BR112018005656B1 - Método de produção de l-metionina - Google Patents

Abstract

MÉTODO DE PRODUÇÃO DE L-METIONINA. A invenção refere-se a um método de produção de L-metionina por reação enzimática entre um precursor de L-metionina, dissulfeto de dimetila (DMDS) e hidrogênio.

Description

[0001] A presente invenção refere-se a um método de produção de L-metionina por reação enzimática entre um precursor de L-metionina, dissulfeto de dimetila (DMDS) e hidrogênio. Ela refere-se também a um método de duas etapas de produção de L-metionina por reação enzimática entre um precursor de L-metionina e mercaptano de metila, este último sendo obtido por hidrogenólise enzimática de DMDS com hidrogênio.

[0002] A metionina é um dos aminoácidos essenciais do corpo humano e é amplamente utilizada como aditivo para a alimentação animal. Ela é também utilizada como matéria-prima para produtos farmacêuticos. A metionina atua como um precursor de compostos tais como a colina (lecitina) e creatina. É também uma matéria-prima de síntese para a cisteína e a taurina.

[0003] A S-adenosil-L-metionina (SAM) é um derivado da L-metionina e está envolvido na síntese de diversos neurotransmissores no cérebro. A L-metionina, e/ou a SAM, inibe a acumulação de lípidos no organismo e melhora a circulação sanguínea no cérebro, coração e rins. A L-metionina pode também ser utilizada para favorecer a digestão, a desintoxicação e a excreção de substâncias tóxicas ou de metais pesados tais como o chumbo. Ela tem um efeito anti-inflamatório nos ossos e nas doenças das articulações e é também um nutriente essencial para os cabelos, impedindo assim a queda prematura e não desejada.

[0004] A metionina já é conhecida por ser preparada industrialmente por vias químicas a partir de matérias-primas derivadas da petroquímica, como descrito por exemplo nos documentos FR2903690, WO2008006977, US2009318715, US5990349, JP19660043158 e WO9408957. Além do fato de estes métodos de preparação não se inscreverem em um processo de desenvolvimento sustentável, estas vias químicas apresentam a desvantagem de produzirem uma mistura em partes iguais de dois enantiômeros L e D.

[0005] Foram propostas na literatura sínteses totalmente biológicas por fermentação bacteriana com a vantagem de produzirem apenas o enantiômero L da metionina, como descrito por exemplo nos documentos WO07077041, WO09043372, WO10020290 e WO10020681. No entanto, a ausência de realização industrial de grande escala até hoje, sugere que os desempenhos e/ou os custos de produção destes métodos continuam insuficientes.

[0006] Métodos mistos químicos/biológicos têm sido industrializados com sucesso conjuntamente pela empresa CJ Cheil-Jedang e a Requerente, nos quais um precursor da L-metionina é produzido por fermentação bacteriana e em seguida reage enzimaticamente com mercaptano de metila para produzir exclusivamente a L- metionina (cf. WO2008013432 e/ou WO2013029690). Estes métodos ainda que bem sucedidos requerem a síntese no local do mercaptano de metila, em que ele próprio requer a síntese do hidrogênio por reforma a vapor de metano, a síntese de sulfeto de hidrogênio por hidrogenação de enxofre e sua síntese a partir de metanol e de sulfeto de hidrogênio, isto é, equipamentos significativos pouco compatíveis com uma extrapolação industrial mais modesta em termos de produção anual do que aquela que já existe.

[0007] Subsiste portanto uma necessidade de produzir a L-metionina por um método misto no qual os equipamentos necessários para a síntese de mercaptano de metila serão menos que para uma síntese a partir de hidrogênio, de sulfeto de hidrogênio e de metanol. É nesta óptica que se inscreve a presente invenção.

[0008] A presente invenção propõe de fato substituir o mercaptano de metila no método resumido abaixo (WO2008013432 e/ou WO2013029690), por dissulfeto de dimetila (DMDS):

[0009] O mercaptano de metila (MeSH) é aqui diretamente utilizado na segunda etapa. A presente invenção propõe substituir o mercaptano de metila pelo produto da hidrogenólise enzimática de dissulfeto de dimetila em uma etapa prévia ou combinar o conjunto em uma reação “one pot”, em que a glucose e o DMDS produzem a L- metionina.

[0010] Relativamente à síntese do mercaptano de metila a partir de dissulfeto de dimetila, pode-se encontrar na técnica anterior os elementos seguintes.

[0011] O pedido de patente EP0649837 propõe um método de síntese de mercaptano de metila por hidrogenólise catalítica, com sulfetos de metais de transição, de dissulfeto de dimetila com hidrogênio. Este método, ainda que bem sucedido, requer temperaturas relativamente elevadas da ordem dos 200 °C para obter produtividades industrialmente interessantes.

[0012] O perito na técnica também sabe que é possível preparar mercaptano de metila por acidificação de uma solução aquosa de mercaptida de metil-sódio (CH3SNa). Este método apresenta a grande desvantagem de produzir grandes quantidades de sais, tais como o cloreto de sódio ou o sulfato de sódio, conforme se utilize o ácido clorídrico ou o ácido sulfúrico. Estas soluções aquosas salinas são muitas vezes muito difíceis de tratar e os vestígios de produtos malcheirosos que permanecem tornam este método difícil de prever a nível industrial.

[0013] Se descobriu agora que se poderia preparar o mercaptano de metila por redução enzimática de dissulfeto de dimetila (DMDS) durante uma etapa anterior à síntese da L-metionina e se descobriu também, de forma surpreendente, que se poderia realizar esta redução enzimática do DMDS durante a síntese da L-metionina.

[0014] Assim, a presente invenção tem por objeto um método de preparação de L-metionina semelhante àquele proposto nos pedidos internacionais WO2008013432 e/ou WO2013029690 e que permite ultrapassar, ou pelo menos reduzir, a manutenção do mercaptano de metila, gerando-se o referido mercaptano de metila em uma reação de catálise enzimática de DMDS, imediatamente antes da utilização do referido mercaptano de metila na síntese de metionina ou gerando-se o referido mercaptano de metila em uma reação de catálise enzimática de DMDS in situ no reator de síntese de L-metionina.

[0015] Mais particularmente, a presente invenção tem como primeiro objeto o método de preparação de L-metionina, compreendendo pelo menos as etapas de: preparação de uma mistura compreendendo: dissulfeto de dimetila (DMDS), uma quantidade catalítica de aminoácido portador de um grupo tiol ou de um peptídeo com grupo tiol, uma quantidade catalítica de enzima que catalisa a reação de redução da ponte dissulfeto do referido aminoácido portador de um grupo tiol ou do referido peptídeo com grupo tiol, hidrogênio, uma quantidade catalítica de enzima que catalisa a reação de redução do hidrogênio, uma quantidade catalítica de um cofator comum às duas enzimas do sistema catalítico (desidrogenase e redutase), condução da reação enzimática para formar o mercaptano de metila (CH3- SH), adição de um precursor da L-metionina e conversão do referido precursor com o mercaptano de metila formado na etapa b), e recuperação e eventualmente purificação da L-metionina formada.

[0016] Os componentes da etapa a) acima podem ser adicionados em ordens diferentes (a ordem de adição na etapa a) não é restritiva). Em uma modalidade da invenção, o aminoácido portador de um grupo tiol e/ou o peptídeo portador de um grupo tiol pode estar na forma de dissulfeto do referido aminoácido e/ou do referido peptídeo respectivamente, por exemplo glutationa na forma de dissulfeto de glutationa.

[0017] De uma maneira geral, a enzima que catalisa a redução da ponte dissulfeto criada entre dois equivalentes do referido aminoácido portador de um grupo tiol ou do referido peptídeo com grupo tiol é uma enzima redutase. O termo “redutase” é utilizado na sequência da descrição para a explicação da presente invenção. De modo semelhante, a enzima que catalisa a reação de redução do hidrogênio é geralmente denominada hidrogênio desidrogenase, o termo “desidrogenase” sendo escolhido na sequência da descrição para a explicação da presente invenção.

[0018] Entre os cofatores comuns às duas enzimas que catalisam a redução e a desidrogenação (a redutase e a desidrogenase), pode citar-se a título de exemplos não limitativos os cofatores flavínicos e os cofatores nicotínicos. Se prefere utilizar os cofatores nicotínicos e mais particularmente a Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo (NAD), ou melhor ainda a Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Fosfato (NADPH). Os cofatores listados acima são vantajosamente utilizados em suas formas reduzidas (por exemplo NADPH, H+) e/ou suas formas oxidadas (por exemplo NADP+), isto é, eles podem ser adicionados nestas formas reduzidas e/ou oxidadas no meio de reação.

[0019] A organização e a ordem de adição dos componentes 1) a 6) na etapa a) podem ser realizadas de diferentes maneiras. A reação enzimática da etapa b) é desencadeada pela adição de um dos componentes do sistema catalítico da mistura da etapa a): uma enzima, um dos compostos adicionados em quantidade estequiométrica (dissulfeto ou composto orgânico redutor), um dos compostos adicionados em quantidade catalítica (aminoácido portador de um grupo tiol ou peptídeo com um grupo tiol ou dissulfeto correspondente ao referido tiol ou ao referido peptídeo ou ainda o cofator).

[0020] Assim, e de acordo com uma modalidade da presente invenção, o método de preparação de L-metionina compreende pelo menos as etapas de: a’) preparação de uma mistura compreendendo: dissulfeto de dimetila (DMDS), uma quantidade catalítica de aminoácido portador de um grupo tiol ou de um peptídeo com grupo tiol, uma quantidade catalítica de enzima redutase correspondente ao referido aminoácido portador de um grupo tiol ou ao referido peptídeo com grupo tiol, uma quantidade catalítica de NADPH, b’) adição de hidrogênio, com uma quantidade catalítica de enzima hidrogênio desidrogenase, c’) condução da reação enzimática para formar o mercaptano de metila (CH3-SH), d’) conversão de um precursor da L-metionina com o mercaptano de metila formado na etapa c’), e e’) recuperação e eventualmente purificação da L-metionina formada.

[0021] De acordo com o método da invenção, o mercaptano de metila, geralmente formado no estado gasoso, é então posto em contato diretamente com um precursor de metionina como descrito adiante.

[0022] O método de síntese da L-metionina de acordo com a invenção se baseia principalmente na redução enzimática de dissulfeto de dimetila com o hidrogênio, de acordo com a reação seguinte: CH3SSCH3 + H2 2 CH3SH

[0023] Se descobriu agora que esta reação é facilmente catalisada pelo sistema enzimático utilizando um aminoácido com grupo tiol ou um peptídeo com grupo tiol, por exemplo a glutationa, na forma de complexo (aminoácido ou peptídeo)/enzima redutase correspondente, regenerada pelo hidrogênio, como descrito na Figura 1 anexa.

[0024] Assim, de acordo com a ilustração da Figura 1, o peptídeo (exemplo representado, a glutationa) reduz o dissulfeto de dimetila em mercaptano de metila transformando-se em peptídeo de ponte dissulfeto (dissulfeto de glutationa representado). A enzima redutase (“glutationa redutase” representada, EC 1.8.1.7 ou EC 1.6.4.2) regenera o peptídeo (glutationa) e esta mesma enzima é regenerada por um complexo enzimático redox bem conhecido do perito na técnica, por exemplo o complexo NADPH/NADP+ (Nicotina adenina dinucleotídeo fosfato (forma reduzida e forma oxidada)). Por sua vez a NADP+ é regenerada em NADPH por intermédio da enzima “Hidrogênio desidrogenase” (EC 1.12.1.5) graças ao hidrogênio. O protão liberado pelo hidrogênio não se acumula porque ele reage com a glutationa-redutase que deu HS-R-S- após reação com NADPH e a função mercaptida formada se torna em uma função mercaptana.

[0025] De acordo com uma modalidade muito particularmente adaptada, o sistema glutationa/dissulfeto de glutationa associado à enzima glutationa-redutase permite, de acordo com a presente invenção, reduzir o DMDS em mercaptano de metila.

[0026] A glutationa é um tripeptídeo amplamente utilizado em biologia. Esta espécie na forma reduzida (glutationa) ou oxidada (dissulfeto de glutationa) forma um par redox importante nas células. Assim, a glutationa é vital para suprimir os metais pesados dos organismos. Assim, por exemplo o pedido WO05107723 descreve uma formulação em que a glutationa é utilizada para formar uma preparação quelante, a patente US4657856 ensina que a glutationa permite também destruir os peróxidos como H2O2 em H2O através da glutationa peroxidase. Por fim a glutationa permite também reduzir as pontes dissulfeto presentes nas proteínas (Rona Chandrawati, “Triggered Cargo Release by Encapsulated Enzymatic Catalysis in Capsosomes”, Nano Lett., (2011), vol. 11, 4958-4963).

[0027] De acordo com o método da invenção, é utilizada uma quantidade catalítica de aminoácido portador de um grupo tiol ou de um peptídeo com grupo tiol, para a produção de mercaptano de metila a partir de dissulfeto de dimetila.

[0028] Entre os aminoácidos portadores de grupo tiol utilizáveis no método da presente invenção, podem citar-se, a título de exemplos não limitativos, a cisteína e a homocisteína. Os sistemas enzimáticos redox utilizados podem regenerar o ciclo catalítico da mesma forma, sendo nestes casos o sistema cisteína/cistina-redutase EC 1.8.1.6, e homocisteína/homocisteína-redutase.

[0029] Pode ser vantajoso utilizar a homocisteína porque este aminoácido pode ser preparado a partir de OAHS (precursor da L-metionina), de sulfeto de hidrogênio (H2S) e da enzima que catalisa a reação que conduz à metionina. Assim, uma quantidade muito pequena de H2S no meio de reação, cria in situ o ciclo equivalente àquele da glutationa.

[0030] Entre os peptídeos portadores de grupo tiol utilizáveis no método da presente invenção, podem citar-se, a título de exemplos não limitativos, a glutationa e a tioredoxina. O sistema glutationa/glutationa redutase, descrito anteriormente, pode assim ser substituído pelo sistema tioredoxina (CAS no. 52500-60-4)/tioredoxina redutase (EC 1.8.1.9 ou EC 1.6.4.5).

[0031] A glutationa e o sistema glutationa/glutationa redutase são muito particularmente preferenciais para a presente invenção, devido à facilidade de aprovisionamento e aos custos de seus compostos.

[0032] No método de acordo com a invenção, o hidrogênio pode ser adicionado ao meio de reação por qualquer meio conhecido do perito na técnica, por exemplo por borbulhamento no meio de reação que é vantajosamente um meio de reação hidro- orgânico. A pressão do hidrogênio no reator corresponde à pressão do próprio meio de reação que é definida mais abaixo.

[0033] A enzima utilizada é a enzima hidrogênio-desidrogenase, também bem conhecida do perito na técnica.

[0034] No método de acordo com a invenção, no caso em que a redução enzimática do DMDS se faz em um reator separado da síntese da L-metionina, somente o DMDS e o hidrogênio são utilizados em quantidade estequiométrica, todos os outros componentes (glutationa, cofator (por exemplo NADPH) e as duas enzimas) são utilizados em quantidade catalítica. No caso em que a reação de redução enzimática do DMDS se faz com a síntese da L-metionina em um só reator, dito “one pot”, o precursor da L-metionina é também adicionada em quantidade estequiométrica, enquanto os reagentes complementares a esta síntese tais como o fosfato piridoxal (PLP) e a enzima específica para esta reação são adicionados em quantidades catalíticas.

[0035] As concentrações em fosfato piridoxal e em enzima específica para o precursor preferenciais são aquelas que se podem encontrar nos pedidos internacionais WO2008013432 e/ou WO2013029690.

[0036] As vantagens obtidas na síntese por catálise enzimática de mercaptano de metila a partir de dissulfeto de dimetila são numerosas, seja no caso das 2 etapas sucessivas seja no do método “one pot”. Entre estas vantagens, pode citar-se a possibilidade de trabalhar em solução aquosa ou hidro-orgânica em condições muito agradáveis de temperatura e de pressão e em condições de pH próximas da neutralidade. Todas estas condições são típicas de um método dito “verde” ou “durável”, e são totalmente compatíveis com a preparação de L-metionina, tal como descrito nos pedidos internacionais WO2008013432 e/ou WO2013029690.

[0037] Uma outra vantagem quando o método utiliza dissulfeto de dimetila é a de o mercaptano de metila produzido, que está no estado gasoso nas condições da reação, sair do meio de reação à medida de sua formação, acompanhado eventualmente pelo hidrogênio que não reagiu. Ele pode então ser diretamente utilizado na saída do reator em uma aplicação mais a jusante se o hidrogênio não reagido não interferir nesta última.

[0038] O mercaptano de metila pode então ser diretamente utilizado na saída do reator na síntese da L-metionina, como descrito por exemplo em WO2008013432 e/ou WO2013029690, isto é, a partir por exemplo de O-acetil-L-homoserina ou de O- succinil-L-homoserina e de enzimas tais como a O-acetil-L-homoserina-sulfidrilase ou a O-succinil-L-homoserina-sulfidrilase respectivamente.

[0039] Caso contrário, o perito na técnica saberá facilmente separar o hidrogênio não convertido do mercaptano de metila. O mercaptano de metila pode também ser facilmente liquefeito por criogenia por exemplo se se o desejar isolar ou separar.

[0040] Os gases de saída contendo hidrogênio e mercaptano de metila podem, caso se deseje e se for necessário, ser reciclados no primeiro reator (redução enzimática do DMDS) após passagem no segundo reator (síntese de L-metionina) se o mercaptano de metila não for totalmente convertido em L-metionina. O método de acordo com a invenção descreve portanto um método de síntese de L-metionina em 2 etapas enzimáticas sucessivas a partir de um precursor de L-metionina e de DMDS.

[0041] É também possível realizar a síntese de L-metionina em um único e mesmo reator. Neste caso se adiciona ao sistema de redução enzimática de DMDS (etapa a) acima) todos os reagentes necessários à síntese da L-metionina e se fecha o reator para evitar a saída do mercaptano de metila formado por redução enzimática in situ de DMDS. O mercaptano de metila reage então com o precursor da L-metionina para dar a L-metionina. O método de acordo com a presente invenção descreve assim um método de síntese direta de L-metionina a partir de um precursor de L-metionina e de DMDS, como ilustrado na Figura 2 anexa, isto é, a síntese a partir de OAHS, de DMDS e hidrogênio.

[0042] O dissulfeto de dimetila (DMDS) pode ser produzido em um outro local a partir de mercaptano de metila e de um oxidante tal como o oxigênio, o enxofre ou a água oxigenada por exemplo, ou ainda a partir de sulfato de dimetila e de dissulfeto de sódio. O DMDS pode também provir de uma fonte de “DiSulfide Oils” (DSO) purificada por exemplo por destilação reativa como descrito no pedido WO2014033399.

[0043] A redução por catálise enzimática de DMDS pode ser considerada como um método que permite evitar o transporte de mercaptano de metila de seu sítio de produção pelas vias industriais existentes, em direção a seu sítio de utilização, se eles forem diferentes. Efetivamente, o mercaptano de metila é um gás à temperatura ambiente, tóxico e fortemente malcheiroso o que complica grandemente seu transporte já bastante regulamentado contrariamente ao DMDS. Assim o DMDS pode por isso ser utilizado para produzir mercaptano de metila diretamente no local de utilização deste último na síntese da L-metionina, assim reduzindo ainda as desvantagens relacionadas à toxicidade e ao odor deste produto, bem como os riscos industriais relacionados.

[0044] No caso do método de síntese em 2 etapas sucessivas, o DMDS sendo consumido na reação e o mercaptano de metila saindo do meio de reação à medida de sua formação, com ou sem hidrogênio não convertido, nenhum produto se acumula na hipótese de uma alimentação em contínuo de hidrogênio e de DMDS. Não é então necessário reciclar o sistema catalítico, dados os produtos que entram e saem do reator.

[0045] De acordo com uma modalidade, o método de acordo com a invenção compreende a preparação de mercaptano de metila por redução enzimática de DMDS, em seguida a reação do referido mercaptano de metila formado com um precursor de L-metionina para dar a L-metionina. Neste caso, o método de acordo com a invenção compreende pelo menos as etapas seguintes: Etapa 1: preparação de um precursor da L-metionina, por exemplo por fermentação bacteriana de glucose (cf. WO2008013432 e/ou WO2013029690), Etapa 2: redução enzimática do DMDS em um reator R1 com formação de mercaptano de metila e eventualmente de hidrogênio não convertido, saindo do referido reator R1 (etapas a) a c) acima), Etapa 3: síntese enzimática da L-metionina em um reator R2 com o precursor da Etapa 1 e o mercaptano de metila da Etapa 2 (etapa d) acima), Etapa 4 (opcional): reciclagem de hidrogênio não convertido para a Etapa 2 e reciclagem do mercaptano de metila para a Etapa 2 ou Etapa 3, e Etapa 5: recuperação e eventualmente purificação da L-metionina formada (etapa e) acima).

[0046] Para a Etapa 1, se encontrará o domínio das condições utilizáveis nos pedidos internacionais WO2008013432 e/ou WO2013029690.

[0047] Para a Etapa 2, a temperatura de reação está compreendida em um intervalo que vai de 10 °C a 50 °C, preferencialmente entre 15 °C e 45 °C, preferencialmente ainda entre 20 °C e 40 °C.

[0048] O pH da reação pode estar compreendido entre 5 e 9, preferencialmente entre 6 e 8,5, preferencialmente ainda entre 6 e 8, e de maneira particularmente preferencial entre 7,0 e 8,0. De forma bastante preferencial, se escolherá o pH de um meio tamponado com um valor de pH compreendido entre 7,5 e 8,0. De acordo com uma outra modalidade preferencial, se escolherá o pH de um meio tamponado com um valor de pH compreendido entre 6,5 e 7,5.

[0049] A pressão utilizada para a reação pode ir de uma pressão reduzida relativamente à pressão atmosférica até vários bares (várias centenas de kPa), consoante os reagentes utilizados e o material utilizado. De forma preferencial, se utilizará uma pressão que vai desde a pressão atmosférica até 20 bares (2 MPa) e de forma ainda mais preferencial se trabalhará sob uma pressão que vai desde a pressão atmosférica até 3 bares (300 kPa).

[0050] Para a Etapa 3, se fará referência ao pedido internacional WO2013029690, para as condições ideais

[0051] De acordo com outra modalidade (outra variante), o método de acordo com a presente invenção é realizado em um único e mesmo reator (“one pot”), e neste caso compreende pelo menos as etapas seguintes: Etapa 1': preparação de um precursor da L-metionina, por exemplo, por fermentação bacteriana, nomeadamente mas não limitativamente fermentação de glucose (semelhante à Etapa 1 acima), Etapa 2': redução enzimática de DMDS em um reator R1 com formação in situ de mercaptano de metila e síntese conjunta enzimática da L- metionina no mesmo reator com o precursor obtido na Etapa 1', Etapa 3' (opcional): ciclo de reciclagem do hidrogênio e do mercaptano de metila no reator R1, ao nível da Etapa 2', e Etapa 4’: recuperação e eventualmente purificação da L-metionina formada (etapa e) acima).

[0052] Para a Etapa 1’, se encontrará o domínio das condições utilizáveis nos pedidos internacionais WO2008013432 e/ou WO2013029690.

[0053] Para a Etapa 2', as condições de operação são as seguintes.

[0054] A temperatura da reação está compreendida em um intervalo que vai de 10 °C a 50 °C, preferencialmente de 15 °C a 45 °C, preferencialmente ainda de 20 °C a 40 °C.

[0055] O pH da reação está vantajosamente compreendido entre 6 e 8, preferencialmente entre 6,2 e 7,5.

[0056] De modo preferencial, a pressão utilizada para a reação “one pot” pode ir de uma pressão reduzida relativamente à pressão atmosférica até vários bares (várias centenas de kPa), consoante os reagentes utilizados e o material utilizado. De forma preferencial, se utilizará uma pressão que vai desde a pressão atmosférica até 20 bares (2 MPa) e de forma ainda mais preferencial se trabalhará sob uma pressão que vai desde a pressão atmosférica até 3 bares (300 kPa).

[0057] A razão molar DMDS/precursor de L-metionina está compreendida entre 0,1 e 10, geralmente entre 0,5 e 5, e preferencialmente a razão molar é a estequiometria (razão molar = 0,5) mas pode ser superior se tal for benéfico para a cinética da reação.

[0058] Em uma ou outra das variantes do método de acordo com a invenção, ele pode ser executado em batelada ou continuamente, em um reator em vidro ou de metal consoante as condições de operação mantidas e os reagentes utilizados. De acordo com uma modalidade, o método da invenção é um método semicontínuo no qual o hidrogênio é adicionado à medida de seu consumo na reação.

[0059] Em uma ou outra das variantes do método de acordo com a invenção, a razão molar hidrogênio/DMDS ideal é a estequiometria (razão molar = 1) mas pode variar de 0,01 a 100 se o perito na técnica achar qualquer interesse nisso tal como uma adição em contínuo de hidrogênio, enquanto o DMDS é introduzido desde o início no reator. De forma preferencial esta razão molar é escolhida entre 1 e 20 globalmente sobre o conjunto da reação.

[0060] O hidrogênio que não for convertido pode ser reciclado da saída do reator para a entrada, até se esgotar totalmente. Se pode também considerar um ciclo com o hidrogênio e o mercaptano de metila, até que o hidrogênio tenha completamente convertido o DMDS. Nesta configuração, os gases na saída do reator R2 (ou do reator, no caso em que a reação é conduzida em “one pot”) contêm quase exclusivamente mercaptano de metila.

[0061] Os elementos presentes em quantidade catalítica na mistura preparada na etapa a) acima (aminoácido portador de um grupo tiol ou de um peptídeo com grupo tiol, ou ainda dissulfeto correspondente ao referido aminoácido ou ao referido peptídeo, enzima redutase, enzima desidrogenase, cofator (por exemplo NADPH)) estão facilmente acessíveis no mercado ou podem ser preparados segundo técnicas bem conhecidas do perito na técnica. Estes diferentes elementos podem se apresentar na forma sólida ou líquida e podem muito vantajosamente ser colocados em solução em água para serem utilizados no método da invenção. As enzimas utilizadas podem também ser enxertadas em suporte (caso das enzimas suportadas).

[0062] A solução aquosa de complexo enzimático compreendendo o aminoácido ou o peptídeo pode também ser reconstituída pelos métodos conhecidos do perito na técnica, por exemplo por permeabilização de células que contenham estes elementos. Esta solução aquosa da qual uma composição é dada no exemplo 1 seguinte pode ser utilizada nos teores em massa compreendidos entre 0,01% e 20% relativamente ao peso total do meio de reação. De forma preferencial se utilizará um teor compreendido entre 0,5% e 10%.

[0063] As concentrações em fosfato piridoxal e em enzima específica para o precursor de L-metionina preferenciais são aquelas que se podem encontrar nos pedidos internacionais WO2008013432 e/ou WO2013029690.

[0064] Se compreenderá melhor a invenção com os exemplos seguintes não limitativos relativamente ao escopo da invenção. Todos os ensaios apresentados abaixo foram realizados em condições anaeróbicas.

EXEMPLO 1: Método em 2 etapas sucessivas

[0065] Em um reator R1 contendo 150 mL de solução aquosa tamponada de pH 7,8, são introduzidos 10 mL de complexo enzimático com glutationa (Aldrich). A solução de complexo enzimático contém: 185 mg (0,6 mmol) de glutationa, 200 U de glutationa-redutase, 50 mg (0,06 mmol) de NADPH e 200 U de enzima hidrogênio- desidrogenase. O meio de reação é levado a 35 °C sob agitação mecânica. É efetuada uma primeira amostragem t = 0. Seguidamente, o dissulfeto de dimetila (9,4 g, 0,1 mol) é colocado em uma bureta e adicionado gota a gota no reator.

[0066] Ao mesmo tempo, um fluxo de hidrogênio de 4 L.h-1 (medido nas condições normais de temperatura e de pressão) é introduzido por borbulhamento no reator. A reação é efetuada à pressão atmosférica.

[0067] Uma análise em cromatografia gasosa dos gases que saem do reator mostra quase essencialmente a presença de hidrogênio e de mercaptano de metila (alguns vestígios de água). O DMDS e o hidrogênio (razão molar hidrogênio/DMDS no conjunto da reação = 10,7) são introduzidos em 6 horas e uma análise final em cromatografia gasosa do meio de reação confirma a ausência de mercaptano de metila que foi expulso do reator pelo hidrogênio em excesso. Estes gases de saída do reator R1 são enviados diretamente para o reator R2.

[0068] Em paralelo, no segundo reator R2 contendo 75 mL de tampão fosfato 0,1 mol.L-1 de pH 6,60, são introduzidos 5 g de O-acetil-L-homoserina (OAHS) (a O-acetil- L-homoserina foi sintetizada a partir de L-homoserina e de anidrido acético de acordo com Sadamu Nagai, “Synthesis of O-acetyl-L-homoserine”, Academic Press, (1971), vol.17, p. 423-424. A solução é levada a 35 °C sob agitação mecânica.

[0069] Antes de qualquer começo da reação, é feita uma amostragem (t = 0) de 1 mL do meio de reação. Uma solução de fosfato piridoxal (1 ;6 mmol, 0,4 g) e a enzima O-acetil-L-homoserina-sulfidrilase (0,6 g) são dissolvidos em 10 mL de água e depois adicionados no reator.

[0070] O mercaptano de metila é introduzido através da reação do reator R1 e vantajosamente empurrado pelo hidrogênio em excesso, ou então quando o hidrogênio está em estequiometria ou em subestequiometria relativamente ao DMDS, o mercaptano de metila é vantajosamente empurrado por uma corrente de gás inerte, por exemplo uma corrente de nitrogênio. A reação então começa. A formação de L- metionina e o desaparecimento da OAHS são seguidas por HPLC. Os gases de saída do reator R2 são capturados em uma solução aquosa de soda (hidróxido de sódio) a 20%. As análises mostram que a OAHS foi convertida em 42% em L-metionina e que o excesso de DMDS foi convertido em mercaptano de metila encontrado na captura de soda.

EXEMPLO 2: Método “one pot”

[0071] Em um reator contendo 150 mL de tampão fosfato 0,2 mol.L-1 de pH 7, são introduzidos 10 mL de complexo enzimático, 5 g (31 mmol) de O-acetil-L-homoserina (OAHS, a O-acetil-L-homoserina foi sintetizada a partir de L-homoserina e de anidrido acético de acordo com Sadamu Nagai, “Synthesis of O-acetyl-L-homoserine”, Academic Press, (1971), vol.17, p. 423-424). A solução do complexo enzimático contém: 185 mg (0,6 mmol) de glutationa, 200 U de glutationa-redutase, 50 mg (0,06 mmol) de NADPH, 200 U de enzima hidrogênio-desidrogenase, 0,4 g (1,6 mmol) de fosfato piridoxal e 0,6 g de O-acetil-L-homoserina-sulfidrilase.

[0072] O meio de reação é levado a 35 °C sob agitação mecânica. É efetuada uma primeira amostragem t = 0. Seguidamente, o dissulfeto de dimetila (3 g, 32 mmol) é colocado em uma bureta e adicionado gota a gota e é introduzido um débito de 4 litros/h de hidrogênio; então a reação começa. A reação é seguida por HPLC para ver o desaparecimento da OAHS e a formação da L-metionina. Ao fim de 6 horas, 12% da OAHS foram convertidos em L-metionina demonstrando a possibilidade de produzir L-metionina por um método “one-pot” a partir de um precursor de L-metionina, de DMDS e de hidrogênio.

EXEMPLO 3: Método “one pot”

[0073] Em um reator contendo 70 mL de tampão fosfato 0,1 mol.L-1 de pH 6,8, são introduzidos 10 mL de complexo enzimático, 5 g (31 mmol) de O-acetil-L-homoserina (OAHS, O-acetil-L-homoserina foi sintetizada a partir de L-homoserina e de anidrido acético de acordo com Sadamu Nagai, “Synthesis of O-acetyl-l-homoserine”, Academic Press, (1971), vol. 17, p. 423-424).

[0074] A solução do complexo enzimático contém: 200 mg de glutationa (0,65 mol), 500 U de glutationa redutase, 100 mg de NADPH (0,13 mol), 50 U de hidrogênio desidrogenase, 400 mg (1,6 mmol) de fosfato piridoxal, 2 g de O-acetil-L-homoserina bem como 0,6 g de O-acetil-L-homoserina-sulfidrilase.

[0075] A hidrogênio desidrogenase é obtida a partir de cultura de microorganismos (segundo Biller e col., “Fermentation Hyperthermophiler Mikroorganismen am Beispiel von Pyrococcus Furiosus”, Shaker Verlag, Maastricht/Herzogenrath, 2002) com o auxílio de técnicas bem conhecidas do perito na técnica.

[0076] O meio de reação é levado a 35 °C sob agitação mecânica e varredura de nitrogênio. É efetuada uma primeira amostragem a t = 0. Seguidamente, são adicionados 20 g (0,22 mol) de dissulfeto de dimetila com a ajuda de uma seringa. Ao mesmo tempo, 4 L.h-1 de hidrogênio (medidos nas condições normais de temperatura e de pressão) são introduzidos por borbulhamento no meio de reação. A reação então começada é efetuada à pressão atmosférica durante 18 horas. A reação é seguida por HPLC para ver o desaparecimento de OAHS e a formação de L-metionina. No final da reação, 27% de OAHS foram convertidos em L-metionina demonstrando a possibilidade de produzir L-metionina por um método “one-pot” a partir de um precursor de L-metionina, de DMDS e de hidrogênio.

Claims (14)

1. Método de preparação de L-metionina, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos as etapas de: a) preparação de uma mistura compreendendo: 1) dissulfeto de dimetila (DMDS), 2) uma quantidade catalítica de aminoácido portador de um grupo tiol ou de um peptídeo com grupo tiol, 3) uma quantidade catalítica de enzima que catalisa a reação de redução da ponte dissulfeto do referido aminoácido portador de um grupo tiol ou do referido peptídeo com grupo tiol, 4) hidrogênio, 5) uma quantidade catalítica de enzima que catalisa a reação de redução de hidrogênio, 6) uma quantidade catalítica de um cofator comum às duas enzimas do sistema catalítico (desidrogenase e redutase), b) condução da reação enzimática para formar o mercaptano de metila (CH3-SH), c) adição de um precursor da L-metionina e conversão do referido precursor com o mercaptano de metila formado na etapa b), e d) recuperação e eventualmente purificação da L-metionina formada.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos as etapas de: a’) preparação de uma mistura compreendendo: • dissulfeto de dimetila (DMDS), • uma quantidade catalítica de aminoácido portador de um grupo tiol ou de um peptídeo com grupo tiol, • uma quantidade catalítica de enzima redutase correspondente ao referido aminoácido portador de um grupo tiol ou ao referido peptídeo com grupo tiol, • uma quantidade catalítica de NADPH, b’) adição de hidrogênio, com uma quantidade catalítica de enzima hidrogênio desidrogenase, c’) condução da reação enzimática para formar o mercaptano de metila (CH3-SH), d’) conversão de um precursor da L-metionina com o mercaptano de metila formado na etapa c’), e e’) recuperação e eventualmente purificação da L-metionina formada.

3. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o mercaptano de metila é colocado diretamente em contato com um precursor de metionina.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que o aminoácido portador de grupo tiol ou o peptídeo portador de grupo tiol é escolhido entre a cisteína, a homocisteína, a glutationa e a tioredoxina.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que o precursor da L-metionina é escolhido entre a O-acetil-L-homoserina e a O-succinil-L-homoserina.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que o hidrogênio é adicionado por borbulhamento no meio de reação.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que compreende a preparação de mercaptano de metila por redução enzimática de DMDS, em seguida a reação do referido mercaptano de metila formado com um precursor de L-metionina para dar a L-metionina.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos as etapas seguintes: Etapa 1: preparação de um precursor da L-metionina, Etapa 2: redução enzimática do DMDS em um reator R1 com formação de mercaptano de metila e eventualmente de hidrogênio não convertido, saindo do referido reator R1, Etapa 3: síntese enzimática da L-metionina em um reator R2 com o precursor da Etapa 1 e o mercaptano de metila da Etapa 2, Etapa 4 (opcional): reciclagem de hidrogênio não convertido para a Etapa 2 e reciclagem do mercaptano de metila para a Etapa 2 ou Etapa 3, e Etapa 5: recuperação e eventualmente purificação da L-metionina formada.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 6, caracterizado pelo fato de que a síntese de mercaptano de metila a partir de DMDS e a síntese de L-metionina a partir do referido mercaptano de metila é realizada em um único e mesmo reator.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos as etapas seguintes: Etapa 1': preparação de um precursor da L-metionina, Etapa 2': redução enzimática de DMDS em um reator R1 com formação in situ de mercaptano de metila e síntese conjunta enzimática da L-metionina no mesmo reator com o precursor obtido na Etapa 1', Etapa 3' (opcional): ciclo de reciclagem do hidrogênio e do mercaptano de metila no reator R1, ao nível da Etapa 2', e Etapa 4': recuperação e eventualmente purificação da L-metionina formada.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que é executado em batelada ou contínuamente.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que a razão molar hidrogênio/DMDS ideal varia de 0,01 a 100, preferencialmente entre 1 e 20 no conjunto da reação.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que a razão molar DMDS/precursor de L-metionina está compreendida entre 0,1 e 10, geralmente entre 0,5 e 5, e preferencialmente a razão molar é a estequiometria (razão molar = 0,5).

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que a temperatura da reação está compreendida em um intervalo que vai de 10 °C a 50 °C, preferencialmente de 15 °C a 45 °C, preferencialmente ainda de 20 °C a 40 °C.