JP2018521650A

JP2018521650A - Ａｍｐａ受容体を阻害する活性ペプチド、ならびにその調製方法およびその使用

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Publication number: JP2018521650A
Application number: JP2018500399A
Authority: JP
Inventors: ムウイーツァイ、; フアイユーグウ、; ジュインルウ、; シンチャンパン、; ヨンマー、; リアンチェン、
Original assignee: チャイナナショナルリサーチインスティテュートオブフードアンドファーメンテーションインダストリーズ
Priority date: 2015-07-08
Filing date: 2015-07-08
Publication date: 2018-08-09
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Abstract

本発明は、ＡＭＰＡ受容体を阻害する活性ペプチド、ならびにその製造方法およびその使用に関する。活性ペプチドを調製する方法は、以下の工程：１）サケ皮を浸漬して破砕し、水を加えてかき混ぜた後、ｐＨを６．５〜７．５に調整する工程；２）中性プロテアーゼを用いて第１の酵素分解に供する工程；３）パパイン酵素を用いて第２の酵素分解に供し、その後酵素を失活させる工程；および４）酵素加水分解物を遠心分離した後、遠心分離した上清を膜ろ過、濃縮、および脱色して、活性ペプチドを調製する工程を含む。該活性ペプチドはＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇのアミノ酸配列を有するテトラペプチドを含む。該テトラペプチドは良好な溶解性を有し、ＡＭＰＡ受容体によって引き起こされるニューロンのシナプス伝達を選択的に阻害することができ、有意な抗てんかん効果を有する。
【選択図】なし

Description

本発明は、活性ペプチド、特にＡＭＰＡ受容体を阻害する活性ペプチドならびにその調製方法およびその使用に関する。

てんかんは、脳ニューロンの突然の異常放電によって引き起こされる一時的な脳機能障害の慢性疾患であり、主な症状は、繰り返される制御不能なけいれんである。それは中国の神経科で頭痛の次に２番目に多い病気になっており、世界中の約１〜２％の人々がこの病気に苦しんでいる。ほとんどの国では１５種類以上の抗てんかん薬が提供されているが、２０〜３０％のてんかん患者は依然として発作時にけいれんを効果的に抑制することができない。

現在のところ、てんかんに関する多くの研究は、生理学的および病理学的状態下での哺乳類動物の中枢神経系の神経活動、特にα−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸受容体（ＡＭＰＡ受容体、ＡＭＰＡＲ）が関与する興奮伝達活性を調節するのに重要な役割を果たす、神経興奮を抑制するためのより安全で効果的な薬剤を見出すことを目的としている。ＡＭＰＡ受容体の過度の興奮は、細胞内カルシウムイオンの濃度が高くなり過ぎる主な原因であり、ＡＭＰＡの腹腔内注射およびＡＭＰＡの脳ヘルニア注射のいずれもが、動物モデルのけいれんを引き起こし、これは、けいれんの発生にＡＭＰＡが影響することを示す。したがって、ＡＭＰＡ受容体は、最適な薬剤標的である。

有効データが、ＡＭＰＡ受容体阻害剤がてんかんの予防または治療の効果を有し得ることを示し、ＡＭＰＡ受容体を阻害または弱める薬剤は、ニューロンを保護してけいれんを抑制するように、ニューロンの過度の興奮を阻害する。典型的なＡＭＰＡ受容体競合阻害剤である２，３−ジヒドロキシ−６−ニトロ−７−スルファモイルベンゾ［ｆ］キノキサリン（ＮＢＱＸ）は、ペンチレンテトラゾール（ＰＴＺ）モデルにおいて役割を果たすことができるが、溶解度が低く、腎臓において沈殿しうる。極性成分が結合したＮＢＱＸ誘導体の溶解性は増加するが、血液脳関門に侵入する能力は低下する。したがって、抗てんかん薬として、良好な溶解度を有する、安全で有効なＡＭＰＡ受容体阻害剤を開発することは、解決すべき緊急課題となっている。

本発明は、ＡＭＰＡ受容体を阻害する活性ペプチド、ならびにその調製方法およびその使用を提供する。該活性ペプチドは、良好な溶解性および安全性を有し、ＡＭＰＡ受容体によって引き起こされるニューロンのシナプス伝達を選択的に阻害することができ、有意な抗てんかん作用を有する。

本発明の第１の態様は、以下の工程：
１）サケ皮を浸漬して破砕し、水を加えてかき混ぜた（ｂｅａｔ）後、ｐＨを６．５〜７．５に調整してスラリーを得る工程；
２）中性プロテアーゼを用いてスラリーを第１の酵素分解に供し、第１の酵素加水分解物を得る工程；
３）パパイン酵素を用いて第１の酵素加水分解物を第２の酵素分解に供し、その後酵素を失活させて、第２の酵素加水分解物を得る工程；ならびに
４）第２の酵素加水分解物を遠心分離した後、遠心分離した上清を膜ろ過、濃縮、および脱色して、活性ペプチドを調製する工程
を含む、活性ペプチドを調製する方法を提供する。

該活性ペプチドは、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇ（略称：ＥＧＡＲ）のアミノ酸配列を有するテトラペプチドを含む。

本発明においては、サケ皮を浸漬するために、質量含有率０．１〜０．５％のアルカリ溶液を使用することができ、これは主に魚臭を除去するために使用される。浸漬中、サケ皮対アルカリ溶液の質量／体積比は１：（２〜４）に制御することができ、即ち、２〜４Ｌのアルカリ溶液を用いて１ｋｇのサケ皮を浸漬する。スラリーの濃度が高すぎると（質量／体積比＞１：２）、流動性が悪く、酵素分解効率が低くなり、スラリーの濃度が低すぎると（質量体積比＜１：４）、その後の処理量が大きくなり、それによりコストが増加する。なお、浸漬時間は５〜２０時間とすることができる。本発明は浸漬に用いられるアルカリ溶液を厳密に制限するものではない。一実施態様において、０．２％の質量含有率のＮａＯＨ溶液を用いてサケ皮を浸すことができ、サケ皮対ＮａＯＨ溶液の質量／体積比は１：３にすることができ、浸漬時間は１２時間とすることができる。

また、第１の酵素分解及び第２の酵素分解を行うとき、中性プロテアーゼの量を５０〜５００Ｕ／ｇに制御することができ、パパインの量を１００〜１０００Ｕ／ｇに制御することができる。上記２種の酵素の量はサケ皮の重量を基準とし、中性プロテアーゼとパパインの量比は１：（１〜３）とすることができる。サケ皮から製造されたスラリーの酵素分解は、中性プロテアーゼとパパインを連続的に使用することによって進行し、これは、マクロ分子タンパク質のマイクロ分子ポリペプチド、特にジペプチドからヘキサペプチドへの分解を容易にし、それにより活性ペプチドの溶解性および吸収性を改善する。

さらに、第１の酵素分解の温度は３０〜６０℃、第１の酵素分解の時間は４〜６時間、第２の酵素分解の温度は３０〜６０℃であり、第２の酵素分解の時間は１〜３時間に制御することができる。第１の酵素分解および第２の酵素分解の時間が短すぎると、タンパク質の完全な分解に好ましくなく、また時間が長すぎると、好ましくない物質（苦味および酸味のある物質など）の生成を引き起こす場合がある。したがって、上記の酵素分解時間が望ましい。酵素は、当該技術分野における従来の方法によって不活性化することができ、例えば、酵素は、１００〜１２０℃の温度で１０〜２０分間で不活性化することができる。

さらに、工程４）における遠心分離の回転速度は２０００〜６０００ｒ／分に制御することができ、水平スクリュー遠心分離機、チューブ遠心分離機等の従来の装置を用いて遠心分離を行うことができる。孔径が５０〜１０００ｎｍのセラミック膜を用いて膜ろ過を進めることができる。膜ろ過中、膜ろ過の絶対圧は０．２〜０．４ＭＰａ、温度は３０〜８０℃に制御することができる。膜ろ過は、酵素分解生成物中のより大きな分子量を有する成分をさらに遮断し、それによって活性ペプチドの溶解性および吸収性を確保することができる。

本発明においては、濃縮は従来の方法を用いて行うことができる。例えば、二重効用流下膜式蒸発器（ｄｏｕｂｌｅ−ｅｆｆｅｃｔｆａｌｌｉｎｇｆｉｌｍｅｖａｐｏｒａｔｏｒ）を用いて蒸発および濃縮を行い、蒸発および濃縮の蒸気圧は０．１±０．０２ＭＰａ、蒸発温度は４０〜８０℃、濃縮された溶液の濃度は２５〜３０ボーメ（Ｂａｕｍｅ）である。さらに、脱色は、従来の脱色剤を用いて行うことができ、脱色剤は、例えば、活性炭粉末であってよい。濃縮溶液の脱色剤とろ液の質量比は（１０〜３０）：１００であってよく、脱色の温度は４０〜７０℃、例えば５５℃に制御してよく、脱色の時間は３０〜９０分であってよく、脱色は撹拌下で行ってよい。脱色後、脱色剤は、従来の方法、例えば、プレートフレームろ過のようなろ過によって除去することができる。さらに、脱色後に滅菌および乾燥を行い、その後活性ペプチドを製造する。乾燥は、例えば噴霧乾燥であってよい。

また、本発明において提供される活性ペプチドの調製方法は、逆相高速液体クロマトグラフィーを用いて活性ペプチドを分離精製し、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇのアミノ酸配列を有するテトラペプチドを得る工程も含んでもよい。

本発明の第２の態様は、上記調製方法のいずれかに従って製造される活性ペプチドを提供する。

さらに、本発明の活性ペプチドにおいて、１０００Ｄａ未満の分子量を有するペプチドの質量含有率は、８０％を超える。加えて、以下の１つ以上のポリペプチド：ＷＹＮ，ＮＴＴＭ，ＮＧＧＧＧＳ，ＰＡＬＨ，ＡＧＧＰ，ＱＫ，ＭＡＤＴ，ＮＫ，ＮＰＲ，ＴＱ，ＲＧＦ，ＮＡＧＫ，ＳＲ，ＱＧＡＫ，ＹＳＡＰ，ＤＡＧＫ，ＧＲ，ＳＳＰ，ＫＲ，ＡＫ，ＧＧＨ，ＤＳＧＤＧ，ＡＧＰＳ，ＧＡＡＧＲ，ＡＰ，ＶＤＧＫ，ＲＥＲ，ＰＱ，ＧＰＲ，ＧＰＱＧ，ＴＧＶＥ，ＡＲＧＧＫ，ＶＲ，ＬＮ，ＶＴＧＫ，ＧＨＡＧＥ，ＶＧＧＫ，ＧＨＧＲ，ＳＰＧＡＧ，ＦＴＥ，ＡＧＧＰＬＧ，ＴＧＧＰＫ，ＧＡＧＧＭＴ，ＡＡＧＰＧＬ，ＶＥＫＥＫＨ，ＴＧＰＫ，ＬＱ，ＳＧＧＥ，ＮＶＧ，ＧＰＡＧ，ＰＮＨ，ＰＨ，ＶＬ，ＬＩＥおよびＴＰＴも含む。

活性ペプチドの機能的研究において、活性ペプチド中のＥＧＡＲは、ＡＭＰＲ受容体との顕著な対形成を示し、マウスの海馬ニューロンのＡＭＰＡ受容体を介するシナプス伝達を選択的に阻害し、海馬ニューロンのシナプス後電流を減少させることができるが、海馬ニューロンにおけるＮＭＤＡ受容体の電気生理学的機能には影響を及ぼさない。さらに、興奮しすぎたニューロンの過度の興奮を抑制することができる。加えて、マウスてんかんモデルにおいて、ＰＴＺによって刺激されたてんかんのマウスのてんかん症状は、ＥＧＡＲ処置後に軽減され、これは、ＥＧＡＲが有意な抗てんかん効果を有することを示す。

これを考慮して、本発明の第３の態様は、ＡＭＰＡ受容体を阻害し、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇのアミノ酸配列を有するテトラペプチドを提供する。

本発明の第４の態様は、抗てんかん食物または薬剤の調製における上記活性ペプチドの使用を提供する。

本発明の第５の態様は、抗てんかん食物または薬剤の調製においてＡＭＰＡ受容体を阻害する上記テトラペプチドの使用を提供する。

本発明の第６の態様は、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇのアミノ酸配列を有する治療上有効な量のテトラペプチドを含有する薬剤をてんかん患者に投与することを含む、てんかんの治療方法を提供する。

例１で調製された活性ペプチドのＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムである。ＡＭＰＡ受容体に結合するＥＧＡＲのコンピュータシミュレーショングラフである。ＡＭＰＡ受容体に結合するＥＧＡＲのコンピュータシミュレーショングラフである。ＡＭＰＡ受容体に結合するＥＧＡＲのコンピュータシミュレーショングラフである。ＡＭＰＡ受容体に結合するＥＧＡＲのコンピュータシミュレーショングラフである。マウス海馬スライスのＥＰＳＣおよびｍＥＰＳＣの電気生理学的グラフである。マウス海馬スライスのＥＰＳＣおよびｍＥＰＳＣの電気生理学的グラフである。マウス海馬スライスのＥＰＳＣおよびｍＥＰＳＣの電気生理学的グラフである。マウス海馬スライスのＥＰＳＣおよびｍＥＰＳＣの電気生理学的グラフである。マウス海馬スライスのＥＰＳＣおよびｍＥＰＳＣの電気生理学的グラフである。マウス海馬スライスのＥＰＳＣおよびｍＥＰＳＣの電気生理学的グラフである。マウス海馬スライスのＥＰＳＣおよびｍＥＰＳＣの電気生理学的グラフである。マウス海馬スライスのＡＭＰＡＲを介したＥＰＳＣの電気生理学的グラフである。マウス海馬スライスのＡＭＰＡＲを介したＥＰＳＣの電気生理学的グラフである。マウス海馬スライスのＡＭＰＡＲを介したＥＰＳＣの電気生理学的グラフである。マウス海馬スライスのＡＭＰＡＲを介したＥＰＳＣの電気生理学的グラフである。ＡＭＰＡＲを介したｍＥＰＳＣを選択的に阻害するＥＧＡＲの電気生理学的グラフである。ＡＭＰＡＲを介したｍＥＰＳＣを選択的に阻害するＥＧＡＲの電気生理学的グラフである。ＡＭＰＡＲを介したｍＥＰＳＣを選択的に阻害するＥＧＡＲの電気生理学的グラフである。ＡＭＰＡＲを介したｍＥＰＳＣを選択的に阻害するＥＧＡＲの電気生理学的グラフである。ＡＭＰＡＲを介したｍＥＰＳＣを選択的に阻害するＥＧＡＲの電気生理学的グラフである。ＡＭＰＡＲを介したｍＥＰＳＣを選択的に阻害するＥＧＡＲの電気生理学的グラフである。ＡＭＰＡＲを介したｍＥＰＳＣを選択的に阻害するＥＧＡＲの電気生理学的グラフである。ＡＭＰＡＲを介したｍＥＰＳＣを選択的に阻害するＥＧＡＲの電気生理学的グラフである。ＡＭＰＡ誘発電流を選択的に阻害するＥＧＡＲの電気生理学的グラフである。ＡＭＰＡ誘発電流を選択的に阻害するＥＧＡＲの電気生理学的グラフである。ＡＭＰＡ誘発電流を選択的に阻害するＥＧＡＲの電気生理学的グラフである。ＡＭＰＡ誘発電流を選択的に阻害するＥＧＡＲの電気生理学的グラフである。低マグネシウム外液によって誘発された海馬ニューロンのてんかん様放電を阻害するＥＧＡＲの電気生理学的グラフである。低マグネシウム外液によって誘発された海馬ニューロンのてんかん様放電を阻害するＥＧＡＲの電気生理学的グラフである。ＰＴＺ誘発性マウスてんかんに対するＥＧＡＲの効果を示す。ＰＴＺ誘発性マウスてんかんに対するＥＧＡＲの効果を示す。

本発明の目的、技術的解決策および利点をより明確にするために、本発明の実施例における技術的解決策は、図面および本発明の実施例を参照して、明確かつ完全に記載される。言うまでもなく、記載された実施例は、本発明のすべての例ではなく、例の一部である。本発明の実施例に基づいて、創造的努力なしに当業者によって得られる他のすべての例は、本発明の保護範囲に入るものとする。

本発明の各例において使用される原材料およびその供給源は以下の通りである：
中性プロテアーゼ：ＮｏｖｏｚｙｍｅｓｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏ．，Ｌｔｄ製；
ＴＴＸ、ＰＴＸ、ＣＮＱＸ、ＡＰＶ、ＮＭＤＡ、およびＡＭＰＡ：ＴＯＣＲＩＳＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製；
パパイン、ＰＴＺ：ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ製；ならびに
合成ＥＧＡＲ：ＳｈａｎｇｈａｉＱｉａｎｇＹａｏＣｏ．，Ｌｔｄ．製。

例１活性ペプチドの調製

１．活性ペプチドの調製

５ｋｇのサケ皮を、体積１５Ｌの質量含有率０．２％のＮａＯＨ溶液に沈降させ、常温で１２時間浸漬し、液を流し出す。サケ皮を破砕し、サケ皮の重量の５倍の脱イオン水でかき混ぜ、ｐＨを７．０に調整した後、スラリーを得る。

中性プロテアーゼを上記スラリーに０．１％（すなわち、４００Ｕ／ｇサケ皮）の量で加え、５０℃で５時間酵素分解に供する。次にパパインを酵素加水分解物に０．２％（すなわち、４００Ｕ／ｇサケ皮）の量で加え、かつ、酵素分解を６０℃で２時間連続的に進行させる。酵素分解の完了後、酵素失活を１００℃で１０分間進行させる。

酵素加水分解物を酵素失活後遠心分離し、遠心分離した上清を孔径２００ｎｍのセラミック膜（ＸｉａｍｅｎＳｔａｒｍｅｎ製）を用いて膜ろ過し、膜ろ過後の透明な液体をＲ−１５１濃縮器（スイス、ＢＵＣＨＩ製）を用いて３０ボーメの濃度に濃縮し、その後、濃縮した溶液に２０％の量の活性炭を加え、５５℃で１時間脱色する。活性炭を除去するためにろ過した後、透明な液体を噴霧乾燥して、６２０ｇの活性ペプチドを得る。

２．活性ペプチドの構造的同定

上記で調製した活性ペプチドを脱イオン水で２ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈し、勾配溶離をＲＰ−ＨＰＬＣ（ＸＢｒｉｄｇｅＢＥＨ１３０，４．６×２５０ｎｍ、Ｗａｔｅｒｓ社、米国）を用いて行う。溶離条件は以下のとおりである：
移動相Ａ：Ｖ（水）：Ｖ（トリフルオロ酢酸）＝１００：０．１；
移動相Ｂ：Ｖ（アセトニトリル）：Ｖ（水）：Ｖ（トリフルオロ酢酸）＝８０：２０：０．１；
検出波長：ＵＶ２２０ｎｍ；
流速：０．６ｍＬ／分；
カラム温度：３２℃；
注入量：５０μＬ；
勾配プログラム：０−１０分、移動相Ｂ：０％−５％；１０〜２０分、移動相Ｂ：５％−５％；２０−３５分、移動相Ｂ：５％−９％；３５−４５分、移動相Ｂ：９％−１３％；４５−６０分、移動相Ｂ：１３％−１３％；６０−７０分、移動相Ｂ：１３％〜７０％；７０−９０分、移動相Ｂ：７０％−７０％。

図１に示すように、上記で調製した活性ペプチドの勾配溶離の間に１１の大きな吸収ピークが現れた。１１の大きな吸収ピークに対応する溶離液を集め、Ｑ−ＴＯＦ２質量分析計（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ、英国）を用いて各成分中のポリペプチドの配列を分析する。結果を表１に示す。

例２分子動力学シミュレーション試験

ＡＭＢＥＲ１１シミュレーションスイートは、分子動力学シミュレーションおよびデータ解析に使用される。全原子点電荷力場（ＡＭＢＥＲＦＦ０３）は、αヘリックスとβシートの結果の間の良好なバランスを示し、ペプチドを特徴づけるのに使用される。水性溶媒は、ＴＩＰ３Ｐモデルによって明示的に表される。ＥＧＡＲによって生成されるパラメータは、以下の通りである：構造最適化後、ＨＦ／６−３１Ｇ^＊＊レベルでＥＧＡＲの静電ポテンシャルが得られる。電荷の一部は、気相の静電ポテンシャルと一致させるためのｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｐｏｔｅｎｔｉａｌ（ＲＥＳＰ）法の使用に由来し、ＥＧＡＲ分子の他の機械的パラメータは、ＡＭＢＥＲＧＡＦＦパラメータセットから取得される。リガンド中の欠けている相互作用パラメータは、ＡＭＢＥＲのａｎｔｅｃｈａｍｂｅｒツールを使用して生成される。このシステムは、まず最急降下アルゴリズムを用いて２０００ステップで最小化され、次にＮＰＴ全体を使用して５ナノ秒のＭＤでシミュレートされる。圧力は１．０ｐｓの異方性接続時間（ａｎｉｓｏｔｒｏｐｉｃｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎｔｉｍｅ）で１バールに固定され、シミュレーション中の温度は０．１ｐｓのカップリング時間で３００Ｋに維持される。長距離の静電気は、粒子メッシュＥｗａｌｄ法（ＰＥＭ）を用いて計算される。ＳＨＡＫＥは水素原子結合手を制限するために使用され、シミュレーションでの時間ステップは２．０ｆｓである。０．８ナノメートルおよび１．２ナノメートルの２つの固定点を用いて、非結合相互作用をそれぞれ評価する。続いて、ＭＭ−ＧＢＳＡを用いて３００Ｋにおける結合エネルギーを推定する。上記の計算には、１９２ＡＭＤＯｐｔｅｒｏｎ（ｔｍ）プロセッサーのＣＰＵ（２．０ＧＨｚ）が使用される。

図２Ａ〜図２Ｄは、ＡＭＰＡ受容体に結合するＥＧＡＲのコンピュータシミュレーショングラフである。ここで、図２ＡのＥＧＡＲ−ＡＭＰＡＲ複合形態は、ＥＧＡＲがＡＭＰＡＲのＳ１Ｓ２ドメインに結合していることを示し；図２Ｂは、ＡＭＰＡＲのＡｒｇ２１９残基およびＧｌｙ７３残基とＥＧＡＲとの間に水素結合が形成されることを示し；図２Ｃは、５０００ｐｓシミュレーションにおけるＥＧＡＲとＡＭＰＡＲとの間の距離を示し、ＡＭＰＡＲのＲＭＳＤは、３回の繰り返しシミュレーションにおいて約１．７５オングストロームで安定したままであり、複合体が比較的安定であることを示し；図２Ｄは、ＥＧＡＲとＡＭＰＡＲとの間の３つの強い水素結合（（Ｇｌｕ−ＯＥ１）−２１９Ａｒｇ、（Ｇｌｕ−ＯＥ２）−２１９Ａｒｇ、Ａｒｇ−７３Ｇｌｙ）の距離の時間依存性と、水素供与体と受容体との間の距離は３．５オングストローム未満であることを示す。

上記の結果は、ＥＧＡＲがＡＭＰＡ受容体に安定に結合できることを示している。

例３動物実験

この動物実験プロトコールは、中山大学の動物のケアおよび使用委員会によって承認され、国家健康メカニズムの実験動物使用基準を満たす。

１．試薬、動物および材料

ＡＣＳＦ：１２４ｍＭの塩化ナトリウム、２．５ｍＭの塩化カリウム、２ｍＭの塩化カルシウム、２ｍＭの塩化マグネシウム、１．２５ｍＭのリン酸二水素ナトリウム、２６ｍＭの重炭酸ナトリウムおよび１０ｍＭのグルコースを含み；９５％Ｏ_２／５％ＣＯ_２でｐＨ７．２〜７．４に飽和される。

Ｃ５７ＢＬ／６マウス：２〜３週齢、１５〜２０グラム、２０〜２２℃のケージ中でそれぞれ飼育し、食物と水を自由に摂取させ、１２時間の明／暗サイクルの環境におく。

ＥＧＡＲ溶液：合成ＥＧＡＲ凍結乾燥粉末を１１５μＬの蒸留水に溶解して原液とし、実験中に原液を上記ＡＣＳＦで希釈して最終濃度１００μＭ、５０μＭ、２０μＭ、および１μＭでそれぞれ使用するＥＧＡＲ溶液とする。

内部液体：１４０ｍＭグルコン酸カリウム、５ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ塩化カルシウム、２ｍＭＭｇＡＴＰ、１０ｍＭＥＧＴＡ、および１０ｍＭＨＥＰＥＳを含み、ｐＨ７．２−７．４であり、記録前に無菌ろ過される。

外部液体：１４０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、１．５ｍＭ塩化カルシウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、および１０ｍＭグルコースを含み、ｐＨ７．２−７．４であり；記録前に無菌ろ過される。

２．脳組織の調製

Ｃ５７ＢＬ／６マウスから海馬を採取して全細胞の記録を行う。マウスを２０％ウレタンで深く麻酔して断頭した後、脳を素早く取り出して氷冷したＡＣＳＦに浸し、その後、脳をトリミングして振動スライサー（ＬｅｉｃａＶＴ１０００Ａ、ドイツ）に固定して、３５０ミクロンの冠状スライスに切断する。記録前に、スライスを室温で少なくとも１時間、ＡＣＳＦとともにインキュベートする。

３．電気生理学的実験

海馬のスライスを水中記録室（Ｗａｒｎｅｒｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）に移す。記録室では、スライスが３ｍｌ／分の速度で、ＡＣＳＦで連続的にかん流され、海馬のＣＡ１領域のニューロンの全細胞記録が、対照群と処理群とを区別しない実験者によって行われた。ニューロンは、赤外線微分干渉位相差顕微鏡（ＢＸ５１Ｗ、オリンパス、日本）を用いて形態学的認識によって同定される。フレミングブラウン方式の電極引出装置（ｆｌａｍｅＢｒｏｗｎｅｌｅｃｔｒｏｄｅｄｒａｗｉｎｇｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）（Ｐ−９７、Ｓｕｔｔｅｒｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）によって、４段引き出し方式（４ｓｔａｇｅｄｒａｗｉｎｇｓｃｈｅｍｅ）を用いて１．５ｍｍ（外径）×０．８６ｍｍ（内径）のホウケイ酸マイクロチューブを引き出し、抵抗が６〜９メガオームの記録電極を形成する。記録用記録電極に上記内部液体を充填し、上記外部液体を用いて全細胞の記録を行う。

興奮性シナプス後電流（ＥＰＳＣ）の電圧クランプ記録を行うために双極性ポリテトラフルオロエチレン絶縁イリジウムを使用し、０．０１６７Ｈｚの周波数で白金微小電極（ＡＭシステム）を誘発する。記録は、Ｍｕｌｔｉｃｌａｍｐ７００Ｂ増幅器でとり、１０ｋＨｚでフィルターをかけ、２００マイクロ秒でサンプリングし、ｐＣｌａｍｐ１０．２ソフトウェアを使用してパーソナルコンピュータに記録し、ＡｘｏｎＤｉｇｉｄａｔａ１４４０ＡおよびｐＣｌａｍｐ１０．２（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）を用いて分析する。

以下に示す実験をそれぞれ行い、その結果を平均値±ＳＥＭで表す。Ｋ−Ｓ検定による累積確率のデータ分析に加えて、生物学的データの統計分析はすべてＴ検定を用いて行われる。すべての統計分析は、ＳＰＳＳ１３．０ソフトウェアを使用して行われる。

（１）ＥＧＡＲ処理をしていないスライスのＥＰＳＣを対照として、ＥＧＡＲで処理したスライスのＥＰＳＣを記録し、１０μＭのＰＴＸを外部液体中に加えてｍＥＰＳＣを分離する。

図３Ａ〜図３Ｇは、マウス海馬スライスのＥＰＳＣおよびｍＥＰＳＣの電気生理学的グラフである。ここで、図３Ａは、ＥＧＡＲ投与前と後の、ＣＡ１領域の錐体細胞から記録されたＥＰＳＣのサンプルトレースを示し；図３ＢのＥＰＳＣ振幅の棒グラフは、対照群と、２０μＭ（^＊＊Ｐ＜０．０３）、５０μＭ（^＊＊Ｐ＜０．０３）および１００μＭ（^＊＊Ｐ＜０．０３）のＥＧＡＲ処理した群との間の有意差を示し；図３Ｃは、ＣＡ１領域の錐体細胞のｍＥＰＳＣ記録であり；図３Ｄのヒストグラムは、対照群と比較して、ＥＧＡＲで処理したスライスはｍＥＰＳＣの周波数で変化がないことを示し；図３ＥのｍＥＰＳＣイベント間隔の累積確率は、対照群と各濃度でのＥＧＡＲ処理群との間に差がないことを示し；図３Ｆの棒グラフは、２０μＭ（^＊＊Ｐ＜０．０３）、５０μＭ（^＊＊Ｐ＜０．０３）および１００μＭ（^＊＊Ｐ＜０．０３）のＥＧＡＲで処理した群の全てでｍＥＰＳＣの振幅の減少を示し；図３ＧのｍＥＰＳＣ振幅の累積確率は、各濃度でのＥＧＡＲ処理群の振幅が対照群と比較して減少していることを示している（Ｋ−Ｓ検定、ｐ＜０．０５）。

上記の結果は、単離された海馬スライス実験において、ある濃度のＥＧＡＲが、興奮性シナプス後電流（ＥＰＳＣ）および微小興奮性シナプス後電流（ｍＥＰＳＣ）を阻害できることを示す。

（２）ＡＣＳＦに５０μＭのＤ−ＡＰＶを添加することによりＮＭＤＡ受容体を介したＥＰＳＣの成分をブロックした後、および、ＡＣＳＦに１０μＭのＣＮＱＸを添加することによりＡＭＰＡＲを介したＥＰＳＣをブロックした後、両者の残りのＥＰＳＣも記録する。１０μＭのＰＴＸを外部液体に加えてｍＥＰＳＣを単離する。１０μＭのＣＮＱＸおよび２０μＭのＥＧＡＲを、ならびに５０μＭのＤ−ＡＰＶ（ＮＭＤＡ受容体のアンタゴニスト）および２０μＭのＥＧＡＲを、ＡＣＳＦに加えた後、ｍＥＰＳＣも記録する。ＡＣＳＦに、１０μＭのＣＮＱＸまたは５０μＭのＤ−ＡＰＶを添加することにより、ＮＭＤＡＲを介した、または、ＡＭＰＡＲを介したｍＥＰＳＣが単離される。

図４Ａ〜図４Ｄは、マウス海馬スライスのＡＭＰＡＲを介したＥＰＳＣの電気生理学的グラフである。ここで、図４Ａは、２０μＭのＥＧＡＲを添加する前と後の、５０μＭのＤ−ＡＰＶ（ＮＭＤＡ受容体のアンタゴニスト）で処理した海馬ＣＡ１領域の代表的なトラックを示し；図４Ｂは、２０μＭのＥＧＡＲを添加する前と後の、１０μＭのＣＮＱＸ（非ＮＭＤＡ受容体の競合的アンタゴニスト）で処理した海馬スライスのＣＡ１領域の代表的なトラックを示し；図４Ｃは、５０μＭのＤ−ＡＰＶおよび２０μＭのＥＧＡＲを添加した処理群のＡＭＰＡＲを介したＥＰＳＣの振幅が、対照群のＡＭＰＡＲを介したＥＰＳＣの振幅と比較して有意に低いことを示す棒グラフであり（^＊＊＊Ｐ＜０．０１、ｔ検定では、ｎ＝６）；図４Ｄは、ニューロンを１０μＭのＣＮＱＸで処理してから２０μＭのＥＧＡＲを添加した処理群のＮＭＡＤＲを介したＥＰＳＣの振幅が、対照群のＮＭＡＤＲを介したＥＰＳＣの振幅と比較して変化しないことを示す棒グラフである（Ｐ＞０．０５、ｔ検定、ｎ＝６）。

上記の結果は、ＥＧＡＲが、ＡＭＰＡＲを介した興奮性シナプス後電流（ＥＰＳＣ）を選択的に阻害できることを示す。

（３）ＮＭＤＡＲを介した電流の記録については、１００μＭのＮＭＤＡが上記の外部液体に添加され；ＡＭＰＡＲを介した電流の記録については、２０μＭのＡＭＰＡが上記の外部液体に添加される。

図５Ａ〜図５Ｈは、ＡＭＰＡＲを介したｍＥＰＳＣを選択的に阻害するＥＧＡＲの電気生理学的グラフである。ここで、図５Ａは、対照群およびＥＧＡＲ処理群の、ＡＭＰＡＲを介したｍＥＰＳＣのサンプルトレースを示し；図５Ｂは、対照群と比較して、ＥＧＡＲで処理されたニューロンのＡＭＰＡＲを介したｍＥＰＳＣの周波数は変化しないことを示す棒グラフであり（Ｐ＞０．０５、ｔ検定、およびＮ＝６）；図５ＣのｍＥＰＳＣイベント間隔の累積確率は、対照群とＥＧＡＲ処理群との間に周波数に差がないことを示し（Ｋ−Ｓ検定、ｐ＞０．０５、ｎ＝６）；図５Ｄの棒グラフは、ＥＧＡＲによって処理されたニューロンの記録によれば、ＡＭＰＡＲを介したｍＥＰＳＣの振幅が対照群と比較して減少することを示し（^＊Ｐ＜０．０５、ｔ検定、ｎ＝６）；図５ＥのｍＥＰＳＣ振幅の累積確率は、対照群と比較して、ＥＧＡＲ処理群の振幅が減少することを示し（Ｋ−Ｓ検定、ｐ＜０．０５、ｎ＝６）；図５Ｆは、ＥＧＡＲ（２０μＭ）添加前と後の、ＮＭＤＡ（１００μＭ）で処理したＣＡ１ニューロンのＮＭＤＡ受容体を介したｍＥＰＳＣの代表的なトラックを示し；図５Ｇは、１００μＭのＮＭＤＡ＋２０μＭのＥＧＡＲのＮＭＤＡＲを介したｍＥＰＳＣの振幅に対する影響の量的効果を示す棒グラフであり、結果は群間に有意差がないことを示し（Ｐ＞０．０５、ｔ検定、ｎ＝６）；図５Ｈは、ＮＭＤＡＲを介したｍＥＰＳＣの周波数に対する１００μＭのＮＭＤＡ＋２０μＭのＥＧＡＲの影響の量的効果を示す棒グラフであり、結果は群間に有意差がないことを示す（Ｐ＞０．０５、ｔ検定、Ｎ＝６）。

上記の結果は、ＥＧＡＲが、ＡＭＰＡを介した微小興奮性シナプス後電流（ｍＥＰＳＣ）を選択的に阻害できることを示している。

（４）ＮＭＤＡにより誘発された電流の記録については、１００μＭのＮＭＤＡが上記の外部液体に添加され；ＡＭＰＡによって誘発される電流の記録については、２０μＭのＡＭＰＡが上記の外部液体に添加される。

図６Ａ〜図６Ｄは、ＡＭＰＡによって誘発される電流を選択的に阻害するＥＧＡＲの電気生理学的グラフである。ここで、図６Ａは、パッチクランプ実験の代表的なトラックを示し、これは、ＥＧＡＲの存在下で２０μＭのＡＭＰＡによって誘発された内向き電流を示し、横軸は、使用された薬剤の適用時間、上段のトレースおよび中段のトレースは、それぞれ、ＡＭＰＡ処理およびＡＭＰＡと２０μＭのＥＧＡＲの共処理を示し、下段のトレースは、ＥＧＡＲを洗い流した後、ＡＭＰＡが反応した部分が対照レベルに戻ることを示し、細胞は−７０ｍＶで電圧クランプされる；図６Ｂは、ＡＭＰＡのピーク電流に対する２０μＭのＡＭＰＡ＋２０μＭのＥＧＡＲの量的効果を示す棒グラフであり、その結果は、群間で有意差があることを示す（^＊＊＊Ｐ＜０．０１、ｔ検定、ｎ＝６）；図６Ｃは、ＮＭＤＡにより誘発された電流に対する２０μＭのＥＧＡＲの効果を示し；図６Ｄは、ＮＭＤＡのピーク電流に対する１００μＭのＮＭＤＡ＋２０μＭのＥＧＡＲの量的効果を示す棒グラフであり、その結果は、群間に有意差がないことを示す（Ｐ＞０．０５、ｔ検定、ｎ＝６）。

上記の結果は、ＥＧＡＲが、ＡＭＰＡによって誘発される電流を選択的に阻害することができることを示している。

（５）公称ゼロマグネシウムの実験において、マグネシウムイオンは、同じ浸透圧濃度を有するナトリウムイオンで置き換えられる。

図７Ａおよび図７Ｂは、低マグネシウム外部液体によって誘発された海馬ニューロンのてんかん様放電を阻害するＥＧＡＲの電気生理学的グラフである。ここで、図７Ａは、２０μＭのＥＧＡＲを用いる、および用いない条件下で、低マグネシウムによって誘発されたピーク電流、ならびに洗浄後に回収された試料のトレースを示し；図７Ｂは、低マグネシウムにより引き起こされるピーク電流の周波数に対する２０μＭのＥＧＡＲの量的効果を示す棒グラフであり、その結果は、群間で有意差があることを示す（^＊Ｐ＜０．０５、ｔ検定、ｎ＝６）。

上記の結果は、ＥＧＡＲが、低マグネシウム外部液体によって誘発された海馬ニューロンのてんかん様放電を阻害することができることを示している。

（６）ニューロンの電気生理学的特性に及ぼすＥＧＡＲの影響を表２に示す。

表２の結果は、ＥＧＡＲがＣＡ１ニューロンの電気生理学的パラメーターに有意な影響を及ぼさないことを示している。

４．ＰＴＺ誘発てんかん発作モデル

ＥＧＡＲの抗けいれん効果を測定するために、ＥＧＡＲ処理後のてんかんの程度を、ＰＴＺ誘発性てんかん発作のモデルについて評価する。ＥＧＡＲはＰＴＺより３０分早く動物に注射される。動物を無作為に４つのグループに分け、各グループには１０匹の動物がいる。４つのグループに、それぞれ、０，１，１０，１００ｍｇ／ｋｇでＥＧＡＲを与えた。すべての動物にＰＴＺを５５ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注射し、この用量は全ての対照動物において間代発作を生じさせることができる。

マウスの行動は、ＰＴＺ注射直後に３０分間観察される。以前の結果を知らない２人のよく訓練された観察者が、マウスの行動を分析する。マウスを透明プラスチックケージに入れ、３０分間観察する。ケージを湿った／乾いた布で徹底的にきれいにし、嗅覚の手がかりを７０％エタノールで除去する。暴走（ｒａｍｐａｇｅ）および前肢のクローヌス、またはより重篤な行動（暴走、クローヌス（ｃｌｏｎｕｓ）および転倒）を示す動物は、マウスの脳の縁（ｂｒａｉｎｅｄｇｅ）におけるてんかんとみなされる。てんかん発作は、以下の基準に従ってスコア化される：０、無反応；１、不動；２、動きと握りしめが見られる；３、震え；４、頭の揺れ；５、暴走と前肢のクローヌス；６、暴走、クローヌスおよび転倒；７、死。

図８Ａおよび図８Ｂは、ＰＴＺ誘発性マウスてんかんに対するＥＧＡＲの効果を示す。ここで、図８Ａは、ＰＢＳ、１ｍｇ／ｋｇのＥＧＡＲ１，１０ｍｇ／ｋｇのＥＧＡＲ１および１００ｍｇ／ｋｇのＥＧＡＲ１でそれぞれ処理した５つのグループのマウスの行動スコアを示し；図８Ｂは、てんかん発作の前臨床期間（ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌｐｅｒｉｏｄ）に対するＰＢＳ、１ｍｇ／ｋｇのＥＧＡＲ、１０ｍｇ／ｋｇのＥＧＡＲおよび１００ｍｇ／ｋｇのＥＧＡＲの量的効果を示す棒グラフであり、その結果は、ＰＢＳ処理したグループと、１ｍｇ／ｋｇのＥＧＡＲ、１０ｍｇ／ｋｇのＥＧＡＲおよび１００ｍｇ／ｋｇのＥＧＡＲ処理をしたグループとの間に有意な差があることを示す（^＊＊Ｐ＜０．０３、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＃ｐ＜０．０５、ｔ検定、ｎ＝６）。

上記の結果は、行動実験において、ＥＧＡＲがＰＴＺ誘発性のてんかんのチック症状を軽減でき、てんかん発作の前臨床期間を延長できることを示す。

最後に、上記の例は、本発明の技術的解決策の単なる例示であって、本発明を限定するものではない；本発明を上記の実施例を参照して詳細に説明したが、当業者であれば、上記の実施例に記載された技術的解決策をさらに変更することができ、または、その中の技術的特徴の一部または全部を等価なものに置換できることを理解するはずである；しかしながら、これらの変更および置換は、本発明のこれらの例の技術的解決の範囲から、対応する技術的解決策の範囲の本質を逸脱するものではない。

Claims

活性ペプチドを調製する方法であって、以下の工程：
１）サケ皮を浸漬して破砕し、水を加えてかき混ぜた後、ｐＨを６．５〜７．５に調整してスラリーを得る工程；
２）中性プロテアーゼを用いてスラリーを第１の酵素分解に供し、第１の酵素加水分解物を得る工程；
３）パパイン酵素を用いて第１の酵素加水分解物を第２の酵素分解に供した後、酵素を失活させて、第２の酵素加水分解物を得る工程；ならびに
４）第２の酵素加水分解物を遠心分離した後、遠心分離した上清を膜ろ過、濃縮、および脱色して、活性ペプチドを得る工程；
を含み、
前記活性ペプチドがＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇのアミノ酸配列を有するテトラペプチドを含む、方法。
サケ皮を浸すために質量含有率０．１〜０．５％のアルカリ溶液を使用し、サケ皮対アルカリ溶液の質量／体積比を１：（２〜４）に制御し、浸漬時間は５〜２０時間とする、請求項１に記載の方法。
中性プロテアーゼの量が５０〜５００Ｕ／ｇであり、パパインの量が１００〜１０００Ｕ／ｇであり、かつ、中性プロテアーゼ：パパインの量比が１：（１〜３）である、請求項１に記載の方法。
第１の酵素分解の温度を３０〜６０℃に制御し、第１の酵素分解の時間を４〜６時間とし、かつ、第２の酵素分解の温度を３０〜６０℃に制御し、第２の酵素分解の時間は１〜３時間とする、請求項１または３に記載の方法。
膜ろ過を、孔径５０〜１０００ｎｍのセラミック膜で行う、請求項１に記載の方法。
逆相高速液体クロマトグラフィーを用いて活性ペプチドを分離精製し、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇのアミノ酸配列を有するテトラペプチドを得る工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法に従って調製された活性ペプチド。
テトラペプチドがＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇのアミノ酸配列を有する、ＡＭＰＡ受容体を阻害するテトラペプチド。
抗てんかん食物または薬剤の調製における、請求項７に記載の活性ペプチドの使用。
抗てんかん食物または薬剤の調製における請求項８に記載のＡＭＰＡ受容体を阻害するテトラペプチドの使用。
Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇのアミノ酸配列を有する治療上有効な量のテトラペプチドを含有する薬剤をてんかん患者に投与する工程を含む、てんかんの治療方法。