JP2018524014A - 融合遺伝子を捕捉するためのロックド核酸 - Google Patents

融合遺伝子を捕捉するためのロックド核酸 Download PDF

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Abstract

本明細書では、試料を、融合遺伝子の切断点を含むポリヌクレオチドについて濃縮するための方法であって、ａ）各プローブが、融合遺伝子に特異的にハイブリダイズするように構成されている、複数のポリヌクレオチドプローブを含むプローブセットであって、１つまたは複数の高い親和性のポリヌクレオチドプローブを含む（例えば、ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のロックド核酸ヌクレオチドを含む）プローブセットを、ポリヌクレオチドの混合物と、ハイブリダイゼーション条件下で接触させて、プローブ捕捉ポリヌクレオチドを生成するステップと、ｂ）混合物からプローブ捕捉ポリヌクレオチドを単離して、融合遺伝子の切断点断片を含むポリヌクレオチドが濃縮された試料を生成するステップとを含む方法を提供する。

Description

相互参照
本出願は、２０１５年７月２１日に出願された米国仮特許出願番号第６２／１９５，２８０号に基づく利益を主張しており、この仮特許出願は、全体が参考として本明細書中に援用される。
背景
遺伝子融合事象は、ゲノム中で少なくとも２つの遺伝子のそれまでは別個であった部分を一緒にする染色体再編成である。遺伝子融合事象の結果、がん融合遺伝子が生じる恐れがあり、この場合、２つまたはそれよりも多くの遺伝子の異常な並置が、融合タンパク質をコードする場合、または１つの遺伝子の調節エレメントが、がん遺伝子の異常な発現を駆動する場合がある。このようながん融合遺伝子を検出するのが、困難である場合がある。切断点断片が、切断点を含有しない断片と同じ程度でプローブにハイブリダイズする可能性は低い。したがって、切断点断片を濃縮するためのハイブリダイゼーションの方法は、効力を発揮しない恐れがある。
融合遺伝子は、がん細胞中に見出される体細胞突然変異の形態である。このような融合遺伝子を検出する能力は、がんを診断し、モニターするのに有用である。
がん中に見出されることが公知の融合遺伝子として、例えば、以下のもの：結腸がん中のＡＰＩＰ／ＳＬＣ１Ａ２、膵臓がん中のＡＴＧ７／ＲＡＦ１、星状細胞腫中のＢＣＬ６／ＲＡＦ１、慢性骨髄性白血病におけるＢＣＲ−ＡＢＬ、正中線癌（ｍｉｄｌｉｎｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）中のＢＲＤ４−ＮＵＴ、血管肉腫中のＣＥＰ８５Ｌ／ＲＯＳ１、乳がん中のＣＬＴＣ／ＶＭＰ１、肺がん中のＥＬＭ４−ＡＬＫ、メラノーマ中のＥＷＳＲ１／ＣＲＥＭ、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病におけるＦＡＭ１３３Ｂ／ＣＤＫ６、低悪性度の星状細胞腫中の（７ｑ３４における）ＫＩＡＡ１５４９−ＢＲＡＦ、粘液性類表皮癌中のＭＥＣＴ１−ＭＡＭＬ２、濾胞性甲状腺癌中のＰＡＸ８−ＰＰＡＲＧ、甲状腺乳頭癌中のＲＥＴ−ＮＴＲＫ１、乳がん中のＳＥＣ１６Ａ−ＮＯＴＣＨ１、低悪性度の星状細胞腫中の（３ｐ２５における）ＳＲＧＡＰ３−ＲＡＦ１、腎臓がん中のＴＦＥ３−ＴＦＥＢを挙げることができる。
切断点は、遺伝子融合に関与する遺伝子中の多くの異なる場所で生じ得る。このような切断点は、遺伝子のある特定の部分にクラスター化し得る。
遺伝子融合を検出する１つの方法は、ＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）による方法である。別の方法は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列決定による方法である。
要旨
本明細書では、がん融合遺伝子を検出し、特徴付けるために、切断点断片を濃縮する方法が必要であることが認識されている。
本開示は、融合遺伝子を検出する方法を提供し、これらの方法を使用して、疾患、例えばがんを検出することができる。本明細書では、疾患、例えばがんと関連がある場合がある融合遺伝子を検出し、特徴付ける等のために、切断点断片を濃縮するための方法を提供する。
ある態様では、本開示は、がんを有するかまたはがんを有することが疑われる対象に診断または治療の介入を提供するための方法であって、（ａ）対象からの無細胞核酸分子を含む生物学的試料を提供するステップと、（ｂ）プローブ捕捉ポリヌクレオチドを生成するのに十分なハイブリダイゼーション条件下で、生物学的試料からの無細胞核酸分子をプローブセットと接触させるステップであって、このプローブセットが複数のポリヌクレオチドプローブを含み、複数のポリヌクレオチドプローブのそれぞれが、（ｉ）融合遺伝子との配列相補性、および（ｉｉ）融合遺伝子と相補的な配列を有し、かつ未改変ヌクレオチドのみを含有するポリヌクレオチドより大きい、融合遺伝子に対する親和性を有する、ステップと、（ｃ）混合物からプローブ捕捉ポリヌクレオチドを単離して、融合遺伝子の切断点断片を含む単離ポリヌクレオチドが濃縮された試料を生成するステップと、（ｄ）単離ポリヌクレオチドを配列決定して、配列を生成するステップと、（ｅ）配列に基づいて、融合遺伝子の切断点を含むポリヌクレオチドを検出するステップと、（ｆ）切断点断片の検出に基づいて、診断または治療のための介入を提供するステップとを含む方法を提供する。
一部の実施形態では、複数のポリヌクレオチドプローブのそれぞれが、１つまたは複数のロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、複数のポリヌクレオチドプローブのそれぞれが、複数のＬＮＡヌクレオチドを含み、ＬＮＡヌクレオチドのうちの少なくとも２つが、３０ヌクレオチド以下の間隔を置いている。一部の実施形態では、ＬＮＡヌクレオチドのうちの少なくとも２つが、１５ヌクレオチド以下の間隔を置いている。
一部の実施形態では、複数のポリヌクレオチドプローブの少なくともサブセットのそれぞれのヌクレオチドのうちの少なくとも５０％が、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドである。一部の実施形態では、複数のポリヌクレオチドプローブの少なくともサブセットのそれぞれのヌクレオチドのうちの少なくとも７５％が、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドである。
一部の実施形態では、複数のポリヌクレオチドプローブのそれぞれが、融合遺伝子と相補的な配列を有し、かつ未改変ヌクレオチドのみを含有するポリヌクレオチドよりも少なくとも約１℃高い融解温度を有する。一部の実施形態では、融解温度が、少なくとも約１０℃より高い。
一部の実施形態では、複数のポリヌクレオチドプローブのそれぞれが、融合遺伝子と相補的な配列を有し、かつ未改変ヌクレオチドのみを含有するポリヌクレオチドよりも少なくとも約２％高い融解温度を有する。一部の実施形態では、融解温度が、少なくとも約１０％より高い。
一部の実施形態では、融合遺伝子が、がん融合遺伝子である。一部の実施形態では、複数のポリヌクレオチドプローブのそれぞれが、図２Ａ〜図２Ｂの融合遺伝子の対の遺伝子または図３から選択される２つもしくはそれよりも多くの遺伝子間の融合遺伝子との配列相補性を有する。一部の実施形態では、複数のポリヌクレオチドプローブのそれぞれが、融合遺伝子の切断点から５００ヌクレオチド以下で離れた切断点領域との配列相補性を有する。一部の実施形態では、複数のポリヌクレオチドプローブのそれぞれが、融合遺伝子中の切断点にわたる配列との配列相補性を有する。
一部の実施形態では、複数のポリヌクレオチドプローブのそれぞれが、約５００ヌクレオチド未満の長さを有する。一部の実施形態では、複数のポリヌクレオチドプローブのそれぞれが、約２０〜約２００ヌクレオチドの間の長さを有する。一部の実施形態では、複数のポリヌクレオチドプローブのそれぞれが、約８０〜約１６０ヌクレオチドの間の長さを有する。
一部の実施形態では、切断点断片のそれぞれが、約１４０〜１８０ヌクレオチドの間の長さを有する。
一部の実施形態では、複数のポリヌクレオチドプローブが、固体支持体にカップリングされている。一部の実施形態では、プローブセットが、１つまたは複数の天然のポリヌクレオチドプローブを含む。一部の実施形態では、複数のポリヌクレオチドプローブが、融合遺伝子中に含まれる核酸配列の切断点領域にハイブリダイズする少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブ、および融合遺伝子中に含まれる核酸配列の非切断点領域にハイブリダイズする少なくとも１つの天然のポリヌクレオチドプローブを含む。
一部の実施形態では、複数のポリヌクレオチドプローブのそれぞれが、融合遺伝子中に含まれる核酸配列の切断点領域の少なくとも５０％のカバレッジを提供する。
一部の実施形態では、ステップ（ｄ）が、単離ポリヌクレオチドに、明確に異なるバーコード配列を有するバーコードを含むタグを付着させ、タグ付き親ポリヌクレオチドを作り出すステップを含む。一部の実施形態では、この方法は、タグ付き親ポリヌクレオチドを増幅して、タグ付き子孫ポリヌクレオチドを生成するステップをさらに含む。
一部の実施形態では、この方法は、（ｉ）タグ付き子孫ポリヌクレオチドを配列決定して、配列リードを生成するステップであって、各配列リードが、バーコード配列と、単離ポリヌクレオチドのうちの所与の１つから誘導された配列とを含む、ステップと、（ｉｉ）少なくともバーコード配列に基づいて、配列リードをファミリーにグループ分けするステップとをさらに含む。
一部の実施形態では、この方法は、各ファミリー内でグループ分けされた配列リードを比較して、各ファミリーについてのコンセンサス配列を決定するステップであって、コンセンサス配列のそれぞれが、タグ付き親ポリヌクレオチド間で固有なポリヌクレオチドに対応する、ステップをさらに含む。
別の態様では、本開示は、融合遺伝子の切断点断片を捕捉するための方法であって、（ａ）融合遺伝子の切断点断片を含む無細胞核酸分子を含有するかまたは融合遺伝子の切断点断片を含む無細胞核酸分子を含有することが疑われる生物学的試料を提供するステップと、（ｂ）生物学的試料を、ポリヌクレオチドプローブと、（ｉ）ポリヌクレオチドプローブと切断点断片との間のハイブリダイゼーションを可能にして、混合物中にプローブ捕捉ポリヌクレオチドを提供するのに十分な条件であって、このポリヌクレオチドプローブが、切断点断片との配列相補性を有し；融合遺伝子と相補的な配列を有し、かつ未改変ヌクレオチドのみを含有するポリヌクレオチドより大きい、融合遺伝子に対する親和性を有する、条件、および（ｉｉ）混合物からのプローブ捕捉ポリヌクレオチドの濃縮または単離を可能にするのに十分な条件であって、ポリヌクレオチドプローブが、切断点断片との配列相補性を有する、条件下で接触させるステップとを含む方法を提供する。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプローブが、１つまたは複数のロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプローブが、複数のＬＮＡヌクレオチドを含み、ＬＮＡヌクレオチドのうちの少なくとも２つが、３０ヌクレオチド以下の間隔を置いている。一部の実施形態では、ＬＮＡヌクレオチドのうちの少なくとも２つが、１５ヌクレオチド以下の間隔を置いている。
本開示の別の態様は、複数のポリヌクレオチドプローブを含むプローブセットであって、ポリヌクレオチドプローブのそれぞれが、（ｉ）無細胞核酸分子の一部としての融合遺伝子との配列相補性、および（ｉｉ）融合遺伝子と相補的な配列を有し、かつ未改変ヌクレオチドのみを含有するポリヌクレオチドより大きい、融合遺伝子に対する親和性を有する、プローブセットを提供する。
一部の実施形態では、複数のポリヌクレオチドプローブのそれぞれが、１つまたは複数のロックド核酸ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、プローブセットが、１つまたは複数の天然のポリヌクレオチドプローブをさらに含む。一部の実施形態では、複数のポリヌクレオチドプローブのそれぞれが、融合遺伝子中に含まれる核酸配列の切断点領域にハイブリダイズする少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブ、および融合遺伝子中に含まれる核酸配列の非切断点領域にハイブリダイズする少なくとも１つの天然のポリヌクレオチドプローブを含む。
一部の実施形態では、複数のポリヌクレオチドプローブのそれぞれが、融合遺伝子中に含まれる核酸配列の切断点領域の少なくとも５０％のカバレッジを提供する。
一部の実施形態では、複数のポリヌクレオチドプローブが、融合遺伝子中の異なる遺伝子の一方または両方の部分にハイブリダイズする。
一部の実施形態では、プローブセットが、固体支持体をさらに含み、複数のポリヌクレオチドプローブが、固体支持体にカップリングされている。
一部の実施形態では、複数のポリヌクレオチドプローブのそれぞれが、融合遺伝子と相補的な配列を有し、未改変ヌクレオチドのみを含有するポリヌクレオチドよりも少なくとも約１℃高い融解温度を有する。一部の実施形態では、融解温度が、少なくとも約１０℃より高い。
一部の実施形態では、複数のポリヌクレオチドプローブのそれぞれが、融合遺伝子と相補的な配列を有し、かつ未改変ヌクレオチドのみを含有するポリヌクレオチドよりも少なくとも約２％高い融解温度を有する。一部の実施形態では、融解温度が、少なくとも約１０％より高い。
一部の実施形態では、融合遺伝子が、がん融合遺伝子である。
一部の実施形態では、複数のポリヌクレオチドプローブのそれぞれが、図２Ａ〜図２Ｂの融合遺伝子の対の遺伝子または図３から選択される２つもしくはそれよりも多くの遺伝子間の融合遺伝子との配列相補性を有する。
別の態様では、本明細書では、無細胞核酸分子中の融合遺伝子と関連がある核酸配列に特異的にハイブリダイズするように構成されている配列を含む、高い親和性のポリヌクレオチドを開示する。
別の態様では、本明細書にでは、融合遺伝子に特異的にハイブリダイズするように構成されている、高い親和性のポリヌクレオチドを開示する。一実施形態では、高い親和性のポリヌクレオチドが、１つまたは複数のロックド核酸ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、高い親和性のポリヌクレオチドが、天然のヌクレオチドのみを含む、同じ配列を有するポリヌクレオチドよりも少なくとも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、１０℃、１５℃または２０℃のいずれかだけ高い融解温度を有する。別の実施形態では、高い親和性のポリヌクレオチドが、天然のヌクレオチドのみを含む、同じ配列を有するポリヌクレオチドよりも少なくとも２％、４％、６％、８％または１０％のいずれかだけ高い融解温度を有する。別の実施形態では、高い親和性のポリヌクレオチドが、がん融合遺伝子に特異的にハイブリダイズするように構成されている。別の実施形態では、高い親和性のポリヌクレオチドが、図２Ａ〜図２Ｂの融合遺伝子の対の遺伝子または図３から選択される少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個もしくはそれよりも多くのいずれかの数の遺伝子間の融合遺伝子に特異的にハイブリダイズするように構成されている。別の実施形態では、高い親和性のポリヌクレオチドが、融合遺伝子の切断点から５００ヌクレオチド以下で離れた切断点領域内でハイブリダイズするように構成されている。別の実施形態では、高い親和性のポリヌクレオチドが、融合遺伝子中の切断点にわたりハイブリダイズするように構成されている。別の実施形態では、高い親和性のポリヌクレオチドが、約５００ヌクレオチド未満の長さ、約２０〜約２００ヌクレオチドの間の長さ、または約８０〜約１６０ヌクレオチドの間の長さを有する。別の実施形態では、高い親和性のポリヌクレオチドが、複数のロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドを含み、ＬＮＡヌクレオチドのうちの少なくとも２つが、３０、２０、１５、１０または５ヌクレオチド以下の間隔を置いている。別の実施形態では、ポリヌクレオチド中の１００％の、あるいは少なくとも９０％、７５％、５０％、２０％、１０％または５％もしくは１％のいずれかの％のヌクレオチドが、ロックド核酸ヌクレオチドである。別の実施形態では、高い親和性のポリヌクレオチドが、融合遺伝子のヌクレオチド配列に完全または実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する。
別の態様では、本開示は、融合遺伝子に特異的にハイブリダイズするように構成されている、高い親和性のポリヌクレオチドを含む、高い親和性のポリヌクレオチドプローブを提供する。一実施形態では、高い親和性のポリヌクレオチドが、１つまたは複数のロックド核酸ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、プローブが、検出可能な標識、結合性部分または固体支持体から選択される機能性を含む。別の実施形態では、プローブが、融合遺伝子の切断点断片にハイブリダイズするように構成されている。別の実施形態では、切断点断片が、約１４０〜約１８０ヌクレオチドの間の長さを有する。別の実施形態では、この断片が、無細胞デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはゲノムＤＮＡである。別の実施形態では、高い親和性のポリヌクレオチドが、固体支持体に結合している。
別の態様では、本開示は、複数のポリヌクレオチドプローブを含むプローブセットであって、各プローブが、融合遺伝子に特異的にハイブリダイズするように構成されており、１つまたは複数の高い親和性のポリヌクレオチドプローブを含む、プローブセットを提供する。一実施形態では、高い親和性のポリヌクレオチドが、１つまたは複数のロックド核酸ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、このセットが、１つまたは複数の天然のポリヌクレオチドプローブを含む。別の実施形態では、プローブセットが、融合遺伝子に関与する遺伝子の切断点領域に特異的にハイブリダイズする、少なくとも１つの高い親和性のポリヌクレオチドプローブ、および融合遺伝子に関与する遺伝子の非切断点領域にハイブリダイズする、少なくとも１つの天然のポリヌクレオチドプローブを含む。別の実施形態では、プローブセット中の１つまたは複数の高い親和性のポリヌクレオチドプローブが、融合遺伝子に関与する遺伝子の切断点領域の少なくとも５０％（例えば、少なくとも０．５×〜５×）のカバレッジを提供する。別の実施形態では、プローブが、融合遺伝子中の異なる遺伝子の一方または両方の部分にハイブリダイズする。別の実施形態では、プローブセットが、オリゴヌクレオチドのチップとして構成されている。別の実施形態では、標的配列が、高い親和性のポリヌクレオチドプローブおよび標準的な親和性のポリヌクレオチドプローブの両方により標的にされる。
別の態様では、本開示は、複数のプローブセットを含むキットであって、各プローブセットが、異なる遺伝子に特異的にハイブリダイズし、プローブセットのうちの少なくとも１つが、本開示のプローブセットである、キットを提供する。一実施形態では、高い親和性のポリヌクレオチドが、１つまたは複数のロックド核酸ヌクレオチドを含む。
別の態様では、本開示は、融合遺伝子の切断点断片を捕捉するための方法であって、切断点断片を、高い親和性のポリヌクレオチドプローブと、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で接触させるステップと、ハイブリダイゼーションさせるステップとを含み、ポリヌクレオチドプローブが、固体支持体に結合しており、ポリヌクレオチドプローブが、切断点断片のヌクレオチド配列に実質的または完全に相補的であるヌクレオチド配列を有する、方法を提供する。一実施形態では、高い親和性のポリヌクレオチドが、１つまたは複数のロックド核酸ヌクレオチドを含む。
別の態様では、本開示は、試料を、融合遺伝子の切断点を含むポリヌクレオチドについて濃縮するための方法であって、ａ）ハイブリダイゼーション条件下で、請求項２０に記載のプローブセットをポリヌクレオチドの混合物と接触させて、プローブ捕捉ポリヌクレオチドを生成するステップと、ｂ）混合物からプローブ捕捉ポリヌクレオチドを単離して、融合遺伝子の切断点断片を含むポリヌクレオチドが濃縮された試料を生成するステップとを含む方法を提供する。一実施形態では、高い親和性のポリヌクレオチドが、１つまたは複数のロックド核酸ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ポリヌクレオチドが、無細胞ＤＮＡまたは断片化されたゲノムＤＮＡを含む。別の実施形態では、この方法は、プローブから捕捉ポリヌクレオチドを単離するステップをさらに含む。別の実施形態では、この方法は、単離ポリヌクレオチドを配列決定するステップをさらに含む。
別の態様では、本開示は、対象におけるがんを診断する方法であって、ａ）対象からのポリヌクレオチドを含む試料を提供するステップと、ｂ）ハイブリダイゼーション条件下で、試料からの無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を請求項２０に記載のプローブセットと、接触させて、プローブ捕捉ポリヌクレオチドを生成するステップと、ｃ）混合物からプローブ捕捉ポリヌクレオチドを単離して、融合遺伝子の切断点断片を含むポリヌクレオチドが濃縮された試料を生成するステップと、ｄ）単離ポリヌクレオチドを配列決定して、配列を生成するステップと、ｅ）配列に基づいて、融合遺伝子の切断点を含むポリヌクレオチドを検出するステップと、ｆ）切断点断片の検出に基づいて、がんを診断するステップとを含む方法を提供する。一実施形態では、高い親和性のポリヌクレオチドが、１つまたは複数のロックド核酸ヌクレオチドを含む。
本開示の別の態様は、１つまたは複数のコンピュータプロセッサにより実行されると、上記または本明細書の他の箇所の方法のうちのいずれかを実行する、機械により実行可能なコードを含む非一時的なコンピュータ可読媒体を提供する。
本開示の別の態様は、１つまたは複数のコンピュータプロセッサ、およびそれらにカップリングされた非一時的なコンピュータ可読媒体を含むシステムを提供する。非一時的なコンピュータ可読媒体が、１つまたは複数のコンピュータプロセッサにより実行されると、上記または本明細書の他の箇所の方法のうちのいずれかを実行する、機械により実行可能なコードを含む。
本開示の追加の態様および利点が、以下の詳細な説明から当業者に容易に明らかになるであろうが、ここでは、本開示の例示的な実施形態を示し、記載するに過ぎない。本開示のその他のおよび異なる実施形態が可能であり、本開示のいくつかの詳細から、多様な明らかな点において、改変形態が可能になり、それらは全て、本開示から逸脱しないことが理解されるであろう。したがって、図面および説明は、本質的に例証のためであり、制限するためではないとみなすべきである。
参照による組込み
本明細書で言及する刊行物、特許および特許出願は全て、あたかもそれぞれ個々の刊行物、特許または特許出願が参照により組み込まれていることが具体的かつ個々に示されているかのごとく、参照により本明細書に組み込まれている。
添付の特許請求の範囲において、本発明の新規の特徴が入念に記載されている。本発明の原理を利用する例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明および付随する図面（本明細書では「図（Ｆｉｇｕｒｅ）」および「図（ＦＩＧ）」とも記載される）を参照することによって、本発明の特徴および利点がより良好に理解されるであろう。
図１は、融合遺伝子に由来する切断点断片、および標準的なプローブ捕捉プロトコールにおけるこのような断片の喪失を示す。
図２Ａは、がん融合遺伝子の対のリストを提供する。図２Ｂは、がん融合遺伝子の対の別のリストを提供する。 図２Ａは、がん融合遺伝子の対のリストを提供する。図２Ｂは、がん融合遺伝子の対の別のリストを提供する。 図２Ａは、がん融合遺伝子の対のリストを提供する。図２Ｂは、がん融合遺伝子の対の別のリストを提供する。 図２Ａは、がん融合遺伝子の対のリストを提供する。図２Ｂは、がん融合遺伝子の対の別のリストを提供する。 図２Ａは、がん融合遺伝子の対のリストを提供する。図２Ｂは、がん融合遺伝子の対の別のリストを提供する。 図２Ａは、がん融合遺伝子の対のリストを提供する。図２Ｂは、がん融合遺伝子の対の別のリストを提供する。 図２Ａは、がん融合遺伝子の対のリストを提供する。図２Ｂは、がん融合遺伝子の対の別のリストを提供する。 図２Ａは、がん融合遺伝子の対のリストを提供する。図２Ｂは、がん融合遺伝子の対の別のリストを提供する。 図２Ａは、がん融合遺伝子の対のリストを提供する。図２Ｂは、がん融合遺伝子の対の別のリストを提供する。
図３は、がん融合遺伝子中で検出される遺伝子のリストを提供する。 図３は、がん融合遺伝子中で検出される遺伝子のリストを提供する。 図３は、がん融合遺伝子中で検出される遺伝子のリストを提供する。 図３は、がん融合遺伝子中で検出される遺伝子のリストを提供する。 図３は、がん融合遺伝子中で検出される遺伝子のリストを提供する。 図３は、がん融合遺伝子中で検出される遺伝子のリストを提供する。 図３は、がん融合遺伝子中で検出される遺伝子のリストを提供する。 図３は、がん融合遺伝子中で検出される遺伝子のリストを提供する。 図３は、がん融合遺伝子中で検出される遺伝子のリストを提供する。
図４Ａ〜図４Ｕは、がん融合遺伝子の対についての例示的な切断点を提供する。 図４Ａ〜図４Ｕは、がん融合遺伝子の対についての例示的な切断点を提供する。 図４Ａ〜図４Ｕは、がん融合遺伝子の対についての例示的な切断点を提供する。 図４Ａ〜図４Ｕは、がん融合遺伝子の対についての例示的な切断点を提供する。 図４Ａ〜図４Ｕは、がん融合遺伝子の対についての例示的な切断点を提供する。 図４Ａ〜図４Ｕは、がん融合遺伝子の対についての例示的な切断点を提供する。 図４Ａ〜図４Ｕは、がん融合遺伝子の対についての例示的な切断点を提供する。 図４Ａ〜図４Ｕは、がん融合遺伝子の対についての例示的な切断点を提供する。 図４Ａ〜図４Ｕは、がん融合遺伝子の対についての例示的な切断点を提供する。 図４Ａ〜図４Ｕは、がん融合遺伝子の対についての例示的な切断点を提供する。 図４Ａ〜図４Ｕは、がん融合遺伝子の対についての例示的な切断点を提供する。 図４Ａ〜図４Ｕは、がん融合遺伝子の対についての例示的な切断点を提供する。 図４Ａ〜図４Ｕは、がん融合遺伝子の対についての例示的な切断点を提供する。 図４Ａ〜図４Ｕは、がん融合遺伝子の対についての例示的な切断点を提供する。 図４Ａ〜図４Ｕは、がん融合遺伝子の対についての例示的な切断点を提供する。 図４Ａ〜図４Ｕは、がん融合遺伝子の対についての例示的な切断点を提供する。 図４Ａ〜図４Ｕは、がん融合遺伝子の対についての例示的な切断点を提供する。 図４Ａ〜図４Ｕは、がん融合遺伝子の対についての例示的な切断点を提供する。 図４Ａ〜図４Ｕは、がん融合遺伝子の対についての例示的な切断点を提供する。 図４Ａ〜図４Ｕは、がん融合遺伝子の対についての例示的な切断点を提供する。 図４Ａ〜図４Ｕは、がん融合遺伝子の対についての例示的な切断点を提供する。 図４Ａ〜図４Ｕは、がん融合遺伝子の対についての例示的な切断点を提供する。
図５Ａおよび図５Ｂは、プローブおよび／またはポリヌクレオチドについての種々のカバレッジ深度およびタイル化を示す。
図６Ａ〜図６Ｄは、高い親和性のプローブ配列のサブセットと標準的な親和性のプローブ配列のサブセットとの種々の例示的な混合物を示す。
図７は、遺伝子再編成に関与する４つの遺伝子、すなわち、ＡＬＫ、ＮＫＲＴ１、ＲＥＴおよびＲＯＳ１を含む、６４個の遺伝子のパネルを示す。
図８は、より深いカバレッジのために標的にできるＡＬＫ遺伝子の８つのゲノム領域を示す。
図９は、本明細書で提供する方法を実行するようにプログラムされているか、またはそれ以外の方法で構成されているコンピュータ制御システムを示す。
詳細な説明
本明細書では、本発明の多様な実施形態を示し、記載しているが、このような実施形態は、例として提供されているに過ぎないことが当業者には明らかである。当業者であれば、多数の変更形態、変化形態および置換形態を、本発明から逸脱することなく思い付くことができる。本明細書に記載する本発明の実施形態に対する多様な代替形態を利用することができることを理解すべきである。
Ｉ．定義
「高い親和性のポリヌクレオチド」は、本明細書で使用する場合、少なくとも１つの化学的改変を含むポリヌクレオチドを指し、こうした化学的改変は、ハイブリダイゼーション反応において、ポリヌクレオチドに、そのようには改変されていない同じ配列のポリヌクレオチドと比較して、より高い融解温度をもたらす。実施形態では、より高い融解温度は、少なくとも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、１０℃、１５℃または２０℃のいずれかだけより高い温度であり得る。ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のヌクレオチド類似体、すなわち、ＬＮＡヌクレオチドを含むことができる。
「ロックド核酸」（「ＬＮＡ」）（時には、「アクセス不能なＲＮＡ（ｉｎａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ ＲＮＡ）」と呼ばれている）は、本明細書で使用する場合、少なくとも１つのロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドを含む、高い親和性のポリヌクレオチドを指す。
「ロックド核酸ヌクレオチド」（「ＬＮＡヌクレオチド」）は、本明細書で使用する場合、改変ＲＮＡヌクレオチドを指し、こうした改変ＲＮＡヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションの間に、ポリヌクレオチドに、改変ＲＮＡヌクレオチドの代わりに天然のリボヌクレオチドを有することによってだけＬＮＡとは異なるポリヌクレオチドと比較した場合、より高い熱力学的安定性をもたらす。ある特定の実施形態では、改変ＲＮＡヌクレオチドのリボース部分を、２’酸素と４’炭素とを接続する余分な架橋を用いて改変する。
ＬＮＡヌクレオチドは、ＲＮＡの２’Ｏと４’Ｃとの間に、ＬＮＡとその相補体との間の二重鎖の熱力学的安定性を増加させる、任意のタイプの余分な架橋を含むことができる。場合によっては、ＢＮＡにおいて、２’酸素と４’炭素とを、メチレン基により架橋させる。場合によっては、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）において、２’酸素と４’炭素とを、エチレン基により架橋させる。ＢＮＡのその他の例として、これらに限定されないが、２’，４’−ＢＮＡＮＣ［ＮＨ］、２’，４’−ＢＮＡＮＣ［ＮＭｅ］、および２’，４’−ＢＮＡＮＣ［ＮＢｎ］を挙げることができる。
「架橋核酸」（「ＢＮＡ」）は、２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン改変核酸を指す。
同様に、その他の２’Ｏ改変ヌクレオチド、例えば２’Ｏ−Ｍｅも、より高い安定性を示す。
「融合遺伝子」は、本明細書で使用する場合、ゲノム中の少なくとも２つの異なる遺伝子のそれまでは別個であった部分を一緒にする染色体再編成（反転、欠失、トランスロケーション）の結果生じる遺伝子を指す。
「がん融合遺伝子」は、本明細書で使用する場合、がん細胞中の体細胞突然変異の結果生じる融合遺伝子を指す。
「切断点」は、本明細書で使用する場合、そこで２つの異なる遺伝子の部分が融合する、融合遺伝子中のヌクレオチドの位置を指す。
「切断点領域」は、本明細書で使用する場合、そこで切断点が生じ得る、遺伝子融合に関与することができる遺伝子の領域を指す。
融合遺伝子の「切断点断片」は、本明細書で使用する場合、融合遺伝子を作り上げる２つの異なる遺伝子に由来する配列を含む、融合遺伝子の断片を指す。
「プローブ」は、本明細書で使用する場合、機能性を含むポリヌクレオチドを指す。機能性は、検出可能な標識（蛍光）、結合性部分（ビオチン）、または固体支持体（磁気的に引き付ける粒子、もしくはチップ）であり得る。
「天然のポリヌクレオチド」または「天然のオリゴヌクレオチド」は、本明細書で使用する場合、プローブ中のヌクレオチドの全部が天然のヌクレオチドであるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを指す。
「相補性」は、核酸が、別の核酸配列と、従来のワトソン−クリック型またはその他の従来とは異なる型のいずれかにより、水素結合を形成する能力を指す。パーセント相補性は、第２の核酸配列と、水素結合を形成すること（ワトソン−クリック塩基対形成）ができる、核酸分子中の残基のパーセンテージを示す（１０個の残基のうちの５、６、７、８、９、１０個が水素結合を形成する場合はそれぞれ、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％および１００％相補的である）。「完全に相補的」は、核酸配列の連続する残基が全部、第２の核酸配列中の同じ数の連続する残基と水素結合することを意味する。
「実質的に相補的」は、本明細書で使用する場合、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０個もしくはそれよりも多くのヌクレオチドの領域にわたる少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％のいずれかである相補性の程度を指すか、またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸を指す。配列同一性、例えばパーセント相補性を評価するための配列同一性は、任意の適切な整列アルゴリズムにより測定することができ、それらとして、これらに限定されないが、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈのアルゴリズム（例えば、任意選択で、デフォルト設定を用いる、ｗｏｒｌｄ ｗｉｄｅ ｗｅｂサイト：ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．ｈｔｍｌにおいて入手可能なＥＭＢＯＳＳのＮｅｅｄｌｅアライナーを参照されたい）、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（例えば、任意選択で、デフォルト設定を用いる、ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉにおいて入手可能なＢＬＡＳＴ整列ツールを参照されたい）、またはＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（例えば、任意選択で、デフォルト設定を用いる、ｗｏｒｌｄ ｗｉｄｅ ｗｅｂサイト：ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｗａｔｅｒ／ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．ｈｔｍｌにおいて入手可能なＥＭＢＯＳＳのＷａｔｅｒアライナーを参照されたい）が挙げられる。デフォルトパラメータを含めた、選ばれたアルゴリズムの任意の適切なパラメータを使用して、最適な整列を評価することができる。
「ハイブリダイゼーション」は、１つまたは複数のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化する複合体を形成する反応を指す。塩基の相補性に従うワトソンクリック塩基対形成、フーグスティーン結合または任意のその他の配列に特異的な様式により、水素結合が生じ得る。複合体は、二重鎖構造を形成する２つの鎖、複数鎖複合体を形成する３つもしくはそれよりも多くの鎖、単一の自己ハイブリダイズする鎖、またはこれらの任意の組合せを含むことができる。ハイブリダイゼーション反応は、より広範なプロセスにおけるステップ、例えばＰＣＲの開始、またはポリヌクレオチドのエンドヌクレアーゼによる酵素切断の構成要素となり得る。第１の配列に相補的である第２の配列を、第１の配列の「相補体」と呼ぶ。用語「ハイブリダイズ可能な」は、ポリヌクレオチドに適用する場合、ポリヌクレオチドが、ハイブリダイゼーション反応において、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化する複合体を形成する能力を指す。
「特異的にハイブリダイズする」または「特異的にハイブリダイズすること」または「特異的なハイブリダイゼーション」は、５０％のホルムアミド、５×のＳＳＣおよび１％のＳＤＳにて４２℃で、または５×のＳＳＣおよび１％のＳＤＳにて６５℃でインキュベートして、０．２×のＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳ中、６５℃で洗浄する条件下で、２つのポリヌクレオチド間で安定な二重鎖を形成することを指す。
用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ポリヌクレオチドが、その標的サブ配列に優先的にハイブリダイズし、その他の配列には、より低い程度でハイブリダイズするかまたは全くハイブリダイズしない条件を指す。核酸のハイブリダイゼーションの実験の文脈における「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、配列依存性であり、異なる環境パラメータ下では異なる。Tijssen（１９９３年）Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes、第１部第２章、「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleicacid probe assays」、Elsevier、NewYorkに、核酸のハイブリダイゼーションに対する広範なガイドが見出される。
一般に、極めてストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、熱融解点（Ｔｍ）が、定義されたイオン強度およびｐＨにおける特異的な配列についてのＴｍよりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、（定義されたイオン強度およびｐＨ下で）標的配列のうちの５０％が、完全に一致するプローブにハイブリダイズする温度である。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブについてのＴｍに等しくなるように選択される。
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、水、緩衝液（ｐＨ６〜９またはｐＨ７〜８のリン酸、トリス、ＳＳＰＥまたはＳＳＣ緩衝液）、塩（ナトリウムまたはカリウム）、および変性剤（ＳＤＳ、ホルムアミドまたはｔｗｅｅｎ）を含む緩衝液、ならびに３７℃〜７０℃、６０℃〜６５℃の温度を含む。
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、１００個よりも多くの相補的な残基を有する相補的な核酸のハイブリダイゼーションを、サザンブロットまたはノーザンブロットにおけるフィルター上で行う場合、１ｍｇのヘパリンを有する５０％ホルマリン、４２℃におけるハイブリダイゼーションの一晩の実施である。極めてストリンジェントな洗浄条件の例は、０．１５ＭのＮａＣｌ、７２℃、約１５分間である。ストリンジェントな洗浄条件の例は、０．２×のＳＳＣによる６５℃での１５分間の洗浄である（ＳＳＣ緩衝液の説明については、Sambrookらを参照されたい）。しばしば、バックグランドのプローブのシグナルを除去するために、低いストリンジェンシーの洗浄が、高いストリンジェンシーの洗浄に先行する。１００個よりも多くのヌクレオチドの二重鎖のための中程度のストリンジェンシーの洗浄の例は、１×のＳＳＣ、４５℃、１５分間である。例えば、１００個よりも多くのヌクレオチドの二重鎖のための低いストリンジェンシーの洗浄の例は、４〜６×のＳＳＣ、４０℃、１５分間である。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて、ノイズに対するシグナルの比が、無関係のプローブについて観察される比よりも２×（またはそれよりも）高い場合に、特異的なハイブリダイゼーションの検出であることが示される。
ＩＩ．概説
本明細書では、１つまたは複数の融合遺伝子を含むポリヌクレオチドを検出するための組成物および方法を提供する。ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）であり得る。本明細書で提供する組成物および方法は、不均一なポリヌクレオチドの試料、例えば無細胞ＤＮＡ（「ｃｆＤＮＡ」）中の融合遺伝子を、高い感度で検出することができる。
がん細胞を含めた、細胞に由来するＤＮＡは、血液中に無細胞ＤＮＡの形態で排出され得る。無細胞ＤＮＡは平均して、約１６０ヌクレオチドの長さを有する。いずれのゲノムの遺伝子座についても、断片化はあらかじめ特定される点において生じるわけではないので、試料中に、遺伝子座にわたってタイル化する断片が存在し得る。
がんにおいて、ある特定の遺伝子は、一般に、その他の遺伝子との遺伝子融合に関与する。例えば、がんにおいては、ＥＭＬ４遺伝子およびＡＬＫ遺伝子が一般に、遺伝子融合を相互に受ける。融合に関与する各遺伝子の切断点が、それぞれの遺伝子中の切断点領域（「ホットスポット」）に存在し得る。これらの融合遺伝子を含有する細胞が死滅すると、それらのＤＮＡが、血液中にｃｆＤＮＡの形態で排出される。図１に示すように、切断点にマッピングされる断片中の位置は、断片中のどこか、すなわち、５’末端付近、中央、または３’末端付近で生じ得る。したがって、ｃｆＤＮＡポリヌクレオチドは、融合に関与するいずれかの遺伝子に由来する非常に短いヌクレオチド配列または非常に長いヌクレオチド配列を有し得る。
ある特定のＤＮＡ配列決定方法は、配列の捕捉を使用して、目的の配列について濃縮する。典型的には、配列の捕捉に、目的の配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブの使用が関与する。プローブセットの戦略には、目的の領域にわたってプローブをタイル化することが関与し得る。このようなプローブは、約１２０塩基長であり得る。プローブセットは、約２×の深度を有し得る。配列の捕捉の有効性は、プローブの配列に相補的（またはほぼ相補的）である標的分子中の配列の長さに一部依存する。
しかし、融合遺伝子の場合、切断点にマッピングされるポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションおよび捕捉にとって最適な配列よりも短い、標的遺伝子に由来する配列を含有し得る。例えば、ＡＬＫ−ＥＭＬ４の融合に関与する融合体にマッピングされるｃｆＤＮＡ断片は、例えば、ＡＬＫ遺伝子の１５０ヌクレオチドの配列、１００ヌクレオチドの配列、５０ヌクレオチドの配列、２５ヌクレオチドの配列または１０ヌクレオチドの配列を有し得る。この場合、ｃｆＤＮＡ断片が、より短いＡＬＫ配列を有するならば、ポリヌクレオチドを捕捉する確率は、ＡＬＫのプローブに完全に相補的な配列を有するポリヌクレオチドを捕捉する確率よりも低い。配列の捕捉が、多くの異なる遺伝子に由来する配列を標的化するマルチプレックスである場合には、この問題はより深刻である。
本明細書では、融合遺伝子中の切断点にマッピングされるポリヌクレオチド断片を捕捉するための材料および方法を提供する。このようなポリヌクレオチドを、高い親和性のポリヌクレオチドプローブ、すなわち、このようなロックド核酸を使用して捕捉する。このようなプローブは、天然のヌクレオチドから作製された、同じ配列のプローブよりも高い融解温度を有する。結果として、それらは、同じ試料から、より高い収率の捕捉産物を生成する。
このようなプローブを、融合遺伝子および非融合遺伝子の両方を標的化するプローブセット中に含めることができる。このようにして、天然のヌクレオチドから作製されたプローブのみを使用して捕捉した集団と比較して、捕捉ポリヌクレオチドは、融合遺伝子を含むヌクレオチドが濃縮されている。
例示的なプローブセットは、例えば、ＬＮＡプローブのサブセットを含有することができる。ＬＮＡプローブを、融合遺伝子に関与する遺伝子の切断点領域にわたってタイル化するように構成することができる。
ＬＮＡプローブ中の全てのヌクレオチドが、ＬＮＡヌクレオチドであり得る。代わって、ヌクレオチドの一部が、ＬＮＡヌクレオチドであってもよい。ある特定の実施形態では、ＬＮＡヌクレオチドは、間隔を置いて離れた所定の数のヌクレオチドであり得る。
本発明は、核酸断片を含有する試料を、遺伝子融合事象を含有する核酸断片について濃縮するために使用することができる、高い親和性のポリヌクレオチドを提供する。これらの高い親和性のポリヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチドを含有することができる。標準的なヌクレオチドをＬＮＡヌクレオチドで置換することによって、高い親和性のポリヌクレオチドの融解温度を増加させ、それにより、高い親和性のポリヌクレオチドと融合遺伝子を含有する核酸断片との間の二重鎖の安定性を増加させることができる。
遺伝子融合は、健常細胞からの新生物（腫瘍または腺腫）の発生と関連があり、場合によっては、それに寄与する恐れもある。これらの遺伝子融合事象の検出は、患者中の新生物の存在を検出および／またはモニターするのに有用なアプローチを提供することができる。しかし、切断点断片は、遺伝子のうちの一方だけに由来する配列を含む、類似の長さの核酸断片よりも、切断点の端部にあるいずれかの遺伝子から誘導された、少ない配列を有している。このために、しばしば、切断点断片は、遺伝子プローブまたは遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドのうちのより小さなセクションに結合することのみが可能である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件が、完全長またはほぼ完全長の結合について最適化されている場合には、切断点を含有する核酸断片は、不十分な親和性でハイブリダイズする場合があり、この断片を失う恐れがある（図１を参照されたい）。さらに、遺伝子融合事象を受けている細胞および遺伝子融合事象を受けていない細胞に由来する核酸断片を含有する不均一な試料においては、遺伝子融合事象を受けていない細胞に由来する核酸断片は、遺伝子プローブまたは遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドにより安定に結合し、切断点を含有する核酸断片のハイブリダイゼーションを競合的に阻害することもできる。
腫瘍に由来する核酸を、無細胞体液中に見出すことができる。新生物を検出するために、このような無細胞体液から得られた、腫瘍に由来する核酸を、融合遺伝子を含有する核酸断片についてアッセイすることができる。無細胞体液が、少量の腫瘍に由来する核酸を含有する恐れがあり、腫瘍に由来する核酸は、健常組織に由来する核酸と混成になっている場合がある。本開示はまた、無細胞体液に由来する核酸から得られる融合遺伝子を含有する核酸断片について濃縮するためのアプローチも提供する。
ＩＩＩ．試験試料
Ａ．対象のタイプ
対象、例えば、がんを発症するリスクを有する患者から、試料を収集する。対象は、がんについての公知のリスク因子を有さない患者であり得る。対象は、がんについてのリスク因子が唯一、年齢および／または性別である患者であり得る。場合によっては、対象は、がんについての公知のリスク因子、例えば、喫煙またはがんの家族の病歴を有することもある。場合によっては、対象は、がんの症状を示す患者であることもある。
その他の対象は、大腸内視鏡検査または画像診断により、これまでに検出されている新生物を有する患者であり得る。治療コースまたは療法を推奨するために、これまでに検出された新生物を有する患者に由来する試料を、切断点を含有する核酸断片についてアッセイすることができる。患者が受けている治療または療法の有効性を決定するために、新生物を有する患者に由来する試料を、切断点を含有する核酸断片についてアッセイすることができる。
その他の対象は、新生物を有し、それがこれまでに検出されたことがあるが、新生物は最早検出可能でない患者（小康状態のまたは疾患の証拠を有さない患者）であり得る。新生物の再発または再出現を検出するために、新生物が最早検出可能でない患者に由来する試料を、切断点を含有する核酸断片についてアッセイすることができる。
その他の対象は、がんの家族歴を有する女性であり得、この場合、家族性のがんに関与する遺伝子の欠陥が、融合遺伝子であることが公知であるかまたは疑われる。場合によっては、がんの家族の病歴を有する女性は、妊娠中であり、体内の胎児が融合遺伝子を有するかどうか決定することを望むこともある。場合によっては、このような対象から得られる胎児核酸を含有する試料を、遺伝子融合事象についてアッセイこともできる。
Ｂ．試料のタイプ
試料は、多様な供給源から抽出された核酸であり得る。核酸は、これらに限定されないが、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、胎児ＤＮＡおよびｍｉＲＮＡであり得る。
試料を、無細胞核酸を含有する多様な体液から抽出することができ、それらとして、これらに限定されないが、血液、血清、血漿、硝子体、痰、尿、涙液、汗、唾液、精液、粘膜排泄物、粘液、脊髄液、羊水、リンパ液等が挙げられる。体液の収集は、多様な技法を使用して達成することができる。場合によっては、収集は、シリンジを使用する、対象からの体液の吸引を含むこともできる。その他の場合には、収集は、ピペッティングするかまたは直接収集して、液体を収集槽中に得ることを含むことがある。
体液の収集の後に、多様な技法を使用して、無細胞核酸を単離および抽出することができる。場合によっては、市販されているキット、例えばＱｉａｇｅｎ Ｑｉａｍｐ（登録商標）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄキットのプロトコールを使用して、無細胞核酸を、単離、抽出および調製することもできる。その他の例では、Ｑｉａｇｅｎ Ｑｕｂｉｔ（商標）ｄｓＤＮＡ ＨＳアッセイキットのプロトコール、Ａｇｉｌｅｎｔ（商標）ＤＮＡ１０００キット、またはＴｒｕＳｅｑ（商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ；低スループット（ＬＴ）プロトコールを使用して、核酸を定量化することができる。無細胞核酸の起源は、（妊娠中の対象から採取した液体を介する）胎児であり得、または無細胞核酸は、対象自身の組織に由来し得る。無細胞核酸は、新生物（例えば、腫瘍または腺腫）に由来し得る。
一般に、無細胞核酸は、分配ステップにより体液から抽出され単離されるが、この分配ステップで、無細胞核酸が溶液中に存在する場合、それらが細胞や体液のその他の非溶解性の構成成分から分離される。分配は、これらに限定されないが、遠心分離または濾過等の技法を含むことができる。その他の場合には、細胞を、最初に無細胞核酸と分配させないが、むしろ溶解させる。１つの例では、インタクトな細胞のゲノムＤＮＡを、選択的沈殿を通して分配する。ＤＮＡを含めた、無細胞核酸は、可溶性の状態を維持し得、これらを、不溶性のゲノムＤＮＡから分離し、抽出することができる。一般に、緩衝液の添加、および種々のキットに特異的なその他の洗浄のステップの後に、イソプロパノール沈殿を使用して、核酸を沈殿させることができる。さらなる清浄化のステップ、例えばシリカに基づくカラムを使用して、混入物または塩を除去することもできる。一般的なステップを、具体的な適用例のために最適化することができる。例えば、非特異的なバルク担体の核酸を、反応全体を通して添加して、手順の、ある特定の態様、例えば収率を最適化することができる。
無細胞核酸は、最大５００ヌクレオチドの長さ、最大４００ヌクレオチドの長さ、最大３００ヌクレオチドの長さ、最大２５０ヌクレオチドの長さ、最大２２５ヌクレオチドの長さ、最大２００ヌクレオチドの長さ、最大１９０ヌクレオチドの長さ、最大１８０ヌクレオチドの長さ、最大１７０ヌクレオチドの長さ、最大１６０ヌクレオチドの長さ、最大１５０ヌクレオチドの長さ、最大１４０ヌクレオチドの長さ、最大１３０ヌクレオチドの長さ、最大１２０ヌクレオチドの長さ、最大１１０ヌクレオチドの長さ、または最大１００ヌクレオチドの長さであり得る。
無細胞核酸は、少なくとも５００ヌクレオチドの長さ、少なくとも４００ヌクレオチドの長さ、少なくとも３００ヌクレオチドの長さ、少なくとも２５０ヌクレオチドの長さ、少なくとも２２５ヌクレオチドの長さ、少なくとも２００ヌクレオチドの長さ、少なくとも１９０ヌクレオチドの長さ、少なくとも１８０ヌクレオチドの長さ、少なくとも１７０ヌクレオチドの長さ、少なくとも１６０ヌクレオチドの長さ、少なくとも１５０ヌクレオチドの長さ、少なくとも１４０ヌクレオチドの長さ、少なくとも１３０ヌクレオチドの長さ、少なくとも１２０ヌクレオチドの長さ、少なくとも１１０ヌクレオチドの長さ、または少なくとも１００ヌクレオチドの長さであり得る。特に、無細胞核酸は、１４０ヌクレオチドの長さ〜１８０ヌクレオチドの長さの間であり得る。
対象から得られた組織から、試料を抽出することができる。試料は、腫瘍の生検であり得る。腫瘍の生検は、腫瘍と健常組織との混合物を含有する場合がある。腫瘍の生検を、ホルムアルデヒド固定し、パラフィン包埋することができる。腫瘍は、生検のうちの少なくとも０．１％、生検のうちの少なくとも０．２％、生検のうちの少なくとも０．５％、生検のうちの少なくとも０．７％、生検のうちの少なくとも１％、生検のうちの少なくとも２％、生検のうちの少なくとも３％、生検のうちの少なくとも４％、生検のうちの少なくとも５％、生検のうちの少なくとも１０％、生検のうちの少なくとも１５％、生検のうちの少なくとも２０％、生検のうちの少なくとも２５％、または生検のうちの少なくとも３０％であり得る。試料は、健常組織から得られた生検であり得る。
組織から抽出した核酸は、最大１０ｋｂの長さ、最大７ｋｂの長さ、最大５ｋｂの長さ、最大４ｋｂの長さ、最大３ｋｂの長さ、最大２ｋｂの長さ、最大１ｋｂの長さ、最大５００ヌクレオチドの長さ、最大４００ヌクレオチドの長さ、最大３００ヌクレオチドの長さ、最大２５０ヌクレオチドの長さ、最大２２５ヌクレオチドの長さ、最大２００ヌクレオチドの長さ、最大１９０ヌクレオチドの長さ、最大１８０ヌクレオチドの長さ、最大１７０ヌクレオチドの長さ、最大１６０ヌクレオチドの長さ、最大１５０ヌクレオチドの長さ、最大１４０ヌクレオチドの長さ、最大１３０ヌクレオチドの長さ、最大１２０ヌクレオチドの長さ、最大１１０ヌクレオチドの長さ、または最大１００ヌクレオチドの長さであり得る。
組織から抽出した核酸は、少なくとも５ｋｂの長さ、少なくとも４ｋｂの長さ、少なくとも３ｋｂの長さ、少なくとも２ｋｂの長さ、少なくとも１ｋｂの長さ、少なくとも５００ヌクレオチドの長さ、少なくとも４００ヌクレオチドの長さ、少なくとも３００ヌクレオチドの長さ、少なくとも２５０ヌクレオチドの長さ、少なくとも２２５ヌクレオチドの長さ、少なくとも２００ヌクレオチドの長さ、少なくとも１９０ヌクレオチドの長さ、少なくとも１８０ヌクレオチドの長さ、少なくとも１７０ヌクレオチドの長さ、少なくとも１６０ヌクレオチドの長さ、少なくとも１５０ヌクレオチドの長さ、少なくとも１４０ヌクレオチドの長さ、少なくとも１３０ヌクレオチドの長さ、少なくとも１２０ヌクレオチドの長さ、少なくとも１１０ヌクレオチドの長さ、または少なくとも１００ヌクレオチドの長さであり得る。
場合によっては、核酸は、抽出プロセスの間にせん断され、１００ヌクレオチドの長さ〜４００ヌクレオチドの長さの間の断片を含むこともある。場合によっては、核酸は、抽出の後にせん断され得、１００〜４００ヌクレオチドの間の長さのヌクレオチドを含むこともある。
無細胞のかつ組織に由来する核酸の単離および精製は、これに限定されないが、会社、例えばＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、ＩＢＩ等が提供する市販のキットおよびプロトコールの使用を含めた、多様なアプローチを使用して達成することができる。また、キットおよびプロトコールは、市販されていないものであってもよい。
ＩＶ．遺伝子解析
遺伝子解析は、ヌクレオチドの配列のバリアント、コピー数の変動、および融合遺伝子の検出を含む。遺伝子のバリアントは、配列決定により決定することができる。配列決定方法は、大規模平行配列決定、すなわち、少なくとも１０万、１００万、１千万、１億または１０億個のいずれかの数のポリヌクレオチド分子を同時に（または迅速的に継続して）配列決定する方法であり得る。配列決定方法として、これらに限定されないが、高スループット配列決定、パイロシーケンシング、合成による配列決定、単分子配列決定、ナノポア配列決定、半導体配列決定、ライゲーションによる配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、ＲＮＡ−Ｓｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、Ｄｉｇｉｔａｌ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、次世代配列決定、Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＳＭＳＳ）（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、大規模平行配列決定、Ｃｌｏｎａｌ Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ａｒｒａｙ（Ｓｏｌｅｘａ）、ショットガン配列決定、マクサム−ギルバートもしくはサンガー配列決定、プライマーウォーキング（ｐｒｉｍｅｒ ｗａｌｋｉｎｇ）、ＰａｃＢｉｏを使用する配列決定、ＳＯＬｉＤ、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ、ナノポアに基づくプラットフォーム、またはその他の配列決定方法を挙げることができる。
配列決定は、配列の捕捉を実施すること、すなわち、試料を、目的の標的配列、すなわち、本明細書に記載するがん融合遺伝子およびがん融合遺伝子の切断点の配列について濃縮することによって、より効率的に行うことができる。配列の捕捉は、目的の標的にハイブリダイズする、固定化されたプローブを使用して実施することができる。配列の捕捉は、官能基、すなわち、ビオチンに付着したプローブを使用して実施することができ、ビオチンにより、特異的な配列にハイブリダイズしているプローブの、試料からのプルダウンによる濃縮が可能になる。場合によっては、非特異的なまたは標的以外への結合を低下させるために、機能化したプローブへのハイブリダイゼーションの前に、特定の配列、例えばライブラリー断片に由来するアダプター配列をマスクすることもでき、これは、それらの断片に、相補的な、非機能化ポリヌクレオチド配列をアニールさせることによって行う。
場合によっては、無細胞核酸の断片または組織に由来する核酸断片を投入して、配列決定ライブラリーを生成する。場合によっては、断片を特異的な配列について濃縮してから、配列決定ライブラリーを調製する。濃縮した、断片化された核酸を、本明細書に開示する任意の配列決定プラットフォーム上で使用するのに適切な任意の配列決定アダプターに付着させることができる。例えば、配列アダプターは、フローセル配列、試料バーコードまたは両方を含むことができる。別の例では、配列アダプターは、ヘアピン形状のアダプターであってもよく、かつ／または試料バーコードを含んでもよい。その上で、結果として生じた断片を増幅し、配列決定を行うことができる。場合によっては、アダプターは、配列決定のプライマー領域を含まない。場合によっては、配列決定ライブラリーを特定の配列について濃縮してから、配列決定を行う。
無細胞核酸は、生殖系列の核酸と混合している少量の腫瘍の核酸を含む場合がある。場合によっては、腫瘍の生検は、健常組織と混成の少量の腫瘍組織を含むことがあり、濃縮せずに、このような試料から抽出した核酸は、生殖系列の核酸と混合している少量の腫瘍の核酸を含むことがある。腫瘍の核酸、特に、遺伝子配列のバリアントおよびコピー数の変動を検出する感度および特異性を増加させる配列決定方法が、本発明の方法において有用である場合がある。このような方法は、例えば、ＷＯ２０１４／０３９５５６、ＷＯ２０１４／１４９１３４およびＷＯ２０１５／１００４２７に記載されており、それらはそれぞれ、全体が参照により本明細書に組み込まれている。これらの方法は、分子を最大０．１％のまたはそれよりも高い感度で検出することができるのみならず、また、これらのシグナルを、現在の配列決定方法においてごく普通に生じるノイズから識別することもできる。無細胞核酸の、血液に基づく試料における感度および特異性の増加は、多様な方法を使用して達成することができる。１つの方法は、試料中の核酸分子の高い効率のタグ付け、すなわち、試料中の少なくとも５０％、７５％または９０％のいずれかの％の当該のポリヌクレオチドにタグを付けることを含む。このことは、試料中の低い存在量の標的分子にタグを付け、続いて、そうした分子について配列決定を行う可能性を増加させ、標的分子の検出感度を顕著に増加させる。
別の方法は、分子を追跡するステップであって、元々の親分子から重複して創出されるに至った配列リードを同定する、ステップと、親分子中の各遺伝子座または位置に、可能性が最も高いことが同定された塩基を割り当てるステップとを含む。このことが、検出の特異性を、増幅により発生したノイズおよび配列決定のエラーを低下させることによって顕著に増加させ、このことにより、擬陽性の頻度が低下する。
本開示の方法は、固有にタグを付けられていない遺伝子の最初の出発材料中の遺伝子の変異体（希少な核酸）を、５％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％または０．０１％未満の濃度で、少なくとも９９％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９９％、９９．９９９９％または９９．９９９９９％の特異性で検出するのに使用することができる。続いて、タグを付けたポリヌクレオチドの配列リードを追跡して、２％、１％、０．１％または０．０１％以下のエラー率を有するポリヌクレオチドのコンセンサス配列を得ることができる。
Ｖ．遺伝子融合事象および切断点領域
遺伝子融合事象は、ゲノム中の少なくとも２つの異なる遺伝子のそれまでは別個であった部分を一緒にする染色体再編成（反転、欠失およびトランスロケーション）であり、結果として、融合遺伝子が生じる。融合遺伝子は、新生物の形成と関連があり、かつ／または新生物の形成を引き起こす恐れがある。融合遺伝子は、がん融合遺伝子であり得る。がん融合遺伝子は、がん中に存在する体細胞突然変異の結果生じる融合遺伝子であり得る。がん融合遺伝子を形成することができる遺伝子の対の非限定的な例が、図２Ａおよび図２Ｂに見出される。融合遺伝子に関与する遺伝子の非限定的な例を、図３に列挙する。
図８は、より深いカバレッジのために標的化することができるＡＬＫ遺伝子のゲノム領域の非限定的な例を示す。図８のゲノム領域は、ＡＬＫ遺伝子の種々のバリアントに対応し得る。このような深いカバレッジは、配列決定を行い、分子バーコードを用いて不要なデータを非表示にした（ｃｏｌｌａｐｓｉｎｇ）後に得られた固有な分子の数により定量化することができ、例えば、典型的なバリアントについては、約２〜３千個の分子、一方、図８のゲノム領域については、約４千個の分子である。数千個の範囲の固有な分子は、１０００×、２０００×、３０００×、４０００×、５０００×または１０，０００×よりも大きな配列決定の深度に対応し得る。
典型的には、融合遺伝子から、融合タンパク質（ＢＣＲ−ＡＢＬｌ）をコードすることができる、２つの遺伝子の異常な並置が生じ得るか、または１つの遺伝子の調節エレメントが、がん遺伝子（ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ）の異常な発現を駆動することができる。がん融合遺伝子の再発性にもかかわらず、各融合遺伝子についての切断点の正確な場所は変化し得る。切断点領域は、遺伝子融合に関与し得る遺伝子の、切断点が生じ得る領域を指す。場合によっては、切断点領域は、切断点から最大５００ヌクレオチドの範囲内である。場合によっては、切断点領域は、切断点から最大２００ヌクレオチドの範囲内、切断点から最大５００ヌクレオチドの範囲内、切断点から最大７５０ヌクレオチドの範囲内、切断点から最大１キロベース（ｋｂ）の範囲内、切断点から最大５ｋｂの範囲内、切断点から最大１０ｋｂの範囲内、切断点から最大２０ｋｂの範囲内、切断点から最大３０ｋｂの範囲内、切断点から最大４０ｋｂの範囲内、切断点から最大５０ｋｂの範囲内、または切断点から最大１００ｋｂの範囲内である。
遺伝子の所与の対についての例示的、非限定的な切断点を、図４Ａ〜図４Ｕ提供する；これらは、Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ（ＣＯＳＭＩＣ）から得た（Forbesら、Nucleic Acids Research（２０１４年）４３巻：Ｄ８０５〜Ｄ８１１頁を参照されたい）。各遺伝子の対について、具体的な突然変異ＩＤを、第１の列に提供し、これは、文献から得られた、検出されたかまたは推測される融合構築物の特定のクラスを示す。例えば、図４Ａは、文献から得られた、検出されたかまたは推測される融合構築物の２９個のクラスを提供する。各突然変異について、５’および３’融合パートナー（５’および３’は、各遺伝子の転写物の方向性に関して示す）によりそれぞれ、遺伝子名、最後に観察されるエクソン、転写物に関して推測される切断点、および挿入された配列があるかどうかを示す。各突然変異ＩＤについて、突然変異を有することが観察された固有な試料の数、およびその特定の突然変異を有する、２つの遺伝子が関与する遺伝子融合のパーセンテージもまた示す。
例えば、図４Ａの第１の行は、突然変異ＣＯＳＦ４６３が、ＥＭＬ４−ＡＬＫの融合であり、この場合、ＥＭＬ４遺伝子は、ＡＬＫ遺伝子の上流で融合していることを示す。この例では、最後に観察されるＥＭＬ４のエクソンは、ＥＭＬ４遺伝子の転写物におけるエクソン１３であり、推測される切断点は、１７５１位に対応するゲノムの位置においてである。融合の接合部の後の第１のＡＬＫのエクソンは、ＡＬＫ遺伝子の転写物におけるエクソン２０であり、推測される切断点の位置は、４０８０位に対応するゲノムの位置であるように、ＥＭＬ４遺伝子は融合している。追加の挿入された配列は、５’パートナー遺伝子および３’パートナー遺伝子のいずれの中にもない。ＣＯＳＦ４６３融合遺伝子は、ＣＯＳＭＩＣデータベース中に含まれる１７０個の固有な試料またはＥＭＬ４−ＡＬＫの融合遺伝子全部の２５％中に検出されている。場合によっては、例えば、ＣＯＳＦ４８８（図４Ａ、５行）は、推測される切断点が、「＋」、およびそれに続く数を含み、これは、ゲノムの位置、および最初の数が示す転写物の位置の下流（イントロンまたはＵＴＲ中）の塩基の数を意味する。数が括弧中に示されている場合には、位置は近似である。場合によっては、例えば、ＣＯＳＦ４８８（図４Ａ、５行）は、推測される切断点が、「−」、およびそれに続く数を含み、これは、ゲノムの位置、および最初の数が示す転写物の位置の上流（イントロンまたはＵＴＲ中）の塩基の数を意味する。数が括弧中に示されている場合には、位置は近似である。「？」は、正確な切断点が不明であることを示す。例えば、ＣＯＳＦ４８８では、切断点は、ＥＭＬ４遺伝子の転写物の２３１８位に対応するゲノムの位置の６５４塩基下流であり、切断点は、ＡＬＫ遺伝子の転写物の４０８０位に対応するゲノムの位置の１７２塩基上流の位置に融合している。
ＶＩ．高い親和性のポリヌクレオチド
場合によっては、高い親和性のポリヌクレオチドは、少なくとも約４５０ヌクレオチドの長さ、少なくとも約４２５ヌクレオチドの長さ、少なくとも約４００ヌクレオチドの長さ、少なくとも約３７５ヌクレオチドの長さ、少なくとも約３５０ヌクレオチドの長さ、少なくとも約３２５ヌクレオチドの長さ、少なくとも約３００ヌクレオチドの長さ、少なくとも約２７５ヌクレオチドの長さ、少なくとも約２５０ヌクレオチドの長さ、少なくとも約２２５ヌクレオチドの長さ、少なくとも約２００ヌクレオチドの長さ、少なくとも約１８０ヌクレオチドの長さ、少なくとも約１６０ヌクレオチドの長さ、少なくとも約１４０ヌクレオチドの長さ、少なくとも約１２０ヌクレオチドの長さ、少なくとも約１００ヌクレオチドの長さ、少なくとも約８０ヌクレオチドの長さ、少なくとも約６０ヌクレオチドの長さ、少なくとも約４０ヌクレオチドの長さ、または少なくとも約２０ヌクレオチドの長さであり得る。
さらに、場合によっては、高い親和性のポリヌクレオチドは、最大約５００ヌクレオチドの長さ、最大約４５０ヌクレオチドの長さ、最大約４２５ヌクレオチドの長さ、最大約４００ヌクレオチドの長さ、最大約３７５ヌクレオチドの長さ、最大約３５０ヌクレオチドの長さ、最大約３２５ヌクレオチドの長さ、最大約３００ヌクレオチドの長さ、最大約２７５ヌクレオチドの長さ、最大約２５０ヌクレオチドの長さ、最大約２２５ヌクレオチドの長さ、最大約２００ヌクレオチドの長さ、最大約１８０ヌクレオチドの長さ、最大約１６０ヌクレオチドの長さ、最大約１４０ヌクレオチドの長さ、最大約１２０ヌクレオチドの長さ、最大約１００ヌクレオチドの長さ、最大約８０ヌクレオチドの長さ、最大約６０ヌクレオチドの長さ、最大約４０ヌクレオチドの長さ、または最大約２０ヌクレオチドの長さであり得る。
特に、場合によっては、高い親和性のポリヌクレオチドは、約２０〜約２００ヌクレオチドの間の長さであり得る。さらに、場合によっては、高い親和性のポリヌクレオチドは、約８０〜約１６０ヌクレオチドの間の長さであり得る。
ある特定の実施形態では、本発明の高い親和性のポリヌクレオチドは、融合遺伝子の標的配列に完全に相補的または実質的に相補的な、少なくとも１０個、少なくとも２５個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、または少なくとも１５０ヌクレオチドからなる配列を有する。
高い親和性のポリヌクレオチドは、１つまたは複数のＬＮＡヌクレオチドを含有することができる。場合によっては、高い親和性のポリヌクレオチド内の１００％のヌクレオチドが、ＬＮＡヌクレオチドである。場合によっては、高い親和性のポリヌクレオチド内の少なくとも９０％、少なくとも７０％、少なくとも５０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％、少なくとも５％、または少なくとも１％のヌクレオチドが、ＬＮＡヌクレオチドである。場合によっては、高い親和性のポリヌクレオチド内の最大９０％、最大７０％、最大５０％、最大２０％、最大１０％、最大５％、または最大１％のヌクレオチドが、ＬＮＡヌクレオチドである。
高い親和性のポリヌクレオチドが、２つ以上のＬＮＡヌクレオチドを含有するのであれば、場合によっては、ＬＮＡヌクレオチドは、３０ヌクレオチド以下、２０ヌクレオチド以下、１５ヌクレオチド以下、１０ヌクレオチド以下、または５ヌクレオチド以下の間隔を置いていてもよい。高い親和性のポリヌクレオチドが、２つ以上のＬＮＡヌクレオチドを含有するその他の場合には、ＬＮＡヌクレオチドは、少なくとも３０ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、または少なくとも５ヌクレオチドの間隔を置いていてもよい。
高い親和性のポリヌクレオチド中の天然のヌクレオチドの代わりに挿入した各々のＬＮＡヌクレオチド毎に、高い親和性のポリヌクレオチドと天然のヌクレオチドのみを含むその相補配列との二重鎖の融解温度が、ストリンジェントな条件下で、少なくとも１℃、少なくとも２℃、少なくとも３℃、少なくとも４℃、少なくとも５℃、少なくとも６℃、少なくとも７℃、少なくとも８℃、少なくとも９℃、または少なくとも１０℃増加し得る。特に、天然のヌクレオチドの代わりに挿入した各々のＬＮＡヌクレオチド毎に、融解温度は、約２℃〜約８℃の間だけ増加し得る。
場合によっては、（１つまたは複数のＬＮＡヌクレオチドを含む）高い親和性のポリヌクレオチドの融解温度は、高い親和性のポリヌクレオチドと同じ配列を有する、天然のヌクレオチドのみを含むポリヌクレオチドの融解温度よりも少なくとも０．５％高く、少なくとも１％高く、少なくとも２％高く、少なくとも３％高く、少なくとも４％高く、少なくとも５％高く、少なくとも１０％高く、少なくとも１５％高く、少なくとも２０％高く、少なくとも２５％高く、少なくとも３０％高く、少なくとも３５％高く、少なくとも４０％高く、少なくとも４５％高く、少なくとも５０％高く、少なくとも５５％高く、少なくとも６０％高く、少なくとも６５％高く、少なくとも７０％高く、少なくとも７５％高く、少なくとも８０％高く、少なくとも８５％高く、少なくとも９０％高く、少なくとも９５％高く、または少なくとも１００％高くなり得る。
１つの構成では、結合しているプローブを、結合パートナーの組合せを使用して、親和性精製することができる。１つの例では、プローブは、結合パートナー、例えばビオチンを含有することができる。次いで、結合パートナーを、親和性精製のステップにおいて、追加の結合パートナー、例えばストレプトアビジンのためのベイトとして使用することができる。場合によっては、結合しているプローブを、結合していないプローブから、親和性精製することもできる。その他の場合には、結合パートナーおよび結合しているプローブを含む試料のポリヌクレオチド鎖を、結合していないプローブから親和性精製することができる。
一般に、結合しているプローブの捕捉のための任意の化学的なアプローチが適切であり得る。場合によっては、捕捉は、ビオチン、およびストレプトアビジンまたはストレプトアビジン誘導体を含む方法を通して達成することができる。例えば、本開示の一実施形態は、融合遺伝子の配列決定ライブラリー断片の捕捉を提供し、この場合、融合遺伝子に関与する遺伝子に対するプローブ、切断点領域に対するプローブ、および／または切断点に対するプローブを、配列決定ライブラリーの融解させた鎖にアニールさせ、親和性精製して、その他の、配列決定ライブラリー断片と別にする。
磁気的に引き付ける粒子、例えばビーズを使用して、単離を行うことができる。任意の適切なビーズによる単離の技法を、本開示の方法と共に使用することができる。場合によっては、ビーズが単離に有用であり得るが、それというのは、目的の分子を、ビーズに付着させることができ、ビーズを洗浄して、ビーズに付着していない溶液の構成成分を除去することができ、これにより、濃縮、精製および／または単離が可能になるからである。ビーズを、特性、例えばサイズ、密度、または誘電特性、イオン特性および磁気特性に基づいて、溶液中のその他の構成成分から分離することができる。好ましい実施形態では、粒子を、磁気的に引き付ける。磁気的に引き付ける粒子を、導入、混合、除去し、磁場を使用して、溶液中に放出させることができる。また、磁気的に引き付ける粒子を利用するプロセスを自動化することもできる。いくつかのベンダーが、ＮＥＢ、Ｄｙｎａｌ、Ｍｉｃｒｏｍｏｄ、ＴｕｒｂｏｂｅａｄおよびＳｐｈｅｒｏｔｅｃｈなどの磁気的な誘引力を有する粒子を供給している。機能化の化学的性質を使用して粒子を機能化し、ポリヌクレオチドへの結合に必要な結合基を有する表面をもたらすことができる。
場合によっては、プローブおよび／または高い親和性のポリヌクレオチドを、がん融合遺伝子にハイブリダイズするように構成する。例えば、プローブおよび／または高い親和性のポリヌクレオチドは、融合遺伝子が誘導されるいずれかの遺伝子の一部に相補的であり得る。場合によっては、がん融合遺伝子は、図２Ａ〜図２Ｂに提示するリストから選択される、１つまたは複数の遺伝子であり得る。
場合によっては、プローブおよび／または高い親和性のポリヌクレオチドを、切断点領域にハイブリダイズするように構成することができる。例えば、場合によっては、プローブおよび／または高い親和性のポリヌクレオチドは、切断点領域の一部に相補的であり得る（プローブおよび／または高い親和性のポリヌクレオチドは、切断点から５００ヌクレオチド以内の配列に相補的であり得る）。さらに、場合によっては、プローブおよび／または高い親和性のポリヌクレオチドを、融合遺伝子中の切断点にわたりハイブリダイズように構成することもできる（図６Ｃを参照されたい）。例えば、プローブおよび／またはポリヌクレオチドは、切断点の両側の配列の一部に相補的であり得る（図６Ｄを参照されたい）。
ＶＩＩ．プローブおよび／またはポリヌクレオチドのセット
場合によっては、プローブおよび／またはポリヌクレオチドのセットを提供する。場合によっては、セット中のプローブおよび／またはポリヌクレオチドの全部が、ＬＮＡヌクレオチドを含む。場合によっては、セット中のプローブおよび／またはポリヌクレオチドのサブセットが、天然のヌクレオチドのみを含み、これを以下、「標準的な親和性のサブセット」と呼び、第２のサブセットが、１つまたは複数のＬＮＡヌクレオチドを含み、これを以下、「高い親和性のサブセット」と呼ぶ。
一実施形態では、プローブセットは、融合遺伝子の切断点領域中のヌクレオチド配列に向けられた１つまたは複数のプローブを含む。
プローブおよび／またはポリヌクレオチドは、多様なカバレッジ深度を提供することができる。例えば、場合によっては、カバレッジ深度は、少なくとも０．５×であり得、この場合、プローブまたはポリヌクレオチドのセットは平均して、領域中の塩基のうちの半分を標的化する（図５Ａを参照されたい）。
場合によっては、カバレッジ深度は、少なくとも１×であり得る、この場合、プローブおよび／またはポリヌクレオチドを、領域中の各塩基が平均して、１つのプローブおよび／またはポリヌクレオチド配列だけにより標的にされるように設計する。場合によっては、カバレッジ深度は、少なくとも２×であり得、この場合、プローブおよび／またはポリヌクレオチドを、領域中の各塩基が平均して、２つのプローブおよび／またはポリヌクレオチド配列により標的にされるように設計する。場合によっては、プローブまたはポリヌクレオチドのセットによるカバレッジ深度は、少なくとも３×、少なくとも４×、または少なくとも５×であり得る。場合によっては、プローブおよび／またはポリヌクレオチドを、タイル化することができ、この場合、プローブおよび／またはポリヌクレオチドのセットを、プローブおよび／またはポリヌクレオチド配列が、連続する標的領域をカバーするように設計する（図５Ｂを参照されたい）。
場合によっては、プローブおよび／またはポリヌクレオチドの標準的な親和性のサブセットを使用して、目的の一部の核酸断片について濃縮し、プローブおよび／またはポリヌクレオチドの高い親和性のサブセットを使用して、同じ試料中のその他の核酸断片について濃縮するのが好ましいこともある。例えば、場合によっては、プローブおよび／またはポリヌクレオチドの標準的な親和性のサブセットが、エクソーム、がん遺伝子または腫瘍抑制遺伝子を標的化することができ、プローブおよび／またはポリヌクレオチドの高い親和性のサブセットが、融合遺伝子、例えばがん融合遺伝子（例えば、図３に列挙する遺伝子）を標的化することもできる。別の例では、場合によっては、標準的な親和性のサブセットが、第１のカバレッジ深度で、切断点領域を含めた、遺伝子融合に関与する１つまたは複数の遺伝子の連続または非連続部分を標的化し、高い親和性のサブセットが、第２のカバレッジ深度で、切断点領域（複数可）を標的化する（図６Ａを参照されたい）。場合によっては、標準的な親和性のサブセットが、第１のカバレッジ深度で、切断点領域を除く、それぞれの遺伝子の連続または非連続部分を標的化し、高い親和性のサブセットが、第２のカバレッジ深度で、切断点領域（複数可）を標的化する（図６Ｂを参照されたい）。場合によっては、標準的な親和性のサブセットが、第１のカバレッジ深度で、それぞれの遺伝子の連続または非連続部分を標的化し、高い親和性のサブセットが、第２のカバレッジ深度で、切断点を標的化する（図６Ｃを参照されたい）。場合によっては、標準的な親和性のサブセットが、第１のカバレッジ深度で、それぞれの遺伝子の連続または非連続部分を標的化し、高い親和性のサブセットが、第２のカバレッジ深度で、切断点の両側の配列を標的化するが、切断点自体は標的化しない（図６Ｄを参照されたい）。
場合によっては、遺伝子融合に関与し得る遺伝子のパネルについて濃縮するために、プローブおよび／またはポリヌクレオチドのセットを、２つ以上の遺伝子を標的化するように構成する（例えば、図７を参照されたい）。さらに、場合によっては、プローブおよび／またはポリヌクレオチドのセットを、２つ以上の遺伝子、およびそれらの切断点または切断点領域を標的化するように構成する。
場合によっては、プローブおよび／またはポリヌクレオチドの複数のセットを、特定の融合遺伝子を標的化するように構成する。例えば、プローブおよび／またはポリヌクレオチドを、遺伝子融合に関与する一方または両方の遺伝子を標的化するように設計することができる。場合によっては、プローブおよび／またはポリヌクレオチドの１つのセットが、単一の遺伝子および／またはその切断点もしくは切断点領域を標的化するプローブおよび／またはポリヌクレオチドを含む。
場合によっては、標準的な親和性のプローブおよび／またはポリヌクレオチドを、高い親和性のプローブおよび／またはポリヌクレオチドと混合する。場合によっては、標準的な親和性のプローブおよび／またはポリヌクレオチドと、高い親和性のプローブおよび／またはポリヌクレオチドとを分離し、順次に利用する。さらに、場合によっては、最初に、試料を、標準的な親和性のプローブと接触させ、次いで、補足されていない核酸断片を、高い親和性のプローブと接触させる。
場合によっては、高い親和性のプローブセットは、高い親和性のポリヌクレオチドを用いてドープした、標準的な親和性のポリヌクレオチドを含むこともできる。このようなプローブセットの場合には、標準的な親和性のポリヌクレオチドおよび高い親和性のポリヌクレオチドの両方が、標的配列を標的化して、ハイブリダイゼーションが行われ得る。このようなドープしたセットの場合、高い親和性のポリヌクレオチドは、切断点領域の配列のみを標的化することができる。
ＶＩＩＩ．キット
本開示は、試料を切断点断片について濃縮するためのキットを提供する。キットは、本明細書に開示するプローブおよび／またはポリヌクレオチドうちのいずれかを含むことができる。場合によっては、キットは、複数のプローブセットを含むこともでき、この場合、各プローブセットが、異なる遺伝子にハイブリダイズし、プローブセットのうちの少なくとも１つが、融合遺伝子にハイブリダイズするように構成されており、１つまたは複数の、高い親和性のポリヌクレオチドおよび／またはプローブを含む。
ＩＸ．使用方法
本開示は、本明細書に開示するプローブおよび／またはポリヌクレオチドうちのいずれかを使用して、切断点断片について濃縮するための方法を提供する。このような方法は、融合遺伝子にハイブリダイズするプローブセットであって、１つまたは複数のプローブおよび／またはポリヌクレオチドが、高い親和性のポリヌクレオチドおよび／またはプローブである、プローブセットを、ポリヌクレオチドの混合物と接触させて、プローブ捕捉ポリヌクレオチドを生成するステップを含むことができる。次いで、プローブ捕捉ポリヌクレオチドを単離して、融合遺伝子の切断点断片を含むポリヌクレオチドが濃縮された試料を生成することができる。場合によっては、ポリヌクレオチドは、無細胞ＤＮＡである。場合によっては、ポリヌクレオチドは、断片化されたゲノムＤＮＡである。場合によっては、プローブ捕捉ポリヌクレオチドを溶出して、プローブから捕捉ポリヌクレオチドを単離する。場合によっては、溶出したポリヌクレオチドを直接配列決定するか、または溶出したポリヌクレオチドを使用して、配列決定ライブラリーを生成する。
融合遺伝子を検出する方法を提供する。ある方法では、少なくとも１つの高い親和性のポリヌクレオチドを含む、少なくとも１つのプローブセットを提供し、このプローブセットは、遺伝子融合に関与する遺伝子に向けられている。プローブセットは、標準的な親和性のポリヌクレオチドプローブ、および高い親和性のポリヌクレオチドプローブの両方を含むことができる。一部の実施形態では、プローブセットは、複数のプローブのサブセットを含み、各サブセットが、目的の、異なる遺伝子の配列に向けられており、それらの遺伝子のうちの１つまたは複数が、がんにおける遺伝子融合に関与し、いくつかの例では、それらの遺伝子のうちの少なくとも１つは、遺伝子融合に関与しない。
プローブセットを、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＤＮＡ、例えばｃｆＤＮＡを含む試料と混合することができ、ＤＮＡを、プローブにハイブリダイズさせることができる。プローブセットが、高い親和性のポリヌクレオチドプローブを含むことから、融合遺伝子の切断点を含むＤＮＡ断片を捕捉する確率が増加する。捕捉したＤＮＡを、プローブから単離し、配列決定を行うことができる。配列を解析して、切断点にまたがる配列を有するＤＮＡ断片、例えば通例は融合していない２つの異なる遺伝子に由来する配列を含むＤＮＡ断片を検出することができる。融合遺伝子の存在が、疾患、例えばがんと相関する場合がある。したがって、この方法は、疾患、例えばがんを診断する際に有用である。
コンピュータ制御システム
本開示は、本開示の方法を実行するようにプログラムするコンピュータ制御システムを提供する。図９は、融合遺伝子の検出、ならびに疾患、例えばがんの診断および／またはそうした疾患のための治療のための介入の提供を行うようにプログラムされているかまたはそれ以外の方法で構成されている、コンピュータシステム９０１を示す。
コンピュータシステム９０１は、中央処理装置（ＣＰＵ；本明細書ではまた、「プロセッサ」および「コンピュータプロセッサ」とも）９０５を含み、ＣＰＵは、シングルコアプロセッサもしくはマルチコアプロセッサ、または並列処理のための複数のプロセッサであり得る。コンピュータシステム９０１はまた、メモリまたはメモリ位置９１０（例えば、ランダムアクセスメモリ、読取り専用メモリ、フラッシュメモリ）、電子ストレージユニット９１５（例えば、ハードディスク）、１つまたは複数のその他のシステムと通信するための通信インターフェース９２０（例えば、ネットワークアダプタ）、ならびに周辺デバイス９２５、例えばキャッシュ、その他のメモリ、データストレージおよび／または電子表示のアダプタも含む。メモリ９１０、ストレージユニット９１５、インターフェース９２０、および周辺デバイス９２５は、コミュニケーションバス（実線）、例えばマザーボードを通して、ＣＰＵ９０５と通信している。ストレージユニット９１５は、データを保存するためのデータストレージユニット（またはデータの収納場所）であり得る。コンピュータシステム９０１は、コンピュータネットワーク（「ネットワーク」）９３０に、通信インターフェース９２０の支援により作動可能にカップリングさせることができる。ネットワーク９３０は、インターネット、インターネットおよび／もしくはエクストラネット、またはインターネットと通信しているイントラネットおよび／もしくはエクストラネットであり得る。ネットワーク９３０は、場合によっては、電気通信網および／またはデータネットワークである。ネットワーク９３０は、分散コンピューティング、例えばクラウドコンピューティングを可能にし得る、１つまたは複数のコンピュータサーバーを含むことができる。ネットワーク９３０は、場合によっては、コンピュータシステム９０１の支援により、ピアツーピアネットワークを実行することができ、こうすることにより、コンピュータシステム９０１にカップリングさせたデバイスが、クライアントまたはサーバーとして振る舞うことを可能にすることができる。
ＣＰＵ９０５は、プログラムまたはソフトウェア中の具体化することができる、機械読取り可能な一連の命令を実行することができる。命令は、記憶場所、例えばメモリ９１０中に保存することができる。命令は、ＣＰＵ９０５に送ることができ、続いて、ＣＰＵ９０５を、本開示の方法を実行するようにプログラムするかまたはそれ以外の方法で構成することができる。ＣＰＵ９０５が実施するオペレーションの例えばフェッチ、デコード、実行およびライトバックを挙げることができる。
ＣＰＵ９０５は、電気回路、例えば集積回路の一部であり得る。システム９０１の１つまたは複数のその他の構成成分を、電気回路中に含めることができる。場合によっては、電気回路は、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）である。
ストレージユニット９１５は、ファイル、例えばドライバ、ライブラリ、およびセーブしたプログラムを保存することができる。ストレージユニット９１５は、ユーザーのデータ、例えば、ユーザーの選好事項およびユーザーのプログラムを保存することができる。コンピュータシステム９０１は、場合によっては、コンピュータシステム９０１の外部にある、例えばイントラネットまたはインターネットを通して、コンピュータシステム９０１と通信している遠隔サーバー上に所在する、１つまたは複数の追加のデータストレージユニットを含むこともできる。
コンピュータシステム９０１は、ネットワーク９３０を通して、１つまたは複数の遠隔のコンピュータシステムと通信することができる。例えば、コンピュータシステム９０１は、ユーザー（例えば、ヘルスケア提供者）の遠隔のコンピュータシステムと通信することができる。遠隔のコンピュータシステムの例として、パーソナルコンピュータ（例えば、ポータブルＰＣ）、スレートＰＣまたはタブレットＰＣ（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰａｄ（登録商標）、Ｓａｍｓｕｎｇ（登録商標）Ｇａｌａｘｙ Ｔａｂ）、電話器、スマートフォン（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰｈｏｎｅ（登録商標）、Ａｎｄｒｏｉｄ系のデバイス、Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ（登録商標））、または携帯情報端末が挙げられる。ユーザーは、ネットワーク９３０を介して、コンピュータシステム９０１にアクセスすることができる。
コンピュータシステム９０１の電子ストレージ位置、例えば、メモリ９１０または電子ストレージユニット９１５等の上に保存されている、機械（例えば、コンピュータプロセッサ）により実行可能なコードを利用して、本明細書に記載する方法を実行することができる。機械により実行可能または機械により読取り可能なコードを、ソフトウェアの形態で提供することができる。使用に際して、プロセッサ９０５が、コードを実行することができる。場合によっては、コードにプロセッサ９０５がすぐにアクセスするために、コードを、ストレージユニット９１５から読み出し、メモリ９１０上に保存する。一部の状況では、電子ストレージユニット９１５を省き、機械により実行可能な命令を、メモリ９１０上に保存することができる。
コードを、プリコンパイルし、設定して、コードを実行するようになされているプロセッサを有する機械を用いて使用してもよく、またはコードを、実行時にコンパイルしてもよい。コードは、プログラミング言語で供給することができ、プログラミング言語を選択して、コードの、プリコンパイルまたは逐次コンパイルの様式の実行を可能にすることができる。
コンピュータシステム９０１等の、本明細書で提供するシステムおよび方法の態様を、プログラミングにおいて具体化することができる。この技術の多様な態様は、機械により読取り可能なあるタイプの媒体中で続行または具体化される、機械（またはプロセッサ）により実行可能なコードおよび／または関連するデータの形態を典型的にはとる「製品」または「製造品」として考えることができる。機械により実行可能なコードは、電子ストレージユニット、例えばメモリ（例えば、読取り専用メモリ、ランダムアクセスメモリ、フラッシュメモリ）またはハードディスク上に保存することができる。「ストレージ」タイプの媒体は、コンピュータ、プロセッサ等の有形のメモリ、またはそれらの関連するモジュール、例えばソフトウェアのプログラミングに、非一時的なストレージをいつでも提供することができる、多様な半導体メモリ、テープドライブ、ディスクドライブ等のうちのいずれかまたは全部を含むことができる。ソフトウェアの全部または一部は時には、インターネット、または多様なその他の電気通信ネットワークを通して通信することができる。このような通信は、例えば、１つのコンピュータまたはプロセッサから別のコンピュータまたはプロセッサへの、例えば、管理サーバーまたはホストコンピュータからアプリケーションサーバーのコンピュータプラットフォームへの、ソフトウェアのロードを可能にし得る。したがって、ソフトウェアエレメントを有することができる別のタイプの媒体は、有線のかつ光学的な地上通信線のネットワークおよび多様なエアリンクを介する光波、電波および電磁波、例えばローカルデバイス間の物理的なインターフェースにわたり使用するものを含む。このような波を運ぶ物理的なエレメント、例えば有線またはワイヤレスのリンク、光学的なリンク等もまた、ソフトウェアを担持する媒体とみなすことができる。コンピュータまたは機械により「読取り可能な媒体」等の用語は、本明細書で使用する場合、非一時的な、有形の「ストレージ」媒体に制限されない限り、実行するための命令をプロセッサに提供することに関与する任意の媒体を指す。
したがって、機械により読取り可能な媒体、例えばコンピュータにより実行可能なコードは、多くの形態をなすことができ、それらとして、これらに限定されないが、有形のストレージ媒体、搬送波媒体、または物理的な伝送媒体が挙げられる。不揮発性のストレージ媒体は、例えば、光ディスクまたは磁気ディスク、例えば任意のコンピュータ等中のストレージデバイスのうちのいずれか、具体的には、図面に示すデータベース等を実行するために使用することができる媒体を含む。揮発性のストレージ媒体は、動的メモリ、例えばこのようなコンピュータプラットフォームの主メモリを含む。有形の伝送媒体は、コンピュータシステムの内部のバスを含む電線を含めて、同軸ケーブル；銅線および光ファイバーを含む。搬送波の伝送媒体は、無線周波数（ＲＦ）および赤外（ＩＲ）のデータ通信の間に発生するもの等の、電気的もしくは電磁気的なシグナル、または音響波または光波の形態をなし得る。したがって、コンピュータにより読取り可能な媒体の一般的な形態として、例えば、フロッピーディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、任意のその他の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤもしくはＤＶＤ−ＲＯＭ、任意のその他の光媒体、パンチカード、紙テープ、穴のパターンを有する、任意のその他の物理的なストレージ媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭおよびＥＰＲＯＭ、フラッシュ−ＥＰＲＯＭ、任意のその他のメモリーチップまたはメモリーカートリッジ、データもしくは命令を転送する搬送波、このような搬送波を転送するケーブルもしくはリンク、またはそこからコンピュータがプログラミングコードおよび／もしくはデータを読み取ることができる任意のその他の媒体が挙げられる。コンピュータにより読取り可能な媒体のこれらの形態のうちの多くが、実行のために、プロセッサに対する１つまたは複数の命令の１つまたは複数のシーケンスを運ぶことに関与することができる。
コンピュータシステム９０１は、対象の診断または対象のための治療のための介入を含むことができるレポートの出力を提供するためのユーザーインターフェース（ＵＩ）９４０を含む電子表示９３５を含むかまたは電子表示９３５と通信することができる。ＵＩの例として、非限定的に、グラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）およびウェブベースのユーザーインターフェースが挙げられる。
本開示の方法およびシステムは、１つまたは複数のアルゴリズムを利用して実行することができる。アルゴリズムは、中央処理装置９０５による実行時に、ソフトウェアを利用して実行することができる。アルゴリズムは、例えば、融合遺伝子の濃縮、配列決定および／検出を促進することができる。
（実施例１）
がん遺伝子およびがん融合遺伝子の濃縮および配列決定
循環型の無細胞ＤＮＡを、がん患者の血漿から、ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、製造元のプロトコールに従って単離する；ただし、ＡｍｐｕｒｅＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いる両側のＳＰＲＩを実施して、＞５００ｂｐの断片を除去し、全てのより低い分子量の断片を保持する。次いで、結果として生じる約１６０ｂｐのｃｆＤＮＡ断片（５〜３０ｎｇ）に、末端修復を行い、これを、分子バーコードタグ、および下流の次世代配列決定（ＨｉＳｅｑ２５００、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に必要な配列を有するアダプターにライゲーションする。ライゲーションされたｃｆＤＮＡを、ライゲーションされたアダプター配列に相補的なプライマーを使用して１０サイクルにわたり増幅する。
融合遺伝子を含む、目的の領域について濃縮するために、結果として生じるｃｆＤＮＡライブラリーを、９５℃で変性させ、次いで、ストリンジェントなハイブリダイゼーション緩衝液中で、最初に、添加した配列をブロックするオリゴに、次いで、１２０ｎｔのビオチン化ＲＮＡオリゴ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に、およびまた１２０ｎｔのビオチン化ＲＮＡ／ＬＮＡオリゴまたはビオチン化ＤＮＡ／ＬＮＡオリゴ（Ｅｘｉｑｏｎ）にも、６５℃で１６時間ハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション反応物を、ストレプトアビジンビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して捕捉し、標的でないｃｆＤＮＡ断片を除去するために洗浄し、水酸化ナトリウムを使用して溶出する。結果として生じる、濃縮されたライブラリーを、別の１２サイクルにわたり増幅し、ＨｉＳｅｑ２５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）上で配列決定を行う。
（実施例２）
配列の捕捉
無細胞ＤＮＡを、がん患者から単離する。
遺伝子再編成に関与する４つの遺伝子を含む６８個の標的遺伝子の配列を有するポリヌクレオチドを捕捉するように構成されているプローブセットを提供する。プローブセットは、サブセットを含み、各サブセットが、パネル中の６８個の遺伝子のうちの１つに向けられている。遺伝子再編成に関与しない遺伝子に向けられた各サブセットは、標準的な親和性のサブセットである（各サブセットは、親和性が高くないポリヌクレオチドのみを含み、これらのポリヌクレオチドは、天然のヌクレオチドのみを有する）。遺伝子再編成に関与する遺伝子に向けられた各サブセットは、高い親和性のサブセットである（各サブセットは、少なくとも１つの、高い親和性のポリヌクレオチドを含む）。これらのセットは、エクソンにわたる２×のタイル化をもたらす。高い親和性のサブセットにおいては、高い親和性のポリヌクレオチドは、遺伝子の切断点領域にのみに向けられている。高い親和性のサブセットは、高い親和性のポリヌクレオチドを用いてドープされており、したがって、高い親和性のポリヌクレオチドおよび標準的な親和性のポリヌクレオチドの両方が、切断点領域中の配列に向けられている。
無細胞ＤＮＡとプローブセットとを、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で組み合わせて、一晩インキュベートする。結合しているｃｆＤＮＡを有するプローブセットを、混合物から単離する。結合しているポリヌクレオチドをプローブから分離し、配列決定を行う。切断点にわたる配列を含むポリヌクレオチドを同定する。
本明細書では、本発明の好ましい実施形態を示し、記載してきたが、このような実施形態は、例として提供されているに過ぎないことが当業者には明らかである。本発明は、本明細書内に提供する特定の実施例により限定されないものとする。本発明を、上記の明細書を参照して記載してきたが、本明細書の実施形態の説明および例証は、限定的な意味で解釈してはならない。当業者であれば、ここで多数の変更形態、変化形態および置換形態を、本発明から逸脱することなく、思い付くであろう。さらに、本発明の態様は全て、本明細書に記載する特定の描写、構成または相対な比率に限定されず、それらは、多様な条件および変数によって異なることが理解されるものとする。本発明の実施に際して、本明細書に記載する本発明の実施形態に対する多様な代替形態を利用することができることを理解すべきである。したがって、本発明はまた、任意のこのような代替形態、改変形態、変更形態または均等物も網羅するものとすることを企図する。以下の特許請求の範囲により、本発明の範囲が定義され、これらの請求項の範囲に属する方法および構造、ならびにそれらの均等物は、特許請求の範囲により網羅されるものとする。

Claims (82)

  1. がんを有するかまたはがんを有することが疑われる対象に診断または治療の介入を提供するための方法であって、
    （ａ）対象からの無細胞核酸分子を含む生物学的試料を提供するステップと、
    （ｂ）プローブ捕捉ポリヌクレオチドを生成するのに十分なハイブリダイゼーション条件下で、前記生物学的試料からの前記無細胞核酸分子をプローブセットと接触させるステップであって、前記プローブセットが複数のポリヌクレオチドプローブを含み、前記複数のポリヌクレオチドプローブのそれぞれが、（ｉ）融合遺伝子との配列相補性、および（ｉｉ）前記融合遺伝子と相補的な配列を有し、かつ未改変ヌクレオチドのみを含有するポリヌクレオチドより大きい、前記融合遺伝子に対する親和性を有する、ステップと、
    （ｃ）混合物から前記プローブ捕捉ポリヌクレオチドを単離して、前記融合遺伝子の切断点断片を含む単離ポリヌクレオチドが濃縮された試料を生成するステップと、
    （ｄ）前記単離ポリヌクレオチドを配列決定して、配列を生成するステップと、
    （ｅ）前記配列に基づいて、融合遺伝子の切断点を含むポリヌクレオチドを検出するステップと、
    （ｆ）切断点断片の前記検出に基づいて、前記診断または治療の介入を提供するステップと
    を含む方法。
  2. 前記複数のポリヌクレオチドプローブのそれぞれが、１つまたは複数のロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記複数のポリヌクレオチドプローブのそれぞれが、複数のＬＮＡヌクレオチドを含み、前記ＬＮＡヌクレオチドのうちの少なくとも２つが、３０ヌクレオチド以下の間隔を置いている、請求項２に記載の方法。
  4. 前記ＬＮＡヌクレオチドのうちの前記少なくとも２つが、１５ヌクレオチド以下の間隔を置いている、請求項３に記載の方法。
  5. 前記複数のポリヌクレオチドプローブの少なくともサブセットのそれぞれのヌクレオチドのうちの少なくとも５０％が、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
  6. 前記複数のポリヌクレオチドプローブの少なくともサブセットのそれぞれのヌクレオチドのうちの少なくとも７５％が、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドである、請求項５に記載の方法。
  7. 前記複数のポリヌクレオチドプローブのそれぞれが、前記融合遺伝子と相補的な配列を有し、かつ未改変ヌクレオチドのみを含有する前記ポリヌクレオチドよりも少なくとも約１℃高い融解温度を有する、請求項１に記載の方法。
  8. 前記融解温度が、少なくとも約１０℃より高い、請求項７に記載の方法。
  9. 前記複数のポリヌクレオチドプローブのそれぞれが、前記融合遺伝子と相補的な配列を有し、かつ未改変ヌクレオチドのみを含有する前記ポリヌクレオチドよりも少なくとも約２％高い融解温度を有する、請求項１に記載の方法。
  10. 前記融解温度が、少なくとも約１０％より高い、請求項９に記載の方法。
  11. 前記融合遺伝子が、がん融合遺伝子である、請求項１に記載の方法。
  12. 前記複数のポリヌクレオチドプローブのそれぞれが、図２Ａ〜図２Ｂの融合遺伝子の対の遺伝子または図３から選択される２つもしくはそれよりも多くの遺伝子間の融合遺伝子との配列相補性を有する、請求項１に記載の方法。
  13. 前記複数のポリヌクレオチドプローブのそれぞれが、前記融合遺伝子の切断点から５００ヌクレオチド以下で離れた切断点領域との配列相補性を有する、請求項１に記載の方法。
  14. 前記複数のポリヌクレオチドプローブのそれぞれが、前記融合遺伝子中の切断点にわたる配列との配列相補性を有する、請求項１に記載の方法。
  15. 前記複数のポリヌクレオチドプローブのそれぞれが、約５００ヌクレオチド未満の長さを有する、請求項１に記載の方法。
  16. 前記複数のポリヌクレオチドプローブのそれぞれが、約２０〜約２００ヌクレオチドの間の長さを有する、請求項１に記載の方法。
  17. 前記複数のポリヌクレオチドプローブのそれぞれが、約８０〜約１６０ヌクレオチドの間の長さを有する、請求項１に記載の方法。
  18. 前記切断点断片のそれぞれが、約１４０〜１８０ヌクレオチドの間の長さを有する、請求項１に記載の方法。
  19. 前記複数のポリヌクレオチドプローブが、固体支持体にカップリングされている、請求項１に記載の方法。
  20. 前記プローブセットが、１つまたは複数の天然のポリヌクレオチドプローブを含む、請求項１に記載の方法。
  21. 前記複数のポリヌクレオチドプローブが、前記融合遺伝子中に含まれる核酸配列の切断点領域にハイブリダイズする少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブ、および前記融合遺伝子中に含まれる前記核酸配列の非切断点領域にハイブリダイズする少なくとも１つの天然のポリヌクレオチドプローブを含む、請求項１に記載の方法。
  22. 前記複数のポリヌクレオチドプローブのそれぞれが、前記融合遺伝子中に含まれる核酸配列の切断点領域の少なくとも５０％のカバレッジを提供する、請求項１に記載の方法。
  23. ステップ（ｄ）が、前記単離ポリヌクレオチドに、明確に異なるバーコード配列を有するバーコードを含むタグを付着させ、タグ付き親ポリヌクレオチドを作り出すことを含む、請求項１に記載の方法。
  24. 前記タグ付き親ポリヌクレオチドを増幅して、タグ付き子孫ポリヌクレオチドを生成するステップをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
  25. （ｉ）前記タグ付き子孫ポリヌクレオチドを配列決定して、配列リードを生成するステップであって、各配列リードが、バーコード配列と、前記単離ポリヌクレオチドのうちの所与の１つから誘導された配列とを含む、ステップと、（ｉｉ）少なくとも前記バーコード配列に基づいて、前記配列リードをファミリーにグループ分けするステップとをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
  26. 各ファミリー内にグループ分けされた前記配列リードを比較して、各ファミリーについてのコンセンサス配列を決定するステップであって、前記コンセンサス配列のそれぞれが、前記タグ付き親ポリヌクレオチド間で固有なポリヌクレオチドに対応する、ステップをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 融合遺伝子の切断点断片を捕捉するための方法であって、
    （ａ）前記融合遺伝子の前記切断点断片を含む無細胞核酸分子を含有するかまたは前記融合遺伝子の前記切断点断片を含む無細胞核酸分子を含有することが疑われる生物学的試料を提供するステップと、
    （ｂ）前記生物学的試料を、ポリヌクレオチドプローブと、
    ｉ．前記ポリヌクレオチドプローブと前記切断点断片との間のハイブリダイゼーションを可能にして、混合物中にプローブ捕捉ポリヌクレオチドを提供するのに十分な条件であって、前記ポリヌクレオチドプローブが、前記切断点断片との配列相補性を有し；前記融合遺伝子と相補的な配列を有し、かつ未改変ヌクレオチドのみを含有するポリヌクレオチドより大きい、前記融合遺伝子に対する親和性を有する、条件、および
    ｉｉ．前記混合物からの前記プローブ捕捉ポリヌクレオチドの濃縮または単離を可能にするのに十分な条件であって、前記ポリヌクレオチドプローブが、前記切断点断片との配列相補性を有する、条件
    下で接触させるステップと
    を含む方法。
  28. 前記ポリヌクレオチドプローブが、１つまたは複数のロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドを含む、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記ポリヌクレオチドプローブが、複数のＬＮＡヌクレオチドを含み、前記ＬＮＡヌクレオチドのうちの少なくとも２つが、３０ヌクレオチド以下の間隔を置いている、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記ＬＮＡヌクレオチドのうちの前記少なくとも２つが、１５ヌクレオチド以下の間隔を置いている、請求項２９に記載の方法。
  31. 複数のポリヌクレオチドプローブを含むプローブセットであって、前記ポリヌクレオチドプローブのそれぞれが、（ｉ）無細胞核酸分子の一部としての融合遺伝子との配列相補性、および（ｉｉ）前記融合遺伝子と相補的な配列を有し、かつ未改変ヌクレオチドのみを含有するポリヌクレオチドより大きい、前記融合遺伝子に対する親和性を有する、プローブセット。
  32. 前記複数のポリヌクレオチドプローブのそれぞれが、１つまたは複数のロックド核酸ヌクレオチドを含む、請求項３１に記載のプローブセット。
  33. １つまたは複数の天然のポリヌクレオチドプローブをさらに含む、請求項３１に記載のプローブセット。
  34. 前記複数のポリヌクレオチドプローブのそれぞれが、前記融合遺伝子中に含まれる核酸配列の切断点領域にハイブリダイズする少なくとも１つのポリヌクレオチドプローブ、および前記融合遺伝子中に含まれる前記核酸配列の非切断点領域にハイブリダイズする少なくとも１つの天然のポリヌクレオチドプローブを含む、請求項３１に記載のプローブセット。
  35. 前記複数のポリヌクレオチドプローブのそれぞれが、前記融合遺伝子中に含まれる核酸配列の切断点領域の少なくとも５０％のカバレッジを提供する、請求項３１に記載のプローブセット。
  36. 前記複数のポリヌクレオチドプローブが、前記融合遺伝子中の異なる遺伝子の一方または両方の部分にハイブリダイズする、請求項３１に記載のプローブセット。
  37. 固体支持体をさらに含み、前記複数のポリヌクレオチドプローブが、前記固体支持体にカップリングされている、請求項３１に記載のプローブセット。
  38. 前記複数のポリヌクレオチドプローブのそれぞれが、前記融合遺伝子と相補的な配列を有し、かつ未改変ヌクレオチドのみを含有する前記ポリヌクレオチドよりも少なくとも約１℃高い融解温度を有する、請求項３１に記載のプローブセット。
  39. 前記融解温度が、少なくとも約１０℃より高い、請求項３８に記載のプローブセット。
  40. 前記複数のポリヌクレオチドプローブのそれぞれが、前記融合遺伝子と相補的な配列を有し、かつ未改変ヌクレオチドのみを含有する前記ポリヌクレオチドよりも少なくとも約２％高い融解温度を有する、請求項３１に記載のプローブセット。
  41. 前記融解温度が、少なくとも約１０％より高い、請求項４０に記載のプローブセット。
  42. 前記融合遺伝子が、がん融合遺伝子である、請求項３１に記載のプローブセット。
  43. 前記複数のポリヌクレオチドプローブのそれぞれが、図２Ａ〜図２Ｂの融合遺伝子の対の遺伝子または図３から選択される２つもしくはそれよりも多くの遺伝子間の融合遺伝子との配列相補性を有する、請求項３１に記載のプローブセット。
  44. 無細胞核酸分子中の融合遺伝子と関連がある核酸配列に特異的にハイブリダイズするように構成されている配列を含む、高い親和性のポリヌクレオチド。
  45. 融合遺伝子に特異的にハイブリダイズするように構成されている、高い親和性のポリヌクレオチド。
  46. １つまたは複数のロックド核酸ヌクレオチドを含む、請求項４５に記載の高い親和性のポリヌクレオチド。
  47. 天然のヌクレオチドのみを含む、同じ配列を有するポリヌクレオチドよりも少なくとも１℃高い融解温度を有する、請求項４５に記載の高い親和性のポリヌクレオチド。
  48. 天然のヌクレオチドのみを含む、同じ配列を有するポリヌクレオチドよりも少なくとも２％高い融解温度を有する、請求項４５に記載の高い親和性のポリヌクレオチド。
  49. がん融合遺伝子に特異的にハイブリダイズするように構成されている、請求項４５に記載の高い親和性のポリヌクレオチド。
  50. 図２Ａ〜図２Ｂの融合遺伝子の対の遺伝子または図３から選択される２つもしくはそれよりも多くの遺伝子間の融合遺伝子に特異的にハイブリダイズするように構成されている、請求項４５に記載の高い親和性のポリヌクレオチド。
  51. 前記融合遺伝子の切断点から５００ヌクレオチド以下で離れた切断点領域内でハイブリダイズするように構成されている、請求項４５に記載の高い親和性のポリヌクレオチド。
  52. 前記融合遺伝子中の切断点にわたりハイブリダイズするように構成されている、請求項４５に記載の高い親和性のポリヌクレオチド。
  53. 約５００ヌクレオチド未満の長さを有する、請求項４５に記載の高い親和性のポリヌクレオチド。
  54. 複数のロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドをさらに含み、前記ＬＮＡヌクレオチドのうちの少なくとも２つが、３０ヌクレオチド以下の間隔を置いている、請求項４６に記載の高い親和性のポリヌクレオチド。
  55. 前記ポリヌクレオチド中の前記ヌクレオチドのうちの少なくとも１％が、ロックド核酸ヌクレオチドである、請求項４６に記載の高い親和性のポリヌクレオチド。
  56. 前記融合遺伝子のヌクレオチド配列に完全または実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する、請求項４５に記載の高い親和性のポリヌクレオチド。
  57. 融合遺伝子に特異的にハイブリダイズするように構成されている、高い親和性のポリヌクレオチドを含む、高い親和性のポリヌクレオチドプローブ。
  58. 前記高い親和性のポリヌクレオチドが、１つまたは複数のロックド核酸ヌクレオチドを含む、請求項５７に記載のプローブ。
  59. 検出可能な標識、結合性部分または固体支持体から選択される機能性をさらに含む、請求項５７に記載のプローブ。
  60. 前記高い親和性のポリヌクレオチドが、融合遺伝子の切断点断片にハイブリダイズするように構成されている、請求項５７に記載のプローブ。
  61. 前記切断点断片が、約１４０〜約１８０ヌクレオチドの間の長さを有する、請求項６０に記載のプローブ。
  62. 前記切断点断片が、無細胞ＤＮＡまたはゲノムＤＮＡである、請求項６０に記載のプローブ。
  63. 前記高い親和性のポリヌクレオチドが、固体支持体に結合している、請求項５７に記載のプローブ。
  64. 複数のポリヌクレオチドプローブを含むプローブセットであって、各プローブが、融合遺伝子に特異的にハイブリダイズするように構成されており、１つまたは複数の高い親和性のポリヌクレオチドプローブを含む、プローブセット。
  65. 前記高い親和性のポリヌクレオチドが、１つまたは複数のロックド核酸ヌクレオチドを含む、請求項６４に記載のプローブセット。
  66. １つまたは複数の天然のポリヌクレオチドプローブを含む、請求項６４に記載のプローブセット。
  67. 前記融合遺伝子に関与する遺伝子の切断点領域に特異的にハイブリダイズする、少なくとも１つの高い親和性のポリヌクレオチドプローブ、および前記融合遺伝子に関与する前記遺伝子の非切断点領域にハイブリダイズする、少なくとも１つの天然のポリヌクレオチドプローブをさらに含む、請求項６４に記載のプローブセット。
  68. 前記プローブセット中の前記１つまたは複数の高い親和性のポリヌクレオチドプローブが、前記融合遺伝子に関与する遺伝子の切断点領域の少なくとも５０％（少なくとも０．５×〜５×）のカバレッジを提供する、請求項６４に記載のプローブセット。
  69. 前記ポリヌクレオチドプローブが、前記融合遺伝子中の異なる遺伝子の一方または両方の部分にハイブリダイズする、請求項６４に記載のプローブセット。
  70. オリゴヌクレオチドのチップとして構成されている、請求項６４に記載のプローブセット。
  71. 標的配列が、高い親和性のポリヌクレオチドプローブおよび標準的な親和性のポリヌクレオチドプローブの両方により標的にされる、請求項６４に記載のプローブセット。
  72. 複数のプローブセットを含むキットであって、各プローブセットが、異なる遺伝子に特異的にハイブリダイズし、前記プローブセットのうちの少なくとも１つが、請求項６４に記載のプローブセットである、キット。
  73. 前記高い親和性のポリヌクレオチドが、１つまたは複数のロックド核酸ヌクレオチドを含む、請求項７２に記載のキット。
  74. 融合遺伝子の切断点断片を捕捉するための方法であって、前記切断点断片を、高い親和性のポリヌクレオチドプローブと、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で接触させるステップと、ハイブリダイゼーションさせるステップとを含み、前記ポリヌクレオチドプローブが、固体支持体に結合しており、前記ポリヌクレオチドプローブが、前記切断点断片のヌクレオチド配列に実質的または完全に相補的であるヌクレオチド配列を有する、方法。
  75. 前記高い親和性のポリヌクレオチドが、１つまたは複数のロックド核酸ヌクレオチドを含む、請求項７４に記載の方法。
  76. 試料を、融合遺伝子の切断点を含むポリヌクレオチドについて濃縮するための方法であって、
    （ａ）ハイブリダイゼーション条件下で、請求項６４に記載のプローブセットをポリヌクレオチドの混合物と接触させて、プローブ捕捉ポリヌクレオチドを生成するステップと、
    （ｂ）前記混合物から前記プローブ捕捉ポリヌクレオチドを単離して、前記融合遺伝子の切断点断片を含むポリヌクレオチドが濃縮された試料を生成するステップと
    を含む方法。
  77. 前記高い親和性のポリヌクレオチドが、１つまたは複数のロックド核酸ヌクレオチドを含む、請求項７６に記載の方法。
  78. 前記ポリヌクレオチドが、無細胞ＤＮＡまたは断片化されたゲノムＤＮＡを含む、請求項７６に記載の方法。
  79. 前記プローブから捕捉ポリヌクレオチドを単離するステップをさらに含む、請求項７６に記載の方法。
  80. 前記単離ポリヌクレオチドを配列決定するステップをさらに含む、請求項７６に記載の方法。
  81. 対象におけるがんを診断する方法であって、
    （ａ）対象からのポリヌクレオチドを含む試料を提供するステップと、
    （ｂ）ハイブリダイゼーション条件下で、前記試料に由来する無細胞デオキシリボ核酸を請求項６４に記載のプローブセットと接触させて、プローブ捕捉ポリヌクレオチドを生成するステップと、
    （ｃ）前記混合物から前記プローブ捕捉ポリヌクレオチドを単離して、前記融合遺伝子の切断点断片を含むポリヌクレオチドが濃縮された試料を生成するステップと、
    （ｄ）前記単離ポリヌクレオチドを配列決定して、配列を生成するステップと、
    （ｅ）前記配列に基づいて、融合遺伝子の切断点を含むポリヌクレオチドを検出するステップと、
    （ｆ）切断点断片の前記検出に基づいて、がんを診断するステップと
    を含む方法。
  82. 前記高い親和性のポリヌクレオチドが、１つまたは複数のロックド核酸ヌクレオチドを含む、請求項８１に記載の方法。
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