CN108026550A - 用于制备l-甲硫氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过在L‑甲硫氨酸的前体，二甲基二硫醚(DMDS)和有机还原化合物之间的酶促反应制备L‑甲硫氨酸的方法。

Description

用于制备L-甲硫氨酸的方法
本发明涉及通过在L-甲硫氨酸的前体，二甲基二硫醚(DMDS)和有机还原化合物之间的酶促反应制备L-甲硫氨酸的方法。它还涉及通过在L-甲硫氨酸的前体和甲硫醇之间的酶促反应制备L-甲硫氨酸的两步法，其中甲硫醇通过DMDS的酶促氢解获得。
甲硫氨酸是人体必需氨基酸之一，并广泛用作动物饲料的添加剂。它也被用作药品的原料。甲硫氨酸充当如胆碱(卵磷脂)和肌酸等化合物的前体。它也是用于合成半胱氨酸和牛磺酸的原料。
S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)是L-甲硫氨酸的衍生物并且参与在脑中各种神经递质的合成。L-甲硫氨酸和/或SAM抑制在生物体内脂质的积聚并改善脑，心脏和肾脏的血液循环。L-甲硫氨酸也可用于帮助消化，解毒和排泄有毒物质或重金属如铅。它对骨骼和关节疾病具有抗炎作用，并且也是头发的必需营养素，从而防止其过早不期望的损失。
甲硫氨酸已知在工业上通过来自石油化学的原材料的化学路线进行制备，如在例如文献FR2903690，WO2008006977，US2009318715，US5990349，JP19660043158和WO9408957中描述的那样。除了这些制备方法不属于可持续发展方法之外，这些化学途径还具有产生相对份数的两种L和D对映异构体的混合物的缺点。
文献中已经提出了通过细菌发酵的完全生物合成，其具有仅产生甲硫氨酸的L对映异构体的优点，如在例如国际申请WO07077041，WO09043372，WO10020290和WO10020681中所述。尽管如此，迄今为止没有大规模的工业实施，使得猜想由这些方法产生的性能和/或成本仍然是不足够的。
最近，CJ Cheil-Jedang公司和申请人共同成功地将混合化学/生物方法进行工业化，其中L-甲硫氨酸的前体通过细菌发酵产生，然后与甲硫醇进行酶促反应以专门产生L-甲硫氨酸(参见WO2008013432和/或WO2013029690)。尽管这些方法具有高水平的性能，但是它们需要现场合成甲硫醇，其本身需要通过甲烷的蒸汽重整合成氢，通过氢的硫化合成硫化氢，和其由甲醇和硫化氢的合成，也就是说，非常大型的设备在年产量方面与在年产量方面比已经存在的规模更适度的工业外推法不相容。
因此仍然需要通过混合方法制备L-甲硫氨酸，其中用于合成甲硫醇所需的设备小于用于从氢，硫化氢和甲醇开始的合成的设备。正在这个观点中描述本发明。
实际上，本发明提出在下列总结的方法(WO2008013432和/或WO2013029690)中用二甲基二硫醚(DMDS)代替甲硫醇：
在这里，甲硫醇(MeSH)直接用于第二步中。本发明提出用在先前步骤中的二甲基二硫醚的酶促氢解产物代替甲硫醇，或者在“一锅”反应中将所有物质组合，其中葡萄糖和DMDS产生L-甲硫氨酸。
关于从二甲基二硫醚合成甲硫醇，在现有技术中可以找到以下要素。
专利申请EP0649837提出了二甲基二硫醚与氢的使用过渡金属硫化物通过催化氢解合成甲硫醇的方法。虽然这种方法是高效的，但它需要约200℃的相对高温度以获得在工业上有利的生产率。
本领域技术人员也知道可以通过酸化甲基硫醇钠(CH3SNa)的水溶液来制备甲硫醇。根据使用盐酸或硫酸，该方法具有产生大量盐例如氯化钠或硫酸钠的主要缺点。这些盐水溶液通常非常难以处理，并且并存在微量的恶臭产物使得该方法在工业规模上是难以设想的。
现在已经发现，可以通过在合成L-甲硫氨酸之前的步骤期间通过二甲基二硫醚(DMDS)的酶促还原来制备甲硫醇，并且还惊奇地发现，可以在合成L-甲硫氨酸期间进行DMDS的这种酶促还原。
因此，本发明的主题本身是用于制备与在国际申请WO2008013432和/或WO2013029690中提出的那些类似的L-甲硫氨酸的方法，并且其允许，通过在DMDS的酶促催化反应中生成所述甲硫醇(正好在所述甲硫醇在甲硫氨酸的合成中使用之前)或通过在DMDS的酶催化的反应中在L-甲硫氨酸的合成反应器中原位生成所述甲硫醇，来免除或至少减少甲硫醇的运输。
更特别地，本发明的第一主题是用于制备L-甲硫氨酸的方法，其至少包括以下步骤：
a)制备包含以下物质的混合物：
1)二甲基二硫醚(DMDS)，
2)催化量的带有巯基的氨基酸或含巯基的肽，
3)催化量的用于催化所述携带巯基的氨基酸或所述含巯基的肽的二硫键的还原反应的酶，
4)相对于二硫化物，特别是DMDS的化学计量的有机还原化合物，
5)催化量的用于催化所涉及的有机还原性化合物的脱氢反应的酶，
6)催化量的该催化体系的两种酶(脱氢酶和还原酶)的共同辅因子，
b)进行酶促反应以形成甲硫醇(CH3-SH)，
c)加入L-甲硫氨酸的前体，并使所述前体与在步骤b)中形成的甲硫醇进行转化，以及
d)回收并任选纯化形成的L-甲硫氨酸。
上述步骤a)的组分可以以不同的顺序进行添加(在步骤a)中的添加顺序不受限制的)。在本发明的一个实施方案中，带有巯基的氨基酸和/或带有巯基的肽可以分别为所述氨基酸和/或所述肽的二硫化物形式，例如为谷胱甘肽二硫化物形式的谷胱甘肽。
一般而言，用催化在两当量所述具有巯基的氨基酸或所述含巯基的肽之间产生的二硫键的还原反应的酶是还原酶。在本说明书的其余部分中使用术语“还原酶”来解释本发明。类似地，用于催化在步骤b)中涉及的有机还原化合物的脱氢反应的酶通常称为脱氢酶，在说明书的其余部分中选择术语“脱氢酶”用于解释本发明。
在用于催化还原反应和脱氢反应的两种酶(还原酶和脱氢酶)的共同辅因子中，作为非限制性实例，可以提及黄素辅因子和烟碱辅因子。优选使用烟碱辅因子，和更特别地使用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，或更好地烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)。上面列出的辅因子有利地以它们的还原形式(例如NADPH，H+)和/或它们的氧化形式(例如NADP+)进行使用，也就是说，它们可以以还原和/或氧化形式加入反应介质中。
在步骤a)中组分1)至6)的添加的组织和顺序可以以不同的方式进行。通过加入步骤a)的混合物的催化体系的组分之一触发步骤b)的酶促反应：酶或按化学计量加入的化合物之一(二硫化物或有机还原化合物)或者以催化量加入的化合物之一(带有巯基的氨基酸或含巯基的肽或对应于所述硫醇，或者所述肽的二硫化物或辅因子)。
因此，根据本发明的一个实施方案，制备L-甲硫氨酸的方法至少包括以下步骤：
a')制备混合物，所述混合物包含：
•二甲基二硫醚(DMDS)，
·催化量的带有巯基的氨基酸或含巯基的肽，
·催化量的对应于所述带有巯基的氨基酸或所述含巯基的肽的还原酶，
•催化量的NADPH，
b')加入相对于二甲基二硫醚为化学计量的量的有机还原化合物与催化量的相应的脱氢酶，
c')进行酶促反应以形成甲硫醇(CH3-SH)，
d')使L-甲硫氨酸的前体与在步骤c')中形成的甲硫醇进行转化，和
e')回收并任选纯化形成的L-甲硫氨酸。
根据本发明的方法，如下所述，然后使通常以气态形成的甲硫醇直接与甲硫氨酸前体接触。
根据本发明的用于合成L-甲硫氨酸的方法首先基于二甲基二硫醚使用作为氢供体的并将在后面定义的有机还原化合物的酶促还原反应，其根据以下反应，通过使用葡萄糖作为有机还原化合物(氢供体)：
现在已经发现，这种反应易于通过采用含巯基的氨基酸或含巯基的肽(例如谷胱甘肽)的酶体系进行催化，该酶体系为复合物(氨基酸或肽)/相应的还原酶的形式，通过供氢有机化合物进行再生，如附图1所述。
因此，根据图1中的说明，肽(用“谷胱甘肽”代表)，通过转化成具有二硫键的肽(用“谷胱甘肽二硫化物”代表)，将二硫化物(用“DMDS”代表)还原成硫醇(用“甲硫醇”代表)。还原酶(用“谷胱甘肽还原酶”代表，EC1.8.1.7或EC1.6.4.2)使该肽(谷胱甘肽)再生，同时氧化辅因子(表示为“NADPH，H+”)。该氧化形式(用“NADP+”表示)然后通过使用本领域技术人员公知的并包含所涉及的脱氢酶(用“葡萄糖脱氢酶”代表，具有例如酶分类号EC1.1.1.47)的称为“再循环”的氧化还原酶复合物和有机还原分子(用“葡萄糖”代表)进行还原。然后获得有机还原化合物的氧化形式(用“葡糖酸内酯”表示)。
更特别地，所述肽(以谷胱甘肽为代表的例子)通过转化为具有二硫键的肽(用谷胱甘肽二硫化物代表)将二甲基二硫醚还原成甲硫醇。还原酶(用谷胱甘肽还原酶代表，EC1.8.1.7或EC1.6.4.2)使该肽(谷胱甘肽)再生，并且该相同的酶通过本领域技术人员公知的氧化还原酶复合物进行再生，例如NADPH/NADP+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(还原形式和氧化形式))复合物。NADP+借助于所述有机还原化合物(用葡萄糖代表)，通过对应于所用有机还原化合物的脱氢酶(在此为“葡萄糖脱氢酶”，EC 1.1.1.47)被再生为NADPH，所述有机还原化合物通过转化为其氧化形式(在此为葡糖酸内酯)提供氢。
根据最特别适合的实施方案，与谷胱甘肽还原酶结合的谷胱甘肽/谷胱甘肽二硫化物体系根据本发明允许将DMDS还原成甲硫醇。
谷胱甘肽是广泛用于生物学的三肽。这种呈还原形式(谷胱甘肽)或氧化形式(谷胱甘肽二硫化物)的物质在细胞中形成重要的氧化还原对。因此，谷胱甘肽对消除在生物体中的重金属至关重要。因此，例如，申请WO05107723描述了其中使用谷胱甘肽来形成螯合制剂的制剂，并且专利US4657856教导了谷胱甘肽还允许通过谷胱甘肽过氧化物酶将过氧化物例如H2O2分解成H2O。最后，谷胱甘肽还允许还原存在于蛋白质中的二硫键(RonaChandrawati, "Triggered Cargo Release by Encapsulated Enzymatic Catalysis inCapsosomes", Nano Lett., (2011), vol. 11, 4958-4963)。
根据本发明的方法，催化量的带有巯基的氨基酸或含巯基的肽用于从二甲基二硫醚制备甲硫醇。
在可用于本发明方法中的带有巯基的氨基酸中，作为实例可以提及半胱氨酸和高半胱氨酸。用于以相同方式再生该催化循环的氧化还原酶体系在这些情况下是半胱氨酸/胱氨酸-还原酶体系EC1.8.1.6和高半胱氨酸/高半胱氨酸-还原酶。
使用高半胱氨酸可以是有利的，因为该氨基酸可以由OAHS(L-甲硫氨酸的前体)，硫化氢(H2S)和甲硫氨酸酶(即，催化该产生甲硫氨酸的反应的酶)进行制备。因此，反应介质中就地产生了非常少量的H2S，该循环与谷胱甘肽循环相当。
在可用于本发明的方法中的带有巯基的肽中，作为实例可以提及谷胱甘肽和硫氧还蛋白。上述谷胱甘肽/谷胱甘肽还原酶体系因此可以被硫氧还蛋白(CAS No.52500-60-4)/硫氧还蛋白还原酶(EC1.8.1.9或EC1.6.4.5)体系代替。
谷胱甘肽和谷胱甘肽/谷胱甘肽还原酶体系对于本发明是最特别优选的，因为这些化合物的成本和它们易于获得。
在可用于本发明的范围中的有机还原化合物中，供氢化合物是最特别优选的，其中完全合适的化合物是带有羟基官能团的供氢有机还原化合物，如醇，多元醇，糖等。
所用的酶是能够使含氢化合物脱氢的酶，例如醇-脱氢酶。葡萄糖是最特别适合用于本发明方法中的糖，其用葡萄糖-脱氢酶生成葡糖酸内酯。
在根据本发明的方法中，在其中DMDS的酶促还原在与合成L-甲硫氨酸分开的反应器中进行的情况下，仅仅葡萄糖以化学计量的量进行使用，并且全部其它组分(谷胱甘肽，辅因子(例如NADPH)和两种酶)以催化量使用。在其中DMDS的酶还原反应在单一反应器(“一锅”)中与合成L-甲硫氨酸一起进行的情况下，L-甲硫氨酸的前体也以化学计量的量进行加入，而用于该合成的补充试剂如磷酸吡哆醛(PLP)和对该反应特异的酶以催化量进行加入。
磷酸吡哆醛和对该前体特异的酶的优选浓度是可在国际申请WO2008013432和/或WO2013029690中找到的那些。
无论是在两个连续的步骤还是“一锅”方法的情况下，由二甲基二硫醚通过酶催化合成甲硫醇所带来的优点是很多的。在这些优点中，可以提到在非常温和的温度和压力条件下和在接近中性的pH条件下在水性或水性-有机溶液中操作的可能性。所有这些条件都是典型的“绿色”或“可持续”方法，并且与如在国际申请WO2008013432和/或WO2013029690中所述的L-甲硫氨酸的制备完全相容。
当该方法使用二甲基二硫醚时的另一个优点是产生的甲硫醇在反应条件下处于气态，随着它的形成，它脱离该反应介质。因此，甲硫醇可以在离开反应器时直接用于L-甲硫氨酸的合成中(如在例如WO2008013432和/或WO2013029690中所述)，即，使用例如O-乙酰高丝氨酸或O-琥珀酰高丝氨酸和酶如O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶或O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶的合成中。
例如，如果希望分离甲硫醇，甲硫醇也可以容易地通过低温进行液化。通过鼓泡引入低流速的惰性气体，有利地为氮气，任选地可以加速其与反应介质的分离。
如果希望并且如果需要的话，含氮和甲硫醇的排出气体，在通过第二反应器(L-甲硫氨酸合成)后，可以被再循环到第一反应器中(DMDS的酶促还原)，如果甲硫醇还没有被完全转化为L-甲硫氨酸的话。因此，根据本发明的方法描述了由L-甲硫氨酸的前体和DMDS在两个连续的酶促步骤中合成L-甲硫氨酸的方法。
也可以在同一个反应器中进行L-甲硫氨酸的合成。在这种情况下，将合成L-甲硫氨酸所需的所有试剂加入用于DMDS的酶促还原(上述步骤a))的体系中并关闭反应器以避免DMDS在原位的酶促还原形成的甲硫醇的损失。甲硫醇这时与L-甲硫氨酸的前体反应以产生L-甲硫氨酸。因此，根据本发明的方法描述了从L-甲硫氨酸的前体和DMDS直接合成L-甲硫氨酸的方法，如附图2所示，其中由OAHS，DMDS和葡萄糖开始合成。
二甲基二硫醚(DMDS)可以在其它地点由甲硫醇和氧化剂例如氧气，硫或过氧化氢水溶液，例如，或者由硫酸二甲酯和二硫化钠进行生产。DMDS也可以来自“二硫化物油”(DSO)源，其例如通过如申请WO2014033399中所述的反应性蒸馏进行纯化。
DMDS的通过酶促催化还原反应可以认为是允许避免将甲硫醇从其制备地点通过现有工业路线运输到其使用地点(如果它们不同的话)。事实上，甲硫醇在室温下是一种有毒且极臭的气体，其使得它的运输显著更复杂，与DMDS不同，它的运输已经受到严格管理。因此，在合成L-甲硫氨酸中，DMDS因此可用于直接在甲硫醇的使用地点制备甲硫醇，从而进一步减少与该产品的毒性和气味有关的缺点，以及与此相关的工业风险。
在两个连续步骤中的合成方法的情况下，由于DMDS在反应中被消耗，并且甲硫醇随着它的形成时离开反应介质，因此仅有机还原化合物的脱氢产物例如葡糖酸内酯在反应介质中积累(假定葡萄糖和DMDS连续进料)。当葡糖酸内酯浓度在反应条件下超过饱和点时，它会沉淀出来，这时可以通过本领域技术人员已知的任何方式从反应介质中分离出来。
葡糖酸内酯可具有多种用途。它例如用作为食品添加剂，以缩写E575已知。葡糖酸内酯在酸性水介质中水解以形成葡萄糖酸，其也用作为食品添加剂(E574)。葡糖酸内酯也用于食品工业的豆腐制备(参见CN103053703)。
特别地且有利地，葡糖酸内酯，就其代表来自根据本发明的方法的“废物”的意义上，可以在任选的用于产生生物乙醇或来自糖或淀粉发酵的任何其它分子的发酵反应中代替葡萄糖。
实际上，某些细菌可以在发酵中使用葡糖酸内酯作为碳源，如J. P. van Dijken在"Novel pathway for alcoholic fermentation of gluconolactone in the yeast Saccharomyces bulderi", J. Bacteriol., (2002), Vol. 184(3), 672-678中所描述。
在根据本发明的方法中葡糖酸内酯的显著益处是将其循环至L-甲硫氨酸的前体的合成中。事实上，由于这种合成是使用葡萄糖的细菌发酵，所以葡糖酸内酯可以容易地代替一部分这种葡萄糖。在这些条件下，这种循环利用可以会带来非常显著的经济优势。
甚至其中反应在上述定义的“一锅法”的条件下进行并且葡糖酸内酯比L-甲硫氨酸更易溶解的情况下，也很容易使用本领域技术人员已知的常规技术将其与反应介质分离。
在本发明的方法中还可以使用其它糖，例如可以用以下体系代替葡萄糖/葡糖酸内酯/葡萄糖脱氢酶体系：葡萄糖-6-磷酸酯/6-磷酸葡糖酸-δ-内酯/葡萄糖-6-磷酸酯脱氢酶(EC 1.1.1.49)。
在本发明的方法中，还可以使用醇代替糖，并因此使用以下通用体系代替葡萄糖/葡糖酸内酯/葡萄糖脱氢酶体系：醇/酮或醛/醇脱氢酶(EC 1.1.1)，更特别是异丙醇/丙酮/异丙醇脱氢酶体系(EC 1.1.1.80)。
实际上，该体系允许从DMDS和异丙醇获得离开反应介质的由甲硫醇(MeSH)和丙酮组成的混合物(因此不积聚任何产物)。如果需要，MeSH和丙酮可以通过简单的蒸馏轻松进行分离。
根据一个实施方案，根据本发明的方法包括通过DMDS的酶促还原，然后形成的甲硫醇与L-甲硫氨酸的前体反应以产生L-甲硫氨酸的制备。在这种情况下，根据本发明的方法至少包括以下步骤：
步骤1：例如通过葡萄糖的细菌发酵制备L-甲硫氨酸的前体(参见WO2008013432和/或WO2013029690)，
步骤2：在反应器R1中酶促还原DMDS，形成甲硫醇，其离开所述反应器R1(对应于上述步骤a')至c'))，
步骤3：用来自步骤1的前体和来自步骤2的甲硫醇在反应器R2中酶促合成1-甲硫氨酸(对应于上述步骤d')，
步骤4(任选)：将步骤3中形成的葡糖酸内酯循环至步骤1，
步骤5：回收并任选纯化所形成的1-甲硫氨酸(对应于上述步骤e'))。
对于步骤1，可以使用的条件范围将在以下专利中找到(参见WO2008013432和/或WO2013029690)。
对于步骤2，反应温度在10℃到50℃，优选在15℃到45℃，更优选在20℃到40℃的范围内。
反应的pH可以在6-8之间，优选在6.5-7.5之间。反应介质的pH值可以通过缓冲液来调节。完全优选地，将选择例如为7.3的0.1mol.l-1磷酸盐缓冲液的pH。
根据所使用的试剂和设备，用于该反应的压力可以是相对于大气压的减压至几巴(几百kPa)。降低的压力确实允许所形成的甲硫醇更快地脱气，但是具有增大水和DMDS的饱和蒸汽压的缺点，稍稍更多地污染该形成的甲硫醇。优选使用从大气压至20巴(2MPa)的压力，甚至更优选地将在从大气压至3巴(300kPa)的压力下进行操作。
对于步骤3，对于理想条件将参考国际申请WO2013029690，其中可能的差别在于将氮气流引入反应器R1以进入反应器R2并将这些气体从反应器R2再循环至处于期望压力的反应器R1中，如果甲硫醇在反应器R2中没有完全反应的话。
根据另一个实施方案(其它变体)，根据本发明的方法在同一个反应器(“一锅”)中进行，并且在这种情况下至少包括以下步骤：
步骤1'：通过例如葡萄糖的细菌发酵制备L-甲硫氨酸的前体(类似于上述步骤1)，
步骤2'：在反应器R1中酶促还原DMDS，原位形成甲硫醇，并在相同的反应器中使用在步骤1'中获得的前体伴随酶促合成L-甲硫氨酸，
步骤3'(任选)：将在步骤2'中形成的葡糖酸内酯再循环至步骤1'，和
步骤4'：回收并任选纯化形成的1-甲硫氨酸。
对于步骤1'，可以使用的条件范围将在国际申请WO2008013432和/或WO2013029690中找到。
对于步骤2'，操作条件如下。
反应温度在10℃至50℃，优选15℃至45℃，更优选20℃至40℃的范围内。
反应的pH有利地在6-8之间，优选在6.2-7.5之间。完全优选地，反应在等于7.0的0.2mol.l-1磷酸盐缓冲液的pH下进行。
优选地，该方法在大气压至20巴(2MPa)，甚至更优选从大气压至3巴(300kPa)的压力下进行。
DMDS/L-甲硫氨酸的前体的摩尔比在0.1-10之间，通常在0.5-5之间，并且优选摩尔比是化学计量比(摩尔比=0.5)，但是可以更高的，如果这证明对反应动力学有利的话。
在根据本发明的方法的一种或另一种变体中，根据所选择的操作条件和所使用的试剂，该方法可以在玻璃或金属反应器中分批或连续地进行。
在本发明方法的一种或另一种变体中，理想的有机还原化合物/DMDS摩尔比为化学计量比(摩尔比=1)，但可以为0.01至100之间，如果本领域技术人员发现其中的任何益处，如连续添加DMDS，而还原化合物从开始就被引入反应器中。优选地，在整个反应中这种摩尔比整体在0.5-5之间进行选择。
在上述步骤a)中制备的混合物中以催化量存在的元素(带有巯基的氨基酸或含巯基的肽或者对应于所述氨基酸的二硫化物或对应于所述肽的二硫化物，还原酶，脱氢酶，辅因子，例如NADPH)易于商购或可以根据本领域技术人员熟知的技术进行制备。这些不同的元素可以以固体或液体形式存在，并且可以非常有利地溶解在水中以用于本发明的方法中。所用的酶也可以被接枝到载体上(在负载酶的情况下)。
包含氨基酸或肽的酶复合物的水溶液还可以通过本领域技术人员已知的方法进行重构，例如通过使含有这些元素的细胞透化。这种水溶液，其组成在下列实施例1中给出，可以以相对于反应介质的总重量以0.01％至20％的重量含量进行使用。优选地，将使用0.5％-10％之间的含量。
通过以下对本发明的范围不是限制性的实施例将更好地理解本发明。
实施例1：两个连续步骤的方法
将10ml谷胱甘肽的酶复合物(Aldrich)和19.2g(0.1mol)葡萄糖引入含有150ml的pH7.30的0.1mol/l磷酸盐缓冲液的反应器R1中。酶复合物溶液包含：185mg (0.6mmol)谷胱甘肽，200U谷胱甘肽还原酶，50mg (0.06mmol) NADPH和200U葡萄糖-脱氢酶。在机械搅拌下使反应介质达到25℃。在t=0时进行第一次取样。随后，将二甲基二硫醚(9.4g，0.1mol)置于滴定管中并滴加到反应器中；反应开始。氮气流被置于反应器中。
离开反应器的气体的气相色谱分析显示几乎基本上存在氮和甲硫醇(一些痕量的水)。这些出口气体被送入反应器R2。DMDS在6小时内被引入反应器R1中。反应器R1的反应介质的最终气相色谱分析证实不存在DMDS，并且通过UPLC/质谱法的分析显示痕量的葡萄糖和几乎排他性存在葡糖酸内酯(痕量葡糖酸)。
平行地，在含有75ml的pH 6.60的0.1mol.l-1磷酸盐缓冲液的第二反应器R2中，加入5g O-乙酰基-L-高丝氨酸(OAHS)(O-乙酰基高丝氨酸已经由L-高丝氨酸和乙酸酐根据Sadamu Nagai, "Synthesis of O-acetyl-l-homoserine", Academic Press, (1971),vol.17, pp. 423-424进行合成)。在机械搅拌下使溶液达到35℃。
在反应开始之前，进行反应介质的1ml取样(t=0)。将磷酸吡哆醛(1.6mmol，0.4g)的溶液和O-乙酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶(0.6g)溶于10ml水中，然后加入到反应器中。
甲硫醇通过反应器R1的反应被引入并通过氮气流推进。然后开始反应。通过HPLC监测L-甲硫氨酸的形成和OAHS的消失。来自反应器R2的出口气体被捕集在20％烧碱(氢氧化钠)水溶液中。分析表明，OAHS已经被转化为52％的L-甲硫氨酸，并且过量的DMDS已经被转化为在氢氧化钠捕集器中发现的甲硫醇。
实施例2：“一锅”方法
在含有150ml的pH7的0.2mol.l-1磷酸盐缓冲液的反应器中，引入10ml酶复合物，6g(33mmol)葡萄糖和5g(31mmol)O-乙酰基-L-高丝氨酸(OAHS，O-乙酰基-L-高丝氨酸已经从L-高丝氨酸和乙酸酐按照Sadamu Naga“SynthesisofO-acetyl-l-homoserine”，AcademicPress，(1971)，第17卷，第423-424页进行了合成)。该酶复合物的溶液含有：185mg(0.6mmol)谷胱甘肽，200U谷胱甘肽还原酶，50mg(0.06mmol)NADPH，200U葡萄糖脱氢酶，0.4g(1.6mmol)磷酸吡哆醛和0.6g O-乙酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶。
在机械搅拌下使反应介质达到27℃。在t=0时进行第一次取样。随后，将二甲基二硫醚(3g，32mmol)置于滴定管中并逐滴加入到已封闭的反应器中以避免释放出甲硫醇；反应开始。通过HPLC监测反应以观察OAHS的消失和L-甲硫氨酸的形成。在6小时后，21％的OAHS已经转化为L-甲硫氨酸，证明了通过“一锅”法从L-甲硫氨酸的前体，DMDS和有机还原化合物制备L-甲硫氨酸的可能性。

Claims (15)

1.用于制备L-甲硫氨酸的方法，其至少包括以下步骤：
a)制备包含以下物质的混合物：
1)二甲基二硫醚(DMDS)，
2)催化量的带有巯基的氨基酸或含巯基的肽，
3)催化量的用于催化还原反应的酶，所述还原反应是所述携带巯基的氨基酸或所述含巯基的肽的二硫键的还原反应，
4)相对于二硫化物，特别是DMDS的化学计量的有机还原化合物，
5)催化量的用于催化所涉及的有机还原性化合物的脱氢反应的酶，
6)催化量的该催化体系的两种酶(脱氢酶和还原酶)的共同辅因子，
b)进行酶促反应以形成甲硫醇(CH3-SH)，
c)加入L-甲硫氨酸的前体，并使用在步骤b)中形成的甲硫醇转化所述前体，以及
d)回收并任选纯化形成的L-甲硫氨酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其包括至少以下步骤：
a')制备混合物，所述混合物包含：
•二甲基二硫醚(DMDS)，
·催化量的带有巯基的氨基酸或含巯基的肽，
·催化量的对应于所述带有巯基的氨基酸或所述含巯基的肽的还原酶，
•催化量的NADPH，
b')加入相对于二甲基二硫醚为化学计量的量的有机还原化合物与催化量的相应的脱氢酶，
c')进行酶促反应以形成甲硫醇(CH3-SH)，
d')使用在步骤c')中形成的甲硫醇转化L-甲硫氨酸前体，和
e')回收并任选纯化形成的L-甲硫氨酸。
3.根据权利要求1或2的方法，其中使甲硫醇直接与甲硫氨酸前体接触。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述有机还原化合物是具有羟基官能团的供氢有机还原化合物，其选自醇，多元醇，糖。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述有机还原化合物选自葡萄糖，葡萄糖-6-磷酸酯和异丙醇。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中带有巯基的氨基酸或带有巯基的肽选自半胱氨酸，高半胱氨酸，谷胱甘肽和硫氧还蛋白。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述L-甲硫氨酸的前体选自O-乙酰-L-高丝氨酸和O-琥珀酰-L-高丝氨酸。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中甲硫醇在离开反应器时被直接用在L-甲硫氨酸的合成中。
9.根据权利要求8所述的方法，其包括至少以下步骤：
步骤1：制备L-甲硫氨酸的前体，例如通过葡萄糖的细菌发酵进行制备，
步骤2：在反应器R1中酶促还原DMDS，形成甲硫醇，其离开所述反应器R1，
步骤3：用来自步骤1的前体和来自步骤2的甲硫醇在反应器R2中酶促合成1-甲硫氨酸，
步骤4(任选)：将在步骤3中形成的葡糖酸内酯循环至步骤1中，
步骤5：回收并任选纯化所形成的1-甲硫氨酸。
10.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中从DMDS合成甲硫醇和从所述甲硫醇合成L-甲硫氨酸在单独的同一个反应器中进行。
11.根据权利要求10所述的方法，其包括至少以下步骤：
步骤1'：通过葡萄糖的细菌发酵制备L-甲硫氨酸的前体，
步骤2'：在反应器R1中酶促还原DMDS，原位形成甲硫醇，并在该相同的反应器中使用在步骤1'中获得的前体伴随酶促合成L-甲硫氨酸，
步骤3'(任选)：将在步骤2'中形成的葡糖酸内酯再循环至步骤1'，和
步骤4'：回收并任选纯化形成的1-甲硫氨酸。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其分批或连续进行。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述理想有机还原化合物/DMDS摩尔比为0.01至100，优选所述摩尔比在0.5至5之间选择，并且完全优选所述摩尔比等于1。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述DMDS/L-甲硫氨酸的前体的摩尔比为0.1-10，通常为0.5-5，并且优选所述摩尔比是化学计量比(摩尔比=0.5)。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述反应温度在10℃至50℃，优选15℃至45℃，更优选20℃至40℃的范围内。
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