KR20170113159A - 광산화 증폭을 이용한 고감도 바이오마커 정량 방법 - Google Patents

광산화 증폭을 이용한 고감도 바이오마커 정량 방법 Download PDF

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Abstract

광산화 증폭을 이용한 고감도 바이오마커 정량 방법을 개시한다. 본 발명의 실시 예에 따른 광산화 증폭을 이용한 고감도 바이오마커 정량 방법은 바이오마커에 특이적으로 결합하는 항체, 압타머, 핵산 중에서 선택된 어느 하나에 표지된 효소를 포함하는 측정시료에 효소-기질 반응을 수행하는 단계; 상기 효소-기질 반응 후 생성물에 지속적으로 광을 노출시켜 광산화 증폭 과정을 수행함과 아울러 광산화 증폭 과정 중에 생성물의 발색량, 발광량, 형광량 중에서 어느 하나 이상 선택된 광특성을 광학적으로 측정하는 단계; 측정된 상기 광특성에 대하여 시간에 따른 변화 양상을 지표화하는 단계; 및 상기 지표화 단계에서 추출된 지표를 기준시료의 지표와 비교하여 측정시료에 포함되어 있는 바이오마커의 농도를 정량하는 단계를 포함하는바, 검출하고자 하는 바이오마커에 특이적인 항체, 압타머, 핵산 등에 표지된 효소와 기질의 반응 후 생성물에 지속적으로 광을 노출시켜 광산화 증폭 과정을 수행하고 시간에 따른 생성물의 광특성 변화 양상을 지표화하여, 저농도 또는 미량의 바이오마커를 보다 정확하게 고감도로 정량할 수 있는 효과가 있다.

Description

광산화 증폭을 이용한 고감도 바이오마커 정량 방법{ULTRASENSITIVE BIOMARKER QUANTIFICATION METHOD USING PHOTOOXIDATION-INDUCED AMPLIFICATION}
본 발명은 광산화 증폭을 이용한 고감도 바이오마커 정량 방법에 관한 것으로, 상세하게는 검출하고자 하는 바이오마커에 특이적인 항체, 압타머, 핵산 등에 표지된 효소와 기질의 반응 후 생성물에 지속적으로 광을 노출시켜 광산화 증폭 과정을 수행하고 시간에 따른 생성물의 발색량, 발광량, 형광량 등의 변화 양상을 지표화하여, 저농도 또는 미량의 바이오마커를 고감도로 정량할 수 있는 광산화 증폭을 이용한 고감도 바이오마커 정량 방법에 관한 것이다.
일반적으로 단백질, 펩타이드, 유전자, 호르몬, 저분자 화합물 등의 바이오마커를 검출하는 방법은 검출하고자 하는 바이오마커에 특이적인 항체, 압타머, 핵산 등을 이용할 수 있다.
그리고 바이오마커에 특이적인 항체, 압타머, 핵산 등을 이용하여 검출된 바이오마커의 농도를 정량하는 방법에는 효소 면역 검정법(ELISA; enzyme-linked immunosorbent assay, EIA; enzyme-linked immunoassay) 등을 이용할 수 있다.
효소 면역 검정법은 항원-항체 또는 항원-압타머의 특이적인 결합을 이용한 면역 검정법의 하나로서 단백질, 펩타이드, 호르몬, 저분자 화합물 등과 같은 항원의 정량 측정법이라고 할 수 있다. 보통은 항원에 특이적인 항체 또는 압타머에 효소를 표지하고 기질과의 반응을 이용하여 정량하는 바, 항체 또는 압타머에 표지되어 있는 효소와 기질의 반응으로 인한 생성물의 발색량, 발광량, 형광량 등을 광학적으로 측정하여 바이오마커를 정량하게 된다. 일반적으로 플레이트 리더(plate reader), 스펙트로미터(spectrometer) 등을 이용하여 측정시료의 효소-기질 반응의 정도를 광학적으로 측정하고, 이를 기준시료의 효소-기질 반응 정도 측정치와 비교하여 바이오마커의 양을 정량화할 수 있다.
또한 효소 면역 검정법은 유전자 바이오마커를 검출하는 데에도 이용될 수 있다. 즉, 검출하고자 하는 유전자 바이오마커에 상보적으로 결합할 수 있는 핵산에 효소를 표지하고 기질과의 반응을 이용하여 정량하는 바, 핵산에 표지되어 있는 효소와 기질의 반응으로 인한 생성물의 발색량, 발광량, 형광량 등을 광학적으로 측정하고, 이를 기준시료의 효소-기질 반응 정도 측정치와 비교하여 바이오마커의 양을 정량화할 수 있다.
하지만, 종래의 효소 면역 검정법에서는 검출하고자 하는 바이오마커의 양이 미량이거나 저농도인 경우에는 항체, 압타머, 핵산 등에 표지된 효소와 기질의 반응으로 인한 생성물의 발색량, 발광량, 형광량 등의 검출이 불가능하거나, 가능하더라도 극소의 검출량으로는 정확한 바이오마커의 정량이 불가능한 문제점이 있었다. 예를 들면, 도 1에 도시된 바와 같이 항체에 표지된 효소의 양이 미량이거나 저농도인 경우에는 효소-기질 반응 후 검출할 수 있는 생성물의 형광량 또한 극소량이기 때문에 미량 또는 저농도 항체의 정확한 정량이 불가능하였다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로, 검출하고자 하는 바이오마커에 특이적인 항체, 압타머, 핵산 등에 표지된 효소와 기질의 반응 후 생성물에 지속적으로 광을 노출시켜 광산화 증폭 과정을 수행하고 시간에 따른 생성물의 발색량, 발광량, 형광량 등의 변화 양상을 지표화하여, 저농도 또는 미량의 바이오마커를 고감도로 정량할 수 있는 광산화 증폭을 이용한 고감도 바이오마커 정량 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 실시예에 따른 광산화 증폭을 이용한 고감도 바이오마커 정량 방법은 바이오마커에 특이적으로 결합하는 항체, 압타머, 핵산 중에서 선택된 어느 하나에 표지된 효소를 포함하는 측정시료에 효소-기질 반응을 수행하는 단계; 상기 효소-기질 반응 후 생성물에 지속적으로 광을 노출시켜 광산화 증폭 과정을 수행함과 아울러 광산화 증폭 과정 중에 생성물의 발색량, 발광량, 형광량 중에서 어느 하나 이상 선택된 광특성을 광학적으로 측정하는 단계; 측정된 상기 광특성에 대하여 시간에 따른 변화 양상을 지표화하는 단계; 및 상기 지표화 단계에서 추출된 지표를 기준시료의 지표와 비교하여 측정시료에 포함되어 있는 바이오마커의 농도를 정량하는 단계;를 포함한다.
상기와 같은 기술 특징을 갖는 본 발명에 따르면, 검출하고자 하는 바이오마커에 특이적인 항체, 압타머, 핵산 등에 표지된 효소와 기질의 반응 후 생성물에 지속적으로 광을 노출시켜 광산화 증폭 과정을 수행하고 시간에 따른 생성물의 발색량, 발광량, 형광량 등의 변화 양상을 지표화하게 되면, 저농도 또는 미량의 바이오마커를 보다 정확하게 고감도로 정량할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 종래 기술의 플레이트 리더를 이용한 효소의 농도에 따른 효소-기질 반응 생성물의 형광 검출량을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 바이오마커에 특이적으로 결합하는 항체, 압타머, 핵산 등에 표지된 효소와 기질의 반응을 설명하기 위한 개념도이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 효소 면역 검정법에서 효소(HRP; horseradish peroxidase)와 기질(Amplex Red)의 반응을 설명하기 위한 도면이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 광산화 증폭 과정을 설명하기 위한 개념도이다.
도 5는 본 발명의 제 1 실시예에 따른 항체에 표지된 효소의 농도에 대한 광산화 증폭 양상을 시간에 따라 도시한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 제 1 실시예에 따른 항체에 표지된 효소의 농도에 대한 광산화 증폭 양상의 T50 지표 추출값을 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 제 1 실시예에 따른 항체에 표지된 효소의 농도에 대한 광산화 증폭 양상의 CTL(characteristic time length) 지표 추출값을 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 제 2 실시예에 따른 단백질 바이오마커의 농도에 대한 광산화 증폭 양상을 시간에 따라 도시한 그래프이다.
도 9는 본 발명의 제 2 실시예에 따른 단백질 바이오마커의 농도에 대한 광산화 증폭 양상의 T50 지표 추출값을 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 제 2 실시예에 따른 단백질 바이오마커의 농도에 대한 광산화 증폭 양상의 CTL 지표 추출값을 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명의 제 2 실시예의 다른 일례에 따른 펩타이드 바이오마커의 농도에 대한 광산화 증폭 양상의 T50 지표 추출값을 나타낸 그래프이다.
도 12는 본 발명의 제 2 실시예의 다른 일례에 따른 펩타이드 바이오마커의 농도에 대한 광산화 증폭 양상의 CTL 지표 추출값을 나타낸 그래프이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
이하, 본 발명의 실시예를 첨부한 도면들을 참조하여 상세히 설명하기로 한다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 바이오마커에 특이적으로 결합하는 항체, 압타머, 핵산 등에 표지된 효소와 기질의 반응을 설명하기 위한 개념도이다.
도 2를 참조하면, 바이오마커에 특이적으로 결합하는 항체, 압타머, 핵산 등에 표지된 효소는 기질과의 반응으로 색 또는 형광을 나타내는 생성물로 바뀌게 되는데, 일정 시간 동안 효소-기질 반응 후 생성물의 발색량, 발광량, 형광량 등을 광학적으로 측정하여 효소-기질 반응 정도를 분석할 수 있다. 이러한 효소-기질 반응 정도를 분석하게 되면 바이오마커에 특이적으로 결합하는 항체, 압타머, 핵산 등에 표지된 효소의 양을 분석할 수 있으며, 결과적으로는 이를 통해 검출하고자 하는 바이오마커의 양을 정량할 수 있다.
도 3은 일례로서, 본 발명의 실시예에 따른 효소 면역 검정법에서 효소(HRP; horseradish peroxidase)와 기질(Amplex Red)의 반응을 설명하기 위한 도면이다.
도 3을 참조하면, 무색 및 무형광인 기질(Amplex Red)이 효소(HRP)의 작용으로 색 및 형광을 나타내는 생성물(Resorufin)로 바뀌게 되는데, 플레이트 리더 등으로 생성물의 형광량을 측정하게 되면 효소-기질 반응 정도를 분석할 수 있으며, 이를 통해 바이오마커에 특이적으로 결합하는 항체, 압타머, 핵산 등에 표지된 효소의 양 또는 바이오마커의 양을 정량할 수 있다. 예를 들면, 항원에 특이적으로 결합하는 항체에 페르옥시다아제 등의 효소를 표지하고 효소-기질 반응 정도를 측정하게 되면, 검출하고자 하는 항원의 양을 정량화할 수 있다.
하지만, 종래의 플레이트 리더 또는 스펙트로미터 등을 이용한 효소-기질 반응 측정 방법으로는 측정시료에 포함되어 있는 바이오마커의 양이 미량이거나 저농도인 경우에는 바이오마커에 특이적인 항체, 압타머, 핵산 등에 표지된 효소와 기질의 반응에 의한 생성물의 발색량, 발광량, 형광량 등의 검출이 불가능하거나, 가능하더라도 극소의 검출량으로는 정확한 바이오마커의 정량이 불가능한 문제점이 있었다.
이를 해결하기 위해, 본 발명에서는 바이오마커에 특이적으로 결합하는 항체, 압타머, 핵산 등에 표지된 효소와 기질의 반응 후 생성물에 지속적으로 광을 노출시켜 생성물의 발색량, 발광량, 형광량 등을 광산화 증폭 과정을 이용하여 검출 가능한 양으로 증폭하고 그 변화 양상을 지표화하여, 저농도 또는 미량의 바이오마커를 보다 정확하게 고감도로 정량할 수 있도록 한다.
본 발명은 광산화 증폭으로 검출하고자 하는 바이오마커를 고감도로 정량하기 위하여, 먼저, 바이오마커에 특이적으로 결합하는 항체, 압타머, 핵산 중에서 선택된 어느 하나에 표지된 효소를 포함하는 측정시료에 효소-기질 반응을 수행하고, 상기 효소-기질 반응 후 생성물에 지속적으로 광을 노출시켜 광산화 증폭 과정을 수행함과 동시에 광산화 증폭 과정 중에 생성물의 발색량, 발광량, 형광량 중에서 어느 하나를 선택하거나 복수로 선택된 광특성을 광학적으로 측정한다.
본 발명에서의 바이오마커는 단백질, 펩타이드, 유전자, 호르몬, 저분자 화합물 중의 어느 하나 이상이 선택될 수 있으며, 그 예로는 AFP, CA 125, CA 15-3, CA 19-9, CA 72-4, calcitonin, CEA, Cyfra 21-1, hCG, HE4, NSE, proGRP, PSA, SCCA, STN, thyroglobulin, TPA 등을 포함하는 종양(암) 표지자; troponin, myoglobin, N-terminal proBNP, 등을 포함하는 심장질환 표지자; beta-amyloid, tau, alpha-synuclein, PrPSc, huntingtin 등을 포함하는 퇴행성뇌질환 표지자; Anti-HAV, Anti-HBc, Anti-HBe, HBeAg, Anti-HBs, HBsAg, Anti-HCV, CMV IgG, CMV IgM, HIV, HIV-Ag, HSV-Ag, HSV-1 IgG, HSV-2 IgG, RSV IgG, RSV IgM, Rubella IgG, Rubella IgM, Syphilis, Toxo IgG, Toxo IgM 등을 포함하는 감염성질환 표지자; Anti-CCP, IgE, interleukin, procalcitonin, TNF, TGF, VEGF 등을 포함하는 염증성질환 표지자; ACTH, Anti-Tg, Anti-TPO, Anti-TSH-R, calcitonin, cortisol, C-peptide, FT3, FY4, hGH, insulin, PTH STAT, T3, T4, thyreoglobulin, TSH 등을 포함하는 내분비질환 표지자; Anti-β2-GP1 IgG/IgM, Anti Cardiolipin IgG/IgM, Anti ds-DNA Ab IgG/IgM, Anti GD1b IgG/IgM, Anti GM1 IgG/IgM, Anti GQ1b IgG/IgM, Anti Phospholipid IgG/IgM, Anti ss-DNA IgG/IgM, RA Factor IgG, 각종 알러지 원인물질 및 IgE 등을 포함하는 자가면역질환 및 알러지 표지자; osteocalcin, P1NP, PTH, Vitamin D 등을 포함하는 골대사 표지자; Cyclosporine, Digitoxin, Sirolimus, Tacrolimus 등을 포함하는 약물검사 표지자; hCG, FSH, HE4, progesterone, testosterone 등을 포함하는 임신/산전검사 표지자, Cytomegalovirus, Hepatitis B, Hepatitis C, Herpes, Influenza A/B, Chlamydia trachomatis, Mycobacteria Tuberculosis, HIV-2, HCV, HBV, Hepatitis E, Strep A, BRAF, KRAS, EGFR 등을 포함하는 유전자 표지자 등이 선택될 수 있다. 또한, 여기서 나열되지 않은 종양(암) 표지자, 심장질환 표지자, 퇴행성뇌질환 표지자, 감염성질환 표지자, 염증성질환 표지자, 내분비질환 표지자, 자가면역질환 및 알러지 표지자, 골대사 표지자, 약물검사 표지자, 임신/산전검사 표지자, 유전자 표지자 등의 바이오마커도 선택되어 질 수 있다.
본 발명에서 상기 항체, 압타머, 핵산은 검출하고자 하는 바이오마커에 따라 어느 하나를 선택할 수 있으며, 상기 항체, 압타머, 핵산 등에 표지된 효소와 기질의 반응을 수행할 시에, HRP(horseradish peroxidase)를 포함하는 페르옥시다아제(peroxidase), β-Galactosidase를 포함하는 갈락토시다아제(galactosidase), AP(alkaline phosphatase)를 포함하는 포스파타아제(phosphatase) 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 효소가 항체, 압타머, 핵산 중에서 선택된 어느 하나에 표지되며, 상기 효소가 표지된 측정시료에 ADHP(10-Acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine; Amplex Red), RGP(resorufin-β-D-galactopyranoside), MUP(4-methylumbelliferyl phosphate) 중에서 선택된 어느 하나 이상의 기질을 혼합하여 일정 시간 동안 효소-기질 반응이 수행된다.
또한, 상기 효소-기질의 반응을 수행할 시에는, 여기서 나열되지 않은 다른 종의 효소와 기질도 선택되어 질 수 있다.
본 발명에서 상기 효소-기질 반응 생성물의 발색량, 발광량, 형광량 중에서 선택되는 광특성은 상기 항체, 압타머, 핵산 등에 표지되는 효소 또는 이에 반응하는 기질에 따라 어느 하나를 선택하거나 복수로 선택할 수 있다.
상기 광특성을 광학적으로 측정하기 위하여 광산화 증폭에 이용되는 광은 넓은 파장의 백색광, 좁은 파장을 갖는 단색광, 단일 파장의 레이저 중에서 어느 하나 이상이 선택될 수 있으며, 효소-기질 반응 생성물에 지속적으로 광을 노출시키면서 광산화 증폭과정 중의 생성물의 광특성을 시간에 따라 연속적으로 측정할 수 있다. 광특성을 연속적 혹은 지속적으로 측정하는 방법은 계속적인 광 노출을 통한 동영상 측정 또는 짧은 시간 간격으로 광특성을 연속적으로 측정하거나, 혹은 일정 시간 간격의 간헐적 광 노출을 통한 시간별 광특성 측정 과정을 통하여 이루어질 수 있다.
한편, 광산화 증폭이 진행되는 동안 혹은 증폭의 진행이 종료되는 시점까지 광학적으로 측정된 상기 광특성에 대하여 시간에 따른 변화 양상을 지표화한다.
본 발명에서 '지표화'라는 것은 시간에 따른 광특성 측정치에 대하여, 다양한 회귀분석(regression analysis)에 의해서 측정치를 정확하게 표현할 수 있는, 즉 측정치의 시간에 따른 변화 양상을 정확하게 나타낼 수 있는 지표를 추출하는 것을 말한다.
따라서, 본 발명의 상기 지표화는 측정된 생성물의 시간에 따른 광특성 변화 양상에 대한 회귀분석에 의해서, 다양한 형태의 지표를 추출할 수 있다.
예를 들면, 상기 광특성 초기값 회귀분석 추정치, 상기 광특성 최대값 회귀분석 추정치, 상기 광특성 최대값의 1/2에 이르는데 걸리는 시간의 회귀분석 추정치, 상기 광특성의 시간에 따른 증폭률 회귀분석 추정치를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 지표를 추출할 수 있다. 즉, 상기 지표들 중에서 어느 하나 이상을 선택하여, 이를 개별적으로 또는 복합적으로 조합하여 다양한 형태의 지표를 사용할 수 있다.
측정시료에 포함되어 있는 바이오마커의 농도 정량은, 상기 지표화 단계에서 추출된 지표를 기준시료의 지표와 비교하여 얻을 수 있다. 또한, 상기 기준시료의 지표는 일정 농도 간격으로 희석된 바이오마커를 포함하는 시료의 광산화 증폭 양상으로부터 얻을 수 있다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 광산화 증폭 과정을 설명하기 위한 개념도이다.
도 4를 참조하면, 광산화 증폭 과정은 일종의 자체촉매(autocatalysis) 반응으로 일어난다. 즉, 효소-기질 반응이 이루어진 시료에 지속적으로 광을 노출시키게 되면, 자체촉매 반응에 의해 효소-기질 반응 후 생성물의 발색량, 발광량, 형광량 등이 증폭된다. 이에, 생성물의 발색량, 발광량, 형광량 등을 광산화 증폭 시간에 따라 측정하게 되면 광산화 증폭 양상을 도시할 수 있다.
광산화 증폭 과정은 자체촉매 반응의 일종이므로 광산화 증폭 양상을 시간에 따라 도시하게 되면 S-자 커브 형태의 그래프로 표시할 수 있다.
또한, 효소-기질 반응 시에 효소의 농도에 따라 각기 다른 양의 초기 생성물이 생성되고, 이렇게 생성된 초기 생성물의 양에 따라 광산화 증폭 속도가 상이하게 된다.
결과적으로, 항체, 압타머, 핵산 등에 표지된 효소의 농도가 높을수록 초기 생성물의 생성량이 많기 때문에 자체촉매 반응의 속도 또한 빠르고 광산화 증폭이 빠르게 진행되어 생성물의 형광량이 빠르게 증폭된다. 반면, 항체, 압타머, 핵산 등에 표지된 효소의 농도가 낮을수록 초기 생성물의 생성량이 적기 때문에 자체촉매 반응의 속도가 느리고 광산화 증폭이 느리게 진행되어 생성물의 형광량이 상대적으로 느리게 증폭된다.
따라서, 생성물의 발색량, 발광량, 형광량 등과 같은 광특성이 증폭되는 상대적인 시간 비교를 통해 항체, 압타머, 핵산 등에 표지된 효소의 농도를 확인할 수 있으며, 시간에 따른 광산화 증폭 양상을 지표화하게 되면, 저농도 또는 미량의 효소의 농도를 보다 정확하게 고감도로 정량할 수 있게 된다.
앞에서 논의한 바와 같이, 광산화 증폭은 자체촉매 반응으로 이루어지므로 광산화 증폭에 따른 생성물의 발색량, 발광량, 형광량 등과 같은 광특성의 변화 양상을 시간에 따라 도시하게 되면 S-자 커브 형태로 나타나게 되는데, 이는 하기 수학식 1에 도시된 바와 같이 자체촉매 반응의 반응속도 식(rate equation)을 통해 이해될 수 있다.
[수학식 1]
Figure pat00001
상기 수학식 1에서 AR은 Amplex Red(기질)를, RSF는 resorufin(생성물)을, [AR]은 AR의 농도를, [RSF]는 RSF의 농도를, k는 자체촉매 반응의 반응속도 상수(reaction rate constant) 혹은 증폭률을, t는 자체촉매 반응의 경과 시간을 각각 의미하며, 상기 수학식 1의 자체촉매 반응의 반응속도 식을 풀게 되면, 하기 수학식 2에 도시된 바와 같이 자체촉매 반응의 경과 시간에 따른 RSF 농도의 변화 양상을 표시할 수 있는 식을 도출할 수 있다.
[수학식 2]
Figure pat00002
상기 수학식 2에서 [AR]0는 초기 Amplex Red의 농도를, [RSF]0는 초기 resorufin의 농도를 각각 의미하는 바, 광산화 증폭에 따른 생성물의 발색량, 발광량, 형광량 등의 변화 양상을 시간에 따라 도시하게 되면 S-자 커브 형태로 나타나게 됨을 이해할 수 있다.
따라서, 광산화 증폭 경과 시간에 따른 생성물(resorufin)의 형광량 측정값을 [RSF]로 놓고, 시간(t)에 따른 [RSF]의 값을 상기 수학식 2에 따라 회귀분석하면 [AR]0, [RSF]0, k 등의 회귀분석 추정치를 도출할 수 있으며, 도출된 추정치를 이용하여 광산화 증폭 양상을 지표화할 수 있다.
광산화 증폭 양상 지표로는 생성물의 발색량, 발광량, 형광량 등과 같은 광특성의 초기값 회귀분석 추정치, 생성물의 광특성 최대값 회귀분석 추정치, 생성물의 광특성 최대값의 1/2에 이르는데 걸리는 시간의 회귀분석 추정치, 생성물 광특성의 시간에 따른 증폭률 회귀분석 추정치 등을 포함하고, 이들 중에서 하나 이상을 선택하여, 이를 개별적으로 또는 복합적으로 조합하여 계산하는 지표를 포함할 수 있다.
예를 들면, 생성물의 발색량, 발광량, 형광량 등의 최대값의 1/2에 이르는데 걸리는 시간의 회귀분석 추정치를 T50 지표라 할 때, T50 지표는 하기 수학식 3에 도시된 바와 같이 도출할 수 있다.
[수학식 3]
Figure pat00003
또 다른 예로, 생성물의 발색량, 발광량, 형광량 등과 같은 광특성의 초기값 회귀분석 추정치, 생성물의 광특성 최대값 회귀분석 추정치, 생성물의 광특성 최대값의 1/2에 이르는데 걸리는 시간의 회귀분석 추정치, 생성물 광특성의 시간에 따른 증폭률 회귀분석 추정치 등을 복합적으로 계산하는 지표를 CTL(characteristic time length) 지표라 할 때, CTL 지표는 하기 수학식 4에 도시된 바와 같이 도출할 수 있다.
[수학식 4]
Figure pat00004
광산화 증폭 양상 지표는 광산화 증폭에 따른 생성물의 발색량, 발광량, 형광량 등의 변화 양상을 상기 수학식 2에 따라 회귀분석하여 추출할 수 있는데, 회귀분석에 이용되는 수학식은 상기 수학식 2와 같이 S-자 커브 형태를 나타낼 수 있는 다른 형태의 수학식을 포함할 수도 있으며, 회귀분석에 사용되는 수학식에 따라 다양한 형태의 광산화 증폭 양상 지표를 도출할 수 있다.
< 실시예 1>
본 발명의 제 1 실시예로 효소의 농도에 따른 광산화 증폭 양상을 비교해보기로 한다.
먼저, 다양한 농도의 효소를 포함하는 시료를 준비하고 효소-기질 반응을 수행한다. 다양한 농도의 효소에는 항체에 표지된 효소, 압타머에 표지된 효소, 핵산에 표지된 효소 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 제 1 실시예에서는 일례로서, HRP 효소가 포함되지 않은 시료(Blank 시료)와 항체에 표지된 HRP 효소를 포함하는 시료, 즉 항체에 표지된 HRP와 1X PBS 버퍼를 혼합하여 시료를 농도에 따라 다양하게 준비하고, Amplex Red 기질을 혼합하여 일정 시간 동안 효소-기질 반응이 일어나도록 한다.
다음으로 상기 각 시료의 효소-기질 반응 후 생성물(레조루핀; resorufin)에 지속적으로 광을 노출시켜 광산화 증폭 과정을 수행함과 아울러 광산화 증폭 과정에서의 생성물의 형광량을 광학적으로 검출하고 이의 시간에 따른 변화 양상을 지표화하여 항체에 표지된 효소의 농도에 따른 광산화 증폭 양상 지표를 비교하도록 한다.
광산화 증폭에 이용되는 광으로는 백색광과 같은 넓은 파장의 광, 단색광과 같은 좁은 파장의 광, 레이저와 같은 단일 파장의 광 등을 포함할 수 있으며, 본 발명의 제 1 실시예에서는 510-550 nm 파장대의 녹색광을 이용한다.
도 5는 본 발명의 제 1 실시예에 따른 항체에 표지된 효소의 농도에 따른 광산화 증폭 양상을 시간에 따라 도시한 그래프이다.
도 5를 참조하면, 항체에 표지된 효소의 농도에 따라 광산화 증폭 양상이 달라짐을 확인할 수 있다. 다시 말해, 효소-기질 반응 시에 효소의 농도에 따라 각기 다른 양의 초기 생성물이 생성되고, 이렇게 생성된 초기 생성물의 양에 따라 광산화 증폭 속도가 달라짐을 확인할 수 있다.
결과적으로, 항체가 결합된 효소의 농도가 높을수록 초기 레조루핀의 생성량이 많기 때문에 자체촉매 반응의 속도 또한 빠르고 광산화 증폭이 빠르게 진행되어 형광 밝기 값이 빠르게 변화된다. 반면, 항체가 결합된 효소의 농도가 낮을수록 초기 레조루핀의 생성량이 적기 때문에 자체촉매 반응의 속도가 느리고 광산화 증폭이 느리게 진행되어 형광 밝기 값이 느리게 변화된다.
따라서, 형광 밝기 값이 변화되는 상대적인 시간 비교를 통해 항체가 결합된 효소의 농도를 확인할 수 있으며, 각 농도별 시료의 차이를 더 벌어지게 샘플링해서 저장해두면 저농도 또는 미량의 효소를 포함하는 시료로도 효소-기질 반응을 보다 정확하게 세부적으로 분석할 수 있게 된다.
도 6은 본 발명의 제 1 실시예에 따른 항체에 표지된 효소의 농도에 대한 광산화 증폭 양상의 T50 지표 추출값을 나타낸 그래프이다.
도 6과 같이, 효소의 농도가 낮을수록 생성물의 발색량, 발광량, 형광량 등의 최대값의 1/2에 이르는데 걸리는 시간을 나타내는 T50 지표가 커지는 것을 확인할 수 있으며, 이를 통해 저농도 또는 미량의 효소의 농도를 보다 정확하게 고감도로 정량할 수 있게 된다.
또한, 도 7은 본 발명의 제 1 실시예에 따른 항체에 표지된 효소의 농도에 대한 광산화 증폭 양상의 CTL(characteristic time length) 지표 추출값을 나타낸 그래프이다. 도 7에 도시된 바와 같이, 효소의 농도가 낮을수록 광산화 증폭 양상의 CTL 지표가 커지는 것을 확인할 수 있으며, 이를 통해 저농도 또는 미량의 효소의 농도를 보다 정확하게 고감도로 정량할 수 있게 된다.
< 실시예 2>
다음으로, 본 발명의 제 2 실시예로 바이오마커의 농도에 따른 광산화 증폭 양상을 지표화하여 바이오마커의 농도를 고감도로 정량해보기로 한다.
먼저, 다양한 농도의 바이오마커를 포함하는 시료를 준비하고 바이오마커에 특이적인 항체, 압타머, 핵산 등을 이용하여 바이오마커를 선택적으로 검출하는 과정을 수행한다. 바이오마커로는 단백질, 펩타이드, 유전자, 호르몬, 저분자 화합물 등 중에서 어느 하나 이상이 선택될 수 있으며, 검출된 바이오마커의 양을 정량하기 위해서 바이오마커에 특이적인 항체, 압타머, 핵산 등에 효소를 표지하는 종래의 효소 면역 검정법 등을 이용할 수 있다.
본 발명의 제 2 실시예에서는 일례로서, 단백질 바이오마커의 일종인 PSA(prostate specific antigen)를 포함하는 시료를 다양한 농도로 준비하고, HRP 효소가 표지된 PSA에 특이적인 항체를 이용하는 종래의 효소 면역 검정법을 수행한다.
다음으로, 다양한 농도의 PSA-항체-HRP 복합체가 포함된 시료에 Amplex Red 기질을 혼합하여 일정 시간 동안 효소-기질 반응을 수행한 후, 상기의 제 1 실시예와 동일한 과정으로 광산화 증폭 과정을 수행한다. 따라서, 제 2 실시예에서의 광산화 증폭 과정 측정 및 광산화 증폭 양상 지표화 방법은 제 1 실시예의 설명으로 대신하기로 한다.
도 8은 본 발명의 제 2 실시예에 따른 단백질 바이오마커의 농도에 대한 광산화 증폭 양상을 시간에 따라 도시한 그래프이며, 도 9는 단백질 바이오마커의 농도에 대한 광산화 증폭 양상의 T50 지표 추출값을, 도 10은 광산화 증폭 양상의 CTL 지표 추출값을 나타낸 그래프이다.
도 8 내지 도 10과 같이, 다양한 농도의 PSA를 포함하는 시료를 이용한 효소 면역 검정법에서 효소-기질 반응 후 생성물에 지속적으로 광을 노출시켜 광산화 증폭을 수행하게 되면, PSA의 농도가 낮을수록 생성물의 발색량, 발광량, 형광량 등의 최대값의 1/2에 이르는데 걸리는 시간을 나타내는 T50 지표 및 CTL 지표가 커지는 것을 확인할 수 있으며, 이를 통해 저농도 또는 미량의 PSA 농도를 보다 정확하게 고감도로 정량할 수 있게 된다. 즉, 농도를 알지 못하는 PSA를 포함하는 시료의 T50 지표 또는 CTL 지표를 일정 농도 간격으로 희석된 PSA를 포함하는 기준시료의 농도에 따른 T50 지표 또는 CTL 지표와 비교하게 되면, 측정 시료에 포함되어 있는 PSA의 농도를 보다 정확하게 고감도로 정량할 수 있게 된다.
본 발명의 제 2 실시예의 다른 일례로서, 펩타이드 바이오마커의 일종인 Aβ42(amyloid beta 42)를 포함하는 시료를 다양한 농도로 준비하고, HRP 효소가 표지된 Aβ42에 특이적인 항체를 이용하는 종래의 효소 면역 검정법을 수행한다.
다음으로, 다양한 농도의 Aβ42-항체-HRP 복합체가 포함된 시료에 Amplex Red 기질을 혼합하여 일정 시간 동안 효소-기질 반응을 수행한 후 상기의 제 1 실시예와 동일한 과정으로 광산화 증폭 과정을 수행한다. 따라서, 제 2 실시예의 다른 예에서의 광산화 증폭 과정 측정 및 광산화 증폭 양상 지표화 방법은 제 1 실시예의 설명으로 대신하기로 한다.
도 11은 본 발명의 제 2 실시예의 다른 일례에 따른 펩타이드 바이오마커의 농도에 대한 광산화 증폭 양상의 T50 지표 추출값을 나타낸 그래프이며, 도 12는 펩타이드 바이오마커의 농도에 대한 광산화 증폭 양상의 CTL 지표 추출값을 나타낸 그래프이다.
도 11 내지 도 12와 같이, 다양한 농도의 Aβ42를 포함하는 시료를 이용한 효소 면역 검정법에서 효소-기질 반응 후 생성물에 지속적으로 광을 노출시켜 광산화 증폭을 수행하게 되면, Aβ42의 농도가 낮을수록 생성물의 발색량, 발광량, 형광량 등의 최대값의 1/2에 이르는데 걸리는 시간을 나타내는 T50 지표 및 CTL 지표가 커지는 것을 확인할 수 있으며, 이를 통해 저농도 또는 미량의 Aβ42 농도를 보다 정확하게 고감도로 정량할 수 있게 된다. 즉, 농도를 알지 못하는 Aβ42를 포함하는 시료의 T50 지표 또는 CTL 지표를 일정 농도 간격으로 희석된 Aβ42를 포함하는 기준시료의 농도에 따른 T50 지표 또는 CTL 지표와 비교하게 되면, 측정 시료에 포함되어 있는 Aβ42의 농도를 보다 정확하게 고감도로 정량할 수 있게 된다.
이상에서 상술한 바와 같이, 본 발명을 통해서는 다양한 실시예로 바이오마커의 종류, 바이오마커에 특이적으로 결합하는 항체, 압타머, 핵산 등의 종류, 효소의 종류, 기질의 종류, 광산화 증폭 양상 지표의 종류 등을 달리하여 검출하고자 하는 바이오마커의 농도를 보다 정확하게 고감도로 정량할 수 있다.
즉, 검출하고자 하는 바이오마커의 종류에 따라 항체, 압타머, 핵산 등의 종류를 변경하여 상기의 제 2 실시예에서와 동일한 방식으로 광산화 증폭 양상을 지표화하고, 이를 기준시료의 광산화 증폭 양상 지표와 비교하여 측정시료에 포함되어 있는 저농도 또는 미량의 바이오마커의 농도를 보다 정확하게 고감도로 정량할 수 있다.
이상 상술한 바에 따른 본 발명의 광산화 증폭을 이용한 고감도 바이오마커 정량 방법으로는 검출하고자 하는 바이오마커에 특이적인 항체, 압타머, 핵산 등에 표지된 효소와 기질의 반응 후 생성물에 지속적으로 광을 노출시켜 광산화 증폭 과정을 수행한다. 그리고 광산화 증폭 시간에 따른 생성물의 발색량, 발광량, 형광량 등의 변화 양상을 지표화하고 이를 기준시료의 지표와 비교하게 되면, 저농도 또는 미량의 바이오마커를 보다 정확하게 고감도로 정량할 수 있게 된다.
이상에서 본 발명은 기재된 실시예에 대하여 상세히 설명되었지만 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당 업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허 청구범위에 속함은 당연한 것이다.

Claims (8)

  1. 바이오마커에 특이적으로 결합하는 항체, 압타머, 핵산 중에서 선택된 어느 하나에 표지된 효소를 포함하는 측정시료에 효소-기질 반응을 수행하는 단계;
    상기 효소-기질 반응 후 생성물에 지속적으로 광을 노출시켜 광산화 증폭 과정을 수행함과 아울러 광산화 증폭 과정 중에 생성물의 발색량, 발광량, 형광량 중에서 어느 하나 이상 선택된 광특성을 광학적으로 측정하는 단계;
    측정된 상기 광특성에 대하여 시간에 따른 변화 양상을 지표화하는 단계; 및
    상기 지표화 단계에서 추출된 지표를 기준시료의 지표와 비교하여 측정시료에 포함되어 있는 바이오마커의 농도를 정량하는 단계;
    를 포함하는 광산화 증폭을 이용한 고감도 바이오마커 정량 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 측정시료에 효소-기질 반응을 수행하는 단계는
    페르옥시다아제(peroxidase), 갈락토시다아제(galactosidase), 포스파타아제(phosphatase) 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 효소가 항체, 압타머, 핵산 중에서 선택된 어느 하나에 표지되며, 상기 효소가 표지된 측정시료에 ADHP(10-Acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine; Amplex Red), RGP(resorufin-β-D-galactopyranoside), MUP(4-methylumbelliferyl phosphate) 중에서 선택된 어느 하나 이상의 기질을 혼합하여 일정 시간 동안 효소-기질 반응을 수행하는 단계를 포함하는 광산화 증폭을 이용한 고감도 바이오마커 정량 방법
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 바이오마커는
    단백질, 펩타이드, 유전자, 호르몬, 저분자 화합물 중의 어느 하나 이상을 선택하는 광산화 증폭을 이용한 고감도 바이오마커 정량 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 광특성을 광학적으로 측정하는 단계에서, 광산화 증폭에 이용되는 광은 백색광, 단색광, 레이저 중에서 어느 하나 이상 선택되는 광산화 증폭을 이용한 고감도 바이오마커 정량 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 광특성을 광학적으로 측정하는 단계는 효소-기질 반응 생성물에 지속적으로 광을 노출시키면서 생성물의 광특성을 시간에 따라 연속적으로 측정하는 단계를 포함하는 광산화 증폭을 이용한 고감도 바이오마커 정량 방법
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 지표화하는 단계는 측정된 생성물의 시간에 따른 광특성 변화 양상에 대한 회귀분석에 의해서 지표를 추출하는 광산화 증폭을 이용한 고감도 바이오마커 정량 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 지표화하는 단계는 측정된 생성물의 시간에 따른 광특성 변화 양상에 대한 회귀분석에 의해서, 상기 광특성의 초기값 회귀분석 추정치, 상기 광특성의 최대값 회귀분석 추정치, 상기 광특성의 최대값의 1/2에 이르는데 걸리는 시간의 회귀분석 추정치, 상기 광특성의 시간에 따른 증폭률 회귀분석 추정치를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 지표를 추출하는 광산화 증폭을 이용한 고감도 바이오마커 정량 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 측정 시료에 포함되어 있는 바이오마커의 농도를 정량하는 단계는, 일정 농도 간격으로 희석된 바이오마커를 포함하는 기준시료의 광산화 증폭 양상 지표를 기준지표로 하고, 검출하고자 하는 바이오마커를 포함하는 측정시료의 광산화 증폭 양상 지표를 기준지표와 비교하여, 측정시료에 포함되어 있는 바이오마커의 농도를 정량하는 단계를 포함하는 광산화 증폭을 이용한 고감도 바이오마커 정량 방법.
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