JP2018529986A

JP2018529986A - 光酸化増幅を用いた高感度バイオマーカー定量方法

Info

Publication number: JP2018529986A
Application number: JP2018535805A
Authority: JP
Inventors: ユンカン，ジ; チョルパク，ミン; ヒホ，ユ
Original assignee: Intekplus Co Ltd
Current assignee: Intekplus Co Ltd
Priority date: 2016-03-31
Filing date: 2017-03-21
Publication date: 2018-10-11
Anticipated expiration: 2037-03-21
Also published as: US11054427B2; JP6603419B2; EP3438666A4; CN108139406B; CN108139406A; US20180180621A1; EP3438666A1; EP3438666B1; KR20170113159A; WO2017171293A1; KR101949380B1

Abstract

光酸化増幅を用いた高感度バイオマーカー定量方法を開示する。本発明の実施例による光酸化増幅を用いた高感度バイオマーカー定量方法は、バイオマーカーに特異的に結合する抗体、アプタマー及び核酸の中から選ばれたいずれか一つに標識された酵素を含む測定試料に酵素−基質反応を行う工程と、前記酵素−基質反応の後、生成物に持続的に光を露出させて光酸化増幅過程を行うとともに、光酸化増幅過程中に生成物の発色量、発光量及び蛍光量の中から少なくとも一つ選ばれた光特性を光学的に測定する工程と、測定された前記光特性に対して時間による変化様相を指標化する工程と、前記指標化工程で抽出された指標を基準試料の指標と比較して、測定試料に含まれているバイオマーカーの濃度を定量する工程とを含む。よって、検出しようとするバイオマーカーに特異的な抗体、アプタマー、核酸などに標識された酵素と基質との反応の後、生成物に持続的に光を露出させて光酸化増幅過程を行い、時間による生成物の光特性変化様相を指標化して、低濃度または微量のバイオマーカーをより正確に高感度で定量することができるという効果がある。

Description

本発明は、光酸化増幅を用いた高感度バイオマーカー定量方法に関し、さらに詳しくは、検出しようとするバイオマーカーに特異的な抗体、アプタマー、核酸などに標識された酵素と基質との反応の後、生成物に持続的に露光して光酸化増幅過程を行い、時間による生成物の発色量、発光量、蛍光量などの変化様相を指標化して、低濃度または微量のバイオマーカーを高感度で定量することができる、光酸化増幅を用いた高感度バイオマーカー定量方法に関する。

一般に、タンパク質、ペプチド、遺伝子、ホルモン、低分子化合物などのバイオマーカーを検出する方法は、検出しようとするバイオマーカーに特異的な抗体、アプタマー、核酸などを用いることができる。
そして、バイオマーカーに特異的な抗体、アプタマー、核酸などを用いて検出されたバイオマーカーの濃度を定量する方法には、酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ；ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ、ＥＩＡ；ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）などを用いることができる。
酵素免疫検定法は、抗原−抗体または抗原−アプタマーの特異的な結合を用いた免疫検定法の一つであって、タンパク質、ペプチド、ホルモン、低分子化合物などの抗原の定量測定法であるといえる。通常は、抗原に特異的な抗体またはアプタマーに酵素を標識し、基質との反応を用いて定量するので、抗体またはアプタマーに標識されている酵素と基質との反応による生成物の発色量、発光量、蛍光量などを光学的に測定してバイオマーカーを定量する。一般に、プレートリーダー（ｐｌａｔｅｒｅａｄｅｒ）、スペクトロメータ（ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）などを用いて測定試料の酵素−基質反応の程度を光学的に測定し、これを基準試料の酵素−基質反応度測定値と比較してバイオマーカーの量を定量化することができる。

また、酵素免疫検定法は、遺伝子バイオマーカーの検出にも用いることができる。すなわち、検出しようとする遺伝子バイオマーカーに相補的に結合することが可能な核酸に酵素を標識し、基質との反応を用いて定量するので、核酸に標識されている酵素と基質との反応による生成物の発色量、発光量、蛍光量などを光学的に測定し、これを基準試料の酵素−基質反応度測定値と比較してバイオマーカーの量を定量化することができる。

しかし、従来の酵素免疫検定法では、検出しようとするバイオマーカーの量が微量または低濃度である場合には、抗体、アプタマー、核酸などに標識された酵素と基質との反応による生成物の発色量、発光量、蛍光量などの検出が不可能であるか、可能であっても極小の検出量では正確なバイオマーカーの定量が不可能であるという問題点があった。たとえば、図１に示すように、抗体に標識された酵素の量が微量であるか低濃度である場合には、酵素−基質反応後に検出することが可能な生成物の蛍光量も極少量であるため、微量または低濃度抗体の正確な定量が不可能であった。

本発明は、上述したような問題点を解決するためのもので、その目的は、検出しようとするバイオマーカーに特異的な抗体、アプタマー、核酸などに標識された酵素と基質との反応の後、生成物に持続的に光を露出させて光酸化増幅過程を行い、時間による生成物の発色量、発光量、蛍光量などの変化様相を指標化して、低濃度または微量のバイオマーカーを高感度で定量することができる、光酸化増幅を用いた高感度バイオマーカー定量方法を提供することである。

上記の目的を達成するための本発明の実施形態に係る光酸化増幅を用いた高感度バイオマーカー定量方法は、バイオマーカーに特異的に結合する抗体、アプタマー及び核酸の中から選ばれたいずれか一つに標識された酵素を含む測定試料に酵素−基質反応を行う工程と、前記酵素−基質反応の後、生成物に持続的に露光して光酸化増幅過程を行うとともに、光酸化増幅過程中に生成物の発色量、発光量及び蛍光量の中から少なくとも一つ選ばれた光特性を光学的に測定する工程と、測定された前記光特性に対して時間による変化様相を指標化する工程と、前記指標化工程で抽出された指標を基準試料の指標と比較して、測定試料に含まれているバイオマーカーの濃度を定量する工程とを含む。

上述したような技術特徴を有する本発明によれば、検出しようとするバイオマーカーに特異的な抗体、アプタマー、核酸などに標識された酵素と基質との反応の後、生成物に持続的に光を露出させて光酸化増幅過程を行い、時間による生成物の発色量、発光量、蛍光量などの変化様相を指標化すると、低濃度または微量のバイオマーカーをより正確に高感度で定量することができるという効果がある。

従来技術のプレートリーダーを用いた酵素の濃度による酵素−基質反応生成物の蛍光検出量を示すグラフである。本発明の実施例に係るバイオマーカーに特異的に結合する抗体、アプタマー、核酸などに標識された酵素と基質との反応を説明するための概念図である。本発明の実施例に係る酵素免疫検定法で酵素（ＨＲＰ；ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）と基質（ＡｍｐｌｅｘＲｅｄ）との反応を説明するための図である。本発明の実施例に係る光酸化増幅過程を説明するための概念図である。本発明の第１実施例に係る抗体に標識された酵素の濃度に対する光酸化増幅様相を時間に従って示すグラフである。本発明の第１実施例に係る抗体に標識された酵素の濃度に対する光酸化増幅様相のＴ₅₀指標抽出値を示すグラフである。本発明の第１実施例に係る抗体に標識された酵素の濃度に対する光酸化増幅様相のＣＴＬ（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｔｉｍｅｌｅｎｇｔｈ）指標抽出値を示すグラフである。本発明の第２実施例に係るタンパク質バイオマーカーの濃度に対する光酸化増幅様相を経時に示すグラフである。本発明の第２実施例に係るタンパク質バイオマーカーの濃度に対する光酸化増幅様相のＴ₅₀指標抽出値を示すグラフである。本発明の第２実施例に係るタンパク質バイオマーカーの濃度に対する光酸化増幅様相のＣＴＬ指標抽出値を示すグラフである。本発明の第２実施例の他の一例によるペプチドバイオマーカーの濃度に対する光酸化増幅様相のＴ₅₀指標抽出値を示すグラフである。本発明の第２実施例の他の一例によるペプチドバイオマーカーの濃度に対する光酸化増幅様相のＣＴＬ指標抽出値を示すグラフである。

特に他の定義がなければ、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する技術分野における当業者に通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使用される命名法は、当該技術分野でよく知られており、通常使われるものである。
本明細書全体において、ある部分がある構成要素を「含む」とするとき、これは、特に反対の記載がない限り、他の構成要素を排除するのではなく、他の構成要素をさらに含むことができることを意味する。
以下、添付図面を参照して、本発明の実施例を詳細に説明する。

図２は本発明の実施例に係るバイオマーカーに特異的に結合する抗体、アプタマー、核酸などに標識された酵素と基質との反応を説明するための概念図である。
図２を参照すると、バイオマーカーに特異的に結合する抗体、アプタマー、核酸などに標識された酵素は、基質との反応で色または蛍光を呈する生成物に変わるが、一定時間の間、酵素−基質反応の後、生成物の発色量、発光量、蛍光量などを光学的に測定して酵素−基質反応の程度を分析することができる。このような酵素−基質反応の程度を分析すると、バイオマーカーに特異的に結合する抗体、アプタマー、核酸などに標識された酵素の量を分析することができ、結果として、検出しようとするバイオマーカーの量を定量することができる。

図３は、一例として、本発明の実施例に係る酵素免疫検定法で酵素（ＨＲＰ；ホースラディッシュペルオキシダーゼ）と基質（ＡｍｐｌｅｘＲｅｄ）との反応を説明するための図である。
図３を参照すると、無色及び無蛍光である基質が、酵素（ＨＲＰ）の作用で、色及び蛍光を呈する生成物（Ｒｅｓｏｒｕｆｉｎ）に変わるが、プレートリーダーなどで生成物の蛍光量を測定すると、酵素−基質反応の程度を分析することができる。これにより、バイオマーカーに特異的に結合する抗体、アプタマー、核酸などに標識された酵素の量またはバイオマーカーの量を定量することができる。例えば、抗原に特異的に結合する抗体にペルオキシダーゼなどの酵素を標識し、酵素−基質反応の程度を測定すると、検出しようとする抗原の量を定量化することができる。

しかし、従来のプレートリーダーまたはスペクトロメータなどを用いた酵素−基質反応度測定方法は、測定試料に含まれているバイオマーカーの量が微量であるか低濃度である場合には、バイオマーカーに特異的な抗体、アプタマー、核酸などに標識された酵素と基質との反応による生成物の発色量、発光量、蛍光量などの検出が不可能であるか、可能であっても極小の検出量では正確なバイオマーカーの定量が不可能であるという問題点があった。

このような問題点を解決するために、本発明では、バイオマーカーに特異的に結合する抗体、アプタマー、核酸などに標識された酵素と基質との反応の後、生成物に持続的に露光して生成物の発色量、発光量、蛍光量などを、光酸化増幅過程を用いて、検出可能な量で増幅し、その変化の様相を指標化して、低濃度または微量のバイオマーカーをより正確に高感度で定量することができる。
本発明は、光酸化増幅で検出しようとするバイオマーカーを高感度で定量するために、まず、バイオマーカーに特異的に結合する抗体、アプタマー及び核酸の中から選ばれたいずれか一つに標識された酵素を含む測定試料に酵素−基質反応を行い、前記酵素−基質反応の後、生成物に持続的に露光して光酸化増幅過程を行うと同時に、光酸化増幅過程中に生成物の発色量、発光量及び蛍光量の中から選ばれたいずれか一つまたは複数の光特性を光学的に測定する。

本発明におけるバイオマーカーは、タンパク質、ペプチド、遺伝子、ホルモン及び低分子化合物のうちの少なくとも一つが選択でき、その例としては、ＡＦＰ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、カルシトニン（ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ）、ＣＥＡ、Ｃｙｆｒａ２１−１、ｈＣＧ、ＨＥ４、ＮＳＥ、ｐｒｏＧＲＰ、ＰＳＡ、ＳＣＣＡ、ＳＴＮ、チログロブリン（ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）、ＴＰＡなどを含む腫瘍（癌）マーカー；トロポニン（ｔｒｏｐｏｎｉｎ）、ミオグロビン（ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ）、Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌｐｒｏＢＮＰなどを含む心臓病マーカー；β−アミロイド（ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄ）、タウ（ｔａｕ）、α−シヌクレイン（ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）、ＰｒＰ^Sc、ハンチントン病（ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ）などを含む変性脳疾患マーカー；Ａｎｔｉ−ＨＡＶ、Ａｎｔｉ−ＨＢｃ、Ａｎｔｉ−ＨＢｅ、ＨＢｅＡｇ、Ａｎｔｉ−ＨＢｓ、ＨＢｓＡｇ、Ａｎｔｉ−ＨＣＶ、ＣＭＶＩｇＧ、ＣＭＶＩｇＭ、ＨＩＶ、ＨＩＶ−Ａｇ、ＨＳＶ−Ａｇ、ＨＳＶ−１ＩｇＧ、ＨＳＶ−２ＩｇＧ、ＲＳＶＩｇＧ、ＲＳＶＩｇＭ、風疹（Ｒｕｂｅｌｌａ）ＩｇＧ、風疹（Ｒｕｂｅｌｌａ）ＩｇＭ、梅毒（Ｓｙｐｈｉｌｉｓ）、ＴｏｘｏＩｇＧ、ＴｏｘｏＩｇＭなどを含む感染性疾患マーカー；Ａｎｔｉ−ＣＣＰ、ＩｇＥ、インターロイキン（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）、プロカルシトニン（ｐｒｏｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ）、ＴＮＦ、ＴＧＦ、ＶＥＧＦなどを含む炎症性疾患マーカー；ＡＣＴＨ、Ａｎｔｉ−Ｔｇ、Ａｎｔｉ−ＴＰＯ、Ａｎｔｉ−ＴＳＨ−Ｒ、カルシトニン（ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ）、コルチゾール（ｃｏｒｔｉｓｏｌ）、Ｃ−ペプチド（Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ）、ＦＴ３、ＦＹ４、ｈＧＨ、インスリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）、ＰＴＨＳＴＡＴ、Ｔ３、Ｔ４、チレオグロブリン（ｔｈｙｒｅｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）、ＴＳＨなどを含む内分泌疾患マーカー；Ａｎｔｉ−β２−ＧＰ１ＩｇＧ／ＩｇＭ、抗カルジオリピン（ＡｎｔｉＣａｒｄｉｏｌｉｐｉｎ）ＩｇＧ／ＩｇＭ、Ａｎｔｉｄｓ−ＤＮＡＡｂＩｇＧ／ＩｇＭ、ＡｎｔｉＧＤ１ｂＩｇＧ／ＩｇＭ、ＡｎｔｉＧＭ１ＩｇＧ／ＩｇＭ、ＡｎｔｉＧＱ１ｂＩｇＧ／ＩｇＭ、抗リン脂質（ＡｎｔｉＰｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）ＩｇＧ／ＩｇＭ、Ａｎｔｉｓｓ−ＤＮＡＩｇＧ／ＩｇＭ、ＲＡＦａｃｔｏｒＩｇＧ、各種アレルギー原因物質及びＩｇＥなどを含む自己免疫疾患およびアレルギーマーカー；オステオカルシン（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）、Ｐ１ＮＰ、ＰＴＨ、ＶｉｔａｍｉｎＤなどを含む骨代謝マーカー；シクロスポリン（Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ）、ジギトキシン（Ｄｉｇｉｔｏｘｉｎ）、シロリムス（Ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ）、タクロリムス（Ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ）などを含む薬物検査マーカー；ｈＣＧ、ＦＳＨ、ＨＥ４、プロゲステロン（ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ）、テストステロン（ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）などを含む妊娠／出生前検査マーカー、サイトメガロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、Ｂ型肝炎（ＨｅｐａｔｉｔｉｓＢ）、Ｃ型肝炎（ＨｅｐａｔｉｔｉｓＣ）、ヘルペス（Ｈｅｒｐｅｓ）、Ａ型／Ｂ型インフルエンザ（ＩｎｆｌｕｅｎｚａＡ／Ｂ）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、結核菌（ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａＴｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ＨＩＶ−２、ＨＣＶ、ＨＢＶ、Ｅ型肝炎（ＨｅｐａｔｉｔｉｓＥ）、ＳｔｒｅｐＡ、ＢＲＡＦ、ＫＲＡＳ、ＥＧＦＲなどを含む遺伝子マーカーなどが選択できる。また、ここで羅列されていない腫瘍（癌）マーカー、心臓病マーカー、変性脳疾患マーカー、感染性疾患マーカー、炎症性疾患マーカー、内分泌疾患マーカー、自己免疫疾患及びアレルギーマーカー、骨代謝マーカー、薬物検査マーカー、妊娠／出生前検査マーカー、遺伝子マーカーなどのバイオマーカーも選択できる。

本発明では、前記抗体、アプタマー、核酸は、検出しようとするバイオマーカーに応じていずれか一つを選択することができ、前記抗体、アプタマー、核酸などに標識された酵素と基質との反応を行うとき、ＨＲＰを含むペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼを含むガラクトシダーゼ、ＡＰ（ａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）を含むホスファターゼの中から選ばれる少なくとも一つの酵素が、抗体、アプタマー及び核酸の中から選択されたいずれか一つに標識され、前記酵素が標識された測定試料にＡＤＨＰ（１０−Ａｃｅｔｙｌ−３，７−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ；ＡｍｐｌｅｘＲｅｄ）、ＲＧＰ（ｒｅｓｏｒｕｆｉｎ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、ＭＵＰ（４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ）の中から選ばれた少なくとも一つの基質を混合して、一定時間の間、酵素−基質反応が行われる。

また、前記酵素−基質反応を行うときは、ここで例示されていない他の種の酵素と基質も選択できる。
本発明において、前記酵素−基質反応生成物の発色量、発光量及び蛍光量の中から選ばれる光特性は、前記抗体、アプタマー、核酸などに標識される酵素またはこれに反応する基質に応じていずれか一つまたは複数を選択することができる。
前記光特性を光学的に測定するために、光酸化増幅に用いられる光は、広い波長の白色光、狭い波長を有する単色光、単一波長のレーザーの中から少なくとも一つが選択できる。酵素−基質反応生成物に持続的を露光しながら光酸化増幅過程中の生成物の光特性を時間に従って連続的に測定することができる。光特性を連続的又は持続的に測定する方法は、継続的な露光を用いた動画像測定、あるいは短い時間間隔による光特性連続測定又は一定時間間隔の間欠的光露出を用いた時間別の光特性測定によって行うことができる。

一方、光酸化増幅が行われる間または増幅の進行が終了する時点まで光学的に測定された前記光特性に対して、時間による変化様相を指標化する。
本発明において、「指標化」とは、時間による光特性測定値に対して、様々な回帰分析（ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ）によって測定値を正確に表現することができる。すなわち、測定値の時間による変化様相を正確に表すことができる指標を抽出することをいう。
したがって、本発明の前記指標化は、測定された生成物の時間による光特性の変化様相に対する回帰分析によって、様々な形態の指標を抽出することができる。

例えば、前記光特性の初期値の回帰分析推定値、前記光特性の最大値の回帰分析推定値、前記光特性の最大値の１／２に達するまでにかかる時間の回帰分析推定値及び前記光特性の時間による増幅率の回帰分析推定値を含む群から選ばれる１つ以上の指標を抽出することができる。すなわち、これらの指標の中から少なくとも一つを選択して、これを個別又は複合的に組み合わせて様々な形態の指標を使用することができる。
測定試料に含まれているバイオマーカーの濃度定量は、前記指標化工程で抽出された指標を基準試料の指標と比較して得ることができる。また、前記基準試料の指標は、一定の濃度間隔で希釈されたバイオマーカーを含む試料の光酸化増幅様相から得ることができる。

図４は本発明の実施例に係る光酸化増幅過程を説明するための概念図である。
図４を参照すると、光酸化増幅過程は、一種の自己触媒反応で起こる。すなわち、酵素−基質反応が行われた試料に持続的に露光すると、自己触媒反応によって酵素−基質反応の後に生成物の発色量、発光量、蛍光量などが増幅される。そこで、生成物の発色量、発光量、蛍光量などを光酸化増幅時間に従って測定すると、光酸化増幅様相を示すことができる。
光酸化増幅過程は、自己触媒反応の一種なので、光酸化増幅様相を時間に従って示すと、Ｓ字カーブ型のグラフで表示することができる。
また、酵素−基質反応の際に酵素の濃度によってそれぞれ異なる量の初期生成物が生成され、このように生成された初期生成物の量によって光酸化増幅速度が異なる。
その結果、抗体、アプタマー、核酸などに標識された酵素の濃度が高いほど初期生成物の生成量が多いため、自己触媒反応の速度も速く、光酸化増幅が急速に進み、生成物の蛍光量が急速に増幅される。これに対し、抗体、アプタマー、核酸などに標識された酵素の濃度が低いほど初期生成物の生成量が少ないため、自己触媒反応の速度が遅く、光酸化増幅が遅く行われて生成物の蛍光量が相対的に遅く増幅される。
したがって、生成物の発色量、発光量、蛍光量などの光特性が増幅される相対的な時間比較によって、抗体、アプタマー、核酸などに標識された酵素の濃度を確認することができ、時間による光酸化増幅様相を指標化すると、低濃度または微量の酵素の濃度をより正確に高感度で定量することができる。

前述したように、光酸化増幅は、自己触媒反応で行われるので、光酸化増幅による生成物の発色量、発光量、蛍光量などの光特性の変化様相を時間に従って示すと、Ｓ字カーブ型で表示されるが、これは、下記数式１に示されているように、自己触媒反応の反応速度式によって理解できる。
［数式１］
数式１において、ＡＲはＡｍｐｌｅｘＲｅｄ（基質）を、ＲＳＦはレゾルフィン（ｒｅｓｏｒｕｆｉｎ）（生成物）を、［ＡＲ］はＡＲの濃度を、［ＲＳＦ］はＲＳＦの濃度を、ｋは自己触媒反応の反応速度定数（ｒｅａｃｔｉｏｎｒａｔｅｃｏｎｓｔａｎｔ）或いは増幅率を、ｔは自己触媒反応の経過時間をそれぞれ意味する。数式１の自己触媒反応の反応速度式を解くと、下記数式２に示されているように、自己触媒反応の経過時間に伴うＲＳＦ濃度の変化様相を表示することが可能な数式を導くことができる。

［数式２］
数式２において、［ＡＲ］₀は初期基質の濃度を、［ＲＳＦ］₀は初期レゾルフィンの濃度をそれぞれ意味する。光酸化増幅による生成物の発色量、発光量、蛍光量などの変化様相を時間に従って示すと、Ｓ字カーブ型で表示されることを理解することができる。

したがって、光酸化増幅経過時間による生成物（レゾルフィン）の蛍光量測定値を［ＲＳＦ］とし、時間（ｔ）による［ＲＳＦ］の値を前記数式２に基づいて回帰分析すると、［ＡＲ］₀、［ＲＳＦ］₀、ｋなどの回帰分析推定値を導くことができ、導かれた推定値を用いて光酸化増幅様相を指標化することができる。
光酸化増幅様相指標としては、生成物の発色量、発光量、蛍光量などの光特性の初期値の回帰分析推定値、生成物の光特性最大値の回帰分析推定値、生成物の光特性最大値の１／２に達するまでにかかる時間の回帰分析推定値、生成物の光特性の時間による増幅率の回帰分析推定値などを含み、これらの中から１つ以上を選択して、これを個別又は複合的に組み合わせて計算する指標を含むことができる。

例えば、生成物の発色量、発光量、蛍光量などの最大値の１／２に達するまでにかかる時間の回帰分析推定値をＴ₅₀指標とするとき、Ｔ₅₀指標は、下記数式３に示されているように導くことができる。
［数式３］
別の例として、生成物の発色量、発光量、蛍光量などの光特性の初期値の回帰分析推定値、生成物の光特性最大値の回帰分析推定値、生成物の光特性最大値の１／２に達するまでにかかる時間の回帰分析推定値、生成物の光特性の時間による増幅率の回帰分析推定値などを複合的に計算する指標をＣＴＬ（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｔｉｍｅｌｅｎｇｔｈ）指標としたとき、ＣＴＬ指標は、下記数式４に示されているように導くことができる。
［数式４］
光酸化増幅様相指標は、光酸化増幅による生成物の発色量、発光量、蛍光量などの変化様相を、前記数式２に基づいて回帰分析して抽出することができる。回帰分析に用いられる数式は、前記数式２のようにＳ字カーブ型を示すことが可能な他の形態の数式を含むこともでき、回帰分析に使用される数式に基づいて様々な形態の光酸化増幅様相指標を導くことができる。

＜実施例１＞
本発明の第１実施例として、酵素の濃度による光酸化増幅様相を比較する。
まず、様々な濃度の酵素を含む試料を準備し、酵素−基質反応を行う。様々な濃度の酵素には、抗体に標識された酵素、アプタマーに標識された酵素、核酸に標識された酵素などを含むことができる。
本発明の第１実施例では、一例として、ＨＲＰ酵素が含まれていない試料（ブランク試料）と、抗体に標識されたＨＲＰ酵素を含む試料、すなわち抗体に標識されたＨＲＰと、１×ＰＢＳバッファとを混合して試料を濃度に応じて様々に準備し、ＡｍｐｌｅｘＲｅｄ基質を混合して一定時間の間、酵素−基質反応が起こるようにする。
次に、前記各試料の酵素−基質反応の後、生成物（レゾルフィン）を持続的に露光して光酸化増幅過程を行うとともに、光酸化増幅過程での生成物の蛍光量を光学的に検出し、その時間による変化様相を指標化して、抗体に標識された酵素の濃度による光酸化増幅様相指標を比較する。
光酸化増幅に用いられる光としては、白色光などの広い波長の光、単色光などの狭い波長の光、レーザーなどの単一波長の光などを含むことができ、本発明の第１実施例では、５１０〜５５０ｎｍ波長帯の緑色光を用いる。

図５は本発明の第１実施例に係る抗体に標識された酵素の濃度による光酸化増幅様相を時間に従って示すグラフである。
図５を参照すると、抗体に標識された酵素の濃度によって光酸化増幅様相が異なることがわかる。すなわち、酵素−基質反応の際に酵素の濃度によってそれぞれ異なる量の初期生成物が生成され、このように生成された初期生成物の量によって光酸化増幅速度が異なることを確認することができる。
結果として、抗体が結合された酵素の濃度が高いほど初期レゾルフィンの生成量が多いため、自己触媒反応の速度も速く、光酸化増幅が急速に行われて蛍光明るさ値が速く変化する。これに対し、抗体が結合された酵素の濃度が低いほど初期レゾルフィンの生成量が少ないため、自己触媒反応の速度が遅く、光酸化増幅が遅く、蛍光の明るさの値が遅く変化する。

したがって、蛍光明るさの値が変化する相対的な時間の比較によって、抗体が結合された酵素の濃度を確認することができ、各濃度別試料の差がさらに大きくなるようにサンプリングして記憶させると、低濃度または微量の酵素を含む試料でも酵素−基質反応をより正確に詳細に分析することができる。

図６は本発明の第１実施例に係る抗体に標識された酵素の濃度に対する光酸化増幅様相のＴ₅₀指標抽出値を示すグラフである。
図６に示すように、酵素の濃度が低いほど生成物の発色量、発光量、蛍光量などの最大値の１／２に達するまでにかかる時間を示すＴ₅₀指標が大きくなることを確認することができ、これにより低濃度または微量の酵素の濃度をより正確に高感度で定量することができる。

また、図７は本発明の第１実施例に係る抗体に標識された酵素の濃度に対する光酸化増幅様相のＣＴＬ指標抽出値を示すグラフである。図７に示されているように、酵素の濃度が低いほど光酸化増幅様相のＣＴＬ指標が大きくなることを確認することができ、これにより低濃度または微量の酵素の濃度をより正確に高感度で定量することができる。

＜実施例２＞
本発明の第２実施例として、バイオマーカーの濃度による光酸化増幅様相を指標化してバイオマーカーの濃度を高感度で定量する。
まず、様々な濃度のバイオマーカーを含む試料を準備し、バイオマーカーに特異的な抗体、アプタマー、核酸などを用いてバイオマーカーを選択的に検出する過程を行う。バイオマーカーとしては、タンパク質、ペプチド、遺伝子、ホルモン、低分子化合物などの中から少なくとも一つが選択でき、検出されたバイオマーカーの量を定量するために、バイオマーカーに特異的な抗体、アプタマー、核酸などに酵素を標識する従来の酵素免疫検定法などを用いることができる。
本発明の第２実施例では、一例として、タンパク質バイオマーカーの一種であるＰＳＡ（ｐｒｏｓｔａｔｅｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｇｅｎ）を含む試料を様々な濃度で準備し、ＨＲＰ酵素が標識されたＰＳＡに特異的な抗体を用いる従来の酵素免疫検定法を行う。

次に、様々な濃度のＰＳＡ−抗体−ＨＲＰ複合体が含まれている試料に基質を混合し、一定時間の間、酵素−基質反応を行った後、上記の第１実施例と同様の過程で光酸化増幅過程を行う。したがって、第２実施例における光酸化増幅過程の測定及び光酸化増幅様相の指標化方法は、第１実施例の説明に代える。
図８は本発明の第２実施例に係るタンパク質バイオマーカーの濃度に対する光酸化増幅様相を時間に従って示すグラフであり、図９はタンパク質バイオマーカーの濃度に対する光酸化増幅様相のＴ₅₀指標抽出値を示すグラフ、図１０は光酸化増幅様相のＣＴＬ指標抽出値を示すグラフである。

図８から図１０に示すように、様々な濃度のＰＳＡを含む試料を用いた酵素免疫検定法で、酵素−基質反応の後に生成物に持続的に光を露出させて光酸化増幅を行うと、ＰＳＡの濃度が低いほど生成物の発色量、発光量、蛍光量などの最大値の１／２に達するまでにかかる時間を示すＴ₅₀指標及びＣＴＬ指標が大きくなることを確認することができ、これにより低濃度または微量のＰＳＡ濃度をより正確に高感度で定量することができる。すなわち、濃度を知らないＰＳＡを含む試料のＴ₅₀指標またはＣＴＬ指標を、一定の濃度間隔で希釈されたＰＳＡを含む基準試料の濃度によるＴ₅₀指標またはＣＴＬ指標と比較すると、測定試料に含まれているＰＳＡの濃度をより正確に高感度で定量することができる。

本発明の第２実施例の他の一例として、ペプチドバイオマーカーの一種であるＡβ₄₂（ａｍｙｌｏｉｄｂｅｔａ４２）を含む試料を、様々な濃度で準備し、ＨＲＰ酵素が標識されたＡβ₄₂に特異的な抗体を用いる従来の酵素免疫検定法を行う。
次に、様々な濃度のＡβ₄₂−抗体−ＨＲＰ複合体が含まれている試料に基質を混合して一定時間の間、酵素−基質反応を行った後、上記の第１実施例と同様の過程で光酸化増幅過程を行う。したがって、第２実施例の他の例における光酸化増幅過程の測定及び光酸化増幅様相の指標化方法は、第１実施例の説明に代える。

図１１は本発明の第２実施例の他の一例によるペプチドバイオマーカーの濃度に対する光酸化増幅様相のＴ₅₀指標抽出値を示すグラフであり、図１２はペプチドバイオマーカーの濃度に対する光酸化増幅様相のＣＴＬ指標抽出値を示すグラフである。
図１１及び図１２に示すように、様々な濃度のＡβ₄₂を含む試料を用いた酵素免疫検定法で、酵素−基質反応の後に生成物に持続的を露光して光酸化増幅を行うと、Ａβ₄₂の濃度が低いほど生成物の発色量、発光量、蛍光量などの最大値の１／２に達するまでにかかる時間を示すＴ₅₀指標及びＣＴＬ指標が大きくなることを確認することができ、これにより低濃度または微量のＡβ₄₂の濃度をより正確に高感度で定量することができる。すなわち、濃度を知らないＡβ₄₂を含む試料のＴ₅₀指標またはＣＴＬ指標を、一定の濃度間隔で希釈されたＡβ₄₂を含む基準試料の濃度によるＴ₅₀指標またはＣＴＬ指標と比較すると、測定試料に含まれているＡβ₄₂の濃度をより正確に高感度で定量することができる。

上述したように、本発明によれば、様々な実施例によってバイオマーカーの種類、バイオマーカーに特異的に結合する抗体、アプタマー、核酸などの種類、酵素の種類、基質の種類、光酸化増幅様相指標の種類などの違いによって、検出しようとするバイオマーカーの濃度をより正確に高感度で定量することができる。
すなわち、検出しようとするバイオマーカーの種類に応じて抗体、アプタマー、核酸などの種類を変更して第２実施例と同様の方式で光酸化増幅様相を指標化し、これを基準試料の光酸化増幅面様相指標と比較して、測定試料に含まれている低濃度または微量のバイオマーカーの濃度をより正確に高感度で定量することができる。
上述した本発明の光酸化増幅を用いた高感度バイオマーカー定量方法では、検出しようとするバイオマーカーに特異的な抗体、アプタマー、核酸などに標識された酵素と基質との反応後、生成物に持続的に露光して光酸化増幅過程を行う。そして、光酸化増幅時間による生成物の発色量、発光量、蛍光量などの変化様相を指標化し、これを基準試料の指標と比較すると、低濃度または微量のバイオマーカーをより正確に高感度で定量することができる。

本発明は、記載された実施例について詳細に説明したが、本発明の技術思想の範囲内で様々な変形及び修正が可能であることは当業者にとって明らかであり、それらの変形及び修正も添付された請求の範囲に属するものとすることができる。

Claims

バイオマーカーに特異的に結合する抗体、アプタマー及び核酸の中から選ばれたいずれか一つに標識された酵素を含む測定試料に酵素−基質反応を行う工程と、
前記酵素−基質反応の後、生成物に持続的に露光して光酸化増幅過程を行うとともに、光酸化増幅過程中に生成物の発色量、発光量及び蛍光量の中から少なくとも一つ選ばれた光特性を光学的に測定する工程と、
測定された前記光特性に対して時間による変化様相を指標化する工程と、
前記指標化工程で抽出された指標を基準試料の指標と比較して、測定試料に含まれているバイオマーカーの濃度を定量する工程とを含む光酸化増幅を用いた高感度バイオマーカー定量方法。
前記測定試料に酵素−基質反応を行う工程は、ペルオキシダーゼ（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、ガラクトシダーゼ（ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）、及びホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）の中から選ばれる少なくとも一つの酵素が、抗体、アプタマー及び核酸の中から選ばれたいずれか一つに標識され、前記酵素が標識された測定試料にＡＤＨＰ（１０−Ａｃｅｔｙｌ−３，７−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ；ＡｍｐｌｅｘＲｅｄ）、ＲＧＰ（ｒｅｓｏｒｕｆｉｎ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）及びＭＵＰ（４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ）の中から選ばれた少なくとも一つの基質を混合して一定時間の間、酵素−基質反応を行う工程を含む請求項１に記載の光酸化増幅を用いた高感度バイオマーカー定量方法。
前記バイオマーカーは、
タンパク質、ペプチド、遺伝子、ホルモン及び低分子化合物のうちの少なくとも一つを選択する請求項１に記載の光酸化増幅を用いた高感度バイオマーカー定量方法。
前記光特性を光学的に測定する工程で、光酸化増幅に用いられる光は白色光、単色光及びレーザーの中から少なくとも一つ選ばれる請求項１に記載の光酸化増幅を用いた高感度バイオマーカー定量方法。
前記光特性を光学的に測定する工程は、酵素−基質反応生成物に持続的に光を露出させながら生成物の光特性を時間に従って連続的に測定する工程を含む請求項１に記載の光酸化増幅を用いた高感度バイオマーカー定量方法。
前記指標化する工程は、測定された生成物の時間による光特性変化様相に対する回帰分析によって指標を抽出する請求項１に記載の光酸化増幅を用いた高感度バイオマーカー定量方法。
前記指標化する工程は、測定された生成物の時間による光特性変化様相に対する回帰分析によって、前記光特性の初期値の回帰分析推定値、前記光特性の最大値の回帰分析推定値、前記光特性の最大値の１／２に達するまでにかかる時間の回帰分析推定値及び前記光特性の時間による増幅率の回帰分析推定値を含む群から選ばれる１つ以上の指標を抽出する請求項１に記載の光酸化増幅を用いた高感度バイオマーカー定量方法。
前記測定試料に含まれているバイオマーカーの濃度を定量する工程は、
一定の濃度間隔で希釈されたバイオマーカーを含む基準試料の光酸化増幅様相指標を基準指標とし、検出しようとするバイオマーカーを含む測定試料の光酸化増幅様相指標を基準指標と比較して、測定試料に含まれているバイオマーカーの濃度を定量する工程を含む、請求項１に記載の光酸化増幅を用いた高感度バイオマーカー定量方法。