JP2018515597A - カテプシンｃおよび／またはｃｅｌａ１および／またはｃｅｌａ３ａおよび／またはそれらに構造的に関連する酵素を特異的に標的とする細胞および／または組織壊死の処置および／または防止のための組成物 - Google Patents

カテプシンｃおよび／またはｃｅｌａ１および／またはｃｅｌａ３ａおよび／またはそれらに構造的に関連する酵素を特異的に標的とする細胞および／または組織壊死の処置および／または防止のための組成物 Download PDF

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Abstract

カテプシンC、CELA1、CELA3Aおよび/またはそれらに構造的に関連する分子のインヒビター化合物および薬剤、それらを含む組成物、および細胞および/または組織壊死の抑制および/または防止におけるそれらの使用が記載される。記載された化合物についての様々な適用、および併用療法も同様に説明される。

Description

関連出願の相互参照
この出願は、2015年4月7日付け米国仮特許出願第62/143,821号および2015年6月4日付け米国仮特許出願第62/170,717号の利益を請求し、参照することによりそれらの双方を全体としてここに組み込む。
本発明の分野
本発明は、そのいくらかの実施態様において、細胞壊死の処置および/または防止のための組成物および方法に、およびさらに具体的には、細胞内カテプシンCおよび/またはCELA1および/またはCELA3Aおよび/またはそれらに構造的に関連する標的の発現の下方制御および/または活性の抑制によって細胞壊死を防止し、または処置することに関する。
壊死（ネクローシス）は、細胞および生存組織の死滅の独特なプロセスであると考えられ、アポトーシスのプログラム細胞死とは区別される。壊死は、細胞の腫脹、クロマチン消化ならびに血しょうおよびオルガネラ膜の破壊によって特徴付けられる。壊死の最終段階は、広範なDNA加水分解、小胞体の空胞化、細胞小器官の崩壊および細胞溶解によって特徴付けられる。細胞膜破裂後の細胞内内容物の放出は、壊死で見られる炎症の原因である。壊死は長い間、細胞死の偶発的な病理学的様式とみなされてきており；しかしながら、最近の研究では、壊死が調節されたプロセスであることを指し示すいくつかの証拠が示された。
アポトーシスは、壊死とは異なって、エネルギー依存性である。アポトーシスは、カスパーゼ活性化およびDNA開裂の特異的様式を特徴とするが、しかしながら、双方のプロセスは壊死には存在しない。
細胞死は戻ってこない点につながるプロセスである。たとえば、総虚血に供された肝細胞について、細胞死はおよそ150分であり、その時間は組織学的切片ではほとんど変化が見られない。壊死は12ないし24時間後だけで十分に発達する。言い換えれば、細胞は、光学顕微鏡検査によって何らかの壊死変化を見ることができるよりもずっと前に死滅する。
多くの壊死の原因があり、それには、たとえば、傷害、虚血、無酸素症、梗塞、感染、ガン、毒、毒液および炎症への長期曝露が含まれる。例として、壊死は、創傷部位への適切なケアの欠如から生じることがある。
壊死はまた、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変および他の潜在的に致命的な疾患を含むいくつかの重篤な疾患の病理に関与する。心不全は、西洋での最大の死因の1つであり、心臓筋肉細胞（心筋細胞）の喪失によって特徴付けられる。心不全に伴う心筋細胞の喪失において、壊死による細胞死が重要な役割を果たすことは十分に確立された。
壊死組織の早期の、および積極的な外科的創面切除および試験切開、高圧酸素療法、高圧力酸素治療法、抗生物質の施与、抗炎症薬の施与および静脈内免疫グロブリンの施与を含む壊死のためのいくつかの既存の治療法が現在存在する。しかしながら、これらはすべて、部分的には成功だが部分的には失敗して使用され、著しい疾病率および死亡率は、壊死の合併症に起因する。
多くの壊死の原因があり、それには、たとえば、傷害、虚血、無酸素症、梗塞、感染、ガン、毒、毒液および炎症への長期曝露が含まれる。例として、壊死は、創傷部位への適切なケアの欠如から生じ得る。壊死はまた、心筋梗塞、脳卒中、肝硬変および他の潜在的に致死的な疾患を含むいくつかの重度の病気の病理に関与する。西洋での最大の死因の1つである心不全は、心臓筋肉細胞（心筋細胞）の喪失を特徴とする。心不全に伴う心筋細胞の喪失において、壊死による細胞死が重要な役割を果たすことは十分に確立された。
さらに、壊死プロセスは、移植前に採取された器官および組織を保存することに関連する問題に寄与する。特に、このプロセスは、ドナー心臓の貯蔵中の心臓組織の劣化に関与し、その結果、そのものの品質が低下する。他の例は、皮弁、腎臓、肝臓および他の組織の保存および移植である。壊死はまた、化学療法中の健康な組織に対する細胞傷害性にも関与する。
目下、壊死についての唯一の処置は、高圧酸素療法である。しかしながら、これらは壊死そのものに対する薬物処置ではない。そのことは、壊死の合併症に起因する著しい疾病率および死亡率をもたらす理由である。
タンパク質の分解を触媒する一定のエラスターゼは、壊死細胞死に関与することが予備的に示されたが、一定の（好中球エラスターゼ）インヒビター化合物による罹患細胞の処置は、インビトロ（in vitro、試験管内）においてそのようなインヒビターが数百マイクロモル濃度で用いられるとき細胞壊死を防止し/治療した（国際公開WO2003079969）。
これらの初期の知見は、ファミリーメンバーの広さを考慮すると、望みを与えるが、壊死を予防/治療するのに有効な高親和性インヒビターを事前に定義することでの難しさ、およびエラスターゼファミリーメンバーが壊死の処置および防止のための有効な標的であるとの理解の欠如およびそのものの理想的な療法は今日まで依然として分かりにくいままである。
本発明の概略
この発明は、一定のエラスターゼ様タンパク質分解酵素の発現および/または活性の抑制が、細胞および組織壊死の非常に有効な防止および処置をもたらすという驚くべき知見を提供する。意外にも、カテプシンC、CELA1、CELA3Aまたは他のそれらに構造的に関連する分子の特異的抑制は、細胞および/または組織壊死を予防および/または処置する。
特に、本発明は、とりわけ、非常に特異的な一連の標的の識別同定のためのものを提供し、それらは、いくつかの態様においてタンパク質分解酵素であり、およびいくつかの態様において、エラスターゼ活性も見せてよく、ここに説明されるように、化合物、薬剤および組成物によりそれらの抑制が達成されることができた。いくらかの態様では、ここに記載の化合物を用いる特異的インビトロ抑制は、以前のエラスターゼインヒビターよりも数桁少ない濃度で提供され、壊死の防止および/または処置および/または停止/排除において驚くほど有効であった。
いくらかの態様では、そのような増強された親和性は、ここに記載されるように、組成物、方法、使用、薬剤および化合物における適用のためにより一層特異的な標的の識別に関連する。
いくらかの態様では、そのような増強された親和性は、いくらかの実施態様において、高度に有効な治療上の標的としての役割を果たす壊死経路における活性酵素の異なるサブセットの識別を反映する。
いくらかの態様では、そのような増強された親和性は、細胞および組織の壊死を減少させることでの適用について以前に識別された標的とは異なる活性を有する標的のクラスの識別に関連する。
したがって、本発明は、とりわけ、細胞および組織壊死およびそれに関連する疾患を処置および防止するための方法を提供し、それは、それを必要とする対象に、カテプシンC、CELA1、CELA3Aまたはそれらに構造的に関連する酵素の発現および/または活性を特異的に抑制する薬剤の有効な量を施与することによる。
そのような薬剤は、カテプシンC、CELA1、CELA3Aまたはそれに構造的に関連する酵素の発現および/または活性を特異的に抑制し、ここにさらに記載されるように、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドインヒビター、ならびにここにさらに記載されるように、規定される化学的化合物であってよい。
この発明は、いくつかの実施態様において、式I：

式I
の構造によって特徴付けられ、
式中、G1は、置換または非置換ピロリジン、置換または非置換ピペリジン、置換または非置換ピペラジン、置換または非置換イミダゾリジン、または置換または非置換ピラゾリジンであり；および
G3は以下の構造：

によって特徴付けられるか；またはG3は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリールまたは置換または非置換のシクロアルキルであり；
式中、G2は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリール、置換または非置換のシクロアルキルまたは置換または非置換の複素環である、化合物；または
式II：
式II
の構造によって特徴付けられ、
式中、G1は、置換または非置換ピロリジン、置換または非置換ピリジン、置換または非置換アリール、置換または非置換ピペリジン、置換または非置換ピペラジン、置換または非置換イミダゾリジン、または置換または非置換ピラゾリジンであり；および
G3は以下の構造：
によって特徴付けられるか；またはG3は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリールまたは置換または非置換のシクロアルキルであり；
式中、G2は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリール、置換または非置換のシクロアルキルまたは置換または非置換の複素環である、化合物；または
式III：
式III
の構造によって特徴付けられ、
式中、G1は、置換または非置換ピロリジン、置換または非置換ピリジン、置換または非置換アリール、置換または非置換ピペリジン、置換または非置換ピペラジン、置換または非置換イミダゾリジン、または置換または非置換ピラゾリジンであり；および
G3は以下の構造：

によって特徴付けられ；またはG3は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリールまたは置換または非置換のシクロアルキルであり；
式中、G2は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリール、置換または非置換のシクロアルキルまたは置換または非置換の複素環である、化合物；または
次の：
3,4-ビス（（2-（ピロリジン-1-イル）エチル）アミノ）-1,2,5-チアジアゾール1,1-ジオキシド；
シクロプロピル（2-（5-イソプロピルイソキサゾール-3-イル）ピロリジン-1-イル）メタノン；
6-ブロモ-2-（3,5-ジメトキシフェニル）-4ベンゾ[d][1,3]オキサジン-4-オン
6-メチル-5 -（（2-メチルピペリジン-1-イル）スルホニル）ピリミジン-2,4（1H,3H）-ジオン；
N-メチル-4,5,6,7,8,9-ヘキサヒドロ-1H-シクロオクタ[c]ピラゾール-3-カルボキサミド；
2-（5-（ピリジン-4-イル）-2H-テトラゾール-2-イル）酢酸；
2-（フラン-2-イル）-5,6,7,8-テトラヒドロ-4H-ベンゾ[4,5]チエノ[2,3-d][1,3]オキサジン-4-オン；
3-（（5-アセトアミド-1H-1,2,4-トリアゾール-3-イル）チオ）プロパン酸；
N,N'-（オキシビス（4,1-フェニレン））ビス（2-メチルプロパンアミド）；
7-（4-エチルピペラジン-1-イル）-5,6-ジメチル-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリミジン；
7-フルオロ-10-（2-（4-イソプロピルピペラジン-1-イル）-2-オキソエチル）-2,3-ジヒドロ-1H-ベンゾ[e]ピロロ[1,2-a][1,4]ジアゼピン-5,11（10H,11aH）-ジオン；
2-（tert-ブチル）-3-（1-メチル-1H-ベンゾ[d]イミダゾール-2-イル）-4-オキソ-4H-クロメン-7-イルピバラート；
3-メチル-8-（ピペリジン-1-イル）-1H-プリン-2,6（3H,7H）-ジオン；
2-（3-ブロモフェニル）-4-オキソ-4H-ベンゾ[d][1,3]オキサジン-6-イルアセタート；
N-（1-エチル-3,5-ジメチル-1H-ピラゾール-4-イル）-3,4,5-トリメトキシベンズアミド；
5-エチル-N-（ピリジン-2-イルメチル）-5H-[1,2,4]トリアジノ[5,6-b]インドール-3-アミン；
3-（（4-クロロ-1H-ピラゾール-1-イル）メチル）-N-（2-（3-フルオロベンズアミド）エチル）-1,2,4-オキサジアゾール-5-カルボキサミド；
1-（4-（メチルチオ）ベンジル）-4-トシルピペラジン；
2-（2-エチルフェニルスルホンアミド）-5-（4-エチルピペラジン-1-イル）安息香酸；
4（（2-メチルインドリン-1-イル）スルホニル）安息香酸；
6-ブロモ-2-（3,5-ジメトキシフェニル）-4H-ベンゾ[d][1,3]オキサジン-4-オン；
2-アミノ-N-（2,4-ジフルオロフェニル）ピリミジン-5-スルホンアミド；
3-メチル-8-（ピペリジン-1-イル）-1H-プリン-2,6（3H,7H）-ジオン；
5-クロロ-N-（2-オキソ-1-フェニルピロリジン-3-イル）チオフェン-2-スルホンアミド；
3-（ピロリジン-1-イルスルホニル）安息香酸；
（3,5-ジメチル-1H-ピラゾール-1-イル）（3,4,5-トリメトキシフェニル）メタノン；
N-（3,4-ジフルオロフェニル）-2-（8-フルオロ-5,11-ジオキソ-2,3,11,11a-テトラヒドロ-1H-ベンゾ[e]ピロロ[1,2-a][1,4]ジアゼピン-10（5H）-イル）アセトアミド；
5-（シクロヘキシルメチル）-3-（ピリジン-2-イル）-1,2,4-オキサジアゾール；
エチル5-メチル-4-（2-（（4-メチルベンジル）アミノ）-2-オキソエチル）-7-フェニル-4,7-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-カルボキシラート；
[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリミジン-2-カルボン酸；
1-（2-（ピペリジン-1-イル）-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-1-イル）ブタン-1-オン；
（4-（6-クロロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピリジン-3-イル）ピペラジン-1-イル）（1-フェニルシクロプロピル）メタノン；
N-（2,4-ジフルオロフェニル）-2-（5,11-ジオキソ-2,3,11,11a-テトラヒドロ-1H-ベンゾ[e]ピロロ[1,2-a][1,4]ジアゼピン-10（5H）-イル）アセトアミド；および
エチル-2,3-ジヒドロ-3-オキソ-1,2-ベンズイソチアゾール-2-アセタート-1,1-ジオキシド；またはそれらの薬学的な塩、またはそれらの任意の組合せからなる群より選ばれる化合物で、細胞または組織壊死またはそれらに関連する疾患の処置または防止における使用のためのものである、化合物を提供する。
直上に規定されるように、化合物を含む薬剤組成物は、同様にこの発明の実施態様を構成すると理解されるべきである。
この発明は、直上に規定されるように、化合物の第1の医学的使用を記載し、この使用は同様に本発明の実施態様を構成すると理解されるべきである。
この発明はさらに、細胞または組織壊死またはそれらに関連する疾患もしくは条件の処置の方法を提供し、直上に規定されるように、化合物の有効量またはそれを含む薬剤組成物を、それを必要とする対象に施与すること、または罹患した細胞または組織をそれに接触させることを含み、それによって細胞または組織壊死またはそれらに関連する条件が処置される方法を提供する。
この発明はまた、直上に規定されるように、化合物の有効量またはそれを含む薬剤組成物の、対象において起こる細胞または組織壊死に関連する疾患または条件を処置することでの使用のための薬の製造における使用を提供する。
いくらかの態様において、このことは、ここに記載されるように、具体化された化合物の最初の実証された医学的使用であり、および本発明により同じことを企図される。いくらかの態様において、ここに記載されるように、化合物またはそれに構造的に関連する化合物は、カテプシンC、CELA1、CELA3Aまたはそれらに構造的に関連する酵素の活性を特異的に抑制する規定された活性を所有し、この発明の構想される態様である。
いくらかの実施態様において、この発明の化合物は、カテプシンC、CELA1、CELA3Aまたはそれらに構造的に関連する酵素、またはKd 10-7Mまたはそれよりも低い（以下の）最小親和性を有するそれらの組み合わせに対するその選択的結合によって規定される。いくらかの実施態様では、この発明の化合物は、CELA2A、CELA3B、またはカテプシンA、B、D、E、G、H、K、L1、L2、O、S、WまたはZまたはそれらの組合せで、それらは、いくらかの実施態様では、Kd 10-6M以上の最小親和性を示すものに対するその少ない選択的結合性によって規定される。
いくらかの実施態様において、この発明は、ここに記載のように、化合物の任意の組合せを含む組成物を提供する。いくらかの実施態様では、本組成物は、ここに記載の化合物の任意の組合せまたはここに記載の任意の単一化合物の有効量を含む。いくらかの実施態様では、本組成物は、薬学的に許容可能な担体または賦形剤をさらに含む。
本発明のいくらかの実施態様によれば、薬剤組成物は細胞膜を浸透することについて調剤される。
本発明のいくらかの実施態様によれば、薬剤組成物は脂質小胞を含む。
いくらかの実施態様では、本組成物は、抗アポトーシス剤または抗加齢剤をさらに含む。本発明のいくらかの実施態様によれば、抗加齢剤は、抗酸化剤、植物化学物質、ホルモン、メトホルミンおよび脂肪酸からなる群より選ばれる。
いくらかの実施態様では、本発明は、カテプシンC、CELA1、CELA3A、またはそれに構造的に関連する酵素のインヒビター剤を提供し、そこでは、前記薬剤は、アンチセンス、siRNA、マイクロRNA、Ribozyme（リボザイム）およびDNAzyme（DNAザイム）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドであり、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35および配列番号36からなる群より選ばれる核酸領域に向けられる。
いくらかの実施態様では、CELA3A、CELA1、またはカテプシンCインヒビター剤は、ポリヌクレオチドであり、そのポリヌクレオチド剤は、配列番号1、配列番号2または配列番号3で表される核酸配列のポリヌクレオチドと少なくとも95％の同一性を共有する。
いくらかの実施態様では、CELA3A、CELA1、またはカテプシンCインヒビター剤は、ポリヌクレオチドであり、そのポリヌクレオチド剤は、CELA1またはCELA3A配列またはそれらの組合せと特異的にハイブリダイズし、およびモデレート（中程度）ないしストリンジェント（厳格）なハイブリダイゼーション条件下でCELA2AまたはCELA3B配列にハイブリダイズしない。
いくらかの実施態様では、CELA3A、CELA1、またはカテプシンCインヒビター剤は、ポリヌクレオチドであり、そのポリヌクレオチド剤は、カテプシンCに特異的にハイブリダイズし、およびモデレートないしストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でカテプシンA、B、D、E、G、H、K、L1、L2、O、S、WまたはZにハイブリダイズしない。
いくらかの実施態様では、CELA3A、CELA1、またはカテプシンCインヒビター剤は、ポリヌクレオチドであり、そのポリヌクレオチド剤は、配列番号1で表される核酸配列のポリヌクレオチドと少なくとも95％の同一性を共有する。いくらかの実施態様では、CELA3A、CELA1、またはカテプシンCインヒビター剤は、ポリヌクレオチドであり、そのポリヌクレオチド剤は、配列番号2で表される核酸配列のポリヌクレオチドと少なくとも95％の同一性を共有する。いくらかの実施態様では、CELA3A、CELA1、またはカテプシンCインヒビター剤は、ポリヌクレオチドであり、そのポリヌクレオチド剤は、配列番号3で表される核酸配列のポリヌクレオチドと少なくとも95％の同一性を共有する。
いくらかの実施態様では、この発明はここに記載されるように、任意のポリヌクレオチドインヒビター剤を含む核酸構築物を提供する。
いくらかの実施態様では、この発明はCELA3A、CELA1、またはカテプシンCインヒビター剤を提供し、そこでは、前記薬剤は、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22および配列番号23からなる群より選ばれる配列を含むポリペプチドに特異的に結合し、およびその機能を抑制または防止する抗体である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、高親和性結合分子は、抗体またはその抗原結合フラグメントで、FabまたはscFvフラグメントを含むものであり、これは熟練技術者（当業者とも言う）には理解されるであろう。
本発明は、細胞の壊死およびそれに関連する疾患を処置および予防するための組成物および方法を提供する。
追加の実施態様では、本発明は、壊死の防止および処置のための、特に低濃度で細胞壊死を抑制することが判明した特異的な小抑制性分子の使用に関する。分子のリストには、様々な化学的ファミリーに属する小さな抑制性化合物、たとえば、2-アミノイミダゾリン、2-アミノチアゾリンおよびイソオキサゾールが含まれる。本発明はまた、細胞壊死に関係する疾患または医学的条件の処置および/または防止に用いるための様々な小分子インヒビターも提供する。またさらに別の実施形態では、細胞壊死に関係する疾患または医学的条件の処置および/または防止のための薬の製造における小分子インヒビターの使用が提供される。
いくらかの実施態様では、本発明は、細胞性壊死の処置、抑止、抑制または防止のために、ここに記載の任意の化合物の使用、または任意のカテプシンC、CELA1、CELA3Aまたはその構造的に関連する酵素の使用を企図する。いくつかの実施形態では、壊死を受けている細胞は、脳細胞、神経細胞、プルキンエ細胞、海馬錐体細胞（hypocampal pyramidal cell、低錐体錐体細胞）、グリア細胞、心筋細胞、筋細胞、ケラチノサイト（角化細胞）、表皮細胞、骨または軟骨細胞、膵臓細胞、心臓細胞、筋肉細胞、肝臓細胞（liver cell）、呼吸器細胞（respiratory cell）または肺細胞肝細胞、腎臓細胞、肝細胞、消化管細胞（胃腸細胞）、脾臓細胞、造血細胞（hematopoetic cell）、リンパ球、マクロファージ（大食細胞）、胸腺細胞、線維芽細胞、上皮細胞、実質細胞、気管支上皮細胞、ネフローゼ尿細管細胞（nephrotic tubular cell、ネフローゼ管状細胞）、糸球体細血管細胞（glomerulus capillary cell）、および肺上皮細胞、および幹細胞、性腺細胞、精子、卵子、受精卵、胚細胞、ステムセル（幹細胞）および網膜細胞からなる群より選ばれる。
いくつかの実施形態では、本発明は、細胞または組織壊死に関係する疾患または条件の処置、抑止、抑制または防止のために、ここに記載のような任意の化合物の使用、または任意のCELA3A、CELA1、またはカテプシンCインヒビター剤の使用を企図する。いくらかの実施形態では、疾患または医学的条件は、神経変性疾患、例は、認知症、パーキンソン病（Parkinson’s disease）、アルツハイマー病、ハンチントン病、多発性硬化筋萎縮性側索硬化（multiple sclerosis Amyotrophic lateral sclerosis）（ALS）、黄斑変性症、加齢黄斑変性（加齢性黄斑変性症）（AMD）、急性網膜壊死（ARN）、進行性網膜外層壊死（進行性外側網膜壊死）、筋ジストロフィー、白血病、リンパ腫、呼吸窮迫（新生児呼吸窮迫症）、窒息、嵌頓ヘルニア（収縮ヘルニア）、糖尿病、結核、子宮内膜症、脈管ジストロフィー（vascular dystrophy）、乾癬、寒冷傷害、鉄負荷合併症（iron-load complication）、ステロイド処置の合併症、虚血性心疾患、心筋梗塞、再潅流傷害、脳血管疾患または損傷、例は、脳卒中または外傷性脳損傷、壊疽、褥瘡性潰瘍（pressure sore、圧痛）、膵炎、重症急性膵炎、肝炎、慢性肝炎、硬変（肝硬変）、ヘモグロビン尿、細菌性敗血症、ウイルス性敗血症、熱傷（火傷）、高熱（体温上昇）、クローン病、セリアック病、コンパートメント症候群、壊死性直腸炎（壊死性結腸炎）、スティーブンス・ジョンソン症候群（SJS）、中毒性表皮壊死（毒性表皮壊死）（TEN）、嚢胞性線維症、関節リウマチ、骨髄炎、壊死性筋膜炎、腎毒性、脊髄損傷、糸球体腎炎、急性尿細管壊死、腎皮質壊死、変形性関節症（変性関節炎）、チロセミア（チロシン血症、甲状腺機能低下症）、多発性硬化症、先天性ミトコンドリア病（congenital mitochondrial disease）、代謝性遺伝性疾患（metabolic inherited disease）、マイコプラズマ病、炭疽感染、細菌感染、ウイルス感染、エボラ感染、アンダーソン病（Anderson’s disease）、先天性ミトコンドリア病、フェニルケトン尿、胎盤梗塞、梅毒、梅毒、無菌壊死、虚血性壊死、アルコール依存、投与および/または自己投与、および/または暴露に関連する壊死（necrosis associated with administration and/or self-administration with, and/or exposure to）で、コカイン、薬物、例は、パラセタモールまたはドキソルビシンによるもの；化学的毒素、農薬、重金属、兵器有機リン酸エステル（warfare organophosphate）、クモまたはヘビ毒（spider or snake venoms）、ダーマルフィラー（皮膚充填剤）施与に関係する壊死；異所的薬物施与に関係する壊死で、たとえば、デキストロース溶液、化学療法薬の溢出などのようなもの；化学療法誘発性壊死、放射線誘発性壊死、移植組織および加齢の保守管理からなる群より選ばれる。
いくらかの実施態様において、本発明は、ここに記載のような任意の化合物の使用、またはカテプシンC、CELA1、CELA3A、またはそれと構造的に関連する酵素の任意のインヒビター剤の使用を、皮膚の概観または質の改善のために企図し、およびいくらかの実施態様では、ここに記載するように、化合物および薬剤の美容的使用を企図する。
また、少なくとも一の薬学的に許容可能な担体およびここに記載のように化合物またはここに記載のようにカテプシンC、CELA1、CELA3A、またはそれと構造的に関連する酵素の任意のインヒビター剤の治療上有効な量を含む、薬剤組成物も提供する。
いくらかの実施態様では、本発明でのカテプシンC、CELA1、CELA3A、またはそれと構造的に関連する酵素の任意のインヒビター剤は、CELA3A、CELA1、またはカテプシンCまたはそれらの組合せに、Kd 10-7M以下の最小親和性を伴って結合し、およびCELA2A、および/またはCELA3B、および/またはカテプシンA、B、D、E、G、H、K、L1、L2、O、S、WまたはZに、CELA3A、CELA1、またはカテプシンCについての最小結合親和性のものに比べて少なくとも10倍高いKdの最小親和性伴って結合する。
いくらかの実施態様において、そのようなインヒビター剤は、CELA3Bおよび/またはOCIAD1にKd 10-7M以下の最小親和性を伴って結合してよい。いくらかの実施態様では、この態様に従い、インヒビター剤は、配列番号3で説明される配列と少なくとも95％の同一性を共有する配列をもつ。
いくらかの実施態様において、そのようなインヒビター剤は、CELA3Bおよび/またはOCIAD1に、CELA2Aおよび/またはカテプシンA、B、D、E、G、H、K、L1、L2、O、S、WまたはZに対する結合よりも高い親和性を伴って結合してよく、上文に説明するように最小親和性をもつ。いくらかの実施態様では、インヒビター剤は、この態様に従い、配列番号3で説明される配列と少なくとも95％の同一性を共有する配列をもつ。
いくらかの態様では、本発明は、当業者によって理解されるように、ここに記載のポリヌクレオチドの保存的置換を企図する。
いくらかのさらなる実施形態では、細胞壊死に関係する医学的疾患または条件の処置で、それを必要とする対象における方法が提供される。本方法は、治療上有効な量のここに記載の任意の薬剤または化合物を、必要に応じてそれらの類似体、誘導体、フラグメント（断片とも言う）、異性体または塩を含めて対象に施与することを含む。さらに好ましい実施態様において、対象は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物である。
いくらかの実施態様では、ここに記載のような薬剤または化合物は、細胞が壊死の初期段階にあるとき有効である。いくらかのさらなる実施態様では、ここに記載のような薬剤または化合物は、細胞が壊死シグナルに供されたとき活性である。
さらなる実施態様によれば、この発明は、加齢の処置および/または防止で、それを必要とする対象における方法を提供し、本方法には：（a）ここに記載のような任意の薬剤または化合物またはそのものの組合せを対象に施与すること；および（b）抗加齢剤を対象に施与することであり、それにより加齢が処置および/または防止されることが含まれる。
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞は壊死性細胞である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、本方法は、抗アポトーシス剤、たとえば、カスパーゼインヒビターのようなものを対象に施与することを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗アポトーシス剤は、ここに記載のような薬剤または化合物の施与に先立ち、それと同時に、または施与後に施与される。本発明のいくつかの実施形態によれば、本方法はインビボで行われる。
本発明のいくつかの実施形態によれば、薬剤組成物は、細胞膜を浸透するために調剤される。本発明のいくつかの実施形態によれば、薬剤組成物には、脂質小胞が含まれる。
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗加齢剤は、抗酸化剤、植物化学物質、ホルモン、メトホルミンおよび脂肪酸からなる群より選ばれる。
本発明のさらなる態様によれば、臓器、組織および細胞の機能的完全性を、ここでの壊死の誘発の防止および/または抑制によって保管および保存するための方法および組成物が提供される。
いくつかの態様では、本発明は、心臓、腎臓、肝臓、皮膚、肺および他の器官および組織の移植または再移植を含む、移植前の保存を必要とするヒト、ヒト適合性または非ヒト収集器官、組織または細胞を保存する方法を提供する。さらに、本発明は、蘇生後に収集された器官の改善された保存のための方法を提供する。本発明はさらに、保存期間中に交替する地理的場所へのそのもののより一層効率的な輸送をに可能にする。さらに、本発明は、さらに保存に付け加え、細胞の回復プロセス中の細胞生存度の改善、例として、解凍後のもの、および移植前の期間の評価のための方法を提供する。さらに加えて、本発明は、それらの維持、保存および移植の間に、再生関連細胞、即ち、生殖腺細胞、精子、卵、受精卵、および/または胚細胞の保存および保守管理のための方法を提供する。
一実施形態では、生物学的組織を保存するための組成物は、生理学的塩溶液、ATPの生成のための基質およびここに開示されるように、インヒビターの1つを含み、それによって細胞の壊死を防止または抑制する。随意に、ATP産生のための基質は、リン酸クレアチン、クレアチンエチルエステル、リンゴ酸ジクレアチン（dicreatine malate）、グルコン酸クレアチン、フルクトース、スクロース、リボース、ヘキソースまたはペントースである。あるいはまた、ATPの生成のための基質は、オレイン酸クレアチン、クレアチン一水和物、アデノシン、またはデキストロース/グルコースである。
いくつかの実施形態では、ここに記載のような薬剤または化合物は、当分野で理解されるように、小分子である。
いくつかの実施形態では、ここに記載のような薬剤または化合物は、ポリヌクレオチド剤であり、アンチセンス、siRNA、マイクロRNA、リボザイムおよびDNAザイムからなる群より選ばれる。ときには、ポリヌクレオチド剤は、本発明の一実施形態によれば、細胞の壊死を防止または抑制する方法がここに提供され、本方法には、壊死シグナルに供される細胞に、細胞内CELA3、CELA1、および/またはカテプシンCの少なくとも1つの活性の発現を特異的に下方制御し、および/またはそれを抑制する薬剤の治療上有効な量を施与することを含み、それにより細胞の壊死を防止または抑制する。
いくつかの実施形態において、ここに記載のような薬剤または化合物は、CELA3Aに対してCELA3Bよりも高い特異性を有するが、いずれかまたは双方の標的の抑制が本発明の一部を包含するものと考えられ、そのものおよび/またはそのものの活性を特異的に抑制する規定されるような薬剤と特異的に相互作用する薬剤が含まれる。
特に好ましい実施形態では、細胞の壊死を防止たは抑制する方法が提供され、本方法には、壊死シグナルに供される細胞に、CELA3AおよびCELA3Bを含むCELA3の活性の発現を特異的に下方制御（ダウンレギュレート）するか、または追加的に、それを抑制する治療上有効な量の薬剤を施与することが含まれる。
本発明のさらなる実施形態によれば、細胞壊死に関係する医学的疾患または条件の処置で、それを必要とする対象における方法を提供し、本方法には、細胞内カテプシンC、CELA1、CELA3Aまたはそれに、および/または対象の細胞において構造的に関連する酵素の少なくとも1つの活性の発現を特異的に下方制御し、およびあるいはまた、追加的にそれを抑制する治療上有効な量の薬剤を対象に施与することを含み、それはいくつかの実施形態では、CELA3Aの抑制よりも最適ではない活性を提供し得るが、それは、それにもかかわらず、発現および/または活性への影響は、たとえば、いくつかの実施形態では、CELA3Bで有用であり、それによって、細胞壊死に関係する条件が処置される。
別の好ましい実施形態では、本発明はまた、モデレートないしストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、CELA3Aおよび/またはCELA1に特異的にハイブリダイズするが、CELA2Aには最適ではなく、またはCELA3Bにあまり最適ではない分離されるポリヌクレオチドの使用にも向けられる。
特に好ましい実施形態において、分離されたポリヌクレオチドは、CELA3Aに特異的にハイブリダイズする。
特に好ましい実施形態では、本発明は、細胞内カテプシンC、CELA1、CELA3Aまたはそれらに構造的に関連する酵素の少なくとも1つを特異的に抑制する小分子の使用に向けられる。
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、小分子は、Kd 10-7M以下の最小親和性を伴って、細胞内カテプシンC、CELA1、CELA3Aまたはそれらに構造的に関連する酵素の少なくとも1つに特異的に結合し、および少なくとも10倍高いKdの最小親和性を伴って、CELA2Aおよび/またはCELA3Bに、および/またはカテプシンA、B、D、E、G、H、K、L1、L2、O、S、WまたはZに結合する。
いくつかの実施形態において、ここに記載のような薬剤または化合物は、CELA3Aよりも低いCELA3Bに対する親和性を伴って結合するが、ここに記載のような薬剤または化合物は、CELA2Aおよび/またはカテプシンA、B、 E、G、H、K、L1、L2、O、S、WまたはZに対するよりも高い親和性を伴ってCELA3Bに、モデレートないしストリンジェントのハイブリダイゼーション条件下で結合する。
本発明の別の実施形態によれば、高親和性分子がここにおいて提供され、それは細胞内カテプシンC、CELA1、CELA3Aまたはそれに構造的に関連する酵素の少なくとも1つの折りたたまれたアミノ酸配列から構成される少なくとも1つのドメインに結合する。
本発明のいくつかの実施形態のある態様によれば、抗体が提供され、それは、Kd 10-7M以下の最小親和性を伴いCELA3AおよびCELA1に結合するが、少なくとも10倍高いKdの最小親和性を伴ってCELA2AまたはCELA3Bに結合する。
本発明のいくつかの実施形態のある態様によれば、抗体が提供され、それは、Kd 10-7Mの最小親和性を伴ってカテプシンCに結合するが、少なくとも10倍高いKdの親和性を伴ってカテプシンA、B、D、E、G、H、K、L1、L2、O、S、WまたはZに結合する。
本発明のいくつかの実施形態のある態様によれば、本発明での分離されたポリヌクレオチド、本発明での高親和性分子、または本発明での抗体、および薬学的に許容可能な担体を含む薬剤組成物が提供される。
本発明のいくつかの実施形態のある態様によれば、本発明での分離されたポリヌクレオチド、抗アポトーシス剤および薬学的に許容可能な担体を含む薬剤組成物が提供される。
いくつかの実施形態では、本発明は、ここに記載のようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含むベクター、コンジュゲート（結合体とも言う）、リポソームまたは担体、およびそれらを含む組成物を提供する。
本発明のいくつかの実施形態のある態様によれば、加齢の処置および/または防止で、それを必要とする対象における方法が提供され、本方法には、（a）対象の細胞において細胞内カテプシンC、CELA1、CELA3Aまたはそれに構造的に関連する酵素の少なくとも1つの活性の発現を下方制御し、およびあるいはまたは追加的に抑制する薬剤を対象に施与すること、および（b）抗加齢剤を対象に施与することで、それにより加齢を処置および/または防止することが含まれる。
本発明のいくつかの実施形態のある態様によれば、本発明での分離されたポリヌクレオチド、抗加齢剤および薬学的に許容可能な担体を含む薬剤組成物が提供される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明の化合物、薬剤、組成物、使用および方法は、壊死シグナルを受けた任意の細胞に適用することができる。
本発明のいくつかの実施形態によれば、薬剤の量は、細胞壊死の細胞アポトーシスへの変換を引き起こすように選定される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、この方法は、抗アポトーシス剤を対象に施与することをさらに含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗アポトーシス剤は、-[R]-N-[2-ヘプチル]-メチルプロパルギルアミン（R-2HMP）、ビタミンE、ビタミンD、カスパーゼインヒビター、薬剤で抗アポトーシスタンパク質および親水性胆汁塩、ウルソデオキシコール酸をダウンレギュレートするものからなる群より選ばれる。
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗アポトーシス剤は、カテプシンC、CELA1、CELA3Aまたはそれに構造的に関連する酵素の発現を特異的にダウンレギュレートし、およびあるいはまたは追加的に抑制する薬剤の施与の前に、同時にまたは施与後に施与され、そこではいくらかの実施態様において、活性はCELA3AについてCELA3Bよりもより優先的であり得る。
本発明のいくつかの実施形態によれば、本方法はインビボで行われる。
本発明はまた、インビトロでの壊死に対する保護を提供するために、細胞内CELA3Aまたは構造的に類似の酵素、CELA1、および/またはカテプシンCの少なくとも1つの抑制のための方法にも向けられる。
いくらかの実施態様では、この発明は、式VI：

式VI
の構造によって特徴付けられ、
式中：
G1は、随意に置換されるNH-ピロリジン、随意に置換されるNH-ピペリジン、随意に置換されるNH-ピペラジン、随意に置換されるNH-イミダゾリジン、随意に置換されるNH-ピラゾリジン、随意に置換されるNH-アリール、随意に置換されるNH-シクロアルキル、随意に置換されるピロリジン、随意に置換されるピペリジン（piperidine）、随意に置換されるピペリディン（piperidin）、随意に置換されるピペラジン、随意に置換されるイミダゾリジン、または随意に置換されるピラゾリジンであり；
G2は、随意に置換されるアルキル、随意に置換されるアリール、随意に置換されるシクロアルキルまたは随意に置換される複素環であり；
ここで：
G1が非置換ピロリジンである場合、そのときG2は、アルキル、シクロペンチル、アルキルシクロペンチルまたはフランではなく；または
G1がピペリジンである場合、そのときG2はアルキルではなく；および
G1がピペラジンである場合、そのときG2はアルキルまたはフランではない、
化合物を提供する。
いくらかの実施態様では、G1はピロリジンであり、およびG2はエチルまたはフランである。いくらかの実施態様では、G1は置換ピペラジンであり、およびG2はフランまたはフェニルである。いくらかの実施態様では、G1はピペリジンであり、およびG2は、シクロペンチル、フランまたはフェニルである。いくらかの実施態様では、G1は随意に置換されるイミダゾリジンまたは随意に置換されるピラゾリジンである。
いくらかの実施態様では、この発明は、式VII：

式VII
の構造によって特徴付けられ、
式中：
G1は、随意に置換されるNH-ピロリジン、随意に置換されるNH-ピペリジン、随意に置換されるNH-ピペラジン、随意に置換されるNH-イミダゾリジン、随意に置換されるNH-ピラゾリジン、随意に置換されるNH-ピリジン、随意に置換されるNH-アリール、随意に置換されるNH-シクロアルキル、随意に置換されるピロリジン、随意に置換されるピペリジン、随意に置換されるピペリジン、随意に置換されるピペラジン、随意に置換されるイミダゾリジン、随意に置換されるピラゾリジンまたは随意に置換されるアリールであり；
G2は、

または随意に置換されるアルキル、随意に置換されるアリールまたは随意に置換されるシクロアルキルであり；および
G4は、随意に置換されるピロリジン、随意に置換されるピペリジン、随意に置換されるピペラジン、随意に置換されるイミダゾリジンまたは随意に置換されるピラゾリジンであり；
ここで：
G1がピペリジンである場合、そのときG4はピロリジンではなく、またはG2は随意に置換されるアリールではなく；または
G1がイミダゾリジンである場合、そのときG2は随意に置換されるアリールではなく；または
G1が随意に置換されるNH-ピリジンである場合、そのときG2は随意に置換されるアリールではなく；または
G1が随意に置換されるNH-アリールである場合、そのときG2は随意に置換されるアリールではなく；または
G1が随意に置換されるピリジンである場合、そのときG2は随意に置換されるアリールではない、
化合物を提供する。
いくらかの実施態様では、この態様に従い、G1は随意に置換されるNH-ピリジンであり、G2は、

であり、式中、G4はピロリジンであり、またはG2はハロアリールであり、およびいくらかの実施態様では、この態様に従い、G1は随意に置換されるNH-アリールであり、およびG2は、

であり、式中、G4はピロリジンである。
他に定義されない限り、ここに使用されるすべての技術および/または科学用語は、本発明が属する技術分野の通常の技量の者（当業者とも言う）によって普通に理解されるのと同じ意味をもつ。ここに記載される方法および物質と類似または等価の方法および物質を本発明の実施態様の実践または試験に使用することができるが、模範的な方法および/または物質を以下に説明する。対立する場合、定義を含めて特許明細書が支配する。さらに、物質、方法、および例は例示に過ぎず、および必ずしも制限的なものではない。
本発明のいくらかの実施態様は、添付の図面を参照して、単に一例として、ここで説明される。今回、特に図面に関連して、示された詳細は、例としてであり、本発明の実施態様の説明のためであることが強調される。この点に関して、図面を用いた説明は、本発明の実施態様がどのように実践され得るかを当業者に明らかにする。
図面において、次に示すとおりである。
U-937細胞におけるKCN誘発細胞死の動態を示す折れ線グラフである。図1は、KCN誘発壊死の時間および用量応答を例示する。アクリジンオレンジおよび臭化エチジウムによる二重染色によって核形態を決定した。 酵素アッセイによって評価されるような10mM KCN処理によるタンパク質分解活性の誘導を示す折れ線グラフである。U-937細胞を異なる時間間隔についてKCNにより処理した。細胞溶解物中のカテプシンC活性およびエラスターゼ様活性は、特定の基質を用いて測定した（ここでの以下の例のセクションに詳細に示すようなもの）。 エラスターゼインヒビターIIIによる細胞におけるKCN誘発エラスターゼ様活性の用量依存的抑制を例示する。10mM KCNで30分間処理した後、細胞溶解物を調製した。エラスターゼ様活性は基質MAAPVを用いて測定した。カテプシンLインヒビターおよびE-64dは、エラスターゼ様タンパク質分解活性に影響を及ぼさなかった。データは示されていない。 図4A-Bは、異なる濃度のKCNによって誘発された壊死を受けるU-937細胞からのLDH放出に対するCELA1およびCELA3AについてのsiRNAによるサイレンシングの効果を例示する。図4Aは、コントロールsiRNAまたは特異的酵素についてのsiRNAによりトランスフェクトし、KCNを含むか、または含まないで7時間処理した細胞を示す棒グラフであり、および次いで細胞からのLDH放出を測定した。コントロールsiRNAを用いたトランスフェクションはそれ自体では効果がなかった。*P<0.001。図4Bは、適切なsiRNAsでの処理に起因する特定タンパク質のダウンレギュレーションを証明するウエスタンブロットを例示する写真を描く。 図4Aと同様である。 KCNによって誘導された壊死を受けるPC12細胞からのLDH放出に対するカテプシンC、CELA1およびCELA3AについてのsiRNAによるサイレンシングの効果を示す。コントロールsiRNAまたは特異的酵素についてのsiRNAによりトランスフェクトされたPC12細胞を、グルコースを含まない培地中で1時間プレインキュベートし、およびKCNを用いてか、または用いずに5時間処理した。その後、細胞からのLDH放出を測定した。*P<0.001。 図5A-Bは、エラスターゼ活性（図5A）およびカテプシンC活性（図5B）に対するsiRNAの効果を示す棒グラフである。コントロールsiRNAまたはカテプシンC、CELA1またはCELA3AについてのsiRNAによって処理した細胞を、KCN10mMに30分間曝露した。次いで、細胞を溶解し、および溶解物中のカテプシンCまたはエラスターゼ様活性を特異的比色基質により測定した。 KCNによって誘発された壊死を受けるPC12細胞からのLDH放出に対する特異的カテプシンCインヒビターの効果を示す。異なる濃度のカテプシンCインヒビターの存在下または不存在下で、異なる濃度のKCNを用いてか、または用いずに細胞を5時間処理し、および次いで細胞からのLDH放出を測定した。エラスターゼインヒビターを陽性コントロールとして用いた。*P<0.01。 図7A-Bは、壊死を受けているPC12細胞に及ぼす種々のエラスターゼインヒビターの保護効果を示す棒グラフである。図7A-Bは、それぞれ異なる濃度のエラスターゼインヒビターIIまたはIIIの存在下または不存在下で5時間、KCNを用いてか、または用いずに処理したPC12細胞を示す。次いで、細胞からのLDH放出を測定した。*P<0.05。図7Cは、最大48時間までのKCN処理細胞のレスキューにおけるエラスターゼインヒビターIIの保護効果を示す棒グラフである。グルコース欠乏培地中に維持された細胞を、エラスターゼインヒビターIIを伴ってか、または伴わずに30分間インキュベートした。その後、細胞を、KCNを用いてか、または用いずに5時間処理した。しかる後、培地を完全DMEMに変更し、およびインキュベーションを24または48時間進行させた。エラスターゼインヒビター自体はコントロール細胞の生存に影響を及ぼさなかった。XTT法を使用して、指定された時間ごとに細胞生存能力を測定し、およびそれらの結果をそれらのそれぞれのコントロールと比較した。 図8A-Bは、エラスターゼインヒビターIIおよびIIIがインビボで閉鎖性頭部損傷からマウスの脳を保護することを示す棒グラフである。エラスターゼインヒビターIIおよびIII（図8A）の神経学的重症度スコア（NSS）に対する効果の定量化および図8Bでの、外傷を負ったマウスの脳における壊死領域の発生を示す。*P<0.01。 化合物Z601-4253（2-（ピペリジン-1-イル）チアゾール-4-イル）（ピロリジン-1-イル）メタノンの保護インビボ効果を示し、それは、アセトアミノフェン（APAP）投与によって引き起こされる肝臓毒性に対する活性化合物の2-アミノチアゾール基に属する。化合物は、3D構造類似性およびCELA3A酵素の位相的類似体に基づいてCELA3Aインヒビターのライブラリーをスクリーニングすることによって見出された。注目すべきは、化合物が、APAP投与の後4時間に投与されたとき、活性であることである。 化合物1-（2-（4-メチルピペラジン-1-イル）-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-1-イル）プロパン-1-オン（M059-0891）の保護効果を示す図であり、それは、上記のようなCELA3インヒビターのライブラリーのスクリーニングによって活性が見出された2-アミノイミダゾリンシリーズに属する。これらの結果は、マウスにおける心筋梗塞/再灌流のモデルにおいてこのインヒビターによる壊死および梗塞サイズの有意な減少を示す。 エラスターゼタンパク質CELA1（配列番号8）、CELA2A（配列番号27）、CELA3A（配列番号10）およびCELA3B（配列番号25）のアミノ酸配列の配列アラインメントを示す。European Bioinformatics Institute（EBI）（欧州バイオインフォマティクス研究所）からのclustalW2（クラスタルW2）ソフトウェアによって決定されるようにアミノ酸標的部位を指し示す（CELA1については黄色、CELA3Aについては緑色で示されている）。
以下は本発明の詳細な記載である。
本発明は、いくつかの実施形態では、細胞または組織の壊死および/またはそれに関連する疾患および状態を処置および/または防止するための組成物および方法に関し、およびより一層詳細にであるが、排他的ではなく、細胞または組織の壊死を、細胞内CELA3、それはいくつかの実施形態では、優先的にCELA3Aまたは構造的に関連する酵素、またはいくつかの実施形態では、CELA1、またはいくつかの実施形態では、カテプシンC、またはいくつかの実施形態では、それらの任意の組合せの活性の発現をダウンレギュレートし、および/または抑制することによって防止または処置することに関する。
驚くべきことに、一定のタンパク質分解酵素が壊死の初期段階に特異的に関与し、および化合物または薬剤を規定する標的として働き、そのものまたは双方の活性の発現をダウンレギュレートするか、またはそれらを抑制し、壊死の防止、壊死の処置、またはそれらの組合せをもたらす。
カテプシンC（CTSC）は、ジペプチジルペプチダーゼI（DPP-1）としても知られ、リソソームエキソシステインプロテアーゼである。ヒトでは、それはCTSC遺伝子によってコードされる。カテプシンCは、タンパク質のN末端からジペプチドの切除を触媒する。カテプシンCは、エラスターゼの活性化因子であることが知られる（Turk（ターク）D.ら、The EMBO Journal（ジ・EMBOジャーナル）(2001)20(23)：6570-6582）。
CELA1は、キモトリプシン様エラスターゼファミリー、メンバー1である。その遺伝子は、12番染色体上の12q13位に位置する。それは、たとえば、膵臓、胃、腸、腎臓、肺、胚組織、肝臓、筋肉、関節、脳、乳腺、脾臓、血液、舌、骨および膀胱において発現される。CELA3Aはキモトリプシン様エラスターゼファミリー、メンバー3Aである。その遺伝子は、1番染色体、1p36.12位に位置する。それは、たとえば、膵臓、膀胱、肝臓、前立腺、皮膚、胸腺、結合組織、脳および血液において発現される。
驚くべきことに、ここでは、カテプシンC、またはCELA1もしくはCELA3、特にCELA3A、またはそれに構造的に関連する酵素の活性の発現をダウンレギュレートするか、またはそれを抑制する化合物または薬剤の定義の点で、壊死の防止、壊死の処置またはそれらの組合せをもたらすことが示された。驚くべきことに、本発明の組成物および使用/方法において有用な新規の薬剤および新規な化合物がここに記載された。
また、驚くべきことに、ここに、薬剤および化合物のクラスが規定され、それはそのものまたは双方の活性の発現をダウンレギュレートするか、またはそれを抑制し、壊死の防止、壊死の処置またはそれらの組合せをもたらし、それによって、化合物の存在は、以前に既知であるがしかし、治療上の使用は説明されていない。
また、驚くべきことに、ここに、薬剤または化合物のクラスが規定され、それは、そのものまたは双方の活性の発現をダウンレギュレーションし、またはそれを抑制することができ、壊死の防止、壊死の処置またはそれらの組合せをもたらし、それによって、それらの化合物の存在は以前に既知であったかもしれず、またはそれ自体治療上の使用は以前に既知であったかもしれないが、そのものの、細胞または組織壊死またはそれらに関する疾患の防止、抑止、発生率の減少または処置における特定の使用は説明されていない。
本発明の原理および操作は、図面および付随の説明を参照することにより、より一層良好に理解され得る。
本発明の少なくとも1つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用が、必ずしも、以下の説明に記載され、または例によって例示される詳細に制限されないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態が可能であるか、または様々な方法で実践または遂行されることが可能である。また、ここに採用される表現および用語が説明のためのものであり、制限的であると見なされるべきではないことを理解されたい。
心筋梗塞、脳損傷、脳卒中、肝硬変および他の多くの疾患および条件は、壊死形態の細胞死に関係する。
本発明を実践するために単純化しながら、本発明者らは、カテプシンC、CELA1、特にCELA3Aまたはそれに構造的に関連する酵素または酵素群が、壊死性細胞応答を調節する細胞標的であり、およびそのものの下方制御または抑制が壊死誘導細胞死から細胞を保護するために使用することができることを明らかにした。
ここで下記および続く例のセクションに示されるように、本発明者らは、細胞壊死が細胞内エラスターゼの活性化を誘導することを明らかにした（図2A-Bおよび3参照）。さらに、細胞内CELA3A、CELA1、および/またはカテプシンCの少なくとも1つの発現を特異的に下方制御するRNAサイレンシング剤は、壊死形態の細胞死を防止する（図4A-B参照）。また、特定のsiRNA（それぞれ配列番号1-3）によるこれらの標的の抑制は、標的細胞におけるカテプシンC酵素活性またはCELA1/CELA3Aエラスターゼ様活性に特異的な様式で抑制をもたらした（図5A-B参照）。さらに、マウスおよびラット（図8A-B参照）、マウスにおけるAPAP誘発性肝毒性モデル（図9）、およびマウスでの心筋虚血/再灌流モデル（図10）において、閉鎖性頭部損傷（外傷）モデルを用いてエラスターゼインヒビターが脳細胞壊死損傷をインビボで防止する能力を示した。まとめると、これらの結果は、壊死誘発細胞死の処置または防止のために、細胞内CELA3Aまたは構造的に関連する酵素、CELA1、および/またはカテプシンCの少なくとも1つについてのダウンレギュレーション剤またはインヒビターの使用を実証する。さらに、CELA3Aまたは構造的に関連する酵素および随意にCELA1の識別は、壊死プロセスの主要な標的として、他のエラスターゼの酵素活性を妨害しない特異的なエラスターゼインヒビターの設計を可能にする。
したがって、本発明の一態様によれば、細胞の壊死を防止または抑制する方法が提供され、本方法には、壊死シグナルに供される細胞に、細胞内CELA3Aまたは構造的に関連する酵素、CELA1、および/またはカテプシンCの少なくとも1つの活性の発現を特異的にダウンレギュレーションし、およびあるいはまたは追加的に抑制する薬剤の治療上有効な量を施与することが含まれる。
ここで使用されるように語句「壊死」は、生きた組織における細胞の時期尚早の死に言及する。壊死は、典型的には、細胞膜および細胞小器官の破壊、細胞の腫脹、ミトコンドリアの障害、続いて細胞の溶解および最終的には細胞死によって特徴付けられる病理学的プロセスである。また、細胞溶解は、典型的には、炎症反応を伴い、および炎症は壊死を増加させる可能性がある。
壊死誘発細胞死は、たとえば、CytoTox 96(R)（サイトトックス96商標）Non-Radioactive Cytotoxicity Assay（非放射性細胞傷害アッセイ）（Promega（プロメガ社）、WI（ウィスコンシン州）、USA）による、LDH Cytotoxicity Assay Kit（LDH細胞傷害性アッセイキット）（Cayman（カイマン社）、MI（ミシガン州）、米国）による、アクリジン・オレンジ/臭化エチジウムによるStaining（ステイニング）、および蛍光顕微鏡によるか、またはFACS（例は、生体染料HO342を用いる）による分析を含め、当業者に知られる任意の方法によってアッセイすることができ、ここで以下の例のセクションのさらなる詳細を参照。
本発明のいくつかの実施形態によれば、壊死は、様々な医学的条件/疾患と関係することがあり、それらのそれぞれが本発明のいくつかの実施形態に従って企図される治療上の標的である。そのような医学的条件/疾患の例には、制限されないが、感染、毒、毒液、放射線、物理的外傷、炎症、栄養素または酸素供給の欠如、化学的不均衡、血液供給の中断、細胞または組織の死をもたらす他の状態、または上記の2以上の組合せを含む。特定の実施形態では、組織壊死は、移植中の組織の移植および/または保存不良に関連することがある。たとえば、細胞または組織の壊死は、以下の条件（病態とも言う）のいずれか1以上に関連し得る：膿瘍、悪寒（マラリア熱）、貧血、強直症、無酸素症、無呼吸、関節炎、窒息、喘息、失調、萎縮、背痛（backache、腰痛）、出血、膿漏眼（blennorrhea）、悪液質、カリエス（骨瘍）、疝痛、便秘、痙攣（convulsion、発作）、咳そう、チアノーゼ、下痢、めまい、水腫（水疱）、乾性壊疽（乾燥壊疽）、赤痢、消化不良、呼吸困難、浮腫（水腫）、るいそう（痩せ）、失神、疲労、発熱、細動（細線維化、フィブリン化）、ガス壊疽、遺伝性疾患、高血圧（high blood pressure）、水症、高血圧症（hypertension）、低血圧症（hypotension）、黄疸（icterus）、消化障害（不消化）、炎症、不眠、そう痒（かゆみ）、黄疸（jaundice）、低血圧（low blood pressure）、腰痛（lumbago）、消耗、湿性壊疽、水がん（noma、壊疽性口内炎）、痛み、麻痺、痒疹（pruritus、そう痒症）、発疹、ルーム（カタル）、硬化、発作、ショック、皮膚発疹、傷（びらん）、攣縮（spasm、痙攣）、脱疽（sphacelation）、癆症（tabes、消耗）、頻脈、う歯、腫瘍、胃のむかつき（upset stomach）、めまいまたは嘔吐が含まれる。
壊死は、生きている細胞のグループに局在化することができ、または1以上の組織領域（例は、壊死組織）にわたって広がることがあることは理解されよう。
用語「組織」は、機能または機能群を実行するように設計された細胞からなる有機体（生物）の一部分に言及する。典型的には、固形組織は血管新生される。例には、脳組織、網膜、皮膚組織、肝臓組織、膵臓組織、骨組織、軟骨組織、結合組織、血液組織、筋組織、心臓組織脳組織、脈管（血管）組織、腎臓組織、肺組織、性腺組織、造血組織が含まれる。
典型的には、細胞は、その細胞外環境からの壊死シグナルを受けた後に壊死されるが、それらに限られない。任意の上記条件、例は、酸素の欠乏、毒、毒素、等があり、および細胞の壊死に至るプロセスを開始する可能性がある。
ここに使用される用語「壊死細胞」または「壊死性細胞」は、壊死シグナルを受け、および壊死に関係する少なくとも1つの表現型を示す任意のタイプの細胞を包含する（上記のようになもの）。
本教示による細胞は、たとえば、脳細胞、ニューロン、心臓細胞、筋肉細胞、皮膚細胞、骨細胞、膵臓細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、腸細胞、脾臓細胞、呼吸器細胞、肺細胞、リンパ球または単球またはここに記載の任意の罹患細胞を含む。
ここで使用される「壊死細胞」という用語は、壊死の任意の段階の細胞にさらに関連する。したがって、細胞は、壊死の初期段階（例は、細胞の腫脹またはミトコンドリアの障害を受けている）であってもよく、または細胞死の最終段階（例は、細胞溶解中）であってもよい。
ここに使用されるように、「抑制する」または「処置する」という語句は、壊死の有害な影響を軽減、治癒、逆進（逆転）、弱化（減弱）、緩和、最小化、抑止または停止することに言及する。
いくつかの態様において、細胞または組織壊死に関係する疾患の防止に言及するとき、そのような言及は、集団レベルでの疾患の発生率の減少に関する。いくつかの態様では、そのような言及は、再発または再発性疾患に罹患しているペイシェントに関するものであり得、そこでは、以前にそのようなペイシェントで起こったような十分な症候、病因または疾患の重篤度を発症しないことが真の防止の指標として役立ち得る。
いくらかの態様では、細胞または組織レベルでの壊死の防止に言及するとき、そのものは古典的マーカーまたは組織病理学的証拠または典型的には壊死に関連する分泌シグナルの明白な減少に言及することもできる。
一実施形態によれば、細胞または組織の壊死を処置または抑制することは、壊死を、本発明の薬剤では処理されていないが処置された細胞/組織と同じ壊死シグナルを受けた同じタイプのものであるコントロール壊死細胞/組織と比較して、少なくとも約10％だけ、少なくとも約20％だけ、少なくとも約30％だけ、少なくとも約40％だけ、少なくとも約50％だけ、少なくとも約60％だけ、少なくとも約70％だけ、少なくとも約80％だけ、少なくとも約90％だけ、または少なくとも約100％だけ減少させ得る。
上述のように、本発明のこの態様の方法は、壊死シグナルに供される細胞に、細胞内CELA3A、または構造的に関連する酵素、CELA1、および/またはカテプシンCの少なくとも一の発現を特異的にダウンレギュレートし、およびあるいは、またはそれに加えてその活性を抑制する薬剤を施与することによって影響を及ぼす。
ここに使用されるように、「特異的に」は、細胞内CELA3Aまたは構造的に類似の酵素、CELA1、および/またはカテプシンCの少なくとも1つの発現をダウンレギュレートし、および/またはその活性を抑制するが、細胞において任意の他のタンパク質の活性または発現を実質的に干渉しない（すなわち、細胞内CELA3A、CELA1、および/またはカテプシンCの少なくとも1種ではない細胞成分の活性または発現において10％、15％、20％、25％、30％未満である。）ことに言及する。具体的には、本教示はまた、細胞内CELA3A、CELA1および/またはカテプシンCの少なくとも一、それらの二（例は、CELA3AおよびCELA1C）またはそれらのすべての活性の発現をダウンレギュレートし、および/または抑制するための単一の薬剤の能力に言及する。
ここに使用されるように、「ダウンレギュレートする」または「抑制する」は、細胞内カテプシンC、CELA1、CELA3Aまたはそれに構造的に関連する酵素であるタンパク質の少なくとも1つの発現または活性の減少、低下、弱化、軽減、最小化、抑止または停止に言及する。1つの実施形態によれば、細胞内カテプシンC、CELA1、CELA3Aまたはその構造的に関連する酵素であるタンパク質の少なくとも1つの発現のダウンレギュレーションおよび/またはその活性の抑制は、本発明での薬剤により処理されてない細胞内CELA3A、CELA1、および/またはカテプシンCタンパク質の少なくとも一であるが、その他では同じ条件に供したコントロールと比べて、少なくとも約5％だけ、少なくとも約10％だけ、少なくとも約20％だけ、少なくとも約30％だけ、少なくとも約40％だけ、少なくとも約50％だけ、少なくとも約60％だけ、少なくとも約70％だけ、少なくとも約80％だけ、少なくとも約90％または少なくとも約100％だけである。
ここに使用されるように、用語「発現」はタンパク質発現またはmRNA発現に言及する。
ここに使用されるように、「細胞内カテプシンC、CELA1、CELA3Aまたはそれに構造的に関連する酵素の少なくとも1つの活性」という語句は、生物学的活性、例は、その酵素活性に言及する。一実施態様によれば、CELA3Aおよび/またはCELA1は、そのセリンプロテアーゼ活性に言及する（例は、タンパク質、たとえば、エラスチンなどのようなものを加水分解するエラスターゼ活性）。別の実施形態によれば、カテプシンCの活性は、そのリソソームシステインプロテイナーゼ活性に言及する（例は、セリンプロテイナーゼの活性化でのもの）。
カテプシンC、CELA1、CELA3Aまたはそれに構造的に関連する酵素の発現または活性のレベル（例は、そのダウンレギュレーション）を評価することは、当業者に知られる任意の方法によって遂行することができる。したがって、たとえば、酵素結合免疫吸着（ELISA）アッセイ、免疫蛍光（IF）アッセイまたはChemiluminescent Immunoassay（CLIA）アッセイで、Uscn、OriGene（オリジーン）またはSigma-Aldrich（シグマ-アルドリッチ）から入手可能であるものを用いて、細胞内カテプシンC、CELA1、CELA3Aまたはそれに構造的に関連する酵素の少なくとも1つのタンパク質レベルを決定することができる。それは酵素アッセイと組み合わせることができた。mRNA発現レベルは、例は、ノーザンブロット分析またはRT-qPCRを用いて遂行することができる。本教示に従って使用され得るCELA1および/またはCELA3A活性アッセイには、例は、Ellman Esterase Assay（エルマン・エステラーゼ・アッセイ）（Ellman, G. L.ら、Biochem. Pharmacol.（バイオケミカル・ファーマコロジー）7、88-95、1961参照）またはフローインジェクション分析（FIA）によるエステラーゼ活性アッセイ[Joga（ジョガ）ら、Biotechnology Letters（バイオテクノロジー・レターズ）（2201）23（12 ）：943-948]が含まれる。本教示に従って使用され得るカテプシンC活性アッセイには、例はUscn Life Science Inc.（Uscnライフ・サイエンス社）からの、入手可能なCTSCアッセイキットが含まれる。
したがって、たとえば、および以下の例3にさらに詳細に記載されるように、エラスターゼ様活性は、基質として使用されるN-メトキシスクシニル-Ala-Ala-Pro-Valp-ニトロアニリド（MAAPV）（Sigma）を用いるELISAによって測定することができ、その一方、カテプシンC様活性は、基質として使用されるGly-Phe p-ニトロアニリド（Sigma）を用いるELISAによって測定することができる。
ここに使用されるように、用語「カテプシンC」は、ジペプチジルペプチダーゼI（DPP-1）またはカテプシンC（CTSC）とも呼ばれ、例は、NP_001107645.1（配列番号6）に記載されるもので、ペプチダーゼC1ファミリーに属するリソソームエキソシステインプロテアーゼに関する。
ここに使用されるように、用語「CELA1」は、エラスターゼ-1（ELA1）としても知られ、例は、NP_001962.3（配列番号8）に記載されるようなもので、キモトリプシン様エラスターゼファミリーメンバー1（CELA1）に関連する。
ここに使用されるように、用語「CELA3A」は、エラスターゼファミリーメンバー3Aとしても知られ、例は、NP_005738.4（配列番号10）に記載されるようなもので、酵素キモトリプシン様エラスターゼファミリーメンバー3Aに関連する。
カテプシンC、CELA1およびCELA3A発現のダウンレギュレーションは、転写および/または翻訳を妨害する種々の分子[例は、RNAサイレンシング剤（例は、アンチセンス、siRNA、shRNA、マイクロRNA）、リボザイムおよびDNAザイム]を用いるゲノムおよび/または転写レベルに影響を及ぼすことができる。細胞内CELA3A、CELA1、および/またはカテプシンC活性の少なくとも1つの抑制は、タンパク質レベルに影響を及ぼし、即ち、タンパク質の活性を抑制するか、または例は、抗体、アンタゴニスト、ポリペプチドを開裂する酵素、小分子、自然インヒビターおよびその他同種類のものなどを用いてその分解を引き起こす。
一実施形態によれば、細胞内CELA3A、CELA1および/またはカテプシンCの少なくとも1つを抑制することが可能な薬剤は、カテプシンC、CELA3AおよびCELA1の折りたたまれたアミノ酸配列から構成される少なくとも1つのドメインに結合する高親和性結合分子である。
たとえば、高親和性結合分子は、カテプシンC、CELA3AおよびCELA1に特異的に結合することが可能なアプタマー、抗体または抗体フラグメントであり得る。特定の実施形態によれば、高親和性分子は、抗原認識ドメイン、例は、カテプシンC、CELA3AおよびCELA1の少なくとも1つのエピトープに特異的に結合する抗体を含む。ここに使用されるように、「エピトープ」という用語は、抗体のパラトープが結合する抗原上の任意の抗原決定基に言及する。
エピトープ決定基は大抵、分子、たとえば、アミノ酸または炭水化物側鎖などのようなものの化学的に活性な表面グルーピングからなり、および特異的な三次元構造特性ならびに特異的な電荷特性を普通に有する。
本教示に従って標的とされ得るCELA1およびCELA3Aの模範的なエピトープは、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22配列番号23および配列番号23で表されるアミノ酸配列を含む。これらの模範的なアミノ酸配列は、CELA1およびCELA3Aのエピトープ領域として企図され、これらは、そのもののダウンレギュレーションを標的とすることができる。当技術でよく知られる方法、例は、ELISAまたはウエスタンブロットアッセイを用いて生成される抗体のそれぞれについて、抗体特異性および酵素抑制のさらなる修飾が行われる必要があることは理解されよう。
本発明において使用されるように、「抗体」という用語には、インタクト（無傷とも言う）な分子ならびにその機能的断片（フラグメント）で、たとえば、マクロファージに結合することが可能なFab、F（ab'）2、およびFvなどのようなものを含む。これらの機能的抗体断片は、以下のように規定される：（1）Fabは、抗体分子の一価抗原結合断片を含む断片であり、抗体全体を酵素パパインで消化してインタクトな軽鎖および1つの重鎖の部分を生じさせる；（2）Fab'は、抗体全体をペプシンで処理し、次いで還元してインタクトな軽鎖および重鎖の一部分を生じさせることによって得ることができる抗体分子のフラグメントであり；抗体分子当たり2つのFab'断片が得られ；（3）（Fab'）2は、抗体全体を酵素ペプシンで処理することで、その後の還元は行わないことによって得ることができる抗体の断片であり；F（ab'）2は、2つのジスルフィド結合によって一緒に保持された2つのFab'断片の二量体であり；（4）Fvは、軽鎖の可変領域および2本鎖として発現される重鎖の可変領域を含む遺伝子操作された断片として規定され；および（5）一本鎖抗体（「SCA」）は、遺伝的に融合される単鎖分子として適切なポリペプチドリンカーによって連結される軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む遺伝子操作された分子である。
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体ならびにそのフラグメントを産生する方法は、当技術においてよく知られる（たとえば、Harlow（ハーロー）およびLane（レーン）、Antibodies（アンティボディズ）：A Laboratory Manual（ラボラトリー・マニュアル）、Cold Spring Harbor Laboratory（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー）、New York（ニューヨーク）、1988を参照し、参照によってそれをここに組み込む。）。
本発明のいくつかの実施形態による抗体フラグメントは、抗体のタンパク質加水分解によって、またはフラグメントをコードするDNAの大腸菌または哺乳動物細胞（例は、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養物または他のタンパク質発現系）での発現によって調製することができる。抗体フラグメントは、慣習的な方法による全抗体のペプシン消化またはパパイン消化によって得ることができる。たとえば、抗体フラグメントは、ペプシンによる抗体の酵素的開裂によって産生され、F（ab'）2と表される5Sフラグメントを提供することができる。このフラグメントは、ジスルフィド連結の開裂から生じるスルフヒドリル基のためのチオール還元剤、および随意にブロッキング基を用いて3.5S Fab'一価フラグメントを生成するためにさらに開裂することができる。あるいは、ペプシンを用いる酵素的切断は、2つの一価Fab'フラグメントおよびFcフラグメントを直接産生する。これらの方法は、たとえば、Goldenberg（ゴールデンバーグ）、米国特許第4,036,945号および同第4,331,647号ならびにそれらに含まれる参考文献によって記載されており、これらの特許はその全体が参照によりここに組み込まれる。Porter（ポーター）、R.R.[Biochem. J.（ザ・バイオケミカル・ジャーナル）73：119-126（1959）]。フラグメントが抗原に結合インタクトな抗体によって認識される限り、抗体を切断する他の方法、たとえば、一価の軽鎖-重鎖フラグメントを形成するための重鎖の分離、フラグメントのさらなる切断、または他の酵素的、化学的、または遺伝子技術などのようなものも使用され得る。
Fvフラグメントは、VHおよびVL鎖の会合を含む。この会合は、Inbar（インバー）らに記載されるように、一価でありうる[Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69:2659-62 (19720]。代わりに、可変鎖は分子内ジスルフィド結合または化学物質、たとえば、グルタルアルデヒドなどのようなものによる架橋によって連結することができる。好適には、Fvフラグメントはペプチドリンカーによって接続されるVHおよびVL鎖を含む。これらの単鎖抗原結合タンパク質（sFv）は、オリゴヌクレオチドによって接続されたVHドメインおよびVLドメインをコードするDNA配列を含む構造遺伝子を構築することにより調製される。構造遺伝子を発現ベクターに挿入し、続いてそれを宿主細胞、たとえば、E. coli（大腸菌）などのようなものに導入する。組換え宿主細胞は、2つのVドメインを架橋するリンカーペプチドを有する単一のポリペプチド鎖を合成する。sFvを生成するための方法は、例えば、[Whitlow（ホイットロー）およびFilpula（フィルプラ）、Methods（メソッヅ）2：97-105（1991）；Bird（バード）ら、Science（サイエンス）242：423-426（1988）；Pack（パック）ら、Bio/Technology（バイオ／テクノロジー）11：1271-77（1993）；および米国特許第4,946,778号によって記載され、それらの全体が参照によりここに組み込まれる。
抗体フラグメントの別の形態は、単一の相補性決定領域（CDR）をコードするペプチドである。CDRペプチド（「最小認識単位」）は、目的の抗体のCDRをコードする遺伝子を構築することによって得ることができる。そのような遺伝子は、たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、抗体産生細胞のRNAから可変領域を合成することによって調製される。たとえば、Larrick（ラリック）およびFry（フライ）参照[Methods、2：106-10（1991）]。
非ヒト（例は、ネズミ）抗体のヒト化形態は、免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片（Fv、Fab、Fab'、F（ab'）.sub.2または抗体の他の抗原結合サブ配列）のキメラ分子であり、それは非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含む。ヒト化抗体には、レシピエントの相補性決定領域（CDR）を形成する残基が、非ヒト種、たとえば、所望される特異性、親和性および能力をもつマウス、ラットまたはウサギなどのようなもののCDR由来の残基（ドナー抗体）によって置換されるヒト免疫グロブリンが含まれる。例として、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体にも、移入されたCDRまたはフレームワーク配列にも見出されない残基を含み得る。概して、ヒト化抗体は、少なくとも1つの、および典型的には2つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、そこでは、CDR領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、およびFR領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域（Fc）の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンのそのものを含む［Jones（ジョーンズ）ら、Nature（ネイチャー）、321：522-525（1986）；Riechmann（リーチマン）ら、Nature、332：323-329（1988）；およびPresta（プレスタ）、Curr. Op. Struct. Biol.（カレント・オピニオン・イン・ストラクチュラル・バイオロジー）、2：593-596（1992）］。
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当技術でよく知られる。概して、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からそれに導入された1つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、インポート残基と呼ばれ、それらは、通常はインポート可変ドメインから取られる。ヒト化は、Winter（ウィンター）および共同研究者の方法に従い[Jonesら、Nature、321：522-525（1986）；Riechmannら、Nature 332：323-327（1988）；Verhoeyen（フェルホアイアン）ら、Science、239：1534-1536（1988）]、げっ歯類のCDRsまたはCDR配列をヒト抗体の対応する配列に置換することによって、本質的に実行することができる。したがって、そのようなヒト化抗体は、キメラ抗体（米国特許第4,816,567号）であり、そこでは、実質的に無傷のヒト可変ドメインが非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている。実際には、ヒト化抗体は、典型的にはヒト抗体であり、そこで、いくつかのCDR残基および場合によってはいくつかのFR残基が、げっ歯類抗体の類似部位由来の残基によって置換されている。
ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリー[Hoogenboom（フーゲンブーム）およびWinter、J. Mol. Biol.（ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー）、227：381（1991）；Marks（マークス）ら、J. Mol. Biol.、222：581（1991）]を含め、当技術において知られる種々の技術を用いて生成することができる。Cole（コール）ら、およびBoerner（ボェルナー）らの技術はまた、ヒトモノクローナル抗体の調製のためにも利用可能である（Coleら、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R.Liss、p.77（1985）およびBoernerら、J. Immunol.（ジャーナル・オブ・イムノロジー）、147（1）：86-95（1991））。同様に、ヒト抗体は、トランスジェニック動物、例は、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されたマウスに、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することによって作製することができる。チャレンジにより、ヒト抗体生成が観察され、それは、すべての観点、遺伝子再構成、アセンブリー、および抗体レパートリーを含め、ヒトにおいてみられるものによく似ている。このアプローチは、たとえば、米国特許第5,545,807号、第5,545,806号、第5,569,825号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,661,016号、および以下の科学刊行物に記載されている：Marksら、Bio/Technology 10,：779-783（1992）；Lonberg（ロンベルグ）ら、Nature 368：856-859（1994）；Morrison（モリスン）、Nature 368 812-13（1994）；Fishwild（フィッシュワイルド）ら、Nature Biotechnology（ネイチャー・バイオテクノロジー）14、845-51（1996）；Neuberger、（ノイバーガー）、Nature Biotechnology 14：826（1996）；LonbergおよびHuszar（フサール）、Intern. Rev. Immunol.（インターナショナル・レビューズ・オブ・イムノロジー）13、65-93（1995）に記載されている。
したがって、細胞内CELA3A、CELA1、および/またはカテプシンC酵素活性の少なくとも1つの抑制は、たとえば、酵素の立体配座変化の認識によって活性酵素に特異的に結合する抗体を用いて影響され得る。あるいは、抗体は、酵素の基質に結合することによって酵素活性を抑制し得る。
本発明の一実施形態によれば、Kd 10-7M以下のCELA3AおよびCELA1に対する最小親和性で結合するが、少なくとも10倍より低い（例は、10-6M）最小親和性でCELA2AまたはCELA3Bに結合する抗体が提供される。特定の実施形態によれば、抗体は、（10-8-10-10Mまたは10-9-10-10M）の範囲のKdで標的に結合する。
本発明の1つの実施形態によれば、カテプシンCに対して10-7M以下のKdの最小親和性で結合するが、、カテプシンA、B、D、E、G、H、K、L1、L2、O、S、WまたはZに少なくとも10倍低い（例は、10-6M）最小親和性で結合する抗体が提供される。特定の実施形態によれば、抗体は、（10-8-10-10Mまたは10-9-10-10M）の範囲のKdで標的に結合する。
本教示に従って使用され得る模範的な抗体には、制限されないが、例は、EMD Millipore（EMDミリポア社）、Sigma-AldrichおよびSanta Cruz Biotechnology（サンタ・クルズ・バイオテクノロジー社）から入手可能なCELA1抗体；例は、Abcam（アブカム社）、Sigma-Aldrich、およびSanta Cruz Biotechnologyからが入手可能な抗CELA3A抗体；例は、Sigma-AldrichおよびR＆D Systems（R&Dシステムズ社）から入手可能な抗カテプシンC / CTSC抗体が含まれる。そのような抗体は、以下にさらに記載されるように、その特異性について認定され得る。
カテプシンC、CELA1、CELA3Aまたはそれに構造的に関連する酵素を抑制することが可能な別の薬剤は、カテプシンC、CELA1、CELA3Aまたはそれに構造的に関連する酵素に結合および/または開裂する任意の分子である。そのような分子は、カテプシンC、CELA1、CELA3Aまたはそれに構造的に関連する酵素のアンタゴニスト、またはカテプシンC、CELA1、CELA3A、またはそれに構造的に関連する酵素の抑制ペプチドであり得る。
カテプシンC、CELA1、CELA3Aまたはそれに構造的に関連する酵素の少なくとも触媒または結合部分の非機能的類似体は、カテプシンC、CELA1、CELA3Aまたは構造的に関連する酵素を抑制する薬剤としても使用できることが理解されよう。
カテプシンC、CELA1、CELA3Aまたはそれに構造的に関連する酵素を抑制するために本発明のいくつかの実施形態とともに使用することができる別の薬剤は、カテプシンC、CELA1、CELA3Aまたはそれに構造的に関連する酵素の活性化または基質結合性を防止する分子である。
カテプシンC、CELA1、CELA3Aまたはそれに構造的に関連する酵素を抑制するために本発明のいくつかの実施形態とともに使用することができる別の薬剤は、ドミナントネガティブ分子、すなわち、そのペプチドの一部またはその変形体で、カテプシンC、CELA1、CELA3Aまたはそれに構造的に関連する酵素のエフェクター（作動体とも言う）と競合する。
細胞内カテプシンC、CELA1、CELA3Aまたはそれに構造的に関連する酵素の少なくとも1つを抑制するために本発明のいくつかの実施形態とともに使用することができる別の薬剤は、その活性化経路において自然なインヒビターである。本発明の教示に従って用い得るカテプシンCの模範的な自然なインヒビターには、制限されないが、シスタチンF、ヒトプロテイナーゼインヒビター9（PI-9/セルピンB9）、シスタチンCおよびステフィンAおよびBが含まれる。
したがって、細胞膜を透過するか、または透過するように改変されてもよく（以下に詳述するように）、および細胞内カテプシンC、CELA1、CELA3Aまたは構造的に関連する酵素の少なくとも1つの触媒活性を本教示に従って使用してもよい。特に好ましい実施態様において、本発明は、細胞内CELA3Aまたは構造的に類似の酵素のCELA1、および/またはカテプシンCの少なくとも1つを特異的に抑制する小分子の使用に向けられる。本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、小分子は、細胞内CELA3A、CELA1、および/またはカテプシンCの少なくとも1つに特異的にKd 10-7Mおよびそれよりも低い（以下とも言う）の最小親和性を伴い結合し、およびCELA2AまたはCELA3B、またはカテプシンA、B、D、E、G、 H、K、L1、L2、O、S、WまたはZに少なくとも10倍より高いKdの最小親和性を伴って結合する。
他の態様では、本発明は、特定のエラスターゼインヒビター、たとえば、エラスターゼインヒビターII（MeOSuc-AAPA-CMK）などのようなもので、Calbiochem-Novabiochem（カルバイオケム-ノババイオケム）、USAから入手可能であるものの使用を意図する。
本発明に従って使用することができる模範的なエラスターゼインヒビターにはまた、非ペプチド小分子も含まれる。
いくつかの態様では、そのようなエラスターゼインヒビターはまた、CELA1、CELA3、および特にCELA3Aおよび/またはカテプシンCの発現を下方制御し、および/または活性を抑制するこの発明の化合物/薬剤を表すこともできる。CELA3または構造的に関連するインヒビターは、3D構造類似性およびトポロジー（位相的）アナログに基づいて、CELA3Aに対して特異的に設計され得る。いくつかの小分子は、様々な化学ファミリーに属することがある。選択的および特異的にCELA 3Aまたは構造的に類似の酵素を抑制することができる模範的な化合物には、ここでのテーブル1に列挙されたものが含まれる。
本発明はまた、以下のテーブル1に列挙される薬剤、またはその誘導体、異性体、塩、酸化物、多形体もしくはそのものの他の既知の形態の任意のサブグルーピングを包含するものと理解される。
壊死を抑制することができる薬剤には、とりわけ、様々な化学的ファミリーに属する他の小さな抑制性化合物、たとえば、2-アミノイミダゾリン、2-アミノチアゾールおよびイソオキサゾールが含まれる。
いくつかの実施形態では、薬剤は、以下のテーブルIによって記載される任意の化合物であり、またはいくつかの実施形態では、薬剤は、その誘導体、類似体、または薬学的塩または異性体である。
いくつかの実施形態では、テーブル1において記載される薬剤の任意の組合せまたはサブグルーピングが、この発明の一部として企図され、およびその実施形態を表す。
CELA 1を選択的かつ特異的に抑制することができる模範的な化合物には、制限されないが、N-[4-[4-（イソブチリルアミノ）フェノキシ]フェニル]-2-メチル-プロピオンアミド、エチル-2,3-ジヒドロ-3-オキソ-1,2-ベンズイソチアゾール-2-アセタート-1,1-ジオキシドが含まれる。
いくつかの実施形態では、この発明の化合物および/またはこの発明の組成物が含まれ、および/またはこの発明の方法は使用を提供し、および/またはこの発明の第1の医学的使用は次の式：
によって特徴付けられる薬剤またはそれらの任意の組合せが含まれる。いくつかの態様において、この発明の化合物および/またはこの発明の組成物は含まれ、および/またはこの発明の方法は使用を提供し、および/またはこの発明の第1の医学的使用には、M059-0032；M059-0055；M059-0082；M059-0053；M059-0335；M059-0891；M059-0891；M059-1012、M008-0111；4112-3656；Z632-2266；またはZ601-4253の構造またはそのものの任意のサブセットによって特徴付けられる薬剤が含まれうる。いくつかの態様では、この発明の化合物および/またはこの発明の組成物は含まれ、および/またはこの発明の方法は使用を提供し、および/またはこの発明の第1の医学的使用には、M059-0032；M059-0055；M059-0082；M059-0053；M059-0335；M059-0891；M059-0891；M059-1012の構造、または中央の2-アミノイミダゾリンが、それらのいずれかの2-アミノ位置で、置換または非置換ピロリジン、置換または非置換ピペリジン、置換または非置換ピペラジン、置換または非置換イミダゾリジン、置換または非置換ピラゾリジン、置換または非置換アリール、置換または非置換5または6員複素環式環、または置換または非置換5または6員シクロアルキルを伴って置換を含む同様の構造を有する化合物によって特徴付けられる薬剤が含まれる。いくつかの態様において、本発明の化合物および/または本発明の組成物は含まれ、および/または本発明の方法は使用を提供し、および/または本発明の第1の医学的使用は、M059-0032；M059-0055；M059-0082；M059-0053；M059-0335；M059-0891；M059-0891；M059-1012の構造、または中央の2-アミノイミダゾリンによって非置換ピロリジン、非置換ピペリジン、非置換ピペラジン、非置換イミダゾリジン、非置換ピラゾリジン、非置換アリール、非置換5または6員複素環式環、または非置換5または6員シクロアルキルを伴うそのものの任意の2-アミノ位置での置換を含む類似の構造を有する化合物により特徴付けられる薬剤を含みうる。いくつかの態様では、本発明の化合物および/または本発明の組成物は含まれ、および/または本発明の方法は使用を提供し、および/または本発明の第1の医学的使用は、M059-0032；M059-0055；M059-0082；M059-0053；M059-0335；M059-0891；M059-0891；M059-1012の構造、または中央の2-アミノイミダゾリンによって置換ピロリジン、置換ピペリジン、置換ピペラジン、置換イミダゾリジン、置換ピラゾリジン、置換アリール、置換5または6員複素環式環、置換5または6員シクロアルキルを伴い同様の任意の2-アミノ位置での置換を含む類似の構造を有する化合物により特徴付けられる薬剤を含みうる。いくつかの態様において、本発明の化合物および/または本発明の組成物は含まれ、および/または本発明の方法は使用を提供し、および/または本発明の第1の医学的使用は、M059-0032；M059-0055；M059-0082；M059-0053；M059-0335；M059-0891；M059-0891；M059-1012の構造、または中央の2-アミノイミダゾリンによって、それらのいずれかの2-アミノ位置で、置換または非置換ピロリジン、置換または非置換ピペリジン、置換または非置換ピペラジン、置換または非置換イミダゾリジン、置換または非置換ピラゾリジンを伴う置換を含む同様の構造を有する化合物により特徴付けられる薬剤を含みうる。
いくつかの態様において、本発明の化合物および/または本発明の組成物は含まれ、および/または本発明の方法は使用を提供し、および/または本発明の第1の医学的使用は、M008-0111；4112-3656；またはZ632-2266の構造またはそのものの任意のサブセットにより特徴付けられる薬剤を含みうる。
いくつかの態様では、本発明の化合物および/または本発明の組成物は含まれ、および/または本発明の方法は使用を提供し、および/または本発明の第1の医学的使用は、M008-0111；4112-3656またはZ632-2266の構造、または中央の2-アミノイミダゾリンによって、置換または非置換ピロリジン、置換または非置換ピペリジン、置換または非置換ピペラジン、置換または非置換イミダゾリジン、置換または非置換ピラゾリジン、置換または非置換アリール、置換または非置換5または6員複素環式環、または置換または非置換5または6員シクロアルキルを伴い、2-アミノ位置で置換を含む同様の構造を有する化合物により特徴付けられる薬剤を含みうる。いくつかの態様では、本発明の化合物および/または本発明の組成物は含まれ、および/または本発明の方法は使用を提供し、および/または本発明の第1の医学的使用は、M008-0111；4112-3656またはZ632-2266の構造、または中央の2-アミノチアゾリンまたはイソキサゾールによって、非置換ピロリジン、非置換ピペリジン、非置換ピペラジン、非置換イミダゾリジン、非置換ピラゾリジン、非置換アリール、非置換5または6員複素環式環、または非置換5または6員シクロアルキルを伴って、2-アミノ位置での置換を含む類似の構造を有する化合物によって特徴付けられる薬剤を含みうる。いくつかの態様では、本発明の化合物および/または本発明の組成物は含まれ、本発明の方法は使用を提供し、および/または本発明の第1の医学的使用は、M008-0111；4112-3656またはZ632-2266の構造、または中央の2-アミノチアゾリンによって、置換ピロリジン、置換ピペリジン、置換ピペラジン、置換イミダゾリジン、置換ピラゾリジン、置換アリール、置換5または6員複素環式環、置換5または6員シクロアルキルを伴って、2-アミノ位置での置換を含む類似の構造を有する化合物によって特徴付けられる薬剤を含みうる。
いくらかの態様において、この発明の化合物および/またはこの発明の組成物は含まれ、および/またはこの発明の方法は使用を提供し、および/またはこの発明の第一の医学的使用は、式I：

式I
の構造によって特徴付けられ、
式中、G1は、置換または非置換ピロリジン、置換または非置換ピペリジン、置換または非置換ピペラジン、置換または非置換イミダゾリジン、または置換または非置換ピラゾリジンであり；および
G3は以下の構造：
によって特徴付けられるか；またはG3は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリールまたは置換または非置換のシクロアルキルであり；
式中、G2は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリール、置換または非置換のシクロアルキルまたは置換または非置換の複素環である、薬剤；または
式II：

式II
の構造によって特徴付けられ、
式中、G1は、置換または非置換ピロリジン、置換または非置換ピリジン、置換または非置換アリール、置換または非置換ピペリジン、置換または非置換ピペラジン、置換または非置換イミダゾリジン、または置換または非置換ピラゾリジンであり；および
G3は以下の構造：

によって特徴付けられるか；またはG3は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリールまたは置換または非置換のシクロアルキルであり；
式中、G2は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリール、置換または非置換のシクロアルキルまたは置換または非置換の複素環である、化合物；または
式III：
式III
の構造によって特徴付けられ、
式中、G1は、置換または非置換ピロリジン、置換または非置換ピリジン、置換または非置換アリール、置換または非置換ピペリジン、置換または非置換ピペラジン、置換または非置換イミダゾリジン、または置換または非置換ピラゾリジンであり；および
G3は以下の構造：

によって特徴付けられ；またはG3は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリールまたは置換または非置換のシクロアルキルであり；
式中、G2は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリール、置換または非置換のシクロアルキルまたは置換または非置換の複素環である、化合物を含みうる。
いくつかの態様において、本発明は、ここに記載のような式I、II、III、IV、VまたはVIの化合物、またはそれを含む組成物を企図し、およびそのものの第一の医学的使用が含まれ、それによって、式において描かれる環構造は、さらに追加のヘテロ原子、たとえば、追加の窒素または酸素が組み込まれてもよい。
基：

を参照するとき、アスタリスクは、述べられる基のためのアタッチメント（付着）の点を示すことが理解される。たとえば、G3が基

によって式I、

に関して特徴付けられるとき、これは今度は次の構造：

によって特徴付けることができる。熟練者は、アスタリスクが、ここに記載のように、式I-VIによって特徴付けられる化合物のいずれかにおいて適切な対応する構造についての指示された位置の付着点を同様に指し示す（inidicate）ことを理解するであろう。
いくつかの実施形態では、G1、G2またはG3に関し、ピロリジン、ピリジン、ピペリジン、ピペラジン、イミダゾリジン、ピラゾリジンまたは複素環として定義されるが、いくつかの実施形態では、指示された原子に対するそのような記述された基のための付着点は、必要に応じて、窒素またはヘテロ原子を介し、または同じ基の炭素原子を介してよい。
いくつかの実施形態では、式Iの化合物に関して、G1がピロリジンであるとき、付着の点はピロリジン基の窒素原子を介しており、およびいくつかの実施形態では、G1がピペラジンであるとき、付着の点はピペラジン基の窒素原子を介し、およびいくつかの実施形態では、G1がピペリジンであるとき、付着の点はピペラジン基の窒素原子を介する。
いくつかの実施形態では、式IIの化合物に関して、G1がピペリジンであるとき、付着の点はピペラジン基の窒素原子を介し、およびいくつかの実施形態では、G1がピペリジンであるとき、付着の点はピペリジン基の炭素原子を介し、そこでは、窒素原子が付着の点に関してオルト位置にある。
いくらかの実施態様において、この発明は、式VI：

式VI
の構造によって特徴付けられ、
式中：
G1は、随意に置換されるNH-ピロリジン、随意に置換されるNH-ピペリジン、随意に置換されるNH-ピペラジン、随意に置換されるNH-イミダゾリジン、随意に置換されるNH-ピラゾリジン、随意に置換されるNH-アリール、随意に置換されるNH-シクロアルキル、随意に置換されるピロリジン、随意に置換されるピペリジン（piperidine）、随意に置換されるピペリディン（piperidin）、随意に置換されるピペラジン、随意に置換されるイミダゾリジン、または随意に置換されるピラゾリジンであり；
G2は、随意に置換されるアルキル、随意に置換されるアルケニル、随意に置換されるアリール、随意に置換されるヘテロアリール、随意に置換されるシクロアルキルまたは随意に置換される複素環であり；
ここで：
G1が非置換ピロリジンである場合、そのときG2は、アルキル、シクロペンチル、アルキルシクロペンチルまたはフランではなく；または
G1がピペリジンである場合、そのときG2はアルキルではなく；および
G1がピペラジンである場合、そのときG2はアルキルまたはフランではない、
化合物を提供する。
いくらかの実施態様では、G1はピロリジンであり、およびG2はエチルまたはフランである。いくらかの実施態様では、G1は置換ピペラジンであり、およびG2はフランまたはフェニルであり、およびいくらかの実施態様では、G1はピペリジンであり、およびG2は、シクロペンチル、フランまたはフェニルである。いくらかの実施態様では、G1は随意に置換されるイミダゾリジンまたは随意に置換されるピラゾリジンである。
いくらかの態様において、この発明の化合物および/またはこの発明の組成物は含まれ、および/またはこの発明の方法は使用を提供し、および/またはこの発明の第一の医学的使用は、式V：

式V
の構造によって特徴付けられ、
式中、XはNまたはSであり；
G1は、置換または非置換ピロリジン、置換または非置換ピリジン、置換または非置換アリール、置換または非置換ピペリジン、置換または非置換ピペラジン、置換または非置換イミダゾリジン、または置換または非置換ピラゾリジンであり；
G3は

であるか；またはG3は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリールまたは置換または非置換のシクロアルキルであり、それはXがNである場合であり；
G3はなく、それはXがSである場合であり；
G4またはG5は各々、無関係に、

；置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアルコキシ、アシル、置換または非置換のアリールまたは置換または非置換のシクロアルキルであり、それはXがSである場合であり；
G4またはG5は各々無関係にH、OH、ハロゲンであり、それはXがNである場合であり；および
G2は、置換または非置換のアルキル、アルコキシ、アシル、置換または非置換のアリール、置換または非置換のシクロアルキルまたは置換または非置換の複素環である、薬剤を含みうる。
いくらかの実施態様において、この発明は、式VI：

式VI
の構造によって特徴付けられ、
式中：
G1は、随意に置換されるNH-ピロリジン、随意に置換されるNH-ピペリジン、随意に置換されるNH-ピペラジン、随意に置換されるNH-イミダゾリジン、随意に置換されるNH-ピラゾリジン、随意に置換されるNH-アリール、随意に置換されるNH-シクロアルキル、随意に置換されるピロリジン、随意に置換されるピペリジン、随意に置換されるピペリディン、随意に置換されるピペラジン、随意に置換されるイミダゾリジン、または随意に置換されるピラゾリジンであり；
G2は、随意に置換されるアルキル、随意に置換されるアリール、随意に置換されるシクロアルキルまたは随意に置換される複素環であり；
ここで：
G1が非置換ピロリジンである場合、そのときG2は、アルキル、シクロペンチル、アルキルシクロペンチルまたはフランではなく；または
G1がピペリジンである場合、そのときG2はアルキルではなく；および
G1がピペラジンである場合、そのときG2はアルキルまたはフランではない、
化合物を提供する。
いくらかの態様では、G1はピロリジンであり、およびG2はエチルまたはフランである。いくらかの態様では、G1は置換ピペラジンであり、およびG2はフランまたはフェニルであり、いくらかの態様では、G1はピペリジンであり、およびG2は、シクロペンチル、フランまたはフェニルである。いくらかの態様では、G1は随意に置換されるイミダゾリジンまたは随意に置換されるピラゾリジンである。
いくらかの実施態様では、G1は、随意に置換されるNH-ピロリジン、随意に置換されるNH-ピペリジン、随意に置換されるNH-ピペラジン、およびG2は随意に置換されるアルキルであり；またはいくらかの実施態様では、G1は、随意に置換されるNH-ピロリジン、随意に置換されるNH-ピペリジン、随意に置換されるNH-ピペラジン、およびG2は随意に置換されるアルケニルであり；またはいくらかの実施態様では、G1は、随意に置換されるNH-ピロリジン、随意に置換されるNH-ピペリジン、随意に置換されるNH-ピペラジン、およびG2は随意に置換されるアリールであり；またはいくらかの実施態様では、G1は、随意に置換されるNH-ピロリジン、随意に置換されるNH-ピペリジン、随意に置換されるNH-ピペラジン、およびG2は随意に置換されるヘテロアリールであり；またはいくらかの実施態様では、G2は随意に置換されるシクロアルキルであり；またはいくらかの実施態様では、G1は、随意に置換されるNH-ピロリジン、随意に置換されるNH-ピペリジン、随意に置換されるNH-ピペラジン、およびG2は随意に置換される複素環である。
いくらかの実施態様では、G1は、随意に置換されるNH-イミダゾリジンまたは随意に置換されるNH-ピラゾリジンであり、およびG2は随意に置換されるアルキルであり；またはいくらかの実施態様では、G1は、随意に置換されるNH-イミダゾリジンまたは随意に置換されるNH-ピラゾリジンであり、およびG2は随意に置換されるアルキルであり；またはいくらかの実施態様では、G1は、NH-イミダゾリジンまたは随意に置換されるNH-ピラゾリジンであり、およびG2は随意に置換されるアリールであり；またはいくらかの実施態様では、G1は、NH-イミダゾリジンまたは随意に置換されるNH-ピラゾリジンであり、およびG2は随意に置換されるヘテロアリールであり；またはいくらかの実施態様では、G2は随意に置換されるシクロアルキルであり；またはいくらかの実施態様では、G1は、NH-イミダゾリジンまたは随意に置換されるNH-ピラゾリジンであり、およびG2は随意に置換される複素環である。
いくらかの実施態様では、G1は、随意に置換されるNH-アリール、随意に置換されるNH-シクロアルキルであり、およびG2は随意に置換されるアルキルであり；またはいくらかの実施態様では、G1は、随意に置換されるNH-アリール、随意に置換されるNH-シクロアルキルであり、およびG2は随意に置換されるアルケニルであり；またはいくらかの実施態様では、G1は、随意に置換されるNH-アリール、随意に置換されるNH-シクロアルキルであり、およびG2は随意に置換されるアリールであり；またはいくらかの実施態様では、G1は、随意に置換されるNH-アリール、随意に置換されるNH-シクロアルキルであり、およびG2は随意に置換されるヘテロアリールであり；またはいくらかの実施態様では、G2は随意に置換されるシクロアルキルであり；またはいくらかの実施態様では、G1は、随意に置換されるNH-アリール、随意に置換されるNH-シクロアルキルであり、およびG2は随意に置換される複素環である。
いくらかの実施態様では、G1は、随意に置換されるピロリジン、随意に置換されるピペリジン、随意に置換されるピペリディンであり、およびG2は随意に置換されるアルキルであり；またはいくらかの実施態様では、G1は、随意に置換されるピロリジン、随意に置換されるピペリジン（piperidine）、随意に置換されるピペリディンであり、およびG2は随意に置換されるアルケニルであり；またはいくらかの実施態様では、G1は、随意に置換されるピロリジン、随意に置換されるピペリジン、随意に置換されるピペリディンであり、およびG2は随意に置換されるアリールであり；またはいくらかの実施態様では、G1は、随意に置換されるピロリジン、随意に置換されるピペリジン、随意に置換されるピペリディンであり、およびG2は随意に置換されるヘテロアリールであり；またはいくらかの実施態様では、G2は随意に置換されるシクロアルキルであり；またはいくらかの実施態様では、G1は、随意に置換されるピロリジン、随意に置換されるピペリジン、随意に置換されるピペリディンであり、およびG2は随意に置換される複素環である。
いくらかの実施態様では、G1は、随意に置換されるピペラジン、随意に置換されるイミダゾリジン、または随意に置換されるピラゾリジンであり、およびG2は随意に置換されるアルキルであり；またはいくらかの実施態様では、G1は、随意に置換されるピロリジン、随意に置換されるピペリジン、随意に置換されるピペリディンであり、およびG2は随意に置換されるアルケニルであり；またはいくらかの実施態様では、G1は、随意に置換されるピペラジン、随意に置換されるイミダゾリジン、または随意に置換されるピラゾリジンであり、およびG2は随意に置換されるアリールであり；またはいくらかの実施態様では、G1は、随意に置換されるピペラジン、随意に置換されるイミダゾリジン、または随意に置換されるピラゾリジンであり、およびG2は随意に置換されるヘテロアリールであり；またはいくらかの実施態様では、G2は随意に置換されるシクロアルキルであり；またはいくらかの実施態様では、G1は、随意に置換されるピペラジン、随意に置換されるイミダゾリジン、または随意に置換されるピラゾリジンであり、およびG2は随意に置換される複素環である。
いくらかの実施態様では、この発明は、式VII：

式VII
の構造によって特徴付けられ、
式中：
G1は、随意に置換されるNH-ピロリジン、随意に置換されるNH-ピペリジン、随意に置換されるNH-ピペラジン、随意に置換されるNH-イミダゾリジン、随意に置換されるNH-ピラゾリジン、随意に置換されるNH-ピリジン、随意に置換されるNH-アリール、随意に置換されるNH-シクロアルキル、随意に置換されるピロリジン、随意に置換されるピペリジン、随意に置換されるピペリジン、随意に置換されるピペラジン、随意に置換されるイミダゾリジン、随意に置換されるピラゾリジンまたは随意に置換されるアリールであり；
G2は、

または随意に置換されるアルキル、随意に置換されるアリールまたは随意に置換されるシクロアルキルであり；および
G4は、随意に置換されるピロリジン、随意に置換されるピペリジン、随意に置換されるピペラジン、随意に置換されるイミダゾリジンまたは随意に置換されるピラゾリジンであり；
ここで：
G1がピペリジンである場合、そのときG4はピロリジンではなく、またはG2は随意に置換されるアリールではなく；または
G1がイミダゾリジンである場合、そのときG2は随意に置換されるアリールではなく；または
G1が随意に置換されるNH-ピリジンである場合、そのときG2は随意に置換されるアリールではなく；または
G1が随意に置換されるNH-アリールである場合、そのときG2は随意に置換されるアリールではなく；または
G1が随意に置換されるピリジンである場合、そのときG2は随意に置換されるアリールではない、
化合物を提供する。
いくらかの実施態様では、この態様に従い、G1は随意に置換されるNH-ピリジンであり、G2は、

であり、式中、G4はピロリジンであり、またはG2はハロアリールであり、およびいくらかの実施態様では、この態様に従う。
G1は随意に置換されるNH-アリールであり、およびG2は、

であり、式中、G4はピロリジンである。
いくらかの態様では、アルキル、アルケニル、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、イミダゾリジンピラゾリジン、アリール、ヘテロアリール、複素環式環、またはシクロアルキル基に関する用語「置換」への言及は、ハロゲン、ヒドロキシル、C1-C6直鎖または分枝鎖アルキル、ニトロ、CN、ニトリルアミド、アミドスルフィド、アミノ、アルデヒド、置換ケトン、-COOH、エステル、トリフルオロメチル、アミド、アルコキシまたはハロアルキル基またはそれらの任意のサブコンビネーションが含まれてよい。
いくつかの態様では、アルキル、アルケニル、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、イミダゾリジンピラゾリジン、アリール、ヘテロアリール、複素環式環、またはシクロアルキル基に関する用語「置換」への言及は、ハロゲン、ヒドロキシル、C1-C6直鎖または分枝鎖アルキル、ニトロ、CN、ニトリルアミド、アミドスルフィド、アミノ、アルデヒド、またはそれらの任意のサブコンビネーションが、またはいくらかの実施態様では、置換ケトン、-COOH、エステル、トリフルオロメチル、アミド、アルコキシまたはハロアルキル基またはそれらの任意のサブコンビネーションが、またはいくらかの実施態様では、ハロゲン、ヒドロキシル、C1-C6直鎖または分枝鎖アルキル、またはそれらの任意のサブコンビネーションが、またはいくらかの実施態様では、ニトロ、CN、ニトリルアミド、アミドスルフィド、アミノ、アルデヒド、またはそれらの任意のサブコンビネーションが含まれてよい。
いくらかの態様では、用語「アルキル」は、直鎖または分枝鎖C1-C6アルキルを含むと理解されるべきである。いくらかの態様では、「シクロアルキル」という用語は、3-、4-、5-または6-員の不飽和環を含むと理解されるべきである。
いくらかの態様では、用語「アルキル」は、線状、分枝状、または環状炭化水素構造およびそれらの組合せを含むことを意図する。アルキル基の例には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、s-およびt-ブチルおよびその他同種類のものなどが含まれる。いくらかの実施態様では、アルキル基はC20以下のものである。いくらかの実施態様では、アルキル基はC7以下のものである。いくらかの実施態様では、アルキル基はC6以下のものである。シクロアルキルは、アルキルのサブセットであり、および3から13個までの炭素原子の環状炭化水素基を含む。シクロアルキル基の例には、c-プロピル、c-ブチル、c-ペンチル、ノルボルニル、アダマンチルおよびその他同種類のものなどが含まれる。この出願では、アルキルは、アルカニル、アルケニルおよびアルキニル残基に言及する。シクロヘキシルメチル、ビニル、アリル、イソプレニルおよびその他同種類のものなどを含むことも意図する。アルキレンはアルキルの別のサブセットであり、アルキルと同じ残基に言及するが、2つの付着の点を有する。アルキレンの例には、エチレン（-CH2CH2-）、プロピレン（-CH2CH2CH2-）、ジメチルプロピレン（-CH2C（CH3）2CH2-）およびシクロヘキシルプロピレン（-CH2CH2CH（C6H13）-）が含まれる。特定の数の炭素を有するアルキル残基が指定されるとき、その炭素数を有するすべての幾何異性体が包含されることを意図され；したがって、たとえば、「ブチル」は、n-ブチル、sec-ブチル、イソブチルおよびt-ブチルを含むことを意味し；「プロピル」には、n-プロピルおよびイソプロピルが含まれる。
ここでの用語「アルコキシ」または「アルコキシル」は、基-O-アルキル、好ましくは、酸素を通して親構造に付着する直鎖、分枝鎖、環状立体配置およびそれらの組合せの1から8個までの炭素原子を含めて言及しうる。例には、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、シクロプロピルオキシ、シクロヘキシルオキシおよびその他同種類のものなどが含まれる。
「置換アルコキシ」という用語は、ここにおいて基-O-（置換アルキル）に言及することができる。
「アシル」という用語は、ここでは、カルボニル官能基を通して親構造に付着する直鎖、分枝鎖、環状立体配置、飽和、不飽和および芳香族およびそれらの組合せの1から10個までの炭素原子の基に言及しうる。親への付着の点がカルボニルに残っている限り、アシル残基中の1以上の炭素は窒素、酸素または硫黄で置き換えられていてもよい。例には、アセチル、ベンゾイル、プロピオニル、イソブチリル、t-ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニルおよびその他同種類のものなどが含まれる。
用語「アリール」は、ここでは、5-または6-員芳香環、二環式9-または10-員芳香族環系、または三環式12-ないし14-員芳香族環系に言及しうる。例には、シクロペンタ-1,3-ジエン、フェニル、ナフチル、インダン、テトラリン、フルオレン、シクロペンタ[b]ナフタレンおよびアントラセンが含まれる。
「ヘテロ環」または「ヘテロシクリル」という用語は、ここでは、1ないし4個の炭素が、たとえば、酸素、窒素または硫黄のようなヘテロ原子によって置換されるシクロアルキル残基に言及しうる。1-4個（またはそれよりも多く）のヘテロ原子を含む4-、5-、6-または7-員の非芳香族環、1-4個（またはそれよりも多く）のヘテロ原子を含む二環式8-、9-または10-員の非芳香族環系、または1-4個（またはそれよりも多く）のヘテロ原子を含む三環式11-ないし14-員の非芳香族環系であり；ヘテロ原子は、O、NまたはSから選ばれる。例には、ピロリジン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロ-チオフェン、チアゾリジン、ピペリジン、テトラヒドロ-ピラン、テトラヒドロ-チオピラン、ピペラジン、モルホリン、チオモルホリンおよびジオキサンが含まれる。
「ヘテロ環」または「ヘテロシクリル」という用語は、ここでは、不飽和の数および配置が基を芳香族にしないという条件で、不飽和結合を含む環系に言及しうる。例には、イミダゾリン、オキサゾリン、テトラヒドロイソキノリン、ベンゾジオキサン、ベンゾジオキソールおよび3,5-ジヒドロベンゾオキサジニルが含まれる。置換ヘテロシクリルの例には、4-メチル-1-ピペラジニルおよび4-ベンジル-1-ピペリジニルが含まれる。
いくつかの態様における用語「アリールアルキル」は、アリールおよびアルキル基の両方に関してここに提供される規定を提供すると理解され、および同様に、任意の組み合わせられた官能基の用語は、各基の説明を無関係に包含すると、同じように理解される。
「随意の」または「随意に」という用語は、後に記載される事象または状況が起こっても起こらなくてもよいことを意味し、および本記載は、前記事象または状況が起こる場合および起こらない場合の例を含む。
たとえば、「随意に置換されるアルキル」は、以下に規定するように、「アルキル」または「置換アルキル」のいずれをも意味する。そのような基は、任意の置換または置換パターンを導入することを意図しておらず（例は、置換アルキルは、随意に置換されるシクロアルキル基を含み、それは次に、随意に置換されるアルキル基を、潜在的に無限に含み）、それは立体的に実現困難であり、合成的に実行可能ではなく、および/または本質的に不安定である。用語「置換または非置換」は、示された基が1以上の置換基を含むか否かに関して同じ選択を包含するものと理解される。
「置換され」という用語は、指定された原子上の1個以上の水素が、示された基からの選定で置き換えられることを意味し、但し、それは現存する状況下での指定された原子の通常の原子価は超えられず、および置換は安定な化合物をもたらす。置換基および/または変数の組合せは、そのような組合せが安定な化合物をもたらす場合にのみ許容される。「安定な化合物」または「安定な構造」は、反応混合物からの有用な純度までの分離、および有効な治療上の薬剤への調剤に残存するのに十分にローバスト（頑強）な化合物を意味する。特定の基、ラジカルまたは部分である。用語「随意に置換され」は、特定の基、ラジカルまたはモイエティ（一部分）による随意の置換を意味する。
ここでの本文、スキーム、例およびテーブル中の不十分な価数を有する任意の炭素およびヘテロ原子は、原子価を満たすのに十分な数の水素原子（群、複数もありうることを示す）を有すると仮定されることにも留意すべきである。
ここに記載のように、本発明は、ここに記載のような化合物の任意の異性体または薬学的に許容可能な塩、N-オキシド、水和物、プロドラッグ、溶媒和物、または誘導体、ここに記載のような化合物の任意の異性体または薬学的に許容可能な塩、N-オキシド、溶媒和物または誘導体を含む組成物、およびここに記載のような化合物の任意の異性体または薬学的に許容される塩、N-オキシド、溶媒和物、水和物または誘導体を採用する第1の医学的用途および/または処置の方法を提供する。
「薬学的に許容可能な塩」という用語は、ここでは、本発明の化合物の生物学的有効性および性質を保持する塩に言及することができ、およびそれらは、生物学的でないもの、またはその他の点で望ましくないものではない。多くの場合、本発明の化合物は、アミノおよび/またはカルボキシル基またはそれに類似の基の存在により、酸および/または塩基の塩を形成することが可能である。薬学的に許容可能な酸付加塩は、無機酸および有機酸により形成することができる。塩を誘導することができる無機酸には、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、およびその他同種類のものなどが含まれる。塩を誘導することができる有機酸には、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、サリチル酸、およびその他同種類のものなどが含まれる。
薬学的に許容可能な塩基付加塩は、無機および有機塩基により形成することができる。塩を誘導することができる無機塩基には、たとえば、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウム、およびその他同種類のものなどが含まれ；特に、アンモニウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩が好ましい。塩が誘導され得る有機塩基には、例えば、第一級、第二級、および第三級アミン、自然に存在する置換アミンを含めて置換アミン、環状アミン、塩基性イオン交換樹脂、およびその他同種類のものなどが含まれ、具体的には、たとえば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、およびエタノールアミンなどのようなものである。
ここにおける用語「溶媒和物」は、薬学的に許容可能な溶媒の1つ以上の分子と物理的に会合した化合物に言及しうる。用語「溶媒和物」は、述べられる化合物、その化合物の薬学的に許容可能な塩、その化合物の溶媒和物、およびその化合物の薬学的に許容可能な塩の溶媒和物を包含するものと理解される。
たとえば、「ここに記載のような化合物」または「記載のような使用のための化合物」などのような句は、式I-VIIの化合物またはその任意の薬学的に許容可能な塩、異性体、N-オキシド、異性体または溶媒和物を包含すると考えられる。
本発明の化合物のプロドラッグおよび溶媒和物もまた、ここにおいて企図される。プロドラッグの議論は、T. Higuchi（ヒグチ）およびV. Stella（ステラ）、Pro-drugs as Novel Delivery Systems（新規デリバリー・システムとしてのプロ-ドラッグ）(1987) 14 of the A. C. S. Symposium Series（A. C. S. シンポジウム・シリーズの14）において、およびBioreversible Carriers in Drug Design（ドラッグ・デザインにおける生物可逆的担体）、(1987) Edward B. Roche（エドワードBロッシェ）編、American Pharmaceutical Association and Pergamon Press（アメリカン・ファーマシューティカル・アソシエーション・アンド・ペルガモン・プレス）において記載される。「プロドラッグ」という用語は、インビボで変換され、式（I）-（IV）の化合物またはその化合物の薬学的に許容可能な塩、水和物または溶媒和物を生成する化合物（例は、薬物前駆体）を意味する。変換は、様々なメカニズム（例は、代謝プロセスまたは化学プロセスにより）、たとえば、血液における加水分解などのようなものを通して起こり得る。プロドラッグの使用についての議論は、T. HiguchiおよびW. Stella、「Pro-drugs as Novel Delivery Systems」、Vol. 14 of the A. C. S. Symposium Series （A.C. S.シンポジウムシリーズのVol. 14）によって、およびBioreversible Carriers in Drug Design、ed.（編者）Edward B. Roche、American Pharmaceutical Association and Pergamon Press、1987において提供される。
本発明に従って使用することができる例示的なカテプシンCインヒビターには、例は、MP Biomedicals, USA（MPバイオメディカル、USA）より入手可能なGly-Phe-ジアゾメチルケトン（Gly-Phe-DMK）が含まれる。
本発明のいくつかの実施形態によれば、任意のバイオインフォマティクス方法は、少なくとも一つの細胞内CELA3Aまたは構造的に関連する酵素、CELA1、および/またはカテプシンCの特異的インヒビターを設計および合成するために使用することができる（例は、バイオインフォマティクス技術、たとえば、Vigyaan、DNALinux仮想デスクトップ（VD）またはBioclipse）。
上記のように、カテプシンC、CELA3AおよびCELA1の活性または発現をダウンレギュレーションすることが可能な別の薬剤は、標的化された様式で発現をサイレンシングするのに適するポリヌクレオチド剤である。そのような薬剤の例は以下に列挙される。
細胞内CELA3A、CELA1、および/またはカテプシンCの少なくとも1つのダウンレギュレーションは、RNAサイレンシングによって達成することができる。ここで使用する「RNAサイレンシング」という語句は、RNA分子によって媒介される調節メカニズムの一群に言及される［例は、RNA干渉（RNAi）、転写遺伝子サイレンシング（TGS）、転写後遺伝子サイレンシング（PTGS）、クウェリング（quelling）、共抑制、および翻訳抑制］で、それらは対応するタンパク質コード遺伝子の発現の抑制すなわち「サイレンシング」をもたらす。RNAサイレンシングは、植物、動物および真菌を含む多くのタイプの有機体において観察された。
ここで使用されるように、用語「RNAサイレンシング剤」は、標的遺伝子の発現を特異的に抑制または「サイレンシング」することが可能なRNAに言及する。一定の実施形態では、RNAサイレンシング剤は、転写後サイレンシングメカニズムを通してmRNA分子の十分なプロセシング（例は、十分な翻訳および/または発現）を防止することが可能である。RNAサイレンシング剤には、非コードRNA分子、たとえば、対形成したストランド（鎖）を含むRNA二重鎖、ならびにそのような小さな非コードRNAがそこから生成され得る前駆体RNAが含まれる。例示的なRNAサイレンシング剤には、dsRNAs、たとえば、siRNAs、miRNAsおよびshRNAsのようなものなどが含まれる。一実施形態では、RNAサイレンシング剤はRNA干渉を誘導することが可能である。別の実施形態では、RNAサイレンシング剤は翻訳抑止を媒介することが可能である。
本発明の一実施形態によれば、RNAサイレンシング剤は標的RNA（例は、カテプシンC、CELA3AおよびCELA1）に特異的であり、および99％以下の標的遺伝子に対するグローバルホモロジー、例は、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％より少ない標的遺伝子に対するグローバルホモロジーを見せる遺伝子またはスプライス変異体を交差抑制またはサイレンシングしない。
RNA干渉は、短い干渉RNA（siRNA）によって媒介される動物における配列特異的転写後遺伝子サイレンシングのプロセスに言及される。植物における対応するプロセスは、普通に、転写後遺伝子サイレンシングまたはRNAサイレンシングとして言及され、および真菌におけるクウェリングとしても言及される。転写後遺伝子サイレンシングのプロセスは、進化的に保存された外来遺伝子の発現を防止するために用いられる細胞防御機構であると考えられており、および普通は多様な動植物（flora and phyla）によって共有される。そのような外来遺伝子発現からの保護は、ウイルス感染から、または相同一本鎖RNAまたはウイルスゲノムRNAを特異的に破壊する細胞応答を介した宿主ゲノムへのトランスポゾンエレメントのランダム組込みから由来する二本鎖RNA（dsRNA）の産生に応じて進化したかもしれない。
細胞において長いdsRNAsの存在は、ダイサーと称されるリボヌクレアーゼIII酵素の活性を刺激する。ダイサーはdsRNAを短い干渉RNAs（siRNAs）として知られるdsRNAの短いピースに加工することに関与する。ダイサー活性から由来する短い干渉RNAsは、典型的には、長さが約21ないし約23のヌクレオチドであり、および約19塩基対の二本鎖を含む。RNAi応答はまた、エンドヌクレアーゼ複合体を特徴とし、一般にRNA誘発サイレンシング複合体（RISC）とも呼ばれ、それはiRNA二本鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を有する一本鎖RNAの切断を媒介する。標的RNAの切断は、siRNA二本鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中央で起こる。
したがって、本発明のいくつかの実施形態は、mRNAからのタンパク質発現をダウンレギュレートするためにdsRNAの使用を企図する。
一実施形態によれば、dsRNAは30bpより大きい。長いdsRNAs（すなわち、30bpより大きいdsRNA）の使用は、二本鎖RNAのこれらのより一層長い領域がインターフェロンおよびPKR応答の誘導をもたらすであろうという考えのために、きわめて制限される。しかしながら、長いdsRNAsの使用は、細胞が膨大な数のsiRNAsを試験する必要性を緩和する最適なサイレンシング配列を選定することができるという点で多くの利点を提供することができ；長いdsRNAsは、サイレンシングライブラリーがsiRNAsに必要とされるよりも少ない複雑さを有することを可能にし；およびおそらく最も重要なことに、長いdsRNAは、治療薬として使用するとき、ウイルスエスケープ変異を防止することができた。
種々の研究は、長いdsRNAsが、ストレス応答を誘導することなく、または有意なオフターゲット効果を引き起こさずに、遺伝子発現をサイレンシングするために使用され得ることを実証する‐たとえば、以下参照［Strat（ストラット）ら、Nucleic Acids Research（ヌクレイック・アシッヅ・リサーチ）、2006、第34巻、第13号、3803-3810；Bhargava（バールガバ）Aら、Brain Res. Protoc.（ブレイン・リサーチ・プロトコルズ）2004、13：115-125；Diallo（ディアロ）M.ら、Oligonucleotides（オリゴヌクレオチズ）、2003；13：381-392；Paddison（パディソン）P. J.ら、Proc. Natl Acad. Sci. USA.（プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ）、2002；99：1443-1448；Tran（チャン）N.ら、FEBS Lett.（FEBSレターズ）、2004；573：127-134]。
特に、いくつかの実施形態による本発明は、インターフェロン経路が活性化されていない細胞（例は、胚細胞および卵母細胞）における遺伝子サイレンシングのための長いdsRNA（30塩基を超える転写物）の導入を企図し、例は、Billy（ビリー）ら、PNAS 2001、Vol 98、第14428-14433頁。およびDialloら、Oligonucleotides、2003年10月1日、13（5）：381-392。doi：10.1089/154545703322617069参照。
いくつかの実施形態による本発明はまた、遺伝子発現を下方制御するためのインターフェロンおよびPKR経路を誘導しないように特異的に設計された長いdsRNAの導入を企図する。例えば、Shinagwa（シナガワ）およびIshii（イシイ）[Genes＆Dev.（ジーンズ・アンド・デベロップメント）17（11）：1340-1345、2003]は、RNAポリメラーゼII（Pol II）プロモーターから長い二本鎖RNAを発現させるために、pDECAPと名付けられたベクターを開発した。pDECAP由来の転写物は、細胞質へのds-RNAの輸送を促進する5'-キャップ構造および3'-ポリ（A）テールの両方を欠くので、pDECAP由来の長いds-RNAはインターフェロン応答を誘導しない。
哺乳動物系におけるインターフェロンおよびPKR経路を回避する別の方法は、トランスフェクションまたは内因性発現のいずれかを介して小抑制（small inhibitory）RNA（siRNA）を導入することによる。
「siRNA」という用語は、RNA干渉（RNAi）経路を誘導する小抑制RNA二本鎖（概して18-30塩基対の間）に言及する。典型的には、siRNAsは、中央の19bpの二本鎖領域および対称な2塩基3'-オーバーハングを終端上で有する21mers（21マー）として化学的に合成されるが、25-30塩基長の化学的に合成されたRNA二本鎖が同じロケーションでの21mersと比較して100倍ほどの効力での増加をもつことができることが最近説明された。RNAiを誘発する際により一層長いRNAを用いて得られる観察され増加した効力は、生成物（21mer）の代わりに基質（27mer）をダイサーに与えることから理論化され、およびこれはRISCへのsiRNA二本鎖の侵入速度または効率を改善する。
3'-オーバーハングの位置がsiRNAの効力に影響を及ぼし、およびアンチセンス鎖での3'-オーバーハングを有する非対称二重鎖は概して、センス鎖での3'-オーバーハングを有するものよりも強力であることが見出された（Rose（ローズ）ら、2005）。このことは、アンチセンス転写産物を標的とするときに反対の有効性パターンが観察されるため、RISCへの非対称鎖負荷に起因する可能性がある。
二本鎖干渉RNA（例は、siRNA）の鎖は、ヘアピンまたはステムループ構造（例は、shRNA）を形成するように連結され得る。したがって、述べられたように、本発明のいくつかの実施形態のRNAサイレンシング剤は、ショートヘアピンRNA（shRNA）であってもよい。
ここで使用される「shRNA」という用語は、ステム-ループ構造を有するRNA剤に言及され、それには、相補的配列の第1および第2の領域が含まれ、本領域の相補性および配向の程度は、塩基対形成がこれらの領域の間で起こるように十分であり、第1および第2の領域はループ領域によって結合され、本ループは、ループ領域内のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）の間の塩基対形成の欠如に起因する。ループでのヌクレオチドの数は、3ないし23、または5ないし15、または7ないし13、または4ないし9、または9ないし11の間またはそれらを含む数である。ループでのヌクレオチドのいくつかは、ループでの他のヌクレオチドとの対の相互作用である。ループを形成するために使用することができるオリゴヌクレオチド配列の例には、5'-UUCAAGAGA-3'（Brummelkamp（ブランメルカンプ）TRら、（2002）Science（サイエンス）296：550）および5'-UUUGUGUAG-3'（Castanotto（カスタノト）D.ら、（2002）RNA 8：1454）。得られる一本鎖オリゴヌクレオチドが、RNAi機構と相互作用することが可能な二本鎖領域を含むステム-ループまたはヘアピン構造を形成することは、この技術での熟練者によって認識されるであろう。
本発明のいくつかの実施形態による使用に適するRNAサイレンシング剤の合成は、以下のようにして行うことができる。最初に、カテプシンC、CELA3AおよびCELA1 mRNA配列を、AAジヌクレオチド配列のAUG開始コドンの下流でスキャンする。潜在的siRNA標的部位として各AAおよび3 '隣接19ヌクレオチドの発生が記録される。好ましくは、非翻訳領域（UTRs）は調節タンパク質結合部位が豊富であるため、siRNA標的部位はオープンリーディングフレームから選定される。UTR結合タンパク質および/または翻訳開始複合体は、siRNAエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨害し得る[Tuschl（ツシュラ）、ChemBiochem.（ケムバイオケム）2：239-245]。しかし、5'UTRに向けられたsiRNAが細胞GAPDH mRNA、および十分に破壊されたタンパク質レベルにおいて約90％の減少を媒介するGAPDHについて実証されるように、非翻訳領域を指向するsiRNAもまた有効であり得ることが理解されるであろう（www.ambion.com/ techlib/tn/91/912.html）。
第2に、任意の配列アラインメントソフトウェア、たとえば、NCBIサーバ（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）から入手可能なBLASTソフトウェアなどのようなものを使用して、潜在的な標的部位を適切なゲノムデータベース（例は、ヒト、マウス、ラット、など）と比較する。他のコード配列と有意な相同性を示す推定標的部位は除外される。
適格（Qualifying）標的配列は、siRNA合成のための鋳型として選定される。好ましい配列は、低いG/C含量を含むものであり、それは、55％より高いG/C含量を有するものと比較して、遺伝子サイレンシングを媒介する上でより有効であることが証明されているからである。いくつかの標的部位は、好ましくは、評価のために標的遺伝子の長さに沿って選定される。選定されたsiRNAのより一層良好な評価のために、ネガティブコントロール（陰性対照とも言う）を併用することが好ましい。ナガティブコントロールsiRNAは、好ましくはsiRNAと同じヌクレオチド組成を含むが、ゲノムとの有意な相同性を欠く。したがって、siRNAのスクランブルされたヌクレオチド配列は、他の遺伝子と何らかの有意な相同性を示さない限り、使用されるのが好ましい。
たとえば、カテプシンCのための適切なsiRNA分子は、配列番号1に記載のような核酸配列を含むことができる。
カテプシンCサイレンシングのための模範的なsiRNA分子、miRNA分子またはshRNA分子は、例は、Sigma-Aldrich、QIAGENまたはOriGeneから商業上購入することができる。
たとえば、CELA1に適するsiRNA分子は、配列番号2に記載されるような核酸配列を含むことができる。
CELA1サイレンシングのための模範的なsiRNA分子、miRNA分子またはshRNA分子は、例は、Sigma-Aldrich、QIAGENまたはOriGeneから商業上購入することができる。
たとえば、CELA3Aに適するsiRNA分子は、配列番号3に記載のような核酸配列を含むことができる。
CELA3Aサイレンシングのための模範的なsiRNA分子、miRNA分子またはshRNA分子は、例は、Sigma-Aldrich、QIAGENまたはOriGeneから商業上購入することができる。
本発明はさらに、配列番号1と少なくとも95％から99％までの同一性を共有するか、または配列番号1に記載されるような核酸配列を含む分離されたポリヌクレオチドを提供する。
本発明はさらに、配列番号2と少なくとも95％から99％までの同一性を共有するか、または配列番号2に記載されるような核酸配列を含む分離されたポリヌクレオチドを提供する。
本発明はさらに、配列番号3と少なくとも95％から99％までの同一性を共有するか、または配列番号3に示される核酸配列を含む分離されたポリヌクレオチドを提供する。
本発明のいくつかの実施形態のRNAサイレンシング剤は、RNAのみを含むそれらの分子に制限される必要はないが、しかし、化学的に修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドをさらに包含することが理解されよう。
RNAサイレンシング剤を用いて標的とされるmRNAsには、制限されないが、それらの発現が望ましくない表現型形質と相関するものが含まれる。標的化され得る模範的なmRNAsは、切断タンパク質をコードするmRNA、すなわち欠失を含むものである。したがって、本発明のいくつかの実施形態のRNAサイレンシング剤は、欠失のいずれかの側の架橋領域を標的とすることができる。そのようなRNAサイレンシング剤の細胞への導入は、突然変異していないタンパク質を影響を受けずに、突然変異したタンパク質のダウンレギュレーションを引き起こす。
別の実施形態によれば、RNAサイレンシング剤はmiRNAであってもよい。
用語「マイクロRNA」、「miRNA」、および「miR」は同義語であり、および約19-28ヌクレオチド長の非コード一本鎖RNA分子のコレクションに言及し、それらは遺伝子発現を調節する。miRNAsは広範囲の有機体（ウイルス、ヒト）に見出され、および発達、恒常性、および病気の原因において役割を演ずることが示された。
miRNAおよびmiRNA*の任意の対の5'および3'端において可変性が存在し得ることに注目すべきである。この変動性は、切断部位に関してドローシャ（Drosha）およびダイサー（Dicer）の酵素処理における変動性に起因し得る。miRNAおよびmiRNA*の5'および3'端での可変性はまた、pri-miRNAおよびpre-miRNAのステム構造におけるミスマッチに起因し得る。ステム鎖（幹鎖とも言う）のミスマッチは、異なるヘアピン構造の集団をもたらす可能性がある。ステム構造における変動はまた、ドローシャおよびダイサーによる開裂の生成物において変動をもたらし得る。
カテプシンC、CELA3AおよびCELA1をダウンレギュレーションすることが可能な別の薬剤は、カテプシンC、CELA3AおよびCELA1のmRNA転写物またはDNA配列を特異的に開裂することが可能なDNAザイム（DNAzyme）分子である。DNAザイムは、一本鎖および二本鎖標的配列の両方を開裂することが可能な一本鎖ポリヌクレオチドである（Breaker（ブレーカー）R. R.およびJoyce（ジョイス）G.のChemistry and Biology（ケミストリー・アンド・バイオロジー）1995；2：655；Santoro（サントロ）S. W. ＆ Joyce、G. F. Proc. Natl, Acad. Sci. USA、1997；943：4262。DNAザイムのための一般的なモデル（「10-23」モデル）が提案された。「10-23」DNAザイムは15のデオキシリボヌクレオチドの触媒ドメインを有し、7ないし9のデオキシリボヌクレオチドのそれぞれの基質認識ドメインの2つに隣接する。このタイプのDNAザイムは、プリン：ピリミジンジャンクション（接合部とも言う）でその基質RNAを効果的に開裂することができる（Santoro, S. W. ＆ Joyce, G. F.、Proc. Natl, Acad. Sci. USA 199；DNAザイムのrevについてはKhachigian（ハチギアン）LM[Curr Opin Mol Ther（カレント・オピニオン・イン・モレキュラー・セラピューティクス）4：119-21（2002）]。
一本鎖および二本鎖の標的開裂部位を認識する合成の、操作されたDNAザイムの構築および増幅の例は、Joyceらへの米国特許第6,326,174号に開示された。ヒトウロキナーゼレセプターに対する類似のデザインのDNAザイムは、ウロキナーゼレセプター発現を抑制し、およびインビボで大腸ガン細胞転移を首尾よく抑制することが最近観察された（Itoh（イトウ）ら、2002、Abstract（アブストラクト）409、Ann Meeting Am Soc Gen Ther wwwdotasgtdotorg）。別の適用において、bcr-ab1ガン遺伝子に相補的なDNAザイムは、白血病細胞におけるガン遺伝子発現の抑制に成功し、およびCMLおよびALLの場合での自己骨髄移植における再発率の低下を成功させた。
カテプシンC、CELA3aおよびCELA1のダウンレギュレーションはまた、カテプシンC、CELA3AおよびCELA1をコードするmRNA転写物と特異的にハイブリダイズすることが可能なアンチセンスポリヌクレオチドを用いることによって行うことができる。
細胞内CELA3A、CELA1、および/またはカテプシンCの少なくとも1つを効率的にダウンレギュレートするために用いることができるアンチセンス分子の設計は、アンチセンスアプローチにとって重要な2つの態様を考慮しつつ行われなければならない。第1の態様は、適切な細胞の細胞質へのオリゴヌクレオチドの配送であり、その一方で、第2の態様は、その翻訳を抑制するように細胞内の指定されたmRNAに特異的に結合するオリゴヌクレオチドの設計である。
先行技術は、オリゴヌクレオチドを多種多様な細胞型に効率的に配送するために使用され得る多数の配送戦略を教示する[例えば、Luft（ルフト）J Mol Med（ジャーナル・オブ・モレキュラー・メディシン）76：75-6（1998）；Kronenwett（クローネンウエット）ら、Blood（ブラッド）91：852-62（1998）；Rajur（ラジュル）らBioconjug Chem（バイオコンジュゲート・ケミストリー）8：935-40（1997）；Lavigne（ラヴィーン）ら、Biochem Biophys Res Commun（バイオケミカル・アンド・バイフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ）237：566-71（1997）およびAoki（アオキ）ら（1997）Biochem Biophys Res Commun 231：540-5（1997）参照]。
さらに、それらの配列を、標的mRNAおよびオリゴヌクレオチドの両方での構造変化のエネルギー論を説明する熱力学的サイクルに基づいて、それらの標的mRNAに対する最も高い予測結合親和性により同定するためのアルゴリズムも利用可能である[例えば、ウォルトン（Walton）ら、Biotechnol Bioeng（バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング）65：1-9（1999）参照]。
そのようなアルゴリズムは、細胞においてアンチセンスアプローチを実践するために首尾よく使用される。例えば、Waltonらによって開発されたアルゴリズムは、 ラビットベータグロビン（RBG）およびマウス腫瘍壊死因子-アルファ（TNFアルファ）転写産物について科学者がアンチセンスオリゴヌクレオチドを首尾よく設計することを可能にした。同じ研究グループは、もっと最近では、kinetic PCR（動力学PCR）技術によって評価したように細胞培養において3つのモデル標的mRNAs（ヒト乳酸デヒドロゲナーゼAおよびBおよびラットgp130）に対する合理的に選択されたオリゴヌクレオチドのアンチセンス活性が、ほとんどすべてのケースにおいて、ホスホジエステルおよびホスホロチオアートオリゴヌクレオチド化学を用いた2つの細胞型における3つの異なる標的に対する試験が含まれ、効率的であると証明されることを報告した。
さらに加え、インビトロ系を用いる特異的オリゴヌクレオチドの効率を設計および予測するためのいくつかのアプローチも発表された（Matveeva（マトベーエワ）ら、Nature Biotechnology（ネイチャー・バイオテクノロジー）16：1374-1375（1998））。
カテプシンC、CELA3AおよびCELA1をダウンレギュレーションすることができる別の薬剤は、カテプシンC、CELA3AおよびCELA1をコードするmRNA転写物を特異的に切断することができるリボザイム分子である。リボザイムは、関心があるタンパク質をコードするmRNAの切断による遺伝子発現の配列特異的抑制にますます使用される[Welch（ウェルチ）ら、Curr Opin Biotechnol.（カレント・オピニオン・イン・バイオテクノロジー）9：486-96（1998）]。任意の特定の標的RNAを切断するようにリボザイムを設計する可能性は、それらを基礎研究および治療用途の両方において貴重なツールにした。治療領域において、リボザイムは、感染症、ガンにおける優勢なガン遺伝子および遺伝的障害における特定の体細胞変異でのウイルスRNAsを標的にするために利用された（Welchら、Clin Diagn Virol.（クリニカル・アンド・ダイアグノスティック・バイロロジー）10：163-71（1998）]。最も注目すべきことに、HIV患者のためのいくつかのリボザイム遺伝子治療プロトコールはすでに第1相試験中である。より最近になって、リボザイムは、トランスジェニック動物研究、遺伝子標的の検証および経路解明に用いられた。いくつかのリボザイムは臨床試験の様々な段階にある。ANGIOZYME（アンジオザイム）はヒト臨床試験で研究される最初の化学合成リボザイムであった。ANGIOZYMEは、血管形成経路における重要な成分であるVEGF-r（血管内皮増殖因子受容体）の形成を特異的に抑制する。Ribozyme Pharmaceuticals, Inc.（リボザイム・ファーマシューティカルズ社）ならびに他の企業は、動物モデルにおいて抗血管新生治療薬の重要性を実証した。HEPTAZYMEは、C型肝炎ウイルス（HCV）RNAを選択的に破壊するように設計されたリボザイムであり、細胞培養アッセイでC型肝炎ウイルスRNAを減少させるのに有効であることが見出された（Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated-WEBホームページ）。
したがって、カテプシンC、CELA3AおよびCELA1調節領域における任意の所定の配列について、三重鎖形成配列を考案することができる。三重鎖形成オリゴヌクレオチドは、好ましくは少なくとも15、より一層好ましくは25、さらにより一層好ましくは30またはそれよりも多くのヌクレオチド長、最大で50または100bpまでである。
TFOsによる細胞のトランスフェクション（例えば、カチオン性リポソームによる）、および標的DNAによる三重らせん構造の形成は、立体的および機能的変化を誘導し、転写開始および伸長がブロックされ、内因性DNAでの望ましい配列変化の導入が可能にされ、および遺伝子発現の特異的ダウンレギュレーションがもたらされる。TFOsにより処理された細胞における遺伝子発現のそのような抑止の例には、TFOで処置した細胞における遺伝子発現のこのような抑制の例には、哺乳動物細胞におけるエピソームsupFG1および内因性HPRT遺伝子のノックアウトが含まれる（Vasquez（バスケス）ら、Nucl Acids Res.（ヌクレイック・アシッズ・リサーチ）1999；27：1176-81およびPuri（プリ）ら、J Biol Chem（ジャーナル・オブ・ケミカル・バイオロジー）、2001；276：28991-98）、および前立腺ガン病因において重要なEts2転写因子の発現の配列-および標的特異的ダウンレギュレーション（Carbone（カルボーネ）ら、Nucl Acid Res. 2003；31：833-43）、および炎症誘発性ICAM-1遺伝子（Besch（ベシュ）ら、J Biol Chem、2002；277：32473-79）が含まれる。さらに、Vuyisich（ブイッジヒ）およびBeal（ビール）は最近、配列特異的TFOsがdsRNAに結合することができ、dsRNA依存性酵素、たとえば、RNA依存性キナーゼなどのようなものの活性が抑制されることを示した（VuyisichおよびBeal、Nuc. Acids Res 2000；28：2369-74）。
さらに追加的に、上記の原理に従って設計されたTFOsは、DNA修復を行うことができる定方向（有向とも言う）変異誘発を誘導することができ、従って内因性遺伝子の発現のダウンレギュレーションおよびアップレギュレーションの両方が提供される（Seidman（セイデマン）およびGlazer（グレーザー）、J Clin Invest（ザ・ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション）2003；112：487-94）。有効なTFOsの設計、合成および管理の詳細な説明は、Froehler（フレーリラー）らへの米国特許出願第2003 017068号および第2003 0096980号、ならびにEmanuele（エマニュエル）らへの2002 0128218および2002 0123476、ならびに、Lawn（ローン）への米国特許第5,721,138号において見出すことができる。
本教示のポリヌクレオチド剤によって標的とされ得るCELA1およびCELA3Aの模範的な核酸領域は、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35に記載されるような核酸配列が含まれる。しかし、カテプシンC、CELA1および/またはCELA3Aの任意の核酸領域が、標的の様式でその発現をサイレンシングし、本発明の教示に従って使用され得ることは理解されるであろう。
本発明はさらに、モデレート（中程度）からストリンジェント（厳格）なハイブリダイゼーション条件下で、CELA1および/またはCELA3Aに特異的にハイブリダイズするが、CELA2AまたはCELA3Bに対してはハイブリダイズしない分離されたポリヌクレオチドを提供する。本発明でのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、例えば、10％デキストラン硫酸、1M NaCl、1％SDSおよび5×106cpm 32p標識プローブを含むハイブリダイゼーション溶液によって65℃で、0.2×SSCおよび0.1％SDSの洗浄溶液で、および65℃での最終洗浄で；その一方、モデレートなハイブリダイゼーション条件は、例えば、10％デキストラン硫酸、1M NaCl、1％SDSおよび5×106cpm 32p標識プローブを含むハイブリダイゼーション溶液によって65℃で、1×SSCおよび0.1％SDSの最終洗浄溶液により、および50℃での最終洗浄で作用され得る。
本発明はさらに、カテプシンCに特異的にハイブリダイズするが、モデレートないしストリンジェントなハイブリダイゼーション条件でカテプシンA、B、D、E、G、H、K、L1、L2、O、S、WまたはZにはそうしない分離されたポリヌクレオチドを提供する。
壊死性細胞におけるカテプシンC、CELA1および/またはCELA3A発現をダウンレギュレートするための分離されたポリヌクレオチド剤は、それ自体が細胞に提供され得る。そのようなポリヌクレオチド剤は、典型的には、発現構築物の一部分として細胞に施与される。この場合、ポリヌクレオチド剤は、細胞においてポリヌクレオチド剤の発現を構成的または誘導的様式で指示することができるシス作用調節エレメント（例は、プロモーター）の制御下で核酸構築物において連結される。
本発明での発現構築物はまた、それを、真核生物における複製および組込みに適するようにするさらなる配列（例は、シャトルベクター）を含み得る。典型的なクローニングベクターは、転写および翻訳開始配列（例えば、プロモーター、エンハンス）および転写および翻訳ターミネーター（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含む。本発明での発現構築物は、プロモーター配列に隣接し、または離れてもよく、そこから転写を上方制御することができるエンハンサーをさらに含むことができる。
既に記載された実施形態に加えて、本発明での発現構築物は、典型的には、クローニングされた核酸の発現レベルを増加させるか、または組換えDNAを所有する細胞の識別を容易にするために、他の特殊な要素を含み得る。例えば、多数の動物ウイルスは、許容細胞型においてウイルスゲノムの染色体外複製を促進するDNA配列を含む。これらのウイルスレプリコンを保有するプラスミドは、プラスミド上または宿主細胞のゲノム上に伴われるいずれかの遺伝子によって適切な因子が提供される限り、エピソーム的に複製される。
本発明での発現構築物は真核生物のレプリコンを含んでも含まなくてもよい。真核生物のレプリコンが存在する場合、ベクターは適切な選択マーカーを用いて真核細胞において増幅することができる。構築物が真核生物レプリコンを含まない場合、エピソーム増幅は不可能である。代わりに、組換えDNAは、操作された細胞のゲノムに組み込まれ、そこでは、プロモーターは望ましい核酸の発現を指示する。
適切な遺伝子配送ビヒクル/方法（トランスフェクション、形質導入、など）および適切な発現系を用いて、核酸構築物を本発明での壊死性細胞に導入することができる。
哺乳動物発現ベクターの例には、制限されないが、pcDNA3、pcDNA3.1（+/-）、pGL3、pZeoSV2（+/-）、pSecTag2、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto、pCR3.1、pSinRep5、DH26S、DHBB、pNMT1、pNMT41およびpNMT81で、それらは、Invitrogen（インビトロゲン社）から入手可能でり、pCIで、それは、Promega（プロメガ社）から入手可能であり、pMbac、pPbac、pBK-RSVおよびpBK-CMVで、それらは、Strategene（ストラテジーン社）から入手可能であり、pTRESで、それは、Clontech（クロンテク社）から入手可能であり、およびそれらの派生物が含まれる。
様々な方法を用いて、本発明の発現ベクターをヒト細胞に導入することができる。そのような方法は、包括的に、例えば：Sambrook（サムブルック）J.およびRussell（ラッセル）D. W.（1989、1992、2001）、Molecular Cloning：A Laboratory Manual（分子クローニング：ラボラトリー・マニュアル）、Cold Springs Harbor Laboratory（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー）、New York（ニューヨーク）；Ausubel（オーズベル）R. M.ら、eds.（編集）（1994、1989）。Current Protocols in Molecular Biology（カレント・プロトコルズ・イン・モレキュラー・バイオロジー）、John Wiley and Sons（ジョン・ワイリー・アンド・サンズ）、Baltimore（ボルチモア）、MD（米国メリーランド州）（1989）；Chang（チャン）P. L.ら、ed.（1995）。Somatic Gene Therapy（ソマティック・ジーン・セラピー）、CRC Press（CRCプレス）、Boca Raton（ボーカラトーン）、Fla（フロリダ）。Vega（ベガ）M. A.（1995）。Gene Targeting（ジーン・ターゲティング）、CRC Press、Boca Raton、FL（フロリダ州）。Rodriguez（ロドリゲス）R. L.およびDenhardt（デンハルト）D. H.（1987）。Vectors（ベクターズ）：A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses（分子クローニングベクターおよびその使用の調査）、Butterworth-Heinemann（バターワース-ハイネマン）、Boston（ボストン）、Mass（マサチューセッツ州）；およびGilboa（ギルボア）E.ら（1986）。Transfer and expression of cloned genes using retro-viral vectors（レトロ-ウイルスベクターを用いるクローン化遺伝子の導入および発現Biotechniques（バイオテクニックズ）4（6）、504-512において説明され；および例えば、安定または一過性トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、および組換えウイルスベクターによる感染が含まれる。さらに、ポジティブ-ネガティブ選定法のための米国特許第5,464,764号および第5,487,992号を参照。
細胞内CELA3A、CELA1、および/またはカテプシンCの少なくとも1つのそれぞれが細胞内標的であるので、本発明の薬剤は細胞内配送のために調剤され得る。例えば、本発明での高親和性結合分子（例えば、抗体）は細胞内送達のためにさらに設計され得る。
いくらかの実施態様において、ここに提供されるRNAサイレンシング剤は、細胞浸透性ペプチドと機能的に会合することができる。ここに使用されるように、「細胞浸透性ペプチド」は、短い（約12-30残基）アミノ酸配列または機能的モチーフを含むペプチドであり、それはエネルギー非依存性（すなわち、非エンドサイトーシス）転座特性を、膜透過性複合体の細胞の血漿および/または核膜を通過する輸送に関連して付与する。本発明のいくつかの実施態様の膜透過性複合体は、少なくとも1つの非機能性システイン残基を好ましくは含み、それは遊離または誘導体化されるかのいずれかで、そのような連結のために修飾された二本鎖リボ核酸とジスルフィド結合を形成する。そのような特性を付与する代表的アミノ酸モチーフは、米国特許第6,348,185号に列挙され、その内容は、参照によりここに明示的に組み込まれる。本発明のいくらかの実施態様の細胞透過性ペプチドは、制限されないが好ましくは、ペネトラチン、トランスポータン、pIsl、TAT（48-60）、pVEC、MTS、およびMAPが含まれる。
したがって、例えば、本発明での標的細胞（例えば、壊死性細胞）へのこれらの抗体の配送のために、脂質系システムを使用することができる。
リポソームには、容量を囲む脂質二重層からなる任意の合成（すなわち、天然に存在しない）構造のものが含まれる。リポソームには、エマルジョン、フォーム、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散物、ラメラ（積層状）層およびその他同種類のものなどが含まれる。リポソームは、本技術で知られる方法のいずれかによって調製することができる[Monkkonen（モンコネン）J.ら、1994、J. Drug Target（ジャーナル・オブ・ドラッグ・ターゲティング）、2：299-308；Monkkonen, J.ら、1993、Calcif. Tissue Int.（カルシフィード・ティッシュ・インターナショナル）、53：139-145；Lasic（レーシック）D D.、Liposomes Technology Inc.（リポソームズ・テクノロジー社）、Elsevier（エルセビア）、1993、63-105。（第3章）；Winterhalter（ウィンターハルター）M、Lasic D D、Chem Phys Lipids（ケミストリー・アンド・フィジックス・オブ・リピッズ）、1993年9月；64（1-3）：35-43]。リポソームは、正に帯電していてもよく、中性であってもよいし、負に帯電していてもよい。単核貪食システム（MPS）取り込みについて、リポソーム膜の親水性マスキング（例えば、ポリエチレングリコール結合脂質および親水性粒子の使用による）がMPS取り込みを起こし難いことがあるので、リポソームは疎水性であることができる。リポソームはまた、立体的に遮蔽された脂質、たとえば、ガングリオシドGM1およびホスファチジルイノシトールなどのようなものは、これらの脂質がMPS摂取を妨げるので、含まないことが好ましい。
リポソームは、単一の脂質層であってもよく、または多層であってもよい。治療上の薬剤が親水性である場合、それらのより一層大きな内部容量のために大きな単層ベシクル（小胞とも言う）を使用してその配送をさらに改善することができる。逆に、治療上の薬剤が疎水性である場合、その配送は多層小胞を使用してさらに改善され得る。あるいはまた、治療剤（例えば、抗体）は、脂質二重層に浸透することができないかもしれず、およびその結果、リポソーム表面に吸着したままであろう。この場合、リポソームの表面積を増加させることにより、治療剤の配送をさらに改善することができる。本発明による適切なリポソームは、非毒性リポソーム、例えば、ホスファチジルコリンホスホグリセロール、およびコレステロールから調製されるリポソームなどのようなものである。使用されるリポソームの直径は、0.1-1.0ミクロン（マイクロメートル）の範囲であり得る。しかしながら、貪食細胞による食作用に適した他のサイズ範囲も使用することができる。リポソームをサイジングするために、ホモジナイゼーションを使用することができ、それは、大きなリポソームをより小さなものにフラグメント化するための剪断エネルギーに依存する。好都合に使用できるホモジナイザーには、Boston、MA所在のMicrofluidics（マイクロフルイディクス社）によって製造されるmicrofluidizers（マイクロフルイダイザー）が含まれる。典型的なホモジナイゼーション手順では、選定されたリポソームの大きさが観察されるまで、標準的なエマルションホモジナイザーを通して、リポソームを再循環させる。粒度分布は、慣習的なレーザービーム粒径の弁別によってモニターすることができる。小孔ポリカーボネート膜または非対称セラミック膜を通じたリポソームの押し出しは、リポソームのサイズを比較的よく規定されたサイズ分布に減少させる有効な方法である。典型的には、懸濁物は、望ましいリポソームサイズ分布が達成されるまで膜を1回以上循環させる。リポソームは、徐々に小さい細孔膜を通して押し出して、リポソームのサイズを徐々に減少させることができる。
当技術において知られる任意の方法を用いて、本発明のいくつかの実施形態の治療剤をリポソームに組み込むことができる。例えば、高親和性分子（例えば、抗体）をリポソーム内に封入してもよい。あるいは、それはリポソームの表面に吸着されていてもよい。本発明でのリポソームに製薬上の薬剤を組み込むために使用され得る他の方法は、Alfonso（アルフォンソ）らによって説明されるもの[The science and practice of pharmacy（薬学のサイエンスおよび実践）、Mack Publishing（マック・パブリッシング）、Easton（イーストン）Pa（ペンシルベニア州）19th ed.（19版）、（1995）]およびKulkarni（クルカルニ）らによって説明されるもの[J. Microencapsul.（ジャーナル・オブ・マイクロエンカプスレーション）1995、12（3）229-46]である。
本発明の方法において使用されるリポソームは、好ましくは血液バリア（血液関門）を横切る。したがって、本発明でのリポソームは、好ましくは、それらの膜部分に多糖類（例えば、マンノース）を標的とする血液バリアを含まない。好ましくは、本発明のリポソームは、血液バリア上のレセプターを標的とする膜部分にペプチドを含まない。このようなペプチドの例には、制限されないが、トランスフェリン、インスリン、IGF-1、IGF-2抗トランスフェリンレセプター抗体、抗インスリンレセプター抗体、抗IGF-1レセプター抗体および抗IGF-2レセプター抗体が含まれる。
本発明に従って特に好適なリポソームを決定するために、スクリーニングアッセイを実行することができ、たとえば、米国特許出願第20040266734号明細書および米国特許出願第20040266734号明細書；およびDanenberg（ダネンバーグ）ら、Journal of cardiovascular pharmacology（ジャーナル・オブ・カルジオバスキュラー・ファーマコロジー）2003、42：671-9；Circulation（サーキュレーション）2002、106：599-605；Circulation 2003、108：2798-804に記載されるアッセイなどのようなものである。
一実施形態によれば、細胞性壊死を予防または抑制する方法は、インビトロ、インビボまたはエクスビボ（ex vivo、生体外とも言う）で行われる。
細胞内CELA3A、CELA1、および/またはカテプシンCの少なくとも1つを調節する能力は、壊死誘発性細胞死の処置のための新規な治療上の様式（therapeutic modality）として使用することができる。
したがって、本発明の別の態様によれば、細胞性壊死に関連する医学的疾患または状態の処置で、それを必要とする対象における方法であって、治療上有効な量の薬剤を対象に施与することを含む方法が提供され、それは、対象の細胞においてカテプシンC、CELA3AおよびCELA1の発現を特異的にダウンレギュレーションし、およびあるいは、またはそれに加えて、それらの活性を抑制する。
「処置する」という用語は、疾患、障害または条件の発症を抑制または阻止すること、および/または疾患、障害もしくは条件の軽減、寛解または退行を引き起こすこと、または疾患、障害もしくは医学的条件を、疾患の障害または状態に罹患している可能性があるが、まだ疾患の障害または状態を有すると診断されていない対象において起こることから避けることに言及する。当業者は、疾患、障害または条件の発症を評価するために様々な方法論およびアッセイを使用することができ、および同様に、疾患、障害または条件の軽減、寛解または退行を評価するために様々な方法論およびアッセイを使用することができることを理解するであろう。
ここに使用されるように、「対象」という用語は、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくは人間に言及し、壊死関連障害または条件に罹患しているか、または罹患しやすい両方の性別の若者および老人の双方を含む。
細胞性壊死に関連する疾患または条件には、神経変性疾患、認知症、パーキンソン病（Parkinson disease）、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、白血病、リンパ腫、呼吸窮迫（新生児呼吸窮迫症）、窒息、嵌頓ヘルニア（収縮ヘルニア）、糖尿病、結核、子宮内膜症、脈管ジストロフィー（vascular dystrophy）、乾癬、寒冷傷害、鉄負荷合併症（iron-load complication）、ステロイド処置の合併症、虚血性心疾患、再潅流傷害、脳血管疾患または損傷、壊疽（gangrene）、褥瘡性潰瘍（pressure sore、圧痛）、膵炎、肝炎、ヘモグロビン尿、髄膜炎、壊疽組織（sphacelus）、虚血性壊死、無血管壊死（avascular necrosis）（例えば、骨のもの）、細菌性敗血症、ウイルス性敗血症、熱傷（火傷）、高熱（体温上昇）、クローン病、セリアック病、コンパートメント症候群、壊死性直腸炎（壊死性結腸炎）、嚢胞性線維症、関節リウマチ、腎毒性、多発性硬化症、脊髄損傷、糸球体腎炎、変形性関節症（変性関節炎）、チロセミア（チロシン血症、甲状腺機能低下症）、代謝性遺伝性疾患（metabolic inherited disease）、マイコプラズマ病、炭疽感染、細菌感染、ウイルス感染、アンダーソン病（Anderson disease）、先天性ミトコンドリア病、フェニルケトン尿、胎盤梗塞、梅毒、梅毒、無菌壊死、虚血性壊死、アルコール依存、および投与および/または自己投与、および/または暴露に関連する壊死（necrosis associated with administration and/or self-administration with, and/or exposure to）で、コカイン、薬物、化学的毒素、農薬および重金属、ダーマルフィラー（皮膚充填剤）施与に関係する壊死；異所的薬物施与に関係する壊死で、たとえば、デキストロース溶液、化学療法薬の溢出などのようなもの；化学療法誘発性壊死、放射線誘発性壊死、移植組織および加齢の保守管理が含まれる。
一実施形態によれば、細胞壊死に関連する疾患または条件は脳損傷（例えば、外傷性脳損傷）である。
したがって、本方法は、任意の急性または慢性中枢神経系（CNS）傷害に関連する壊死の処置において有用である。そのような疾患または条件には、制限されないが、卒中（血栓症、塞栓症または血管収縮によって引き起こされるもの）、閉鎖頭部損傷、全脳虚血（例えば、心筋梗塞、不整脈、出血性ショック、および冠状動脈バイパス移植後脳傷害を含む任意の原因の全身性低血圧による虚血）、局所虚血および頭蓋内出血が含まれうる。CNS（中枢神経系）への虚血性損傷は、全虚血または局所虚血条件のいずれかでも起因し得る。全虚血は、たとえば、心停止の間などのようなものの一定の時間の期間、脳全体への血流が止まるところで起こる。局所虚血は、脳の一部が正常な血流を奪われたとき、たとえば、脳血管の血栓塞栓性の閉塞（thromboembolytic occlusion）、外傷性頭部外傷、浮腫および脳腫瘍の間などのようなときに生じる。脳虚血に起因するCNS損傷の多くは、虚血状態に続いて数時間または数日後でさえも起こり、および損傷組織による細胞傷害性生成物の放出に続発する。
いくつかの態様では、本発明は、任意の既知の原因、たとえば、感染に基づく、または毒性物質への暴露、または当業者により理解されるような他のものから生じる肝臓の毒性の処置または防止を特に考慮する。
いくつかの態様では、本発明は、当業者によって理解されるように、いくつかの態様において、心筋梗塞、心不全、心臓病、およびその他を含め、心疾患の処置または防止を特別に企図する。
本教示によれば、細胞壊死に関連する医学的疾患または条件を処置するために、対象は、カテプシンC、CELA1および/またはCELA3Aまたは構造的に関連する酵素の発現を特異的にダウンレギュレートし、および代替的または追加的にそれらの活性を抑制する薬剤により、さらに上文に詳述されるように管理される。
各々の上述のダウンレギュレーション剤またはダウンレギュレーション剤をコードする発現ベクターは、個体に、それ自体でか、または生理学的に許容可能な担体をも含む薬剤組成物の一部としてか、またはいくつかの態様では、コンジュゲート、荷電粒子、リポソーム、または当技術分野における任意の既知の担体の一部として施与できることが理解され、次にそれは、いくつかの態様では、薬剤組成物の一部としてさらに調剤されてもよい。薬剤組成物の目的は、有機体への活性成分の管理を容易にすることである。
ここに使用されるように、「薬剤組成物」は、ここに記載される1以上の活性成分の、他の化学成分、たとえば、生理学的に適切な担体および賦形剤などのようなものとの調製物に言及する。薬剤組成物の目的は有機体への化合物の管理を容易にすることである。
ここにおいて、用語「活性成分」は、細胞内CELA3A、CELA1、および/またはカテプシンC、生物学的効果について説明可能な下方制御性または抑制性の薬剤の少なくとも1つに言及する。
以下において、「生理学的に許容可能な担体」および「薬学的に許容可能な担体」という語句は、交換可能に使用されてよく、有機体に対して有意な刺激を引き起こさず、かつ、生物学的活性および特性を無効にしない担体または希釈剤に言及される。アジュバントはこれらの語句の下に含まれる。
ここにおいて、用語「賦形剤」は、活性成分の管理をさらに容易にするために薬剤組成物に添加される不活性物質に言及する。賦形剤の例には、制限なく、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびでんぷんのタイプ、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが含まれる。
薬物の調剤および施与のための技術は、参照によりここに組み込まれる、Remington's Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Co.、Easton、PA、最新版に見出すことができる。
適切な投与経路には、例えば、経口、直腸、経粘膜、特に経鼻、腸または非経口配送が含まれ、筋肉内、皮下および髄腔内注入ならびに髄腔内、直接的な心室内、心臓内、例えば、右または左心室腔への、共通冠動脈への、静脈内、腹腔内、鼻腔内、または眼（球）内注入が含まれうる。
中枢神経系（CNS）への薬物配送のための慣習的なアプローチには、次の：（脳）神経外科的戦略（例えば、脳内注射または脳室内注入）；薬剤の分子操作（例えば、それ自体BBBを横切ることができない薬剤と組み合わせた内皮細胞表面分子に対する親和性を有する輸送ペプチドを含むキメラ融合タンパク質の産生）で、BBBの内因性輸送経路の1つを利用する試みにおけるもの；薬剤の脂質溶解性を高めるために設計された薬理学的戦略（例えば、脂質またはコレステロール担体への水溶性薬剤のコンジュゲート）；および高浸透圧性破壊によるBBBの完全性の一時的な破壊（頸動脈へのマンニトール溶液の注入または生物学的に活性な薬剤、たとえば、アンジオテンシンペプチドなどのようなものの使用に起因する）が含まれる。
本発明の一実施形態によれば、薬剤組成物は、細胞膜に侵入性のために調剤される。したがって、例えば、薬剤組成物は脂質小胞を含み得る。
あるいはまた、あるものは、例えば、薬剤組成物をペイシェント（主として患者を意味する）の組織領域（例えば、壊死性組織）に直接注入することによって、全身的よりはむしろ局所的に薬剤組成物を施与することができる。
本発明のいくつかの実施形態の薬剤組成物は、例えば、慣習的な混合、溶解、造粒（顆粒化とも言う）、ドラジェ-メーキング（糖衣錠作成）、粉（ゲル状）にする（levigating）、乳化、封入、捕捉または凍結乾燥プロセスによって、当技術でよく知られるプロセスによって製造することができる。
したがって、本発明のいくつかの実施形態に従って使用するための薬剤組成物は、調剤上で使用することができる調製物への活性成分の処理を容易にする賦形剤および補助剤を含む1以上の生理学的に許容可能な担体を用いて慣習的な様式において調剤することができる。適切な調剤物は選定される施与の経路に依存する。
注入のために、薬剤組成物の活性成分は、水溶液、好ましくは生理学的に適合する緩衝剤、たとえば、ハンクス液、リンガー液、または生理的塩緩衝剤などのようなものにおいて調剤され得る。経粘膜投与のために、浸透すべき障壁に適切な浸透剤が製剤中に使用される。そのような浸透剤は、本技術において包括的に知られている。
経口投与の場合、薬剤組成物は、活性化合物を当該技術でよく知られる薬学的に許容可能な担体と組み合わせることによって容易に製剤化することができる。そのような担体は、ペイシェントによる経口摂取のために、薬剤組成物を錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁物、およびその他同種類のものなどとして処方することを可能にする。経口使用のための薬理学的調製物は、必要に応じて適切な補助剤を添加した後、錠剤または糖衣錠コアを得るために、固形賦形剤を使用して、随意に得られる混合物を粉砕し、および顆粒の混合物を加工することができる。適切な賦形剤は、特に、充填剤で、たとえば、糖などのようなもので、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを；セルロース調製物で、たとえば、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボメチルセルロースナトリウムなどのようなものを；および/または生理学的に許容されるポリマーで、たとえば、ポリビニルピロリドン（PVP）が含まれるものである。必要に応じて、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸またはたとえば、アルギン酸ナトリウムなどのようなその塩などの崩壊剤を添加してもよい。
糖衣錠コアには、適切なコーティングが施される。この目的のために、濃縮糖溶液を使用することができ、それには、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液および適切な有機溶媒または溶媒混合物が随意に含まれることができる。識別のために、または活性化合物用量の異なる組合せを特徴付けるために、染料または顔料を錠剤または糖衣錠コーティングに添加してもよい。
経口で使用することができる薬剤組成物には、ゼラチン製のプッシュフィットカプセル、ならびにゼラチンおよび可塑剤で、たとえば、グリセロールまたはソルビトールなどのようなものでできた軟質の、密封カプセルが含まれる。プッシュフィットカプセルは、活性成分を、充填剤で、たとえば、ラクトースなどのようなもの、結合剤で、たとえば、デンプンなどのようなもの、潤滑剤で、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどのようなもの、および随意に安定剤と混合して含むことができる。ソフトカプセルにおいて、活性成分は、適切な液体で、たとえば、脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどのようなものに溶解または懸濁されてもよい。さらに、安定剤を添加してもよい。経口投与のためのすべての製剤は、選択された施与の経路に適した投与量でなければならない。
頬側（口腔とも言う）投与の場合、組成物は、慣習的な様式で製剤化された錠剤またはロゼンジ剤（トローチ剤とも言う）の形態を取ることができる。
鼻吸入による投与のために、本発明のいくつかの実施形態による使用のための活性成分は、適切な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロ-テトラフルオロエタンまたは二酸化炭素の使用を伴う加圧パックまたは噴霧器からのエアロゾルスプレープレゼンテーションの形態で慣習的に配送される。加圧エアロゾルの場合、投与量単位は、計量された量を配送するための弁を提供することによって決定され得る。ディスペンサーにおいて使用するための、例えば、ゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物および適切な粉末基剤で、例えば、ラクトースまたはデンプンなどのようなものの粉体混合物を含むように製剤化することができる。
ここに記載の薬剤組成物は、例えば、ボーラス注入または連続注入などによる非経口施与のために製剤化することができる。注入用調剤物は、単位剤形、例えば、アンプルにおいて、または多回投与容器において、随意に保存剤を加えて提示することができる。組成物は、油性または水性ビヒクルにおける懸濁物、溶液または乳濁物であってもよく、および処方剤（formulatory agents）で、例えば、懸濁剤、安定化剤および/または分散剤などのようなものを含有してもよい。
非経口施与のための薬剤組成物は水溶性形態での活性調製物の水性溶液を含む。さらに、活性成分の懸濁物は適切な油性または水ベースの注入懸濁物として調製することができる。適切な親油性溶媒またはビヒクルには、脂肪油で、たとえば、ゴマ油などのようなもの、または合成脂肪酸エステルで、たとえば、オレイン酸エチル、トリグリセリドまたはリポソームなどのようなものが含まれる。水性注入懸濁物は、懸濁液の粘度を増加させる物質で、たとえば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランなどのようなものを含み得る。随意に、懸濁物はまた、高濃度の溶液の調製を可能にするために、活性成分の溶解性を高める適切な安定剤または薬剤を含有してもよい。
あるいはまた、活性成分は、使用前に適切なビヒクルで、例えば、滅菌した、発熱物質を含まない水ベースの溶液により構成するための粉体の形態であってもよい。
本発明のいくつかの実施形態の薬剤組成物は、直腸組成物、例えば、坐剤または停留浣腸などのようなものにおいて、例えば、慣習的な坐薬基剤で、例えば、カカオバターまたは他のグリセリドなどのようなものを使用して、調剤することもできる。
本発明のいくつかの実施形態に関連して使用するのに適した薬剤組成物は、活性成分が意図された目的を達成するのに有効な量で含まれる組成物を含む。より一層具体的には、治療上有効な量は、障害（例えば、細胞壊死）の症状を防止、緩和または改善するのに有効な、または処置される対象の生存を延長する量の活性成分（例えば、細胞内CELA3A、CELA1、および/またはカテプシンCのダウンレギュレーション性または抑制性の薬剤の少なくとも1つ）を意味する。
本発明のある実施形態によれば、本発明の薬剤の効果的な量は、細胞壊死の細胞アポトーシスへの変換を引き起こすように選定される量である。
ここに使用するように、「細胞アポトーシス」という用語は、プログラムされた細胞死の細胞プロセスに言及する。アポトーシスは、細胞質および核における明確な形態変化、規則的に離れた部位でのクロマチン切断、およびヌクレオソーム部位でのゲノムDNAのエンドヌクレアーゼ切断によって特徴付けられる。これらの変化には、小疱形成（ブレブ形成）、細胞収縮、核断片化、染色体凝縮、および染色体DNA断片化が含まれる。しかし、壊死とは異なり、アポトーシスは、アポトーシス小体と呼ばれる細胞断片を産生し、それは細胞の内容物が周囲の細胞にあふれ出し、および損傷を受ける前に、食細胞が貪食して迅速に除去することができる。
治療上有効量の決定は、特にここに提供される詳細な開示を考慮すると、十分に当業者の能力の範囲内である。
本発明の方法において使用される任意の調製物について、治療上有効な量または用量は、初期にインビトロおよび細胞培養アッセイから推定することができる（例えば、以下の例のセクションでの例1-3参照）。さらに、用量は望ましい濃度または力価を達成するために、動物モデルで処方することができる。そのような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。
ここに記載の活性成分の毒性および治療上の効力は、インビトロ、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。これらのインビトロおよび細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトでの使用のための投与量の範囲を定式化する際に使用することができる。投与量は、採用される剤形および利用される施与経路に依存して変動し得る。正確な製剤、施与経路および投与量は、ペイシェントの条件を考慮して個々の医師によって選定することができる。（例えば、Fingl（フィングル）ら、1975、The Pharmacological Basis of Therapeutics（治療の薬理学的基礎）、Ch.1（第一章）p.1（第1頁）参照）。
壊死性疾患および条件のための動物モデルには、無菌壊死についてのブタモデル[例えば、Muller-Vahl（ミューラー-バール）HおよびPabst（パブスト）R.、Int J Tissue React.（インターナショナル・ジャーナル・オブ・ティッシュ・リアクションズ）（1984）6（3）：251-4]、大腿骨頭壊死についてのヒツジモデル[J. Manggold（マンゴールド）ら、Laboratory Animals（ラボラトリー・アニマルズ）（2002）36、173-180]が含まれる。
投薬量および間隔は、生物学的効果（最小有効濃度、MEC）を誘導または抑制するのに十分な量で活性成分を提供するために、個別に調節されてもよい。MECは各調製物について変動するが、インビトロデータから推定することができる。MECを達成するために必要な投与量は、個々の特徴および施与の経路に依存する。検出アッセイを使用して、血漿濃度を決定することができる。
処置される条件の重篤度および応答性に依存して、投薬は、数日間から数週間までの持続する処置過程または治癒がもたらされ、または疾患状態の減少が達成されるまで、単回または複数回の施与であり得る。
施与される組成物の量は、もちろん、治療される対象、悩みの重症度、施与の様式、処方する医師の判断、などに依存するであろう。
本発明のいくつかの実施形態の組成物は、必要に応じて、パックまたはディスペンサー装置で、例えば、FDA承認キットなどのようなものにおいて提供することができ、それらは活性成分を含有する1以上の単位剤形を含むことができる。パックは、例えば、金属またはプラスチックホイルで、例えば、ブリスターパックなどのようなものを含むことができる。パックまたはディスペンサー装置は、施与のための指示書を伴ってもよい。パックまたはディスペンサーはまた、調合薬の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形態で、容器に付随する通知によって収容されてもよく、その通知は、組成物の形態またはヒトまたは獣医学的投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬について米国食品医薬品局によって承認を受けたラベルまたは承認された製品挿入物のものであってもよい。適合性のある薬学的担体において調剤される本発明の調製物を含む組成物は、上記でさらに詳述したように、調製され、適切な容器に入れられ、および指示された条件の処置のために標識されてもよい。
本発明の薬剤は、製造物の物品として適切に包装することができる薬剤組成物として適切に調剤することができる。そのような製造物の物品は、壊死関連疾患の処置において使用するためのラベルを含み、パッケージング材料は薬学的に有効な量のダウンレギュレーション剤を包装する。
本発明の薬剤または組成物の各々は、他の既知の処置で、制限されないが、抗アポトーシス剤または抗炎症剤を含めて組み合わせて施与され得ることが理解されるであろう。
本発明の薬剤または組成物は、後者の施与の前に、それと同時に、または後に施与され得る。
本教示に従って使用することができる抗アポトーシス剤には、制限されないが、-[R]-N-[2-ヘプチル]-メチルプロパルギルアミン（R-2HMP）、ビタミンE、ビタミンD、カスパーゼインヒビターおよび親水性胆汁酸塩ウルソデオキシコール酸が含まれる。
本発明の教示に従って使用することができる抗炎症剤には、制限されないが、アクロフェナク；ジプロプタン酸アルクロメタゾン；アルゲストンアセトニド；アルファアミラーゼ；アムシナファル；アムシナフィド；アムフェナックナトリウム；アミプリロース塩酸塩；アナキンラ；アニロラック；アニトラザフェン；アパゾン；バルサラジド二ナトリウム；ベンダザック；ベノキサプロフェン；ベンジダミン塩酸塩；ブロメライン；ブロペラモール；ブデソニド；カルプロフェン；シクロプロフェン；シンタゾン；クリップロフェン；プロピオン酸クロベタゾール；クロベタゾンブチラート；クロピラク；プロピオナートクロチカゾン；酢酸コルメタゾン；コルトドキソン；デフラザコート；デソニド；デソキシメタゾン；デプロメタゾンジプロピオナート；ジクロフェナクカリウム；ジクロフェナクナトリウム；ジフルラゾンジアセタート；ジフルミドンナトリウム；ジフルニサル；ジフルプレドナート；ジフタロン（Diftalone）；ジメチルスルホキシド；ドロシノニド；エンドリソン；エンリモマブ；エノリラムナトリウム；エピリゾール；エトドラク；エトフェナマート；フェルビナク；フェナモール；フェンブフェン；フェンクロフェナック；フェンクロラック；フェンドサル；フェンピパロン（Fenpipalone）；フェンチアザック；フラザロン；フルアザコート；フルフェナミン酸；フルミゾール；フルニソリドアセタート；フルニキシン；フルニキシンメグルミン；フルオルコルチンブチル；フルオロメトロンアセタート；フルクアゾン（Fluquazone）；フルルビプロフェン；フルレトフェン（Fluretofen）；プロピオン酸フルチカゾン；フラプロフェン；フロブフェン；ハルシノニド；プロピオン酸ハロベタゾール；ハロプロドンアセタート；イブフェナク；イブプロフェン；イブプロフェンアルミニウム；イブプロフェンピコノール；イロニダップ（Ilonidap）；インドメタシン；インドメタシンナトリウム；インドプロフェン；インドキソール；イントラゾール；イソフルプレドンアセタート；イソキセパク（Isoxepac）；イソキシカム（Isoxicam）；ケトプロフェン；ロフェミゾール塩酸塩；ロモキシカム（Lomoxicam）；ロテプレドノールエタボナート；メクロフェナマートナトリウム；メクロフェナム酸；メクロリソンジブチラート；メフェナム酸；メサラミン；メセクラゾン；メチルプレドニソロンスレプタナート；モミフルマート；ナブメトン；ナプロキセン；ナプロキセンナトリウム；ナプロキソール；ニマゾン；オルサラジンナトリウム；オルゴテイン；オルパノキシン；オキサプロジン；オキシフェンブタゾン；塩酸パラニリン；ペントサン多硫酸ナトリウム（Pentosan Polysulfate Sodium）；フェンブタゾンナトリウムグリセラート；ピルフェニドン；ピロキシカム；ピロキシカムシンナマート；ピロキシカムオラミン；ピルプロフェン；プレドナザート；プリフェロン；プロドール酸；プロクアゾン；プロキサゾール；くえん酸プロキサゾール；リメキソロン；ロマザリット；サルコレクス（Salcolex）；サルナセジン（Salnacedin）；サルサラート；サンギナリンクロリド（Sanguinarium Chloride）；セクラゾン；セルメタシン；スドキシカム；スリンダク；スプロフェン；タルメタシン；タルニフルマート；タロサラート；テブフェロン；テニダップ；テニダップナトリウム；テノキシカム；テシカム；テシミド；テトリダミン；チオピナック；チキソコルトールピバラート；トルメチン；トルメチンナトリウム；トリクロニド；トリフルミダート；ジドメタシン；ゾメピラックナトリウムが含まれる。
治療効率を試験するために、対象体は、物理的検査ならびに細胞壊死を評価するための本技術で知られる任意の方法を用いて評価され得る。したがって、例えば、壊死性細胞または組織サンプルを（例えば、対象体から）得ることができ、および光、蛍光または電子顕微鏡技術によって、またはトリパンブルー染色を介して、それによって壊死性細胞が色素を取り込み、および従って青色で染色され、壊死性細胞を識別することができる。壊死細胞は、膜の完全性の喪失、オルガネラの崩壊および/またはクロマチンの凝集を含む形態学的変化によって健常細胞と区別することができる。
本発明の別の態様によれば、加齢を処置および/または防止の、それを必要とする対象における方法が提供され、その方法には、次の：（a）対象の細胞において、カテプシンC、CELA3Aまたは構造的に類似の酵素およびCELA1の発現を、特異的にダウンレギュレートし、およびあるいはまたは追加的に、それらの活性を抑制する薬剤を対象に施与すること；および（b）抗加齢薬剤を対象に施与することであり、それによって加齢を処置および/または防止することが含まれる。
本教示によれば、任意の抗加齢剤、たとえば、抗酸化剤、植物化学物質、ホルモンおよび脂肪酸などのようなものを使用することができる。
本教示に従って用いることができる模範的な抗加齢剤には、制限されないが、ビタミンE、ビタミンC、コエンザイムQ10、リポ酸、葉酸、セレン、フラボノイド、カロテン、ビタミンBおよびカルニチンが含まれる。
本教示と併せて使用することができる分子は、以下のようにそれらの特異性について認定することができる。
したがって、本発明の別の態様によれば、細胞の壊死を抑制することができる薬剤を識別する方法が提供され、その方法には、壊死シグナルに供された細胞に試験薬剤を導入すること、および試験薬剤が、細胞内CELA3A、CELA1、および/またはカテプシンCの少なくとも1つの発現を特異的にダウンレギュレートし、およびあるいはまたは付加的にそれらの活性を抑制し、それによって細胞の壊死を抑制することができる薬剤を識別することが含まれる。試験薬剤は、他の細胞タンパク質、たとえば、他のCELAタンパク質またはタンパク質群などのようなものに対するその効果を経路おいて試験することによって特異性について試験される（上文に、「特異性」の下でさらに詳述されるようなもの）。
さらなる好ましい実施形態では、本発明は、壊死および関連する疾患および条件の防止および処置用に使用するために特異的な小抑制分子を提供する。分子のリストには、様々な化学的ファミリーに属する小さな抑制性化合物、例えば、2-アミノイミダゾリン、アミノチアゾールおよびイソオキサゾールが含まれる。本発明はまた、細胞壊死に関係する疾患または医学的条件の処置および/または防止における使用のための種々の小分子インヒビターをも提供する。さらにまた別の実施形態では、細胞壊死に関係する疾患または医学的条件の処置および/または防止のための薬の製造における小分子インヒビターの使用が提供される。
したがって、一実施形態によれば、試験薬剤は、小分子またはエラスターゼの自然なインヒビター（例えば、インドール-3-カルビノールまたはフラバノール（-）エピガロカテキン-3-ガレート）であってよく、およびCELA1またはCELA3のその特異的抑制は本教示を用いて評価することができる。試験薬剤が特定のCELA1/CELA3Aインヒビターとして検証された後、それは、細胞壊死の抑制についてさらに分析される。そのような分子のリストをテーブル1に示す。
例えば、本発明での小分子は、遷移状態類似体（すなわち、酵素触媒化学反応において基質分子の遷移状態に類似する化学構造を有する化学的化合物を含むことができるが、それらは典型的には化学反応を受けず、および酵素インヒビターとして作用し）、可逆的インヒビター（すなわち、典型的に、酵素、酵素-基質複合体、またはその両方に非共有結合するインヒビター）および不可逆的インヒビター（すなわち、典型的には酵素と反応し、およびそれを化学的に、例えば、共有結合形成を介して変化させ、および酵素活性に必要とされる重要なアミノ酸残基を修飾するインヒビター）を含む。
ここに記載の化合物のいずれかに関して、本発明はまた、任意の異性体、薬学的に許容可能な塩、薬剤生成物、水和物、N-オキシド、結晶またはそれらの任意の組合せを企図し、および同じものが本発明の一部とみなされる。
一実施形態によれば、試験薬剤は、高親和性結合分子またはポリヌクレオチドであってもよく、およびカテプシンC、CELA1、CELA3Aまたはそれに構造的に関連する酵素のその特異的抑制は、本教示を用いて評価することができる。試験薬剤が特異的インヒビターとして検証された後、細胞壊死の抑制についてさらに分析される。
したがって、本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞壊死に関連する疾患または医学的条件の処置および/または防止における使用のための細胞透過性プロテアーゼインヒビターが提供される。プロテアーゼインヒビターは、壊死を受けている細胞における壊死性細胞死に関与する少なくとも1つの細胞内プロテアーゼの酵素活性を抑制する。細胞内プロテアーゼは、CELA3A、CELA1、およびカテプシンCからなる群より選ばれる。好ましい実施形態では、プロテアーゼはCELA3Aである。
ここに使用されるように、用語「約」は±10％に言及する。
用語「comprises」、「comprising」、「includes」、「including」、「having」およびそれらのコンジュゲート（同語源の語）は、「制限されないが、含まれる」ことを意味する。
「からなる」という用語は、「含み、および制限される」ことを意味する。
用語「から本質的になる」は、追加の成分、ステップおよび/または部分が、請求される組成物、方法または構造の基本的および新規な特性を実質的に変えない場合にのみ、組成物、方法または構造が追加の成分、工程および/または部分を含み得ることを意味する。
ここに使用されるように、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の参照を含む。例えば、「ある化合物」または「少なくとも1つの化合物」という用語は、その混合物を含め、複数の化合物を含み得る。
この出願を通して、本発明の様々な実施形態を範囲形式で提示することができる。範囲の形式の記載は、便宜上のものであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の記載は、その範囲内のすべての可能な部分範囲および個々の数値を具体的に開示したものとみなされるべきである。例えば、1から6までなどのような範囲の記述は、1から3まで、1から4まで、1から5まで、2から4まで、2から6まで、3から6までなどの下位範囲、ならびにその範囲内の個々の数字、例えば1、2、3、4、5および6などのようなものを具体的に開示したものと考えるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
数値範囲がここに示される場合はいつでも、示された範囲内に任意の引用数字（分数または整数）を含むことを意味する。語句、第1の指示番号および第2の指示番号の「範囲内/間の範囲」および第1の指示番号から第2の指示番号までの「範囲内/それからの範囲」は、ここでは交換可能に使用され、および第1および第2の指示番号およびそれらの間のすべての分数および整数の数字が含まれることを意味する。
ここに使用するように、「方法」という用語は、所与のタスクを達成するための様式、手段、技術および手順に言及し、制限されないが、化学的、薬理学的、生物学的、生化学的および医学的技術の実践者によって、既知の様式で知られるか、または容易に開発される様式、手段、技術および手順が含まれる。
明瞭にするために、別個の実施形態の文脈で記載される本発明の一定の特長は、単一の実施形態において組み合わせて提供されてもよいことが理解される。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈で記載される本発明の様々な特長は、別々に、または任意の適切なサブコンビネーションで、または本発明の任意の他の記載された実施形態に適するものとして提供されてよい。様々な実施形態の文脈で説明される一定の特長は、実施形態がそれらの要素なしで動作不能でない限り、それらの実施形態の本質的な特長と見なすべきではない。
上記に詳細に描写され、次の請求の範囲の項で請求される本発明の様々な実施形態および態様は、以下の実施例において実験的支持を見出せる。
上記の記載と共に、次に本発明を非制限的に説明する以下の例を参照する。
包括的に、ここに使用される命名法および本発明で利用される実験手順には、分子的、生化学的、微生物学的および組換えDNA技術が含まれる。そのような技術は文献で十分に説明されている。例えば、「Molecular Cloning：A laboratory Manual」Sambrookら、（1989）；「Current Protocols in Molecular Biology」、Volumes I-III Ausubel, R. M.ら（1994）；Ausubelら、「Current Protocols in Molecular Biology」、John Wiley and Sons、Baltimore、Maryland（1989）；Perbal、「A Practical Guide to Molecular Cloning（分子クローニングの実践ガイド）」、John Wiley＆Sons、New York（1988）； Watson（ワトソン）ら、「Recombinant DNA（組換えDNA）」、Scientific American Books（シエンティフィック・アメリカン・ブックス）、New York；Birrenら、（eds）「Genome Analysis：A Laboratory Manual Series（ゲノム分析：実験マニュアルシリーズ）」、Vols. 1-4、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York（1998）；米国特許第4,666,828号；第4,683,202号；第4,801,531号；第5,192,659号および第5,272,057号に記載のような方法論；「Cell Biology：A Laboratory Handbook（細胞生物学：実験ハンドブック）」、Volumes I-III、Cellis, J. E.（1994）；「Current Protocols in Immunology（免疫学での最新のプロトコル）」Volumes I-III Coligan J. E. ed.（1994）；Stitesら（eds）、「Basic and Clinical Immunology（基礎的および臨床的免疫学）」（第8版）、Appleton＆Lange、Norwalk、CT（1994）；MishellおよびShiigi（eds）、「Selected Methods in Cellular Immunology（細胞免疫学における選択方法）」、W.H. Freeman and Co.、New York（1980）；利用可能なイムノアッセイは、特許および科学文献に広範に記載されており、たとえば、米国特許第3,791,932号；第3,839,153号；第3,850,752号；第3,850,578号；第3,853,987号；第3,867,517号；第3,879,262号；第3,901,654号；第3,935,074号；第3,984,533号；第3,996,345号；第4,034,074号；第4,098,876号；第4,879,219号；第5,011,771号および第5,281,521号；「Oligonucleotide Synthesis（オリゴヌクレオチド合成）」Gait, M. J.、ed.（1984）；「Nucleic Acid Hybridization（拡散ハイブリダイゼーション）」Hames, B. D.、およびHiggins S. J.、eds.（1985）；「Transcription and Translation（転写および翻訳）」Hames, B. D.およびHiggins S. J., Eds.（1984）；「Animal Cell Culture（動物細胞培養）」Freshney, R. I., ed.（1986）；「Immobilized Cells and Enzymes（固定化細胞および酵素）」IRL Press、（1986）；「A Practical Guide to Molecular Cloning（分子クローニングに対する実践ガイド）」Perbal, B.（1984）および「Methods in Enzymology（酵素学での方法）」Vol. 1-317、Academic Press；「PCR Protocols：A Guide To Methods And Applications（PCRプロトコル：方法および適用への指針）」、Academic Press、San Diego、CA（1990）；Marshakら、「Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual（タンパク質精製および特徴付けのための戦略-実験コースマニュアル」CSHL Press（1996）を参照し；これらすべては参照によりここにあたかも説明されるかのように組み込む。他の包括的な参考文献は、この文書を通して提供される。ここでの手法は、この技術においてよく知られるものと考えられ、および読者の便宜のため提供される。ここに含まれるすべての情報は、参照によりここに組み込まれる。
包括的な材料および実験手順
インビトロ壊死のモデル
KCN誘発壊死
10％熱不活性化ウシ胎仔血清、2mMグルタミン、100U/mlペニシリンおよび100μg/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを補充したRPMI-1640培地での懸濁物中で、ヒトプロモノサイトU-937細胞（p53-陰性前単球細胞株）を増殖させた。対数期での細胞を4×10 5/mlの濃度で播種した（Tsesin Nら、Chemistry and Physics of Lipids、2014、183：159-168）。
ラット褐色細胞腫PC12細胞株（細胞系とも言う）を、5％熱不活化仔ウシ血清、10％熱不活性化ウマ血清、2mMのL-グルタミン、100U/mlペニシリンおよび100μg/ mlのストレプトマイシンで補充したDMEM培地（Beit Haemek、Israel）において増殖させた。対数期でのPC12細胞を、96ウェルプレートに1.2×10 5/ウェルの濃度で播種し、および一晩インキュベートした。
その後、細胞を2回洗浄し、および2mMピルビン酸および10％透析FCSを補充したRPMI-1640（U-937細胞）およびDMEM（PC-12細胞）グルコースフリー培地中に1時間維持した。次いで、示された濃度で7時間（U-937細胞）、または5時間（PC12細胞）、KCN（Merck、Germany）の存在下または非存在下で細胞を処理した。
インヒビターの試験
エラスターゼインヒビターII（MeOSuc-AAPA-CMK）およびエラスターゼインヒビターIII（MeOSuc-AAPV-CMK）は、Calbiochem-Novabiochem、USAから購入した。化合物Gly-Pheジアゾメチルケトンは、MP Biomedicals、USAから購入した。上記のテーブル1に開示されるすべての化合物は、ChemDiv、San Diego、CAから購入した。化合物をDMSOに溶解し、および細胞死誘導剤を添加する30分前に投与した。すべてのサンプルに添加されたDMSOの最終濃度は0.1％であり、これはそれ自体では効果がなかった。
siRNAおよび細胞トランスフェクション
細胞を、HiPerFect Transfection Reagent（トランスフェクション試薬）と特異的プロテアーゼを抑制することを目的とするsiRNAとの複合体により、または以下のような適切なコントロールにより48時間処理した。HiPerFectトランスフェクション試薬は、有効なsiRNAの取り込みと細胞内でのsiRNAの効率的な放出を可能にし、完全な遺伝子ノックダウンをもたらす、カチオン性脂質と中性脂質のブレンドである。陰性および陽性の死のコントロールは製造者の指示に従って使用した。カテプシンCサイレンシングについてのsiRNA配列は、ATGATCTGCATCAGTTGTAAA（配列番号1）であった。CELA1についてのsiRNA配列はCGGCAACATGCTGGTCCTTTA（配列番号2）であり、およびCELA3AについてのsiRNA配列はCTGCCTTTGGCTGCAACTTCA（配列番号3）であった。コントロールに用いたsiRNA配列はAATTCTCCGAACGTGTCACGT（配列番号4）であった。すべてのsiRNAsとHiPerFectTMトランスフェクション試薬はQiagenから購入した。
その後、正常細胞またはサイレンシングされた細胞を2回洗浄し、およびグルコースを含まない培地に1時間移し、および次いで上記のようにシアン化カリウムで壊死を誘発した。細胞死亡率は、溶解細胞からの安定した細胞質ゾル酵素である乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）の放出を定量することにより、細胞死を正確かつ迅速に測定するPromegaのCytoTox96(R) Non-Radioactive Cytotoxicity Assay（非放射性細胞毒性アッセイ）によって評価した。
CELA1のsiRNA配列は、CELA1転写産物と完全に一致するが、それはまたCELA3AおよびCELA3Bには不完全にしか一致しない。CELA3AのsiRNAはCELA3Aと完全に一致する。
壊死およびアポトーシスの形態学的定量
アポトーシスまたは壊死性細胞死に関係する形態学的変化を受ける細胞を、以前に記載されるようにモニターした[McGahon AJら、Methods Cell Biol（1995）46：153-184]および[Zelig Uら、Biophys J. 2009年10月7日；97（7）：2107-14]。処理後の与えられる時点で、1mlの細胞懸濁物を収集し、遠心分離し、およびペレットを色素混合物（100μg/mlアクリジンオレンジおよび100μg/ml臭化エチジウムから構成される）のPBSでの20倍希釈物に再懸濁し、およびガラススライド上に置き、蛍光顕微鏡で観察する。核が正常な形態を示し、および緑色であれば、細胞は生きていると評価された。正常な形態およびオレンジ色を呈する細胞を壊死として評価した。それらの核がクロマチン凝縮および/または核断片化を示した場合、細胞をアポトーシスとして評価した。各サンプルについて最低100個の細胞を採点した。
乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）放出を用いた壊死のアッセイ
溶解した細胞から放出されるLDHの量は細胞死の敏感な尺度である。96ウェルプレートにおいてPromega CytoTox 96 LDHアッセイキットを用いて壊死性細胞死を測定した。0.1％Triton X-100中で10分間溶解した細胞からのLDH含量を全LDHの指標として使用した。培地中に放出されたLDHを壊死細胞死の指標として使用し、および合計のLDHからのパーセンテージを算出した。インヒビターによる保護は、インヒビターの存在下および不存在下におけるLDH放出のパーセンテージを比較することに基づいて算出した。インヒビターはまた、合計、ブランクおよびコントロールに加えた。490nmでの吸光度をELISAリーダー（BioTec）で測定した。
エラスターゼおよびカテプシンC活性のアッセイ
細胞を収集し、氷冷PBSで2回洗浄し、および氷冷溶解緩衝剤（50mMトリス-HClのpH7.5、0.1％NP-40、1mMのDTT）中に2×108/mlで再懸濁させた。ポリトロン（各7秒の3サイクル）により細胞を破壊し、および13,000g、30分間、4℃での遠心分離によって破片をペレット化した。上清を直ちに使用した。標準としてウシ血清アルブミン（BSA）を用いたBradford Protein Assay（ブラッドフォードタンパク質アッセイ）（Bio-Rad）を用いて、各試料のタンパク質含有量を測定した。すべてのアッセイは、合計容量100μlで行い、およびエラスターゼ基質としてN-メトキシスクシニル-Ala-Ala-Pro-Valp-ニトロアニリド（MAAPV）（Sigma）を最終濃度5mM、40μgサンプルタンパク質を、特定の濃度のプロテアーゼインヒビターまたはコントロールのための溶媒の存在下または非存在下で、平底マイクロタイタープレートにおいて3連で含んだ。37℃で1.5時間インキュベートした後、405nmでのODをプレートELISAリーダー（Molecular Devices）で測定した。プロテアーゼ活性はp-ニトロアニリンの較正曲線に従って算出した。カテプシンC様活性を同様にGly-Phe p-ニトロアニリド（Sigma）で測定した。
外傷性脳損傷インビボモデル
クローズドヘッド損傷（閉鎖性頭部外傷）法を使用して、脳壊死の発症に対する、および神経学的重症度スコア（NSS）を用いて評価された神経学的状態に対するエラスターゼインヒビターの効果を定めた。外傷の1時間後にNSS検査を行った。 NSSテストの間、様々な反射、移動能力、ビームバランス、ビームウォーク、およびサイクルの探索および終了などの他の行動パラメータが監視された。壊死の発生は、2,3,5-トリフェニル-2H-テトラゾリウムクロライド（TTC）で染色された脳スライスでの壊死空間を評価することによって測定した。
体重40±4g（平均±SD）のC57BL/6Jマウスを本研究で使用した。体重減少装置を用いて、頭蓋骨にショックを与え、制御された脳損傷を生じさせた。インパクトは、フレームに降ろされたプラットフォームから押し出されるシリコーンコーティングされた5mmの金属先端によってもたらされた。この頭蓋損傷モデルは以前の研究で用いられた[Feldman Zら、J Neurosurg（1995）83：1060-1066；Shapira Yら、J Neurosurg Anesthesiol（1995）7：17-25]。）。すべての動物の手技とケア技術は、the Ben-Gurion University of the Negev Committee for the Ethical Care and Use of Animals in Research（ベングリオン大学の研究での動物の倫理学的ケアおよび使用のためのネゲブ委員会）によって承認を受けた。
マウスを、イソフルランでの麻酔により手術用に調製し、自発的に呼吸させた。実験手順に対する適切な麻酔の維持は角膜反射の喪失によって確認した。角膜反射がなくなれば、中線の頭皮切開を行い、頭皮および下にある筋肉を横方向に動かした。閉鎖性頭部外傷（CHT）は左大脳半球の前頭部分にわたり頭蓋骨に送られた。外傷の1分後、エラスターゼインヒビターIIまたはIIIの100μgをそのビヒクル（DMSO溶液）において、大槽内に直接送ることにより脳室内注入した。ビヒクル自体は以前は効果がないことが判明した。外傷を受けていないマウスのNSSは0ないし1であり、および染色された脳スライスには壊死スペースはなかった。
注射麻酔を中止した後、動物をケージに戻し、そして食物および水を自由に与えた。
野生型C57BL/6Jマウスに加えて、好中球エラスターゼノックアウトマウス株B6.129X1-Elaneもまた試験した。すべての手続はネゲブのベングリオン大学倫理委員会によって承認された。
肝臓毒性インビボモデル
体重23±3グラムの野生型C57BL/6Jマウスを、処置当たり6匹のマウスで使用した。マウスはHarlan（ハーラン）（イスラエル）から得た。すべての動物の手技とケア技術は、ベングリオン大学の研究での動物の倫理学的ケアおよび使用のためのネゲブ委員会により承認を受けた。マウスは、アセトアミノフェン（N-アセチル-p-アミノフェノール）APAP（300mg/kg）の単回腹腔（i.p.）用量の投与の前に16時間断食した。APAP注射の4時間後、マウスにビヒクル（PBS中20％DMSO）に溶解した試験化合物によりi.p.注入した。コントロールマウスにはビヒクルのみを注射した。APAP注射の24時間後、マウスを犠牲にし、および心臓から採血した。ヘパリンを血漿採取のための抗凝固添加剤として使用した。血漿サンプルを4000gで室温にて10分間遠心分離した。ALTおよびASTレベルの測定のために上清を回収した。酵素レベルは、Soroka's Biochemistry Medical Center（ソロカのバイオケミストリー・メディカル・センター）の自動分析装置で測定した。
心臓壊死インビボモデル
雄のBalb/cマウス（20-25g；Charles River（チャールズ・リバー）；Milan（ミラノ）；イタリア）を制御された環境に収容し、および標準的なげっ歯類の餌および水を与えた。
公表された方法論（Yetら、2001）を用いて、マウスに30分間の心筋虚血および6時間の再灌流を施した。調査群は、偽物、ビヒクルコントロール、およびインヒビター（n=8/群、下記参照）からなった。簡潔には、ペントバルビタールナトリウム（60mg/kg体重）でマウスを麻酔し、麻酔を維持するために必要に応じて追加用量を与えた。マウスに挿管し、および100％酸素で機械的に換気した。マウスは、活性インヒビターの1-（2-（4-メチルピペラジン-1-イル）-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-1-イル）プロパン-1-オン（M059-0891）（30mg/kg）の最初のIV投与を受けて、およびその胸を開けた。インヒビターのIV投与後20分に、冠動脈左前下行枝（LAD）を、LADにわたり通常位置付け左心房の先端から1mmに配置したPE-10チュービングのセクションで8-0絹縫合糸を用いて結紮することによって虚血を開始した。30分間の閉塞の後、結紮を解放し、およびPE-10チュービングを取り除くことによって再灌流を開始した。動物は、再灌流の開始時に2回目のIV用量のインヒビター（30mg/kg）を受けた。次いで、胸壁を閉じ、動物を抜管し、および体温を37℃の温かいプレートの使用により維持した。6時間の再灌流後、動物を形態損傷の決定のために心臓の収集用に安楽死させた。AARの％である壊死領域を定量化した。
実験群：合計で24匹のマウスを以下の群に割り当てた：
-虚血/再灌流+ビヒクル：LAD閉塞（30分）に続いて再灌流（6時間）に供したマウス（n=8）。
-虚血/再灌流+化合物：上記のように説明の外科的処置を施し、およびマウス虚血開始の前、および再灌流の開始時20分およびエラスターゼインヒビターで処置したマウス（IVボーラスを介して投与量を30mg/kg）（n=8）。
-偽物+賦形剤：LAD閉塞を除いて同一の外科的方法に供し、および実験期間中、麻酔下に保たれたマウス（n=8）。
すべての実験の終わりに、梗塞領域の評価のために動物を下記のように処理した。
梗塞サイズの決定。
再灌流期間の後、1mL/kgの4％チオフラビンS溶液をIV注入して、非リフロー領域を描写する。チオフラビンS溶液は、灌流された領域を蛍光として染色する蛍光黄緑色色素であり、非リフロー領域は暗く見える。5分後、LADを再閉塞し、およびAAR（青色色素を欠く組織）を描写するために、IV注入によって0.6mLの50％Unisperse blue（ユニスパルス・ブルー）（Ciba Geigy（チバ・ガイギー）、Hawthorne（ホーソーン）、NY）を与え、および深部麻酔下で1mLのKCl（150mg/mL IV）で処置しマウスを安楽死させた。その後、心臓を切除し、LVを4つの等しい厚さの横断切片に切断する。これらのスライスは、非リフロー領域（暗領域）を決定するために紫外光（λ=254nm）および黄色フィルタを使用して写真撮影し、および次いでハロゲン照明下でAARを識別する（染色されていない青色）。次いで、梗塞領域を描写するために、スライスを1％トリフェニルテトラゾリウムクロライド（TTC）中で37℃にて15分間インキュベートする。TTCは生存可能な心筋組織をブリック赤に染色し、および梗塞組織は白く見える。その後、心室スライスを再撮影する。非リフロー領域、AARおよび壊死領域を示す心臓スライスのデジタル写真を追跡し、および次いでコンピュータ化された面積測定（planimetric）システムを用いてデジタル化する。虚血領域および非虚血領域の面積が計算され、スライスのパーセンテージとして壊死および非壊死組織の％と同様に表される。各スライスにおいての％にスライスの重みが乗算される。重量は各心臓について合計される。AAR（染色されてない青色領域）は、LV質量のパーセンテージとして表される。壊死の程度は、LV質量のパーセンテージとして計算され、および梗塞サイズは、AAR（梗塞サイズ=壊死の程度/AARの程度）のパーセンテージとして表される。
データ分析
図およびテキストにおけるすべての値は、N回の観察の平均（SEM）の平均標準誤差として表された。データは、一元配置ANOVA、続いて多重比較のためのBonferroni（ボンフェローニ）post-hoc（事後）検定によって分析した。ノンパラメトリックデータはFisher's exact（フィッシャー直接）検定を用いて分析した。0.05未満のp値は有意であるとみなされる。*p<0.05対偽物。*p<0.05対I/R
統計分析
特に明記しない限り、各実験は3回実施し；各試料を少なくとも二連で試験した。結果は平均±SEを示す。統計分析はStudent’s T-test（スチューデントのT検定）を用いて行った。NSSの値は、Microsoft Windows(R)（マイクロソフト・ウインドウズ（商標））ソフトウェア用のSPSSを使用したノンパラメトリックマンホイットニー検定で解析される。有意性はP<0.05に設定した。
例1
壊死は細胞内エラスターゼ様タンパク質分解活性の誘導を伴う
壊死が細胞内タンパク質分解活性の誘導を伴うか否かを決定するために、第1の実験を行った。U-937細胞における壊死は、KCNによる処理によって誘導され、それは化学的低酸素症（chemohypoxia）を引き起こして細胞を死滅させる。U-937細胞におけるKCN誘発壊死の用量および時間依存動力学を図1に示す。
エラスターゼ様タンパク質分解活性の活性化が壊死細胞死プロセスの間に起こることをさらに確証するために、KCN処理U-937細胞から調製した細胞抽出物において、コントロールと比較してMAAPV、エラスターゼ特異的基質を用いてその活性を定めた。壊死のどの段階でエラスターゼ様酵素が活性化されたかを見るために、KCNで異なる時間間隔で処理したU937細胞から調製した溶解液中で酵素アッセイを行った。図2は、10mMのKCNによる処理によって誘導されたタンパク質分解活性の時間依存誘導を示す。見られるように、エラスターゼ様活性も10分以内に劇的に上昇し、およびその活性が7倍上昇したとき15分以内に最大に達した。エラスターゼ活性の増加は細胞死の形態学的徴候が観察される前に検出された。
エラスターゼ様誘導活性は、異なるプロテアーゼインヒビターを用いてさらに特徴付けられた。100μM濃度でのEIIIIはコントロール細胞のエラスターゼ活性にわずかな効果を有した；しかし、それは壊死誘導活性を十分に抑制した。抑制は用量依存的であり、IC50は2.735μMを有した（図3）。これらの結果は、U-937細胞における壊死に関連する誘導タンパク質分解活性がセリンプロテアーゼ活性と適合性であることを示した。
本発明者らはまた、どの壊死段階において、カテプシンCのエラスターゼの活性化酵素が活性化されたかを知りたかった。この目的のために、酵素アッセイを、異なる時間間隔で10mMのKCNで処理した細胞の溶解物において行った。図2は、10mMのKCNによる処理によって誘導されたタンパク質分解活性の時間依存的誘導を示す。見られるように、すでに10分の処置後、カテプシンC様活性は4倍だけ上昇し、およびその最大に達した。
エラスターゼ様タンパク質分解活性の誘導（分、図2）および壊死過程の進行（時間、図1）の時間スケールにおける非常に大きな差異は、タンパク質分解活性が壊死経路の初期分子ステップの一部分であるという仮説を導いた。この仮説を試験するために、エラスターゼ様酵素の発現の抑制および下方制御のために、および壊死過程に対するそれらの効果を調べるために、異なる方法を利用した（以下の例2および3参照）。
例2
カテプシンC、CELA3AおよびCELA1のためのsiRNAによるトランスフェクションは、壊死誘導細胞死に対して保護する
壊死プロセスの初期段階で活性化される酵素（群）を特徴付ける試みにおいて、本発明者らは、異なるプロテアーゼに対するsiRNAのライブラリーを利用した。トランスフェクションは合計93のプロテアーゼに対するsiRNAを用いて実行した。
図4A~Bは、CELA1またはCELA3AのsiRNAでのU-937細胞のトランスフェクションが、KCNとの7時間のインキュベーション後のLDH放出での安定で、および有意な減少をもたらしたことを示す。CELA1またはCELA3Aのいずれか単独によるトランスフェクションは部分的な保護を引き起こしたが、その一方、CELA1およびCELA3Aの両方に対するsiRNAの組合せによるトランスフェクションは壊死に対して十分な保護を提供した。
CELA1およびCELA3AのsiRNAに加えて、他のプロテアーゼのsiRNAsも試験した。中でもカテプシンA、B、C、D、E、G、H、K、L1、L2、O、S、WおよびZ、セリンプロテアーゼHNE、HtrA、キモトリプシンC、CELA 2AおよびCELA 3B、マトリクスメタロペプチダーゼ7、11、12、21および25がある。結果は、カテプシンCに対するsiRNAも、壊死に対して保護効果を示したことを示す（図4A）。合計で90個のプロテアーゼに対するsiRNAsを用いたトランスフェクションは、KCN誘導性細胞死に対するいかなる防御も与えることができなかった。
特定のsiRNAsの効果がU-937細胞に特異的でないことを確かめるために、これらの実験をPC12細胞で繰り返した（図4C）。
PC12細胞による比較実験は、カテプシンC、CELA3AおよびCELA1についてのsiRNAが各々、シアン化物誘導細胞死に対してU-937およびPC12細胞での有意な保護効果を有することを示した。また、siRNAおよびHiPerFectのトランスフェクション試薬（コントロール処理）の混合物は、細胞にとって毒性でないことも見ることができた。さらに、壊死の間の初期のカテプシンCの活性化は、小分子カテプシンCインヒビターによる壊死の抑制と同様に示された。結果はまた、上記の酵素の活性の抑制が細胞死での減少に関係することを示した。結果は、これらの酵素が、壊死性細胞死を制御/調節するための標的として役立つ可能性があることを示した。
例3
カテプシンC、CELA1および/またはCELA3AについてsiRNAによるトランスフェクションは特異的抑制を導く
特定のsiRNAsの保護効果が標的酵素の転写の停止に起因するものであり、および何らかのオフターゲット効果によるものではないことを確実にするために、本発明者らは、カテプシンCおよびエラスターゼ様活性が特異的siRNAsによりトランスフェクトされた細胞において抑制されたことを示すために酵素的なアッセイを実行した。効果的なサイレンシングの追加的な支持のために、指定されたタンパク質についてウエスタンブロット分析を行い、およびサイレンシングされた酵素の発現が実際に抑制されたことを示した。
図5A-Bは、カテプシンC、CELA1およびCELA3AについてのsiRNAsが、細胞溶解物の適切な酵素活性の安定した、および有意な低下を引き起こすことを示す。さらに、エラスターゼCELA1およびCELA3Aに対するsiRNAによるトランスフェクションは、カテプシンC活性に影響を及ぼさず、効果の特異性がさらに支持された。この実験は、特定のsiRNAsでの処置の保護効果が、酵素のダウンレギュレーションに起因し、および他の非標的効果に起因しないことを示した。これらの結果は、カテプシンCがプログラムされた壊死性細胞死に必須であることをさらに示した。
さらに、図4Aおよび図5A-Bの両方の組み合わされた結果は、これらの特異的酵素（CELA3AおよびCELA1）の活性が抑制される条件下では（図5A-B）、壊死のプロセスは抑制され（図4A）、これらの酵素の活性をブロックすることは細胞死の抑制を引き起こすことを意味する。
したがって、これらの研究は酵素が壊死の抑制のための有効な標的であるという基礎を提供する。まとめると、特異的CELA3AおよびCELA1インヒビターは他のエラスターゼのインヒビターではなく、壊死性細胞死を抑制することができることが示唆される。
例4
カテプシンC、CELA3AおよびCELA1インヒビターは壊死性細胞死の抑制をもたらす
図6は、カテプシンCインヒビター（Gly-Phe-DMK、MP Biomedicals、USA）がPC12中のKCNによって誘発された壊死を抑制することができたことを示す。インヒビターの添加は、LDH放出の用量依存的な減少によって明らかにされるように、細胞壊死を抑制した。再度、図5A-Bおよび図6の結果は、カテプシンCが抗壊死性薬剤についての標的を提供することができたことを意味した。
エラスターゼ様活性を壊死性の死経路と関連付ける本仮説の直接の結果は、このタンパク質分解活性の抑制が壊死性細胞死プログラムの実行を遅延または防止することである。この仮説を試験するために、壊死性細胞死に対する透過性エラスターゼインヒビターの効果を研究した。EI IIおよびIIIは、LDH放出によって評価されるように、PC12細胞におけるKCN誘発細胞死を用量依存的様式において抑制した（図7AおよびB）。非細胞透過性エラスターゼインヒビターのエラスタチナール（elastatinal）は、KCN誘発性壊死を受ける細胞に対して保護効果を有さなかった（データ示さず）。
CELA3Aインヒビターは3D構造類似性およびトポロジカルな類似性に基づいて合成した。これらは抗壊死性防御を与える能力について試験された。いくつかの結果の代表例をテーブル2に示す。KCN誘発壊死に対する保護は、最大0.1nMまでの様々な濃度で観察された（テーブル2）。CELA1の2つの小分子インヒビターは同様に壊死を抑制することができ、その上、ある種の化合物、たとえば、テーブルに挙げられた最後の3つの化合物は、著しく高い濃度で保護を与えた。
それら自体で不活性であった高濃度（最大300μM）の非特異的エラスターゼインヒビターEI IIおよびIIIへのPC-12細胞の曝露は、KCNによって誘発された壊死を有意に抑制することを観察することができる。しかし、小分子CELA3Aインヒビターが数桁低い濃度で有効であったことも同様に容易に見ることができる。壊死の防止/処置におけるCELA1-およびCELA3A-特異的抑制の予想外の増強された活性は、これらの2つの独特の標的、およびそれによってそれらと構造的に関連する標的の重要性を強調する。
例5
エラスターゼインヒビターの保護効果は、膜破壊を防止するよりも、KCN処理細胞の救済に現れる。
エラスターゼインヒビターの細胞への保護効果が、虚血後の長期間にわたって維持されているかどうかを調べるために、本発明者らは動態学試験を行った。5時間のKCNインキュベーション後、培地をKCNまたはエラスターゼインヒビターを含まない通常のDMEMに交換し、およびインキュベーションを48時間まで進行させた。細胞の生存は、膜の完全性よりは細胞代謝活性を測定するXTT法によって評価した。この結果は、細胞が不可逆的な損傷なしに5時間のKCN処理で生存したことを示す。それらは、KCN処置の48時間後に十分な回復を示す（図7C）。これらの結果は、エラスターゼインヒビターが長期間にわたる保護効果を提供することを実証するので、臨床的意義がある。例えば、MIまたは脳卒中のような虚血性ストレス後の治療域（therapeutic window）中にエラスターゼインヒビターで処置された組織を保存することができた。
例6
エラスターゼインヒビターがインビボでの壊死に及ぼす影響
上記有望な結果を考慮して、インビボでの壊死プロセスに対するエラスターゼインヒビターの効果の評価を試験した。研究された最初のインビボモデルは、外傷性脳損傷であった（図8）。まず、エラスターゼインヒビターIIおよびIIIならびにビヒクルのコントロールマウスに対する効果を調べた。マウスはNSS 0ないし1および壊死性脳組織なしで健康であることが判明した。図8A-Bは、エラスターゼインヒビターIIまたはIII処置マウスにおける、未処理の外傷を受けた動物と比較したニューロン損傷の減少および壊死空間の減少を示す。神経学的状態を、神経学的重症度スコアを用いて評価した。EIs IIおよびIIIは、損傷後1時間で測定したとき神経学的損傷を有意に減少させる。図8Bは、TTC染色によって測定したとき外傷を負ったマウスにおける壊死空間の量を示し；エラスターゼインヒビターによる処置は、損傷した半球の50から25％までに壊死組織の空間を明らかに縮小させた。好中球エラスターゼノックアウトマウスでインヒビターの効果を試験した場合、実質的に同じ結果が得られた（図8B）。図8A-Bに示すデータに加え、野生型Sprague Dawley（スプラーグドーリー）ラットについても同じ実験を行い、同様の結果が得られた（データは示していない）。
まとめると、図4A-C、7A-Bおよび8A-Bに提示される結果は、壊死性傷害を減弱させるエラスターゼインヒビターの使用を支持する。興味深いことに、壊死の発生および正常とノックアウトのマウスの間の処置に対する反応に差異はなく、好中球エラスターゼがこれらの2つの過程において何らの役割も果たさないことを示す。
さらに、CELA3Aまたは構造的に関連する酵素の選択された特異的に強力なインヒビターを、壊死の追加のモデルにおいてインビボで試験した。以前に記載されたそのような活性小分子インヒビターは、3D構造類似性およびCELA3A酵素のトポロジカルな類似体に基づくCELA3Aインヒビターのライブラリーをスクリーニングすることによって見出された。これらの化合物のインビトロ活性を以下に示し、例7参照。化合物Z601-4253（2-（ピペリジン-1-イル）チアゾール-4-イル）（ピロリジン-1-イル）メタノネン、それは活性化合物の2-アミノチアゾールグループに属し、それを肝臓毒性に対する保護について試験した。
本発明者らは、APAP肝毒性に対する抗壊死剤としてのこの化合物の可能性を評価した。この目的のために、本発明者らは、肝細胞死に関する血清生化学マーカーのレベルでの変化、すなわちALTおよびASTの変化を調べた。
図9に示すように、300mg/kgのAPAPによるマウスの処置は、酵素レベルにおいて有意な増加を生じさせ、パラセタモール投与の24時間後に血液中の肝酵素レベルが測定された。APAPのみで処置したマウスのALTレベルは8220±413U/Lであり、およびそれらのASTレベルは3553±290U/Lであった。偽物、コントロールおよび化合物単独では、ALTは2％未満であり、およびASTは4％未満であった。パラレルコントロールは、対応するAPAP処理から減少させた。APAPの投与の4時間後にIP注射した化合物Z601-4253は、血液中の両肝酵素のレベルを用量依存的様式で有意に低下させ、パラセタモール誘発毒性に対して保護する。
研究された別のモデルは、心筋虚血/再灌流傷害のネズミインビボモデルであった（図10）。2-（4-（4-メチルピペラジン-1-イル）-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-1-イル）プロパン-1-オン（M059-0891）の活性化合物、1-アミノイミダゾリンシリーズに属するものを研究した。結果は、インヒビターによる壊死および梗塞サイズの著しい減少を示す。
例7
本発明に従い使用するための具体的化合物のための包括的合成方法
以下に提供するスキーム1は、2-アミノイミダゾリン化合物の調製のための一般的な合成方法を記載しており、テーブル3は、指示された変数のための具体的な置換基を提供する。
一定の2-アミノイミダゾリン化合物の調製を、塩化メチレン中、2-チオメチルジヒドロイミダゾールヨウ化水素酸塩（ヒドロヨージド）（1.550gm（グラム）、0.0063モル）およびジイソプロピルエチルアミン（2.2当量）の混合物（15ml）に、室温で攪拌し、およびプロピオン酸無水物で処理し調製することによって達成された。混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を濃縮し、および塩化メチレンおよび水（それぞれ20ml）で希釈した。塩化メチレン層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、および濃縮してN-プロパノイル-2-チオメチルジヒドロイミダゾール（1.2gm）を得た。t-ブタノール（12ml）中のN-プロパノイル-2-チオメチルジヒドロイミダゾール（400mg）および1-メチルピペラジン（3当量）の混合物を3日間還流し、次いで濃縮し、シリカゲルカラム上で20-30％メタノール-塩化メチレンを用いて溶出し、出発物質（210mg）と共に化合物1（50mg）を与えた。1HNMR（DMSo-D6）：0.99（t、J=8Hz、3H）、2.16（s、3H）、2.32（q、J=8Hz、2H）、2.49（m、4H）、3.04）、3.39（t、J=8Hz、2H）、3.81（t、J=8Hz、2H）。LCMS m/z 225.0[M+1]。この合成手順は、上に概略的に示された方法Aに従う。
一定の2-アミノイミダゾリン化合物の調製は、メタノール（15ml）中の2-チオメチルジヒドロイミダゾールヨウ化水素酸塩（1.1gm）および1-メチルピペラジン（1.5当量）の混合物を、反応が完了するまで還流し（6-18時間）、次いで濃縮し、および塩化メチレン（20ml）に溶解し、およびトリエチルアミン（2当量）および無水プロピオン酸（1.25当量）で処理し、調製することによって達成した。混合物を室温で1時間撹拌した。次いで、反応混合物を濃縮し、および10-30％メタノール-塩化メチレンを用いてシリカゲルカラム上で精製して化合物1（780mg）を与えた。0.1％TFA-水を用いて化合物1（0.5gm）をC-18カラム上でさらに精製して化合物1のTFA塩（280mg）を与えた。1HNMR（CDCl3）：1.17（t、J=8Hz、3H）、2.38（s、3H）、2.49（q、J=8Hz、2H）、2.54(m、4H)、3.32(m、4H)、3.61(t、J=8Hz、2H)、3.93(t、J=8Hz、2H)；LCMS m/z 225.0[M+1]。この合成手順は、上に概略的に示された方法Bに従う。
方法Aの合成手順に従い、以下の特性を有する化合物2（M059-0851）をまた合成した：1HNMR(DMSO-d6):0.98(t、J=8Hz、3H)、1.50-1.83(m、8H)、2.30(q、J=8Hz、2H)、2.34-2.37(m、4H)、3.03-3.05(m、4H)、3.12-3.16(m、1H)、3.39(t、J=8Hz、2H)、3.84(t、J=8Hz、2H)；LCMS m/z 279.1[M+1]。
方法Aの合成手順に次いで、化合物3のTFA塩（M059-0032）を合成し、続いてC-18カラム精製を行い、以下の特性を生成した：1HNMR(DMSO-d6):1.82-1.90(m、2H)、1.96-2.03(m、2H)、3.33-3.37(m、2H)、3.50-3.54(m、2H)、3.71(t、J=8Hz、2H)、4.39(t、J=8Hz、2H)、6.81-6.82(m、1H)、7.50(d、J=Hz、1H)、8.11(m、1H)、9.84(s、1H)；LCMS m/z 234.0[M+1]。
方法Aの合成手順に続いて、化合物4のTFA塩（M059-0055）を合成し、以下の特性を生成した：1HNMR(DMSO-d6):1.08-1.83(m、8H)、1.81-1.85(m、4H)、2.15-2.22(m、1H)、2.59(d、J=8Z、2H)、3.38-3.41(m、4H)、3.36(t、J=8Hz、2H)、4.17(t、J=8Hz、2H)、9.47(s、1H)；LCMS m/z 250.1[M+1]。
方法Aの合成手順に続いて、化合物5（M059-0082）を合成した。方法Aの合成手順に続いて、1HNMR(DMSO-d6):1.48-1.74(m、8H)、1.85-1.90(m、4H)、2.49-2.56(m、1H)、3.18-3.23(m、2H)、3.34-3.40(m、6H)；LCMS m/z 236.1[M+1]である。
化合物6（M059-0053）および化合物7（M059-0335）は、方法Aに従って、化合物4と同様のプロトコールで調製した。
化合物8（Z601-4253）は、2-ピペリジノ-1,3-チアゾール-4-カルボン酸およびピロリジンから、塩化メチレン中、DCC、トリエチルアミンおよびDMAPの存在下で調製した。
以下に示すスキーム2は、2-アミノイミダゾリン化合物の調製のための包括的な合成方法を記載しており、テーブル3は、指示された変数のための具体的な置換基を提供する。
化合物9（M008-0111）および10（4112-3656）を、対応するブロモアセトフェノンおよびアミンから、スキーム2に記載の方法に従って調製した。
以下に示すスキーム3は、2-アミノイミダゾリン化合物の調製のための包括的な合成方法を記載する。
スキーム3に従い、商業上入手可能な5-イソプロピル-3-ピロリジン-2-イルイソオキサゾールおよびシクロプロパンカルボン酸から塩化メチレン中、DCC、トリエチルアミンおよびDMAPの存在下で化合物11（Z632-2266）を調製した。
以下に提供されるスキーム4は、ここに記載されるように使用する具体化化合物/化合物群のための追加の包括的合成手順を記載する：
スキーム4：
以下に提供されるスキーム5は、ここに記載の使用のための具体化化合物/化合物群のための追加の包括的合成手順を記載する：
以下に提供されるスキーム6は、ここに記載の使用のための具体化化合物/化合物群のための追加の包括的合成手順を記載する：
以下に提供されるスキーム7は、ここに記載の使用のための具体化化合物/化合物群のための追加の包括的合成手順を記載する：
以下に提供されるスキーム8は、ここに記載されるような使用のための具体化された化合物/化合物群のための追加の包括的合成手順を記載する。提供される参考文献はまた、その全体が参照によりここに十分に組み込まれる。
以下に提供されるスキーム9は、ここに記載されるような使用のための具体化された化合物/化合物群のための追加の包括的合成手順を記載する：
簡潔には、PMRスペクトルを300MHz Bruker DPXに登録し、およびBruker XWinNMRソフトウェアを用いて処理した。すべての商業的に入手した試薬をさらに精製することなく使用した。
化合物3。化合物1（0.1モル）を、化合物1（0.1モル）とエーテル（100ml）の混合物に加えた。混合物を28-30℃で12時間撹拌し、および次いで5℃に冷却した。形成された沈殿物をろ過によって集収し、水で洗浄し、乾燥させ、およびエタノールから結晶化して純粋な反応生成物3を70-75％の収率で与えた。
化合物4。化合物3（0.1モル）を、水（200ml）でのNaOH（0.25モル）およびエタノール（5ml）の溶液に懸濁させた。固体が完全に溶解するまで混合物を90℃で撹拌した。得られた溶液を室温まで冷却し、および酢酸で注意深く酸性化した。生成した沈殿物をろ過により集収し、水で洗浄し、乾燥させ、およびジオキサンから結晶化させて純粋な反応生成物4を75-80％の収率で与えた。
化合物5。1mmolの酸4を、5mlの乾燥DMF中のCDI（0.95mmol）の溶液に添加した。混合物をガスが形成されている間に80℃で2時間撹拌した。次いで、1mmolのアミンHNR2aR2bを反応混合物に加え、3-4時間還流し、および室温で一晩放置した。次いで、混合物を水（10ml）に注ぎ、形成された沈殿物をろ過により集収し、プロパノール-2からの結晶化により精製して、純粋な反応生成物5を40-85％の収率で与えた。
また、スキーム10を参照する：
提供される参考文献は、その全体がここに十分に組み込まれる。
当業者は、上記の合成方法が、テーブル1に記載されるような化合物を調製するために、またはここに提供される任意の式によって規定されるようにどのように修飾されることができるかを理解するであろう。
例8
3D構造の類似性およびトポロジカルな類似性に基づいてCELA3AおよびCELA1インヒビターのライブラリーをスクリーニングすることによって見出された活性小分子インヒビターのリスト
以下の化合物をベンダーChemDiv Inc.（San Diego、USA）によって調製し、およびそれらのそれぞれのChemDiv I.D.ナンバーを以下のテーブル4に示す。
壊死性細胞死のインヒビター
これらの化合物を、PC12細胞においてKCNによって誘導された壊死を抑制するそれらの能力について試験した。この系における細胞死の壊死モードは、以前に記載されたように検証された。結果を以下のテーブルに示す。PC12細胞に上記のようにKCNをチャレンジした。LDH放出法を用いて評価したKCN誘発性壊死に対する化合物の保護効果を以下のテーブル5に示す。これらのインヒビターのIC50値は、数十から単一ナノモルの範囲にある。
考察
壊死性細胞死を防止または処置することができないことは未解決の問題である。本発明者らは、siRNAによって、または特異的エラスターゼ低分子インヒビターによるエラスターゼ様活性の低下が、壊死性細胞死を受けた細胞に対する保護を与えることを示した。保護効果は異なる方法によって検証された。エラスターゼインヒビターが細胞を死から保護する能力は、オリゴマイシンAの存在下で、KCNでのか、または以前は抗Fasおよびスタウロスポリンによる処置後に観察されたように、細胞死誘発とは無関係であるように思われる。異なるクラスのペプチドおよび複素環式エラスターゼインヒビターは、保護を付与することができ、その効果は化合物に特異的でないことが示された。この死のプロセスにおける細胞内エラスターゼの役割に対するさらなる支持は、壊死細胞の細胞抽出物におけるエラスターゼ様活性の早期増加によってもたらされ、明らかな壊死性細胞死の兆候の前に起こる。活性における増加は、特定の基質を用いたエラスターゼ様活性の測定によって確認された。また、透過性エラスターゼインヒビター（EI IIおよびEI III）によるインタクトな細胞の処理は、細胞における酵素活性の誘導を無効にした。壊死中のエラスターゼ様活性の誘導に必要な短い時間は、酵素が壊死プロセスの初期段階、おそらく最終的に細胞死に至る分子事象のカスケードにおける初期段階のタンパク質分解活性化因子として作用することを示す。壊死におけるエラスターゼのこの役割は、細胞死プロセスにおけるタンパク質分解カスケードの既知の関与と一致する。したがって、エラスターゼ様活性の早期の顕著な誘導および細胞死を防止するエラスターゼインヒビターの能力は、壊死プロセスにおけるエラスターゼ様酵素の重要な役割を支持する。
マウスおよびラットにおける閉鎖頭部損傷（外傷）モデルを用いて、インビボでの脳細胞壊死損傷を防止するエラスターゼインヒビターの能力が示された。エラスターゼインヒビターの投与後の神経機能の改善（NSSでの減少）は、神経機能の低下が最も顕著であったとき、外傷後1時間に主に観察された。TTC染色によって明らかにされるような壊死領域の発生に対する保護効果は、外傷後24時間でさえ顕著であった。脳薄片のTTC染色は印象的な画像を明らかにし：エラスターゼインヒビターは脳組織の最大60％までを保護し、それはそうでなければ壊死を発症すると思われた。
罹患組織、たとえば、心筋梗塞からなどのようなものは、事象後4-12時間以内に壊死を生じる。同様に、脳卒中の場合、梗塞後数時間最大で24時間以内に壊死が発生し、脳組織に修復不能な損傷を引き起こす。事象直後のエラスターゼインヒビターによる処置は壊死の発生を防止する。したがって、本研究は明らかに治療的処置を表す。
本研究では、エラスターゼインヒビターが免疫細胞の活性または寄与とは無関係に壊死性細胞死を抑えることが明らかに示された。この実験系では、HNEを放出することができる好中球またはグリア細胞を欠く細胞モノカルチャーを利用した。注目すべきは、本研究で使用されるPC12細胞系はニューロン起源であり、および好中球エラスターゼを欠く。さらに、累積的にこれらの結果は、遍在性エラスターゼ様酵素が壊死性細胞死の開始に関与していることを示す。したがって、インビボでのエラスターゼインヒビター施与後のNSSでの改善は、ニューロン細胞に存在する細胞内エラスターゼ様酵素の抑制の結果である可能性が高い。このことは、免疫優先的部位（immune preferred site）における外傷後の回復の初期段階中に、有意な好中球浸潤はなく、およびそれによって好中球エラスターゼの抑制による混乱効果が最も起こりにくいという事実に起因する。この概念は、NEノックアウトマウスが壊死に対するエラスターゼインヒビターの保護効果に応答することを示す結果によって裏付けられる。
結論として、特定の細胞透過性エラスターゼインヒビターが壊死性細胞死を防止することが初めて示された。これらのインヒビターは、壊死性傷害の発症前の細胞死の予防に使用することができ、驚くべきことにここで行われた研究から生じる保護作用である。この治療上のアプローチは、脳卒中または心筋梗塞のリスクが高い患者の処置に特に有用であることができる。
エラスターゼインヒビターが細胞を死から保護する能力は、細胞死の引き金とは無関係であるようであり、およびインビトロおよびインビボで記録された。さらに、siRNAサイレンシングにより、標的のより一層特異的な識別が可能にされた。
提示された模範的な活性化合物のリストは、CELA3Aまたは同様の酵素との構造的類似性およびトポロジカルな類似性を有する分子を有する。これらの化合物はすべて、アッセイにおいて壊死を抑制することが見出された。すべての化合物は、著しい保護を1μM以下の濃度で与えることができた。
高濃度（最大300μM）の非特異的エラスターゼインヒビターEI IIおよびIIIは、それら自体で不活性であり、それらへのPC-12細胞の曝露は、KCNによって誘発された壊死を著しく抑制することが既に観察された。しかしながら、開示された小分子インヒビターが数桁低い濃度で有効であったことも同様に容易にわかる。非特異的なインヒビターに対する特異的なインヒビターの優越性のこの予期しない表示は、特異的な標的化の重要性を裏付ける。
罹患組織、たとえば、心筋梗塞からなどのようなものは、事象後4-12時間以内に壊死する。同様に、脳卒中の場合、梗塞後数時間以内最大で24時間で壊死が発生し、脳組織に修復不能な損傷を引き起こす。事象直後のエラスターゼインヒビターによる処置は壊死の発生を防止する。これは、3D構造類似性およびトポロジカルな類似性に基づいたCELA3Aインヒビターのライブラリーをスクリーニングすることによって発見された特異的小分子インヒビターの注入がAPAP投与の4時間後に投与されたときでも肝臓毒性に対して保護することを示す結果によってさらに裏付けられる。MIの処置は、スクリーニングによって発見された別の小さなインヒビターによる梗塞サイズでの約30％の減少を示すことによっても支持される。したがって、本研究は明らかに治療的処置の可能性を示す。
本発明をその特定の実施形態と共に説明したが、当業者には多くの代替物、修飾および変形が容易に見えることは明らかである。したがって、添付の請求の範囲の精神および広い範囲内に入るそのような代替、修飾および変形のなどのようなもののすべてを包含することが意図される。
ここに言及されるすべての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許または特許出願のそれぞれが、ここに参考として組み込まれることが具体的に、および個別に示されているのと同程度に、本明細書中に、同じ範囲にまで受け継がれ、ここにそれらの全体が組み込まれる。さらに、本出願における任意の参考文献の引用または識別は、そのような参照が本発明の先行技術として利用可能であることを認めるものと解釈されてはならない。セクション見出しが使用される限り、それらは必ずしも制限的であると解釈されるべきではない。

Claims (56)

  1. 式I：
    式I
    の構造によって特徴付けられ、
    式中、G1は、置換または非置換ピロリジン、置換または非置換ピペリジン、置換または非置換ピペラジン、置換または非置換イミダゾリジン、または置換または非置換ピラゾリジンであり；および
    G3は以下の構造：
    によって特徴付けられるか；またはG3は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリールまたは置換または非置換のシクロアルキルであり；
    式中、G2は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリール、置換または非置換のシクロアルキルまたは置換または非置換の複素環である、化合物；または
    式II：
    式II
    の構造によって特徴付けられ、
    式中、G1は、置換または非置換ピロリジン、置換または非置換ピリジン、置換または非置換アリール、置換または非置換ピペリジン、置換または非置換ピペラジン、置換または非置換イミダゾリジン、または置換または非置換ピラゾリジンであり；および
    G3は以下の構造：
    によって特徴付けられるか；またはG3は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリールまたは置換または非置換のシクロアルキルであり；
    式中、G2は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリール、置換または非置換のシクロアルキルまたは置換または非置換の複素環である、化合物；または
    式III：

    式III
    の構造によって特徴付けられ、
    式中、G1は、置換または非置換ピロリジン、置換または非置換ピリジン、置換または非置換アリール、置換または非置換ピペリジン、置換または非置換ピペラジン、置換または非置換イミダゾリジン、または置換または非置換ピラゾリジンであり；および
    G3は以下の構造：

    によって特徴付けられ；またはG3は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリールまたは置換または非置換のシクロアルキルであり；
    式中、G2は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリール、置換または非置換のシクロアルキルまたは置換または非置換の複素環である、化合物；または
    次の：
    3,4-ビス（（2-（ピロリジン-1-イル）エチル）アミノ）-1,2,5-チアジアゾール1,1-ジオキシド；
    シクロプロピル（2-（5-イソプロピルイソキサゾール-3-イル）ピロリジン-1-イル）メタノン；
    6-ブロモ-2-（3,5-ジメトキシフェニル）-4ベンゾ[d][1,3]オキサジン-4-オン
    6-メチル-5 -（（2-メチルピペリジン-1-イル）スルホニル）ピリミジン-2,4（1H,3H）-ジオン；
    N-メチル-4,5,6,7,8,9-ヘキサヒドロ-1H-シクロオクタ[c]ピラゾール-3-カルボキサミド；
    2-（5-（ピリジン-4-イル）-2H-テトラゾール-2-イル）酢酸；
    2-（フラン-2-イル）-5,6,7,8-テトラヒドロ-4H-ベンゾ[4,5]チエノ[2,3-d][1,3]オキサジン-4-オン；
    3-（（5-アセトアミド-1H-1,2,4-トリアゾール-3-イル）チオ）プロパン酸；
    N,N'-（オキシビス（4,1-フェニレン））ビス（2-メチルプロパンアミド）；
    7-（4-エチルピペラジン-1-イル）-5,6-ジメチル-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリミジン；
    7-フルオロ-10-（2-（4-イソプロピルピペラジン-1-イル）-2-オキソエチル）-2,3-ジヒドロ-1H-ベンゾ[e]ピロロ[1,2-a][1,4]ジアゼピン-5,11（10H,11aH）-ジオン；
    2-（tert-ブチル）-3-（1-メチル-1H-ベンゾ[d]イミダゾール-2-イル）-4-オキソ-4H-クロメン-7-イルピバラート；
    3-メチル-8-（ピペリジン-1-イル）-1H-プリン-2,6（3H,7H）-ジオン；
    2-（3-ブロモフェニル）-4-オキソ-4H-ベンゾ[d][1,3]オキサジン-6-イルアセタート；
    N-（1-エチル-3,5-ジメチル-1H-ピラゾール-4-イル）-3,4,5-トリメトキシベンズアミド；
    5-エチル-N-（ピリジン-2-イルメチル）-5H-[1,2,4]トリアジノ[5,6-b]インドール-3-アミン；
    3-（（4-クロロ-1H-ピラゾール-1-イル）メチル）-N-（2-（3-フルオロベンズアミド）エチル）-1,2,4-オキサジアゾール-5-カルボキサミド；
    1-（4-（メチルチオ）ベンジル）-4-トシルピペラジン；
    2-（2-エチルフェニルスルホンアミド）-5-（4-エチルピペラジン-1-イル）安息香酸；
    4（（2-メチルインドリン-1-イル）スルホニル）安息香酸；
    6-ブロモ-2-（3,5-ジメトキシフェニル）-4H-ベンゾ[d][1,3]オキサジン-4-オン；
    2-アミノ-N-（2,4-ジフルオロフェニル）ピリミジン-5-スルホンアミド；
    3-メチル-8-（ピペリジン-1-イル）-1H-プリン-2,6（3H,7H）-ジオン；
    5-クロロ-N-（2-オキソ-1-フェニルピロリジン-3-イル）チオフェン-2-スルホンアミド；
    3-（ピロリジン-1-イルスルホニル）安息香酸；
    （3,5-ジメチル-1H-ピラゾール-1-イル）（3,4,5-トリメトキシフェニル）メタノン；
    N-（3,4-ジフルオロフェニル）-2-（8-フルオロ-5,11-ジオキソ-2,3,11,11a-テトラヒドロ-1H-ベンゾ[e]ピロロ[1,2-a][1,4]ジアゼピン-10（5H）-イル）アセトアミド；
    5-（シクロヘキシルメチル）-3-（ピリジン-2-イル）-1,2,4-オキサジアゾール；
    エチル5-メチル-4-（2-（（4-メチルベンジル）アミノ）-2-オキソエチル）-7-フェニル-4,7-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-カルボキシラート；
    [1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリミジン-2-カルボン酸；
    1-（2-（ピペリジン-1-イル）-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-1-イル）ブタン-1-オン；
    （4-（6-クロロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピリジン-3-イル）ピペラジン-1-イル）（1-フェニルシクロプロピル）メタノン；
    N-（2,4-ジフルオロフェニル）-2-（5,11-ジオキソ-2,3,11,11a-テトラヒドロ-1H-ベンゾ[e]ピロロ[1,2-a][1,4]ジアゼピン-10（5H）-イル）アセトアミド；および
    エチル-2,3-ジヒドロ-3-オキソ-1,2-ベンズイソチアゾール-2-アセタート-1,1-ジオキシド；またはそれらの薬学的な塩、またはそれらの任意の組合せからなる群より選ばれる化合物で、細胞または組織壊死またはそれらに関連する疾患の処置または防止における使用のためのものである、化合物。
  2. 前記化合物は（2-（ピペリジン-1-イル）チアゾール-4-イル）（ピロリジン-1-イル）メタノン；N-（4-メチルピリジン-2-イル）-4-（2,4,5-トリメチルフェニル）チアゾール-2-アミン；4-（（2-メチルインドリン-1-イル）スルホニル）安息香酸；1-（2-（4-メチルピペラジン-1-イル）-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-1-イル）プロパン-1-オン；シクロペンチル（2-（ピロリジン-1-イル）-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-1-イル）メタノン；N1-（4-（4-クロロフェニル）チアゾール-2-イル）-N4,N4-ジメチルベンゼン-1,4-ジアミン；2-シクロペンチル-1-（2-（ピロリジン-1-イル）-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-1-イル）エタノン；N1-（4-（4-クロロフェニル）チアゾール-2-イル）-N4,N4-ジメチルベンゼン-1,4-ジアミン；シクロペンチル（2-（4-エチルピペラジン-1-イル）-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-1-イル）メタノン；2-エチル-1-（2-（ピロリジン-1-イル）-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-1-イル）ブタン-1-オン；フラン-2-イル（2-（ピロリジン-1-イル）-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-1-イル）メタノン；（2-クロロフェニル）-[2-（1-ピペリジル）-4,5-ジヒドロイミダゾール-1-イル]メタノンである、請求項1の化合物。
  3. 前記化合物は、CELA3Aまたはそれらに構造的に関連する酵素、CELA1またはカテプシンCまたはそれらの組合せにKd10-7Mまたはそれよりも少ない最小親和性を伴い選択的に結合する、請求項1または2のいずれか一項の化合物。
  4. 前記化合物は、CELA2A、CELA3B、またはカテプシンA、B、D、E、G、H、K、L1、L2、O、S、WまたはZまたはそれらの組合せに最小親和性Kd10-6Mまたはそれよりも多くを伴い結合する、請求項3の化合物。
  5. 前記使用はエクスビボまたはインビトロである、請求項1または2のいずれか一項の化合物。
  6. 前記使用はインビボである、請求項1または2のいずれか一項の化合物。
  7. 細胞または組織壊死を処置または防止することは、脳細胞、神経細胞、プルキンエ細胞、海馬錐体細胞、グリア細胞、心筋細胞、筋細胞、ケラチノサイト、表皮細胞、骨または軟骨細胞、膵臓細胞、肝細胞、腎臓細胞、消化管細胞、脾臓細胞、造血細胞、リンパ球、マクロファージ胸腺細胞、線維芽細胞、上皮細胞、気管支上皮細胞、腎細胞（nephrocyte）、糸球体細血管細胞、性腺細胞、精子、卵子、受精卵、胚細胞および肺上皮細胞からなる群より選ばれる細胞に影響を及ぼす、請求項1または2のいずれか一項の化合物。
  8. 細胞または組織壊死を処置または防止することは、徴候を処置、寛解、抑止し、または次の：神経変性疾患、黄斑変性症、網膜壊死、筋ジストロフィー、白血病、リンパ腫、呼吸窮迫、窒息、嵌頓ヘルニア、糖尿病、結核、子宮内膜症、脈管ジストロフィー、乾癬、寒冷傷害、鉄負荷合併症、ステロイド処置の合併症、虚血性心疾患、心筋梗塞、再潅流傷害、脳血管疾患または壊疽の損傷、褥瘡性潰瘍、膵炎、肝炎、硬変、ヘモグロビン尿、敗血症、熱傷、高熱、クローン病、セリアック病、コンパートメント症候群、壊死性直腸炎、スティーブンス・ジョンソン症候群（SJS）、中毒性表皮壊死（TEN）、嚢胞性線維症、関節リウマチ、骨髄炎、壊死性筋膜炎、腎毒性、脊髄損傷、糸球体腎炎、急性尿細管壊死、腎皮質壊死、変形性関節症、チロセミア、代謝性遺伝性疾患、細菌性、ウイルス性、真菌性または寄生虫感染、アンダーソン病、先天性ミトコンドリア病、フェニルケトン尿、胎盤梗塞、梅毒、梅毒、無菌壊死、虚血性壊死、アルコール依存、薬物による投与または暴露に関連する壊死（necrosis associated with administration with or exposure to a drug）、化学的毒素、農薬、重金属、兵器有機リン酸エステル、クモまたはヘビ毒、ダーマルフィラー施与に関係する壊死、異所的薬物施与に関係する壊死、化学療法誘発性壊死、放射線誘発性壊死、移植組織の欠陥または低下した質（impairment of or reduced quality of transplant tissue）、または加齢からなる群より選ばれる疾患または医学的条件の発生率を減らす、請求項1または2のいずれか一項の化合物。
  9. 式I：
    式I
    の構造によって特徴付けられ、
    式中、G1は、置換または非置換ピロリジン、置換または非置換ピペリジン、置換または非置換ピペラジン、置換または非置換イミダゾリジン、または置換または非置換ピラゾリジンであり；および
    G3は以下の構造：
    によって特徴付けられるか；またはG3は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリールまたは置換または非置換のシクロアルキルであり；
    式中、G2は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリール、置換または非置換のシクロアルキルまたは置換または非置換の複素環である、化合物；または
    式II：
    式II
    の構造によって特徴付けられ、
    式中、G1は、置換または非置換ピロリジン、置換または非置換ピリジン、置換または非置換アリール、置換または非置換ピペリジン、置換または非置換ピペラジン、置換または非置換イミダゾリジン、または置換または非置換ピラゾリジンであり；および
    G3は以下の構造：
    によって特徴付けられるか；またはG3は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリールまたは置換または非置換のシクロアルキルであり；
    式中、G2は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリール、置換または非置換のシクロアルキルまたは置換または非置換の複素環である、化合物；または
    式III：
    式III
    の構造によって特徴付けられ、
    式中、G1は、置換または非置換ピロリジン、置換または非置換ピリジン、置換または非置換アリール、置換または非置換ピペリジン、置換または非置換ピペラジン、置換または非置換イミダゾリジン、または置換または非置換ピラゾリジンであり；および
    G3は以下の構造：

    によって特徴付けられ；またはG3は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリールまたは置換または非置換のシクロアルキルであり；
    式中、G2は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリール、置換または非置換のシクロアルキルまたは置換または非置換の複素環である、化合物；または
    次の：
    3,4-ビス（（2-（ピロリジン-1-イル）エチル）アミノ）-1,2,5-チアジアゾール1,1-ジオキシド；
    シクロプロピル（2-（5-イソプロピルイソキサゾール-3-イル）ピロリジン-1-イル）メタノン；
    6-ブロモ-2-（3,5-ジメトキシフェニル）-4ベンゾ[d][1,3]オキサジン-4-オン
    6-メチル-5 -（（2-メチルピペリジン-1-イル）スルホニル）ピリミジン-2,4（1H,3H）-ジオン；
    N-メチル-4,5,6,7,8,9-ヘキサヒドロ-1H-シクロオクタ[c]ピラゾール-3-カルボキサミド；
    2-（5-（ピリジン-4-イル）-2H-テトラゾール-2-イル）酢酸；
    2-（フラン-2-イル）-5,6,7,8-テトラヒドロ-4H-ベンゾ[4,5]チエノ[2,3-d][1,3]オキサジン-4-オン；
    3-（（5-アセトアミド-1H-1,2,4-トリアゾール-3-イル）チオ）プロパン酸；
    N,N'-（オキシビス（4,1-フェニレン））ビス（2-メチルプロパンアミド）；
    7-（4-エチルピペラジン-1-イル）-5,6-ジメチル-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリミジン；
    7-フルオロ-10-（2-（4-イソプロピルピペラジン-1-イル）-2-オキソエチル）-2,3-ジヒドロ-1H-ベンゾ[e]ピロロ[1,2-a][1,4]ジアゼピン-5,11（10H,11aH）-ジオン；
    2-（tert-ブチル）-3-（1-メチル-1H-ベンゾ[d]イミダゾール-2-イル）-4-オキソ-4H-クロメン-7-イルピバラート；
    3-メチル-8-（ピペリジン-1-イル）-1H-プリン-2,6（3H,7H）-ジオン；
    2-（3-ブロモフェニル）-4-オキソ-4H-ベンゾ[d][1,3]オキサジン-6-イルアセタート；
    N-（1-エチル-3,5-ジメチル-1H-ピラゾール-4-イル）-3,4,5-トリメトキシベンズアミド；
    5-エチル-N-（ピリジン-2-イルメチル）-5H-[1,2,4]トリアジノ[5,6-b]インドール-3-アミン；
    3-（（4-クロロ-1H-ピラゾール-1-イル）メチル）-N-（2-（3-フルオロベンズアミド）エチル）-1,2,4-オキサジアゾール-5-カルボキサミド；
    1-（4-（メチルチオ）ベンジル）-4-トシルピペラジン；
    2-（2-エチルフェニルスルホンアミド）-5-（4-エチルピペラジン-1-イル）安息香酸；
    4（（2-メチルインドリン-1-イル）スルホニル）安息香酸；
    6-ブロモ-2-（3,5-ジメトキシフェニル）-4H-ベンゾ[d][1,3]オキサジン-4-オン；
    2-アミノ-N-（2,4-ジフルオロフェニル）ピリミジン-5-スルホンアミド；
    3-メチル-8-（ピペリジン-1-イル）-1H-プリン-2,6（3H,7H）-ジオン；
    5-クロロ-N-（2-オキソ-1-フェニルピロリジン-3-イル）チオフェン-2-スルホンアミド；
    3-（ピロリジン-1-イルスルホニル）安息香酸；
    （3,5-ジメチル-1H-ピラゾール-1-イル）（3,4,5-トリメトキシフェニル）メタノン；
    N-（3,4-ジフルオロフェニル）-2-（8-フルオロ-5,11-ジオキソ-2,3,11,11a-テトラヒドロ-1H-ベンゾ[e]ピロロ[1,2-a][1,4]ジアゼピン-10（5H）-イル）アセトアミド；
    5-（シクロヘキシルメチル）-3-（ピリジン-2-イル）-1,2,4-オキサジアゾール；
    エチル5-メチル-4-（2-（（4-メチルベンジル）アミノ）-2-オキソエチル）-7-フェニル-4,7-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-カルボキシラート；
    [1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリミジン-2-カルボン酸；
    1-（2-（ピペリジン-1-イル）-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-1-イル）ブタン-1-オン；
    （4-（6-クロロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピリジン-3-イル）ピペラジン-1-イル）（1-フェニルシクロプロピル）メタノン；
    N-（2,4-ジフルオロフェニル）-2-（5,11-ジオキソ-2,3,11,11a-テトラヒドロ-1H-ベンゾ[e]ピロロ[1,2-a][1,4]ジアゼピン-10（5H）-イル）アセトアミド；および
    エチル-2,3-ジヒドロ-3-オキソ-1,2-ベンズイソチアゾール-2-アセタート-1,1-ジオキシド；またはそれらの薬学的な塩、またはそれらの任意の組合せからなる群より選ばれる化合物の有効量を含み、および随意に薬学的に許容可能な担体または賦形剤をさらに含む、薬剤組成物。
  10. 抗アポトーシス剤または抗加齢剤がさらに含まれる、請求項9の組成物。
  11. 細胞または組織壊死の処置または防止における使用のためのものである、請求項9の組成物。
  12. 前記使用はエクスビボまたはインビトロである、請求項11の組成物。
  13. 前記細胞または組織壊死を処置または防止することは、脳細胞、神経細胞、プルキンエ細胞、海馬錐体細胞、グリア細胞、心筋細胞、筋細胞、ケラチノサイト、表皮細胞、骨または軟骨細胞、膵臓細胞、肝細胞、腎臓細胞、消化管細胞、脾臓細胞、造血細胞、リンパ球、マクロファージ胸腺細胞、線維芽細胞、上皮細胞、気管支上皮細胞、腎細胞、糸球体細血管細胞、性腺細胞、精子、卵子、受精卵、胚細胞および肺上皮細胞からなる群より選ばれる細胞に影響を及ぼす、請求項11の組成物。
  14. 細胞または組織壊死を処置または防止することは、次の：神経変性疾患、黄斑変性症、網膜壊死、筋ジストロフィー、白血病、リンパ腫、呼吸窮迫、窒息、嵌頓ヘルニア、糖尿病、結核、子宮内膜症、脈管ジストロフィー、乾癬、寒冷傷害、鉄負荷合併症、ステロイド処置の合併症、虚血性心疾患、心筋梗塞、再潅流傷害、脳血管疾患または壊疽の損傷、褥瘡性潰瘍、膵炎、肝炎、硬変、ヘモグロビン尿、敗血症、熱傷、高熱、クローン病、セリアック病、コンパートメント症候群、壊死性直腸炎、スティーブンス・ジョンソン症候群（SJS）、中毒性表皮壊死（TEN）、嚢胞性線維症、関節リウマチ、骨髄炎、壊死性筋膜炎、腎毒性、脊髄損傷、糸球体腎炎、急性尿細管壊死、腎皮質壊死、変形性関節症、チロセミア、代謝性遺伝性疾患、細菌性、ウイルス性、真菌性または寄生虫感染、アンダーソン病、先天性ミトコンドリア病、フェニルケトン尿、胎盤梗塞、梅毒、梅毒、無菌壊死、虚血性壊死、アルコール依存、薬物による投与または暴露に関連する壊死、化学的毒素、農薬、重金属、兵器有機リン酸エステル、クモまたはヘビ毒、ダーマルフィラー施与に関係する壊死、異所的薬物施与に関係する壊死、化学療法誘発性壊死、放射線誘発性壊死、移植組織の欠陥または低下した質、または加齢からなる群より選ばれる疾患または医学的条件の徴候を処置し、寛解し、抑止し、または発生率を減らす、請求項11の組成物。
  15. 壊死に関係する疾患または条件の徴候を処置し、防止し、寛解し、抑止し、またはそれらの発生率を減らすにあたり、それを必要とする対象において、式I：
    式I
    の構造によって特徴付けられ、
    式中、G1は、置換または非置換ピロリジン、置換または非置換ピペリジン、置換または非置換ピペラジン、置換または非置換イミダゾリジン、または置換または非置換ピラゾリジンであり；および
    G3は以下の構造：

    によって特徴付けられるか；またはG3は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリールまたは置換または非置換のシクロアルキルであり；
    式中、G2は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリール、置換または非置換のシクロアルキルまたは置換または非置換の複素環である、化合物；または
    式II：

    式II
    の構造によって特徴付けられ、
    式中、G1は、置換または非置換ピロリジン、置換または非置換ピリジン、置換または非置換アリール、置換または非置換ピペリジン、置換または非置換ピペラジン、置換または非置換イミダゾリジン、または置換または非置換ピラゾリジンであり；および
    G3は以下の構造：

    によって特徴付けられるか；またはG3は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリールまたは置換または非置換のシクロアルキルであり；
    式中、G2は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリール、置換または非置換のシクロアルキルまたは置換または非置換の複素環である、化合物；または
    式III：

    式III
    の構造によって特徴付けられ、
    式中、G1は、置換または非置換ピロリジン、置換または非置換ピリジン、置換または非置換アリール、置換または非置換ピペリジン、置換または非置換ピペラジン、置換または非置換イミダゾリジン、または置換または非置換ピラゾリジンであり；および
    G3は以下の構造：

    によって特徴付けられ；またはG3は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリールまたは置換または非置換のシクロアルキルであり；
    式中、G2は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアリール、置換または非置換のシクロアルキルまたは置換または非置換の複素環である、化合物；または
    次の：
    3,4-ビス（（2-（ピロリジン-1-イル）エチル）アミノ）-1,2,5-チアジアゾール1,1-ジオキシド；
    シクロプロピル（2-（5-イソプロピルイソキサゾール-3-イル）ピロリジン-1-イル）メタノン；
    6-ブロモ-2-（3,5-ジメトキシフェニル）-4ベンゾ[d][1,3]オキサジン-4-オン
    6-メチル-5 -（（2-メチルピペリジン-1-イル）スルホニル）ピリミジン-2,4（1H,3H）-ジオン；
    N-メチル-4,5,6,7,8,9-ヘキサヒドロ-1H-シクロオクタ[c]ピラゾール-3-カルボキサミド；
    2-（5-（ピリジン-4-イル）-2H-テトラゾール-2-イル）酢酸；
    2-（フラン-2-イル）-5,6,7,8-テトラヒドロ-4H-ベンゾ[4,5]チエノ[2,3-d][1,3]オキサジン-4-オン；
    3-（（5-アセトアミド-1H-1,2,4-トリアゾール-3-イル）チオ）プロパン酸；
    N,N'-（オキシビス（4,1-フェニレン））ビス（2-メチルプロパンアミド）；
    7-（4-エチルピペラジン-1-イル）-5,6-ジメチル-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリミジン；
    7-フルオロ-10-（2-（4-イソプロピルピペラジン-1-イル）-2-オキソエチル）-2,3-ジヒドロ-1H-ベンゾ[e]ピロロ[1,2-a][1,4]ジアゼピン-5,11（10H,11aH）-ジオン；
    2-（tert-ブチル）-3-（1-メチル-1H-ベンゾ[d]イミダゾール-2-イル）-4-オキソ-4H-クロメン-7-イルピバラート；
    3-メチル-8-（ピペリジン-1-イル）-1H-プリン-2,6（3H,7H）-ジオン；
    2-（3-ブロモフェニル）-4-オキソ-4H-ベンゾ[d][1,3]オキサジン-6-イルアセタート；
    N-（1-エチル-3,5-ジメチル-1H-ピラゾール-4-イル）-3,4,5-トリメトキシベンズアミド；
    5-エチル-N-（ピリジン-2-イルメチル）-5H-[1,2,4]トリアジノ[5,6-b]インドール-3-アミン；
    3-（（4-クロロ-1H-ピラゾール-1-イル）メチル）-N-（2-（3-フルオロベンズアミド）エチル）-1,2,4-オキサジアゾール-5-カルボキサミド；
    1-（4-（メチルチオ）ベンジル）-4-トシルピペラジン；
    2-（2-エチルフェニルスルホンアミド）-5-（4-エチルピペラジン-1-イル）安息香酸；
    4（（2-メチルインドリン-1-イル）スルホニル）安息香酸；
    6-ブロモ-2-（3,5-ジメトキシフェニル）-4H-ベンゾ[d][1,3]オキサジン-4-オン；
    2-アミノ-N-（2,4-ジフルオロフェニル）ピリミジン-5-スルホンアミド；
    3-メチル-8-（ピペリジン-1-イル）-1H-プリン-2,6（3H,7H）-ジオン；
    5-クロロ-N-（2-オキソ-1-フェニルピロリジン-3-イル）チオフェン-2-スルホンアミド；
    3-（ピロリジン-1-イルスルホニル）安息香酸；
    （3,5-ジメチル-1H-ピラゾール-1-イル）（3,4,5-トリメトキシフェニル）メタノン；
    N-（3,4-ジフルオロフェニル）-2-（8-フルオロ-5,11-ジオキソ-2,3,11,11a-テトラヒドロ-1H-ベンゾ[e]ピロロ[1,2-a][1,4]ジアゼピン-10（5H）-イル）アセトアミド；
    5-（シクロヘキシルメチル）-3-（ピリジン-2-イル）-1,2,4-オキサジアゾール；
    エチル5-メチル-4-（2-（（4-メチルベンジル）アミノ）-2-オキソエチル）-7-フェニル-4,7-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリミジン-6-カルボキシラート；
    [1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリミジン-2-カルボン酸；
    1-（2-（ピペリジン-1-イル）-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-1-イル）ブタン-1-オン；
    （4-（6-クロロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピリジン-3-イル）ピペラジン-1-イル）（1-フェニルシクロプロピル）メタノン；
    N-（2,4-ジフルオロフェニル）-2-（5,11-ジオキソ-2,3,11,11a-テトラヒドロ-1H-ベンゾ[e]ピロロ[1,2-a][1,4]ジアゼピン-10（5H）-イル）アセトアミド；および
    エチル-2,3-ジヒドロ-3-オキソ-1,2-ベンズイソチアゾール-2-アセタート-1,1-ジオキシド；またはそれらの薬学的な塩、またはそれらの任意の組合せからなる群より選ばれる化合物の治療上有効な量を前記対象に施与することを含み、それによって前記対象において疾患または条件が処置される、方法。
  16. 前記化合物は、（2-（ピペリジン-1-イル）チアゾール-4-イル）（ピロリジン-1-イル）メタノン；N-（4-メチルピリジン-2-イル）-4-（2,4,5-トリメチルフェニル）チアゾール-2-アミン；4-（（2-メチルインドリン-1-イル）スルホニル）安息香酸；1-（2-（4-メチルピペラジン-1-イル）-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-1-イル）プロパン-1-オン；シクロペンチル（2-（ピロリジン-1-イル）-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-1-イル）メタノン；N1-（4-（4-クロロフェニル）チアゾール-2-イル）-N4,N4-ジメチルベンゼン-1,4-ジアミン；2-シクロペンチル-1-（2-（ピロリジン-1-イル）-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-1-イル）エタノン；N1-（4-（4-クロロフェニル）チアゾール-2-イル）-N4,N4-ジメチルベンゼン-1,4-ジアミン；シクロペンチル（2-（4-エチルピペラジン-1-イル）-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-1-イル）メタノン；2-エチル-1-（2-（ピロリジン-1-イル）-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-1-イル）ブタン-1-オン；フラン-2-イル（2-（ピロリジン-1-イル）-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-1-イル）メタノン；および（2-クロロフェニル）-[2-（1-ピペリジル）-4,5-ジヒドロイミダゾール-1-イル]メタノンからなる群より選ばれる、請求項15の方法。
  17. 前記疾患または条件は、神経変性疾患、黄斑変性症、網膜壊死、筋ジストロフィー、白血病、リンパ腫、呼吸窮迫、窒息、嵌頓ヘルニア、糖尿病、結核、子宮内膜症、脈管ジストロフィー、乾癬、寒冷傷害、鉄負荷合併症、ステロイド処置の合併症、虚血性心疾患、心筋梗塞、再潅流傷害、脳血管疾患または壊疽の損傷、褥瘡性潰瘍、膵炎、肝炎、硬変、ヘモグロビン尿、敗血症、熱傷、高熱、クローン病、セリアック病、コンパートメント症候群、壊死性直腸炎、スティーブンス・ジョンソン症候群（SJS）、中毒性表皮壊死（TEN）、嚢胞性線維症、関節リウマチ、骨髄炎、壊死性筋膜炎、腎毒性、脊髄損傷、糸球体腎炎、急性尿細管壊死、腎皮質壊死、変形性関節症、チロセミア、代謝性遺伝性疾患、細菌性、ウイルス性、真菌性または寄生虫感染、アンダーソン病、先天性ミトコンドリア病、フェニルケトン尿、胎盤梗塞、梅毒、梅毒、無菌壊死、虚血性壊死、アルコール依存、薬物による投与または暴露に関連する壊死、化学的毒素、農薬、重金属、兵器有機リン酸エステル、クモまたはヘビ毒、ダーマルフィラー施与に関係する壊死、異所的薬物施与に関係する壊死、化学療法誘発性壊死、放射線誘発性壊死、移植組織の欠陥または低下した質、または加齢からなる群より選ばれる、請求項15の方法。
  18. 抗アポトーシス剤を対象に施与することがさらに含まれる、請求項15の方法。
  19. 前記抗アポトーシス剤は、前記化合物の施与前、施与と同時に、または施与後に施与される、請求項18の方法。
  20. 前記抗アポトーシス剤は、-[R]-N-[2-ヘプチル]-メチルプロパルギルアミン（R-2HMP）、ビタミンE、ビタミンD、カスパーゼインヒビターおよび親水性胆汁塩ウルソデオキシコール酸からなる群より選ばれる、請求項18の方法。
  21. 抗加齢剤を対象に施与するステップがさらに含まれる、請求項15の方法。
  22. 前記抗加齢剤は、抗酸化剤、植物化学物質、ホルモン、メトホルミンおよび脂肪酸からなる群より選ばれる、請求項21の方法。
  23. 細胞または組織壊死に関係する疾患または医学的条件の徴候の処置、防止、寛解、抑止、発生率の減少のための薬の製造における、請求項1または2のいずれか一項の化合物または請求項9の組成物の使用。
  24. CELA3A、CELA1、またはカテプシンCインヒビター剤であって、前記薬剤は、アンチセンス、siRNA、マイクロRNA、リボザイムおよびDNAザイムからなる群より選ばれるポリヌクレオチドであり、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35および配列番号36からなる群より選ばれる核酸領域に向けられる、CELA3A、CELA1、またはカテプシンCインヒビター剤。
  25. CELA3A、CELA1、またはカテプシンCインヒビター剤であって、前記薬剤はポリヌクレオチドであり、ポリヌクレオチド剤は、配列番号1、配列番号2または配列番号3で表される核酸配列のポリヌクレオチドと少なくとも95％の同一性を共有する、CELA3A、CELA1、またはカテプシンCインヒビター剤。
  26. 前記インヒビター剤は、CELA1またはCELA3A配列またはそれらの組合せと特異的にハイブリダイズし、およびモデレートないしストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でCELA2AまたはCELA3B配列にハイブリダイズしない、請求項24または25のいずれか一項のインヒビター剤。
  27. 前記インヒビター剤は、CELA1またはCELA3A配列またはその組合せと特異的にハイブリダイズし、およびストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でCELA2AまたはCELA3B配列にハイブリダイズしない、請求項24または25のいずれか一項のインヒビター剤。
  28. 前記インヒビター剤は、カテプシンCに特異的にハイブリダイズし、およびモデレートないしストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でカテプシンA、B、D、E、G、H、K、L1、L2、O、S、WまたはZにハイブリダイズしない、請求項24または25のいずれか一項のインヒビター剤。
  29. 前記インヒビター剤はポリヌクレオチドであり、ポリヌクレオチド剤は、配列番号1で表される核酸配列のポリヌクレオチドと少なくとも95％の同一性を共有する、請求項24または25のいずれか一項のインヒビター剤。
  30. 前記インヒビター剤はポリヌクレオチドであり、ポリヌクレオチド剤は、配列番号2で表される核酸配列のポリヌクレオチドと少なくとも95％の同一性を共有する、請求項24または25のいずれか一項のインヒビター剤。
  31. 前記インヒビター剤はポリヌクレオチドであり、ポリヌクレオチド剤は、配列番号3で表される核酸配列のポリヌクレオチドと少なくとも95％の同一性を共有する、請求項24または25のいずれか一項のインヒビター剤。
  32. 請求項24-31のいずれか一項のインヒビター剤を含む核酸構築物。
  33. CELA3A、CELA1またはカテプシンCインヒビター剤であって、前記薬剤は、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、および配列番号23からなる群より選ばれる配列を含むポリペプチドに特異的に結合し、およびその機能を抑制または防止する抗体である、CELA3A、CELA1またはカテプシンCインヒビター剤。
  34. 請求項24-33のいずれか一項のインヒビター剤および薬学的に許容される担体を含む薬剤組成物。
  35. 細胞膜の浸透のために調剤される、請求項34の薬剤組成物。
  36. 脂質小胞が含まれる、請求項35の薬剤組成物。
  37. 抗アポトーシス剤がさらに含まれる、請求項34-36のいずれか一項の薬剤組成物。
  38. 前記抗アポトーシス剤は、-[R]-N-[2-ヘプチル]-メチルプロパルギルアミン（R-2HMP）、ビタミンE、ビタミンD、カスパーゼインヒビターおよび親水性胆汁塩ウルソデオキシコール酸からなる群より選ばれる、請求項37の薬剤組成物。
  39. 抗加齢剤がさらに含まれる、請求項34-36のいずれか一項の薬剤組成物。
  40. 前記抗加齢剤は、抗酸化剤、植物化学物質、ホルモン、メトホルミンおよび脂肪酸からなる群より選ばれる、請求項39の薬剤組成物。
  41. 細胞または組織壊死に関係する疾患または条件の徴候の処置、防止、寛解、抑止または発生率の減少のための薬の製造における、請求項24-33のいずれか一項のインヒビター剤、または請求項37-34のいずれか一項の組成物の使用。
  42. 壊死に関係する疾患または条件の徴候を処置し、防止し、寛解し、抑止しまたは発生率を減らすにあたり、それを必要とする対象において、請求項24-33のいずれか一項のインヒビター剤、または請求項37-34のいずれか一項の組成物の治療上有効な量を前記対象に施与することを含み、それによって前記対象において疾患または条件が処置される、方法。
  43. 前記疾患または条件は、神経変性疾患、黄斑変性症、網膜壊死、筋ジストロフィー、白血病、リンパ腫、呼吸窮迫、窒息、嵌頓ヘルニア、糖尿病、結核、子宮内膜症、脈管ジストロフィー、乾癬、寒冷傷害、鉄負荷合併症、ステロイド処置の合併症、虚血性心疾患、心筋梗塞、再潅流傷害、脳血管疾患または壊疽の損傷、褥瘡性潰瘍、膵炎、肝炎、硬変、ヘモグロビン尿、敗血症、熱傷、高熱、クローン病、セリアック病、コンパートメント症候群、壊死性直腸炎、スティーブンス・ジョンソン症候群（SJS）、中毒性表皮壊死（TEN）、嚢胞性線維症、関節リウマチ、骨髄炎、壊死性筋膜炎、腎毒性、脊髄損傷、糸球体腎炎、急性尿細管壊死、腎皮質壊死、変形性関節症、チロセミア、代謝性遺伝性疾患、細菌性、ウイルス性、真菌性または寄生虫感染、アンダーソン病、先天性ミトコンドリア病、フェニルケトン尿、胎盤梗塞、梅毒、梅毒、無菌壊死、虚血性壊死、アルコール依存、薬物による投与または暴露に関連する壊死、化学的毒素、農薬、重金属、兵器有機リン酸エステル、クモまたはヘビ毒、ダーマルフィラー施与に関係する壊死、異所的薬物施与に関係する壊死、化学療法誘発性壊死、放射線誘発性壊死、移植組織の欠陥または低下した質、または加齢からなる群より選ばれる、請求項42の方法、または請求項41の使用。
  44. 抗アポトーシス剤を対象に施与することがさらに含まれる、請求項42の方法。
  45. 前記抗アポトーシス剤は、前記化合物の施与前、施与と同時に、または施与後に施与される、請求項44の方法。
  46. 前記抗アポトーシス剤は、-[R]-N-[2-ヘプチル]-メチルプロパルギルアミン（R-2HMP）、ビタミンE、ビタミンD、カスパーゼインヒビターおよび親水性胆汁塩ウルソデオキシコール酸からなる群より選ばれる、請求項44の方法。
  47. 抗加齢剤を対象に施与するステップがさらに含まれる、請求項42の方法。
  48. 前記抗加齢剤は、抗酸化剤、植物化学物質、ホルモンおよび脂肪酸からなる群より選ばれる、請求項47の方法。
  49. 式VI

    式VI
    の構造によって特徴付けられ、
    式中：
    G1は、随意に置換されるNH-ピロリジン、随意に置換されるNH-ピペリジン、随意に置換されるNH-ピペラジン、随意に置換されるNH-イミダゾリジン、随意に置換されるNH-ピラゾリジン、随意に置換されるNH-アリール、随意に置換されるNH-シクロアルキル、随意に置換されるピロリジン、随意に置換されるピペリジン、随意に置換されるピペリディン、随意に置換されるピペラジン、随意に置換されるイミダゾリジン、または随意に置換されるピラゾリジンであり；
    G2は、随意に置換されるアルキル、随意に置換されるアリール、随意に置換されるシクロアルキルまたは随意に置換される複素環であり；
    ここで：
    G1が非置換ピロリジンである場合、そのときG2は、アルキル、シクロペンチル、アルキルシクロペンチルまたはフランではなく；または
    G1がピペリジンである場合、そのときG2はアルキルではなく；および
    G1がピペラジンである場合、そのときG2はアルキルまたはフランではない、
    化合物。
  50. G1はピロリジンであり、およびG2はエチルまたはフランである、請求項49の化合物。
  51. G1は置換ピペラジンであり、およびG2はフランまたはフェニルである、請求項49の化合物。
  52. G1はピペリジンであり、およびG2は、シクロペンチル、フランまたはフェニルである、請求項49の化合物。
  53. G1は随意に置換されるイミダゾリジンまたは随意に置換されるピラゾリジンである、請求項49の化合物。
  54. 式VII：

    式VII
    の構造によって特徴付けられ、
    式中：
    G1は、随意に置換されるNH-ピロリジン、随意に置換されるNH-ピペリジン、随意に置換されるNH-ピペラジン、随意に置換されるNH-イミダゾリジン、随意に置換されるNH-ピラゾリジン、随意に置換されるNH-ピリジン、随意に置換されるNH-アリール、随意に置換されるNH-シクロアルキル、随意に置換されるピロリジン、随意に置換されるピペリジン、随意に置換されるピペリディン、随意に置換されるピペラジン、随意に置換されるイミダゾリジン、随意に置換されるピラゾリジンまたは随意に置換されるアリールであり；
    G2は、

    または随意に置換されるアルキル、随意に置換されるアリールまたは随意に置換されるシクロアルキルであり；および
    G4は、随意に置換されるピロリジン、随意に置換されるピペリジン、随意に置換されるピペラジン、随意に置換されるイミダゾリジンまたは随意に置換されるピラゾリジンであり；
    ここで：
    G1がピペリジンである場合、そのときG4はピロリジンではなく、またはG2は随意に置換されるアリールではなく；または
    G1がイミダゾリジンである場合、そのときG2は随意に置換されるアリールではなく；または
    G1が随意に置換されるNH-ピリジンである場合、そのときG2は随意に置換されるアリールではなく；または
    G1が随意に置換されるNH-アリールである場合、そのときG2は随意に置換されるアリールではなく；または
    G1が随意に置換されるピリジンである場合、そのときG2は随意に置換されるアリールではない、
    化合物。
  55. G1は随意に置換されるNH-ピリジンであり、G2は、

    であり、式中、G4はピロリジンであり、またはG2はハロアリールである、請求項54の化合物。
  56. G1は随意に置換されるNH-アリールであり、およびG2は、

    であり、式中、G4はピロリジンである、請求項54の化合物。
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