JP2018532373A - 核酸の研究方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(a) 核酸を含む試料へのクロマチン結合剤の添加;
(b) 前記剤が結合したクロマチンの単離;
(c) 工程(b)の単離クロマチンへのトランスポザーゼの添加;
(d) クロマチンからの核酸の単離;および
(e) シーケンスライブラリーの入手、
を含む方法。
(a) 核酸を含む試料へのクロマチン結合抗体の添加;
(b) 前記抗体が結合したクロマチンの単離;
(c) 工程(b)の結合および単離されたクロマチンへのトランスポザーゼの添加;
(d) クロマチンからの核酸の単離;並びに
(e) シーケンスライブラリーの入手、
を含む方法。
を含む方法。
(a) 核酸を含む試料へのクロマチン結合剤の添加;
(b) 前記剤が結合したクロマチンの単離;
(c) 工程(b)の単離クロマチンへのトランスポザーゼの添加;
(d) クロマチンからの核酸の単離;
(e) 核酸の増幅;
(f) 増幅された核酸の配列決定;および
(g) 分子間相互作用の特定、
を含む方法。
(a) 核酸を含む試料へのクロマチン結合抗体の添加;
(b) 前記抗体が結合したクロマチンの単離;
(c) 工程(b)の結合および単離されたクロマチンへのトランスポザーゼの添加;
(d) クロマチンからの核酸の単離;
(e) 核酸の増幅;
(f) 増幅された核酸の配列決定;並びに
(g) 分子間相互作用の特定、
(i) 細胞の培養および回収;
(ii) 細胞の固定;
(iii) 細胞の溶解およびそれによる核酸を含む第一試料の入手;並びに
(iv) 第一試料の超音波処理およびそれによる、第1項または第2項に記載の方法で使用されるべき、核酸を含む第二試料の入手、
によって調製された、第1項〜第4項に記載の方法。
4、Six−5、Six−6、SMAD−1、SMAD−2、SMAD−3、SMAD−4、SMAD−5、SOX−11、SOX−12、Sox−4、Sox−5、SOX−9、Sp1、Sp2、Sp3、Sp4、Sph因子、Spi−B、SPIN、SRCAP、SREBP−1a、SREBP−1b、SREBP−1c、SREBP−2、SRE−ZBP、SRF、SRY、SRP1、Staf−50、STAT1α、STAT1β、STAT2、STAT3、STAT4、STAT6、T3R、T3R−α1、T3R−α2、T3R−β、TAF(I)110、TAF(I)48、TAF(I)63、TAF(II)100、TAF(II)125、TAF(II)135、TAF(II)170、TAF(II)18、TAF(II)20、TAF(II)250、TAF(II)250Delta、TAF(II)28、TAF(II)30、TAF(II)31、TAF(II)55、TAF(II)70−α、TAF(II)70−β、TAF(II)70−γ、TAF−I、TAF−II、TAF−L、Tal−1、Tal−1β、Tal−2、TAR因子、TBP、TBX1A、TBX1B、TBX2、TBX4、TBXS(長鎖アイソフォーム)、TBXS(短鎖アイソフォーム)、TCF、TCF−1、TCF−1A、TCF−1B、TCF−1C、TCF−1D、TCF−1E、TCF−1F、TCF−1G、TCF−2α、TCF−3、TCF−4、TCF−4(K)、TCF−4B、TCF−4E、TCFβ1、TEF−1、TEF−2、tel、TFE3、TFEB、TFIIA、TFIIA−α/β前駆物質、TFIIA−α/β前駆物質、TFIIA−γ、TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIE−α、TFIIE−β、TFIIF、TFIIF−α、TFIIF−β、TFIIH、TFIIH*、TFIIH−CAK、TFIIH−サイクリンH、TFIIH−ERCC2/CAK、TFIIH−MAT1、TFIIH−MO15、TFIIH−p34、TFIIH−p44、TFIIH−p62、TFIIH−p80、TFIIH−p90、TFII−I、Tf−LF1、Tf−LF2、TGIF、TGIF2、TGT3、THRA1、TIF2、TLE1、TLX3、TMF、TR2、TR2−11、TR2−9、TR3、TR4、TRAP、TREB−1、TREB−2、TREB−3、TREF1、TREF2、TRF(2)、TTF−1、TXRE BP、TxREF、UBF、UBP−1、UEF−1、UEF−2、UEF−3、UEF−4、USF1、USF2、USF2b、Vav、Vax−2、VDR、vHNF−1A、vHNF−1B、vHNF−1C、VITF、WSTF、WT1、WT1I、WT1 I−KTS、WT1 I−del2、WT1−KTS、WT1−del2、X2BP、XBP−1、XW−V、XX、YAF2、YB−1、YEBP、YY1、ZEB、ZF1、ZF2、ZFX、ZHX1、ZIC2、ZID、ZNF174等が挙げられる。
fixative)は、高分子、特にタンパク質および/または核酸、の間に化学的な共有結合を生成することによって作用する。これに関連して、周知の固定液はホルムアルデヒドである。ホルムアルデヒドは、リン酸緩衝食塩水中およそ3.7%〜4.0%のホルムアルデヒドである、10%中性緩衝ホルマリン(NBF)として使用されることが好ましい。ホルムアルデヒドは室温で気体であるため、ホルムアルデヒド固定液を作製する場合、水に溶解されたホルマリン−ホルムアルデヒド気体(約37%w/v)が使用される。パラホルムアルデヒドはホルムアルデヒドの重合形態であり、通常は白色の細粉として得られ、加熱されると脱重合してホルマリンに戻る。ホルムアルデヒドは、タンパク質、主に塩基性アミノ酸であるリジン残基、を架橋結合することにより組織を固定する。その効果は過剰な水により可逆性となり、これによりホルマリン色素の沈着が回避される。他の利点としては長期貯蔵および良好な組織透過性が挙げられる。もう1つの一般的な固定用アルデヒドはグルタルアルデヒドである。グルタルアルデヒドは、ホルムアルデヒドと同様に、タンパク質内のαヘリックス構造の変形を引き起こすことにより機能する。しかし、グルタルアルデヒドはホルムアルデヒドより大きな分子であるため、グルタルアルデヒドの膜を通じた拡散速度はホルムアルデヒドより遅い。結果的に、厚みのある試料に対するグルタルアルデヒドによる固定が妨げられる場合があるが、この問題は試料のサイズを縮小させることで克服することができる。グルタルアルデヒド固定の利点の1つは、より強固な、または固く結合した固定産物を与え得ることであり、グルタルアルデヒドの長さおよび2つのアルデヒド基は、グルタルアルデヒドが「架橋」してより遠くのタンパク質分子対を連結することを可能にする。グルタルアルデヒド固定は、急速且つ不可逆的な変化を引き起こし、迅速に固定し、電子顕微鏡観察によく適しており、4℃でよく固定し、最良の全体的な細胞質および細胞核の詳細を与える。しかし、グルタルアルデヒド固定は免疫組織化学染色には適していない。
細胞の回収および固定
細胞を回収し、PBSで1回洗浄し、1.5ml以下のPBS中の1%パラホルムアルデヒドで室温で10分間固定した。グリシンを0.125Mの最終含量になるように室温で5分間加え、反応を停止させた。細胞を500×g、10分間、4℃で集め、1μM PMSFを添加した1ml以下の氷冷PBSで2回洗浄した。
ペレットをRIPA緩衝液(10mMトリス塩酸、pH8.0、1mM EDTA、pH8.0、140mM NaCl、1%Triton x−100、0.1%SDS、0.1%DOC、1×プロテアーゼ阻害剤(シグマ社))中で溶解させ、1ml milliTUBE内で、コバリス社製(Covaris)S220において、断片の大部分が200〜700塩基対の長さになるまで30分間、超音波処理した(設定:デューティサイクル(duty cycle)5%、ピーク放射電力(peak incident power)140ワット、バーストあたりのサイクル数(cycles per burst)200、K562細胞用)。ライセートを最高速度で4℃で5分間遠心した。次に、断片化されたクロマチンを含有する上清を0.5 PCRチューブに移し、氷上に置いた。
超音波処理と並行して、50μl 磁性プロテインA/Gビーズ(低インプット量のChIPmentationでは10μl)を、PBS(0.5%BSA、0.5%Tween−20)中で2回それらを洗浄および再懸濁することにより、ブロッキングおよび抗体結合させた。抗体を加え、室温で1時間超(または4℃で2時間超)回転させてビーズに結合させた。
ChIPあたり、ブロッキングされ、抗体が結合した磁性プロテインAビーズ50μlを加え、4℃で3時間インキュベートした。その後、免疫沈降用ビーズを、冷150μl RIPA(2回)、RIPA−500(10mMトリス塩酸、pH8.0、1mM EDTA、pH8.0、500mM NaCl、1%Triton x−100、0.1%SDS、0.1%DOC)(2回)、およびRIPA−LiCl(10mMトリス塩酸、pH8.0、1mM EDTA、pH8.0、250mM LiCl、1%Triton X−100、0.5%DOC、0.5%NP40(2回)で洗浄した。
ビーズを冷トリス塩酸(pH8.0)で2回洗浄して、界面活性剤、塩、およびEDTAを除去した。次に、ビーズを、Nextera DNA Sample Prep Kit(イルミナ社)のTagment DNA Enzymeを1μl含有する、30μlのタグメンテーション反応混合物(10mM トリス pH8.0、5mM MgCl)中に再懸濁させ、サーモサイクラー内で37℃で10分間インキュベートした。次に、ビーズを磁石の上に置いてタグメンテーション反応を除去し、その後RIPAで2回洗浄した。
最後に、ビーズをTE(pH8.0)で2回洗浄した。複合体を溶出させるため、ビーズを、2μlのプロテアーゼK(NEB)を含有する70μlの溶出緩衝液(0.5%SDS、300mM NaCl、5mM EDTA、10mM トリス塩酸 pH8.0)と、55℃で1時間および65℃で8時間インキュベートして、ホルムアルデヒド架橋を外し、上清を新しいチューブに移した。
最後に、DNAをAMPure XPビーズ(試料:ビーズ比 1:2)またはキアゲン社製MinEluteカラムで精製した。
1μlの各ChIPmentation反応を、0.15μMプライマー(プライマー配列については、Buenrostro et al. Nature Methods(最初のATAC−seqに関する刊行物))、1×SYBR greenおよび5μlのKAPA HIFI 2×ready mixを含有する10μlのqPCR反応中で、以下のプログラムを用いて増幅して、最適な濃縮サイクル数を評価した:72℃5分;98℃30秒;98℃10秒、63℃30秒、72℃30秒を24サイクル;72℃で1分間の最終伸長。第一のPCR工程におけるニックトランスレーションが上手くいくように、PCR反応の調製前にKAPA HIFI 2x ready mixを98℃で45秒間インキュベートして、ホットスタート酵素(hot-start enzyme)を活性化させた。ライブラリーの最終濃縮を、0.75μMプライマーおよび25μlのKAPA HIF 2x ready mixを用いる50μlの反応中で行った。ライブラリーはNサイクル増幅され、ここでNはqPCR反応において決定された端数切り上げのCq値と等しい。
濃縮したライブラリーを、0.7:1(ビーズ:試料)の比でSPRI AMPure XPビーズを用いるサイズ選別法で精製して、長い断片(600bp超)を除去し、2:1(ビーズ:試料)の比で反応中の残留DNAを回収した。配列決定を、イルミナ社製HiSeq2000/2500プラットフォームを用いる、CeMMにおける、Biomedical Sequencing Facilityによって行った。
細胞培養および試料収集
K562細胞を10%FCSおよび抗生物質を添加したRPMI培地中で培養した。細胞をCASYセルカウンターで分析して、細胞数を決定した。ウィーン医科大学の倫理委員会に承認されるように、末梢血を健常人から得た。凝固をEDTAまたはヘパリンで防止し、末梢血をPBSで1:1〜1:3希釈し、Lymphoprep密度勾配(Axis−Shield)を用いて製造業者の説明書に従って末梢血単核球(PBMC)を単離した。精製した細胞を10%FBSおよびペニシリン−ストレプトマイシンを添加したRPMI中に懸濁した。
実施例3〜5で詳述されるクロマチン免疫沈降を行うための3つの異なるプロトコルと組み合わせて、ChIPmentationを試験した。
精製したChIP DNAを、製造業者の取扱説明書に従ってNEBNext End Repair Module(NEB社)を用いて、末端修復した。精製は、製造業者の取扱説明書に従ってAmpure XPビーズ(Agencourt)を用いて行った。Klenow(3’→5’エキソ)ポリメラーゼ(エンジマティクス社(Enzymatics))を用いて断片をポリアデニル化し、T4 DNA Ligase(エンジマティクス社)を用いてTruSeq適合性アダプターを結合した。Ampure XPビーズを用いて最終的なライブラリーをサイズ選別し、アダプター二量体を除去した。
ChIPmentationは種々様々なChIPプロトコルに適合し、これは、異なるChIPプロトコルにおいて最もよく機能する抗体へのChIPmentationの適用を容易にしている。一般的に、免疫沈降したクロマチンを保持するビーズがLiCl含有洗浄緩衝液(実施例3ではChIP用WBIII、実施例4ではChIP用RIPA−LiCl、および実施例5ではChIP用TF−WBIII)で洗浄されるまで、最適なChIPプロトコルが実行される。次に、ビーズをトリス塩酸(pH8.0)で2回洗浄して、界面活性剤、塩およびEDTAを除去する。その後、ビーズを、Nextera DNA Sample Prep Kit(イルミナ社)のTagment DNA酵素を1μl含有する、20〜30μlのタグメンテーション反応緩衝液(10mM トリス pH8.0、5mM MgCl)中に再懸濁させ、サーモサイクラー内で37℃で10〜20分間インキュベートする。タグメンテーションに続いて、ビーズを150μlのWBI(ChIP 実施例3)、RIPA(ChIP 実施例4)、またはWBI(ChIP 実施例5)で2回洗浄する。その後、対応するChIPプロトコルを継続し、最後のビーズ洗浄、ビーズからの溶出、脱架橋およびDNA精製を行う。
末梢血単核球(PBMC)における標準的なH3K4me3 ChIPから精製したChIP DNAを、Qubit蛍光光度計を用いて測定し、次いで、0.1%Tween−20を添加した10mM トリス塩酸(pH8.5)で希釈して、100pg、10pg、または2pgの総DNAにした。タグメンテーション反応を、希釈したDNA、5μlの2×タグメンテーション緩衝液(イルミナ社)および1μl(100pg DNA)または0.5μl(10pgおよび2pg)の1:10希釈Nextera Tag DNA Enzyme(予冷TE/50%グリセロールで希釈)を含有する10μlの反応において、55℃で5分間行った。タグメンテーションしたDNAを、製造業者の取扱説明書に従ってNextera DNA Sample Prep Kit(イルミナ社)を用いて、以下のプログラムで増幅した:72℃5分;98℃30秒;98℃10秒、63℃30秒、72℃30秒を14サイクル;72℃で1分間の最終伸長。1.5:1のビーズ:試料比でSPRI AMPure XPビーズを用いて、ライブラリーを精製した。K562 ChIPからの精製したChIP DNAまたは除タンパクしたインプットDNAは、PBMCに関しての調製に少し変更を加えて、調製した:5ngのChIP DNAを、5μlの反応において0.5μlの1:10希釈Tn5酵素を用いる55℃で5分間のタグメンテーション反応に用いた。MinEluteキット(キアゲン社)を用いてDNAを精製し、KAPA HIFI 2×ready mixを用いて増幅した。
1μlの各ChIPmentation反応を、0.15μMプライマー、1×SYBR greenおよび5μlのKAPA HIFI 2×ready mixを含有する10μlのqPCR反応中で、以下のプログラムを用いて増幅して、最適な濃縮サイクル数を評価した:72℃5分;98℃30秒;98℃10秒、63℃30秒、72℃30秒を24サイクル;72℃で1分間の最終伸長。第一のPCR工程におけるニックトランスレーションが上手くいくように、PCR反応の調製前にKAPA HIFI 2x ready mixを98℃で45秒間インキュベートして、ホットスタート酵素を活性化させた。ライブラリーの最終濃縮を、0.75μMプライマーおよび25μlのKAPA HIF 2x ready mixを用いる50μlの反応中で行った。ライブラリーはNサイクル増幅され、ここでNはqPCR反応において決定された端数切り上げのCq値と等しい。濃縮したライブラリーを、0.7:1(ビーズ:試料)の比でSPRI AMPure XPビーズを用いるサイズ選別法で精製して、長い断片(600bp超)を除去し、2:1(ビーズ:試料)の比で反応中の残留DNAを回収した。配列決定を、イルミナ社製HiSeq2000/2500プラットフォームを用いる、CeMMにおける、Biomedical Sequencing Facilityによって行った(詳細については図8を参照)。
オープンクロマチンのマッピングを、トランスポザーゼ接近可能クロマチン解析法(assay for transposase accessible chromatin)(ATAC−seq)を用いて、K562細胞用に小さな改変を加えた以前の報告の通りに、行った。各実験において、1×105個の細胞を50μlのPBSで1回洗浄し、50μlのATAC−seq溶解緩衝液(10mMトリス塩酸、pH7.4、10mM NaCl、3mM MgCl2および0.01%IGEPAL CA−630)中で再懸濁し、4℃で10分間遠心した。遠心分離後、ペレットを50μlのMgCl2緩衝液(10mM トリス pH8.0、5mM MgCl2)で短時間洗浄し、その後、トランスポザーゼ反応混合物(12.5μLの2×TD緩衝液、2μLのトランスポザーゼ(イルミナ社)および10.5μLのヌクレアーゼ非含有水)中で37℃で30分間インキュベートした。MinEluteキット(キアゲン社)を用いたDNA精製の後、1μlの溶出DNAをqPCR反応に用いて、最適な増幅サイクル数を評価した。ライブラリー増幅の後、SPRIサイズ選別を行い、1200bpより長い断片を排除した。Qubit蛍光光度計(ライフテクノロジーズ社)でDNA濃度を測定した。
リードをskewerを用いてトリミングした。トリミングしたリードを、Bowtie2を「−−very−sensitive」のパラメーターで用いて、ヒトゲノムのhg19/GRCh37アセンブリーにアラインメントした。ChIPmentationおよびATAC−seqのデータについては、転位事象の中心が示されるようにリード開始位置を調整した。前の記述2の通りに、プラス鎖にアラインメントさせたリードは+4bpだけずらし、マイナス鎖にアラインメントさせたリードは−5bpだけずらした。MACS2を用いて、ChIPmentation試料、ChIP−seq試料、およびATAC−seq試料に対してピーク抽出を行った。ChIPおよびChIPmentationのデータについて、MACS2を、200bpの帯域幅を用い、バイオロジカルレプリケート用にバックグラウンドとして独立して適合IgG対照を用いて、実行した。ブロードなヒストンマーク(H3K27me3、H3K36me3)については、「−−broad」、「−−nomodel」、「−−extsize 73」、および「−−pvalue 1e−3」のフラグおよび引数をとった。レプリケート間の一貫性を確認した後、併せたバイオロジカルレプリケートから抽出されたピークに対して、同様に下流解析を行った。ChIPmentationおよびChIP−seqの両試料の相関分析について、ゲノム全体で1,000bpのウインドウ内のリード数を算出し、非重複リードの総数に対して正規化した。ピアソン相関係数を計算し、底を2とするシグナルの対数を全てのウインドウについてプロットした。バイオロジカルレプリケート間、異なる手法間(ChIP−seq対ChIPmentation)、および異なる細胞数間で比較を行った(後者2つは併せたバイオロジカルレプリケートに基づく)。抽出したピーク間の比較を、他のレプリケートからのピークと重なっている上位5%または25%のピークの割合を算出することにより行った。同じ比較を、ChIP−seqとChIPmentationのデータ間、および、両レプリケートを組み合わせた試料を用いて、異なる数の細胞を用いて作製されたChIPmentation試料間で、行った。
細胞をPBSで1回洗浄し、1ml以下のPBS中の1%パラホルムアルデヒドで室温で5分間固定した。グリシンを添加して反応を止めた。細胞を500×g、10分間、4℃で集め(特に記載がない限り、後の作業は氷上で行い、冷緩衝液および冷溶液を使用した)、1μM PMSFを添加した1ml以下の氷冷PBSで2回洗浄した。ペレットを、細胞溶解緩衝液(50mM HEPES/KOH pH7.4、140mM NaCl、1mM EDTA、0.5mM EGTA、10%グリセロール、0.5%NP−40、0.25%Triton X−100、1×プロテアーゼ阻害剤(シグマ社))中で10分間、氷上で溶解させた。溶解させた細胞を1,000×g、4℃で10分間遠心して核を単離し、上清を捨て、ペレットを超音波処理緩衝液(10mM トリス塩酸 pH7.6、1mM EDTA、0.1%SDS)中に再懸濁させ、コバリス社製S220上の130μlのmicroTUBE(3×106個以下の細胞用)内で、断片の大部分が200〜700塩基対の長さになるまで12分間、超音波処理した(設定:デューティサイクル 2%、ピーク放射電力 105ワット、バーストあたりのサイクル数 200)。ライセートを最高速度で4℃で5分間遠心し、上清を新しいチューブに移した。ライセートを、20mM HEPES、0.1%SDS、1%Triton X−100、150mM NaCl、1mM EDTA、0.5mM EGTAの緩衝液組成でIP当たり200μlに調整し、H3K4me3に対する抗体(1μg/IP、ダイアジェノード社(Diagenode)pAb−003−050)またはH3K27me3に対する抗体(1μg/IP、ダイアジェノード社pAb−195−050)と共に、ローテータ上で4℃で一晩インキュベートした。20μlのプロテインA(または、使用する抗体に応じて、プロテインG)磁気ビーズを、PBS中の0.1%BSAで一晩ブロッキングし、翌日IPに加えてローテータ上に4℃で2時間置き、免疫沈降した断片を捕捉した。次に、免疫沈降したクロマチンを、WBI(20mM HEPES、150mM NaCl、0.1%SDS、0.1%DOC、1%Triton X−100、1mM EDTA、0.5mM EGTA)(2回)、WBII(20mM HEPES、500mM NaCl、0.1%SDS、0.1%DOC、1%Triton X−100、1mM EDTA、0.5mM EGTA)(1回)、WBIII(20mM HEPES、250mM LiCl、0.5%DOC、0.5%NP−40、1mM EDTA、0.5mM EGTA)(1回)、およびWBIV(20mM HEPES、1mM EDTA、0.5mM EGTA)(2回)で洗浄した。次に、ビーズを、2μlのプロテアーゼK(NEB)を含有する70μlの溶出緩衝液(0.5%SDS、300mM NaCl、5mM EDTA、10mM トリス塩酸 pH8.0)と、55℃で1時間および65℃で8時間インキュベートして、ホルムアルデヒド架橋を外し、上清を新しいチューブに移した。別の30μlの溶出緩衝液をビーズに加えて1分間置き、溶出液を合わせ、別の1μlのプロテアーゼKと55℃で1時間インキュベートした。最後に、DNAをSPRI AMPure XPビーズ(試料:ビーズ比 1:2)またはキアゲン社製MinEluteカラムで精製した。
細胞をPBSで1回洗浄し、1.5ml以下のPBS中の1%パラホルムアルデヒドで室温で10分間固定した。グリシンを添加して反応を止めた。細胞を500×g、10分間、4℃で集め(特に記載がない限り、後の作業は氷上で行い、冷緩衝液および冷溶液を使用した)、1μM PMSFを添加した1ml以下の氷冷PBSで2回洗浄した。ペレットをRIPA緩衝液(10mMトリス塩酸、pH8.0、1mM EDTA、pH8.0、140mM NaCl、1%Triton x−100、0.1%SDS、0.1%DOC、1×プロテアーゼ阻害剤(シグマ社))中で溶解させ、1ml milliTUBE内で、コバリス社製S220において、断片の大部分が200〜700塩基対の長さになるまで30分間、超音波処理した(設定:デューティサイクル 5%、ピーク放射電力 140ワット、バーストあたりのサイクル数 200)。ライセートを最高速度で4℃で5分間遠心し、超音波処理されたクロマチンを含有する上清を新しいチューブに移した。並行して、50μl(低インプット量のChIPmentationでは10μl)の磁性プロテインAビーズまたは磁性プロテインGビーズ(使用する抗体に依存)を、PBS(0.5%BSA、0.5%Tween−20)中で2回洗浄および再懸濁することにより、ブロッキングおよび抗体結合させた。抗体を加え、室温で1時間超回転させてビーズに結合させた。使用した抗体は、H3K4me1(1μg/IP、ダイアジェノード社pAb−194−050)、H3K36me3(1μg/IP、ダイアジェノード社pAb−192−050)、およびREST(10μg/IP、ミリポア社07−579)であった。次に、ブロッキングした抗体結合ビーズを磁石上に置き、上清を除去し、超音波処理したライセートをビーズに加え、その後、4℃で3時間ローテータ上でインキュベートした。その後、ビーズを、150μl RIPA(2回)、RIPA−500(10mMトリス塩酸、pH8.0、1mM EDTA、pH8.0、500mM NaCl、1%Triton x−100、0.1%SDS、0.1%DOC)(2回)、RIPA−LiCl(10mMトリス塩酸、pH8.0、1mM EDTA、pH8.0、250mM LiCl、1%Triton X−100、0.5%DOC、0.5%NP40)およびTE(pH8.0)(2回)で洗浄した。次に、ビーズを、2μlのプロテアーゼK(NEB)を含有する70μlの溶出緩衝液(0.5%SDS、300mM NaCl、5mM EDTA、10mM トリス塩酸 pH8.0)と、55℃で1時間および65℃で8時間インキュベートして、ホルムアルデヒド架橋を外し、上清を新しいチューブに移した。最後に、DNAをSPRI AMPure XPビーズ(試料:ビーズ比 1:2)またはキアゲン社製MinEluteカラムで精製した。
細胞をPBSで1回洗浄し、1.5ml以下のPBS中の1%パラホルムアルデヒドで室温で5〜10分間固定した。グリシンを添加して反応を止めた。細胞を500×g、10分間、4℃で集め(特に記載がない限り、後の作業は氷上で行い、冷緩衝液および冷溶液を使用した)、1μM PMSFを添加した1ml以下の氷冷PBSで2回洗浄した。ペレットを、L3B緩衝液(10mM トリス塩酸、pH8.0、100mM NaCl、1mM EDTA、0.5mM EGTA、0.1%デオキシコール酸ナトリウム、0.5%N−ラウロイルザルコシン、1×プロテアーゼ阻害剤(シグマ社))中で溶解させ、1ml milliTUBE内で、コバリス社製S220において、断片の大部分が200〜700塩基対の長さになるまで20分間、超音波処理した(設定:デューティサイクル 5%、ピーク放射電力 140ワット、バーストあたりのサイクル数 200)。ライセートに1%Triton X−100を添加し、最高速度で4℃で5分間遠心し、超音波処理されたクロマチンを含有する上清を新しいチューブに移した。並行して、ビーズを、0.5%BSAを含むPBSで2回洗浄し、IP当たり50μl(低インプット量のChIPmentationでは10μlのビーズ)の磁性プロテインAビーズまたは磁性プロテインGビーズ(使用する抗体に依存)を0.5%BSAを含む200μlのPBS中に再懸濁することにより、ブロッキングおよび抗体結合させた。抗体を加え、室温で1時間超または4℃で2時間超、ローテータで回転させてビーズに結合させた。使用した抗体は、H3K27ac(2μg、ダイアジェノード社pAb−196−050)、PU.1(5μg/IP、サンタクルーズ社(Santa Cruz)sc−352)、CTCF(10μl/IP、ミリポア社07−729)、およびGATA1(4μg/IP、低インプット量では2μg、アブカム社ab11852)であった。ブロッキングした抗体結合磁気ビーズをクロマチンを含むチューブに加え、4℃で3時間インキュベートした。次にビーズを、150μlのTF−WBI(20mM トリス塩酸/pH7.4、150mM NaCl、0.1%SDS、1%Triton X−100、2mM EDTA)(2回)、TF−WBIII(250mM LiCl、1%Triton X−100、0.7%DOC、10mMトリス塩酸、1mM EDTA)(2回)、およびTET(0.2%Tween−20、10mMトリス塩酸/pH8.0、1mM EDTA)(2回)で洗浄した。次に、ビーズを、2μlのプロテアーゼK(NEB)を含有する70μlの溶出緩衝液(0.5%SDS、300mM NaCl、5mM EDTA、10mM トリス塩酸 pH8.0)と、55℃で1時間および65℃で8時間インキュベートして、ホルムアルデヒド架橋を外し、上清を新しいチューブに移した。別の30μlの溶出緩衝液をビーズに加えて1分間置き、溶出液を合わせ、別の1μlのプロテアーゼKと55℃で1時間インキュベートした。最後に、DNAをSPRI AMPure XPビーズ(試料:ビーズ比 1:2)またはキアゲン社製MinEluteカラムで精製した。
K562白血病細胞株については、1%ホルムアルデヒドによる固定を室温で10分間行った。超音波処理緩衝液(10mMトリス塩酸 pH7.6、1mM EDTA、0.1%SDS)中のクロマチンを、コバリス社製S220(または同様のバージョン)上の130μlのコバリス社製microTUBE(3×106個以下の細胞用)内で、10〜15分間、以下の設定で、超音波処理した:デューティサイクル 2%、ピーク放射電力 105ワット、バーストあたりのサイクル数 200、推奨水温度最大値 8℃、脱気用ポンプのスイッチオン。第二の例として、クロマチンは、RIPA緩衝液(10mMトリス塩酸、pH8.0、1mM EDTA、pH8.0、140mM NaCl、1%Triton x−100、0.1%SDS、0.1%DOC、1×プロテアーゼ阻害剤(シグマ社))に入れ、1mlのコバリス社製milliTUBE内で、コバリス社製S220(または同様のバージョンの装置)において、25〜30分間、以下の設定で、超音波処理することができる:デューティサイクル 5%、ピーク放射電力 140ワット、バーストあたりのサイクル数 200、推奨水温度最大値 8℃、脱気用ポンプのスイッチオン。
凍結した腫瘍片を、ミクロトームを用いて50μm切片にスライスし、氷上の反応チューブに移した(腫瘍のサイズによるが、複数のヒストンChIPmentation反応には20〜50枚の切片で十分である)。切片をPBSで1回洗浄し、1.5ml以下のPBS中の1%パラホルムアルデヒドを用いて室温で10分間固定する。グリシンを添加して反応を止める。細胞を500×g、10分間、4℃で集め(特に記載がない限り、後の作業は氷上で行い、緩衝液および溶液は冷却されている)、1μM PMSFを添加した1ml以下の氷冷PBSで2回洗浄する。ペレットを、L3B緩衝液(10mM トリス塩酸、pH8.0、100mM NaCl、1mM EDTA、0.5mM EGTA、0.1%デオキシコール酸ナトリウム、0.5%N−ラウロイルザルコシン、1×プロテアーゼ阻害剤(シグマ社))中で溶解させ、1ml milliTUBE内で、コバリス社製S220において、断片の大部分が200〜700塩基対の長さになるまで35分間、超音波処理する(設定:デューティサイクル 5%、ピーク放射電力 140ワット、バーストあたりのサイクル数 200)。ライセートに1%Triton X−100を添加し、最高速度で4℃で5分間遠心し、超音波処理されたクロマチンを含有する上清を新しいチューブに移す。並行して、ビーズを、0.5%BSAを含むPBSで2回洗浄し、IP当たり50μl(低インプット量のChIPmentationでは10μlのビーズ)の磁性プロテインAビーズまたは磁性プロテインGビーズ(使用する抗体に依存)を0.5%BSAを含む200μlのPBS中に再懸濁することにより、ブロッキングおよび抗体結合させる。抗体を加え、室温で1時間超回転させてビーズに結合させる。抗体の例として、H3K27ac(2μg、ダイアジェノード社pAb−196−050)、PU.1(5μg/IP、サンタクルーズ社(Santa Cruz)sc−352)、CTCF(10μl/IP、ミリポア社07−729)、およびGATA1(4μg/IP、および、低インプット量では2μg、アブカム社ab11852)がある。ブロッキングした抗体結合磁気ビーズをクロマチンを含むチューブに加え、4℃で3時間インキュベートする。次にビーズを、150μlのTF−WBI(20mM トリス塩酸/pH7.4、150mM NaCl、0.1%SDS、1%Triton X−100、2mM EDTA)(2回)、およびTF−WBIII(250mM LiCl、1%Triton X−100、0.7%DOC、10mMトリス塩酸、1mM EDTA)(2回)で洗浄する。ビーズを冷トリス塩酸(pH8.0)で2回洗浄して、界面活性剤、塩、およびEDTAを除去する。ビーズを、Nextera DNA Sample Prep Kit(イルミナ社)のTagment DNA Enzymeを1μl含有する、30μlのタグメンテーション反応混合物(10mM トリス pH8.0、5mM MgCl)中に慎重に再懸濁させ、サーモサイクラー内で37℃で10分間インキュベートする。前記反応を磁石上に置き、上清を除去することで、タグメンテーション反応を除去し、ビーズをTF−WBIで2回洗浄する。ビーズをTET(0.2%Tween−20、10mMトリス塩酸/pH8.0、1mM EDTA)(2回)で洗浄する。次に、ビーズを、2μlのプロテアーゼK(NEB)を含有する70μlの溶出緩衝液(0.5%SDS、300mM NaCl、5mM EDTA、10mM トリス塩酸 pH8.0)と、55℃で1時間および65℃で8時間インキュベートして、ホルムアルデヒド架橋を外し、上清を新しいチューブに移す。別の30μlの溶出緩衝液をビーズに加えて1分間置き、溶出液を合わせ、別の1μlのプロテアーゼKと55℃で1時間インキュベートする。最後に、DNAをSPRI AMPure XPビーズ(試料:ビーズ比 1:2)またはキアゲン社製MinEluteカラムで精製し、11μlのH2Oに溶出させる。1μlの各ChIPmentation反応を、0.15μMプライマー、1×SYBR greenおよび5μlのKAPA HIFI 2×ready mixを含有する10μlのqPCR反応中で、以下のプログラムを用いて増幅して、最適な濃縮サイクル数を評価する:72℃5分;98℃30秒;98℃10秒、63℃30秒、72℃30秒を24サイクル;72℃で1分間の最終伸長。第一のPCR工程におけるニックトランスレーションが上手くいくように、PCR反応の調製前にKAPA HIFI 2x ready mixを98℃で45秒間プレインキュベートして、ホットスタート酵素を活性化させる。ライブラリーの最終濃縮(ChIPからの残りの10μlを使用)を、0.75μMプライマーおよび25μlのKAPA HIF 2x ready mixを用いる50μlの反応中で行う。ライブラリーはNサイクル増幅され、ここでNはqPCR反応において決定された端数切り上げのCq値と等しい。濃縮したライブラリーを、0.7:1(ビーズ:試料)の比でSPRI AMPure XPビーズを用いるサイズ選別法で精製して、長い断片(600bp超)を除去し、2:1(ビーズ:試料)の比で反応中の残留DNAを回収する。配列決定を、イルミナ社製HiSeq2000/2500プラットフォームを用いて行う。
当該技術分野において公知の方法を用いて、試料をホルマリン固定しパラフィン包埋する。FFPE試料に対し本発明を使用するために、室温、1mLのヒストレモン(hystolemon)溶液(6〜8回)中での連続的なインキュベーション(各10分間)を通じて、組織試料切片の脱パラフィン(deparaffination)を行う。次に試料を、エタノールによって、エタノール濃度を100%(無水エタノール)から開始して95%、70%、50%、および20%へと減少させながら再水和していき、最終段階として水で再水和する(再水和反応の各段階は室温で5分間)。再水和させたFFPE切片を、0.5mLの透過処理緩衝液[1×トリス緩衝生理食塩水(TBS)、0.5%Tween20、1mM PMSF、および10μg/mLリボヌクレアーゼA]中、室温で30分間、回転台(rotating platform)において、インキュベートする。18,000×g、+4℃で5分間遠心分離した後、試料を200μLの消化緩衝液[50mMトリス塩酸(pH7.4)、0.32Mスクロース、4mM MgCl2、1mM CaCl2、および0.1mM PMSF]中に再懸濁する。FFPE由来試料を、Labsonic L超音波処理器(B.ブラウン・バイオテック・インターナショナル社(B. Braun, Biotech International))を用いて、穏やかな超音波処理を通じて部分的に断片化し、次いで、1U/10μgクロマチンの最終濃度の小球菌ヌクレアーゼ(N.70196Y;USB)により37℃で1分間消化する。18,000×g、+4℃で5分間遠心分離した後、試料を200μLの超音波処理緩衝液[1×TBS、0.1%SDS、および1mM Na2EDTA(pH8.0)]中に再懸濁し、さらに断片化する。8,000×g、室温で5分間遠心分離した後、第一の上清を集める(約170μLの体積)。ペレットを50μLの超音波処理緩衝液で1回洗浄し、5秒間ボルテックスし、再度遠心分離して、第二の上清を得る(約220μLの最終体積に達する)。クロマチンをQubit(インビトロジェン社)によって蛍光定量する。ChIP緩衝液[30mMトリス塩酸(pH7.4)、50mM NaCl、5mM Na2EDTA、および0.1mM PMSF]中、各アッセイに260〜600ngのクロマチンを用いて(各実験でFFPE試料から抽出されたクロマチンの量または行われるChIPアッセイの数に依存)、クロマチンの免疫選択を行い、回転台において、+4℃で16時間、所望の抗体と共にインキュベートする。20μLの50体積%のスラリー状rec−Protein G−Sepharose 4B Conjugate(ChIP緩衝液中1mg/mLのBSAと共に+4℃で16時間プレインキュベート;ザイメッド社(Zymed))を各ChIPアッセイに加え、+4℃で3時間インキュベートする。2,000×g、+4℃で5分間遠心分離した後、ペレットを、2mLの洗浄緩衝液A[50mMトリス塩酸(pH7.4)、1%TritonX−100、50mM NaCl、5mM Na2EDTA、および0.1mM PMSF]および2mLの洗浄緩衝液B[50mMトリス塩酸(pH7.4)、1%TritonX−100、100mM NaCl、5mM Na2EDTA、および0.1mM PMSF]で連続的に洗浄する。ビーズを冷トリス塩酸(pH8.0)で2回洗浄して、界面活性剤、塩、およびEDTAを除去する。ビーズを、Nextera DNA Sample Prep Kit(イルミナ社)のTagment DNA Enzymeを1μl含有する、30μlのタグメンテーション反応混合物(10mM トリス pH8.0、5mM MgCl)中に慎重に再懸濁させ、サーモサイクラー内で37℃で10分間インキュベートする。タグメンテーション反応を磁石上に置き、上清を除去することで、タグメンテーション反応を取り除き、ビーズを2回、洗浄緩衝液Aおよび10mLの洗浄緩衝液C[50mMトリス塩酸(pH7.4)、1%TritonX−100、150mM NaCl、5mM Na2EDTA、および0.1mM PMSF]で洗浄する。200μLの溶出緩衝液[1×トリス−EDTA(TE)/1%SDS]を加えることで溶出を行い、回転台において室温で30分間インキュベートする。1,200×g、室温で5分間遠心分離した後、上清を収集し、前記溶出を繰り返して400μLの最終体積(結合画分)を得る。DNA単離。溶出緩衝液(0.2M NaCl)中、65℃で一晩インキュベートし、次いで80μg/mLプロテアーゼK(+45℃で3時間)で消化することにより、脱架橋を行った。3分の1容のフェノール:クロロホルム(1:1)、1容のフェノール:クロロホルム(1:1)および1容のクロロホルムによる連続抽出で、DNAを単離した。DNAを−20℃で一晩沈殿させる。遠心分離後、DNAペレットを11μLのTE緩衝液中に再懸濁させる(−20℃で保存)。1μlの各ChIPmentation反応を、0.15μMプライマー、1×SYBR greenおよび5μlのKAPA HIFI 2×ready mixを含有する10μlのqPCR反応中で、以下のプログラムを用いて増幅して、最適な濃縮サイクル数を評価する:72℃5分;98℃30秒;98℃10秒、63℃30秒、72℃30秒を24サイクル;72℃で1分間の最終伸長。第一のPCR工程におけるニックトランスレーションが上手くいくように、PCR反応の調製前にKAPA HIFI 2x ready mixを98℃で45秒間プレインキュベートして、ホットスタート酵素を活性化させる。ライブラリーの最終濃縮(ChIPからの残りの10μlを使用)を、0.75μMプライマーおよび25μlのKAPA HIF 2x ready mixを用いる50μlの反応中で行う。ライブラリーはNサイクル増幅され、ここでNはqPCR反応において決定された端数切り上げのCq値と等しい。濃縮したライブラリーを、0.7:1(ビーズ:試料)の比でSPRI AMPure XPビーズを用いるサイズ選別法で精製して、長い断片(600bp超)を除去し、2:1(ビーズ:試料)の比で反応中の残留DNAを回収する。配列決定を、イルミナ社製HiSeq2000/2500プラットフォームを用いて行う。
B細胞性慢性リンパ性白血病(B−CLL)、別名慢性リンパ様白血病(CLL)は、成人において最も一般的な白血病の種類(白血球のがんの一種)である。骨髄から生じ、リンパ節で発達し、正常には抗体産生により感染と戦うB細胞リンパ球に、CLLは影響を及ぼす。
酪酸ナトリウム(NaB)を新鮮末梢血に5mMの最終濃度となるように添加する。これを、室温で等体積のフィコール(GEヘルスケア社、アマシャム社、英国)上に層にして、13.8g、4℃で20分間、速度を落とさずに遠心分離する。PBMC層を抜き取り、5mM NaBを含有する20mlのPBSで2回洗浄する。得られた細胞を完全培地中で洗浄し、250μlのRobosep緩衝液中で再懸濁し、製造業者の説明書に従ってネガティブセレクション用にRobosep装置をセットアップする(EasySep Human CD2 Positive Selection Kit、カタログ番号18657;ステムセルテクノロジーズ社(StemCell technologies)、グルノーブル、フランス)。カラムと結合していない細胞(すなわちCD2−集団)を集め、培地中で再懸濁し、本発明に記載の免疫沈降手順にそのまま使用する。実際には、患者由来の白血病試料は、当該技術分野において公知の方法を用いて凍結することができる。
細胞は1×10e8細胞/mlの濃度で凍結されるべきである。白血病細胞に、等体積のRPMI/50%FCS+20%DMSOを、5分間かけて、繰り返し滴加および混合する(最高濃度1×10e8細胞/ml、最終濃度の凍結用培地RPMI/50%FCS+10%DMSO)。凍結用培地中の1mlの細胞を無菌の標識付きクライオチューブに移す。クライオチューブを室温の凍結保存用ボックスに入れ、凍結保存用ボックスを−80℃のフリーザーに入れる。24時間以内に、凍結したクライオチューブを窒素タンクに移す。
37℃の水浴中で極めて迅速に、細胞を融解させる。バイアルを開く前に70%エタノールで拭く。直ちに1mlの細胞を、37℃に予め温めたRPMI/10%FCSを含む15mlチューブに移す。細胞を250×g、室温で5分間遠心する。細胞ペレットを、37℃に予め温めた2mlのRPMI/10%FCSに慎重に再懸濁させる。免疫沈降へ進む。
細胞をPBSで1回洗浄し、1ml以下のPBS中の1%パラホルムアルデヒドで室温で5分間固定する。グリシンを添加して反応を止める。細胞を500×g、10分間、4℃で集め(特に記載がない限り、後の作業は氷上で行い、冷緩衝液および冷溶液を使用する)、1μM PMSFを添加した1ml以下の氷冷PBSで2回洗浄する。ペレットを、細胞溶解緩衝液(50mM HEPES/KOH pH7.4、140mM NaCl、1mM EDTA、0.5mM EGTA、10%グリセロール、0.5%NP−40、0.25%Triton X−100、1×プロテアーゼ阻害剤(シグマ社))中で10分間、氷上で溶解させる。溶解させた細胞を1,000×g、4℃で10分間遠心して核を単離し、上清を捨て、ペレットを超音波処理緩衝液(10mM トリス塩酸 pH7.6、1mM EDTA、0.1%SDS)中に再懸濁させ、コバリス社製S220上の130μlのmicroTUBE(3×106個以下の細胞用)内で、断片の大部分が200〜700塩基対の長さになるまで15分間、超音波処理する(設定:デューティサイクル 2%、ピーク放射電力 105ワット、バーストあたりのサイクル数 200)。ライセートを最高速度で4℃で5分間遠心し、上清を新しいチューブに移す。ライセートを、20mM HEPES、0.1%SDS、1%Triton X−100、150mM NaCl、1mM EDTA、0.5mM EGTAの緩衝液組成でIP当たり200μlに調整し、最適な抗体と共に、ローテータ上で4℃で一晩インキュベートする。20μlのプロテインA(または、使用する抗体に応じて、プロテインG)磁気ビーズを、PBS中の0.1%BSAで一晩ブロッキングし、翌日IPに加えてローテータ上に4℃で2時間置き、免疫沈降した断片を捕捉する。次に、免疫沈降したクロマチンを、WBI(20mM HEPES、150mM NaCl、0.1%SDS、0.1%DOC、1%Triton X−100、1mM EDTA、0.5mM EGTA)(2回)、WBII(20mM HEPES、500mM NaCl、0.1%SDS、0.1%DOC、1%Triton X−100、1mM EDTA、0.5mM EGTA)(1回)、およびWBIII(20mM HEPES、250mM LiCl、0.5%DOC、0.5%NP−40、1mM EDTA、0.5mM EGTA)(1回)で洗浄する。ビーズを冷トリス塩酸(pH8.0)で2回洗浄して、界面活性剤、塩、およびEDTAを除去する。ビーズを、Nextera DNA Sample Prep Kit(イルミナ社)のTagment DNA Enzymeを1μl含有する、30μlのタグメンテーション反応混合物(10mM トリス pH8.0、5mM MgCl)中に慎重に再懸濁させ、サーモサイクラー内で37℃で10分間インキュベートする。前記反応を磁石上に置き、上清を除去することで、タグメンテーション反応を除去し、ビーズをWBIで2回洗浄する。ビーズをWBIV(20mM HEPES、1mM EDTA、0.5mM EGTA)(2回)で洗浄する。次に、ビーズを、2μlのプロテアーゼK(NEB)を含有する70μlの溶出緩衝液(0.5%SDS、300mM NaCl、5mM EDTA、10mM トリス塩酸 pH8.0)と、55℃で1時間および65℃で8時間インキュベートして、ホルムアルデヒド架橋を外し、上清を新しいチューブに移す。別の30μlの溶出緩衝液をビーズに加えて1分間置き、溶出液を合わせ、別の1μlのプロテアーゼKと55℃で1時間インキュベートする。最後に、DNAをSPRI AMPure XPビーズ(試料:ビーズ比 1:2)またはキアゲン社製MinEluteカラムで精製する。DNAを11μlのEB緩衝液(10mMトリス塩酸 pH8.5)中に溶出させる。1μlの各ChIPmentation反応を、0.15μMプライマー、1×SYBR greenおよび5μlのKAPA HIFI 2×ready mixを含有する10μlのqPCR反応中で、以下のプログラムを用いて増幅して、最適な濃縮サイクル数を評価する:72℃5分;98℃30秒;98℃10秒、63℃30秒、72℃30秒を24サイクル;72℃で1分間の最終伸長。第一のPCR工程におけるニックトランスレーションが上手くいくように、PCR反応の調製前にKAPA HIFI 2x ready mixを98℃で45秒間プレインキュベートして、ホットスタート酵素を活性化させる。ライブラリーの最終濃縮(ChIPからの残りの10μlを使用)を、0.75μMプライマーおよび25μlのKAPA HIF 2x ready mixを用いる50μlの反応中で行う。ライブラリーはNサイクル増幅され、ここでNはqPCR反応において決定された端数切り上げのCq値と等しい。濃縮したライブラリーを、0.7:1(ビーズ:試料)の比でSPRI AMPure XPビーズを用いるサイズ選別法で精製して、長い断片(600bp超)を除去し、2:1(ビーズ:試料)の比で反応中の残留DNAを回収する。配列決定を、イルミナ社製HiSeq2000/2500プラットフォームを用いて行う。
K562細胞は、最初に樹立されたヒト不死化骨髄性白血病株であった。K562細胞は赤白血病型の細胞であり、K562細胞株は、急性転化期の53歳の女性CML患者に由来する。K562細胞は非接着性で丸く、bcr:abl融合遺伝子について陽性であり、未分化の顆粒球および赤血球の両方といくつかのプロテオミクス的な類似点がある。
本発明の方法は、ゲノム全体のヒストン−DNA相互作用の解析に低インプット量しか必要としない。本発明により、少ない細胞数からなる個々の動物の初期発生段階の解析が可能となることが期待される。1つの例として、コイ目(Cypriniformes)ヒメハヤ科(コイ科(Cyprinidae))に属する熱帯淡水魚である、ゼブラフィッシュ(Danio rerio)がある。ゼブラフィッシュは、ヒマラヤ地方を原産とし、観賞魚として人気が高く、しばしばゼブラダニオ(zebra danio)という商品名で販売されている。ゼブラフィッシュはまた、科学研究において重要な、脊椎動物のモデル生物である。受精後、卵子は分割し、4時間後には既に胚は数千個の細胞からなり、本発明を用いた単一胚におけるヒストン修飾の解析に充分となり得る。本発明が細胞に対して使用可能となるように、初期発生段階の胚の貯蔵を利用して細胞数を増加させることもできる。提案されたプロトコルは、所望の細胞型/組織/発生段階の単離が当該技術分野において周知の方法を用いて実行される場合、あらゆる種類の他の生物、例えばマウス、に適合可能である。ある特定の状況(すなわち、過剰発現実験またはノックダウン実験)では、この手法に必要な多数の胚を一度に入手することが困難である可能性がある。これらの場合、胚の処理および固定を数回に分けて行うことができ、これは、液体窒素中で凍結し、必要な胚の総数が集まるまで−80℃で保存することができる。全ての胚が同じ発生段階で収集されたことを確認するため、ゼブラフィッシュの雌と雄を15分間だけつがわせ、胚用培地(E3培地:5mM NaCl、0.17mM KCl、0.4mM CaCl2、0.16mM MgSO4)を含むペトリ皿に胚を集め、それらを所望の発生段階に達するまで28℃で育てる。0.50mlのE3中に胚を集め、5μlの30mg/mlプロナーゼ(ロシュ社、参照10165921001)を添加する。胚を28℃で穏やかに振盪およびインキュベートする。卵膜の軟化には約15分間かかる。立体顕微鏡下で、卵膜を持たない最初の胚が見つかるまで胚を調べる。直ちに、胚をE3培地で徹底的に洗浄して(3回)、プロナーゼを完全に取り除く。卵膜から胚を外すため、ピペットを用いてE3培地中で慎重にそれらをピペッティングする。胚をピペットで0.5mlチューブに移し、E3を全て除去する。0.46mlのE3および0.4mlの4%PFA(4%PFA(シグマ社P6148)、リン酸緩衝液200mM、pH7.4、NaOH 0.02N)を胚に加え、室温で15分間穏やかに振盪する。グリシン(メルク社、1.00590.1000)を0.125Mの最終濃度になるように加えてホルムアルデヒドを抑制し、室温で5分間穏やかに振盪する。上清を除去し、胚を氷冷1×PBS中で3回すすぐ。PBSを除去し、細胞溶解を行うか、またはペレットを液体窒素中で凍結して−80℃で保存する。以後は4℃の低温室で作業を行う。Dyna Protein G磁気ビーズをしっかりと混ぜる。10μl(抗体当たり)を取り、それらを1.5mlセーフロックチューブ内で1mlの新鮮ブロッキング溶液(1×PBS中0.5%BSA;4℃で1週間保存可)中で洗浄する。3000rpmで3分間遠心してビーズを集める。ビーズを1.5mlのブロッキング溶液でさらに2回洗浄する。それぞれの洗浄の後、ビーズを激しく再懸濁させる。磁気スタンド(DYNAMag−Spin、インビトロジェン社123.20D)を用いてビーズを集め、上清を捨てる。ビーズを10μlのブロッキング溶液に再懸濁し、抗体を加える。いくつかの抗体の含量は以下とすることができる:1μlの抗H3K4me1抗体(ダイアジェノード社、カタログ番号CS−037−100、濃度未定)、1μlの抗H3K4me3抗体(ダイアジェノード社、カタログ番号pAb−003−050、1.1μg/μl)、1μlの抗H3K27ac抗体(アブカム社、カタログ番号ab4729、0.80mg/ml)および1μlの抗H3K27me3(ミリポア社07−449、1mg/ml)。抗体を4℃で最低で4時間または一晩、回転台上でインキュベートする。磁気スタンドを用いてビーズを集め、上清を除去する。低温室内で、ビーズを0.2mlのブロッキング溶液で洗浄する。この工程をさらに2回繰り返す。ビーズを10μlのブロッキング溶液に再懸濁する。使用の直前に、プロテアーゼ阻害剤(Complete tablet、ロシュ社11697498001)を全ての溶解緩衝液に加える。(Completeの50×ストック(1錠剤/ml 1×PBS)は−20℃で2ヵ月間保存可能)。架橋結合後の胚を、0.13mlの細胞溶解緩衝液(50mMトリス塩酸 pH7.5、10mM EDTA、1%SDS)に再懸濁する。破壊のために胚を上下にピペッティングし、圧搾(squeeze)する。チューブを氷上に置き、10分間インキュベートする。試料を15分間氷上で放置し、氷水浴を新たに加える。コバリス社製S220上の130μlのmicroTUBE(コバリス社、3×106個以下の細胞用)内で、断片の大部分が200〜700塩基対の長さになるまで10〜60分間(使用される胚の多さに依存し、実験的に求める必要がある)、超音波処理する(設定:デューティサイクル 2%、ピーク放射電力 105ワット、バーストあたりのサイクル数 200)。
インビボでの、ゲノム全域にわたる、ビオチン化JQ1の占有解析(インビボChem−seq)。
対数増殖期のMM1.S細胞(試料当たり2×108個の細胞)を、5μMビオチン化JQ1(Bio−JQ1)またはDMSO(ビヒクル)および1%ホルムアルデヒドで同時に、細胞培養液中で20分間処理する。トリスが300mMの最終濃度となるようにトリス緩衝液(pH7.5)を加えて、化学的な架橋結合を終了させる。シリコン製スクレーパーを用いて細胞を回収し、遠心分離し、得られたペレットをPBSで3回洗浄する。細胞核を以下の通りに調製する。細胞を、50mM HEPES、pH7.5、140mM NaCl、1mM EDTA、10%グリセロール、0.5%NP−40、0.25%Triton X−100およびプロテアーゼ阻害剤混合物「complete」(ロシュ社)中で溶解し、細胞核を10mMトリス塩酸、pH8.0、200mM NaCl、1mM EDTA、0.5mM EGTAおよびプロテアーゼ阻害剤で1回洗浄する。核を、50mM HEPES−KOH、pH7.5、140mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、1%Triton X−100、0.1%デオキシコール酸ナトリウム、0.1%SDS(超音波処理緩衝液)およびプロテアーゼ阻害剤混合物中で、氷上、18Wで、10サイクル(各30秒)、サイクル間に30秒間の間隔を空けて、再懸濁および超音波処理する。超音波処理したライセートを遠心分離で清澄にし、磁性ストレプトアビジンDynabeads(MyOne Streptavidin T1、インビトロジェン社)と共に4℃で16〜20時間インキュベートする(ビーズはこのインキュベーション工程の前に0.5%BSA含有PBS中でブロッキングする)。超音波処理した核ライセートのインキュベーション後、ビーズを、超音波処理緩衝液で2回、500mM NaClを含有する超音波処理緩衝液で1回、LiCl緩衝液(20mMトリス塩酸、pH8.0、1mM EDTA、250mM LiCl、0.5%NP−40、0.5%デオキシコール酸ナトリウム)で1回洗浄する。ビーズを冷トリス塩酸(pH8.0)で2回洗浄して、界面活性剤、塩、およびEDTAを除去する。ビーズを30μlのタグメンテーション反応混合物(ここでは:Nextera DNA Sample Prep Kit(イルミナ社)のTagment DNA Enzymeを2μl、Nextera DNA Sample Prep Kitの2×Tagment DNA緩衝液を15μl、およびヌクレアーゼ非含有水を13μl)中で慎重に再懸濁し、サーモサイクラー内で37℃で3分間インキュベートする。前記反応を磁石上に置き、上清を除去することで、タグメンテーション反応を除去し、ビーズを超音波処理緩衝液で2回洗浄する。次に、ビーズを10mMトリス(pH7.5)、0.1mM EDTAで1回洗浄する。その後、結合したタンパク質−DNA複合体を50mMトリス塩酸、pH8.0、10mM EDTA、1%SDS中、65℃で15分間溶離させ、溶離液を65℃で一晩インキュベートして架橋結合を外す。混入したRNAおよびタンパク質を、それぞれリボヌクレアーゼおよびプロテアーゼKの添加により消化し、上述の通りにDNAを精製する34。最後に、精製したDNA断片を超並列配列決定にかける。
対数増殖期の未処理MM1.S細胞を、1%ホルムアルデヒドで20分間、細胞培養液中で固定する。化学的な架橋結合を終了させ、細胞核を調製し、超音波処理した核ライセートを上記のように得る。しかし、インビボのプロトコルと異なり、ストレプトアビジンDynabeadsを、0.5%BSAおよび200μMビオチン化薬剤またはビヒクル(DMSO)を含有するPBS中で6時間プレインキュベートする。その後、薬剤が結合したビーズをPBS/0.5%BSAで4回洗浄して未結合の薬剤を除去し、超音波処理した核ライセート中、4℃で16〜20時間インキュベートする。以降の工程は全て上記(インビボChem−seq法)と同じである。
対数増殖期の未処理MM1.S細胞を、0.5%ホルムアルデヒドで5分間、細胞培養液中で固定する。トリスが300mMの最終濃度となるようにトリス緩衝液(pH7.5)を加えて、化学的な架橋結合を終了させる。細胞をPBSで3回洗浄し、細胞核を以下の通りに調製する。細胞核を、50mM HEPES、pH7.5、140mM NaCl、1mM EDTA、10%グリセロール、0.5%NP−40、0.25%Triton X−100およびプロテアーゼ阻害剤混合物「complete」(ロシュ社)中で溶解し、細胞核を10mMトリス塩酸、pH8.0、200mM NaCl、1mM EDTA、0.5mM EGTAおよびプロテアーゼ阻害剤で1回洗浄する。核を、50mM HEPES−KOH、pH7.5、140mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、0.5%NP−40、0.5%Triton−X(超音波処理緩衝液)中で再懸濁および超音波処理する。ペレットを、氷上、Misonix超音波処理器内で、9〜12Wで、4サイクル(各30秒間)、サイクル間に1分間の間隔を空けて、超音波処理する。薬剤結合ビーズを清澄化した超音波処理物に加え、12〜18時間沈降させる。その後、薬剤結合ビーズを超音波処理緩衝液で3回洗浄する。ビーズを冷トリス塩酸(pH8.0)で2回洗浄して、界面活性剤、塩、およびEDTAを除去する。ビーズを30μlのタグメンテーション反応混合物(ここでは:Nextera DNA Sample Prep Kit(イルミナ社)のTagment DNA Enzymeを2μl、Nextera DNA Sample Prep Kitの2×Tagment DNA緩衝液を15μl、およびヌクレアーゼ非含有水を13μl)中で慎重に再懸濁し、サーモサイクラー内で37℃で3分間インキュベートする。前記反応を磁石上に置き、上清を除去することで、タグメンテーション反応を除去し、ビーズを超音波処理緩衝液で2回洗浄する。タンパク質を1%SDS中で溶離させ、溶離液を1%SDS中、65℃で一晩インキュベートすることにより架橋結合を外す。混入したRNAおよびタンパク質を、リボヌクレアーゼAおよびプロテアーゼKと共に順次インキュベートすることにより消化し、上述の通りにDNAを精製する。精製したDNA断片を超並列配列決定にかける。
Nuclei EZ prepキット(シグマ社)を用いて、細胞核を対数増殖期のMM.S細胞から調製する。次に、核を氷冷PBSに再懸濁し、そのまま、5μMビオチン化ソラレンまたはビヒクル(DMSO)と共に4℃で30分間インキュベートする。核をPBSで1回洗浄し、その後すぐに、氷上で30分間、360nmで照射する(Stratalinker)。核を、50mM HEPES−KOH、pH7.5、140mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、1%Triton X−100、0.1%デオキシコール酸ナトリウム、0.1%SDS(超音波処理緩衝液)およびプロテアーゼ阻害剤混合物中で、氷上、18Wで、10サイクル(各30秒)、サイクル間に30秒間の間隔を空けて、再懸濁および超音波処理する。超音波処理したライセートを遠心分離で清澄にし、磁性ストレプトアビジンDynabeads(MyOne Streptavidin T1、インビトロジェン社)と共に4℃で16〜20時間インキュベートする(ビーズはこのインキュベーション工程の前に0.5%BSA含有PBS中でブロッキングする)。超音波処理した核ライセートのインキュベーション後、ビーズを、超音波処理緩衝液で2回、500mM NaClを含有する超音波処理緩衝液で1回、LiCl緩衝液(20mMトリス塩酸、pH8.0、1mM EDTA、250mM LiCl、0.5%NP−40、0.5%デオキシコール酸ナトリウム)で1回洗浄する。ビーズを冷トリス塩酸(pH8.0)で2回洗浄して、界面活性剤、塩、およびEDTAを除去する。ビーズを30μlのタグメンテーション反応混合物(ここでは:Nextera DNA Sample Prep Kit(イルミナ社)のTagment DNA Enzymeを2μl、Nextera DNA Sample Prep Kitの2×Tagment DNA緩衝液を15μl、およびヌクレアーゼ非含有水を13μl)中で慎重に再懸濁し、サーモサイクラー内で37℃で3分間インキュベートする。前記反応を磁石上に置き、上清を除去することで、タグメンテーション反応を除去し、ビーズを超音波処理緩衝液で2回洗浄し、次いで、10mMトリス、pH7.5、0.1mM EDTAで1回洗浄する。その後、結合したタンパク質−DNA複合体を50mMトリス塩酸、pH8.0、10mM EDTA、1%SDSおよび10mMビオチン中で溶離させ、溶離液を65℃で一晩インキュベートする。混入したRNAおよびタンパク質を、それぞれリボヌクレアーゼおよびプロテアーゼKの添加により消化し、上述の通りにDNAを精製する。最後に、精製したDNA試料を254nmで5分間照射して(Stratalinker)ソラレン−DNA架橋結合を外し、その後、ライブラリー調製、超並列DNA配列決定法を行う。
複数のパラメーターを最適化することで、本発明の方法を用いた実験における信号雑音比を改善することができる。本明細書中で提供される例示的なプロトコルは、チューブ換えおよび特定のタグメンテーション緩衝液を用いることで、タグメンテーション時間を約1分間に短縮する。前記プロトコルは、実施例3、4および5にそれぞれ記載されるプロトコルのような、様々なChIP用プロトコルに適合する。これにより、前記プロトコルは、ある特定のChIPプロトコルにおいて最もよく機能する抗体への適用が容易である。免疫沈降したクロマチンを有するビーズをLiCl含有洗浄緩衝液(実施例3ではWBIII、実施例4ではRIPA−LiCl、実施例5ではTF−WBIII)で洗浄するまで、実施例3、4または5のプロトコルに従うことにより、最良の信号雑音比が認められた。次に、ビーズを冷トリス塩酸(pH8.0)で1回洗浄して、界面活性剤、塩、およびEDTAを除去した。その後、ビーズを再度冷トリス塩酸(pH8.0)で洗浄したが、その後すぐに反応を磁石上に置いて上清を捨てることをしなかった。その代わり、ビーズを含む反応全体を新しいチューブに移し、その後に、磁石上に置いて上清を除去した。これにより、チューブ壁に付着している非特異的なクロマチン断片のタグメンテーションが減少した。次に、ビーズを、Nextera DNA Sample Prep Kit(イルミナ社)のTagment DNA Enzymeを1μl含有する、25μlのタグメンテーション反応混合物(10mM トリス pH8.0、5mM MgCl2、10体積%ジメチルホルムアミド)中に慎重に再懸濁させ、サーモサイクラー内で37℃で1分間インキュベートした。トランスポザーゼはオリゴヌクレオチドをDNAに組み込むための機構として水分子を求核攻撃(nucleophilic attac)に利用することから、極性非プロトン(aprotoc)溶媒としてのジメチルホルムアミドは求核反応を増強することができるため、転位反応において有効であり得る。あるいは、NexeraキットのTagment DNA緩衝液を用いてもよい。タグメンテーション反応を除去し、ビーズをWBI(実施例3)、RIPA(実施例4)、またはTF−WBI(実施例5)で2回洗浄した。その後は、ChIPプロトコルに従ったが、前工程で既述したようにWBIV(実施例3)、TE(実施例4)、またはTET(実施例5)で2回目の洗浄を行う際に反応を再度新しいチューブに移した。これにより、チューブ壁に付着しているタグ付けされた非特異的クロマチン断片の繰り越し汚染が減少した。実験は500,000個の細胞を用いて行い、それぞれ500,000個の細胞または10,000,000個(10Mio)の細胞を使用して、チューブ換え無しの、ジメチルホルムアミドを使用しない標準プロトコルと比較した。結果を図12を示す。最適化されたプロトコルは、本明細書に記載の方法の標準プロトコルによる10,000,000個の細胞を用いた実験以上の信号雑音比を与えている。
さらにアッセイ時間を最適化するため、脱架橋のための加熱温度を上昇させてもよい。従って、例えば、最初の変性前に72℃5分間のPCR工程が推奨されるNexteraプロトコルのように、リバース鎖上のアダプター配列を充填するための追加の「末端修復」工程と共に、本発明の方法を実行した。そうするために、PCRマスターミックスを加え、試料を72℃に加熱し、95℃で脱架橋した。トランスポザーゼはDNAに「固着(stick)」し得るため、プロトコルは、末端修復を可能にするために、末端修復前のEDTAによるトランスポザーゼの「剥がし」、MgCl2によるEDTAのクエンチングを提案している(EDTAはあらゆるPCRを妨害する)。最終洗浄工程までのChIPmentationを含み、溶出緩衝液でビーズからクロマチンをすぐに溶離させる代わりに、末端修復のためのPCRマスターミックスの直接的な添加により(a以下);クロマチンからのトランスポザーゼの完全な剥離を確実にするためのEDTA、次いでMgCl2によるクエンチング、次いで末端修復のためのPCRマスターミックスの添加により(b以下);または、上記のように単により速い手順を用いて(c以下)、ビーズを再懸濁させる、プロトコルを含む、いくつかの超高速プロトコルを実行した。その後、反応を72℃で5分間インキュベートして末端を修復し(=第二鎖のアダプター末端を埋め)、95℃で10〜15分間架橋を外し、反応に新鮮なPCRマスターミックスを補給し(または、プロトコル2cの場合は補給しない)、プライマーを添加し、ライブラリーを増幅した。(a)の場合、クロマチンを保持するビーズを最後に洗浄するまで、ChIPmentation手順に従った。上清を捨て、ビーズを14μlの冷1×KAPA HiFi Hot Start ReadyMix(95℃に30秒間予熱)に再懸濁した。反応を72℃で5分間、次いで95℃で10分間インキュベートした。その後、反応を4℃に冷却した。後のPCRのため、各1.5μlのフォワードプライマーおよびリバースプライマー(それぞれ25μM)、15μlのH2Oおよび18μlの2×KAPA HiFi Hot Start ReadyMix(95℃に30秒間予熱)を加え、DNAを増幅した。(b)の場合、クロマチンを保持するビーズを最後に洗浄し、上清を捨てるまで、ChIPmentation手順に従った。ビーズを8μlの50mM EDTAに再懸濁し、50℃で30分間インキュベートした。次に、2μlの200mM MgCl2を加え、50℃で30分間インキュベートし、その後、10μlの2×KAPA HiFi Hot Start ReadyMixを加え(95℃に30秒間予熱)、72℃で5分間インキュベートした。その後、反応を95℃で10分間インキュベートし、次いで4℃に冷却した。最後に、各1.5μlの25μMフォワードプライマーおよびリバースプライマー、12μlのH2Oおよび15μlの2×KAPA HiFi Hot Start ReadyMixを加え(95℃に30秒間予熱)、ChIPmentationライブラリー増幅パラメーターに基づいて12〜18サイクルを用いて反応を増幅した。(c)の場合、クロマチンを保持するビーズを最後に洗浄し、上清を捨てるまで、ChIPmentation手順に従った。次に、11μlの20mM EDTAを加え、50℃で10分間インキュベートした。その後、11μlの20mM MgCl2および25μlの2×KAPA HiFi Hot Start ReadyMixを加え(95℃に30秒間予熱)、72℃で5分間インキュベートした。反応を95°Cで10分間インキュベートし、次いで4℃に冷却した。次に、各1.5μlの25μMフォワードプライマーおよびリバースプライマーを加え、ChIPmentationライブラリー増幅パラメーターに基づいて12〜18サイクルで反応を増幅した。結果を図15に示す。すなわち、本明細書に記載の超高速手順の使用は、実験時間を有意に短縮しつつ、同等のデータ妥当性をもたらした。特に、(c)の場合、細胞培養からライブラリー増幅までの全手順を一作業日で完了することができる。より具体的には、実験工程は、細胞の回収およびビーズの調製(実施例5に従う)(20分間)、ホルムアルデヒドでの細胞の固定およびペレットの洗浄(45分間)、細胞の溶解および超音波処理(sonify)(40分間)、抗体でのクロマチンの単離(=免疫沈降工程、実施例5に従う場合は3時間)、クロマチンの洗浄(30分間)、トランスポザーゼの添加(10分間)、後の洗浄(10分間)、末端修復および脱架橋(30分間)、ライブラリーの増幅(45分間)、並びにライブラリーの精製(45分間)、を含み、合計時間は8時間未満となる。ここで、長い作業日のスケジュールに、患者からの特定の細胞(例えば、CD4+T細胞)の単離を、まだ組み込むことができる(採血およびCD4+単離に+90分間)。第二の操作者が適切な配列決定装置(例えば、イルミナ社製MiSeq)を準備している場合、試料をオーバーナイトで配列決定することができ、これにより、患者採血から配列決定までが約24時間の完全なワークフローができあがり、臨床的なタイムスケールでのエピゲノムの個別化が可能となる。より具体的には、ChIPmentation試料をイルミナ社製MiSeqでMiSeq Reagent Kit v3を用いて配列決定する場合、50回の配列決定サイクルを、約25百万個のクラスターから、5〜6時間で完了することが可能であり、これにより、採血から配列決定ChIPmentation実験(sequenced ChIPmentation experiment)までの合計時間は約15時間となる。
別のトランスポザーゼをPicelli et al. (2014) Genome Research 24:2033-40に従って調製した。簡潔には、Picelli et al.に従って(上記の通りに)、配列番号3の配列を有する発現ベクターを用いて、C末端インテインタグおよびキチン結合ドメインを含有する自家製トランスポザーゼをコードする核酸に関連する配列番号1またはコアトランスポザーゼ酵素に関連する配列番号2の配列にコードされるアミノ酸配列を有するTn5酵素を作製および保存し、次に、一定分量のTn5をTn5希釈緩衝液で希釈し(Tn5の活性に応じて)、Tn5に積載させるためのオリゴヌクレオチドを作製し、その後、希釈されたTn5にオリゴヌクレオチドを積載する(全ての工程は上記の通り)。「自家製」Tn5は代わりとしてそのまま使用することができる。以下の緩衝液を使用した:Tn5希釈緩衝液(50mMトリス塩酸(pH7.5);100mM NaCl;0.1mM EDTA;50%グリセロール;0.1%Triton X−100および1mM DTT(通常は希釈前に新鮮なものを加える:1mlの緩衝液当たり1μlの1M DTT)。モザイク末端(Mosaic End)オリゴヌクレオチドのプレアニーリングのために、以下の手順に従った:(1)Tn5ME−Aオリゴヌクレオチド+Tn5MErevオリゴヌクレオチドの100μM等モル混合物およびTn5ME−Bオリゴヌクレオチド+Tn5MErevオリゴヌクレオチドの100μM等モル混合物の調製;Tn5MErev:5’−[リン酸化]CTGTCTCTTATACACATCT−3’(配列番号4);Tn5ME−A:5’−TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG−3’(配列番号5)およびTn5ME−B:5’−GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG−3’(配列番号6)を使用、ここで、Tn5Merevは5’末端がリン酸化されている;(2)両混合物を95℃で3分間インキュベートし、サーモブロックの電源を切って一晩インキュベートして冷却し、その後、両方を1:1で混合、(3)0.143容のプレアニーリングされたオリゴヌクレオチド1:1をTn5希釈物に添加し、室温で1時間インキュベートすることにより、トランスポソームの生成を行い、必要になるまで氷上でインキュベート。
Claims (30)
- シーケンスライブラリーの調製方法であって、
(a) 核酸を含む試料へのクロマチン結合剤の添加;
(b) 前記剤が結合したクロマチンの単離;
(c) 工程(b)の単離クロマチンへのトランスポザーゼの添加;
(d) クロマチンからの核酸の単離;および
(e) シーケンスライブラリーの入手、
を含む方法。 - シーケンスライブラリーの調製方法であって、
(a) 核酸を含む試料へのクロマチン結合抗体の添加;
(b) 前記抗体が結合したクロマチンの単離;
(c) 工程(b)の結合および単離されたクロマチンへのトランスポザーゼの添加;
(d) クロマチンからの核酸の単離;並びに
(e) シーケンスライブラリーの入手、
を含む方法。 - 核酸を含む分子間の相互作用のマッピング方法であって、
(a) 核酸を含む試料へのクロマチン結合剤の添加;
(b) 前記剤が結合したクロマチンの単離;
(c) 工程(b)の単離クロマチンへのトランスポザーゼの添加;
(d) クロマチンからの核酸の単離;
(e) 核酸の増幅;
(f) 増幅された核酸の配列決定;および
(g) 分子間相互作用の特定、
を含む方法。 - 核酸を含む分子間の相互作用のマッピング方法であって、
(a) 核酸を含む試料へのクロマチン結合抗体の添加;
(b) 前記抗体が結合したクロマチンの単離;
(c) 工程(b)の結合および単離されたクロマチンへのトランスポザーゼの添加;
(d) クロマチンからの核酸の単離;
(e) 核酸の増幅;
(f) 増幅された核酸の配列決定;並びに
(g) 分子間相互作用の特定、
を含む方法。 - 核酸を含む試料が、
(i) 細胞の培養および回収;
(ii) 細胞の固定;
(iii) 細胞の溶解およびそれによる核酸を含む第一試料の入手;並びに
(iv) 第一試料の超音波処理およびそれによる、第1項または第2項に記載の方法で使用されるべき、核酸を含む第二試料の入手、
によって調製された、請求項1〜4に記載の方法。 - 細胞固定中に導入された架橋結合を外す工程をさらに含む、請求項1〜5に記載の方法。
- 核酸が、DNAである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞が、核酸−タンパク質複合体を含む、請求項5〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞が、ヒト細胞、動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、古細菌細胞、植物細胞またはウイルスである、請求項8に記載の方法。
- ヒト細胞または動物細胞が、疾患細胞もしくは非疾患細胞、または疾患組織由来細胞もしくは非疾患組織由来細胞である、請求項9に記載の方法。
- ヒト細胞または動物細胞が、がん細胞、免疫細胞、血液細胞または幹細胞である、請求項9または10に記載の方法。
- がんが、固形がんまたは血液がんである、請求項11に記載の方法。
- 血液がんが、白血病である、請求項12に記載の方法。
- 固形がんが、腫瘍である、請求項12に記載の方法。
- 動物が、希少種に属する、絶滅危惧種に属する、および/またはモデル生物である、請求項9、10または11に記載の方法。
- 細胞が、胚細胞である、請求項9、10または11に記載の方法。
- 工程(ii)が、化学物質の添加および/または物理的手段を含む、請求項5に記載の方法。
- 化学物質が、ホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドである、請求項17に記載の方法。
- 物理的手段が、紫外光またはレーザーを含む、請求項17に記載の方法。
- 工程(iv)が、核酸断片の大部分が20〜5000塩基対長、好ましくは200〜300塩基対長になるまでの超音波処理を含む、請求項5に記載の方法。
- クロマチン結合剤が、抗体または化学物質である、請求項1または2に記載の方法。
- 抗体が、ヒストン、転写因子、またはヒストンおよび/もしくは転写因子に結合しているタンパク質に特異的に結合する、請求項21に記載の方法。
- ヒストンおよび/または転写因子に結合しているタンパク質が、核酸リモデリングタンパク質またはクロマチン修飾酵素である、請求項22に記載の方法。
- ヒストンが、H3.3、H2A.Z、CENP−A、H3.2、H3.3A、H3.3B、H4またはH3.1である、請求項22または23に記載の方法。
- ヒストンが、修飾ヒストンであり、修飾がメチル化、アセチル化、プロピオニル化、ブチリル化、クロトニル化、2−ヒドロキシイソブチリル化、マロニル化、サクシニル化および/またはリボシル化である、請求項22、23または24に記載の方法。
- 修飾ヒストンが、H3K4me1/2/3、H2BK5me1、H3K27me1/2/3、H3K9me1/2/3、H4K20me1、H3K79me1、H3K36me3、H2AK5ac、H2AK9ac、H2BK5ac、H2BK12ac、H2BK20ac、H2BK120ac、H3K4ac、H3K9ac、H3K14ac、H3K18ac、H3K23ac、H3K27ac、H3K36ac、H4K5ac、H4K8ac、H4K12ac、H4K16ac、H4K91ac、H2AubまたはH2Bubである、請求項25に記載の方法。
- 化学物質が、薬剤またはツール化合物(tool compound)である、請求項21に記載の方法。
- 化学物質が、ビオチン化されている、請求項21または27に記載の方法。
- トランスポザーゼが、ランダムDNA配列タグまたは所定DNA配列タグを含む、請求項1〜4に記載の方法。
- トランスポザーゼが、Tn5トランスポザーゼである、請求項29に記載の方法。
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