CN116472348A - 用于选择性无细胞核酸分析的方法 - Google Patents

Abstract

本文提供了用于处理从无细胞生物样品中衍生的多个核酸分子的方法，包括使所述多个核酸分子或其衍生物与多个结合剂接触，以提供耦联到所述多个结合剂的所述多个核酸分子的第一子集和所述多个核酸分子的第二子集；将耦联到所述多个结合剂的所述多个核酸分子的所述第一子集与所述多个核酸分子的所述第二子集分离；使从所述多个核酸分子的所述第一子集中衍生的核酸分子环化以获得环化核酸分子；以及识别所述环化核酸分子或其衍生物。

Description

用于选择性无细胞核酸分析的方法

交叉引用

本专利申请要求于2020年8月19日提交的美国临时申请号63/067,800的权益，该申请通过引用整体并入本文。

背景技术

核酸变异通常包括蛋白质结合的差异，诸如包括但不限于转录因子的核酸结合蛋白，以及诸如甲基化的核酸修饰。这种变异有时与疾病或发生疾病的风险有关。因此，分析与特定蛋白质结合或具有特定变化的核酸在疾病诊断和治疗中可能是有用的。

发明内容

在一方面，本文提供了用于处理从无细胞生物样品中衍生的多个核酸分子的方法。在一些情况下，本文的方法包括(a)使多个核酸分子或其衍生物与多个结合剂接触，以提供耦联到多个结合剂的多个核酸分子的第一子集和多个核酸分子的第二子集；(b)将耦联到多个结合剂的多个核酸分子的第一子集与多个核酸分子的第二子集分离；(c)在(b)之后，使从多个核酸分子的第一子集中衍生的核酸分子环化以获得环化核酸分子；和(d)识别环化核酸分子或其衍生物。在一些情况下，多个核酸分子包括脱氧核糖核酸(DNA)分子或核糖核酸(RNA)分子。在一些情况下，环化包括将核酸分子的5’端和3’端相互连接。在一些情况下，环化包括将衔接子耦联到核酸分子的3’端、5’端或5’端和3’端两者。在一些情况下，方法进一步包括对环化核酸分子进行核酸扩增以生成环化核酸分子的多个扩增产物，其中(d)包括识别多个核酸扩增产物。在一些情况下，核酸扩增通过具有链置换活性的聚合酶来实现。在一些情况下，核酸扩增通过不具有链置换活性的聚合酶来实现。在一些情况下，核酸扩增包括使环化核酸分子与包含随机引物的扩增反应混合物接触。在一些情况下，核酸扩增包括使环化核酸分子与包含一种或多种引物的扩增反应混合物接触，该一种或多种引物中的每一个经由序列互补性特异性地与不同靶序列杂交。在一些情况下，结合剂包括抗体或其片段。在一些情况下，抗体或其片段与核酸结合蛋白特异性结合。在一些情况下，核酸结合蛋白是染色质蛋白。在一些情况下，核酸结合蛋白是组蛋白。在一些情况下，核酸结合蛋白是甲基CpG结合蛋白。在一些情况下，核酸结合蛋白是转录因子。在一些情况下，核酸结合蛋白是RNA结合蛋白。在一些情况下，抗体或其片段与核酸序列特异性结合。在一些情况下，核酸序列是甲基化的。在一些情况下，结合剂包括多肽或核酸。在一些情况下，多肽包括链霉亲和素。在一些情况下，方法进一步包括确定多个无细胞核酸分子中的每个无细胞核酸分子的大小。在一些情况下，(d)包括对环化核酸分子或其衍生物进行测序。在一些情况下，测序包括选自以下中的一种或多种的方法：合成测序、连接测序、纳米孔测序、纳米球测序、离子检测、杂交测序、聚合酶群落(polymerized colony，POLONY)测序、纳米网格滚环测序(ROLONY)和离子激流测序。在一些情况下，无细胞生物样品包含少于75纳克的核酸。在一些情况下，无细胞生物样品包括体液。在一些情况下，体液是尿液、唾液、血液、血清、血浆、泪液、痰、脑脊液、滑液、黏液、胆汁、精液、淋巴液、羊膜液、月经液或其组合。在一些情况下，(d)包括对环化核酸分子或其衍生物进行测序。在一些情况下，方法进一步包括对照多个参考序列处理序列以将序列识别为对应于多个参考序列的至少一个子集，从而确定对象患有疾病或处于患有疾病的风险中。在一些情况下，疾病是癌症。在一些情况下，癌症选自结肠癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、肝细胞癌、肝癌、皮肤癌、恶性黑色素瘤、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌、脑癌、白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。在一些情况下，方法进一步包括使用识别的序列来输出电子报告，该电子报告指示对象患有疾病或处于患有疾病的风险中。在一些情况下，方法进一步包括使用识别的序列来为疾病的对象提供治疗干预。在一些情况下，方法进一步包括使用识别的序列来治疗对象的疾病。在一些情况下，通过对对象施用化疗或免疫疗法来治疗对象。在一些情况下，方法进一步包括使用识别的序列来监测对象的进展或消退。在一些情况下，在(c)中，核酸分子耦联到多个结合剂中的结合剂。

在另一方面，提供了用于处理从无细胞生物样品中衍生的多个核酸分子的方法，包括(a)确定多个核酸分子中的核酸分子的甲基化状态；(b)确定多个核酸分子中的核酸分子的大小；和(c)(i)对照第一数据库处理多个核酸分子中的核酸分子的甲基化状态，以及(ii)对照第二数据库处理多个核酸分子中的核酸分子的大小，以识别甲基化状态和大小与至少一种疾病的关联。在一些情况下，确定甲基化状态包括对多个核酸分子中的核酸分子进行测序。在一些情况下，测序包括选自以下中的一种或多种的方法：合成测序、连接测序、纳米孔测序、纳米球测序、离子检测、杂交测序、聚合酶群落(POLONY)测序、纳米网格滚环测序(ROLONY)和离子激流测序。在一些情况下，确定甲基化状态包括使核酸分子与结合剂接触，该结合剂与甲基化核酸或其衍生物特异性结合。在一些情况下，确定甲基化状态包括：(a)使多个核酸分子与多个结合剂接触，以提供耦联到多个结合剂的多个核酸分子的第一子集和多个核酸分子的第二子集；(b)将耦联到多个结合剂的多个核酸分子的第一子集与多个核酸分子的第二子集分离；(c)在(b)之后，使从多个核酸分子的第一子集中衍生的核酸分子环化，以获得环化核酸分子；和(d)识别环化核酸分子或其衍生物。在一些情况下，结合剂包括抗体或其片段。在一些情况下，结合剂包括多肽或核酸。在一些情况下，多肽包括链霉亲和素。在一些情况下，多个核酸分子包括脱氧核糖核酸(DNA)分子或核糖核酸(RNA)分子。在一些情况下，环化包括将核酸分子的5’端和3’端相互连接。在一些情况下，环化包括将衔接子耦联到核酸分子的3’端、5’端或5’端和3’端两者。在一些情况下，方法进一步包括对环化核酸分子进行核酸扩增以生成环化核酸分子的多个扩增产物，其中(d)包括识别多个核酸扩增产物。在一些情况下，核酸扩增通过具有链置换活性的聚合酶来实现。在一些情况下，核酸扩增通过不具有链置换活性的聚合酶来实现。在一些情况下，核酸扩增包括使环化核酸分子与包含随机引物的扩增反应混合物接触。在一些情况下，核酸扩增包括使环化核酸分子与包含一种或多种引物的扩增反应混合物接触，该一种或多种引物中的每一个经由序列互补性特异性地与不同靶序列杂交。在一些情况下，(d)包括对环化核酸分子或其衍生物进行测序。在一些情况下，测序包括选自以下中的一种或多种的方法：合成测序、连接测序、纳米孔测序、纳米球测序、离子检测、杂交测序、聚合酶群落(POLONY)测序、纳米网格滚环测序(ROLONY)和离子激流测序。在一些情况下，无细胞生物样品包含少于75纳克的核酸。在一些情况下，无细胞生物样品包括体液。在一些情况下，体液是尿液、唾液、血液、血清、血浆、泪液、痰、脑脊液、滑液、黏液、胆汁、精液、淋巴液、羊膜液、月经液或其组合。在一些情况下，方法进一步包括对照多个参考甲基化状态处理甲基化状态，以及对照多个参考大小处理大小，以将甲基化状态识别为对应于多个参考甲基化状态的至少一个子集，并且将大小识别为对应于参考大小的至少一个子集，从而确定对象患有疾病或处于患有疾病的风险中。在一些情况下，疾病是癌症。在一些情况下，癌症选自结肠癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、肝细胞癌、肝癌、皮肤癌、恶性黑色素瘤、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌、脑癌、白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。在一些情况下，方法进一步包括使用识别的甲基化状态和大小来输出电子报告，该电子报告指示对象患有疾病或处于患有疾病的风险中。在一些情况下，方法进一步包括使用识别的甲基化状态和大小来为疾病的对象提供治疗干预。在一些情况下，方法进一步包括使用识别的甲基化状态和大小来治疗对象的疾病。在一些情况下，通过对对象施用化疗或免疫疗法来治疗对象。在一些情况下，方法进一步包括使用识别的甲基化状态和大小来监测对象的进展或消退。

在另一方面，提供了用于处理从对象的无细胞生物样品中衍生的多个核酸分子的方法，包括：(a)使多个核酸分子或其衍生物与多个结合剂接触，以提供耦联到多个结合剂的多个核酸分子的第一子集和多个核酸分子的第二子集；(b)将耦联到多个结合剂的多个核酸分子的第一子集与多个核酸分子的第二子集分离；(c)在(b)之后，使从多个核酸分子的第一子集中衍生的核酸分子环化以获得环化核酸分子的第一子集；(d)在(b)之后，使从多个核酸分子的第二子集中衍生的核酸分子环化以获得环化核酸分子的第二子集；(e)对环化核酸分子的第一子集或其衍生物进行测序以获得第一大小，并对环化核酸分子的第二子集或其衍生物进行测序以获得第二大小；(f)将第一大小与第二大小进行比较以确定对象的疾病水平。

在另一方面，提供了用于处理从对象的无细胞生物样品中衍生的多个核酸分子的方法，包括：(a)使多个核酸分子或其衍生物与多个结合剂接触，以提供耦联到多个结合剂的多个核酸分子的第一子集和多个核酸分子的第二子集；(b)将耦联到多个结合剂的多个核酸分子的第一子集与多个核酸分子的第二子集分离；(c)在(b)之后，使从多个核酸分子的第一子集中衍生的核酸分子环化以获得环化核酸分子的第一子集；(d)在(b)之后，使从多个核酸分子的第二子集中衍生的核酸分子环化以获得环化核酸分子的第二子集；(e)对环化核酸分子的第一子集或其衍生物进行测序以获得第一末端序列，并对环化核酸分子的第二子集或其衍生物进行测序以获得第二末端序列；(f)将第一末端序列与第二末端序列进行比较以确定对象的疾病水平。

援引并入

本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同特别地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用而并入。

附图说明

本发明的新颖特征在所附权利要求书中进行了具体阐述。通过参考以下对利用了本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述及其附图(本文也称为“附图”和“图”)，将会获得对本发明的特征和优点的更好的了解，在附图中：

图1示意性地图示了可被编程或以其他方式被配置为实现本公开的方法的计算机系统。

具体实施方式

尽管本文已经示出和描述了本发明的各种实施方案，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，此类实施方案仅作为示例提供。在不背离本发明的情况下，本领域技术人员可以想到许多变化、改变和替换。应当理解，可以采用本文所述的本发明实施方案的各种替代方案。

如本文所用，术语“约”或“大约”是指在由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这可能部分取决于如何测量或确定该值，即测量系统的局限性。例如，根据本领域的实践，“约”可以表示在1个或大于1个标准偏差内。作为另一个示例，“约”可以表示给定值的最多20％、最多10％、最多5％或最多1％的范围。关于生物系统或过程，术语“约”可以表示在一个数量级之内，诸如在一个值的5倍或2倍之内。在申请和权利要求书中描述了特定值的情况下，除非另有说明，否则术语“约”是指在特定值的可接受误差范围内。

如本文所用，术语“多核苷酸”通常是指任何长度的核苷酸的聚合形式，无论是脱氧核糖核苷酸(DNA)或核糖核苷酸(RNA)或其类似物。多核苷酸可以是核酸分子。多核苷酸(或寡核苷酸)可以具有核苷酸或核酸序列。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何功能。以下是多核苷酸的非限制性示例：无细胞核酸、无细胞DNA(cfDNA)、无细胞RNA(cfRNA)、循环肿瘤DNA(ctDNA)、循环肿瘤RNA(ctRNA)、基因或基因片段的编码区或非编码区、连锁分析定义的一个基因座(多个基因座)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含一种或多种修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可以在聚合物组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸序列可以被非核苷酸组分打断。多核苷酸可以在聚合后进一步修饰，诸如通过与标记组分缀合。

如本文所用，术语“对象”通常是指脊椎动物，诸如哺乳动物(例如，人类)。哺乳动物包括但不限于鼠类、猿猴、人类、农场动物、竞技用动物和宠物(例如，狗或猫)。还包括在体内获得或在体外培养的生物实体的组织、细胞和它们的后代。对象可以是患者。对象可能有与疾病(例如，癌症)相关的症状。或者，对象可能没有与疾病相关的症状。

如本文所用，术语“生物样品”通常是指源自或获得自诸如哺乳动物(例如，人类)等对象的样品。生物样品可以包括但不限于头发、指甲、皮肤、汗液、眼泪、眼液、鼻拭子或鼻咽洗液、痰、咽拭子、唾液、黏液、血液、血清、血浆、胎盘液、羊膜液、脐带血、重点流体(emphatic fluid)、腔液、耳垢、油、腺体分泌物、胆汁、淋巴液、脓汁、微生物群、胎粪、母乳、骨髓、骨骼、中枢神经系统(CNS)组织、脑脊液、脂肪组织、滑液、粪便、胃液、尿液、精液、阴道分泌物、胃、小肠、大肠、直肠、胰腺、肝脏、肾脏、膀胱、肺和其他源自或获得自对象的组织和液体。生物样品可以是无细胞的(或没有细胞的)生物样品。

如本文所用，术语“无细胞生物样品”通常是指源自或获得自对象的不含细胞的样品。无细胞生物样品可以包括一个或多个无细胞分子，诸如无细胞DNA、无细胞RNA或无细胞多肽(例如，蛋白质)。无细胞生物样品可以包括但不限于血液、血清、血浆、鼻拭子或鼻咽洗液、唾液、尿液、胃液、眼泪、粪便、黏液、汗液、耳垢、油、腺体分泌物、胆汁、淋巴液、脑脊液、组织、精液、阴道液、间质液(包括源自肿瘤组织的间质液)、眼液、脊髓液、咽拭子、呼吸、头发、指甲、皮肤、活体组织切片、胎盘液、羊膜液、脐带血、重点流体、腔体液、痰、脓汁、微生物群、胎粪、母乳和/或其他排泄物。

如本文所用，术语“结合剂”通常是指与核酸结合的材料。结合剂可以包括但不限于抗体或其片段、多肽、链霉亲和素、核酸、DNA探针或RNA探针中的一个或多个。

如本文所用，术语“早期癌症”和“非转移性癌症”通常是指可能尚未在对象中转移的癌症(即，癌症尚未离开其初始位置以扩散到其他位置)。早期癌症可能会在对象中转移。替代地，早期癌症可能不会在对象中转移。确切的分期可能取决于癌症的类型。

如本文所用，术语“肿瘤负担”和“肿瘤负荷”通常是指对象体内肿瘤的大小或癌症的量。

每当术语“至少”、“大于”或“大于或等于”在一系列两个或更多个数值中的第一个数值之前时，术语“至少”、“大于”或“大于或等于”适用于该系列数值中的每个数值。例如，大于或等于1、2或3等价于大于或等于1、大于或等于2或大于或等于3。

每当术语“不大于”、“小于”或“小于或等于”在一系列两个或更多个数值中的第一个数值之前时，术语“不大于”、“小于”或“小于或等于”适用于该系列数值中的每个数值。例如，小于或等于3、2或1等价于小于或等于3、小于或等于2或小于或等于1。

本文提供了用于分析来自无细胞生物样品的核酸的方法、系统和组合物，其包括选择无细胞生物样品的至少一个核酸子集。一些这样的方法可以包括使用结合剂(诸如抗体或其片段)对核酸(诸如甲基化的核酸或与蛋白质(诸如核酸结合蛋白(例如，转录因子))结合的核酸)进行免疫沉淀，以及分离结合的核酸用于进一步分析，诸如序列或大小分析。

用于选择性核酸分析的方法

本文提供了用于选择性核酸分析的方法。在一些情况下，用于处理从无细胞生物样品中衍生的多个核酸分子的方法包括使多个核酸分子与诸如抗体或其片段的多个结合剂接触。这提供了耦联到多个抗体或其片段的多个核酸分子的第一子集和多个核酸分子的第二子集。接下来，可以将耦联到多个抗体或其片段的多个核酸分子的第一子集与多个核酸分子的第二子集分离。接下来，可以使从多个核酸分子的第一子集中衍生的核酸分子环化以获得环化核酸分子。然后，该方法包括识别环化核酸分子或其衍生物。

在本文提供的用于选择性核酸分析的方法的方面中，在一些情况下，多个核酸分子包括脱氧核糖核酸(DNA)分子。在一些情况下，多个核酸分子包括核糖核酸(RNA)分子。在一些情况下，多个核酸分子包括RNA分子和DNA分子的混合物。

在本文提供的用于选择性核酸分析的方法的方面中，在一些情况下，环化包括将核酸分子的5’端和3’端相互连接。在一些情况下，环化包括将衔接子耦联到核酸分子的3’端、5’端或5’端和3’端两者。

在本文提供的用于选择性核酸分析的方法的方面中，在一些情况下，方法进一步包括对环化核酸分子进行核酸扩增以生成环化核酸分子的多个扩增产物，其中识别步骤包括识别多个核酸扩增产物。在一些情况下，核酸扩增通过具有链置换活性的聚合酶来实现。在一些情况下，核酸扩增通过不具有链置换活性的聚合酶来实现。在一些情况下，核酸扩增包括使环化核酸分子与包含随机引物的扩增反应混合物接触。在一些情况下，核酸扩增包括使环化核酸分子与包含一种或多种引物的扩增反应混合物接触，该一种或多种引物中的每一个经由序列互补性特异性地与不同靶序列杂交。在一些情况下，核酸扩增包括使环化核酸分子与包含一种或多种随机引物的扩增混合物接触。

在本文提供的用于选择性核酸分析的方法的方面中，在一些情况下，结合剂，诸如抗体或其片段与核酸特异性结合。在一些情况下，抗体或其片段与核酸结合蛋白特异性结合。在一些情况下，核酸结合蛋白是染色质蛋白。在一些情况下，核酸结合蛋白是组蛋白。在一些情况下，核酸结合蛋白是甲基CpG结合蛋白。在一些情况下，核酸结合蛋白是转录因子。在一些情况下，核酸结合蛋白是聚合酶。在一些情况下，核酸结合蛋白是核酸酶。在一些情况下，核酸结合蛋白包括锌指基序、螺旋-转角-螺旋基序或亮氨酸拉链基序。在一些情况下，核酸结合蛋白是RNA结合蛋白。在一些情况下，核酸结合蛋白是剪接蛋白或RNA运输蛋白。在一些情况下，抗体或其片段与核酸序列特异性结合。在一些情况下，抗体或其片段与甲基化的核酸序列特异性结合。在一些情况下，抗体或其片段与磷酸化的核酸序列特异性结合。在一些情况下，抗体或其片段与乙酰化的核酸序列特异性结合。在一些情况下，核酸分子耦联到多个抗体或其片段中的抗体或其片段。

在本文提供的用于选择性核酸分析的方法的方面中，在一些情况下，方法进一步包括确定多个无细胞核酸分子中的每个无细胞核酸分子的大小。在一些情况下，确定每个无细胞核酸分子的大小包括测序、电泳或其组合。

在本文提供的用于选择性核酸分析的方法的方面中，在一些情况下，识别环化核酸包括对环化核酸分子或其衍生物进行测序。在一些情况下，测序包括选自以下中的一种或多种的方法：合成测序、连接测序、纳米孔测序、纳米球测序、离子检测、杂交测序、聚合菌落(ROLONY)测序、纳米网格滚环测序(ROLONY)和离子激流测序。

在本文提供的用于选择性核酸分析的方法的方面中，在一些情况下，无细胞生物样品包含少于100纳克的核酸。在一些情况下，无细胞生物样品包含少于90纳克的核酸。在一些情况下，无细胞生物样品包含少于80纳克的核酸。在一些情况下，无细胞生物样品包含少于75纳克的核酸。在一些情况下，无细胞生物样品包含少于70纳克的核酸。在一些情况下，无细胞生物样品包含少于60纳克的核酸。在一些情况下，无细胞生物样品包含少于50纳克的核酸。

在本文提供的用于选择性核酸分析的方法的方面中，在一些情况下，无细胞生物样品包括体液。在一些情况下，体液是尿液、唾液、血液、血清、血浆、泪液、痰、脑脊液、滑液、黏液、胆汁、精液、淋巴液、羊膜液、月经液或其组合。

用于确定对象是否患有疾病或处于患有疾病的风险中的方法

本文提供了确定对象是否患有疾病或处于患有疾病的风险中的方法，包括本文的选择性核酸分析。在一些情况下，一些这样的方法包括使多个核酸分子与诸如抗体或其片段的多个结合剂接触，以提供耦联到多个抗体或其片段的多个核酸分子的第一子集和多个核酸分子的第二子集。接下来，在一些情况下，方法包括将耦联到多个抗体或其片段的多个核酸分子的第一子集与多个核酸分子的第二子集分离。接下来，该方法包括使从多个核酸分子的第一子集中衍生的核酸分子环化以获得环化核酸分子。然后，该方法包括识别环化核酸分子或其衍生物的序列，并对照多个参考序列处理该序列，以将该序列识别为对应于多个参考序列的至少一个子集，从而确定对象患有疾病或处于患有疾病的风险中。在一些情况下，多个核酸分子包括脱氧核糖核酸(DNA)分子或核糖核酸(RNA)分子。在一些情况下，核酸分子耦联到多个抗体或其片段中的抗体或其片段。

在本文提供的用于选择性核酸分析的方法的方面中，在一些情况下，环化包括将核酸分子的5’端和3’端相互连接。在一些情况下，环化包括将衔接子耦联到核酸分子的3’端、5’端或5’端和3’端两者。

在本文提供的用于诊断的方法的方面中，在一些情况下，方法进一步包括对环化核酸分子进行核酸扩增以生成环化核酸分子的多个扩增产物，其中识别步骤包括识别多个核酸扩增产物。在一些情况下，核酸扩增通过具有链置换活性的聚合酶来实现。在一些情况下，核酸扩增通过不具有链置换活性的聚合酶来实现。在一些情况下，核酸扩增包括使环化核酸分子与包含随机引物的扩增反应混合物接触。在一些情况下，核酸扩增包括使环化核酸分子与包含一种或多种引物的扩增反应混合物接触，该一种或多种引物中的每一个经由序列互补性特异性地与不同靶序列杂交。在一些情况下，核酸扩增包括使环化核酸分子与包含一种或多种随机引物的扩增混合物接触。

在本文提供的用于诊断的方法的方面中，在一些情况下，结合剂，诸如抗体或其片段与核酸特异性结合。在一些情况下，抗体或其片段与核酸结合蛋白特异性结合。在一些情况下，核酸结合蛋白是染色质蛋白。在一些情况下，核酸结合蛋白是组蛋白。在一些情况下，核酸结合蛋白是甲基CpG结合蛋白。在一些情况下，核酸结合蛋白是转录因子。在一些情况下，核酸结合蛋白是聚合酶。在一些情况下，核酸结合蛋白是核酸酶。在一些情况下，核酸结合蛋白包括锌指基序、螺旋-转角-螺旋基序或亮氨酸拉链基序。在一些情况下，核酸结合蛋白是RNA结合蛋白。在一些情况下，核酸结合蛋白是剪接蛋白或RNA运输蛋白。在一些情况下，抗体或其片段与核酸序列特异性结合。在一些情况下，抗体或其片段与甲基化的核酸序列特异性结合。在一些情况下，抗体或其片段与磷酸化的核酸序列特异性结合。在一些情况下，抗体或其片段与乙酰化的核酸序列特异性结合。在一些情况下，核酸分子耦联到多个抗体或其片段中的抗体或其片段。

在本文提供的用于诊断的方法的方面中，在一些情况下，方法进一步包括确定多个无细胞核酸分子中的每个无细胞核酸分子的大小。在一些情况下，确定每个无细胞核酸分子的大小包括测序、电泳或其组合。

在本文提供的用于诊断的方法的方面中，在一些情况下，识别环化核酸包括对环化核酸分子或其衍生物进行测序。在一些情况下，测序包括选自以下中的一种或多种的方法：合成测序、连接测序、纳米孔测序、纳米球测序、离子检测、杂交测序、聚合酶群落(POLONY)测序、纳米网格滚环测序(ROLONY)和离子激流测序。

在本文提供的用于诊断的方法的方面中，在一些情况下，无细胞生物样品包含少于100纳克的核酸。在一些情况下，无细胞生物样品包含少于90纳克的核酸。在一些情况下，无细胞生物样品包含少于80纳克的核酸。在一些情况下，无细胞生物样品包含少于75纳克的核酸。在一些情况下，无细胞生物样品包含少于70纳克的核酸。在一些情况下，无细胞生物样品包含少于60纳克的核酸。在一些情况下，无细胞生物样品包含少于50纳克的核酸。

在本文提供的用于诊断的方法的方面中，在一些情况下，无细胞生物样品包括体液。在一些情况下，体液是尿液、唾液、血液、血清、血浆、泪液、痰、脑脊液、滑液、黏液、胆汁、精液、淋巴液、羊膜液、月经液或其组合。

在本文提供的用于诊断的方法的方面中，在一些情况下，疾病是癌症。在一些情况下，癌症选自结肠癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、肝细胞癌、肝癌、皮肤癌、恶性黑色素瘤、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌、脑癌、白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。

在本文提供的用于诊断的方法的方面中，在一些情况下，方法进一步包括使用识别的序列来输出电子报告，该电子报告指示对象患有疾病或处于患有疾病的风险中。在一些情况下，方法进一步包括使用识别的序列来为疾病的对象提供治疗干预。在一些情况下，方法进一步包括使用识别的序列来治疗对象的疾病。

在本文提供的用于诊断的方法的方面中，在一些情况下，通过对对象施用化疗或免疫疗法来治疗对象。

在本文提供的用于诊断的方法的方面中，在一些情况下，方法进一步包括使用识别的序列来监测对象的进展或消退。

本文提供了确定对象是否患有疾病或处于患有疾病的风险中的方法，包括本文的选择性核酸分析。在一些情况下，方法包括：确定多个核酸分子中的核酸分子的甲基化状态并确定多个核酸分子中的核酸分子的大小。然后，该方法包括对照第一数据库处理多个核酸分子中的核酸分子的甲基化状态，以及对照第二数据库处理多个核酸分子中的核酸分子的大小。接下来，该方法包括识别甲基化状态和大小与至少一种疾病的关联，从而确定对象患有疾病或处于患有疾病的风险中。

在本文提供的用于诊断的方法的方面中，在一些情况下，疾病是癌症。在一些情况下，癌症选自结肠癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、肝细胞癌、肝癌、皮肤癌、恶性黑色素瘤、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌、脑癌、白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。

在本文提供的用于诊断的方法的方面中，在一些情况下，方法包括使用识别的甲基化状态和大小来输出电子报告，该电子报告指示对象患有疾病或处于患有疾病的风险中。在一些情况下，方法进一步包括使用识别的甲基化状态和大小来为疾病的对象提供治疗干预。在一些情况下，方法进一步包括使用识别的甲基化状态和大小来治疗对象的疾病。在一些情况下，通过对对象施用化疗或免疫疗法来治疗对象。在一些情况下，方法进一步包括使用识别的甲基化状态和大小来监测对象的进展或消退。

用于甲基化和大小核酸分析的方法

本文提供了使用甲基化状态和大小进行核酸分析的方法。在一些情况下，方法包括确定多个核酸分子中的核酸分子的甲基化状态并确定多个核酸分子中的核酸分子的大小。接下来，方法包括对照第一数据库处理多个核酸分子中的核酸分子的甲基化状态并对照第二数据库处理多个核酸分子中的核酸分子的大小。然后，方法包括识别核酸分子的甲基化状态和核酸分子的大小与至少一种疾病的关联。

在本文提供的用于选择性核酸分析的方法的方面中，在一些情况下，确定甲基化状态包括对多个核酸分子中的核酸分子进行测序。在一些情况下，测序包括选自以下中的一种或多种的方法：合成测序、连接测序、纳米孔测序、纳米球测序、离子检测、杂交测序、聚合酶群落(POLONY)测序、纳米网格滚环测序(ROLONY)和离子激流测序。在一些情况下，确定甲基化状态包括亚硫酸氢盐测序。

在本文提供的用于核酸分析的方法的方面中，在一些情况下，确定甲基化状态包括使核酸分子与抗体或其片段接触，该抗体或其片段与甲基化核酸特异性结合。在一些情况下，抗体或其片段与甲基化核酸结合蛋白或其片段特异性结合。

在本文提供的用于核酸分析的方法的方面中，在一些情况下，确定甲基化状态包括使多个核酸分子与多个抗体或其片段接触，以提供耦联到多个抗体或其片段的多个核酸分子的第一子集和多个核酸分子的第二子集。接下来，该方法包括将耦联到多个抗体或其片段的多个核酸分子的第一子集与多个核酸分子的第二子集分离。然后，该方法包括使从多个核酸分子的第一子集中衍生的核酸分子环化，以获得环化核酸分子并识别环化核酸分子或其衍生物。

在本文提供的用于核酸分析的方法的方面中，在一些情况下，多个核酸分子包括脱氧核糖核酸(DNA)分子。在一些情况下，多个核酸分子包括核糖核酸(RNA)分子。在一些情况下，多个核酸分子包括RNA分子和DNA分子的混合物。

在本文提供的用于核酸分析的方法的方面中，在一些情况下，环化包括将核酸分子的5’端和3’端相互连接。在一些情况下，环化包括将衔接子耦联到核酸分子的3’端、5’端或5’端和3’端两者。

在本文提供的用于核酸分析的方法的方面中，在一些情况下，方法进一步包括对环化核酸分子进行核酸扩增以生成环化核酸分子的多个扩增产物，其中识别步骤包括识别多个核酸扩增产物。在一些情况下，核酸扩增通过具有链置换活性的聚合酶来实现。在一些情况下，核酸扩增通过不具有链置换活性的聚合酶来实现。在一些情况下，核酸扩增包括使环化核酸分子与包含随机引物的扩增反应混合物接触。在一些情况下，核酸扩增包括使环化核酸分子与包含一种或多种引物的扩增反应混合物接触，该一种或多种引物中的每一个经由序列互补性特异性地与不同靶序列杂交。在一些情况下，核酸扩增包括将环化核酸分子与包含一种或多种随机引物的扩增混合物接触。

在本文提供的用于核酸分析的方法的方面中，在一些情况下，抗体或其片段与核酸特异性结合。在一些情况下，抗体或其片段与核酸结合蛋白特异性结合。在一些情况下，核酸结合蛋白是染色质蛋白。在一些情况下，核酸结合蛋白是组蛋白。在一些情况下，核酸结合蛋白是甲基CpG结合蛋白。在一些情况下，核酸结合蛋白是转录因子。在一些情况下，核酸结合蛋白是RNA结合蛋白。在一些情况下，抗体或其片段与核酸序列特异性结合。在一些情况下，抗体或其片段与甲基化的核酸序列特异性结合。在一些情况下，核酸分子耦联到多个抗体或其片段中的抗体或其片段。

在本文提供的用于核酸分析的方法的方面中，在一些情况下，方法进一步包括确定多个无细胞核酸分子中的每个无细胞核酸分子的大小。

在本文提供的用于核酸分析的方法的方面中，在一些情况下，识别环化核酸包括对环化核酸分子及其衍生物进行测序。在一些情况下，测序包括选自以下中的一种或多种的方法：合成测序、连接测序、纳米孔测序、纳米球测序、离子检测、杂交测序、聚合酶群落(POLONY)测序、纳米网格滚环测序(ROLONY)和离子激流测序。

在本文提供的用于核酸分析的方法的方面中，在一些情况下，无细胞生物样品包含少于100纳克的核酸。在一些情况下，无细胞生物样品包含少于90纳克的核酸。在一些情况下，无细胞生物样品包含少于80纳克的核酸。在一些情况下，无细胞生物样品包含少于75纳克的核酸。在一些情况下，无细胞生物样品包含少于70纳克的核酸。在一些情况下，无细胞生物样品包含少于60纳克的核酸。在一些情况下，无细胞生物样品包含少于50纳克的核酸。

在本文提供的用于选择性核酸分析的方法的方面中，在一些情况下，无细胞生物样品包括体液。在一些情况下，体液是尿液、唾液、血液、血清、血浆、泪液、痰、脑脊液、滑液、黏液、胆汁、精液、淋巴液、羊膜液、月经液或其组合。

系统和计算机辅助方法

本文提供了用于本文提供的选择性核酸分析方法的系统。在一些情况下，本文的系统包括计算机和处理单元，该计算机被配置为接收处理从无细胞生物样品中衍生的多个核酸分子的用户请求，该处理单元用于使多个核酸分子与诸如抗体或其片段的多个结合剂接触，以获得耦联到多个抗体或其片段的多个核酸分子的第一子集和多个核酸分子的第二子集。在一些情况下，该系统进一步包括分离单元，该分离单元用于将耦联到多个抗体或其片段的多个核酸分子的第一子集与多个核酸分子的第二子集分离。在一些情况下，该系统进一步包括环化单元，该环化单元用于使从多个核酸分子的第一子集中衍生的核酸分子环化以获得环化核酸分子。在一些情况下，该系统进一步包括识别单元，该识别单元用于识别环化核酸分子或其衍生物。在一些情况下，该系统附加地包括报告生成器，该报告生成器向接收者发送包含环化核酸分子或其衍生物的身份的报告。

用于该系统的计算机可以包括一个或多个处理器。处理器可以与一个或多个控制器、计算单元和/或计算机系统的其他单元相关联，或者根据需要植入固件中。如果在软件中实现，则例程可以存储在任何计算机可读存储器中，诸如RAM、ROM、闪存、磁盘、激光盘或其他合适的存储介质。同样，该软件可以经由任何已知的交付方法交付给计算设备，包括例如经由诸如电话线、互联网、无线连接等的通信信道，或经由诸如计算机可读磁盘、闪存驱动器等的可传输介质。各种步骤可以实现为各种块、操作、工具、模块和技术，而这些块、操作、工具、模块和技术又可以在硬件、固件、软件或者硬件、固件和/或软件的任何组合中实现。当在硬件中实现时，一些或所有块、操作、技术等可以在例如定制集成电路(IC)、应用专用集成电路(ASIC)、现场可编程逻辑阵列(FPGA)、可编程逻辑阵列(PLA)等中实现。可以在系统的实施方案中使用客户端-服务器、关系数据库架构。客户端-服务器架构是一种网络架构，其中网络上的每台计算机或进程要么是客户端，要么是服务器。服务器计算机通常是功能强大的计算机，专用于管理磁盘驱动器(文件服务器)、打印机(打印服务器)或网络流量(网络服务器)。客户端计算机包括用户在其上运行应用程序的PC(个人计算机)或工作站，以及如本文所公开的示例输出设备。客户端计算机依赖服务器计算机获取资源，诸如文件、设备甚至处理能力。在一些实施方案中，服务器计算机处理所有数据库功能。客户端计算机可以具有处理所有前端数据管理的软件，也可以接收来自用户的数据输入。

系统可以被配置为接收用户请求以对样品进行检测反应。用户请求可以是直接的或间接的。直接请求的示例包括通过输入设备(诸如键盘、鼠标或触摸屏)传输的请求。间接请求的示例包括经由诸如通过互联网(有线的或无线的)等通信介质的传输。

该系统可以进一步包括响应于用户请求对样品或其一部分进行核酸扩增反应的扩增系统。多种扩增多核苷酸(例如DNA和/或RNA)的方法是可用的。扩增可以是线性的、指数的，或在多相扩增过程中涉及线性相和指数相两者。扩增方法可能涉及温度变化，诸如热变性步骤，或者可能是不需要热变性的等温过程。本文描述了合适的扩增过程的非限制性示例，诸如与本公开的各个方面中的任何一个相关。在一些实施方案中，扩增包括滚环扩增(RCA)。多种用于扩增多核苷酸的系统是可用的，并且可以根据要进行的扩增反应的类型而变化。例如，对于包括温度变化循环的扩增方法，扩增系统可以包括热循环仪。扩增系统可以包括实时扩增和检测仪器，诸如由Applied Biosystmes、Roche和Stratagene制造的系统。在一些实施方案中，扩增反应包括以下步骤：(i)环化单个多核苷酸以形成多个环状多核苷酸，该环状多核苷酸中的每一个在5’端与3’端之间具有接点；和(ii)扩增环状多核苷酸。样品、多核苷酸、引物、聚合酶和其他试剂可以是本文所述的任何那些，诸如与各个方面的任何一个相关。本文提供了环化过程(例如，有和没有衔接子寡核苷酸)、试剂(例如，衔接子类型、连接酶的使用)、反应条件(例如，有利于自接合)、可选的附加处理(例如，反应后纯化)和由此形成的接点的非限制性示例，诸如与本公开的各个方面中的任何一个相关。可以选择和/或设计系统来执行任何这样的方法。

系统可以进一步包括测序系统，该测序系统生成由扩增系统扩增的多核苷酸的测序读数，识别测序读数与参考序列之间的序列差异，并将在具有不同接点的至少两个环状多核苷酸中发生的序列差异判定为序列变体。测序系统和扩增系统可以是相同的，或者包括重叠的设备。例如，扩增系统和测序系统都可以使用相同的热循环仪。系统中有多种测序平台可供使用，可根据所选测序方法进行选择。本文描述了测序方法的示例。扩增和测序可能涉及使用液体处理器。可以使用几种市售的液体处理系统来自动化运行这些过程(参见例如来自Perkin-Elmer、Beckman Coulter、Caliper Life Sciences、Tecan、Eppendorf、Apricot Design、Velocity 11的液体处理器作为示例)。市售多种自动化测序机器，包括由Life Technologies(SOLiD平台和基于pH的检测)、Roche(454平台)、Illumina(例如，诸如Genome Analyzer设备等基于流动池的系统)制造的测序仪。在2、3、4、5或更多个自动化设备之间(例如在一个或多个液体处理器与测序设备之间)的转移可以是手动的或自动化的。

该系统可以进一步包括向接收者发送报告的报告生成器，其中该报告含有用于检测序列变体的结果。可以实时生成报告，诸如在处理期间或在分析数据时，其中随着过程的进展定期更新。附加地或替代地，可以在分析结束时生成报告。报告可以自动生成，诸如当系统完成识别环状核酸的步骤时。在一些实施方案中，响应于来自用户的指令生成报告。除了识别核酸的结果之外，报告还可以包含基于识别的核酸的分析。例如，在一个或多个序列变体与特定污染物或表型相关联的情况下，报告可以包含有关该关联的信息，诸如污染物或表型存在的可能性、存在的水平，以及可选地基于该信息的建议(例如附加测试、监控或补救措施)。报告可以采用多种形式中的任何一种。可以设想，与本公开相关的数据可以通过这样的网络或连接(或用于传输信息的任何其他合适的方法，包括但不限于邮寄实体报告，诸如打印稿)传输以供接收方接收和/或审查。接收方可以是但不限于个人或电子系统(例如，一个或多个计算机，和/或一个或多个服务器)。

包括计算机可执行代码的机器可读介质可以采取多种形式，包括但不限于有形存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质包括例如光盘或磁盘(诸如任何计算机中的任何存储设备)等，诸如可用于实现数据库的非易失性存储介质等。易失性存储介质包括动态存储器，诸如此类计算机平台的主存储器。有形传输介质包括同轴电缆；铜线和光纤，包括构成计算机系统内总线的导线。载波传输介质可以采用电信号或电磁信号，或者声波或光波的形式，诸如在射频(RF)和红外(IR)数据通信期间所生成的那些。因此，计算机可读介质的常见形式包括，例如：软盘、柔性盘、硬盘、磁带、任何其他磁性介质、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、任何其他光学介质、穿孔卡片纸带、任何其他带有孔洞图案的物理存储介质、RAM、ROM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、任何其他存储芯片或盒、传输数据或指令的载波、传输此类载波的缆线或链路，或者计算机可以从中读取编程代码和/或数据的任何其他介质。许多这些形式的计算机可读介质可参与将一个或多个序列的一个或多个指令传送到处理器以供执行。

本计算机可执行代码可以在包括处理器的任何合适的设备上执行，该设备包括服务器、PC或诸如智能电话或平板电脑等的移动设备。任何控制器或计算机可选地包括监控器，该监控器可以是阴极射线管(“CRT”)显示器、平板显示器(例如，有源矩阵液晶显示器、液晶显示器等)，或其他。计算机电路通常放置在盒子中，该盒子包含许多集成电路芯片，诸如微处理器、存储器、接口电路等。该盒子还可选地包含硬盘驱动器、软盘驱动器、诸如可写CD-ROM等的高容量可移动驱动器以及其他常见的外围元件。诸如键盘、鼠标或触敏屏幕等的输入设备可选地提供来自用户的输入。计算机可以包括用于接收用户指令的适当软件，该软件或者以用户输入成一组参数字段的形式，例如，在GUI中，或者以预编程指令的形式，例如，被预编程用于各种不同的特定操作。

文库制备和扩增的方法

在某些情况下，本文的方法包括扩增来自对象的样品中存在的多核苷酸。本文使用的扩增方法通常包括滚环扩增。替代地或组合地，本文使用的扩增方法包括PCR。在一些情况下，本文的扩增方法包括线性扩增。扩增通常不针对一个基因或一组基因，而是扩增整个核酸样品。在一些情况下，该方法包括(a)环化多个多核苷酸中的单个多核苷酸以形成多个环状多核苷酸，该环状多核苷酸中的每一个在5’端与3’端之间具有接点；和(b)扩增(a)的环状多核苷酸以产生扩增的多核苷酸。在另外的情况下，扩增方法包括(c)剪切扩增的多核苷酸以产生剪切的多核苷酸，每个剪切的多核苷酸在5’端和/或3’端包含一个或多个剪切点。在一些情况下，该方法不包括富集靶序列。

通常，将多核苷酸的末端彼此接合以形成环状多核苷酸(直接接合，或通过一个或多个中间衔接子寡核苷酸接合)产生具有接合序列的接点。当多核苷酸的5’端和3’端通过衔接子多核苷酸接合时，术语“接点”可以指多核苷酸与衔接子之间的接点(例如，5’端接点或3’端接点之一)，或指多核苷酸的5’端和3’端之间由衔接子多核苷酸形成且包含衔接子多核苷酸的接点。当多核苷酸的5’端和3’端在没有间插衔接子的情况下接合时(例如单链DNA的5’端和3’端)，术语“接点”指这两个末端接合的点。接点可以通过构成该接点的核苷酸序列(也称为“接合序列”)来识别。

本文的样品包含具有通过以下过程形成的末端混合物的多核苷酸：自然降解过程(如细胞裂解、细胞死亡和多核苷酸如DNA和RNA从细胞释放到其周围环境的其他过程，多核苷酸在该周围环境中可进一步降解，如无细胞多核苷酸，如无细胞DNA和无细胞RNA)、作为样品处理的副产物的片段化(诸如固定、染色和/或储存过程)，以及通过切割不限于特定靶序列的DNA的方法进行的片段化(例如，机械片段化，如通过超声处理；非序列特异性核酸酶处理，如DNA酶I、片段化酶)。当样品包含具有末端混合物的多核苷酸时，两个多核苷酸具有相同5’端或3’端的可能性较低，并且两个多核苷酸独立地具有相同5’端和3’端的可能性更低。因此，在一些实施方案中，即使两个多核苷酸包含具有相同靶序列的部分，也可以使用接点来区分不同的多核苷酸。当多核苷酸末端在没有间插衔接子的情况下接合时，可以通过与参考序列比对来识别接合序列。例如，在两个组成序列的顺序相对于参考序列似乎颠倒的情况下，似乎发生颠倒的点可以表示在该点处的接点。当多核苷酸末端通过一个或多个衔接子序列接合时，可以通过与已知衔接子序列的接近度识别接点，或者如果测序读取的长度足以从环化多核苷酸的5’和3’端获得序列，则通过如上所述的比对来识别接点。在一些实施方案中，特定接点的形成是非常罕见的事件，使得其在样品的环化多核苷酸中是独特的。

在一些实施方案中，环化单个多核苷酸通过使多个多核苷酸经受连接反应来实现。连接反应可以包括连接酶。在一些情况下，连接酶是单链DNA或RNA连接酶。在一些情况下，连接酶是双链DNA连接酶。在一些实施方案中，连接酶在(b)中的扩增之前被降解。在(b)中的扩增之前降解连接酶可以增加可扩增多核苷酸的回收率。在一些实施方案中，多个环化多核苷酸在(b)之前没有被纯化或分离。在一些实施方案中，未环化的线性多核苷酸在扩增之前被降解。在一些情况下，多个多核苷酸在环化之前被变性以产生单链多核苷酸；在一些情况下，多个多核苷酸在环化之前未被变性。

在一些情况下，(a)中的环化包括将衔接子多核苷酸接合到多个多核苷酸中的多核苷酸的5’端、3’端或5’端和3’端二者的步骤。如前所述，当多核苷酸的5’端和/或3’端通过衔接子多核苷酸接合时，术语“接点”可以指多核苷酸与衔接子之间的接点(例如，5’端接点或3’端接点之一)，或指多核苷酸的5’端和3’端之间由衔接子多核苷酸形成且包含衔接子多核苷酸的接点。

在一些情况下，例如在连接酶降解后，扩增环化多核苷酸以产出扩增的多核苷酸。扩增环状多核苷酸可以通过聚合酶来实现。在一些情况下，聚合酶是具有链置换活性的聚合酶。在一些情况下，聚合酶是Phi29 DNA聚合酶。或者，聚合酶是不具有链置换活性的聚合酶。在一些情况下，聚合酶是T4 DNA聚合酶或T7 DNA聚合酶。替代地或组合地，聚合酶是Taq聚合酶，或Taq聚合酶家族中的聚合酶。在一些情况下，聚合酶是逆转录酶。在一些情况下，扩增包括滚环扩增(RCA)。由RCA产生的扩增的多核苷酸可以包含线性多联体，或包含来自模板多核苷酸的多于一个拷贝的靶序列(例如，亚基序列)的多核苷酸。在一些实施方案中，扩增包括使环状多核苷酸经受包含随机引物的扩增反应混合物。在一些情况下，扩增包括使环状多核苷酸经受包含一种或多种引物的扩增反应混合物，该一种或多种引物中的每一个经由序列互补性与不同的靶序列特异性杂交。在一些情况下，扩增包括使环状多核苷酸经受包含反向引物的扩增反应混合物。

在一些情况下，将扩增的多核苷酸剪切，以产生长度相对于未剪切多核苷酸更短的剪切多核苷酸。源自相同线性多联体的两个或更多个剪切的多核苷酸可具有相同的接合序列，但可具有不同的5’和/或3’端(例如剪切末端)。

来自样品的无细胞多核苷酸可以是多种多核苷酸中的任何一种，包括但不限于，DNA、RNA、核糖体RNA(rRNA)、转移RNA(tRNA)、微小RNA(miRNA)、信使RNA(mRNA)、小干扰RNA(siRNA)、任何这些的片段，或任何两个或更多个这些的组合。在一些实施方案中，样品包含DNA。在一些实施方案中，样品包含无细胞基因组DNA。在一些实施方案中，样品包含通过扩增产生的DNA，例如通过使用引物和DNA聚合酶的任何合适的组合的引物延伸反应，包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、逆转录及其组合。当引物延伸反应的模板是RNA时，逆转录产物称为互补DNA(cDNA)。用于引物延伸反应的引物可包含对一种或多种靶标特异的序列、随机序列、部分随机序列及其组合。通常，样品多核苷酸包含样品中存在的任何多核苷酸，其可以包含或不包含靶多核苷酸。多核苷酸可以是单链、双链或其组合。在一些实施方案中，可经历本公开内容方法的多核苷酸是单链多核苷酸，其可以存在或不存在双链多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸是单链DNA。单链DNA(ssDNA)可以是以单链形式分离的ssDNA，或以双链形式分离并随后出于本公开方法中的一个或多个步骤的目的而制成单链的DNA。

在一些实施方案中，在没有提取步骤和/或没有纯化步骤的情况下使多核苷酸经历后续步骤(例如环化和扩增)。例如，可以在没有提取步骤的情况下处理流体样品以除去细胞，从而产生纯化的液体样品和细胞样品，然后从纯化的流体样品中分离DNA。有多种分离多核苷酸的方法可用，例如通过沉淀，或与基底非特异性结合并随后洗涤该基底以释放结合的多核苷酸。在没有细胞提取步骤的情况下从样品中分离多核苷酸时，多核苷酸将主要是细胞外或“无细胞”多核苷酸，如无细胞DNA和无细胞RNA，其可以对应于死亡或受损的细胞。这些细胞的特性可用于表征其所源自的细胞或细胞群，如肿瘤细胞(例如癌症检测时)、胎儿细胞(例如产前诊断时)、来自移植组织的细胞(例如移植失败的早期检测时)或微生物群落的成员。

如果处理样品以例如从样品中的细胞提取多核苷酸，则可使用多种提取方法。例如，可以通过用苯酚、苯酚/氯仿/异戊醇或类似制剂(包括TRIzol和TriReagent)进行有机提取来纯化核酸。提取技术的其他非限制性实例包括：(1)有机萃取然后乙醇沉淀，例如，使用苯酚/氯仿有机试剂(Ausubel等人，1993，其通过引用全部并入本文)，使用或不使用自动核酸提取器，例如可从Applied Biosystems(Foster city,Calif)获得的341DNA型提取器；(2)固定相吸附法(美国专利号5,234,809；Walsh等人，1991，其中每一个均通过引用全部并入本文)；和(3)盐诱导核酸沉淀法(Miller等人，(1988)，其通过引用全部并入本文)，该沉淀方法一般被称作“盐析”法。核酸分离和/或纯化的另一个实例包括使用核酸能够特异性或非特异性结合的磁性颗粒，然后使用磁体分离珠子，并洗涤和从珠子中洗脱核酸(参见，例如，美国专利号5,705,628，其通过引用全部并入本文)。在一些实施方案中，上述分离方法之前可先进行酶消化步骤以帮助从样品中去除不需要的蛋白质，例如用蛋白酶K或其他类似的蛋白酶进行消化。参见，例如，美国专利号7,001,724，其通过引用全部并入本文。如果需要，可向裂解缓冲液中添加RNase抑制剂。对于特定的细胞或样品类型，可能需要在方案中增加蛋白质变性/消化步骤。纯化方法可以针对分离DNA、RNA或此两者。当DNA和RNA在提取程序过程中或之后被一起分离时，可使用进一步的步骤来与另一种分开地纯化一种或两者。也可生成提取的核酸的亚级分，例如，根据大小、序列或其他物理或化学特性进行纯化。除了初始核酸分离步骤，核酸的纯化还可以在所公开的方法的任意步骤之后进行，例如用于去除过量的或不需要的试剂、反应物或产物。多种用来确定样品中的核酸量和/或核酸纯度的方法是可用的，例如通过吸光度(例如，在260nm、280nm处的光吸收，和其比值)和标记物的检测(例如，荧光染料和嵌入剂，例如SYBR绿、SYBR蓝、DAPI、碘化丙锭、Hoechst染色剂、SYBR金、溴化乙锭)。

在一些情况下，本文的方法包括从多核苷酸制备DNA文库。例如，本文的方法包括制备单链DNA文库。任何合适的制备单链DNA文库的方法都可以用于本文的方法中。例如，制备单链DNA文库的方法包括使DNA样品变性以产生多个ssDNA；通过非模板合成将衔接子连接到ssDNA分子的3’端或延伸ssDNA分子的3’端；使用与衔接子或3’延伸序列互补的引物合成第二链；将双链衔接子连接到延伸产物；使用靶向第一衔接子和第二衔接子的引物(例如，使用PCR)扩增第二链；以及在测序仪上对文库进行测序。制备单链文库的附加方法包括使DNA样品变性以产生多个ssDNA；将衔接子连接到ssDNA分子的3’端；使用与衔接子互补的引物合成第二链；将双链衔接子连接到延伸产物；使用靶向第一衔接子和第二衔接子的引物(例如，通过PCR)扩增第二链；任选地使用与捕获探针杂交来富集感兴趣的区域；(例如，通过PCR)扩增捕获的产物；以及在测序仪上对文库进行测序。

单链文库制备的进一步示例包括一种方法，该方法包括以下步骤：用不耐热磷酸酶处理DNA，以从DNA链的5’端和3’端去除残留的磷酸基团；从DNA链去除源自胞嘧啶脱氨基作用的脱氧尿嘧啶；将具有约10个核苷酸和长3’生物素化间隔臂的5’-磷酸化衔接子寡核苷酸连接到DNA链的3’端；将衔接子连接的分子固定在链霉亲和素珠上；使用Bst聚合酶，使用与衔接子互补的5’加尾引物复制模板链；洗去多余的引物；使用T4 DNA聚合酶去除3’突出端；使用平端连接将第二衔接子接合到新合成的链；洗去多余的衔接子；通过热变性释放文库分子；通过使用加尾引物扩增添加包括条形码在内的全长衔接子序列；并对文库进行测序，如Gansauge等人2013.Nature Protocols.8(4)737-748中所述，其通过引用将其全部并入本文。

在另外的实施方案中，本文的方法包括制备双链DNA文库。任何合适的制备双链DNA文库的方法都可以用于本文的方法中。例如，制备双链DNA文库的方法包括将测序衔接子连接到多个DNA片段的5’端和3’端并在测序仪上对文库进行测序。制备双链DNA文库的附加方法包括将衔接子连接到多个DNA片段的5’端和3’端；使用与连接的衔接子互补的引物，通过PCR将完整的衔接子序列附接到连接的片段上；并在测序仪上对文库进行测序。进一步方法包括将衔接子连接到多个DNA片段的5’端和3’端；通过与连接的衔接子互补的PCR扩增连接的产物；任选地通过与捕获探针杂交来富集感兴趣的区域；PCR扩增捕获的产物；并在测序仪上对文库进行测序。制备双链文库的附加方法包括将衔接子连接到多个DNA片段的5’端和3’端；使用与连接的衔接子互补的引物通过PCR扩增连接的产物；使双链PCR产物环化或使单链PCR产物变性和环化；任选地，使用靶向特定基因的引物通过PCR富集感兴趣的区域；并在测序仪上对文库进行测序。

双链文库制备的进一步示例包括Kinde等人(Kinde等人,2011.Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,108(23)9530-9535，其通过引用完全并入本文)中描述的安全测序系统(Safe-Sequencing System)，该系统包括为每个模板分子分配唯一标识符(UID)；扩增每个独特标记的模板分子以创建UID家族；和扩增产物的冗余测序。附加示例包括Lv等人(Lv等人,2015.Clin.Chem.,61(1)172-181，其通过引用整体并入本文)中描述的环化单分子扩增和重测序技术(cSMART)，该技术用独特的条形码标记单个分子，环化、靶向等位基因以通过反向PCR复制，继而对制备的文库测序并计算存在的等位基因。

在附加文库制备方法中，使用抗体选择具有某些特征的cfDNA片段。在一些情况下，使用抗体选择甲基化或高甲基化的cfDNA片段。继而将选定的cfDNA片段用于本文所述的任何文库制备方法，包括环化、单链DNA文库制备和双链DNA文库制备。对此类分离的cfDNA片段进行测序可提供有关cfDNA中存在的特征的信息，包括诸如甲基化或高甲基化等的修饰。

根据一些实施方案，来自样品的多种多核苷酸中的多核苷酸被环化。环化可包括将多核苷酸的5’端接合到同一多核苷酸的3’端，接合到样品中的另一多核苷酸的3’端，或接合到来自不同来源的多核苷酸(例如，人工多核苷酸，如寡核苷酸衔接子)的3’端。在一些实施方案中，多核苷酸的5’端接合到同一多核苷酸的3’端(也称为“自接合”)。在一些实施方案中，选择环化反应的条件以利于在特定长度范围内的多核苷酸的自接合，以便生成具有特定平均长度的环化多核苷酸群体。例如，可以选择环化反应条件以利于长度短于约5000、2500、1000、750、500、400、300、200、150、100、50个或更少的核苷酸的多核苷酸的自接合。在一些实施方案中，偏向于长度为50-5000个核苷酸、100-2500个核苷酸或150-500个核苷酸的片段，以使得环化多核苷酸的平均长度落入各自的范围内。在一些实施方案中，80％或更多的环化片段的长度为50-500个核苷酸，例如长度为50-200个核苷酸。可以优化的反应条件包括分配给接合反应的时间长度、各种试剂的浓度和待接合的多核苷酸的浓度。在一些实施方案中，环化反应保持在环化前存在于样品中的片段长度的分布。例如，环化前样品中的片段长度以及环化多核苷酸的平均值、中值、众数(mode)和标准差中的一个或多个彼此在75％、80％、90％、95％或更高的百分比以内。

在一些情况下，使用一种或多种衔接子寡核苷酸，使得样品中多核苷酸的5’端和3’端通过一个或多个间插衔接子寡核苷酸接合形成环状多核苷酸，而不是优先形成自接合环化产物。例如，多核苷酸的5’端可以接合至衔接子的3’端，而同一衔接子的5’端可以接合至同一多核苷酸的3’端。衔接子寡核苷酸包括具有某种序列的任意寡核苷酸，该序列的至少一部分是已知的，它能够与样品多核苷酸连接。衔接子寡核苷酸可以包含DNA、RNA、核苷酸类似物、非典型核苷酸、标记的核苷酸、修饰的核苷酸或其组合。衔接子寡核苷酸可以是单链的、双链的或部分双链体。通常，部分双链体衔接子包含一个或多个单链区域和一个或多个双链区域。双链衔接子可包含彼此相互杂交的两个分离的寡核苷酸(也称作“寡核苷酸双链体”)，并且杂交可留下一个或多个平端、一个或多个3’突出端、一个或多个5’突出端、一个或多个由错配的和/或不配对的核苷酸所导致的凸起，或其任意组合。当衔接子的两个杂交区域被非杂交区域彼此分开时，会产生“气泡”结构。不同种类的衔接子，例如具有不同序列的衔接子，可以组合使用。不同的衔接子可以在顺序的反应中或同时地接合到样品多核苷酸。在一些实施方案中，将相同的衔接子添加至靶多核苷酸的两端。例如，可以将第一和第二衔接子添加到相同的反应中。可以在与样品多核苷酸组合之前操作衔接子。例如，可以添加或去除末端磷酸盐。

在使用衔接子寡核苷酸的情况下，衔接子寡核苷酸可包含多种序列元件中的一个或多个，包括但不限于，一个或多种扩增引物退火序列或其互补体、一个或多个测序引物退火序列或其互补体、一个或多个条形码序列、一个或多个在多个不同衔接子或不同衔接子的子集之间共有的共同序列、一个或多个限制酶识别位点、与一个或多个靶多核苷酸突出端互补的一个或多个突出端、一个或多个探针结合位点(例如，用于附接至测序平台，如用于大规模平行测序的流动池，如Illumina,Inc.开发的流动池)、一个或多个随机的或接近随机的序列(例如，在一个或多个位置处从一组两个或更多个不同核苷酸中随机选择的一个或多个核苷酸，其中在一个或多个位置处选择的不同核苷酸中的每一个均表现在包含随机序列的一组衔接子中)，或其组合。在一些情况下，衔接子可用于纯化这些含有衔接子的环，例如通过使用以包含衔接子互补序列的寡核苷酸涂覆的珠子(为了易于处理，特别是磁珠)，该珠子可以通过与之杂交而“捕获”具有正确衔接子的闭合环，洗掉那些不包含衔接子和任何未连接的组分的环，然后从珠子上释放所捕获的环。此外，在一些情况下，杂交的捕获探针和目标环的复合体可直接用于生成多联体，例如通过直接滚环扩增(RCA)。在一些实施方案中，环中的衔接子还可用作测序引物。两个或更多个序列元件可以是彼此不邻近的(例如被一个或多个核苷酸隔开)、彼此邻近的、部分重叠的或完全重叠的。例如，扩增引物退火序列还可作为测序引物退火序列。序列元件可位于或靠近3’端、位于或靠近5’端或在衔接子寡核苷酸内部。序列元件可以是任意合适的长度，例如小于或等于约50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3个或更少个的核苷酸的长度。衔接子寡核苷酸可具有任意合适的长度，至少足以容纳其所包含的一个或多个序列元件。在一些实施方案中，衔接子的长度小于或等于约200、100、90、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10个或更少个的核苷酸。在一些实施方案中，衔接子寡核苷酸的长度在约12至40个核苷酸的范围内，例如长度为约15至35个核苷酸。

在一些实施方案中，与来自一个样品的片段化多核苷酸接合的衔接子寡核苷酸包含一个或多个所有衔接子寡核苷酸所共有的序列和对于与该特定样品的多核苷酸接合的衔接子而言独特的条形码，以使得该条形码序列可用于区分来源于一个样品或衔接子接合反应的多核苷酸与来源于另一个样品或衔接子接合反应的多核苷酸。在一些实施方案中，衔接子寡核苷酸包含与一个或多个靶多核苷酸突出端互补的5’突出端、3’突出端或此两者。互补突出端可以是一个或多个核苷酸的长度，包括但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个核苷酸的长度。互补突出端可包含固定的序列。衔接子寡核苷酸的互补突出端可以包含一个或多个核苷酸的随机序列，以使得在一个或多个位置处从一组两个或更多个不同核苷酸中随机选择一个或多个核苷酸，其中在一个或多个位置处选择的不同核苷酸中的每一个都表现在包含随机序列的一组具有互补突出端的衔接子中。在一些实施方案中，衔接子突出端与通过限制性内切核酸酶消化产生的靶多核苷酸突出端互补。在一些实施方案中，衔接子突出端由腺嘌呤或胸腺嘧啶组成。

多种环化多核苷酸的方法是可用的。在一些实施方案中，环化包含酶促反应，例如使用连接酶(例如RNA或DNA连接酶)。多种连接酶是可用的，包括但不限于，Circligase^TM(Epicentre；Madison，WI)、RNA连接酶、T4 RNA连接酶1(ssRNA连接酶，其作用于DNA和RNA两者)。此外，如果不存在dsDNA模板，T4 DNA连接酶也可以连接ssDNA，尽管这通常是缓慢的反应。连接酶的其他非限制性实例包括：NAD-依赖性连接酶，包括Taq DNA连接酶、丝状栖热菌(Thermus filiformis)DNA连接酶、大肠杆菌(Escherichia coli)DNA连接酶、Tth DNA连接酶、水管致黑栖热菌(Thermus scotoductus)DNA连接酶(I和II)、热稳定的连接酶、Ampligase热稳定的DNA连接酶、VanC-型连接酶、9°N DNA连接酶、Tsp DNA连接酶和通过生物勘探发现的新型连接酶；ATP-依赖性连接酶，包括T4 RNA连接酶、T4 DNA连接酶、T3 DNA连接酶、T7 DNA连接酶、Pfu DNA连接酶、DNA连接酶1、DNA连接酶III、DNA连接酶IV和通过生物勘探发现的新型连接酶；以及野生型、突变同工型，及其遗传工程变体。当需要自接合时，可调节多核苷酸和酶的浓度以促进分子内环而非分子间结构的形成。反应温度和时间也可调整。在一些实施方案中，使用60℃来促进分子内环的形成。在一些实施方案中，反应时间为12-16小时。反应条件可以是所选择的酶的制造商所规定的条件。在一些实施方案中，可以包括外切核酸酶步骤以在环化反应后消化任何未连接的核酸。也就是说，闭合环不含游离5’或3’端，因此引入5’或3’外切核酸酶不会消化闭合环但会消化未连接的组分。这尤其可用于多路系统中。

通常，多核苷酸的末端彼此接合以形成环状多核苷酸(直接地，或者使用一个或多个居间衔接子寡核苷酸)会产生具有接合序列的接点。当多核苷酸的5’端和3’端通过衔接子多核苷酸接合时，术语“接点”指该多核苷酸与衔接子之间的接点(例如，5’端接点或3’端接点之一)，或指多核苷酸的5’端与3’端之间由衔接子多核苷酸形成且包含衔接子多核苷酸的接点。当多核苷酸的5’端和3’端在不使用间插衔接子的情况下接合时(例如，单链DNA的5’端和3’端)，术语“接点”可以指这两个末端相接合的点。接点可通过包含接点的核苷酸的序列(也被称为“接合序列”)进行识别。在一些实施方案中，样品包含具有通过以下过程形成的末端混合物的多核苷酸：自然降解过程(如细胞裂解、细胞死亡和DNA从细胞释放到其周围环境的其他过程，DNA在该周围环境中可进一步降解，如在无细胞多核苷酸中，如无细胞DNA和无细胞RNA)、作为样品处理的副产物的片段化(诸如固定、染色和/或储存过程)，以及通过切割不限于特定靶序列的DNA的方法进行的片段化(例如，机械片段化，如通过超声处理；非序列特异性核酸酶处理，如DNA酶I、片段化酶)。当样品包含具有末端混合物的多核苷酸时，两个多核苷酸具有相同的5’端或3’端的可能性很低，并且两个多核苷酸独立地具有相同的5’端和3’端两者的可能性极低。因此，在一些实施方案中，甚至在两个多核苷酸包含具有相同靶序列的部分时，可以使用接点来区分不同的多核苷酸。当多核苷酸末端在不使用间插衔接子的情况下接合时，接合序列可通过与参考序列进行比对来识别。例如，当两种组分序列的顺序相对于参考序列似乎反转时，显示发生反转的点可以指示在该点处的接点。当多核苷酸末端通过一个或多个衔接子序列接合时，接点可通过与已知衔接子序列的邻近进行识别，或者在测序读取的长度足以从环化多核苷酸的5’和3’端获得序列的情况下，则通过如上所述的比对进行识别。在一些实施方案中，特定接点的形成是十分罕见的事件，使得其在样品的环化多核苷酸之间是独特的。

测序方法

根据一些实施方案，使线性和/或环化多核苷酸(或其可能已经任选地富集的扩增产物)经受测序反应以生成测序读数。可以根据本文公开的其他方法使用由此类方法产生的测序读数。多种测序方法是可用的，特别是高通量测序方法。示例包括但不限于Illumina制造的测序系统(诸如和/>等测序系统)、Life Technologies制造的测序系统(Ion/>等)、Roche的454Life Science系统、PacificBiosciences系统、Oxford Nanopore Technologies、纳米球测序、杂交测序、聚合酶群落(POLONY)测序、纳米网格滚环测序(ROLONY)等。在一些实施方案中，测序包括使用和/>系统产生长度约为或多于约50、75、100、125、150、175、200、250、300个或更多个核苷酸的读取。在一些实施方案中，测序包括合成测序过程，其中随着单独的核苷酸被添加至生长的引物延伸产物，该核苷酸被迭代地识别。焦磷酸测序是合成测序法的一个实例，其通过分析所产生的合成混合物中测序反应副产物即焦磷酸的存在而识别核苷酸的掺入。特别是，引物/模板/聚合酶复合体与一种类型的核苷酸接触。如果该核苷酸掺入，则聚合反应切割三磷酸链的α和β磷酸之间的三磷酸核苷，从而释放焦磷酸。然后使用化学荧光酶报告系统识别所释放的焦磷酸的存在，该系统将含有AMP的焦磷酸转化为ATP，之后用萤光素酶测量ATP以生成可测量的光信号。当检测到光时，碱基已掺入，当未检测到光时，碱基未掺入。在适当的洗涤步骤后，使各种碱基周期性地与该复合体接触，以连续地识别模板序列中的后续碱基。参见，例如，美国专利号6,210,891。

在相关的测序过程中，将引物/模板/聚合酶复合体固定在基底上，并且该复合体与标记的核苷酸接触。复合体的固定可通过引物序列、模板序列和/或聚合酶进行，并且可以是共价的或非共价的。例如，复合体的固定可以通过聚合酶或引物与基底表面之间的连接而实现。在可替代的构型中，核苷酸具有以及不具有可去除的终止基团。在掺入后，标记物与复合体偶联，因此是可检测的。在携带终止子的核苷酸的情况下，携带可单独识别的标记物的全部四种不同的核苷酸与复合体相接触。标记的核苷酸的掺入由于终止子的存在而阻止了延伸，并将标记物添加到复合体中，从而允许识别掺入的核苷酸。然后将标记物和终止子从掺入的核苷酸上去除，并在适当的洗涤步骤后重复该过程。在未终止的核苷酸的情况下，如焦磷酸测序那样，将一种类型的标记的核苷酸添加到复合体中以确定其是否将会掺入。在去除核苷酸上的标记基团和适当的洗涤步骤之后，各种不同的核苷酸在同一过程中通过反应混合物进行循环。参见，例如，美国专利号6,833,246，其为了所有目的通过引用而整体并入本文。例如，Illumina基因组分析系统(Illumina Genome Analyzer System)是基于WO 98/44151中描述的技术，其中DNA分子通过锚定探针结合位点(另外被也称为流动池结合位点)结合到测序平台(流动池)上，并且在载玻片上原位扩增。在其上扩增DNA分子的固体表面一般包含多个第一和第二结合寡核苷酸，第一个与靠近或位于靶多核苷酸的一个末端的序列互补，而第二个与靠近或位于靶多核苷酸的另一个末端的序列互补。这种排列允许进行桥式扩增，例如US20140121116中所描述的。DNA分子然后与测序引物退火，并且使用可逆终止子方法逐个碱基地平行测序。在测序引物的杂交之前，可在锚定双链桥的结合寡核苷酸之一中的切割位点处切割双链桥多核苷酸的一条链，从而留下一条单链不与固体基底结合，其可通过变性去除，而另一条链结合于并可用来与测序引物杂交。通常，Illumina基因组分析仪系统利用具有8个通道的流动池，产生长度为18至36个碱基的测序读取，每次运行产生>1.3Gbp的高质量数据(参见www.illumina.com)。

在又一个合成序列的过程中，随着模板依赖性合成的进行，实时观察差异标记的核苷酸的掺入。随着荧光标记的核苷酸被掺入，可以观察到单个固定的引物/模板/聚合酶复合物，从而允许在添加时实时识别每个添加的碱基。在这个过程中，标记基团可以附接到在掺入过程中被切割的核苷酸的一部分。例如，通过将标记基团附接到在掺入过程中去除的磷酸链的一部分，即，核苷多磷酸盐上的α、β、γ或其他末端磷酸基团，标记不会掺入新生链中，而是产生天然的DNA。单个分子的观察可能涉及将复合物光学限制在非常小的照明体积内。通过任选地对复合物进行光学限制，可以创建受监测的区域，其中随机扩散的核苷酸可以存在很短的时间，而掺入的核苷酸在掺入时可以在观察体积内保留更久的时间。这可能导致与掺入事件相关联的特征信号，该掺入事件还通过所添加的碱基所特有的信号谱进行表征。相互作用的标记成分，诸如荧光共振能量转移(FRET)染料对，可以与聚合酶或复合物的其他部分和掺入核苷酸一起提供，使得掺入事件使标记成分相互邻近，并产生特征信号结果，这也是所掺入的碱基所特有的(参见，例如，美国专利号6,917,726、7,033,764、7,052,847、7,056,676、7,170,050、7,361,466和7,416,844；和US 20070134128，前述中的每一个均通过引用完整并入本文)。

在一些实施方案中，样品中的核苷酸可通过连接进行测序。该方法一般使用DNA连接酶来识别靶序列，例如，如在聚合酶群落(polony)方法和在SOLiD技术(AppliedBiosystems，目前为Invirogen)中所使用的。通常，提供一组固定长度的所有可能的寡核苷酸，按照测序位置进行标记。将寡核苷酸退火并连接；DNA连接酶对匹配序列的优先连接会产生对应于该位点的互补序列的信号。

本公开的测序方法可以提供对各种应用有用的信息，诸如，举例而言，识别对象中的疾病(例如，癌症)或确定对象有患(或发展出)疾病的风险。测序可以提供多态性区域的序列。测序可以提供诸如DNA(例如，cfDNA)等的多核苷酸的长度。此外，测序可以提供诸如断点cfDNA等的DNA的断点或末端的序列。测序可以提供蛋白质结合位点边界或DNA酶超敏位点边界的序列。

样品

在本文所述的各种方法的一些实施方案中，样品来自对象。对象可以是任何动物，包括但不限于牛、猪、小鼠、大鼠、鸡、猫、狗等，并且通常是哺乳动物，诸如人。样品多核苷酸通常从来自对象的无细胞样品中分离，诸如组织样品、体液样品或器官样品，包括例如血液样品或含有核酸的流体样品(例如唾液)。在一些情况下，对样品进行处理以去除细胞，或在没有细胞提取步骤的情况下分离多核苷酸(例如，分离无细胞多核苷酸，诸如无细胞DNA)。样品来源的其他示例包括来自血液、尿液、粪便、鼻孔、肺、肠、其他体液或排泄物、源自其的材料或其组合。在一些实施方案中，样品是血液样品或其一部分(例如血浆或血清)。血清和血浆可能是特别感兴趣的，因为与此类组织中恶性细胞死亡率较高相关联的肿瘤DNA相对富集。在一些实施方案中，来自单个个体的样品被分成多个分开的样品(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个分开的样品)，它们独立地经受本公开的方法，诸如一式二份、一式三份、一式四份或一式更多份的分析。在样品来自对象的情况下，参考序列也可以源自对象，诸如来自被分析样品的共有序列或来自同一对象的另一个样品或组织的多核苷酸序列。例如，可以分析血液样品的cfDNA突变，同时分析来自另一个样品(例如口腔或皮肤样品)的细胞DNA以确定参考序列。

可以根据任何合适的方法，从样品中提取多核苷酸。有多种试剂盒可用于提取多核苷酸，其选择可取决于样品的类型或待分离的核酸的类型。本文提供了提取方法的实例，如关于本文公开的多个方面中的任一方面描述。在一个实例中，样品可以是血液样品，例如在EDTA管(例如BD Vacutainer)中收集的样品。可以通过离心(例如在1900xg，4℃下10分钟)将血浆与外周血细胞分离。以此种方式在6mL血液样品上进行的血浆分离通常将产生2.5至3mL血浆。根据制造商的方案，可以从血浆样品中提取循环无细胞DNA，如通过使用QIAmp循环核酸试剂盒(Qiagene)。然后可以定量DNA(例如，在具有高灵敏度DNA试剂盒(Agilent)的Agilent 2100生物分析仪上)。例如，来自健康人的这种血浆样品的循环DNA的产量可以是每毫升血浆1ng至10ng，在疾病(例如，癌症)患者样品中明显更高。

在一些实施方案中，多种多核苷酸包含无细胞多核苷酸，如无细胞DNA(cfDNA)、无细胞RNA(cfRNA)、循环肿瘤DNA(ctDNA)或循环肿瘤RNA(ctRNA)。无细胞DNA在健康和患病个体中循环。无细胞RNA在健康和患病个体中循环。来自肿瘤的cfDNA(ctDNA)不限于任何特定的癌症类型，但似乎是不同恶性肿瘤中常见的发现。根据一些测量，血浆中的游离循环DNA浓度在对照对象中为约14-18ng/ml，在肿瘤患者中为约180-318ng/ml。凋亡和坏死的细胞死亡有助于体液中的无细胞循环DNA。例如，在前列腺癌患者和其他前列腺疾病如良性前列腺增生和前列腺炎的血浆中观察到循环DNA水平显著升高。此外，循环肿瘤DNA存在于原发肿瘤所在器官的体液中。因此，乳腺癌检测可以在导管灌洗液中实现；结直肠癌检测在大便中实现；肺癌检测在痰中实现，并且前列腺癌检测在尿液或精液中检测。无细胞DNA可以从多种来源获得。一个常见的来源是对象的血液样品。然而，cfDNA或其他片段化DNA可以来自多种其他来源。例如，尿液和粪便样品可以是包括ctDNA在内的cfDNA的来源。无细胞RNA可以从多种来源获得。

在一些实施方案中，在没有提取步骤和/或没有纯化步骤的情况下使多核苷酸经历后续步骤(例如环化和扩增)。例如，可以在没有提取步骤的情况下处理流体样品以除去细胞，以产生纯化的液体样品和细胞样品，然后从纯化的流体样品中分离DNA。有多种分离多核苷酸的方法可用，例如通过沉淀，或与基底非特异性结合并随后洗涤该基底以释放结合的多核苷酸。在没有细胞提取步骤的情况下从样品中分离多核苷酸时，多核苷酸将主要是细胞外或“无细胞”多核苷酸。例如，无细胞多核苷酸可包括无细胞DNA(也称为“循环”DNA)。在一些实施方案中，循环DNA是来自肿瘤细胞的循环肿瘤DNA(ctDNA)，例如来自体液或排泄物(例如血液样品)。无细胞多核苷酸可包括无细胞RNA(也称为“循环”RNA)。在一些实施方案中，循环RNA是来自肿瘤细胞的循环肿瘤RNA(ctRNA)。肿瘤可显示出凋亡或坏死，使得肿瘤核酸通过各种机制，以不同形式和不同水平释放到体内，包括对象的血流中。通常，ctDNA的大小可以在较高浓度的较小片段(通常长度为70至200个核苷酸)至较低浓度的高达数千碱基的大片段之间。

癌症

本文的方法提供癌症检测或癌症风险的检测。癌症的分期取决于癌症类型，其中每种癌症类型都有自己的分类系统。下文更详细地描述了癌症分期或分类系统的示例。

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在某些方面，本文提供的方法允许早期检测癌症或检测非转移性癌症。根据本文公开的方法可以检测的癌症的示例包括但不限于棘皮瘤、腺泡细胞癌、听神经瘤、肢端着色斑性黑素瘤、顶端螺旋瘤、急性嗜酸细胞白血病、急性淋巴母细胞性白血病、急性巨核母细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、成熟的急性成髓细胞白血病、急性髓样树突细胞白血病、急性髓样白血病、急性早幼粒细胞性白血病、釉质瘤、腺癌、腺样囊性癌、腺瘤、牙源性腺瘤样瘤、肾上腺皮质癌、成人T-细胞白血病、侵袭性NK-细胞白血病、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、软组织腺泡状肉瘤、成釉细胞纤维瘤、肛门癌、间变性大细胞淋巴瘤、甲状腺未分化癌、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、血管肌脂瘤、血管肉瘤、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型性畸胎样横纹肌样瘤、基底细胞癌、基底细胞样癌、B-细胞白血病、B细胞淋巴瘤、Bellini管癌、胆道癌、膀胱癌、母细胞瘤、骨癌、骨瘤、脑干胶质瘤、脑瘤、乳腺癌、Brenner瘤、支气管瘤、细支气管肺泡癌、棕色瘤、伯基特淋巴瘤、原发灶不明的癌症、类癌瘤、癌、原位癌、阴茎癌、原发灶不明癌、癌肉瘤、Castleman病、中枢神经系统胚胎瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤、宫颈癌、胆管细胞癌、软骨瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、绒毛膜癌、脉络丛乳头状瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性单核细胞性白血病、慢性髓性白血病、慢性骨髓增生性疾病、慢性嗜中性粒细胞白血病、明细胞肿瘤、结肠癌、结直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、Degos病、隆凸性皮肤纤维肉瘤、皮样囊肿、结缔组织增生性小圆细胞瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、胚胎发育不良神经上皮瘤、胚胎癌、内胚窦瘤、子宫内膜癌、子宫内膜子宫癌、子宫内膜样肿瘤、肠病相关的T细胞淋巴瘤、室管膜母细胞瘤、室管膜瘤、上皮样肉瘤、红白血病、食管癌、鼻腔神经胶质瘤、尤因家族肿瘤、尤因家族肉瘤、尤因肉瘤、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、肝外胆管癌、非乳腺性佩吉特病、输卵管癌、胎中胎、纤维瘤、纤维肉瘤、滤泡性淋巴瘤、滤泡性甲状腺癌、胆囊癌、胆囊癌、神经节胶质瘤、神经节瘤、胃癌、胃淋巴瘤、胃肠癌、胃肠类癌瘤、胃肠间质瘤、胃肠间质瘤、生殖细胞肿瘤、生殖细胞瘤、妊娠性绒毛膜癌、妊娠滋养细胞瘤、骨巨细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、胶质瘤、大脑胶质瘤病、血管球瘤、胰高血糖素瘤、成性腺细胞瘤、粒层细胞瘤、毛细胞白血病、毛细胞白血病、头颈癌、头颈癌、心脏癌、血管母细胞瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、恶性血液肿瘤、肝细胞癌、肝脾T细胞淋巴瘤、遗传性乳腺癌-卵巢癌综合征、霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、下丘脑胶质瘤、炎性乳腺癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、胰岛细胞瘤、幼年型粒单核细胞白血病、卡波西肉瘤、卡波西肉瘤、肾癌、Klatskin瘤、Krukenberg瘤、喉癌、喉癌、恶性雀斑样痣黑素瘤、白血病、白血病、唇癌和口腔癌、脂肪肉瘤、肺癌、黄体瘤、淋巴管瘤、淋巴管肉瘤、淋巴上皮瘤、淋巴样白血病、淋巴瘤、巨球蛋白血症、恶性纤维组织细胞瘤、恶性纤维组织细胞瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤、恶性胶质瘤、恶性间皮瘤、恶性外周神经鞘瘤、恶性棒状瘤、恶性特里顿瘤、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、肥大细胞淋巴瘤、纵膈生殖细胞瘤、纵膈肿瘤、甲状腺髓样癌、髓母细胞瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、黑素瘤、黑素瘤、脑膜瘤、Merkel细胞癌、间皮瘤、间皮瘤、原发灶隐匿转移性鳞状颈癌、转移性尿路上皮癌、混合Mullerian瘤、单核细胞性白血病、口腔癌、黏液瘤、多发性内分泌瘤综合征、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤、蕈样肉芽肿、蕈样肉芽肿、骨髓增生异常疾病、骨髓增生异常综合征、髓样白血病、髓样肉瘤、骨髓增生性疾病、黏液瘤、鼻腔癌、鼻咽癌症、鼻咽癌、赘生物、神经鞘瘤、神经母细胞瘤、神经母细胞瘤、神经纤维瘤、神经瘤、结节型黑素瘤、非霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、非黑素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、眼肿瘤、少突星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、嗜酸粒细胞腺瘤、视神经鞘脑膜瘤、口癌、口癌、口咽癌、骨肉瘤、骨肉瘤、卵巢癌、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤、乳腺Paget病、Pancoast瘤、胰腺癌、胰腺癌、乳头状甲状腺癌、乳头状瘤病、副神经节瘤、副鼻窦癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、血管周上皮样细胞瘤、咽癌、嗜铬细胞瘤、中度分化的松果体实质瘤、成松果体细胞瘤、垂体细胞瘤、垂体腺瘤、垂体瘤、浆细胞瘤、胸膜肺母细胞瘤、多胚瘤、前体T成淋巴细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、原发性肝细胞癌、原发性肝癌、原发性腹膜癌、原始神经外胚层瘤、前列腺癌、腹膜假黏液瘤、直肠癌、肾细胞癌、涉及染色体15上NUT基因的呼吸道癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌瘤、横纹肌肉瘤、Richter转化、骶尾部畸胎瘤、唾腺癌、肉瘤、施万鞘瘤神经鞘瘤病(Schwannomatosis)、皮脂腺癌、继发性肿瘤、精原细胞瘤、浆液性肿瘤、Sertoli-Leydig细胞瘤、性索间质瘤、Sezary综合征、印戒细胞癌、皮肤癌、小蓝圆细胞瘤、小细胞癌、小细胞肺癌、小细胞淋巴瘤、小肠癌、软组织肉瘤、生长抑素瘤、煤烟疣、脊髓瘤、脊髓肿瘤、脾边缘区淋巴瘤、鳞状细胞癌、胃癌、表浅扩散性黑素瘤、幕上原始神经外胚层瘤、表面上皮-间质瘤、滑膜肉瘤、T细胞急性淋巴母细胞性白血病、T细胞大颗粒淋巴细胞白血病、T细胞白血病、T细胞淋巴瘤、T细胞幼淋巴细胞白血病、畸胎瘤、晚期淋巴癌、睾丸癌、泡膜细胞瘤、喉癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、移行细胞癌、脐尿管癌、尿道癌、泌尿生殖系统肿瘤、子宫肉瘤、葡萄膜黑素瘤、阴道癌、Verner Morrison综合征、疣状癌、视通路胶质瘤、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、Warthin瘤、维尔姆斯瘤，及其组合。

计算机系统

本公开提供了被编程以实现本公开的方法的计算机系统。图1示出了被编程或以其他方式被配置成实现本公开的方法的计算机系统201。计算机系统201可以调节本公开的方法的各个方面，诸如，举例而言，用于确定对象患有疾病(例如，癌症)或处于患疾病(例如，癌症)风险中的方法。

计算机系统201包括中央处理单元(CPU，本文中也称为“处理器”和“计算机处理器”)205，其可以是单核处理器或多核处理器，或者用于并行处理的多个处理器。计算机系统201还包括存储器或存储器位置210(例如，随机存取存储器、只读存储器、闪存存储器)，电子存储单元215(例如，硬盘)，用于与一个或多个其他系统通信的通信接口220(例如，网络适配器)，以及外围设备225(诸如高速缓存、其他存储器、数据储存器和/或电子显示适配器)。存储器210、存储单元215、接口220和外围设备225通过诸如主板等通信总线(实线)与CPU 205通信。存储单元215可以是用于存储数据的数据存储单元(或数据存储库)。计算机系统201可以借助于通信接口220可操作地耦合至计算机网络(“网络”)230。网络230可以是因特网、互联网和/或外联网，或者与因特网通信的内联网和/或外联网。在一些情况下，网络230是电信和/或数据网络。网络230可以包括一个或多个计算机服务器，该计算机服务器可以支持诸如云计算等分布式计算。在一些情况下，网络230借助于计算机系统201可以实现对等网络，该对等网络可以使耦合至计算机系统201的设备能够充当客户端或服务器。

CPU 205可以执行体现在程序或软件中的一系列机器可读指令。指令可以存储在诸如存储器210等存储器位置中。指令可以被引导到CPU 205，该指令随后可以对CPU 205进行编程或以其他方式对CPU 205进行配置以实现本公开的方法。CPU 205执行的操作的示例可以包括获取、解码、执行和回写。

CPU 205可以是诸如集成电路等电路的一部分。系统201的一个或多个其他组件可以包括在电路中。在一些情况下，电路是应用专用集成电路(ASIC)。

存储单元215可以存储文件，诸如驱动程序、库和保存的程序。存储单元215可以存储用户数据，例如用户偏好和用户程序。在一些情况下，计算机系统201可以包括一个或多个在计算机系统201外部的附加数据存储单元，诸如位于通过内联网或因特网与计算机系统201通信的远程服务器上。

计算机系统201可以通过网络230与一个或多个远程计算机系统通信。例如，计算机系统201可以与用户(例如，医疗保健提供者或患者)的远程计算机系统通信。远程计算机系统的示例包括个人计算机(例如，便携式PC)、板或平板PC(例如，iPad、Galaxy Tab)、电话、智能电话(例如，/>iPhone、支持Android的设备、)或个人数字助理。用户可以经由网络230访问计算机系统201。

如本文所述的方法可以通过存储在计算机系统201的电子存储位置上(诸如，举例而言，存储器210或电子存储单元215上)的机器(例如，计算机处理器)可执行代码来实现。机器可执行或机器可读代码可以以软件的形式提供。在使用期间，代码可以由处理器205执行。在一些情况下，代码可以从存储单元215中检索并存储在存储器210中以供处理器205随时访问。在一些情况下，可以不包括电子存储单元215，并且将机器可执行指令存储在存储器210上。

代码可以被预编译和被配置用于与具有适于执行代码的处理器的机器一起使用，或者可以在运行时被编译。能够以可以选择的编程语言来提供代码，以使代码能够以预编译或编译后的方式执行。

本文提供的系统和方法(诸如计算机系统201)的方面可以体现在编程中。技术的各个方面可以被认为是通常以在一种机器可读介质类型上承载或体现的机器(或处理器)可执行代码和/或相关联数据的形式的“产品”或“制品”。机器可执行代码可以存储在电子存储单元上，例如存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、闪存存储器)或硬盘。“存储”类型介质可以包括计算机、处理器等或其相关模块的任何或所有有形存储器，诸如各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等，它们可以提供非暂时性存储随时用于软件编程。软件的全部或部分有时可以通过因特网或各种其他电信网络进行通信。例如，这样的通信可以支持将软件从一台计算机或处理器加载到另一台计算机或处理器中，例如，从管理服务器或主机计算机加载到应用服务器的计算机平台中。因此，可以承载软件元件的另一种类型的介质包括诸如通过本地设备之间的物理接口、通过有线和光陆线网络以及通过各种空中链路使用的等光波、电波和电磁波。承载此类波的物理元件，诸如有线或无线链路、光链路等，也可以被认为是承载软件的介质。如本文所用，除非限于非暂时性的、有形的“存储”介质，诸如计算机或机器“可读介质”等术语是指参与向处理器提供指令以供执行的任何介质。

因此，诸如计算机可执行代码等机器可读介质可以采取多种形式，包括但不限于有形存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质包括例如光盘或磁盘(诸如任何计算机等中的任何存储设备)，诸如可用于实现附图中所示的数据库等的非易失性存储介质。易失性存储介质包括动态存储器，诸如此类计算机平台的主存储器。有形传输介质包括同轴电缆；铜线和光纤，包括构成计算机系统内总线的导线。载波传输介质可以采用电信号或电磁信号，或者声波或光波的形式，诸如在射频(RF)和红外(IR)数据通信期间所生成的那些。因此，计算机可读介质的常见形式包括例如：软盘、柔性盘、硬盘、磁带、任何其他磁性介质、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、任何其他光学介质、穿孔卡片纸带、任何其他带有孔洞图案的物理存储介质、RAM、ROM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、任何其他存储芯片或盒、传输数据或指令的载波、传输此类载波的缆线或链路，或者计算机可以从中读取编程代码和/或数据的任何其他介质。许多这些形式的计算机可读介质可参与将一个或多个序列的一个或多个指令传送到处理器以供执行。

计算机系统201可以包括电子显示器235或与之通信，电子显示器235包括用于提供例如本公开的方法的结果的用户界面(UI)240。UI的示例包括但不限于图形用户界面(GUI)和基于网络的用户界面。

本公开的方法和系统可以通过一种或多种算法来实现。算法可以在中央处理单元205执行时通过软件来实现。算法可以是例如训练算法(或训练机器学习算法)，诸如，举例而言，支持向量机或神经网络。

实施例

以下实施例是为了说明本发明的各种实施方案而给出，并不意味着以任何方式限制本发明。本实施例以及本文所述的方法目前是优选实施方案的代表，是示例性的，并不旨在作为对本发明范围的限制。本领域技术人员将想到在由权利要求的范围所限定的本发明的精神内所包含的变化和其他用途。

实施例1：用于选择性测序的方法

从对象获得生物样品，并从该样品中分离出无细胞核酸。与甲基化核酸特异性结合的抗体用于将具有甲基化序列的核酸与不具有甲基化序列的核酸分开。从抗体中提纯与抗体结合的核酸，然后环化和测序，从而获得对象中具有甲基化序列的无细胞核酸的序列。

虽然本文已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但是对于本领域的技术人员来说，显而易见的是，这些实施方案仅作为示例来提供。本领域技术人员现将在不背离本发明的情况下想到许多变化、改变和替换。应当理解，可以采用本文描述的实施方案的各种替代方案。意在以下权利要求限定了本发明的范围，并且这些权利要求范围内的方法和结构及其等价物将被覆盖。

Claims (67)

1.一种用于处理从无细胞生物样品中衍生的多个核酸分子的方法，包括：(a)使所述多个核酸分子或其衍生物与多个结合剂接触，以提供耦联到所述多个结合剂的所述多个核酸分子的第一子集和所述多个核酸分子的第二子集；(b)将耦联到所述多个结合剂的所述多个核酸分子的所述第一子集与所述多个核酸分子的所述第二子集分离；(c)在(b)之后，使从所述多个核酸分子的所述第一子集中衍生的核酸分子环化以获得环化核酸分子；和(d)识别所述环化核酸分子或其衍生物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个核酸分子包括脱氧核糖核酸(DNA)分子或核糖核酸(RNA)分子。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述环化包括将所述核酸分子的5’端和3’端相互连接。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述环化包括将衔接子耦联到所述核酸分子的3’端、5’端或5’端和3’端两者。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，进一步包括对所述环化核酸分子进行核酸扩增以生成所述环化核酸分子的多个扩增产物，其中(d)包括识别所述多个核酸扩增产物。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述核酸扩增通过具有链置换活性的聚合酶来实现。

7.根据权利要求5所述的方法，其中所述核酸扩增通过不具有链置换活性的聚合酶来实现。

8.根据权利要求5所述的方法，其中所述核酸扩增包括使所述环化核酸分子与包含随机引物的扩增反应混合物接触。

9.根据权利要求5所述的方法，其中所述核酸扩增包括使所述环化核酸分子与包含一种或多种引物的扩增反应混合物接触，所述一种或多种引物中的每一个经由序列互补性特异性地与不同靶序列杂交。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述结合剂包括抗体或其片段。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述抗体或其片段与核酸结合蛋白特异性结合。

12.根据权利要求10所述的方法，其中所述核酸结合蛋白是染色质蛋白。

13.根据权利要求10所述的方法，其中所述核酸结合蛋白是组蛋白。

14.根据权利要求10所述的方法，其中所述核酸结合蛋白是甲基CpG结合蛋白。

15.根据权利要求10所述的方法，其中所述核酸结合蛋白是转录因子。

16.根据权利要求10所述的方法，其中所述核酸结合蛋白是RNA结合蛋白。

17.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述抗体或其片段与核酸序列特异性结合。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述核酸序列是甲基化的。

19.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述结合剂包括多肽或核酸。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述多肽包括链霉亲和素。

21.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，进一步包括确定所述多个无细胞核酸分子中的每个无细胞核酸分子的大小。

22.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中(d)包括对所述环化核酸分子或其衍生物进行测序。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述测序包括选自以下中的一种或多种的方法：合成测序、连接测序、纳米孔测序、纳米球测序、离子检测、杂交测序、聚合酶群落(POLONY)测序、纳米网格滚环测序(ROLONY)和离子激流测序。

24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述无细胞生物样品包含少于75纳克的核酸。

25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述无细胞生物样品包括体液。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述体液是尿液、唾液、血液、血清、血浆、泪液、痰、脑脊液、滑液、黏液、胆汁、精液、淋巴液、羊膜液、月经液或其组合。

27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中(d)包括对所述环化核酸分子或其衍生物进行测序。

28.根据权利要求27所述的方法，进一步包括对照多个参考序列处理所述序列以将所述序列识别为对应于所述多个参考序列的至少一个子集，从而确定对象患有疾病或处于患有疾病的风险中。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述疾病是癌症。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述癌症选自结肠癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、肝细胞癌、肝癌、皮肤癌、恶性黑色素瘤、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌、脑癌、白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。

31.根据权利要求28所述的方法，进一步包括使用识别的所述序列来输出电子报告，所述电子报告指示所述对象患有疾病或处于患有疾病的风险中。

32.根据权利要求28所述的方法，进一步包括使用识别的所述序列来为疾病的所述对象提供治疗干预。

33.根据权利要求28所述的方法，进一步包括使用识别的所述序列来治疗所述对象的所述疾病。

34.根据权利要求32或权利要求33所述的方法，其中通过对所述对象施用化疗或免疫疗法来治疗所述对象。

35.根据权利要求28所述的方法，进一步包括使用识别的所述序列来监测所述对象的进展或消退。

36.根据权利要求1的方法，其中在(c)中，所述核酸分子耦联到所述多个结合剂中的结合剂。

37.一种用于处理从无细胞生物样品中衍生的多个核酸分子的方法，包括：(a)确定所述多个核酸分子中的核酸分子的甲基化状态；(b)确定所述多个核酸分子中的所述核酸分子的大小；和(c)(i)对照第一数据库处理所述多个核酸分子中的所述核酸分子的所述甲基化状态，以及(ii)对照第二数据库处理所述多个核酸分子中的所述核酸分子的所述大小，以识别所述甲基化状态和所述大小与至少一种疾病的关联。

38.根据权利要求37所述的方法，其中确定所述甲基化状态包括对所述多个核酸分子中的所述核酸分子进行测序。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述测序包括选自以下中的一种或多种的方法：合成测序、连接测序、纳米孔测序、纳米球测序、离子检测、杂交测序、聚合酶群落(POLONY)测序、纳米网格滚环测序(ROLONY)和离子激流测序。

40.根据权利要求37所述的方法，其中确定所述甲基化状态包括使所述核酸分子与结合剂接触，所述结合剂与甲基化核酸或其衍生物特异性结合。

41.根据权利要求37至40中任一项所述的方法，其中确定所述甲基化状态包括：(a)使所述多个核酸分子与多个结合剂接触，以提供耦联到所述多个结合剂的所述多个核酸分子的第一子集和所述多个核酸分子的第二子集；(b)将耦联到所述多个结合剂的所述多个核酸分子的所述第一子集与所述多个核酸分子的所述第二子集分离；(c)在(b)之后，使从所述多个核酸分子的所述第一子集中衍生的核酸分子环化，以获得环化核酸分子；和(d)识别所述环化核酸分子或其衍生物。

42.根据权利要求37至41中任一项所述的方法，其中所述结合剂包括抗体或其片段。

43.根据权利要求37至41中任一项所述的方法，其中所述结合剂包括多肽或核酸。

44.根据权利要求43所述的方法，其中所述多肽包括链霉亲和素。

45.根据权利要求37至44中任一项所述的方法，其中所述多个核酸分子包括脱氧核糖核酸(DNA)分子或核糖核酸(RNA)分子。

46.根据权利要求41或权利要求45所述的方法，其中所述环化包括将所述核酸分子的5’端和3’端相互连接。

47.根据权利要求41至46中任一项的方法，其中所述环化包括将衔接子耦联到所述核酸分子的3’端、5’端或5’端和3’端两者。

48.根据权利要求41至47中任一项所述的方法，进一步包括对所述环化核酸分子进行核酸扩增以生成所述环化核酸分子的多个扩增产物，其中(d)包括识别所述多个核酸扩增产物。

49.根据权利要求48所述的方法，其中所述核酸扩增通过具有链置换活性的聚合酶来实现。

50.根据权利要求48所述的方法，其中所述核酸扩增通过不具有链置换活性的聚合酶来实现。

51.根据权利要求48所述的方法，其中所述核酸扩增包括使所述环化核酸分子与包含随机引物的扩增反应混合物接触。

52.根据权利要求48所述的方法，其中所述核酸扩增包括使所述环化核酸分子与包含一种或多种引物的扩增反应混合物接触，所述一种或多种引物中的每一个经由序列互补性特异性地与不同靶序列杂交。

53.根据权利要求41至52中任一项所述的方法，其中(d)包括对所述环化核酸分子或其衍生物进行测序。

54.根据权利要求53所述的方法，其中所述测序包括选自以下中的一种或多种的方法：合成测序、连接测序、纳米孔测序、纳米球测序、离子检测、杂交测序、聚合酶群落(POLONY)测序、纳米网格滚环测序(ROLONY)和离子激流测序。

55.根据权利要求37至54中任一项所述的方法，其中所述无细胞生物样品包含少于75纳克的核酸。

56.根据权利要求37至55中任一项所述的方法，其中所述无细胞生物样品包括体液。

57.根据权利要求56所述的方法，其中所述体液是尿液、唾液、血液、血清、血浆、泪液、痰、脑脊液、滑液、黏液、胆汁、精液、淋巴液、羊膜液、月经液或其组合。

58.根据权利要求37至57中任一项所述的方法，进一步包括对照多个参考甲基化状态处理所述甲基化状态，以及对照多个参考大小处理所述大小，以将所述甲基化状态识别为对应于所述多个参考甲基化状态的至少一个子集，并且将所述大小识别为对应于所述参考大小的至少一个子集，从而确定对象患有疾病或处于患有疾病的风险中。

59.根据权利要求58所述的方法，其中所述疾病是癌症。

60.根据权利要求59所述的方法，其中所述癌症选自结肠癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、肝细胞癌、肝癌、皮肤癌、恶性黑色素瘤、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌、脑癌、白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。

61.根据权利要求58所述的方法，进一步包括使用识别的所述甲基化状态和所述大小来输出电子报告，所述电子报告指示所述对象患有疾病或处于患有疾病的风险中。

62.根据权利要求58所述的方法，进一步包括使用识别的所述甲基化状态和所述大小来为疾病的所述对象提供治疗干预。

63.根据权利要求58所述的方法，进一步包括使用识别的所述甲基化状态和所述大小来治疗所述对象的所述疾病。

64.根据权利要求62或权利要求63所述的方法，其中通过对所述对象施用化疗或免疫疗法来治疗所述对象。

65.根据权利要求58所述的方法，进一步包括使用识别的所述甲基化状态和所述大小来监测所述对象的进展或消退。

66.一种用于处理从对象的无细胞生物样品中衍生的多个核酸分子的方法，包括：(a)使所述多个核酸分子或其衍生物与多个结合剂接触，以提供耦联到所述多个结合剂的所述多个核酸分子的第一子集和所述多个核酸分子的第二子集；(b)将耦联到所述多个结合剂的所述多个核酸分子的所述第一子集与所述多个核酸分子的所述第二子集分离；(c)在(b)之后，使从所述多个核酸分子的所述第一子集中衍生的核酸分子环化以获得环化核酸分子的第一子集；(d)在(b)之后，使从所述多个核酸分子的所述第二子集中衍生的核酸分子环化以获得环化核酸分子的第二子集；(e)对所述环化核酸分子的第一子集或其衍生物进行测序以获得第一大小，并对所述环化核酸分子的第二子集或其衍生物进行测序以获得第二大小；(f)将所述第一大小与所述第二大小进行比较以确定所述对象的疾病水平。

67.一种用于处理从对象的无细胞生物样品中衍生的多个核酸分子的方法，包括：(a)使所述多个核酸分子或其衍生物与多个结合剂接触，以提供耦联到所述多个结合剂的所述多个核酸分子的第一子集和所述多个核酸分子的第二子集；(b)将耦联到所述多个结合剂的所述多个核酸分子的所述第一子集与所述多个核酸分子的所述第二子集分离；(c)在(b)之后，使从所述多个核酸分子的所述第一子集中衍生的核酸分子环化以获得环化核酸分子的第一子集；(d)在(b)之后，使从所述多个核酸分子的所述第二子集中衍生的核酸分子环化以获得环化核酸分子的第二子集；(e)对所述环化核酸分子的第一子集或其衍生物进行测序以获得第一末端序列，并对所述环化核酸分子的第二子集或其衍生物进行测序以获得第二末端序列；(f)将所述第一末端序列与所述第二末端序列进行比较以确定所述对象的疾病水平。