JP2018534943A - 昆虫細胞において遺伝暗号拡張によって遺伝子操作されたタンパク質を調製するための手段および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
1.定義
別に記載されない場合には、ヌクレオチド配列(NS)は、本明細書において5’→3’方向に表される。別に記載されない場合には、アミノ酸配列(AS)は、本明細書においてN末端→C末端方向に表される。
「サプレッサーtRNA」は、所与の翻訳系におけるメッセンジャーRNA(mRNA)の読み取りを変更するtRNAである。サプレッサーtRNAは、例えば、停止コドン、4塩基コドンまたは稀なコドンを読み通すことができる。
O−tRNAは、内因性シンセターゼによってアシル化されず、本明細書において記載されるようなセレクターコドンをデコード可能である。O−RSは、例えば、拡張されたアンチコドンループを有するO−tRNAを認識し、O−tRNAを非天然アミノ酸(ncAA)を用いて優先的にアシル化する。
TP 標的ポリペプチド
ncAA 非標準アミノ酸残基
ICL 昆虫細胞株
CSTP ヌクレオチド配列をコードするTP
O−RS 直交性細菌性のアミノアシルtRNAシンセターゼ
O−tRNAncAA 直交性細菌性のtRNAncAA
CS tRNAncAA 前記の1種以上の細菌性のtRNAncAAのコード配列
RSIC 昆虫細胞由来調節配列および
snRNA 小核リボ核酸
tRNA トランスファーリボ核酸
tRNAPyl ピロリシルtRNA
PylRS ピロリシルtRNAシンセターゼ
PylRS WT ピロリシルtRNAシンセターゼ野生型
PylRS AF ピロリシルtRNAシンセターゼ突然変異体
Pyl ピロリシン
SCO リシンの特定のシクロオクチニル誘導体
TCO リシンの特定のシクロオクチニル誘導体
TOC* リシンの特定のシクロオクチニル誘導体
BOC ブトキシカルボニルリシン
PrK リシンの特定のプロピニル誘導体
GFP 緑色フルオロフォア(オワンクラゲ(Aequoria victoria)由来の緑色蛍光タンパク質)
mCherry 赤色フルオロフォア(ショウジョウバエ属(Drosophila)由来、単量体形態)
本発明は、以下の特定の実施形態に関する。
a)前記の1種以上のncAAの存在下で昆虫細胞株(ICL)において前記TPを発現させるステップを含み、TPをコードするヌクレオチド配列(CSTP)が、前記の1個以上のncAA残基をコードする、1つ以上の、好ましくは、1〜5つの、最も好ましくは、1、2または3つのセレクターコドンを含み;同時にまたは任意の順序で逐次的に、
b)前記ICLにおいて、前記の1個以上のncAA残基を、前記TPのアミノ酸配列中に導入するのに必要な、1種以上の、好ましくは、1〜5種の、最も好ましくは、1、2または3種の直交性細菌性の、特に、古細菌性のアミノアシルtRNAシンセターゼ/tRNAncAA(O−RS/O−tRNAncAA)対を発現させるステップを含み、前記の1種以上の細菌性の、特に、古細菌性のtRNAncAAのコード配列(CStRNAncAA)は、昆虫細胞由来調節配列(RSIC)の制御下にあり、
c)任意選択で、発現されたTPを回収するステップを含む、方法。
a)昆虫snRNA U6遺伝子の調節配列および
b)昆虫tRNA遺伝子の調節配列、特に、H1調節配列
から選択され、
実施形態a)が好ましい、実施形態4の方法。
a)配列番号1の1〜400
b)配列番号2の1〜392
c)配列番号3〜8の1〜385
d)a)〜c)において定義されるヌクレオチド配列のうちいずれか1種の部分配列を含む、意図されるプロモーター活性を保持する、特に、前記の機能的断片の制御下にあるtRNAncAAの発現を調節する、その機能的断片
に対応するヌクレオチド配列から選択される、実施形態8の方法。
a)配列番号1の470〜569、
b)配列番号2の462〜561、
c)配列番号3〜8の455〜554
d)好ましくは、a)〜c)において定義されるヌクレオチド配列のいずれか1種の部分配列を含む、意図されるターミネーター活性を保持する、特に、前記の機能的断片の制御下にあるtRNAncAAの発現を調節する、その機能的断片
に対応するヌクレオチド配列から選択される、実施形態10の方法。
5’下流U6プロモーター/tRNAncAAコード配列/3’上流U6ターミネーター
に従って構築される、細菌性、特に、古細菌性のtRNAncAAのための発現カセットが適用される、実施形態1の方法。
a)昆虫snRNA U6遺伝子の調節配列および
b)昆虫tRNA遺伝子の調節配列、特に、H1調節配列
から選択され、実施形態a)が好ましい、実施形態19から21のうち1つのベクター。
a)配列番号1の1〜400
b)配列番号2の1〜392
c)配列番号3〜8の1〜385
d)a)〜c)において定義されるヌクレオチド配列のいずれか1種の部分配列を含む、意図されるプロモーター活性を保持する、特に、前記の機能的断片の制御下にあるtRNAncAAの発現を調節する、その機能的断片
に対応するヌクレオチド配列から選択される、実施形態23のベクター。
a)配列番号1の470〜569
b)配列番号2の462〜561
c)配列番号3〜8の455〜554
d)好ましくは、a)〜c)において定義されるヌクレオチド配列のいずれか1種の部分配列を含む、意図されるターミネーター活性を保持し、特に、前記の機能的断片の制御下にあるtRNAncAAの発現を調節する、その機能的断片
に対応するヌクレオチド配列から選択される、実施形態25のベクター。
5’下流U6プロモーター/tRNAncAAコード配列/3’上流U6ターミネーター
に従って構築される、細菌性、特に、古細菌性のtRNAncAAの発現カセットを含む、実施形態19から26のいずれか1つのベクター。
a)昆虫snRNA U6遺伝子の調節配列および
b)昆虫tRNA遺伝子の調節配列、特に、H1調節配列
から選択され、実施形態a)が好ましい、実施形態38のICL。
a)配列番号1の1〜400
b)配列番号2の1〜392
c)配列番号3〜8の1〜385
d)a)〜c)において定義されるヌクレオチド配列のいずれか1種の部分配列を含む、意図されるプロモーター活性を保持し、特に、前記の機能的断片の制御下にあるtRNAncAAの発現を調節する、その機能的断片
に対応するヌクレオチド配列から選択される、実施形態40のICL。
a)配列番号1の470〜569
b)配列番号2の462〜561
c)配列番号3〜8の455〜554
d)好ましくは、a)〜c)において定義されるヌクレオチド配列のいずれか1種の部分配列を含む、意図されるターミネーター活性を保持し、特に、前記の機能的断片の制御下にあるtRNAncAAの発現を調節する、その機能的断片
に対応するヌクレオチド配列から選択される、実施形態42のILC。
5’下流U6プロモーター/tRNAncAAコード配列/3’上流U6ターミネーター
に従って構築される、細菌性、特に、古細菌性のtRNAncAAの発現カセットを含む、実施形態33から43のいずれか1つのICL。
a)配列番号1の1〜400
b)配列番号2の1〜392
c)配列番号3〜8の1〜385
d)a)〜c)において定義されるヌクレオチド配列のうちいずれか1種の部分配列を含む、意図されるプロモーター活性を保持する、特に、前記の機能的断片の制御下にあるtRNAncAAの発現を調節する、その機能的断片
に対応するヌクレオチド配列から選択される。
−前記ICLは、Sf21(DSMZ Nr.ACC119)である、
−前記ICLは、前記TPおよび前記の1種以上のO−RS/O−tRNAncAA対を発現させるのに必要な遺伝情報(コード配列および調節配列)を保持する1種または2種のバキュロウイルスベクターを用いて安定にトランスフェクトされる、
−前記のtRNAncAAは、メタノサルシナ・マゼイ(Methanosarcina mazei)由来のピロリシルtRNA(tRNAPyl)である、および
−前記RSICは、昆虫snRNA U6コード配列の3’上流に、特に、図1に表わされるような昆虫snRNA U6コード配列の3’上流に、好ましくは、配列番号12の配列をコードする昆虫snRNA U6コード配列の3’上流に、最も好ましくは、配列番号1の連続ヌクレオチド残基1〜400、配列番号2の1〜392または配列番号3〜8の1〜385に対応するヌクレオチド配列から選択されるU6終結配列を含む。
1.酵素、標的ポリペプチド(TP)およびその機能的同等物および突然変異体
本発明は、本明細書において具体的に開示される、または記載される特定のタンパク質または酵素(アミノアシル−tRNAシンセターゼ、標的ポリペプチドのような)に制限されず、むしろ、その機能的同等物または類似体に広がる。
適したアミノ酸置換の制限しない例が、以下の表に示されている:
2.1核酸およびその機能的同等物
本発明はまた、調節核酸配列(プロモーターおよびターミネーター配列のような)および上記のような酵素もしくは標的ポリペプチドもしくはtRNAをコードする核酸配列またはその突然変異体もしくは機能的同等物に関する。
マルチプルアラインメントパラメータ:
ギャップ開始ペナルティー(Gap opening penalty) 10
ギャップ伸張ペナルティー(Gap extension penalty) 10
ギャップ分離ペナルティー範囲(Gap separation penalty range) 8
ギャップ分離ペナルティー(Gap separation penalty) オフ
アラインメント遅延の同一性% 40
残基特異的ギャップ オフ
親水性残基ギャップ オフ
トランジション加重(Transition weighting) 0
ペアワイズアラインメントパラメータ:
FASTアルゴリズム オン
K−タプルサイズ(tuplesize) 1
ギャップペナルティー 3
ウィンドウサイズ 5
最良対角線の数(Number of best diagonals) 5
DNAギャップ伸張ペナルティー(Gap Extension Penalty) 6.66
DNAマトリックス 同一性
タンパク質ギャップ開始ペナルティー(Gap Open Penalty) 10.0
タンパク質ギャップ伸張ペナルティー(Gap Extension Penalty) 0.2
タンパク質マトリックス ゴネット(Gonnet)
タンパク質/DNA ENDGAP −1
タンパク質/DNA GAPDIST 4
さらに、本発明に従う酵素または標的ポリペプチドの機能的突然変異体を製造するための方法は、当業者に公知である。
−遺伝子の単一またはいくつかのヌクレオチドが計画的に交換される、部位特異的突然変異誘発(Trower MK(編) 1996年; In vitro mutagenesis protocols. Humana Press、New Jersey)、
−任意のアミノ酸のコドンが、遺伝子の任意の点で交換または付加され得る、飽和突然変異誘発(Kegler−Ebo DM、Docktor CM、DiMaio D(1994年)Nucleic Acids Res第22巻:1593;Barettino D、Feigenbutz M、Valcarel R、Stunnenberg HG(1994)Nucleic Acids Res第22巻:541;Barik S(1995年) Mol Biotechnol第3巻:1)、
−ヌクレオチド配列が、エラー−プローンDNAポリメラーゼによって突然変異される、エラー−プローンポリメラーゼ連鎖反応(エラー−プローンPCR)(Eckert KA、Kunkel TA(1990年) Nucleic Acids Res第18巻:3739)、
−好ましい交換が、ポリメラーゼによって妨げられる、SeSaM法(配列飽和法)、Schenkら、Biospektrum、第3巻、2006年、277〜279頁
−例えば、防御的DNA修復機序のために、ヌクレオチド配列の突然変異率の増大がある、ミューテーター株における遺伝子の継代(Trower MK(編) In vitro mutagenesis protocols. Humana Press、New Jersey中の、Greener A、Callahan M、Jerpseth B(1996) An efficient random mutagenesis technique using an E.coli mutator strain.)または
−密接に関連する遺伝子のプールが形成され、消化され、断片が、ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型として使用され、鎖を分離することおよび再度一緒にすることの反復によって、最終的に、全長のモザイク遺伝子が生成する、DNAシャッフリング(Stemmer WPC (1994年) Nature第370巻:389;Stemmer WPC (1994年) Proc Natl Acad Sci USA 第91巻:10747)。
本発明は、さらに、特に、本明細書において定義される調節核酸配列の遺伝制御の下に、ポリペプチド、酵素またはtRNAの核酸配列コーディングを含有する組換え発現構築物または発現カセットに関する。本発明はまた、特に、これらの発現構築物のうち少なくとも1種を含む組換えベクターに関する。
下線を引いたtRNA配列
二重の下線を引いた3’終結シグナル
文脈に応じて、用語「微生物」または「宿主」は、広く理解されるべきであり、野生型微生物または遺伝子変更された組換え微生物または両方を意味することもあり、適した発現ベクターを作成するために適用され得る、または本発明の標的ポリペプチドを作成するために適用され得る、原核生物または真核生物微生物ならびにより高等な真核生物の細胞株、特に、昆虫細胞株にも及び得る。
本発明はさらに、本明細書において定義される標的ポリペプチドを組換え製造するための方法であって、ポリペプチド産生微生物を培養し、任意選択で、ポリペプチドの発現を誘導し、これらを培養物から単離する方法に関する。
用語「ncAA」とは、一般に、22種の天然に存在するタンパク質原性アミノ酸の中にない、任意の非標準または非天然アミノ酸またはアミノ酸残基を指す。この用語は、このようなncAAの対応する塩の形態も包含する。
本発明はまた、1以上のncAA基を有する標的ポリペプチド(TP)を調製するためのプロセスであって、
a)(i)アミノアシルtRNAシンセターゼまたはそれをコードするポリヌクレオチド
(ii)ncAAまたはその塩、
(iii)セレクターコドンに対するアンチコドンを有するtRNAまたは前記tRNAをコードするポリヌクレオチド、および
(iv)TPをコードし、1つまたは2つ以上のセレクターコドンを含むポリヌクレオチド
を含む翻訳系を提供し、
アミノアシルtRNAシンセターゼ(i)が、化合物または塩(ii)を用いてtRNA(iii)を特異的にアシル化可能であることと、
b)ポリヌクレオチド(iv)の翻訳を可能にすることと
c)任意選択で、得られたポリペプチドを回収することと
を含む、プロセスに関する。
A.材料および一般的な方法:
別に記載しない限り、組換えタンパク質のクローニングおよび発現を、例えば、Sambrook,J.、Fritsch,E.F.およびManiatis,T.、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、1989年に記載されるような標準法によって実施する。
1.1 プラスミド
プラスミドマップが、図11A〜Lに示されている。
pIEX−ccdb:供給源:Protein Expression and Purification core facility EMBL、Heidelberg
pIDK:供給源:Imre Berger、EMBL Grenoble
pIZT−V5/His:供給源:Thermo scientific、pIZT/V5−Hisベクターキット
pUCDM:供給源:Imre Berger、EMBL Grenoble
pACEBac−Dual:供給源:Protein Expression and Purification core facility EMBL、Heidelberg
pFastBac−Dual:Imre Berger、EMBL Grenoble
pBAD−Intein−CBD−12His:供給源:Plass T.、Milles S.、Koehler C.、Schultz C.、Lemke EA. Genetically encoded copper−free click chemistry. Angew Chem Int Ed Engl. 第50巻、3878〜81頁(2011年)
pEvol PylRS WT:供給源:Plass T.、Milles S.、Koehler C.、Schultz C.、Lemke EA. Genetically encoded copper−free click chemistry. Angew Chem Int Ed Engl.第50巻、3878〜81頁(2011年)
pEvol PylRS AF:供給源:Plass T.、Milles S.、Koehler C.、Schultz C.、Lemke EA. Genetically encoded copper−free click chemistry. Angew Chem Int Ed Engl.第50巻、3878〜81頁(2011年)
pBAD−GFP(Y39TAG−6His):供給源:Plass T.、Milles S.、Koehler C.、Schultz C.、Lemke EA. Genetically encoded copper−free click chemistry. Angew Chem Int Ed Engl.第50巻、3878〜81頁(2011年)
1.2.1 昆虫細胞:
2.1 ヨトウガ(Spodoptera frugiperda)細胞株Sf21
標準バキュロウイルスプロトコール(Nie,Y.、Bieniossek,C. & Berger,I. ACEMBL Expression System、User Manual. バージョン09.11(2009年))に従い、Sf21細胞(DSMZ ACC119)を、エルレンマイヤーフラスコ中、27℃、180rpmで振盪しながら、Sf−900(商標) III SFM培地を使用して培養した。細胞を毎日0.6*106個細胞/mlに、または3日目毎に0.3*106個細胞/mlにわけた。
細胞培養ディッシュ(10mm)中でSchneider2R+細胞(Drosophila Genomics Resource Center (DGRC))(DeRenzi lab、EMBL Heidelberg)を培養するために、10%ウシ胎児血清(FBS)(PAA Laboratories)、2mMグルタミンおよび1%ペニシリンストレプトマイシンを含むSchneider Drosophila培地(Thermo scientific)を使用し、100万個細胞/mlの密度で維持した。トランスフェクションのために、0.5*106個細胞/mlの密度で細胞を播種し、次いで、トランスフェクションした。6ウェルマルチディッシュを利用して、2μgのDNAを、200μlの培地および12μlのFuGENE HDトランスフェクション試薬と混合し、15〜20分間インキュベートし、各ウェルに滴加した。2種のプラスミドの同時トランスフェクションの割合は常に1:1とした。2日後、顕微鏡またはフローサイトメトリーによってトランスフェクションを解析した。
標準プロトコールを使用してヨトウガ(Spodoptera frugiperda)のゲノムDNAを抽出し、EMBL、Heidelbergのgenome core facilityによってゲノムを配列決定した。
フローサイトメトリー解析を、BD LSRFORTESSA (BD Biosciences)で行った。従って、6ウェルマルチディッシュにおいてSf21またはS2細胞を、pIZT−PylRS−mCherry−GFP(Y39TAG)−6His(図5B参照のこと)およびtRNA発現のためのプラスミドを用いて同時トランスフェクトした。2日のインキュベーション時間の後、細胞を、500rpmで10分間、4℃で回収し、500μlの滅菌1xPBSに再懸濁した。懸濁液を、セルストレーナー(Falcon、70μm、Fisher scientific)を通して濾過し、測定まで氷上で維持した。各サンプルの500万個の細胞のデータを獲得し、FlowJo Xソフトウェア(FlowJo Enterprise)を用いて解析した。
一過性トランスフェクションにおけるメタノサルシナ・マゼイ(Methanosarcina mazei)tRNAPylの発現のために、種々のU6 プロモーターを試験した。種々のtRNAPyl発現構築物の配列が、図3Aに示されている(配列番号15〜18)。
U6(ヒト(homo sapiens))プロモーターを、Mm tRNAPyl遺伝子の前に、続いて、短い3’終結シグナルをプラスミド pIEx−ccdB(配列番号50)中にクローニングし、pIEx−U6(ヒト)−tRNAPyl−3’termプラスミド(配列番号19)となった。
プラスミドpIEx−U6(Dm)−2−tRNAPyl−3’term(配列番号20)を、Biancoら2012 1 . Bianco,A.、Townsley,F.M.、Greiss,S.、Lang,K. & Chin、J.W. Expanding the genetic code of Drosophila melanogaster. Nat Chem Biol第8巻、748〜750頁(2012年)におけるクローニング戦略に従って構築した。U6(Dm)−2プロモーターを有する4回tRNA発現カセットをクローニングして、プラスミドpIEx−U6(Dm)−2−tRNAPyl−3’term 4xを達成した(配列番号21)。
U6−2プロモーター カイコ(Bombyx mori)と、それに続くカイコ(Bombyx mori)由来のtRNAPyl遺伝子およびsnRNA U6遺伝子の3’終結シグナルから構成されるtRNAカセットが、Genewiz Incから順序付けられた。この586bp断片を、プラスミドpIDK(配列番号22)中のClaIおよびNcoI部位の間にクローニングし、pIDK−U6(Bm)−2−tRNAPyl−3’term(配列番号23)が得られた。
a)プラスミドpIEx−U6(Sf21)−2−tRNAPyl−3’termの調製
ヨトウガ(Spodoptera frugiperda)由来のU6プロモーターを使用する一過性な系においてアンバーサプレッションを試験するために、U6(Sf21)−2プロモーター配列(snRNA U6 genの400bp上流)に、メタノサルシナ・マゼイ(Methanosarcina mazei)tRNAPyl遺伝子を続け、snRNA U6 遺伝子の対応する3’終結シグナル(配列番号2)で終わった。PCRによって、順序付けられた遺伝子(Genewiz Inc.)からメタノサルシナ・マゼイ(Methanosarcina mazei)tRNA構築物を取り出し、EcoRIおよびNotI制限酵素を用いて消化し、pIEx−ccdbプラスミド(配列番号50)(Protein Expression and Purification core facility EMBL、Heidelberg)中にライゲーションし、これは、IE1と呼ばれるプロモーターの前のエンハンサーおよびクローニングの間、バックグラウンドを低く維持するのに役立つccdB 遺伝子からなるものであった。このプラスミドを、同一酵素を用いて事前に切断し、プラスミドpIEx−U6(Sf21)−2−tRNAPyl−3’term(図5A)(配列番号24)を得た。種々のU6(Sf21)プロモーター(U6(SF21)1−8)を比較するために、U6(Sf21)−2 tRNA構築物についてと同一のクローニング戦略を使用した。
プラスミドpIZT−PylRS−mCherry−GFP(Y39TAG)−6His (図5B)(配列番号25)を作成するために、第1に、mCherry−GFP(Y39TAG)−6His構築物を、アンピシリンに対する耐性遺伝子を変更した後、制限酵素としてNcoIおよびSalIを使用して、OpIE1プロモーターの下、pIZT−V5/Hisプラスミド(Thermo scientific、pIZT/V5−His ベクターキット)中にクローニングし、第2のステップにおいて、PCRならびにKpnIおよびXbaIを使用する従来の制限酵素クローニングによって、pEvol−PylRSからメタノサルシナ・マゼイ(Methanosarcina mazei)PylRS WT遺伝子(配列番号26)を取り出して、OpIE2プロモーターの下で発現される遺伝子を得た。pEvol PylRSは、大腸菌(E.coli)細胞においてアンバーサプレッションのために使用され、構成プロモーターの下のtRNAPyl遺伝子に加えて、2つのメタノサルシナ・マゼイ(Methanosarcina mazei)PylRS遺伝子を、1つは構成プロモーターの下に(glnS)、1つはアラビノース誘導プロモーターの下に含有するプラスミドである。pIZT−PylRS−mCherry−GFP(WT)(配列番号28)を同一方法で構築した。
リポーター構築物GFP(Y39TAG)−6HisならびにpEvol PylRS WTおよびpEvol PylRS AFのプラスミドコーディングを、これまでに記載されたようにクローニングした(Plass T.、Milles S.、Koehler C.、Schultz C.、Lemke EA. Genetically encoded copper−free click chemistry. Angew Chem Int Ed Engl.第50巻、3878〜81頁(2011年))。プラスミドpEvol PylRS AFは、プラスミドpEvol PylRS WTと同一要素を含有するが、PylRS遺伝子は、2つの点突然変異(Y346AおよびY384F)を含む(配列番号29)。
実施例D.1:アンバーサプレッションバクミド(DH10BacTAG)の構築
アンバーサプレッションのためにPylRSシンセターゼおよびtRNAPylを含有するバクミドを作成するために、本発明者らは、第1に、制限酵素としてClaIおよびXbaIを使用して、U6(Sf21)−2−tRNAPyl−3’term(配列番号2)を、pUCDM(Imre Berger、EMBL Grenoble)(配列番号32)プラスミド中にクローニングし、続いて、MM PylRSまたはMM PylRS AFをp10プロモーターの下に付加し、NsiIおよびXhoIを用いて切断した。pUCDMを、バクミド骨格の修飾においてトランスファープラスミドとして使用し、2種の遺伝子の並行発現のために2つの昆虫プロモーターを含有する。pUCDMプラスミドのすべてのクローニングステップのために、BW23474細胞を増殖のために使用した。得られるベクターpUCDM−PylRSWT−U6(Sf21)−2−tRNAPyl−3’term(図5C)(配列番号33)(U6−tRNA カセット5’→3’およびPylRS遺伝子3’→5’)を、Berger,I.、Fitzgerald,D.J. & Richmond,T.J. Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes. Nat Biotechnol第22巻、1583〜1587頁(2004年)およびFitzgerald,D.J.ら Protein complex expression by using multigene baculoviral vectors. Nat Methods第3巻、1021〜1032頁(2006年)のプロトコールに従ってエレクトロコンピテント大腸菌(E.coli)DH10MultiBacCre細胞(Imre Berger、EMBL Grenoble)中に形質転換した。
アンバー突然変異タンパク質を発現させるために種々のプラスミドを構築した。
リポータープラスミドを構築し、従って、制限酵素としてBamHIおよびPstIを使用して、GFP(Y39TAG)−6Hisを、PH(ポリヘドリン(Polyhedrin))プロモーターの下、pACEBac−Dual−プラスミド(配列番号35)(Protein Expression and Purification core facility, EMBL Heidelberg)中にクローニングした。得られたpACEBac−Dual−GFP(Y39TAG)−6His(配列番号36)(図5D)を、DH10BacTAG(WT)およびDH10BacTAG(AF)中に形質転換し(実施例D1を参照のこと)、それによって、Tn7サイド(side)中に組み込まれた。
ヘルセプチン(抗Her)の重鎖(配列番号37)および軽鎖(配列番号39)の可変および定常領域のコード配列から構成されるFab断片genは、Sf21細胞に対して最適化された順序付けられたコドンであり、重鎖のC末端6His−タグとともに、それぞれ、p10プロモーターおよびPHプロモーターの下、pACEBac−デュアルプラスミド中にクローニングした。重鎖の位置A121およびA132の2つのアンバー突然変異を、クイックチェンジ(quick change)PCRによって個別に挿入し、プラスミド、pACEBac−Dual−ヘルセプチン−6His(配列番号41)(ヘルセプチン軽鎖5’→3’、重鎖3’→5’)(図5E)が得られた。
制限酵素としてRsrIIおよびEcoRIを使用して、TAF11(転写開始因子TFIIDサブユニット11)遺伝子配列番号43をN末端6His−タグとともに、PHプロモーターの下、pFastBac−デュアルプラスミド中に、ならびにTAF13(転写開始因子TFIIDサブユニット13)配列番号45を、得られたプラスミド中、p10プロモーターの後ろにクローニングすることによって、pFastBac−デュアル−6HisTAF11/TAF13(図5F)(配列番号42)(TAF11 5’→3’およびTAF13 3’→5’)を作製した。クイックチェンジ(quick change)PCRを実施して、単一アンバー停止コドンを、位置R30、E34およびR35でTAF13遺伝子中に導入した。
酵素としてNcoIおよびSpeIを使用する従来の制限部位クローニングによって、TATA−Box結合タンパク質(TBP)(配列番号48)の残基155〜333を、pBAD−インテイン−CBD−12Hisプラスミド中にクローニングし、pBAD−TBP−インテイン−CBD−12His(図5G)(配列番号49)が得られた。
実施例F.1 大腸菌(E.coli)におけるGFP(Y39TAG)の発現および精製
GFP(pBAD−GFP(Y39TAG−6His)のアンバー突然変異体(Y39TAG)のプラスミドコーディングを、それぞれ、pEvol PylRS WTまたはpEvol PylRS AFとともに同時形質転換し、TB−FB培地で、37℃で大腸菌(E.coli)BL21(DE3)AI細胞において発現させた。0.2のOD600が達成された時点でncAAを添加し、OD600=0.4で、0.02%アラビノースを用いて発現を誘導した。6〜8時間後、細胞を回収し、ペレットを凍結し、−20℃で保存した。
GFPのアンバー突然変異体(Y39TAG)をコードするプラスミドpACEBac−デュアル−GFP(Y39TAG)−6His(図5Dを参照のこと)を、実施例E1に従って調製されたようなDH10BacTAG細胞(WTおよびAF変異体)中に形質転換し、X−GalおよびIPTGならびにアンピシリン(100μg/ml)、カナマイシン(30μg/ml)、テトラサイクリン(10μg/ml)およびゲンタマイシン(10μg/ml)を含有する青/白選択プレート上にプレーティングした。4つの白色コロニーを選び取り、バクミド−DNAを調製した。本明細書において先に記載されたようにSf21細胞にトランスフェクトした後、60時間後に4種のV0ウイルス調製物を回収した。4種のV0ウイルスすべてを使用してV1ウイルスを並行して製造し、各1mlのウイルスを100mlの新鮮Sf21細胞に添加した。5種の培養物を同一方法で設定した、すなわち1mMの最終濃度のncAAが添加された、4種のV1ウイルスのうち各々について1種および最初のバクミド−DNAに起因するV1ウイルスが添加された陰性対照としてのncAAを用いない1種の培養物。細胞増殖が停止した後、細胞をさらなる48〜60時間後に回収した。
重鎖中の位置121または132にアンバー停止コドンを有するヘルセプチンFab断片の発現のために、プラスミドpACEBac−デュアル−ヘルセプチン−6His(図5Eを参照のこと)を、バキュロウイルス系におけるGFP(Y39TAG)発現と同一プロトコールに従って、実施例E2)に従って調製されたようなDH10BacTAG WTおよびAF中に形質転換し、発現は、PrKを用いておよび用いずに、ならびにBOC−リシンを用いておよび用いずに実施した。また、この精製のために、本発明者らは、GFP(Y39TAG)−6Hisプロトコールについてと同一のプロトコールをたどり、SDS−PAGEで純度を解析した。図13Aは、PrKを用いるまたは用いない発現を示し、図13Bは、BOC−リシンを用いるまたは用いない発現を示す。
TAF複合体を発現させるために、本発明者らは、プラスミドpACEBac−デュアル−6HisTAF11/TAF13(図5Fを参照のこと)を、実施例E3に従って調製されたようなDH10BacTAG AF変異体中に形質転換した。これは、TAF11/TAF13 WT複合体について、ならびにアンバー突然変異体について行った。本発明者らは、バキュロウイルス系においてGFP(Y39TAG)−6His発現についてと同一の発現プロトコールをたどった。
pBAD−TBP−インテイン−CBD−12His(図5Gを参照のこと;実施例E4において調製されたような)を、大腸菌(E.coli)BL21(DE3)AI細胞に形質転換し、TB−FP培地において、18℃で一晩発現させた。遠心分離(4500rpm、20分、4℃)によって細胞を回収し、−20℃で保存した。
対照測定として、本発明者らは、Schneider2細胞においてキイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)U6−tRNA構築物(U6(Dm))を調べた。したがって、本発明者らは、pIZT−PylRS−mCherry−GFP(Y39TAG)を用いる同時トランスフェクションにおいてpIEx−U6(Dm)−2−tRNAPyl−3’termならびにpIEx−U6(Dm)−2−tRNAPyl−3’term(4x)を使用して一過性トランスフェクションを実施した。発現収率をフローサイトメトリーによって解析した(図4参照のこと)。GFPシグナルは、緑色チャネルにおいてncAAを用いるおよび用いないシグナルを比較して明確に示される、作動しているアンバーサプレッション系を報告する。
Sf21細胞を、PylRS遺伝子(pIZT−PylRS−mCherry−GFP(Y39TAG)ならびに4種のtRNA発現プラスミドのうち1種も含むリポータープラスミドを用いて一過性にトランスフェクトした。これらのプラスミドは、pIEx−U6(ヒト)−tRNAPyl−3’term、pIEx−U6(Dm)−tRNSPyl−3’term、pIDK−U6(Bm)−2−tRNAPyl−3’termおよびpIEx−U6(Sf21)−2−tRNAPyl−3’termであり、それらすべてが、tRNAPylの遺伝子、U6プロモーターおよび3’終結シグナルを含有している。本発明者らは、U6(Sf21)−2プロモーターを含有するtRNA発現カセットが使用される場合には、一過性系においてSf21細胞におけるアンバーサプレッションは、唯一作動しており、その他のプロモーター配列の内1種がトランスフェクトされる場合またはncAAが添加されない場合には、アンバーサプレッションはないことを示す。この結果は、フローサイトメーターにおいてGFPシグナルを解析することによって得られる(図3B)。
実施例G.1 銅によって触媒されるアルキン−アジド環化付加(CuAAC):
ncAA(プロパルギルリジン、PrK)を含有し、アンバー停止コドンサイド(side)にアルキル基が組み込まれている精製タンパク質を、1xPBSバッファーpH7.5(0.2mM TCEP)に交換し、Tyagi,SおよびLemke,E.A. Tyagi,S. & Lemke,E.A. Genetically encoded click chemistry for single−molecule FRET of proteins.Methods Cell Biol第113巻、169〜187頁(2013年)におけるプロトコールに従って、5nmolをクリック反応に使用した。環化付加(Cycloadditon)反応を、SDS−PAGEによってフォローアップした(ヘルセプチンFab断片132PrK突然変異体については図13C参照のこと)。
1mMのSCO−L−リシン(Sichem)の存在下で発現されたタンパク質を精製し、1xPBSバッファー(pH8)に交換した。標識反応のために、25nmolのTAMRA−H−テトラジン(Jena Biosciences)と混合した5nmolのタンパク質を、室温で一晩インキュベートした。Plass,T.、Milles,S.、Koehler,C.、Schultz,C. & Lemke,E.A. Genetically encoded copper−free click chemistry、Angew Chem Int Ed Engl第50巻、3878〜3881頁(2011年)。標識反応を、SDS−PAGEの蛍光スキャンによって確認した。図10は、TAMRA−H−テトラジンおよびヘルセプチンFab野生型と反応させた、ヘルセプチンFab 121SCOのSPACC反応の結果を示す(図10A蛍光スキャン、図10Bクーマシーブルー用いるタンパク質染色)。見られるように、Her121SCOは、選択的に印がつけられている。
Claims (15)
- そのアミノ酸配列中に、1個以上の同一または異なる非標準アミノ酸(ncAA)残基を含む標的ポリペプチド(TP)を調製する方法であって、
a)前記の1個以上のncAAの存在下で、昆虫細胞株(ICL)において前記TPを発現させるステップを含み、このステップにおいてTPをコードするヌクレオチド配列(CSTP)が、前記の1個以上のncAA残基をコードする1つ以上のセレクターコドンを含み;同時にまたは任意の順序で逐次的に、
b)前記ICLにおいて、前記の1個以上のncAA残基を、前記TPのアミノ酸配列中に導入するのに必要な、1種以上の直交性細菌性のアミノアシルtRNAシンセターゼ/tRNAncAA(O−RS/O−tRNAncAA)対を発現させるステップを含み、このステップにおいて前記の1種以上の細菌性のtRNAncAAのコード配列(CStRNAncAA)は、昆虫細胞由来調節配列(RSIC)の制御下にあり;
c)任意選択で、発現されたTPを回収するステップを含む、方法。 - 前記ICLが、前記TPおよび前記の1種以上のO−RS/O−tRNAncAA対を発現させるのに必要な遺伝情報を保持する、1種以上のバキュロウイルスのベクターを用いてトランスフェクトされる、または形質導入される、請求項1に記載の方法。
- 前記RSICが、
a)昆虫snRNA U6遺伝子の調節配列、および
b)昆虫tRNA遺伝子の調節配列、特に、H1調節配列
から選択される、請求項1に記載の方法。 - 前記RSICが、U6プロモーターを含み、前記U6プロモーターが、ヌクレオチド残基
a)配列番号1の1〜400
b)配列番号2の1〜392
c)配列番号3〜8の1〜385
d)a)〜c)において定義されるヌクレオチド配列のうちいずれか1種の部分配列を含むその機能的断片
に対応するヌクレオチド配列から選択される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。 - 前記ICLが、スポドプテラ属(Spodoptera)細胞株、特に、ヨトウガ(Spodoptera frugiperda)細胞株、好ましくは、Sf21(DSMZ Nr.ACC119)またはショウジョウバエ属(Drosophila)細胞株、特に、キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)細胞株、好ましくは、Schneider−2 R+(Drosophila Genomics Research Center (DGRC)ストック番号150)から選択される、請求項の1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 1種以上の直交性細菌性のアミノアシルtRNA シンセターゼ/tRNAncAA(O−RS/O−tRNAncAA)対のコード配列を含むバキュロウイルスのベクターであって、前記細菌性のtRNAncAAコード配列(CStRNAncAA)が、昆虫細胞由来調節配列(RSIC)の制御下に置かれる、ベクター。
- 前記RSICが、U6プロモーターを含み、前記U6プロモーターが、ヌクレオチド残基
a)配列番号1の1〜400
b)配列番号2の1〜392
c)配列番号3〜8の1〜385
d)a)〜c)において定義されるヌクレオチド配列のいずれか1種の部分配列を含む、その機能的断片
に対応するヌクレオチド配列から選択される、請求項6に記載のベクター。 - 1個以上のncAA残基を、前記ICLによって同時発現されるTPのアミノ酸配列中に導入するのに必要な、1種以上の直交性細菌性のアミノアシルtRNAシンセターゼ/tRNAncAA O−RS/O−tRNAncAA対を発現可能な昆虫細胞株(ICL)であって、各細菌性のtRNAncAAコード配列が、昆虫細胞由来調節配列(RSIC)の制御下で発現される、昆虫細胞株(ICL)。
- 前記TPおよび前記の1種以上のO−RS/O−tRNAncAA対を発現させるのに必要な遺伝情報を保持する1種以上のバキュロウイルスのベクター、特に、請求項6および7のいずれか一項に定義される1種以上のベクターを用いてトランスフェクトされる、または形質導入される、請求項8に記載のICL。
- 前記RSICが、U6プロモーターを含み、前記U6プロモーターが、ヌクレオチド残基
a)配列番号1の1〜400
b)配列番号2の1〜392
c)配列番号3〜8の1〜385
d)a)〜c)において定義されるヌクレオチド配列のいずれか1種の部分配列を含む、その機能的断片
に対応するヌクレオチド配列から選択される、請求項8または9に記載のICL。 - 前記ICLが、スポドプテラ属(Spodoptera)細胞株、特に、ヨトウガ(Spodoptera frugiperda)細胞株、好ましくは、Sf21(DSMZ Nr.ACC119)、またはショウジョウバエ属(Drosophila)細胞株、特に、キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)細胞株、好ましくは、Schneider−2 R+(DGRC 150)から選択される、請求項8から10のいずれか一項に記載のICL。
- 配列番号1〜8のU6−1〜U6−8から選択されるtRNApylをコードする発現カセットまたは昆虫細胞において細菌性のtRNApylを機能的に発現するその能力を保持する、少なくとも40%の配列同一性の程度を有する配列。
- そのアミノ酸配列中に、1個以上の同一または異なる非標準アミノ酸(ncAA)残基を含む標的タンパク質(TP)であって、前記の1個以上のncAAの存在下で、昆虫細胞株(ICL)においてTPをコードするヌクレオチド配列(CSTP)を発現させることによって得られ、前記CSTPが、前記の1個以上のncAA残基をコードする1つ以上のセレクターコドンを含み、
請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法によって得られ、任意選択で、そのアミノ酸配列中に含有される前記の少なくとも1個の非標準アミノ酸(ncAA)残基とクリック反応を実施することによってさらに化学的に修飾される、標的タンパク質。 - 1個以上のncAA残基を有する組換え標的ポリペプチドTPを調製するためのキットであって、少なくとも1個のncAAまたはその塩を含み、請求項6または7に記載の少なくとも1種のバキュロウイルスのベクターをさらに含む、キット。
- プロモーター配列が、ヌクレオチド残基
a)配列番号1の1〜400
b)配列番号2の1〜392
c)配列番号3〜8の1〜385
d)a)〜c)において定義されるヌクレオチド配列のいずれか1種の部分配列を含む、その機能的断片
に対応するヌクレオチド配列から選択される。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2023282315A1 (ja) * | 2021-07-07 | 2023-01-12 | 味の素株式会社 | 非天然アミノ酸含有タンパク質の分泌生産法 |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20200340011A1 (en) * | 2016-06-10 | 2020-10-29 | University Of Wyoming | Recombinant insect vectors and methods of use |
AU2020291535A1 (en) * | 2019-06-14 | 2022-01-20 | The Scripps Research Institute | Reagents and methods for replication, transcription, and translation in semi-synthetic organisms |
TW202128994A (zh) * | 2019-09-30 | 2021-08-01 | 美商史基普研究協會 | 真核半合成生物 |
EP3868882A1 (en) * | 2020-02-21 | 2021-08-25 | European Molecular Biology Laboratory | Archaeal pyrrolysyl trna synthetases for orthogonal use |
US20210340586A1 (en) * | 2020-04-30 | 2021-11-04 | Sutro Biopharma, Inc. | Methods of Producing Full-Length Antibodies Using E. coli |
KR102557569B1 (ko) * | 2021-03-04 | 2023-07-20 | 전남대학교산학협력단 | 메타노사에타 콘실리에서 유래한 티로실-tRNA 합성효소 및 이를 이용한 단백질 생산방법 |
EP4186529A1 (en) | 2021-11-25 | 2023-05-31 | Veraxa Biotech GmbH | Improved antibody-payload conjugates (apcs) prepared by site-specific conjugation utilizing genetic code expansion |
WO2023094525A1 (en) | 2021-11-25 | 2023-06-01 | Veraxa Biotech Gmbh | Improved antibody-payload conjugates (apcs) prepared by site-specific conjugation utilizing genetic code expansion |
WO2023104941A1 (en) | 2021-12-08 | 2023-06-15 | European Molecular Biology Laboratory | Hydrophilic tetrazine-functionalized payloads for preparation of targeting conjugates |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007099854A1 (ja) * | 2006-02-22 | 2007-09-07 | Riken | サプレッサーtRNAの合成方法、DNA構築物及びそれを用いた非天然型アミノ酸組み込みタンパク質の製造 |
US20120077224A1 (en) * | 2009-06-05 | 2012-03-29 | The Salk Institute For Biological Studies | unnatural amino acid incorporation in eukaryotic cells |
US20130183761A1 (en) * | 2010-09-24 | 2013-07-18 | North Carolina State University | Methods for Incorporating Unnatural Amino Acids in Eukaryotic Cells |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2004233083B2 (en) * | 2003-04-17 | 2010-09-16 | The Scripps Research Institute | Expanding the eukaryotic genetic code |
AU2008335778B2 (en) * | 2007-12-11 | 2014-04-10 | The Scripps Research Institute | In vivo unnatural amino acid expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris |
US20110076718A1 (en) * | 2008-02-27 | 2011-03-31 | The Scripps Research Institute | In vivo incorporation of an unnatural amino acid comprising a 1,2-aminothiol group |
US20130078671A1 (en) * | 2011-03-25 | 2013-03-28 | The Texas A&M University System | Incorporation of two different noncanonical amino acids into a single protein |
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Patent Citations (3)
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WO2007099854A1 (ja) * | 2006-02-22 | 2007-09-07 | Riken | サプレッサーtRNAの合成方法、DNA構築物及びそれを用いた非天然型アミノ酸組み込みタンパク質の製造 |
US20120077224A1 (en) * | 2009-06-05 | 2012-03-29 | The Salk Institute For Biological Studies | unnatural amino acid incorporation in eukaryotic cells |
US20130183761A1 (en) * | 2010-09-24 | 2013-07-18 | North Carolina State University | Methods for Incorporating Unnatural Amino Acids in Eukaryotic Cells |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
"岩浅央, 構造解析のための蛋白質作成技術(2)−バキュロウイルス−昆虫細胞系を用いた蛋白質の大量発現−", 構造生物, vol. vol. 2, no. 1 [online], JPN6021028126, April 1996 (1996-04-01), pages 1 - 5, ISSN: 0004715764 * |
J BIOSCI BIOENG, 2006, VOL. 102, NO. 6, PP. 511-517, JPN6020044315, ISSN: 0004554793 * |
PROTEIN SCI, 2010 JAN 5, VOL. 19, NO. 3, PP. 440-448, JPN6020044314, ISSN: 0004715763 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2023282315A1 (ja) * | 2021-07-07 | 2023-01-12 | 味の素株式会社 | 非天然アミノ酸含有タンパク質の分泌生産法 |
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