JP2018529356A - 水素支援ジスルフィド酵素水素化分解によるメルカプタンの製造方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、ジスルフィドおよび水素から、酵素触媒作用によりメルカプタンを製造する方法、特にジメチルジスルフィドおよび水素からメチルメルカプタンを製造する方法に関する。

Description

本発明は、水素を使った、酵素触媒作用による、ジスルフィド、特にジメチルジスルフィドからのメルカプタン、特にメチルメルカプタンの製造方法に関する。

メルカプタンは、多くの分野、例えば、香味剤、ガス用着臭剤、重合における連鎖移動剤、医薬品または化粧品産業用の出発材料、酸化防止剤の合成のための出発材料、潤滑のための超高圧または耐摩耗添加剤として極めて有用である。これらの例は、現時点で知られている、また、本発明の方法により調製できるメルカプタンの使用を限定するものでは全くない。

特に、最初のメルカプタンであるメチルメルカプタン（ＣＨ_３ＳＨ）は、特に、動物の飼料に非常に広範に使用される必須アミノ酸のメチオニンの合成における出発材料として、工業的に極めて有益である。メチルメルカプタンはまた、多くのその他の分子の合成用に非常に広範に使用される出発材料でもある。

メルカプタンは、アルコールのスルフヒドリル化、不飽和の有機化合物への触媒的または光化学的硫化水素付加、硫化水素によるハロゲン化物、エポキシドまたは有機カーボネートの置換、などの多くの方法により合成され得る。

特に、メチルメルカプタンは、最近、反応（１）により、メタノールおよび硫化水素からトンスケールで工業的に製造されている。

ＣＨ_３ＯＨ＋Ｈ_２Ｓ→ＣＨ_３ＳＨ＋Ｈ_２Ｏ（１）
これらの方法は、メタノール（ＣＨ_３ＯＨ）を必要とし、硫化水素（Ｈ_２Ｓ、例えば、水素と硫黄から合成されるが、これにはさらに水素の合成を要する。）を合成するという欠点を有し、ジメチルエーテル（ＣＨ_３ＯＣＨ_３）、ジメチルスルフィド（ＣＨ_３ＳＣＨ_３）タイプの副産物、クラッキング産物および水を生じ、これは、メチルメルカプタンの精製に多くの工程を要することを意味する。

例えば、これらの反応に基づく方法の記載は、ＷＯ２０１３０９２１２９、ＷＯ２００８１１８９２５、ＷＯ２００７０２８７０８、ＷＯ２００６０１５６６８およびＷＯ２００４０９６７６０などの特許出願で見つけられる。

以下の合成スキーム（２）に従って、（メタノール合成を避けるために）一酸化炭素、水素および硫化水素からメチルメルカプタンを製造したいという願望は、経済的に利点があることが立証され得る。

ＣＯ＋２Ｈ_２＋Ｈ_２Ｓ→ＣＨ_３ＳＨ＋Ｈ_２Ｏ（２）
しかし、これらの方法は、合成ガス（ＣＯ／Ｈ_２）を必要とし、従って、炭化水素原料の水蒸気改質の実施を必要とし、ＣＯとＨ_２との間の比率を適切にすることを必要とし、このため、「水性ガスシフト反応」（ＣＯ＋Ｈ_２Ｏ→ＣＯ_２＋Ｈ_２）と呼ばれる反応に伴うＣＯ／Ｈ_２比率を調節できるようにすることを必要とし、また、Ｈ_２Ｓを合成することを必要とするという難点がある。

これらの方法はまた、通常、大きな割合のＣＯ_２を副産物として生じ、さらに、メタン、ジメチルスルフィド、および水も生じる。例えば、これらの反応に基づく方法の記載は、ＵＳ２０１０２８６４４８、ＵＳ２０１００９４０５９、ＵＳ２００８２９３９７４、ＵＳ２００７２１３５６４などの特許出願で見つけられる。

さらに他の方法が記載されており、また、下記のような異なる反応が組み合わされている。

・メタンと硫黄からＣＳ_２およびＨ_２Ｓの形成（３）：
ＣＨ_４＋４Ｓ→ＣＳ_２＋２Ｈ_２Ｓ（３）
・ＣＳ_２の水素化（４）：
ＣＳ_２＋３Ｈ_２→ＣＨ_３ＳＨ＋Ｈ_２Ｓ（４）

メタノールとの反応（反応１）または合成ガスとの反応（反応２）で、反応（３）および（４）由来の過剰のＨ_２Ｓを使用して、さらにメチルメルカプタンを得ることも可能である。

これらの方法が、反応（１）および（２）に対し記載した欠点と、反応（４）を実施させるのに過剰の水素を要するというさらなる困難とを、併せ持っていることは明らかである。これらの方法の記載は、特許出願ＵＳ２０１１０１５４４３、または、より具体的には、反応（４）に関して、出願ＷＯ２０１００４６６０７で見つけられる。

出願ＷＯ２００１９６２９０は、メタンとＨ_２Ｓからメチルメルカプタンを直接合成し、水素を同時に製造する方法を提案している。このメタンとＨ_２Ｓとの直接反応は、コロナ放電を伴うパルスプラズマにより行われる。この出願は合成例を何ら記載していないので、この技術によるメチルメルカプタンの大規模な工業的合成方法を想定するのは困難であろう。さらに、この方法は、Ｈ_２Ｓが入手できない場合には、これを合成する必要がある。

一方で、特許出願ＥＰ０６４９８３７は、遷移金属硫化物を用いたジメチルジスルフィドの水素による触媒水素化分解を介したメチルメルカプタンの合成方法を提案している。この方法は効率的であるが、工業的に有利なレベルの生産性を得るためには、２００℃程度の比較的高温を必要とする。

当業者なら、ナトリウムメチルメルカプチド（ＣＨ_３ＳＮａ）の水溶液の酸性化によりメチルメルカプタンを調製することが可能であることも知っている。この方法は、塩酸が使用されるか硫酸が使用されるかに応じて、塩化ナトリウムまたは硫酸ナトリウムなどの大量の塩を生成するという大きな欠点がある。これらの塩類水溶液は多くの場合処理が極めて困難であり、また、微量の悪臭に満ちた生成物が残るため、この方法を工業規模ですぐに想定することはできない。

メチルメルカプタンより高級なメルカプタンの合成方法も同様に、多くの欠点がある。このように、アルコールを硫化水素で置換することは、高温、また多くの場合、高圧を必要とし、オレフィン、エーテルおよび硫化物タイプの望ましくない副産物をもたらす。

不飽和化合物に対する硫化水素の触媒的のまたは光化学的付加は、上記よりわずかに緩い条件下で起こることがよくあるが、この場合も、出発材料の異性化、非位置選択性の付加または硫化物を生ずる二重付加により、形成される多くの副産物をもたらす。最終的に、ハロゲン化誘導体の置換は、工業的工程と容易には両立され得ない大量の排出物および塩類廃棄物を生成する工程をもたらす。

国際公開第２０１３／０９２１２９号 国際公開第２００８／１１８９２５号 国際公開第２００７／０２８７０８号 国際公開第２００６／０１５６６８号 国際公開第２００４／０９６７６０号 米国特許出願公開第２０１０／２８６４４８号明細書 米国特許出願公開第２０１０／０９４０５９号明細書 米国特許出願公開第２００８／２９３９７４号明細書 米国特許出願公開第２００７／２１３５６４号明細書 米国特許出願公開第２０１１／０１５４４３号明細書 国際公開第２０１０／０４６６０７号 国際公開第２００１／９６２９０号 欧州特許第０６４９８３７号明細書

本発明の主題は、メルカプタン、特にメチルメルカプタンを調製する、上記先行技術に由来する方法に記載された欠点のない、新規な方法を提案することである。

水素により再生されるグルタチオン／グルタチオンレダクターゼ複合体による還元を示す。

より具体的には、本発明の第１の主題は、式Ｒ−ＳＨのメルカプタンの調製方法である：
ａ）混合物の調製ステップであって：
１）式Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｒ’のジスルフィド、
２）触媒量のチオール基含有アミノ酸またはチオール基含有ペプチド、
３）触媒量の、２当量の前記チオール基含有アミノ酸間または２当量の前記チオール基含有ペプチド間に形成されたジスルフィド架橋の還元を触媒する酵素、
４）触媒量の、水素の還元を触媒する酵素、
５）触媒量の、還元および脱水素を触媒する２種の酵素に共通な補因子、
を含む混合物の調製ステップ、
ｂ）水素の付加ステップ、
ｃ）酵素反応の実施ステップ、
ｄ）式Ｒ−ＳＨのメルカプタンおよび式Ｒ’−ＳＨのメルカプタンの回収ステップ、
ｅ）式Ｒ−ＳＨのメルカプタンおよび／または式Ｒ’−ＳＨのメルカプタンの分離および任意の精製ステップ、
を少なくとも含む方法。

水素の還元を触媒する酵素は、当業者に既知の任意の種類、例えば、水素デヒドロゲナーゼ酵素であってよい。

一般的に言って、２当量の前記チオール基含有アミノ酸間または前記チオール基含有ペプチド間に形成されたジスルフィド架橋の還元を触媒する酵素は、レダクターゼ酵素である。用語の「レダクターゼ」は、本発明の説明の記載の残りの部分で使用される。

還元および脱水素を触媒する２種の酵素（レダクターゼおよびデヒドロゲナーゼ）に共通の補因子の中で、フラビン補因子およびニコチン補因子が非制限的例として言及される。ニコチン補因子の使用が好ましく、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）がより好ましく、またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰＨ）がさらに好ましい。上記補因子は、これらの還元型（例えば、ＮＡＤＰＨ、Ｈ^＋）および／またはこれらの酸化型（ＮＡＤＰ^＋）で使用するのが好都合であり、即ち、これらは、前述の還元型および／または酸化型で反応媒体中に添加してよい。

本発明の一実施形態では、チオール基含有アミノ酸および／またはチオール基含有ペプチドは、前記アミノ酸および／または前記ペプチドのそれぞれのジスルフィドの形であってよい（例えば、グルタチオンジスルフィドの形のグルタチオン）。

上記で定義の方法のステップａ）およびｂ）の異なる成分の添加の仕方および順番は、様々に実施してよい。いずれの場合でも、ステップｃ）の酵素反応は、触媒の系の成分の１種：酵素もしくは化学量論量で添加される化合物の１種（ジスルフィドまたは水素）、または触媒量で添加される化合物の１種（チオール基含有アミノ酸またはチオール基含有ペプチドまたは前記分子もしくは補因子に対応するジスルフィド）の添加により開始される。

またさらに具体的には、本発明の主題は、式Ｒ−ＳＨのメルカプタンの調製方法である：
ａ’）混合物の調製ステップであって：
・式Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｒ’のジスルフィド、
・触媒量の、チオール基含有アミノ酸またはチオール基含有ペプチド、
・触媒量の、前記チオール基含有アミノ酸または前記チオール基含有ペプチドに対応するレダクターゼ酵素、
・触媒量のＮＡＤＰＨ、
を含む混合物の調製ステップ、
ｂ’）触媒量の水素デヒドロゲナーゼ酵素による水素の付加ステップ、
ｃ’）酵素反応の実施ステップ、
ｄ’）式Ｒ−ＳＨのメルカプタンおよび式Ｒ’−ＳＨのメルカプタンの回収ステップ、
ｅ’）式Ｒ−ＳＨのメルカプタンおよび式Ｒ’−ＳＨのメルカプタンの分離および任意の精製ステップ
を少なくとも含む方法。

本発明においては、一般式Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｒ’に相当する任意のジスルフィドがメルカプタン製造方法に関与することができる。一般式Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｒ’では、同じまたは異なるＲおよびＲ’は、相互に独立に、１から２０個の炭素原子を含む、直鎖、分岐鎖、または環状の炭化水素系基を表し、前記鎖は、飽和であるかまたは二重もしくは三重結合の形の１つ以上の不飽和部位を有する。ＲおよびＲ’は、一緒に、これらを保持する硫黄原子と共に、４から２２個の原子、好ましくは５から１０個の原子を含む環状分子を形成してもよい。

好ましい態様では、同じかまたは異なる基ＲおよびＲ’は、１から２０個の炭素原子、好ましくは１から１２個の炭素原子、より好ましくは１から６個の炭素原子を含み、任意選択の、非制限的な例示としてのアルコール、アルデヒド、ケトン、酸、アミド、ニトリルもしくはエステルの官能基、または、硫黄、リン、ケイ素もしくはハロゲンを含有する官能基から選択される１種以上の官能基により官能化された、直鎖もしくは分岐鎖の、飽和もしくは不飽和のアルキル、シクロアルキル、アリール、アルキルアリールまたはアリールアルキル基から相互に独立に選択される。

式Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｒ’のジスルフィドは、本発明の方法に従って、式Ｒ−ＳＨのメルカプタンおよび式Ｒ’−ＳＨのメルカプタンに還元できる。ＲがＲ’と異なる場合、非対称ジスルフィドに関し記載され、ＲがＲ’と同じの場合には、対称ジスルフィドに関して記載されている。対称ジスルフィドＲ−Ｓ−Ｓ−Ｒの場合、本発明の方法は、式Ｒ−ＳＨのメルカプタンをもたらす。本発明の特に好ましい態様では、ジメチルジスルフィド（ＤＭＤＳ）は、メチルメルカプタンＣＨ_３ＳＨを製造する目的で使用される。

非対称ジスルフィドＲ−Ｓ−Ｓ−Ｒ’の場合、本発明の方法は、式Ｒ−ＳＨおよびＲ’−ＳＨのメルカプタンの混合物をもたらし、これは、そのまま使用され得るか、または、当業者に周知の１種以上の分離操作、例えば、蒸留に供することができる。

本発明の方法で１種以上の対称および／または非対称ジスルフィドの混合物を使用することも可能である。可能なジスルフィド混合物は、ＤＳＯ（ジスルフィド油）を含んでよく、前記ＤＳＯは、従って、極めて有利に利用できる可能性があり得る。

本発明の方法では、製造されたメルカプタンは通常、固体、液体および／または気体の形で回収される。

本発明による製造方法は、メチルメルカプタンが得られるジメチルジスルフィドで例示される次の反応に従う水素によるジスルフィド、特にジメチルジスルフィドの酵素還元をベースにしている：
ＣＨ_３ＳＳＣＨ_３＋Ｈ_２→２ＣＨ_３ＳＨ
今般、この反応は、添付図１で記載のように、水素により再生される（アミノ酸またはペプチド）／対応するレダクターゼ酵素複合体の形の、チオール基含有アミノ酸またはチオール基含有ペプチド、例えば、グルタチオンを用いた酵素系により容易に触媒されることが見出された。

従って、図１の説明により、ペプチド（「グルタチオン」で例示）は、ジスルフィド架橋を有するペプチド（「グルタチオンジスルフィド」で示す。）に変換することにより、ジスルフィド（「ＤＭＤＳ」で示す。）をメルカプタン（「メチルメルカプタン」で示す。）に還元する。レダクターゼ酵素（「グルタチオンレダクターゼ」で示す、ＥＣ１．８．１．７またはＥＣ１．６．４．２）は、ペプチド（グルタチオン）を再生し、この同じ酵素は、当業者に周知の酸化還元酵素複合体、例えば、ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（還元型および酸化型））複合体により再生される。ＮＡＤＰ＋は、次に、「水素デヒドロゲナーゼ」酵素（ＥＣ１．１２．１．５）により、水素によってＮＡＤＰＨに再生される。水素により放出されるプロトンは、ＮＡＤＰＨと反応後ＨＳ−Ｒ−Ｓ⁻を生ずるグルタチオンレダクターゼと反応し、メルカプチド官能基がメルカプタン官能基になるので、蓄積されない。

換言すれば、ペプチド（「グルタチオン」で示す。）は、ジスルフィド架橋を有するペプチド（「グルタチオンジスルフィド」で示す。）に変換することにより、ジスルフィド（「ＤＭＤＳ」で示す。）をメルカプタン（「メチルメルカプタン」で示す。）に還元する。還元を触媒する酵素（「グルタチオンレダクターゼ」で示す、酵素分類番号例ＥＣ１．８．１．７または１．６．４．２）は、ペプチド（「グルタチオン」）を再生し、同時に、補因子を酸化する（「ＮＡＤＰＨ、Ｈ^＋」で示す。）。酸化型（「ＮＡＤＰ^＋」で示す。）はその後、当業者に周知の、関与するデヒドロゲナーゼ酵素（「水素デヒドロゲナーゼ」、酵素分類番号例ＥＣ１．１．１．４７で示される。）を含む「リサイクル」酸化還元酵素複合体および水素により還元される。水素により放出されるプロトンは、使用するレダクターゼ酵素により触媒される反応中に形成されるメルカプチド官能基と直接反応するので、蓄積されない。

特に最も好適する実施形態では、グルタチオンレダクターゼ酵素と組み合わされたグルタチオン／グルタチオンジスルフィド系は、本発明により、ＤＭＤＳをメチルメルカプタンに還元することを可能にする。

グルタチオンは生物学に広く使用されるトリペプチドである。還元型（グルタチオン）または酸化型（グルタチオンジスルフィド）では、この種は、細胞中で重要なレドックス対を形成する。従って、グルタチオンは生物から重金属を取り除くのに不可欠である。例えば、出願ＷＯ０５１０７７２３はまた、グルタチオンがキレート化製剤を形成するために使用される配合物を記載しており、また、特許ＵＳ４６５７８５６は、グルタチオンにより、Ｈ_２Ｏ_２などのペルオキシドをグルタチオンペルオキシダーゼを介してＨ_２Ｏに分解できることを教示している。最終的に、グルタチオンによりまた、タンパク質中のジスルフィド架橋の還元が可能とする（Ｒｏｎａ Ｃｈａｎｄｒａｗａｔｉ，”Ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ Ｃａｒｇｏ Ｒｅｌｅａｓｅ ｂｙ Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｃａｐｓｏｓｏｍｅｓ”，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．，（２０１１），ｖｏｌ．１１，４９５８−４９６３）。

本発明の方法では、触媒量のチオール基含有アミノ酸またはチオール基含有ペプチドを用いて、ジスルフィドからメルカプタンが製造される。

本発明の方法で使用し得るチオール基含有アミノ酸の中で、非制限的例としてのシステインおよびホモシステインに言及する。これらの事例では、同様の方式での触媒サイクルを再生するために使用される酸化還元酵素系は、システイン／シスチンレダクターゼ系ＥＣ１．８．１．６およびホモシステイン／ホモシステインレダクターゼ系である。

本発明の方法で使用し得るチオール基含有ペプチドの中で、非制限的例としてのグルタチオンおよびチオレドキシンに言及する。従って、上記のグルタチオン／グルタチオンレダクターゼ系は、チオレドキシン（ＣＡＳ番号５２５００−６０−４）／チオレドキシンレダクターゼ（ＥＣ１．８．１．９またはＥＣ１．６．４．５）系により置換することができる。

グルタチオンおよびグルタチオン／グルタチオンレダクターゼ系は、これら化合物のコストおよび製造が容易であるために、本発明にとって特に好ましいものである。

本発明による方法では、当業者に既知の任意の手段により、例えば、反応媒体中へのバブリングを介して水素を反応媒体に添加でき、これには、水性−有機反応媒体が好都合である。反応器中の水素圧力は、下記で定義される反応媒体自体の圧力に相当する。

使用酵素は、水素デヒドロゲナーゼ酵素であり、これも当業者によく知られている。

本発明による方法では、ジスルフィドおよび水素のみが化学量論量で使用され、その他の全ての成分（アミノ酸またはペプチド、補因子（例えば、ＮＡＤＰＨ）および２種の酵素）は、触媒量で使われる。

本発明の方法によりもたらされる利点は多い。これらの利点の中で、極めて穏やかな温度条件下および圧力条件下および中性に近いｐＨ条件下での水性または水性−有機溶液中での作業の可能性について言及する。全てのこれらの条件は、「環境に優しい」または「持続可能な」生物触媒工程に特有のものである。

方法がジメチルジスルフィドを使用する場合の別の利点は、反応条件下で気体状態である生成したメチルメルカプタンが、未反応の水素が付随することもあるが、形成された時点で反応媒体から出ていくことである。メチルメルカプタンは、従って、未反応の水素が後工程に悪影響を与えない場合には、反応器を出て、さらに下流の用途で直接に使用し得る。未反応の水素が下流の用途に悪影響を与える場合には、当業者ならメチルメルカプタンから未変換水素を容易に分離できるであろう。メルカプタンを分離したい場合、例えば、極低温で容易に液化することもできる。

ジメチルジスルフィド（ＤＭＤＳ）を、メチルメルカプタンと、例えば、酸素、硫黄もしくは過酸化水素水溶液などの酸化剤とから、または、硫酸ジメチルおよび二硫化ナトリウムから、別の場所で製造してもよい。ＤＭＤＳはまた、上述のようにジスルフィド油（ＤＳＯ）由来であってもよく、その後、出願ＷＯ２０１４０３３３９９に記載のように、例えば、反応蒸留により精製してもよい。ＤＳＯはまた、構成する異なるジスルフィド間で精製する必要もなく、そのままも使用してもよいことに留意されたい。メルカプタンの混合物はその後、本発明の方法を適用することにより得られる。

ＤＭＤＳがジスルフィドとして使用される場合、本発明による方法は、従って、製造と使用の場所が異なる場合に、メチルメルカプタンを製造場所からの既存の工業的経路による使用場所への輸送の回避を可能とする方法と見なすことができる。実際に、メチルメルカプタンは、室温で有毒で極めて悪臭に満ちた気体であり、このため、輸送が極めて複雑化し、ＤＭＤＳと異なり、輸送が従来から強く規制されている。本発明で記載の方法は、従って、メチルメルカプタンを後工程の使用現場で直接製造するために使用できる。

ＤＭＤＳが反応で消費され、メチルメルカプタンが、水素なしで、または未変換水素と共に、形成された時点で反応媒体から出ていくので、水素およびＤＭＤＳが連続的に供給されると想定される場合に、反応媒体中に生成物が蓄積されない。従って、反応器に入り、出ていく生成物を考慮すると、触媒系をリサイクルする必要がない。

その他のジスルフィドの場合では、形成されるメルカプタンの沸点および反応媒体中での溶解度に応じて、メルカプタンを、容易に分離するために、任意で、当業者に周知の技術により反応媒体から分離して沈殿させ得る。上記で分離できない場合には、同様に当業者に既知のいずれかの手段により反応媒体から分離できる。

一般に、反応温度は、１０℃から５０℃、好ましくは、１５℃から４５℃、より好ましくは、２０℃から４０℃の範囲内である。

反応のｐＨは、６から８．５、好ましくは、７．０から８．０であってよい。反応媒体のｐＨは、緩衝液により調整してもよい。緩衝媒体のｐＨが、７．５から８．０のｐＨ値で選択されるのが極めて好ましい。

反応に使われる圧力は、試薬および使用装置に応じて、大気圧より減圧から数バール（数百ｋＰａ）までの範囲であってよい。好ましくは、使用は、大気圧から２０バール（２ＭＰａ）の範囲の圧力で実施され、またはさらに好ましくは、方法は、大気圧から３バール（３００ｋＰａ）の範囲の圧力下で実施される。

本発明による方法は、選択操作条件および使用試薬に応じて、ガラスまたは金属反応器中でバッチ式でまたは連続式で実施できる。反応で水素が消費されるに伴い添加される半連続工程が選択されるのが好ましい。

理想的な水素／ジスルフィドモル比は、化学量論（モル比＝１）であるが、当業者が何らかの利益があると考える場合、例えば、水素を連続添加とする一方で、ジスルフィドを開始時から反応器に導入するなどの場合、０．０１から１００まで変わってもよい。好ましくは、このモル比は、全反応にわたり、全体で１から２０の間で選択される。

任意の未変換水素を、完全に消費されるまで、反応器の出口から反応器の入口へリサイクルできる。水素が完全にジスルフィドを変換するまで、水素および形成されたメルカプタンによるループを考慮してもよい。この結果、全てのジメチルジスルフィドが変換されると、反応の終わりには、出口気体は、実質上メチルメルカプタンのみを含む。

上記ステップａ）で調製された混合物中に触媒量で存在する要素（チオール基含有アミノ酸またはチオール基含有ペプチド、レダクターゼ酵素、補因子（例えば、ＮＡＤＰＨ））は、市販品として容易に入手できるかまたは当業者に周知の技術により調製できる。これらの異なる要素は、固体または液体形態であってよく、極めて好都合にも、水に溶解して、本発明の方法で使用され得る。使われる酵素は、支持物上にグラフト化されてもよい（担持酵素の場合）。

アミノ酸またはペプチドを含む酵素複合体の水溶液はまた、当業者に既知の方法により、例えば、これらの要素を含む細胞の透過化により再構成され得る。次の実施例１で与えられる組成物である、この水溶液は、反応媒体の合計重量を基準にして、０．０１重量％から２０重量％の間の含量で使用し得る。０．５％から１０％の含量で使用されるのが好ましい。

別の態様では、本発明は、ジスルフィドからメルカプタンの合成のための、上記で定義のチオール官能基含有アミノ酸または上記で定義のチオール官能基含有ペプチドを含む酵素複合体の水溶液の使用に関する。

上記の方法のステップａ）で使用可能である混合物は、下記：
１）式Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｒ’のジスルフィド、
２）触媒量の、チオール基含有アミノ酸またはチオール基含有ペプチド、
３）触媒量の、２当量の前記チオール基含有アミノ酸間または２当量の前記チオール基含有ペプチド間に形成されたジスルフィド架橋の還元を触媒する酵素、
４）任意選択の、触媒量の水素の還元を触媒する酵素、
５）触媒量の、還元および脱水素を触媒する２種の酵素に共通な補因子、
６）および、任意選択の水素を含み、
式中、ＲおよびＲ’は上記で定義の通りであって、新規であり、従って、本発明の一部を形成する。

本発明の一実施形態では、チオール基含有アミノ酸および／またはチオール基含有ペプチドは、前記アミノ酸および／または前記ペプチドジスルフィドの形であってよい。さらに別の実施形態では、補因子は、酸化型（ＮＡＤＰ^＋）または還元型（ＮＡＤＰＨ、Ｈ^＋）のＮＡＤＰＨである。

より具体的には、前記混合物は、
・式Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｒ’のジスルフィド、
・触媒量の、チオール基含有アミノ酸またはチオール基含有ペプチド、
・触媒量の、前記チオール基含有アミノ酸または前記チオール基含有ペプチドに対応するレダクターゼ酵素、および
・触媒量のＮＡＤＰＨを含み、
式中、ＲおよびＲ’は上記で定義の通りである。

本発明の範囲に対し非限定的である、以下の実施例によって、本発明はよりよく理解されるであろう。下記に提示される全ての試験は、嫌気性条件下で実施された。

［実施例１］
１０ｍｌのグルタチオン酵素複合体を、ｐＨ７．８の１５０ｍｌの緩衝化水溶液を含む反応器中に導入する。酵素複合体の溶液は、下記を含む：
１８５ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ）のグルタチオン、２００Ｕのグルタチオンレダクターゼ、５０ｍｇ（０．０６ｍｍｏｌ）のＮＡＤＰＨおよび２００Ｕの水素デヒドロゲナーゼ酵素。

反応媒体を機械的に攪拌をしながら３５℃にする。第１の試料をｔ＝０で採取する。その後、ジメチルジスルフィド（９．４ｇ、０．１ｍｏｌ）をビュレットに入れ、反応器に滴加する。同時に、４Ｌ／時間の水素流（標準温度および圧力条件下で測定）をバブリングにより反応器に導入する。大気圧で反応を実施する。反応器を出る気体のガスクロマトグラフィー分析では、水素およびメチルメルカプタン（微量の水）が存在することを実質的に示す。これらの出口気体は、２０％の水酸化ナトリウム水溶液でトラップする。ＤＭＤＳおよび水素（反応全体に対し、水素／ＤＭＤＳのモル比＝１０．７）を６時間導入し、反応を、反応器の出口のトラップ中のメチルメルカプタンナトリウム塩の電位差銀滴定によりモニターする。さらに、反応媒体の最終的ガスクロマトグラフィー分析により、ＤＭＤＳが存在しないこと、および過剰水素により反応器から追い出されたメチルメルカプタンが存在しないことを確認する。

［実施例２］
実施例１の反応媒体に対し、９．４ｇ（０．１ｍｏｌ）のＤＭＤＳを６時間滴下して再導入するが、今回は、１ｌ／時間のみの水素流を、同様に６時間にわたり導入する（反応全体に対し、水素／ＤＭＤＳのモル比＝２．７）。反応器の出口の２０％の水酸化ナトリウム溶液を交換後、反応を実施例１と同様にモニターする。反応の終了時点での分析により、ＤＭＤＳの完全な消失を確認し、完全にメチルメルカプタンに変換され、水酸化ナトリウム溶液中のナトリウム塩型として認められる。反応の終わりでは、グルコノラクトンのみが反応媒体中で分析され、認められる。本実施例は、触媒系の堅牢さについて再現性があり、また同様に、化学量論に近い水素／ＤＭＤＳのモル比で取り扱うことが可能であることも示す。

［実施例３］
１０ｍｌのグルタチオン酵素複合体を、ｐＨ６．８の緩衝化水溶液（７０ｍｌ）を含む反応器中に導入する。酵素複合体の溶液は、下記を含む：
２００ｍｇ（０．６５ｍｍｏｌ）のグルタチオン、５００Ｕのグルタチオンレダクターゼ、１００ｍｇ（０．１２ｍｍｏｌ）のＮＡＤＰＨおよび５０Ｕの水素デヒドロゲナーゼ。

水素デヒドロゲナーゼは、当業者に周知の技術を用いて、微生物の培養により得た（Ｂｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｒ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ａｍ Ｂｅｉｓｐｉｅｌ ｖｏｎ Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ Ｆｕｒｉｏｓｕｓ”，Ｓｈａｋｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ／Ｈｅｒｚｏｇｅｎｒａｔｈ，２００２、に従って）。

反応媒体を機械的に攪拌し、窒素をフラッシングしながら３５℃にする。第１の試料をｔ＝０で採取する。その後、２０ｇ（０．２２ｍｏｌ）のジメチルジスルフィドを注射器を用いて添加する。

同時に、４ｌ／時間の量の水素（標準温度および圧力条件下で測定）をバブリングにより反応媒体中に導入する。大気圧で反応を実施する。

反応器を出る気体のガスクロマトグラフィー分析は、水素、窒素およびメチルメルカプタン（微量の水）の存在を実質的に示す。これらの出口気体は、２０重量％の水酸化ナトリウム水溶液でトラップする。ＤＭＤＳおよび水素（反応全体に対し、水素／ＤＭＤＳのモル比＝４．９）を６時間導入し、反応器の出口のトラップ中のメチルメルカプタンナトリウム塩の電位差銀滴定により反応をモニターする。

最終的な分析では、ＤＭＤＳが定量的にメチルメルカプタンに変換されたことを示す。さらに、反応媒体の最終的なガスクロマトグラフィー分析により、ＤＭＤＳが存在しないこと、および水素により反応器から追い出されたメチルメルカプタンが存在しないことを確認する。

Claims (12)

1. 式Ｒ−ＳＨのメルカプタンの調製方法であって、
   ａ）混合物の調製ステップであって、
   １）式Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｒ’のジスルフィド、
   ２）触媒量の、チオール基含有アミノ酸またはチオール基含有ペプチド、
   ３）触媒量の、２当量の前記チオール基含有アミノ酸間または２当量の前記チオール基含有ペプチド間に形成されたジスルフィド架橋の還元を触媒する酵素、
   ４）触媒量の、水素の還元を触媒する酵素、
   ５）触媒量の、還元および脱水素を触媒する前記２種の酵素に共通な補因子、
   を含む混合物の調製ステップ、
   ｂ）触媒量の水素デヒドロゲナーゼ酵素による水素の付加ステップ、
   ｃ）酵素反応の実施ステップ、
   ｄ）前記式Ｒ−ＳＨのメルカプタンおよび式Ｒ’−ＳＨのメルカプタンの回収ステップ、
   ｅ）前記式Ｒ−ＳＨのメルカプタンおよび／または前記式Ｒ’−ＳＨのメルカプタンの任意の分離および任意の精製ステップ、
   を少なくとも含む方法。
2. 請求項１に記載の方法であって、
   ａ’）混合物の調製ステップであって、
   ・式Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｒ’のジスルフィド、
   ・触媒量の、チオール基含有アミノ酸またはチオール基含有ペプチド、
   ・触媒量の、前記チオール基含有アミノ酸または前記チオール基含有ペプチドに対応するレダクターゼ酵素、
   ・触媒量のＮＡＤＰＨ、
   を含む混合物の調製ステップ、
   ｂ’）触媒量の水素デヒドロゲナーゼ酵素による水素の付加ステップ、
   ｃ’）酵素反応の実施ステップ、
   ｄ’）式Ｒ−ＳＨのメルカプタンおよび式Ｒ’−ＳＨのメルカプタンの回収ステップ、
   ｅ’）前記式Ｒ−ＳＨのメルカプタンおよび／または前記式Ｒ’−ＳＨのメルカプタンの分離および任意の精製ステップ、
   を少なくとも含む方法。
3. 同じまたは異なるＲおよびＲ’が、相互に独立に、１から２０個の炭素原子を含む、直鎖、分岐鎖または環状鎖の炭化水素系基を表し、前記鎖が、飽和であるか、または二重もしくは三重結合の形の１つ以上の不飽和部位を有し、ＲおよびＲ’が、さらに一緒に、かつこれらを保持する硫黄原子と共に、４から２２個の原子、好ましくは５から１０個の原子を含む環状分子を形成できる、請求項１または請求項２に記載の方法。
4. 同じまたは異なる基ＲおよびＲ’が、１から２０個の炭素原子、好ましくは１から１２個の炭素原子、より好ましくは１から６個の炭素原子を含み、任意的に、アルコール、アルデヒド、ケトン、酸、アミド、ニトリルもしくはエステル官能基、または、硫黄、リン、ケイ素もしくはハロゲンを含有する官能基から選択される１種以上の官能基により官能化された、直鎖もしくは分岐鎖の、飽和もしくは不飽和のアルキル、シクロアルキル、アリール、アルキルアリールまたはアリールアルキル基から相互に独立に選択される、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記式Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｒ’のジスルフィドがジメチルジスルフィドである、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記チオール基含有アミノ酸または前記チオール基含有ペプチドが、システイン、ホモシステイン、グルタチオンおよびチオレドキシンから選択される、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記水素がバブリングにより反応媒体中に導入される、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
8. 反応のｐＨが、６から８．５、好ましくは、７．０から８．０である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
9. 水素／ジスルフィドのモル比が、反応全体にわたり、０．０１から１００、好ましくは、全体で１から２０である、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
10. ジスルフィドからメルカプタンの合成のための、チオール官能基含有アミノ酸またはチオール官能基含有ペプチドを含む酵素複合体の水溶液の使用。
11. 混合物であって、
    １）式Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｒ’のジスルフィド、
    ２）触媒量、のチオール基含有アミノ酸またはチオール基含有ペプチド、
    ３）触媒量の、２当量の前記チオール基含有アミノ酸間または２当量の前記チオール基含有ペプチド間に形成されたジスルフィド架橋の還元を触媒する酵素、
    ４）任意選択の、触媒量の、水素の還元を触媒する酵素、
    ５）触媒量の、還元および脱水素を触媒する前記２種の酵素に共通な補因子、
    ６）および、任意選択の水素
    を含み、
    式中、ＲおよびＲ’が請求項１で定義の通りである、
    混合物。
12. 請求項１１に記載の混合物であって、
    ・式Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｒ’のジスルフィド、
    ・触媒量の、チオール基含有アミノ酸またはチオール基含有ペプチド、
    ・触媒量の、前記チオール基含有アミノ酸または前記チオール基含有ペプチドに対応するレダクターゼ酵素、および
    ・触媒量のＮＡＤＰＨ、
    を含み
    式中、ＲおよびＲ’は請求項１で定義の通りである、
    混合物。

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