JP2022031637A

JP2022031637A - 神経変性疾患、例えばとりわけ、パーキンソン病およびハンチントン病の治療における、ａａｖ／ｕｐｒ－プラスウイルス、ｕｐｒ－プラス融合たんぱく質、遺伝子治療、およびその使用

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Publication number: JP2022031637A
Application number: JP2021171510A
Authority: JP
Inventors: フロレス，クラウディオアンドレスヘッツ; Andres Hetz Flores Claudio; ゴメス，レネルイヴィダル; Lius Vidal Gomez Rene
Original assignee: Universidad de Chile
Current assignee: Universidad de Chile
Priority date: 2015-11-04
Filing date: 2021-10-20
Publication date: 2022-02-22
Anticipated expiration: 2036-11-04
Also published as: CL2015003242A1; EP3372249B1; EP3372249A1; US20190309324A1; JP2018536432A; EP3372249A4; US20210079424A1; US11795476B2; EP3372249C0; AU2016348759A1; US10889831B2; JP7357039B2; WO2017075729A1; AU2016348759B2; JP6965254B2

Abstract

【課題】中枢神経系（ＣＮＳ）のニューロンにおいて、ＸＢＰ１ｓ、リンカーペプチド、およびＡＴＦ６ｆの間の融合たんぱく質を過剰発現する、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の使用を介して、特に神経変性疾患の治療において、医学分野に適用され、神経変性問題、好ましくはパーキンソン病およびハンチントン病を回復および改善する方法を提供する。【解決手段】細胞をアデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）と接触させることを含む、たんぱく質のミスフォールディングまたは凝集を低下させる方法であって、ＡＡＶは、融合たんぱく質をコードする目的のポリヌクレオチドと動作可能に結合するプロモーターを含む転写の調節領域を含む発現カセットを含み、融合たんぱく質がＸＢＰ１ｓ、ＡＴＦ６ｆ、および架橋またはリンカー配列を含む、前記方法。【選択図】図１４

Description

本発明の技術分野
本発明は、中枢神経系（ＣＮＳ）のニューロンにおいて、ＸＢＰ１ｓ、リンカーペプチ
ド、およびＡＴＦ６ｆの間の融合たんぱく質を過剰発現する、アデノ随伴ウイルス（ＡＡ
Ｖ）の使用を介して、特に神経変性疾患の治療において、医学分野に適用され、神経変性
問題、好ましくはパーキンソン病およびハンチントン病を回復および改善する。

背景技術およびその記載
ＣＮＳ疾患に関する科学研究は、近年、特に認知および運動疾患に関連する疾患に大き
な関心を集めている。神経変性問題に関連する疾患の治療は、現在、症状を軽減するため
の遺伝子治療アプローチを有していない。

これらの運動および認知疾患の治療のための研究において、ＸＢＰ１およびＡＴＦ６と
呼ばれる２つの転写因子が同定されている。これらは、たんぱく質フォールディングおよ
び凝集プロセスを改善するための生物学的および分子的メカニズムに関与している。主に
、新しい融合たんぱく質は、たんぱく質フォールディングを改善することに関与する遺伝
子クラスターの転写を活性化することを目的としている。そして、シャペロンのようなた
んぱく質フォールディングに関与する特定の遺伝子の転写を再プログラミングすることに
よって、これらの凝集を減少させる。たんぱく質凝集の現象は、神経変性疾患における共
通の特徴であり、選択的神経細胞死の原因である。

今日の既存の薬理療法は、これらの疾患に罹患した患者の症状を軽減することに焦点を
当てており、ニューロンの選択的な死を止めることができないため、対症的でしかない。
これらは一般的に、脳の正しい機能を保証する基礎的な神経細胞群の死により、変化した
神経伝達物質のレベルを調節する薬理療法からなる。このタイプの治療の例として、パー
キンソン病患者へのＬ－ドーパおよびその薬理学的誘導体の投与がある。この化合物は、
患者のドーパミンレベルを回復することができるが、この疾患を引き起こすドーパミン作
動性ニューロンの選択的な死を止めるものではない。現在の提唱されているものは、遺伝
子療法を用いた神経細胞の死滅を抑制し、このタイプの病態のための効果的かつ決定的な
治療法を提供することに焦点を当てている。

ハンチントン病のような神経運動疾患に関連するその他の病態が存在するが、その処置
は限られているか存在していない。この疾患は、ハンチンチンたんぱく質をコードする、
ＩＴ１５遺伝子の突然変異によって引き起こされる優性遺伝性神経変性の病態である。突
然変異は、線条体領域の中型有刺ニューロン（ＭＳＮ）にたんぱく質凝集体を生成する、
たんぱく質のＮ末端におけるポリグルタミンセグメントの拡大をもたらす。これは、神経
変性、ならびに随意筋運動調節の進行性消失（舞踏病）、精神症状、および認知症のよう
な疾患に特徴的な症状を誘発する（Atwal、２００７）。

今日まで、合成融合たんぱく質の使用に関する提案は、概して対処されていない。ＸＢ
Ｐ１、ｅＩＦ２α、Ｓ５１Ａ、およびＡＴＦ（スプライシングによる欠失後形態）を別々
にコードする組換えたんぱく質の形成を指し示す、国際公開第２００４／１１１１９４号
および同第２００６／０２８８８９号のような特許公報が存在するが、融合たんぱく質と
してではないし、単一の構築物において神経変性疾患の調節の改善を最適化しようとする
ものでもない。一方、米国特許第２０１３１９７０２３号に提示されているように、細胞
恒常性を維持するために必要とされる小胞体（ＥＲ）のフォールディング能力の増加と相
関する、ＸＢＰ１の内在的減少を指す個々の文献が存在する。ＸＢＰ１発現のこの個々の
負の調節は、国際特許出願第２０１０／００８８６０号にて出願されているように、ハン
チントン病および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）における神経保護の発生に関与している
。

転写制御因子ＸＢＰ１が関与する小胞体ストレスの測定に関する別の関連特許は、日本
国特許第２００７１２９９７０号である。

一般に、この開発は、パーキンソン病およびハンチントン病のような神経変性疾患の治
療のためのＸＢＰ１ｓ、リンカーペプチド、およびＡＴＦ６ｆに適合する新規のペプチド
の合成および生存率を指すが、これらのみに限定されるものではない。

このアプローチに近づく特許のひとつは、組換えウイルスＡＡＶ／ＸＢＰ１Ｓ－ＨＡに
よって記憶を改善するための遺伝子治療方法を提示する、チリ特許出願第３５９０－２０
１４号である。この治療はＸＢＰ１ｓ－ＨＡペプチドを認知機能の改善に近づけるが、疾
患の治療には役立たない。他方で、ＸＢＰ１ｓをその構成要素内に有する機能的融合たん
ぱく質の話はない。

発明の概要
最近の研究は、ＥＲ（小胞体）におけるたんぱく質恒常性の慢性的変化が、とりわけ、
アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症などのたんぱ
く質フォールディング障害に関連する、事実上すべての神経変性疾患において観察される
、横断的病理学的事象であることを示している。

異なる状態では、小胞体の内腔におけるたんぱく質合成およびフォールディングプロセ
スが妨害され、ミスフォールドしたたんぱく質の異常な蓄積がもたらされる。小胞体スト
レスと呼ばれるこの状態は、特定の突然変異体たんぱく質の発現によって、ならびにたん
ぱく質合成および成熟のプロセスにおける変化によって促進され得る。この現象に応じて
、ＵＰＲと呼ばれる統合された細胞内シグナル伝達カスケードが活性化される。ＵＰＲの
活性化は、たんぱく質恒常性に全体的な影響を及ぼす遺伝子発現において異なる変化をも
たらし、例えば、以下に起因する異常凝集およびたんぱく質ミスフォールディングのレベ
ルを低下させる：
（ｉ）シャペロンおよびフォールダーゼ（foldase）の発現の増加；
（ｉｉ）たんぱく質品質管理の改善；および、
（ｉｉｉ）欠陥たんぱく質の大量除去。

ＵＰＲの第１の目的は、たんぱく質平衡を回復させ、細胞生存率を維持することである
。しかしながら、慢性的な小胞体ストレスは、いくつかの神経変性病態において観察され
る現象である、アポトーシスによる細胞死をもたらす。

第１のＵＰＲ段階は、以下の３つの小胞体「ストレスセンサー」によって媒介される：
（１）ＰＥＲＫ（小胞体キナーゼなどの二本鎖ＲＮＡ活性化プロテインキナーゼ［Ｐ
ＫＲ］）；
（２）ＡＴＦ６（活性化転写因子６）；および、
（３）ＩＲＥ１（イノシトール要求キナーゼ１）。

これらのセンサーの各々は、特定の転写因子を制御することによって、小胞体内腔の折
り畳み状態に関する情報を核に伝達するが、ここでＸＢＰ１（Ｘ－Ｂｏｘ結合たんぱく質
－１）が目立つ。ＸＢＰ１は、その他のプロセスの中でも、たんぱく質の品質管理、フォ
ールディングに関与する一連の遺伝子を制御する。これらの３つの適応経路は、たんぱく
質恒常性および細胞生存を維持しながら、一斉に作用する。ＡＴＦ６およびＸＢＰ１依存
性応答とは異なり、ＰＥＲＫセンサーによって媒介されるシグナル伝達もまた、アポトー
シス促進効果と関連している。これらの以前の定義は、これらの反応を測定するための新
規の動物モデルの設計に加えて、神経変性疾患の治療におけるＵＰＲの影響を定義するた
めにこのプロジェクトの開発に協力してきた。

以前の証拠によると、ＸＢＰ１機能の増加は、３つの神経変性疾患：ハンチントン病、
パーキンソン病、および筋萎縮性側索硬化症の動物モデルにおける神経変性プロセスを遅
らせるということが記載されている。一方で、パーキンソン病の前臨床モデルにおいて、
ＡＴＦ６転写因子欠損が神経細胞死に対する抵抗性の喪失を引き起こすこともまた決定さ
れている。これらの前例は、有毒なたんぱく質凝集体の形成による神経変性過程における
、これらの転写因子の重要性を示している。したがって、UPRplus（商標）は、ＸＢＰ１
、ＡＴＦ６、およびリンカーペプチドのようなＵＰＲの２つの活性成分の融合に基づく。

現在、ＵＰＲｐｌｕｓが開発され、ＵＰＲに関連する遺伝子群（クラスター）の特異的
転写活性が示されている。ＵＰＲｐｌｕｓは融合たんぱく質であり、潜在的にニューロン
中の有毒なたんぱく質凝集物の負荷を軽減するプロセスに関与することができる。

本発明の第１の態様は、中枢神経系におけるＵＰＲｐｌｕｓのニューロン過剰発現を誘
発するウイルスを用いた、哺乳類、好ましくはヒトにおける認知プロセスおよび運動プロ
セスにおける神経変性疾患の治療方法に関する。

本発明の第２の態様は、認知プロセスおよび運動プロセスにおける神経変性疾患を治療
する方法を提供する。本方法は、患者または対象の血液脳関門を過ぎて脳内にウイルスを
導入する、静脈内、および／または腹腔内、および／または頭蓋内、および／または髄内
、および／または鼻腔内、および／または神経内、および／またはあらゆる経路を包含す
る。ウイルスは、個体あたり１×１０⁶～１×１０³⁰ウイルス単位の用量範囲でＵＰＲｐ
ｌｕｓのニューロン過剰発現を誘導する。

本発明の第３の態様は、神経変性疾患の治療におけるその使用のための、静脈内、およ
び／または腹腔内、および／または頭蓋内、および／または髄内、および／または鼻腔内
、および／または神経内医薬組成物、および／または血液脳関門を通過し、上述で記載さ
れたものと同じ投与量範囲を有し、脳へのＵＰＲｐｌｕｓのニューロン過剰発現を誘導す
るウイルスを伝導するあらゆる形態と、薬学的に許容可能なビヒクルとの形態である。

本発明の第４の態様は、神経変性疾患の認知および運動能力の治療に有用な薬物を調製
するために使用できるため、ＵＰＲｐｌｕｓおよびそのたんぱく質由来化合物のニューロ
ン過剰発現を誘導するウイルスの使用である。

本発明の第５の態様は、バクテリア大腸菌に含有される、表Ｉに記載のヌクレオチド配
列またはその変種のいずれかを有するウイルスの配列およびインサートを伴うアデノ随伴
ウイルス（ＡＡＶ）であり、哺乳類、好ましくはヒトにおいて、ＵＰＲｐｌｕｓの神経転
写因子の代わりに、これをコードするかまたは過剰発現する、中枢神経系または断片のあ
らゆる変異体において、国際生物学寄託機関である、Instituto de Investigaciones Agr
opecuarias de Chile（チリ農業研究所、ＩＮＩＡ）に寄託番号第ＲＧＭ２２３５号とし
て寄託された、ＸＢＰ１ｓ－ＬＦＧ－ＡＴＦ６ｆ（ＵＰＲ－プラス５）神経転写因子が過
剰発現しているプラスミドで翻訳される。

本発明の第６の態様は、バクテリア大腸菌に含有される、表ＩＩに記載のヌクレオチド
配列またはその変種のいずれかを有するウイルスの配列およびインサートを伴うアデノ随
伴ウイルス（ＡＡＶ）であり、国際生物学寄託機関である、Instituto de Investigacion
es Agropecuarias de Chile（ＩＮＩＡ）に寄託番号第ＲＧＭ２２３４号として寄託され
たプラスミドで形質転換され、ここで、哺乳類、好ましくはヒトにおいて、ＸＢＰ１ｓ－
ＬＦ－ＡＴＦ６ｆ（ＵＰＲ－プラス４）神経転写因子またはＵＰＲｐｌｕｓの神経転写因
子の代わりに、この代替物をコードするかまたは過剰発現する断片のあらゆる変種が、好
ましくは中枢神経系において、過剰発現する。

本発明の第７の態様は、バクテリア大腸菌に含有される、表ＩＩＩに記載のヌクレオチ
ド配列またはその変異体のいずれかを有するウイルスの配列およびインサートを伴うアデ
ノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であり、国際生物学寄託機関である、Instituto de Investiga
ciones Agropecuarias de Chile（ＩＮＩＡ）に寄託番号第ＲＧＭ２２３６号として寄託
されたプラスミドで形質転換されており、哺乳類、好ましくはヒトにおいて、ＸＢＰ１ｓ
－Ｌ４Ｈ４－ＡＴＦ６ｆ（ＵＰＲ－プラス６）神経転写因子または、ＵＰＲｐｌｕｓの神
経転写因子の代わりにこの代替物をコードするかまたは過剰発現する断片のあらゆる変異
体が、好ましくは中枢神経系で、過剰発現する。

本発明の第８の態様は、バクテリア大腸菌に含有される、表ＩＶに記載のヌクレオチド
配列またはその変異体のいずれかを有するウイルスの配列およびインサートを伴うアデノ
随伴ウイルス（ＡＡＶ）であり、国際生物学寄託機関である、Instituto de Investigaci
ones Agropecuarias de Chile（ＩＮＩＡ）に寄託番号第ＲＧＭ２２３２号として寄託さ
れたプラスミドで形質転換されており、哺乳類、好ましくはヒトにおいて、、ＡＴＦ６ｆ
－ＬＦＧ－ＸＢＰ１ｓ（ＵＰＲ－プラス２）神経転写因子、またはＵＰＲｐｌｕｓの神経
転写因子の代わりに、この代替物をコードするかまたは過剰発現する断片のあらゆる変異
体が、好ましくは中枢神経系で、過剰発現する。

本発明の第９の態様は、バクテリア大腸菌に含有される、表Ｖに記載のヌクレオチド配
列またはその変異体のいずれかを有するウイルスの配列およびインサートを伴うアデノ随
伴ウイルス（ＡＡＶ）であり、国際生物学寄託機関である、Instituto de Investigacion
es Agropecuarias de Chile（ＩＮＩＡ）に寄託番号第ＲＧＭ２２３３号として寄託され
たプラスミドで形質転換されており、哺乳類、好ましくはヒトにおいて、、ＡＴＦ６ｆ－
Ｌ４Ｈ４－ＸＢＰ１ｓ（ＵＰＲ－プラス３）神経転写因子、またはＵＰＲｐｌｕｓの神経
転写因子の代わりに、この代替物をコードするかまたは過剰発現する断片のあらゆる変異
体が、好ましくは中枢神経系で、過剰発現する。

本発明の第１０の態様は、バクテリア大腸菌に含有される、表ＶＩに記載のヌクレオチ
ド配列またはその変異体のいずれかを有するウイルスの配列およびインサートを伴うアデ
ノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であり、国際生物学寄託機関である、Instituto de Investiga
ciones Agropecuarias de Chile（ＩＮＩＡ）に寄託番号第ＲＧＭ２２３１号として寄託
されたプラスミドで形質転換されており、哺乳類、好ましくはヒトにおいて、、ＡＴＦ６
ｆ－ＬＦ－ＸＢＰ１ｓ（ＵＰＲ－プラス１）神経転写因子、またはＵＰＲｐｌｕｓの神経
転写因子の代わりに、この代替物をコードするかまたは過剰発現する断片のあらゆる変異
体が、好ましくは中枢神経系で、過剰発現する。

微生物寄託
プラスミドｐＡＡＶ＿ＡＴＦ６ｆ－ＬＦＧ－ＸＢＰ１ｓ－ＨＡは、寄託番号第ＲＧＭ２
２３２号として、国際生物寄託機関である、Instituto de Investigaciones Agropecuari
as de Chile（ＩＮＩＡ）に、２０１５年１０月７日に寄託された。

プラスミドｐＡＡＶ＿ＡＴＦ６ｆ－ＬＦ－ＸＢＰ１ｓ－ＨＡは、寄託番号第ＲＧＭ２２
３１号として、国際生物寄託機関である、Instituto de Investigaciones Agropecuarias
de Chile（ＩＮＩＡ）に、２０１５年１０月７日に寄託された。

プラスミドｐＡＡＶ＿ＡＴＦ６ｆ－Ｌ４Ｈ４－ＸＢＰ１ｓ－ＨＡは、寄託番号第ＲＧＭ
２２３３号として、国際生物寄託機関である、Instituto de Investigaciones Agropecua
rias de Chile（ＩＮＩＡ）に、２０１５年１０月７日に寄託された。

プラスミドｐＡＡＶ＿ＸＢＰ１ｓ－ＬＦＧ－ＡＴＦ６ｆ－ＨＡは、寄託番号第ＲＧＭ２
２３５号として、国際生物寄託機関である、Instituto de Investigaciones Agropecuari
as de Chile（ＩＮＩＡ）に、２０１５年１０月７日に寄託された。

プラスミドｐＡＡＶ＿ＸＢＰ１ｓ－ＬＦ－ＡＴＦ６ｆ－ＨＡは、寄託番号第ＲＧＭ２２
３４号として、国際生物寄託機関である、Instituto de Investigaciones Agropecuarias
de Chile（ＩＮＩＡ）に、２０１５年１０月７日に寄託された。

プラスミドｐＡＡＶ＿ＸＢＰ１ｓ－Ｌ４Ｈ４－ＡＴＦ６ｆ－ＨＡは、寄託番号第ＲＧＭ
２２３６号として、国際生物寄託機関である、Instituto de Investigaciones Agropecua
rias de Chile（ＩＮＩＡ）に、２０１５年１０月７日に寄託された。

発明の詳細な説明
本発明は、本明細書に記載の特定の方法論、複合体、材料、製造技術、使用、および適
用に限定されず、これらは変更してもよいことに留意されたい。また、本明細書で使用さ
れる用語は、特定の表現を説明するだけの目的のために使用され、本発明の見方および可
能性を制限することを意図するものではないことも、理解されるべきである。

特許請求の範囲および本文を通して表されるような単数形の使用および方法は、明確に
単数形であること示す文脈でない限り、複数形を排除しないことに留意されたい。したが
って、例えば、「使用または方法」への言及は、１つ以上の使用または方法への言及であ
り、主題（技術）の知識がある者に周知である均等物が包含される。同様に、別の例とし
て、「１つのステップ」、「１つのステージ」、または「１つのモード」への言及は、１
つ以上のステップ、ステージ、またはモードへの言及であり、暗示的および／または結果
的に、サブステップ、サブステージ、またはサブモードを包含し得る。

すべての接続詞は、可能な限り、最小限に制限的、かつ最大限に包括的に理解されるべ
きである。したがって、例えば、接続詞「または（or）」は、その正統的な論理的意味で
理解されるべきであり、文脈または本文が明白にこれを必要とするかまたは示さない限り
、「または除く」として理解されるべきではない。本明細書に記載の構造、材料、および
／または要素は、無限かつ網羅的な列挙を避けるための、機能的等価物への参照として理
解されるべきである。

近似または概念化を示すために使用される表現は、文脈が異なる解釈を必要としない限
り、本明細書で述べるように理解されるべきである。

本明細書で使用されるすべての名称、ならびに技術的および／または科学的用語は、特
に明確な断りのない限り、これらの事項において資格を有する共通の人間によって与えら
れた、共通の意味を有する。

方法、技術、要素、化合物、および組成物を記載するが、記載されたこれらと同様およ
び／または等価である方法、技術、化合物、および組成物が、実際におよび／または本発
明のための試験において、使用されるか、または好ましくともよい。

全ての特許およびその他の刊行物、例えば、本発明に関連して有用であり得るそのよう
な刊行物に記載されている方法論は、説明および／または通知のために相互参照されてい
る。

これらの刊行物は、本特許出願の登録日に先立って、事前の特許情報のためにのみ包含
される。

この点に関して、著者および／または発明者が権利を有しないか、もしくはそのような
刊行物がそれ以前の刊行物に基づき日付を記入されているか、またはその他のあらゆる理
由によって、承認または受諾、拒絶または除外と解釈されることがあってはならない。

本発明は、血清型ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、
ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、および偽型ＡＡＶに基づき、ならびに中枢神経系への遺伝子導
入を効率的に媒介することができるアデノ随伴ウイルスに由来するベクターを記載する。

これらのベクターの全身投与はまた、脳および脊髄の両方への効率的な遺伝子供給をも
たらす。本発明は、ＵＰＲｐｌｕｓ転写因子プロモーターの近位領域を有するＡＡＶ２ベ
クターが、脳および脊髄における因子のクラスターにおいて非特異的応答の生成を可能に
することを主張する。特に、異種遺伝子ＸＢＰ１ｓおよびＡＴＦ６ｆがＣＭＶプロモータ
ーの制御下にある一連の発現カセットを含んでなる、ＡＡＶ２ベクターの局所投与は、神
経変性媒介性疾患に罹患している個体における運動および認知能力を改善する。（図１６
および１７、ならびに図１７）。

I.一般的な用語および表現の定義
本明細書で使用される用語「アデノ随伴ウイルス」、「ＡＡＶウイルス」、「ＡＡＶビ
リオン」、「ＡＡＶウイルス粒子」、および「ＡＡＶ粒子」は、互換性がある。これらは
、少なくとも１つのＡＡＶカプシドたんぱく質（好ましくは、特定のＡＡＶ血清型の全カ
プシドたんぱく質）、および１つのカプセル化ＡＡＶゲノムポリヌクレオチドからなるウ
イルス粒子を指す。粒子がＡＡＶの末端逆位配列に隣接する異種ポリヌクレオチド（すな
わち、哺乳類細胞に送達される導入遺伝子のような天然型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレ
オチド）を含んでなる場合、典型的には「ＡＡＶ粒子ベクター」または「ＡＡＶベクター
」と呼ばれる。ＡＡＶとは、パルボウイルス科のディペンドウイルス属に属するウイルス
を指す。ＡＡＶゲノムはおよそ４．７キロベース長であり、陽性または陰性として数える
ことができる一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）からなる。ゲノムは、ＤＮＡ鎖の両
端に末端逆位配列（ＩＴＲ）、ならびに２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）
であるＲＥＰおよびＣＡＰ（レプリカーゼおよびカプシド）を含んでなる。ＲＥＰフレー
ムワークは、ＡＡＶのライフサイクルに必要とされるＲＥＰたんぱく質（ＲＥＰ７８、Ｒ
ＥＰ６８、ＲＥＰ５２、およびＲＥＰ４０）をコードする、４つの重なり合う遺伝子から
なる。ＣＡＰフレームは、相互に作用して正二十面体対称カプシドを形成する、２０個の
カプシドたんぱく質配列：ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の重なり合うヌクレオチドを含
有する。

本明細書で使用する用語「アデノ随伴ＩＲＴウイルス」または「ＡＡＶＩＴＲ」とは
、アデノ随伴ウイルスゲノムのＤＮＡ鎖の両端に存在する反復逆位末端を指す。ＩＲＴ配
列は、ＡＡＶゲノムの効率的な増殖に必要である。これらの配列の別の特性は、フォーク
を形成する能力である。この特徴は、第２のＤＮＡ鎖の独立した一次合成を可能にする、
自己複製に寄与する。ＩＲＴはまた、宿主細胞ゲノムへの天然ＡＡＶＤＮＡの組み込み
、および宿主細胞のレスキュー、ならびにＡＡＶＤＮＡの効果的なカプセル化と完全な
アセンブリの生成の両方に必要であることが判明した。

本発明で使用される用語「ＡＡＶ２」とは、次のウェブサイトにあるＧｅｎＢａｎｋア
クセス番号第ＡＦ０４３３０３．１番で定義されるゲノム配列を有する、アデノ随伴ウイ
ルスの血清型２を指す：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF043303.1。

現在、ベクターとして使用できる約１１のヒトＡＡＶ血清型および約１００の霊長類Ａ
ＡＶ血清型が報告されている。各血清型は、安定性、生産性、免疫原性、バイオアベイラ
ビリティ、指向性などに関して、利点および欠点を示す。しかしながら、多くの研究室は
、異なる血清型の利点を得るため、またはいくつかの血清型のいくつかのカバーたんぱく
質の欠点を避けるために、擬似的な典型的ベクター、すなわち、異なる血清型のカバーた
んぱく質を含有する改変ＡＡＶを開発している。例として、２つのウイルス血清型の特徴
が混合されているＡＡＶ２／６ウイルスが、本発明において時には使用される。

本発明で使用される用語「ＡＡＶベクター」はまた、ＡＡＶ末端反復配列（ＩＴＲ）に
隣接する１つ以上の目的のポリヌクレオチド（または導入遺伝子）を含んでなるベクター
を指す。そのようなＡＡＶベクターは、それらがＲＥＰおよびＣＡＰ遺伝子（すなわち、
ＲＥＰおよびＣＡＰＡＡＶたんぱく質）をコードし、発現するベクターで形質移入され
た宿主細胞中に存在する場合、複製して感染性ウイルス粒子にパッケージングすることが
でき、宿主細胞は、Ｅ４ｏｒｆ６アデノウイルスリーディングフレーム由来のたんぱく質
をコードし、発現するベクターで形質移入されている。ＡＡＶベクターがより大きなポリ
ヌクレオチド（例えば、染色体、またはクローニングもしくは形質移入に使用されるプラ
スミドなどのその他のベクター）に組み込まれる場合、ＡＡＶベクターは典型的には「プ
ロベクター（pro-vector）」と呼ばれる。プロベクターは、ＡＡＶパッケージング機能、
およびＥ４ｏｒｆ６によって提供される必要な補助機能の存在下で、複製およびカプセル
化によって「レスキュー」することができる。

ＡＡＶベクターの血清型は、各血清型の指向性を与えられた導入遺伝子を発現する細胞
型の特異性を提供する。

本発明において使用される用語「ＵＰＲｐｌｕｓ転写調節領域の特異的結合部位」とは
、プロモーターとして働く（すなわち、選択された核酸配列の発現を調節し、プロモータ
ーに作動的に結合する）核酸配列を指し、これは、ニューロンのような特定の組織細胞に
おいて選択された核酸配列の発現に影響を及ぼす。神経組織転写の調節エレメントの特異
的結合部位は、構成的または誘導的であり得る。

本発明で使用される用語「ＣＡＰ遺伝子」または「ＡＡＶＣＡＰ遺伝子」とは、ＣＡ
Ｐたんぱく質をコードする遺伝子を指す。本明細書で使用する用語「ＣＡＰたんぱく質」
とは、天然ＡＡＶ（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）のＣＡＰたんぱく質の少なくとも１つの機
能活動の活性を有するポリペプチドを指す。ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３たんぱく質の
機能活動の例として、カプシド形成を誘導する能力、単鎖ＤＮＡ蓄積を促進する能力、カ
プシドへのＡＡＶＤＮＡのパッケージング（すなわち、カプセル化）を促進する能力、
細胞受容体に結合する能力、および宿主へウイルスを侵入させる能力が挙げられる。

本発明で使用される用語「カプシド」とは、ウイルスゲノムがパッケージングされた構
造を指す。カプシドは、ＣＡＰたんぱく質の構造サブユニットを有するオリゴマー構造か
らなる。例えば、ＡＡＶは、３つのカプシドたんぱく質：ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３
の相互作用によって形成される、正二十面体のカプシドを有する。

本明細書で使用する用語「細胞組成物」とは、本発明の細胞および少なくとも１つのそ
の他の成分を含んでなる、複合型材料を指す。組成物は、単一の製剤として製剤化されて
もよく、または各成分の別々の製剤として提供されてもよく、組み合わせ製剤としての併
用のために組み合わせてもよい。組成物は、各成分が個々に製剤化され包装される部品キ
ットであってもよい。

本発明において使用される用語「構成的プロモーター（constituent promoter）」とは
、細胞の環境および外部条件についてほとんどまたは全く考慮せずに、生物体全体にわた
ってまたはほとんどの実験段階で、比較的一定のレベルで活性が維持されるプロモーター
を指す。

本明細書で使用される用語「発現カセット」とは、標的細胞へ特定の核酸を転写するこ
と可能にする、核酸に特異的な一連の要素と、合成的にまたは組換えによって生成された
、核酸の構築を指す。

本明細書で使用される用語「支持機能を提供する遺伝子」とは、ポリペプチドをコード
し、複製に依存するＡＡＶ上の機能（すなわち、「支持機能」）を実施する遺伝子を指す
。補助機能は、ＡＡＶ遺伝子転写の活性化、ＡＡＶｍＲＮＡスプライシングの特異的段
階、ＡＡＶＤＮＡ複製、ＣＡＰ産物の合成、およびＡＡＶカプシドアセンブリに関与す
るこれらの断片を包含する、ＡＡＶ複製に必要な機能を包含する。アクセサリーウイルス
機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、およびワクシニアウイル
スのような既知の補助ウイルスのいずれかから得ることができる。補助機能には、ＷＨＶ
レンチウイルスが包含されるが、これに限定されない。

本明細書に記載されているように、用語「作動的に連結された」とは、目的のポリヌク
レオチドに関するプロモーター配列の機能的関係および位置を指す（例えば、プロモータ
ーまたはエンハンサーは、その配列の転写に影響を及ぼすコード配列に作動的に連結され
ている）。一般に、作動的に連結されたプロモーターは、目的の配列に隣接している。し
かしながら、エンハンサーは、その発現を制御するために目的の配列に隣接する必要はな
い。

本明細書で使用される用語「局所投与される」とは、本発明のポリヌクレオチド、ベク
ター、ポリペプチド、および／または医薬組成物が、特定の部位またはその近くで、対象
に投与されることを意味する。

用語「医薬的に許容可能な担体」、「薬学的に許容可能な希釈剤」、「薬学的に許容可
能な賦形剤」、または「薬学的に許容可能なビヒクル」は、本明細書において互換性があ
り、非毒性の固体、半固体、または充填液、希釈剤、もしくはカプセル化材料、またはあ
らゆる従来型の補助調合物である。薬学的に許容可能な担体は、その用量および濃度で使
用され、レシピエントに対して本質的に非毒性であり、製剤中のその他の成分と適合性で
ある。薬学的に許容可能なビヒクルの数および性質は、所望の投与方法に依存する。薬学
的に許容可能なビヒクルは公知であり、周知の技工法によって調製することができる。

本明細書で使用する用語「プロモーター」とは、ポリヌクレオチドの配列の上流に位置
する１つ以上のポリヌクレオチドの転写を制御する核酸を指し、ＲＮＡポリメラーゼ依存
性ＤＮＡ結合部位、転写開始部位、ならびに転写因子結合部位、リプレッサー、および活
性化因子たんぱく質結合部位を包含するがこれに限定されないあらゆるその他のＤＮＡ配
列、ならびにプロモーターからの転写量を調節するように直接または間接的に作用する技
術で知られているあらゆるその他のヌクレオチド配列の存在により、構造的に同定される
。「組織特異的」プロモーターは、特定のタイプの分化した細胞または組織においてのみ
活性化される。

本明細書で使用する用語「ポリヌクレオチド」とは、デオキシリボヌクレオチドまたは
リボヌクレオチドをそれぞれ含有する、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかの核酸分子を指す
。核酸は、二本鎖、一本鎖であってもよく、二本鎖または一本鎖の配列のいずれかの一部
を含有していてもよい。用語「ポリヌクレオチド」は、これらに限定されないが、ポリペ
プチドをコードする能力を有する核酸配列、および転写後にその様式で処理された細胞ま
たは対象の内因性ポリヌクレオチドに部分的または完全に相補的である核酸配列を包含し
、内因性ポリヌクレオチド発現をハイブリダイズし、阻害することができるＲＮＡ分子（
例えば、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）を生成する。

本明細書中で使用される場合、用語「架橋またはリンカー」とは、目的の配列の物理的
分離を可能にする、連続的または非連続的なポリヌクレオチド配列を指し、目的の配列を
物理的に分離し、それらを翻訳および転写できるように適切な様式で配置することを可能
にすることができる。

本明細書中の用語「ストリング」とは、連続したヌクレオチドの配列（修飾された天然
または非天然のヌクレオチドを含むか、または含まない）を指す。２つ以上の鎖は、別個
の分子であるか、もしくは別個の分子の一部であってもよく、または、例えばカップリン
グによって共有結合的に相互連結されて（例えば、ポリエチレングリコールなどのリンカ
ー）、分子を形成してもよい。鎖の少なくとも１本は、標的ＲＮＡに対して充分に相補的
な領域を含有し得る。

アンチセンス鎖に対する相補的領域を含むｄｓＲＮＡ剤の第２鎖は、「センス鎖」と呼
ばれる。しかしながら、ｓｉＲＮＡ剤はまた、少なくとも部分的に自己相補的であり、例
えば、ヘアピンまたはボタンホールの構造を形成し、二本鎖領域を包含する、単一ＲＮＡ
分子から形成することもできる。後者は、以下、短鎖ヘアピンＲＮＡまたはｓｈＲＮＡと
呼ばれる。そのような場合、用語「鎖」とは、同じＲＮＡ分子の別の領域に相補的なＲＮ
Ａ分子の領域の１つを指す。

本明細書で使用する用語「組換えウイルスゲノム」とは、少なくとも１つの非発現ポリ
ヌクレオチドカセットが天然のＡＡＶゲノムに挿入されているＡＡＶゲノムを指す。

本明細書で使用される用語「ｒｅｐ遺伝子」または「ＡＡＶｒｅｐ遺伝子」とは、Ｒ
ｅｐたんぱく質をコードする遺伝子を指す。本明細書で使用される用語「Ｒｅｐたんぱく
質」とは、天然のＡＡＶｒｅｐたんぱく質（例えば、Ｒｅｐ４０、５２、６８、７８）
の少なくとも１つの機能活動を有するポリペプチドを指す。Ｒｅｐたんぱく質（例えば、
Ｒｅｐ４０、５２、６８、７８）の「機能活動」は、たんぱく質の生理学的機能に関連す
るあらゆる活動であり、ＡＡＶＤＮＡ複製の開始点の認識、結合、および切断によるＤ
ＮＡ複製の促進、ならびにＤＮＡのらせん活性を包含する。さらなる機能には、ＡＡＶ転
写（またはその他の異種）プロモーターの調節、および宿主染色体へのＡＡＶＤＮＡの
部位特異的組込みが包含される。

本明細書で使用する用語「対象」とは、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、チンパンジーま
たはその他の類人猿、およびその他の猿種）、動物（例えば、鳥、魚、家畜、ヒツジ、ブ
タ、ヤギ、およびウマ）、哺乳類（例えば、イヌおよびネコ）、または実験動物（例えば
、マウス、ラット、サイレンシングされた遺伝子を有するマウス（ノックアウトマウス）
、遺伝子を過剰発現するマウス（トランスジェニックマウス）、およびモルモットなどの
げっ歯類）を指す。この用語は、特定の年齢または性別を示すものではない。「対象」と
いう用語には、胚および胎児が包含される。

本明細書で使用される用語「全身投与される」および「全身投与」とは、本発明のポリ
ヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、または医薬組成物が、非局所形態で対象に投与
されることを意味する。本発明のポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、または医
薬組成物の全身投与は、対象の全身のいくつかの臓器もしくは組織に到達してもよく、ま
たは新たな特定の器官もしくは組織に到達してもよい。例えば、本発明の医薬組成物の静
脈内投与は、対象の２つ以上の組織または器官において形質導入をもたらし得る。

本明細書で使用する用語「転写調節エレメント」とは、１つ以上の遺伝子の発現を調節
することができる核酸フラグメントを指す。本発明のポリヌクレオチド調節エレメントは
、プロモーター、および随意にエンハンサーを包含する。

本明細書で使用される用語「形質導入」という用語は、外来ヌクレオチドの配列を細胞
に導入してウイルスベクターにするプロセスを指す。

この文書で使用される用語「形質移入」とは、標的真核細胞へのDNAの導入を指す。

本明細書で使用される用語「ベクター」とは、宿主細胞中の１つ以上の目的のポリヌク
レオチドを送達し、随意に発現させることができる構築物を指す。ベクターの例として、
これらに限定されないが、ウイルスベクター、ＤＮＡまたは裸のＲＮＡ発現ベクター、プ
ラスミド、コスミドまたはファージベクター、カチオン性縮合剤に関連するＲＮＡまたは
ＤＮＡ発現ベクター、リポソーム封入ＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、および例えば細
胞を産生するような特定の真核生物が挙げられる。ベクターは安定性であってもよく、自
己複製することができる。使用できるベクターの種類に制限はない。ベクターは、増殖に
好適であり、いくつかの異種生物に組み込まれたポリヌクレオチド、遺伝子構築物、また
は発現ベクターを得るのに好適である、クローニングベクターであってもよい。好適なベ
クターには、原核生物発現ベクター、ファージおよびシャトルベクター、ならびにウイル
スベクター（例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ならびにレトロウイルスおよ
びレンチウイルス）に基づく真核生物発現ベクター、ならびに、例えばｐＳｉｌｅｎｃｅ
ｒ４．１－ＣＭＶのような非ウイルスベクターが包含される。

本明細書において使用される用語「ＵＰＲｐｌｕｓ」とは、ＸＢＰ１ｓ、ＡＴＦ６ｆ、
プロモーター、連結または架橋配列、および同定のためのエピトープからなる配列を指す
。

本発明の方法および組成物（例えば、前述の挿入物を有するＡＡＶウイルスの方法およ
び組成物）は、本発明に記載のあらゆる用量および／または製剤、ならびに本発明に記載
されるあらゆる投与経路と共に使用することができる。

「認知および運動療法または治療スキル」という用語については、本発明で定義される
病態を有する、異なる種および／または対象に対して行われる認知および運動試験を指す
。

用語「ｃＤＮＡ」または「相補的ＤＮＡ」とは、ＲＴ－ＰＣＲ合成を形成するために使
用されるＲＮＡ配列を完全に補完するＤＮＡ配列を指す。

「標的遺伝子のサイレンシング」という語句は、薬剤と接触していない同様の細胞と比
較して、薬剤と接触していない場合の標的遺伝子の特定の産物を含有および／または発現
する細胞が、薬剤と接触した場合のそのような遺伝子の産物の少なくとも、１０％、２０
％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくはそれ以下を含
有および／または発現するプロセスを指す。この標的遺伝子産物は、例えば、メッセンジ
ャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、たんぱく質、または調節エレメントであってもよい。

本明細書において使用される用語「相補的」とは、化合物と標的ＲＮＡ分子との間で安
定した特異的結合が起こるほど充分な相補性を指す。特異的結合は、特異的結合が望まれ
る条件下、すなわちインビボ試験もしくは治療的処置の場合の生理学的条件下において、
またはインビトロ試験の場合、試験が実施されている条件下において、非標的配列へのオ
リゴマー化合物の非特異的結合を回避するのに充分な相補性を必要とする。

本明細書において使用される用語「制限部位」とは、前記配列のための特定の制限酵素
が結合され切断されるか、または分離される、ヌクレオチド配列を指す。

リガンド
その薬理学的特性を含有するウイルスの特性は、例えば、リガンドの導入によって影響
され、調整され得る。さらに、ウイルス剤の薬理学的特性は、リガンドを薬剤製剤および
ウイルスに組み込むことによって改善することができる。

リガンドは、ウイルス剤に結合するリガンドなどの多種多様な実体に結合させることが
できるか、またはコンジュゲートもしくは製剤添加物として使用することができる。例え
ば、リガンドに結合したモノマーサブユニットのビヒクルを用いて行うことができる。以
下の実施例は、リガンドに結合したモノマーサブユニットの文脈で記載されているが、こ
れは好ましいものであり、実体はウイルスの他の場所で結合することができる。

リガンドは、それが包埋されるウイルス剤の分布、方向、または寿命を変化させる。好
ましい様式において、リガンドは、前記リガンドが存在しない主と比較して、選択された
標的、例えば、例えば、分子、細胞、または細胞型、区画（細胞もしくは器官区画、組織
、または身体の領域など）に対してより良好な親和性を提供する。

本発明において、リガンドは、ウイルス中の標的分子の輸送、ハイブリダイゼーション
、および特異性を改善し得る。

リガンドは、一般に、例えば個体における分子の吸収を改善するための治療的改変剤、
例えば、分布を監視するための診断化合物またはリポーター群、架橋剤、免疫反応に抵抗
性を示す画分、および天然または珍しい核酸塩基を含有し得る。

一般例として、親油性分子、脂質、レクチン（例えば、ヘシゲニン（hecigenin）、ジ
オスゲニン）、テルペン（例えば、トリテルペン、サルササポゲニン、フリーデリン、エ
ピフリーデラノール（epifriedelanol）由来のリトコール酸）、ビタミン、炭水化物（例
えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン）、合成ポリマー（例えば、１５塩基
長のオリゴ乳酸）、および天然ポリマー（例えば、低および中分子量）、イヌリン、シク
ロデキストリン、またはヒアルロン酸）、たんぱく質、たんぱく質結合剤、インテグリン
結合分子、ポリカチオン、ペプチド、ポリアミンならびにペプチド模倣物が挙げられる。
その他の例として、上皮細胞または葉酸受容体リガンド、例えばトランスフェリンが挙げ
られる。

リガンドは、合成ポリマー（例えば、合成ポリアミノ酸）などの、天然に存在するか、
または組換えもしくは合成分子であり得る。ポリアミノ酸の例として、ポリリジン（ＰＬ
Ｌ）、ポリアスパラギン酸Ｌ－アスパラギン酸、ポリ酸Ｌ－グルタミン酸、マレイン酸の
スチレン無水物コポリマー、ジビニルエーテル無水マレイン酸のポリ（乳酸－グリコール
酸）コポリマー、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）－メタクリルアミド（ＨＭＰＡ）のコ
ポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルビニルアルコール（ＰＶＡ）
、ポリウレタン、ポリ（２－エチルアクリル酸）、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドポリ
マー、またはポリホスファゼンが挙げられる。ポリアミンの例として、ポリエチレンイミ
ン、ポリリシン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、偽ペプチドポリア
ミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロ
タミン、例えばカチオン性脂質、カチオン性ポルフィリンなどのカチオン性画分、ポリア
ミンの第４級塩、またはアルファ－ヘリックスペプチドが挙げられる。

リガンドはまた、甲状腺刺激ホルモン、メラノトロピン、界面活性たんぱく質Ａ、ムチ
ン炭水化物、グリコシル化ポリアミノ酸、ビスホスホネート、ポリグルタメート、ポリア
スパルテート、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐペプチド（ＲＧＤ）、もしくはＲＧＤペプチドの
模倣物などの、細胞または組織に対するステアリング剤を含有していてもよい。

リガンドは、たんぱく質、例えば、低密度リポたんぱく質（ＬＤＬ）などの糖たんぱく
質もしくはリポたんぱく質、または血清アルブミンなどのアルブミン、またはコリガンド
に対して特異的親和性を有する分子などのペプチド、または特定の細胞型に結合する抗体
などの抗体であってもよい。リガンドはまた、ホルモンおよびホルモン受容体も含み得る
。これらはまた、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクト
サミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン、多価マンノース、または多価フコースのような非
ペプチド種も含み得る。

リガンドは、例えば、細胞の細胞骨格、またはその微小管、微小線維、および/もしく
は中間径線維を改変することによって、細胞内のウイルス剤の吸収を増加させることがで
きる薬剤などの物質であってもよい。

ひとつの点では、リガンドは脂質であるか、または脂質ベースの分子である。この脂質
または脂質ベースの分子は、好ましくは、アルブミン血清のようなホエーたんぱく質に結
合される。

あるいは、ウイルスをパッケージングしてもよい。

注射可能なウイルス溶液の調製は、ＰＢＳ（生理食塩水緩衝液）中に必要なウイルス濃
度を希釈することにより実施され、以下のように処方される。

１．以下を有する８００ｍｌの蒸留水にウイルス用量（事前にＰＢＳで１倍に希釈した
もの）を溶解する：
８ｇのＮａＣｌ
０．２ｇのＫＣｌ
１．４４ｇのＮａ₂ＨＰＯ₄
０．２４ｇのＫＨ₂ＰＯ₄。
２．ｐＨをＨＣｌで７．４まで調節する。
３．追加の蒸留水Ｈ２Ｏを用いて量を１Ｌに設定する。
４．滅菌および高圧蒸気滅菌。

設計および選択
ＵＰＲｐｌｕｓ分子変種の作成。
本特許の目的の１つは、ＸＢＰ１ｓと呼ばれる活性型のＸＢＰ１、およびＡＴＦ６ｆと
呼ばれるＡＴＦ６の活性型の、ヒト配列から構成される組換えＤＮＡの６つの変種を作製
することである。ＵＰＲｐｌｕｓ変種は、その設計に２つの変数、すなわち、２つの配列
間のＸＢＰ１ｓおよびＡＴＦ６ｆ分子（ＸＢＰ１ｓ－ＡＴＦ６ｆおよびＡＴＦ６ｆ－ＸＢ
Ｐ１ｓ）、ならびに結合ペプチド（リンカーとしても知られる）の順序を含む。使用する
リンカーは以下の通りである：
・１９－ＡＡグリシンフレキシブルリンカー（「ＧＦＬ」）；
・２５－ＡＡアルファヘリックスリンカー（「ＡＨＬ４」）；および、
・５０－ＡＡ可動性リンカー（「ＦＬ」）。

これらの３つのタイプの結合部または架橋は、これらの間の相互作用を達成するために
、その端部で結合されたたんぱく質間の柔軟性および適切な距離を提供することが示され
ている。ＸＢＰ１ｓとＡＴＦ６ｆ分子の間のこれらの３つのリンカーの生成および評価は
、特異的遺伝子エレメントを結合するのに充分な三次元形状を採用する、活性機能転写因
子を生成する可能性を拡大させた。

さらに、これらのキメラたんぱく質の発現をより検出するために、ヘマグルチニンペプ
チド（ＨＡ）たんぱく質配列（とりわけ、このエピトープに限定されない）を全てのたん
ぱく質の末端カルボキシル終点に付加した。

利用したクローニング戦略は、ｐＡＡＶ発現ベクターへのその後の連結のための制限部
位を包含する新規の合成によって、ＸＢＰ１ｓ、ＡＴＦ６ｆ、および３つの異なるリンカ
ーのＤＮＡ配列を生成した。この発現ベクターは、インビトロでの最も高い神経保護活性
を有するＵＰＲｐｌｕｓ変種の選択の前に、ウイルス粒子を生成するために使用された。

新規の合成により、２組の遺伝子配列が得られた。これらは第３末端にＨＡ配列を包含
し、リンカーに依存する。種々の制限部位を以下に示す。
第１組ＸＢＰ１ｓ－リンカー－ＡＴＦ６ｆ
ＳｎａＢＩ＿ＸＢＰ１ｓ－ＬＦＧ－ＡＴＦ６ｆ＿ＦｓｅＩ
ＢｓｐＥＩ＿ＸＢＰＳ１ｓ－ＬＦ－ＡＴＦ６ｆ＿ＫｐｎＩ
ＢｓｐＥＩ＿ＸＢＰｓ－Ｌ４Ｈ４－Ａｔｆ６ｆ＿ＫｐｎＩ
第２組ＡＴＦ６－リンカー－ＸＢＰ１ｓ
ＳｎａＢＩ＿ＡＴＦ６－ＬＦＧ－ＸＢＰ１ｓ＿ＦｓｅＩ
ＫｐｎＩ＿ＡＴＦ６－Ｌ４Ｈ４－ＸＢＰ１ｓ＿ＳｆｉＩ
ＫｐｎＩ＿ＡＴＦ６－ＬＦ－ＸＢＰ１ｓ＿ＳｆｉＩ

この目的に使用されるｍＲＮＡ配列は、それぞれ表ＶＩＩおよび表ＶＩＩＩ、ＡＴＦ６
ｆおよびＸＢＰ１ｓに記載されている。

リンカーまたはブリッジのｍＲＮＡ配列は、ＬＧＦ、Ｌ４Ｈ４、およびＬＦリンカーを
示す、表ＩＸに記載されている。

これらの６種のＵＰＲｐｌｕｓ変種の生成に伴い、ＡＡＶに関連するＸＢＰ１ｓおよび
ＡＴＦ６ｆの個別のバージョン（それぞれ表ＸＩおよびＸＩＩ）が産生され、これらの転
写因子の個々の発現に関してＵＰＲｐｌｕｓの活性を正確に比較するために、ｐＡＡＶ発
現ベクターにクローン化された。

これらの配列の発現は、ＵＰＲｐｌｕｓ変種の同一のプロモーターを使用し、ＨＡペプ
チドを提示し、これらの要素を含有しなかった転写因子ＸＢＰ１ｓおよびＡＴＦ６ｆで実
施された以前の研究とは異なる。

これらの配列が新規合成によって得られた直後、上記の制限部位を介して、それらをｐ
ＡＡＶ発現ベクターに連結した。生成した組換えＤＮＡの８つのバージョンを配列決定し
、配列が正確であり、期待される結果と一致することを確認した。

前述の配列の新規合成およびこれらの配列のｐＡＡＶベクターへの連結は、米国のGENE
WIZ社によって行われた。

プラスミドで得られた配列は、図１、２、３、４、５、および６のマップとして見るこ
とができる。

これらのプラスミドを確認するために、得られた配列の制限分析を、ＥｃｏＲ１制限酵
素を用いたプラスミドＤＮＡ消化によって行った。

制限酵素アッセイで得られたフラグメントサイズは、図７に示すように、予想通りであ
った。

治療的使用のための生物医学的範囲の分析によって、この技術の使用がその適用におい
て驚くべき結果を生み出した、神経変性疾患を治療するための効果的で革新的な方法が提
供された。

ＵＰＲｐｌｕｓの関与を調査するために、上の段落に記載された６つの組換えＤＮＡ変
種が生成された。これらは、ＸＢＰ１ｓと呼ばれる活性型のＸＢＰ１のヒト配列、および
異なるリンカーによって連結され、その他の可能性のあるエピトープの中でヘマグルチニ
ン（ＨＡ）のエピトープに連結された、ＡＴＦ６ｆと呼ばれるＡＴＦ６の活性型のヒト配
列をコードする。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の開発に関して、目的のポリヌクレオチドに作動的に連
結された転写調節エレメントを有する発現カセットを包含する、ウイルス組換えゲノムを
含んでなる。ＡＡＶ血清型の種類は、排他的にではなく、目的のポリヌクレオチドが発現
される組織選択性の一部を提供する。

本発明によれば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、４２種類のあらゆる既知の血清型
を包含し、パルボウイルスに由来する。一般に、種々のＡＡＶ血清型は、アミノ酸および
核酸に関して有意に相同なゲノム配列であり、同一の遺伝的機能、機能的かつ物理的に本
質的同一である、ビブリオ細菌、それらの複製および事実上同一のメカニズムを用いる組
合せた使用を提供する。

本発明において、特に、ＡＡＶ血清型２を使用した（ＡＡＶ２に関して表Ｘ中に示され
る、ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号（（ＡＡＶ２）ＮＣ＿００１４０１．２、（ＡＡＶ６）
ＡＦ０２８７０４．１、ＮＣ００６２６０（ＡＡＶ７）、ＮＣ００６２６１（ＡＡＶ８）
、ＡＸ７５３２５０．１（ＡＡＶ９）、（ＡＡＶ１０）、（ＡＡＶ１１）、および偽型Ａ
ＡＶにて言及したようなもの）。

ＡＡＶ１０およびＡＡＶ１１ウイルスについては、カプシドたんぱく質が異なるため、
完全な配列は入手できない。

本発明によれば、ＡＡＶゲノムは、通常、シス５内のアクチュエータ、逆位３末端反復
配列、および発現カセットを含んでなる。ＩＴＲまたはＬＴＲ配列は、１４１塩基対の長
さを有する。好ましくは、ＬＴＲの完全な配列が分子内で使用され、配列のわずかな改変
のみが許される。本発明の好ましい形態において、ＡＡＶの組換えゲノムは、第５および
第３のＡＡＶＬＴＲを含んでなる。本発明の別の好ましい形態において、第５および第
３のＡＡＶＬＴＲは、ＡＡＶ血清型２に由来する。本発明の別のより好ましい形態では
、ＡＡＶの組換えゲノムは、ＲｅｐおよびＣａｐオープンリーディングフレームを欠いて
いる。

一方で、ＩＴＲはその他のＡＡＶ血清型に由来し得る。

本発明のＡＡＶは、あらゆる血清型由来のカプシドを含んでなる。特に、本発明では、
血清型２、６、７、８、９、および１０に由来するカプシドが好ましい。しかしながら、
血清型２のＡＡＶカプシドが好ましい。

いくつかの実施形態では、本発明の方法における使用のためのＡＡＶキャップは、ＡＡ
Ｖキャップの１つ、またはそれらのコード核酸の突然変異誘発（すなわち、挿入、欠失、
または置換）によって生成され得る。いくつかの生産において、ＡＡＶキャップは、前述
のＡＡＶキャップの１つ以上と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、
９５％、９８％、または９９％以上類似している。

いくつかの実施において、ＡＡＶキャップは、前述のＡＡＶキャップの２つ、３つ、４
つ、またはそれ以上のドメインを含んでなる、キメラである。いくつかの設計において、
ＡＡＶキャップは、モノマーＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３のモザイクであり、２つまたは３つ
の異なるＡＡＶまたは組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）に由来する。いくつかの生産において、
ｒＡＡＶの組成物は、上記のＣＡＰＳの２つ以上を含んでなる。

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ組成物にて使用するためのＡＡＶＣＡＰは、異種
配列またはその他の修飾を含有するように設計される。例えば、選択的標的化または免疫
回避を与えるペプチドまたはたんぱく質配列は、Ｃａｐたんぱく質上で遺伝子操作され得
る。あるいは、または加えて、ｒＡＡＶの表面が、免疫回避を促進し得るポリエチレング
リコールなどの特定の化学修飾を示すように、キャップを化学的に修飾することができる
。Ｃａｐたんぱく質はまた、誘導された突然変異（例えば、その天然結合受容体を除去す
るため、または免疫原性エピトープを隠すため）によっても生成され得る。

一実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＧｅｎＢａｎｋから得た、以下：表Ｉ（Ｓｎ
ａＢＩ＿ＸＢＰ１ｓ－ＬＦＧ－ＡＴＦＧ－ＡＴＦ６ｆ＿ＦｓｅＩ）、または表ＩＩ（Ｂｓ
ｐＥＩ＿ＸＢＰＳ１ｓ－ＬＦ－ＡＴＦ６ｆ＿ＫｐｎＩ）、または表ＩＩＩ（ＢｓｐＥＩ＿
ＸＢＰｓ－Ｌ４Ｈ４－Ａｔｆ６ｆ＿ＫｐｎＩ）、または表ＩＶ（ＳｎａＢＩ＿ＡＴＦ６－
ＬＦＧ－ＸＢＰ１ｓ＿ＦｓｅＩ）、または表Ｖ（ＫｐｎＩ＿ＡＴＦ６－Ｌ４Ｈ４－ＸＢＰ
１ｓ＿ＳｆｉＩ）、または表ＶＩ（ＫｐｎＩ＿ＡＴＦ６－ＬＦ－ＸＢＰ１ｓ＿ＳｆｉＩ）
から選択することができる、ＳｎａＢＩ＿ＸＢＰ１ｓ－ＬＦＧ－ＡＴＦＧ－ＡＴＦ６ｆ＿
ＦｓｅＩ；またはＢｓｐＥＩ＿ＸＢＰＳ１ｓ－ＬＦ－ＡＴＦ６ｆ＿ＫｐｎＩ；またはＢｓ
ｐＥＩ＿ＸＢＰｓ－Ｌ４Ｈ４－Ａｔｆ６ｆ＿ＫｐｎＩ；またはＳｎａＢＩ＿ＡＴＦ６－Ｌ
ＦＧ－ＸＢＰ１ｓ＿ＦｓｅＩ；またはＫｐｎＩ＿ＡＴＦ６－Ｌ４Ｈ４－ＸＢＰ１ｓ＿Ｓｆ
ｉＩ、またはＫｐｎＩ＿ＡＴＦ６－ＬＦ－ＸＢＰ１ｓ＿ＳｆｉＩのうち少なくとも１つの
配列の、少なくとも１つの標的配列の付加を伴うプロモーターを含有する。

一実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＳｎａＢＩ＿ＸＢＰ１ｓ－ＬＦＧ－ＡＴＦ６
ｆ＿ＦｓｅＩ；またはＢｓｐＥＩ＿ＸＢＰＳ１ｓ－ＬＦ－ＡＴＦ６ｆ＿ＫｐｎＩ；または
ＢｓｐＥＩ＿ＸＢＰｓ－Ｌ４Ｈ４－Ａｔｆ６ｆ＿ＫｐｎＩ；またはＳｎａＢＩの標的配列
の少なくとも１つの付加を伴うプロモーターを含有する。

一実施形態において、ＡＡＶベクターは、前述の表から選択された標的配列と８５％相
同である、少なくとも１つの標的配列の付加を伴うプロモーターを含有する。

一実施形態において、ＡＡＶベクターは、前述の表から選択された標的配列と７０％相
同である、少なくとも１つの標的配列の付加を伴うプロモーターを含有する。

一実施形態において、ＡＡＶベクターは、前述の表から選択される標的配列の機能的等
価物である、少なくとも１つの標的配列の付加を伴うプロモーターを含有する。

転写調節エレメントは、プロモーター、および随意にエンハンサー領域を含むことがで
きる。プロモーターは、好ましくは、とりわけ、ＣＭＶ、ＰＧＫ１、ＣＡＭＫＩＩ、ＴＨ
Ｙ１、ＧＡＤ３４の中から選択される。エンハンサーは、神経組織に特異的である必要は
ない。

一実施形態において、プロモーターは、例えば、ＣＭＶとしても知られているサイトメ
ガロウイルスに特異的である。

一実施形態において、プロモーターは、例えば、ＰＧＫ１としても知られているホスホ
グリセリン酸キナーゼ１たんぱく質に特異的である。

一実施形態において、プロモーターは、例えば、ＣＡＭＫＩＩとしても知られているカ
ルシウムカルモジュリンキナーゼ２に特異的である。

一実施形態において、プロモーターは特異的であり、例えば、Ｔｈｙ１としても知られ
ている。

一実施形態において、プロモーターは特異的であり、例えば、ＧＡＢＡ作動性ニューロ
ンにおいて通常作動するＧＡＤ３４としても知られている、グルタミン酸デカルボキシラ
ーゼ３４に対して特異的である。

別の実施形態では、本発明のＡＡＶの一部を形成する発現カセットは、転写後調節エレ
メントも含んでなる。好ましい実施形態では、転写後調節エレメントは、ウッドチャック
肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）またはその機能的変種および断片、なら
びにＰＰＴ－ＣＴＳまたは機能的変種および断片そのものである。１つの特定の実施形態
において、転写後調節エレメントは、ＷＰＲＥである。

本発明によるＡＡＶの一部を形成する発現カセットは、「目的のポリヌクレオチド」を
含んでなる。好ましい実現において、目的のポリヌクレオチドは、全身作用性たんぱく質
をコードする。別の実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、ニューロン内で作用する
たんぱく質をコードする。好ましい実施形態において、ニューロン内で作用するたんぱく
質は、ＸＢＰ１ｓ－ＬＦＧ－ＡＴＦ６ｆ、またはＸＢＰ１ｓ－ＬＦ－ＡＴＦ６ｆ、または
ＸＢＰ１ｓ－ＬＦ－ＡＴＦ６ｆ、またはＸＢＰ１ｓ－Ｌ４Ｈ４－ＡＴＦ６ｆ、またはＡＴ
Ｆ６ｆ－ＬＦＧ－ＸＢＰ１、またはＡＴＦ６－Ｌ４Ｈ４－ＸＢＰ１、またはＡＴＦ６ｆ－
ＬＦ－ＸＢＰ１ｓであり、細胞内位置において変動するそれらのアイソザイムのいずれか
を包含する。

ＡＡＶベクターパッケージングのサイズ制限は、ＡＡＶ血清型に応じてサイズが変動す
る、野生型ＡＡＶゲノムのサイズに制限される（すなわち、４０８７～４７６７）。例え
ば、天然のＡＡＶ－２は、５３８２のゲノムサイズを有する。実施のいくつかの形態にお
いて、組換えＲＮＡベクターのクローニング能力は制限され得、所望のコード配列はウイ
ルスゲノムの４．８キロベースの完全な置換を伴ってもよい。したがって、大型の遺伝子
は、場合によっては、標準的な組換えＡＡＶベクターでの使用に適していない可能性があ
る。平均的な専門家は、限られたコーディング能力を克服する手法において、選択肢が利
用可能であることを理解できよう。例えば、２ゲノムＡＡＶＩＲＴは、頭～尾にコンカ
テマーを形成するようにハイブリダイズし、ベクターの能力をほぼ倍増させることができ
る。スプライス部位の挿入は、転写後のＩＲＴの除去を可能にする。限定されたクローニ
ング能力を克服するためのその他の選択肢は、主題の専門家には明らかであろう。

次の目的として、これらの変種の発現をヒト細胞株で試験した。この目的を達成するた
めに、ＳＨＳＹ５Ｙ細胞の形質移入率が低い（３０％）ため、ＳＨＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫
由来細胞をＨＥＫ２９３細胞と交換した。ＨＥＫ２９３細胞はヒト腎臓胚細胞系に相当し
、ＣａＰＯ₄法によって高い形質移入率（８０％）を示す。

ＨＥＫ２９３細胞を、ＵＰＲｐｌｕｓの６つの変種で形質移入した。対照として、同一
の発現ベクターにクローン化されたヒトＸＢＰ１ｓおよびＡＴＦ６ｆ（それぞれ、表ＸＩ
およびＸＩＩ）の個々のバージョンを包含した。また、実験室に存在するＸＢＰ１ｓのマ
ウスＤＮＡ配列に対応する、２つのバージョンの発現も包含されていた。

ＨＥＫ２９３細胞を、ＣａＰＯ₄法を用いてそれぞれの組換えＤＮＡで形質移入し、発
現の４８時間後にＲＩＰＡ緩衝液によりたんぱく質抽出し、総たんぱく質の定量を行った
。

続いて、抗ＨＡ抗体、抗ＸＢＰ１抗体、および抗ＡＴＦ６抗体を用いて、ウエスタンブ
ロット（ＷＢ）によって異なるたんぱく質を検出した。

ＷＢ分析は、図８に示されるように、抗ＨＡ抗体を有するＵＰＲｐｌｕｓの全ての変種
を検出することが可能であったので、これらのたんぱく質が正確に発現されたことを示し
た。ヘマグルチニン（ＨＡ）のエピトープは、全てのＵＰＲｐｌｕｓ変種の末端Ｃ末端に
存在するため、第１の近似として使用した。得られた分子量は、ＵＰＲｐｌｕｓ変種につ
いておよそ１００ｋＤａであり、個々のたんぱく質について約５０ｋＤａであった。

ＵＰＲｐｌｕｓ変異体のウイルス発現においてクローニングされたＸＢＰ１ｓの個々の
バージョンについて得られた分子サイズは、同一のアッセイ（図８、レーン８および１１
）において既に特徴付けられ決定されているマウスＸＢＰ１ｓバージョンと比較して、差
異がない。電気泳動によって得られた分子量は、ＵＰＲｐｌｕｓたんぱく質および個々の
たんぱく質の両方について、予想された分子量よりも多かった（図８参照）。

一方で、ヒトＸＢＰ１ｓの発現は、抗ＸＢＰ１１４３Ｆ（Biolegend）抗体を用いた
全てのＵＰＲｐｌｕｓ変種（レーン１－６、図９）、ならびに個々の変種（レーン８、図
９）において検出された。この抗体はＸＢＰ１ｓのヒト型のみを認識するので、マウスＸ
ＢＰ１ｓ配列の発現を検出することはできなかった（レーン９、１１、および１２、図９
）。

最後に、図１０に示すように、ＵＰＲｐｌｕｓ変種に存在するＡＴＦ６ｆたんぱく質も
抗ＡＴＦ６（ａｂＣａｍ）抗体で検出された。この抗体は、ＡＴＦ６ｆのヒトおよびマウ
スバージョンの両方を認識した（図１０）。

ＨＥＫ２９３細胞におけるこれらのたんぱく質の細胞内位置を決定するために、間接免
疫蛍光アッセイを、ＵＰＲｐｌｕｓたんぱく質およびそれらの個々のバージョンを発現す
る細胞に対して行った。ＷＢ分析に用いた上記と同一の抗体を使用した。ＵＰＲｐｌｕｓ
の異なる変種で一時的に形質移入されたＨＥＫ２９３細胞、ならびにＸＢＰ１ｓおよびＡ
ＴＦ６たんぱく質の個々のバージョンで形質移入された細胞においても、ＸＢＰ１および
ＡＴＦ６たんぱく質のエピトープＨＡの発現が検出された（図１１、１２、および１３）
。これらの結果から、本発明者らは、６つのＵＰＲｐｌｕｓ変種の細胞内位置が、細胞の
核を特異的に染色するＨｏｅｃｈｓｔプローブとの共マーキングにより明らかになった核
パターンに相当することを確認した（図１１、１２、および１３）。抗ＨＡ抗体の特異性
を決定するために、ＸＢＰ１のマウス配列に対応するｍＸＢＰ１ｓ／ＥＧＦＰプラスミド
で一過性に形質移入した細胞を、陰性対照として包含した（図１１Ｂ）。

また、抗ＸＢＰ１抗体は、ＵＰＲｐｌｕｓの全ての変種において、免疫蛍光によってＸ
ＢＰ１たんぱく質を特異的に認識することも判明した。抗ＸＢＰ１抗体の特異性は、ＡＴ
Ｆ６を個々に形質移入した細胞上、または非形質移入細胞中に標識がないことによって判
定した（図１２Ａ）。このアッセイによって、抗ＸＢＰ１抗体を用いてＸＢＰ１ｓのマウ
ス配列を検出することができた（図１２Ｂ）。

ＡＴＦ６の発現はまた、ＵＰＲｐｌｕｓ変種で形質移入されたＨＥＫ２９３細胞におけ
る免疫蛍光によっても確証された。ＡＴＦ６たんぱく質の検出は、陰性対照として使用し
たＸＢＰ１ｓを個別に形質移入した細胞を除いて、ＵＰＲｐｌｕｓの全てのたんぱく質変
種で観察された（図１３）。

形質移入されたＨＥＫ２９３細胞におけるこれらのたんぱく質の発現の細胞内局在化に
続いて、ルシフェラーゼ活性に結合したレポーターを用いて、プロモーターエレメントの
活性を、ｐＡＡＶ－ＵＰＲｐｌｕｓウイルスによって媒介される、折り畳まれていないた
んぱく質応答「ＵＰＲ」に対する応答について評価した。

ｐＡＡＶ－ＵＰＲｐｌｕｓ変種の転写活性のこの分析は、好ましくはＡＴＦ６ｆとＸＢ
Ｐ１ｓとの間のヘテロダイマーに応答する、「ＵＰＲＥ」と呼ばれるＵＰＲ要素の制御下
において、ルシフェラーゼレポーターシステムを用いて行った。この目的のために、ＨＥ
Ｋ２９３細胞を、ルシフェラーゼ－ＵＰＲＥレポータープラスミドと共にプラスミドｐＡ
ＡＶ－ＵＰＲｐｌｕｓ１～６で同時に形質移入した。さらに、化学発光分子（Promega、D
ual-Luciferase（商標）レポーターアッセイシステム）を恒常的に発現する、Ｒｅｎｉｌ
ｌａコードプラスミドを形質移入し、アッセイの内部対照として使用して全てのプラスミ
ドを発現する細胞のパーセンテージを決定した。発現の４８時間後、得られた発光をルミ
ノメーターで測定した。ｐＡＡＶ－ＵＰＲｐｌｕｓ変異体によるＵＰＲに対する応答エレ
メントの活性化レベルを、ｐＡＡＶ－ＸＢＰ１ｓと呼ばれる活性化形態のＸＢＰ１ｓ、お
よびｐＡＡＶ－ＡＴＦ６ｆと呼ばれる活性型のＡＴＦ６、ならびにおよび両方のプラスミ
ド（ｐＡＡＶ－ＸＢＰ１ｓおよびｐＡＡＶ－ＡＴＦ６ｆ）の同時形質移入に対する、コー
ド化プラスミドの形質移入によって生成されたレベルと比較した。また、実験の陽性対照
としては、ＸＢＰ１ｓのマウス配列のバージョンに対応するｐＣＤＮＡ３－ｍＸＢＰ１ｓ
プラスミドの形質移入が包含された。ｐＣＤＮＡ３空ベクター形質移入はまた、ＸＢＰ１
／ＡＴＦ６転写因子のＸＢＰ１／ＡＴＦ６転写活性系のベースライン活性として包含され
ていた。

図１４は、ＵＰＲｐｌｕｓおよび関連する対照の６つの変異体の転写活性を示す。示し
た値は、３つの独立した実験の平均を表す。以下の表ＸＩＩＩに示す通り：

最大活性（転写活性の１００％）を、同時形質移入されたＸＢＰ１ｓおよびＡＴＦ６ｆ
変種によって到達された活性化値として決定し、この値に基づいて各実験における各変種
の活性を正規化した。

得られた結果は、ＸＢＰ１ｓおよびＡＴＦ６ｆの共発現条件と同様に、１～３の変種の
転写活性を示す。これらの変異体は、ＵＰＲＥプロモーター領域に結合し、ルシフェラー
ゼレポーターの発現を活性化させることができる。４～６の変種は、ＡＴＦ６ｆ／ＸＢＰ
１ｓ共発現制御に関して約２０％の転写活性レベルを示したので、ＵＰＲＥプロモーター
領域に結合することができないか、またはこのキメラたんぱく質を採用する構造がそのＤ
ＮＡ配列へのその結合を変化させるであろう。

さらに、個々の変種はＵＰＲＥプロモーター領域を活性化することができ、ＡＴＦ６ｆ
はＸＢＰ１ｓたんぱく質よりも高い活性を示すことが判明した。

これらの結果は、「ＡＴＦ６ｆ－ＸＢＰ１ｓ」の混合変種の３つ（１、２、および３と
して指定された変種）がＵＰＲの活性化特性を維持し、プロジェクトで提案された戦略が
実行可能であり、ヘテロダイマーＡＴＦ６ｆ／ＸＢＰ１ｓの転写活性に関連する標的遺伝
子を活性化することができる可能性があることを確認した。

この開発における次のステップは、ｐＡＡＶ－ＵＰＲｐｌｕｓの発現によって媒介され
るＵＰＲ転写標的の活性化を評価することであった。

ＨＥＫ２９３細胞を用いてこの研究を行い、６つのｐＡＡＶ－ＵＰＲｐｌｕｓ変種、な
らびに個々のｐＡＡＶ－ＸＢＰ１ｓおよびｐＡＡＶ－ＡＴＦ６ｆ変種に対してコード化プ
ラスミドを形質移入した。さらに、これらの実験的試験においてヘテロダイマーによって
達成された最大活性化であると考えられる状態である、両方の変種（ｐＡＡＶ－ＸＢＰ１
ｓおよびｐＡＡＶ－ＡＴＦ６ｆ）の同時形質移入を包含した。

発現の２４時間後、リアルタイムＰＣＲ技術を用いて、ヘテロダイマーＡＴＦ６ｆ－Ｘ
ＢＰ１ｓによって調節される転写標的として記載された遺伝子の群のｍＲＮＡレベルを定
量化することにより、ＵＰＲ経路に関連する遺伝子の転写活性化を測定した。

このプロジェクト段階で分析された遺伝子は、ＨＥＫ２９３細胞のＸＢＰ１ｓおよび／
またはＡＴＦ６によって示差的に調節される遺伝子を大量配列決定する、最近の研究（Sh
oulders et al., 2013）に記載された。この研究では、これらのたんぱく質の発現を制御
する薬物の添加によって、示差的かつ誘導された方法でＸＢＰ１ｓおよび／またはＡＴＦ
６ｆ転写因子を発現することができる、ＨＥＫ２９３細胞が生成された。このシステムは
、ドキシサイクリン、薬物トリメトプリム（ＴＭＰ）によるＡＴＦ６ｆ、および両方の薬
物とのインキュベーションによる両方のたんぱく質（ヘテロダイマー）を添加することに
よって、ＸＢＰ１ｓを発現することができる。

これらの転写因子によって示差的に発現される記載された遺伝子は、以下の表ＸＩＶに
示されている：

上記の表ＸＩＶは、誘導性ＨＥＫ２９３細胞におけるＸＢＰ１および／またはＡＴＦ６
によって調節される遺伝子を示す。

この情報に基づいて、オリゴヌクレオチド配列を生成して、小胞体ストレス（ＥＲ）を
誘導する薬物であるツニカマイシンで処理したＨＥＫ細胞における、リアルタイムＰＣＲ
を用いた表ＸＩＶに示される遺伝子の発現レベルを決定した。

このアッセイにより、これらの遺伝子の増幅効率を試験し、これらの遺伝子が小胞体ス
トレス条件に応答して活性化されることを確証することができた。

図１５に示すように、遺伝子が効率的に増幅されていることが確認され、小胞体ストレ
ス条件に応答して発現が増加することも確認された。

続いて、ｐＡＡＶ－ＵＰＲｐｌｕｓ、ｐＡＡＶ－ＸＢＰ１ｓ、またはｐＡＡＶ－ＡＴＦ
６ｆの６つの変種のそれぞれを個別に形質移入したＨＥＫ２９３細胞から得られた、いく
つかの転写ＵＰＲ標的のｍＲＮＡレベルを比較し、両方の変種（ｐＡＡＶ－ＸＢＰ１ｓお
よびｐＡＡＶ－ＡＴＦ６ｆ）で同時形質移入した。

分析のために選択された遺伝子は、ヘテロダイマーの活性化に関連する遺伝子であった
。選択された遺伝子は、ＥＲＡＤ（「小胞体関連たんぱく質分解」）と呼ばれる小胞体プ
ロセスに関連し折り畳まれていないたんぱく質の分解に関連する遺伝子であるＣＲＥＬＤ
２、たんぱく質フォールディングプロセスに関連するＨＹＯＵ１、ならびに細胞外マトリ
ックスの形成に関与する分泌酵素である、ＥＲＡＤおよびＳＵＬＦ１に関連するＥＤＥＭ
１であった。さらに、ＥＲＡＤプロセスに関与するたんぱく質フォールディングおよびＨ
ＥＲＰＵＤに関連する、ＢＩＰの活性化が判定された。Ｃｒｅｌｄ２、Ｅｄｅｍ１、Ｈｙ
ｏｕ１、およびＳｕｌｆ１のようなヘテロダイマーの発現に関連するメッセンジャーＲＮ
Ａについて、変種１、２、および３は、４、５、および６の変種と比較して、この遺伝子
群を活性化することができるということが観察される（図１６）。さらに、ＳＵＬＦ１遺
伝子の発現の場合、ＵＰＲｐｌｕｓ３変種は、ＸＢＰ１ｓおよびＡＴＦ６ｆ変種が共発現
される場合に得られる活性よりも大きな活性化を示す。

この結果は、ＵＰＲｐｌｕｓキメラたんぱく質が、折り畳まれていないたんぱく質応答
に関連する遺伝子を活性化することができるということを示す。さらに、１、２、および
３の変異体によって達成される活性化レベルは、両方のたんぱく質を同時発現することに
よって得られる活性化レベルと類似するか、またはそれ以上である（図１６）。ＥＲＡＤ
に関連するシャペロンＢｉｐおよびＨＥＲＰＵＤ遺伝子に関して、ＵＰＲｐｌｕｓの１、
２、および３変異体がこれらの遺伝子を優先的に活性化し、これらの転写因子を同時発現
する場合と類似の誘導レベルに達することができるということもまた観察された。得られ
た結果は、３つの独立した実験の平均に対応する。

投与経路
ウイルスの投与経路は、標的ニューロンを感染させるために血液脳関門を通過させる。

本発明においてこの目的を達成するために、２つの投与経路が主に定義されている。

これらの経路の第１経路は経鼻である。一般に、経鼻投与される薬物は、全身循環を介
して血流に入ることができ、脳に直接浸透することができるか、または場合によっては両
方の経路に従うことができる。しかしながら、これらの経路の各々による薬物の流れを制
御する多くの要因は完全には定義されていない。一般に、鼻腔に投与される薬物が移動す
ることができる３つの経路が存在する。これらの経路には、鼻粘膜からの全身循環への直
接的な侵入、ニューロンを介する軸索輸送による嗅球への侵入、および脳への直接的な侵
入が包含される。異なるタイプのウイルスについて、種々のモデル基質に対するこれらの
経路の各々の役割を支持する証拠を、以下に要約する。

この表は本質的に包括的なものではなく、１つ以上の経路に従うことが示されている、
異なる種類の溶質を強調するためのものである。

ＣＮＳにおける細胞へのその他の投与経路には、以下が包含される。

眼内の硝子体液などの液体区画への直接注入；脈絡叢、脳室上皮／髄膜に送達するため
の脳室内もしくはくも膜下腔内（＊＊）の異なる経路を介する、脊椎の髄液中への直接投
与、およびそこからこれらの層内に伸展するプロセスを介する近接する脳への直接投与；
および一時的浸透圧もしくは薬理学的中断と組み合わせた動脈内注射により血液脳関門ま
たは血液腫瘍関門を介するその経路。

用語（＊＊）髄腔内（Intrathecal、intra + theca、「鞘内」）とは、鞘内の解剖学的
空間または潜在的な空間、最も一般的には脳のくも膜または脊髄中に生じるか、または導
入されるものを指す形容詞である。

投与量計算
Ulusoy et al,.によると、ベクター滴定は、１０¹⁰～１０¹²ｇｃ／ｍｌの実証された用
量で、１ｍｌあたり１０⁹～１０¹³ゲノムコピー（ＧＣ）の範囲を必要とする。他方で、
評価されるベクターのあらゆる希釈倍率においては、１０¹¹ｇｃ／ｍｌの低い中程度の範
囲を有さなければならないため、毒性が消失する。

ヒトにおける用量
ヒトにおける用量範囲は、この範囲を異なる年齢群の適用に制限することなく、または
年齢もしくは病態による分布の変更量で制限することなく、１０⁹～１０³⁰ウイルス単位
／体重ｋｇの間で見出される。

同一の生物種の正常な（対照）生物および定義された暴露条件下でのストレスにおいて
観察されるものとは区別できる標的生物の、形態、機能的能力、成長、発達、または寿命
の検出可能な有害な変化を引き起こさない、実験または観察によって見出される物質の、
最大濃度または量。

適用法
ｒＡＡＶ２ベクターを、約６０～８０ミクロンの先端直径を有するガラスキャピラリー
を備えた５μＬのHamiltonシリンジを使用して、ＮＳに左右に注入した。適切な濃度のウ
イルス粒子を含有する２マイクロリットルの緩衝液を、０．４μｌ／分の速度で注入した
。注射完了の５分後に針をゆっくりと抜いた。

図１は、７７０１ｂｐを有するｐＡＡＶ－ＸＢＰ１ｓ－ＬＦＧ－ＡＴＦ６ｆプラスミドの制限地図、および生成された組換えＤＮＡ中に存在する遺伝子エレメントの表現を示す。図２は、７８０９ｂｐを有するｐＡＡＶ－ＸＢＰ１ｓ－ＬＦ－ＡＴＦ６ｆプラスミドの制限地図、および生成された組換えＤＮＡ中に存在する遺伝子エレメントの表現を示す。図３は、７７１９ｂｐを有するＡＡＶ－ＸＢＰ１ｓ－Ｌ４Ｈ４－ＡＴＦ６ｆプラスミドの制限地図、および生成された組換えＤＮＡ中に存在する遺伝子エレメントの表現を示す。図４は、７７０１ｂｐを有するＡＡＶ－ＡＴＦ６ｆ－ＬＦＧ－ＸＢＰ１ｓプラスミドの制限地図、および生成された組換えＤＮＡ中に存在する遺伝子エレメントの表現を示す。図５は、７７１９ｂｐを有するｐＡＡＶ－ＡＴＦ６ｆ－Ｌ４Ｈ４－ＸＢＰ１ｓプラスミドの制限地図、および生成された組換えＤＮＡ中に存在する遺伝子エレメントの表現を示す。図６は、７８０９ｂｐを有するｐＡＡＶ－ＡＴＦ６ｆ－ＬＦ－ＸＢＰ１ｓプラスミドの制限地図、および生成された組換えＤＮＡ中に存在する遺伝子エレメントの表現を示す。図７は、ＵＰＲｐｌｕｓ変異体の制限試験の写真を示す。プラスミドＤＮＡ消化を、制限酵素ＥｃｏＲ１を用いて３７℃で２時間行った。得られた断片を１％アガロースゲルにセットした。２種類の分子量マーカーを使用した。サイズはゲル写真の端に示す：１．ｐＡＡＶ＿ＡＴＦ６ｆ－ＬＦＧ－ＸＢＰ１ｓ－ＨＡ２．ｐＡＡＶ＿ＡＴＦ６ｆ－ＬＦ－ＸＢＰ１ｓ－ＨＡ３．ｐＡＡＶ＿ＡＴＦ６ｆ－Ｌ４Ｈ４－ＸＢＰ１ｓ－ＨＡ４．ｐＡＡＶ＿ＸＢＰ１ｓ－ＬＦＧ－ＡＴＦ６ｆ－ＨＡ５．ｐＡＡＶ＿ＸＢＰ１ｓ－ＬＦ－ＡＴＦ６ｆ－ＨＡ６．ｐＡＡＶ＿ＸＢＰ１ｓ－Ｌ４Ｈ４－ＡＴＦ６ｆ－ＨＡ７．ｐＡＡＶ＿ＡＴＦ６ｆ－ＨＡ８．ｐＡＡＶ＿ＸＢＰ１ｓ－ＨＡＥｃｏＲ１で消化後の予想されるサイズ：１．３８９５、１９２８、１５３１、３４７、総サイズ：７７０１２．３８９５、１９２８、１６３９、３４７、総サイズ：７８０９３．３８９５、１９２８、１５４９、３４７、総サイズ：７７１９４．４２６２、１９２８、８１８、６９３、総サイズ：７７０１５．４２６４、１９２８、９２６、６９３、総サイズ：７８０９６．４２６４、１９２８、８３６、６９３、総サイズ：７７１９７．３８９５、１９２８、６９３、総サイズ：６５１６８．４２６２、１９２８、３４７、総サイズ：６５３７図８は、ＨＥＫ２９３細胞におけるＵＰＲｐｌｕｓ変異体の発現、およびＨＡエピトープによるそれらの検出を示す。ＨＥＫ２９３細胞をＵＰＲｐｌｕｓ変異体で一過性に形質移入した。コードするプラスミドを、ＸＢＰ１ｓ－ＨＡ、ＡＴＦ６－ＨＡ、およびＸＢＰ１ｓ／ＧＦＰの対照として用いた。さらに、非形質移入細胞（ＮＴ）の抽出物が包含されていた。発現の４８時間後、全たんぱく質を抽出し、ＨＡエピトープを、抗ＨＡカバンス抗体（希釈１：１０００）を用いて検出した。ｍＸＢＰ１－ＨＡを陽性対照として用いた。Ｈｓｐ９０を負荷制御として使用した。サイズはゲル写真の端に示す：１．ｐＡＡＶ＿ＡＴＦ６ｆ－ＬＦＧ－ＸＢＰ１ｓ－ＨＡ、期待分子量８３ＫＤａ２．ｐＡＡＶ＿ＡＴＦ６ｆ－ＬＦ－ＸＢＰ１ｓ－ＨＡ、期待分子量８７ＫＤａ３．ｐＡＡＶ＿ＡＴＦ６ｆ－Ｌ４Ｈ４－ＸＢＰ１ｓ－ＨＡ、期待分子量８２ＫＤａ４．ｐＡＡＶ＿ＸＢＰ１ｓ－ＬＦＧ－ＡＴＦ６ｆ－ＨＡ、期待分子量８３ＫＤａ５．ｐＡＡＶ＿ＸＢＰ１ｓ－ＬＦ－ＡＴＦ６ｆ－ＨＡ、期待分子量８７ＫＤａ６．ｐＡＡＶ＿ＸＢＰ１ｓ－Ｌ４Ｈ４－ＡＴＦ６ｆ－ＨＡ、期待分子量８２ＫＤａ７．ｐＡＡＶ＿ＡＴＦ６ｆ－ＨＡ、期待分子量４３ＫＤａ８．ｐＡＡＶ＿ＸＢＰ１ｓ－ＨＡ、期待分子量４３ＫＤａ９．ｐＡＡＶ＿ｍＸＢＰ１／ＧＦＰ、期待分子量４０ＫＤａ１０．試験せず１１．ｐＡＡＶ＿ｍＸＢＰ１ｓ－ＨＡ、期待分子量４３ＫＤａ１２．ｐＡＡＶ＿ｍＸＢＰ１ｓ－ＨＡ、期待分子量４３ＫＤａ図９は、ＨＥＫ２９３細胞におけるＵＰＲｐｌｕｓ変異体の発現、およびその中のＸＢＰ１ｓの検出を示す。ＨＥＫ２９３細胞は、ＵＰＲｐｌｕｓ変異体、ならびにＸＢＰ１ｓ－ＨＡ、ＡＴＦ６－ＨＡ、ＸＢＰ１ｓ、およびｍＸＢＰ１ｓのためのコード化プラスミドで、一時的に形質移入された。さらに、非形質移入細胞（ＮＴ）の抽出物を対照として使用した。発現の４８時間後、全たんぱく質を抽出し、ＸＢＰ１たんぱく質を、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ抗ＸＢＰ１抗体である１４３Ｆ（希釈１：１０００）を用いて検出した。Ｈｓｐ９０を負荷制御として使用した。ゲルレーンの同定：１．ｐＡＡＶ＿ＡＴＦ６ｆ－ＬＦＧ－ＸＢＰ１ｓ－ＨＡ２．ｐＡＡＶ＿ＡＴＦ６ｆ－ＬＦ－ＸＢＰ１ｓ－ＨＡ３．ｐＡＡＶ＿ＡＴＦ６ｆ－Ｌ４Ｈ４－ＸＢＰ１ｓ－ＨＡ４．ｐＡＡＶ＿ＸＢＰ１ｓ－ＬＦＧ－ＡＴＦ６ｆ－ＨＡ５．ｐＡＡＶ＿ＸＢＰ１ｓ－ＬＦ－ＡＴＦ６ｆ－ＨＡ６．ｐＡＡＶ＿ＸＢＰ１ｓ－Ｌ４Ｈ４－ＡＴＦ６ｆ－ＨＡ７．ｐＡＡＶ＿ＡＴＦ６ｆ－ＨＡ８．ｐＡＡＶ＿ＸＢＰ１ｓ－ＨＡ９．ｐＡＡＶ＿ｍＸＢＰ１／ＧＦＰ１０．試験せず１１．ｐＡＡＶ＿ｍＸＢＰ１ｓ－ＨＡ１２．ｐＡＡＶ＿ｍＸＢＰ１ｓ－ＨＡ図１０は、この図は、ＨＥＫ２９３細胞におけるＵＰＲｐｌｕｓ変異体の発現、およびＡＴＦ６の検出を示す。ＨＥＫ２９３細胞を、ＵＰＲｐｌｕｓ変異体、およびＸＢＰ１ｓ－ＨＡ、ＡＴＦ６－ＨＡ、ＸＢＰ１ｓ、ｍＸＢＰ１ｓのコード化プラスミドで、一過的に形質移入した。さらに、非形質移入細胞（ＮＴ）を対照として使用した。発現の４８時間後、全たんぱく質を抽出し、ＡＴＦ６たんぱく質を、抗ＡＴＦ６抗体ａｂＣａｍ（希釈１：２５０）を用いて検出した。マウスＡＴＦ６たんぱく質の発現を陽性対照として用いた。Ｈｓｐ９０を負荷制御として用いた。ゲルレーンの同定：１．ｐＡＡＶ＿ＡＴＦ６ｆ－ＬＦＧ－ＸＢＰ１ｓ－ＨＡ２．ｐＡＡＶ＿ＡＴＦ６ｆ－ＬＦ－ＸＢＰ１ｓ－ＨＡ３．ｐＡＡＶ＿ＡＴＦ６ｆ－Ｌ４Ｈ４－ＸＢＰ１ｓ－ＨＡ４．ｐＡＡＶ＿ＸＢＰ１ｓ－ＬＦＧ－ＡＴＦ６ｆ－ＨＡ５．ｐＡＡＶ＿ＸＢＰ１ｓ－ＬＦ－ＡＴＦ６ｆ－ＨＡ６．ｐＡＡＶ＿ＸＢＰ１ｓ－Ｌ４Ｈ４－ＡＴＦ６ｆ－ＨＡ７．ｐＡＡＶ＿ＡＴＦ６ｆ－ＨＡ８．ｐＡＡＶ＿ＸＢＰ１ｓ－ＨＡ９．ＲＶＡＴＦ６ｆ１０．試験せず図１１は、この図は、ＡおよびＢの２つの群の写真を示し、ＨＥＫ２９３細胞におけるＵＰＲｐｌｕｓ変異体の細胞下分布を観察することができる。（Ａ）として同定されたグループは、各条件において、ＵＰＲｐｌｕｓの異なる変異型で形質移入し、発現の４８時間後に固定し、抗ＨＡ抗体（赤色、上パネル）およびＨｏｅｃｈｓｔ（青色、中部パネル）で同時染色した、ＨＥＫ２９３細胞を示す。画像のオーバーレイは、各条件の下部パネルに表示される。（Ｂ）として同定されたグループは、ｍＸＢＰ１ｓ／ＥＧＦＰで形質移入し、発現の４８時間後に固定し、抗ＨＡ抗体（赤色）、ＥＧＦＰ固有蛍光（緑色）、およびＨｏｅｃｈｓｔ（青色）で同時染色した、ＨＥＫ２９３細胞を示す。各写真の下部のバーは１０μｍに相当する。図１２は、ＨＥＫ２９３細胞におけるＵＰＲｐｌｕｓ変異体の細胞下分布を示す、２つのグループの写真ＡおよびＢを示す。（Ａ）ＨＥＫ２９３細胞を各条件において、ＵＰＲｐｌｕｓの異なる変異型で形質移入し、発現の４８時間後に固定し、抗ＸＢＰ１抗体（赤色、上パネル）およびＨｏｅｃｈｓｔ染色（青色、中部パネル）で同時染色した。画像のオーバーレイは、各条件の下部パネルに表示される。（Ｂ）ＨＥＫ２９３細胞を、ｍＸＢＰ１ｓ／ＥＧＦＰで形質移入し、発現の４８時間後に固定し、抗ＸＢＰ１抗体（赤色）、ＥＧＦＰ固有蛍光（緑色）、およびＨｏｅｃｈｓｔ染色（青色）で同時染色した。各写真の下部のバーは２０μｍに相当する。図１３は、ＨＥＫ２９３細胞におけるＵＰＲｐｌｕｓ変異体の細胞下分布を分析する。（Ａ）ＨＥＫ２９３細胞を、各条件において、ＵＰＲｐｌｕｓの異なる変異型で形質移入し、発現の４８時間後に固定し、抗ＡＴＦ６抗体（赤色、上パネル）およびＨｏｅｃｈｓｔ染色（青色、中部パネル）で同時染色した。画像のオーバーレイは、各条件の下部パネルに表示される。各写真の下部のバーは２０μｍに相当する。図１４は、ＵＰＲｐｌｕｓ変異体の転写活性を表す棒グラフを示す。ＨＥＫ２９３細胞を、３つの異なるプラスミドで一時的に形質移入した：・ＵＰＲｐｌｕｓ変異体をコードするベクター；・ルシフェラーゼ発現を制御するＵＰＲＥプロモーター領域を有するベクター；および、・内部対照として、ウミシイタケをコードするプラスミド。使用した陽性対照は、ＡＴＦ６－ＨＡ、ＸＢＰ１ｓ－ＨＡ、およびＡＴＦ６－ＨＡ／ＸＢＰ１ｓ－ＨＡの同時形質移入のためのコード化プラスミドであった。また、形質移入されたｐＣＤＮＡ３空ベクターを陰性対照として用いた。発現の４８時間後、転写活性をルシフェラーゼアッセイによって測定した。ルミネッセンス測定を行い、ウミシイタケ活性で標準化した。グラフ（上部パネル）は、３つの独立した実験の平均を表し、値は平均値および平均値の標準誤差（ＳＥＭ）である。表（下部パネル）は、各実験条件で得られた各実験値を示す。図１５は、ＨＥＫ２９３細胞におけるＵＰＲ標的遺伝子の発現の分析を示す。ＵＰＲ関連転写標的のｍＲＮＡレベルを、ベースライン条件下でＨＥＫ２９３細胞から得られたｃＤＮＡからのリアルタイムＰＣＲによって分析し、１μｇ／ｍｌのツニカマイシンで８時間処理した。全ての試料を、構成的に活性なβ－アクチン遺伝子の発現レベルで標準化した。図１６は、ｐＡＡＶ－ＵＰＲｐｌｕｓで形質移入したＨＥＫ２９３細胞におけるＵＰＲ標的遺伝子の発現の分析を示す。ＵＰＲ関連転写標的のｍＲＮＡレベルを、６つのｐＡＡＶ－ＵＰＲｐｌｕｓ変異体、ならびに個々の変異体ＸＢＰ１ｓおよびＡＴＦ６ｆ、ならびに両者（ｐＡＡＶ－ＸＢＰ１ｓおよびｐＡＡＶ－ＡＴＦ６ｆ）の同時形質移入についてコード化プラスミドで形質移入した、ＨＥＫ２９３細胞から得られたｃＤＮＡからのリアルタイムＰＣＲによって分析した。全ての試料を、構成的に活性なβ－アクチン遺伝子の発現レベルで標準化した。１．ｐＡＡＶ＿ＡＴＦ６ｆ－ＬＦＧ－ＸＢＰ１ｓ－ＨＡ、２．ｐＡＡＶ＿ＡＴＦ６ｆ－ＬＦ－ＸＢＰ１ｓ－ＨＡ、３．ｐＡＡＶ＿ＡＴＦ６ｆ－Ｌ４Ｈ４－ＸＢＰ１ｓ－ＨＡ、４．ｐＡＡＶ＿ＸＢＰ１ｓ－ＬＦＧ－ＡＴＦ６ｆ－ＨＡ、５．ｐＡＡＶ＿ＸＢＰ１ｓ－ＬＦＡＴＦ６ｆ－ＨＡ、６．ｐＡＡＶ＿ＸＢＰ１ｓ－Ｌ４Ｈ４－ＡＴＦ６ｆ－ＨＡ、７．ｐＡＡＶ＿ＡＴＦ６ｆ－ＨＡ、８．ｐＡＡＶ＿ＸＢＰ１ｓ－ＨＡ、７＋８．ｐＡＡＶ＿ＡＴＦ６ｆ－ＨＡ＋ｐＡＡＶ＿ＸＢＰ１ｓ－ＨＡ、ＧＦＰ．ｐＡＡＶ－ＥＧＦＰ。図１７は、ＵＰＲｐｌｕｓの発現に対するポリＱ７９たんぱく質（適用例）のたんぱく質凝集分析を示す。（Ａ）Ｎ２Ａ細胞を、ｐＡＡＶ－ＵＰＲｐｌｕｓ、ｐＡＡＶ－ＸＢＰ１ｓ、またはｐＡＡＶ－ＡＴＦ６ベクター、およびｐＥＧＦＰ－ポリ－Ｑ７９ベクターで、一過性に同時形質移入した。発現の２４時間後（右パネル）および４８時間後（左パネル）に、たんぱく質発現をウエスタンブロットによって分析した。ＨＳＰ９０を負荷制御として使用した。（Ｂ）これらの同一の試料を、発現の２４時間後（右パネル）および４８時間後（左パネル）のフィルタートラップアッセイによって分析した。（Ｃ）発現の２４時間後（右パネル）および４８時間後（左パネル）における、ウエスタンブロットを使用したポリＱ７９たんぱく質のたんぱく質凝集の定量を表すグラフ。３つの独立した実験の平均および標準誤差を示す。（Ｄ）発現の２４時間後（右パネル）および４８時間後（左パネル）における、フィルタートラップを使用したポリＱ７９たんぱく質のたんぱく質凝集の定量を表すグラフ。３つの独立した実験の平均および標準誤差を示す。

応用例
パーキンソン病およびハンチントン病は、黒質のドーパミン作動性ニューロンにおいて
優先的に、選択的な神経細胞死を引き起こすたんぱく質凝集体の形成に関連する。これら
の影響を観察するために、図１７に示すように、ウエスタンブロット試験を行った。

３×１０⁵個のＮ２Ａ細胞を３０ｍｍウェルに播種した。２４時間後、ｐＡＡＶ－ＵＰ
Ｒｐｌｕｓ、ｐＡＡＶ－ＸＢＰ１ｓ、またはｐＡＡＶ－ＡＴＦ６ベクターを同時形質移入
し、ｐＥＧＦＰ－ポリ－Ｑ７９ベクターをＥｆｆｅｃｔｅｎｅ法で使用した。０．６μｇ
の各ベクター＋３．２μｌのエンハンサー、および１００μｌのＥＣ緩衝液を混合した。
混合物をボルテックスで１５秒間振とうし、室温で１０分間インキュベートした。８μｌ
のＥｆｆｅｃｔｅｎｅ（Qiagen）を加え、ボルテックスで１０秒間振とうし、室温で１５
分間インキュベートした。この溶液を５００μｌのＤＭＥＭ１０％ＳＦＢ培地と混合し
、表面全体を覆う滴下培養プレートに添加した。

発現の２４時間後または４８時間後、細胞を、細胞スクレーパーを用いて培養プレート
から取り出し、収集し、４℃で５分間、２０００ｒｐｍにて遠心分離した。沈殿物を、プ
ロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を添加した、１％Ｔｒｉｔｏｎを有するＰＢＳ緩衝液に
再懸濁した。細胞を氷上において５秒間で３回超音波処理し、最後に、ＢＣＡたんぱく質
アッセイ（ピアス、イリノイ州ロックフォード）を用いて各サンプルにおいてたんぱく質
濃度を決定した（Zhang et al. 2014）。

２５μｇの全たんぱく質を用いてたんぱく質試料を調製し、４Ｘチャージバッファー（
Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ０．２Ｍ［ｐＨ６．８］、ＳＤＳ１０％、ブロモフェノールブルー
０．０５％およびグリセロール２０％）と混合し、９５℃で５分間加熱した。これらを８
％変性剤ゲルに充填した。Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ３８０ｍＭ［ｐＨ８．３］、アクリルアミ
ド－ビス－アクリルアミド８％、ＳＤＳ０．１％、過硫酸アンモニウム０．１％、およ
びＴＥＭＥＤ０．０６％を用いて８％ポリアクリルアミド分離ゲルを調製した。コンプ
レッサーポリアクリルアミドゲルを、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ６０ｍＭ［ｐＨ６．８］、アク
リルアミド－ビス－アクリルアミド４％、ＳＤＳ０．１％、過硫酸アンモニウム０．１
％、およびＴＥＭＥＤ０．０６％を用いて調製した。

電気泳動は、１００Ｖの定電圧でランニングバッファー（Ｔｒｉｓ２５ｍＭ、グリシ
ン２５０ｍＭ、およびＳＤＳ０．１％）中で行った。ゲル前面が青色でなくなった場合
、電気泳動を停止した。続いて、たんぱく質をトランスファーバッファー（Ｔｒｉｓ２
５ｍＭ、グリシン２５０ｍＭ、およびメタノール２０％）中のＰＶＤＦ膜に、１００Ｖの
定電圧で２時間３０分、氷上において移動させた。次いで、膜をブロッキング溶液（ＰＢ
Ｓ中の５％ミルク）中において室温で１時間、一定の攪拌下でインキュベートした。最後
に、膜を次の抗体のいずれかと共にインキュベートし、５％ミルクＰＢＳ０．０２％Ｔ
ｗｅｅｎで希釈した；抗ＧＦＰ１：１０００（Santa Cruz）または抗ＨＳＰ９０１：３
０００（Santa Cruz）で、４℃にて１６時間、絶えず攪拌しながらインキュベートする。
翌日、膜をＰＢＳＴｗｅｅｎ０．１％で５分間３回洗浄し、その後、室温で１時間イ
ンキュベートし、関連する二次抗体である、１：３０００（ＰＢＳＴｗｅｅｎ０．０
２％中のミルク５％）に希釈された抗ウサギ－ＨＲＰまたは抗マウス－ＨＲＰ（Invitrog
en）を用いて一定に撹拌した。この期間が転動した後、膜をＰＢＳＴｗｅｅｎ０．１
％で洗浄し、今回は５分間３回洗浄した。最後に、ウエスタンブロッティング基質キット
（Pierce）およびChemidoc画像検出システム（Biorad）を用いて、たんぱく質分析を行っ
た。

上記で得られたデータを確認するために、フィルタートラップアッセイを行い、ＰＢＳ
－ＳＤＳ４×緩衝液と混合した２５μｇの全たんぱく質を使用して、これを行った。

これらの試料を、セルロースアセテートフィルターを含有する真空ポンプに連結された
９６ウェルプレートに載せた。試料を添加した後、真空により高分子量種のみをフィルタ
ーに保持した。続いて、フィルターをブロッキング溶液（ＰＢＳ中５％ミルク）中におい
て室温で１時間、一定に攪拌しながらインキュベートした。その後、抗ＧＦＰ抗体１：１
０００（Santa Cruz）と共にインキュベートし、５％ミルクＰＢＳＴｗｅｅｎ０．０
２％中において１６時間４℃で一定に攪拌しながら希釈した。翌日、フィルターをＰＢＳ
Ｔｗｅｅｎ０．１％で５分間３回洗浄し、その後室温で１時間インキュベートし、１
：３０００（ＰＢＳＴｗｅｅｎ０．０２％中５％ミルク）に希釈した２次抗マウスＨ
ＲＰ抗体（Invitrogen）で一定に撹拌した。

この期間の後、膜をＰＢＳＴｗｅｅｎ０．１％で洗浄し、今回は５分間３回洗浄し
た。最後に、ウエスタンブロッティング基質キット（Pierce）およびChemidoc画像検出シ
ステム（Biorad）を用いて、たんぱく質分析を行った。

結論：
ＵＰＲｐｌｕｓ、ＸＢＰ１ｓ、およびＡＴＦ６ｆたんぱく質を２４時間発現させると、
Ｎ２Ａ細胞におけるポリＱ７９－ＥＧＦＰたんぱく質の凝集率は減少した。ＵＰＲｐｌｕ
ｓ、ＸＢＰ１ｓ、およびＡＴＦ６ｆたんぱく質の発現は、それぞれ、ＷＢを用いて決定さ
れた凝集率である２３．２％、４７％、および５１．４％にまで減少した。

フィルタートラップ技術を用いて抗凝集効果もまた測定した。この場合、ＵＰＲｐｌｕ
ｓ、ＸＢＰ１ｓ、およびＡＴＦ６ｆたんぱく質の発現は、２４時間後に、それぞれ１５．
１％、１５％、および３９．１％に低下した。

さらに、ＸＢＰ１ｓ、ＡＴＦ６ｆ、およびＵＰＲｐｌｕｓたんぱく質の発現の抗凝集効
果を、４８時間後にＷＢを用いて評価した。ポリＱ７９の凝集は、ＵＰＲｐｌｕｓ処理（
４７％減少）のみ有意に低下したことが観察された。

さらに、フィルタートラップ技術により、ＸＢＰ１ｓ、ＡＴＦ６ｆ、およびＵＰＲｐｌ
ｕｓたんぱく質の発現は、ポリＱ７９－ＧＦＰのたんぱく質凝集を、対照に関して、４８
時間後に、それぞれ４８．５％、６５．６％、および２４％まで低下させることが観察さ
れた。

材料および方法
アデノ随伴ベクター産生
ＡＡＶウイルス血清型２（ＡＡＶ２／６）粒子は、２９３－ＡＡＶ細胞（Agilent Tech
nologies、カリフォルニア州サンタクララ）の形質移入によって産生され、イオジキサノ
ール勾配、続いてカラムアフィニティークロマトグラフィーで精製された。ゲノムが懸濁
液中に含有するＡＡＶ粒子の数、ならびにＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるベクターの懸濁液
の感染力を、ＴａｑＭａｎｑＰＣＲアッセイによって決定した。

６つの変異体についてのアデノウイルスプラスミド（ｐＡＡＶ）の調製
この標的の開発のために、ＸＢＰ１ｓ配列、ヒトＡＴＦ６ｆ配列、およびそれぞれのリ
ンカーを新規合成し、ＣＭＶプロモーターの下で、トランスジーンを発現するアデノウイ
ルスプラスミドｐＡＡＶ－ＣＭＶ－ＭＣＳにクローニングした。ＨＡタグ配列（図１７／
１７Ａ）は、生成した構築物の全てに包含されているため、形質導入された細胞を同定す
ることができた。空のアデノウイルスプラスミドｐＡＡＶ－ＣＭＶ－ＭＣＳを対照として
使用した。

生成した構築物の発現を確認するために、異なる構築物でＨＥＫ細胞を形質移入し、形
質移入の４８時間後に、抗ＨＡ抗体を用いてＷＢによって評価されたたんぱく質の抽出を
行った。

図１０に示すように、本発明者らは、ｐＡＡＶ－ＸＢＰ１ｓ－ＨＡ（５５ｋＤａ）、ｐ
ＡＡＶ－ＡＴＦ６ｆ－ＨＡ（５５ｋＤａ）、およびｐＣＤＮＡ－ｍＸＢＰ１ｓ（５５ｋＤ
ａ）の発現制御と共に、変異体ＵＰＲｐｌｕｓ（１３０ｋＤａ）の予想される分子量を有
するバンドを検出した。

リアルタイムＰＣＲ
異なるプラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞から全ＲＮＡを単離した。
ＰＢＳ中でホモジナイズした後、製造者が推奨するＴｒｉｚｏｌＲＮＡ抽出プロトコー
ルに従った。ｃＤＮＡは、高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Applied Biosystems）を用いて
合成した。ＳＹＢＲグリーンおよびＭｘ３００５ＰＱＰＣＲシステム（Stratagene）を
定量的ＲＴ－ＰＣＲに使用した。ｍＲＮＡの相対定量は対照としてのβ－アクチンを用い
た比較閾値サイクル法により計算した。配列のプライマーは、PrimerBankから得た（表Ｘ
Ｖ）。

ウエスタンブロット
本技術は実験１にて詳述する。

培養
Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＡＴＣＣから入手し、それぞれ１０％
または５％ウシ血清、および抗生物質（１００００Ｕ／ｍｌペニシリン、１０ｍｇ／ｍｌ
ストレプトマイシン）を補充したＤＭＥＭ培地中、３７℃および５％ＣＯ₂で培養した。

アッセイ
フィルタートラップアッセイ：全たんぱく質２５μｇを、酢酸セルロースフィルターを
含有する真空ポンプ（Microfiltration Apparatus、bio-rad、http://www.bio-rad.com/e
n-us/applications-technologies/protein-blotting-equipment-cells-power-supplies#3
）に連結された、９６ウェルプレートに適用する。

試料を添加した後、真空によって高分子量種のみをフィルターに保持した。次いで、フ
ィルターをブロッキング溶液（ＰＢＳ中５％ミルク）中において、室温で攪拌しながら１
時間インキュベートした。次いで、それらを抗ＧＦＰ抗体１：１０００（Santa Cruz）と
共にインキュベートし、撹拌しながら４℃で１６時間、５％ミルク／ＰＢＳＴｗｅｅｎ
０．０２％中において希釈した。翌日、フィルターをＰＢＳＴｗｅｅｎ０．１％で
５分間３回洗浄し、次いで、１：３０００（５％ミルク／ＰＢＳＴｗｅｅｎ０．０２
％）に希釈した二次抗マウスＨＲＰ抗体（Invitrogen）でと共に一定に撹拌しながら、室
温で１時間インキュベートした。

Effectene法：この方法は、プラスミドを真核細胞に形質移入する方法からなり、製造
者のプロトコール（Qiagen）によって記載され標準化されている。（https://www.qiagen
.com/es/shop/assay-technologies/transfection-reagents/effectene-transfection-rea
gent/）。

このプロトコールは、０．６μｇの各ベクター＋３．２μｌのエンハンサー、および１
００μｌのＥＣ緩衝液を混合することからなる。混合物をボルテックスで１０秒間振とう
し、室温で１０分間インキュベートする。次いで、８μｌのEffecteneを加え、ボルテッ
クスで１０秒間振とうし、室温で１５分間インキュベートした。この溶液を、５００μｌ
のＤＭＥＭ１０％ＦＢＳ培地と混合し、表面全体を覆う３０ｍｍ滴下培養プレートに加
える。

統計
データは、平均およびＳＥＭとして表される。実験に応じて、結果は、スチューデント
のＴ検定、またはマンホイットニー検定、２元配置分散分析、その後、ポストホック検定
としてホルム－シダックまたはボンフェローニ、もしくはランク上の１元配置分散分析に
よるクラスカル・ワリス、続いてポストホック検定としてダン試験またはボンフェローニ
を用いて、統計的に比較した。

Claims

組換えウイルスゲノムを含んでなり、そのようなゲノムは、融合たんぱく質をコードす
る目的のＵＰＲｐｌｕｓポリヌクレオチドと動作可能に結合する神経組織の特異的転写の
調節領域を含んでなる発現カセットを含んでなる、アデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）。
前記ＡＡＶの血清型が、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ
１０、ＡＡＶ１１、および偽型ＡＡＶを含んでなる群から選択される、請求項１に記載の
アデノ随伴ベクター。
前記ＡＡＶの前記血清型が、ＡＡＶ２である、請求項２に記載のアデノ随伴ベクター。
転写調節領域が、とりわけ、ＣＭＶ、ＰＧＫ１、ＣＡＭＫＩＩ、ＴＨＹ１、ＧＡＤ３４
を含んでなる群から選択されたプロモーター領域を包含する、請求項１、２、および３に
記載のアデノ随伴ベクター。
前記群の前記選択されたプロモーター領域が、ＣＭＶである、請求項４に記載のアデノ
随伴ベクター。
とりわけ、Ｈａ、Ｆｌａｇ、Ｇｆｐ、Ｈｉｓ、およびＭｙｃ群から選択された免疫応答
部位に対する翻訳領域を含んでなる、請求項１、２、および３に記載のアデノ随伴ベクタ
ー。
免疫応答部位に対する前記翻訳領域が、Ｈａである、請求項６に記載のアデノ随伴ベク
ター。
前記アデノ随伴ベクターの血清型が、各血清型の指向性により導入遺伝子が発現する細
胞型の特異性を提供する、請求項４に記載のアデノ随伴ベクター。
前記アデノ随伴ベクターの血清型が、特定の神経細胞型に特異的である、請求項８に記
載のアデノ随伴ベクター。
前記アデノ随伴ベクターの血清型が、第２番、および／または第２／６番偽型ベクター
の型である、請求項９に記載のアデノ随伴ベクター。
前記発現カセットが、転写後調節領域を含んでなる、請求項１～１０のいずれか一項に
記載のアデノ随伴ベクター。
前記転写後調節領域が、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）の転写後調節エレメン
トである、請求項１１に記載のアデノ随伴ベクター。
アデノ随伴ウイルスのＩＲＴが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９
、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、および偽型ＡＡＶ、優先的にはＡＡＶ２に由来するＩＲＴで
ある、請求項１～１２に記載のアデノ随伴ベクター。
転写されるＵＰＲｐｌｕｓ標的配列が、ＸＢＰ１ｓ、ＡＴＦ６ｆ、および架橋またはリ
ンカー配列を含んでなる、請求項１～１３に記載のアデノ随伴ベクター。
架橋配列が、前記ＬＧＦ、Ｌ４Ｈ４、およびＬＦ配列を含んでなる、請求項１４に記載
のアデノ随伴ベクター。
転写される前記標的配列が、ＸＢＰ１ｓ－ＬＧＦ－ＡＴＦ６ｆ－ＨＡである、請求項１
４および１５に記載のアデノ随伴ベクター。
転写される前記標的配列が、ＸＢＰ１ｓ－ＬＦ－ＡＴＦ６ｆ－ＨＡである、請求項１４
および１５に記載のアデノ随伴ベクター。
転写される前記標的配列が、ＸＢＰ１ｓ－Ｌ４Ｈ４－ＡＴＦ６ｆ－ＨＡである、請求項
１４および１５に記載のアデノ随伴ベクター。
転写される前記標的配列が、ＡＴＦ６ｆ－ＬＧＦ－ＸＢＰ１ｓ－ＨＡである、請求項１
４および１５に記載のアデノ随伴ベクター。
転写される前記標的配列が、ＡＴＦ６ｆ－ＬＦ－ＸＢＰ１ｓ－ＨＡである、請求項１４
および１５に記載のアデノ随伴ベクター。
転写される前記標的配列が、ＡＴＦ６ｆ－Ｌ４Ｈ４－ＸＢＰ１ｓ－ＨＡである、請求項
１４および１５に記載のアデノ随伴ベクター。
目的の前記ポリヌクレオチドが、神経細胞に対して全身的に近接して作用するかまたは
神経細胞で作用する、ＸＢＰ１ｓ－ＬＧＦ－ＡＴＦ６ｆ－ＨＡ、ＸＢＰ１ｓ－ＬＦ－ＡＴ
Ｆ６ｆ－ＨＡ、ＸＢＰ１ｓ－Ｌ４Ｈ４－ＡＴＦ６ｆ－ＨＡ、ＡＴＦ６ｆ－ＬＧＦ－ＸＢＰ
１ｓ－ＨＡ、ＡＴＦ６ｆ－ＬＦ－ＸＢＰ１ｓ－ＨＡ、およびＡＴＦ６ｆ－Ｌ４Ｈ４－ＸＢ
Ｐ１ｓ－ＨＡを含んでなる群の中で融合たんぱく質をコードする、請求項１～２１に記載
のアデノ随伴ベクター。
目的の前記ポリヌクレオチドが、前記融合たんぱく質ＸＢＰ１ｓ－ＬＧＦ－ＡＴＦ６ｆ
－ＨＡをコードする、請求項２２に記載のアデノ随伴ベクター。
目的の前記ポリヌクレオチドが、前記融合たんぱく質ＸＢＰ１ｓ－ＬＦ－ＡＴＦ６ｆ－
ＨＡをコードする、請求項２２に記載のアデノ随伴ベクター。
目的の前記ポリヌクレオチドが、前記融合たんぱく質ＸＢＰ１ｓ－Ｌ４Ｈ４－ＡＴＦ６
ｆ－ＨＡをコードする、請求項２２に記載のアデノ随伴ベクター。
目的の前記ポリヌクレオチドが、前記融合たんぱく質ＡＴＦ６ｆ－ＬＧＦ－ＸＢＰ１ｓ
－ＨＡをコードする、請求項２２に記載のアデノ随伴ベクター。
目的の前記ポリヌクレオチドが、前記融合たんぱく質ＡＴＦ６ｆ－ＬＦ－ＸＢＰ１ｓ－
ＨＡをコードする、請求項２２に記載のアデノ随伴ベクター。
目的の前記ポリヌクレオチドが、前記融合たんぱく質ＡＴＦ６ｆ－Ｌ４Ｈ４－ＸＢＰ１
ｓ－ＨＡをコードする、請求項２２に記載のアデノ随伴ベクター。
神経細胞に対して全身的に近接して作用するかまたは神経細胞で作用する目的の前記ポ
リヌクレオチドが、神経変性に関与する細胞に特異的である、請求項２２に記載のアデノ
随伴ベクター。
神経細胞に対して全身的に近接して作用するかまたは神経細胞で作用する目的の前記ポ
リヌクレオチドが、パーキンソン病およびハンチントン病に関与する細胞に特異的である
、請求項２２および２９に記載のアデノ随伴ベクター。
神経細胞に対して全身的に近接して作用するかまたは神経細胞で作用する目的の前記ポ
リヌクレオチドが、優先的には黒質のドーパミン作動性ニューロンにおいて、パーキンソ
ン病に関与する細胞に特異的であり、またハンチントン病に関して、線条体の中型有棘神
経細胞（ＭＳＮ）と称されるＧＡＢＡ作動性の神経細胞にも特異的である、請求項３０に
記載のアデノ随伴ベクター。
請求項１～３１に記載のアデノ随伴ベクター、および薬剤的に許容可能な賦形剤を含ん
でなる、医薬組成物。
化合物１ｍｌ当たり１０⁹～１０¹³個のゲノムコピー（ＧＣ）の範囲のウイルスの用量
を含んでなる、請求項３２に記載の医薬組成物。
神経変性疾患の治療のための薬物の調製に有用である、請求項３２に記載の医薬組成物
の使用。
哺乳類における、神経変性疾患の治療のための薬物の調製に有用である、請求項１に記
載のアデノ随伴ベクターの使用。
パーキンソン病および／またはハンチントン病の治療のための薬物の調製に有用である
、請求項３５に記載のアデノ随伴ベクターの使用。
この哺乳類が、ヒトである、請求項３５に記載のアデノ随伴ベクターの使用。
前記アデノ随伴ベクターまたは前記医薬組成物が、全身的または局所的に投与される、
請求項３５に記載のアデノ随伴ベクターの使用。
前記アデノ随伴ベクターまたは前記医薬組成物が、前記神経組織における目的の前記ポ
リヌクレオチドの発現を必要とする、請求項３５に記載のアデノ随伴ベクターの使用。
請求項１に記載のアデノ随伴ベクターを用いる治療方法であって：
ａ：神経細胞を請求項１～３１に記載のアデノ随伴ウイルスと接触させること；およ
び、
ｂ：神経細胞におけるウイルスの発現、を含んでなる、治療方法。
とりわけ、直接的な脳室内および／またはくも膜下腔内注射によって、投与経路が血液
脳関門の前記ウイルスの通過を受けやすく、鼻経路を含んでなる、請求項４０に記載のア
デノ随伴ベクターを用いる治療方法。
アデノ随伴ウイルスのＩＴＲに隣接する発現カセットを含んでなり、そのような発現カ
セットは、プロモーター、免疫応答に対する翻訳領域、および融合たんぱく質をコードす
る目的のポリヌクレオチドを含んでなる、ポリヌクレオチド。
前記プロモーター領域が、とりわけ、ＣＭＶ、ＰＧＫ１、ＣＡＭＫＩＩ、ＴＨＹ１、お
よびＧＡＤ３４を含んでなる群から選択される、請求項４２に記載のポリヌクレオチド。
前記群から選択された前記プロモーター領域が、ＣＭＶである、請求項４３に記載のポ
リヌクレオチド。
とりわけ、Ｈａ、Ｆｌａｇ、Ｇｆｐ、Ｈｉｓ、およびＭｙｃの群から選択された免疫応
答部位に対する翻訳領域を含んでなる、請求項４２に記載のポリヌクレオチド。
免疫応答部位に対する前記翻訳領域が、Ｈａである、請求項４５に記載のポリヌクレオ
チド。
前記アデノ随伴ベクターの血清型の前記型が、各血清型の前記指向性を与えられた前記
導入遺伝子を発現する前記細胞型の特異性を提供する、請求項４２に記載のポリヌクレオ
チド。
前記アデノ随伴ベクターの血清型の前記型が、特定の神経細胞型に特異的である、請求
項４７に記載のポリヌクレオチド。
前記アデノ随伴ベクターの血清型の前記型が、第２番および／または第２／６番偽型ベ
クターの型である、請求項４８に記載のポリヌクレオチド。
前記発現カセットがまた、転写後調節領域も含んでなる、請求項４２～４９に記載のポ
リヌクレオチド。
前記転写後調節領域が、前記ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）の前記転写後調節
エレメントである、請求項５０に記載のポリヌクレオチド。
転写される前記標的配列が、ＸＢＰ１ｓ－ＬＧＦ－ＡＴＦ６ｆ－ＨＡ、ＸＢＰ１ｓ－Ｌ
Ｆ－ＡＴＦ６ｆ－ＨＡ、ＸＢＰ１ｓ－Ｌ４Ｈ４－ＡＴＦ６ｆ－ＨＡ、ＡＴＦ６ｆ－ＬＧＦ
－ＸＢＰ１ｓ－ＨＡ、ＡＴＦ６ｆ－ＬＦ－ＸＢＰ１ｓ－ＨＡ、およびＡＴＦ６ｆ－Ｌ４Ｈ
４－ＸＢＰ１ｓ－ＨＡを含んでなり、神経細胞に対して全身的に近接して作用するかまた
は神経細胞で作用する、請求項４２～５１に記載のポリヌクレオチド。
転写される前記標的配列が、ＸＢＰ１ｓ－ＬＧＦ－ＡＴＦ６ｆ－ＨＡである、請求項５
２に記載のポリヌクレオチド。
転写される前記標的配列が、ＸＢＰ１ｓ－ＬＦ－ＡＴＦ６ｆ－ＨＡである、請求項５２
に記載のポリヌクレオチド。
転写される前記標的配列が、ＸＢＰ１ｓ－Ｌ４Ｈ４－ＡＴＦ６ｆ－ＨＡである、請求項
５２に記載のポリヌクレオチド。
転写される前記標的配列が、ＡＴＦ６ｆ－ＬＧＦ－ＸＢＰ１ｓ－ＨＡである、請求項５
２に記載のポリヌクレオチド。
転写される前記標的配列が、ＡＴＦ６ｆ－ＬＦ－ＸＢＰ１ｓ－ＨＡである、請求項５２
に記載のポリヌクレオチド。
転写される前記標的配列が、ＡＴＦ６ｆ－Ｌ４Ｈ４－ＸＢＰ１ｓ－ＨＡである、請求項
５２に記載のポリヌクレオチド。
目的の前記ポリヌクレオチドが、ＸＢＰ１ｓ－ＬＧＦ－ＡＴＦ６ｆ－ＨＡ、ＸＢＰ１ｓ
－ＬＦ－ＡＴＦ６ｆ－ＨＡ、ＸＢＰ１ｓ－Ｌ４Ｈ４－ＡＴＦ６ｆ－ＨＡ、ＡＴＦ６ｆ－Ｌ
ＧＦ－ＸＢＰ１ｓ－ＨＡ、ＡＴＦ６ｆ－ＬＦ－ＸＢＰ１ｓ－ＨＡ、およびＡＴＦ６ｆ－Ｌ
４Ｈ４－ＸＢＰ１ｓ－ＨＡを含んでなる群を有するたんぱく質をコードし、神経細胞に対
して全身的に近接して作用するかまたは神経細胞で作用する、請求項４２～５８に記載の
ポリヌクレオチド。
目的の前記ポリヌクレオチドが、前記たんぱく質ＸＢＰ１ｓ－ＬＧＦ－ＡＴＦ６ｆ－Ｈ
Ａをコードする、請求項５９に記載のポリヌクレオチド。
目的の前記ポリヌクレオチドが、前記たんぱく質ＸＢＰ１ｓ－ＬＦ－ＡＴＦ６ｆ－ＨＡ
をコードする、請求項５９に記載のポリヌクレオチド。
目的の前記ポリヌクレオチドが、前記たんぱく質ＸＢＰ１ｓ－Ｌ４Ｈ４－ＡＴＦ６ｆ－
ＨＡをコードする、請求項５９に記載のポリヌクレオチド。
目的の前記ポリヌクレオチドが、前記たんぱく質ＡＴＦ６ｆ－ＬＧＦ－ＸＢＰ１ｓ－Ｈ
Ａをコードする、請求項５９に記載のポリヌクレオチド。
目的の前記ポリヌクレオチドが、前記たんぱく質ＡＴＦ６ｆ－ＬＦ－ＸＢＰ１ｓ－ＨＡ
をコードする、請求項５９に記載のポリヌクレオチド。
目的の前記ポリヌクレオチドが、前記たんぱく質ＡＴＦ６ｆ－Ｌ４Ｈ４－ＸＢＰ１ｓ－
ＨＡをコードする、請求項５９に記載のポリヌクレオチド。
目的の前記ポリヌクレオチドが、前記黒質のドーパミン作動性ニューロンに対して全身
的に近接して作用する、請求項４２に記載のポリヌクレオチド。
目的の前記ポリヌクレオチドが、前記黒質のドーパミン作動性ニューロンに対して全身
的に近接して作用するかまたは神経細胞で作用する、請求項６６に記載のポリヌクレオチ
ド。
生物学的寄託の国際機関である、ＩＮＩＡ、Instituto de Investigaciones Agropecua
rias de Chileに寄託番号第ＲＧＭ２２３１号として寄託されたプラスミドなどの、アデ
ノ随伴の配列、アデノ随伴ウイルスのＩＴＲと隣接する発現カセットを含んでなり、発現
カセットは、プロモーター、免疫応答に対する翻訳領域、および目的のポリヌクレオチド
を含んでなる、プラスミド。
生物学的寄託の国際機関である、ＩＮＩＡ、Instituto de Investigaciones Agropecua
rias de Chileに寄託番号第ＲＧＭ２２３２号として寄託されたプラスミドなどの、アデ
ノ随伴の配列、アデノ随伴ウイルスのＩＴＲと隣接する発現カセットを含んでなり、発現
カセットは、プロモーター、免疫応答に対する翻訳領域、および目的のポリヌクレオチド
を含んでなる、プラスミド。
生物学的寄託の国際機関である、ＩＮＩＡ、Instituto de Investigaciones Agropecua
rias de Chileに寄託番号第ＲＧＭ２２３３号として寄託されたプラスミドなどの、アデ
ノ随伴の配列、アデノ随伴ウイルスのＩＴＲと隣接する発現カセットを含んでなり、発現
カセットは、プロモーター、免疫応答に対する翻訳領域、および目的のポリヌクレオチド
を含んでなる、プラスミド。
生物学的寄託の国際機関である、ＩＮＩＡ、Instituto de Investigaciones Agropecua
rias de Chileに寄託番号第ＲＧＭ２２３４号として寄託されたプラスミドなどの、アデ
ノ随伴である配列、アデノ随伴ウイルスのＩＴＲと隣接する発現カセットを含んでなり、
発現カセットは、プロモーター、免疫応答に対する翻訳領域、および目的のポリヌクレオ
チドを含んでなる、プラスミド。
生物学的寄託の国際機関である、ＩＮＩＡ、Instituto de Investigaciones Agropecua
rias de Chileに寄託番号第ＲＧＭ２２３５号として寄託されたプラスミドなどの、アデ
ノ随伴の配列、アデノ随伴ウイルスのＩＴＲと隣接する発現カセットを含んでなり、発現
カセットは、プロモーター、免疫応答に対する翻訳領域、および目的のポリヌクレオチド
を含んでなる、プラスミド。
生物学的寄託の国際機関である、ＩＮＩＡ、Instituto de Investigaciones Agropecua
rias de Chileに寄託番号第ＲＧＭ２２３６号として寄託されたプラスミドなどの、アデ
ノ随伴の配列、アデノ随伴ウイルスのＩＴＲと隣接する発現カセットを含んでなり、発現
カセットは、プロモーター、免疫応答に対する翻訳領域、および目的のポリヌクレオチド
を含んでなる、プラスミド。
請求項４２～６４に記載のウイルスゲノムを含んでなる、アデノ随伴ウイルス。
アデノ随伴ウイルスベクターを得る方法であって、以下のステップ：
ａ．ＡＡＶがその複製に依存する、ＡＡＶＣａｐたんぱく質、ＡＡＶＲｅｐたん
ぱく質、およびウイルスたんぱく質を有する、請求項４２～６４のいずれか一項に記載の
ポリヌクレオチドを含んでなる細胞を、提供すること、
ｂ．ＡＡＶの構築のために適切な条件下において細胞を維持すること；ならびに、
ｃ．細胞によって産生されたアデノ随伴ウイルスベクターを精製すること、を含んで
なる、方法。
前記ＡＡＶが、アデノウイルスに由来する複製に依存する、請求項７５に記載の方法。
前記アデノ随伴ウイルスの前記ＣａｐおよびＲｅｐたんぱく質が、前記血清型ＡＡＶ２
、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、および偽型ＡＡ
Ｖから選択されるＡＡＶに由来する、請求項６８および７５に記載の方法。
前記アデノ随伴ウイルスの前記ＣａｐおよびＲｅｐたんぱく質が、前記血清型ＡＡＶ２
に由来する、請求項７７に記載の方法。