分序列；或2018年12月6日提交的国际申请PCT/US2018/064242的图7A-图7B中所示的序列，所述国际申请全文并入本文；或2018年9月7日提交的国际申请PCT/US18/49996的表2、3、4、5、6、7、8、9或10A-10B中所公开的序列，所述国际申请全文以引用方式并入本文。
V.示例性ceDNA载体
如上文所述，本公开涉及重组ceDNA表达载体和编码PAH蛋白的包含经密码子修饰的核酸的ceDNA载体，其包含以下任一者：如上文所述的不对称ITR对、对称ITR对或基本上对称的ITR对。在某些实施方案中，本公开涉及具有侧接ITR序列和转基因的用于表达PAH蛋白的重组ceDNA载体，其中如本文所定义，ITR序列相对于彼此不对称、对称或基本上对称，并且ceDNA还包含位于侧接ITR之间的感兴趣的核酸序列(例如包含转基因的核酸的表达盒)，其中所述核酸分子不含病毒衣壳蛋白编码序列。
用于表达PAH蛋白的ceDNA表达载体可以为包括如本文所描述的(多个)核酸序列的可以便利地进行重组DNA程序的任何ceDNA载体，前提是改变至少一个ITR。本公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体与其中将引入ceDNA载体的宿主细胞相容。在某些实施方案中，ceDNA载体可以是线性的。在某些实施方案中，ceDNA载体可作为染色体外实体存在。在某些实施方案中，本公开的ceDNA载体可包含允许供体序列整合到宿主细胞基因组中的元件。如本文所用，“转基因”和“异源核酸序列”同义，并且可编码PAH蛋白，如本文所述。
A.调节元件。
包含如本文所定义的不对称的ITR对或对称的ITR对的如本文所描述的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可以进一步包含顺式调节元件的特定组合。
本文描述了包含PAH核酸序列的ceDNA载体，所述PAH核酸序列已进行密码子优化并与特定的顺式作用元件(例如，特异性启动子、特异性增强子以及特异性启动子和增强子的组合)组合，所述特定的顺式作用元件已测试苯丙氨酸水平的最佳校正(例如，表达和持续时间)。根据一些实施方案，当与特异性启动子序列和/或特异性增强子序列组合时，特定的经密码子优化的PAH核酸序列与相同的经密码子优化的PAH核酸序列与例如另一启动子序列和/或特异性增强子序列的组合相比表现更好。
在某些实施方案中，在启动子的上游提供增强子序列以提高启动子的功效。
在某些实施方案中，在经密码子优化的核酸序列的上游提供内含子序列。
(i)启动子：
普通技术人员应当了解，适当时，应当根据其启动的特定序列和组织或细胞类型来定制如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体中所使用的启动子。
用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的表达盒能够包括启动子，所述启动子能够影响整体表达水平以及细胞特异性。对于转基因表达，例如PAH蛋白表达，其可以包括高活性病毒衍生的即刻早期启动子。表达盒可以含有组织特异性的真核启动子，以将转基因表达限制在特定细胞类型，并减少由不受调节的异常表达引起的毒性效应和免疫反应。表7A和7B列出了可在ceDNA PAH治疗中实施的核心启动子序列。
表7A.核心启动子
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表7B.核心启动子描述
根据特定实施方案，启动子选自由VD(也称为“VanD”)启动子、人α1-抗胰蛋白酶(hAAT)启动子(包括CpG最小化的hAAT(979)启动子(CpGmin hAAT_core_C10)和其他CpGmin_hAAT启动子如hAAT_core_C06、hAAT_core_C07、hAAT_core_C08和hAAT_core_C09)和运甲状腺素蛋白(TTR)肝特异性启动子组成的组。
在一些实施方案中，VD启动子包含小鼠微小病毒(MVM)内含子、最小运甲状腺素蛋白启动子(TTRm)、丝氨酸蛋白酶抑制剂增强子(72bp)和TTRm 5'UTR。
根据一些实施方案，TTRm包含如下所示的SEQ ID NO:442：
GTCTGTCTGCACATTTCGTAGAGCGAGTGTTCCGATACTCTAATCTCCCTAGGCAAGGTTCATATTTGTGTAGGTTACTTATTCTCCTTTTGTTGACTAAGTCAATAATCAGAATCAGCAGGTTTGGAGTCAGCTTGGCAGGGATCAGCAGCCTGGGTTGGAAGGAGGGGGTATAAAAGCCCCTTCACCAGGAGAAGCCGTC(SEQ ID NO:442)。
根据一些实施方案，丝氨酸蛋白酶抑制剂增强子包含如下所示的SEQ ID NO:449：
GGGGGAGGCTGCTGGTGAATATTAACCAAGGTCACCCCAGTTATCGGAGGAGCAAACAGGGGCTAAGTCCAC(SEQ ID NO:449)。
根据一些实施方案，TTRm 5’UTR包含如下所示的SEQ ID NO:498：
ACACAGATCCACAAGCTCCTG(SEQ ID NO:498)。
根据另外的实施方案，VD启动子包含如下所示的SEQ ID NO:191：
CCGTCTGTCTGCACATTTCGTAGAGCGAGTGTTCCGATACTCTAATCTCCCTAGGCAAGGTTCATATTTGTGTAGGTTACTTATTCTCCTTTTGTTGACTAAGTCAATAATCAGAATCAGCAGGTTTGGAGTCAGCTTGGCAGGGATCAGCAGCCTGGGTTGGAAGGAGGGGGTATAAAAGCCCCTTCACCAGGAGAAGCCGTCACACAGATCCACAAGCTCCTG(SEQ ID NO:191)。
根据一些实施方案，hAAT(979)启动子包含SEQ ID NO:447。包含启动子组的hAAT(979)例示于SEQ ID NO:479中。
根据一些实施方案，CpGmin_hAAT启动子包含选自SEQ ID NO:443-447的序列。根据一些实施方案，CpGmin_hAAT启动子组为SEQ ID NO:475。根据一些实施方案，CpGmin_hAAT启动子组为SEQ ID NO:479。根据一些实施方案，运甲状腺素蛋白(TTR)肝特异性启动子包含表7A中列出的序列(SEQ ID NO:442)。
根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:191具有至少95％同一性的核酸序列。
根据一些实施方案，其中启动子包含与SEQ ID NO:443具有至少95％同一性的核酸序列。根据一些实施方案，其中启动子包含与SEQ ID NO:444具有至少95％同一性的核酸序列。
根据一些实施方案，其中启动子包含与SEQ ID NO:445具有至少95％同一性的核酸序列。根据一些实施方案，其中启动子包含与SEQ ID NO:446具有至少95％同一性的核酸序列。根据一些实施方案，其中启动子包含与SEQ ID NO:447具有至少95％同一性的核酸序列。
根据一些实施方案，其中启动子包含与SEQ ID NO:443具有至少96％同一性的核酸序列。根据一些实施方案，其中启动子包含与SEQ ID NO:444具有至少96％同一性的核酸序列。
根据一些实施方案，其中启动子包含与SEQ ID NO:445具有至少96％同一性的核酸序列。根据一些实施方案，其中启动子包含与SEQ ID NO:446具有至少96％同一性的核酸序列。根据一些实施方案，其中启动子包含与SEQ ID NO:447具有至少96％同一性的核酸序列。
根据一些实施方案，其中启动子包含与SEQ ID NO:443具有至少97％同一性的核酸序列。根据一些实施方案，其中启动子包含与SEQ ID NO:444具有至少97％同一性的核酸序列。根据一些实施方案，其中启动子包含与SEQ ID NO:445具有至少97％同一性的核酸序列。根据一些实施方案，其中启动子包含与SEQ ID NO:446具有至少97％同一性的核酸序列。根据一些实施方案，其中启动子包含与SEQ ID NO:447具有至少97％同一性的核酸序列。
根据一些实施方案，其中启动子包含与SEQ ID NO:443具有至少98％同一性的核酸序列。根据一些实施方案，其中启动子包含与SEQ ID NO:444具有至少98％同一性的核酸序列。根据一些实施方案，其中启动子包含与SEQ ID NO:445具有至少98％同一性的核酸序列。根据一些实施方案，其中启动子包含与SEQ ID NO:446具有至少98％同一性的核酸序列。根据一些实施方案，其中启动子包含与SEQ ID NO:447具有至少98％同一性的核酸序列。
根据一些实施方案，其中启动子包含与SEQ ID NO:443具有至少99％同一性的核酸序列。根据一些实施方案，其中启动子包含与SEQ ID NO:444具有至少99％同一性的核酸序列。根据一些实施方案，其中启动子包含与SEQ ID NO:445具有至少99％同一性的核酸序列。根据一些实施方案，其中启动子包含与SEQ ID NO:446具有至少99％同一性的核酸序列。根据一些实施方案，其中启动子包含与SEQ ID NO:447具有至少99％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，启动子组包含本文所述的启动子序列和增强子序列。根据一些实施方案，启动子组包含与SEQ ID NO:475具有至少95％同一性的核酸序列。根据一些实施方案，其中启动子包含与SEQ ID NO:475具有至少96％同一性的核酸序列。根据一些实施方案，其中启动子包含与SEQ ID NO:475具有至少97％同一性的核酸序列。根据一些实施方案，其中启动子包含与SEQ ID NO:475具有至少98％同一性的核酸序列。根据一些实施方案，其中启动子包含与SEQ ID NO:475具有至少99％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，启动子组包含本文所述的启动子序列和增强子序列。根据一些实施方案，其中启动子包含与SEQ ID NO:479具有至少95％同一性的核酸序列。根据一些实施方案，其中启动子包含与SEQ ID NO:479具有至少96％同一性的核酸序列。根据一些实施方案，其中启动子包含与SEQ ID NO:479具有至少97％同一性的核酸序列。根据一些实施方案，其中启动子包含与SEQ ID NO:479具有至少98％同一性的核酸序列。根据一些实施方案，其中启动子包含与SEQ ID NO:479具有至少99％同一性的核酸序列。
(ii)增强子
在一些实施方案中，表达经密码子优化的PAH的ceDNA包含一个或多个增强子。在一些实施方案中，增强子序列位于启动子序列的5'。在一些实施方案中，增强子序列位于启动子序列的3'。根据一些实施方案，增强子选自由丝氨酸蛋白酶抑制剂增强子、3xHNF1-4_ProEnh_10mer、5xHNF1_ProEnh_10mer组成的组。
表8A.增强子
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表8B.增强子元件的描述
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根据一些实施方案，与TTR启动子融合的3xHNF1-4_ProEnh(前白蛋白增强子)增强子包含SEQ ID NO:462所示的序列。
根据一些实施方案，与3x VanD-TTRe和TTR启动子融合的3xHNF1-4_ProEnh(前白蛋白增强子)增强子包含SEQ ID NO:463所示的序列。
根据一些实施方案，与TTR启动子融合的5xHNF1_ProEnh_enhancer包含SEQ IDNO:464所示的序列。根据一些实施方案，与3xVanD-TTRe和TTR启动子融合的5xHNF1_ProEnh_enhancer包含SEQ ID NO:465所示的序列。
根据一些实施方案，丝氨酸蛋白酶抑制剂增强子(SerpEnh)包含如下所示的序列：
GGGGGAGGCTGCTGGTGAATATTAACCAAGGTCACCCCAGTTATCGGAGGAGCAAACAGGGGCTAAGTCCAC(SEQ ID NO:449)。
在一些其他实施方案中，增强子可用于多个串联或重复序列中。非限制性示例包括SEQ ID NO:587-601中描述的增强子序列。
表9A.启动子组(组合的核心启动子和增强子)
表9B.启动子组(组合的核心启动子和增强子)注释
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表9C.启动子组：hAAT CpG最小化增强子和核心启动子CpG最小化hAAT core_C10 (hAAT_979或hAAT_core_C06)的组合。
(iii)5'UTR序列和内含子序列
在一些实施方案中，ceDNA载体包含5'UTR序列和/或位于5'ITR序列的3'的内含子序列。在一些实施方案中，5'UTR位于转基因例如编码PAH蛋白的序列的5’。示例性5'UTR序列在下面表10中和国际专利申请PCT/US2020/021328中列出，例如在表9A中，所述国际专利申请全文以引用方式并入本文。
表10.5'UTR
GE# 描述 SEQ ID NO
GE-1124 TTR-MVM-PmeI-Consensus-5pUTR 482
GE-1125 TTR-MVM_v2-PmeI-Consensus-5pUTR 483
GE-1126 TTR-MVM-PmeI*-Consensus-5pUTR 484
GE-1138 hAAT-5pUTR_v2 485
GE-1167 TTR-MVMspliced-PmeI-Consensus-5pUTR 486
GE-772 5pUTR-325243 487
GE-774 5pUTR-constant 489
GE-1208 hAAT-SV40-PmeI-Mod-5pUTR 490
GE-1209 hAAT-SV40-PmeI-Mod2-5pUTR 491
GE-1210 hAAT-SV40-PmeI-Con-5pUTR 492
GE-1211 hAAT-SV40-PmeI-325243-5pUTR 493
GE-1212 hAAT-SV40-PmeI-536-5pUTR 494
GE-1219 TTR-Xbal-MVM-PmeI-Consensus-5pUTR 495
GE-1220 TTR-XbaI-MVM_v2-PmeI-Consensus-5pUTR 496
GE-1221 TTR-XbaI-MVM-PmeI*-Consensus-5pUTR 497
GE-1122 TTR-5pUTR 498
GE-1260 hAAT-PmeI-Mod2-5pUTR 400
GE-1261 TTR-MVM_v2-PmeI-Mod2-5pUTR 500
GE-1262 TTR-MVM-PmeI-325243-5pUTR Copy 502
GE-1263 TTR-MVM-PmeI*-Mod2-5pUTR 502
GE-1264 TTR-MVM-PmeI-Mod2-5pUTR 503
GE-1265 TTR-MVMspliced-PmeI-Mod2-5pUTR 504
GE-1266 TTR-XbaI-MVM_v2-PmeI-Mod2-5pUTR 505
GE-1267 TTR-XbaI-MVM-PmeI*-Mod2-5pUTR 506
GE-1268 TTR-XbaI-MVM-PmeI-Mod2-5pUTR 507
GE-1269 hAAT-PmeI-Con-5pUTR 508
表10B.5'UTR描述
/>
在一些实施方案中，ceDNA载体包含位于ORF的5'的内含子。在一些其他实施方案中，ceDNA载体包含位于ORF序列内的内含子。可使用的合适内含子序列列于下面的表11A中。
表11A.嵌合内含子序列
GE 名称 序列标识符
GE-1252 hIVS-1B内含子 509
GE-1253 hIVS-1B-Wt 510
GE-1254 hPAH_Modified_Intron1_CpGfree_v1 511
GE-1255 hPAH-delta2KbIntron 512
GE-1256 mIVS-1B内含子 513
GE-1257 mIVS-1B-CpGfree_v1 514
GE-1258 Modified_intron 515
GE-1259 oIVS-v2 516
GE-1260 MVM_intron_v2 1000
表11B.嵌合内含子序列描述
根据一些实施方案，MVM内含子也可以在PAH开放阅读框的5'中实现(例如，作为5'UTR的一部分)。MVM内含子包含SEQ ID NO:1026，如下所示：
AAGAGGTAAGGGTTTAAGGGATGGTTGGTTGGTGGGGTATTAATGTTTAATTACCTGGAGCACCTGCCTGAAATCACTTTTTTTCAGGTTG(SEQ ID NO:1026)
(iv)3'UTR序列
在一些实施方案中，ceDNA载体包含位于3'ITR序列的5'的3'UTR序列。在一些实施方案中，3'UTR位于转基因例如编码PAH蛋白的序列的3’。示例性3'UTR序列在下面表12中和国际申请PCT/US2020/021328中列出，例如在表9B中，所述国际申请全文以引用方式并入本文。
表12.3'UTR元件
用于表达PAH蛋白的ceDNA载体还可包含转录后调节元件(WPRE)和BGH polyA。
(v)聚腺苷酸化序列
编码聚腺苷酸化序列的序列可包含在用于表达PAH蛋白的ceDNA载体中以使由ceDNA载体表达的mRNA稳定并且有助于核输出和翻译。在一个实施方案中，ceDNA载体不包含聚腺苷酸化序列。在其他实施方案中，用于表达PAH蛋白的ceDNA载体包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少40个、至少45个、至少50个或更多个腺嘌呤二核苷酸。在一些实施方案中，聚腺苷酸化序列包含约43个核苷酸、约40-50个核苷酸、约40-55个核苷酸、约45-50个核苷酸、约35-50个核苷酸或它们之间的任何范围。
表达盒可以包含所属领域已知的任何聚腺苷酸化序列或其变体。在一些实施方案中，聚腺苷酸化(polyA)序列选自国际专利申请PCT/US2020/021328中列出那些中的任一种，例如在表10中，所述国际专利申请全文以引用方式并入本文。也可以使用所属领域公知的其他polyA序列，例如，包括但不限于从牛BGHpA(例如，SEQ ID NO:68)或病毒SV40pA(例如，SEQ ID NO:86)中分离的天然存在的序列、或合成序列(例如，SEQ ID NO:87)。一些表达盒还可包含SV40晚期polyA信号上游增强子(USE)序列。在一些实施方案中，USE序列可以与SV40pA或异源poly-A信号组合使用。polyA序列位于编码PAH蛋白的转基因的3'。
表达盒还可以包含转录后元件以增加转基因的表达。在一些实施方案中，使用土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调节元件(WPRE)(例如SEQ ID NO:67)增强转基因表达。可以使用其他转录后加工元件，诸如来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因或乙型肝炎病毒(HBV)的转录后元件。分泌序列能够连接到转基因，例如VH-02和VK-A26序列，例如SEQ ID NO:88和SEQ ID NO:89。
(vi)核定位序列和DNA核靶向序列
在一些实施方案中，用于表达PAH蛋白的ceDNA载体包含一个或多个核定位序列(NLS)，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个NLS。在一些实施方案中，一个或多个NLS位于氨基末端处或附近、羧基末端处或附近、或这些位置的组合(例如氨基末端的一个或多个NLS和/或羧基末端的一个或多个NLS)。当存在多于一个NLS时，可以彼此独立地选择，使得单个NLS可以多于一个拷贝存在并且/或者与以一个或多个拷贝存在的一个或多个其他NLS组合存在。NLS的非限制性示例示于表13A中。
在一些实施方案中，用于表达PAH蛋白的ceDNA载体包含一个或多个DNA核靶向序列(DTS)以促进ceDNA被摄入靶细胞的核中。表13B列出了可在表达PAH蛋白的ceDNA载体中实现的DTS的非限制性示例。
表13A：核定位信号
表13B.DNA核靶向序列(DTS)
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表13C.DTS描述
B.ceDNA载体的其他组分
本公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可包含其他组分，诸如但不限于Kozak序列(表14A)、小鼠微小病毒(MVM)内含子、间隔子、CpG基序。在一些实施方案中，用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可包含涉及免疫反应或肝脏稳态的一个或多个微RNA(MIR)序列(表14B)。
表14A.Kozak序列
表14B.MIR序列
C.元件和ORF的组合
根据一些实施方案，经密码子优化的特定核酸序列与特定启动子、增强子或其他顺式元件的组合中的一种或多种配对。
根据一些实施方案，经密码子优化的序列包含hPAH_codop_ORF_v2，并且与编码VD_PromoterSet的核酸序列配对，如本文所述。根据一些实施方案，经密码子优化的序列包含hPAH_codop_ORF_v2，并且与编码VD_PromoterSet的核酸序列配对，如本文所述，其中VD启动子(例如，TTRm)还包含SERP增强子。根据一些实施方案，经密码子优化的序列包含hPAH_codop_ORF_v2，并且与编码VD_PromoterSet的核酸序列配对，如本文所述，其中VD启动子(例如，TTRm)包含3x SERP增强子。根据一些实施方案，经密码子优化的序列包含hPAH_codop_ORF_v2，并且与编码VD_PromoterSet的核酸序列配对，如本文所述，其中VD启动子包含3xSERP增强子并且还包含MVM内含子。
根据一些实施方案，经密码子优化的序列包含hPAH_codop_ORF_v2，并且与编码hAAT(979)_PromoterSet的核酸序列配对，如本文所述。根据一些实施方案，经密码子优化的序列包含hPAH_codop_ORF_v2，并且与编码TTR肝特异性启动子的核酸序列配对，如本文所述，并且还包含ProEnh_10mer和MVM内含子。
根据一些实施方案，经密码子优化的序列包含hPAH_codop_ORF_v2，并且与编码运甲状腺素蛋白(TTR)肝特异性启动子的核酸序列配对，如本文所述。根据一些实施方案，经密码子优化的序列包含hPAH_codop_ORF_v2，并且与编码运甲状腺素蛋白(TTR)肝特异性启动子的核酸序列配对，如本文所述，并且还包含MVM内含子。根据一些实施方案，经密码子优化的序列包含hPAH_codop_ORF_v2，并且与编码最小运甲状腺素蛋白(TTRm)肝特异性启动子的核酸序列配对，如本文所述。
根据一些实施方案，经密码子优化的序列包含hPAH_codop_ORF_v2delta1-29aa，并且与编码VD_PromoterSet或CpG最小化hAAT的核酸序列配对，如本文所述。
根据一些实施方案，经密码子优化的序列包含hPAH-r5-s29，并且与编码VD_PromoterSet的核酸序列配对，如本文所述，其中VD启动子包含3xSERP增强子。
根据一些实施方案，ceDNA构建体包含left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、VD_PromoterSet、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1。根据一些实施方案，ceDNA构建体由left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、VD_PromoterSet、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1组成。
根据一些实施方案，ceDNA构建体包含Left-ITR_v1:spacer_left-ITR_v1:VD_Promoter Set:PmeI_site:Consensus_Kozak:hPAH_cDNA_ORF_v3:PacI_site:WPRE_3pUTR:bGH:spacer_right-ITR_v1:right-ITR_v1。根据一些实施方案，ceDNA构建体由Left-ITR_v1:spacer_left-ITR_v1:VD_Promoter Set:PmeI_site:Consensus_Kozak:hPAH_cDNA_ORF_v3:PacI_site:WPRE_3pUTR:bGH:spacer_right-ITR_v1:right-ITR_v1组成。
根据一些实施方案，ceDNA构建体包含Left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、3xSerpEnh-TTRe-TTRm、MVM_intron、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1。根据一些实施方案，ceDNA构建体由Left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、3xSerpEnh-TTRe-TTRm、MVM_intron、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1组成。
根据一些实施方案，ceDNA构建体包含left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、VD_PromoterSet、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2_delta1-29aa、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1。根据一些实施方案，ceDNA构建体由left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、VD_PromoterSet、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2_delta1-29aa、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1组成。
根据一些实施方案，ceDNA构建体包含left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、3xVanD_TTRe_PromoterSet、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH-r5-s29::hIVS1B、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1。根据一些实施方案，ceDNA构建体由left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、3xVanD_TTRe_PromoterSet、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH-r5-s29::hIVS1B、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1组成。
根据一些实施方案，ceDNA构建体包含left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、3xVanD_TTRe_PromoterSet、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH-r5-s29::hIVS1B_33bpFlanks、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1。根据一些实施方案，ceDNA构建体由left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、3xVanD_TTRe_PromoterSet、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH-r5-s29::hIVS1B_33bpFlanks、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1组成。
根据一些实施方案，ceDNA构建体包含left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、3xVanD_TTRe_PromoterSet、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH-r5-s29::mod-Intron_oIVS-v2_33bpFlanks、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1。根据一些实施方案，ceDNA构建体由left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、3xVanD_TTRe_PromoterSet、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH-r5-s29::mod-Intron_oIVS-v2_33bpFlanks、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1组成。
根据一些实施方案，ceDNA构建体包含left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、3xVanD_TTRe_PromoterSet、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2_mIVS-intron1B_33bpFlanks、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1。根据一些实施方案，ceDNA构建体由left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、3xVanD_TTRe_PromoterSet、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2_mIVS-intron1B_33bpFlanks、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1组成。
根据一些实施方案，ceDNA构建体包含left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、3xVanD_TTRe_PromoterSet、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2_modified_Intron1_33bpFlanks、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1。根据一些实施方案，ceDNA构建体由left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、3xVanD_TTRe_PromoterSet、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2_modified_Intron1_33bpFlanks、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1组成。
根据一些实施方案，ceDNA构建体包含left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、hAAT(979)_PromoterSet、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1。根据一些实施方案，ceDNA构建体由left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、hAAT(979)_PromoterSet、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1组成。
根据一些实施方案，ceDNA构建体包含left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、VD_PromoterSet、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2、PacI_site、HBBv2_3pUTR、SV40_polyA、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1。根据一些实施方案，ceDNA构建体由left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、VD_PromoterSet、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2、PacI_site、HBBv2_3pUTR、SV40_polyA、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1组成。
根据一些实施方案，ceDNA构建体包含left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、VD_PromoterSet、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2、PacI_site、HBBv3_3pUTR、SV40_polyA、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1。根据一些实施方案，ceDNA构建体由left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、VD_PromoterSet、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2、PacI_site、HBBv3_3pUTR、SV40_polyA、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1组成。
根据一些实施方案，ceDNA构建体包含left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、VD_PromoterSet、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2、PacI_site、WPRE_3pUTR、SV40_polyA、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1。根据一些实施方案，ceDNA构建体由left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、VD_PromoterSet、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2、PacI_site、WPRE_3pUTR、SV40_polyA、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1组成。
根据一些实施方案，ceDNA构建体包含left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、VD_PromoterSet、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2、PacI_site、WPRE_3pUTR、HBBv2_3pUTR、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1。根据一些实施方案，ceDNA构建体由left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、VD_PromoterSet、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2、PacI_site、WPRE_3pUTR、HBBv2_3pUTR、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1组成。
根据一些实施方案，ceDNA构建体包含left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、3xHNF1-4_ProEnh_10mer、BamHI_site、TTR_liver_specific_Promoter、MVM_intron、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1。根据一些实施方案，ceDNA构建由left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、3xHNF1-4_ProEnh_10mer、BamHI_site、TTR_liver_specific_Promoter、MVM_intron、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1组成。
根据一些实施方案，ceDNA构建体包含left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、3xHNF1-4_ProEnh_10mer、HS-CRM8_SERP_Enhancer_nospacer、HS-CRM8_SERP_Enhancer_nospacer、BamHI_site、TTR_liver_specific_Promoter、MVM_intron、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1。根据一些实施方案，ceDNA构建体由left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、3xHNF1-4_ProEnh_10mer、HS-CRM8_SERP_Enhancer_nospacer、HS-CRM8_SERP_Enhancer_nospacer、BamHI_site、TTR_liver_specific_Promoter、MVM_intron、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1组成。
根据一些实施方案，ceDNA构建体包含left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、CpGfree20mer_1、5xHNF1_ProEnh_10mer、BamHI_site、TTR_liver_specific_Promoter、MVM_intron、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1。根据一些实施方案，ceDNA构建体由left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、CpGfree20mer_1、5xHNF1_ProEnh_10mer、BamHI_site、TTR_liver_specific_Promoter、MVM_intron、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1组成。
根据一些实施方案，ceDNA构建体包含left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、CpGfree20mer_1、5xHNF1_ProEnh_10mer、3xVanD_TTRe_PromoterSet_v2、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1。根据一些实施方案，ceDNA构建体由left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、CpGfree20mer_1、5xHNF1_ProEnh_10mer、3xVanD_TTRe_PromoterSet_v2、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1组成。
根据一些实施方案，ceDNA构建体包含left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、3xVanD_TTRe_PromoterSet_v2、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1。根据一些实施方案，ceDNA构建体由left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、3xVanD_TTRe_PromoterSet_v2、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1组成。
根据一些实施方案，ceDNA构建体包含left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、CpGmin_hAAT_Promoter_Set、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1。根据一些实施方案，ceDNA构建体由left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、CpGmin_hAAT_Promoter_Set、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1组成。
根据一些实施方案，ceDNA构建体包含left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2、HS-CRM8_SERP_Enhancer_nospacer、HS-CRM8_SERP_Enhancer_nospacer、HS-CRM8_SERP_Enhancer_nospacer、BamHI_site、TTR-promoter-d5pUTR、MVM_intron、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH-r3-s34、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1。根据一些实施方案，ceDNA构建体由left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2、HS-CRM8_SERP_Enhancer_nospacer、HS-CRM8_SERP_Enhancer_nospacer、HS-CRM8_SERP_Enhancer_nospacer、BamHI_site、TTR-promoter-d5pUTR、MVM_intron、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH-r3-s34、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1组成。
根据一些实施方案，ceDNA构建体包含left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2、HS-CRM8_SERP_Enhancer_nospacer、HS-CRM8_SERP_Enhancer_nospacer、HS-CRM8_SERP_Enhancer_nospacer、BamHI_site、TTR-promoter-d5pUTR、MVM_intron、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH-r5-s29、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1。根据一些实施方案，ceDNA构建体由left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2、HS-CRM8_SERP_Enhancer_nospacer、HS-CRM8_SERP_Enhancer_nospacer、HS-CRM8_SERP_Enhancer_nospacer、BamHI_site、TTR-promoter-d5pUTR、MVM_intron、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH-r5-s29、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1组成。
根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与选自由以下组成的组的序列具有至少90％同一性的核酸序列：SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:199、SEQ ID NO:200、SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:202、SEQ IDNO:203、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:212和SEQ ID NO:213。
D.调节开关
分子调节开关是一种响应信号而产生可测量的状态变化的开关。所述调节开关可以有效地与如本文所描述的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体组合以控制ceDNA载体对PAH蛋白的表达的输出。在一些实施方案中，用于表达PAH蛋白的ceDNA载体包含用于微调PAH蛋白表达的调节开关。例如，其可以发挥ceDNA载体的生物封存功能。在一些实施方案中，开关为被设计成以可控制和可调节的方式启动或停止(即，关闭)ceDNA载体中PAH蛋白的表达的“ON/OFF”型开关。在一些实施方案中，开关可以包含“杀伤开关”，一旦所述开关被激活，其就可以指令包括ceDNA载体的细胞经历细胞程序性死亡。所涵盖的在用于表达PAH蛋白的ceDNA载体中使用的示例性调节开关可用于调节转基因表达，并且在国际申请PCT/US18/49996中更全面地论述，该国际申请全文以引用方式并入本文。
(i)二元调节开关
在一些实施方案中，用于表达PAH蛋白的ceDNA载体包含可以用于可控制地调节PAH蛋白表达的调节开关。例如，位于ceDNA载体的ITR之间的表达盒可以另外包含可操作地连接到编码PAH蛋白的核酸序列的调节区，例如启动子、顺式元件、抑制因子、增强子等，其中调节区由一种或多种辅因子或外源因子调节。仅举例来说，调节区可以通过小分子开关或诱导型或阻遏型启动子进行调节。诱导型启动子的非限制性示例是激素诱导型或金属诱导型启动子。其他示例性诱导型启动子/增强子元件包括但不限于RU486诱导型启动子、蜕皮素诱导型启动子、雷帕霉素诱导型启动子和金属硫蛋白启动子。
(ii)小分子调节开关
多种所属领域已知的基于小分子的调节开关为所属领域中已知的，并且可以与如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体组合以形成调节开关控制的ceDNA载体。在一些实施方案中，调节开关可选自以下中的任何一种或组合：正交配体/核受体对，例如类视黄醇受体变体/LG335和GRQCIMFI，以及控制操作性连接的转基因的表达的人工启动子，诸如Taylor等人，BMC Biotechnology 10(2010):15中所公开；经工程改造的类固醇受体，例如具有C末端截短的经修饰的孕酮受体，其不能结合孕酮但结合RU486(米非司酮)(美国专利5,364,791)；来自果蝇的蜕皮素及其蜕皮甾类配体(Saez等人，PNAS,97(26)(2000),14512–14517)；或者由抗生素甲氧苄啶(TMP)控制的开关，如Sando R 3rd；NatMethods.2013,10(11):1085-8中所公开。在一些实施方案中，控制转基因或由ceDNA载体表达的调控开关是前药活化开关，如美国专利8,771,679和6,339,070中公开的活化开关，所述国际申请全文以引用方式并入本文。
(iii)“密码”调节开关
在一些实施方案中，调节开关可以是“密码开关”或“密码回路”。在发生特定条件时，也就是说，需要存在条件的组合才能发生转基因表达和/或阻遏时，密码开关允许微调对转基因从ceDNA载体的表达的控制。例如，为了发生转基因的表达，至少必须发生条件A和B。密码调节开关可以是任何数量的条件，例如，要存在至少2个、或至少3个、或至少4个、或至少5个、或至少6个、或至少7个或更多个条件方能发生转基因表达。在一些实施方案中，需要发生至少2个条件(例如A、B条件)，并且在某些实施方案中，需要发生至少3个条件(例如A、B和C，或A、B和D)。仅例如，为了从具有密码“ABC”调节开关的ceDNA发生基因表达，必须存在条件A、B和C。条件A、B和C可以如下：条件A是存在病状或疾病，条件B是激素响应，并且条件C是对转基因表达的响应。例如，如果转基因编辑缺陷性EPO基因，那么条件A是存在慢性肾病(CKD)，如果受试者的肾脏中有低氧状况，那么发生条件B，条件C是肾脏中产生促红细胞产生素的细胞(EPC)的募集受损；或者，HIF-2活化受损。一旦氧水平升高或达到期望的EPO水平，转基因就会关闭，直到再次发生3个条件，它重新打开。
在一些实施方案中，涵盖用于ceDNA载体中的密码调节开关或“密码回路”包含杂合转录因子(TF)以扩大用于界定生物封存条件的环境信号的范围和复杂度。与在预定条件存在下触发细胞死亡的致命开关相反，“密码回路”允许在特定“密码”存在下细胞存活或转基因表达，并且只有当存在预定环境条件或密码时，才可以容易地重新编程以允许转基因表达和/或细胞存活。
本文所公开的调节开关，例如小分子开关、基于核酸的开关、小分子-核酸杂合开关、转录后转基因调节开关、翻译后调节、辐射控制开关、低氧介导的开关和如本文所公开的所属领域中普通技术人员已知的其他调节开关中的任何和所有组合均可以用于如本文所公开的密码调节开关中。涵盖使用的调节开关也在综述文章Kis等人，J R SocInterface.12:20141000(2015)中论述，并总结在Kis的表1中。在一些实施方案中，用于密码系统中的调节开关可以选自国际专利申请PCT/US18/49996的表11中所公开的任何开关或开关组合，所述专利申请全文以引用方式并入本文。
(iv)控制转基因表达的基于核酸的调节开关
在一些实施方案中，用于控制ceDNA对PAH蛋白的表达的调节开关是以基于核酸的控制机制为基础。示例性核酸控制机制是所属领域中已知的并且是设想使用的。例如，此类机制包括核糖开关，例如以下文献中所公开的核糖开关：例如US2009/0305253、US2008/0269258、US2017/0204477、WO2018026762A1、美国专利9,222,093和EP申请EP288071；以及Villa JK等人的综述中所公开的核糖开关(Microbiol Spectr.2018年5月；6(3))。还包括代谢物响应性转录生物传感器，例如WO2018/075486和WO2017/147585中公开的那些。设想使用的其他所属领域已知的机制包括用siRNA或RNAi分子(例如miR、shRNA)使转基因沉默。例如，ceDNA载体可以包含编码与ceDNA载体所表达的转基因的一部分互补的RNAi分子的调控开关。当此类RNAi表达时，即使ceDNA载体表达转基因(例如PAH蛋白)，所述转基因也将因互补的RNAi分子而沉默，并且当ceDNA载体表达转基因时而所述RNAi未表达时，所述转基因不会因RNAi沉默。
在一些实施方案中，调节开关为组织特异性自我失活型调节开关，例如US2002/0022018中所公开，其中调节开关在其中转基因表达原本可能不利的位点有意地将转基因(例如PAH蛋白)关闭。在一些实施方案中，调节开关是重组酶可逆基因表达系统，例如US2014/0127162和美国专利8,324,436中所公开。
(v)转录后和翻译后调节开关
在一些实施方案中，用于控制ceDNA载体对PAH蛋白的表达的调节开关为转录后修饰系统。例如，此类调节开关可以是对四环素或茶碱敏感的适体酶(aptazyme)核糖开关，如以下中所公开：US2018/0119156、GB201107768、WO2001/064956A3、欧洲专利2707487和Beilstein等人，ACS Synth.Biol.,2015,4(5)，第526–534页；Zhong等人，Elife.2016年11月2日；5.pii:e18858。在一些实施方案中，设想所属领域普通技术人员可以编码转基因和含有配体敏感性(OFF-开关)适体的抑制性siRNA二者，净结果是配体敏感性ON-开关。
(vi)其他示例性调节开关
任何已知的调节开关都可以用于ceDNA载体中以控制ceDNA载体对PAH蛋白的表达，包括环境变化所触发的表达。另外的示例包括但不限于：Suzuki等人，ScientificReports 8；10051(2018)的BOC方法；遗传密码扩展和非生理性氨基酸；辐射控制或超声波控制的on/off开关(参见例如Scott S等人，Gene Ther.2000年7月；7(13):1121-5；美国专利5,612,318、5,571,797、5,770,581、5,817,636和WO1999/025385A1)。在一些实施方案中，调节开关由可植入系统控制，例如美国专利7,840,263、US2007/0190028A1中所公开，其中基因表达是通过一种或多种形式的能量控制，包括电磁能，所述能量将可操作地连接到ceDNA载体中的转基因的启动子活化。
在一些实施方案中，设想用于ceDNA载体中的调节开关是低氧介导的或胁迫活化的开关，例如WO1999060142A2、美国专利5,834,306、6,218,179、6,709,858、US2015/0322410；Greco等人，(2004)Targeted Cancer Therapies 9,S368中所公开的那些，所述文献全文以引用方式并入本文，以及FROG、TOAD和NRSE元件以及条件诱导型沉默元件，包括低氧反应元件(HRE)、炎症反应元件(IRE)和剪切应力活化元件(SSAE)，例如美国专利9394526中所公开，该专利全文以引用方式并入本文。此类实施方案可用于在缺血后或在缺血组织和/或肿瘤中打开转基因从ceDNA载体的表达。
(vii)杀伤开关
本文所述的其他实施方案涉及如本文所述的包含杀伤开关的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体。如本文所公开的杀伤开关能够使包括ceDNA载体的细胞被杀伤或经历程序性细胞死亡，作为从受试者的系统中永久去除引入的ceDNA载体的手段。所属领域的普通技术人员将了解，杀伤开关在用于表达PAH蛋白的ceDNA载体中的使用通常联合ceDNA载体靶向受试者可以接受地损失的有限数目个细胞或靶向期望细胞凋亡时的细胞类型(例如癌细胞)。在所有方面，如本文所公开的“杀伤开关”被设计成在缺乏输入的存活信号或其他指定条件下提供对包括ceDNA载体的细胞的快速而稳固的细胞杀伤。换句话说，由如本文所描述的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体编码的杀伤开关可以使包含ceDNA载体的细胞的细胞存活受特定输入信号所限定的环境限制。如果希望从受试者中去除用于表达PAH蛋白的ceDNA载体或确保其不表达所编码的转基因，那么此类杀伤开关发挥生物学的生物封存功能。
本领域的普通技术人员已知的其他杀伤开关被涵盖在内以在如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体中使用，例如US2010/0175141、US2013/0009799、US2011/0172826、US2013/0109568中所公开，以及在如下文献中公开的杀伤开关：Jusiak等人，Reviews in Cell Biology and molecular Medicine；2014；1-56；Kobayashi等人，PNAS,2004；101；8419-9；Marchisio等人，Int.Journal of Biochem and Cell Biol.,2011；43；310-319；以及Reinshagen等人，Science Translational Medicine,2018,11，所有这些文献全文以引用方式并入本文。
因此，在一些实施方案中，用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可以含有包含编码效应毒素或报告蛋白的核酸的杀伤开关核酸构建体，其中效应毒素(例如死亡蛋白)或报告蛋白的表达受预定条件控制。例如，预定条件可以是存在环境试剂，例如外源试剂，在没有所述环境试剂的情况下，细胞将默认表达效应毒素(例如死亡蛋白质)并且被杀伤。在另选的实施方案中，预定条件是存在两种或更多种环境试剂，例如细胞将仅在提供两种或更多种必需的外源试剂时存活，而在其中的任一种不存在的情况下，包含ceDNA载体的细胞被杀伤。
在一些实施方案中，用于表达PAH蛋白的ceDNA载体经修饰以并入杀伤开关，从而破坏包含ceDNA载体的细胞，以有效地终止ceDNA载体所表达的转基因的体内表达(例如PAH蛋白的表达)。具体地说，进一步对ceDNA载体进行基因工程改造以表达在哺乳动物细胞中、在正常生理学条件下不具功能性的开关蛋白。仅在药物施用后或在特异性靶向这种开关蛋白的环境条件下，表达开关蛋白的细胞被破坏，从而终止治疗蛋白或肽的表达。例如，据报告，表达HSV-胸苷激酶的细胞在药物(例如苷昔洛韦(ganciclovir)和胞嘧啶脱氨酶)施用后可以被杀伤。参见例如Dey和Evans，Suicide Gene Therapy by Herpes Simplex Virus-1 Thymidine Kinase(HSV-TK),in Targets in Gene Therapy，由You编辑(2011)；以及Beltinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(15):8699-8704(1999)。在一些实施方案中，ceDNA载体可以包括siRNA杀伤开关，称为DISE(存活基因排除所诱发的死亡)(Murmann等人，Oncotarget.2017；8:84643-84658.Induction of DISE in ovarian cancer cells invivo)。
VI.制备ceDNA载体的方法
一般制备方法
用于产生如本文所定义的包含不对称的ITR对或对称的ITR对的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的某些方法描述于2018年9月7日提交的国际申请PCT/US18/49996的章节IV中，所述申请全文以引用方式并入本文。在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可以如本文所描述使用昆虫细胞产生。在另选的实施方案中，如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可以以合成方式产生，并且在一些实施方案中，以游离方法产生，如2019年1月18日提交的国际申请PCT/US19/14122所公开，所述申请全文以引用方式并入本文。
如本文所述，在一个实施方案中，用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可以例如通过包括以下步骤的方法获得：a)在能有效诱导在宿主细胞内产生ceDNA载体的条件下并持续足以诱导在宿主细胞内产生ceDNA载体的时间，在Rep蛋白的存在下培育具有不含病毒衣壳编码序列的多核苷酸表达构建体模板(例如ceDNA质粒、ceDNA杆粒和/或ceDNA杆状病毒)的宿主细胞(例如昆虫细胞)群体，并且其中宿主细胞不包含病毒衣壳编码序列；以及b)从宿主细胞中采集和分离ceDNA载体。Rep蛋白的存在诱导具有经修饰的ITR的载体多核苷酸复制，从而在宿主细胞中产生ceDNA载体。然而，没有表达病毒粒子(例如，AAV病毒粒子)。因此，没有大小限制，如在AAV或其他基于病毒的载体中天然强加的大小限制。
可以通过以下来确认从宿主细胞分离的ceDNA载体的存在：用在ceDNA载体上具有单个识别位点的限制酶来消化从宿主细胞分离的DNA，并在非变性凝胶上分析消化的DNA材料，以与线性和非连续DNA相比确认线性和连续DNA的特征带的存在。
在另一方面，本公开提供了将DNA载体多核苷酸表达模板(ceDNA模板)稳定地整合至其自身基因组中的宿主细胞系用于产生非病毒DNA载体的用途，例如Lee,L.等人(2013)Plos One 8(8):e69879中所述。优选地，Rep以约3的MOI加入宿主细胞中。当宿主细胞系是哺乳动物细胞系、例如HEK293细胞时，所述细胞系可以具有稳定整合的多核苷酸载体模板，并且可以使用第二载体、例如疱疹病毒将Rep蛋白引入细胞中，使得在Rep和辅助病毒存在下切除和扩增ceDNA。
在一个实施方案中，用于制造如本文所描述的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的宿主细胞为昆虫细胞，并使用杆状病毒递送编码Rep蛋白的多核苷酸和用于ceDNA的非病毒DNA载体多核苷酸表达构建体模板，例如图3A-图3C和实施例1中所描述。在一些实施方案中，宿主细胞经工程改造以表达Rep蛋白。
然后从宿主细胞中收获和分离ceDNA载体。从细胞采集和收集本文所描述的ceDNA载体的时间可以进行选择和优化，以实现高产率地产生ceDNA载体。例如，可以根据细胞活力、细胞形态、细胞生长等选择采集时间。在一个实施方案中，细胞在足以产生ceDNA载体的条件下生长，并在杆状病毒感染后足以产生ceDNA载体但在大多数细胞开始因杆状病毒毒性而死亡之前的时间采集。可以使用质粒纯化试剂盒，例如，Qiagen Endo-Free Plasmid试剂盒分离DNA载体。为分离质粒而开发的其他方法也适用于DNA载体。通常，可以采用任何核酸纯化方法。
DNA载体可以通过所属领域的技术人员已知用于纯化DNA的任何手段来纯化。在一个实施方案中，ceDNA载体被纯化为DNA分子。在另一个实施方案中，将ceDNA载体作为外泌体或微粒进行纯化。
用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的存在可以通过以下来证实：用在ceDNA载体上具有单个识别位点的限制酶消化从细胞中分离的载体DNA，并使用凝胶电泳分析被消化和未被消化的DNA物质，以证实与线性且非连续的DNA相比线性且连续的DNA的特征带的存在。图3C和图3D示出了用于鉴定通过本文的方法产生的封闭端ceDNA载体的存在的一个实施方案。
VII.药物组合物
在另一方面，提供了药物组合物。药物组合物包含如本文所描述的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体和药学上可接受的载剂或稀释剂。
如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可以并入适于施用于受试者的药物组合物中以体内递送到受试者的细胞、组织或器官。通常，药物组合物包括如本文所公开的ceDNA-载体和药学上可接受的载剂。例如，如本文所述的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可以并入适于期望的治疗性施用途径(例如肠胃外施用)的药物组合物中。还涵盖通过高压静脉内或动脉内输注以及例如核内显微注射或胞浆内注射等细胞内注射进行的被动组织转导。用于治疗目的的药物组合物可配制成溶液、微乳液、分散液、脂质体或其他适合高ceDNA载体浓度的有序结构。无菌注射溶液可以通过将所需量的ceDNA载体化合物根据需要与上文列举的成分之一或组合一起并入适当的缓冲液中、然后进行过滤灭菌来制备。可以配制包括ceDNA载体，以将核酸中的转基因递送到接受者的细胞，使得转基因或供体序列在其中治疗性表达。组合物还可以包括药学上可接受的载剂。
包含用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的药学活性组合物可以被配制成将用于不同目的的转基因递送到细胞，例如受试者的细胞。
用于治疗目的的药物组合物通常必须在制造和存储条件下是无菌的和稳定的。组合物可以配制成溶液、微乳液、分散液、脂质体或其他适合于高ceDNA载体浓度的有序结构。无菌注射溶液可以通过将所需量的ceDNA载体化合物根据需要与上文列举的组分中的一种或组合一起并入适当的缓冲液中，接着进行过滤灭菌来制备。
如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可以并入适于局部、全身、羊膜内、鞘内、颅内、动脉内、静脉内、淋巴管内、腹膜内、皮下、气管、组织内(例如肌肉内、心内、肝内、肾内、脑内)、鞘内、膀胱内、结膜(例如眼眶外、眼眶内、眼眶后、视网膜内、视网膜下、脉络膜、脉络膜下、基质内、眼房内和玻璃体内)、耳蜗内和经粘膜(例如经口、经直肠、经鼻)施用的药物组合物中。还涵盖通过高压静脉内或动脉内输注以及如核内显微注射或胞质内注射的细胞内注射进行的被动组织转导。
在一些方面中，本文所提供的方法包含将一种或多种如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体递送到宿主细胞。本文还提供了通过这类方法产生的细胞，以及包含这类细胞或由这类细胞产生的生物体(例如动物、植物或真菌)。核酸的递送方法可包括脂质转染、核转染、显微注射、生物弹药、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质：核酸缀合物、裸DNA和试剂增强的DNA吸收。脂质转染描述于例如美国专利5,049,386、4,946,787和4,897,355(所述专利全文以引用方式并入本文)中，并且脂质转染试剂是市售的(例如，TransfectamTM和LipofectinTM)。可以递送到细胞(例如体外或离体施用)或靶组织(例如体内施用)。
将核酸递送到细胞的各种技术和方法是所属领域中已知的。例如，核酸例如用于表达PAH蛋白的ceDNA可以被配制到脂质纳米粒子(LNP)、类脂质(lipidoid)、脂质体、脂质纳米粒子、脂质体复合物(lipoplex)或核壳纳米粒子中。通常，LNP由核酸(例如ceDNA)分子、一种或多种可电离或阳离子脂质(或其盐)、一种或多种非离子或中性脂质(例如磷脂)、防止聚集的分子(例如PEG或PEG-脂质缀合物)以及任选的固醇(例如胆固醇)构成。
另一种用于将核酸例如用于表达PAH蛋白的ceDNA递送到细胞的方法为使核酸与被细胞内化的配体缀合。例如，配体可以结合细胞表面上的受体并通过胞吞而被内化。配体可以与核酸中的核苷酸共价连接。用于将核酸递送到细胞中的示例性缀合物描述于例如国际专利申请公布WO2015/006740、WO2014/025805、WO2012/037254、WO2009/082606、WO2009/073809、WO2009/018332、WO2006/112872、WO2004/090108、WO2004/091515和WO2017/177326中，所有这些专利申请公布的内容全文以引用方式并入本文。
核酸例如用于表达PAH蛋白的ceDNA载体还可以通过转染递送到细胞。有用的转染方法包含(但不限于)：脂质介导的转染、阳离子聚合物介导的转染或磷酸钙沉淀。转染试剂在所属领域中是熟知的并且包含(但不限于)：TurboFect转染试剂(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific))、Pro-Ject试剂(赛默飞世尔科技)、TRANSPASSTMP蛋白转染试剂(新英格兰生物实验室)、CHARIOTTM蛋白递送试剂(Active Motif)、PROTEOJUICETM蛋白转染试剂(EMD密理博)、293fectin、LIPOFECTAMINETM2000、LIPOFECTAMINETM3000(赛默飞世尔科技)、LIPOFECTAMINETM(赛默飞世尔科技)、LIPOFECTINTM(赛默飞世尔科技)、DMRIE-C、CELLFECTINTM(赛默飞世尔科技)、OLIGOFECTAMINETM(赛默飞世尔科技)、LIPOFECTACETM、FUGENETM(瑞士巴塞尔的罗氏(Roche,Basel,Switzerland))、FUGENETMHD(罗氏)、TRANSFECTAMTM(转染胺，威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司(Promega,Madison,Wis.))、TFX-10TM(普洛麦格公司)、TFX-20TM(普洛麦格公司)、TFX-50TM(普洛麦格公司)、TRANSFECTINTM(加利福尼亚州赫拉克勒斯的伯乐公司(BioRad,Hercules,Calif.))、SILENTFECTTM(伯乐公司)、EffecteneTM(加利福尼亚州瓦伦西亚的凯杰公司(Qiagen,Valencia,Calif.))、DC-chol(阿凡提极性脂质公司(Avanti Polar Lipids))、GENEPORTERTM(加利福尼亚圣地亚哥的基因疗法系统(Gene Therapy Systems,San Diego,Calif.))、DHARMAFECT 1TM(科罗拉多州拉斐特的达尔马肯(Dharmacon,Lafayette,Colo.))、DHARMAFECT 2TM(达尔马肯)、DHARMAFECT 3TM(达尔马肯)、DHARMAFECT 4TM(达尔马肯)、ESCORTTMIII(密苏里州圣路易斯的西格玛公司(Sigma,St.Louis,Mo.))和ESCORTTMIV(西格玛化学品公司(Sigma ChemicalCo.))。核酸，如ceDNA，也可以通过所属领域的技术人员已知的微流体方法递送到细胞。
如本文所描述的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体还可以直接施用于生物体以在体内转导细胞。施用是通过正常用于引入分子与血液或组织细胞最终接触的任何途径，包含(但不限于)：注射、输注、局部施用和电穿孔。合适的施用此类核酸的方法是可获得的并且是本领域的技术人员公知的，并且虽然可以使用超过一种途径来施用特定的组合物，但特定的途径通常可以提供比另一途径更直接和更有效的反应。
引入如本文所公开的用于表达PAH蛋白的核酸载体ceDNA载体的方法可以例如通过如例如美国专利第5,928,638号中所描述的方法来递送到造血干细胞中，所述美国专利全文以引用方式并入本文。
本公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可以被添加到脂质体中以递送到受试者的细胞或靶器官中。脂质体是具有至少一个脂质双层的囊泡。在医药研发的背景下，脂质体通常用作药物/治疗剂递送的载剂。其通过与细胞膜融合并重新定位其脂质结构以递送药物或活性药物成分(API)来起作用。用于此类递送的脂质体组合物由磷脂，尤其具有磷脂酰胆碱基团的化合物构成，然而这些组合物还可以包括其他脂质。2018年9月7日提交的国际申请PCT/US2018/050042和2018年12月6日提交的国际申请PCT/US2018/064242中公开了示例性脂质体和脂质体配方，包括(但不限于)含有聚乙二醇(PEG)官能基的化合物，参见例如标题为“医药配方”的章节，每个国际申请的内容全文以引用方式并入本文。
所属领域已知的各种递送方法或其改良方法可用于在体外或体内递送ceDNA载体。例如，在一些实施方案中，用于表达PAH蛋白的ceDNA载体是通过机械能、电能、超声波能、流体动力能或基于激光的能量使得短暂渗透细胞膜以使得便于DNA进入靶向细胞中来递送。例如，可以通过经过大小限制的通道挤压细胞或通过所属领域中已知的其他手段来瞬时破坏细胞膜来递送ceDNA载体。在一些情况下，单独的ceDNA载体作为裸DNA直接注射到以下任一组织中：任何一种或多种组织选自：肝脏、肾脏、胆囊、前列腺、肾上腺、心脏、肠、肺和胃、皮肤、胸腺，心肌或骨骼肌。在一些情况下，通过基因枪递送ceDNA载体。涂覆有无衣壳的AAV载体的金或钨球形粒子(直径1-3μm)可以通过加压气体加速到高速而渗透到目标组织细胞中。
本文特别涵盖包含用于表达PAH蛋白的ceDNA载体和药学上可接受的载剂的组合物。在一些实施方案中，ceDNA载体与脂质递送系统，例如本文所述的脂质体一起配制。在一些实施方案中，这类组合物通过熟练从业人员期望的任何途径来施用。可以通过不同途径，包括经口、肠胃外、舌下、经皮直肠、经粘膜、局部、通过吸入、经颊施用、胸膜内、静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、鼻内鞘内和关节内或其组合，向受试者施用组合物。对于兽医用途，可根据正常兽医实践将组合物作为适当可接受的配制物施用。兽医可以很容易地确定最适合具体动物的给药方案和施用途径。可以通过传统注射器、无针注射装置、“微弹轰击基因枪”或其他物理方法(例如电穿孔(“EP”)、流体动力学方法或超声波)施用组合物。
在一些情况下，用于表达PAH蛋白的ceDNA载体是通过流体动力学注射来递送，所述流体动力学注射为将任何水溶性化合物和粒子直接细胞内递送到内脏和整个肢体的骨骼肌中的简单且高效的方法。
在一些情况下，用于表达PAH蛋白的ceDNA载体是通过超声波，通过在膜中制造纳米级孔以便于将DNA粒子细胞内递送到内脏或肿瘤的细胞中来递送，因此质粒DNA的大小和浓度在系统的效率中起重要作用。在一些情况下，通过使用磁场的磁转染来递送ceDNA载体，以将含有核酸的粒子集中到目标细胞中。
在一些情况下，可以使用化学递送系统，例如通过使用纳米复合物，其包含用属于阳离子脂质体/胶束或阳离子聚合物的聚阳离子纳米粒子来压紧带负电核酸。用于递送方法的阳离子脂质包含但不限于单价阳离子脂质、多价阳离子脂质、含胍化合物、胆固醇衍生化合物、阳离子聚合物、(例如聚(乙烯亚胺)、聚-L-赖氨酸、鱼精蛋白、其他阳离子聚合物)和脂质-聚合物杂化物。
A.外泌体：
在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体是通过包装于外泌体中来递送。外泌体是胞吞来源的小膜囊泡，其在多囊泡体与质膜融合后被释放到细胞外环境中。其表面由来自供体细胞的细胞膜的脂质双层组成，其含有来自产生外泌体的细胞的胞溶质并且在表面上展现来自亲本细胞的膜蛋白。外泌体由包含上皮细胞、B和T淋巴细胞、肥大细胞(MC)以及树突状细胞(DC)在内的各种细胞类型产生。一些实施方案设想使用直径在10nm与1μm之间、20nm与500nm之间、30nm与250nm之间、50nm与100nm之间的外泌体。使用外泌体的供体细胞或通过将特定核酸引入外泌体中，可以分离外泌体以递送到目标细胞中。所属领域中已知的各种方法可以用于产生含有本公开的无衣壳AAV载体的外泌体。
B.微米粒子/纳米粒子
在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体是通过脂质纳米粒子来递送。通常，脂质纳米粒子包含可电离的氨基脂质(例如4-(二甲基氨基)丁酸三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基酯、DLin-MC3-DMA、磷脂酰胆碱(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱，DSPC)、胆固醇和外被脂质(聚乙二醇-二肉豆蔻酰基甘油，PEG-DMG)，例如Tam等人(2013).Advances in Lipid Nanoparticles for siRNA delivery.Pharmaceuticals5(3):498-507所公开。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子具有介于约10nm和约1000nm之间的平均直径。在一些实施方案中，脂质纳米粒子具有小于300nm的直径。在一些实施方案中，脂质纳米粒子具有介于约10nm和约300nm之间的直径。在一些实施方案中，脂质纳米粒子具有小于200nm的直径。在一些实施方案中，脂质纳米粒子具有介于约25nm和约200nm之间的直径。在一些实施方案中，脂质纳米粒子制剂(例如包含多个脂质纳米粒子的组合物)具有一定的尺寸分布，其中平均尺寸(例如直径)为约70nm至约200nm，并且更典型地，平均尺寸为约100nm或更小。
所属领域中已知的多种脂质纳米粒子可以用于递送如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体。例如，在美国专利第9,404,127号、第9,006,417号和第9,518,272号中描述了使用脂质纳米粒子的各种递送方法。
在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体是通过金纳米粒子来递送。通常，核酸可以与金纳米粒子共价结合或与金纳米粒子非共价结合(例如通过电荷-电荷相互作用结合)，例如如Ding等人(2014).Gold Nanoparticles for NucleicAcid Delivery.Mol.Ther.22(6)；1075-1083所述。在一些实施方案中，使用例如美国专利6,812,334中所述的方法制备金纳米粒子-核酸缀合物。
B.缀合物
在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体与增强细胞吸收的试剂缀合(例如共价结合)。“增加细胞吸收的药剂”是促进核酸跨脂质膜运输的分子。例如，核酸能够与亲脂性化合物(例如胆固醇、生育酚等)、细胞穿透肽(CPP)(例如穿膜肽、TAT、Syn1B等)和多胺(例如精胺)缀合。增强细胞吸收的试剂的其他实施方案公开于例如Winkler(2013)Oligonucleotide conjugates for therapeuticapplications.Ther.Deliv.4(7)；791-809中。
在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体与聚合物(例如聚合分子)或叶酸(folate)分子(例如叶酸(folic acid)分子)缀合。通常，与聚合物缀合的核酸的递送是所属领域中已知的，例如WO2000/34343和WO2008/022309中所描述。在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体与聚(酰胺)聚合物缀合，例如美国专利8,987,377所述。在一些实施方案中，如美国专利8,507,455中所述，将本公开所描述的核酸与叶酸分子缀合。
在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体与碳水化合物缀合，例如美国专利8,450,467中所述。
C.纳米胶囊
或者，可以使用如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的纳米胶囊配制物。纳米胶囊通常可以呈稳定并且可再现的方式截留物质。为了避免由于细胞内聚合物过载所致的副作用，应使用能够在体内降解的聚合物来设计此类超细粒子(尺寸约0.1μm)。满足这些要求的可生物降解的聚烷基-氰基丙烯酸酯纳米粒子是预期使用的。
D.脂质体
本公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可以被添加到脂质体中以递送到受试者的细胞或靶器官中。脂质体是具有至少一个脂质双层的囊泡。在医药研发的背景下，脂质体通常用作药物/治疗剂递送的载剂。其通过与细胞膜融合并重新定位其脂质结构以递送药物或活性药物成分(API)来起作用。用于此类递送的脂质体组合物由磷脂，尤其具有磷脂酰胆碱基团的化合物构成，然而这些组合物还可以包括其他脂质。
脂质体的形成和使用是所属领域的技术人员通常已知的。已经研发了血清稳定性和循环半衰期有所改善的脂质体(美国专利第5,741,516号)。此外，已经描述了脂质体和脂质体样制剂作为潜在药物载剂的各种方法(美国专利5,567,434、5,552,157、5,565,213、5,738,868和5,795,587，所述专利全文以引用方式并入本文)。
E.示例性脂质体和脂质纳米粒子(LNP)组合物
本公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可以被添加到脂质体中以递送到细胞，例如需要表达转基因的细胞。脂质体是具有至少一个脂质双层的囊泡。在医药研发的背景下，脂质体通常用作药物/治疗剂递送的载剂。其通过与细胞膜融合并重新定位其脂质结构以递送药物或活性药物成分(API)来起作用。用于此类递送的脂质体组合物由磷脂，尤其具有磷脂酰胆碱基团的化合物构成，然而这些组合物还可以包括其他脂质。
包含ceDNA载体的脂质纳米粒子(LNP)公开于全文并入本文的2018年9月7日提交的国际申请PCT/US2018/050042和2018年12月6日提交的国际申请PCT/US2018/064242中，并且设想用于针对如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的方法和组合物中。
在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其包含一种或多种具有聚乙二醇(PEG)官能团的化合物(所谓的“PEG化的化合物”)，所述聚乙二醇官能团可以降低一种或多种所述化合物的免疫原性/抗原性、为其提供亲水性和疏水性并降低剂量频率。或者，脂质体配制物仅包含聚乙二醇(PEG)聚合物作为额外组分。在此类方面，PEG或PEG官能团的分子量可以从62Da至约5,000Da。
在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其将在数小时至数周的时间内以延长释放或受控释放曲线来递送API。在一些相关的方面，脂质体配制物可以包括以脂质双层结合的水性腔。在其他相关方面，脂质体配制物将API与组分一起包封起来，所述组分在升高的温度下经历物理转变，在数小时到数周的时段内释放API。
在一些方面，脂质体配制物包括鞘磷脂和一种或多种本文所公开的脂质。在一些方面，脂质体配制物包括光敏体。
在一些方面，本公开提供了脂质体制剂，其包含选自以下的一种或多种脂质：N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺钠盐、(二硬脂酰基-sn-甘油-磷酸乙醇胺)、MPEG(甲氧基聚乙二醇)缀合的脂质、HSPC(氢化大豆磷脂酰胆碱)；PEG(聚乙二醇)；DSPE(二硬脂酰基-sn-甘油-磷酸乙醇胺)；DSPC(二硬脂酰磷脂酰胆碱)；DOPC(二油酰磷脂酰胆碱)；DPPG(二棕榈酰磷脂酰甘油)；EPC(卵磷脂酰胆碱)；DOPS(二油酰磷脂酰丝氨酸)；POPC(棕榈酰油酰磷脂酰胆碱)；SM(鞘磷脂)；MPEG(甲氧基聚乙二醇)；DMPC(二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱)；DMPG(二肉豆蔻酰磷脂酰甘油)；DSPG(二硬脂酰磷脂酰甘油)；DEPC(二油酰磷脂酰胆碱)；DOPE(二油酰基-sn-甘油-磷酸乙醇胺)、胆固醇硫酸酯(CS)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、DOPC(二油酰基-sn-甘油-磷脂酰胆碱)或它们的任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其包括磷脂、胆固醇和PEG化脂质，摩尔比为56:38:5。在一些方面，脂质体配制物的总脂质含量为2-16mg/mL。在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其包括含有磷脂酰胆碱官能团的脂质、含有乙醇胺官能团的脂质和PEG化脂质。在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其包括含有磷脂酰胆碱官能团的脂质、含有乙醇胺官能团的脂质和PEG化脂质，摩尔比分别为3:0.015:2。在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其包括含有磷脂酰胆碱官能团的脂质、胆固醇和PEG化脂质。在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其包括含有磷脂酰胆碱官能团的脂质和胆固醇。在一些方面，PEG化脂质是PEG-2000-DSPE。在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其包括DPPG、大豆PC、MPEG-DSPE脂质缀合物和胆固醇。
在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其包括一种或多种含有磷脂酰胆碱官能团的脂质和一种或多种含有乙醇胺官能团的脂质。在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其包括以下中的一种或多种：含有磷脂酰胆碱官能团的脂质、含有乙醇胺官能团的脂质和固醇，例如胆固醇。在一些方面，脂质体配制物包括DOPC/DEPC；和DOPE。
在一些方面，本公开提供了一种脂质体调配物，其进一步包括一种或多种药物赋形剂，例如蔗糖和/或甘氨酸。
在一些方面，本公开提供了一种结构上为单层或多层的脂质体配制物。在一些方面中，本公开提供了一种包含多囊泡粒子和/或泡沫基粒子的脂质体配制物。在一些方面，本公开提供了一种相对普通纳米粒子的相对尺寸更大并且尺寸为约150至250nm的脂质体配制物。在一些方面，脂质体配制物是冻干粉末。
在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其通过向在脂质体外部具有分离的ceDNA的混合物中添加弱碱，用本文中公开或描述的ceDNA载体制备并负载所述ceDNA载体。这种添加将脂质体外部的pH提高到大致7.3，并驱动API进入脂质体中。在一些方面，本公开提供了一种脂质体内部pH为酸性的脂质体配制物。在此类情况下，脂质体的内部可以处于pH 4-6.9下，并且更优选pH 6.5。在其他方面，本公开提供了一种通过使用脂质体内药物稳定化技术制备的脂质体配制物。在这样的情况下，利用聚合或非聚合的带高电荷阴离子和脂质体内俘获剂，例如多磷酸盐或蔗糖八硫酸盐。
在一些方面中，本公开提供了包含ceDNA和可电离脂质的脂质纳米粒子。例如，通过如2018年9月7日提交的国际申请PCT/US2018/050042中公开的方法获得的ceDNA制备并负载ceDNA的脂质纳米粒子配制物，所述申请并入本文。这可以通过在低pH下将乙醇脂质与ceDNA水溶液高能混合，使可电离脂质质子化并为ceDNA/脂质缔合和粒子成核提供有利的能量来实现。通过水稀释和去除有机溶剂可以进一步稳定粒子。能够将颗粒浓缩至所需水平。
通常，以约10:1至30:1的总脂质与ceDNA(质量或重量)比率制备脂质粒子。在一些实施方案中，脂质与ceDNA比率(质量/质量比率；w/w比率)可以在约1:1至约25:1、约10:1至约14:1、约3:1至约15:1、约4:1至约10:1、约5:1至约9:1或约6:1至约9:1范围内。能够调节脂质和ceDNA的量以提供所需的N/P比，例如N/P比为3、4、5、6、7、8、9、10或更高。通常，脂质颗粒配制物的总脂质含量能够在约5mg/mL至约30mg/mL的范围内。
可电离的脂质通常用于在低pH值下浓缩核酸货物(例如ceDNA)并驱动膜缔合和融合。通常，可电离的脂质是包含至少一个氨基的脂质，所述氨基在酸性条件下(例如在pH6.5或更低的条件下)带正电或质子化。可电离脂质在本文中也称为阳离子脂质。
示例性可电离脂质描述于国际专利公布WO2015/095340、WO2015/199952、WO2018/011633、WO2017/049245、WO2015/061467、WO2012/040184、WO2012/000104、WO2015/074085、WO2016/081029、WO2017/004143、WO2017/075531、WO2017/117528、WO2011/022460、WO2013/148541、WO2013/116126、WO2011/153120、WO2012/044638、WO2012/054365、WO2011/090965、WO2013/016058、WO2012/162210、WO2008/042973、WO2010/129709、WO2010/144740、WO2012/099755、WO2013/049328、WO2013/086322、WO2013/086373、WO2011/071860、WO2009/132131、WO2010/048536、WO2010/088537、WO2010/054401、WO2010/054406、WO2010/054405、WO2010/054384、WO2012/016184、WO2009/086558、WO2010/042877、WO2011/000106、WO2011/000107、WO2005/120152、WO2011/141705、WO2013/126803、WO2006/007712、WO2011/038160、WO2005/121348、WO2011/066651、WO2009/127060、WO2011/141704、WO2006/069782、WO2012/031043、WO2013/006825、WO2013/033563、WO2013/089151、WO2017/099823、WO2015/095346和WO2013/086354，以及美国专利公布US2016/0311759、US2015/0376115、US2016/0151284、US2017/0210697、US2015/0140070、US2013/0178541、US2013/0303587、US2015/0141678、US2015/0239926、US2016/0376224、US2017/0119904、US2012/0149894、US2015/0057373、US2013/0090372、US2013/0274523、US2013/0274504、US2013/0274504、US2009/0023673、US2012/0128760、US2010/0324120、US2014/0200257、US2015/0203446、US2018/0005363、US2014/0308304、US2013/0338210、US2012/0101148、US2012/0027796、US2012/0058144、US2013/0323269、US2011/0117125、US2011/0256175、US2012/0202871、US2011/0076335、US2006/0083780、US2013/0123338、US2015/0064242、US2006/0051405、US2013/0065939、US2006/0008910、US2003/0022649、US2010/0130588、US2013/0116307、US2010/0062967、US2013/0202684、US2014/0141070、US2014/0255472、US2014/0039032、US2018/0028664、US2016/0317458和US2013/0195920中，所有文献的内容全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，可电离脂质为具有以下结构的MC3(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA或MC3)：
脂质DLin-MC3-DMA描述于Jayaraman等人，Angew.Chem.Int.Ed Engl.(2012),51(34):8529-8533中，该文献的内容全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，可电离脂质是如WO2015/074085中所述的脂质ATX-002，其内容全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，可电离脂质是如国际专利申请公布WO2012/040184中所述的(13Z,16Z)-N,N-二甲基-3-壬基二十二碳-13,16-二烯-1-胺(化合物32)，所述文献的内容全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，可电离脂质是如国际专利申请公布WO2015/199952中所述的化合物6或化合物22，所述文献的内容全文以引用方式并入本文。
没有限制，可电离的脂质可以占脂质纳米粒子中存在的总脂质的20-90％(mol)。例如，可电离的脂质摩尔含量可以为脂质纳米粒子中存在的总脂质的20-70％(mol)、30-60％(mol)或40-50％(mol)。在一些实施方案中，可电离的脂质占脂质纳米粒子中存在的总脂质的约50摩尔％至约90摩尔％。
在一些方面中，脂质纳米粒子可以进一步包含非阳离子脂质。非离子脂质包括两亲脂质、中性脂质和阴离子脂质。因此，非阳离子脂质可以是中性不带电的、两性离子型或阴离子脂质。非阳离子脂质通常用于增强融合性。
设想用于如本文所公开的方法和组合物中的示例性非阳离子脂质描述于2018年9月7日提交的国际专利申请PCT/US2018/050042和2018年12月6日提交的PCT/US2018/064242中，所述国际专利申请均全文并入本文。示例性非阳离子脂质描述于国际申请公布WO2017/099823和美国专利公布US2018/0028664中，两者的内容全文以引用方式并入本文。
非阳离子脂质能够占脂质纳米粒子中存在的总脂质的0-30％(mol)。例如，非阳离子脂质含量为脂质纳米粒子中存在的总脂质的5-20％(mol)或10-15％(mol)。在各种实施方案中，可电离的脂质与中性脂质的摩尔比为约2:1至约8:1。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子不包含任何磷脂。在一些方面中，脂质纳米粒子能够进一步包含例如固醇等组分，以提供膜完整性。
可用于脂质纳米粒子的一种示例性固醇是胆固醇及其衍生物。示例性胆固醇衍生物描述于国际专利申请WO2009/127060和美国专利公布US2010/0130588中，所述文献全文以引用方式并入本文。
提供膜完整性的组分(例如固醇)能够占脂质纳米粒子中存在的总脂质的0-50％(mol)。在一些实施方案中，此类组分占脂质纳米粒子的总脂质含量的20％-50％(mol)、30％-40％(mol)。
在一些方面，脂质纳米粒子可以还包含聚乙二醇(PEG)或缀合的脂质分子。通常，这些用于抑制脂质纳米粒子的聚集和/或提供空间稳定。示例性缀合脂质包括但不限于PEG-脂质缀合物、聚噁唑啉(POZ)-脂质缀合物、聚酰胺-脂质缀合物(如ATTA-脂质缀合物)、阳离子聚合物脂质(CPL)缀合物以及其混合物。在一些实施方案中，缀合脂质分子是PEG-脂质缀合物，例如(甲氧基聚乙二醇)缀合的脂质。示例性PEG-脂质缀合物包括但不限于：PEG-二酰基甘油(DAG)(诸如1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG))、PEG-二烷氧基丙基(DAA)、PEG-磷脂、PEG-神经酰胺(Cer)、聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、PEG丁二酸酯二酰基甘油(PEGS-DAG)(诸如4-O-(2',3'-二(十四烷酰氧基)丙基-1-O-(w-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG))、PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺钠盐，或它们的混合物。另外的示例性PEG-脂质缀合物描述于例如美国专利或专利申请公布US5,885,613、US6,287,591、US2003/0077829、US2003/0077829、US2005/0175682、US2008/0020058、US2011/0117125、US2010/0130588、US2016/0376224和US2017/0119904中，所有这些文献的内容全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，PEG-脂质是如专利申请公布US2018/0028664中定义的化合物，该文献的内容全文以引用方式并入本文。在一些实施方案中，PEG-脂质公开于专利申请公布US20150376115或US2016/0376224中，该文献的内容全文以引用方式并入本文。
PEG-DAA缀合物可以是例如PEG-二月桂酰氧基丙基、PEG-二肉豆蔻酰氧基丙基、PEG-二棕榈酰氧基丙基或PEG-二硬脂酰氧基丙基。PEG-脂质可以是以下中的一种或多种：PEG-DMG、PEG-二月桂基甘油、PEG-二棕榈酰基甘油、PEG-二硬脂基甘油、PEG-二月桂基甘油酰胺、PEG-二肉豆蔻基甘油酰胺、PEG-二棕榈酰基甘油酰胺、PEG-二硬脂基甘油酰胺、PEG-胆固醇(1-[8'-(胆甾-5-烯-3[β]-氧基)甲酰氨基-3',6'-二氧杂辛基]氨甲酰基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)、PEG-DMB(3,4-二(十四烷氧基)苯甲基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚)，以及1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]。在一些实施方案中，PEG-脂质可以选自由以下组成的组：PEG-DMG、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]。
还能够使用与除PEG之外的分子缀合的脂质替代PEG-脂质。例如，代替PEG-脂质或除PEG-脂质以外，还可以使用聚噁唑啉(POZ)-脂质缀合物、聚酰胺-脂质缀合物(如ATTA-脂质缀合物)和阳离子聚合物脂质(CPL)缀合物。示例性缀合脂质(即，PEG-脂质、(POZ)-脂质缀合物、ATTA-脂质缀合物和阳离子聚合物-脂质)描述于国际专利申请公布WO1996/010392、WO1998/051278、WO2002/087541、WO2005/026372、WO2008/147438、WO2009/086558、WO2012/000104、WO2017/117528、WO2017/099823、WO2015/199952、WO2017/004143、WO2015/095346、WO2012/000104、WO2012/000104和WO2010/006282；美国专利申请公布US2003/0077829、US2005/0175682、US2008/0020058、US2011/0117125、US2013/0303587、US2018/0028664、US2015/0376115、US2016/0376224、US2016/0317458、US2013/0303587、US2013/0303587和US20110123453；以及美国专利US5,885,613、US6,287,591、US6,320,017和US6,586,559，所有文献的内容全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，一种或多种另外的化合物可以是治疗剂。治疗剂可以选自适合于治疗目的的任何类别。换句话说，治疗剂可以选自适合于治疗目的的任何类别。换句话说，可以根据治疗目的和所需的生物学作用选择治疗剂。例如，如果LNP内的ceDNA可用于治疗PKU，则另外的化合物可以是抗PKU剂(例如化学治疗剂)、其他PKU疗法(包括但不限于小分子或抗体)。例如，如果LNP内的ceDNA可用于治疗血友病A，则另外的化合物可以是抗微生物剂(例如抗生素或抗病毒化合物)。在又一个实施方案中，如果含有ceDNA的LNP可用于治疗免疫疾病或病症，那么另外的化合物可以是调节免疫反应的化合物(例如免疫抑制剂、免疫刺激化合物或调节一种或多种特异性免疫途径的化合物)。在一些实施方案中，含有不同化合物例如编码不同蛋白质的ceDNA或不同化合物例如治疗剂的不同脂质纳米粒子的不同混合液可以用于本公开的组合物和方法中。
在一些实施方案中，另外的化合物是免疫调节剂。例如，另外的化合物是免疫抑配制物。在一些实施方案中，另外的化合物是免疫刺激剂。本文还提供了包含所产生的经脂质纳米粒子封装的昆虫细胞或如本文所描述的以合成方式产生的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体以及药学上可接受的载剂或赋形剂的药物组合物。
在一些方面，本公开提供了一种脂质纳米粒子配制物，其还包含一种或多种药物赋形剂。在一些实施方案中，脂质纳米粒子配制物还包含蔗糖、tris、海藻糖和/或甘氨酸。
ceDNA载体能够与粒子的脂质部分复合或囊封于脂质纳米粒子的脂质位置。在一些实施方案中，可以将ceDNA完全囊封在脂质纳米粒子的脂质位置中，从而保护其免于被核酸酶降解，例如在水溶液中。在一些实施方案中，脂质纳米粒子在37℃下暴露于核酸酶至少约20分钟、30分钟、45分钟或60分钟后，脂质纳米粒子中的ceDNA基本上不降解。在一些实施方案中，脂质纳米粒子中的ceDNA在将血清中的粒子在37℃下培育至少约30分钟、45分钟或60分钟或至少约2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、26小时、28小时、30小时、32小时、34小时或36小时后基本上不降解。
在某些实施方案中，脂质纳米粒子对受试者，例如对哺乳动物，例如人基本上是无毒的。在一些方面，脂质纳米粒子配制物是冻干粉末。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子是具有至少一个脂质双层的固体芯粒子。在其他实施方案中，脂质纳米粒子具有非双层结构，即非层状(即非双层)形态。不受限制，非双层形态能够包括例如三维管、棒、对称立方体等。例如，使用例如Cryo-TEM分析，能够轻松地评估且表征脂质纳米粒子的形态(片层对非片层)，如US2010/0130588中所述，所述文献的内容全文以引用方式并入本文。
在一些其他实施方案中，具有非层状形态的脂质纳米粒子是电子致密的。在一些方面，本公开提供了一种结构上为单层或多层的脂质纳米粒子。在一些方面，本公开提供了一种包含多囊泡粒子和/或基于泡沫的粒子的脂质纳米粒子配制物。
通过控制脂质组分的组成和浓度，可以控制脂质缀合物从脂质粒子中交换出来的速率，进而可以控制脂质纳米粒子融合的速率。另外，包括例如pH、温度或离子强度的其他变量可以用于改变和/或控制脂质纳米粒子融合的速率。基于本公开，所属领域的普通技术人员将清楚可以用于控制脂质纳米粒子融合的速率的其他方法。同样显而易见，通过控制所述脂质缀合物的组合物和浓度，可以控制脂质颗粒的尺寸。
配制的阳离子脂质的pKa可以与LNP递送核酸的有效性相关(参见Jayaraman等人，Angewandte Chemie，国际版(2012),51(34),8529-8533；Semple等人，NatureBiotechnology 28,172-176(20l 0)，这两篇文献均全文以引用方式并入)。pKa的优选范围是约5到约7。可使用基于2-(对甲苯氨基)-6-萘磺酸(TNS)荧光的测定法测定脂质纳米粒子中阳离子脂质的pKa。
VIII.使用方法
如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体还可以用于将感兴趣的核酸序列(例如编码PAH蛋白)递送到靶细胞(例如宿主细胞)的方法中。所述方法尤其可以是将PAH蛋白递送到有需要的受试者的细胞且治疗PKU的方法。本公开允许在ceDNA载体中经编码的PAH蛋白在受试者的细胞中进行体内表达以使得出现PAH蛋白表达的治疗作用。在ceDNA载体的体内和体外递送模式中均可以看到这些结果。
另外，本公开提供了在有需要的受试者的细胞中递送PAH蛋白的方法，其包含多次施用编码所述PAH蛋白的本公开的ceDNA载体。由于本公开的ceDNA载体不像对包封病毒载体通常所观察到那样诱导免疫反应，所以所述多次施用策略将可能在基于ceDNA的系统中取得更大的成功。ceDNA载体是以足以转染期望组织细胞和提供足够的基因转移和PAH蛋白表达水平而无不当副作用的量施用。常规和药学上可接受的施用途径包括但不限于视网膜施用(例如视网膜下注射，脉络膜上注射或玻璃体内注射)、静脉内施用(例如在脂质体配制物中)、直接递送至所选器官(例如选自肝脏、肾脏、胆囊、前列腺、肾上腺、心脏、肠、肺和胃中的任何一种或多种组织)、肌肉内施用和其他肠胃外施用途径。如果需要，可以组合施用途径。
如本文所描述的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的递送不限于所表达的PAH蛋白的递送。例如，常规产生(例如使用基于细胞的产生方法(例如昆虫细胞产生方法))或合成产生的如本文所述的ceDNA载体可以联合为了提供基因疗法的一部分而提供的其他递送系统使用。可以与本公开的ceDNA载体组合的系统的一个非限制性示例包括单独递送一种或多种辅因子或免疫抑制剂用于使表达PAH蛋白的ceDNA载体进行有效基因表达的系统。
本公开还提供了一种治疗受试者的PKU的方法，该方法包括将治疗有效量的ceDNA载体，任选地与药学上可接受的载剂一起引入受试者的对其有需要的靶细胞(尤其是肌肉细胞或组织)中。虽然ceDNA载体可以在载剂存在下引入，但此类载剂不是必需的。所选ceDNA载体包含编码可用于治疗PKU的PAH蛋白的核酸序列。确切地说，ceDNA载体可以包含可操作地连接到控制元件的期望PAH蛋白序列，所述控制元件在引入受试者中时能够引导由外源DNA序列编码的期望PAH蛋白的转录。ceDNA载体可经由如上文和本文其他地方提供的任何适合的途径施用。
本文所提供的组合物和载体可以用于递送PAH蛋白以用于各种目的。在一些实施方案中，转基因编码旨在用于研究目的，例如创建具有转基因的体细胞转基因动物模型，例如研究PAH蛋白产物的功能的PAH蛋白。又如，转基因编码旨在用于建立PKU动物疾病模型的PAH蛋白。在一些实施方案中，编码的PAH蛋白可用于治疗或预防哺乳动物受试者的PKU状态。可以将PAH蛋白以足量转移到患者(例如在其中表达)，以治疗与基因表达降低、缺乏表达或功能障碍有关的PKU。
原则上，表达盒可以包括编码PAH蛋白的核酸或任何转基因，所述PAH蛋白因突变而减少或不存在或在本公开的范围内被认为是过表达时会赋予治疗益处。优选地，本文提供的ceDNA组合物中不存在未插入的细菌DNA，并且优选地不存在细菌DNA。
ceDNA载体不限于ceDNA载体的一种。因而，在另一方面，表达不同蛋白或相同PAH蛋白、但可操作地连接到不同启动子或顺式调节元件的多种ceDNA载体可以同时或依序递送到靶细胞、组织、器官或受试者。因此，这种策略能够允许多个蛋白质同时进行基因疗法或基因递送。将PAH蛋白的不同部分分离成可以同时或在不同时间施用并且可以单独调节的单独ceDNA载体(例如，PAH蛋白的功能所需的不同结构域和/或辅因子)，由此添加额外水平的对PAH蛋白表达的控制也是可能的。考虑到由于缺乏病毒衣壳而缺乏抗衣壳宿主免疫反应，递送也可以进行多次，并且对于临床环境中的基因疗法来说，重要的是随后增加或减少剂量。可以预期，由于没有衣壳，因此不会发生抗衣壳反应。
本公开还提供了一种治疗受试者的PKU的方法，该方法包括将治疗有效量的如本文所公开的ceDNA载体，任选地与药学上可接受的载剂一起引入受试者的对其有需要的靶细胞(尤其是肌肉细胞或组织)。虽然ceDNA载体可以在载剂存在下引入，但此类载剂不是必需的。所实现的ceDNA载体包含可用于治疗PKU的所关注的核酸序列。具体地说，ceDNA载体可以包括与控制元件可操作地连接的期望的外源DNA序列，当引入受试者中时，所述控制元件能够指导由外源DNA序列编码的期望的多肽、蛋白质或寡核苷酸的转录。ceDNA载体可经由如上文和本文其他地方提供的任何适合的途径施用。
IX.递送用于产生PAH蛋白的ceDNA载体的方法
在一些实施方案中，用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可以通过各种适合的方法体外或体内递送到靶细胞。可以施用或注射单独的ceDNA载体。CeDNA载体可以在不借助于转染试剂或其他物理方式的情况下递送到细胞。或者，用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可以使用任何所属领域已知的转染试剂或其他所属领域已知的便于DNA进入细胞中的物理方式，例如脂质体、醇类、富含聚赖氨酸的化合物、富含精氨酸的化合物、磷酸钙、微囊泡、显微注射、电穿孔等等来递送。
如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可以有效地靶向通常难以使用各种递送试剂用常规AAV病毒粒子转导的细胞和组织类型。
本文所描述的技术的一个方面涉及将PAH蛋白递送到细胞的方法。通常，对于体内和体外方法，如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可以使用如本文所公开的方法以及所属领域中已知的其他方法引入细胞中。如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体优选以生物学有效量施用于细胞。如果将ceDNA载体在体内施用于细胞(例如施用于受试者)，那么ceDNA载体的生物学有效量是足以使PAH蛋白在靶细胞中转导和表达的量。
如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的示例性施用模式包括经口、经直肠、经粘膜、鼻内、吸入(例如，通过气雾剂)、经颊(例如，舌下)、经阴道、鞘内、眼内、透皮、内皮内、子宫内(或卵内)、肠胃外(例如，静脉内、皮下、皮内、颅内、肌肉内[包括施用于骨骼肌、隔膜肌和/或心肌]、胸膜内、脑内和关节内)。施用可以全身或直接递送至肝脏或其他地方(例如，任何肾脏、胆囊、前列腺、肾上腺、心脏、肠、肺和胃)。
施用可以是局部(例如，皮肤和粘膜表面，包括气道表面和透皮施用)、淋巴管内等，以及直接组织或器官注射(例如但不限于肝脏，但也可用于眼睛、肌肉，包括骨骼肌、心肌、膈肌或大脑)。
可以向受试者的任何部位施用ceDNA载体，包括(但不限于)选自由以下组成的组的部位：肝脏和/或眼睛、脑、骨骼肌、平滑肌、心脏、膈膜、气道上皮、肾脏、脾脏、胰腺。
在任何给定情况下最适合的途径将取决于所治疗、改善和/或预防的病状的性质和严重程度，以及所使用的特定ceDNA载体的性质。另外，ceDNA准许人们施用在单个载体或多个ceDNA载体(例如ceDNA混合液)中的超过一种PAH蛋白。
A.ceDNA载体的肌肉内施用
在一些实施方案中，治疗受试者的疾病的方法包含将治疗有效量的编码PAH蛋白的ceDNA载体和任选的药学上可接受的载剂引入受试者的有需要的靶细胞(尤其肌肉细胞或组织)中。在一些实施方案中，将用于表达PAH蛋白的ceDNA载体施用于受试者的肌肉组织。
在一些实施方案中，ceDNA载体能够施用于受试者的任何部位，包括但不限于选自由骨骼肌、平滑肌、心脏、隔膜或眼肌组成的组的部位。
向本公开的骨骼肌施用如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体包括但不限于向肢体(例如上臂、下臂、大腿和/或小腿)、背、颈、头(例如舌)、胸腔、腹部、骨盘/会阴和/或手指的骨骼肌施用。如本文所公开的ceDNA载体可通过静脉内施用、动脉内施用、腹膜内施用、肢体灌注(任选地，腿和/或手臂的隔离肢体灌注；参见例如Arruda等人，(2005)Blood 105:3458-3464)和/或直接肌肉内注射而递送到骨骼肌。在特定实施方案中，如本文所公开的ceDNA载体通过肢体灌注、任选地隔离肢体灌注(例如静脉内或关节内施用)来施用于受试者(例如患有如DMD的肌营养不良症的受试者)的肢体(臂和/或腿)。在实施方案中，如本文所公开的ceDNA载体可以在不使用“流体动力学”技术的情况下施用。
例如，常规病毒载体的组织递送(例如递送到肌肉)通常利用流体动力学技术增强(例如大体积的静脉内/静脉内施用)，其增强血管压力并且促进病毒载体穿越内皮细胞屏障的能力。在特定实施方案中，本文所述的ceDNA载体能够在流体动力学技术缺乏的情况下施用，例如大体积输注和/或升高的血管内压力(例如大于正常收缩压，例如小于或等于血管内压力相对于正常收缩压的5％、10％、15％、20％、25％增幅)。这样的方法可以减少或避免与流体动力学技术相关的副作用，例如水肿、神经损伤和/或隔室综合征。
此外，包含施用于骨骼肌的如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的组合物可以施用于肢体(例如上臂、下臂、大腿和/或小腿)、背、颈、头(例如舌片)、胸腔、腹部、骨盘/会阴和/或手指的骨骼肌。适合的骨骼肌包括但不限于外展小指肌(abductor digitiminimi)(在手中)、外展小趾肌(abductor digiti minimi)(在脚中)、拇展肌(abductorhallucis)、第五趾(指)展肌(abductor ossis metatarsi quinti)、拇短展肌(abductorpollicis brevis)、拇长展肌(abductor pollicis longus)、内收短肌(adductorbrevis)、拇收肌(adductor hallucis)、内收长肌(adductor longus)、內收大肌(adductormagnus)、拇收肌(adductor pollicis)、肘肌(anconeus)、前斜角肌(anterior scalene)、膝关节肌(articularis genus)、肱二头肌(biceps brachii)、股二头肌(bicepsfemoris)、肱肌(brachialis)、肱挠肌(brachioradialis)、颊肌(buccinator)、喙肱肌(coracobrachialis)、皱眉肌(corrugator supercilii)、三角肌(deltoid)、降口角肌(depressor anguli oris)、降下唇肌(depressor labii inferioris)、二腹肌(digastric)、骨间背侧肌(dorsal interossei)(在手中)、骨间背侧肌(在脚中)、桡侧腕短伸肌(extensor carpi radialis brevis)、桡侧腕长伸肌(extensor carpi radialislongus)、尺侧伸腕肌(extensor carpi ulnaris)、伸小指肌(extensor digiti minimi)、伸趾肌(extensor digitorum)、伸趾短肌(extensor digitorum brevis)、伸趾长肌(extensor digitorum longus)、伸拇短肌(extensor hallucis brevis)、伸拇长肌(extensor hallucis longus)、伸食指肌(extensor indicis)、伸拇短肌(extensorpollicis brevis)、伸拇长肌(extensor pollicis longus)、桡侧腕屈肌(flexor carpiradialis)、尺侧屈腕肌(flexor carpi ulnaris)、小指短屈肌(flexor digiti minimibrevis)(在手中)、小趾短屈肌(flexor digiti minimi brevis)(在脚中)、趾短屈肌(flexor digitorum brevis)、趾长屈肌(flexor digitorum longus)、指深屈肌(flexordigitorum profundus)、指浅屈肌(flexor digitorum superficialis)、拇短屈肌(flexorhallucis brevis)、拇长屈肌(flexor hallucis longus)、拇短屈肌(flexor pollicisbrevis)、拇长屈肌(flexor pollicis longus)、额肌(frontalis)、腓肠肌(gastrocnemius)、颏舌骨肌(geniohyoid)、臀大肌(gluteus maximus)、臀中肌(gluteusmedius)、臀小肌(gluteus minimus)、股薄肌(gracilis)、颈髂肋肌(iliocostaliscervicis)、腰髂肋肌(iliocostalis lumborum)、胸髂肋肌(iliocostalis thoracis)、髂肌(illiacus)、下孖肌(inferior gemellus)、下斜肌(inferior oblique)、下直肌(inferior rectus)、冈下肌(infraspinatus)、棘间肌(interspinalis)、横突间肌(intertransversi)、翼外肌(lateral pterygoid)、外直肌(lateral rectus)、背阔肌(latissimus dorsi)、提口角肌(levator anguli oris)、提上唇肌(levator labiisuperioris)、提上唇鼻翼肌(levator labii superioris alaeque nasi)、提上睑肌(levator palpebrae superioris)、肩胛提肌(levator scapulae)、长回旋肌(longrotators)、头最长肌(longissimus capitis)、颈最长肌(longissimus cervicis)、胸最长肌(longissimus thoracis)、头长肌(longus capitis)、颈长肌(longus colli)、蚓状肌(lumbricals)(在手中)、蚓状肌(lumbricals)(在脚中)、咬肌(masseter)、翼内肌(medialpterygoid)、内直肌(medial rectus)、中斜角肌(middle scalene)、多裂肌(multifidus)、下颌舌骨肌(mylohyoid)、头下斜肌(obliquus capitis inferior)、头上斜肌(obliquuscapitis superior)、闭孔外肌(obturator externus)、闭孔内肌(obturator internus)、枕肌(occipitalis)、肩胛舌骨肌(omohyoid)、小指对掌肌(opponens digiti minimi)、拇对掌肌(opponens pollicis)、眼轮匝肌(orbicularis oculi)、口轮匝肌(orbicularisoris)、骨间掌侧肌(palmar interossei)、掌短肌(palmaris brevis)、掌长肌(palmarislongus)、耻骨肌(pectineus)、胸大肌(pectoralis major)、胸小肌(pectoralis minor)、腓短肌(peroneus brevis)、腓长肌(peroneus longus)、第三腓骨肌(peroneus tertius)、梨状肌(piriformis)、跖侧骨间肌(plantar interossei)、跖肌(plantaris)、颈阔肌(platysma)、腘肌(popliteus)、后斜角肌(posterior scalene)、旋前方肌(pronatorquadratus)、旋前圆肌(pronator teres)、腰大肌(psoas major)、股方肌(quadratusfemoris)、跖方肌(quadratus plantae)、头直前肌(rectus capitis anterior)、头侧直肌(rectus capitis lateralis)、头后大直肌(rectus capitis posterior major)、头后小直肌(rectus capitis posterior minor)、股直肌(rectus femoris)、大菱形肌(rhomboidmajor)、小菱形肌(rhomboid minor)、笑肌(risorius)、缝匠肌(sartorius)、小斜角肌(scalenus minimus)、半膜肌(semimembranosus)、头半棘肌(semispinalis capitis)、颈半棘肌(semispinalis cervicis)、胸半棘肌(semispinalis thoracis)、半腱肌(semitendinosus)、前锯肌(serratus anterior)、短回旋肌(short rotators)、比目鱼肌(soleus)、头棘肌(spinalis capitis)、颈棘肌(spinalis cervicis)、胸棘肌(spinalisthoracis)、头夹肌(splenius capitis)、颈夹肌(splenius cervicis)、胸锁乳突肌(sternocleidomastoid)、胸舌骨肌(sternohyoid)、胸骨甲状肌(sternothyroid)、茎突舌骨肌(stylohyoid)、锁骨下肌(subclavius)、锁骨下肌(subscapularis)、上孖肌(superiorgemellus)、上斜肌(superior oblique)、上直肌(superior rectus)、旋后肌(supinator)、冈上肌(supraspinatus)、颞肌(temporalis)、阔筋膜张肌(tensor fascia lata)、大圆肌(teres major)、小圆肌(teres minor)、胸肌(thoracis)、甲状舌骨肌(thyrohyoid)、胫前肌(tibialis anterior)、胫骨后肌(tibialis posterior)、斜方肌(trapezius)、肱三头肌(triceps brachii)、股中间肌(vastus intermedius)、股外侧肌(vastus lateralis)、股内侧肌(vastus medialis)、颧大肌(zygomaticus major)和颧小肌(zygomaticus minor)、以及所属领域中已知的任何其他适合的骨骼肌。
向隔膜肌施用如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可以通过任何适合的方法，包括静脉内施用、动脉内施用和/或腹膜内施用来进行。在一些实施方案中，从ceDNA载体表达的转基因递送到靶组织还能够通过递送包含ceDNA载体的合成储槽来实现，其中将包含ceDNA载体的储槽植入骨骼肌、平滑肌、心肌和/或隔膜肌组织，或能够使肌肉组织与包含如本文所述的ceDNA载体的膜或其他基质接触。此类可植入基质或底物描述于美国专利第7,201,898号中，所述美国专利全文以引用方式并入本文。
向心肌施用如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体包括向左心房、右心房、左心室、右心室和/或隔膜(septum)施用。如本文所述的ceDNA载体可以通过静脉内施用、动脉内施用、例如主动脉内施用、直接心脏注射(例如注入左心房、右心房、左心室、右心室)和/或冠状动脉灌注而递送到心肌。
向平滑肌施用如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可以通过任何适合的方法，包括静脉内施用、动脉内施用和/或腹膜内施用来进行。在一个实施方案中，可以施用存在于平滑肌内、附近和/或平滑肌上的内皮细胞。平滑肌的非限制性示例包括眼虹膜、肺细支气管、喉肌(声带)、胃肠道的胃、食道、小肠和大肠肌肉层、膀胱的输尿管、逼尿肌肌肉、子宫的子宫肌层、阴茎或前列腺腺体。
在一些实施方案中，将如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体施用于骨骼肌、隔膜肌和/或心肌。在代表性实施方案中，本公开的ceDNA载体用于治疗和/或预防骨骼肌、心肌和/或隔膜肌病症。
具体地说，预期包含如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的组合物可以被递送到眼睛的一种或多种肌肉(例如外直肌(Lateral rectus)、内直肌(Medialrectus)、上直肌(Superior rectus)、下直肌(Inferior rectus)、上斜肌(Superioroblique)、下斜肌(Inferior oblique))、面部肌肉(例如枕额肌(Occipitofrontalismuscle)、颞下颌肌(Temporoparietalis muscle)、降眉间肌(Procerus muscle)、鼻肌(Nasalis muscle)、降鼻中隔肌(Depressor septi nasi muscle)、眼轮匝肌(Orbicularisoculi muscle)、皱眉肌(Corrugator supercilii muscle)、降眉肌(Depressorsupercilii muscle)、耳廓肌(Auricular muscles)、口轮匝肌(Orbicularis orismuscle)、降口角肌(Depressor anguli oris muscle)、笑肌(Risorius)、颧大肌(Zygomaticus major muscle)、颧小肌(Zygomaticus minor muscle)、提上唇肌(Levatorlabii superioris)、提上唇鼻翼肌(Levator labii superioris alaeque nasi muscle)、降下唇肌(Depressor labii inferioris muscle)、提口角肌(Levator anguli oris)、颊肌(Buccinator muscle)、颏肌(Mentalis))或舌肌(例如颏舌肌(genioglossus)、舌骨舌肌(hyoglossus)、小角舌肌(chondroglossus)、茎舌肌(styloglossus)、腭舌肌(palatoglossus)、舌上纵肌(superior longitudinal muscle)、舌下纵肌(inferiorlongitudinal muscle)、舌直肌(vertical muscle)和舌横肌(transverse muscle))。
(i)肌肉内注射：
在一些实施方案中，可使用针将包含如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的组合物注射到受试者的指定肌肉的一个或多个部位，例如骨骼肌(例如三角肌、股外侧肌、背外侧肌的侧臀肌、或婴儿的前外侧股)。包含ceDNA的组合物可引入肌肉细胞的其他亚型中。肌肉细胞亚型的非限制性示例包括骨骼肌细胞、心肌细胞、平滑肌细胞和/或隔膜肌细胞。
肌肉内注射的方法是所属领域技术人员已知的，因此本文中不再详细描述。
在一些实施方案中，能够将肌肉内注射与以下组合：电穿孔、递送压力或使用转染试剂增强ceDNA载体的细胞吸收。
(ii)转染试剂
在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体被配制成包含一种或多种转染试剂的组合物，以促进载体吸收到肌管或肌肉组织中。因此，在一个实施方案中，使用本文中别处所述的方法、通过转染将本文所述的核酸施用于肌肉细胞、肌管或肌肉组织。
(iii)电穿孔
在某些实施方案中，如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体在缺乏载剂的情况下施用以促进ceDNA进入细胞中，或在生理学上呈惰性的药学上可接受的载剂中(即，不改进或不增强无衣壳非病毒载体吸收到肌管中的任何载剂)施用。在此类实施方案中，通过对细胞或组织进行电穿孔能够促进无衣壳非病毒载体的吸收。
细胞膜天然地抵抗从细胞外传递到细胞的细胞质中。一种用于暂时减小这种抵抗力的方法是“电穿孔”，其中使用电场在细胞中产生孔隙而对细胞不引起持久性损伤。这些孔隙大足以允许DNA载体、药物、DNA和其他极性化合物触及细胞内部。细胞膜中的孔隙封闭并且细胞再次变得不可通透。
电穿孔能够用于体外和体内应用中以将例如外源DNA引入活细胞中。体外应用典型地是将活细胞样品与包含例如DNA的组合物混合。然后将细胞放在电极(例如平行板)之间并且向细胞/组合物混合物施加电场。
体内电穿孔的方法有多种；电极能够以多种配置提供，例如夹持表皮的测径规上覆于待治疗的细胞区域上。另选地，可以将针形电极插入组织中，从而更深地触及所定位的细胞。在任一情况下，将包含例如核酸的组合物注射到治疗区域之后，电极向所述区域施加电场。在一些电穿孔应用中，这个电场包含约10到60ms持续时间的约100到500V/cm的单一方波脉冲。此类脉冲可以通过例如Genetronics有限公司的分公司BTX制造的ElectroSquare Porator T820的已知应用产生。
典型地，仅当肌肉在施用组合物(例如注射到肌肉中)之后立即或不久加以电刺激时才成功地发生例如核酸的吸收。
在某些实施方案中，使用电场脉冲或使用低电压/长脉冲治疗方案(例如使用方波脉冲电穿孔系统)达成电穿孔。能够产生脉冲电场的示例性脉冲发生器包括例如可产生指数波形的ECM600，以及可产生方波形的ElectroSquarePorator(T820)，两者均购自Genetronics的分公司BTX(San Diego,Calif.)。方波电穿孔系统递送可控的电脉冲，其快速地升高到设定电压，在那个水平保持设定的时间长度(脉冲长度)，然而快速地降到零。
在一些实施方案中，施用局部麻醉剂，例如通过在治疗部位注射以减少疼痛，所述疼痛可能与组织在包含如本文所述的无衣壳非病毒载体的组合物存在下电穿孔有关。另外，所属领域的技术人员将了解，应该选择最小化且/或防止过度组织损伤、以致肌肉发生纤维化、坏死或发炎的组合物剂量。
(iv)递送压力
在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体递送到肌肉组织是通过递送压力促进，其将大体积与快速注射到供应肢体的动脉(例如髂动脉)组合使用。这种施用模式能够通过多种方法达成，包括将包含ceDNA载体的组合物输注到肢体血管中，典型地同时使用血管钳压脉带将肌肉与全身循环分隔。在一种方法中，组合物通过肢体血管循环以准许外渗到细胞中。在另一方法中，提高血管内流体动力学压力以扩展血管床且增强ceDNA载体吸收到肌肉细胞或组织中。在一个实施方案中，将ceDNA组合物施用于动脉。
(v)脂质纳米粒子组合物
在一些实施方案中，肌肉内递送用的如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体被配制成包含如在本文别处所述的脂质体的组合物。
(vi)靶向肌肉组织的ceDNA载体的全身施用
在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体被配制成经由间接递送施用靶向肌肉，其中与肝脏相反，将ceDNA输送到肌肉。因此，本文所描述的技术涵盖向肌肉组织间接施用包含如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的组合物，例如通过全身施用。此类组合物能够通过体表、静脉内(通过集团或连续输注)、细胞内注射、组织内注射、口服、通过吸入、腹膜内、皮下、腔内施用，并且在必要时能够通过蠕动方式或通过所属领域的技术人员已知的其他方式递送。药剂能够全身性施用，例如通过静脉内输注(如果希望如此)。
在一些实施方案中，通过使用优先地将载体引导到肌肉组织的靶向剂或部分来增加如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体到肌肉细胞/组织中的吸收。因此，在一些实施方案中，相较于无衣壳ceDNA载体存在于身体的其他细胞或组织中的量，无衣壳ceDNA载体能够在肌肉组织中浓缩。
在一些实施方案中，包含如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的组合物还包含到肌肉细胞的靶向部分。在其他实施方案中，所表达的基因产物包含对期望产生作用的组织具有特异性的靶向部分。靶向部分能包括能够靶向细胞或组织的细胞内、细胞表面或细胞外生物标志物、与其相互作用、与其偶合且/或结合至其的任何分子或分子复合物。生物标志物能包括例如细胞蛋白酶、激酶、蛋白质、细胞表面受体、脂质和/或脂肪酸。靶向部分能靶向、相互作用、偶合和/或结合到的生物标志物的其他实施方案包括与特定疾病有关的分子。例如，生物标志物能够包括涉及癌症发展的细胞表面受体，例如表皮生长因子受体和运铁蛋白受体。靶向部分能够包括(但不限于)结合到靶肌肉组织中所表达的分子的合成化合物、天然化合物或产物、巨分子实体、生物工程化分子(例如多肽、脂质、多核苷酸、抗体、抗体片段)以及小实体(例如小分子、神经传递素、底物、配体、激素和元素化合物)。
在某些实施方案中，靶向部分可以还包含受体分子，包括例如天然地识别靶细胞中的特定期望分子的受体。此类受体分子包括已经修饰以增强其与靶分子相互作用的特异性的受体、已经修饰以与受体天然不识别的所期望靶分子相互作用的受体，以及此类受体的片段(参见例如Skerra,2000,J.Molecular Recognition,13:167-187)。优选的受体是趋化因子受体。示例性趋化因子受体已经描述于例如Lapidot等人,2002,Exp Hematol,30:973-81和Onuffer等人,2002,Trends Pharmacol Sci,23:459-67。
在其他实施方案中，另外的靶向部分可以包含配体分子，包括例如天然地识别靶细胞的特定期望受体的配体，例如运铁蛋白(Tf)配体。此类配体分子包括已经修饰以增强其与靶受体相互作用的特异性的配体、已经修饰以与配体天然不识别的期望受体相互作用的配体，和此类配体的片段。
在其他实施方案中，靶向部分可包含适体。适体是经选择可特异性结合到靶细胞的期望分子结构的寡核苷酸。适体典型地是类似于噬菌体呈现亲和力选择(又称为体外分子进化)的亲和力选择方法的产物。所述方法涉及执行亲和力分离的若干次串联迭代，例如使用致病免疫原所结合的固体载体执行；随后执行聚合酶链反应(PCR)以扩增结合到免疫原的核酸。每一轮亲和力分离由此从核酸群体中富集成功地结合期望免疫原的分子。以这种方式，可以“培育”随机核酸池，从而产生特异性结合靶分子的适体。适体典型地是RNA，但可以是DNA或其类似物或衍生物，例如(不限于)肽核酸(PNA)和硫代磷酸酯核酸。
在一些实施方案中，靶向部分可包含光可降解配体(即，‘笼状’配体)，所述配体通过例如聚焦光束释放，从而使无衣壳非病毒载体或基因产物靶向特定组织。
本文还预期组合物递送到受试者的一种或多种肌肉的多个部位。也就是说，能够在至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100个注射部位中进行注射。此类部位相对于单一肌肉的区域能够扩展或能够在多种肌肉之间分布。
B.将用于表达PAH蛋白的ceDNA载体施用于非肌肉位置
在另一个实施方案中，将用于表达PAH蛋白的ceDNA载体施用于肝脏。可以将ceDNA载体施用于眼睛的不同区域，例如角膜和/或视神经。还可以将ceDNA载体引入脊髓、脑干(延髓、脑桥)、中脑(下丘脑、丘脑、上丘脑、垂体腺、黑质、松果体)、小脑、端脑(纹状体；包括枕骨、颞叶、顶叶和额叶的大脑；皮质；基底神经节；海马和杏仁核(portaamygdala))、边缘系统、新皮质、纹状体、大脑和下丘。ceDNA载体可以被递送到脑脊髓液中(例如通过腰椎穿刺)。可以在血脑屏障已经被扰动(例如脑瘤或大脑梗塞)的情况下进一步将用于表达PAH蛋白的ceDNA载体血管内施用于CNS。
在一些实施方案中，用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可以通过所属领域已知的任何途径施用于眼睛的(多个)期望区域，所述途径包括但不限于鞘内、眼内、大脑内、脑室内、静脉内(例如在存在糖例如甘露糖醇下)、鼻内、耳内、眼内(例如玻璃体内、视网膜下、前房)和眼周(例如眼球筋膜囊下区(sub-Tenon's region))递送以及肌肉内递送和逆行递送到运动神经元。
在一些实施方案中，用于表达PAH蛋白的ceDNA载体是在液体配制物中通过直接注射(例如立体定向注射)施用于CNS中的期望区域或腔室中。在其他实施方案中，可以通过局部施加到期望区域或通过鼻内施用气雾剂配制物来提供ceDNA载体。可以通过局部施加液滴来施用眼睛。作为另一替代方案，ceDNA载体能够作为固体、缓释型配制物施用(参见例如美国专利第7,201,898号)。在另外的实施方案中，ceDNA载体可用于逆行转运，以治疗、改善和/或预防涉及运动神经元的疾病和病症(例如肌萎缩性侧索硬化(ALS)；脊髓性肌萎缩(SMA)等)。例如，可以将ceDNA载体递送到肌肉组织，其可以从肌肉组织迁移到神经元中。
C.离体治疗
在一些实施方案中，从受试者去除细胞，将如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体引入其中，并且然后将细胞替换回到受试者中。从受试者取出细胞进行离体处理、然后再引回到受试者中的方法是本领域已知的(参见例如美国专利5,399,346；该专利的公开内容全文并入本文)。另选地，将ceDNA载体引入另一个受试者的细胞，引入培养细胞中，或引入任何其他适合来源的细胞中，并将细胞施用于有需要的受试者。
经如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体转导的细胞优选地以“治疗有效量”与药物载剂组合施用于受试者。所属领域的技术人员将了解，治疗效果不必是完全的或治愈的，只要给受试者提供了一些益处即可。
在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可以编码如本文所述的PAH蛋白(有时称为转基因或异源核苷酸序列)，所述PAH蛋白将在体外、离体或体内细胞中产生。例如，与本文所描述的ceDNA载体在如本文所讨论的治疗方法中的使用形成相比，在一些实施方案中，可以将用于表达PAH蛋白的ceDNA载体引入经培养细胞中并从细胞分离所表达的PAH蛋白，例如用于产生抗体和融合蛋白。在一些实施方案中，包含如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的经培养细胞可以用于商业上生产抗体或融合蛋白，从而例如充当小规模或大规模生物制造抗体或融合蛋白的细胞源。在另选的实施方案中，将如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体引入宿主非人类受试者的细胞中，用于体内生产抗体或融合蛋白，包括小规模生产以及商业大规模PAH蛋白生产。
如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可以用于兽医学与医学应用中。如上所述的离体基因递送方法的合适受试者包括禽类(例如鸡、鸭、鹅、鹌鹑、火鸡和野鸡)和哺乳动物(例如人、牛、绵羊、山羊、马、猫、犬和兔)，以哺乳动物为优选。人类受试者是最优选的。人类受试者包括新生儿、婴儿、青少年和成人。
D.剂量范围
本文提供了治疗方法，其包含向受试者施用有效量的包含如本文所描述的编码PAH蛋白的ceDNA载体的组合物。如熟练的从业者将了解，术语“有效量”是指ceDNA组合物的施用量，引起PAH蛋白以治疗PKU的“治疗有效量”表达。
可以任选地采用体内和/或体外分析来帮助鉴定使用的最优剂量范围。制剂中准备采用的精确剂量还将取决于施用途径和病状严重度，并应根据所属领域的普通技术人员的判断和每个受试者的情况来决定。有效剂量可从衍生自例如体外或动物模型试验系统的剂量-反应曲线推断。
如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体是以足以转染期望组织的细胞和足以提供足够水平的基因转移和表达而无不当副作用的量施用。常规和药学上可接受的施用途径包括但不限于上文在“施用”部分中所述的那些途径，例如直接递送至选定的器官(例如门静脉内递送至肝脏)、口服、吸入(包括鼻内和气管内递送)、眼内、静脉内、肌肉内、皮下、皮内、肿瘤内和其他肠胃外施用途径。如果需要，施用途径可以组合。
实现特定“治疗作用”所需的本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的剂量将基于若干因素而变化，所述因素包括但不限于：核酸施用途径、实现治疗作用所需的基因或RNA表达水平、所治疗的特定疾病或病症以及(多种)基因、(多种)RNA产物或(多种)所产生的所表达的蛋白质的稳定性。所属领域的技术人员可以基于前述的因素以及所属领域中熟知的其他因素容易地确定治疗患有特定疾病或病症的患者的ceDNA载体剂量范围。
剂量方案可以调整，以提供最优的治疗反应。例如，可以重复施用寡核苷酸，例如可以每天施用若干剂，或者可以根据治疗情况的紧急程度的指示，按比例减少剂量。所属领域的普通技术人员将能够容易地确定主题寡核苷酸的适当剂量和施用计划，无论所述寡核苷酸是将施用于细胞还是受试者。
“治疗有效剂量”将落在相对较宽的范围内，所述范围可以通过临床试验确定并将取决于特定应用(神经细胞将需要很少的量，而全身性注射将需要大量)。例如，对于体内直接注射到人类受试者的骨骼肌或心肌中，治疗有效剂量将为约1μg至100g左右的ceDNA载体。如果使用外泌体或微粒来递送ceDNA载体，那么可以通过实验确定治疗有效剂量，但预计递送1μg至约100g的载体。此外，治疗有效剂量是表达足量的转基因、从而对受试者起作用的ceDNA载体的量，其使得疾病的一种或多种症状减少，但不产生显著的脱靶或显著的不良副作用。在一个实施方案中，“治疗有效量”是所表达的PAH蛋白的量，所述量足以使PKU生物标志物的表达产生统计显著的可测量变化或使指定疾病症状产生统计显著的可测量减轻。指定的ceDNA载体组合物的此类有效量能够在临床试验以及动物研究中加以调整。
药学上可接受的赋形剂和载剂溶液的配制物是所属领域的技术人员熟知的，开发在多种治疗方案中使用本文所描述的特定组合物的适合的剂量和治疗方案也是所属领域技术人员熟知的。
对于体外转染，递送到细胞(1×106个细胞)的如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的有效量将为约0.1到100μg、优选1到20μg并且更优选1到15μg或8到10μgceDNA载体。ceDNA载体越大，需要的剂量越高。如果使用外泌体或微粒，那么可以通过实验确定有效的体外剂量，但意图递送大致相同量的ceDNA载体。
对于PKU治疗，如本文所公开的表达PAH蛋白的ceDNA载体的适当剂量将取决于待治疗的疾病的特定类型、PAH蛋白类型、PKU的严重程度和病程、先前疗法、患者的临床史和对抗体的反应以及主治医师的判断。编码PAH蛋白的ceDNA载体适当地一次或在一系列治疗内施用于患者。本文涵盖了各种给药方案，包括(但不限于)单次施用或在不同时间点上的多次施用、集团施用和脉冲输注。
取决于疾病的类型和严重性，通过一次或多次单独施用或通过连续输注以使得经编码PAH蛋白以约0.3mg/kg到100mg/kg(例如15mg/kg-100mg/kg或所述范围内的任何剂量)表达的量来施用ceDNA载体。ceDNA载体的一种典型日剂量足以引起在约15mg/kg到100mg/kg或更大范围内的经编码PAH蛋白表达，此取决于上文提及的因素。ceDNA载体的一种示例性剂量是足以引起如本文所公开的经编码的PAH蛋白在约10mg/kg至约50mg/kg范围内表达的量。因此，可以向患者施用呈足以引起约0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2.0mg/kg、3mg/kg、4.0mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、80mg/kg、90mg/kg或100mg/kg(或其任何组合)的经编码PAH蛋白表达的量的一次或多次剂量的ceDNA载体。在一些实施方案中，ceDNA载体为足以引起在50mg至2500mg范围内的总剂量的经编码PAH蛋白表达的量。ceDNA载体的示例性剂量为足以引起约50mg、约100mg、200mg、300mg、400mg、约500mg、约600mg、约700mg、约720mg、约1000mg、约1050mg、约1100mg、约1200mg、约1300mg、约1400mg、约1500mg、约1600mg、约1700mg、约1800mg、约1900mg、约2000mg、约2050mg、约2100mg、约2200mg、约2300mg、约2400mg或约2500mg(或它们的任何组合)的经编码PAH蛋白的总表达的量。由于ceDNA载体对PAH蛋白的表达可以由本文中的调节开关小心地控制，或者，向受试者施用多次剂量的ceDNA载体，ceDNA载体对PAH蛋白的表达可以使得可以间歇地，例如每周、每两周、每三周、每四周、每月、每两个月、每三个月或每六个月从ceDNA载体施用所表达的PAH蛋白的剂量的方式进行控制。通过常规技术和分析能够监测此疗法的进展。
在某些实施方案中，ceDNA载体以足以引起呈15mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、60mg/kg或均一剂量例如300mg、500mg、700mg、800mg或更高的剂量的经编码PAH蛋白表达的量施用。在一些实施方案中，ceDNA载体对PAH蛋白的表达受到控制以使得PAH蛋白在一段时间内每天、每隔一天、每周、每2周或每4周进行表达。在一些实施方案中，ceDNA载体对PAH蛋白的表达受到控制以使得PAH蛋白在一段时间内每2周或每4周进行表达。在某些实施方案中，时间段是6个月、一年、十八个月、两年、五年、十年、15年、20年或患者一生。
治疗可以涉及施用单次剂量或多次剂量。在一些实施方案中，可以向受试者施用多于一次剂量；实际上，可根据需要施用多次剂量，因为ceDNA载体由于没有病毒衣壳而不会引发抗衣壳宿主免疫反应。因此，所属领域的技术人员可以容易地确定适当剂量次数。施用的剂数可以例如1-100剂，优选地2-20剂的量级。
在不希望受任何特定理论束缚的情况下，缺乏通过施用如本公开所描述的ceDNA载体引发的典型抗病毒免疫反应(即，不存在衣壳组分)允许用于表达PAH蛋白的ceDNA载体在多种场合施用于宿主。在一些实施方案中，将核酸例如异源核酸递送至受试者的次数在2至10次的范围内(例如2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或10次)。在一些实施方案中，向受试者递送ceDNA载体超过10次。
在一些实施方案中，每个日历天(例如24小时时间段)向受试者施用一种剂量的如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体不超过一次。在一些实施方案中，每2个、3个、4个、5个、6个或7个日历日向受试者施用一剂ceDNA载体不超过一次。在一些实施方案中，每个日历周(例如7个日历天)向受试者施用一种剂量的如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体不超过一次。在一些实施方案中，ceDNA载体的剂量施用于受试者，每两周不超过一次(例如两个日历周时间段为一次)。在一些实施方案中，ceDNA载体的剂量施用于受试者，每个日历月不超过一次(例如30个日历日为一次)。在一些实施方案中，ceDNA载体的剂量施用于受试者，每六个日历月不超过一次。在一些实施方案中，ceDNA载体的剂量施用于受试者，每个日历年(例如365天或闰年366天)不超过一次。
在特定实施方案中，超过一次施用(例如两次、三次、四次或更多次施用)如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可以用于在不同间隔期内，例如每天、每周、每月、每年等实现所期望的基因表达水平。
在一些实施方案中，由如本文所公开的ceDNA载体编码的治疗性PAH蛋白可以通过调节开关、可诱导或可抑制型启动子进行调节以使得其在受试者中表达至少1小时、至少2小时、至少5小时、至少10小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时、至少36小时、至少48小时、至少72小时、至少1周、至少2周、至少1个月、至少2个月、至少6个月、至少12个月/一年、至少2年、至少5年、至少10年、至少15年、至少20年、至少30年、至少40年、至少50年或更长时间。在一个实施方案中，通过在预定或期望的间隔时间反复施用本文所述的ceDNA载体能够达成表达。另选地，如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体还可包含基因编辑系统的组分(例如CRISPR/Cas、TALEN、锌指核酸内切酶等)以允许插入一个或多个编码PAH蛋白的核酸序列以获得疾病的基本上永久的治疗或“治愈”。包含基因编辑组分的此类ceDNA载体公开于国际申请PCT/US18/64242中，并且可包含5'和3'同源臂(例如SEQ ID NO:151-154，或与其具有至少40％、50％、60％、70％或80％同源性的序列)以便将编码PAH蛋白的核酸插入安全港区域，诸如但不包括白蛋白基因或CCR5基因。例如，表达PAH蛋白的ceDNA载体可以包含用于将PAH转基因插入基因组安全港中的至少一个基因组安全港(GSH)特异性同源臂，其公开于2019年3月1日提交的国际专利申请PCT/US2019/020225中，所述申请全文以引用方式并入本文。
治疗持续时间视受试者的临床进展和对治疗的反应而定。初始较高治疗剂量之后，预期为连续的相对较低维持剂量。
E.单位剂型
在一些实施方案中，包含如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的药物组合物可以便利地以单位剂型呈现。单位剂量通常将适于药物组合物的一种或多种特定施用途径。在一些实施方案中，单位剂型适合于直接施用于眼睛的液滴。在一些实施方案中，单位剂量适合于通过吸入施用。在一些实施方案中，单位剂量适合于通过汽化器施用。在一些实施方案中，单位剂量适合于通过喷雾器施用。在一些实施方案中，单位剂量适合于通过气雾器施用。在一些实施方案中，单位剂量适合于口服施用、经颊施用或舌下施用。在一些实施方案中，单位剂量适合于静脉内、肌肉内或皮下施用。在一些实施方案中，单位剂型适合于视网膜下注射、脉络膜上注射或玻璃体内注射。
在一些实施方案中，单位剂量适合于鞘内或脑室内施用。在一些实施方案中，配制药物组合物以供局部施用。可以与载剂材料组合以产生单个剂量的活性组分的量将通常是化合物产生治疗效果的量。
X.治疗方法
本文所述的技术还通过多种方式(包括例如离体、非原位、体外和体内应用、方法、诊断程序和/或基因疗法方案)展现了用于制备所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的方法以及使用所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的方法。
在一个实施方案中，由如本文所公开的ceDNA载体表达的所表达的治疗性PAH蛋白具有治疗疾病的功能。在一个优选的实施方案中，治疗性PAH蛋白不引起免疫系统反应，除非期望如此。
本文提供了一种治疗受试者的PKU或病症的方法，包含将治疗有效量的如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体、任选地与药学上可接受的载剂一起引入有需要的靶细胞(例如肌肉细胞或组织，或其他受影响的细胞类型)。虽然ceDNA载体可以在载剂存在下引入，但此类载剂不是必需的。所建构的ceDNA载体包含可用于治疗疾病的如本文所描述的编码PAH蛋白的核酸序列。确切地说，如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可以包含可操作地连接到控制元件的期望PAH蛋白DNA序列，所述控制元件能够在由外源性DNA序列编码的期望PAH蛋白引入受试者中时引导其转录。如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可以通过如上文和本文其他地方所提供的任何适合的途径施用。
本文公开了如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体组合物和配制物，其包括本公开的一种或多种ceDNA载体以及一种或多种药学上可接受的缓冲剂、稀释剂或赋形剂。此类组合物可以包含在一种或多种诊断或治疗试剂盒中，以用于诊断、预防、治疗或改善PKU的一种或多种症状。一方面，所述疾病、损伤、病症、创伤或功能障碍是人疾病、损伤、病症、创伤或功能障碍。
本文所述的技术的另一方面提供了向对其有需要的受试者提供诊断或治疗有效量的如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的方法，该方法包括向对其有需要的受试者的细胞、组织或器官提供一定量的如本文所公开的ceDNA载体；并且持续能有效实现ceDNA载体表达PAH蛋白的时间，由此向受试者提供诊断或治疗有效量的由ceDNA载体表达的PAH蛋白。在另一方面，受试者为人。
本文描述的技术的另一方面提供了一种用于诊断、预防、治疗或改善受试者的PKU、病症、功能障碍、损伤、异常病状或创伤的至少一种或多种症状的方法。在整体和一般意义上，所述方法至少包括以足以诊断、预防、治疗或改善受试者的疾病、病症、功能障碍、损伤、异常病况或创伤的一种或多种症状的量并持续足以诊断、预防、治疗或改善受试者的疾病、病症、功能障碍、损伤、异常病况或创伤的一种或多种症状的时间向有需要的受试者施用一种或多种所公开的用于产生PAH蛋白的ceDNA载体的步骤。在此类实施方案中，可以评估受试者的PAH蛋白的功效，或者，检测受试者的PAH蛋白或PAH蛋白的组织位置(包括细胞和亚细胞位置)。因此，如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可以用作体内诊断工具，例如用于检测癌症或其他适应症。在另一方面，受试者为人。
另一方面是如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体用作治疗或减轻PKU或疾病状态的一种或多种症状的工具的用途。有许多遗传疾病中的缺陷基因是已知的，并且通常分为两类：缺陷状态，通常是酶，一般以隐性方式遗传；和不平衡状态，其可以涉及调节蛋白或结构蛋白，并且通常但不总是以显性方式遗传。就不均衡的疾病状态而言，如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体能够用于在模型系统中建立PKU状态，然后能够利用所述模型系统尝试抵消疾病状态。因此，如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体准许治疗遗传疾病。如本文所使用的，通过部分或完全拯救导致疾病或使其更严重的缺陷或不平衡，可以治疗PKU状态。
A.宿主细胞
在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体将PAH蛋白转基因递送到受试者宿主细胞中。在一些实施方案中，细胞是感光细胞。在一些实施方案中，细胞是RPE细胞。在一些实施方案中，受试者的宿主细胞是人宿主细胞，包括例如血细胞、干细胞、造血细胞、CD34+细胞、肝细胞、癌细胞、血管细胞、肌肉细胞、胰腺细胞、神经细胞、视觉或视网膜细胞、上皮或内皮细胞、树突状细胞、成纤维细胞或任何其他哺乳动物来源的细胞，包括但不限于肝(即肝)细胞、肺细胞、心脏细胞、胰腺细胞、肠细胞、隔膜细胞、肾(即肾)细胞、神经细胞、血细胞、骨髓细胞或预期进行基因治疗的受试者的任何一种或多种选定的组织。在一方面，受试者的宿主细胞是人类宿主细胞。
本公开还涉及如上文所提及的重组宿主细胞，其包括如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体。因此，对于技术人员而言显而易见的是，可以根据目的使用多种宿主细胞。将包括供体序列的如本文所公开的用于表达PAH蛋白的构建体或ceDNA载体引入宿主细胞中以使得供体序列维持为染色体整合体，如早先所描述。术语宿主细胞涵盖由于复制过程中发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上取决于供体序列和其来源。
宿主细胞也可以是真核生物，例如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是人细胞(例如原代细胞、干细胞或永生化细胞系)。在一些实施方案中，可以向宿主细胞离体施用如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体，然后在基因疗法事件之后递送到受试者。宿主细胞可以是任何细胞类型，例如体细胞或干细胞、诱导型多能干细胞或血细胞，例如T细胞或B细胞，或骨髓细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是同种异体细胞。例如，T细胞基因组工程可用于癌症免疫疗法、如HIV疗法的疾病调节(例如受体敲除，如CXCR4和CCR5)和免疫缺陷疗法。可靶向B细胞上的MHC受体进行免疫治疗。在一些实施方案中，能够将基因经修饰的宿主细胞(例如骨髓干细胞，例如CD34+细胞，或诱导多能干细胞)移植回到患者中用于表达治疗蛋白。
B.基因疗法所针对的额外疾病
一般来说，如本文所公开的用表达PAH蛋白的ceDNA载体可用于递送根据上述说明的任何PAH蛋白以治疗、预防或改善与PKU有关的症状，所述病症与受试者的异常蛋白质表达或基因表达有关。
在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可用于将PAH蛋白递送至骨骼肌、心肌或膈肌，以产生用于在血液中分泌和循环的PAH蛋白或用于全身递送至其他组织以治疗、改善和/或预防PKU。
如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可以通过任何适合的方式，任选地通过施用受试者所吸入的包含ceDNA载体的可吸入粒子的气雾剂悬浮液来施用受试者的肺。可吸入粒子可以是液体或固体。包含ceDNA载体的液体粒子的气雾剂可以通过任何合适的手段产生，例如用压力驱动的气雾剂喷雾器或超声喷雾器，如所属领域的技术人员所知。参见例如美国专利第4,501,729号。包含ceDNA载体的固体粒子的气雾剂也可以通过制药领域已知的技术，用任何固体粒子药物气雾剂发生器产生。
在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可以施用于CNS组织(例如大脑、眼睛)。
可以用如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体治疗、改善或预防的眼病包括涉及视网膜、后束和视神经的眼科病症(例如色素性视网膜炎、糖尿病性视网膜病变和其他视网膜变性疾病、葡萄膜炎、年龄相关黄斑变性、青光眼)。许多眼科疾病和病症与以下三种类型适应症中的一种或多种有关：(1)血管产生、(2)炎症和(3)变性。在一些实施方案中，如本文所公开的ceDNA载体可用于递送抗血管生成因子；抗炎因子；延缓细胞退化、促进细胞保留或促进细胞生长的因子，以及上述的组合。例如，糖尿病性视网膜病的特征是血管产生。通过眼内(例如玻璃体内)或眼周(例如眼球筋膜囊下区域)递送一种或多种抗血管产生抗体或融合蛋白能够治疗糖尿病性视网膜病变。可以用本公开的ceDNA载体治疗、改善或预防的额外眼病包括：地图样萎缩、血管性或“湿性”黄斑变性、PKU、雷伯氏先天性黑蒙(LCA)、尤塞氏综合征(Usher syndrome)、弹力纤维性假黄瘤(PXE)、x连锁色素性视网膜炎(XLRP)、x连锁视网膜劈裂症(XLRS)、无脉络膜症、雷伯氏遗传性视神经病变(LHON)、色盲、视锥-视杆营养不良、富克斯角膜内皮营养不良(Fuchs endothelial corneal dystrophy)、糖尿病性黄斑水肿以及眼癌和肿瘤。
在一些实施方案中，发炎眼部疾病或病症(例如葡萄膜炎)可以通过如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体治疗、改善或预防。通过眼内(例如玻璃体或前房)施用如本文所公开的ceDNA载体能够表达一种或多种消炎抗体或融合蛋白。
在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可以编码与编码报告多肽(例如酶，例如绿色荧光蛋白或碱性磷酸酶)的转基因相关的PAH蛋白。在一些实施方案中，编码可用于实验或诊断目的的报告蛋白的转基因选自下列中的任何一种：β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶、胸苷激酶、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶和所属领域中熟知的其他转基因。在一些方面中，表达连接到报告子多肽的PAH蛋白的ceDNA载体可以用于诊断目的，以及测定ceDNA载体在其所施用到的受试者中的功效或用作ceDNA载体在所述受试者中的活性的标志物。
C.使用ceDNA载体测试成功的基因表达
所属领域中熟知的分析可以用于测试ceDNA载体对PAH蛋白的基因递送的效率，所述测试可以在体外和体内模型中执行。所属领域的技术人员可以通过测量PAH蛋白的mRNA和蛋白质含量(例如逆转录PCR、蛋白质印迹分析和酶联免疫吸附分析(ELISA))来评估ceDNA对PAH蛋白的表达水平。在一个实施方案中，ceDNA包含报告蛋白，所述报告蛋白可以用于评估PAH蛋白的表达，例如通过利用荧光显微术或发光读盘器检查报告蛋白的表达。对于体内应用，蛋白质功能分析可以用于测试既定PAH蛋白的功能以确定基因表达是否成功进行。熟练的技术人员能够确定用于测量由ceDNA载体体外或体内表达的PAH蛋白的功能的最佳测试。
本文预期在细胞或受试者中ceDNA载体对PAH蛋白的基因表达的效应可以持续至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少四个月、至少5个月、至少六个月、至少10个月、至少12个月、至少18个月、至少2年、至少5年、至少10年、至少20年，或可以永久。
在一些实施方案中，本文所描述的表达盒、表达构建体或ceDNA载体中的PAH蛋白可以针对宿主细胞进行密码子优化。如本文所用，术语“进行密码子优化”或“密码子优化”是指通过用如小鼠或人(例如人源化)等所关注脊椎动物的基因中使用频率较高或最高的密码子替换天然序列(例如原核序列)的至少一个、超过一个或大量密码子来修饰核酸序列以增强其在所述脊椎动物的细胞中的表达的过程。各种物种对特定氨基酸的某些密码子表现出特定的偏好。通常，密码子优化不会改变原始翻译蛋白质的氨基酸序列。使用例如Aptagen的Gene密码子优化和定制基因合成平台(Aptagen公司)或其他公共数据库可以确定优化密码子。
D.通过评估ceDNA载体对PAH蛋白的表达来测定功效
所属领域中已知的用于测定蛋白质表达的基本上任何方法都可以用于分析ceDNA载体对PAH蛋白的表达。此类方法/分析的非限制性示例包括酶联免疫分析(ELISA)、亲和力ELISA、ELISPOT、连续稀释、流式细胞术、表面等离子体共振分析、动力学排除分析、质谱学、蛋白质印迹、免疫沉淀和PCR。
为了评估体内PAH蛋白表达，可以从受试者获得生物样品进行分析。示例性生物样品包括生物流体样品、体液样品、血液(包括全血)、血清、血浆、尿液、唾液、切片和/或组织样品等。生物样品或组织样品还可以指从个体中分离出的组织或流体样品，包括(但不限于)肿瘤切片、粪便、脊髓液、胸膜液、乳头抽出物、淋巴液、皮肤、呼吸道、肠道和泌尿生殖道的外部切片、泪液、唾液、母乳、细胞(包括(但不限于)血细胞)、肿瘤、器官，以及体外细胞培养液成分的样品。术语还包括上述样品的混合物。术语“样品”还包括未治疗或预治疗(或预处理)的生物样品。在一些实施方案中，用于本文描述的分析和方法的样品包含从待测受试者收集的血清样品。
E.通过临床参数测定所表达的PAH蛋白的功效
由ceDNA载体表达的给定PAH蛋白对PKU的功效(即功能性表达)可由熟练的临床医生确定。然而，在本文使用“有效治疗”时，如果在用如本文所述的编码治疗性PAH蛋白的ceDNA载体治疗之后PKU的任一种或所有体征或症状以有益方式改变、或疾病的其他临床上接受的症状或标志物改良或改善例如至少10％，那么认为治疗是“有效治疗”。还可以根据个体未发生恶化来测量功效，如通过PKU的稳定或对医疗干预的需求(即，疾病的进展停止或至少减缓)所评估。测量这些指标的方法是所属领域的技术人员已知的和/或描述于本文中。治疗包括个体或动物(一些非限制性示例包括人或哺乳动物)中的疾病的任何治疗，并且包括：(1)抑制疾病，例如阻止或减缓PKU的进展；或(2)缓解PKU，例如使PKU症状消退；以及(3)预防或降低PKU疾病发展的可能性，或预防与PKU相关的继发性疾病/病症。当本文定义有效治疗时，治疗疾病的有效量意味着当施用于有需要的哺乳动物时足以对所述疾病产生有效治疗的量。药剂功效能够通过评估PKU疾病所特有的身体指标来测定。医生可以评估PKU的任何一种或多种临床症状，包括：**(i)定期饮食时降低血清苯胺(Phe)水平。Phe减少是PKU治疗研发的关键生物标志物。(ii)恢复正常饮食中Phe与酪氨酸代谢比率。该途径负责神经递质的产生；和/或(iii)评估降低的血清Phe水平。
实施例
以下实施例以说明而非限制的方式提供。所属领域的普通技术人员将了解，可以从本文所述的任何野生型或修饰ITR中构建ceDNA载体，并且以下示例性方法可以用于构建和评估这类ceDNA载体的活性。虽然这些方法以某些ceDNA载体为例，但它们适用于符合描述的任何ceDNA载体。
实施例1：使用基于昆虫细胞的方法构建ceDNA载体
使用多核苷酸构建体模板产生ceDNA载体描述于PCT/US18/49996的实施例1中，该文献全文以引用方式并入本文。例如，用于产生本公开的ceDNA载体的多核苷酸构建体模板可以是ceDNA质粒、ceDNA杆粒和/或ceDNA杆状病毒。不受理论束缚，在准许的宿主细胞中，在例如Rep的存在下，具有两个对称ITR(其中至少一个ITR相对于野生型ITR序列经修饰)和表达构建体的多核苷酸构建体模板复制而产生ceDNA载体。ceDNA载体产生经历两个步骤：第一，经由Rep蛋白从模板主链(例如ceDNA-质粒、ceDNA-杆粒、ceDNA-杆状病毒基因组等)中切除(“拯救”)模板；以及第二，Rep介导所切除的ceDNA载体复制。
ceDNA-杆粒的产生：
依循根据制造商说明书的方案，用测试或对照质粒转化DH10Bac感受态细胞(MAXDH10BacTM感受态细胞，赛默飞世尔)。诱导DH10Bac细胞中质粒与杆状病毒穿梭载体之间的重组，以产生重组ceDNA-杆粒。通过以下方法来选择重组杆粒：在含有X-gal和IPTG的细菌琼脂平板上利用抗生素基于大肠杆菌中的蓝白筛选来筛选阳性选择(Φ80dlacZΔM15标志物提供了来自杆粒载体的β-半乳糖苷酶基因的α-互补)，以选择转化体并维持杆粒和转座酶质粒。挑选出由破坏β-半乳糖苷指示基因的转座所造成的白色菌落，并在10ml培养基中进行培养。
从大肠杆菌中分离重组ceDNA-杆粒，并使用FugeneHD将其转染到Sf9或Sf21昆虫细胞中以产生感染性杆状病毒。将附着性Sf9或Sf21昆虫细胞在25℃下在T25烧瓶内的50ml培养基中进行培养。四天后，从细胞去除培养基(含有P0病毒)，将培养基通过0.45μm过滤器过滤，从细胞或细胞碎片中分离出感染性杆状病毒粒子。
任选地，第一代杆状病毒(P0)通过在50到500ml培养基中感染原初Sf9或Sf21昆虫细胞来扩增。将细胞在回转式振荡温育箱的悬浮培养液中、在130rpm下、在25℃下维持，监测细胞直径和存活率，直到细胞达到18-19nm直径(从14-15nm的原初直径)和～4.0E+6个细胞/mL的密度。感染后第3天到第8天，利用离心去除细胞和残骸、然后通过0.45μm过滤器过滤来收集培养基中的P1杆状病毒粒子。
收集包括测试构建体的ceDNA-杆状病毒，并测定杆状病毒的感染活性或滴度。具体来说，用P1杆状病毒按下列稀释度处理四个20ml的2.5E+6个细胞/ml的Sf9细胞培养物：1/1000、1/10,000、1/50,000、1/100,000，并在25℃-27℃下培育。通过细胞直径增加和细胞周期停滞的速率以及4到5天中每天细胞活力的变化来确定感染性。
如PCT/US18/49996的图8A中所公开的“Rep质粒”(该文献全文以引用方式并入本文)在pFASTBACTM-Dual表达载体(ThermoFisher)中产生，该表达载体包含Rep78(SEQ IDNO:131或133)和Rep52(SEQ ID NO:132)或Rep68(SEQ ID NO:130)和Rep40(SEQ ID NO:129)。依循制造商提供的方案，将Rep-质粒转化到DH10Bac感受态细胞(MAXDH10BacTM感受态细胞(赛默飞世尔))中。诱导DH10Bac细胞中Rep-质粒与杆状病毒穿梭载体之间的重组，以产生重组杆粒(“Rep-杆粒”)。通过阳性选择来选择重组杆粒，所述阳性选择包含在含有X-gal和IPTG的细菌琼脂平板上在大肠杆菌中进行蓝白筛选(Φ80dlacZΔM15标志物提供了来自杆粒载体的β-半乳糖苷酶基因的α-互补)。挑选分离的白色菌落，并接种到10ml选择培养基(含卡那霉素、庆大霉素(gentamicin)、四环素的LB培养液)中。从大肠杆菌中分离出重组杆粒(Rep-杆粒)，并将Rep-杆粒转染到Sf9或Sf21昆虫细胞中，以产生感染性杆状病毒。
将Sf9或Sf21昆虫细胞在50ml培养基中培养4天，并从培养物中分离感染性重组杆状病毒(“Rep-杆状病毒”)。任选地，第一代Rep-杆状病毒(P0)通过感染原生Sf9或Sf21昆虫细胞来扩增并且在50ml到500ml培养基中培养。在感染后3天与8天之间，通过离心或过滤或其他分级分离方法分离细胞来收集培养基中的P1杆状病毒粒子。收集Rep-杆状病毒并测定杆状病毒的感染活性。具体地说，用P1杆状病毒按下列稀释度治疗四个20mL的2.5×106个细胞/mL的Sf9细胞培养物：1/1000、1/10,000、1/50,000、1/100,000，并温育。通过细胞直径增加和细胞周期停滞的速率以及4到5天中每天细胞活力的变化来确定感染性。
ceDNA载体产生和表征
参考图3B，然后将含有(1)含有ceDNA-杆粒或ceDNA-杆状病毒的样品和(2)上述Rep杆状病毒二者之一的Sf9昆虫细胞培养基分别以1:1000和1:10,000的比率加入到新鲜的Sf9细胞培养物(2.5E+6个细胞/毫升，20ml)中。然后将细胞在25℃下以130rpm培养。共同感染4-5天后，检测细胞直径和活力。当细胞直径达到18-20nm并且活力为约70％-80％时，将细胞培养物离心，去除培养基，并收集细胞团粒。首先将细胞团粒悬浮于适量的水性介质，即水或缓冲液中。使用凯杰(Qiagen)MIDI PLUSTM纯化方案(凯杰，每个柱处理0.2mg细胞团粒质量)从细胞中分离并纯化ceDNA载体。
初始基于260nm下的UV吸光度，测定从Sf9昆虫细胞产生和纯化的ceDNA载体的产量。
可以通过如图3D所示在天然或变性条件下的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定来评估ceDNA载体，其中(a)在限制性核酸内切酶裂解和凝胶电泳分析后，对比天然凝胶，变性凝胶上存在以两倍大小迁移的特征色带；以及(b)在未裂解物质的变性凝胶上存在单体和二聚体(2x)色带是ceDNA载体存在的特征。
通过用限制性核酸内切酶消化从共同感染的Sf9细胞(如本文所述)获得的DNA，进一步分析分离的ceDNA载体的结构，所述限制性核酸内切酶是针对以下条件选择的：a)在ceDNA载体内仅存在单个切割位点；和b)所得到的片段足够大，以便在0.8％变性琼脂糖凝胶上进行分级分离时被清楚看到(>800bp)。如图3D和图3E所示，具有非连续结构的线性DNA载体以及具有线性且连续结构的ceDNA载体可以通过它们反应产物的大小来区分，例如，预计具有非连续结构的DNA载体将产生1kb和2kb片段，而具有连续结构的非衣壳化载体预计产生2kb和4kb片段。
因此，为了以定性方式证明分离的ceDNA载体是根据定义所要求那样共价封闭端的，将样品用在特定DNA载体序列的背景下被鉴定为具有单个限制位点的限制性核酸内切酶消化，优选产生两个大小不等的裂解产物(例如1000bp和2000bp)。在变性凝胶(其将两条互补的DNA链分开)上进行消化和电泳后，线性、非共价封闭的DNA将以1000bp和2000bp大小分解，而共价封闭的DNA(即ceDNA载体)将以2倍大小分解(2000bp和4000bp)，这是因为两条DNA链是连接的并且现在伸展且长度翻倍(尽管是单链)。此外，由于多聚体DNA载体的端对端连接，对单体、二聚体和n聚体形式的DNA载体的消化都将分解为相同大小的片段(参见图3D)。图4是用核酸内切酶(用于ceDNA构建体1和2的EcoRI；用于ceDNA构建体3和4的BamH1；用于ceDNA构建体5和6的SpeI；以及用于ceDNA构建体7和8的XhoI)进行(+)或不进行(-)消化的ceDNA载体的变性凝胶电泳实施例的示例性图片。构建体1-8描述于国际申请PCT PCT/US18/49996的实施例1中，该申请全文以引用方式并入本文。确定了用星号突出显示的色带的大小，并提供在图片的底部。
如本文所用，短语“通过在天然凝胶和变性条件下进行琼脂糖凝胶电泳来鉴定DNA载体的分析”是指一种通过执行限制性核酸内切酶消化、随后对消化产物进行电泳评估来评估ceDNA封闭端的分析。后面是一种这样的示例性分析，尽管所属领域的普通技术人员将了解，对这个实施例可以进行许多所属领域已知的变化。选择限制性核酸内切酶作为所关注的ceDNA载体的单切酶，其将产生DNA载体长度的大致1/3x和2/3x的产物。由此使天然凝胶和变性凝胶上的色带解析。变性之前，重要的是从样品中去除缓冲液。Qiagen PCR清洁试剂盒或脱盐“离心柱”，例如GE HEALTHCARE ILUSTRATMMICROSPINTMG-25柱，是核酸内切酶消化的一些本领域已知的选项。所述分析包括例如：i)用适当的限制性核酸内切酶消化DNA；2)施加于例如Qiagen PCR清洁试剂盒，用蒸馏水洗脱；iii)加入10x变性溶液(10x＝0.5MNaOH、10mM EDTA)，加入10X染料，不进行缓冲，并与通过添加入10X变性溶液至4x而制备的DNA序列梯一起，在预先与1mM EDTA和200mM NaOH一起培育以确保凝胶和凝胶盒中的NaOH浓度均匀的0.8-1.0％凝胶上进行分析，并在1x变性溶液(50mM NaOH、1mM EDTA)存在下跑动凝胶。所属领域的普通技术人员将了解基于所得物的大小和期望的计时使用什么电压来跑动电泳。电泳后，将凝胶排出并在1x TBE或TAE中进行中和，并转移到蒸馏水或含1xSYBR金的1x TBE/TAE中。然后使用例如赛默飞世尔金核酸凝胶染色剂(DMSO中的10,000×浓缩液)和落射荧光(蓝色)或UV(312nm)使带可视化。
产生的ceDNA载体的纯度可以使用任何所属领域已知的方法来评估。作为一个示例性和非限制性方法，通过对ceDNA载体的荧光强度与标准进行比较，能够估计ceDNA-质粒对样品的总体UV吸光度的贡献。例如，若基于UV吸光度将4μg ceDNA载体装载于凝胶上并且ceDNA载体荧光强度等效于已知是1μg的2kb色带，则存在1μg ceDNA载体，且ceDNA载体是总UV吸收材料的25％。然后将凝胶上的带强度相对于带表示的计算输入作图，例如，如果总ceDNA载体为8kb，而切下的比较带为2kb，那么带强度将按总输入的25％绘制，在这种情况下，对于1.0μg输入，将为25μg。使用ceDNA载体质粒滴定来绘制标准曲线，然后使用回归线方程计算ceDNA载体色带的量，然后可以用于测定ceDNA载体所表示的总输入的百分比或纯度百分比。
出于比较的目的，实施例1描述了使用基于昆虫细胞的方法和多核苷酸构建体模板产生ceDNA载体，并且还描述在国际专利申请PCT/US18/49996的实施例1中，该专利申请全文以引用方式并入本文。例如，用于根据实施例1产生本公开的ceDNA载体的多核苷酸构建体模板可以是ceDNA质粒、ceDNA杆粒和/或ceDNA杆状病毒。不受理论束缚，在准许的宿主细胞中，在例如Rep的存在下，具有两个对称ITR(其中至少一个ITR相对于野生型ITR序列经修饰)和表达构建体的多核苷酸构建体模板复制而产生ceDNA载体。ceDNA载体产生经历两个步骤：第一，经由Rep蛋白从模板主链(例如ceDNA-质粒、ceDNA-杆粒、ceDNA-杆状病毒基因组等)中切除(“拯救”)模板；以及第二，Rep介导所切除的ceDNA载体复制。
实施例2：经由从双链DNA分子切除产生合成ceDNA
ceDNA载体的合成产生描述于2019年1月18日提交的国际专利申请PCT/US19/14122的实施例2-6中，该专利申请全文以引用方式并入本文。使用合成方法产生ceDNA载体的一种示例性方法涉及切除双链DNA分子。简而言之，可以使用双链DNA构建体产生ceDNA载体，例如，参见PCT/US19/14122的图7A-图8E。在一些实施方案中，双链DNA构建体是ceDNA质粒(例如参见例如2018年12月6日提交的国际专利申请PCT/US2018/064242的图6)。
在一些实施方案中，制备ceDNA载体的构建体包含如本文所述的调节开关。
出于说明的目的，实施例2描述了ceDNA载体的产生，所述ceDNA载体是使用此方法产生的示例性封闭端DNA载体。然而，虽然本实施例中以ceDNA载体为例来说明产生封闭端DNA载体的体外合成产生方法，其通过切除包含ITR和表达盒(例如核酸序列，例如异源核酸序列)的双链多核苷酸，随后如本文所述将自由的3'和5'端接合来实现，但所属领域的普通技术人员应当了解，可以如上所说明修饰双链DNA多核苷酸分子，使得产生任何期望的封闭端DNA载体，包括但不限于狗骨状DNA、哑铃状DNA等。能够利用实施例2中所述的合成产生方法产生的用于产生抗体或融合蛋白的示例性ceDNA载体论述于标题为“III.通用ceDNA载体”的章节中。由ceDNA载体表达的示例性抗体和融合蛋白描述于标题为“IIC.由ceDNA载体表达的示例性抗体和融合蛋白”的章节中。
所述方法包括(i)从双链DNA构建体中切除编码表达盒的序列和(ii)在一个或多个ITR处形成发夹和(iii)通过接合(例如通过T4 DNA连接酶)将自由的5'与3'端连接。
双链DNA构建体以5'至3'的顺序包含：第一限制性核酸内切酶位点；上游ITR；表达盒；下游ITR；以及第二限制性核酸内切酶位点。然后使双链DNA构建体与一种或多种限制性核酸内切酶接触以在两个限制性核酸内切酶位点处产生双链断裂。一种核酸内切酶可以靶向两个位点，或者每个位点可以被不同的核酸内切酶靶向，只要限制性位点不存在于ceDNA载体模板中。这从双链DNA构建体的其余部分切除了限制性核酸内切酶位点之间的序列(参见PCT/US19/14122的图9)。接合后，形成封闭端DNA载体。
所述方法中使用的一个或两个ITR可以是野生型ITR。也可以使用经修饰的ITR，其中所述修饰能够包括形成B和B'臂和/或C和C'臂的序列中的野生型ITR中的一个或多个核苷酸的缺失、插入或取代(参见例如PCT/US19/14122的图6-8和10；图11B)，并且可以具有两个或更多个发夹环(参见例如PCT/US19/14122的图6-8；图11B)或单个发夹环(参见例如PCT/US19/14122的图10A-10B、图11B)。通过对现有寡核苷酸进行基因修饰或通过重新生物学和/或化学合成能够产生发夹环经修饰的ITR。
在一个非限制性实施例中，左和右ITR-6(SEQ ID NO:111和112)在B-B'和C-C'臂中包括来自AAV2的野生型ITR的40个核苷酸的缺失。经修饰的ITR中剩余的核苷酸预测可形成单个发夹结构。展开结构的吉布斯自由能(Gibbs free energy)是约-54.4千卡/摩尔。还可以对ITR产生其他修饰，包括功能Rep结合位点或Trs位点的任选缺失。
实施例3：经由寡核苷酸构建产生ceDNA
使用涉及组装不同寡核苷酸的合成方法产生ceDNA载体的另一种示例性方法提供于PCT/US19/14122的实施例3中，所述专利全文以引用方式并入本文，其中ceDNA载体是通过合成5’寡核苷酸和3’ITR寡核苷酸并且将ITR寡核苷酸与包含表达盒的双链多核苷酸接合来产生。PCT/US19/14122的图11B显示了将5'ITR寡核苷酸和3'ITR寡核苷酸与包含表达盒的双链多核苷酸接合的示例性方法。
ITR寡核苷酸可包含WT-ITR(参见例如图2A、图2C)或经修饰的ITR(参见例如图2B和图2D)。(参见例如PCT/US19/14122的图6A、图6B、图7A和图7B，该文献全文并入本文)。示例性ITR寡核苷酸包括但不限于SEQ ID NO:134-145(参见例如PCT/US19/14122的表7)。经修饰的ITR可以包含形成B和B'臂和/或C和C'臂的序列中相对于野生型ITR的一个或多个核苷酸的缺失、插入或取代。用于无细胞合成的包括如本文所述的WT-ITR或经修饰ITR的ITR寡核苷酸可通过遗传修饰或生物学和/或化学合成产生。ITR寡核苷酸可包括对称或非对称构型的WT-ITR或经修饰的ITR(mod-ITR)，如本文所论述。
实施例4：经由单链DNA分子产生ceDNA
使用合成方法产生ceDNA载体的另一种示例性方法提供于PCT/US19/14122的实施例4中，所述申请全文以引用方式并入本文，并且所述示例性方法使用包含两个有义ITR的单链线性DNA，所述两个有义ITR侧接有义表达盒序列并且共价附接到与反义表达盒侧接的两个反义ITR，然后将所述单链线性DNA的末端接合以形成封闭端单链分子。一个非限制性实施例包含合成和/或产生单链DNA分子、使所述分子的各部分粘接以形成具有二级结构的一个或多个碱基对区域的单一线性DNA分子，然后使自由的5’与3’端彼此接合以形成封闭的单链分子。
用于产生ceDNA载体的示例性单链DNA分子从5'至3'包含：第一有义ITR；有义表达盒序列；第二有义ITR；第二反义ITR；反义表达盒序列；以及第一反义ITR。
用于实施例4的示例性方法的单链DNA分子可以通过本文所描述的任何DNA合成方法形成，例如体外DNA合成，或通过用核酸酶使DNA构建体(例如质粒)裂解并将所得的dsDNA片段解链以提供ssDNA片段来提供。
通过将温度降低到低于有义和反义序列对的所计算的解链温度可以实现粘接。解链温度取决于特定核苷酸碱基含量和所用溶液的特征，例如盐浓度。任何给定序列的解链温度和溶液组合容易由所属领域的普通技术人员计算出。
退火分子的游离5'和3'端可以彼此接合，或接合到发夹分子上以形成ceDNA载体。适合的示例性接合方法和发夹分子描述于实施例2和3中。
实施例5：ceDNA的纯化和/或产生确认
通过本文所述方法(例如包括实施例1中所述的基于昆虫细胞的产生方法或实施例2至4中所述的合成产生方法)产生的任一种DNA载体产物可使用所属领域的技术人员通常已知的方法加以纯化，例如去除杂质、未使用的组分或副产物；并且/或者可加以分析，从而确认所产生的DNA载体(在此情况下是ceDNA载体)是所期望的分子。用于纯化DNA载体(例如ceDNA)的示例性方法是使用Qiagen Midi Plus纯化方案(Qiagen)和/或凝胶纯化。
以下是用于确认ceDNA载体身份的示例性方法。
可以通过如图3D所示在天然或变性条件下的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定来评估ceDNA载体，其中(a)在限制性核酸内切酶裂解和凝胶电泳分析后，对比天然凝胶，变性凝胶上存在以两倍大小迁移的特征色带；以及(b)在未裂解物质的变性凝胶上存在单体和二聚体(2x)色带是ceDNA载体存在的特征。
分离出的ceDNA载体的结构进一步如下分析：用根据以下所选的限制核酸内切酶消化经纯化的DNA：a)ceDNA载体内仅存在单个切割位点；和b)所得片段当在0.8％变性琼脂糖凝胶上分级分离时大得足以清晰可见(>800bp)。如图3C和3D中所说明，具有非连续结构的线性DNA载体和具有线性连续结构的ceDNA载体能够根据其反应产物的尺寸区分，例如，具有非连续结构的DNA载体预期产生1kb和2kb片段，而具有连续结构的ceDNA载体预期产生2kb和4kb片段。
因此，为了以定性方式证明分离的ceDNA载体是根据定义所要求那样共价封闭端的，将样品用在特定DNA载体序列的背景下被鉴定为具有单个限制位点的限制性核酸内切酶消化，优选产生两个大小不等的裂解产物(例如1000bp和2000bp)。在变性凝胶(其将两条互补的DNA链分开)上进行消化和电泳后，线性、非共价封闭的DNA将以1000bp和2000bp大小分解，而共价封闭的DNA(即ceDNA载体)将以2倍大小分解(2000bp和4000bp)，这是因为两条DNA链是连接的并且现在伸展且长度翻倍(尽管是单链)。此外，由于多聚体DNA载体的端对端连接，对单体、二聚体和n聚体形式的DNA载体的消化都将分解为相同大小的片段(参见图3E)。
如本文所用，短语“通过在天然凝胶和变性条件下进行琼脂糖凝胶电泳来鉴定DNA载体的分析”是指一种通过执行限制性核酸内切酶消化、随后对消化产物进行电泳评估来评估ceDNA封闭端的分析。后面是一种这样的示例性分析，尽管所属领域的普通技术人员将了解，对这个实施例可以进行许多所属领域已知的变化。选择限制性核酸内切酶作为所关注的ceDNA载体的单切酶，其将产生DNA载体长度的大致1/3x和2/3x的产物。由此使天然凝胶和变性凝胶上的色带解析。变性之前，重要的是从样品中去除缓冲液。Qiagen PCR清洁试剂盒或脱盐“离心柱”，例如GE HEALTHCARE ILUSTRATMMICROSPINTMG-25柱，是核酸内切酶消化的一些本领域已知的选项。所述分析包括例如：i)用适当的限制性核酸内切酶消化DNA；2)施加于例如Qiagen PCR清洁试剂盒，用蒸馏水洗脱；iii)加入10x变性溶液(10x＝0.5MNaOH、10mM EDTA)，加入10X染料，不进行缓冲，并与通过添加入10X变性溶液至4x而制备的DNA序列梯一起，在预先与1mM EDTA和200mM NaOH一起培育以确保凝胶和凝胶盒中的NaOH浓度均匀的0.8-1.0％凝胶上进行分析，并在1x变性溶液(50mM NaOH、1mM EDTA)存在下跑动凝胶。所属领域的普通技术人员将了解基于所得物的大小和期望的计时使用什么电压来跑动电泳。电泳后，将凝胶排出并在1x TBE或TAE中进行中和，并转移到蒸馏水或含1xSYBR金的1x TBE/TAE中。然后使用例如赛默飞世尔金核酸凝胶染色剂(DMSO中的10,000×浓缩液)和落射荧光(蓝色)或UV(312nm)使带可视化。前述基于凝胶的方法通过从凝胶色带中分离出ceDNA载体且允许其复性而能够根据纯化目的调整。
产生的ceDNA载体的纯度可以使用任何所属领域已知的方法来评估。作为一个示例性和非限制性方法，通过对ceDNA载体的荧光强度与标准进行比较，能够估计ceDNA-质粒对样品的总体UV吸光度的贡献。例如，若基于UV吸光度将4μg ceDNA载体装载于凝胶上并且ceDNA载体荧光强度等效于已知是1μg的2kb色带，则存在1μg ceDNA载体，且ceDNA载体是总UV吸收材料的25％。然后将凝胶上的带强度相对于带表示的计算输入作图，例如，如果总ceDNA载体为8kb，而切下的比较带为2kb，那么带强度将按总输入的25％绘制，在这种情况下，对于1.0μg输入，将为25μg。使用ceDNA载体质粒滴定来绘制标准曲线，然后使用回归线方程计算ceDNA载体色带的量，然后可以用于测定ceDNA载体所表示的总输入的百分比或纯度百分比。
实施例6：通过IV和流体动力学施用ceDNA来评估PAHenu2小鼠中苯丙氨酸水平的生 化校正的药理学研究
先前在国际申请PCT/US2020/022595(该申请全文以引用方式并入本文)中已证明，使用PAH缺陷的鼠模型PAHenu2小鼠，当通过流体动力学注射施用时，各自具有野生型左ITR和截短突变体右ITR并且具有编码人PAH的转基因区域的两种不同ceDNA载体表达能够全身性降低苯丙氨酸水平的活性PAH。此外，国际申请PCT/US2020/022595表明，施用包含连接到人PAH密码子优化型式2(“Codop2”)的VD启动子的ceDNA导致血清PHE水平降低，表明早在第3天就有足够的PAH活性来校正鼠PKU中的血液苯丙氨酸水平。
如上述实施例1和5所述制备和纯化ceDNA载体。
包含经密码子优化的人PAH型式2的ceDNA(ceDNA“hPAH Codop2”)的核酸序列在本文中示出为SEQ ID NO:192，并且包含以下元件：left-ITR_v1:spacer_left-ITR_v2.1:VD_Promoter Set(VD):PmeI_site:Modified_Minimum_Consensus_Kozak:hPAH_codop_ORF_v2:PacI_site:WPRE_3pUTR:bGH/spacer:spacer_right-ITR_v1:right-ITR_v1(ceDNA412)。
包含人PAH cDNA(无密码子优化的连接到hPAH cDNA的ceDNA VD启动子)的ceDNA的核酸序列在本文中示出为SEQ ID NO:193，并且包含以下元件：Left-ITR_v1:spacer_left-ITR_v1:VD_Promoter Set(VD):PmeI_site:Consensus_Kozak:hPAH_cDNA_ORF_v3:PacI_site:WPRE_3pUTR:bGH:spacer_right-ITR_v1:right-ITR_v1(ceDNA802)。
包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)以及特异性顺式调节元件的ceDNA的核酸序列在本文中示出为SEQ ID NO:213，并且包含以下元件：left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2、HS-CRM8_SERP_Enhancer_nospacer、HS-CRM8_SERP_Enhancer_nospacer、HS-CRM8_SERP_Enhancer_nospacer、BamHI_site、TTR-promoter-d5pUTR、MVM_intron、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH-r5-s29、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1(ceDNA1530)。
每个ceDNA PAH载体(单独的，没有任何LNP封装)和对照被施用于大约4-6周龄的混合性别、年龄匹配的PAHenu2小鼠。对于ceDNA412和ceDNA802，裸ceDNA载体以每只动物(每组5只动物)0.5μg或5μg的剂量给药，并且对于ceDNA1530，以每只动物(每组5只动物)0.5μg或1μg的剂量给药，方法是经由外侧尾静脉，通过流体动力静脉内注射，第0天的剂量体积为90-100ml/kg。第21天为终末时间点。
将核酸引入啮齿动物中的肝脏的熟知的方法是通过流体动力学尾静脉注射。在此系统中，大量未囊封核酸的加压注射导致细胞通透性的瞬时增加，并直接递送到组织和细胞中。这提供了绕过许多宿主免疫系统(诸如巨噬细胞递送)的实验机制，提供了在没有这种活性的情况下观察递送和表达的机会。
研究设计如下表15所示。
表15
No.＝编号；IV＝静脉内；WT＝野生型；MUT＝突变体。
供试品以浓缩原液的形式提供，并储存在约4℃，直到使用。制剂不涡旋或离心。各个组通过手术室中通风架上的接触垫料安置在透明的聚碳酸酯笼中。随意向动物提供用1NHCl酸化至目标pH值2.5-3.0的食物和过滤自来水。
分别在如下表16A和16B中的中间和终点时间点收集血液。
表16A.血液收集(中期)
a将全血收集到带有凝块活化剂的血清分离管中；MOV＝最大可获得体积
表16B.终末血液和组织收集
a将全血收集到带有凝块活化剂的血清分离管中；MOV＝最大可获得体积
研究详情如下：
物种(数量、性别、年龄)：40+2只备用PAHenu2突变(MUT)小鼠(混合性别，约5-10周龄，抵达时年龄匹配)；5只野生型(WT)；混合性别、同窝仔；年龄匹配。动物处于剂量起始约10-14周。
笼侧观察：每天进行笼侧观察。
化合物类别：重组DNA载体，ceDNA
体重：在第-3、0、1、2、4、7、14和21天(安乐死前)记录所有动物的体重(如适用)。根据需要记录额外的体重。
剂量配方：以浓缩原液形式提供的供试品。在使用前立即用PBS稀释原液。如果不立即进行给药，则准备好的材料在约4℃下(或在湿冰上)存储。
剂量施用：第1-7组的测试材料在第0天经由外侧尾静脉、通过流体动力学IV施用，以每只动物90-100ml/kg的设定体积(取决于组中最轻的动物)给药。第8组和第9组在第0天通过流体动力学IV施用给药，每只动物设定体积5ml/kg。
血液收集和尸检前禁食(对于血清和组织)：所有动物(所有组)在所有血液收集和尸检(第-3、4、7、14和21天)前禁食至少4小时。动物在第0天不禁食。
中期血液收集：仅第1、2、8和9组中的所有动物将在第0天收集中期血液；测试材料给药后6小时(±5％)。
第1-9组中的所有动物将在第-3、-4、0、1、2、4、3和7、14和21天收集血液。动物将具有用于禁食血清收集的全血。
安乐死和终末血液收集：在第21天，禁食至少4小时后，通过CO2窒息对动物实施安乐死，然后进行开胸手术和放血。
苯丙氨酸(PHE)水平：通过Pure Honey分析血清样品的PHE水平。
活性水平：通过Pure Honey分析两(2)个冷冻肝脏样品的活性水平。
结果
如图5A-图5C所示，包含已进行密码子优化的PAH核酸序列的ceDNA载体(ceDNA412；hPAH_codop_ORF_v2)在0.5μg和5μg流体动力学剂量下以比ceDNA802(hPAH天然cDNA序列)更高的速率将苯丙氨酸水平(“PHEμM”)校正至低于目标浓度，而ceDNA802不校正PHE浓度。示出21天内各个小鼠的结果。ceDNA1530是包含已进行密码子优化的PAH核酸序列(ceDNA1530；hPAH-r5-s29)和3xHS-CRM8_SERP_增强子、TTR-启动子-d5pUTR和MVM_内含子的ceDNA载体。如图5D和5E所示，ceDNA1530在0.5μg剂量下在校正PHE浓度方面没有那么有效，但在1μg剂量下达到目标PHE水平。
实施例7：通过自我调节突变体ceDNA1274的ceDNA测试的流体动力学施用评估 PAHenu2小鼠中苯丙氨酸水平的生化校正的药理学研究
如上述实施例1和5所述制备和纯化ceDNA载体。
包含经密码子优化的人PAH型式2的ceDNA(ceDNA“hPAH Codop2”)的核酸序列在本文中示出为SEQ ID NO:192，并且包含以下元件：left-ITR_v1:spacer_left-ITR_v2.1:VD_Promoter Set(VD):PmeI_site:Modified_Minimum_Consensus_Kozak:hPAH_codop_ORF_v2:PacI_site:WPRE_3pUTR:bGH/spacer:spacer_right-ITR_v1:right-ITR_v1(ceDNA412)。
包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH Codop2”)以及特异性顺式调节元件的ceDNA的核酸序列在本文中示出为SEQ ID NO:194，并且包含以下元件：left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、3xSerpEnh-TTRe-TTRm、MVM_intron、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1(ceDNA1132)。
包含具有29个氨基酸缺失的经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH Codop2”)以及特异性顺式调节元件的ceDNA的核酸序列在本文中示出为SEQ ID NO:195，并且包含以下元件：left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、VD_PromoterSet、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2_delta1-29aa、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1(ceDNA1274)。
包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)以及特异性顺式调节元件的ceDNA的核酸序列在本文中示出为SEQ ID NO:210，并且包含以下元件：left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、3xVanD_TTRe_PromoterSet_v2、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1(ceDNA1527)。
每个ceDNA PAH载体(单独的，没有任何LNP封装)和对照被施用于大约4-6周龄的混合性别、年龄匹配的PAHenu2小鼠。对于ceDNA412、ceDNA1132和ceDNA1527，裸ceDNA载体以每只动物(每组5只动物)0.5μg或5μg的剂量给药，并且对于ceDNA1527，以每只动物(每组5只动物)5μg的剂量给药，方法是经由外侧尾静脉，通过流体动力静脉内注射，第0天的剂量体积为90-100ml/kg。第28天为终末时间点。研究设计如下表17所示。
表17
No.＝编号；IV＝静脉内；ROA＝施用途径；WT＝野生型；MUT＝纯合突变体；min＝分钟；hr＝小时
供试品以浓缩原液的形式提供，并储存在约4℃，直到使用。制剂不涡旋或离心。各个组通过手术室中通风架上的接触垫料安置在透明的聚碳酸酯笼中。随意向动物提供小鼠饮食5058，并用1N HCl将过滤自来水酸化至目标pH 2.5-3.0。
分别在如下表18A和18B中的中期和终末时间点收集血液。
表18A.血液收集(中期)
a将全血收集到带有凝块活化剂的血清分离管中
表18B.终末血液和组织收集
a将全血收集到带有凝块活化剂的血清分离管中
MOV＝最大可获得体积
研究详情如下：
物种(数量、性别、年龄)：40+2只备用PAHenu2突变(MUT)小鼠(混合性别，约5-10周龄，抵达时年龄匹配)；5只野生型(WT)；混合性别、同窝仔；年龄匹配。动物处于剂量起始约10-14周。
笼侧观察：每天进行笼侧观察。
临床观察：在第0天测试材料给药后约1小时、约5-6小时和约24小时进行临床观察(如对于剩余组适用)。
化合物类别：重组DNA载体：ceDNA。
体重：在第-5、0、1、2、3、7、14、21和28天(安乐死前)记录所有动物的体重。可根据需要记录额外的体重。
剂量配方：供试品以浓缩原液形式提供。将原液温热至室温并在使用前即刻用提供的PBS稀释。如果不立即给药，则将制备好的材料储存在约4℃下。
剂量施用：第1-9组的测试材料在第0天经由外侧尾静脉、通过流体动力学IV施用，以每只动物90-100ml/kg的设定体积(取决于组中最轻的动物)给药。
血液收集前禁食：所有动物(所有组)在所有中期和终末血液收集(第-5、3、7、14、21和28天)前禁食至少4小时。
取出食物并更换床上用品。在每次中期血液收集结束时返回食物，禁食持续时间不超过8小时。
中期血液收集：第1-9组中的所有动物在第-5、3、7、14和21天收集中期血液。动物具有用于禁食血清收集的全血。收集后，动物在皮下接受0.5–1.0mL乳酸林格氏液。
血液收集：通过隐静脉收集用于血清的全血。将全血收集到带有凝块活化剂管的血清分离器中，并处理成每个设施SOP一(1)份血清。将所有样品在标称-70℃下储存，直到装运到干冰上。
计划外安乐死：从在预定时间点之前被安乐死的垂死动物收集终末组织。如果可能，从被发现死亡的动物身上收集和储存组织。
安乐死：在第28天，禁食至少4小时后，通过CO2窒息对动物实施安乐死，然后进行开胸手术和放血。
终末血液：将来自放血的全血收集到带有凝块活化剂管的血清分离器中，并处理成每个设施SOP两(2)份血清。将所有样品在标称-70℃下储存，直到装运到干冰上。
苯丙氨酸(PHE)水平：通过Pure Honey分析血清样品的PHE水平。
活性水平：通过Pure Honey分析两(2)个冷冻肝脏样品的活性水平。
结果
如图6的右图所示，当以5μg流体动力学给药时，在该研究中测试的所有构建体(ceDNA412、ceDNA1132、ceDNA1274和ceDNA1527)在研究的第7天将平均PHE水平(PHEμM)校正至低于目标浓度(小于350μM)。PHE水平在研究的大约第14天再次开始升高。图6A示出了野生型小鼠对照，其具有正常的PHE水平(低于目标浓度)，如所预期的那样，并且给予媒介物的PAHenu2小鼠具有高水平的PHE，同样如所预期的那样。尽管具有经密码子优化的人PAH型式2的ceDNA载体在0.5μg的剂量下校正PHE水平接近目标校正，但校正的水平从未达到低于目标。
先前在体内研究中检查了ceDNA1132，其中n＝2/3动物导致PHE校正(数据未示出)。因为ceDNA1132体外表达良好，所以再次对其进行体外测试以增加n。如图7D和7E所示，在5μg剂量下，ceDNA1132和ceDNA1274组中的所有5只动物在第7天显示出经校正的PHE水平(PHEμM)低于目标浓度(小于350μM)。在ceDNA412和ceDNA1527组中仅有1个无反应者。如图7A、7C和7F所示，在0.5μg的剂量下，在所测试的构建体之间在PHE校正方面没有可区分的差异；然而，认为如果排除单个无反应者，则ceDNA1527可能更有效。总之，数据表明，当以5μg流体动力学给药时，本研究中测试的所有构建体在至少第7天将平均PHE水平校正为低于目标浓度。在一些组中，当以5μg流体动力学给药时，在各个小鼠中维持低于目标水平的校正长达20天或更长时间。
实施例8：通过流体动力学施用ceDNA评估PAHenu2小鼠中苯丙氨酸水平的生化校正 的药理学研究-不同启动子对PHE校正的影响
如上述实施例1和5所述制备和纯化ceDNA载体。
包含经密码子优化的人PAH型式2的ceDNA(ceDNA“hPAH Codop2”)的核酸序列在本文中示出为SEQ ID NO:192，并且包含以下元件：left-ITR_v1:spacer_left-ITR_v2.1:VD_Promoter Set(VD):PmeI_site:Modified_Minimum_Consensus_Kozak:hPAH_codop_ORF_v2:PacI_site:WPRE_3pUTR:bGH/spacer:spacer_right-ITR_v1:right-ITR_v1(ceDNA412)。
包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)以及特异性顺式调节元件的ceDNA的核酸序列在本文中示出为SEQ ID NO:196，并且包含以下元件：left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、3xVanD_TTRe_PromoterSet、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH-r5-s29::hIVS1B、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1(ceDNA1414)。
包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)以及特异性顺式调节元件的ceDNA的核酸序列在本文中示出为SEQ ID NO:197，并且包含以下元件：left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、3xVanD_TTRe_PromoterSet、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH-r5-s29::hIVS1B_33bpFlanks、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1(ceDNA1416)。
包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)以及特异性顺式调节元件的ceDNA的核酸序列在本文中示出为SEQ ID NO:198，并且包含以下元件：left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、3xVanD_TTRe_PromoterSet、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH-r5-s29::mod-Intron_oIVS-v2_33bpFlanks、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1(ceDNA1428)
包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)以及特异性顺式调节元件的ceDNA的核酸序列在本文中示出为SEQ ID NO:211，并且包含以下元件：left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、CpGmin_hAAT_Promoter_Set、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1 1(ceDNA1528)。
每个ceDNA PAH载体(单独的，没有任何LNP封装)和对照被施用于大约4-6周龄的混合性别、年龄匹配的PAHenu2小鼠。裸ceDNA载体以每只动物(每组5只动物)0.5μg或5μg的剂量给药，方法是经由外侧尾静脉，通过流体动力静脉内注射，第0天的剂量体积为90-100ml/kg。第28天为终末时间点。研究设计如下表19所示。
表19
No.＝编号；IV＝静脉内；ROA＝施用途径；WT＝野生型；MUT＝纯合突变体；min＝分钟；hr＝小时
分别在如下表20A和20B中的中期和终末时间点收集血液。
表20A.血液收集(中期)
a将全血收集到带有凝块活化剂的血清分离管中
表20B.终末血液和组织收集
a将全血收集到带有凝块活化剂的血清分离管中；MOV＝最大可获得体积
研究详情如下：
物种(数量、性别、年龄)：55+2只备用PAHenu2突变(MUT)小鼠(混合性别，约5-10周龄，抵达时年龄匹配)；5只野生型(WT)；混合性别、同窝仔；年龄匹配。动物处于剂量起始约10-14周。
笼侧观察：每天进行笼侧观察。
临床观察：在第0天测试材料给药后约1小时、约5-6小时和约24小时进行临床观察(如对于剩余组适用)。
化合物类别：重组DNA载体，ceDNA。
体重：在第-5、0、1、2、3、7、14、21和29天(安乐死前)记录所有动物的体重。可根据需要记录额外的体重。
剂量配方：供试品以浓缩原液形式提供。将原液温热至室温并在使用前即刻用提供的PBS稀释。如果不立即给药，则将制备好的材料储存在约4℃下。
剂量施用：第1-12组的测试材料在第0天经由外侧尾静脉、通过流体动力学IV施用，以每只动物90-100ml/kg的设定体积(取决于组中最轻的动物)给药。
血液收集前禁食：所有动物(所有组)在所有中期和终末血液收集(第-5、3、7、14、21和29天)前禁食至少4小时。
取出食物并更换床上用品。在每次中期血液收集结束时返回食物，禁食持续时间不超过8小时。
中期血液收集：第1-12组中的所有动物将在第-5、3、7、14和21天收集中期血液。动物将具有用于禁食血清收集的全血。收集后，动物将在皮下接受0.5–1.0mL乳酸林格氏液
血液收集：通过隐静脉收集用于血清的全血。将全血收集到带有凝块活化剂管的血清分离器中，并处理成每个设施SOP一(1)份血清。将所有样品在标称-70℃下储存，直到装运到干冰上。
计划外安乐死：从在预定时间点之前被安乐死的垂死动物收集终末组织。如果可能，从被发现死亡的动物身上收集和储存组织。
安乐死：在第29天，禁食至少4小时后，通过CO2窒息对动物实施安乐死，然后进行开胸手术和放血。
终末血液：将来自放血的全血收集到带有凝块活化剂管的血清分离器中，并处理成每个设施SOP两(2)份血清。将所有样品在标称-70℃下储存，直到装运到干冰上。
苯丙氨酸(PHE)水平：通过Pure Honey分析血清样品的PHE水平。
活性水平：通过Pure Honey分析两(2)个冷冻肝脏样品的活性水平。
结果
本研究测试了与不同启动子或顺式调节元件组合相结合的两种经密码子优化的人PAH序列(经密码子优化的人PAH型式2和经密码子优化的人PAH型式2r5-s29)。具体地说，测试了下列构建体，每种构建体具有启动子、经密码子优化的序列、CpG含量(例如，CpGmin)、内含子等的不同组合。
表21.
如图8A-图8B、图9A-图9E和图10A-图10E、图11A-图11B、图12A-图12E、图13A-图13E和图14A-图14E所示，在5μg剂量下，ceDNA1416、ceDNA1428和ceDNA1528组而不是ceDNA1414组在7天内在5/5小鼠中显示PHE水平(PHEμM)急性校正至低于目标浓度(小于350μM)。如图8A-图8B和图9A-图9E所示，0.5μg剂量下的数据表明ceDNA1416和ceDNA1528可能比ceDNA412更有效(7天后，与ceDNA412的2/5小鼠相比，4/5小鼠显示PHE水平(PHEμM)校正至低于目标浓度(小于350μM))。基于该数据，可以得出结论，CpGmin_hAAT_Promoter_Set可以显示出优于标准VD启动子的改进。3xVanD_TTRe也是强启动子，但需要进一步实验以与该数据组中的VanD(VD)启动子进行比较。
如图11A-图11B、图12A-图12E和图13A-图13E所示，在研究的整个28天持续时间内，ceDNA412组(5μg剂量)中的所有小鼠(5/5)显示出PHE水平(PHEμM)校正至低于目标浓度(小于350μM)。此结果先前未见过，表明基因表达和功效的令人惊讶的持久性。所测试的其他经密码子优化的构建体在第14天之后显示出预期的Phe增加(在5μg剂量下)。
最后，进行了进一步的研究，测试经密码子优化的人PAH序列与不同启动子或顺式调节元件组合的组合。具体地说，测试了下列构建体，每种构建体具有启动子、经密码子优化的序列、CpG含量(例如，CpGmin)、内含子等的不同组合。
表22
对所有小鼠流体动力学施用5μg剂量。令人惊讶地，如图14A-图14I所示，顺式调节元件与经密码子优化的序列的特定组合显示出PHE水平(PHEμM)校正至低于目标浓度(小于350μM)。具体地说，具有启动子组合3xHNF1-4||前白蛋白增强子||TTR启动子的ceDNA1471在5μg剂量下将PHE浓度降低至低于目标值，在该研究中显示出比ceDNA412(VD_PromoterSet||hPAH_codop_ORF_v2)更高的效力。
实施例9：通过流体动力学施用ceDNA评估PAHenu2小鼠中苯丙氨酸水平的生化校正 的药理学研究-不同启动子或启动子组和不同ORF对PHE校正的影响
ceDNA构建体
本研究测试了具有不同启动子或启动子组(即，hAAT启动子和VD启动子组)和经密码子优化的PAH序列或ORF(即，具有或不具有CpG最小化的人PAH cDNA和人PAH型式2)的ceDNA载体。如上述实施例1和5所述制备和纯化ceDNA载体。
包含经密码子优化的人PAH型式2的ceDNA(ceDNA“hPAH Codop2”)的核酸序列在本文中示出为SEQ ID NO:192，并且包含以下元件：left-ITR_v1:spacer_left-ITR_v2.1:VD_Promoter Set:PmeI_site:Modified_Minimum_Consensus_Kozak:hPAH_codop_ORF_v2:PacI_site:WPRE_3pUTR:bGH/spacer:spacer_right-ITR_v1:right-ITR_v1(ceDNA412)。ceDNA412在实施例9所述的本研究中用作对照。
包含经密码子优化的人PAH型式2ORF(hPAH_codop_ORF_v2)、具有特异性嵌合内含子(mIVS-intron1B)和内含子侧接区(33bpFlanks)的ceDNA的核酸序列在本文中示出为SEQID NO:546，并且包含与前白蛋白增强子组合的hAAT启动子和6个拷贝的肝核因子1和4结合位点(3xHNF1-4)(ceDNA1476)。
包含经密码子优化的人PAH型式2ORF(hPAH_codop_ORF_v2)、具有特异性嵌合内含子(mIVS-intron1B)和内含子侧接区(33bpFlanks)的ceDNA的核酸序列在本文中示出为SEQID NO:549，并且包含与前白蛋白增强子组合的hAAT启动子和5个拷贝的肝核因子1结合位点HNF1(5xHNF1)(ceDNA1479)。
包含经密码子优化的人PAH CpG最小化cDNA型式1ORF的ceDNA(hPAH-cDNA_0CpG1_ORF)的核酸序列在本文中示出为SEQ ID NO:562，并且包含VD_Promoter Set(ceDNA1939)。
包含经密码子优化的人PAH CpG最小化cDNA型式2ORF的ceDNA(hPAH-cDNA_0CpG2_ORF)的核酸序列在本文中示出为SEQ ID NO:563，并且包含VD_Promoter Set(ceDNA1940)。
包含经密码子优化的人PAH CpG最小化cDNA型式3ORF的ceDNA(hPAH-cDNA_0CpG3_ORF)的核酸序列在本文中示出为SEQ ID NO:564，并且包含VD_Promoter Set(ceDNA1941)。
包含经密码子优化的人PAH CpG最小化cDNA型式4ORF的ceDNA(hPAH-cDNA_0CpG4_ORF)的核酸序列在本文中示出为SEQ ID NO:565，并且包含VD_Promoter Set(ceDNA1942)。
包含没有CpG最小化的经密码子优化的人PAH cDNA型式1ORF的ceDNA(hPAH-cDNA_1_ORF)的核酸序列在本文中示出为SEQ ID NO:566，并且包含VD_Promoter Set(ceDNA1943)。
包含没有CpG最小化(CpG＝99)的经密码子优化的人PAH cDNA型式2ORF的ceDNA(hPAH-cDNA_2_ORF)的核酸序列在本文中示出为SEQ ID NO:567，并且包含VD_PromoterSet(ceDNA1944)。
本研究中使用的和如上所述的ceDNA载体的特征汇总于下表23中。
表23.实施例9研究中的ceDNA载体的构建体特征
研究设计
每个ceDNA PAH载体(单独的，没有任何LNP封装)和对照被施用于大约4-6周龄的混合性别、年龄匹配的PAHenu2小鼠。裸ceDNA载体以每只动物(每组5只动物)0.5μg的剂量给药，方法是经由外侧尾静脉，通过流体动力静脉内注射，第0天的剂量体积为90-100ml/kg。第28天为终末时间点。研究设计如下表24所示。
表24.实施例9研究中的测试材料施用
No.＝编号；IV＝静脉内；ROA＝施用途径；WT＝野生型；MUT＝纯合突变体；min＝分钟；hr＝小时
分别在如下表25A和25B中的中期和终末时间点收集血液。
表25A.血液收集(中期)实施例9研究
a将全血收集到带有凝块活化剂的血清分离管中
表25B.终末血液和组织收集
a将全血收集到带有凝块活化剂的血清分离管中；MOV＝最大可获得体积
研究细节
物种(数量、性别、年龄)：55+4只备用PAHenu2突变(MUT)小鼠(混合性别，约6-8周龄，抵达时年龄匹配)；5只野生型(WT)；混合性别、同窝仔；年龄匹配。动物处于剂量起始约7-9周。
笼侧观察：每天进行笼侧观察。
临床观察：在第0天测试材料给药后约1小时、约5-6小时和约24小时进行临床观察(如对于剩余组适用)。
化合物类别：重组DNA载体，ceDNA。
体重：在第-4、0、1、2、3、7、14、21和28天(安乐死前)记录所有动物的体重。
剂量配方：供试品以浓缩原液形式提供。将原液温热至室温并在使用前即刻用提供的PBS稀释。如果不立即给药，则将制备好的材料储存在约4℃下。
剂量施用：第1-12组的测试材料在第0天经由外侧尾静脉、通过流体动力学IV施用，以每只动物90-100ml/kg的设定体积(取决于组中最轻的动物)给药。
血液收集前禁食：所有动物(所有组)在所有中期和终末血液收集(第-4、3、7、14、21和28天)前禁食至少4小时。
取出食物并更换床上用品。在每次中期血液收集结束时返回食物，禁食持续时间不超过8小时。
中期血液收集：第1-11组中的所有动物在第-4、3、7、14和21天收集中期血液。动物具有用于禁食血清收集的全血。收集后，动物将在皮下接受0.5–1.0mL乳酸林格氏液
血液收集：通过隐静脉收集用于血清的全血。将全血收集到带有凝块活化剂管的血清分离器中，并处理成每个设施SOP一(1)份血清。将所有样品在标称-70℃下储存，直到装运到干冰上。
计划外安乐死：从在预定时间点之前被安乐死的垂死动物收集终末组织。如果可能，从被发现死亡的动物身上收集和储存组织。
安乐死：在第28天，禁食至少4小时后，通过CO2窒息对动物实施安乐死，然后进行开胸手术和放血。
终末血液：将来自放血的全血收集到带有凝块活化剂管的血清分离器中，并处理成每个设施SOP两(2)份血清。将所有样品在标称-70℃下储存，直到装运到干冰上。
苯丙氨酸(PHE)水平：通过Pure Honey分析血清样品的PHE水平。
活性水平：通过Pure Honey分析两(2)个冷冻肝脏样品的活性水平。
结果
本研究测试了与不同启动子或顺式调节元件组合相结合的两种经密码子优化的人PAH序列(经密码子优化的人PAH型式2和经密码子优化的人PAH cDNA，有或没有CpG最小化)。包含在每个测试的ceDNA构建体中的特定元件汇总于表23中。
如图15A-图15I所示，在0.5μg量下，在本研究中测试的所有ceDNA载体即ceDNA1476、ceDNA1939和ceDNA1941但不是其余的ceDNA载体在7天内在总共5只小鼠中的至少一只中显示出PHE水平(PHEμM)急性校正至低于目标浓度(小于350μM)。值得注意的是，在总共5只小鼠中的4只中，ceDNA1476和ceDNA1939各自表现出PHE水平的急性校正至低于目标浓度。ceDNA1479、ceDNA1940和ceDNA1942各自具有与处于350μM阈值但不低于该阈值的单个小鼠相关的单个时间点；而ceDNA1479、ceDNA1942、ceDNA1943和ceDNA1944没有接近350μM阈值的时间点。
ceDNA1476和ceDNA1479之间唯一的结构差异是后者含有5个拷贝的HNF1结合位点(在每两个拷贝的HNF1之间具有10聚体间隔区)，而ceDNA1476仅含有6个拷贝的HNF1和HNF4的组合，其中HNF1和HNF4彼此交替。本发明人发现HNF1和HNF4的组合导致改善的PHE水平校正(将图15C与图15B进行比较)。
ceDNA1943、ceDNA1944和ceDNA1939、ceDNA1940、ceDNA1941和ceDNA1942之间的差异是ceDNA1943的开放阅读框，并且ceDNA1944未进行CpG最小化。与ceDNA1943和ceDNA1944(图15H和15I)相比，ceDNA1939、ceDNA1940、ceDNA1941和ceDNA1942中改善的PHE水平校正(图15D-15G)说明了CpG最小化对PAH表达以及因此对PHE水平校正的重要性。
类似于实施例8中对ceDNA1471的观察，此处在实施例9中，注意到具有启动子组合3xHNF1-4||前白蛋白增强子||TTR启动子的ceDNA1476在0.5μg剂量下将PHE浓度降低至低于目标值，在该研究中显示出比对照ceDNA412(1x VD_PromoterSet||hPAH_codop_ORF_v2)更高的效力。
实施例10：通过流体动力学施用ceDNA评估PAHenu2小鼠中苯丙氨酸水平的生化校 正的药理学研究-不同启动子或启动子和来自小鼠或人的PAH对PHE校正的影响
ceDNA构建体
本研究测试了具有不同启动子或启动子组(即，hAAT启动子和VD启动子组)和来自小鼠或人的经密码子优化的PAH序列或ORF(即，mousePAH_codop_ORF_v2或hPAH_codop_ORF_v2)的ceDNA载体。如上述实施例1和5所述制备和纯化ceDNA载体。
包含经密码子优化的人PAH型式2的ceDNA(ceDNA“hPAH Codop2”)的核酸序列在本文中示出为SEQ ID NO:192，并且包含以下元件：left-ITR_v1:spacer_left-ITR_v2.1:VD_Promoter Set:PmeI_site:Modified_Minimum_Consensus_Kozak:hPAH_codop_ORF_v2:PacI_site:WPRE_3pUTR:bGH/spacer:spacer_right-ITR_v1:right-ITR_v1(ceDNA412)。ceDNA412在实施例10所述的本研究中用作对照。
包含经密码子优化的人PAH CpG最小化cDNA型式1ORF(hPAH-cDNA_0CpG1_ORF)的ceDNA的核酸序列在本文中示出为SEQ ID NO:562，并且包含VD_Promoter Set(ceDNA1939)。先前在实施例9中研究的ceDNA1939也在实施例10所述的本研究中用作对照。
包含经密码子优化的小鼠PAH型式2ORF(mousePAH_codop_ORF_v2)的ceDNA的核酸序列在本文中示出为SEQ ID NO:568，并且包含VD_Promoter Set(ceDNA1955)。
包含经密码子优化的人PAH型式2ORF(hPAH_codop_ORF_v2)的ceDNA的核酸序列在本文中示出为SEQ ID NO:569，并且包含具有存在于ceDNA1476和ceDNA1479(ceDNA62)中的增强子的人AAT启动子。
本研究中使用的和如上所述的ceDNA载体的特征汇总于下表26中。
表26.实施例10研究中的ceDNA载体的构建体特征
ceDNA 构建体特征
ceDNA412 VD_PromoterSet||hPAH_codop_ORF_v2
ceDNA1939 VD_PromoterSet||hPAH-cDNA_0CpG1_ORF
ceDNA1955 VD_PromoterSet||mousePAH_codop_ORF_v2
ceDNA62 hAAT||mousePAH_codop_ORF_v2
研究设计
每个ceDNA PAH载体(单独的，没有任何LNP封装)和对照被施用于大约7-9周龄的混合性别、年龄匹配的PAHenu2小鼠。裸ceDNA载体以每只动物(每组5只动物)0.5μg的剂量给药，方法是经由外侧尾静脉，通过流体动力静脉内注射，第0天的剂量体积为90-100ml/kg。第28天为终末时间点。研究设计如下表27所示。
表27.实施例10研究中的测试材料施用
No.＝编号；IV＝静脉内；ROA＝施用途径；WT＝野生型；MUT＝纯合突变体；min＝分钟；hr＝小时
分别在如下表28A和28B中的中期和终末时间点收集血液。
表28A.血液收集(中期)实施例10研究
a将全血收集到带有凝块活化剂的血清分离管中
表28B.终末血液和组织收集
a将全血收集到带有凝块活化剂的血清分离管中；MOV＝最大可获得体积
研究细节
物种(数量、性别、年龄)：30+3只备用PAHenu2突变(MUT)小鼠(混合性别，约6-8周龄，抵达时年龄匹配)；5只野生型(WT)；混合性别、同窝仔；年龄匹配。动物处于剂量起始约7-9周。
笼侧观察：每天进行笼侧观察。
临床观察：在第0天测试材料给药后约1小时、约5-6小时和约24小时进行临床观察(如对于剩余组适用)。
化合物类别：重组DNA载体，ceDNA。
体重：在第-1、0、1、2、3、7、14、21和28天(安乐死前)记录所有动物的体重。
剂量配方：供试品以浓缩原液形式提供。将原液温热至室温并在使用前即刻用提供的PBS稀释。如果不立即给药，则将制备好的材料储存在约4℃下。
剂量施用：第1-5组的测试材料在第0天经由外侧尾静脉、通过流体动力学IV施用，以每只动物90-100ml/kg的设定体积(取决于组中最轻的动物)给药。
血液收集前禁食：所有动物(所有组)在所有中期和终末血液收集(第-4、3、7、14、21和28天)前禁食至少4小时。
取出食物并更换床上用品。在每次中期血液收集结束时返回食物，禁食持续时间不超过8小时。
中期血液收集：第1-6组中的所有动物在第-1、3、7、14和21天收集中期血液。动物具有用于禁食血清收集的全血。收集后，动物将在皮下接受0.5–1.0mL乳酸林格氏液
血液收集：通过隐静脉收集用于血清的全血。将全血收集到带有凝块活化剂管的血清分离器中，并处理成每个设施SOP一(1)份血清。将所有样品在标称-70℃下储存，直到装运到干冰上。
计划外安乐死：从在预定时间点之前被安乐死的垂死动物收集终末组织。如果可能，从被发现死亡的动物身上收集和储存组织。
安乐死：在第28天，禁食至少4小时后，通过CO2窒息对动物实施安乐死，然后进行开胸手术和放血。
终末血液：将来自放血的全血收集到带有凝块活化剂管的血清分离器中，并处理成每个设施SOP两(2)份血清。将所有样品在标称-70℃下储存，直到装运到干冰上。
苯丙氨酸(PHE)水平：通过Pure Honey分析血清样品的PHE水平。
活性水平：通过Pure Honey分析两(2)个冷冻肝脏样品的活性水平。
结果
本研究测试了两个经密码子优化的PAH序列(即，小鼠或人经密码子优化的PAH型式2)与不同启动子(即，VD启动子组或人AAT启动子)的组合。包含在每个测试的ceDNA构建体中的特定元件汇总于表26中。
如图16A-图16D所示，在0.5μg剂量下，并且如至少实施例9中所证明，均表达经密码子优化的人PAH ORF型式2的ceDNA412和ceDNA1939在7天内在总共5只小鼠中的至少一只中显示出PHE水平(PHEμM)急性校正至低于目标浓度(小于350μM)。如在实施例9中所观察到的那样，ceDNA1939在7天内在总共5只小鼠中的4只中再次表现出急性PHE校正。
令人惊讶地，均表达经密码子优化的小鼠PAH ORF型式2的ceDNA1955和ceDNA62在小鼠中未导致优于ceDNA412和ceDNA1939的PHE校正。最多可以说ceDNA1955导致与ceDNA1939校正相当或略差的PHE校正。ceDNA62完全未显示出任何PHE校正。ceDNA62具有hAAT启动子，但没有像ceDNA1476和ceDNA1479那样的增强子(如实施例8中所研究)，也没有像ceDNA1528那样的CpG最小化(如实施例7中所研究)。在ceDNA62中缺乏PHE校正说明了增强子和CpG最小化在改善hAAT启动子中的重要性。
实施例11：通过流体动力学施用ceDNA评估PAHenu2小鼠中苯丙氨酸水平的生化校正的药理学研究-不同启动子及其顺式调节元件、内含子和UTR对PHE校正的影响
ceDNA构建体
本研究测试了具有不同启动子组(即、hAAT启动子组和TTR启动子组)和它们各自的顺式调节元件、转录后调节元件、内含子和UTR以及经密码子优化的人PAH序列或ORF(即，hPAH-r5-s29、hPAH-r5-s29::hIVS1B_33bpFlanks或hPAH-r5-s29::mod-Intron_oIVS-v2_33bpFlanks)的ceDNA载体。如上述实施例1和5所述制备和纯化ceDNA载体。
包含经密码子优化的人PAH型式2的ceDNA(ceDNA“hPAH Codop2”)的核酸序列在本文中示出为SEQ ID NO:192，并且包含以下元件：left-ITR_v1:spacer_left-ITR_v2.1:VD_Promoter Set(VD):PmeI_site:Modified_Minimum_Consensus_Kozak:hPAH_codop_ORF_v2:PacI_site:WPRE_3pUTR:bGH/spacer:spacer_right-ITR_v1:right-ITR_v1(ceDNA412)。ceDNA412在实施例11所述的本研究中用作对照。
包含具有内含子和内含子侧接区的经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(hPAH-r5-s29::oIVS1B_33bpFlanks)的ceDNA的核酸序列在本文中示出为SEQ ID NO:570，并且包含TTR启动子和其他增强子(即，启动子组1471)、内含子、UTR、限制性核酸内切酶位点、顺式和转录后调节元件(ceDNA2409)。
包含具有内含子和内含子侧接区的经密码子优化的人PAH型式2r5-s29的ceDNA的核酸序列(hPAH-r5-s29::mod-Intron_oIVS-v2_33bpFlanks)在本文中示出为SEQ ID NO:571，并且包含TTR启动子和与ceDNA2409中相同的增强子(即，启动子组1471)、内含子、UTR、限制性核酸内切酶位点、顺式和转录后调节元件(ceDNA2410)。
包含具有内含子和内含子侧接区的经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(hPAH-r5-s29::oIVS1B_33bpFlanks)的ceDNA的核酸序列在本文中示出为SEQ ID NO:572，并且包含hAAT启动子和其他增强子(即，启动子组1476)、内含子、UTR、限制性核酸内切酶位点、顺式和转录后调节元件(ceDNA2415)。
包含具有内含子和内含子侧接区的经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(hPAH-r5-s29::oIVS1B_33bpFlanks)的ceDNA的核酸序列在本文中示出为SEQ ID NO:573，并且包含hAAT启动子和其他增强子(即，启动子组1479)、内含子、UTR、限制性核酸内切酶位点、顺式和转录后调节元件(ceDNA2418)。ceDNA2418在HNF结合位点的拷贝数和类型方面不同于ceDNA2415。
包含具有内含子和内含子侧接区的经密码子优化的人PAH型式2r5-s29的ceDNA的核酸序列(hPAH-r5-s29::mod-Intron_oIVS-v2_33bpFlanks)在本文中示出为SEQ ID NO:574，并且包含hAAT启动子和与ceDNA2415中相同的增强子(即，启动子组1476)、内含子、UTR、限制性核酸内切酶位点、顺式和转录后调节元件(ceDNA2416)。
包含具有内含子和内含子侧接区的经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(hPAH-r5-s29::mod-Intron_oIVS-v2_33bpFlanks)的ceDNA的核酸序列在本文中示出为SEQ ID NO:575，并且包含hAAT启动子和与ceDNA2418中相同的增强子(启动子组1479)、内含子、UTR、限制性核酸内切酶位点、顺式和转录后调节元件(ceDNA2419)。ceDNA2419在HNF结合位点的拷贝数和类型方面不同于ceDNA2416。
包含不具有内含子和内含子侧接区的经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(hPAH-r5-s29)的ceDNA的核酸序列在本文中示出为SEQ ID NO:576，并且包含TTR启动子和与ceDNA2409中相同的增强子(即，启动子组1471)、内含子、UTR、限制性核酸内切酶位点、顺式和转录后调节元件(ceDNA2420)。
本研究中使用的和如上所述的ceDNA载体的特征汇总于下表29中。
表29.实施例11研究中的ceDNA载体的构建体特征
研究设计
每个ceDNA PAH载体(单独的，没有任何LNP封装)和对照被施用于大约6-11周龄的混合性别、年龄匹配的PAHenu2小鼠。裸ceDNA载体以每只动物(每组5只动物)0.1μg(仅选择的动物)或0.5μg的剂量给药，方法是经由外侧尾静脉，通过流体动力静脉内注射，第0天的剂量体积为90-100ml/kg。第28天为终末时间点。研究设计如下表30所示。
表30.实施例11研究中的测试材料施用
No.＝编号；IV＝静脉内；ROA＝施用途径；WT＝野生型；MUT＝纯合突变体；min＝分钟；hr＝小时
分别在如下表31A和31B中的中期和终末时间点收集血液。
表31A.血液收集(中期)实施例11研究
a将全血收集到带有凝块活化剂的血清分离管中
表31B.终末血液和组织收集
a将全血收集到带有凝块活化剂的血清分离管中；MOV＝最大可获得体积
研究细节
物种(数量、性别、年龄)：70+3只备用PAHenu2突变(MUT)小鼠(混合性别，约6-8周龄，抵达时年龄匹配)；5只野生型(WT)；混合性别、同窝仔；年龄匹配。动物处于剂量起始约6-11周。
笼侧观察：每天进行笼侧观察。
临床观察：在第0天测试材料给药后约1小时、约5-6小时和约24小时进行临床观察(如对于剩余组适用)。
化合物类别：重组DNA载体，ceDNA。
体重：在第-6、0、1、2、3、7、14、21和28天(安乐死前)记录所有动物的体重。
剂量配方：供试品以浓缩原液形式提供。将原液温热至室温并在使用前即刻用提供的PBS稀释。如果不立即给药，则将制备好的材料储存在约4℃下。
剂量施用：第1-14组的测试材料在第0天经由外侧尾静脉、通过流体动力学IV施用，以每只动物90-100ml/kg的设定体积(取决于组中最轻的动物)给药。
血液收集前禁食：所有动物(所有组)在所有中期和终末血液收集(第-6、3、7、14、21和28天)前禁食至少4小时。
取出食物并更换床上用品。在每次中期血液收集结束时返回食物，禁食持续时间不超过8小时。
中期血液收集：第1-10组中的所有动物在第-6、3、7、14和21天收集中期血液。动物具有用于禁食血清收集的全血。收集后，动物将在皮下接受0.5–1.0mL乳酸林格氏液
血液收集：通过隐静脉收集用于血清的全血。将全血收集到带有凝块活化剂管的血清分离器中，并处理成每个设施SOP一(1)份血清。将所有样品在标称-70℃下储存，直到装运到干冰上。
计划外安乐死：从在预定时间点之前被安乐死的垂死动物收集终末组织。如果可能，从被发现死亡的动物身上收集和储存组织。
安乐死：在第28天，禁食至少4小时后，通过CO2窒息对动物实施安乐死，然后进行开胸手术和放血。
终末血液：将来自放血的全血收集到带有凝块活化剂管的血清分离器中，并处理成每个设施SOP两(2)份血清。将所有样品在标称-70℃下储存，直到装运到干冰上。
苯丙氨酸(PHE)水平：通过Pure Honey分析血清样品的PHE水平。
活性水平：通过Pure Honey分析两(2)个冷冻肝脏样品的活性水平。
结果
本研究测试了两个经密码子优化的PAH序列(即，小鼠或人经密码子优化的PAH型式2)与不同启动子(即，VD启动子组或人AAT启动子)的组合。包含在每个测试的ceDNA构建体中的特定元件汇总于表26中。
图17A-图17I示出了本研究的结果。如图17A所示，在0.5μg剂量下，ceDNA412在7天内在总共5只小鼠中的全部5只中显示出PHE水平(PHEμM)急性校正至低于目标浓度(小于350μM)。值得注意的是，在一只小鼠中，PHE校正一直维持到第28天。相比之下，在实施例8和9中，对于ceDNA412，在总共5只小鼠中的4只中观察到PHE校正。
ceDNA2409、ceDNA2410、ceDNA2415、ceDNA2418、ceDNA2416和ceDNA2420各自在7天内在总共5只小鼠中的至少1只中显示出PHE水平(PHEμM)急性校正至低于目标浓度(小于350μM)。值得注意的是，ceDNA2409、ceDNA2410和ceDNA2415各自在7天内在总共5只小鼠中的4只中显示出PHE水平(PHEμM)急性校正至低于目标浓度(小于350μM)，并且在3天内在总共5只小鼠中的至少1只中显示出PHE水平急性校正至低于目标浓度。值得注意的是，在施用ceDNA2415的一只小鼠中，PHE校正一直维持到第28天。换句话说，本研究显示至少表达hPAH-r5-s29::mod-Intron_oIVS-v2_33bpFlanks ORF、TTR启动子以及增强子、内含子、UTR、限制性核酸内切酶位点、顺式和转录后调节元件的ceDNA2415，如果不优于具有VD启动子组和经密码子优化的人PAH型式2ORF的ceDNA412，则是等效的。当如图18A-图18E所示以0.1μg的较低剂量重复研究时，显著地，ceDNA2415在14天内在总共5只小鼠中的2只中以及在7天内在总共5只小鼠中的1只中显示出PHE水平(PHEμM)急性校正至低于目标浓度(小于350μM)。
当HNF结合位点的数目和类型变化，但包括启动子本身在内的所有其他结构元件保持相同时，如在ceDNA2418(5xHNF1)对比ceDNA2415(3xHNF1-4)以及ceDNA2419(5xHNF1)对比ceDNA2416(3xHNF1-4)中，PHE水平校正似乎受损。当以0.1μg的ceDNA2418(图18D)对比0.1μg ceDNA2415(图18C)为小鼠给药时，注意到类似的观察结果。实施例11中的这些观察结果与实施例8中对ceDNA1476和ceDNA1479的观察结果一致。
与ceDNA2409、ceDNA2410、ceDNA2415和ceDNA2416相比，ceDNA2420 PHE校正水平较差，其中3只小鼠在任何时间点均未达到目标值。与ceDNA2409、ceDNA2410、ceDNA2415和ceDNA2416相比，ceDNA2420表达hPAH-r5-s29 ORF，但没有任何内含子和内含子侧接区。该观察结果突出了内含子和内含子侧接区在改善hPAH-r5-s29 ORF中的重要性。
实施例12：通过流体动力学施用ceDNA评估PAHenu2小鼠中苯丙氨酸水平的生化校正的药理学研究-不同启动子和ceDNA产生方法对PHE校正的影响
ceDNA构建体
本研究测试了具有不同启动子组和它们各自的顺式调节元件、转录后调节元件、内含子和UTR以及经密码子优化的人PAH序列或ORF的ceDNA载体。除了用作对照的ceDNA412外，本研究中的ceDNA载体按照上述国际专利申请PCT/US2019/14122中所述进行制备和纯化。
包含经密码子优化的人PAH型式2的ceDNA(ceDNA“hPAH Codop2”)的核酸序列在本文中示出为SEQ ID NO:192，并且包含以下元件：left-ITR_v1:spacer_left-ITR_v2.1:VD_Promoter Set(VD):PmeI_site:Modified_Minimum_Consensus_Kozak:hPAH_codop_ORF_v2:PacI_site:WPRE_3pUTR:bGH/spacer:spacer_right-ITR_v1:right-ITR_v1(ceDNA412)。ceDNA412在实施例12所述的本研究中用作对照。
包含经密码子优化的人PAH型式2(hPAH_codop_ORF_v2)的ceDNA的核酸序列在本文中示出为SEQ ID NO:577，并且包含VD启动子组、内含子、UTR、限制性核酸内切酶位点、顺式和转录后调节元件(ceDNA34)。
包含具有内含子和内含子侧接区的经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(hPAH-r5-s29::mod-Intron_oIVS-v2_33bpFlanks)的ceDNA的核酸序列在本文中示出为SEQ ID NO:581，并且包含hAAT启动子和其他增强子(即，启动子组1476)、内含子、UTR、限制性核酸内切酶位点、顺式和转录后调节元件(ceDNA41)。
包含经密码子优化的人PAH型式2(hPAH_codop_ORF_v2)的ceDNA的核酸序列在本文中示出为SEQ ID NO:579，并且包含TTR启动子和其他增强子(即，HS-CRM8_FOXA_HNF4_consensus_v1)、内含子、UTR、限制性核酸内切酶位点、顺式和转录后调节元件(ceDNA36)。
包含具有内含子和内含子侧接区的经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(hPAH-r5-s29::oIVS1B_33bpFlanks)的ceDNA的核酸序列在本文中示出为SEQ ID NO:583，并且包含TTR启动子和其他增强子(即，HS-CRM8_FOXA_HNF4_consensus_v1)、内含子、UTR、限制性核酸内切酶位点、顺式和转录后调节元件(ceDNA43)。
包含具有内含子和内含子侧接区的经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(hPAH-r5-s29::oIVS1B_33bpFlanks)的ceDNA的核酸序列在本文中示出为SEQ ID NO:582，并且包含TTR启动子和其他增强子(即，3x_HNF_FOXA_v1)、内含子、UTR、限制性核酸内切酶位点、顺式和转录后调节元件(ceDNA42)。
本研究中使用的和如上所述的ceDNA载体的特征汇总于下表32中。
表32.实施例12研究中的ceDNA载体的构建体特征
研究设计
每个ceDNA PAH载体(单独的，没有任何LNP封装)和对照被施用于大约7-10周龄的混合性别、年龄匹配的PAHenu2小鼠。裸ceDNA载体以每只动物(每组5只动物)0.1μg(仅选择的动物)或0.5μg的剂量给药，方法是经由外侧尾静脉，通过流体动力静脉内注射，第0天的剂量体积为90-100ml/kg。第28天为终末时间点。研究设计如下表33所示。
表33.实施例12研究中的测试材料施用
No.＝编号；IV＝静脉内；ROA＝施用途径；WT＝野生型；MUT＝纯合突变体；min＝分钟；hr＝小时
分别在如下表34A和34B中的中期和终末时间点收集血液。
表34A.血液收集(中期)实施例12研究
a将全血收集到带有凝块活化剂的血清分离管中
表34B.终末血液和组织收集
a将全血收集到带有凝块活化剂的血清分离管中；MOV＝最大可获得体积
研究细节
物种(数量、性别、年龄)：60+5只备用PAHenu2突变(MUT)小鼠(混合性别，约6-8周龄，抵达时年龄匹配)；5只野生型(WT)；混合性别、同窝仔；年龄匹配。动物处于剂量起始约7-10周。
笼侧观察：每天进行笼侧观察。
临床观察：在第0天测试材料给药后约1小时、约5-6小时和约24小时进行临床观察(如对于剩余组适用)。
化合物类别：重组DNA载体，ceDNA。
体重：在第-4、0、1、2、3、7、14、21和28天(安乐死前)记录所有动物的体重。
剂量配方：供试品以浓缩原液形式提供。将原液温热至室温并在使用前即刻用提供的PBS稀释。如果不立即给药，则将制备好的材料储存在约4℃下。
剂量施用：第1-12组的测试材料在第0天经由外侧尾静脉、通过流体动力学IV施用，以每只动物90-100ml/kg的设定体积(取决于组中最轻的动物)给药。
血液收集前禁食：所有动物(所有组)在所有中期和终末血液收集(第-4、0、1、2、3、7、14、21和28天)前禁食至少4小时。
取出食物并更换床上用品。在每次中期血液收集结束时返回食物，禁食持续时间不超过8小时。
中期血液收集：第1-12组中的所有动物在第-4、3、7、14和21天收集中期血液。动物具有用于禁食血清收集的全血。收集后，动物将在皮下接受0.5–1.0mL乳酸林格氏液
血液收集：通过隐静脉收集用于血清的全血。将全血收集到带有凝块活化剂管的血清分离器中，并处理成每个设施SOP一(1)份血清。将所有样品在标称-70℃下储存，直到装运到干冰上。
计划外安乐死：从在预定时间点之前被安乐死的垂死动物收集终末组织。如果可能，从被发现死亡的动物身上收集和储存组织。
安乐死：在第28天，禁食至少4小时后，通过CO2窒息对动物实施安乐死，然后进行开胸手术和放血。
终末血液：将来自放血的全血收集到带有凝块活化剂管的血清分离器中，并处理成每个设施SOP两(2)份血清。将所有样品在标称-70℃下储存，直到装运到干冰上。
苯丙氨酸(PHE)水平：通过Pure Honey分析血清样品的PHE水平。
活性水平：通过Pure Honey分析两(2)个冷冻肝脏样品的活性水平。
结果
本研究测试了两个经密码子优化的PAH序列(即，hPAH_codop_ORF_v2和hPAH-r5-s29::hIVS1B_33bpFlanks)与不同启动子或具有至少启动子伴有增强子的启动子组的组合(即，VD启动子组、启动子组1476和TTR启动子与HS-CRM_FOXA_HNF4_consensus_v1或3x_HNF4_FOXA_v1作为增强子之一)。包含在每个测试的ceDNA构建体中的特定元件汇总于表32中。
如图19A和图19B所示，在0.5μg剂量下，ceDNA412及其相应的合成产生的对应载体ceDNA34显示出相等的PAH活性和PHE校正。在0.5μg给药时，其他合成产生的载体即ceDNA36、ceDNA41和ceDNA43在3天内在总共5只小鼠中的至少1只中表现出PHE水平(PHEμM)急性校正至低于目标浓度(小于350μM)。值得注意的是，ceDNA41和ceDNA43优于对照ceDNA412，因为总共5只小鼠中多达4只在给药3天内达到低于目标浓度的PHE水平。
ceDNA36和ceDNA43各自具有与HS-CRM_FOXA_HNF4_consensus_v1增强子组合的TTR启动子，但PAH序列的不同之处在于ceDNA43包含hPAH-r5-s29::hIVS1B_33bpFlanksPAH序列，其具有CpG含量＝0，而ceDNA41包含hPAH_codop_ORF_v2 PAH序列(CpG含量＝77)。与ceDNA36相比，在ceDNA43中优异的PHE校正说明了CpG最小化在PAH序列中的重要性(参见图19C和19E)。类似地，除了不同的产生方法外，ceDNA41和ceDNA412在PAH序列方面也不同，因为ceDNA41包含hPAH-r5-s29::hIVS1B_33bpFlanks PAH序列，而ceDNA412包含hPAH_codop_ORF_v2 PAH序列。与ceDNA412相比，ceDNA41表现出优异的PHE校正(参见图19D和19A)。
包含TTR启动子与作为增强子的HS-CRM_FOXA_HNF4_consensus_v1(即，ceDNA43和ceDNA36)的组合的两种载体在给药3天内在总共5只小鼠中的至少1只中显示出PHE校正，ceDNA43在总共5只小鼠中的4只中实现PHE校正(参见图19B和19E)。令人惊讶的是，与ceDNA43的不同之处在于与相同TTR启动子组合使用的3x_HNF4_FOXA_v1包含3个拷贝的HNF4结合位点的ceDNA42在任何小鼠中均未实现PHE校正(参见图19D)。
从0.5μg给药研究可以看出，合成产生的ceDNA43表达hPAH-r5-s29::hIVS1B_33bpFlanks PAH序列，其具有CpG含量＝0，并且包含TTR启动子与作为增强子的HS-CRM_FOXA_HNF4_consensus_v1的组合，是研究的所有载体中最有效的载体。
因此，实施例6-12中的研究表明，包含已进行密码子优化的PAH核酸序列的ceDNA构建体(例如，ceDNA载体)可以与特定的顺式作用元件(例如，特异性启动子、特异性增强子以及特异性启动子和增强子的组合)进行组合，所述特定的顺式作用元件已测试苯丙氨酸水平的最佳校正(例如，表达和持续时间)。此外，实施例12研究证明合成产生的ceDNA构建体在PAH-缺陷型PAHenu2小鼠中具有相等或更有效的PHE校正。
核酸序列：
包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH Codop2”)的ceDNA的核酸序列如下所示(ceDNA412)。启动子以下划线显示(SEQ ID NO:191)，并且经密码子优化的PAH型式2开放阅读框(ORF)以双下划线显示(SEQ ID NO:382)。
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上面的ceDNA构建体包含left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、VD_PromoterSet、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1。
根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH Codop2”)的ceDNA的核酸序列包含SEQ ID NO:192。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH Codop2”)的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:192具有至少85％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH Codop2”)的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:192具有至少90％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH Codop2”)的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:192具有至少91％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH Codop2”)的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:192具有至少92％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH Codop2”)的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:192具有至少93％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH Codop2”)的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:192具有至少94％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH Codop2”)的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:192具有至少95％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH Codop2”)的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:192具有至少96％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH Codop2”)的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:192具有至少97％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH Codop2”)的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:192具有至少98％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH Codop2”)的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:192具有至少99％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAHCodop2”)的ceDNA的核酸序列由SEQ ID NO:192组成。
包含人PAH cDNA的ceDNA的核酸序列(ceDNA VD启动子连接到没有密码子优化的hPAH cDNA)如下所示。启动子以下划线显示(SEQ ID NO:191)，并且PAH开放阅读框(ORF)以双下划线显示(SEQ ID NO:394；ceDNA802)。
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SEQ ID NO:193包含以下元件。Left-ITR_v1:spacer_left-ITR_v1:VD_PromoterSet:PmeI_site:Consensus_Kozak:hPAH_cDNA_ORF_v3:PacI_site:WPRE_3pUTR:bGH:spacer_right-ITR_v1:right-ITR_v1。
根据一些实施方案，包含人PAH cDNA(ceDNA VD启动子连接到没有密码子优化的hPAH cDNA)的ceDNA的核酸序列包含SEQ ID NO:193。根据一些实施方案，包含人PAH cDNA(ceDNA VD启动子连接到没有密码子优化的hPAH cDNA)的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:193具有至少85％同一性。根据一些实施方案，包含人PAH cDNA(ceDNA VD启动子连接到没有密码子优化的hPAH cDNA)的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:193具有至少90％同一性。根据一些实施方案，包含人PAH cDNA(ceDNA VD启动子连接到没有密码子优化的hPAH cDNA)的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:193具有至少91％同一性。根据一些实施方案，包含人PAHcDNA(ceDNA VD启动子连接到没有密码子优化的hPAH cDNA)的ceDNA的核酸序列与SEQ IDNO:193具有至少92％同一性。根据一些实施方案，包含人PAH cDNA(ceDNA VD启动子连接到没有密码子优化的hPAH cDNA)的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:193具有至少93％同一性。根据一些实施方案，包含人PAH cDNA(ceDNA VD启动子连接到没有密码子优化的hPAHcDNA)的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:193具有至少94％同一性。根据一些实施方案，包含人PAH cDNA(ceDNA VD启动子连接到没有密码子优化的hPAH cDNA)的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:193具有至少95％同一性。根据一些实施方案，包含人PAH cDNA(ceDNA VD启动子连接到没有密码子优化的hPAH cDNA)的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:193具有至少96％同一性。根据一些实施方案，包含人PAH cDNA(ceDNA VD启动子连接到没有密码子优化的hPAH cDNA)的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:193具有至少97％同一性。根据一些实施方案，包含人PAH cDNA(ceDNA VD启动子连接到没有密码子优化的hPAH cDNA)的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:193具有至少98％同一性。根据一些实施方案，包含人PAH cDNA(ceDNAVD启动子连接到没有密码子优化的hPAH cDNA)的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:193具有至少99％同一性。根据一些实施方案，包含人PAH cDNA(ceDNA VD启动子连接到没有密码子优化的hPAH cDNA)的ceDNA的核酸序列由SEQ ID NO:193组成。
包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH Codop2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列如下所示(ceDNA1132)。
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCGCGGCCGCGGGGGAGGCTGCTGGTGAATATTAACCAAGGTCACCCCAGTTATCGGAGGAGCAAACAGGGGCTAAGTCCACCGGGGGAGGCTGCTGGTGAATATTAACCAAGGTCACCCCAGTTATCGGAGGAGCAAACAGGGGCTAAGTCCACCGGGGGAGGCTGCTGGTGAATATTAACCAAGGTCACCCCAGTTATCGGAGGAGCAAACAGGGGCTAAGTCCACGGTACCCACTGGGAGGATGTTGAGTAAGATGGAAAACTACTGATGACCCTTGCAGAGACAGAGTATTAGGACATGTTTGAACAGGGGCCGGGCGATCAGCAGGTAGCTCTAGAGGATCCCCGT CTGTCTGCACATTTCGTAGAGCGAGTGTTCCGATACTCTAATCTCCCTAGGCAAGGTTCATATTTGTGTAGGTTAC TTATTCTCCTTTTGTTGACTAAGTCAATAATCAGAATCAGCAGGTTTGGAGTCAGCTTGGCAGGGATCAGCAGCCT GGGTTGGAAGGAGGGGGTATAAAAGCCCCTTCACCAGGAGAAGCCGTCACACAGATCCACAAGCTCCTGAAGAGGTAAGGGTTTAAGGGATGGTTGGTTGGTGGGGTATTAATGTTTAATTACCTGGAGCACCTGCCTGAAATCACTTTTTTTCAGGTTGGGTTTAAACCGCAGCCACCATGAGCACCGCCGTGCTGGAAAATCCTGGCCTGGGCAGAAAGCTGAGCGACTTCGGCCAAGAGACAAGCTACATCGAGGACAACTGCAACCAGAACGGCGCCATCAGCCTGATCTTCAGCCTGAAAGAAGAAGTGGGCGCCCTGGCCAAGGTGCTGAGACTGTTCGAAGAGAACGACGTGAACCTGACACACATCGAGAGCAGACCCAGCAGACTGAAGAAGGACGAGTACGAGTTCTTCACCCACCTGGACAAGCGGAGCCTGCCTGCTCTGACCAACATCATCAAGATCCTGCGGCACGACATCGGCGCCACAGTGCACGAACTGAGCCGGGACAAGAAAAAGGACACCGTGCCATGGTTCCCCAGAACCATCCAAGAGCTGGACAGATTCGCCAACCAGATCCTGAGCTATGGCGCCGAGCTGGACGCTGATCACCCTGGCTTTAAGGACCCCGTGTACCGGGCCAGAAGAAAGCAGTTTGCCGATATCGCCTACAACTACCGGCACGGCCAGCCTATTCCTCGGGTCGAGTACATGGAAGAGGAAAAGAAAACCTGGGGCACCGTGTTCAAGACCCTGAAGTCCCTGTACAAGACCCACGCCTGCTACGAGTACAACCACATCTTCCCACTGCTCGAAAAGTACTGCGGCTTCCACGAGGACAATATCCCTCAGCTTGAGGACGTGTCCCAGTTCCTGCAGACCTGCACCGGCTTTAGACTGAGGCCAGTTGCCGGACTGCTGAGCAGCAGAGATTTTCTCGGCGGCCTGGCCTTCAGAGTGTTCCACTGTACCCAGTACATCAGACACGGCAGCAAGCCCATGTACACCCCTGAGCCTGATATCTGCCACGAGCTGCTGGGACATGTGCCCCTGTTCAGCGATAGAAGCTTCGCCCAGTTCAGCCAAGAGATCGGACTGGCTTCTCTGGGAGCCCCTGACGAGTACATTGAGAAGCTGGCCACCATCTACTGGTTCACCGTGGAATTCGGCCTGTGCAAGCAGGGCGACAGCATCAAAGCTTATGGCGCTGGCCTGCTGTCTAGCTTCGGCGAGCTGCAGTACTGTCTGAGCGAGAAGCCTAAGCTGCTGCCCCTGGAACTGGAAAAGACCGCCATCCAGAACTACACCGTGACCGAGTTCCAGCCTCTGTACTACGTGGCCGAGAGCTTCAACGACGCCAAAGAAAAAGTGCGGAACTTCGCCGCCACCATTCCTCGGCCTTTCAGCGTCAGATACGACCCCTACACACAGCGGATCGAGGTGCTGGACAACACACAGCAGCTGAAAATTCTGGCCGACTCCATCAACAGCGAGATCGGCATCCTGTGCAGCGCCCTGCAGAAAATCAAGTGATAGTTAATTAAGAGCATCTTACCGCCATTTATTCCCATATTTGTTCTGTTTTTCTTGATTTGGGTATACATTTAAATGTTAATAAAACAAAATGGTGGGGCAATCATTTACATTTTTAGGGATATGTAATTACTAGTTCAGGTGTATTGCCACAAGACAAACATGTTAAGAAACTTTCCCGTTATTTACGCTCTGTTCCTGTTAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGATATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTGTGTGGATATGCTGCTTTATAGCCTCTGTATCTAGCTATTGCTTCCCGTACGGCTTTCGTTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTTAGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCCGTCAACGTGGCGTGGTGTGCTCTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGCTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAACTCCTTTCTGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCGATCGCCACGGCAGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTAGGTTGCTGGGCACTGATAATTCCGTGGTGTTGTCTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTCTAGAGCATGGCTACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACACCTGCAGGAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG(SEQ ID NO:194)
SEQ ID NO:194包含以下元件。Left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、3xSerpEnh-TTRe-TTRm、MVM_intron、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1。
根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列包含SEQ ID NO:194。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:194具有至少85％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:194具有至少90％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:194具有至少91％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:194具有至少92％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:194具有至少93％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:194具有至少94％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:194具有至少95％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:194具有至少96％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ IDNO:194具有至少97％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:194具有至少98％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:194具有至少99％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列由SEQ ID NO:194组成。
包含具有29个氨基酸缺失的经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH Codop2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列被示出为SEQ ID NO:195(ceDNA1274)。
SEQ ID NO:195包含以下元件。left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、VD_PromoterSet、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2_delta1-29aa、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1。
根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2delta1-29aa(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2_delta1-29aa”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列包含SEQ ID NO:195。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2delta1-29aa(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2_delta1-29aa”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:195具有至少85％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2delta1-29aa(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2_delta1-29aa”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:195具有至少90％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2delta1-29aa(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2_delta1-29aa”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:195具有至少91％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2delta1-29aa(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2_delta1-29aa”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:195具有至少92％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2delta1-29aa(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2_delta1-29aa”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:195具有至少93％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2delta1-29aa(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2_delta1-29aa”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:195具有至少94％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2delta1-29aa(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2_delta1-29aa”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:195具有至少95％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2delta1-29aa(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2_delta1-29aa”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ IDNO:195具有至少96％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2delta1-29aa(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2_delta1-29aa”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:195具有至少97％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2delta1-29aa(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2_delta1-29aa”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:195具有至少98％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2delta1-29aa(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2_delta1-29aa”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:195具有至少99％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2delta1-29aa(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2_delta1-29aa”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列由SEQ ID NO:195组成。
包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列被示出为SEQ ID NO:196(ceDNA1414)。
SEQ ID NO:196包含以下元件。left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、3xVanD_TTRe_PromoterSet、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH-r5-s29::hIVS1B、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1。
根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列包含SEQ ID NO:196。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:196具有至少85％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:196具有至少90％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:196具有至少91％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:196具有至少92％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:196具有至少93％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:196具有至少94％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:196具有至少95％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:196具有至少96％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ IDNO:196具有至少97％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:196具有至少98％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:196具有至少99％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列由SEQ ID NO:196组成。
包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列被示出为SEQ ID NO:197(ceDNA1416)。
SEQ ID NO:197包含以下元件。left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、3xVanD_TTRe_PromoterSet、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH-r5-s29::hIVS1B_33bpFlanks、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1。
根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列包含SEQ ID NO:197。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:197具有至少85％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:197具有至少90％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:197具有至少91％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:197具有至少92％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:197具有至少93％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:197具有至少94％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:197具有至少95％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:197具有至少96％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ IDNO:197具有至少97％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:197具有至少98％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:197具有至少99％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列由SEQ ID NO:197组成。包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列被示出为SEQ IDNO:198(ceDNA1428)。
SEQ ID NO:198包含以下元件。left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、3xVanDTTRe PromoterSet、PmeI site、Mod Minimum Consensus Kozak、hPAH-r5-s29::mod-Intron_oIVS-v2_33bpFlanks、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1。
根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列包含SEQ ID NO:198。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:198具有至少85％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:198具有至少90％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:198具有至少91％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:198具有至少92％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:198具有至少93％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:198具有至少94％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:198具有至少95％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:198具有至少96％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ IDNO:198具有至少97％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:198具有至少98％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:198具有至少99％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列由SEQ ID NO:198组成。
包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列被示出为SEQ ID NO:199(ceDNA1430)。
SEQ ID NO:199包含以下元件。left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、3xVanD_TTRe_PromoterSet、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2_mIVS-intron1B_33bpFlanks、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1。
根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列包含SEQ ID NO:199。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:199具有至少85％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:199具有至少90％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:199具有至少91％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:199具有至少92％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:199具有至少93％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:199具有至少94％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:199具有至少95％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:199具有至少96％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ IDNO:199具有至少97％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:199具有至少98％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:199具有至少99％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列由SEQ ID NO:199组成。
包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列被示出为SEQ ID NO:200(ceDNA1432)。
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCGCGGCCGCGGGGGAGGCTGCTGGTGAATATTAACCAAGGTCACCCCAGTTATCGGAGGAGCAAACAGGGGCTAAGTCCACCGGGGGAGGCTGCTGGTGAATATTAACCAAGGTCACCCCAGTTATCGGAGGAGCAAACAGGGGCTAAGTCCACCGGGGGAGGCTGCTGGTGAATATTAACCAAGGTCACCCCAGTTATCGGAGGAGCAAACAGGGGCTAAGTCCACGGTACCCACTGGGAGGATGTTGAGTAAGATGGAAAACTACTGATGACCCTTGCAGAGACAGAGTATTAGGACATGTTTGAACAGGGGCCGGGCGATCAGCAGGTAGCTCTAGAGGATCCCCGTCTGTCTGCACATTTCGTAGAGCGAGTGTTCCGATACTCTAATCTCCCTAGGCAAGGTTCATATTTGTGTAGGTTACTTATTCTCCTTTTGTTGACTAAGTCAATAATCAGAATCAGCAGGTTTGGAGTCAGCTTGGCAGGGATCAGCAGCCTGGGTTGGAAGGAGGGGGTATAAAAGCCCCTTCACCAGGAGAAGCCGTCACACAGATCCACAAGCTCCTGAAGAGGTAAGGGTTTAAGGGATGGTTGGTTGGTGGGGTATTAATGTTTAATTACCTGGAGCACCTGCCTGAAATCACTTTTTTTCAGGTTGGGTTTAAACCGCAGCCACCATGAGCACCGCCGTGCTGGAAAATCCTGGCTTGGGCAGGAAACTCTCTGACTTTGGACAGGTGAGCCACGGCAGCCTGAGCTGCTCAGTTAGGGGAATTTGGGCCTCCAGAGAAAGAGATCCGAAGACTGCTGGTGCTTCCTGGTTTCATAAGCTCAGTAAGAAGTCTGAATTCGTTGGAAGCTGATGATAGAAGAAAGAGTTCATGCTTGCTTTGTCCATGGAGGTTTAACAGGAATGAATTGCTAAACTGTGGAAAATGTTTTAAACAAATGCATCTTATCCTGTAGGAAACAAGCTATATTGAAGACAACTGCAATCAAAACGGCGCCATCAGCCTGATCTTCAGCCTGAAAGAAGAAGTGGGCGCCCTGGCCAAGGTGCTGAGACTGTTCGAAGAGAACGACGTGAACCTGACACACATCGAGAGCAGACCCAGCAGACTGAAGAAGGACGAGTACGAGTTCTTCACCCACCTGGACAAGCGGAGCCTGCCTGCTCTGACCAACATCATCAAGATCCTGCGGCACGACATCGGCGCCACAGTGCACGAACTGAGCCGGGACAAGAAAAAGGACACCGTGCCATGGTTCCCCAGAACCATCCAAGAGCTGGACAGATTCGCCAACCAGATCCTGAGCTATGGCGCCGAGCTGGACGCTGATCACCCTGGCTTTAAGGACCCCGTGTACCGGGCCAGAAGAAAGCAGTTTGCCGATATCGCCTACAACTACCGGCACGGCCAGCCTATTCCTCGGGTCGAGTACATGGAAGAGGAAAAGAAAACCTGGGGCACCGTGTTCAAGACCCTGAAGTCCCTGTACAAGACCCACGCCTGCTACGAGTACAACCACATCTTCCCACTGCTCGAAAAGTACTGCGGCTTCCACGAGGACAATATCCCTCAGCTTGAGGACGTGTCCCAGTTCCTGCAGACCTGCACCGGCTTTAGACTGAGGCCAGTTGCCGGACTGCTGAGCAGCAGAGATTTTCTCGGCGGCCTGGCCTTCAGAGTGTTCCACTGTACCCAGTACATCAGACACGGCAGCAAGCCCATGTACACCCCTGAGCCTGATATCTGCCACGAGCTGCTGGGACATGTGCCCCTGTTCAGCGATAGAAGCTTCGCCCAGTTCAGCCAAGAGATCGGACTGGCTTCTCTGGGAGCCCCTGACGAGTACATTGAGAAGCTGGCCACCATCTACTGGTTCACCGTGGAATTCGGCCTGTGCAAGCAGGGCGACAGCATCAAAGCTTATGGCGCTGGCCTGCTGTCTAGCTTCGGCGAGCTGCAGTACTGTCTGAGCGAGAAGCCTAAGCTGCTGCCCCTGGAACTGGAAAAGACCGCCATCCAGAACTACACCGTGACCGAGTTCCAGCCTCTGTACTACGTGGCCGAGAGCTTCAACGACGCCAAAGAAAAAGTGCGGAACTTCGCCGCCACCATTCCTCGGCCTTTCAGCGTCAGATACGACCCCTACACACAGCGGATCGAGGTGCTGGACAACACACAGCAGCTGAAAATTCTGGCCGACTCCATCAACAGCGAGATCGGCATCCTGTGCAGCGCCCTGCAGAAAATCAAGTGAtagTTAATTAAGAGCATCTTACCGCCATTTATTCCCATATTTGTTCTGTTTTTCTTGATTTGGGTATACATTTAAATGTTAATAAAACAAAATGGTGGGGCAATCATTTACATTTTTAGGGATATGTAATTACTAGTTCAGGTGTATTGCCACAAGACAAACATGTTAAGAAACTTTCCCGTTATTTACGCTCTGTTCCTGTTAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGATATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTGTGTGGATATGCTGCTTTATAGCCTCTGTATCTAGCTATTGCTTCCCGTACGGCTTTCGTTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTTAGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCCGTCAACGTGGCGTGGTGTGCTCTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGCTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAACTCCTTTCTGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCGATCGCCACGGCAGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTAGGTTGCTGGGCACTGATAATTCCGTGGTGTTGTCTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTCTAGAGCATGGCTACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACACCTGCAGGAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG(SEQ ID NO:200)
SEQ ID NO:200包含以下元件。left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、3xVanD_TTRe_PromoterSet、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2_modified_Intron1_33bpFlanks、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1。
根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列包含SEQ ID NO:200。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:200具有至少85％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:200具有至少90％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:200具有至少91％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:200具有至少92％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:200具有至少93％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:200具有至少94％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:200具有至少95％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:200具有至少96％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ IDNO:200具有至少97％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:200具有至少98％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:200具有至少99％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列由SEQ ID NO:200组成。
包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列被示出为SEQ ID NO:201(ceDNA1436)。
SEQ ID NO:202包含以下元件。left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、hAAT(979)_PromoterSet、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1。
根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列包含SEQ ID NO:201。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:201具有至少85％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:201具有至少90％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:201具有至少91％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:201具有至少92％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:201具有至少93％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:201具有至少94％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:201具有至少95％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:201具有至少96％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ IDNO:201具有至少97％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:201具有至少98％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:201具有至少99％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列由SEQ ID NO:201组成。
包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列被示出为SEQ ID NO:202(ceDNA1458)。
SEQ ID NO:202包含以下元件。left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、VD_PromoterSet、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2、PacI_site、HBBv2_3pUTR、SV40_polyA、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1。
根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列包含SEQ ID NO:202。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:202具有至少85％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:202具有至少90％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:202具有至少91％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:202具有至少92％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:202具有至少93％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:202具有至少94％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:202具有至少95％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:202具有至少96％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ IDNO:202具有至少97％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:202具有至少98％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:202具有至少99％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列由SEQ ID NO:202组成。
包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列被示出为SEQ ID NO:203(ceDNA1459)。
SEQ ID NO:203包含以下元件。l left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、VD_PromoterSet、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2、PacI_site、HBBv3_3pUTR、SV40_polyA、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1。
根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列包含SEQ ID NO:203。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:203具有至少85％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:203具有至少90％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:203具有至少91％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:203具有至少92％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:203具有至少93％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:203具有至少94％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:203具有至少95％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:203具有至少96％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ IDNO:203具有至少97％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:203具有至少98％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:203具有至少99％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列由SEQ ID NO:203组成。
包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列被示出为SEQ ID NO:204(ceDNA1464)。
SEQ ID NO:204包含以下元件。left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、VD_PromoterSet、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2、PacI_site、WPRE_3pUTR、SV40_polyA、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1。
根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列包含SEQ ID NO:204。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:204具有至少85％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:204具有至少90％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:204具有至少91％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:204具有至少92％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:204具有至少93％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:204具有至少94％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:204具有至少95％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:204具有至少96％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ IDNO:204具有至少97％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:204具有至少98％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:204具有至少99％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列由SEQ ID NO:204组成。
包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列被示出为SEQ ID NO:205(ceDNA1466)。
SEQ ID NO:205包含以下元件。left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、VD_PromoterSet、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2、PacI_site、WPRE_3pUTR、HBBv2_3pUTR、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1。
根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列包含SEQ ID NO:205。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:205具有至少85％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:205具有至少90％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:205具有至少91％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:205具有至少92％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:205具有至少93％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:205具有至少94％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:205具有至少95％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:205具有至少96％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ IDNO:205具有至少97％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:205具有至少98％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:205具有至少99％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列由SEQ ID NO:205组成。
包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列被示出为SEQ ID NO:206(ceDNA1471)。
SEQ ID NO:206包含以下元件。left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、3xHNF1-4_ProEnh_10mer、BamHI_site、TTR_liver_specific_Promoter、MVM_intron、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1。
根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列包含SEQ ID NO:206。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:206具有至少85％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:206具有至少90％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:206具有至少91％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:206具有至少92％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:206具有至少93％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:206具有至少94％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:206具有至少95％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:206具有至少96％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ IDNO:206具有至少97％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:206具有至少98％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:206具有至少99％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列由SEQ ID NO:206组成。
包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列被示出为SEQ ID NO:207(ceDNA1472)。
SEQ ID NO:207包含以下元件。left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、3xHNF1-4_ProEnh_10mer、HS-CRM8_SERP_Enhancer_nospacer、HS-CRM8_SERP_Enhancer_nospacer 、BamHI_site 、TTR_liver_specific_Promoter、 MVM_intron、 PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1。
根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列包含SEQ ID NO:207。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:207具有至少85％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:207具有至少90％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:207具有至少91％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:207具有至少92％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:207具有至少93％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:207具有至少94％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:207具有至少95％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:207具有至少96％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ IDNO:207具有至少97％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:207具有至少98％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:207具有至少99％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列由SEQ ID NO:207组成。
包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列被示出为SEQ ID NO:208(ceDNA1473)。
SEQ ID NO:208包含以下元件。left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、CpGfree20mer_1、5xHNF1_ProEnh_10mer、BamHI_site、TTR_liver_specific_Promoter、MVM_intron、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1。
根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式元件的ceDNA的核酸序列包含SEQ ID NO:208。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:208具有至少85％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ IDNO:208具有至少90％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:2082具有至少91％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:208具有至少92％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:208具有至少93％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:208具有至少94％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:208具有至少95％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ IDNO:208具有至少96％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:208具有至少97％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:208具有至少98％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:208具有至少99％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列由SEQ ID NO:208组成。
包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列被示出为SEQ ID NO:209(ceDNA1474)。
SEQ ID NO:209包含以下元件。left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、CpGfree20mer_1、5xHNF1_ProEnh_10mer、3xVanD_TTRe_PromoterSet_v2、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1。
根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列包含SEQ ID NO:209。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:209具有至少85％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:209具有至少90％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:209具有至少91％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:209具有至少92％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:209具有至少93％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:209具有至少94％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:209具有至少95％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:209具有至少96％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ IDNO:209具有至少97％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:209具有至少98％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:209具有至少99％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列由SEQ ID NO:209组成。
包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列被示出为SEQ ID NO:210(ceDNA1527)。
SEQ ID NO:210包含以下元件。left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、3xVanD_TTRe_PromoterSet_v2、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1。
根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列包含SEQ ID NO:210。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:210具有至少85％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:210具有至少90％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:210具有至少91％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:210具有至少92％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:210具有至少93％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:210具有至少94％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:210具有至少95％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:210具有至少96％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ IDNO:210具有至少97％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:210具有至少98％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:210具有至少99％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列由SEQ ID NO:210组成。
包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列被示出为SEQ ID NO:211(ceDNA1528)。
SEQ ID NO:211包含以下元件。left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2.1、CpGmin_hAAT_Promoter_Set、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH_codop_ORF_v2、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1。
根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列包含SEQ ID NO:211。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:211具有至少85％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:211具有至少90％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:211具有至少91％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:211具有至少92％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:211具有至少93％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:211具有至少94％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:211具有至少95％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:211具有至少96％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ IDNO:211具有至少97％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:211具有至少98％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:211具有至少99％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2(ceDNA“hPAH_codop_ORF_v2”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列由SEQ ID NO:211组成。
包含经密码子优化的人PAH型式2r3-s34(ceDNA“hPAH-r3-s34”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列被示出为SEQ ID NO:212(ceDNA1529)。
SEQ ID NO:212包含以下元件。left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2、HS-CRM8_SERP_Enhancer_nospacer、HS-CRM8_SERP_Enhancer_nospacer、HS-CRM8_SERP_Enhancer_nospacer、BamHI_site、TTR-promoter-d5pUTR、MVM_intron、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH-r3-s34、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1。
根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r3-s34(ceDNA“hPAH-r3-s34”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列包含SEQ ID NO:212。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r3-s34(ceDNA“hPAH-r3-s34”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:212具有至少85％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r3-s34(ceDNA“hPAH-r3-s34”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:212具有至少90％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r3-s34(ceDNA“hPAH-r3-s34”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:212具有至少91％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r3-s34(ceDNA“hPAH-r3-s34”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:212具有至少92％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r3-s34(ceDNA“hPAH-r3-s34”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:212具有至少93％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r3-s34(ceDNA“hPAH-r3-s34”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:212具有至少94％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r3-s34”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:212具有至少95％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r3-s34(ceDNA“hPAH-r3-s34”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:212具有至少96％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r3-s34(ceDNA“hPAH-r3-s34”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ IDNO:212具有至少97％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r3-s34(ceDNA“hPAH-r3-s34”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:212具有至少98％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r3-s34(ceDNA“hPAH-r3-s34”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:212具有至少99％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r3-s34(ceDNA“hPAH-r3-s34”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列由SEQ ID NO:212组成。
包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列被示出为SEQ ID NO:213(ceDNA1530)。
SEQ ID NO:213包含以下元件：left-ITR_v1、spacer_left-ITR_v2、HS-CRM8_SERP_Enhancer_nospacer、HS-CRM8_SERP_Enhancer_nospacer、HS-CRM8_SERP_Enhancer_nospacer、BamHI_site、TTR-promoter-d5pUTR、MVM_intron、PmeI_site、Mod_Minimum_Consensus_Kozak、hPAH-r5-s29、PacI_site、WPRE_3pUTR、bGH、spacer_right-ITR_v1、right-ITR_v1。
根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列包含SEQ ID NO:213。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:213具有至少85％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:213具有至少90％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:213具有至少91％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:213具有至少92％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:213具有至少93％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:213具有至少94％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:213具有至少95％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:213具有至少96％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ IDNO:213具有至少97％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:213具有至少98％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:213具有至少99％同一性。根据一些实施方案，包含经密码子优化的人PAH型式2r5-s29(ceDNA“hPAH-r5-s29”)和特定顺式调节元件的ceDNA的核酸序列由SEQ ID NO:213组成。
另外的全长ceDNA PAH构建体序列示于表35中。在一些实施方案中，全长ceDNAPAH构建体序列的核酸序列与表35中列出的序列中的任何序列具有至少90％同一性。在一些实施方案中，全长ceDNA PAH构建体序列的核酸序列与表35中列出的序列中的任何序列具有至少95％同一性。在一些实施方案中，全长ceDNA PAH构建体序列的核酸序列与表35中列出的序列中的任何序列具有至少96％同一性。在一些实施方案中，全长ceDNA PAH构建体序列的核酸序列与表35中列出的序列中的任何序列具有至少97％同一性。在一些实施方案中，全长ceDNA PAH构建体序列的核酸序列与表35中列出的序列中的任何序列具有至少98％同一性。在一些实施方案中，全长ceDNA PAH构建体序列的核酸序列与表35中列出的序列中的任何序列具有至少99％同一性。在一些实施方案中，全长ceDNA PAH构建体序列的核酸序列包含表35中列出的序列中的任何序列。在一些实施方案中，全长ceDNA PAH构建体序列的核酸序列由表35中列出的序列中的任何序列组成。
表35.另外的全长ceDNA PAH构建体序列
参考文献
在本说明书和本文的实施例中引用的所有出版物和参考文献，包括但不限于专利和专利申请，都全文以引用方式并入本文，如同每个单独的出版物或参考文献被明确且单独地指出像充分阐述一样，以引用方式并入本文一般。本申请要求优先权的任何专利申请也以上述针对出版物和参考文献的方式通过引用并入本文。

Claims (86)

1.一种封闭端DNA(ceDNA)载体，包含：
编码至少一种苯丙氨酸羟化酶(PAH)蛋白的至少一个核酸序列，其中所述至少一个核酸序列选自与表1A中所示的序列中的任何序列具有至少90％同一性的序列，其中所述至少一个核酸序列是经密码子优化的，并且其中所述至少一个核酸序列位于侧接反向末端重复序列(ITR)之间；以及
启动子，所述启动子可操作地连接到编码所述至少一种PAH蛋白的所述至少一个核苷酸序列，其中所述启动子选自由VD启动子、人α1-抗胰蛋白酶(hAAT)启动子(包括hAAT(979)启动子和CpGmin_hAAT启动子)和运甲状腺素蛋白(TTR)肝特异性启动子组成的组。
2.根据权利要求1所述的ceDNA载体，其中编码所述至少一种PAH蛋白的所述至少一个核酸序列选自与表1A中所示的序列中的任一序列具有至少95％同一性的序列。
3.一种封闭端DNA(ceDNA)载体，包含：
编码至少一种PAH蛋白的核酸序列，其中所述核酸序列选自与表1A中所示的序列中的任何序列具有至少95％同一性的序列，其中所述至少一个核酸序列位于侧接反向末端重复序列(ITR)之间；以及
启动子，所述启动子可操作地连接到编码所述至少一种PAH蛋白的所述核酸序列，其中所述启动子选自由VD启动子、人α1-抗胰蛋白酶(hAAT)启动子和运甲状腺素蛋白(TTR)肝特异性启动子组成的组。
4.一种封闭端DNA(ceDNA)载体，包含：
编码至少一种PAH蛋白的核酸序列，其中所述核酸序列选自与表1A中所示的序列中的任何序列具有至少96％同一性的序列，其中所述至少一个核酸序列位于侧接反向末端重复序列(ITR)之间；以及
启动子，所述启动子可操作地连接到编码所述至少一种PAH蛋白的所述核酸序列，其中所述启动子选自由VD启动子、人α1-抗胰蛋白酶(hAAT)启动子和运甲状腺素蛋白(TTR)肝特异性启动子组成的组。
5.一种封闭端DNA(ceDNA)载体，包含：
编码至少一种PAH蛋白的核酸序列，其中所述核酸序列选自与表1A中所示的序列中的任何序列具有至少97％同一性的序列，其中所述至少一个核酸序列位于侧接反向末端重复序列(ITR)之间；以及
启动子，所述启动子可操作地连接到编码所述至少一种PAH蛋白的所述核酸序列，其中所述启动子选自由VD启动子、人α1-抗胰蛋白酶(hAAT)启动子和运甲状腺素蛋白(TTR)肝特异性启动子组成的组。
6.一种封闭端DNA(ceDNA)载体，包含：
编码至少一种PAH蛋白的核酸序列，其中所述核酸序列选自与表1A中所示的序列中的任何序列具有至少98％同一性的序列，其中所述至少一个核酸序列位于侧接反向末端重复序列(ITR)之间；以及
启动子，所述启动子可操作地连接到编码所述至少一种PAH蛋白的所述核酸序列，其中所述启动子选自由VD启动子、人α1-抗胰蛋白酶(hAAT)启动子和运甲状腺素蛋白(TTR)肝特异性启动子组成的组。
7.一种封闭端DNA(ceDNA)载体，包含：
编码至少一种PAH蛋白的核酸序列，其中所述核酸序列选自与表1A中所示的序列中的任何序列具有至少99％同一性的序列，其中所述至少一个核酸序列位于侧接反向末端重复序列(ITR)之间；以及
启动子，所述启动子可操作地连接到编码所述至少一种PAH蛋白的所述核酸序列，其中所述启动子选自由VD启动子、人α1-抗胰蛋白酶(hAAT)启动子和运甲状腺素蛋白(TTR)肝特异性启动子组成的组。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的ceDNA载体，其中编码所述至少一种PAH蛋白的所述至少一个核酸序列是与SEQ ID NO:382所示的序列具有至少98％同一性的序列。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的ceDNA载体，其中编码所述至少一种PAH蛋白的所述至少一个核酸序列是与SEQ ID NO:382所示的序列具有至少99％同一性的序列。
10.根据权利要求1至7中任一项所述的ceDNA载体，其中编码所述至少一种PAH蛋白的所述至少一个核酸序列如SEQ ID NO:382所示。
11.根据权利要求1至7中任一项所述的ceDNA载体，其中编码所述至少一种PAH蛋白的所述至少一个核酸序列是与SEQ ID NO:425所示的序列具有至少99％同一性的序列。
12.根据权利要求1至7中任一项所述的ceDNA载体，其中编码所述至少一种PAH蛋白的所述至少一个核酸序列如SEQ ID NO:425所示。
13.根据权利要求1至7中任一项所述的ceDNA载体，其中编码所述至少一种PAH蛋白的所述至少一个核酸序列是与SEQ ID NO:431所示的序列具有至少99％同一性的序列。
14.根据权利要求1至7中任一项所述的ceDNA载体，其中编码所述至少一种PAH蛋白的所述至少一个核酸序列如SEQ ID NO:431所示。
15.根据权利要求1至7中任一项所述的ceDNA载体，其中编码所述至少一种PAH蛋白的所述至少一个核酸序列是与SEQ ID NO:435所示的序列具有至少99％同一性的序列。
16.根据权利要求1至7中任一项所述的ceDNA载体，其中编码所述至少一种PAH蛋白的所述至少一个核酸序列如SEQ ID NO:435所示。
17.根据权利要求1至7中任一项所述的ceDNA载体，其中所述启动子包含与SEQ ID NO:191具有至少85％同一性的核酸序列。
18.根据权利要求1至7中任一项所述的ceDNA载体，其中所述启动子包含与SEQ ID NO:443具有至少98％同一性的核酸序列。
19.根据权利要求1至7中任一项所述的ceDNA载体，其中所述启动子包含与SEQ ID NO:444具有至少99％同一性的核酸序列。
20.根据权利要求1至7中任一项所述的ceDNA载体，其中所述启动子包含与SEQ ID NO:445具有至少99％同一性的核酸序列。
21.根据权利要求1至7中任一项所述的ceDNA载体，其中所述启动子包含与SEQ ID NO:446具有至少99％同一性的核酸序列。
22.根据权利要求1至7中任一项所述的ceDNA载体，其中所述启动子包含与SEQ ID NO:447具有至少96％同一性的核酸序列。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体还包含增强子。
24.根据权利要求23所述的ceDNA载体，其中所述增强子选自由丝氨酸蛋白酶抑制剂增强子、3xHNF1-4_ProEnh_10mer和5xHNF1_ProEnh_10mer组成的组。
25.根据权利要求23所述的ceDNA载体，其中所述增强子包含与SEQ ID NO:450具有至少85％同一性的核酸序列。
26.根据权利要求23所述的ceDNA载体，其中所述增强子包含与SEQ ID NO:586具有至少85％同一性的核酸序列。
27.根据权利要求23所述的ceDNA载体，其中所述增强子包含与SEQ ID NO:587具有至少85％同一性的核酸序列。
28.根据权利要求1至7中任一项所述的ceDNA载体，其中所述启动子是包含与SEQ IDNO:462具有至少85％同一性的核酸序列的启动子组。
29.根据权利要求1至7中任一项所述的ceDNA载体，其中所述启动子是包含与SEQ IDNO:467具有至少85％同一性的核酸序列的启动子组。
30.根据权利要求1至7中任一项所述的ceDNA载体，其中所述启动子是包含与SEQ IDNO:470具有至少85％同一性的核酸序列的启动子组。
31.根据权利要求1至7中任一项所述的ceDNA载体，其中所述启动子是包含与SEQ IDNO:470具有至少90％同一性的核酸序列的启动子组。
32.根据权利要求1至7中任一项所述的ceDNA载体，其中所述启动子是包含与SEQ IDNO:470具有至少95％同一性的核酸序列的启动子组。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体还包含一个或多个内含子。
34.根据权利要求33所述的ceDNA载体，其中所述一个或多个内含子是小鼠微小病毒(MVM)。
35.根据权利要求1至34中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含3'非翻译区(3'UTR)。
36.根据权利要求1至35中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含至少一个polyA序列。
37.根据权利要求1至7中任一项所述的ceDNA载体，其中所述VD启动子包含SERP增强子。
38.根据权利要求1至7中任一项所述的ceDNA载体，其中所述VD启动子包含3xSERP增强子。
39.根据权利要求1至7中任一项所述的ceDNA载体，其中所述启动子是TTR肝启动子，并且所述ceDNA还包含MVM内含子。
40.根据权利要求1至39中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含与选自由以下组成的组的核酸序列具有至少90％同一性的核酸序列：SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:199、SEQ ID NO:200、SEQID NO:201、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:211、SEQID NO:212、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:541、SEQ ID NO:542、SEQ ID NO:543、SEQ ID NO:544、SEQ ID NO:545、SEQ ID NO:546、SEQ ID NO:547、SEQ ID NO:548、SEQ ID NO:549、SEQID NO:550、SEQ ID NO:551、SEQ ID NO:552、SEQ ID NO:553、SEQ ID NO:554、SEQ ID NO:555、SEQ ID NO:556、SEQ ID NO:557、SEQ ID NO:558、SEQ ID NO:559、SEQ ID NO:560、SEQID NO:561、SEQ ID NO:562、SEQ ID NO:563、SEQ ID NO:564、SEQ ID NO:565、SEQ ID NO:566、SEQ ID NO:567、SEQ ID NO:570、SEQ ID NO:571、SEQ ID NO:572、SEQ ID NO:573、SEQID NO:574、SEQ ID NO:575、SEQ ID NO:576、SEQ ID NO:577、SEQ ID NO:578、SEQ ID NO:579、SEQ ID NO:580、SEQ ID NO:581、SEQ ID NO:582、SEQ ID NO:583和SEQ ID NO:584。
41.根据权利要求1至40中任一项所述的ceDNA载体，其中至少一个核酸序列是PAH的cDNA。
42.根据权利要求1至41中任一项所述的ceDNA载体，其中至少一个ITR包含功能末端解链位点(TRS)和Rep结合位点。
43.根据权利要求1至42中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个ITR来自病毒，所述病毒选自细小病毒、依赖病毒和腺相关病毒(AAV)。
44.根据权利要求1至43中任一项所述的ceDNA载体，其中所述侧接ITR是对称或不对称的。
45.根据权利要求44所述的ceDNA载体，其中所述侧接ITR是对称或基本上对称的。
46.根据权利要求45所述的ceDNA载体，其中所述侧接ITR是不对称的。
47.根据权利要求1至46中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个ITR是野生型的，或者其中所述ITR中的两个ITR都是野生型的。
48.根据权利要求1至47中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的两个ITR都是相同AAV的野生型。
49.根据权利要求48所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的两个ITR都是AAV2的野生型。
50.根据权利要求1至49中任一项所述的ceDNA载体，其中所述侧接ITR来自不同病毒血清型。
51.根据权利要求1至50中任一项所述的ceDNA载体，其中所述侧接ITR来自表2中所示的病毒血清型对。
52.根据权利要求1至51中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个ITR包含选自表3、表5A、表5B或表6中的序列的序列。
53.根据权利要求1至52中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的至少一个ITR由野生型AAV ITR序列通过影响所述ITR的总体三维构象的缺失、添加或取代进行改变。
54.根据权利要求1至53中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个ITR来源于选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12的AAV血清型。
55.根据权利要求1至54中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个ITR是合成的。
56.根据权利要求1至55中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个ITR不是野生型ITR，或者其中所述ITR中的两个ITR都不是野生型的。
57.根据权利要求1至56中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个ITR通过在选自A、A'、B、B'、C、C'、D和D'的至少一个ITR区域中的缺失、插入和/或取代而被修饰。
58.根据权利要求57所述的ceDNA载体，其中所述缺失、插入和/或取代导致通常由所述A、A'、B、B'、C或C'区域形成的茎-环结构的全部或一部分缺失。
59.根据权利要求1至58中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个ITR通过缺失、插入和/或取代而被修饰，所述缺失、插入和/或取代导致通常由所述B和B'区域形成的茎-环结构的全部或一部分缺失。
60.根据权利要求1至59中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个ITR通过缺失、插入和/或取代而被修饰，所述缺失、插入和/或取代导致通常由所述C和C'区域形成的茎-环结构的全部或一部分缺失。
61.根据权利要求1至60中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个ITR通过缺失、插入和/或取代而被修饰，所述缺失、插入和/或取代导致通常由所述B和B'区域形成的茎-环结构的一部分和/或通常由所述C和C'区域形成的茎-环结构的一部分缺失。
62.根据权利要求1至61中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个ITR在通常包含由所述B和B'区域形成的第一茎-环结构以及由所述C和C'区域形成的第二茎-环结构的区域中包含单个茎-环结构。
63.根据权利要求1至62中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个ITR在通常包含由所述B和B'区域形成的第一茎-环结构以及由所述C和C'区域形成的第二茎-环结构的区域中包含单个茎和两个环。
64.根据权利要求1至63中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个ITR在通常包含由所述B和B'区域形成的第一茎-环结构以及由所述C和C'区域形成的第二茎-环结构的区域中包含单个茎和单个环。
65.根据权利要求1至64中任一项所述的ceDNA载体，其中两个ITR以使得当所述ITR相对于彼此呈反向时产生整体三维对称性的方式改变。
66.根据权利要求1至65中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含与SEQ IDNO:382、SEQ ID NO:383、SEQ ID NO:384、SEQID NO:385或SEQ ID NO:386具有至少90％同一性的核酸序列。
67.根据权利要求1至65中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含与SEQ IDNO:382、SEQ ID NO:383、SEQ ID NO:384、SEQID NO:385或SEQ ID NO:386具有至少95％同一性的核酸序列。
68.根据权利要求1至65中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含与SEQ IDNO:382、SEQ ID NO:383、SEQ ID NO:384、SEQID NO:385或SEQ ID NO:386具有至少96％同一性的核酸序列。
69.根据权利要求1至65中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含与SEQ IDNO:382、SEQ ID NO:383、SEQ ID NO:384、SEQID NO:385或SEQ ID NO:386具有至少97％同一性的核酸序列。
70.根据权利要求1至65中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含与SEQ IDNO:382、SEQ ID NO:383、SEQ ID NO:384、SEQID NO:385或SEQ ID NO:386具有至少98％同一性的核酸序列。
71.根据权利要求1至65中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含与SEQ IDNO:382、SEQ ID NO:383、SEQ ID NO:384、SEQID NO:385或SEQ ID NO:386具有至少99％同一性的核酸序列。
72.一种使PAH蛋白在细胞中表达的方法，所述方法包括使所述细胞与根据权利要求1至71中任一项所述的ceDNA载体接触。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述细胞是感光细胞或视网膜色素上皮(RPE)细胞。
74.根据权利要求72或73所述的方法，其中所述细胞在体外或体内。
75.一种治疗患有苯丙酮尿症(PKU)的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1至71中任一项所述的ceDNA载体。
76.根据权利要求75所述的方法，其中编码至少一种PAH蛋白的所述至少一个核酸序列选自与表1A中所示的序列中的任一序列具有至少90％同一性的序列。
77.根据权利要求72至76中任一项所述的方法，其中与施用前所述受试者的血清苯丙氨酸水平相比，所述受试者表现出至少约50％的血清苯丙氨酸水平降低。
78.根据权利要求72至77中任一项所述的方法，其中与施用前的PAH活性水平相比，所述受试者在施用后表现出至少约10％的PAH活性增加。
79.根据权利要求72至78中任一项所述的方法，其中所述ceDNA载体被配制在脂质纳米粒子中。
80.根据权利要求72至79中任一项所述的方法，其中所述ceDNA载体被静脉内施用。
81.根据权利要求72至79中任一项所述的方法，其中所述ceDNA载体被肌肉内施用。
82.根据权利要求72至79中任一项所述的方法，其中所述ceDNA载体通过输注施用。
83.一种药物组合物，包含根据权利要求1至71中任一项所述的ceDNA载体。
84.一种组合物，包含根据权利要求1至71中任一项所述的ceDNA载体和脂质。
85.根据权利要求84所述的组合物，其中所述脂质为脂质纳米粒子(LNP)。
86.一种试剂盒，包含根据权利要求1至71中任一项所述的ceDNA载体、根据权利要求83所述的药物组合物或者根据权利要求84或85所述的组合物。
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