KR102078490B1 - L-메티오닌의 제조 방법 - Google Patents

L-메티오닌의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 L-메티오닌 전구체, 다이메틸 다이설파이드(DMDS) 및 환원성 유기 화합물 사이의 효소 반응을 수행하여 L-메티오닌의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

L-메티오닌의 제조 방법
본 발명은 L-메티오닌 전구체, 다이메틸 다이설파이드(DMDS) 및 유기 환원성 화합물 간 효소 반응에 의한 L-메티오닌의 제조를 위한 방법에 관한 것이다. 또한 L-메티오닌 전구체 및 메틸 머캅탄 간 효소 반응에 의해 L-메티오닌의 제조를 위한 2단계 방법에 관한 것이며, 후자는 DMDS의 효소적 수소첨가분해에 의해 수득된다.
메티오닌은 인체의 필수 아미노산 중 하나이며 동물 사료용 첨가제로서 널리 사용된다. 이는 또한 약학 제품용 출발 물질로서도 사용된다. 메티오닌은 콜린(레시틴) 및 크레아틴과 같은 화합물에 대한 전구체로서 작용한다. 또한 시스테인 및 타우린에 대한 합성 출발 물질이기도 하다.
S-아데노실-L-메티오닌(SAM)은 L-메티오닌의 유도체이고 뇌에서 다양한 신경전달물질의 합성에 관여한다. L-메티오닌 및/또는 SAM은 체내에서 지질의 축적을 억제하고, 뇌, 심장 및 신장에서 혈액 순환을 개선시킨다. L-메티오닌은 또한 소화, 해독, 및 독성 물질 또는 중금속 예컨대 납의 배출을 돕는데 사용될 수도 있다. 뼈 및 관절 질환에 항염증성 효과를 가지며 모발에 필수적인 영양분이기도 하여, 이들의 때이른 원치않는 손실을 예방한다.
메티오닌은 예를 들어 문헌 FR2903690, WO2008006977, US2009318715, US5990349, JP19660043158 및 WO9408957에 기술된 바와 같이, 석유화학-유래 출발 물질로부터 화학적 경로에 의해 산업적으로 제조되는 것으로 이미 알려져 있다. 이들 제조 방법이 지속가능한 개발 방법에 속하지 않는다는 사실이외에도, 이들 화학적 경로는 2가지 L 및 D 거울상이성질체의 균등한 혼합물을 생성시킨다는 단점을 갖는다.
메티오닌의 L 거울상이성질체만을 생성시키는 장점이 있는 박테리아 발효에 의한 완벽한 생물학적 합성이 예를 들어, 국제 공개 특허 출원 WO07077041, WO09043372, WO10020290 및 WO10020681에 기술된 바와 같이 문헌에서 제안된 바 있다. 그럼에도 불구하고, 지금까지 대규모의 산업적 실행의 부재는 이들 방법의 성능 및/또는 비용 가격이 만족스럽지 않은 채로 남아있다는 가정에 이르게 한다.
혼합된 화학/생물학 방법은 최근에 CJ 제일제당 회사 및 본 출원인이 공동으로 성공적으로 산업화시켰는데, 여기서는 L-메티오닌 전구체를 박테리아 발효에 의해 생성한 후, 효소적으로 메틸 머캅탄과 반응시켜, L-메티오닌을 배타적으로 생산한다(참조: WO2008013432 및/또는 WO2013029690). 이들 방법은 성능의 수준이 높은 반면, 결국에 스팀 메탄 개질에 의한 수소의 합성, 황의 수소첨가에 의한 황화수소의 합성, 메탄올 및 황화수소로부터 이의 합성을 필요로 하는, 메틸 머캅탄의 현장 (on-site) 합성을 필요로 하며, 다시 말해서, 이미 존재하는 것보다 연간 생산면에서 보다 적당한 규모에 대한 산업적 추정과 잘 호환되지 않는 매우 대규모의 장비를 필요로 한다.
따라서, 메틸 머캅탄의 합성에 필요한 장비가 수소, 황화수소 및 메탄올로부터 출발하는 합성에 대한 것보다 소규모인 혼합 방법에 의해 L-메티오닌을 제조할 필요가 있다. 이러한 관점에서 본 발명이 제공된다.
또한, 본 발명은 하기에 요약한 방법(WO2008013432 및/또는 WO2013029690)에서 메틸 머캅탄을 다이메틸 다이설파이드(DMDS)로 대체하는 것을 제안한다:
Figure 112018040118456-pct00001
여기서, 메틸 머캅탄(MeSH)은 제2 단계에서 직접 사용된다. 본 발명은 글루코오스 및 DMDS가 L-메티오닌을 생성시키는, "원 포트(one pot)" 반응으로 모든 것을 배합하거나, 또는 이전 단계에서 다이메틸 다이설파이드의 효소적 수소첨가분해의 생성물로 메틸 머캅탄을 치환하는 것을 제안한다.
다음의 성분은 다이메틸 다이설파이드로부터 메틸 머캅탄의 합성과 관련하여 종래 기술에서 확인할 수 있다.
특허 출원 EP0649837은 전이 금속 황화물을 이용하여, 수소에 의한 다이메틸 다이설파이드의 촉매적 수소첨가분해에 의한 메틸 머캅탄의 합성 방법을 제안한다. 이 방법이 효율적이지만, 산업적으로 유리한 생산성 수준을 수득하기 위해서는 200℃ 정도의 비교적 높은 온도를 요구한다.
당업자는 또한 나트륨 메틸 머캅타이드(CH3SNa)의 수용액의 산성화에 의해 메틸 머캅탄을 제조하는 것이 가능하다는 것을 알고 있다. 이 방법은 염산 또는 황산이 사용되는지 여부에 따라, 염화나트륨 또는 황산나트륨과 같은, 대량의 염을 생성시키는 주요한 단점을 갖는다. 이들 염수 수용액은 종종 처리가 매우 어렵고, 잔존하는 미량의 악취물은 이 방법이 용이하게 산업적 규모로 고안될 수 없다는 것을 의미한다.
이제 L-메티오닌의 합성 이전 단계 동안 다이메틸 다이설파이드(DMDS)의 효소적 환원에 의해 메틸 머캅탄을 제조하는 것이 가능하다는 것을 발견하였고, 또한 놀랍게도, L-메티오닌의 합성 동안 DMDS의 이러한 효소적 환원을 수행하는 것이 가능하다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명의 주제는 국제 공개 특허 출원 WO2008013432 및/또는 WO2013029690에서 제안된 것과 유사하고, 메티오닌의 합성에서 상기 메틸 머캅탄의 사용 직전에 DMDS의 효소적 촉매작용을 위한 반응으로 상기 메틸 머캅탄을 생성시키거나, 또는 L-메티오닌의 합성을 위한 반응기 중에 제자리에서 DMDS의 효소적 촉매작용을 위한 반응으로 상기 메틸 머캅탄을 생성시켜, 메틸 머캅탄의 취급을 생략하거나, 또는 아주 최소로 감소시키는 것을 가능하게 만드는, L-메티오닌의 제조를 위한 방법이다.
보다 특히, 본 발명의 제1 주제는 적어도 다음의 단계들을 포함하는, L-메티오닌의 제조를 위한 방법이다:
a) 1) 다이메틸 다이설파이드(DMDS),
2) 티올기 보유 아미노산 또는 티올기 함유 펩타이드의 촉매량
3) 상기 티올기를 보유하는 아미노산 또는 상기 티올기 함유 펩타이드의 다이설파이드 브릿지의 환원 반응을 촉진시키는 효소의 촉매량,
4) 다이설파이드, 특히 DMDS에 대한 화학양론적 양의 유기 환원성 화합물,
5) 대상 유기 환원성 화합물의 탈수소화를 위한 반응을 촉진시키는 효소의 촉매량,
6) 촉매계의 2종의 효소(디하이드로게나제(dehydrogenase) 및 리덕타제(reductase))에 공통인 보조인자의 촉매량
을 포함하는 혼합물의 제조 단계,
b) 효소 반응을 수행하여 메틸 머캅탄(CH3-SH)을 형성시키는 단계,
c) L-메티오닌의 전구체의 첨가, 및 단계 b)에서 형성된 메틸 머캅탄을 이용한 상기 전구체의 전환 단계, 및
d) 형성된 L-메티오닌의 회수 및 임의적 정제 단계.
상기 단계 a)의 성분들은 상이한 순서로 첨가될 수 있다(단계 a)의 첨가 순서는 제한적이지 않음). 본 발명의 일 실시형태에서, 티올기를 보유하는 아미노산 및/또는 티올기를 보유하는 펩타이드는 개별적으로, 상기 아미노산 및/또는 상기 펩타이드의 다이설파이드의 형태, 예를 들어 글루타티온 다이설파이드 형태의 글루타티온일 수 있다.
일반적으로, 티올기를 보유한 상기 아미노산 또는 상기 티올기 함유 펩타이드의 2개 균등물 사이에 형성된 다이설파이드 브릿지의 환원을 촉진시키는 효소는 리덕타제 효소이다. 용어 "리덕타제"는 본 발명의 설명을 위한 서술의 나머지에서 사용된다. 유사하게, 단계 b)에 관여하는 유기 환원성 화합물의 탈수소반응을 촉진시키는 효소는 일반적으로 디하이드로게나제 효소라고 하며, 용어 "디하이드로게나제"는 본 발명의 설명을 위한 서술의 나머지에서 선택된다.
환원 및 탈수소반응을 촉진시키는 2종의 효소(리덕타제 및 디하이드로게나제)에 공통인 보조인자 중에서, 비제한적인 예로서, 언급할 수 있는 것은 예를 들어, 플라빈계 보조인자 및 니코틴계 보조인자가 있다. 니코틴계 보조인자를 사용하는 것이 바람직하고 보다 구체적으로는 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 또는 훨씬 더 낫게는 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드 포스페이트(NADPH)를 사용하는 것이다. 상기 열거된 보조인자는 유리하게 그들의 환원된 형태(예를 들어, NADPH, H+) 및/또는 그들의 산화된 형태(예를 들어, NADP+)를 사용하는 것이며, 다시 말해서 그들은 반응 매질에 환원 및/또는 산화 형태로 첨가될 수 있다.
단계 a) 의 성분 1) 내지 6)의 첨가 순서 및 구성은 상이한 방식으로 수행될 수 있다. 단계 b)의 효소 반응은 단계 a)의 혼합물의 촉매계의 성분 중 하나: 하나의 효소, 또는 화학양론적 양으로 첨가되는 화합물 중 하나(다이설파이드 또는 유기 환원성 화합물), 또는 촉매량으로 첨가되는 화합물 중 하나(티올기를 보유한 아미노산, 또는 티올기 함유 펩타이드, 또는 상기 티올 또는 상기 펩타이드에 상응하는 다이설파이드, 또는 그외 보조인자)의 첨가에 의해 촉발된다.
따라서, 본 발명의 일 실시형태에서, L-메티오닌의 제조를 위한 방법은 적어도 다음의 단계들을 포함한다:
a') ·다이메틸 다이설파이드 (DMDS),
·티올기를 보유하는 아미노산 또는 티올기 함유 펩타이드의 촉매량,
·티올기를 보유하는 상기 아미노산 또는 상기 티올기 함유 펩타이드에 상응하는 리덕타제 효소의 촉매량,
·NADPH의 촉매량
을 포함하는 혼합물의 제조 단계,
b') 상응하는 디하이드로게나제 효소의 촉매량과 함께 다이메틸 다이설파이드에 대한 화학양론적 양의 유기 환원성 화합물의 첨가 단계,
c') 효소 반응을 수행하여 메틸 머캅탄(CH3-SH)을 형성시키는 단계,
d') 단계 c')에서 형성된 메틸 머캅탄을 이용한 L-메티오닌 전구체의 전환 단계, 및
e') 형성된 L-메티오닌의 회수 및 임의적 정제 단계.
본 발명의 방법에 따라서, 일반적으로 가스 상태로 형성된 메틸 머캅탄을, 이후에 직접적으로 하기에 기술된 바와 같이 메티오닌 전구체와 접촉되도록 위치시킨다.
본 발명에 따른 L-메티오닌의 합성 방법은, 무엇보다도, 유기 환원성 화합물(수소 공여체)로서 글루코오스를 사용하여, 하기 반응에 따라서, 하기에 정의하게 되는 바와 같은 수소 공여체인, 유기 환원성 화합물에 의한 다이메틸 다이설파이드의 효소적 환원을 기반으로 한다:
Figure 112018040118456-pct00002
이제 이러한 방법이 첨부된 도 1에 기술된 바와 같이, 수소-공여 유기 화합물에 의해 재생된, 상응하는 리덕타제 효소/(아미노산 또는 펩타이드)의 형태로, 티올기 함유 아미노산 또는 티올기 함유 펩타이드, 예를 들어 글루타티온을 적용하는 효소 시스템에 의해 쉽게 촉진된다는 것을 발견하였다.
따라서, 도 1의 예시에 따라서, 펩타이드("글루타티온"으로 표시됨)는 다이설파이드 브릿지를 갖는 펩타이드("글루타티온 다이설파이드"로 표시됨)로 전환시켜서, 다이설파이드("DMDS"로 표시됨)를 머캅탄("메틸 머캅탄"으로 표시됨)으로 환원시킨다. 리덕타제 효소("글루타티온 리덕타제"로 표시됨, EC 1.8.1.7 또는 EC 1.6.4.2)는 펩타이드(글루타티온)를 재생시키는 한편 보조인자("NADPH, H+"로 표시됨)를 산화시킨다. 다음으로, 산화된 형태("NADP+"로 표시됨)는 당업자에게 잘 알려지고, 관여되는 디하이드로게나제 효소(효소 분류 번호 EC 1.1.1.47의 예로 표시된 "글루코오스 디하이드로게나제") 및 유기 환원성 분자("글루코오스"으로 표시됨)를 포함하는 산화환원 효소 복합체를 "재순환"시켜 환원된다. 이후에 유기 환원성 화합물의 산화된 형태가 수득된다("글루코노락톤"으로 표시됨).
보다 특히, 펩타이드(표시된 예는 글루타티온임)는 다이설파이드 브릿지를 갖는 펩타이드(글루타티온 다이설파이드로 표시됨)로 전환되어 다이메틸 다이설파이드를 메틸 머캅탄으로 환원시킨다. 리덕타제 효소(글루타티온 리덕타제로 표시됨, EC 1.8.1.7 또는 EC 1.6.4.2)는 펩타이드(글루타티온)를 재생시키고 이와 동일한 효소는 당업자에게 잘 알려진 산화환원 효소 복합체, 예를 들어 NADPH/NADP+((니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드 포스페이트)(환원된 형태 및 산화된 형태)) 복합체에 의해 재생된다. NADP+는 결국에 이의 산화된 형태(여기서는, 글루코노락톤)로 전환되어, 수소(수소 공여체)를 제공하는 상기 유기 환원성 화합물(글루코오스로 표시됨)로 인해서 사용되는 유기 환원성 화합물(여기서는, 글루코오스 디하이드로게나제, EC 1.1.1.47)에 상응하는 디하이드로게나제 효소에 의해 NADPH로 재생된다.
가장 특히 적합한 실시형태에 따라서, 글루타티온 리덕타제 효소와 조합된 글루타티온/글루타티온 다이설파이드 시스템은, DMDS를 메틸 머캅탄으로 환원시키는 것을 본 발명에 따라서 가능하게 만든다.
글루타티온은 생물학에서 광범위하게 사용되는 트라이펩타이드이다. 환원된 형태(글루타티온) 또는 산화된 형태(글루타티온 다이설파이드)로, 이러한 종은 세포에서 중요한 산화환원 커플을 형성한다. 따라서, 글루타티온은 유기체로부터 중금속을 제거하는데 매우 중요하다. 따라서, 예를 들어, 국제 공개 특허 출원 WO05107723은 글루타티온이 킬레이트화 조제물을 형성시키는데 사용된 제제를 기술하고, 미국 특허 US4657856은 글루타티온이 글루타티온 퍼옥시다제를 통해서 과산화물 예컨대 H2O2를 H2O로 분해시키는 것을 가능하게 만든다는 것을 교시한다. 마지막으로, 글루타티온은 또한 단백질에 존재하는 다이설파이드 브릿지를 환원시키는 것을 가능하게 만든다(Rona Chandrawati, "Triggered Cargo Release by Encapsulated Enzymatic Catalysis in Capsosomes", Nano Lett., (2011), vol. 11, 4958-4963).
본 발명의 방법에 따라서, 티올 기를 보유하는 아미노산 또는 티올 기 함유 펩타이드의 촉매량이 다이메틸 다이설파이드로부터 메틸 머캅탄을 제조하는데 사용된다.
본 발명의 방법에서 사용할 수 있는 티올기를 보유하는 아미노산 중에서, 비제한적인 예로서 언급할 수 있는 것은, 시스테인 및 호모시스테인이다. 이들 경우에서, 사용되는 산화환원 효소 시스템은 시스테인/시스틴 리덕타제 EC 1.8.1.6 및 호모시스테인/호모시스테인 리덕타제와 동일한 방식으로 촉매 주기를 재생시킬 수 있다.
이러한 아미노산을 OAHS (L-메티오닌 전구체), 황화수소(H2S) 및 메티오닌 효소, 즉 메티오닌을 유도하는 반응을 촉진시키는 효소로부터 제조할 수 있기 때문에, 호모시스테인을 사용하는 것이 유리할 수 있다. 따라서, 반응 매질 중 매우 소량의 H2S는 글루타티온과 균등한 주기를 제자리에서 생성시킨다.
본 발명의 방법에서 사용할 수 있는 티올 기를 보유하는 펩타이드 중에서, 언급할 수 있는 것은 비제한적인 예로서, 글루타티온 및 티오레독신(thioredoxin)이 있다. 상기에 기술된 글루타티온/글루타티온 리덕타제 시스템은 티오레독신(카스 번호 52500-60-4)/티오레독신 리덕타제(EC 1.8.1.9 또는 EC 1.6.4.5) 시스템으로 대체될 수 있다.
글루타티온 및 글루타티온/글루타티온 리덕타제 시스템은 이들 화합물의 비용 및 이들의 입수 용이성으로 인해, 본 발명에서 가장 특히 바람직하다.
본 발명의 맥락에서 사용할 수 있는 유기 환원성 화합물 중에서, 수소 공여 화합물이 가장 특히 바람직하고, 그 중에서, 전체적으로 적합한 화합물은 하이드록실 관능기를 보유하는 수소 공여 유기 환원성 화합물, 예컨대 알콜, 폴리올, 당 등이다.
사용되는 효소는 수소 보유 화합물을 탈수소화시킬 수 있는 효소, 예를 들어 알콜 디하이드로게나제이다. 글루코오스는 글루코노락톤을 제공하기 위해 글루코오스 디하이드로게나제와 함께 본 발명의 방법에서 사용하기에 가장 특히 적합한 당이다.
본 발명에 따른 방법에서, DMDS의 효소적 환원이 L-메티오닌의 합성에 대해 개별 반응기에서 수행되는 경우, 글루코오스만이 화학양론적인 양으로 사용되고 모든 다른 화합물(글루타티온, 보조인자(예를 들어, NADPH) 및 2종의 효소)은 촉매량으로 사용된다. DMDS의 효소적 환원 반응이 단일 반응기에서 L-메티오닌의 합성과 함께 수행되는 경우("원 포트"), L-메티오닌 전구체는 또한 화학양론적 양으로 첨가되는 한편, 이 합성을 위한 보충 시약 예컨대 피리독살 포스페이트(PLP) 및 이 반응에 특이적인 효소는 촉매량으로 첨가된다.
피리독살 포스페이트 및 전구체에 특이적인 효소의 바람직한 농도는 국제 공개 특허 출원 WO2008013432 및/또는 WO2013029690에서 확인할 수 있는 것이다.
효소적 촉매에 의해 다이메틸 다이설파이드로부터 메틸 머캅탄의 합성에 의한 장점은, "원 포트" 방법 또는 2회 연속 단계의 경우에 관계없이, 많다. 이들 장점 중에서, 언급할 수 있는 것은 매우 약한 온도 및 압력 조건 하 및 중성에 가까운 pH 조건 하에서, 수성 또는 수성-유기 용매에서의 작업 가능성이다. 모든 이들 조건은 "환경친화적(green)" 또는 "지속가능" 방법의 전형이고, 국제 공개 특허 출원 WO2008013432 및/또는 WO2013029690에 기술된 바와 같은 L-메티오닌의 제조와 전체적으로 호환 가능하다.
방법이 다이메틸 다이설파이드를 사용할 때의 다른 장점은, 반응 조건 하에서 가스 상태인, 생성된 메틸 머캅탄이 그것이 형성될 때 반응 매질을 떠난다는 것이다. 따라서, 메틸 머캅탄은, 예를 들어 WO2008013432 및/또는 WO2013029690에 기술된 바와 같이, 다시 말해서, 반응기에서 나올 때, O-아세틸호모세린 또는 O-숙시닐호모세린, 및 효소 예컨대 각각 O-아세틸호모세린 설프하이드릴라제 또는 O-숙시닐호모세린 설프하이드릴라제로부터 L-메티오닌의 합성에 직접 사용될 수 있다.
메틸 머캅탄은 또한 예를 들어 그것을 단리하는 것이 바람직하다면, 극저온에서 쉽게 액화시킬 수 있다. 저유속의 불활성 가스, 유리하게 질소를 버블링하여 유입시켜서 반응 매질로부터 이의 배출을 가속화시키는 것이 임의로 가능하다.
질소 및 메틸 머캅탄을 함유하는 출구 가스는, 바람직하고 필요하다면, 메틸 머캅탄이 완전하게 L-메티오닌으로 전환되지 않은 경우, 제2 반응기(L-메티오닌 합성)로 통과되기 전에 제1 반응기(DMDS의 효소적 환원)로 재순환될 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 방법은 L-메티오닌 전구체 및 DMDS로부터 2회의 연속적인 효소적 단계로의 L-메티오닌의 합성 방법을 기술한다.
하나 및 동일한 반응기에서 L-메티오닌의 합성을 수행하는 것이 또한 가능하다. 이러한 경우에서, L-메티오닌의 합성에 필요한 모든 시약은 DMDS의 효소적 환원(상기 단계 a))을 위해 시스템에 첨가되고 반응기는 DMDS의 제자리 효소적 환원에 의해 형성된 메틸 머캅탄의 손실을 피하기 위해 폐쇄된다. 다음으로, 메틸 머캅탄은 L-메티오닌 전구체와 반응하여 L-메티오닌이 제공된다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 첨부된 도 2에서 예시된 바와 같이, L-메티오닌 전구체 및 DMDS로부터 L-메티오닌의 직접 합성, 또는 OAHS, DMDS 및 글루코오스로부터 합성 방법을 기술한다.
다이메틸 다이설파이드(DMDS)는 메틸 머캅탄 및 산화제 예컨대 산소, 황 또는 수성 과산화수소 용액, 예를 들어, 또는 그외 다이메틸 설페이트 및 이황화나트륨으로부터 다른 부위에서 생성될 수 있다. DMDS는 또한 국제 공개 특허 출원 WO2014033399에 기술된 바와 같이 예를 들어 반응성 증류에 의해 정제된, 다이설파이드 오일(DSO)의 공급원으로부터 기원될 수도 있다.
효소적 촉매에 의한 DMDS의 환원은 그들이 상이하다면, 현존하는 산업적 경로에 의해 이의 생산 부위에서, 이의 사용 부위로 메틸 머캅탄을 수송하는 것을 피하는 것을 가능하게 만드는 방법으로서 고려될 수 있다. 또한, 메틸 머캅탄은 독성이고 실온에서 극도로 악취의 가스여서, 이의 수송이 상당히 복잡하여, DMDS와 달리 이미 엄격하게 규제된다. 따라서, 그러므로 DMDS는 L-메티오닌의 합성에서 이후의 사용 부위에서 직접 메틸 머캅탄을 제조하는데 사용될 수 있어, 이 생성물의 독성 및 냄새와 연관된 장점을 더욱 감소시키고, 또한 이와 연관된 산업적 위험성을 감소시킨다.
2회 연속 단계의 합성 방법의 경우에서, DMDS는 반응에서 소비되고, 메틸 머캅탄은 이것이 형성되면서 반응 매질에서 나가게되므로, 글루코오스 및 DMDS가 연속적으로 공급된다고 가정하면, 오직 유기 환원성 화합물의 탈수소화 생성물, 예를 들어 글루코노락톤만이 반응 매질에 축적된다. 글루코노락톤 농도가 반응 조건 하에서 포화점을 초과하면, 침전될 것이고, 이후에 당업자에게 공지된 임의 방식으로 반응 매질로부터 단리될 수 있다.
글루코노락톤은 몇몇 용도를 가질 수 있다. 예를 들어 레퍼런스 E575에 의해 알려진, 식품 첨가제로서 사용된다. 글루코노락톤은 산성 수성 매질에서 가수분해되어, 역시 식품 첨가제(E574)로서 사용되는 글루콘산을 형성시킨다. 글루코노락톤은 식품 산업에서 두부의 제조에도 사용된다(참조 CN103053703).
특히 유리하게, 본 발명에 따른 방법으로부터의 "폐기물"을 나타낸다는 점에서, 글루코노락톤은 바이오에탄올, 또는 당 또는 전분의 발효에서 기원된 임의의 다른 분자를 생성시키는 가능한 발효 반응에서 글루코오스를 대체할 수 있다.
또한, 문헌 [J. P. van Dijken, "Novel pathway for alcoholic fermentation of gluconolactone in the yeast Saccharomyces bulderi", J. Bacteriol., (2002), Vol. 184(3), 672-678]에 기술된 바와 같이, 특정 박테리아가 발효의 탄소원으로서 글루코노락톤을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 방법에서 글루코노락톤의 명확한 이득은, L-메티오닌 전구체의 합성으로 이를 재순환시키는 것이다. 또한, 이 합성은 글루코오스를 사용하는 박테리아 발효이므로, 글루코노락톤은 용이하게 이러한 글루코오스의 일부를 대체할 수 있다. 이들 조건 하에서, 이러한 재순환은 매우 상당한 경제적 장점을 의미할 수 있다.
반응이 상기 정의된 바와 같이, "원 포트" 하에서 수행되고, 글루코노락톤이 L-메티오닌보다 훨썬 더 가용성인 경우더라도, 당업자에게 잘 알려진 통상의 기술을 사용해 반응 매질로부터 이것을 분리시키는 것이 용이하다.
또 다른 당이 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는데, 예를 들어 다음의 시스템으로 글루코오스/글루코노락톤/글루코오스 디하이드로게나제 시스템을 대체하는 것이 가능하다: 글루코오스 6-포스페이트/6-포스포글루코노-δ-락톤/글루코오스 6-포스페이트 디하이드로게나제(EC 1.1.1.49).
본 발명의 방법에서, 당 대신에 알콜을 사용하고, 따라서 글루코오스/글루코노락톤/글루코오스 디하이드로게나제 시스템 대신에 다음의 일반적인 시스템을 사용하는 것이 또한 가능하다: 알콜/케톤 또는 알데하이드/알콜 디하이드로게나제(EC 1.1.1), 및 보다 구체적으로 아이소프로판올/아세톤/아이소프로판올 디하이드로게나제 시스템(EC 1.1.1.80).
또한, 이 시스템은 DMDS 및 아이소프로판올로부터, 반응 매질에서 나오는 메틸 머캅탄(MeSH) 및 아세톤으로 이루어진 혼합물을 수득하는 것을 가능하게 만든다(따라서, 임의의 생성물 축적이 없음). MeSH 및 아세톤은 바람직하다면 단순 증류에 의해 용이하게 분리될 수 있다.
일 실시형태에 따라서, 본 발명에 따른 방법은 DMDS의 효소적 환원에 의한 제조, 이후 L-메티오닌 전구체와 형성된 메틸 머캅탄의 반응에 의한 L-메티오닌의 제공을 포함한다. 이러한 경우에서, 본 발명에 따른 방법은 적어도 다음의 단계들을 포함한다:
단계 1: 예를 들어 글루코오스의 박테리아 발효에 의한 L-메티오닌 전구체의 제조(WO2008013432 및/또는 WO2013029690 참조),
단계 2: 상기 반응기(R1)에서 나오는 메틸 머캅탄의 형성물을 이용한 반응기(R1)에서 DMDS의 효소적 환원(상기 단계 a') 내지 c')에 상응),
단계 3: 단계 1 유래의 전구체 및 단계 2 유래의 메틸 머캅탄을 이용한 반응기(R2)에서 L-메티오닌의 효소적 합성(상기 단계 단계 d')에 상응),
단계 4(임의적): 단계 3에서 형성된 글루코노락톤의 단계 1로의 재순환,
단계 5: 형성된 L-메티오닌의 회수 및 임의로 정제(상기 단계 e')에 상응).
단계 1의 경우에서, 사용될 수 있는 조건 범위는 다음의 특허에서 확인할 수 있을 것이다(WO2008013432 및/또는 WO2013029690).
단계 2의 경우에서, 반응 온도는 10℃ 내지 50℃로 확대되는 범위 내, 바람직하게 15℃ 내지 45℃, 보다 바람직하게 20℃ 내지 40℃이다.
반응의 pH는 6 내지 8, 바람직하게 6.5 내지 7.5일 수 있다. 반응 매질의 pH는 완충제에 의해 조정될 수 있다. 전체적으로 바람직하게, 예를 들어 0.1 mol.l-1 포스페이트 완충제의 pH는 7.3으로 선택될 것이다.
반응에 사용되는 압력은 사용되는 시약 및 장비에 따라, 대기압과 비교하여 감압에서 수 bar(수백 kPa)의 범위일 수 있다. 감압은 또한 형성된 메틸 머캅탄의 보다 빠른 탈기를 가능하게 할 수 있지만, 물 및 DMDS의 포화된 증기압을 증가시켜, 형성된 메틸 머캅탄을 약간 더 오염시킨다는 단점을 갖는다. 바람직하게, 대기압 내지 20 bar(2MPa) 범위의 압력을 사용할 수 있을 것이고, 보다 더 바람직하게 방법은 대기압 내지 3 bar(300 kPa) 범위의 압력 하에서 수행할 수 있을 것이다.
단계 3의 경우에서, 이상적인 조건에 대해 국제 공개 특허 출원 WO2013029690을 참조할 수 있을 것이며, 가능한 차이점은 질소 흐름을 반응기(R1)로 유입시켜 반응기(R2)로 통과시키고, 메틸 머캅탄이 반응기(R2)에서 완전히 반응하지 않은 경우, 원하는 압력에서 반응기(R2)로부터 반응기(R1)로 이들 가스를 재순환시키는 것이다.
다른 실시형태(다른 별법)에 따라서, 본 발명에 따른 방법은 하나의 동일한 반응기("원 포트")에서 수행되고, 이러한 경우에 적어도 다음의 단계들을 포함한다:
단계 1': 예를 들어 글루코오스의 박테리아 발효에 의한 L-메티오닌 전구체의 제조(상기 단계 1과 유사),
단계 2': 메틸 머캅탄의 제자리 형성물을 이용한 반응기(R1)에서 DMDS의 효소적 환원, 및 단계 1'에서 수득된 전구체를 이용한 동일 반응기에서의 L-메티오닌의 동시적 효소적 합성,
단계 3'(선택적): 단계 2'에서 형성된 글루코노락톤의 단계 1'로의 재순환, 및
단계 4': 형성된 L-메티오닌의 회수 및 임의로 정제.
단계 1'의 경우에서, 사용할 수 있는 조건의 범위는 국제 공개 특허 출원 WO2008013432 및/또는 WO2013029690에서 확인할 수 있을 것이다.
단계 2'의 경우에서, 조작 조건은 다음과 같다.
반응 온도는 10℃ 내지 50℃로 확대된 범위 내, 바람직하게 15℃ 내지 45℃, 보다 바람직하게 20℃ 내지 40℃이다.
반응의 pH는 유리하게 6 내지 8, 바람직하게 6.2 내지 7.5이다. 전체적으로 바람직하게, 반응은 0.2 mol.l-1 포스페이트 완충액의 pH 및 7.0의 pH에서 수행된다.
바람직하게, 방법은 대기압 내지 20 bar(2 MPa), 보다 더 바람직하게 대기압 내지 3 bar(300 kPa) 범위의 압력에서 수행된다.
DMDS/L-메티오닌 전구체 몰비가 0.1 내지 10, 일반적으로 0.5 내지 5, 및 바람직하게 몰비가 화학양론(몰비 = 0.5)이지만, 이는 반응 동역학에 유리한 것으로 입증되는 경우 더 높을 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 하나 또는 나머지 별법에서, 방법은 선택되는 조작 조건 및 사용되는 시약에 따라, 유리 또는 금속 반응기에서 회분식으로 또는 연속적으로 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 하나의 별법 또는 나머지 별법에서, 이상적인 유기 환원성 화합물/DMDS 몰비가 화학양론(몰비 = 1)이지만, 출발물로부터 반응기로 환원 화합물을 유입시키면서 DMDS의 연속 첨가 등과 같은 임의의 이득을 당업자가 발견한다면, 0.01 내지 100으로 가변적일 수 있다. 바람직하게, 이러한 몰비가 반응의 전반에 걸쳐, 전체적으로 0.5 내지 5로 선택된다.
상기 단계 a)에서 제조된 혼합물 중 촉매량으로 존재하는 성분(티올기를 보유하는 아미노산 또는 티올기 함유 펩타이드, 또는 상기 아미노산에 상응하는 그외 다이설파이드 또는 상기 펩타이드에 상응하는 다이설파이드, 리덕타제 효소, 디하이드로게나제 효소, 보조인자, 예를 들어 NADPH)는 쉽게 상업적으로 입수할 수 있거나 또는 당업자에게 공지된 기술에 따라 제조될 수 있다. 이들 상이한 성분은 고체 또는 액체 형태일 수 있고, 유리하게 본 발명의 방법에서 사용을 위해 물에 용해될 수 있다. 사용되는 효소는 또한 지지체 상에 그라프트될 수 있다(지지된 효소의 경우).
아미노산 또는 펩타이드를 포함하는 효소 복합체의 수용액은 또한 예를 들어 이들 성분을 함유하는 세포의 투과성에 의해 당업자에게 공지된 방법에 의해 재구성될 수 있다. 이러한 수성 용액, 하기 실시예 1에서 제공되는 조성물은, 반응 매질의 총 중량에 대해 0.01 중량% 내지 20 중량%의 함량으로 사용될 수 있다. 바람직하게, 0.5 중량% 내지 10 중량%의 함량이 사용될 것이다.
본 발명은 본 발명의 범주와 관련하여 비제한적인 하기 실시예에 의해 더욱 잘 이해될 것이다.
실시예 1: 2 연속 단계의 방법
10 mL의 글루타티온 효소 복합체(Aldrich) 및 19.2 g(0.1 mol)의 글루코오스를 pH 7.3인 150 mL의 0.1 mol/L의 포스페이트 완충제를 함유하는 반응기(R1)에 도입시켰다. 효소 복합체의 용액은 185 mg(0.6 mmol)의 글루타티온, 200 U의 글루타티온 리덕타제, 50 mg(0.06 mmol)의 NADPH 및 200 U의 글루코오스 디하이드로게나제를 함유하였다. 반응 매질을 기계적 교반하면서 25℃가 되게 하였다. 제1 샘플은 t = 0에 채취하였다. 이후에, 다이메틸 다이설파이드(9.4 g, 0.1 mol)를 뷔렛에 위치시키고 반응기에 적가하였고, 반응이 시작되었다. 질소 스트림을 반응기에 위치시켰다.
반응기에서 나오는 가스의 가스 크로마토그래피 분석은 실제로 필수적으로 질소 및 메틸 머캅탄(일부 미량의 물)의 존재를 보여주었다. 이들 출구 가스는 반응기(R2)로 보내졌다. DMDS를 6시간 동안 반응기(R1)에 유입시켰다. 반응기(R1)의 반응 매질의 최종 가스 크로마토그래피 분석은 DMDS의 부재를 확인시켜 주었고, UPLC/질량 분광분석법에 의한 분석은 미량의 글루코오스 및 실제로 배타적인 글루코노락톤의 존재(미량의 글루콘산)를 보여주었다.
동시에, 5 g의 O-아세틸-L-호모세린(OAHS)(O-아세틸호모세린은 문헌 [Sadamu Nagai, "Synthesis of O-acetyl-L-homoserine", Academic Press, (1971), vol.17, pp. 423-424]에 따라 L-호모세린 및 아세트산 무수물로부터 합성되었음)을 pH 6.60인 75 mL의 0.1 mol.l-1 포스페이트 완충제를 함유하는 제2 반응기(R2)에 유입시켰다. 용액을 기계적 교반하면서 35℃가 되게 하였다.
반응을 시작하기 전에, 1 mL의 반응 매질의 샘플(t = 0)을 채취하였다. 피리독살 포스페이트(1.6 mmol, 0.4 g) 및 효소 O-아세틸-L-호모세린 설프하이드릴라제(0.6 g)의 용액을 10 mL의 물에 용해시킨 후, 반응기에 첨가하였다.
메틸 머캅탄은 반응기(R1)의 반응을 통해 유입시켰고, 질소 스트림에 의해 추진시켰다. 다음으로 반응을 시작하였다. L-메티오닌의 형성 및 OAHS의 소멸은 HPLC로 모니터링하였다. 반응기(R2)로부터의 출구 가스를 20%의 수성 수산화나트륨 용액에 포집하였다. 분석은 OAHS가 L-메티오닌으로 52% 정도로 전환되었고, 과량의 DMDS는 수산화나트륨 트랩에서 발견되는 메틸 머캅탄으로 전환되었음을 보여주었다.
실시예 2: "원 포트" 방법
10 mL의 효소 복합체, 6 g(33 mmol)의 글루코오스 및 5 g(31 mmol)의 O-아세틸-L-호모세린(OAHS - O-아세틸-L-호모세린은 문헌 [Sadamu Nagai, "Synthesis of O-acetyl-L-homoserine", Academic Press, (1971), vol.17, pp. 423-424]에 따라 L-호모세린 및 아세트산 무수물로부터 합성되었음)을 pH 7의 150 mL의 0.2 mol.l-1 포스페이트 완충제를 함유하는 반응기에 유입시켰다. 효소 복합체의 용액은 185 mg(0.6 mmol)의 글루타티온, 200 U의 글루타티온 리덕타제, 50 mg(0.06 mmol)의 NADPH, 200 U의 글루코오스 디하이드로게나제, 0.4 g(1.6 mmol)의 피리독살 포스페이트 및 0.6 g의 O-아세틸-L-호모세린 설프하이드릴라제를 함유하였다.
반응 매질은 기계적 교반하면서 27℃가 되게 하였다. t = 0의 제1 샘플을 채취하였다. 후속하여서, 다이메틸 다이설파이드(3 g, 32 mmol)는 뷔렛에 위치시키고, 메틸 머캅탄의 임의 방출을 피하기 위해 폐쇄된 반응기에 적가하였고, 반응이 시작되었다. 반응은 HPLC로 모니터링하여 OAHS의 소멸 및 L-메티오닌의 형성을 확인하였다. 6시간 후, 21%의 OAHS가 L-메티오닌으로 전환되어, L-메티오닌 전구체, DMDS 및 유기 환원성 화합물로부터 "원 포트" 방법에 의한 L-메티오닌의 제조 가능성을 입증하였다.

Claims (15)

  1. 적어도 다음의 단계들을 포함하는, L-메티오닌의 제조 방법:
    a) 1) 다이메틸 다이설파이드(DMDS),
    2) 티올기를 보유하는 아미노산 또는 티올기 함유 펩타이드의 촉매량,
    3) 상기 티올기를 보유하는 아미노산 또는 상기 티올기 함유 펩타이드의 다이설파이드 브릿지의 환원 반응을 촉진시키는 효소의 촉매량,
    4) 다이설파이드 또는 DMDS에 대한 화학양론적 양의 유기 환원성 화합물,
    5) 대상 유기 환원성 화합물의 탈수소화를 위한 반응을 촉진시키는 효소의 촉매량,
    6) 촉매 시스템의 2종의 효소(디하이드로게나제 및 리덕타제)에 공통인 보조인자의 촉매량
    을 포함하는 혼합물의 제조 단계,
    b) 효소 반응을 수행하여 메틸 머캅탄(CH3-SH)을 형성시키는 단계,
    c) L-메티오닌의 전구체의 첨가, 및 단계 b)에서 형성된 메틸 머캅탄을 이용한 상기 전구체의 전환 단계, 및
    d) 형성된 L-메티오닌의 회수 및 임의적 정제 단계.
  2. 제1항에 있어서, 적어도 하기 단계들을 포함하는, L-메티오닌의 제조 방법:
    a') ·다이메틸 다이설파이드(DMDS),
    ·티올기를 보유하는 아미노산 또는 티올기 함유 펩타이드의 촉매량,
    ·상기 티올기를 보유하는 아미노산 또는 상기 티올기 함유 펩타이드에 상응하는 리덕타제 효소의 촉매량,
    ·NADPH의 촉매량
    을 포함하는 혼합물의 제조 단계,
    b') 상응하는 디하이드로게나제 효소의 촉매량과 함께 다이메틸 다이설파이드에 대한 화학양론적 양의 유기 환원성 화합물의 첨가 단계,
    c') 효소 반응을 수행하여 메틸 머캅탄(CH3-SH)을 형성시키는 단계,
    d') 단계 c')에서 형성된 메틸 머캅탄을 이용한 L-메티오닌 전구체의 전환 단계, 및
    e') 형성된 L-메티오닌의 회수 및 임의적 정제 단계.
  3. 제1항에 있어서, 메틸 머캅탄이 메티오닌 전구체와 직접 접촉하도록 위치되는, L-메티오닌의 제조 방법.
  4. 제1항에 있어서, 유기 환원성 화합물이 알콜, 폴리올, 당 등에서 선택되는, 하이드록실 관능기를 보유하는 수소 공여 유기 환원성 화합물인, L-메티오닌의 제조 방법.
  5. 제1항에 있어서, 유기 환원성 화합물이 글루코오스, 글루코오스 6-포스페이트 및 아이소프로판올에서 선택되는, L-메티오닌의 제조 방법.
  6. 제1항에 있어서, 티올기를 보유하는 아미노산 또는 티올기 함유 펩타이드가, 시스테인, 호모시스테인, 글루타티온 및 티오레독신에서 선택되는, L-메티오닌의 제조 방법.
  7. 제1항에 있어서, L-메티오닌 전구체가 O-아세틸-L-호모세린 및 O-숙시닐-L-호모세린에서 선택되는, L-메티오닌의 제조 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 메틸 머캅탄이, 반응기에서 나올 때, L-메티오닌의 합성에 직접 사용되는, L-메티오닌의 제조 방법.
  9. 제8항에 있어서, 적어도 다음의 단계들을 포함하는, L-메티오닌의 제조 방법:
    단계 1: 글루코오스의 박테리아 발효에 의한 L-메티오닌 전구체의 제조,
    단계 2: 상기 반응기(R1)에서 나오는 메틸 머캅탄의 형성물을 이용한 반응기(R1) 에서의 DMDS의 효소적 환원,
    단계 3: 단계 1 유래의 전구체 및 단계 2 유래의 메틸 머캅탄을 이용한 반응기(R2) 에서의 L-메티오닌의 효소적 합성,
    단계 4(임의적): 단계 3에서 형성된 글루코노락톤의 단계 1로의 재순환,
    단계 5: 형성된 L-메티오닌의 회수 및 임의적 정제.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, DMDS로부터 메틸 머캅탄의 합성 및 상기 메틸 머캅탄으로부터 L-메티오닌의 합성이, 하나의 동일한 반응기에서 수행되는, L-메티오닌의 제조 방법.
  11. 제10항에 있어서, 적어도 다음의 단계들을 포함하는, L-메티오닌의 제조 방법:
    단계 1': 글루코오스의 박테리아 발효에 의한 L-메티오닌 전구체의 제조,
    단계 2': 메틸 머캅탄의 제자리 형성물을 이용한 반응기(R1)에서의 DMDS의 효소적 환원, 및 단계 1'에서 수득된 전구체를 이용한 동일한 반응기에서의 L-메티오닌의 동시적 효소적 합성,
    단계 3'(임의적): 단계 2'에서 형성된 글루코노락톤의 단계 1'로의 재순환, 및
    단계 4': 형성된 L-메티오닌의 회수 및 임의적 정제.
  12. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 회분식으로 또는 연속적으로 수행되는, L-메티오닌의 제조 방법.
  13. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 이상적인 유기 환원성 화합물/DMDS 몰비가 0.01 내지 100으로 가변적이거나, 또는 상기 몰비가 0.5 내지 5에서 선택되거나, 또는 상기 몰비가 1인, L-메티오닌의 제조 방법.
  14. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, DMDS/L-메티오닌 전구체 몰비가 0.1 내지 10, 또는 0.5 내지 5이거나, 또는 상기 몰비가 화학양론(몰비 = 0.5)인, L-메티오닌의 제조 방법.
  15. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 반응 온도가 10℃ 내지 50℃, 또는 15℃ 내지 45℃, 또는 20℃ 내지 40℃로 확대된 범위 내인, L-메티오닌의 제조 방법.
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