KR20180002676A - Cathepsin c 및/또는 cela1 및/또는 cela3a 및/또는 그와 관련된 구조적 효소를 타겟으로 하여 세포 또는 조직의 감염을 치료 및/또는 예방하기위한 조성물 - Google Patents

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이라나 나싼
보리스 칼핀
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엘라 파마 리미티드
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Abstract

억제제 화합물 및 카텝신 C, CELA1, CELA3A 및/또는 구조적으로 이에 관련된 분자의 제제, 이를 포함하는 조성물 및 세포 및/또는 조직 괴사의 억제 및/또는 예방에 있어서 이들의 용도가 기재되어 있다. 기재된 화합물에 대한 다양한 적용, 및 병용 요법이 또한 기재되어 있다.

Description

카텝신 C 및/또는 CELA1 및/또는 CELA3A 및/또는 구조적으로 이에 관련된 효소를 특이적으로 표적화하는 세포 또는 조직 괴사를 치료 및/또는 예방하기 위한 조성물
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2015년 4월 7일자로 출원된 미국 가특허 일련 번호 제62/143,821호 및 2015년 6월 4일자로 출원된 미국 가출원 일련 번호 제62/170,717호의 이익을 주장하며, 이들 모두는 이의 전문이 본원에 참조로 인용된다.
발명의 분야
본 발명은, 이의 일부 구현예에서, 세포 괴사를 치료 및/또는 예방하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이며, 보다 특히, 그러나 전적으로는 아니지만, 세포내 카텝신 C 및/또는 CELA3A 및/또는 CELA1 및/또는 구조적으로 이에 관련된 표적의 발현의 하향조절 및/또는 활성의 억제에 의해 세포 괴사를 예방 또는 치료하는 것에 관한 것이다.
괴사는 아폽토시스 프로그래밍화된 세포사와 구별되는 세포 및 살아있는 조직의 독특한 사멸 과정으로 간주된다. 괴사는 세포 팽창, 염색질 분해 및 세포질막및 세포소기관 막의 파괴를 특징으로 한다. 괴사의 후반 단계는 광범위한 DNA 가수분해, 소포체의 액포화, 세포소기관 파괴 및 세포 용해를 특징으로 한다. 세포질막 파열 후 세포내 내용물의 방출은 괴사로 보이는 염증의 원인이다. 괴사는 오랫동안 우발적인 세포사의 병리학적 모드로 간주되었지만, 최근의 연구들은 괴사가 조절된 과정임을 나타내는 몇가지 증거를 제시했다.
괴사와 달리 아폽토시스는 에너지 의존적이다. 아폽토시스는 카파제 활성화 및 DNA 절단의 특이적 모드를 특징으로 하지만, 괴사에는 두 과정 모두가 없다.
세포사는 되돌릴 수 없는 지점으로 유도하는 과정이다. 예를 들어, 전체 허혈에 걸린 간세포의 경우, 세포사는 대략 150분이 걸리는데, 이 시간은 조직학적 부분에서 어떠한 변화도 거의 보이지 않았다. 괴사는 단지 12 내지 24시간 후에 만연하다. 즉, 임의의 괴사성 변화를 광학현미경으로 볼 수 있기 오래 전에 세포는 죽는다.
예를 들어, 상해, 허혈, 무산소증, 경색증, 감염, 암, 독, 독액 및 염증으로의 장기간 노출을 포함한 괴사의 많은 원인이 있다. 예를 들어, 괴사는 적절한 치료가 부족하여 상처 부위에 발생할 수 있다.
또한 심근경색증, 뇌졸중, 간경화증 및 기타 잠재적으로 치명적인 질환을 포함한 여러 심각한 질환의 병리학이 괴사와 관련이 있다. 서양에서 최대 살인자 중 하나인 심부전은 심장근육세포 (heart muscle cell) (심근세포: cardiomyocyte)의 손실을 특징으로 한다. 괴사에 의한 세포사가 심부전을 수반하는 심근세포 손실에 중요한 역할을 한다는 것은 잘 알려져 있다.
현재 괴사 조직의 조기 및 공격적 외과적 절제술 및 연구, 고압 산소 요법 (hyperbaric oxygen therapy), 고압 산소 요법 (high pressure oxygen therapy), 항생제 투여, 항염증제 투여 및 정맥내 면역글로불린 투여를 포함하여 괴사에 대한 몇 가지 기존 요법이 있다. 그러나, 모두가 반정도 성공하며, 심각한 이환율과 사망율은 괴사의 합병증에 기인한다.
예를 들어, 상해, 허혈, 무산소증, 경색증, 감염, 암, 독, 독액 및 염증으로의 장기간 노출을 포함한 괴사의 많은 원인이 있다. 예를 들어, 괴사는 적절한 치료가 부족하여 상처 부위에 발생할 수 있다. 또한 심근경색증, 뇌졸중, 간경화증 및 기타 치명적인 질환을 포함한 몇 가지 심각한 질환의 병리학이 괴사에 관련있다. 서양에서 최대 살인자 중 하나인 심부전은 심근세포 (심장 근세포)의 소실을 특징으로 한다. 괴사에 의한 세포사가 심부전을 수반하는 심근세포 손실에 중요한 역할을 한다는 것은 잘 알려져 있다.
또한, 괴사 과정은 이식 전에 수거된 장기 및 조직을 보존하는 것과 관련된 문제에 기여한다. 특히 상기 과정은 기증자 심장의 보관 동안에 심장 조직의 열화에 관련되어 이의 품질이 불량해진다. 다른 예로는 피부판 (skin flap), 신장, 간 및 기타 조직의 보존 및 이식이 있다. 괴사는 또한 화학요법 동안 건강한 조직에 대한 세포독성에 관여한다.
현재 괴사에 대한 유일한 치료는 고압 산소 요법이다. 그러나, 이는 괴사 자체에 대한 약물 치료가 아니다. 이것이 괴사의 합병증으로 인한 심각한 이환율과 사망률을 초래하는 이유이다.
단백질 분해를 촉진시키는 특정 엘라스타제는 괴사성 세포사에 관여하는 것으로 사전에 밝혀졌고, 영향을 받은 세포를 특정 (호중구 엘라타제) 억제제 화합물로 처리하면 상기 억제제가 수백 마이크로몰 농도로 사용되는 경우 시험관내 세포 괴사를 예방/치료하였다 (WO2003079969).
이러한 초기 발견은 고무적이지만, 계열 구성원의 범위를 고려하여, 괴사를 예방/치료하는데 효과적인 고친화성 억제제를 선험적으로 정의할 때의 어려움과 엘라스타제 계열 구성원이 괴사의 치료 및 예방 및 이에 대한 이상적 치료에 효과적인 표적인지에 대한 이해력 부족은 지금까지도 파악하기 어렵다.
본 발명은 특정 엘라스타제형 단백질분해 효소의 발현 및/또는 활성의 억제가 세포 및 조직 괴사의 매우 효과적인 예방 및 치료를 초래한다는 놀라운 발견을 제공한다. 놀랍게도, 카텝신 C, CELA1, CELA3A 또는 다른 구조적으로 이에 관련된 분자의 특이적 억제는 세포 및/또는 조직 괴사를 예방 및/또는 치료한다.
특히, 본 발명은 특히, 몇몇 양태에서 단백질분해 효소이고 일부 양태에서 엘라스타제 활성을 나타낼 수도 있는 매우 특이적인 일련의 표적의 동정을 제공하며, 본원에 기재된 화합물, 약제 및 조성물에 의한 억제를 달성할 수 있다. 일부 양태에서, 이전의 엘라스타제 억제제보다 수십배 적은 농도로 제공되는 본원에 기재된 화합물을 사용하는 특이적 시험관내 억제는 놀랍게도 괴사를 예방 및/또는 치료 및/또는 중지/폐지 (abrogating)하는데 효과적이었다.
일부 양태에서, 이러한 향상된 친화력은 본원에 기재된 바와 같은 조성물, 방법, 용도, 제제 및 화합물에서의 적용을 위한 보다 특이적 표적의 동정과 관련이있다.
일부 양태에서, 이러한 향상된 친화력은 일부 구현예에서 매우 효과적인 치료 표적으로서 작용하는 괴사 경로에서 활성 효소의 상이한 서브세트의 동정을 반영할 수 있다.
일부 양태에서, 이러한 향상된 친화력은 세포 및 조직 괴사를 감소시키는 적용을 위한 이전에 동정된 표적과 다른 활성을 갖는 부류의 표적의 동정과 관련이 있다.
따라서, 본 발명은 특히 카텝신 C, CELA1, CELA3A 또는 구조적으로 이에 관련된 효소의 발현 및/또는 활성을 특이적으로 억제하는 유효량의 제제를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써 세포 및 조직 괴사 및 이와 관련된 질환을 치료 및 예방하기 위한 방법을 제공한다.
본원에 추가로 기재된 바와 같은 카텝신 C, CELA1, CELA3A 또는 구조적으로 이에 관련된 효소의 발현 및/또는 활성을 특이적으로 억제하는 이러한 제제는 본원에 추가로 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 억제제 뿐만 아니라 정의된 화합물일 수 있다.
본 발명은, 일부 구현예에서, 세포 또는 조직 괴사 또는 이에 관련된 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 화학식 I의 구조를 특징으로 하는 화합물:
화학식 I
Figure pct00001
　
(여기서, G1은 치환된 또는 비치환된 피롤리딘, 치환된 또는 비치환된 피페리딘, 치환된 또는 비치환된 피페라진, 치환된 또는 비치환된 이미다졸리딘, 또는 치환된 또는 비치환된 피라졸리딘이고;
G3은 하기 구조:
Figure pct00002
를 특징으로 하거나; 또는 G3은 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬이고;
여기서, G2는 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클이다); 또는
화학식 II의 구조를 특징으로 하는 화합물:
화학식 II
Figure pct00003
　
(여기서, G1은 치환된 또는 비치환된 피롤리딘, 치환된 또는 비치환된 피리딘, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 피페리딘, 치환된 또는 비치환된 피페라진, 치환된 또는 비치환된 이미다졸리딘, 또는 치환된 또는 비치환된 피라졸리딘이고;
G3은 하기 구조:
Figure pct00004
를 특징으로 하거나; 또는 G3은 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬이고;
여기서, G2는 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클이다); 또는
화학식 III의 구조를 특징으로 하는 화합물:
화학식 III
Figure pct00005
　
(여기서, G1은 치환된 또는 비치환된 피롤리딘, 치환된 또는 비치환된 피리딘, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 피페리딘, 치환된 또는 비치환된 피페라진, 치환된 또는 비치환된 이미다졸리딘, 또는 치환된 또는 비치환된 피라졸리딘이고;
G3은 하기 구조:
Figure pct00006
를 특징으로 하거나; 또는 G3은 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬이고;
여기서, G2는 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클이다); 또는
3,4-비스((2-(피롤리딘-1-일)에틸)아미노)-1,2,5-티아디아졸 1,1-디옥사이드;
사이클로프로필(2-(5-이소프로필이속사졸-3-일)피롤리딘-1-일)메타논;
6-브로모-2-(3,5-디메톡시페닐)-4벤조[d][1,3]옥사진-4-온
6-메틸-5-((2-메틸피페리딘-1-일)설포닐)피리미딘-2,4(1H,3H)-디온;
N-메틸-4,5,6,7,8,9-헥사하이드로-1H-사이클로옥타[c]피라졸-3-카복스아미드;
2-(5-(피리딘-4-일)-2H-테트라졸-2-일)아세트산;
2-(푸란-2-일)-5,6,7,8-테트라하이드로-4H-벤조[4,5]티에노[2,3-d][1,3]옥사진-4-온;
3-((5-아세트아미도-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)티오)프로판산;
N,N'-(옥시비스(4,1-페닐렌))비스(2-메틸프로판아미드);
7-(4-에틸피페라진-1-일)-5,6-디메틸-[1,2,4]트리아졸로[1,5-a]피리미딘;
7-플루오로-10-(2-(4-이소프로필피페라진-1-일)-2-옥소에틸)-2,3-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-5,11(10H,11aH)-디온;
2-(3급-부틸)-3-(1-메틸-1H-벤조[d]이미다졸-2-일)-4-옥소-4H-크로멘-7-일 피발레이트;
3-메틸-8-(피페리딘-1-일)-1H-푸린-2,6(3H,7H)-디온;
2-(3-브로모페닐)-4-옥소-4H-벤조[d][1,3]옥사진-6-일 아세테이트;
N-(1-에틸-3,5-디메틸-1H-피라졸-4-일)-3,4,5-트리메톡시벤즈아미드;
5-에틸-N-(피리딘-2-일메틸)-5H-[1,2,4]트리아지노[5,6-b]인돌-3-아민;
3-((4-클로로-1H-피라졸-1-일)메틸)-N-(2-(3-플루오로벤즈아미도)에틸)-1,2,4-옥사디아졸-5-카복스아미드;
1-(4-(메틸티오)벤질)-4-토실피페라진;
2-(2-에틸페닐설폰아미도)-5-(4-에틸피페라진-1-일)벤조산;
4((2-메틸인돌린-1-일)설포닐)벤조산;
6-브로모-2-(3,5-디메톡시페닐)-4H-벤조[d][1,3]옥사진-4-온;
2-아미노-N-(2,4-디플루오로페닐)피리미딘-5-설폰아미드;
3-메틸-8-(피페리딘-1-일)-1H-푸린-2,6(3H,7H)-디온;
5-클로로-N-(2-옥소-1-페닐피롤리딘-3-일)티오펜-2-설폰아미드;
3-(피롤리딘-1-일설포닐)벤조산;
(3,5-디메틸-1H-피라졸-1-일)(3,4,5-트리메톡시페닐)메타논;
N-(3,4-디플루오로페닐)-2-(8-플루오로-5,11-디옥소-2,3,11,11a-테트라하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-일)아세트아미드;
5-(사이클로헥실메틸)-3-(피리딘-2-일)-1,2,4-옥사디아졸;
에틸 5-메틸-4-(2-((4-메틸벤질)아미노)-2-옥소에틸)-7-페닐-4,7-디하이드로-[1,2,4]트리아졸로[1,5-a]피리미딘-6-카복실레이트;
[1,2,4]트리아졸로[1,5-a]피리미딘-2-카복실산;
1-(2-(피페리딘-1-일)-4,5-디하이드로-1H-이미다졸-1-일)부탄-1-온;
(4-(6-클로로-[1,2,4]트리아졸로[4,3-a]피리딘-3-일)피페라진-1-일)(1-페닐사이클로프로필)메타논;
N-(2,4-디플루오로페닐)-2-(5,11-디옥소-2,3,11,11a-테트라하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-일)아세트아미드; 및
에틸-2,3-디하이드로-3-옥소-1,2-벤즈이소티아졸-2-아세테이트-1,1-디옥사이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 화합물; 또는 이의 약제학적 염 또는 이의 임의의 조합을 제공한다.
상기 정의된 바와 같은 화합물을 포함하는 약제 학적 조성물은 또한 본 발명의 구현된 양태를 구성하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명은 상기 정의된 바와 같은 화합물의 제1 의학적 용도를 기재하며, 이 용도는 또한 본 발명의 구현된 양태를 구성하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명은 추가로 세포 또는 조직 괴사 또는 이에 관련한 질환 또는 병태의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 정의된 바와 같은 유효량의 화합물 또는이를 포함하는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하거나 또는 영향을 받은 세포 또는 조직을 이와 접촉시키고 이에 의해 세포 또는 조직 괴사 또는 이에 관련된 병태를 치료하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 대상체에서 발생하는 세포 또는 조직 괴사와 관련된 질환 또는 병태를 치료하는데 사용하기 위한 약제의 제조에서 상기 정의된 바와 같은 유효량의 화합물 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물의 용도를 제공한다.
일부 양태에서, 이것은 본원에 기재된 바와 같은 구현된 화합물의 첫번째로 입증된 의학적 용도이며, 본 발명은 이를 고려한다. 일부 양태에서, 카텝신 C, CELA1, CELA3A 또는 구조적으로 이에 관련된 효소의 활성을 특이적으로 억제하는 한정된 활성을 갖는, 본원에 기재된 또는 이에 구조적으로 관련된 화합물은 본 본 발명의 계획된 양태이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 화합물은 카텝신 C, CELA1, CELA3A 또는 구조적으로 이에 관련된 효소 또는 이들의 조합에 Kd 10-7 M 이하의 최소 친화력으로 선택적으로 결합시킴으로써 정의된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 화합물은 CELA2A, CELA3B, 또는 카텝신 A, B, D, E, G, H, K, L1, L2, O, S, W 또는 Z 또는 이들의 조합에 덜 선택적으로 결합시킴으로써 정의되며, 일부 구현예에서, Kd 10-7 M 이상의 최소 친화력을 나타낸다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 화합물의 임의의 조합을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 화합물 또는 본원에 기재된 바와 같은 임의의 단일 화합물의 임의의 조합의 유효량을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 추가로 포함할 것이다.
본 발명의 일부 구현예에 따라, 상기 약제학적 조성물은 세포막을 관통하도록 제형화된다.
본 발명의 일부 구현예에 따라, 상기 약제학적 조성물은 지질 소포체를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 조성물은 항-아폽토시스제 또는 항-노화제를 추가로 포함한다. 본 발명의 일부 구현예에 따라, 상기 항-노화제는 항산화제, 피토케미컬 (phytochemical), 호르몬, 메트포르민 및 지방산으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 카텝신 C 억제제, CELA1, CELA3A 또는 구조적으로 이에 관련된 효소를 제공하며, 여기서, 상기 제제는 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35 및 서열번호 36으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 핵산 영역에 지시된, 안티센스, siRNA, 마이크로RNA, 리보자임 및 DNAzyme로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 상기 CELA3A, CELA1, 또는 카텝신 C 억제제는 폴리뉴클레오타이드이며, 폴리뉴클레오타이드 제제는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3에 기재된 바와 같은 핵산 서열의 폴리뉴클레오타이드와 적어도 95 % 동일성을 공유한다.
일부 구현예에서, 상기 CELA3A, CELA1, 또는 카텝신 C 억제제는 폴리뉴클레오타이드이며, 폴리뉴클레오타이드 제제는 중등도 내지 엄격한 하이브리드화 조건하에 CELA1 또는 CELA3A 서열 또는 이의 조합과 특이적으로 하이브리드화되고 CELA2A 또는 CELA3B 서열에 하이브리드화되지 않는다.
일부 구현예에서, 상기 CELA3A, CELA1, 또는 카텝신 C 억제제는 폴리뉴클레오타이드이며, 폴리뉴클레오타이드 제제는 중등도 내지 엄격한 하이브리드화 조건하에 카텝신 C에 특이적으로 하이브리드화되고 카텝신 A, B, D, E, G, H, K, L1, L2, O, S, W 또는 Z에 하이브리드화되지 않는다.
일부 구현예에서, 상기 CELA3A, CELA1, 또는 카텝신 C 억제제는 폴리뉴클레오타이드이며, 폴리뉴클레오타이드 제제는 서열번호 1에 기재된 바와 같은 핵산 서열의 폴리뉴클레오타이드와 적어도 95 % 동일성을 공유한다. 일부 구현예에서, 상기 CELA3A, CELA1, 또는 카텝신 C 억제제는 폴리뉴클레오타이드이며, 폴리뉴클레오타이드 제제는 서열번호 2에 기재된 바와 같은 핵산 서열의 폴리뉴클레오타이드와 적어도 95 % 동일성을 공유한다. 일부 구현예에서, 상기 CELA3A, CELA1, 또는 카텝신 C 억제제는 폴리뉴클레오타이드이며, 폴리뉴클레오타이드 제제는 서열번호 3에 기재된 바와 같은 핵산 서열의 폴리뉴클레오타이드와 적어도 95 % 동일성을 공유한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 임의의 폴리뉴클레오타이드 억제제를 포함하는 핵산 작제물을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 CELA3A, CELA1, 또는 카텝신 C 억제제를 제공하며, 여기서, 상기 제제는 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22 및 서열번호 23으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하고 이의 기능을 억제 또는 예방하는 항체이다.
본 발명의 일부 구현예에 따라, 고친화성 결합 분자는 당업자에 의해 인식되는 바와 같이 Fab 또는 scFv 단편을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
본 발명은 세포의 괴사 및 이와 관련된 질환을 치료 및 예방하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 특히 낮은 농도에서의 세포 괴사를 억제하는 것으로 밝혀진 특정 소형 억제 분자의 괴사의 예방 및 치료를 위한 용도에 관한 것이다. 분자 리스트에는 다양한 화학 계열에 속하는 소형 억제 화합물, 예를 들어, 2-아미노이미다졸린, 2-아미노티아졸린 및 이속사졸이 포함된다. 본 발명은 또한 세포 괴사와 관련된 질환 또는 의학적 병태의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 다양한 소분자 억제제를 제공한다. 추가의 구현예에서, 세포 괴사와 관련된 질환 또는 의학적 병태의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에서 소분자 억제제의 용도가 제공된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 세포 괴사의 치료, 폐지, 억제 또는 예방을 위한 본원에 기재된 임의의 화합물의 용도, 또는 임의의 카텝신 C, CELA1, CELA3 또는 구조적으로 이에 관련된 효소의 용도를 고려한다. 일부 구현예에서, 괴사를 겪는 세포는 뇌 세포, 뉴런 세포, 퍼킨제 세포, 해마 추상 세포, 신경교 세포, 심근 세포, 근세포, 각질형성 세포, 표피 세포, 골 또는 연골 세포, 췌장 세포, 심장 세포, 근세포, 간 세포, 호흡 세포 또는 폐 세포, 간세포, 신장 세포, 위장 세포, 비장 세포, 조혈 세포, 림프구, 대식세포, 흉선 세포, 섬유아세포, 상피 세포, 조직질실 세포, 기관지 상피 세포, 신세뇨관 세포, 사구체 모세혈관 세포, 및 폐 상피 세포, 및 줄기 세포, 생식선 세포, 정자, 난자, 수정란, 배아 세포, 줄기 세포 및 망막 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 세포 또는 조직 괴사와 관련된 질환 또는 병태의 치료, 폐지, 억제 또는 예방을 위한 본원에 기재된 바와 같은 임의의 화합물의 용도 또는 임의의 CELA3A, CELA1 또는 카텝신 C 억제제의 용도를 고려한다. 일부 구현예에서, 상기 질환 또는 의학적 병태는 신경퇴행성 질환, 예를 들어, 치매, 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 다발성 경화증 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 황반변성, 연령-관련 황반변성 (AMD), 급성 망막 괴사 (ARN), 진행성 외망막 괴사, 근위축증, 백혈병, 림프종, 신생아 호흡곤란 증후군, 질식, 감돈 탈장, 진성 당뇨병, 결핵, 자궁내막증, 혈관 이상증, 건선, 한냉 손상, 철-부하 합병증, 스테로이드 치료의 합병증, 허혈성 심질환, 심근경색증, 재관류 손상, 뇌혈관 질환 또는 손상, 예를 들어, 뇌졸중 또는 외상성 뇌 손상, 괴저, 욕창, 췌장염, 중증 급성 췌장염, 간염, 만성 간염, 경화증, 혈색소뇨증, 세균 패혈증, 바이러스성 패혈증, 화상, 고체온증, 크론병, 셀리악병, 구획 증후군, 괴사성 직장염, 스티븐-존슨 증후군 (SJS), 독성 표피 괴사 (TEN), 낭포성 섬유증, 류마티스 관절염, 골수염, 괴사성 근막염, 신독성, 척수 손상, 사구체신염, 급성 세뇨관 괴사, 신피질 괴사, 퇴행성 관절염, 타이로신혈증, 다발성 경화증, 선천성 미토콘드리아병, 대사성 유전 질환, 마이크로플라즈마 질환, 탄저 감염, 세균 감염, 바이러스성 감염, 에볼라 감염, 앤더슨병, 선천성 미토콘드리아병, 페닐케톤뇨증, 태반 경색증, 매독, 무균성 괴사, 무혈성 괴사, 알콜 중독, 코카인, 약물, 예를 들어, 파라세타몰 또는 독소루비신과의 투여 및/또는 자가 투여 및/또는 이로의 노출과 관련된 괴사; 화학 독소, 농약, 중금속, 전쟁 유기인산염, 또는 거미 또는 뱀 독; 피부 필러 투여와 관련된 괴사; 이소성 약물 투여, 예를 들어, 덱스트로스 용액의 혈관외유출, 화학요법 약물과 관련된 괴사; 화학요법-유도된 괴사, 방사선 유도된 괴사, 이식 조직 유지 및 노화로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 피부의 외관 또는 질을 개선시키기 위한 본원에 기재된 바와 같은 임의의 화합물의 용도, 또는 카텝신 C 억제제, CELA1, CELA3A 또는 구조적으로 이에 관련된 효소의 임의의 억제제의 용도를 고려하고, 일부 구현예에서 본원에 기재된 바와 같은 화합물 및 제제가 고려된다.
또한, 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체 및 본원에 기재된 바와 같은 치료학적 유효량의 화합물 또는 본원에 기재된 바와 같은 임의의 카텝신 C 억제제, CELA1, CELA3A 또는 구조적으로 이에 관련된 효소를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 임의의 카텝신 C 억제제, CELA1, CELA3A 또는 구조적으로 이에 관련된 효소는 Kd 10-7 M 이하의 최소 친화력으로 CELA3A, CELA1, 또는 카텝신 C 또는 이들의 조합에 결합할 것이며, CELA3A, CELA1, 또는 카텝신 C에 대한 최소 결합 친화력과 비교하여 적어도 10배 높은 Kd의 최소 친화력으로 CELA2A 및/또는 CELA3B, 및/또는 카텝신 A, B, D, E, G, H, K, L1, L2, O, S, W 또는 Z에 결합할 것이다.
일부 구현예에서, 이러한 억제제는 Kd 10-7 M 이하의 최소 친화력으로 CELA3B 및/또는 OCIAD1에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 이 양태에 따라, 상기 억제제는 서열번호 3에 기재된 것과 적어도 95 %의 동일성을 공유하는 서열을 가질 것이다.
일부 구현예에서, 상기 억제제는 상기 기재된 바와 같은 최소 친화력을 갖는CELA2A 및/또는 카텝신 A, B, D, E, G, H, K, L1, L2, O, S, W 또는 Z에 대한 결합보다 높은 친화력으로 CELA3B 및/또는 OCIAD1에 결합 할 수 있다. 일부 구현예에서, 이 양태에 따라, 상기 억제제는 서열번호 3에 기재된 것과 적어도 95 %의 동일성을 공유하는 서열을 가질 것이다.
일부 양태에서, 본 발명은 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 본원에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드에 대한 보존적 치환을 고려한다.
일부 추가의 구현예에서, 이를 필요로 하는 대상체에서 세포 괴사와 관련된 의학적 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 적절하게 이의 유사체, 유도체, 단편, 이성체 또는 염을 포함하는 치료학적 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 임의의 제제 또는 화합물을 대상체에게 투여함을 포함한다. 추가의 바람직한 구현예에서, 대상체는 인간 또는 비-인간 포유동물이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 제제 또는 화합물은 세포가 괴사의 초기 단계일 때 효과적이다. 일부 추가의 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 제제 또는 화합물은 세포가 괴사 신호에 노출되었을 때 활성이다.
추가의 구현예에 따라, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 노화를 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 상기 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 임의의 제제 또는 화합물 또는 이의 임의의 조합을 투여하는 단계; 및 (b) 상기 대상체에게 항-노화제를 투여하여 노화를 치료 및/또는 예방하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따라, 상기 세포는 괴사성 세포이다.
본 발명의 일부 구현예에 따라, 상기 방법은 상기 대상체에게 카스파제 억제제와 같은 항-아폽토시스제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따라, 상기 항-아폽토시스제는 본원에 기재된 바와 같은 제제 또는 화합물의 투여 전에, 투여와 동시에 또는 투여 후에 투여된다. 본 발명의 일부 구현예에 따라, 상기 방법은 생체내에서 수행된다.
본 발명의 일부 구현예에 따라, 상기 약제학적 조성물은 세포막을 관통하도록 제형화된다. 본 발명의 일부 구현예에 따라, 상기 약제학적 조성물은 지질 소포체를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따라, 상기 항-노화제는 항산화제, 피토케미컬, 호르몬, 메트포르민 및 지방산으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 추가의 양태에 따라, 본 발명은 괴사의 예방 및/또는 유도 억제를 통해 장기, 조직 및 세포의 기능적 완전성을 저장 및 보존하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다.
일부 양태에서, 본 발명은 심장, 신장, 간, 피부, 폐 및 다른 장기 및 조직의 이식 또는 재이식을 포함하는, 이식 전에 보존이 필요한 인간, 인간-호환 또는 비-인간 수거된 기관, 조직 또는 세포를 보존하기 위한 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 소생술 후에 수거된 장기의 개선된 보존을 위한 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 보존 기간 동안 대안적인 지리적 위치로 이를 보다 효율적으로 운송하는 것을 가능하게 한다. 또한, 본 발명은 예를 들어, 해동 후 보존에 더하여 세포의 회복 과정 동안에 세포 생존력을 개선시키기 위한 방법 및 이식 전의 기간 평가 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 이들의 유지, 보존 및 이식 동안에 재생 관련 세포, 즉, 생식선 세포, 정자, 난자, 수정란 및/또는 배아 세포를 보존 및 유지하기 위한 방법을 제공한다.
하나의 구현예에서, 생물학적 조직을 보존하기 위한 조성물은 생리학적 염 용액, ATP 생성용 기질 및 본원에 개시된 바와 같은 억제제들 중 하나를 포함하며, 이에 의해 세포의 괴사를 예방 또는 억제한다. 임의로, ATP 생성용 기질은 포스포크레아틴, 크레아틴 에틸 에스테르, 크레아틴 말레이트, 크레아틴 글루코네이트, 프룩토스, 수크로스, 리보스, 헥소오스 또는 펜토오스이다. 대안적으로, ATP 생성용 기질은 크레아틴 오로테이트, 크레아틴 일수화물, 아데노신 또는 덱스트로스/글루코오스이다.
일부 구현예에서 본원에 기재된 바와 같은 제제 또는 화합물은 당업계에서 이해된 바와 같은 소분자이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 제제 또는 화합물은 안티센스, siRNA, 마이크로RNA, 리보자임 및 DNAzyme로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 제제이다. 종종 상기 폴리뉴클레오타이드 제제는 본원에 제공된 본 발명의 한 구현예에 따라 세포의 괴사를 예방 또는 억제하는 방법으로, 상기 방법은 괴사 신호에 노출된 세포에 세포내 CELA3, CELA1 및/또는 카텝신 C 중 적어도 하나의 발현을 특이적으로 하향조절 및/또는 활성을 억제하는 제제를 치료학적 유효량으로 투여하여, 세포 괴사를 예방 또는 억제하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 제제 또는 화합물은 CELA3B보다 CELA3A에 대해 더 큰 특이성을 갖지만, 당업자는 이의 활성을 특이적으로 억제하는 것으로 정의된 것과 같은 화합물 및/또는 제제와 특이적으로 상호작용하는 것으로 정의된 제제를 포함하여, 어느 하나 또는 둘 모두의 표적의 억제가 본 발명의 일부를 포함하는 것으로 이해할 것이다.
특히 바람직한 구현예에서, 세포의 괴사를 예방 또는 억제하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 괴사 신호에 노출된 세포에 CELA3 및 CELA3B를 포함하는 CELA3의 발현을 특이적으로 하향조절하고 대안적으로 또는 추가로 활성을 억제하는 치료학적 유효량의 제제를 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 추가의 구현예에 따라, 이를 필요로 하는 대상체에서 세포 괴사와 관련된 의학적 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 세포내 카텝신 C, CELA1, CELA3A 또는 구조적으로 이에 관련된 효소 중 적어도 하나의 발현을 특이적으로 하향조절하고 대안적으로 또는 추가로 활성을 억제하는 치료학적 유효량의 약물을 대상체에게 투여함을 포함하고, 이는 일부 구현예에서, CELA3A의 억제보다 덜 최적의 활성을 제공할 수 있지만, 그럼에도 불구하고 발현 및/또는 활성에 영향을 주는 대상체의 세포에서, 예를 들어, 일부 구현예에서 CELA3B이 유용하여 세포 괴사와 관련된 증상을 치료한다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 또한 중등도 내지 엄격한 하이브리드화 조건하에 CELA3A 및/또는 CELA1에 특이적으로 하이브리드화되지만 CELA2A에는 하이브리드화되지 않거나 CELA3B에 덜 최적으로 하이브리드화되는 단리 된 폴리뉴클레오타이드의 용도에 관한 것이다.
특히 바람직한 구현예에서, 상기 단리된 폴리뉴클레오타이드는 CELA3A에 특이적으로 하이브리드화된다.
특히 바람직한 구현예에서, 본 발명은 세포내 카텝신 C, CELA1, CELA3A 또는 구조적으로 이에 관련된 효소 중 적어도 하나를 특이적으로 억제하는 소형 분자의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 일부 구현예의 한 양태에 따라, 소형 분자는 Kd 10-7 M 이하의 최소 친화력으로 세포내 카텝신 C, CELA1, CELA3A 또는 구조적으로 이에 관련된 효소 중 적어도 하나에 특이적으로 결합하고, 적어도 10배 높은 Kd의 최소 친화력으로 CELA2A 및/또는 CELA3B 및/또는 카텝신 A, B, D, E, G, H, K, L1, L2, O, S, W 또는 Z에 결합한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 제제 또는 화합물은 중등도 내지 엄격한 하이브리드화 조건하에 CELA3A보다 CELA3B에 덜 친화력으로 결합하지만, 본원에 기재된 바와 같은 제제 또는 화합물은 CELA2A 및/또는 카텝신 A, B, D, E, G, H, K, L1, L2, O, S, W 또는 Z보다 더 큰 친화력으로 CELA3B에 결합한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따라, 세포내 카텝신 C, CELA1, CELA3A 또는 구조적으로 이에 관련된 효소 중 적어도 하나의 폴딩된 아미노산 서열로 구성된 적어도 하나의 도메인에 결합하는 고친화성 분자가 본원에 제공된다.
본 발명의 일부 구현예에 따라, Kd 10-7 M 미만의 최소 친화력으로 CELA3A 및 CELA1에 결합하지만 적어도 10배 높은 Kd의 최소 친화력으로 CELA2A 또는 CELA3B에 결합하는 항체가 제공된다.
본 발명의 일부 구현예에 따라, Kd 10-7 M 미만의 최소 친화력으로 카텝신 C에 결합하지만 적어도 10배 높은 Kd의 최소 친화력으로 카텝신 A, B, D, E, G, H, K, L1, L2, O, S, W 또는 Z에 결합하는 항체가 제공된다.
본 발명의 일부 구현예에 따라, 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오타이드, 본 발명의 고친화성 분자 또는 본 발명의 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 일부 구현예에 따라, 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오타이드, 항-아폽토시스제 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 포함하는 벡터, 접합체, 리포좀 또는 담체 및 이를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 일부 구현예의 양태에 따라, 이를 필요로 하는 대상체에서 노화를 치료 및/또는 예방하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) 상기 대상체에게 상기 대상체의 세포에서 세포내 카텝신 C, CELA1, CELA3A 또는 구조적으로 이에 관련된 효소 중 하나 이상의 발현을 특이적으로 하향조절하고 대안적으로 또는 추가로 활성을 억제하는 제제를 투여하는 단계; 및 (b) 상기 대상체에게 항-노화제를 투여하여 노화를 치료 및/또는 예방하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따라, 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오타이드, 항-노화제 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 일부 구현예에 따라, 본 발명의 화합물, 제제, 조성물, 용도 및 방법은 괴사성 신호를 겪었던 임의의 세포에 적용될 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에 따라, 상기 제제의 양은 세포 괴사가 세포 아폽토시스로 전환되도록 선택된다.
본 발명의 일부 구현예에 따라, 상기 방법은 대상체에게 항-아폽토시스제를 투여함을 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따라, 상기 항-아폽토시스제는 -[R]-N-[2-헵틸]-메틸프로파르길아민 (R-2HMP), 비타민 E, 비타민 D, 카스파제 억제제, 항아폽토시스 단백질을 하향조절하는 제제 및 친수성 담즙염 우르소데옥시콜산으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 일부 구현예에 따라, 상기 항-아폽토시스제는 카텝신 C, CELA1, CELA3A 또는 구조적으로 이에 관련된 효소의 발현을 특이적으로 하향조절하고 대안적으로 또는 추가로 활성을 억제하는 제제의 투여 전에, 투여와 동시에 또는 투여 후에 투여된다. 여기서, 일부 구현예에서 활성은 CELA3B보다 CELA3A가 더 선호될 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에 따라, 상기 방법은 생체내에서 수행된다.
본 발명은 또한 시험관내에서 괴사에 대한 보호를 제공하기 위해 세포내 CELA3A 또는 구조적으로 유사한 효소, CELA1 및/또는 카텝신 C 중 적어도 하나의 억제 방법에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 화학식 VI의 구조를 특징으로 하는 화합물을 제공한다.
화학식 VI
Figure pct00007
여기서, G1은 임의로 치환된 NH-피롤리딘, 임의로 치환된 NH-피페리딘, 임의로 치환된 NH-피페라진, 임의로 치환된 NH-이미다졸리딘, 임의로 치환된 NH-피라졸리딘, 임의로 치환된 NH-아릴, 임의로 치환된 NH-사이클로알킬, 임의로 치환된 피롤리딘, 임의로 치환된 피페리딘, 임의로 치환된 피페리딘, 임의로 치환된 피페라진, 임의로 치환된 이미다졸리딘, 또는 임의로 치환된 피라졸리딘이고;
G2는 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 사이클로알킬 또는 임의로 치환된 헤테로사이클이고;
여기서, G1이 비치환된 피롤리딘인 경우, G2는 알킬, 사이클로펜틸, 알킬사이클로펜틸 또는 푸란이 아니거나;
G1이 피페리딘인 경우, G2는 알킬이 아니며;
G1이 피페라진인 경우, G2는 알킬 또는 푸란이 아니다.
일부 구현예에서, G1은 피롤리딘이고 G2는 에틸 또는 푸란이다. 일부 구현예에서, G1은 치환된 피페라진이고 G2는 푸란 또는 페닐이고, 일부 구현예에서, G1은 피페리딘이고 G2는 사이클로펜틸, 푸란 또는 페닐이다. 일부 구현예에서, G1은 임의로 치환된 이미다졸리딘 또는 임의로 치환된 피라졸리딘이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 화학식 VII의 구조를 특징으로 하는 화합물을 제공한다.
화학식 VII
Figure pct00008
여기서, G1은 임의로 치환된 NH-피롤리딘, 임의로 치환된 NH-피페리딘, 임의로 치환된 NH-피페라진, 임의로 치환된 NH-이미다졸리딘, 임의로 치환된 NH-피라졸리딘, 임의로 치환된 NH-피리딘, 임의로 치환된 NH-아릴, 임의로 치환된 NH-사이클로알킬, 임의로 치환된 피롤리딘, 임의로 치환된 피페리딘, 임의로 치환된 피페리딘, 임의로 치환된 피페라진, 임의로 치환된 이미다졸리딘, 임의로 치환된 피라졸리딘 또는 임의로 치환된 아릴이고;
G2는
Figure pct00009
또는 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 아릴 또는 임의로 치환된 사이클로알킬이고;
G4는 임의로 치환된 피롤리딘, 임의로 치환된 피페리딘, 임의로 치환된 피페라진, 임의로 치환된 이미다졸리딘 또는 임의로 치환된 피라졸리딘이며;
여기서, G1이 피페리딘인 경우, G4는 피롤리딘이 아니거나 G2는 임의로 치환된 아릴이 아니거나;
G1이 이미다졸리딘인 경우, G2는 임의로 치환된 아릴이 아니거나;
G1이 임의로 치환된 NH-피리딘인 경우, G2는 임의로 치환된 아릴이 아니거나;
G1이 임의로 치환된 NH-아릴인 경우, G2는 임의로 치환된 아릴이 아니거나;
G1이 임의로 치환된 피리딘인 경우, G2는 임의로 치환된 아릴이 아니다.
일부 구현예에서, 이 양태에 따라, G1은 임의로 치환된 NH-피리딘이고 G2는
Figure pct00010
(여기서, G4는 피롤리딘이다)이거나 G2는 할로아릴이며, 일부 구현예에서, 이 양태에 따라, G1은 치환된 NH-아릴이고 G2는
Figure pct00011
(여기서, G4는 피롤리딘이다)이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및/또는 과학 용어는 본 발명이 속하는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사한 또는 동등한 방법 및 재료가 본 발명의 구형예를 실시 또는 시험하는데 사용될 수 있지만, 예시적인 방법 및/또는 재료가 하기에 기재된다. 충돌이 있는 경우, 정의를 포함한 특허 명세서를 조정할 것이다. 또한, 재료, 방법 및 실시예는 단지 예시적인 것이며 반드시 제한하려는 것은 아니다.
본 발명의 일부 구현예는 첨부 도면을 참조하여 단지 예시로 본원에 기재된다. 이제 도면의 상세한 설명히 특별히 참조하여, 도시된 세부 사항은 예시이며 본 발명의 구현예의 예시적 논의를 목적으로 한다. 이와 관련하여, 도면과 함께 취해진 설명은 본 발명의 구현예들이 어떻게 실시될 수 있는지를 당업자에게 명백하게 한다.
도면에서:
도 1은 U-937 세포에서 KCN-유도된 세포사의 동역학을 묘사하는 선 그래프이다. 도 1은 KCN 유도된 괴사의 시간 및 용량 반응을 도시한다. 핵 형태는 아 크리딘 오렌지와 브롬화에티듐으로 이중 염색함에 의해 결정되었다.
도 2는 효소적 검정에 의해 평가된 10 mM KCN 처리에 의한 단백질분해 활성의 유도를 나타내는 선 그래프이다. U-937 세포를 KCN으로 상이한 시간 간격으로 처리하였다. 세포 용해물 중의 카텝신 C 및 엘라스타제형 활성은 특정 기질을 사용하여 측정하였다 (하기 본원 실시예 섹션에 상세히 기재된 바와 같음).
도 3은 엘라스타제 억제제 III에 의한 세포에서의 KCN 유도된 엘라스타제형 활성의 용량 의존성 억제를 나타낸다. 30분 동안 10 mM KCN으로 처리한 후 세포 용해물을 제조하였다. 엘라스타제형 활성은 기질 MAAPV를 사용하여 측정하였다. 카텝신 L 억제제 및 E-64d는 엘라스타제형 단백질분해 활성에 영향을 미치지 않았다. 데이터를 나타내지 않았다.
도 4a-b는 상이한 농도의 KCN에 의해 유도된 괴사를 겪는 U-937 세포로부터의 LDH 방출에 대한 CELA1 및 CELA3A에 대한 siRNA에 의한 사일런싱 효과를 나타낸다. 도 4a는 특정 효소에 대한 대조군 siRNA 또는 siRNA로 형질감염시키고 KCN의 존재 또는 부재하에 7시간 동안 처리한 다음, 세포로부터의 LDH 방출을 결정한 세포를 나타내는 막대 그래프이다. 대조군 siRNA를 사용한 형질감염은 그 자체가 어떠한 효과도 없었다. * P <0.001; 도 4b는 적절한 siRNA로의 처리로 인해 특정 단백질의 하향조절을 나타내는 웨스턴 블롯을 나타내는 사진을 도시한다.
도 4c는 KCN에 의해 유도된 괴사를 겪는 PC12 세포로부터의 LDH 방출에 대한 카펩신 C, CELA1 및 CELA3A에 대한 siRNA에 의한 사일런싱 효과를 나타낸다. 특정 효소에 대한 대조군 siRNA 또는 siRNA로 형질감염된 PC12 세포를 글루코스 부재 배지에서 1시간 동안 예비항온처리하고 KCN의 존재 또는 부재하에 5시간 동안 처리하였다. 이후, 세포로부터의 LDH 방출이 결정되었다. * P <0.001.
도 5a-b는 엘라스타제 활성 (도 5a) 및 카텝신 C 활성 (도 5b)에 대한 siRNA의 효과를 나타내는 막대 그래프이다. 카텝신 C, CELA1 또는 CELA3A에 대한 대조군 siRNA 또는 siRNA에 의해 처리된 세포를 30분 동안 10 mM KCN에 노출시켰다. 이어서, 세포를 용해시키고, 특정 비색 기질을 사용하여 용해물에서 카텝린 C 또는 엘라스타제형 활성을 측정하였다.
도 6은 KCN에 의해 유도된 괴사를 겪는 PC12 세포로부터의 LDH 방출에 대한 특정 카텝신 C 억제제의 효과를 나타낸다. 상이한 농도의 카텝신 C 억제제의 존재 또는 부재하에 5시간 동안 상이한 농도의 KCN의 존재 또는 부재하에 세포를 처리한 다음, 세포로부터의 LDH 방출을 결정하였다. 엘라스타제 억제제를 양성 대조군으로서 사용하였다. *P<0.01.
도 7a-b는 괴사를 겪는 PC12 세포에 대한 상이한 엘라스타제 억제제의 보호 효과를 도시하는 막대 그래프이다. 도 7a-b는 각각 상이한 농도의 엘라스타제 억제제 II 또는 III의 존재 또는 부재하에 5시간 동안 KCN의 존재 또는 부재하에 처리된 PC12 세포를 나타낸다. 이어서, 세포로부터의 LDH 방출을 측정하였다; * P <0.05. 도 7c는 48시간까지 KCN-처리된 세포의 구조에서 엘라스타제 억제제 II의 보호 효과를 나타내는 막대 그래프이다. 글루코스 결핍 배지에서 유지된 세포를 엘라스타제 억제제 II의 존재 또는 부재하에 30분 동안 항온처리하였다. 이어서, 세포를 KCN의 존재 또는 부재하에 5시간 동안 처리하였다. 이후, 배지를 전체 DMEM으로 변경하고 24시간 또는 48시간 동안 항온처리하였다. 엘라스타제 억제제 자체는 대조군 세포의 생존에 영향을 미치지 않았다. XTT 방법은 각 지정된 시간에 세포 생존능을 측정하기 위해 사용되었으며 결과는 이들의 각각의 대조군과 비교되었다.
도 8a-b는 엘라스타제 억제제 II 및 III이 생체내 폐쇄성 뇌 손상으로부터 마우스 뇌를 보호하는 것을 나타내는 막대 그래프이다. 외상을 입은 마우스의 뇌에서 (도 8a) 신경성 중증도 스코어 (NSS)에 대한 엘라스타제 억제제 II 및 III의 영향을 정량화하고, 도 8b에 괴사성 부위의 발생을 나타낸다. * P <0.01.
도 9는 아세트아미노펜 (APAP) 투여에 의해 유발된 간 독성에 대한 활성 화합물의 2-아미노티아졸 그룹에 속하는 화합물 Z601-4253 (2-(피페리딘-1-일)티아졸-4-일)(피롤리딘-1-일)메타논의 생체내 보호 효과를 나타낸다. 화합물은 3D 구조 유사성 및 CELA3A 효소의 위상적 유사체 (위상적 유사체)에 기반하여 CELA3A 억제제의 라이브러리를 스크리닝함으로써 발견되었다. 주목할 것은 APAP 투여 후 화합물이 4시간 째에 투여될 때 활성이라는 점이다.
도 10은 상기 기재된 CELA3 억제제의 라이브러리의 스크리닝에 의해 활성이 발견된 2-아미노이미다졸린 시리즈에 속하는 화합물 1-(2-(4-메틸피페라진-1-일)-4,5-디하이드로-1H-이미다졸-1-일)프로판-1-온 (M059-0891)의 보호 효과를 나타낸다. 결과는 마우스에서 심근경색증/재관류 모델에서 이 억제제에 의한 괴사 및 경색 크기의 유의한 감소를 나타낸다.
도 11은 EBI (European Bioinformatics Institute)로부터의 clustalW2 소프트웨어에 의해 결정된 바와 같이, 아미노산 표적 부위 (CELA1은 황색, CELA3A는 녹색으로 표시됨)를 나타내는 엘라스타제 단백질 CELA1 (서열번호 8), CELA2A (서열번호 27), CELA3A (서열번호 10) 및 CELA3B (서열번호 25)의 아미노산 서열의 서열 정렬이다.
본 발명은, 일부 구현예에서, 세포 또는 조직 괴사 및/또는 이에 관련된 질환 및 병태를 치료 및/또는 예방하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이며, 보다 특히, 그러나 전적으로는 아니지만, 세포내 CELA3, 일부 구현예에서 우선적으로 CELA3A 또는 구조적으로 관련된 효소, 또는 일부 구현예에서, CELA1, 또는 일부 구현예에서, 카텝신 C 또는 일부 구현예에서, 이들의 임의의 조합 중 적어도 하나의 발현을 하향조절 및/또는 활성을 억제하는 수단에 의해 세포 또는 조직 괴사를 예방 또는 치료하는 것에 관한 것이다.
놀랍게도, 특정 단백질분해 효소가 괴사의 초기 단계에 특이적으로 관여하고, 이의 또는 둘 다의의 발현을 하향조절하거나 활성을 억제하여 괴사의 예방, 괴사의 치료 또는 이들의 조합을 유도하는 화합물 또는 제제의 정의를 위한 표적으로서 작용할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
디펩티딜 펩티다제 I (DPP-I)로도 알려져 있는 카텝신 C (CTSC)는 리소좀 엑소시스테인 프로테아제이다. 인간에서는 CTSC 유전자에 의해 암호화된다. 카텝신 C는 단백질의 N-말단으로부터 디펩타이드의 절단을 촉매한다. 카텝신 C는 엘라스타 제의 활성제로 알려져 있다 [참조: Turk D. et al, The EMBO Journal (2001) 20 (23): 6570-6582].
CELA1은 키모트립신형 엘라스타제 계열이며 구성원 1이다. 이 유전자는 12번 염색체에 위치한다 (위치 12q13). 예를 들어, 췌장, 위장, 장, 신장, 폐, 배아 조직, 간, 근육, 관절, 뇌, 유선, 비장, 혈액, 혀, 골 및 방광에서 발현된다. CELA3A는 키모트립신형 엘라스타제 계열이며 구성원 3A이다. 이의 유전자는 첫 번째 염색체에 위치한다 (위치 lp36.12). 예를 들어, 췌장, 방광, 간, 전립선, 피부, 흉선, 결합 조직, 뇌 및 혈액에서 발현된다.
놀랍게도, 본원에서, 카텝신 C 또는 CELA1 또는 CELA3, 특히 CELA3A 또는 구조적으로 이에 관련된 효소의 특이적 표적화는, 이의 또는 둘 다의 발현을 하향조절하거나 활성을 억제하는 화합물 또는 제제의 정의의 관점에서, 괴사의 예방, 괴사의 치료 또는 이들의 조합을 초래하는 것으로 밝혀졌다. 놀랍게도, 본 발명의 조성물 및 용도/방법에 유용한 신규한 제제 및 신규한 화합물이 본원에 기재되어 있다.
또한 놀랍게도, 이의 또는 둘 다의 발현을 하향조절하거나 활성을 억제하여 괴사의 예방, 괴사의 치료 또는 이들의 조합을 초래할 수 있는 제제 및 화합물의 부류가 본원에 정의되어 있으며 이로써 기존 화합물은 이미 알려졌을 수도 있지만 이의 치료적 용도는 기재되어 있지 않다.
또한 놀랍게도, 이의 또는 둘 다의 발현을 하향조절하거나 활성을 억제하여 괴사의 예방, 괴사의 치료 또는 이들의 조합을 초래할 수 있는 제제 및 화합물의 부류가 본원에 정의되어 있으며 이로써 기존 화합물은 이미 알려졌을 수도 있거나 치료적 용도 그 자체는 이미 알려졌을 수도 있지만 세포 또는 조직 괴사 또는 이에 관련된 질병의 예방, 폐지, 발병률 감소 또는 치료에 있어서의 이의 특정 용도는 알려져 있지 않다.
본 발명의 원리 및 작업은 도면 및 첨부된 설명을 참조하여 더 잘 이해될 있다.
본 발명의 적어도 하나의 구현예를 상세하게 설명하기 전에, 본 발명은 그 적용에 있어서 이하 설명에서 설명되거나 실시예에 의해 예시된 세부 사항으로 반드시 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 본 발명은 다른 구현예가 가능하거나 다양한 방법으로 실시되거나 수행될 수 있다. 또한, 본원에 사용된 어법 및 용어는 설명의 목적을 위한 것이며 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다는 것을 이해해야 한다.
심근경색증, 뇌 손상, 뇌졸중, 간경화증 및 많은 다른 질환 및 병태가 세포사의 괴사 형태와 관련이 있다.
본 발명을 실시하는 것을 감소시키면서, 본 발명자들은 카텝신 C, CELA1 및 특히 CELA3A 또는 구조적으로 이에 관련된 효소 또는 효소들이 괴사성 세포 반응을 조절하는 세포 표적이고, 특히 괴사-유발 세포사로부터 세포를 보호하기 위해 이의하향조절 또는 억제가 사용될 수 있음을 밝혀냈다.
하기 및 하기 실시예 섹션에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 세포 괴사가 세포내 엘라스타제의 활성화를 유도한다는 것을 밝혀냈다 (도 2a-b 및 3 참조). 또한, 세포내 CELA3A, CELA1, 및/또는 카텝신 C 중 적어도 하나의 발현을 특이적으로 하향조절하는 RNA 사이런싱제는 세포사의 괴사 형태를 방지한다 (도 4a-b 참조). 또한, 특정 siRNA (각각 서열번호 1-3)에 의한 이들 표적의 억제는 특정 방식으로 표적 세포에서 카텝신 C 효소 활성 또는 CELA1/CELA3A 엘라스타제형 활성의 억제를 초래하였다 (도 5a-b 참조). 또한, 마우스 및 래트에서의 폐쇄성 뇌 손상 (외상) 모델 (도 8a-b 참조), 마우스에서의 APAP-유도된 간 독성 모델 (도 9) 및 마우스에서의 심근허혈/재관류 모델 (도 10)을 사용하여 생체내에서 뇌 세포 괴사 손상을 방지하기 위한 엘라스타제 억제제의 능력을 나타내었다. 종합하면, 이러한 결과는 괴사 유도된 세포사의 치료 또는 예방을 위한 세포내 CELA3A 또는 구조적으로 관련된 효소, CELA1 및/또는 카펩신 C 중 적어도 하나에 대한 하향조절제 또는 억제제의 용도를 입증한다. 또한, 괴사 과정의 주요 표적으로서 CELA3A 또는 구조적으로 관련 효소 및 선택적으로 CELA1의 동정은 다른 엘라스타제의 효소 활성을 방해하지 않는 특정 엘라스타제 억제제의 설계를 허용한다. 또한, 괴사 과정의 주요 표적으로 CELA3A 또는 구조적으로 관련된 효소 및 임의로 CELA1의 동정은 다른 엘라스타제의 효소 활성을 방해하지 않는 특정 엘라 스타제 억제제의 디자인을 허용한다.
따라서, 본 발명의 한 양태에 따라, 세포의 괴사를 예방 또는 억제하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 괴사 신호에 노출된 세포에 세포내 CELA3A 또는 구조적으로 관련된 효소, CELA1 및/또는 카텝신 C 중 적어도 하나의 발현을 특이적으로 하향조절하고 대안적으로 또는 추가로 활성을 억제하는 치료학적 유효량의 제제를 투여하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 "괴사"라는 문구는, 살아있는 조직에서의 조기 세포사를 언급한다. 괴사는 전형적으로 세포막 및 세포소기관 파괴, 세포 팽창, 미토콘드리아 장애에 이어 세포 용해 및 궁극적으로 세포사를 특징으로 하는 병리학적 과정이다. 또한, 세포 용해는 전형적으로 염증 반응을 동반하고 염증은 괴사를 증가시킬 수 있다.
괴사 유도된 세포사는 예를 들어,CytoTox 96® 비-방사성 세포 독성 분석 (Promega, WI, USA)에 의해, LDH 세포독성 분석 키트 (Cayman, MI)에 의해, 아크리딘 오렌지/브롬화에티듐에 의한 염색에 의해 및 형광 현미경 또는 FACS (예를 들어, 생체 염색 H0342를 사용)에 의한 분석을 포함하여 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 분석될 수 있으며 하기 본원 실시예 섹션의 추가의 설명을 참조한다.
본 발명의 일부 구현예에 따라, 괴사는 다양한 의학적 병태/질환과 관련될 수 있으며, 이들 각각은 본 발명의 일부 구현예에 따라 고려되는 치료학적 표적이다. 이러한 의학적 병태/질환의 예는 감염, 독소, 독, 방사선, 물리적 외상, 염증, 영양소 또는 산소 공급 부족, 화학적 불균형, 혈액 공급의 중단, 세포 또는 조직 사멸로 유도하는 다른 조건들 또는 상기의 둘 이상의 조합을 포함하지만, 이로써 제한되지 않는다. 구체적인 구현예에서, 조직 괴사는 이식 및/또는 이식 동안에 조직의 열악한 보존과 관련될 수 있다. 예를 들어, 세포 또는 조직 괴사는 다은 병태 중 어느 하나 이상과 관련될 수 있다: 부스럼, 학질, 빈혈, 관절강직, 무산소증, 무호흡증, 관절염, 질식, 천식, 운동실조, 위축증, 요통, 출혈, 농루, 악액질, 카리에스, 산통, 변비, 경련, 기침, 청색증, 설사, 어지럼증, 수종, 건선 괴저, 이질, 소화불량, 호흡장애, 부종, 쇠약, 기절, 피로, 열, 섬유성연축, 가스 괴저, 유전병, 고혈압, 수종, 고혈압, 저혈압, 황달, 소화불량, 염증, 불면증, 소양증, 황달, 저혈압, 요통, 소모증, 습성 괴저, 노마, 통증, 마비, 소양증, 발진, 점막 분비물, 경화증, 발작, 쇼크, 피부 발진, 상처 (sore), 경련, 탈저 (sphacelation), 쇠약, 빈맥, 치아 우식증, 종양, 배탈, 현기증 또는 구토.
괴사는 살아있는 세포 그룹에 국한될 수 있거나 하나 이상의 조직 영역 (예를 들어, 괴사 조직)에 퍼질수 있음을 인식할 수 있다.
용어 "조직"은 기능 또는 기능들을 수행하도록 디자인된 세포로 이루어진 유기체의 일부를 언급한다. 전형적으로 고형 조직은 혈관화된다. 예로는 뇌 조직, 망막, 피부 조직, 간 조직, 췌장 조직, 골 조직, 연골 조직, 결합 조직, 혈액 조직, 근육 조직, 심장 조직, 뇌 조직, 혈관 조직, 신장 조직, 폐 조직, 생식 조직, 조혈 조직을 포함하지만, 이로써 제한되지 않는다.
전형적으로, 세포는 세포외 환경으로부터 괴사 신호를 받은 후 괴사를 겪지만 배타적이지는 않다. 상기 언급된 조건 중 어느 하나, 예를 들어, 산소, 독, 독소 등이 부족하여 세포의 괴사를 유발하는 과정을 시작할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "괴사성 세포" 또는 "괴사화 세포"는 괴사성 신호를 받고 괴사와 관련된 적어도 하나의 표현형을 나타내는 임의의 유형의 세포를 포함한다 (상기 기재된 바와 같음).
본 발명의 교시에 따른 세포는, 예를 들어, 뇌 세포, 뉴런, 심장 세포, 근세포, 피부 세포, 골 세포, 췌장 세포, 간 세포, 신장 세포, 장 세포, 호흡 세포, 폐 세포, 림프구 또는 단핵구 또는 본원에 기재된 바와 같은 임의의 영향을 받은 세포를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "괴사성 세포"는 추가로 괴사의 임의의 단계에서 세포에 관한 것이다. 따라서, 세포는 괴사의 초기 단계 (예를 들어, 세포 팽창 또는 미토콘드리아 손상을 겪음)일 수 있거나 또는 세포사의 최종 단계 (예를 들어, 세포 용해를 겪음)일 수 있다.
본원에 사용된 "억제하는" 또는 "치료하는"이란 문구는 괴사의 유해한 효과를 감소, 경화, 역전, 약화, 완화, 최소화, 억제 또는 정지시키는 것을 언급한다.
일부 양태에서, 세포 또는 조직 괴사와 관련된 질환의 예방을 언급할 때, 이러한 언급은 인구 수준에서 질환 발병의 감소에 관한 것이다. 일부 양태에서, 이러한 언급은 재발 또는 재발성 질환을 앓고 있는 환자에 관한 것이며, 이러한 환자에서 이전에 발생한 것과 같은 완전한 증상, 병인 또는 질환 중증도를 나타내지 않는 것이 진정한 예방의 지표로서 역할을 할 수 있다.
일부 양태에서, 세포 또는 조직 수준에서 괴사의 예방을 언급하는 경우, 전형적으로 괴사와 관련된 전형적인 마커 또는 조직병리학적 증거 또는 분비된 신호의 명백한 감소를 언급할 수 있다.
일 구현예에 따라, 세포 또는 조직의 괴사의 치료 또는 억제는, 본 발명의 제제로 처리되지 않았지만 그렇지 않은 경우 처리된 세포/조직과 동일한 괴사성 신호를 겪는 동일한 유형의 대조적 괴사성 세포/조직과 비교하여, 괴사를 적어도 약 10 %까지, 적어도 약 20 %까지, 적어도 약 30 %까지, 적어도 약 40 %까지, 적어도 약 50 %까지, 적어도 약 60 %까지, 적어도 약 70 %까지, 적어도 약 80 %까지, 적어도 약 90 %까지 또는 적어도 약 100 %까지 감소시킬 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 양태의 방법은 괴사 신호에 노출된 세포에 세포내 CELA3A, 또는 조적으로 관련된 효소, CELA1, 및/또는 카텝신 C 중 적어도 하나의 발현을 특이적으로 하향조절하고 대안적으로 또는 추가로 활성을 억제하는 제제를 투여함으로써 수행된다.
본원에 사용된 "특이적으로"는 세포내 CELA3A 또는 구조적으로 유사한 효소, CELA1 및/또는 카텝신 C 중 적어도 하나의 발현을 하향조절 및/또는 활성을 억제하지만 세포내 임의의 다른 단백질의 활성 또는 발현을 실질적으로 방해하지 않는 것을 언급한다 (즉, 세포내 CELA3A, CELA1, 및/또는 카텝신 C 중 적어도 하나가 아닌 세포 구성요소의 활성 또는 발현이 10, 15, 20, 25, 30 % 미만 감소). 특이적이란, 본 발명의 교시는 또한 세포내 CELA3A, CELA1 및/또는 카텝신 C 중 적어도 하나, 이들 중 둘 (예를 들어, CELA3A 및 CELA1C) 또는 이들 모두의 발현을 하향조절 및/또는 활성을 억제하는 단일 제제의 능력을 언급한다.
본원에 사용된 "하향조절" 또는 "억제"는 세포내 카텝신 C, CELA1, CELA3A 또는 구조적으로 이에 관련된 효소 단백질 중 적어도 하나의 발현 또는 활성을 감소, 저하, 약화, 완화, 최소화, 억제 또는 중지를 언급하기 위해 상호교환적으로 사용될 수 있다. 일 구현예에 따라, 세포내 카텝신 C, CELA1, CELA3A 또는 구조적으로 이에 관련된 효소 단백질 중 적어도 하나의 발현의 하향조절 및/또는 활성의 억제는, 본 발명의 제제로 처리되지 않았지만 그렇지 않은 경우 동일한 조건이 적용되는 세포내 CELA3A, CELA1, 및/또는 카텝신 C 단백질 중 적어도 하나의 대조군과 비교하여, 적어도 약 5 %까지, 적어도 약 10 %까지, 적어도 약 20 %까지, 적어도 약 30 %까지, 적어도 약 40 %까지, 적어도 약 50 %까지, 적어도 약 60 %까지, 적어도 약 70 %까지, 적어도 약 80 %까지, 적어도 약 90 %까지 또는 적어도 약 100 %까지이다.
본원에 사용된 용어 "발현"은 단백질 발현 또는 mRNA 발현을 언급한다.
본원에 사용된 "세포내 카텝신 C, CELA1, CELA3A 또는 구조적으로 이에 관련된 효소 중 적어도 하나의 활성"이라는 문구는 생물학적 활성, 예를 들어, 이의 효소 활성을 언급한다. 일 구현예에 따라, CELA3A 및/또는 CELA1의 활성은 이의 세린 프로테아제 활성 (예를 들어, 엘라스틴과 같은 단백질을 가수분해하는 엘라스타 제 활성)을 언급한다. 또 다른 구현예에 따라, 카텝신 C의 활성은 (예를 들어, 세린 프로테이나제의 활성화에서) 이의 리소좀 시스테인 프로테이나제 활성을 언급한다.
카텝신 C, CELA1, CELA3A 또는 구조적으로 이에 관련된 효소 발현 또는 활성 (예를 들어, 이의 하향조절)의 수준을 평가하는 것은 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 세포내 카텝신 C, CELA1, CELA3A 또는 구조적으로 이에 관련된 효소 중 적어도 하나의 단백질 수준을 측정하는 것은 예를 들어, 효소-결합 면역흡착 (ELISA) 분석, 면역형광 (IF) 분석 또는 화학발광 면역 분석 (CLIA) 분석 (예를 들어, Uscn, 오리진 (OriGene) 또는 시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich)로부터 구입가능)을 사용하여 수행될 수 있다. 이것은 효소 분석과 결합될 수 있다. mRNA 발현 수준은 예를 들어, 노던 블롯 (Northern blot) 분석 또는 RT-qPCR을 사용하여 수행될 수 있다. 본 발명의 교시에 따라 사용될 수 있는 CELA1 및/또는 CELA3A 활성 분석은 예를 들어, 엘만 엘라스타제 분석법 (Ellman Esterase Assay) (참조: Ellman, GL, et al, Biochem. Pharmacol. 7, 88-95, 1961) 또는 유동 주입 분석법 (FIA)에 의한 에스테라제 활성 분석 [참조: Joga et al., Biotechnology Letters (2201) 23(12): 943-948]을 포함한다. 본 발명의 교시에 따라 사용될 수 있는 카텝신 C 활성 분석은 CTSC 분석 키트 (예를 들어, Uscn Life Science Inc.로부터 구입가능)를 포함한다.
따라서, 예를 들어, 본원의 하기 실시예 3에서 보다 상세하게 기재된 바와 같이, 엘라스타제형 활성은 기질 (시그마)로서 사용된 N-메톡시석시닐-Ala-Ala-Pro-Val p-니트로아닐라이드 (MAAPV)를 사용한 ELISA에 의해 측정될 수 있는 반면, 카텝신 C형 활성은 기질 (시그마)로서 사용된 Gly-Phe p-니트로아닐라이드를 사용하여 ELISA에 의해 측정될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "카텝신 C"는 디펩티딜 펩티다제 I (DPP-1) 또는 카텝신 C (CTSC)로도 명명되는 펩티다제 CI 계열에 속하는 리소좀 엑소시스테인 프로테아제에 관한 것이고, 예를 들어, NP_001107645.1 (서열번호 6)에 기재된 바와 같다.
본원에 사용된 용어 "CELA1"은 엘라스타제-1 (ELA1)로도 공지된 효소 키모 트립신형 엘라스타제 계열 구성원 1 (CELA1)에 관한 것이고, 예를 들어, NP_001962.3 (서열번호 8)에 기재된 바와 같다.
본원에 사용된 용어 "CELA3A"는 엘라스타제 계열 구성원 3A로도 공지된 효소 키모트립신형 엘라스타제 계열 구성원 3A에 관한 것이고, 예를 들어, NP_005738.4 (서열번호 10)에 기재된 바와 같다.
카텝신 C, CELA1 및 CELA3A 발현의 하향조절은 전사 및/또는 번역을 방해하는 다양한 분자를 사용하여 게놈 및/또는 전사 수준에서 수행될 수 있다 [예를 들어, RNA 사일런싱제 (예를 들어, 안티센스, siRNA, shRNA, 마이크로-RNA), 리보자임 및 DNAzyme]. 세포내 CELA3A, CELA1 및/또는 카텝신 C 활성 중 적어도 하나의 억제는 단백질 수준에서 수행될 수 있는데, 즉, 예를 들어, 항체, 길항제, 폴리펩티드를 절단하는 효소, 소분자, 천연 억제제 등을 사용하여 단백질의 활성을 저해하거나 분해를 야기할 수 있다.
일 구현예에 따라, 세포내 CELA3A, CELA1 및/또는 카텝신 C 중 적어도 하나를 억제할 수 있는 제제는 카텝신 C, CELA3A 및 CELA1의 폴딩된 아미노산 서열로 구성된 적어도 하나의 도메인에 결합하는 고친화성 결합 분자이다.
예를 들어, 고친화성 결합 분자는 카텝신 C, CELA3A 및 CELA1을 특이적으로 결합할 수 있는 앱타머, 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 특정 구현예에 따라, 고친화성 분자는 항원 인식 도메인, 예를 들어, 카텝신 C, CELA3A 및 CELA1 중 적어도 하나의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "에피토프"는 항체의 파라토프가 결합하는 항원 상의 임의의 항원 결정기를 언급한다.
에피토프 결정기는 일반적으로 아미노산 또는 탄수화물 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹으로 구성되며, 일반적으로 특정 전하 특성 뿐만 아니라 특정 3차원 구조적 특성을 갖는다.
본 발명의 교시에 따라 표적화될 수 있는 CELA1 및 CELA3A의 예시적인 에피토프는 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22 및 서열번호 23에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 예시적인 아미노산 서열은 이의 하향조절을 표적으로 할 수 있는 CELA1 및 CELA3A의 에피토프 영역으로서 고려된다. 항체 특이성 및 효소 억제에 대한 추가의 자격은 당업계에 익히 공지된 방법, 예를 들어, ELISA 또는 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 생성된 항체 각각에 대해 수행될 필요가 있음을 인식할 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "항체"는 온전한 분자 뿐만 아니라 대식세포에 결합할 수 있는 Fab, F(ab')2 및 Fv와 같은 이의 기능적 단편을 포함한다. 이들 기능적 항체 단편은 다음과 같이 정의된다: (1) 항체 분자의 1가 항원-결합 단편을 함유하는 단편인 Fab는 전체 항체를 효소 파파인으로 소화시켜 온전한 경쇄 및 하나의 중쇄의 일부를 생성함으로써 생산될 수 있다; (2) 전체 항체를 펩신으로 처리한 후 환원하여 온전한 경쇄 및 중쇄의 일부를 수득함으로써 수득할 수 있는 항체 분자의 단편인 Fab'; 2 개의 Fab '단편은 항체 분자당 수득되고; (3) 후속적인 환원 없이 전체 항체를 효소 펩신으로 처리함으로써 수득할 수 있는 항체의 단편인 (Fab')2; F(ab')2는 2개의 이황화 결합에 의해 함께 결합된 2개의 Fab' 단편의 이합체이다; (4) 경쇄의 가변 영역 및 2개의 쇄로서 표현되는 중쇄의 가변 영역을 함유하는 유전적으로 가공된 단편으로서 정의되는 Fv; 및 (5) 유전적으로 융합된 단일쇄 분자로서 적합한 폴리펩티드 링커에 의해 연결된, 경쇄의 가변 영역 및 중쇄의 가변 영역을 함유하는 유전적으로 가공된 분자인 단일쇄 항체 ("SCA").
폴리클로날 및 모노클로날 항체 뿐만 아니라 이의 단편을 생산하는 방법은 당업계에 익지 공지되어 있다 (참조: 예를 들어, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988, incorporated herein by reference).
본 발명의 일부 구현예에 따른 항체 단편은 항체의 단백질분해 가수분해에 의해 또는 단편을 암호화하는 DNA의 이. 콜리 (E. coli) 또는 포유동물 세포 (예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소 세포 배양 또는 다른 단백질 발현 시스템)에서의 발현에 의해 제조될 수 있다. 항체 단편은 통상적인 방법으로 전체 항체의 펩신 또는 파파인 소화에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 펩신으로 항체를 효소적으로 절단하여 F(ab')2로 표시된 5S 단편을 제공함으로써 생성될 수 있다. 이 단편은 티올 환원제 및 임의로 디설파이드 결합의 절단으로부터 생성된 설프하이 드릴 그룹을 위한 차단 그룹을 사용하여 3.5S Fab' 1가 단편을 생성하여 추가로 절단될 수 있다. 대안적으로, 펩신을 사용한 효소적 절단은 2개의 1가 Fab '단편과 Fc 단편을 직접 생산한다. 이들 방법은 예를 들어, 문헌 [참조: Goldenberg, U.S. Pat. 미국 특허 제4,036,945호 및 제4,331,647호, 상기 특허들은 이들의 전문이 본원에 참조로 인용된다]에 기재되어 있다. 또한 문헌 [Porter, R.R. [Biochem. J. 73: 119-126 (1959)]을 참조한다. 단편이 온전한 항체에 의해 인식되는 항원에 결합하는 한, 1가 경쇄-중쇄 단편을 형성하기 위한 중쇄의 분리, 단편의 추가의 절단 또는 다른 효소적, 화학적 또는 유전적 기술과 같은 항체를 절단하는 다른 방법이 사용될 수도 있다.
Fv 단편은 VH 및 VL 쇄의 회합을 포함한다. 이러한 회합은 문헌 [참조: Inbar et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69:2659-62 (19720)]에 기재되어 있다. 대안적으로, 가변 쇄는 분자간 디설파이드 결합에 의해 연결되거나 또는 글루타르 알데하이드와 같은 화학물질에 의해 가교결합될 수 있다. 바람직하게는, Fv 단편은 펩티드 링커에 의해 연결된 VH 및 VL 쇄를 포함한다. 이러한 단쇄 항원 결합 단백질 (sFv)은 올리고뉴클레오타이드에 의해 연결된 VH 및 VL 도메인을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 구조 유전자를 작제함으로써 제조된다. 상기 구조적 유전자는 이. 콜리와 같은 숙주 세포에 연속적으로 도입되는 발현 벡터에 삽입된다. 재조합 숙주 세포는 2개의 V 도메인을 브릿징하는 링커 펩타이드를 갖는 단일 폴리펩타이드 쇄를 합성한다. sFv를 생산하는 방법은 예를 들어, 문헌 [참조: Whitlow and Filpula, Methods 2: 97-105 (1991); Bird et al., Science 242:423-426 (1988); Pack et al., Bio/Technology 11: 1271-77 (1993); 및 미국 특허 제4,946,778호]에 기재되어 있으며, 이들은 이의 전문이 본원에 참조로 인용된다.
항체 단편의 또 다른 형태는 단일 상보성-결정 영역 (CDR)을 암호화하는 펩타이드이다. CDR 펩타이드 ("최소 인식 단위")는 관심 항체의 CDR을 암호화하는 유전자를 작제함으로써 수득될 수 있다. 이러한 유전자는 항체-생산 세포의 RNA로부터 가변 영역을 합성하기 위해 폴리머라제 연쇄 반응을 사용하여 제조된다 [참조: 예를 들어, Larrick and Fry [Methods, 2: 106-10 (1991)].
비-인간 (예를 들어, 쥐) 항체의 인간화 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유도된 최소 서열을 함유하는 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 이의 단편 (Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 서열)의 키메라 분자이다. 인간화 항체는, 수령자의 상보적인 결정 영역 (CDR)을 형성하는 잔기가 원하는 특이성, 친화성 및 용량을 갖는 마우스, 쥐 또는 토끼와 같은 비-인간 종 (공여자 항체)의 CDR로부터의 잔기로 대체되는 인간 면역글로불린을 포함한다. 일부의 경우, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 인간화 항체는 또한 수용자 항체에서도 또는 도입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 실질적으로 모두 적어도 1개 및 전형적으로 2개 모두의 가변 도메인을 포함할 것이며, CDR 영역의 모두 또는 실질적으로 모두가 비-인간 면역글로불린의 영역에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 것이다. 또한 인간화 항체는 최적으로 적어도 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 일부, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 일부를 포함할 것이다 [참조: Jones et al., Nature, 321 :522-525 (1986); Riechmann et al, Nature, 332:323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)].
비-인간 항체를 인간화하는 방법은 당업계에 익히 공지되어 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비-인간인 공급원으로부터 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종 도입 잔기 (import residues)로 언급되며, 전형적으로 도입 가변 도메인으로부터 취한다. 인간화는 근본적으로, 인간 항체의 상응하는 서열을 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 대체함으로써 윈터 (Winter)와 동료의 방법에 따라 수행될 수 있다 [참조: Jones et al., Nature, 321 :522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)]. 따라서, 상기 인간화 항체는 키메라 항체 (미국 특허 제4,816,567호)로서, 실질적으로 온전한 인간 가변 도메인이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 치환되는 것이다. 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사한 부위로부터 잔기에 의해 치환된 인간 항체이다.
인간 항체는 또한 파지 디스플레이 라이브러리를 포함하여 당해 분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다 [참조: Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]. 콜 (Cole) 등 및 뵈르너 (Boerner) 등의 기술은 또한 인간 단클론 항체의 제조에 이용 가능하다 [참조: Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) and Boerner et al., J. Immunol, 147(1):86-95 (1991)]. 유사하게는, 인간 항체는 형질전환 동물, 예를 들어, 내인성 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 마우스 내로 인간 면역글로불린 유전자좌를 도입함으로써 제조될 수 있다. 챌린지시 인간 항체 생산이 관찰되며 이는 유전자 재배열, 어셈블리 및 항체 레퍼토리를 포함하여 모든 측면에서 인간에서 보여지는 것과 매우 유사하다. 이 접근법은, 예를 들어, 미국 특허 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,661,016호 및 하기 과학 출판물에 기재되어 있다: Marks et al., Bio/Technology 10,: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996); and Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13, 65-93 (1995).
따라서, 세포내 CELA3A, CELA1, 및/또는 카텝신 C 효소 활성 중 적어도 하나의 억제는 예를 들어, 효소의 구조 변화의 인식에 의해 활성 효소에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 영향을 받을 수 있다. 대안적으로, 항체는 효소 기질에 결합함으로써 효소 활성을 억제할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따라, Kd 10-7 M 이하의 최소 친화력으로 CELA3A 및 CELA1에 결합하지만 적어도 10배 낮은 (예를 들어, 10-6 M) 최소 친화력으로 CELA2A 또는 CELA3B에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 구현예에 따라, 항체는 (10-8-10-10 M 또는 10-9-10-10 M) 범위의 Kd로 표적에 결합한다.
본 발명의 일 구현예에 따라, Kd 10-7 M 이하의 최소 친화력으로 카텝신 C에 결합하지만 적어도 10배 낮은 (예를 들어, 10-6 M)의 최소 친화력으로 카텝신 A, B, D, E, G, H, K, L1, L2, O, S, W 또는 Z에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 구현예에 따라, 항체는 (10-8-10-10 M 또는 10-9-10-10 M)의 범위의 Kd로 표적에 결합한다.
본 발명의 교시에 따라 사용될 수 있는 예시적인 항체는 예를 들어, EMD 밀리포어 (Millipore), 시그마-알드리치 및 산타 크루즈 바이오테크놀러지 (Santa Cruz Biotechnology)로부터 구입가능한 항-CELA1 항체; 예를 들어, 에이빔 (Abeam), 시그마-알드리치및 산타 크루즈 바이오테크놀러지로부터 구입가능한 항-CELA3A 항체; 예를 들어, 시그마-알드리치 및 알 앤 디 시스템즈 (R&D Systems)로부터 구입가능한 항-카텝신 C/CTSC 항체를 포함하지만, 이로써 제한되지 않는다. 이러한 항체는 이하에 추가로 기재된 바와 같이 이들의 특이성에 자격을 갖출 수 있다.
카텝신 C, CELA1, CELA3A 또는 구조적으로 이에 관련된 효소를 억제할 수 있는 또 다른 제제는 카텝신 C, CELA1, CELA3A 또는 구조적으로 이에 관련된 효소에 결합 및/또는 절단하는 임의의 분자일 수 있다. 이러한 분자는 카텝신 C, CELA1, CELA3A 또는 구조적으로 이에 관련된 효소 길항제, 또는 카텝신 C, CELA1, CELA3A 또는 구조적으로 이에 관련된 효소 억제 펩타이드일 수 있다.
적어도 카텝신 C, CELA1, CELA3A 또는 구조적으로 이에 관련된 효소의 촉매적 또는 결합 부분의 비-기능적 유사체는 또한 카텝신 C, CELA1, CELA3A 또는 구조적으로 이에 관련된 효소를 억제하는 제제로서 사용될 수 있다.
카텝신 C, CELA1, CELA3A 또는 구조적으로 이에 관련된 효소를 억제하기 위해 본 발명의 일부 구현예와 함께 사용될 수 있는 또 다른 제제는 카텝신 C, CELA1, CELA3A 또는 구조적으로 이에 관련된 효소의 활성화 또는 기질 결합을 방지하는 분자이다.
카텝신 C, CELA1, CELA3A 또는 구조적으로 이에 관련된 효소를 억제하기 위해 본 발명의 일부 구현예와 함께 사용될 수 있는 또 다른 재제는 우성 음성 분자, 즉 카텝신 C, CELA1, CELA3A 또는 구조적으로 이에 관련된 효소의 이펙터와 경쟁하는 펩타이드의 일부 또는 이의 돌연변이이다.
세포내 카텝신 C, CELA1, CELA3A 또는 구조적으로 이에 관련된 효소 중 적어도 하나를 억제하기 위해 본 발명의 일부 구현예와 함께 사용될 수 있는 또 다른 제제는 이들의 활성화 경로에서 천연 억제제이다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 카텝신 C의 예시적인 천연 억제제는 시스타틴 F, 인간 프로테이나제 억제제 9 (PI-9/세르핀B9), 시스타틴 C 및 스테핀스 A 및 B를 포함하지만, 이로써 제한되지 않는다.
따라서, 세포막을 관통하고 세포내 카텝신 C, CELA1, CELA3A 또는 구조적으로 이에 관련된 효소 촉매 활성 중 적어도 하나를 특이적으로 억제하도록 침투할 수 있거나 변형될 수 있는 임의의 특이적 억제제가 본 발명의 교시에 따라 사용될 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명은 세포내 CELA3A 또는 구조적으로 유사한 효소 CELA1 및/또는 카텝신 C 중 적어도 하나를 특이적으로 억제하는 소분자의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 일부 구현예의 양태에 따라, 소분자는 Kd 10-7 M 이하의 최소 친화도를 가지고 세포내 CELA3A, CELA1, 및/또는 카텝신 C 중 적어도 하나에 특이적으로 결합하고, 적어도 10배 높은 Kd의 최소 친화력으로 CELA2A 또는 CELA3B 또는 카텝신 A, B, D, E, G, H, K, LI, L2, O, S, W 또는 Z에 결합한다.
다른 양태에서, 본 발명은 특정 엘라스타제 억제제, 예를 들어, 시판되는 엘라스타제 억제제 II (MeOSuc-AAPA-CMK) (예를 들어, 미국 소재의 Calbiochem-Novabiochem으로부터 시판됨)와 같은 특정 엘라스타제 억제제의 사용을 고려한다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 예시적인 엘라스타제 억제제는 또한 비-펩타이드 소분자를 포함한다.
일부 양태에서, 상기 엘라스타제 억제제는 또한 CELA1, CELA3 및 특히 CELA3A 및/또는 카텝신 C의 발현을 하향조절하고/하거나 활성을 억제하는 본 발명의 화합물/제제를 나타낼 수 있다. 일부 양태에서, 상기 소분자 CELA3 또는 구조적으로 관련된 억제제는 3D 구조 유사성 및 형태 유사체를 기반으로 CELA3A에 대해 특이적으로 디자인되었다. 일부 소분자는 다양한 화학 계열에 속할 수 있다. 선택적으로 및 특이적으로 CELA3A 또는 구조적으로 유사한 효소를 억제할 수 있는 예시적인 화합물은 본원의 표 1에 기재된 화합물을 포함한다.
본 발명은 또한 하기 표 1에 기재된 제제, 또는 이의 유도체, 이성체, 염, 산화물, 다형체 또는 다른 공지된 형태의 임의의 하위그룹을 포함하는 것으로 이해 될 것이다.
괴사를 억제할 수 있는 제제는 특히 다양한 화학 계열에 속하는 소형 억제 화합물, 예를 들어, 2-아미노이미다졸린, 2-아미노티아졸 및 이속사졸을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 제제는 하기 표 1에 기재된 임의의 화합물이거나, 일부 구현예에서, 상기 제제는 유도체, 유사체 또는 약제학적 염 또는 이성체이다.
일부 구현예에서, 표 1에 기재된 제제의 임의의 조합 또는 하위그룹은 본 발명의 일부로서 고려되며 이의 구현예를 나타낸다.
[표 1]
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
선택적으로 및 특이적으로 CELA 1을 억제할 수 있는 예시적인 화합물은 N-[4-[4-(이소부티릴아미노)페녹시]페닐]-2-메틸-프로피온아미드, 에틸-2,3-디하이드로-3-옥소-1,2-벤즈이소티아졸-2-아세테이트-1,1-디옥사이드를 포함하지만, 이로써 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 본 발명의 화합물 및/또는 본 발명의 조성물 및/또는 본 발명의 용도 및/또는 제1 의학적 용도를 제공할 수 있는 본 발명의 방법은 하기 화학식 또는 이의 임의의 조합을 특징으로 하는 제제를 포함할 수 있다:
Figure pct00018
Figure pct00019
일부 양태에서, 본 발명의 화합물 및/또는 본 발명의 조성물 및/또는 본 발명의 용도 및/또는 제1 의학적 용도를 제공할 수 있는 본 발명의 방법은 M059-0032; M059-0055; M059-0082; M059-0053; M059-0335; M059-0891; M059-0891; M059-1012, M008-0111; 4112-3656; Z632-2266; 또는 Z601-4253 또는 이의 임의의 하위세트의 구조를 특징으로 하는 제제를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명의 화합물 및/또는 본 발명의 조성물 및/또는 본 발명의 용도 및/또는 제1 의학적 용도를 제공할 수 있는 본 발명의 방법은 M059-0032; M059-0055; M059-0082; M059-0053; M059-0335; M059-0891; M059-0891; M059-1012, 또는 중심 2-아미노이미다졸린이 치환된 또는 비치환된 피롤리딘, 치환된 또는 비치환된 피페리딘, 치환된 또는 비치환된 피페라진, 치환된 또는 비치환된 이미다졸리딘, 치환된 또는 비치환된 피라졸리딘, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 5 또는 6원 헤테로사이클릭 환, 또는 치환된 또는 비치환된 5 또는 6원 사이클로알킬로 이중 어느 것의 2-아미노 위치에서 치환을 포함하는 유사한 구조를 갖는 화합물의 구조를 특징으로 하는 제제를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명의 화합물 및/또는 본 발명의 조성물 및/또는 본 발명의 용도 및/또는 제1 의학적 용도를 제공할 수 있는 본 발명의 방법은 M059-0032; M059-0055; M059-0082; M059-0053; M059-0335; M059-0891; M059-0891; M059-1012, 또는 중심 2-아미노이미다졸린이 비치환된 피롤리딘, 비치환된 피페리딘, 비치환된 피페라진, 비치환되 이미다졸리딘, 비치환된 피라졸리딘, 비치환된 아릴, 비치환된 5 또는 6원 헤테로사이클릭 환, 또는 비치환된 5 또는 6원 사이클로알킬로 이중 어느 것의 2-아미노 위치에서 치환을 포함하는 유사한 구조를 갖는 화합물의 구조를 특징으로 하는 제제를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명의 화합물 및/또는 본 발명의 조성물 및/또는 본 발명의 용도 및/또는 제1 의학적 용도를 제공할 수 있는 본 발명의 방법은 M059-0032; M059-0055; M059-0082; M059-0053; M059- 0335; M059-0891; M059-0891; M059-1012, 또는 중심 2-아미노이미다졸린이 치환된 피롤리딘, 치환된 피페리딘, 치환된 피페라진, 치환된 이미다졸리딘, 치환된 피라졸리딘, 치환된 아릴, 치환된 5 또는 6원 헤테로사이클릭 환, 치환된 5 또는 6원 사이클로알킬로 이중 어느 것의 2-아미노 위치에서 치환을 포함하는 유사한 구조를 갖는 화합물의 구조를 특징으로 하는 제제를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명의 화합물 및/또는 본 발명의 조성물 및/또는 본 발명의 용도 및/또는 제1 의학적 용도를 제공할 수 있는 본 발명의 방법은 M059-0032; M059-0055; M059-0082; M059-0053; M059-0335; M059-0891; M059-0891; M059-1012, 또는 중심 2-아미노이미다졸린이 치환된 또는 비치환된 피롤리딘, 치환된 또는 비치환된 피페리딘, 치환된 또는 비치환된 피페라진, 치환된 또는 비치환된 이미다졸리딘, 치환된 또는 비치환된 피라졸리딘으로 이중 어느 것의 2-아미노 위치에서 치환을 포함하는 유사한 구조를 갖는 화합물의 구조를 특징으로 하는 제제를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명의 화합물 및/또는 본 발명의 조성물 및/또는 본 발명의 용도 및/또는 제1 의학적 용도를 제공할 수 있는 본 발명의 방법은 M008-0111; 4112-3656; 또는 Z632-2266 또는 이의 임의의 하위세트의 구조를 특징으로 하는 제제를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명의 화합물 및/또는 본 발명의 조성물 및/또는 본 발명의 용도 및/또는 제1 의학적 용도를 제공할 수 있는 본 발명의 방법은 M008-0111; 4112-3656 또는 Z632-2266 또는 중심 2-아미노티아졸린이 치환된 또는 비치환된 피롤리딘, 치환된 또는 비치환된 피페리딘, 치환된 또는 비치환된 피페라진, 치환된 또는 비치환된 이미다졸리딘, 치환된 또는 비치환된 피라졸리딘, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 5 또는 6원 헤테로사이클릭 환, 또는 치환된 또는 비치환된 5 또는 6원 사이클로알킬로 2-아미노 위치에서 치환을 포함하는 유사한 구조를 갖는 화합물의 구조를 특징으로 하는 제제를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명의 화합물 및/또는 본 발명의 조성물 및/또는 본 발명의 용도 및/또는 제1 의학적 용도를 제공할 수 있는 본 발명의 방법은 M008-0111; 4112-3656; 또는 Z632-2266 또는 중심 2-아미노티아졸린 또는 이속사졸이 비치환된 피롤리딘, 비치환된 피페리딘, 비치환된 피페라진, 비치환되 이미다졸리딘, 비치환된 피라졸리딘, 비치환된 아릴, 비치환된 5 또는 6원 헤테로사이클릭 환, 또는 비치환된 5 또는 6원 사이클로알킬로 2-아미노 위치에서 치환을 포함하는 유사한 구조를 갖는 화합물의 구조를 특징으로 하는 제제를 포함할 수 있다. 본 발명의 화합물 및/또는 본 발명의 조성물 및/또는 본 발명의 용도 및/또는 제1 의학적 용도를 제공할 수 있는 본 발명의 방법은 M008-0111; 4112-3656 또는 Z632-2266 또는 중심 2-아미노티아졸린이 치환된 피롤리딘, 치환된 피페리딘, 치환된 피페라진, 치환된 이미다졸리딘, 치환된 피라졸리딘, 치환된 아릴, 치환된 5 또는 6원 헤테로사이클릭 환, 치환된 5 또는 6원 사이클로알킬로 2-아미노 위치에서 치환을 포함하는 유사한 구조를 갖는 화합물의 구조를 특징으로 하는 제제를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명의 화합물 및/또는 본 발명의 조성물 및/또는 본 발명의 용도 및/또는 제1 의학적 용도를 제공할 수 있는 본 발명의 방법은
화학식 I의 구조를 특징으로 하는 제제:
화학식 I
Figure pct00020
(여기서, G1은 치환된 또는 비치환된 피롤리딘, 치환된 또는 비치환된 피페리딘, 치환된 또는 비치환된 피페라진, 치환된 또는 비치환된 이미다졸리딘, 또는 치환된 또는 비치환된 피라졸리딘이고;
G3은 하기 구조:
Figure pct00021
를 특징으로 하거나; 또는 G3은 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬이고;
여기서, G2는 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클이다); 또는
화학식 II의 구조를 특징으로 하는 화합물:
화학식 II
Figure pct00022
(여기서, G1은 치환된 또는 비치환된 피롤리딘, 치환된 또는 비치환된 피리딘, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 피페리딘, 치환된 또는 비치환된 피페라진, 치환된 또는 비치환된 이미다졸리딘, 또는 치환된 또는 비치환된 피라졸리딘이고;
G3은 하기 구조:
Figure pct00023
를 특징으로 하거나; 또는 G3은 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬이고;
여기서, G2는 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클이다); 또는
화학식 III의 구조를 특징으로 하는 화합물:
화학식 III
　
Figure pct00024
(여기서, G1은 치환된 또는 비치환된 피롤리딘, 치환된 또는 비치환된 피리딘, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 피페리딘, 치환된 또는 비치환된 피페라진, 치환된 또는 비치환된 이미다졸리딘, 또는 치환된 또는 비치환된 피라졸리딘이고;
G3은 하기 구조:
Figure pct00025
를 특징으로 하거나; 또는 G3은 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬이고;
여기서, G2는 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클이다)을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 화학식 I, II, III, IV, V 또는 VI의 화합물, 또는 이를 포함하는 조성물을 고려하며 이의 제1 의학적 용도를 포함하여, 이에 의해 상기 화학식에 나타낸 환 구조는 추가의 헤테로원자, 예를 들어, 추가의 질소 또는 산소를 추가로 혼입시킬 수 있다.
그룹
Figure pct00026
을 언급할 때, *은 명시된 그룹에 대한 부착점을 나타냄을 인식할 것이다. 예를 들어, G3이 화학식 I
Figure pct00027
과 관련하여 그룹
Figure pct00028
을 특징으로 할 때, 이것은 다시 하기 구조:
Figure pct00029
를 특징으로 할 수 있다. 당업자는 유사하게 *가 본원에 기재된 바와 같은 화학식 I 내지 VI를 특징으로 하는 임의의 화합물에서 적절한 상응하는 구조에 대해 나타낸 위치에서의 부착점을 나타낸다는 것을 인식할 것이다.
일부 구현예에서, 피롤리딘, 피리딘, 피페리딘, 피페라진, 이미다졸리딘, 피라졸리딘 또는 헤테로사이클로서 정의되는 G1, G2 또는 G3과 관련하여 일부 구현예에서, 나타낸 원자에 대한 이러한 언급된 그룹에 대한 부착점은 질소 또는 헤테로 원자를 통해 또는 적절한 경우 동일한 그룹의 탄소 원자를 통해 있을 수 있음을 이해해야 한다.
일부 구현예에서, 화학식 I의 화합물관 관련하여, G1이 피롤리딘인 경우 부착점은 피롤리딘 그룹의 질소 원자를 통해 존재하고, 일부 구현예에서, G1이 피페라진인 경우 부착점은 피페라진 그룹의 질소 원자를 통해 존재하고, 일부 구현예에서, G1이 피페리딘인 경우 부착점은 피페라딘 그룹의 질소 원자를 통해 존재한다.
일부 구현예에서, 화학식 II의 화합물과 관련하여, G1이 피페리딘인 경우 부착점은 피페라딘 그룹의 질소 원자를 통해 존재하고, 일부 구현예에서, G1이 피페리딘인 경우 부착점은 피페리딘 그룹의 탄소 원자를 통해 존재하고, 여기서, 질소 원자는 부착점에 대해 오르토 위치에 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 화학식 VI의 구조를 특징으로 하는 화합물을 제공한다.
화학식 VI
Figure pct00030
여기서, G1은 임의로 치환된 NH-피롤리딘, 임의로 치환된 NH-피페리딘, 임의로 치환된 NH-피페라진, 임의로 치환된 NH-이미다졸리딘, 임의로 치환된 NH-피라졸리딘, 임의로 치환된 NH-아릴, 임의로 치환된 NH-사이클로알킬, 임의로 치환된 피롤리딘, 임의로 치환된 피페리딘, 임의로 치환된 피페리딘, 임의로 치환된 피페라진, 임의로 치환된 이미다졸리딘, 또는 임의로 치환된 피라졸리딘이고;
G2는 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알케닐, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 사이클로알킬 또는 임의로 치환된 헤테로사이클이고;
여기서, G1이 비치환된 피롤리딘인 경우, G2는 알킬, 사이클로펜틸, 알킬사이클로펜틸 또는 푸란이 아니거나;
G1이 피페리딘인 경우, G2는 알킬이 아니며;
G1이 피페라진인 경우, G2는 알킬 또는 푸란이 아니다.
일부 구현예에서, G1은 피롤리딘이고 G2는 에틸 또는 푸란이다. 일부 구현예에서, G1은 치환된 피페라진이고 G2는 푸란 또는 페닐이고, 일부 구현예에서, G1은 피페리딘이고 G2는 사이클로펜틸, 푸란 또는 페닐이다. 일부 구현예에서, G1은 임의로 치환된 이미다졸리딘 또는 임의로 치환된 피라졸리딘이다.
일부 양태에서, 본 발명의 화합물 및/또는 본 발명의 조성물 및/또는 본 발명의 용도 및/또는 제1 의학적 용도를 제공할 수 있는 본 발명의 방법은 화학식 V의 구조를 특징으로 하는 제제를 포함할 수 있다.
화학식 V
Figure pct00031
여기서, X는 N 또는 S이고;
G1은 치환된 또는 비치환된 피롤리딘, 치환된 또는 비치환된 피리딘, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 피페리딘, 치환된 또는 비치환된 피페라진, 치환된 또는 비치환된 이미다졸리딘, 또는 치환된 또는 비치환된 피라졸리딘이고;
G3은
Figure pct00032
이거나; 또는 G3은 X가 N인 경우 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬이고 (X가 N인 경우),
G3은 존재하지 않으며 (X가 S인 경우),
G4 또는 G5는 각각 독립적으로
Figure pct00033
; 치환된 또는 비치환된 알킬, 알콕시, 아실, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬이고 (X가 S인경우),
G4 또는 G5는 각각 독립적으로 H, OH, 할로겐이고 (X가 N인경우);
G2는 치환된 또는 비치환된 알킬, 알콕시, 아실, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 화학식 VI의 구조를 특징으로 하는 화합물을 제공한다.
화학식 VI
Figure pct00034
여기서, G1은 임의로 치환된 NH-피롤리딘, 임의로 치환된 NH-피페리딘, 임의로 치환된 NH-피페라진, 임의로 치환된 NH-이미다졸리딘, 임의로 치환된 NH-피라졸리딘, 임의로 치환된 NH-아릴, 임의로 치환된 NH-사이클로알킬, 임의로 치환된 피롤리딘, 임의로 치환된 피페리딘, 임의로 치환된 피페리딘, 임의로 치환된 피페라진, 임의로 치환된 이미다졸리딘, 또는 임의로 치환된 피라졸리딘이고;
G2는 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 사이클로알킬 또는 임의로 치환된 헤테로사이클이고;
여기서, G1이 비치환된 피롤리딘인 경우, G2는 알킬, 사이클로펜틸, 알킬사이클로펜틸 또는 푸란이 아니거나;
G1이 피페리딘인 경우, G2는 알킬이 아니며;
G1이 피페라진인 경우, G2는 알킬 또는 푸란이 아니다.
일부 구현예에서, G1은 피롤리딘이고 G2는 에틸 또는 푸란이다. 일부 구현예에서, G1은 치환된 피페라진이고 G2는 푸란 또는 페닐이고, 일부 구현예에서, G1은 피페리딘이고 G2는 사이클로펜틸, 푸란 또는 페닐이다. 일부 구현예에서, G1은 임의로 치환된 이미다졸리딘 또는 임의로 치환된 피라졸리딘이다.
일부 구현예에서, G1은 임의로 치환된 NH-피롤리딘, 임의로 치환된 NH- 피페리딘, 임의로 치환된 NH-피페라진이고 G2는 임의로 치환된 알킬이거나; 또는 일부 구현예에서, G1은 임의로 치환된 NH-피롤리딘, 임의로 치환된 NH-피페리딘, 임의로 치환된 NH-피페라진이고 G2는 임의로 치환된 알케닐이거나; 또는 일부 구현예에서, G1은 임의로 치환된 NH-피롤리딘, 임의로 치환된 NH-피페리딘, 임의로 치환된 NH-피페라진이고 G2는 임의로 치환된 아릴이거나; 또는 일부 구현예에서, G1은 임의로 치환된 NH-피롤리딘, 임의로 치환된 NH-피페리딘, 임의로 치환된 NH-피페라진이고 G2는 임의로 치환된 헤테로아릴이거나; 또는 일부 구현예에서, G2는 임의로 치환된 사이클로알킬이거나; 또는 일부 구현예에서, G1은 임의로 치환된 NH-피롤리딘, 임의로 치환된 NH-피페리딘, 임의로 치환된 NH-피페라진이고 G2는 임의로 치환된 헤테로사이클이다.
일부 구현예에서, G1은 임의로 치환된 NH-이미다졸리딘 또는 임의로 치환된 NH-피라졸리딘이고 G2는 임의로 치환된 알킬이거나; 또는 일부 구현예에서, G1은 NH-이미다졸리딘 또는 임의로 치환된 NH-피라졸리딘이고 G2는 임의로 치환된 알케닐이거나; 또는 일부 구현예에서, G1은 NH-이미다졸리딘 또는 임의로 치환된 NH-피라졸리딘이고 G2는 임의로 치환된 아릴이거나; 또는 일부 구현예에서, G1은 NH-이미다졸리딘 또는 임의로 치환된 NH-피라졸리딘이고 G2는 임의로 치환된 헤테로아릴이거나; 또는 일부 구현예에서, G2는 임의로 치환된 사이클로알킬이거나; 또는 일부 구현예에서, G1은 NH-이미다졸리딘 또는 임의로 치환된 NH-피라졸리딘이고 G2는 임의로 치환된 헤테로사이클이다.
일부 구현예에서, G1은 임의로 치환된 NH-아릴, 임의로 치환된 NH-사이클로알킬이고 G2는 임의로 치환된 알킬이거나; 또는 일부 구현예에서, G1은 임의로 치환된 NH-아릴, 임의로 치환된 NH-사이클로알킬이고 G2는 임의로 치환된 알케닐이거나; 또는 일부 구현예에서, G1은 임의로 치환된 NH-아릴, 임의로 치환된 NH-사이클로알킬이고 G2는 임의로 치환된 아릴이거나; 또는 일부 구현예에서, G1은 임의로 치환된 NH-아릴, 임의로 치환된 NH-사이클로알킬이고 G2는 임의로 치환된 헤테로아릴이거나; 또는 일부 구현예에서, G2는 임의로 치환된 사이클로알킬이거나; 또는 일부 구현예에서, G1은 임의로 치환된 NH-아릴, 임의로 치환된 NH-사이클로알킬이고 G2는 임의로 치환된 헤테로사이클이다.
일부 구현예에서, G1은 임의로 치환된 피롤리딘, 임의로 치환된 피페리딘, 임의로 치환된 피페리딘이고 G2는 임의로 치환된 알킬이거나; 또는 일부 구현예에서, G1은 임의로 치환된 피롤리딘, 임의로 치환된 피페리딘, 임의로 치환된 피페리딘이고 G2는 임의로 치환된 알케닐이거나; 또는 일부 구현예에서, G1은 임의로 치환된 피롤리딘, 임의로 치환된 피페리딘, 임의로 치환된 피페리딘이고 G2는 임의로 치환된 아릴이거나; 또는 일부 구현예에서, G1은 임의로 치환된 피롤리딘, 임의로 치환된 피페리딘, 임의로 치환된 피페리딘이고 G2는 임의로 치환된 헤테로아릴이거나; 또는 일부 구현예에서, G2는 임의로 치환된 사이클로알킬이거나; 또는 일부 구현예에서, G1은 임의로 치환된 피롤리딘, 임의로 치환된 피페리딘, 임의로 치환된 피페리딘이고 G2는 임의로 치환된 헤테로사이클이다.
일부 구현예에서, G1은 임의로 치환된 피페라진, 임의로 치환된 이미다졸리딘, 또는 임의로 치환된 피라졸리딘이고 G2는 임의로 치환된 알킬이거나; 또는 일부 구현예에서, G1은 임의로 치환된 피롤리딘, 임의로 치환된 피페리딘, 임의로 치환된 피페리딘이고 G2는 임의로 치환된 알케닐이거나; 또는 일부 구현예에서, G1은 임의로 치환된 피페라진, 임의로 치환된 이미다졸리딘, 또는 임의로 치환된 피라졸리딘이고 G2는 임의로 치환된 아릴이거나; 또는 일부 구현예에서, G1은 임의로 치환된 피페라진, 임의로 치환된 이미다졸리딘, 또는 임의로 치환된 피라졸리딘이고 G2는 임의로 치환된 헤테로아릴이거나; 또는 일부 구현예에서, G2는 임의로 치환된 사이클로알킬이거나; 또는 일부 구현예에서, G1은 임의로 치환된 피페라진, 임의로 치환된 이미다졸리딘, 또는 임의로 치환된 피라졸리딘이고 G2는 임의로 치환된 헤테로사이클이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 화학식 VII의 구조식를 특징으로 하는 화합물을 제공한다.
화학식 VII
Figure pct00035
여기서, G1은 임의로 치환된 NH-피롤리딘, 임의로 치환된 NH-피페리딘, 임의로 치환된 NH-피페라진, 임의로 치환된 NH-이미다졸리딘, 임의로 치환된 NH-피라졸리딘, 임의로 치환된 NH-피리딘, 임의로 치환된 NH-아릴, 임의로 치환된 NH-사이클로알킬, 임의로 치환된 피롤리딘, 임의로 치환된 피페리딘, 임의로 치환된 피페리딘, 임의로 치환된 피페라진, 임의로 치환된 이미다졸리딘, 임의로 치환된 피라졸리딘 또는 임의로 치환된 아릴이고;
G2는
Figure pct00036
또는 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 아릴 또는 임의로 치환된 사이클로알킬이고;
G4는 임의로 치환된 피롤리딘, 임의로 치환된 피페리딘, 임의로 치환된 피페라진, 임의로 치환된 이미다졸리딘 또는 임의로 치환된 피라졸리딘이며;
여기서, G1이 피페리딘인 경우, G4는 피롤리딘이 아니거나 G2는 임의로 치환된 아릴이 아니거나;
G1이 이미다졸리딘인 경우, G2는 임의로 치환된 아릴이 아니거나;
G1이 임의로 치환된 NH-피리딘인 경우, G2는 임의로 치환된 아릴이 아니거나;
G1이 임의로 치환된 NH-아릴인 경우, G2는 임의로 치환된 아릴이 아니거나;
G1이 임의로 치환된 피리딘인 경우, G2는 임의로 치환된 아릴이 아니다.
일부 구현예에서, 이 양태에 따라, G1은 임의로 치환된 NH-피리딘, G2는
Figure pct00037
(여기서, G4는 피롤리딘이이다)이거나, 또는 G2는 할로아릴이고, 일부 구현예에서, 이 양태에 따라,
G1은 치환된 NH-아릴이고 G2는
Figure pct00038
이고, 여기서, G4는 피롤리딘이다.
일부 양태에서, 알킬, 알케닐, 피롤리딘, 피페리딘, 피페라진, 이미다졸리딘 피라졸리딘, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릭 환, 또는 사이클로알킬 그룹과 관련하여 "치환된"이라는 용어에 대한 언급은 할로겐, 하이드록실, C1-C6 직쇄 또는 측쇄 알킬, 니트로, CN, 니트릴아미도, 아미도설파이드, 아미노, 알데하이드, 치환된 케톤, -COOH, 에스테르, 트리플루오로메틸, 아미드, 알콕시 또는 할로알킬 그룹 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 알킬, 알케닐, 피롤리딘, 피페리딘, 피페라진, 이미다졸리딘 피라졸리딘, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릭 환, 또는 사이클로알킬 그룹관 관련하여 "치환된"이라는 용어에 대한 언급은 할로겐, 하이드록실, C1-C6 직쇄 또는 측쇄 알킬, 니트로, CN, 니트릴아미도, 아미도설파이드, 아미노, 알데하이드, 또는 이의 임의의 하위조합을 포함할 수 있거나, 또는 일부 구현예에서, 치환된 케톤, -COOH, 에스테르, 트리플루오로메틸, 아미드, 알콕시 또는 할로알킬 그룹 또는 이의 임의의 하위조합을 포함할 수 있거나, 또는 일부 구현예에서, 할로겐, 하이드록실, C1-C6 직쇄 또는 측쇄 알킬, 또는 이의 임의의 하위조합을 포함할 수 있거나, 또는 일부 구현예에서, 니트로, CN, 니트릴아미도, 아미도설파이드, 아미노, 알데하이드, 또는 이의 임의의 하위조합을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 용어 "알킬"은 직쇄 또는 측쇄 C1-C6 알킬을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 일부 양태에서, 용어 "사이클로알킬"은 3-, 4-, 5- 또는 6-원 불포화 환을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
일부 양태에서, 용어 "알킬"은 선형, 분지형 또는 사이클릭 탄화수소 구조 및 이들의 조합을 포함하는 것으로 의도된다. 알킬 그룹의 예는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, s- 및 t-부틸 등을 포함한다. 일부 구현예에서, 알킬 그룹은 C20 이하의 것들이다. 일부 구현예에서, 알킬 그룹은 C7 이하의 것들이다. 일부 구현예에서, 알킬 그룹은 C6 이하의 것들이다. 사이클로알킬은 알킬의 하위세트이고 탄소수 3 내지 13의 사이클릭 탄화수소 그룹을 포함한다. 사이클로알킬 그룹의 예는 c-프로필, c-부틸, c-펜틸, 노르보르닐, 아다만틸 등을 포함한다. 이러한 적용에서, 알킬은 알카닐, 알케닐 및 알키닐 잔기를 언급하고; 사이클로헥실메틸, 비닐, 알릴, 이소프레닐 등을 포함하는 것으로 의도된다. 알킬렌 알킬의 또 다른 하위세트로, 알킬과 동일한 잔기를 언급하지만, 2개의 부착점을 갖고 있다. 알킬렌의 예는 에틸렌 (-CH2CH2-), 프로필렌 (-CH2CH2CH2-), 디메틸프로필렌 (-CH2C (CH3) 2CH2-) 및 사이클로헥실프로필렌 (-CH2CH2CH (C6H13)-)을 포함한다. 특정탄소수를 갖는 알킬 잔기가 명명되는 경우, 그 탄소수를 갖는 모든 기하이성체가 포함되는 것으로 의도된다; 따라서, 예를 들어, "부틸"은 n-부틸, 2급-부틸, 이소부틸 및 t-부틸을 포함하는 것을 의미하고; "프로필"은 n-프로필 및 이소프로필을 포함한다.
본원에서 용어 "알콕시"또는 "알콕시"는 바람직하게는 산소를 통해 모 (parent) 구조에 부착된 선형, 분지형, 사이클릭 구성 및 이들의 조합의 1 내지 8개의 탄소 원자를 포함하는 그룹 O-알킬기를 언급할할 수 있다. 예로는 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, 사이클로프로필옥시, 사이클로헥실옥시 등을 포함한다.
용어 "치환된 알콕시"는 본원에서 그룹-0-(치환된 알킬)을 언급할 수 있다.
용어 "아실"은 본원에서 카보닐 작용기를 통해 모 구조에 부착된 선형, 분지형, 사이클릭 구성, 포화, 불포화 및 방향족 및 이들의 조합의 탄소수 1 내지 10의 그룹을 언급할 수 있다. 모에 대한 부착점이 카보닐에 남아있는 한, 아실 잔기의 하나 이상의 탄소는 질소, 산소 또는 황으로 대체될 수 있다. 예로는 아세틸, 벤조일, 프로피오닐, 이소부티릴, t-부톡시카보닐, 벤질옥시카보닐 등 등을 포함한다.
용어 "아릴"은 본원에서 5- 또는 6-원 방향족 환, 바이사이클릭 9- 또는 10-원 방향족 환 시스템, 또는 트리사이클릭 12- 내지 14-원 방향족 환 시스템을 언급할 수 있다. 예로는 사이클로펜타-1,3-디엔, 페닐, 나프틸, 인단, 테트랄린, 플루오렌, 사이클로펜타 [b] 나프탈렌 및 안트라센을 포함한다.
용어 "헤테로사이클" 또는 "헤테로사이클릴"은 본원에서 1 내지 4개의 탄소가 산소, 질소 또는 황과 같은 헤테로원자, 1 내지 4개의 헤테로원자를 함유하는 4-, 5-, 6- 또는 7-원 비-방향족 환, 1 내지 4개의 (또는 그 이상의) 헤테로원자를 함유하는 바이사이클릭 8-, 9- 또는 10-원 비-“‡향족 환 시스템, 또는 1 내지 4개의 (또는 그 이상의) 헤테로원자를 함유하는 트리사이클릭 11- 내지14-원 비-“‡향족 환 시스템에 의해 대체되는 사이클로알킬 잔기를 언급할 수 있다; 상기 헤테로원자는 O, N 또는 S로부터 선택된다. 예로는 피롤리딘, 테트라하이드로푸란, 테트라하이드로-티오펜, 티아졸리딘, 피페리딘, 테트라하이드로-피란, 테트라하이드로-티오피란, 피페라진, 모르폴린, 티오모르폴린 및 디옥산을 포함한다.
용어 "헤테로사이클" 또는 "헤테로사이클릴"은 본원에서 불포화의 수 및 배치가 그룹이 방향족이 되지 않는 한, 불포화 결합을 포함하는 환 시스템을 언급할 수 있다. 예로는 이미다졸린, 옥사졸린, 테트라하이드로이소퀴놀린, 벤조디옥산, 벤조디옥솔 및 3, 5-디하이드로벤즈옥사지닐을 포함한다. 치환된 헤테로사이클릴 의 예는 4-메틸-1-피페라지닐 및 4-벤질-1-피페리디닐을 포함한다.
일부 양태에서 용어 "아릴알킬"은 아릴 및 알킬 그룹 둘 다에 관해 본원에서 제공된 정의를 제공하는 것으로 이해되어야 하며 유사하게는, 임의의 조합된 작용기 용어는 독립적으로 각 그룹의 설명을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "임의의" 또는 "임의로"는 후속하여 기재된 사건 또는 상황이 발생할 수 있고 발생하지 않을 수도 있음을 의미하며, 상기 설명은 상기 사건 또는 상황이 발생하는 경우 및 발생하지 않는 경우를 포함한다.
예를 들어, "임의로 치환된 알킬"은 하기 정의된 바와 같은 "알킬" 또는 "치환된 알킬"을 의미한다. 하나 이상의 치환체를 함유하는 임의의 그룹에 관해 당업자는 이러한 그룹이 입체적으로 비실용적이며 합성적으로 실현가능하지 않고/않거나 본질적으로 불안정한 임의의 치환 또는 치환 패턴을 도입하고자 하는 것은 아니라는 것을 이해할 것이다 (예를 들어, 치환된 알킬은 임의로 치환된 사이클로알킬 그룹을 포함하고, 이는 다시 임의로 치환된 알킬 그룹을 포함하는 것으로 정의되며, 잠재적으로 무한하다). 용어 "치환된 또는 비치환된"은 나타낸 그룹이 하나 이상의 치환체를 함유하는지의 여부에 관해서 동일한 선택을 포함하는 것으로 이해될 것이다.
용어 "치환된"은 지정된 원자 상의 하나 이상의 수소가 존재하는 상황하에 지정된 원자의 정상 원자가가 초과되지 않고 치환이 안정한 화합물을 생성하는 한, 나타낸 그룹으로부터의 선택으로 대체됨을 의미한다. 치환체 및/또는 변수의 조합은 이러한 조합이 안정한 화합물을 생성하는 경우에만 허용가능하다. "안정한 화합물" 또는 "안정한 구조"란, 반응 혼합물로부터 유용한 순도에 대한 단리 및 효과적인 치료제로의 제형을 견디는 데 충분히 견고한 화합물을 의미한다. 용어 "임의로 치환된"은 특정 그룹, 라디칼 또는 모이어티로의 임의의 치환을 의미한다.
또한, 본원의 본문, 반응식, 실시예 및 표에서 불완전한 원자가를 갖는 임의의 탄소 뿐만 아니라 헤테로 원자는 원자가를 만족시키기에 충분한 수소 원자(들) 수를 갖는 것으로 가정된다는 것을 주목해야 한다.
본원에서 주목된 바와 같이, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 화합물의 임의의 이성체 또는 약제학적으로 허용되는 염, N-옥사이드, 수화물, 프로드럭, 용매화물 또는 유도체, 본원에 기재된 바와 같은 화합물의 임의의 이성체 또는 약제학적으로 허용되는 염, N-옥사이드, 용매화물, 수화물 또는 유도체, 본원에 기재된 바와 같은 화합물의 임의의 이성체 또는 약제학적으로 허용되는 염, N-옥사이드, 용매화물, 수화물 또는 유도체를 사용하는 제1 의학적 용도 및/또는 치료 방법을 고려한다.
용어 "약제학적으로 허용되는 염"은 본원에서 생물학적으로 또는 다른 방식으로 바람직하지 않은 것은 아닌 본 발명의 화합물의 생물학적 유효성 및 성질을 보유하는 염을 의미할 수 있다. 다수의 경우, 본 발명의 화합물은 아미노 및/또는 카복실 그룹 또는 이와 유사한 그룹의 존재로 인해 산 및/또는 염기 염을 형성할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 산 부가염은 무기산 및 유기산으로 형성될 수 있다. 염이 유도될 수 있는 무기산은 예를 들어, 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등을 포함한다. 염이 유도될 수 있는 유기산은 예를 들어, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말레산, 말론산, 석신산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 만델산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 살리실산 등을 포함한다.
약제학적으로 허용되는 염기 부가염은 무기 염기 및 유기 염기로 형성될 수있다. 염이 유도될 수 있는 무기 염기는 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘, 마그네슘, 철, 아연, 구리, 망간, 알루미늄 등; 특히 바람직하게는 암모늄, 칼륨, 나트륨, 칼슘 및 마그네슘 염을 포함한다. 염이 유도될 수 있는 유기 염기는 예를 들어, 1급, 2급 및 3급 아민, 자연 발생 치환된 아민을 포함하는 치환된 아민, 사이클릭 아민, 염기성 이온 교환 수지 등, 구체적으로는 예를 들어, 이소프로필아민, 트리메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 및 에탄올아민을 포함한다.
용어 "용매화물"은 본원에서 약제학적으로 허용되는 용매의 하나 이상의 분자와 물리적으로 회합한 화합물을 언급할 수 있다. 용어 "용매화물"은 언급된 화합물, 화합물의 약제학적으로 허용되는 염, 화합물의 용매화물 및 화합물의 약제학적으로 허용되는 염의 용매화물을 포함하는 것으로 이해될 것이다.
"본원에 기재된 바와 같은 화합물" 또는 "기재된 바와 같이 사용하기 위한 화합물"과 같은 문구는 화학식 I-VII의 화합물 또는 이의 임의의 약제학적으로 허용되는 염, 이성체, N-옥사이드, 이성체 또는 용매화물을 포함하는 것으로 간주되어야 함을 이해할 것이다.
본 발명의 화합물의 프로드럭 및 용매화물 또한 본원에서 고려된다. 프로드럭에 대한 논의는 문헌 [참조:T. Higuchi and V. Stella, Pro-drugs as Novel Delivery Systems (1987) 14 of the A. C. S. Symposium Series, and in Bioreversihie Gamers in Drug Design, (1987) Edward B. Roche, ed., American Pharmaceutical Association and Pergamon Press]에 제공되어 있다. 용어 "프로드럭"은 생체내에서 형질전환되어 화학식 I - IV의 화합물 또는 상기 화합물의 약제학적으로 허용되는 염, 수화물 또는 용매화물을 생성하는 화합물 (예를 들어, 약물 전구체)을 의미한다. 형질전환은, 예를 들어, 혈액내 가수분해를 통한 다양한 기작 (예를 들어, 대사 과정 또는 화학 과정에 의해)에 의해 발생할 수 있다. 프로드럭의 용도에 대한 논의는 문헌에 제공되어 있다 [참조: T. Higuehi and W. Stella, "Pro-drugs as Novel Delivery Systems," Vol. 14 of the A. C. S. Symposium Series, and in Bioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987].
본 발명에 따라 사용될 수 있는 예시적인 카텝신 C 억해제는 예를 들어, 미국 소재의 MP Biomedicals로부터 구입가능한 Gly-Phe-디아조메틸케톤 (Gly-Phe-DMK)을 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따라, 임의의 생물정보학 방법을 사용하여 세포내 CELA3A 또는 구조적으로 관련있는 효소, CELA1 및/또는 카텝신 C (예를 들어, Vigyaan, DNALinux Virtual Desktop (VD) 또는 Bioclipse와 같은 생물정보 기술) 중 적어도 하나의 특이적 억제제를 디자인하고 합성할 수 있다.
언급된 바와 같이, 카텝신 C, CELA3A 및 CELA1의 활성 또는 발현을 하향조절할 수 있는 또 다른 제제는 표적화된 방식으로 발현을 사일런싱하는데 적합한 폴리 뉴클레오타이드 제제이다. 이러한 제제의 예가 하기에 열거되어 있다.
세포내 CELA3A, CELA1, 및/또는 카텝신 C 중 적어도 하나의 하향조절은 RNA 사일런싱에 의해 달성될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "RNA 사일런싱"이라는 문구는 상응하는 단백질-암호화 유전자의 발현을 억제하거나 "사일런싱"시키는 RNA 분자에 의해 매개된 조절 기작의 그룹 [예를 들어, RNA 간섭 (RNAi), 전사 유전자 사일런싱 (TGS), 전사후 유전자 사일런싱 (PTGS), 억누름 (quelling), 공동억제, 및 번역 억제]을 언급한다. RNA 사일런싱은 식물, 동물 및 진균을 포함하는 다수의 유형에서 관찰되었다.
본원에 사용된 용어 "RNA 사일런싱제"는 표적 유전자의 발현을 특이적으로 억제하거나 "사일렁싱"할 수 있는 RNA를 언급한다. 특정 구현예에서, RNA 사일런 싱제는 전사후 사일런싱 기작을 통해 mRNA 분자의 완전한 프로세싱 (예를 들어, 완전한 번역 및/또는 발현)을 방지할 수 있다. RNA 사일런싱제는 비암호화 RNA 분자, 예를 들어, 한쌍의 가닥을 포함하는 RNA 이중 가닥 뿐만 아니라 이러한 작은 비-암호화 RNA가 생성될 수 있는 전구체 RNA를 포함한다. 예시적인 RNA 사일런싱제는 siRNA, miRNA 및 shRNA와 같은 dsRNA를 포함한다. 일 구현예에서, RNA 사일런싱제는 RNA 간섭을 유도 할 수있다. 또 다른 구현예에서, RNA 사일런싱제는 번역 억제를 매개할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따라, RNA 사일런싱제는 표적 RNA (예를 들어, 카텝신 C, CELA3A 및 CELA1)에 특이적이며 표적 유전자에 대해 99 % 이하의 전체적인 상동성, 예를 들어, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 94 %, 93 %, 92 %, 91 %, 90 %, 89 %, 88 %, 87 %, 86 %, 85 %, 84 %, 83 %, 82 %, 81 % 미만의 전체적인 상동성을 나타내는 유전자 또는 스플라이스 변이체를 교차 억제하거나 사일런싱하지 않는다
RNA 간섭은 짧은 간섭 RNA (siRNA)에 의해 매개된 동물에서 서열-특이적 서열후전사 유전자 사일런싱 과정을 언급한다. 식물에서의 상응하는 과정은 통상적으로 전사후 유전자 사일렁싱 또는 RNA 사일렁싱으로 언급되며 진균에서 억누름 (quelling)으로도 언급된다. 전사후 유전자 사일런싱 과정은 외래 유전자의 발현을 막는 데 사용되는 진화론적으로-보존된 세포 방어 기작으로 생각되며 통상적으로 다양한 식물군과 종족에 의해 공유된다. 이러한 외래 유전자 발현으로부터의 보호는 바이러스 감염으로부터 유래된 이중-가닥 RNA (dsRNA)의 생성 또는 동종의 단일-가닥 RNA 또는 바이러스성 게놈 RNA를 특이적으로 파괴하는 세포 반응을 통한 트랜스포존 인자의 숙주 게놈으로의 무작위 통합으로부터 진화될 수 있다.
세포에서 긴 dsRNA의 존재는 다이서로 언급되는 리보뉴클레아제 III 효소의 활성을 자극한다. 다이서는 짧은 간섭 RNA (siRNA)로 알려진 짧은 dsRNA 조각으로 dsRNA를 가공하는 과정에 관여한다. 다이서 활성으로부터 유래된 짧은 간섭 RNA는 전형적으로 길이가 약 21 내지 약 23개 뉴클레오타이드이고 약 19개 염기쌍 이중 가닥을 포함한다. RNAi 반응은 또한 siRNA 이중 가닥의 안티센스 가닥에 상보적인 서열을 갖는 단일-가닥 RNA의 절단을 매개하는 RNA-유도된 사일런싱 족합체 (RISC)로 통상적으로 언급되는 엔도뉴클레아제 복합체를 특징으로 한다. 표적 RNA의 절단은 siRNA 이중 가닥의 안티센스 가닥에 상보적인 영역의 중간에서 일어난다.
따라서, 본 발명의 일부 구현예는 mRNA로부터 단백질 발현을 하향조절하기 위한 dsRNA의 사용을 고려한다.
일 구현예에 따라, dsRNA는 30 bp보다 크다. 긴 dsRNA (즉, 30 bp보다 큰 dsRNA)의 사용은 이중 가닥 RNA의 이러한 더 긴 영역이 인터페론 및 PKR 반응의 유도를 초래할 것이라는 믿음 때문에 매우 제한적이었다. 그러나, 긴 dsRNA의 사용은 세포가 다수의 siRNA를 시험할 필요성을 경감시키는 최적의 사일런싱 서열을 선택할 수 있다는 점에서 많은 이점을 제공할 수 있으며; 긴 dsRNA는 사일런싱 라이브러리가 siRNA에 필요한 것보다 적은 복잡성을 가질 수 있도록 하고; 아마도 가장 중요한 것은 긴 dsRNA가 치료제로 사용되는 경우 바이러스 탈출 돌연변이를 방지할 수 있다는 것이다.
다양한 연구는 긴 dsRNA가 스트레스 반응을 유도하거나 상당한 표적 이탈 효과 (off-target effect)를 유발하지 않으면서 유전자 발현을 사일런싱하는데 사용될 수 있음을 입증한다 - 참조: 예를 들어 [Strat et al., Nucleic Acids Research, 2006, Vol. 34, No. 13 3803-3810; Bhargava A et al. Brain Res. Protoc. 2004;13:115-125; Diallo M., et al., Oligonucleotides. 2003;13:381-392; Paddison P.J., et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2002;99: 1443-1448; Tran N., et al., FEBS Lett. 2004;573:127-134].
특히, 본 발명의 일부 구현예에 따른 본 발명은 인터페론 경로가 활성화되지 않은 세포 (예를 들어, 배아세포 및 난모세포)에서 유전자 사일런싱을 위한 긴 dsRNA (30개 이상의 염기 전사체)의 도입을 고려한다. 참조: 예를 들어, [Billy et al., PNAS 2001, Vol 98, pages 14428-14433. 및 Diallo et al, Oligonucleotides, October 1, 2003, 13(5): 381-392. doi: 10.1089/154545703322617069]
본 발명의 일부 구현예에 따른 본 발명은 또한 유전자 발현을 하향조절하기 위한 인터페론 및 PKR 경로를 유도하지 않도록 특별히 디자인된 긴 dsRNA의 도입을 고려한다. 예를 들어, 시나가와 (Shinagwa) 및 이시이 (Ishii) [Genes & Dev. 17 (11): 1340-1345, 2003]는 RNA 폴리머라제 II (Pol II) 프로모터로부터 긴 이중-가닥 RNA를 발현시키기 위해 pDECAP로 명명된 벡터를 개발하였다. pDECAP로부터의 전사인자는 세포질로의 ds-RNA 전달을 촉진하는 5'-캡 구조와 3'-폴리 (A) 테일 둘 다가 부족하기 때문에 pDECAP로부터 긴 ds-RNA는 인터페론 반응을 유도하지 않는다.
포유동물 시스템에서 인터페론 및 PKR 경로를 회피하는 또 다른 방법은 형질 감염 또는 VIa 내인성 발현을 통해 작은 억제 RNA (siRNA)를 도입하는 것이다.
용어 "siRNA"는 RNA 간섭 (RNAi) 경로를 유도하는 작은 억제 RNA 이중 가닥 (일반적으로 18 내지 30 염기쌍 사이)을 언급한다. 전형적으로, siRNA는 25 내지 30개 염기 길이의 화학적으로 합성된 RNA 이중 가닥이 동일한 위치에서 21mer와 비교하여 효능을 100배 증가시킬 수 있다고 최근에 기재되었지만, 말단에 중심 19 bp 이중 가닥 영역 및 대칭 2-염기 3'-오버행을 갖는 21mer로서 화학적으로 합성된다. RNAi를 유발하는데 더 긴 RNA를 사용하여 수득한 관찰된 증가된 효능은 생성물 (21mer) 대신에 다이서에 기질 (27mer)을 제공한 결과로 이론화되었으며 이로 인해 siRNA 이중 가닥이 RISC로의 유입 속도 또는 효율을 향상사킨다.
3'-오버행의 위치는 siRNA의 효력에 영향을 미치고 안티센스 가닥 상의 3'-오버행을 갖는 비대칭 이중 가닥은 일반적으로 센스 가닥 상의 3'-오버행을 갖는 것보다 더 강력한 것으로 밝혀졌다 (참조: Rose et al ., 2005). 반대의 효능 패턴이 안티센스 전사체를 표적으로 할 때 관찰되기 때문에 이것은 RISC로의 비대칭적 가닥 부하에 기인할 수 있다.
이중-가닥의 간섭 RNA (예를 들어, siRNA)의 가닥은 헤어핀 또는 줄기-루프 (stem-loop) 구조 (예를 들어, shRNA)를 형성하도록 연결될 수 있다. 따라서, 언급된 바와 같이, 본 발명의 일부 구현예의 RNA 사일런싱제는 또한 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "shRNA"는 상보적인 서열의 제1 및 제2 영역을 포함하는 줄기-루프 구조를 갖는 RNA 제제를 언급하며, 상기 영역의 상보성 및 배향 정도는 상기 영역들 간에 염기쌍이 발생하도록 충분하며, 상기 제1 및 제2 영역은 루프 영역에 의해 결합되며 상기 루프는 상기 루프 영역 내의 뉴클레오타이드 (또는 뉴클레오타이드 유사체) 사이의 염기쌍이 결핍되어 생성된다. 루프 내의 뉴클레오타이드의 수는 3 내지 23, 또는 5 내지 15, 또는 7 내지 13, 또는 4 내지 9 또는 9 내지 11의 수이다. 루프 내의 뉴클레오타이드의 일부는 루프 내의 다른 뉴클레오타이드와의 염기-쌍 상호작용에 관여할 수있다. 루프를 형성하는데 사용될 수 있는 올리고뉴클레오타이드 서열의 예는 5'-UUCAAGAGA-3 '(참조: Brummelkamp, T. R. et al. (2002) Science 296: 550) 및 5'-UUUGUGUAG-3'(참조: Castanotto, D.et al . (2002) RNA 8: 1454)을 포함한다. 수득 된 단일 쇄 올리고뉴클레오타이드가 RNAi 조직과 상호작용할 수 있는 이중-가닥 영역을 포함하는 줄기-루프 또는 헤어핀 구조를 형성한다는 것은 당업자에게 인식 될 것이다.
본 발명의 일부 구현예와 함께 사용하기에 적합한 RNA 사일런싱제의 합성은 다음과 같이 수행될 수 있다. 먼저, 카텝신 C, CELA3A 및 CELA1 mRNA 서열은 A A 디뉴클레오타이드 서열에 대한 AUG 개시 코돈의 다운스트림에서 스캐닝된다. 각각의 A A 및 인접한 19 뉴클레오타이드의 발생이 잠재적인 siRNA 표적 부위로서 기록된다. 바람직하게는, 비번역된 영역 (UTR)이 조절 단백질 결합 부위가 풍부하므로, siRNA 표적 부위는 개방형 판독 프레임으로부터 선택된다. UTR-결합 단백질 및/또는 번역 개시 복합체는 siRNA 엔도뉴클레아제 복합체의 결합을 간섭할 수 있다 [참조: Tuschl ChemBiochem. 2: 239-245]. 그러나, 5 'UTR에서 지시된 siRNA가 세포 GAPDH mRNA의 약 90 % 감소를 매개하고 단백질 수준을 완전히 폐지한 GAPDH에 대해 입증된 바와 같이, 비번역된 영역을 지시하는 siRNA가 또한 효과적 일 수 있음을 이해할 것이다 (www.ambion.com/techlib/tn/91/912.html).
둘째로, 잠재 표적 부위는 NCBI 서버 (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)로부터 입수가능한 BLAST 소프트웨어와 같은 임의의 서열 정렬 소프트웨어를 사용하여 적절한 게놈 데이터베이스 (예를 들어, 인간, 마우스, 래트 등)와 비교된다. 다른 암호화 서열과 유의한 상동성을 나타내는 추정적 표적 부위는 걸러 낸다.
적합한 표적 서열을 siRNA 합성을 위한 주형으로서 선택한다. 바람직한 서열은 55 % 이상의 G/C 함량을 갖는 것들에 비해 유전자 사일런싱을 매개하는데 더 효과적인 것으로 입증된 낮은 G/C 함량을 포함하는 서열이다. 수개의 표적 부위가 바람직하게는 평가를 위해 표적 유전자의 길이를 따라 선택된다. 선택된 siRNA의 더 우수한 평가를 위해, 음성 대조군은 바람직하게는 함께 사용된다. 음성 대조군 siRNA는 바람직하게는 siRNA와 동일한 뉴클레오타이드 조성을 포함하지만, 게놈과 유의한 상동성이 없다. 따라서, siRNA의 스크램블된 뉴클레오타이드 서열은 바람직하게는 임의의 다른 유전자와 유의한 상동성을 나타내지 않는 한 사용된다.
예를 들어, 카텝신 C에 적합한 siRNA 분자는 서열번호 1에 기재된 바와 같은 핵산 서열을 포함할 수 있다.
카텝신 C 사일런싱을 위한 예시적인 siRNA 분자, miRNA 분자 또는 shRNA 분자는 예를 들어, 시그마-알드리치, QIAGEN 또는 오리진으로부터 상업적으로 구입할 수 있다.
예를 들어, CELA1에 적합한 siRNA 분자는 서열번호 2에 기재된 바와 같은 핵산 서열을 포함할 수 있다.
CELA1 사일런싱을 위한 예시적인 siRNA 분자, miRNA 분자 또는 shRNA 분자는, 예를 들어, 시그마-알드리치, QIAGEN 또는 오리진으로부터 상업적으로 구입할 수 있다.
예를 들어, CELA3A에 적합한 siRNA 분자는 서열번호 3에 기재된 바와 같은 핵산 서열을 포함할 수 있다.
CELA3A 사일런싱을 위한 예시적인 siRNA 분자, miRNA 분자 또는 shRNA 분자는 예를 들어, 시그마-알드리치, QIAGEN 또는 오리진으로부터 상업적으로 구입할 수 있다.
본 발명은 추가로 서열번호 1에 기재된 바와 같은 적어도 95 % 내지 99 %의 동일성을 공유하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
본 발명은 추가로 서열번호 2에 기재된 바와 같은 적어도 95 % 내지 99 %의 동일성을 공유하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
본 발명은 추가로 서열번호 3에 기재된 바와 같와 적어도 95 % 내지 99 %의 동일성을 공유하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
본 발명의 일부 구현예의 RNA 사일런싱은 RNA만을 함유하는 분자로 제한될 필요는 없지만, 화학적으로-변형된 뉴클레오타이드 및 비-뉴클레오타이드를 추가로 포함하는 것으로 인식될 것이다.
RNA 사일런싱제를 사용하여 표적화될 mRNA는 이들의 발현이 바람직하지 않은 표현형 형질과 상관 관계가 있는 것을 포함하지만, 이로써 제한되지 않는다. 표적화될 수 있는 예시적인 mRNA는 절단된 단백질을 암호화한 mRNA, 즉 결실을 포함한다. 따라서, 본 발명의 일부 구현예의 RNA 사일런싱제는 결실의 어느 한쪽 상의 가교 영역을 표적으로 할 수 있다. 이러한 RNA 사일런싱제를 세포 내로 도입하면 돌연변이된 단백질의 하향조절이 일어나고 비-돌연변이된 단백질은 영향을 받지 않게 된다.
또 다른 구현예에 따라, RNA 사일런싱제는 miRNA일 수 있다.
용어 "마이크로RNA", "miRNA", 및 "miR"은 동의어이며 유전자 발현을 조절하는 약 19 내지 28개 뉴클레오타이드의 비-암호화 단일-가닥 RNA 분자의 집합을 나타낸다. miRNA는 광범위한 유기체 (바이러스, 인간)에서 발견되며 발달, 항상성 및 질환 병인에서 역할을 하는 것으로 나타났다.
miRNA와 miRNA *의 5 '와 3' 말단에는 가변성이 있을 수 있음을 주목해야 한다. 이 가변성은 절단 부위와 관련하여 드로셔 (Drosha)와 다이서의 효소 처리의 다양성으로 인한 것일 수 있다. miRNA 및 miRNA*의 5' 및 3' 말단에서의 가변성은 pri-miRNA 및 pre-miRNA의 줄기 구조에서의 불일치로 인한 것일 수도 있다. 줄기 가닥의 불일치는 상이한 헤어핀 구조의 집단으로 이어질 수 있다. 줄기 구조의 다양성은 또한 드로셔와 다이서의 절단 산물의 다양성을 초래할 수 있다.
카텝신 C, CELA3A 및 CELA1을 하향조절할 수 있는 또 다른 제제는 카텝신 C, CELA3A 및 CELA1의 mRNA 전사체 또는 DNA 서열을 특이적으로 절단할 수 있는 DNAzyme 분자이다. DNAzymes은 단일 및 이중 가닥 표적 서열 둘 다를 절단할 수 있는 단일-가닥 폴리뉴클레오타이드이다 (참조: Breaker, R.R. and Joyce, G. Chemistry and Biology 1995;2:655; Santoro, S.W. & Joyce, G.F. Proc. Natl, Acad. Sci. USA 1997;943:4262). DNAzyme의 일반적인 모델 ("10-23" 모델)이 제안되었다. "10-23" DNAzyme은 15개의 데옥시리보뉴클레오타이드의 촉매 도메인을 가지며, 각각 7 내지 9개의 데옥시리보뉴클레오타이드의 2개의 기질-인식 도메인이 측면에 있다. 이러한 유형의 DNAzyme은 푸린:피리미딘 접합부에서 기질 RNA를 효과적으로 절단할 수 있다 (Santoro, S.W. & Joyce, G.F. Proc. Natl, Acad. Sci. USA 199; DNAzymes의 rev에 대해서는 Khachigian, LM [Curr Opin Mol Ther 4: 119-21 (2002) 참조].
단일 및 이중-가닥 표적 절단 부위를 인식하는 합성의 조작된 DNAzyme의 작제 및 증폭의 예는 조이스 (Joyce) 등의 미국 특허 제6,326,174호에 개시되어 있다. 인간 우로키나제 수용체에 대해 지시된 유사한 디자인의 DNAzyme은 최근 우로키나제 수용체 발현을 억제하고 생체내 대장암 세포 전이를 성공적으로 억제하는 것으로 관찰되었다 (참조: Itoh et al, 2002, Abstract 409, Ann Meeting Am Soc Gen Ther wwwdotasgtdotorg). 또 다른 적용에서, bcr-abl 발암유전자에 상보적인 DNAzyme은 백혈병 세포에서 발암유전자 발현을 억제하고, CML 및 ALL의 경우 자가 골수 이식에서 재발율을 감소시키는데 성공적이었다.
카텝신 C, CELA3a 및 CELA1의 하향조절은 또한 카텝신 C, CELA3A 및 CELA1을 암호화하는 mRNA 전사체와 특이적으로 하이브리드화 될 수 있는 안티센스 폴리뉴클레오타이드를 사용하여 수행될 수 있다.
세포내 CELA3A, CELA1 및/또는 카텝신 C 중 적어도 하나를 효율적으로 하향조절하는데 사용될 수 있는 안티센스 분자의 디자인은 안티센스 접근법에 중요한 두 가지 양태를 고려하면서 수행되어야 한다. 제1 양태는 적절한 세포의 세포질 내로의 올리고뉴클레오타이드의 전달이고, 제2 양태는 이의 번역을 억제하는 방식으로 세포 내에서 지정된 mRNA와 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오타이드의 디자인이다.
선행 기술은 올리고뉴클레오타이드를 다양한 세포 유형으로 효율적으로 전달하는데 사용될 수 있는 다수의 전달 전략을 교시한다 [참조: 예를 들어, Luft J Mol Med 76: 75-6 (1998); Kronenwett et al. Blood 91 : 852-62 (1998); Rajur et al. Bioconjug Chem 8: 935-40 (1997); Lavigne et al. Biochem Biophys Res Commun 237: 566-71 (1997) and Aoki et al. (1997) Biochem Biophys Res Commun 231: 540-5 (1997)].
또한, 표적 mRNA와 올리고뉴클레오타이드 둘 다의 구조적 변화의 에너지론을 설명하는 열역학 사이클에 기반하여 표적 mRNA에 대해 예측된 최대 결합 친화성을 갖는 서열을 확인하는 알고리즘이 또한 이용가능하다 [참조: 예를 들어, Walton et al. Biotechnol Bioeng 65: 1-9 (1999)].
이러한 알고리즘은 세포에서 안티센스 접근법을 구현하는 데 성공적으로 사용되었다. 예를 들어, 월튼 (Walton)에 의해 개발된 알고리즘은 토끼 베타-글로빈 (RBG) 및 마우스 종양 괴사 인자-알파 (TNF 알파) 전사체에 대한 안티센스 올리고 뉴클레오타이드를 성공적으로 디자인할 수 있었다. 동일한 연구 그룹은 디에스테르 및 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드 화학물질로 2가지 세포 유형에서 3가지 상이한 표적에 대한 시험을 포함하는, 거의 모든 경우에 효과적임이 입증된 키네틱 PCR 기술에 의해 평가된 세포 배양에서 3가지 모델 표적 mRNA (인간 락테이트 탈수소 효소 A 및 B 및 래트 gp130)에 대한 합리적으로 선택된 올리고 뉴클레오타이드의 안티센스 활성이 거의 모든 경우에 효과적이라는 것을 보고했다
또한, 시험관내 시스템을 사용하여 특이적 올리고뉴클레오타이드의 효율을 디자인 및 예측하기 위한 여러 접근법이 또한 공개되었다 [참조: Matveeva et al., Nature Biotechnology 16: 1374 - 1375 (1998)].
카텝신 C, CELA3A 및 CELA1을 하향조절할 수 있는 또 다른 제제는 카텝신 C, CELA3A 및 CELA1을 암호화하는 mRNA 전사체를 특이적으로 절단할 수 있는 리보자임 분자이다. 리보자임은 관심 단백질을 암호화하는 mRNA의 절단에 의한 유전자 발현의 서열-특이적 억제에 점점 더 많이 사용되고 있다 [참조: Welch et al., Curr Opin Biotechnol. 9:486-96 (1998)]. 임이의 특이적 표적 RNA를 절단하기 위해 리보자임을 디자인할 수 있는 가능성은 기본 연구 및 치료 적용분야에서 유용한 도구가 되었다. 치료 영역에서, 리보자임은 감염성 질환, 암에서의 지배적인 발암유전자 및 유전적 장애의 특이적 체세포 돌연변이에서 바이러스성 RNA를 표적화하는데 이용되어 왔다 [참조: Welch et al., Clin Diagn Virol. 10: 163-71 (1998)]. 특히, HIV 환자에 대한 몇몇 리보자임 유전자 치료 프로토콜은 이미 1 단계 시험 중이다. 보다 최근에는, 리보자임은 형질전환 동물 연구, 유전자 표적 검증 및 경로 해독에 사용되어 왔다. 몇몇 리보자임은 임상 시험의 다양한 단계에 있다. ANGIOZYME은 인간 임상 시험에서 연구될 최초 화학적으로 합성된 리보자임이었다. ANGIOZYME은 혈관신생 경로의 주요 구성요소인 VEGF-r (혈관 내피 성장 인자 수용체)의 생성을 특이적으로 억제한다. 리보자임 파마슈티컬스, 인코포레이티드 (Ribozyme Pharmaceuticals, Inc.) 뿐만 아니라 다른 회사들은 동물 모델에서 항 혈관신생 치료제의 중요성을 입증했다. C형 간염 바이러스 (HCV) RNA를 선택적으로 파괴하기 위해 디자인된 리보자임인 HEPTAZYME는 세포 배양 분석에서 C형 간염 바이러스 RNA를 감소시키는 데 효과적인 것으로 밝혀졌다 (참조: Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated - WEB 홈페이지).
따라서, 카텝신 C, CELA3A 및 CELA1 조절 영역에서 임의의 주어진 서열에 대해, 삼중나선 형성 서열이 고안될 수 있다. 삼중나선-형성 올리고뉴클레오타이드는 바람직하게는 길이 15 이상, 보다 바람직하게는 25 이상, 더욱 바람직하게는 30 이상의 뉴클레오타이드로, 최대 50 또는 100 bp 이하이다.
TFO로 세포의 형질감염 (예를 들어, 양이온성 리포좀을 통해) 및 표적 DNA와 함께 삼중 나선 구조의 형성은 입체 및 기능 변화를 유도하고 전사 개시 및 신장을 차단하여 내인성 DNA에 원하는 서열 변화를 도입하여 유전자 발현의 특이적 하향조절을 유도한다. TFO로 처리된 세포에서의 이러한 유전자 발현 억제의 예는 포유동물 세포에서 에피솜 supFG1 및 내인성 HPRT 유전자의 녹아웃 (참조: Vasquez et al., Nucl Acids Res. 1999;27:1176-81, and Puri, et al, J Biol Chem, 2001;276:28991-98), 및 전립선암 병인에서 중요한 Ets2 전사 인자의 발현의 서열 및 표적 특이적 하향조절 (참조: Carbone, et al, Nucl Acid Res. 2003;31 :833-43), 및 전-염증성 ICAM-1 유전자 (참조: Besch et al, J Biol Chem, 2002;277:32473-79). 또한, Vuyisich와 Beal은 최근에 서열 특이적 TFO가 RNA-의존성 효소 (참조: Vuyisich and Beal, Nuc. Acids Res 2000; 28:2369-74)와 같은 dsRNA-의존성 효소의 활성을 억제하는 dsRNA에 결합 할 수 있음을 보여주었다.
또한, 상기 언급된 원리에 따라 디자인된 TFO는 DNA 회복을 수행할 수 있는 지시된 돌연변이유발을 유도하여 내인성 유전자의 발현의 하향조절 및 상향조절을 제공할 수 있다 (참조: Seidman and Glazer, J Clin Invest 2003;112: 487-94). 효과적인 TFO의 디자인, 합성 및 투여에 대한 상세한 설명은 프뢸러 (Froehler) 등의 미국 특허 출원 제2003 017068호 및 제2003 0096980호, 및 엠마뉴엘 (Emanuele) 등의 제2002 0128218호 및 제2002 0123476호 및 론 (Lawn)의 미국 특허 제5,721,138 호에서 발견할 수 있다.
본 발명의 교시의 폴리뉴클레오타이드 제제에 의해 표적화될 수 있는 CELA1 및 CELA3A의 예시적인 핵산 영역은 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35 및 서열번호 36에 기재된 바와 같은 핵산 서열을 포함한다. 그러나, 표적화된 방식으로 이의 발현을 사일런싱하는 카텝신 C, CELA1 및/또는 CELA3A의 임의의 핵산 영역이 본 발명의 교시에 따라 사용될 수 있음을 인식할 것이다.
본 발명은 중등도 내지 엄격한 하이브리드화 조건하에 CELA1 및/또는 CELA3A에 특이적으로 하이브리드화되지만 CELA2A 또는 CELA3B에는 하이브리드화되지 않는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 추가로 제공한다. 본 발명의 엄격한 하이브리드화 조건은 예를 들어, 10 % 덱스트란 설페이트, 1M NaCl, 1 % SDS 및 5 x 106cpm 32p- 표지된 프로브를 함유하는 하이브리드화 용액에 의해 65 ℃에서 영향을 받을 수 있으며 최종 세척 용액은 0.2 x SSC 및 0.1 % SDS였으며 65 ℃에서 최종 세척하였지만, 온화한 하이브리드화 조건은 예를 들어, 10 % 덱스트란 설페이트, 1M NaCl, 1 % SDS 및 5 x 106 cpm 32p-표지된 프로브를 함유하는 하이브리드화 용액에 의해 65 ℃에서 영향을 받을 수 있고, 최종 세척 용액은 1 x SSC 및 0.1 % SDS였으며 50 ℃에서 최종 세척하였다.
본 발명은 중등도 내지 엄격한 혼성화 조건하에 카텝신 C에 특이적으로 하이브리드화하지만 카텝신 A, B, D, E, G, H, K, L1, L2, O, S, W 또는 Z에는 하이브리드화되지 않는 단리된 폴리 뉴클레오타이드를 추가로 제공한다
괴사화 세포에서 카텝신 C, CELA1 및/또는 CELA3A 발현을 하향조절하기 위한 단리된 폴리뉴클레오타이드 제제를 세포 자체에 제공할 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오타이드 제제는 전형적으로 발현 작제물의 일부로서 세포에 투여된다. 이 경우, 폴리뉴클레오타이드 제제는 세포에서 폴리뉴클레오타이드의 발현을 구성적 또는 유도적 방식으로 지시할 수 있는 시스-작용 조절 요소 (예를 들어, 프로모터)의 제어하에 핵산 작제물 내에 연결된다.
본 발명의 발현 작제물은 또한 진핵 세포 (예를 들어, 셔틀 벡터)에서의 복제 및 통합에 적합하게 하는 추가 서열을 포함할 수 있다. 전형적인 클로닝 벡터는 전사 및 번역 개시 서열 (예를 들어, 프로모터, 인핸서) 및 전사 및 번역 종결 (예를 들어, 폴리아데닐화 신호)을 함유한다. 본 발명의 발현 작제물은 프로모터 서열에 인접하거나 멀리있을 수 있고 이로부터 전사를 상향조절할 수 있는 인핸서를 추가로 포함할 수 있다.
이미 기재된 구현예에 추가하여, 본 발명의 발현 작제물은 전형적으로 클로닝된 핵산의 발현 수준을 증가시키거나 또는 재조합 DNA를 보유하는 세포의 동정을 용이하게 하는 다른 특이적 요소를 함유할 수 있다. 예를 들어, 다수의 동물 바이러스는 수용가능한 세포 유형에서 바이러스 게놈의 염색체외 복제를 촉진시키는 DNA 서열을 포함한다. 플라스미드 또는 숙주 세포의 게놈 중 하나로 운반된 유전자에 의해 적절한 인자가 제공되는 한, 이들 바이러스 레플리콘을 갖는 플라스미드는 에피솜으로 복제된다.
본 발명의 발현 작제물은 진핵생물 레플리콘을 포함하거나 포함하지 않을 수있다. 진핵생물 레플리콘이 존재하는 경우, 벡터는 적절한 선별 마커를 사용하여 진핵생물 세포에서 증폭 될 수 있다. 작제물이 진핵생물 레플리 콘을 포함하지 않는 경우, 에피솜 증폭은 불가능한다. 대신, 재조합 DNA는 가공된 세포의 게놈에 통합되며, 프로모터는 원하는 핵산의 발현을 지시한다.
핵산 작제물은 적절한 유전자 전달 비히클/방법 (형질감염, 형질도입 등) 및 적절한 발현 시스템을 사용하여 본 발명의 괴사화 세포에 도입될 수 있다.
포유동물 발현 벡터의 예는 pcDNA3, pcDNA3.1(+/-), pGL3, pZeoSV2(+/-), pSecTag2, pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto, pCR3.1, pSinRep5, DH26S, DHBB, pNMTl, pNMT41, 및 pNMT81 (인비트로겐 (Invitrogen)으로부터 구입가능함), pCI (프로메가 (Promega)로부터 구입가능함), pMbac, pPbac, pBK-RSV and pBK-CMV (스트라트진 (Strategene)으로부터 구입가능함), pTRES (클론테크 (Clontech)로부터 구입가능함), 및 이들의 유도체를 포함하지만, 이로써 제한되지 않는다.
본 발명의 발현 벡터를 인간 세포에 도입하기 위한 다양한 방법이 사용될 수있다. 이러한 방법들은 일반적으로, 예를 들어, 문헌 [참조: Sambrook, J. and Russell, D. W. (1989, 1992, 2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York; Ausubel, R. M. et al., eds. (1994, 1989). Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989); Chang, P. L., ed. (1995). Somatic Gene Therapy, CRC Press, Boca Raton, Fla.; Vega, M. A. (1995). Gene Targeting, CRC Press, Boca Raton, Fla.; Rodriguez, R. L. 및 Denhardt, D. H. (1987). Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworth-Heinemann, Boston, Mass; and Gilboa, E. et al. (1986). Transfer and expression of cloned genes using retro-viral vectors. Biotechniques 4(6), 504-512]에 기재되 있으며, 예를 들어, 안정한 또는 일시적인 형질감염, 리포펙션, 전기천공법, 및 재조합 바이러스 벡터에 의한 감염을 포함한다. 또한, 양성-음성 선택 방법에 대해 미국 특허 제5,464,764호 및 제5,487,992호를 참조한다.
세포내 CELA3A, CELA1 및/또는 카텝신 C 중 적어도 하나가 각각 세포내 표적이기 때문에, 본 발명의 제제는 세포내 전달을 위해 제형화될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 고친화성 결합 분자 (예를 들어, 항체)는 세포내 전달을 위해 추가로 디자인될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 RNA 사일런싱제는 세포-침투성 펩타이드와 기능적으로 회합될 수 있다. 본원에서 사용된 "세포-침투성 펩타이드"는 짧은 (약 12 내지 30개 잔기) 아미노산 서열 또는 세포의 혈장 및/또는 핵 막을 가로지르는 막-과성 복합체의 수송과 관련된 에너지-독립적인 (즉, 비-세포내이입) 전좌 성질을 부여하는 기능성 모티프를 포함하는 펩타이드이다. 본 발명의 일부 구현예의 막-투과성 복합체에 사용되는 세포-침투성 펩타이드는 바람직하게는 적어도 하나의 비-기능성 시스테인 잔기를 포함하며, 이는 이러한 결합을 위해 변형된 이중-가닥의 리보핵산과 함께 디설파이드 결합을 형성하기 위해 유리되거나 유도된 것이다. 이러한 성질을 부여하는 대표적인 아미노산 모티프는 미국 특허 제6,348,185 호에 기재되어 있으며, 그 내용은 명맥하게 본원에 참조로 인용된다. 본 발명의 일부 구현예의 세포-침투성 펩타이드는 바람직하게는 페너트라틴, 트랜스패르탄, pls1, TAT (48-60), pVEC, MTS 및 MAP를 포함하지만, 이로써 제한되지 않는다.
따라서, 예를 들어, 지질-기반 시스템은 본 발명의 표적 세포 (예를 들어, 괴사성 세포) 내로 이들 항체를 전달하기 위해 사용될 수 있다.
리포좀은 체적을 둘러싸는 지질 이중층으로 구성된 임의의 합성 (즉, 자연 발생적이지 않은) 구조를 포함한다. 리포좀은 유제, 발포체, 미셀, 불용성 단일 층, 액정, 인지질 분산액, 라멜라 층 (lamellar layer) 등을 포함한다. 리포좀은 당업계의 임의의 공지된 방법들에 의해 제조될 수 있다 [참조: Monkkonen, J. et al., 1994, J. Drug Target, 2:299-308; Monkkonen, J. et al., 1993, Calcif. Tissue Int., 53: 139-145; Lasic D D., Liposomes Technology Inc., Elsevier, 1993, 63-105. (chapter 3); Winterhalter M, Lasic D D, Chem Phys Lipids, 1993 September;64(1-3):35-43]. 리포좀은 양전하, 중성 또는 음전하일 수 있다. 단핵 식균 시스템 (MPS) 흡수를 위해, (예를 들어, 폴리에틸렌글리콜-연결된 지질 및 친수성 입자의 사용에 의한) 리포좀 막의 친수성 마스킹이 MPS 흡수에 덜 기여할 수 있기 때문에, 리포좀은 소수성일 수 있다. 또한, 리포좀은 강글리오시드-GMj 및 포스파티딜이노시톨과 같은 입체적으로 차폐된 지질을 포함하지 않는 것이 바람직한데, 이는 이들 지질이 MPS 흡수를 방지하기 때문이다.
리포좀은 단일 지질 층일 수 있거나 다중층일 수 있다. 치료제가 친수성인 경우, 이들의 더 큰 내부 체적 때문에 큰 단일라멜라 비히클을 사용하여 전달이 더 향상될 수 있다. 반대로, 치료제가 소수성인 경우, 다중라멜라 비히클을 사용하여 치료제가 더욱 개선될 수 있다. 대안적으로, 치료제 (예를 들어, 항체)는 지질 이중층을 투과할 수 없으며 결과적으로 리포좀 표면에 흡착된 채로 남을 것이다. 이러한 경우, 리포좀의 표면적을 증가시키는 것은 치료제의 전달을 더 개선시킬 수 있다. 본 발명에 따른 적합한 리포좀은, 예를 들어, 포스파티딜-콜린 포스포글리세롤 및 콜레스테롤로부터 제조된 것과 같은 무독성 리포좀이다. 사용된 리포좀의 직경은 0.1 내지 1.0 미크론 범위일 수 있다. 그러나, 식세포에 의한 식균작용에 적합한 다른 크기 범위가 또한 사용될 수 있다. 리포좀의 크기 결정을 위해, 큰 리포좀을 작은 입자로 분할하기 위해 전단 에너지에 의존하는 균질화가 사용될 수 있다. 편리하게 사용될 수 있는 균질기는 마이크로플루이딕스 (Microfluidics) (미국 매사추세츠주 보스톤 소재)에 의해 제조된 미세유동화기를 포함한다. 전형적인 균질화 과정에서, 선택된 리포좀 크기가 관찰될 때까지 표준 에멀젼 균질기를 통해 리포좀을 재순환시킨다. 입자 크기 분포는 통상적인 레이저 빔 입자 크기 식별에 의해 모니터링될 수 있다. 작은-기공의 폴리카보네이트 막 또는 비대칭 세라믹 막을 통한 리포좀의 압출은 리포좀 크기를 비교적 잘 정의된 크기 분포로 감소시키기 위한 효과적인 방법이다. 전형적으로, 현탁액은 원하는 리포좀 크기 분포가 달성 될 때까지 막을 1회 이상 순환한다. 리포좀은 리포좀 크기를 점진적으로 감소시키기 위해 연속적으로 작은 기골 막을 통해 압출될 수 있다.
당해 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 본 발명의 일부 구현예의 치료제를 리포좀에 혼입시킬 수 있다. 예를 들어, 고친화성 분자 (예를 들어, 항체)는 리포좀 내에 캡슐화될 수 있다. 대안적으로, 리포좀의 표면에 흡착될 수 있다. 본 발명의 리포좀에 약제학적 제제를 혼입시키는데 사용될 수 있는 다른 방법들 알폰소 (Alfonso) 등 [참조: Alfonso et al., The science and practice of pharmacy, Mack Publishing, Easton Pa 19th ed., (1995)]에 의해 기재되어 있으며 카르니 (Kulkarni) 등 [참조: J. Microencapsul.1995, 12 (3) 229-46]에 의해 기재되어 있다.
본 발명의 방법에 사용되는 리포좀은 바람직하게는 혈액 장벽을 가로 지른다. 따라서, 본 발명의 리포좀은 바람직하게는 막 부분에 폴리사카라이드 (예를 들어, 만노즈)를 표적으로 하는 혈액 장벽을 포함하지 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 리포좀은 리피좀을 혈액 장벽 상의 수용체에 표적화시키는 펩타이드를 막 부분에 포함하지 않는다. 이러한 펩타이드의 예는 트랜스페린, 인슐린, IGF-1, IGF-2 항-트랜스페린 수용체 항체, 항-인슐린 수용체 항체, 항-IGF-1 수용체 항체 및 항-IGF-2 수용체 항체를 포함하지만, 이로써 제한되지 않는다.
본 발명에 따라 특히 적합한 리포좀을 결정하기 위해, 문헌 [미국 특허 출원 제 20040266734호 및 미국 특허 출원 제20040266734호 및 Danenberg et al, Journal of cardiovascular pharmacology 2003, 42:671-9; Circulation 2002, 106:599-605; Circulation 2003, 108:2798-804]에 기재된 분석과 같은 스크리닝 분석을 수행할 수 있다.
일 구현예에 따라, 세포 괴사를 예방 또는 억제하는 방법은 시험관내, 생체내 또는 생체외에서 수행된다
세포내 CELA3A, CELA1 및/또는 카텝신 C 중 적어도 하나를 조절하는 능력은 괴사 유도된 세포사의 치료를 위한 새로운 치료 양상으로서 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 이를 필요로 하는 대상체에서 세포 괴사와 관련된 의학적 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 카텝신 C, CELA3A 및 CELA1의 발현을 특이적으로 하향조절하고 대안적으로 또는 추가로 활성을 억제하는 치료학적 유효량의 제제를 상기 대상체에게 투여함을 포함한다.
용어 "치료하는"은 질환, 장애 또는 병태의 발달을 억제 또는 정지시키고/시키거나 질병, 장애 또는 병태의 감소, 완화 또는 경감을 일으키거나 질환, 장애 또는 병태의 위험에 처할 수 있지만 질환, 장애 또는 병태를 갖는 것으로 아직 진단되지 않은 대상체에서 발생하는 질환, 장애 또는 의학적 병태를 유지하는 것을 언급한다. 당업자는 다양한 방법 및 분석법을 사용하여 질환, 장애 또는 병태의 발달을 평가할 수 있으며, 유사하게는 다양한 방법 및 분석법을 사용하여 질환, 장애 또는 병태의 감소, 완화 또는 퇴화를 평가할 수 있음을 이해할 것이다.
본원에 사용된 용어 "대상체"는 괴사 관련 장애 또는 병태에 걸리거나 걸리기 쉬운 성별의 젊은이와 노인 모두를 포함하는 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간을 언급한다.
세포 괴사와 관련된 질환 또는 병태는 신경퇴행성 질환, 치매, 파킨슨병, 알츠하이머병, 근위축증, 백혈병, 림프종, 신생아 호흡곤란 증후군, 질식, 감돈 탈장, 진성 당뇨병, 결핵, 자궁내막증, 혈관 이상증, 건선, 한냉 손상, 철-부하 합병증, 스테로이드 치료의 합병증, 허혈성 심질환, 재관류 손상, 뇌혈관 질환 또는 손상, 괴저, 욕창, 췌장염, 간염, 혈색소뇨증, 뇌수막염, 괴저, 허혈 괴사, 무혈성 괴사 (예를 들어, 골의), 세균 패혈증, 바이러스성 패혈증, 화상, 고체온증, 크론병, 셀리악병, 구획 증후군, 괴사성 직장염, 낭포성 섬유증, 류마티스 관절염, 신독성, 다발성 경화증, 척수 손상, 사구체신염, 퇴행성 관절염, 타이로신혈증, 대사성 유전 질환, 마이크로플라즈마 질환, 탄저 감염, 세균 감염, 바이러스성 감염, 앤더슨병, 선천성 미토콘드리아병, 페닐케톤뇨증, 태반 경색증, 매독, 무균성 괴사, 무혈성 괴사, 알콜 중독 및 코카인, 약물, 화학 독소, 농약 및 중금속 투여 및/또는 이의 자가 투여 및/또는 이로의 노출과 관련된 괴사, 피부 필러 투여와 관련된 괴사; 이소성 약물 투여와 관련된 괴사, 예를 들어, 덱스트로스 용액의 혈관외유출, 화학요법 약물; 화학요법-유도된 괴사, 방사선 유도된 괴사, 이식 조직 유지 및 노화로 이루어진 그룹을 포함하지만, 이로써 제한되지 않는다.
일 구현예에 따라, 세포 괴사와 관련된 질환 또는 병태는 뇌 손상 (예를 들어, 외상성 뇌 손상)이다.
따라서, 본 방법은 임의의 급성 또는 만성 중추 신경계 (CNS) 손상과 관련된 괴사를 치료하는데 유용하다. 상기 질환 또는 병태는 뇌졸중 (혈전증, 색전증 또는 혈관수축으로 인한 것), 폐쇄성 뇌 손상, 전뇌 허혈 (예를 들어, 심근 경색증, 심장 부정맥, 출혈성 쇼크, 및 관상동맥 우회술 후 뇌 손상을 포함하는 임의의 원인에 전진성 저혈압으로 인한 허혈), 국소 허혈 및 두개내 출혈를 포함할 수 있지만, 이로써 제한되지 않는다. CNS에 대한 허혈성 손상은 전세계적 또는 국소 허혈 병태로 인해 발생할 수 있다. 전뇌 허혈은 심장 정지와 같이 일정 기간 동안 전체 뇌로의 혈류가 중단되는 곳에서 발생한다. 국소 허혈은 뇌의 일부가 뇌 혈관의 혈전용해 폐색, 외상성 두부 손상, 부종 및 뇌종양과 같은 정상적인 혈류를 빼앗길 때 발생한다. 뇌 허혈로 인한 CNS 손상의 대부분은 허혈성 병태 이후 수시간 또는 수일동안 발생하며, 손상된 조직에 의한 세포 독성 생성물의 방출에 이어 두번째이다.
일부 양태에서, 본 발명은 구체적으로, 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 임의의 알려진 원인, 예를 들어, 감염에 기초한 또는 독성 물질 노출 등으부터 발생하는 간 독성의 치료 또는 예방을 고려한다.
일부 양태에서, 본 발명은 구체적으로, 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 일부 양태에서 심근경색증, 심부전증, 심부전 등을 포함하여, 심장 질환의 치료 또는 예방을 고려한다.
본 발명의 교시에 따라, 세포 괴사와 관련된 의학적 질환 또는 병태를 치료하기 위해, 상기에 더 자세히 설명된 바와 같이, 대상체에 카텝신 C, CELA1 및/또는 CELA3A 또는 구조적으로 관련된 효소의 발현을 특이적으로 하향조절하고 대안적으로 또는 추가로 억제하는 제제를 투여한다.
상기 기재된 하향조절제 또는 하향조절제를 암호화하는 발현 벡터 각각은 그 자체로 또는 생리학적으로 허용되는 담체를 또한 포함하는 약제학적 조성물의 일부로서, 또는 일부 양태에서, 접합체, 하전된 입자, 리포좀 또는 당해 분야에 공지된 임의의 담체의 일부로서 개체에게 투여될 수 있고 다시 일부 양태에서, 약제학적 조성물의 일부로서 제형화될 수 있음을 인식할 것이다. 약제학적 조성물의 목적은 활성 성분의 유기체로의 투여를 용이하게 하는 것이다.
본원에 사용된 "약제학적 조성물"은 생리학적으로 적합한 담체 및 부형제와 같은 다른 화학 성분을 갖는 본원에 기재된 하나 이상의 활성 성분의 제제를 언급한다. 약제학적 조성물의 목적은 화합물을 유기체에 투여하는 것을 용이하게 하는 것이다.
본원에서 용어 "활성 성분"은 세포내 CELA3A, CELA1, 및/또는 카텝신 C 중 적어도 하나를 언급하며, 생물학적 효과에 대해 책임이 있는 억제제를 하향조절 또는 억제한다.
이후, 상호교환적으로 사용될 수 있는 "생리학적으로 허용되는 담체" 및 "약제학적으로 허용되는 담체"라는 문구는 유기체에 유의한 자극을 유발하지 않고 투여된 화합물의 생물학적 활성 및 성질을 폐지하지 않는 담체 또는 희석제를 언급한다. 이들 문구에는 보조제가 포함되어 있다.
본원에서 용어 "부형제"는 활성 성분의 투여를 보다 용이하게 하기 위해 약제학적 조성물에 첨가된 불활성 물질을 언급한다. 부형제의 예는 비제한적으로 탄산칼슘, 인산칼슘, 다양한 당 및 전분 유형의 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 식물성 오일 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.
약물 제형화및 투여 기술은 "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA, 최신판에서 발견할 수 있으며, 이는 본원에 참조로 인용된다.
적합한 투여 경로는, 예를 들어, 우심실 또는 좌심실 공동 내로, 일반적인 관상 동맥, 정맥내, 복강내, 비강내, 또는 안내 주사 내로 근육내, 피하 및 골수내 주사 뿐만 아니라 척수강내, 직접 심실내, 심장내 주사를 포함하는 경구, 직장, 경점막, 특히 경비, 장내 또는 비경구 전달을 포함할 수 있다.
중추 신경계 (CNS)로의 약물 전달을 위한 통상적인 접근법은 include: 신경외과적 전략 (예를 들어, 뇌내 주사 또는 뇌실내 주입); BBB의 내인성 수송 경로 중 하나를 이용하려는 시도에서 제제의 분자 조작 (예를 들어, 내피 세포 표면 분자에 대한 친화성을 갖는 수송 펩타이드와 그 자체가 BBB를 가로지를 수 없는 제제를 조합하여 포함하는 키메라 융합 단백질의 생산); 제제의 지질 용해도를 증가시키기 위해 고안된 약리학적 전략 (예를 들어, 수용성 제제와 지질 또는 콜레스테롤 캐리어와의 접합); 및 고삼투압성 붕괴에 의한 BBB의 완전성의 일시적인 파괴 (경동맥 내로의 만니톨 용액의 주입 또는 안지오텐신 펩타이드와 같은 생물학적 활성제의 사용으로 인해 발생함)를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따라, 약제학적 조성물은 세포막을 관통하도록 제형 화된다. 따라서, 예를 들어, 약제학적 조성물은 지질 소포체를 포함할 수 있다.
대안적으로, 예를 들어, 약제학적 조성물을 환자의 조직 영역 (예를 들어, 괴사 조직)에 직접 주입함으로써 전신적 방식보다는 국부적 방식으로 약제학적 조성물을 투여할 수 있다.
본 발명의 일부 구현예의 약제학적 조성물은, 예를 들어, 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당의정화 (dragee-making), 가루화 (levigating), 유화, 캡슐화, 포획 또는 동결건조 방법에 의해 당해 분야에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다.
따라서, 본 발명의 일부 구현예에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물은 약제학적으로 사용될 수 있는 제제로 활성 성분을 가공하는 것을 용이하게하 는 부형제 및 보조제를 포함하는 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 담체를 사용하여 통상적인 방식으로 제형화될 수 있다. 적절한 제형은 선택된 투여 경로에 의존한다.
주사를 위해, 약제학적 조성물의 활성 성분은 수용액, 바람직하게는 행크 용액, 링거 용액 또는 생리학적 염 완충액과 같은 생리학적으로 상용성인 완충액으로 제제화될 수 있다. 경점막 투여를 위해, 침투될 장벽에 적합한 침투제가 제형에 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 당해 분야에 공지되어 있다.
경구 투여의 경우, 당해 분야에 익히 공지된 약제학적으로 허용되는 담체와 활성 화합물을 배합하여 약제학적 조성물을 용이하게 제형화할 수 있다. 이러한 담체는 환자에 의한 경구 섭취를 위해 약제학적 조성물을 정제, 환제, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로 제형화할 수 있다. 경구용 약리학적 제제는 고체 부형제를 사용하여, 임의로 생성된 혼합물을 분쇄하고, 원하는 경우 적합한 보조제를 첨가한 후에 과립의 혼합물을 가공하여 정제 또는 당의정 코어를 수득 할 수 있다. 적합한 부형제는 특히, 락토오스, 수크로오, 만니톨 또는 소르비톨을 포함하는 당과 같은 충전제; 예를 들어 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트라가칸트 검, 메틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸-셀룰로오스, 나트륨 카보메틸셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 제제; 및/또는 폴리비닐피롤리돈 (PVP)과 같은 생리학적으로 허용되는 중합체이다. 경우에 따라, 붕해제가 첨가될 수 있는데, 예를 들면, 가교결합된 폴리비닐 피롤리돈, 한천 또는 알긴산 또는 또는 이의 염, 예를 들면, 알긴산 나트륨이 있다.
당의정 코어에는 적합한 코팅이 제공된다. 이를 위해, 아르비아 검, 탈크, 폴리비닐 피롤리돈, 카보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜, 이산화티탄, 래커 용액 및 적합한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 임의로 함유할 수 있는 농축 당 용액을 사용할 수 있다. 염료 또는 안료를 정제 또는 당의정 코팅에 첨가하여 활성 화합물 용량의 상이한 조합을 확인하거나 특성분석할 수 있다.
경구로 사용될 수 있는 약제학적 조성물은 젤라틴으로 제조된 푸시-핏 (push-fit) 캡슐 뿐만 아니라 젤라틴 및 글리세롤 또는 소르비톨과 같은 가소제로 제조된 연질 밀봉된 캡슐을 포함한다. 상기 푸시-핏 캡술은 활성 성분을 락토스와 같은 충전제, 전분과 같은 결합제, 활석 또는 스테아르산마그네슘과 같은 윤활제 및 임의로 안정화제와 혼합하여 함유할 수 있다. 상기 연질 캡슐에서, 활성 성분은 지방 오일, 액체 파라핀 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 액체에 용해되거나 현탁될 수 있다. 또한, 안정화제가 첨가될 수 있다. 경구 투여를 위한 모든 제형은 선택된 투여 경로에 적합한 투여량이어야 한다.
협측 투여의 경우, 조성물은 통상적인 방식으로 제형화된 정제 또는 로젠지 형태를 취할 수 있다.
비강 흡입비강 흡입에 의한 투여의 경우, 본 발명의 일부 구현예에 따라 사용하기 위한 활성 성분은 적합한 추진제, 예를 들어, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로-테트라플루오로에탄 또는 이산화탄소를 사용하여 가압 팩 또는 분무기로부터의 에어로졸 분무 표시 형태로 편리하게 전달된다. 가압 에어로졸의 경우, 투여량 단위는 계량된 양을 전달하기 위한 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 디스펜서에 사용하기 위한 예를 들어, 젤라틴과의 캡슐 및 카트리지는 화합물과 락토오스 또는 전분과 같은 적합한 분말 기재의 분말 혼합물을 함유하여 제형화될 수 있다.
본원에 기재된 약제학적 조성물은 비경구 투여, 예를 들어, 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의해 제형화될 수 있다. 주사용 제형은 단위 투여 형태, 예를 들어, 앰플 또는 다회투여용 용기에, 임의로 방부제를 첨가하여 제공될 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 유제일 수 있으며, 현탁 제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 함유할 수 있다.
비경구 투여용 약제학적 조성물은 수용성 형태의 활성 제제의 수용액을 포함한다. 또한, 활성 성분의 현탁액은 적절한 유성 또는 수성 주사 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클은 참기름과 같은 지방성 오일 또는 에틸 올레에이트, 트리글리세라이드 또는 리포좀과 같은 합성 지방산 에스테르를 포함한다. 수성 주사 현탁액은 나트륨 카복시메틸 셀룰로오스, 소르비톨 또는 덱스트란과 같은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 함유할 수 있다. 임의로, 현탁액은 또한 고농축 용액의 제조를 허용하기 위해 활성 성분의 용해도를 증가시키는 적합한 안정화제 또는 제제를 함유할 수 있다.
대안적으로, 활성 성분은 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들어, 살균의 발열원이 없는 수성 용액으로 구성하기 위한 분말 형태일 수 있다.
본 발명의 일부 구현예의 약제학적 조성물은 또한, 예를 들어, 코코아 버터 또는 기타 글리세리드와 같은 통상적인 좌제 기재를 사용하여 좌약 또는 정체 관장 (retention enemas)과 같은 직장 조성물로 제형화될 수 있다.
본 발명의 일부 구현예의 맥락에 사용하기에 적합한 약제학적 조성물은 활성 성분이 의도된 목적을 달성하는데 효과적인 양으로 함유된 조성물을 포함한다. 보다 구체적으로, 치료학적 유효량은 장애 (예를 들어, 세포 괴사)의 예방, 완화 또는 증상 개선 또는 치료될 대상체의 생존을 연장시키는데 유효한 활성 성분 (예를 들어, 세포내 CELA3A, CELA1, 및/또는 카텝신 C 중 적어도 하나를 하향조절 또는 억제하는 제제)의 양을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따라, 본 발명의 제제의 유효량은 세포 괴사가 세포 아폽토시스로 전환되도록 선택되는 양이다.
본원에 사용된 용어 "세포 아폽토시스"는 프로그램된 세포사의 세포 과정을 언급한다. 아폽토시스는 세포질과 핵에서 뚜렷한 형태학적 변화, 규칙적으로 이격된 부위에서의 염색질 절단, 뉴클레오좀내 부위에서 게놈 DNA의 내부핵산가수분해 분해성 절단을 특징으로 한다. 이러한 변화는 수포, 세포 수축, 핵 분열, 염색질 응축 및 염색체 DNA 단편화를 포함한다. 그러나, 괴사와 달리, 아폽토시스는, 식세포 세포의 내용물이 주변 세포로 유출되어 손상을 일으키기 전에 삼켜서 신속하게 제거할 수 있는, 아폽토시스 바디로 불리는 세포 단편을 생산한다.
치료학적 유효량의 결정은 특히 본원에서 제공된 상세한 설명에 비추어 당업자의 능력 범위 내에 있다.
본 발명의 방법에 사용된 임의의 제제에 대해, 치료학적 유효량 또는 투여 량은 초기에 시험관내 및 세포 배양 분석으로부터 추정될 수 있다 (하기 실시예 섹션의 실시예 1 내지 3 참조). 또한, 원하는 농도 또는 적정을 달성하기 위해 동물 모델에서 용량을 공식화할 수 있다. 이러한 정보는 인간에서 유용한 용량을 보다 정확하게 결정하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 기재된 활성 성분의 독성 및 치료학적 효능은 시험관내, 세포 배양 또는 실험 동물에서의 표준 약제학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 이러한 시험관내 및 세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 얻은 데이터는 인간에서 사용하기 위한 투여량 범위를 공식화하는데 사용될 수 있다. 투여량은 사용된 투여 형태 및 사용된 투여 경로에 따라 달라질 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로 및 투여량은 환자의 상태를 고려한 개별 의사에 의해 선택될 수 있다 (참조: 예를 들어, Fingl, et al., 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p. 1).
괴사성 질환 및 병태에 대한 동물 모델은 include the porcine model for 무균성 괴사를 위한 돼지 모델 [참조: 예를 들어, Muller-Vahl H and Pabst R., Int J Tissue React. (1984) 6(3):251-4], 대퇴골두 괴사의 양 모델 [참조: 예를 들어, J. Manggold et al., Laboratory Animals (2002) 36, 173-180]을 포함한다.
투여량 및 투여 간격은 개별적으로 조절되어 생물학적 효과 (최소 유효 농도, MEC)를 유발하거나 억제하기에 충분한 양의 활성 성분을 제공할 수 있다. MEC는 각 제조에 따라 다르지만 시험관내 데이터로부터 추정할 수 있다. MEC를 달성하는 데 필요한 투여량은 개체의 특성과 투여 경로에 좌우될 것이다. 검출 분석은 혈장 농도를 결정하는데 사용될 수 있다.
치료될 병태의 중증도 및 반응성에 따라, 투약은 수일 내지 수주 지속되는 치료 과정 또는 치료가 이루어지거나 질환 상태의 감소가 달성될 때까지 단일 또는 복수의 투여일 수 있다.
투여될 조성물의 양은 물론 치료되는 대상, 고통의 중증도, 투여 방식, 처방 의사의 판단 등에 좌우될 것이다.
본 발명의 일부 구현예의 조성물은 경우에 따라 활성 성분을 함유하는 하나 이상의 단위 투여형을 함유할 수 있는 FDA 승인 키트와 같은 팩 또는 디스펜서 장치로 제공될 수 있다. 팩은, 예를 들어, 블리스터 팩과 같은 금속 또는 플라스틱 호일을 포함할 수 있다. 팩 또는 디스펜서 장치에는 투여를 위한 지침서가 첨부될 수 있다. 팩 또는 디스펜서는 또한 의약품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태로 컨테이너와 관련된 통지서에 의해 수용될 수 있으며, 상기 통지서는 구성 또는 인간 또는 수의학 투여 형태의 해당 기관의 승인을 반영한 것이다. 예를 들어, 이러한 통지서는 미국 식품 의약국 (FDA)의 승인을 받은 처방 약물 또는 승인된 제품 삽입물의 라벨링일수 있다. 상용성 약제학적 담체 중에 제형화된 본 발명의 제제를 포함하는 조성물을 또한 제조하고, 적절한 컨테이너에 넣고, 추가로 상술한 바와 같이 나타낸 병태의 치료를 위해 표지될 수있다.
본 발명의 제제는 제조 물품으로서 적합하게 팩키징될 수 있는 약제학적 조성물로서 적합하게 제형화될 수 있다. 상기 제조 물품은 약제학적 유효량의 하향 조절제를 팩키징하는 괴사 관련 질환의 치료에 사용하기 위한 라벨을 포함한다.
본 발명의 제제 또는 조성물 각각은 항-아폽토시스제 또는 항염증제를 포함하지만, 이로써 제한되지 않는 다른 공지된 치료제와 함께 투여될 수 있음을 인식할 것이다.
본 발명의 제제 또는 조성물은 후자의 투여 전에, 투여와 동시에, 또는 투여 후에 투여될 수 있다.
본 발명의 교시에 따라 사용될 수 있는 항-아폽토시스제는 -[R]-N-[2-헵틸]-메틸프로파르길아민 (R-2HMP), 비타민 E, 비타민 D, 카스파제 억제제 및 친수성 담즙염 우르소데옥시콜산을 포함하지만, 이로써 제한되지 않는다.
본 발명의 교시에 따라 사용될 수 있는 항염증제는 알클로페낙; 알클로메타손 디프로피오네이트; 알게스톤 아세토나이트; 알파 아밀라제; 암시나팔; 암시나피드; 암페낙 나트륨; 아미프릴로스 하이드로클로라이드; 아나킨라; 아니롤락; 아니트라자펜; 아파존; 발살레지드 이나트륨; 벤다작; 베녹사프로펜; 벤지드아민 하이드로클로라이드; 브로멜라인; 브로페라몰; 부데소니드; 카프로펜; 시클로프로펜; 신타존; 글리프로펜; 클로베타솔 프로피오네이트; 클로베타손 부티레이트; 클로피락; 클로티카손 프로피오네이트; 코르메타손 아세테이트; 코르토독손; 데플라자코르트; 데소나이드; 덱스옥시메타손; 덱사메타손 디프로피오네이트; 디클로페낙 칼륨; 디클로페낙 나트륨; 디플로라손 디아세테이트; 디플루미돈 나트륨; 디플루니살; 디플루프레드네이트; 디프탈론; 디메틸 설폭사이드; 드로시노나이드; 엔드리손; 엔리모맙; 에놀리캄 나트륨; 에피리졸; 에토돌락; 에토페나메이트; 펠비낙; 펜아몰; 펜부펜; 펜클로페낙; 펜크로락; 펜도살; 펜피팔론; 펜티아잭; 플라잘론; 플루아자코르트; 플루페남산; 플루미졸; 플루니솔라이드 아세테이트; 플루닉신; 플루닉신 메글루민; 플루오코르틴 부틸; 플루오로메톨론 아세테이트; 플루쿠아존; 플루르비프로펜; 플루레토펜; 플루티카손 프로피오네이트; 푸라프로펜; 푸로부펜; 할시노니드; 할로베타솔 프로피오네이트; 할로프레돈 아세테이트; 이부페낙; 이부프로펜; 이부프로펜 알루미늄; 이부프로펜 피코놀; 일로니답; 인도메타신; 인도메타신 나트륨; 인도프로펜; 인독솔; 인트라졸; 이소플루프레돈 아세테이트; 이속세팍; 이속시탐; 케토프로펜; 로페미졸 하이드로클로라이드; 로목시캄; 로테프레드놀 에타부네이트; 메클로페나메이트 나트륨; 메클로페남산; 메클로리손 디부티레이트; 메페남산; 메살아민; 메섹라존; 메틸프레드니솔론 술렙타네이트; 모미플루메이트; 나부메톤; 나프록센; 나프록센 나트륨; 나프록솔; 니마존; 올살라진 나트륨; 오르고테인; 오르파녹신; 옥사프로진; 옥시펜부타존; 파라닐린 하이드로클로라이드; 펜토산 폴리설페이트 나트륨; 펜부타존 나트륨 글리세레이트; 피르페니돈; 피록시캄; 피록시캄 신나메이트; 피록시캄 (디아민); 피르프로펜; 프레드나제이트; 프리펠론; 프로돌릭산; 프로쿠아존; 프록사졸; 프록사졸 시트레이트; 리멕솔론; 로마자리트; 살콜렉스; 살나세딘; 살살레이트; 산구이나륨 클로라이드; 세클라존; 세르메타신; 수독시캄; 설린닥; 수프로펜; 탈메탁신; 탈니플루메이트; 탈로살레이트; 테부펠론; 테니답; 테니답 나트륨; 테녹시캄; 테시캄; 테시마이드; 테트리드아민; 티오피낙; 틱소코르톨 피발레이트; 톨메틴; 톨메틴 나트륨; 트리클로나이드; 트리플루미데이트; 지도메탁신; 조메피락 나트륨을 포함하지만, 이로써 제한되지 않는다.
치료 효능을 시험하기 위해, 대상체는 신체 검사 뿐만 아니라 세포 괴사를 평가하기 위한 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 괴사성 세포 또는 조직 샘플을 수득할 수 있고 (예를 들어, 대상체로부터), 괴사성 세포는 빛, 형광 또는 전자 현미경 검사 기술 또는 트립판 블루로 염색됨으로써 확인될 수 있으며, 이로써 괴사성 세포가 염료를 흡수하여 청색으로 염색된다. 괴사성 세포는 막 완전성의 손실, 세포소기관의 붕괴 및/또는 염색질의 응집을 포함하는 형태학적 변화를 통해 건강한 세포와 구별될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따라, 이를 필요로 하는 대상체에서 노화를 치료 및/또는 예방하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) 대상체의 세포에서 카텝신 C, CELA3A 또는 구조적으로 유사한 효소 및 CELA1의 발현을 특이적으로 조절하고 선택적으로 또는 추가로 활성을 억제하는 제제를 환자에게 투여하는 단계; 및 (b) 항-노화제를 대상체에 투여하여 노화를 치료 및/또는 예방하는 단계를 포함한다.
본 발명의 교시에 따라, 예를 들어, 항산화제, 피토케미컬, 호르몬 및 지방산과 같은 임의의 항-노화제로가 사용될 수 있다.
본 발명의 교시에 따라 사용될 수 있는 예시적인 항-노화제는 비타민 E, 비타민 C, 코엔자임 Q10, 리포산, 폴산, 셀레늄, 플라보노이드, 카로틴, 비타민 B 및 카르니틴을 포함하지만, 이로써 제한되지 않는다.
본 발명의 교시와 함께 사용될 수 있는 분자는 다음과 같이 이들의 특이성에 적격일 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 양태에 따라, 세포의 괴사를 억제할 수 있는 제제를 동정하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 괴사 신호를 받는 세포 내로 시험 제제를 도입하고, 시험 약제가 세포내 CELA3A, CELA1, 및/또는 카텝신 C 중 적어도 하나의 발현을 특이적으로 하향조절하고 대안적으로 또는 추가로 이의 활성을 억제하며, 이에 의해 세포의 괴사를 억제하는지를 동정하는 단계를 포함한다. 시험 제제는 경로에서 다른 CELA 단백질 또는 단백질과 같은 다른 세포 단백질에 대한 효과를 시험함으로써 특이성을 시험한다 (상기에 "특이성"으로 추가로 정의됨).
추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명은 괴사 및 관련 질환 및 병태의 예방 및 치료에 사용하기 위한 특정 소형 억제 분자를 제공한다. 분자의 리스트에는 다양한 화학 계열에 속하는 소형 억제 화합물, 예를 들어, 2-아미노이미다졸린, 아미노티아졸 및 이속사졸이 포함된다. 본 발명은 또한 세포 괴사와 관련된 질환 또는 의학적 병태의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 다양한 소분자 억제제를 제공한다. 추가의 구현예에서, 세포 괴사와 관련된 질환 또는 의학적 병태의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에서 소분자 억제제의 용도가 제공되었다.
따라서, 일 구현예에 따라, 시험 제제는 소분자 또는 천연 엘라스타제 억제제 (예를 들어, 인돌-3-카비놀 또는 플라바놀(-)에피갈로카테킨-3-갈레이트)일 수 있으며, 본 발명의 교시를 사용하여 CELA1 또는 CELA3의 이의 특이적 억제를 평가할 수 있다. 시험 제제가 특이적 CELA1/CELA3A 억제제로서 확인된 후, 세포 괴사의 억제에 대해 추가로 분석된다. 상기 분자의 리스트는 표 1에 제시되어 있다.
예를 들어, 본 발명의 소분자는 전이 상태 유사체 (즉, 효소-촉매된 화학 반응에서 기질 분자의 전이 상태와 유사한 화학 구조를 갖는 화학적 화합물이지만, 이들은 전형적으로 화학 반응을 일으키지 않고 효소 억제제로서 작용한다), 가역적 억제제 (즉, 효소, 효소-기질 복합체 또는 둘 다에 비공유 결합하는 억제제) 및 비가역적 억제제 (즉, 효소와 전형적으로 반응하는 억제제 및 예를 들어, 공유 결합 형성을 통해 화학적으로 변화시키고, 효소 활성에 필요한 주요 아미노산 잔기를 변경)를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 임의의 화합물에 관하여, 본 발명은 또한 임의의 이성체, 약제학적으로 허용되는 염, 약제학적 생성물, 수화물, N-옥사이드, 결정 또는 이들의 임의의 조합을 고려하며, 이는 본 발명의 일부로 고려되어야 한다.
하나의 구현예에 따라, 시험 제제는 고친화성 결합 분자 또는 폴리뉴클레오타이드일 수 있고, 카텝신 C, CELA1, CELA3A 또는 구조적으로 이에 관련된 효소의 특이적 억제는 본 발명의 교시를 사용하여 평가될 수 있다. 시험 제제가 특이적 억제제로서 확인된 후에, 세포 괴사의 억제에 대해 추가로 분석된다.
따라서, 본 발명의 일부 구현예에 따라, 세포 괴사와 관련된 질환 또는 의학적 병태의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 세포-투과성 프로테아제 억제제가 제공된다. 프로테아제 억제제는 괴사를 겪는 세포에서 괴사성 세포사에 관여하는 적어도 하나의 세포내 프로테아제의 효소 활성을 억제한다. 세포내 프로테아제는 CELA3A, CELA1 및 카텝신 C로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 프로테아제는 CELA3A이다.
본원에서 사용된 용어 "약"은 ± 10 %를 언급한다.
용어 "포함하다 (comprises)", "포함하는 (comprising)", "포함하다 (includes)", "포함하는 (including)", "갖는" 및 이들의 동일 어원은 "포함하지만 이로써 제한되지 않는다"를 의미한다.
용어 "이로 이루어진"은 "포함하고 이로 제한되는"을 의미한다.
용어 "이로 본질적으로 이루어지는"은 추가의 성분, 단계 및/또는 부분이 청구된 조성물, 방법 또는 구조의 기본 및 신규한 특성을 실질적으로 변경시키지 않는 경우에만, 조성물, 방법 또는 구조는 추가의 성분, 단계 및/또는 부분을 포함 할 수 있음을 의미한다.
본원에 사용된 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 명확하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 대상을 포함한다. 예를 들어, 용어 "화합물" 또는 "적어도 하나의 화합물"은 이의 혼합물을 포함하여 복수의 화합물을 포함할 수 있다.
본원 전반에 걸쳐, 본 발명의 다양한 구현예는 범위 형식으로 제공될 수 있다. 범위 형식에서의 설명은 단지 편의상 및 간략화를 위한 것이며 본 발명의 범위에 대한 융통성 없는 제한으로 해석되어서는 안됨을 이해해야 한다. 따라서, 범위의 설명은 모든 가능한 하위범위 및 그 범위 내의 개별 수치를 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 설명은 이 범위 내의 개별 숫자, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 및 6 뿐만 아니라, 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같은 하위범위를 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 이는 범위의 폭에 관계없이 적용된다.
본원에 수치 범위가 지시될 때마다, 지시된 범위 내에서 임의의 인용된 숫자 (분수 또는 정수)를 포함함을 의미한다. 제1 지시 숫자와 제2 지시 숫자 "사이의 범위/범위"라는 문구 및 제1 지시 숫자 "내지" 제2 지시 숫자의 "로부터의 범위/범위"는 본원에 상호교환적으로 사용되며 제1 및 제2 지시된 숫자 및 그 사이의 모든 분수와 정수 숫자를 포함하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "방법"은 공지된 방식으로 공지되거나 또는 공지된 방식으로 용이하게 개발된 방식, 수단, 기술 및 절차를 포함하지만 이에 제한되지 않는 주어진 작업을 수행하기위한 방식, 수단, 기술 및 절차를 의미한다. 화학적, 약리학적, 생물학적, 생화학적 및 의학적 분야의 전문가 및 기술 및 절차에 대해 설명합니다.
본원에 사용된 용어 "방법"은 화학적, 약리학적, 생물학적, 생화학적 및 의학적 분야의 종사자가 알고 있는 방식, 수단, 기술 및 절차로 알려져 있거나 이들에 의해 쉽게 개발된 방식, 수단, 기술 및 절차를 포함하지만 이로써 제한되지 않는 주어진 작업을 수행하기 위한 방식, 수단, 기술 및 절차를 의미한다
명료화를 위해, 별도의 구현예의 문맥에 기재된 본 발명의 특정 특징들은 단일 구현예에서 조합하여 제공될 수도 있다는 것을 인식한다. 반대로, 간략화를 위해, 단일 구현예의 문맥에 기재된 본 발명의 다양한 특징은 또한 개별적으로 또는 임의의 적절한 하위조합으로 또는 본 발명의 임의의 다른 기재된 구현예에 적합하게 제공될 수 있다. 다양한 구현예의 문맥에 기재된 특정 특징들은 구현예가 이들 요소없이 작동하지 않는 한, 이들 구현예의 필수적인 특징으로 고려되어서는 안된다.
상기 설명되고 하기 청구항 섹션에 청구된 바와 같은 본 발명의 다양한 구현예 및 양상은 하기 실시예에서 실험적 뒷받침을 발견한다.
실시예
이제 상기 기재와 함께 비제한적 양상으로 본 발명을 설명하는 하기의 실시예를 참조한다.
일반적으로, 본원에 사용된 명명법 및 본 발명에 사용된 연구 과정은 분자, 생화학적, 미생물학적 및 재조합 DNA 기술을 포함한다. 상기 기술은 문헌에 전반적으로 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌 ["Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); methodologies as set forth in U.S. Pat. Nos. 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 and 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980)]을 참조하고; 가용한 면역검정은 특허 및 과학적 문헌에 광범위하게 기재되어 있고, 예를 들어, 문헌 [U.S. Pat. Nos. 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 and 5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein 정제 and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996)]을 참조하고; 이 모두는 본원에 완전하게 제시된 것 처럼 문헌에 인용되어 있다. 다른 일반 참조문헌은 상기 문헌에 제공되어 있다. 본원의 과정들은 당업계에 널리 공지되어 있는 것으로 사료되고 검토자의 편의를 위해 제공된다. 본원에 함유된 모든 정보는 본원에서 참조로 인용된다.
일반 재료 및 실험 과정
시험관내 괴사의 모델
KCN -유도된 괴사
인간 전단핵구 U-937 세포 (p53-음성 전단핵구 세포주)는 10 % 열-불활성화된 태아 소 혈청, 2 mM 글루타민, 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640 배지에서 현탁 상태로 증식시켰다. 대수증식기에서 세포는 4 x 105/ml의 농도로 씨딩하였다 (참조: Tsesin N, et al. Chemistry and Physics of Lipids, 2014, 183: 159-168).
상기 래트 갈색세포종 PC12 세포주는 5% 열-불활성화된 소 혈청, 10 % 열-불활성화된 말 혈청, 2 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신이 보충된 DMEM 배지 (Beit Haemek, Israel)에서 증식시켰다. 대수증식기에서 PC12 세포는 96-웰 플레이트에서 1.2 x 105/웰의 농도로 씨딩하고 밤새 항온처리하였다.
이후, 상기 세포는 2회 세척하고 2 mM 피루베이트 및 10 % 투석된 FCS가 보충된 RPMI-1640 (U-937 세포) 및 DMEM (PC-12 세포) 글루코스-부재 배지에서 1시간 동안 유지시켰다. 이어서 세포는 7시간 (U-937 세포) 또는 5시간 (PC12 세포) 동안 나타낸 농도에서 KCN (Merck, Germany)의 존재 또는 부재하에 처리하였다.
억제제의 시험
엘라스타제 억제제 II (MeOSuc-AAPA-CMK) 및 엘라스타제 억제제 III (MeOSuc-AAPV-CMK)는 제조원(Calbiochem-Novabiochem, USA)으로부터 구입하였다. 화합물 Gly-Phe 디아조메틸케톤은 제조원(MP Biomedicals, USA)으로부터 구입하였다. 상기 본원에서 표 1에 기재된 모든 화합물은 제조원(ChemDiv, San Diego, CA)으로부터 구입하였다. 상기 화합물은 DMSO 중에 용해시키고 세포사 유도제의 첨가 30분전에 투여하였다. 모든 샘플에 첨가되는 DMSO의 최종 농도는 0.1 %였고 이는 그 자체가 어떠한 효과도 갖지 않았다.
siRNA 및 세포 형질감염
세포는 HiPerFect 형질감염 시약과 특이적 프로테아제를 억제하는 것을 목표로 하는 siRNA의 복합체로 또는 하기와 같이 적당한 대조군으로 48시간 동안 처리하였다. HiPerFect 형질감염 시약은 siRNA를 효과적으로 흡수할 수 있고 세포 내부에서 siRNA를 효율적으로 방출시켜 완전한 유전자 녹다운을 유발하는 양이온 및 중성 지질의 블렌드이다. 음성 및 양성 세포사 대조군은 제조 지침에 따라 사용하였다. 카텝신 C 사일런싱을 위한 siRNA 서열은 ATGATCTGCATCAGTTGTAAA (서열번호 1)이다. CELA1에 대한 siRNA 서열은 CGGCAACATGCTGGTCCTTTA (서열번호 2)이고 CELA3A에 대한 siRNA 서열은 CTGCCTTTGGCTGCAACTTCA (서열번호 3)이다. 대조군을 위해 사용되는 siRNA 서열은 AATTCTCCGAACGTGTCACGT (서열번호 4)이다. 모든 siRNA 및 HiPerFect™ 형질감염 시약은 제조원 (Qiagen)으로부터 구입하였다.
이후, 정상 또는 사일런싱 세포는 2회 세척하고 1시간 동안 글루코스-부재 배지로 이동시키고 이어서 상기된 바와 같이 시안화칼륨으로 괴사를 유도하였다. 세포사 속도는 용해된 세포로부터의 안정한 세포질 효소인 락테이트 데하이드로게나제 (LDH)의 방출을 정량함에 의해 세포사를 정확하고 신속하게 측정하는 Promega's CytoTox 96® 비-방사능활성 세포독성 검정에 의해 평가하였다.
CELA1 siRNA 서열은 CELA1 전사체와 완전히 일치하지만 이것은 또한 CELA3A 및 CELA3B와 불완전하게 일치한다. CELA3A siRNA는 CELA3A와 완전히 일치한다.
괴사 및 아폽토시스의 형태학적 정량화
아폽토시스성 또는 괴사성 세포사와 관련된 형태학적 변화를 겪는 세포는 이전에 기재된 바와 같이 모니터링하였다 [참조: McGahon AJ et al., Methods Cell Biol (1995) 46: 153-184 및 Zelig U et al., Biophys J. 2009 Oct 7; 97(7):2107-14.]. 처리 후 소정의 시점에서 1 ml의 세포 현탁액을 수거하고 원심분리하고 펠렛을 PBS 중에서 염료 혼합물(100 ㎍/ml의 아크리딘 오렌지 및 100 ㎍/ml의 에티듐 브로마이드로 이루어진)의 20배 희석물에 재현탁시키고 유리 슬라이드 상에 위치시켜 형광 현미경 상에서 관찰하였다. 세포는 핵이 정상 형태를 나타내고 녹색인 경우 생존하는 것으로서 스코어링하였다. 정상 형태 및 오렌지 색을 나타내는 세포는 괴사성으로서 스코어링하였다. 세포는 이들의 핵이 염색질 농축 및/또는 핵 단편화를 나타내는 경우 아폽토시스성으로서 스코어링하였다. 최소 100개 세포를 각각의 샘플에 대해 스코어링하였다.
락테이트 데하이드로게나제 ( LDH ) 방출을 사용한 괴사의 검정
용해된 세포로부터 방출된 LDH의 양은 세포사의 민감성 측정이다. 괴사성 세포사는 Promega CytoTox 96 LDH 검정 키트를 사용하여 96웰 플레이트에서 측정하였다. 0.1 % Triton X-100 중에서 10분 동안 용해된 세포로부터의 LDH 함량은 총 LDH의 지수로서 사용하였다. 배양 배지에서 방출된 LDH는 괴사성 세포사의 지수로서 사용하고 총 LDH로부터의 %를 계산하였다. 억제제에 의한 보호는 억제제의 존재 및 부재하에 LDH 방출 %를 비교함을 기준으로 계산하였다. 상기 억제제는 또한 전체, 블랭크 및 대조군에 첨가하였다. 490 nm에서의 흡광도는 ELISA 판독기 (BioTec)로 측정하였다.
엘라스타제 및 카텝신 C 활성의 검정
세포를 수거하고 빙냉 PBS로 2회 세척하고 빙냉 용해 완충액 (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.1 % NP-40, 1 mM DTT) 중에 2 x 108 /ml로 재현탁시켰다. 세포는 폴리트론으로 부수고(각각 7초의 3회 사이클) 파쇄물을 4 ℃에서 30분 동안 13,000 g에서 원심분리함에 의해 펠렛화하였다. 상등액을 즉시 사용하였다. 각각의 샘플의 단백질 함량은 표준물로서 소 혈청 알부민 (BSA)을 사용하는 브래드포드 단백질 검정(Bio-Rad)을 사용하여 결정하였다. 모든 검정은 100㎕의 총 용적으로 설정하고 평저 미세역가 플레이트 중 3회 특정 농도의 프로테아제 억제제 또는 대조군에 대한 용매의 존재 또는 부재하에 5 mM의 40 ㎍의 샘플 단백질의 최종 농도에서 엘라스타제 기질로서 N-메톡시석시닐-Ala-Ala-Pro-Val p-니트로아닐라이드 (MAAPV) (Sigma)를 함유하였다. 37 ℃에서 1.5시간 동안 항온처리 후, 405 nm에서 OD는 플레이트 ELISA 판독기 (Molecular Devices)를 사용하여 측정하였다. 프로테아제 활성은 p-니트로아닐린의 보정 곡선에 따라 계산하였다. 카텝신 C형 활성은 Gly-Phe p-니트로아닐라이드 (Sigma)를 사용하여 유사하게 측정하였다.
외상성 뇌 손상 생체내 모델
폐쇄성 뇌 손상 방법은 뇌 괴사의 발달 및 신경학적 중증도 스코어 (NSS)를 사용하여 평가된 신경학적 상태에 대한 엘라스타제 억제제의 효과를 측정하기 위해 사용되었다. NSS 시험은 외상 1시간 후 수행하였다. NSS 시험 동안에, 사이클로부터 탐색하고 나오는 다양한 반사, 이동 능력, 빔 균형, 빔 워크 및 다른 거동인자 파라미터 등을 모니터링하였다. 괴사의 발달은 2,3,5-트리페닐-2H-테트라졸륨 클로라이드(TTC)로 염색된 뇌 슬라이스내 괴사성 공간을 평가함에 의해 측정하였다.
40+4 g (평균 ± SD)의 무게가 나가는 C57BL/6J 마우스를 상기 연구에 사용하였다. 무게 하강 장치를 사용하여 쇼크를 스컬로 전달하고 제어된 뇌 손상을 유도하였다. 충격은 프레임 아래로 하강하는 플랫폼으로부터 돌출된 실리콘-코팅된 5mm 금속 팁에 의해 전달하였다. 두개골 손상의 상기 모델은 이전의 연구에서 사용되어 왔다 [참조: Feldman Z et al., J Neurosurg (1995) 83: 1060-1066; Shapira Y et al., J Neurosurg Anesthesiol (1995) 7: 17-25]. 모든 동물 과정 및 케어 기술은 기관[Ben-Gurion University of the Negev Committee for the Ethical Care and Use of Animals in Research]에 의해 승인되었다.
마우스는 이소플루란으로 마취시킴에 의해 수술을 위해 준비하고 자발적으로 숨쉬도록 하였다. 실험 과정 동안 적당한 마취의 유지는 뇌반사의 상실에 의해 확인하였다. 뇌반사가 폐지되면, 정중선 두피 절개하고 두피 및 아래 근육을 측면으로 이동시켰다. 폐쇄된 두부 외상 (CHT)은 좌측 뇌 반구의 전두 부분 상의 두피로 전달하였다. 외상 1분 후, 이의 비히클 (DMSO 용액) 중 100 ㎍의 엘라스타제 억제제 II 또는 III는 큰수조 (cisterna magna)로의 직접적인 전달에 의해 뇌척수내로 주사하였다. 비히클 자체는 이전에 어떠한 효과를 갖지 않는 것으로 밝혀졌다. 외상을 입지 않은 마우스는 0 내지 1의 NSS를 갖고 염색된 뇌 슬라이스 상에 뇌사성 공간을 갖지 않았다.
주사 마취를 중단한 후 동물은 이들의 케이지로 복귀시키고 음식과 물을 자유롭게 공급받도록 하였다.
야생형 C57BL/6J 마우스에 추가로, 호중구 엘라스타제 녹아웃 마우스 종 B6.129Xl-Elane을 또한 조사하였다. 모든 과정은 윤리위원회 (Ben-Gurion University of Negev)에 의해 승인되었다.
간 독성 생체내 모델
23+3 그램의 무게가 나가는 야생형 C57BL/6J 마우스를 처리 당 6마리로 사용하였다. 마우스는 제조원 (Harlan (Israel))으로부터 구입하였다. 모든 동물 과정 및 케어 기술은 기관 [Ben-Gurion University of the Negev Committee for the Ethical Care and Use of Animals in Research]에 의해 승인되었다. 마우스는 단일 복강내 (i. p.) 용량의 아세트아미노펜 (N-아세틸-p-아미노페놀) APAP (300 mg/kg)의 투여 전 16시간 동안 단식시켰다. APAP 주사 4시간 후, 마우스에 (PBS 중 20 % DMSO) 중 용해된 시험된 화합물을 복강내 주사하였다. 대조군 마우스에 비히클만 주사하였다. APAP 주사 24시간 후, 마우스를 희생시키고 혈액을 심장으로부터 수거하였다. 헤파린은 혈장 수거를 위해 항응고 첨가제로서 사용하였다. 혈장 샘플은 실온에서 10분 동안 4000 g에서 원심분리하였다. 상등액은 ALT 및 AST 수준 측정을 위해 수거하였다. 효소 수준은 문헌 [Soroka's Biochemistry Medical Center]에서 자동분석기로 측정하였다.
심장 괴사 생체내 모델
수컷 Balb/c 마우스 (20-25 g; Charles River; Milan; Italy)는 제어된 환경에 거주시키고 표준 설치류 먹이 및 물을 제공하였다.
마우스는 공개된 방법을 사용하여 30분의 심근 허혈 및 6시간의 재관류에 적용하였다 (참조: Yet et al, 2001). 연구 그룹은 샴 (sham), 비히클 대조군 및 억제제(n=8/그룹, 하기 참조)로 이루어진다. 간략하게, 마우스는 마취를 유지하기 위해 요구되는 바와 같은 소정의 추가의 용량과 함께 펜토바비탈 나트륨 (60 mg/kg 체중)으로 마취시켰다. 마우스에 관을 삽입하고 100 % 산소를 기계적으로 흡기시켰다. 마우스에 제1 IV 용량의 활성 억제제 1-(2-(4-메틸피페라진-1-일)-4,5-디하이드로-1H-이미다졸-1-일)프로판-1-온 (M059-0891) (30 mg/kg)을 투여하고 이들의 흉부를 개방하였다. 억제제 IV 투여 20분 후, 허혈은 8-0 실크 봉합사를 사용하여 좌측 전방 하강 관상 동맥 (LAD)을 정상적으로 위치된 좌측 심방의 정상으로부터 1mm인 상기 LAD 상에 위치한 PE-10 튜빙 부분에 결찰시킴에 의해 개시하였다. 30분 동안 폐색 후, 재관류는 결찰을 풀고 PE-10 튜빙을 제거함에 의해 개시하였다. 동물에게 재관류 개시에서 제2 IV 용량의 억제제 (30 mg/kg)를 투여하였다. 흉부벽을 이어서 폐쇄시키고, 동물로부터 관을 제거하고 37 ℃ 가온 플레이트를 사용하여 체온을 유지하였다. 재관류 6시간 후, 동물은 형태학적 손상의 결정을 위해 심장의 수거를 위해 안락사시켰다. 괴사 면적은 AAR의 %로서 정량하였다.
실험 그룹: 총 24마리의 마우스는 하기의 그룹에 할당하였다:
- 허혈/재관류 + 비히클: LAD 폐색(30분)에 이어서 재관류 (6시간)에 적용된 마우스(n=8);
- 허혈/재관류 + 화합물: 상기된 수술 과정에 적용되고 허혈 개시 20분 전 및 재관류의 개시(IV 볼러스를 통한 용량 30 mg/kg)에 엘라스타제 억제제로 처리된 마우스 (n=8);
- 샴 + 비히클: LAD 폐색을 제외하고는 동일한 수술적 과정에 적용되고 실험 기간 동안에 마취하에 유지된 마우스 (n=8);
모든 실험 종료 시점에서, 동물은 경색 영역의 평가를 위해 하기된 바와 같이 처리하였다.
경색 크기의 결정
재관류 기간 후, 1 mL/kg의 4 % 티오플라빈 에스 용액은 노우-리플로우 (no-reflow) 영역을 해명하기 위해 IV로 주사한다. 티오플라빈 에스 용액은 형광성과 같이 관류된 영역을 염색시키는 형광성 황녹색 염료인 반면, 노우-리플로우 영역은 암색으로 나타난다. 5분 후, LAD는 재폐색시키고 0.6 mL의 50 %의 유니스퍼스 블루(Unisperse blue) (Ciba Geigy, Hawthorne, NY)는 AAR (블루 염료가 없는 조직)을 해명하기 위해 IV 주사에 의해 투여하고, 마우스는 깊은 마취하에 1 ml의 KCl (150mg/mL IV)로 안락사시킨다. 이어서 심장은 절개하고 LV를 4개의 균등하게 두꺼운 횡근 슬라이스로 절단한다. 이들 슬라이스는 노우-리플로우 지대 (암영역)를 결정하고 이어서 할로겐 조명하에 AAR(어떠한 블루로 염색되지 않음)을 동정하기 위해 자외선 광 (λ= 254 nm) 및 옐로우 필터를 사용하여 사진촬영하였다. 이어서 상기 슬라이스는 경색 지대를 해명하기 위해 37℃에서 15분 동안 1 % 트리페닐테트라졸륨 클로라이드(TTC) 중에서 항온처리한다. TTC는 생존 심근 조직 브릭을 적색으로 염색시키고 경색 조직을 백색으로 나타낸다. 이어서 심실 슬라이스는 다시 사진촬영하였다. 노우-리플로우 지대, AAR 및 괴사 지대를 보여주는 심장 슬라이스의 디지탈 사진을 추적하고 이어서 컴퓨터 면적 측정 시스템을 사용하여 디지탈화한다. 허혈 및 비허혈 영역의 면적을 컴퓨터화하고 괴사 및 비-괴사 조직의 %로서 슬라이스의 %로서 나타낸다. 이어서 각각의 슬라이스에서 %는 슬라이스의 중량을 곱한다. 중량은 각각의 심장에 대해 합산한다. AAR (염색되지 않은 블루 영역)은 LV 질량의 %로서 나타낸다. 괴사의 정도는 LV 질량의 %로서 계산하고 경색 크기는 AAR (경색 크기 = 괴사 정도/AAR 정도)의 %로서 나타낸다.
데이터 분석
도면 및 기재내용에서 모든 값은 N 관찰의 평균 (SEM)의 평균 표준 오차로서 나타낸다. 상기 데이터는 다중 비교를 위해 원-웨이 ANOVA에 이어서 본페로니 포스트-혹 시험에 의해 분석하였다. 비-파라미터 데이터는 피셔의 정확도 시험 (Fisher's exact test)으로 분석하였다. 0.05 미만의 p-값은 유의적인 것으로 고려된다. *p<0.05 대. 샴. *p<0.05 대 I/R
통계학적 분석
달리 특정되지 않는 경우, 각각의 실험은 3회 수행하고; 각각의 샘플은 적어도 2회 시험하였다. 상기 결과는 평균 ± SE를 입증한다. 통계학적 분석은 스튜던트 T-시험을 사용하여 수행하였다. NSS의 값은 마이크로소프트 Windows® 소프트웨어에 대한 SPSS를 사용하는 비-파라미터 만-휘트니 시험으로 분석한다. 유의성은 P < 0.05로 설정하였다.
실시예 1
괴사는 세포내 엘라스타제형 단백질분해 활성의 유도를 수반한다.
제1 실험은 괴사가 세포내 단백질분해 활성의 유도를 수반하는지를 결정하기 위해 수행하였다. U-937 세포에서 괴사는 화학저산소증을 유발함에 의해 세포를 사멸시키는 KCN으로 처리하여 유도하였다. U-937 세포에서 KCN-유도된 괴사의 용량 및 시간 의존적 역학은 도 1에 나타낸다.
엘라스타제형 단백질용해 활성의 활성화가 괴사성 세포사 과정 동안에 일어나는 것을 추가로 확증하기 위해, 이의 활성은 엘라스타제 특이적 기질인 MAAPV를 사용하여 대조군과 비교하여 KCN-처리된 U-937 세포로부터 제조된 세포 추출물에서 결정하였다. 괴사 엘라스타제형 효소의 어떤 단계가 활성화되었는지를 확인하기 위해 효소적 검정은 상이한 시간 간격에 대해 KCN으로 처리된 U937 세포로부터 제조된 용해물에서 수행하였다. 도 2는 10mM KCN을 사용한 처리에 의해 유도된 단백질분해 활성의 시간 의존적 유도를 보여준다. 알 수 있는 바와 같이, 엘라스타제 형 활성은 또한 10분 이내에 급격히 상승하고 이의 활성이 7배 상승되는 경우 15분 이내에 이의 최고점에 도달하였다. 엘라스타제 활성의 증가는 세포사의 형태학적 징후가 관찰될 수 있기 전에 검출되었다.
엘라스타제형 유도된 활성은 상이한 프로테아제 억제제를 사용하여 추가로 특징 분석되었다. 100 μΜ 농도의 EI III는 대조군 세포의 엘라스타제 활성에 대해 약간의 효과를 가졌지만, 이것은 괴사-유도된 활성을 완전히 억제하였다. 상기 억제는 용량 의존성이고 IC50은 2.735 μΜ이다 (도 3). 이들 결과는 U-937 세포에서 괴사와 관련된 유도된 단백질분해 활성이 세린 프로테아제 활성과 상용성임을 나타낸다.
본 발명자는 또한 괴사의 어떠한 단계에서 카텝신 C, 엘라스타제 활성화 효소가 불활성화되는지를 알고 싶었다. 이러한 목적을 위해, 상기 효소적 검정은 상이한 시간 간격에 대해 KCN 10 mM로 처리된 세포의 용해물에서 수행하였다. 도 2는 10mM KCN으로 처리함에 의해 유도된 단백질용해 활성의 시간 의존적 유도를 보여준다. 알 수 있는 바와 같이, 처리 10분 후에 이미, 카텝신 C형 활성은 4배 상승되었고 이의 최고점에 도달하였다.
엘라스타제형 단백질분해 활성 유도의 시간 스케일 (분, 도 2)과 괴사 과정 진행의 시간 스케일(시간, 도 1)에서 매우 큰 차이는 단백질분해 활성이 괴사 경로의 초기 분자 단계의 일부라는 추측을 유도하였다. 상기 추측을 시험하기 위해, 상이한 방법을 엘라스타제형 효소의 발현 억제 및 하향 조절을 위해 그리고 괴사 과정에 대한 이들의 효과를 조사하기 위해 사용하였다 (본원에 하기 실시예 2 및 3 참조).
실시예 2
괴사에 대항하는 카텝신 C, CELA3A 및 CELA1 단백질에 대한 siRNA을 사용한 형질감염은 세포사를 유도하였다.
괴사 과정의 조기 단계에서 활성화된 효소(들)을 특징 분석하기 위한 시도에서, 본 발명자는 상이한 프로테아제에 대한 siRNA의 라이브러리를 사용하였다. 형질감염은 총 93개 프로테아제에 대한 siRNA로 수행하였다.
도 4a-b는 CELA1 또는 CELA3A의 siRNA를 사용한 U-937 세포의 형질감염이 KCN으로 7시간 항온처리 후 LDH 방출에서 안정하고 유의적 감소를 유도함을 보여준다. 단독으로 CELA1 또는 CELA3A를 사용한 형질감염은 부분적 보호를 유발하는 반면에 CELA1 및 CELA3A 둘다에 대한 siRNA의 조합을 사용한 형질감염은 괴사에 대해 완전한 보호를 제공하였다.
CELA1 및 CELA3A에 대한 siRNA에 추가로, 다른 프로테아제에 대한 siRNA를 시험하였다. 이들 중에는 카텝신 A, B, C, D, E, G, H, K, L1, L2, O, S, W 및 Z, 세린 프로테아제 HNE, HtrA, 키모트립신 C, CELA 2A 및 CELA 3B, 매트릭스 메탈로펩티다제 7, 11, 12, 21 및 25가 있다. 상기 결과는 카텝신 C에 대한 siRNA가 괴사에 대해 보호 효과를 나타냄을 지적한다 (도 4a). 총 90개 프로테아제에 대한 siRNA를 사용한 형질감염은 KCN 유도된 세포사에 대해 임의의 보호를 제공할 수 없었다.
특정 siRNA의 효과가 U-937 세포에 대해 특이적이지 않음을 확신하기 위해, 이들 실험은 PC 12 세포를 사용하여 반복하였다(도 4c).
PC 12 세포를 사용한 비교 실험은 카텝신 C, CELA3A 및 CELA1 각각에 대한 siRNA가 시안화물 유도된 세포사에 대해 U-937 및 PC 12 세포에 대한 유의적 보호 효과를 가짐을 보여주었다. 또한 siRNA 및 HiPerFect 형질감염 시약 (대조군 처리)의 혼합물이 세포에 독성이 아님을 알 수 있다. 더욱이 괴사 동안에 조기 카텝신 C의 활성화 및 소분자 카텝신 C 억제제에 의한 괴사의 억제를 나타냈다. 상기 결과는 또한 상기 언급된 효소의 활성의 억제가 세포사에서의 감소와 관련되어 있음을 보여주었다. 상기 결과는 이들 효소가 괴사성 세포사를 제어하고/조절하기 위한 표적으로서 작용할 수 있음을 나타낸다.
실시예 3
카텝신 C, CELA1 및/또는 CELA3A에 대한 siRNA를 사용한 형질감염은 특이적 억제를 유도한다.
특정된 siRNA의 보호 효과가 표적 효소 전사의 셧다운으로 인한 것이고 임의의 오프-표적 효과에 의한 것이 아님을 확신하기 위해, 본 발명자는 카텝신 C 및 엘라스타제형 활성이 특이적 siRNA로 형질감염된 세포에서 억제됨을 보여주기 위해 효소적 검정을 수행하였다. 효과적인 사일런싱의 추가의 지지를 위해, 웨스턴 블롯 분석은 특정 단백질에 대해 수행하고 사일런싱된 효소의 발현이 실제로 억제됨을 보여주었다.
도 5a-b는 카텝신 C, CELA1 및 CELA3A에 대한 siRNA가 세포 용해물의 적당한 효소 활성에서 안정하고 유의적 감소를 유발함을 보여준다. 더욱이, 엘라스타제 CELA1 및 CELA3A에 대한 siRNA를 사용한 형질감염은 카텝신 C 활성에 대한 효과를 갖지 않았고 상기 효과의 특이성을 추가로 지지한다. 상기 실험은 특정된 siRNA를 사용한 처리의 보호 효과가 효소의 하향조절에 의한 것이지 임의의 다른 비-표적 효과에 의한 것이 아님을 보여주었다. 이들 결과는 카텝신 C가 프로그램화된 괴사성 세포사를 위해 필수적임을 추가로 보여주었다.
더욱이, 도 4a 도 5a-b 둘다의 조합된 결과는 이들 특이적 효소 (CELA3A 및 CELA1)의 활성이 억제되는 조건하에서 (도 5a-b), 괴사 과정이 억제됨을 나타내고 (도 4a) 이는 이들 효소의 활성 차단이 세포사의 억제를 유발함을 의미한다.
따라서, 이들 연구는 효소가 괴사의 억제를 위해 효과적인 표적을 나타내는 것에 대한 발판을 제공한다. 종합하면 상기 결과는 다른 엘라스타제의 억제제가 아니라 특이적 CELA3A 및 CELA1 억제제가 괴사성 세포사를 억제할 수 있음을 시사한다.
실시예 4
카텝신 C, CELA3A 및 CELA1 억제제는 괴사성 세포사의 억제를 유도한다.
도 6은 카텝신 C 억제제 (Gly-Phe-DMK, MP Biomedicals, USA)가 PC 12에서 KCN에 의해 유도되는 괴사를 억제할 수 있음을 보여준다. 억제제의 첨가는 용량 의존적 방식으로 LDH 방출 감소에 의해 나타나는 바와 같이 세포 괴사를 억제하였다. 다시, 도 5a-b 및 도 6의 결과는 카텝신 C가 항-괴사성 제제에 대한 표적을 제공할 수 있음을 의미하였다.
엘라스타제형 활성을 괴사성 사멸 경로에 연계시키는 본 가설의 직접적인 결과는 상기 단백질분해 활성의 억제가 괴사성 세포사 프로그램의 수행을 지연시키거나 예방한다는 것이다. 상기 가설을 시험하기 위해, 괴사성 세포사에 대한 투과성 엘라스타제 억제제의 효과를 연구하였다. EI II 및 III은 LDH 방출에 의해 평가된 바와 같이 PC12 세포에서 용량 의존적 방식으로 KCN-유도된 세포사를 억제하였다(도 7a 및 b). 비-세포 투과성 엘라스타제 억제제 엘라스타티날은 KCN-유도된 괴사를 진행하는 세포에 대해 보호 효과를 갖지 않았다 (데이터는 나타내지 않음).
CELA3A 억제제는 3D 구조 유사성 및 위상적 유사성을 기준으로 합성하였다. 이들은 항괴사 보호를 부여하는 이들의 능력에 대해 시험되었다. 결과 일부의 대표적인 예는 표 2에 제공된다. KCN 유도된 괴사에 대한 보호는 0.1 nM 이하의 다양한 농도에서 관찰되었다(표 2). CELA1의 2개 소분자 억제제는 또한 괴사를 억제할 수 있었고 특정 화합물, 예를 들어, 표에 열거된 마지막 3개의 화합물은 보다 높은 농도에서 보호를 제공하였다.
[표 2]
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
이들 자체가 불활성인 높은 농도 (300 μM 이하)의 비특이적 엘라스타제 EI II 및 III로의 PC-12 세포의 노출이 KCN에 의해 유도된 괴사를 상당히 억제하는 것으로 관찰될 수 있다. 그러나, 소분자 CELA3A 억제제는 다수의 정도로 보다 낮은 농도에서 효과적임을 알 수 있다. 괴사를 예방하고/치료하는데 있어서 CELA1- 및 CELA3A-특이적 억제의 예상치 않은 증진된 활성은 이들 2개의 독특한 표적 및 이에 의해 이에 구조적으로 관련된 표적의 중요성을 강조한다.
실시예 5
엘라스타제 억제제의 보호 효과는 이들의 막 파열을 단지 예방하는 것 보다는 KCN-처리된 세포의 구제에서 나타난다.
세포에 대한 엘라스타제 억제제의 보호 효과가 허혈 스트레스 후 오랜 시간 동안 유지되는지를 조사하기 위해, 본 발명자는 역학적 연구를 수행하였다. 5시간 KCN 항온처리 후, 상기 배지는 어떠한 KCN 또는 엘라스타제가 없는 정규 DMEM으로 변화시키고 48시간 이하 동안 항온처리를 진행하였다. 세포 생존은 XTT 방법에 의해 평가하였고, 상기 방법은 막 통합성 보다는 세포 대사 활성을 측정한다. 상기 결과는 세포가 비가역적 손상 없이 5시간 KCN 처리로부터 생존하였음을 지적한다. 이들은 KCN 처리 후 48시간에 완전한 회복을 보여준다 (도 7c). 이들 결과는 임상적으로 중요한데 이는 이들이 엘라스타제 억제제가 오래 지속적인 보호 효과를 제공함을 입증하기 때문이다. 예를 들어, MI 또는 뇌졸중에서 처럼 허혈 스트레스 후 치료학적 윈도우 동안에 엘라스타제 억제제로 처리된 조직은 구제될 수 있다.
실시예 6
생체내 괴사에 대한 엘라스타제 억제제의 효과
상기 전망있는 결과의 관점에서, 생체내 괴사 과정에 대한 엘라스타제 억제제 효과의 평가가 조사되었다. 연구된 제1 생체내 모델은 외상성 뇌 손상이었다 (도 8). 먼저, 대조군 마우스에 대한 엘라스타제 억제제 II 및 III 및 비히클의 효과가 조사되었다. 마우스는 건강한 것으로 밝혀졌고 NSS는 0 내지 1이고 어떠한 괴사성 뇌 조직을 갖지 않았다. 도 8a-b는 비처리된 외상 동물과 비교하여 신경 손상에서의 감소 및 엘라스타제 억제제 II 또는 III 처리된 마우스에서 괴사 공간의 감소를 보여준다. 신경학적 상태는 신경학적 중증도 스코어를 사용하여 평가하였다. Els II 및 III은 손상 1시간 후 측정된 바와 같이 신경학적 손상을 상당히 감소시킨다. 도 8b는 TTC 염색에 의해 측정된 바와 같은 외상 마우스에서 괴사 공간의 양을 보여주고; 엘라스타제 억제제로의 처리는 손상된 반구의 50 %에서 25%까지 뇌사성 질환의 공간을 명백히 감소시켰다. 실제로 동일한 결과는 억제제의 효과가 호중구 엘라스타제 녹아웃 마우스에 대해 시험되는 경우 수득되었다(도 8b). 도 8a-b에서 제공된 데이터에 추가로, 동일한 실험을 야생형 스프라그 돌리 래트에 대해 수행하였고 유사한 결과가 수득되었다(데이터는 나타내지 않음).
종합하면, 도 4a-c, 7a-b 및 8a-b에 제공된 결과는 괴사성 손상을 약화시키는데 엘라스타제 억제제의 사용을 지지한다. 흥미롭게도, 괴사의 발달과, 정상 마우스와 녹아웃 마우스 간의 처리에 대한 반응에서 어떠한 차이도 없었고 이는 호중구 엘라스타제가 이들 2개의 과정에 임의의 역할을 수행하지 않음을 지적한다.
CELA3A 또는 구조적으로 관련된 효소의 추가로 선택된 특이적 강력 억제제는 생체내 괴사의 추가의 모델에서 시험되었다. 이전에 기재된 상기 활성 소분자 억제제는 CELA3A 효소의 3D 구조 유사성 및 위상적 유사체를 기준으로 CELA3A 억제제 라이브러리를 스크리닝함에 의해 발견되었다. 이들 화합물의 시험관내 활성은 하기에 나타내고 실시예 7을 참조한다. 활성 화합물의 2-아미노티아졸 그룹에 속하는 화합물 Z601-4253 (2-(피페리딘-1-일)티아졸-4-일)(피롤리딘-1-일)메타논의 효과는 간 독성에 대한 보호에 대해 시험되었다.
본 발명자는 APAP 간독성에 대한 항-괴사제로서의 상기 화합물의 효력을 평가하였다. 이러한 목적을 위해, 본 발명자는 간 세포사에 대해 혈청 생화학적 마커의 수준에서의 변화를 조사하였다: ALT 및 AST.
도 9에 나타낸 바와 같이, 300 mg/kg APAP를 사용한 마우스의 처리는 효소 수준에서의 상당한 증가를 생성하였고, 혈중 간 효소 수준은 파라세타몰 투여 후 24시간째에 측정하였다. 단지 APAP 처리된 마우스의 ALT 수준은 8220+413 U/L이었고 이들의 AST 수준은 3553+290 U/L이었다. 샴, 대조군 및 단독의 화합물은 2% 미만의 ALT 및 4 % 미만의 AST를 가졌다. 병행 대조군은 상응하는 APAP 처리로부터 감소되었다. APAP의 투여 4시간 후에 IP 주사된 화합물 Z601-4253은 파라세타몰 유도된 독성에 대하여 보호하는 용량 의존적 방식으로 혈중 간 효소 둘다의 수준을 상당히 감소시켰다.
연구된 또 다른 모델은 심근 허혈/재관류 손상의 생체내 모델에서 쥐였다(도 10). 2-아미노이미다졸린 시리즈에 속하는 활성 화합물 1-(2-(4-메틸피페라진-1-일)-4,5-디하이드로-1H-이미다졸-1-일)프로판-1-온 (M059-0891)의 효과를 연구하였다. 상기 결과는 억제제에 의해 괴사 및 경색 크기에서 상당한 감소를 보여준다.
실시예 7
본 발명에 따라 사용하기 위해 구현된 화합물에 대한 일반 합성 방법
하기에 제공된 반응식 1은 2-아미노이미다졸린 화합물의 제조를 위한 일반 합성 방법을 기재하고, 표 3은 나타낸 변수에 대해 구현된 치환체를 제공한다.
반응식 1
Figure pct00042
[표 3]
Figure pct00043
특정 2-아미노이미다졸린 화합물의 제조는 실온에서 교반되고 프로피온산 무수물로 처리된 메틸렌 클로라이드 (15 ml) 중의 2-티오메틸-디하이드로이미다졸 하이드로요오다이드 (1.550 gm, 0.0063 mol)와 디이소프로필 에틸아민 (2.2 당량)의 혼합물을 제조함으로써 달성되었다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 메틸렌 클로라이드 및 물 (각각 20 ml)로 농축시키고, 희석시켰다. 메틸렌 클로라이드 층을 분리하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고 농축시켜 N-프로파노일-2-티오메틸 디하이드로이미다졸 (1.2 gm)을 수득하였다. t-부탄올 (12 ml) 중의 N-프로파노일-2-티오메틸 디하이드로이미다졸 (400 mg)과 1-메틸피페라진 (3 당량)의 혼합물을 3일 동안 환류시킨 다음, 농축시키고, 20-30 % 메탄올-메틸렌 클로라이드를 사용하여 실리카 겔 컬럼 상에서 정제하여 화합물 1 (50 mg)을 출발 물질 (210 mg)과 함께 수득하였다. 1HNMR (DMSo-D6): 0.99 (t, J = 8 Hz, 3H), 2.16 (s, 3H), 2.32 (q, J = 8 Hz, 2H), 2.49 (m, 4H), 3.04 (m, 4H), 3.39 (t, J = 8 Hz, 2H), 3.81 (t, J = 8 Hz, 2H); LCMS m/z 225.0 [M + 1]. 이 합성 과정은 상기 개략적으로 도시된 방법 A를 따른다.
특정 2-아미노이미다졸린 화합물의 제조는 메탄올 (15 ml) 중의 2-티오메틸 디하이드로이미다졸 하이드로요오다이드 (1.1 gm)와 1-메틸피페라진 (1.5 당량)의 혼합물을 반응이 완료될 때까지 (6-18시간) 환류시킨 다음, 농축시키고 메틸렌 클로라이드 (20 ml)에 용해시키고 트리에틸아민 (2 당량) 및 피오피온산 무수물 (1.25 당량)로 처리하여 제조함으로써 달성되었다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 농축시키고, 10-30 % 메탄올-메틸렌 클로라이드를 사용하여 실리카 겔 컬럼 상에서 정제하여 화합물 1 (780 mg)을 수득하였다. 화합물 1 (0.5 gm)을 0.1% TFA - 물을 사용하여 C-18 컬럼 상에서 추가로 정제하여 화합물 1의 TFA 염 (280 mg)을 수득하였다. 1HNMR (CDC13): 1.17 (t, J = 8 Hz, 3H), 2.38 (s, 3H), 2.49 (q, J = 8 Hz, 2H), 2.54 (m, 4H), 3.32 (m, 4H), 3.61 (t, J = 8 Hz, 2H), 3.93 (t, J = 8 Hz, 2H); LCMS m/z 225.0 [M +1]. 이 합성 과정은 상기 개략적으로 도시된 방법 B를 따른다.
또한 방법 A의 합성 과정에 따라 화합물 2 (M059-0851)를 합성하였으며 이는 하기 특성을 갖는다: 1HNMR (DMSO-de): 0.98 (t, J = 8 Hz, 3H), 1.50 -1.83 (m, 8H), 2.30 (q, J = 8Hz, 2H), 2.34 - 2.37 (m, 4H), 3.03 - 3.05 (m, 4H), 3.12 - 3.16 (m, 1H), 3.39 (t, J = 8 Hz, 2H), 3.84 (t, J = 8 Hz, 2H); LCMS m/z 279.1 [M + 1].
또한 방법 A의 합성 과정에 따라 화합물 3 TFA 염 (M059-0032)을 합성하였고 이어서 C-18 컬럼 정제하였으며 이는 하기 특성을 갖는다: 1HNMR (DMSO-d6): 1.82 - 1.90 (m, 2H), 1.96 - 2.03 (m, 2H), 3.33 - 3.37 (m, 2H), 3.50 - 3.54 (m, 2H), 3.71 (t, J = 8 Hz, 2H), 4.39 (t, J = 8 Hz, 2H), 6.81 -6.82 (m, 1H), 7.50 (d, J = Hz, 1H), 8.11 (m, 1H), 9.84 (s, 1H); LCMS m/z 234.0 [M + 1].
또한 방법 A의 합성 과정에 따라 화합물 4 TFA 염 (M059-0055)을 합성하였고 이는 하기 특성을 갖는다: 1HNMR (DMSO-d6): 1.08 - 1.83 (m, 8H), 1.81 - 1.85 (m, 4H), 2.15 - 2.22 (m, 1H), 2.59 (d, J = 8Z, 2H), 3.38 - 3.41 (m, 4H), 3.36 (t, J = 8 Hz, 2H), 4.17 (t, J = 8 Hz, 2H), 9.47 (s, 1H); LCMS m/z 250.1 [M + 1].
또한 방법 A의 합성 절차를 따라 화합물 5 (M059-0082)를 합성하였다. 방법 A의 합성 과정에 따라 합성하였다: 1HNMR (DMSO-de): 1.48 - 1.74 (m, 8H), 1.85 - 1.90 (m, 4H), 2.49 - 2.56 (m, 1H), 3.18 - 3.23 (m, 2H), 3.34 - 3.40 (m, 6H); LCMS m/z 236.1 [M + 1].
화합물 6 (M059-0053) 및 화합물 7 (M059-0335)을 화합물 4와 유사한 프로토콜에서 방법 A에 따라 제조되었다.
DCC, 트리에틸 아민 및 DMAP의 존재하에 메틸렌 클로라이드 중의 2-피페리디노-1,3-티아졸-4-카복실산 및 피롤리딘으로부터 화합물 8 (Z601-4253)을 제조하였다.
하기 제공된 반응식 2는 2-아미노이미다졸린 화합물의 제조를 위한 일반적인 합성 방법을 기술하며 표 3은 나타낸 변수에 대한 구현된 치환체를 제공한다.
반응식 2
Figure pct00044
상응하는 브로모아세토페논 및 아민으로부터 반응식 2에 기재된 방법에 따른 방법으로 화합물 9 (M008-0111) 및 10 (4112-3656)을 제조하였다.
하기 제공된 반응식 3은 2-아미노이미다졸린 화합물의 제조를 위한 일반적인 합성 방법을 기술한다.
반응식 3
Figure pct00045
반응식 3에 따라 DCC, 트리에틸 아민 및 DMAP의 존재하에 메틸렌 클로라이드 중의 시판중인 5-이소프로필-3-피롤리딘-2-일이속사졸 및 사이클로프로판 카복실산으로부터 화합물 11 (Z632-2266)을 제조하였다.
하기 제공된 반응식 4는 구현화된 화합물/본원에 기재된 바와 같이 사용하기 위한 화합물에 대한 추가의 일반적인 합성 절차를 기술한다:
반응식 4
Figure pct00046
반응식 5는 구현화된 화합물/본원에 기재된 바와 같이 사용하기 위한 화합물에 대한 추가의 일반적인 합성 절차를 기술한다:
반응식 5
Figure pct00047
반응식 6은 구현화된 화합물/본원에 기재된 바와 같이 사용하기 위한 화합물에 대한 추가의 일반적인 합성 절차를 기술한다:
반응식 6:
Figure pct00048
반응식 7은 구현화된 화합물/본원에 기재된 바와 같이 사용하기 위한 화합물에 대한 추가의 일반적인 합성 절차를 기술한다:
반응식 7
Figure pct00049
반응식 8은 구현화된 화합물/본원에 기재된 바와 같이 사용하기 위한 화합물에 대한 추가의 일반적인 합성 절차를 기술한다. 제공된 참조문헌은 또한 이의 전문이 전부 본원에 참조로 인용된다.
반응식 8
Figure pct00050
반응식 9는 구현화된 화합물/본원에 기재된 바와 같이 사용하기 위한 화합물에 대한 추가의 일반적인 합성 절차를 기술한다:
반응식 9
Figure pct00051
간단히, PMR 스펙트럼은 300 MHz Bruker DPX에 등록되었으며 Bruker XWinNMR 소프트웨어를 사용하여 처리하였다. 모든 시판중인 시약은 추가의 정제 없이 사용되었다.
화합물 3. 화합물 1 (0.1 mol)을 화합물 2 (0.1 mol)와 에테르 (100 ml)의 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 28-30 ℃에서 12시간 동안 교반한 다음, 5℃로 냉각시켰다. 형성된 침전물을 여과에 의해 수집하고, 물로 세척하고, 건조시키고, 에탄올로부터 결정화하여 순수한 반응 생성물을 3을 70-75 % 수율로 수득하였다.
화합물 4. 화합물 3 (0.1 mol)을 물 (200 ml) 중의 NaOH (0.25 mol)와 에탄올 (5 ml)의 용액에 현탁시셨다. 고체가 완전히 용해될 때까지 혼합물을 90 ℃에서 교반하였다. 생성된 용액을 실온으로 냉각시키고 아세트산으로 조심스럽게 산성화시켰다. 형성된 침전물을 여과에 의해 수집하고, 물로 세척하고, 건조시키고, 디옥산으로부터 결정화하여 반응 생성물 4를 75-80 % 수율로 수득하였다.
화합물 5. 1 mmol의 산 4를 5 ml의 무수 DMF 중의 CDI (0.95 mmol)의 용액에 첨가하였다. 가스를 형성시키면서 동안 80 ℃에서 2시간 동안 혼합물을 교반하였다. 이어서, 1 mmol의 아민 HNR^aR^b을 상기 반응 혼합물에 첨가하고, 이를 3 내지 4시간 동안 환류시키고 실온에서 밤새 방치시켰다. 이어서, 혼합물을 물 (10 ml)에 붓고, 형성된 침전물을 여과에 의해 수집하고, 프로판올-2로부터의 결정화헤 의해 정제하여 반응 생성물 5를 40-85 % 수율로 수득하였다.
그리고, 반응식 10도 참조한다:
Figure pct00052
여기서 제공되는 참조문헌은 이의 전문이 전부 본원에 인용된다.
당업자는 표 1에 기재된 바와 같은 또는 본원에서 제공된 임의의 화학식에 의해 정의된 바와 같은 화합물을 제조하기 위해 상기 기재된 합성 방법을 어떻게 변형시킬 수 있는지를 인식할 것이다.
실시예 8
3D 구조 유사성 및 위상적 유사체를 기반으로 CELA3A 및 CELA1 억제제의 라이브러리를 스크리닝하여 발견된 활성 소분자 억제제의 리스트
하기 화합물은 vandor ChemDiv Inc. (San Diego, USA)에 의해 제조되었으며 이들의 각각의 ChemDiv I.D. 넘버는 아래 표 4에 나타낸다.
[표 4]
I.D. IUPAC 명칭
Z087-0195 3,4-비스((2-(피롤리딘-1-일)에틸)아미노)-1,2,5-티아디아졸 1,1-디옥사이드
Z601-4253 (2-(피페리딘-1-일)티아졸-4-일)(피롤리딘-1-일)메타논
Z632-2266 사이클로프로필(2-(5-이소프로필이속사졸-3-일)피롤리딘-1-일)메타논
M008-0111 N-(4-메틸피리딘-2-일)-4-(2,4,5-트리메틸페닐)티아졸-2-아민
D216-0746 4-((2-메틸인돌린-1-일)설포닐)벤조산
M059-0891 1-(2-(4-메틸피페라진-1-일)-4,5-디하이드로-1H-이미다졸-1-일)프로판-1-온
3952-1000 6-브로모-2-(3,5-디메톡시페닐)-4H-벤조[d][1,3]옥사진-4-온
E214-0380 6-메틸-5-((2-메틸피페리딘-1-일)설포닐)피리미딘-2,4(1H,3H)-디온
5149-0030 에틸 2-(1,1-디옥시도-3-옥소벤조[d]이소티아졸-2(3H)-일)아세테이트
Z632-6109 N-메틸-4,5,6,7,8,9-헥사하이드로-1H-사이클로옥타[c]피라졸-3-카복스아미드
8018-2960 2-(5-(피리딘-4-일)-2H-테트라졸-2-일)아세트산
4789-3852 2-(푸란-2-일)-5,6,7,8-테트라하이드로-4H-벤조[4,5]티에노[2,3-d][1,3]옥사진-4-온
M059-0082 사이클로펜틸(2-(피롤리딘-1-일)-4,5-디하이드로-1H-이미다졸-1-일)메타논
L150-1122 3-((5-아세트아미도-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)티오)프로판산
4112-3656 N1-(4-(4-클로로페닐)티아졸-2-일)-N4,N4-디메틸벤젠-1,4-디아민
M059-0032 푸란-2-일(2-(피롤리딘-1-일)-4,5-디하이드로-1H-이미다졸-1-일)메타논
Z606-8336 7-(4-에틸피페라진-1-일)-5,6-디메틸-[1,2,4]트리아졸로[1,5-a]피리미딘
M284-0488 7-플루오로-10-(2-(4-이소프로필피페라진-1-일)-2-옥소에틸)-2,3-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-5,11(10H,11aH)-디온
4334-1600 브로모페닐)-4-옥소-4H-벤조[d][1,3]옥사진-6-일 아세테이트-3)-2
4356-0595 2-(3급-부틸)-3-(1-메틸-1H-벤조[d]이미다졸-2-일)-4-옥소-4H-크로멘-7-일 피발레이트
M059-0055 2-사이클로펜틸-1-(2-(피롤리딘-1-일)-4,5-디하이드로-1H-이미다졸-1-일)에타논
D226-0031 3-메틸-8-(피페리딘-1-일)-1H-푸린-2,6(3H,7H)-디온
E205-0066 5-에틸-N-(피리딘-2-일메틸)-5H-[1,2,4]트리아지노[5,6-b]인돌-3-아민
8019-5381 3-((4-클로로-1H-피라졸-1-일)메틸)-N-(2-(3-플루오로벤즈아미도)에틸)-1,2,4-옥사디아졸-5-카복스아미드
4240-0470 1-(4-(메틸티오)벤질)-4-토실피페라진
F684-0507 2-(2-에틸페닐설폰아미도)-5-(4-에틸피페라진-1-일)벤조산
G830-0845 2-아미노-N-(2,4-디플루오로페닐)피리미딘-5-설폰아미드
D226-0031 3-메틸-8-(피페리딘-1-일)-1H-푸린-2,6(3H,7H)-디온
P316-0028 5-클로로-N-(2-옥소-1-페닐피롤리딘-3-일)티오펜-2-설폰아미드
3506-0172 3-(피롤리딘-1-일설포닐)벤조산
3346-3249 (3,5-디메틸-1H-피라졸-1-일)(3,4,5-트리메톡시페닐)메타논
M284-0942 N-(3,4-디플루오로페닐)-2-(8-플루오로-5,11-디옥소-2,3,11,11a-테트라하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-일)아세트아미드
4953-1443 5-(사이클로헥실메틸)-3-(피리딘-2-일)-1,2,4-옥사디아졸
D529-0049 에틸 5-메틸-4-(2-((4-메틸벤질)아미노)-2-옥소에틸)-7-페닐-4,7-디하이드로-[1,2,4]트리아졸로 [1,5-a]피리미딘-6-카복실레이트
M059-1012 사이클로펜틸(2-(4-에틸피페라진-1-일)-4,5-디하이드로-1H-이미다졸-1-일)메타논
R052-2664 [1,2,4]트리아졸로[1,5-a]피리미딘-2-카복실산
M059-0335 1-(2-(피페리딘-1-일)-4,5-디하이드로-1H-이미다졸-1-일)부탄-1-온
T404-2346 (4-(6-클로로-[1,2,4]트리아졸로[4,3-a]피리딘-3-일)피페라진-1-일)(1-페닐사이클로프로필)메탄올
M284-0939 N-(2,4-디플루오로페닐)-2-(5,H-디옥소-2,3,11,11a-테트라하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-일)아세트아미드
M059-0053 2-에틸-1-(2-(피롤리딘-1-일)-4,5-디하이드로-1H-이미다졸-1-일)부탄-1-온
Y200-4081 N-[4-[4-(이소부티릴아미노)페녹시)페닐]-2-메틸-프로피온아미드
괴사성 세포사의 억제제
이들 화합물은 2개 세포에서 KCN에 의해 유도된 괴사를 억제하는 이들의 능력에 대해 시험되었다. 상기 시스템에서 세포사의 괴사성 방식은 이전에 기재된 바와 같이 입증되었다. 상기 결과는 하기 표에 나타낸다. PC 12 세포에 상기된 바와 같은 KCN을 투여하였다. LDH 방출 방법을 사용하여 평가된 KCN-유도된 괴사에 대한 화합물의 보호 결과는 표 5에서 하기에 나타낸다. 이들 억제제의 IC50 값은 수십 내지 단일 나노몰 범위에 있다.
[표 5]
Figure pct00053
논의
괴사성 세포사를 예방하거나 치료하지 못하는 무능력은 해결되지 않는 문제점이다. 본 발명자는 siRNA에 의한 또는 특이적 엘라스타제 소분자 억제제에 의한 엘라스타제형 활성의 감소가 괴사성 세포사를 진행하는 세포에 대해 보호를 제공함을 보여주었다. 상기 보호 효과는 상이한 방법에 의해 입증되었다. 엘라스타제 억제제가 세포사로부터 세포를 보호하는 능력은 KCN으로 또는 이전에 올리고마이신 A의 존재하에 항 Fas 및 스타우로스포린 각각으로 처리 후 관찰된 바와 같은 세포사 유발과는 무관한 것으로 나타난다. 상이한 부류의 펩타이드 및 헤테로사이클릭 엘라스타제 억제제는 보호를 제공할 수 있었고 이는 상기 효과가 화합물-특이적이지 않음을 지적한다. 상기 사멸 과정에서 세포내 엘라스타제의 역할에 대한 추가의 지지는 프랭크 괴사성 세포사의 임의의 징후 전에 일어나는 괴사성 세포의 세포내 추출물에서 엘라스타제형 활성의 조기 증가에 의해 제공되었다. 활성에서의 증가는 특이적 기질을 사용한 엘라스타제형 활성의 측정에 의해 확인되었다. 투과성 엘라스타제 억제제 (EI II 및 EI III)를 사용한 온전한 세포의 추가의 처리는 세포에서 효소적 활성의 유도를 중지시켰다. 괴사 동안에 엘라스타제형 활성의 유도를 위해 요구되는 짧은 시간은 효소가 궁극적으로 세포사를 유도하는 일련의 분자 반응들에서 조기 단계의 단백질용해 활성화제로서 괴사성 과정의 조기 단계에서 작용함을 지적한다. 괴사에서 엘라스타제의 상기 역할은 세포사 과정에서 일련의 단백질용해의 공지된 관여와 일치한다. 따라서, 세포사를 예방하는 엘라스타제형 활성 및 엘라스타제 억제제의 능력의 조기 현저한 유도는 괴사성 과정에서 엘라스타제형 효소의 주요 역할을 지지한다.
생체내 뇌 세포 괴사성 손상을 예방하는 엘라스타제 억제제의 능력은 마우스 및 래트에서 폐쇄성 뇌 손상 (외상)모델을 사용하여 나타냈다. 신경학적 기능에서의 감소가 가장 현저한 경우, 엘라스타제 억제제의 투여 후 신경학적 기능에서의 개선 (NSS에서 감소)은 주로 외상 1시간 후 관찰되었다. TTC 염색에 의해 나타난 바와 같은 괴저성 부위의 발생에 대한 보호 효과는 외상 24시간 후에도 현저하였다. 뇌 슬라이스의 TTC 염색은 인상적 형태를 나타냈고: 상기 엘라스타제 억제제는 달리 괴사를 발병하는 것으로 예상된 뇌 조직의 60% 이하를 보호하였다.
예를 들어, 심근경색증으로부터의 환부 조직은 입사 후 4 내지 12시간 이내에 괴사성이 되었다. 유사하게, 뇌졸중의 경우에, 괴사는 24시간 이하의 몇 시간 및 심지어 경색 후에도 나타나고 뇌 조직에 대한 회복할 수 없는 손상을 유발한다. 입사 직후 엘라스타제 억제제를 사용한 처리는 괴사의 발생을 예방한다. 따라서, 본 연구는 명백히 치료학적 치료를 나타낸다.
본 연구에서, 엘라스타제 억제제는 명백하게 면역 세포 활성 또는 기여와는 무관하게 괴사성 세포사를 감소시키는 것으로 나타났다. 상기 실험적 시스템에서, HNE를 방출시킬 수 있는 호중구 또는 신경아교세포가 없는 세포 단일 배양을 사용하였다. 주지말한하게, 본 연구에 사용된 PC 12 세포주는 신경 단위 기원이고 호중구 엘라스타제가 없다. 더욱이, 점증적으로 이들 결과는 산재하는 엘라스타제형 효소가 괴사성 세포사를 개시하는데 관여함을 지적한다. 따라서, 생체내 엘라스타제 억제제 투여 후 NSS에서의 개선은 뉴런 세포에 거주하는 세포내 엘라스타제형 효소의 억제 결과일 가능성이 있다. 이것은 면역 바람직한 부위에서 외상후 회복의 조기 단계 동안에 어떠한 유의적 침윤이 없고 호중구 엘라스타제의 억제로 인한 교란 효과가 거의 가능성이 없다는 사실로부터 유래한다. 이러한 개념은 NE 녹아웃 마우스가 괴사에 대해 엘라스타제 억제제의 보호 효과에 응답함을 보여주는 결과에 의해 지지된다.
결론적으로, 본원에서 처음으로 특이적 세포 투과성 엘라스타제 억제제가 괴사성 세포사를 예방함을 입증하였다. 이들 억제제는 괴사성 손상의 개시 전에 세포사의 예방, 본원에서 수행된 연구로부터 놀랍게도 나타난 보호 작용을 위해 사용될 수 있다. 상기 치료학적 방법은 특히 뇌졸중 또는 심근경색증의 고위험에 있는 환자의 치료를 위해 유용할 수 있다.
사멸로부터 세포를 보호하는 엘라스타제 억제제의 능력은 세포사 유발과 무관하게 나타나고 시험관내 및 생체내 보고되었다. 추가로 siRNA 사일런싱에 의해 표적의 보다 특이적 동정이 가능할 수 있었다.
제공된 예시적 목록의 활성 화합물 분자는 CELA3A 또는 유사한 효소와 구조적 유사성 및 형태적 유사성을 갖는 분자를 소유한다. 모든 이들 화합물은 검정에서 괴사를 억제하는 것으로 밝혀졌다. 모든 화합물은 1μM 이하의 농도에서 상당한 보호를 제공할 수 있었다.
이들 자체가 불활성인 비-특이적 엘라스타제 억제제 EI II 및 III의 고농도 (300μM 이하)에 PC-12 세포의 노출은 KCN에 의해 유도된 괴사를 상당히 억제한 것으로 이미 관찰되었다. 그러나, 이것은 기재된 소분자 억제제가 다양한 정도로 보다 낮은 농도에서 효과적임을 용이하게 알 수 있다. 특이적 억제제 대 비-특이적 억제제의 상기 예상치 않은 우월성은 특이적 표적화의 중요성을 확증한다.
예를 들어, 심근경색증으로부터의 환부 조직은 입사 후 4 내지 12시간 이내에 괴사성이 되었다. 유사하게, 뇌졸중의 경우에, 괴사는 24시간 이하의 몇 시간 및 심지어 경색 후에도 나타나고 뇌 조직에 대한 회복할 수 없는 손상을 유발한다. 입사 직후 엘라스타제 억제제를 사용한 처리는 괴사의 발생을 예방한다. 이것은 추가로 3D 구조 유사성 및 형태적 유사체를 기반으로 하는 CELA3A 억제제 라이브러리를 스크리닝함에 의해 발견된 특이적 소분자 억제제의 주사가 APAP 투여 후 4시간에 투여되는 경우에도 간 독성으로부터 보호함을 보여주는 결과에 의해 확증된다. MI의 치료는 또한 스크리닝에 의해 발견되는 또 다른 소형 억제제에 의한 경색 크기에서의 약 30 %의 감소를 보여줌에 의해 지지된다. 따라서, 본 연구는 명백하게 치료학적 치료를 위한 잠재능을 나타낸다.
본 발명이 이의 특정 구현예와 관련하여 기재되었지만, 많은 대안, 변형 및 변경이 당업자에게 명백하다는 것이 자명하다. 따라서, 첨부된 청구범위의 취지 및 범위 내에 속하는 모든 이러한 대안, 변형 및 변경을 포함하는 것으로 의도된다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 본원에 참조로 구체적으로 및 개별적으로 인용되도록 지시된 것과 같이 동일한 정도로 이의 전문이 본 명세서에 인용된다. 또한, 본원에서 참조 문헌의 인용 또는 식별은 이러한 참조가 본 발명의 선행 기술로서 이용가능하다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 섹션 표제가 사용되는 한, 이들이 반드시 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
SEQUENCE LISTING <110> NATHAN, ILANA KHALFIN, BORIS <120> CATHEPSIN C, CELA3A, CELA1 INHIBITION IN PREVENTING OR TREATING CELLULAR NECROSIS <130> NATHAN7408PC2 <150> US 62/143,821 <151> 2015-04-07 <150> US 62/170,717 <151> 2015-06-04 <160> 40 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 1 atgatctgca tcagttgtaa a 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 2 cggcaacatg ctggtccttt a 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 3 ctgcctttgg ctgcaacttc a 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 4 aattctccga acgtgtcacg t 21 <210> 5 <211> 6099 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 cgtagctatt tcaaggcgcg cgcctcgtgg tggactcacc gctagcccgc agcgctcggc 60 ttcctggtaa ttcttcacct cttttctcag ctccctgcag catgggtgct gggccctcct 120 tgctgctcgc cgccctcctg ctgcttctct ccggcgacgg cgccgtgcgc 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<210> 9 <211> 813 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 atgatgctcc ggctgctcag ttccctcctc cttgtggccg ttgcctcagg ctatggccca 60 ccttcctctc actcttccag ccgcgttgtc catggtgagg atgcggtccc ctacagctgg 120 ccctggcagg tttccctgca gtatgagaaa agtggaagct tctaccacac gtgtggcggt 180 agcctcatcg cccccgattg ggttgtgact gccggccact gcatctcgag ggatctgacc 240 taccaggtgg tgttgggtga gtacaacctt gctgtgaagg agggccccga gcaggtgatc 300 cccatcaact ctgaggagct gtttgtgcat ccactctgga accgctcgtg tgtggcctgt 360 ggcaatgaca tcgccctcat caagctctca cgcagcgccc agctgggaga tgccgtccag 420 ctcgcctcac tccctcccgc tggtgacatc cttcccaaca agacaccctg ctacatcacc 480 ggctggggcc gtctctatac caatgggcca ctcccagaca agctgcagca ggcccggctg 540 cccgtggtgg actataagca ctgctccagg tggaactggt ggggttccac cgtgaagaaa 600 accatggtgt gtgctggagg gtacatccgc tccggctgca acggtgactc tggaggaccc 660 ctcaactgcc ccacagagga tggtggctgg caggtccacg gtgtgaccag ctttgtttct 720 gcctttggct gcaacttcat ctggaagccc acggtgttca ctcgagtctc cgccttcatc 780 gactggattg aggagaccat agcaagccac tag 813 <210> 10 <211> 270 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Met Leu Arg Leu Leu Ser Ser Leu Leu Leu Val Ala Val Ala Ser 1 5 10 15 Gly Tyr Gly Pro Pro Ser Ser His Ser Ser Ser Arg Val Val His Gly 20 25 30 Glu Asp Ala Val Pro Tyr Ser Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu Gln Tyr 35 40 45 Glu Lys Ser Gly Ser Phe Tyr His Thr Cys Gly Gly Ser Leu Ile Ala 50 55 60 Pro Asp Trp Val Val Thr Ala Gly His Cys Ile Ser Arg Asp Leu Thr 65 70 75 80 Tyr Gln Val Val Leu Gly Glu Tyr Asn Leu Ala Val Lys Glu Gly Pro 85 90 95 Glu Gln Val Ile Pro Ile Asn Ser Glu Glu Leu Phe Val His Pro Leu 100 105 110 Trp Asn Arg Ser Cys Val Ala Cys Gly Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys 115 120 125 Leu Ser Arg Ser Ala Gln Leu Gly Asp Ala Val Gln Leu Ala Ser Leu 130 135 140 Pro Pro Ala Gly Asp Ile Leu Pro Asn Lys Thr Pro Cys Tyr Ile Thr 145 150 155 160 Gly Trp Gly Arg Leu Tyr Thr Asn Gly Pro Leu Pro Asp Lys Leu Gln 165 170 175 Gln Ala Arg Leu Pro Val Val Asp Tyr Lys His Cys Ser Arg Trp Asn 180 185 190 Trp Trp Gly Ser Thr Val Lys Lys Thr Met Val Cys Ala Gly Gly Tyr 195 200 205 Ile Arg Ser Gly Cys Asn Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Asn Cys Pro 210 215 220 Thr Glu Asp Gly Gly Trp Gln Val His Gly Val Thr Ser Phe Val Ser 225 230 235 240 Ala Phe Gly Cys Asn Phe Ile Trp Lys Pro Thr Val Phe Thr Arg Val 245 250 255 Ser Ala Phe Ile Asp Trp Ile Glu Glu Thr Ile Ala Ser His 260 265 270 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Cys Ile Ser Arg Asp Leu Thr Tyr 1 5 <210> 12 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 12 Gly Glu Tyr Asn Leu Ala Val Lys 1 5 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 13 Pro Ile Asn Ser Glu Glu Leu Phe 1 5 <210> 14 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 14 Gln Gln Ala Arg Leu Pro Val Val 1 5 <210> 15 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 15 Thr Met Val Cys Ala Gly Gly Tyr 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 16 Ala Phe Gly Cys Asn Phe Ile Trp Lys 1 5 <210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 17 Met Leu Val Leu Tyr Gly His Ser Thr Gln Asp Leu Pro Glu Thr Asn 1 5 10 15 <210> 18 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 18 Ala Gly Arg Asn Ser Trp Pro Ser 1 5 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 19 Leu Ser Gln Asn Asp Gly Thr Glu Gln Tyr 1 5 10 <210> 20 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 20 Ser Asp Asn Val Ala Ala Gly Tyr 1 5 <210> 21 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial seqeunce <400> 21 Ala Tyr Leu Pro Ser Val 1 5 <210> 22 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 22 Ala Ile Cys Ser Ser Ser Ser Tyr 1 5 <210> 23 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 23 Ser Arg Gly Cys Asn Val Ser Arg 1 5 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 24 tgcatctcga gggatctgac ctac 24 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 25 ggtgagtaca accttgctgt gaag 24 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 26 cccatcaact ctgaggagct gttt 24 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 27 cagcaggccc ggctgcccgt ggtg 24 <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 28 accatggtgt gtgctggagg gtac 24 <210> 29 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 29 gcctttggct gcaacttcat ctggaag 27 <210> 30 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 30 atgctggtcc tttatggaca cagcacccag gaccttccgg aaaccaatg 49 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 31 gccgggagga attcctggcc ctct 24 <210> 32 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 32 ctgagccaga atgatggcac tgagcagtac 30 <210> 33 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 33 agcgataacg tggctgccgg ctat 24 <210> 34 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 34 gcttacctgc cctctgtg 18 <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 35 gccatctgct ccagctcctc ctac 24 <210> 36 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 36 agccggggct gtaatgtctc cagg 24 <210> 37 <211> 813 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 37 atgatgctcc ggctgctcag ttccctcctc cttgtggccg ttgcctcagg ctatggccca 60 ccttcctctc gcccttccag ccgcgttgtc aatggtgagg atgcggtccc ctacagctgg 120 ccctggcagg tttccctgca gtatgagaaa agcggaagct tctaccacac ctgtggcggt 180 agcctcatcg cccccgactg ggttgtgact gccggccact gcatctcgag ctcccggacc 240 taccaggtgg tgttgggcga gtacgaccgt gctgtgaagg agggccccga gcaggtgatc 300 cccatcaact ctggggacct ctttgtgcat ccactctgga accgctcgtg tgtggcctgt 360 ggcaatgaca tcgccctcat caagctctca cgcagcgccc agctgggaga cgccgtccag 420 ctcgcctcac tccctccggc tggtgacatc cttcccaacg agacaccctg ctacatcacc 480 ggctggggcc gtctctatac caacgggcca ctcccagaca agctgcagga ggccctgctg 540 ccggtggtgg actatgaaca ctgctccagg tggaactggt ggggttcctc cgtgaagaag 600 accatggtgt gtgctggagg ggacatccgc tccggctgca atggtgactc tggaggaccc 660 ctcaactgcc ccacagagga tggtggctgg caggtccatg gcgtgaccag ctttgtttct 720 gcctttggct gcaacacccg caggaagccc acggtgttca ctcgagtctc cgccttcatt 780 gactggattg aggagaccat agcaagccac tag 813 <210> 38 <211> 270 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Met Met Leu Arg Leu Leu Ser Ser Leu Leu Leu Val Ala Val Ala Ser 1 5 10 15 Gly Tyr Gly Pro Pro Ser Ser Arg Pro Ser Ser Arg Val Val Asn Gly 20 25 30 Glu Asp Ala Val Pro Tyr Ser Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu Gln Tyr 35 40 45 Glu Lys Ser Gly Ser Phe Tyr His Thr Cys Gly Gly Ser Leu Ile Ala 50 55 60 Pro Asp Trp Val Val Thr Ala Gly His Cys Ile Ser Ser Ser Arg Thr 65 70 75 80 Tyr Gln Val Val Leu Gly Glu Tyr Asp Arg Ala Val Lys Glu Gly Pro 85 90 95 Glu Gln Val Ile Pro Ile Asn Ser Gly Asp Leu Phe Val His Pro Leu 100 105 110 Trp Asn Arg Ser Cys Val Ala Cys Gly Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys 115 120 125 Leu Ser Arg Ser Ala Gln Leu Gly Asp Ala Val Gln Leu Ala Ser Leu 130 135 140 Pro Pro Ala Gly Asp Ile Leu Pro Asn Glu Thr Pro Cys Tyr Ile Thr 145 150 155 160 Gly Trp Gly Arg Leu Tyr Thr Asn Gly Pro Leu Pro Asp Lys Leu Gln 165 170 175 Glu Ala Leu Leu Pro Val Val Asp Tyr Glu His Cys Ser Arg Trp Asn 180 185 190 Trp Trp Gly Ser Ser Val Lys Lys Thr Met Val Cys Ala Gly Gly Asp 195 200 205 Ile Arg Ser Gly Cys Asn Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Asn Cys Pro 210 215 220 Thr Glu Asp Gly Gly Trp Gln Val His Gly Val Thr Ser Phe Val Ser 225 230 235 240 Ala Phe Gly Cys Asn Thr Arg Arg Lys Pro Thr Val Phe Thr Arg Val 245 250 255 Ser Ala Phe Ile Asp Trp Ile Glu Glu Thr Ile Ala Ser His 260 265 270 <210> 39 <211> 810 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 39 atgataagga cgctgctgct gtccactttg gtggctggag ccctcagttg tggggacccc 60 acttacccac cttatgtgac tagggtggtt ggcggtgaag aagcgaggcc caacagctgg 120 ccctggcagg tctccctgca gtacagctcc aatggcaagt ggtaccacac ctgcggaggg 180 tccctgatag ccaacagctg ggtcctgacg gctgcccact gcatcagctc ctccaggacc 240 taccgcgtgg ggctgggccg gcacaacctc tacgttgcgg agtccggctc gctggcagtc 300 agtgtctcta agattgtggt gcacaaggac tggaactcca accaaatctc caaagggaac 360 gacattgccc tgctcaaact ggctaacccc gtctccctca ccgacaagat ccagctggcc 420 tgcctccctc ctgccggcac cattctaccc aacaactacc cctgctacgt cacgggctgg 480 ggaaggctgc agaccaacgg ggctgttcct gatgtcctgc agcagggccg gttgctggtt 540 gtggactatg ccacctgctc cagctctgcc tggtggggca gcagcgtgaa aaccagtatg 600 atctgtgctg ggggtgatgg cgtgatctcc agctgcaacg gagactctgg cgggccactg 660 aactgtcagg cgtctgacgg ccggtggcag gtgcacggca tcgtcagctt cgggtctcgc 720 ctcggctgca actactacca caagccctcc gtcttcacgc gggtctccaa ttacatcgac 780 tggatcaatt cggtgattgc aaataactaa 810 <210> 40 <211> 269 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Met Ile Arg Thr Leu Leu Leu Ser Thr Leu Val Ala Gly Ala Leu Ser 1 5 10 15 Cys Gly Asp Pro Thr Tyr Pro Pro Tyr Val Thr Arg Val Val Gly Gly 20 25 30 Glu Glu Ala Arg Pro Asn Ser Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu Gln Tyr 35 40 45 Ser Ser Asn Gly Lys Trp Tyr His Thr Cys Gly Gly Ser Leu Ile Ala 50 55 60 Asn Ser Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Ile Ser Ser Ser Arg Thr 65 70 75 80 Tyr Arg Val Gly Leu Gly Arg His Asn Leu Tyr Val Ala Glu Ser Gly 85 90 95 Ser Leu Ala Val Ser Val Ser Lys Ile Val Val His Lys Asp Trp Asn 100 105 110 Ser Asn Gln Ile Ser Lys Gly Asn Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ala 115 120 125 Asn Pro Val Ser Leu Thr Asp Lys Ile Gln Leu Ala Cys Leu Pro Pro 130 135 140 Ala Gly Thr Ile Leu Pro Asn Asn Tyr Pro Cys Tyr Val Thr Gly Trp 145 150 155 160 Gly Arg Leu Gln Thr Asn Gly Ala Val Pro Asp Val Leu Gln Gln Gly 165 170 175 Arg Leu Leu Val Val Asp Tyr Ala Thr Cys Ser Ser Ser Ala Trp Trp 180 185 190 Gly Ser Ser Val Lys Thr Ser Met Ile Cys Ala Gly Gly Asp Gly Val 195 200 205 Ile Ser Ser Cys Asn Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Asn Cys Gln Ala 210 215 220 Ser Asp Gly Arg Trp Gln Val His Gly Ile Val Ser Phe Gly Ser Arg 225 230 235 240 Leu Gly Cys Asn Tyr Tyr His Lys Pro Ser Val Phe Thr Arg Val Ser 245 250 255 Asn Tyr Ile Asp Trp Ile Asn Ser Val Ile Ala Asn Asn 260 265

Claims (56)

  1. 세포 또는 조직 괴사 또는 이에 관련된 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 화학식 I의 구조를 특징으로 하는 화합물:
    화학식 I
    　
    Figure pct00054

    (여기서, G1은 치환된 또는 비치환된 피롤리딘, 치환된 또는 비치환된 피페리딘, 치환된 또는 비치환된 피페라진, 치환된 또는 비치환된 이미다졸리딘, 또는 치환된 또는 비치환된 피라졸리딘이고;
    G3은 하기 구조:
    Figure pct00055
    를 특징으로 하거나; 또는 G3은 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬이고;
    여기서, G2는 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클이다); 또는
    화학식 II의 구조를 특징으로 하는 화합물:
    화학식 II
    Figure pct00056

    　(여기서, G1은 치환된 또는 비치환된 피롤리딘, 치환된 또는 비치환된 피리딘, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 피페리딘, 치환된 또는 비치환된 피페라진, 치환된 또는 비치환된 이미다졸리딘, 또는 치환된 또는 비치환된 피라졸리딘이고;
    G3은 하기 구조:
    Figure pct00057
    를 특징으로 하거나; 또는 G3은 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬이고;
    여기서, G2는 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클이다); 또는
    화학식 III의 구조를 특징으로 하는 화합물:
    화학식 III
    Figure pct00058

    (여기서, G1은 치환된 또는 비치환된 피롤리딘, 치환된 또는 비치환된 피리딘, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 피페리딘, 치환된 또는 비치환된 피페라진, 치환된 또는 비치환된 이미다졸리딘, 또는 치환된 또는 비치환된 피라졸리딘이고;
    G3은 하기 구조:
    Figure pct00059
    를 특징으로 하거나; 또는 G3은 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬이고;
    여기서, G2는 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클이다); 또는
    3,4-비스((2-(피롤리딘-1-일)에틸)아미노)-1,2,5-티아디아졸 1,1-디옥사이드;
    사이클로프로필(2-(5-이소프로필이속사졸-3-일)피롤리딘-1-일)메타논;
    6-브로모-2-(3,5-디메톡시페닐)-4벤조[d][1,3]옥사진-4-온
    6-메틸-5-((2-메틸피페리딘-1-일)설포닐)피리미딘-2,4(1H,3H)-디온;
    N-메틸-4,5,6,7,8,9-헥사하이드로-1H-사이클로옥타[c]피라졸-3-카복스아미드;
    2-(5-(피리딘-4-일)-2H-테트라졸-2-일)아세트산;
    2-(푸란-2-일)-5,6,7,8-테트라하이드로-4H-벤조[4,5]티에노[2,3-d][1,3]옥사진-4-온;
    3-((5-아세트아미도-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)티오)프로판산;
    N,N'-(옥시비스(4,1-페닐렌))비스(2-메틸프로판아미드);
    7-(4-에틸피페라진-1-일)-5,6-디메틸-[1,2,4]트리아졸로[1,5-a]피리미딘;
    7-플루오로-10-(2-(4-이소프로필피페라진-1-일)-2-옥소에틸)-2,3-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-5,11(10H,11aH)-디온;
    2-(3급-부틸)-3-(1-메틸-1H-벤조[d]이미다졸-2-일)-4-옥소-4H-크로멘-7-일 피발레이트;
    3-메틸-8-(피페리딘-1-일)-1H-푸린-2,6(3H,7H)-디온;
    2-(3-브로모페닐)-4-옥소-4H-벤조[d][1,3]옥사진-6-일 아세테이트;
    N-(1-에틸-3,5-디메틸-1H-피라졸-4-일)-3,4,5-트리메톡시벤즈아미드;
    5-에틸-N-(피리딘-2-일메틸)-5H-[1,2,4]트리아지노[5,6-b]인돌-3-아민;
    3-((4-클로로-1H-피라졸-1-일)메틸)-N-(2-(3-플루오로벤즈아미도)에틸)-1,2,4-옥사디아졸-5-카복스아미드;
    1-(4-(메틸티오)벤질)-4-토실피페라진;
    2-(2-에틸페닐설폰아미도)-5-(4-에틸피페라진-1-일)벤조산;
    4((2-메틸인돌린-1-일)설포닐)벤조산;
    6-브로모-2-(3,5-디메톡시페닐)-4H-벤조[d][1,3]옥사진-4-온;
    2-아미노-N-(2,4-디플루오로페닐)피리미딘-5-설폰아미드;
    3-메틸-8-(피페리딘-1-일)-1H-푸린-2,6(3H,7H)-디온;
    5-클로로-N-(2-옥소-1-페닐피롤리딘-3-일)티오펜-2-설폰아미드;
    3-(피롤리딘-1-일설포닐)벤조산;
    (3,5-디메틸-1H-피라졸-1-일)(3,4,5-트리메톡시페닐)메타논;
    N-(3,4-디플루오로페닐)-2-(8-플루오로-5,11-디옥소-2,3,11,11a-테트라하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-일)아세트아미드;
    5-(사이클로헥실메틸)-3-(피리딘-2-일)-1,2,4-옥사디아졸;
    에틸 5-메틸-4-(2-((4-메틸벤질)아미노)-2-옥소에틸)-7-페닐-4,7-디하이드로-[1,2,4]트리아졸로[1,5-a]피리미딘-6-카복실레이트;
    [1,2,4]트리아졸로[1,5-a]피리미딘-2-카복실산;
    1-(2-(피페리딘-1-일)-4,5-디하이드로-1H-이미다졸-1-일)부탄-1-온;
    (4-(6-클로로-[1,2,4]트리아졸로[4,3-a]피리딘-3-일)피페라진-1-일)(1-페닐사이클로프로필)메타논;
    N-(2,4-디플루오로페닐)-2-(5,11-디옥소-2,3,11,11a-테트라하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-일)아세트아미드; 및
    에틸-2,3-디하이드로-3-옥소-1,2-벤즈이소티아졸-2-아세테이트-1,1-디옥사이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 화합물; 또는 이의 약제학적 염 또는 이의 임의의 조합.
  2. 제1항에 있어서, 상기 화합물이 (2-(피페리딘-1-일)티아졸-4-일)(피롤리딘-1-일)메타논; N-(4-메틸피리딘-2-일)-4-(2,4,5-트리메틸페닐)티아졸-2-아민; 4-((2-메틸인돌린-1-일)설포닐)벤조산; 1-(2-(4-메틸피페라진-1-일)-4,5-디하이드로-1H-이미다졸-1-일)프로판-1-온; 사이클로펜틸(2-(피롤리딘-1-일)-4,5-디하이드로-1H-이미다졸-1-일)메타논; N1-(4-(4-클로로페닐)티아졸-2-일)-N4,N4-디메틸벤젠-1,4-디아민; 2-사이클로펜틸-1-(2-(피롤리딘-1-일)-4,5-디하이드로-1H-이미다졸-1-일)에타논; N1-(4-(4-클로로페닐)티아졸-2-일)-N4,N4-디메틸벤젠-1,4-디아민; 사이클로펜틸(2-(4-에틸피페라진-1-일)-4,5-디하이드로-1H-이미다졸-1-일)메타논; 2-에틸-1-(2-(피롤리딘-1-일)-4,5-디하이드로-1H-이미다졸-1-일)부탄-1-온; 푸란-2-일(2-(피롤리딘-1-일)-4,5-디하이드로-1H-이미다졸-1-일)메타논; (2-클로로페닐)-[2-(1-피페리딜)-4,5-디하이드로이미다졸-1-일]메타논인, 화합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 화합물이 CELA3A 또는 구조적으로 이에 관련된 효소인 CELA1 또는 카텝신 C 또는 이들의 조합과 Kd 10-7 M 이하의 최소 친화력으로 선택적으로 결합하는, 화합물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 화합물이 CELA2A, CELA3B, 또는 카텝신 A, B, D, E, G, H, K, L1, L2, O, S, W 또는 Z 또는 이들의 조합에 Kd 10-6 M 이상의 최소 친화력으로 결합하는, 화합물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 용도가 생체외 또는 시험관내인, 화합물.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 용도가 생체내인, 화합물.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포 또는 조직 괴사의 치료 또는 예방이 뇌 세포, 뉴런 세포, 퍼킨제 세포, 해마 추상 세포, 신경교 세포, 심근 세포, 근세포, 각질형성 세포, 표피 세포, 골 또는 연골 세포, 췌장 세포, 간세포, 신장 세포, 위장 세포, 비장 세포, 조혈 세포, 림프구, 대식세포, 흉선 세포, 섬유아세포, 상피 세포, 기관지 상피 세포, 비뇨세관, 사구체 모세혈관 세포, 생식선 세포, 정자, 난자, 수정란, 배아 세포 및 폐 상피 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된 세포에 영향을 미치는, 화합물.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포 또는 조직 괴사의 치료 또는 예방이 신경퇴행성 질환, 황반변성, 망막 괴사, 근위축증, 백혈병, 림프종, 신생아 호흡곤란 증후군, 질식, 감돈 탈장, 진성 당뇨병, 결핵, 자궁내막증, 혈관 이상증, 건선, 한냉 손상, 철-부하 합병증, 스테로이드 치료의 합병증, 허혈성 심질환, 심근경색증, 재관류 손상, 뇌혈관 질환 또는 괴저 손상, 욕창, 췌장염, 간염, 경화증, 혈색소뇨증, 패혈증, 화상, 고체온증, 크론병, 셀리악병, 구획 증후군, 괴사성 직장염, 스티븐-존슨 증후군 (SJS), 독성 표피 괴사 (TEN), 낭포성 섬유증, 류마티스 관절염, 골수염, 괴사성 근막염, 신독성, 척수 손상, 사구체신염, 급성 세뇨관 괴사, 신피질 괴사, 퇴행성 관절염, 타이로신혈증, 대사성 유전 질환, 세균, 바이러스, 진균 또는 기생충 감염, 앤더슨병, 선천성 미토콘드리아병, 페닐케톤뇨증, 태반 경색증, 매독, 무균성 괴사, 무혈성 괴사, 알콜 중독, 약물 투여 또는 노출과 관련된 괴사, 화학 독소, 농약, 중금속, 전쟁 유기인산염, 또는 거미 또는 뱀 독, 피부 필러 투여와 관련된 괴사, 이소성 약물 투여와 관련된 괴사, 화학요법 유도 괴사, 방사선 유도된 괴사, 이식 조직의 손상 또는 감소된 질 또는 노화로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질환 또는 의학적 병태의 치료, 개선, 이의 증상의 폐지 (abrogating) 또는 이의 발병을 감소시키는, 화합물.
  9. 유효량의 화학식 I의 구조를 특징으로 하는 화합물:
    화학식 I
    　
    Figure pct00060

    (여기서, G1은 치환된 또는 비치환된 피롤리딘, 치환된 또는 비치환된 피페리딘, 치환된 또는 비치환된 피페라진, 치환된 또는 비치환된 이미다졸리딘, 또는 치환된 또는 비치환된 피라졸리딘이고;
    G3은 하기 구조:
    Figure pct00061
    를 특징으로 하거나; 또는 G3은 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬이고;
    여기서, G2는 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클이다); 또는
    화학식 II의 구조를 특징으로 하는 화합물:
    화학식 II
    Figure pct00062

    (여기서, G1은 치환된 또는 비치환된 피롤리딘, 치환된 또는 비치환된 피리딘, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 피페리딘, 치환된 또는 비치환된 피페라진, 치환된 또는 비치환된 이미다졸리딘, 또는 치환된 또는 비치환된 피라졸리딘이고;
    G3은 하기 구조:
    Figure pct00063
    를 특징으로 하거나; 또는 G3은 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬이고;
    여기서, G2는 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클이다); 또는
    화학식 III의 구조를 특징으로 하는 화합물:
    화학식 III
    Figure pct00064

    (여기서, G1은 치환된 또는 비치환된 피롤리딘, 치환된 또는 비치환된 피리딘, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 피페리딘, 치환된 또는 비치환된 피페라진, 치환된 또는 비치환된 이미다졸리딘, 또는 치환된 또는 비치환된 피라졸리딘이고;
    G3은 하기 구조:
    Figure pct00065
    를 특징으로 하거나; 또는 G3은 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬이고;
    여기서, G2는 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클이다); 또는
    3,4-비스((2-(피롤리딘-1-일)에틸)아미노)-1,2,5-티아디아졸 1,1-디옥사이드;
    사이클로프로필(2-(5-이소프로필이속사졸-3-일)피롤리딘-1-일)메타논;
    6-브로모-2-(3,5-디메톡시페닐)-4벤조[d][1,3]옥사진-4-온;
    6-메틸-5-((2-메틸피페리딘-1-일)설포닐)피리미딘-2,4(1H,3H)-디온;
    N-메틸-4,5,6,7,8,9-헥사하이드로-1H-사이클로옥타[c]피라졸-3-카복스아미드;
    2-(5-(피리딘-4-일)-2H-테트라졸-2-일)아세트산;
    2-(푸란-2-일)-5,6,7,8-테트라하이드로-4H-벤조[4,5]티에노[2,3-d][1,3]옥사진-4-온;
    3-((5-아세트아미도-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)티오)프로판산;
    N,N'-(옥시비스(4,1-페닐렌))비스(2-메틸프로판아미드);
    7-(4-에틸피페라진-1-일)-5,6-디메틸-[1,2,4]트리아졸로[1,5-a]피리미딘;
    7-플루오로-10-(2-(4-이소프로필피페라진-1-일)-2-옥소에틸)-2,3-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-4]디아제핀-5,11(10H,11aH)-디온;
    2-(3급-부틸)-3-(1-메틸-1H-벤조[d]이미다졸-2-일)-4-옥소-4H-크로멘-7-일 피발레이트;
    3-메틸-8-(피페리딘-1-일)-1H-푸린-2,6(3H,7H)-디온;
    2-(3-브로모페닐)-4-옥소-4H-벤조[d][1,3]옥사진-6-일 아세테이트;
    N-(1-에틸-3,5-디메틸-1H-피라졸-4-일)-3,4,5-트리메톡시벤즈아미드;
    5-에틸-N-(피리딘-2-일메틸)-5H-[1,2,4]트리아지노[5,6-b]인돌-3-아민;
    3-((4-클로로-1H-피라졸-1-일)메틸)-N-(2-(3-플루오로벤즈아미도)에틸)-1,2,4-옥사디아졸-5-카복스아미드;
    1-(4-(메틸티오)벤질)-4-토실피페라진;
    2-(2-에틸페닐설폰아미도)-5-(4-에틸피페라진-1-일)벤조산;
    4((2-메틸인돌린-1-일)설포닐)벤조산;
    6-브로모-2-(3,5-디메톡시페닐)-4H-벤조[d][1,3]옥사진-4-온;
    2-아미노-N-(2,4-디플루오로페닐)피리미딘-5-설폰아미드;
    3-메틸-8-(피페리딘-1-일)-1H-푸린-2,6(3H,7H)-디온;
    5-클로로-N-(2-옥소-1-페닐피롤리딘-3-일)티오펜-2-설폰아미드;
    3-(피롤리딘-1-일설포닐)벤조산;
    (3,5-디메틸-1H-피라졸-1-일)(3,4,5-트리메톡시페닐)메타논;
    N-(3,4-디플루오로페닐)-2-(8-플루오로-5,11-디옥소-2,3,11,11a-테트라하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-일)아세트아미드;
    5-(사이클로헥실메틸)-3-(피리딘-2-일)-1,2,4-옥사디아졸;
    에틸 5-메틸-4-(2-((4-메틸벤질)아미노)-2-옥소에틸)-7-페닐-4,7-디하이드로-[1,2,4]트리아졸로[1,5-a]피리미딘-6-카복실레이트;
    [1,2,4]트리아졸로[1,5-a]피리미딘-2-카복실산;
    1-(2-(피페리딘-1-일)-4,5-디하이드로-1H-이미다졸-1-일)부탄-1-온;
    (4-(6-클로로-[1,2,4]트리아졸로[4,3-a]피리딘-3-일)피페라진-1-일)(1-페닐사이클로프로필)메타논;
    N-(2,4-디플루오로페닐)-2-(5,11-디옥소-2,3,11,11a-테트라하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a] [1,4]디아제핀-10(5H)-일)아세트아미드; 및
    에틸-2,3-디하이드로-3-옥소-1,2-벤즈이소티아졸-2-아세테이트-1,1-디옥사이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 화합물; 또는 이의 약제학적 염 또는 이의 임의의 조합을 포함하는, 약제학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 항-아폽토시스제 또는 항-노화제를 추가로 포함하는, 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 세포 또는 조직 괴사의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 용도가 생체외 또는 시험관내인, 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 세포 또는 조직 괴사의 상기 치료 또는 예방이 뇌 세포, 뉴런 세포, 퍼킨제 세포, 해마 추상 세포, 신경교 세포, 심근 세포, 근세포, 각질형성 세포, 표피 세포, 골 또는 연골 세포, 췌장 세포, 간세포, 신장 세포, 위장 세포, 비장 세포, 조혈 세포, 림프구, 대식세포, 흉선 세포, 섬유아세포, 상피 세포, 기관지 상피 세포, 비뇨세관, 사구체 모세혈관 세포, 생식선 세포, 정자, 난자, 수정란, 배아 세포 및 폐 상피 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된 세포에 영향을 미치는, 조성물.
  14. 제11항에 있어서, 세포 또는 조직 괴사의 치료 또는 예방이 신경퇴행성 질환, 황반변성, 망막 괴사, 근위축증, 백혈병, 림프종, 신생아 호흡곤란 증후군, 질식, 감돈 탈장, 진성 당뇨병, 결핵, 자궁내막증, 혈관 이상증, 건선, 한냉 손상, 철-부하 합병증, 스테로이드 치료의 합병증, 허혈성 심질환, 심근경색증, 재관류 손상, 뇌혈관 질환 또는 괴저 손상, 욕창, 췌장염, 간염, 경화증, 혈색소뇨증, 패혈증, 화상, 고체온증, 크론병, 셀리악병, 구획 증후군, 괴사성 직장염, 스티븐-존슨 증후군 (SJS), 독성 표피 괴사 (TEN), 낭포성 섬유증, 류마티스 관절염, 골수염, 괴사성 근막염, 신독성, 척수 손상, 사구체신염, 급성 세뇨관 괴사, 신피질 괴사, 퇴행성 관절염, 타이로신혈증, 대사성 유전 질환, 세균, 바이러스, 진균 또는 기생충 감염, 앤더슨병, 선천성 미토콘드리아병, 페닐케톤뇨증, 태반 경색증, 매독, 무균성 괴사, 무혈성 괴사, 알콜 중독, 약물 투여 또는 노출과 관련된 괴사, 화학 독소, 농약, 중금속, 전쟁 유기인산염, 또는 거미 또는 뱀 독, 피부 필러 투여와 관련된 괴사, 이소성 약물 투여와 관련된 괴사, 화학요법 유도 괴사, 방사선 유도된 괴사, 이식 조직의 손상 또는 감소된 질 또는 노화로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질환 또는 의학적 병태의 치료, 개선, 이의 증상의 폐지 또는 이의 발병을 감소시키는, 조성물.
  15. 이를 필요로 하는 대상체에서 괴사와 관련된 질환 또는 병태의 치료, 예방, 개선, 이의 증상의 폐지 또는 이의 발병을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 화학적 유효량의 화학식 I의 구조를 특징으로 하는 화합물:
    화학식 I
    　
    Figure pct00066

    (여기서, G1은 치환된 또는 비치환된 피롤리딘, 치환된 또는 비치환된 피페리딘, 치환된 또는 비치환된 피페라진, 치환된 또는 비치환된 이미다졸리딘, 또는 치환된 또는 비치환된 피라졸리딘이고;
    G3은 하기 구조:
    Figure pct00067
    를 특징으로 하거나; 또는 G3은 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬이고;
    여기서, G2는 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클이다); 또는
    화학식 II의 구조를 특징으로 하는 화합물:
    화학식 II
    Figure pct00068

    (여기서, G1은 치환된 또는 비치환된 피롤리딘, 치환된 또는 비치환된 피리딘, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 피페리딘, 치환된 또는 비치환된 피페라진, 치환된 또는 비치환된 이미다졸리딘, 또는 치환된 또는 비치환된 피라졸리딘이고;
    G3은 하기 구조:
    Figure pct00069
    를 특징으로 하거나; 또는 G3은 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬이고;
    여기서, G2는 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클이다); 또는
    화학식 III의 구조를 특징으로 하는 화합물:
    화학식 III
    Figure pct00070

    (여기서, G1은 치환된 또는 비치환된 피롤리딘, 치환된 또는 비치환된 피리딘, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 피페리딘, 치환된 또는 비치환된 피페라진, 치환된 또는 비치환된 이미다졸리딘, 또는 치환된 또는 비치환된 피라졸리딘이고;
    G3은 하기 구조:
    Figure pct00071
    를 특징으로 하거나; 또는 G3은 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬이고;
    여기서, G2는 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클이다); 또는
    3,4-비스((2-(피롤리딘-1-일)에틸)아미노)-1,2,5-티아디아졸 1,1-디옥사이드;
    사이클로프로필(2-(5-이소프로필이속사졸-3-일)피롤리딘-1-일)메타논;
    6-브로모-2-(3,5-디메톡시페닐)-4벤조[d][1,3]옥사진-4-온
    6-메틸-5-((2-메틸피페리딘-1-일)설포닐)피리미딘-2,4(1H,3H)-디온;
    N-메틸-4,5,6,7,8,9-헥사하이드로-1H-사이클로옥타[c]피라졸-3-카복스아미드;
    2-(5-(피리딘-4-일)-2H-테트라졸-2-일)아세트산;
    2-(푸란-2-일)-5,6,7,8-테트라하이드로-4H-벤조[4,5]티에노[2,3-d][1,3]옥사진-4-온;
    3-((5-아세트아미도-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)티오)프로판산;
    N,N'-(옥시비스(4,1-페닐렌))비스(2-메틸프로판아미드);
    7-(4-에틸피페라진-1-일)-5,6-디메틸-[1,2,4]트리아졸로[1,5-a]피리미딘;
    7-플루오로-10-(2-(4-이소프로필피페라진-1-일)-2-옥소에틸)-2,3-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-5,11(10H,11aH)-디온;
    2-(3급-부틸)-3-(1-메틸-1H-벤조[d]이미다졸-2-일)-4-옥소-4H-크로멘-7-일 피발레이트;
    3-메틸-8-(피페리딘-1-일)-1H-푸린-2,6(3H,7H)-디온;
    2-(3-브로모페닐)-4-옥소-4H-벤조[d][1,3]옥사진-6-일 아세테이트;
    N-(1-에틸-3,5-디메틸-1H-피라졸-4-일)-3,4,5-트리메톡시벤즈아미드;
    5-에틸-N-(피리딘-2-일메틸)-5H-[1,2,4]트리아지노[5,6-b]인돌-3-아민;
    3-((4-클로로-1H-피라졸-1-일)메틸)-N-(2-(3-플루오로벤즈아미도)에틸)-1,2,4-옥사디아졸-5-카복스아미드;
    1-(4-(메틸티오)벤질)-4-토실피페라진;
    2-(2-에틸페닐설폰아미도)-5-(4-에틸피페라진-1-일)벤조산;
    4((2-메틸인돌린-1-일)설포닐)벤조산;
    6-브로모-2-(3,5-디메톡시페닐)-4H-벤조[d][1,3]옥사진-4-온;
    2-아미노-N-(2,4-디플루오로페닐)피리미딘-5-설폰아미드;
    3-메틸-8-(피페리딘-1-일)-1H-푸린-2,6(3H,7H)-디온;
    5-클로로-N-(2-옥소-1-페닐피롤리딘-3-일)티오펜-2-설폰아미드;
    3-(피롤리딘-1-일설포닐)벤조산;
    (3,5-디메틸-1H-피라졸-1-일)(3,4,5-트리메톡시페닐)메타논;
    N-(3,4-디플루오로페닐)-2-(8-플루오로-5,11-디옥소-2,3,11,11a-테트라하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-일)아세트아미드;
    5-(사이클로헥실메틸)-3-(피리딘-2-일)-1,2,4-옥사디아졸;
    에틸 5-메틸-4-(2-((4-메틸벤질)아미노)-2-옥소에틸)-7-페닐-4,7-디하이드로-[1,2,4]트리아졸로[1,5-a]피리미딘-6-카복실레이트;
    [1,2,4]트리아졸로[1,5-a]피리미딘-2-카복실산;
    1-(2-(피페리딘-1-일)-4,5-디하이드로-1H-이미다졸-1-일)부탄-1-온;
    (4-(6-클로로-[1,2,4]트리아졸로[4,3-a]피리딘-3-일)피페라진-1-일)(1-페닐사이클로프로필)메타논;
    N-(2,4-디플루오로페닐)-2-(5,11-디옥소-2,3,11,11a-테트라하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a] [1,4]디아제핀-10(5H)-일)아세트아미드; 및
    에틸-2,3-디하이드로-3-옥소-1,2-벤즈이소티아졸-2-아세테이트-1,1-디옥사이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 화합물; 또는 이의 약제학적 염 또는 이의 임의의 조합을 상기 대상체에 투여하여, 상기 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 화합물이 (2-(피페리딘-1-일)티아졸-4-일)(피롤리딘-1-일)메타논; N-(4-메틸피리딘-2-일)-4-(2,4,5-트리메틸페닐)티아졸-2-아민; 4-((2-메틸인돌린-1-일)설포닐)벤조산; 1-(2-(4-메틸피페라진-1-일)-4,5-디하이드로-1H-이미다졸-1-일)프로판-1-온; 사이클로펜틸(2-(피롤리딘-1-일)-4,5-디하이드로-1H-이미다졸-1-일)메타논; N1-(4-(4-클로로페닐)티아졸-2-일)-N4,N4-디메틸벤젠-1.4-디아민; 2-사이클로펜틸-1-(2-(피롤리딘-1-일)-4,5-디하이드로-1H-이미다졸-1-일)에타논; N1-(4-(4-클로로페닐)티아졸-2-일)-N4,N4-디메틸벤젠-1,4-디아민; 사이클로펜틸(2-(4-에틸피페라진-1-일)-4,5-디하이드로-1H-이미다졸-1-일)메타논; 2-에틸-1-(2-(피롤리딘-1-일)-4,5-디하이드로-1H-이미다졸-1-일)부탄-1-온; 푸란-2-일(2-(피롤리딘-1-일)-4,5-디하이드로-1H-이미다졸-1-일)메타논; 및 (2-클로로페닐)-[2-(1-피페리딜)-4,5-디하이드로이미다졸-1-일]메타논으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 질환 또는 병태가 신경퇴행성 질환, 황반변성, 망막 괴사, 근위축증, 백혈병, 림프종, 신생아 호흡곤란 증후군, 질식, 감돈 탈장, 진성 당뇨병, 결핵, 자궁내막증, 혈관 이상증, 건선, 한냉 손상, 철-부하 합병증, 스테로이드 치료의 합병증, 허혈성 심질환, 심근경색증, 재관류 손상, 뇌혈관 질환 또는 괴저 손상, 욕창, 췌장염, 간염, 경화증, 혈색소뇨증, 패혈증, 화상, 고체온증, 크론병, 셀리악병, 구획 증후군, 괴사성 직장염, 스티븐-존슨 증후군 (SJS), 독성 표피 괴사 (TEN), 낭포성 섬유증, 류마티스 관절염, 골수염, 괴사성 근막염, 신독성, 척수 손상, 사구체신염, 급성 세뇨관 괴사, 신피질 괴사, 퇴행성 관절염, 타이로신혈증, 대사성 유전 질환, 세균, 바이러스, 진균 또는 기생충 감염, 앤더슨병, 선천성 미토콘드리아병, 페닐케톤뇨증, 태반 경색증, 매독, 무균성 괴사, 무혈성 괴사, 알콜 중독, 약물 투여 또는 노출과 관련된 괴사, 화학 독소, 농약, 중금속, 전쟁 유기인산염, 또는 거미 또는 뱀 독, 피부 필러 투여와 관련된 괴사, 이소성 약물 투여와 관련된 괴사, 화학요법 유도 괴사, 방사선 유도된 괴사, 이식 조직의 손상 또는 감소된 질 또는 노화로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  18. 제15항에서, 상기 대상체에게 항-아폽토시스제를 투여함을 추가로 포함하는, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 항-아폽토시스제가 상기 화합물의 투여 전에, 투여와 동시에 또는 투여 후에 투여되는, 방법.
  20. 제18항에 있어서, 상기 항-아폽토시스제가 -[R]-N-[2-헵틸]-메틸프로파르길아민 (R-2HMP), 비타민 E, 비타민 D, 카스파제 억제제 및 친수성 담즙염 우르소데옥시콜산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  21. 제15항에 있어서, 상기 대상체에게 항-노화제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 항-노화제가 항산화제, 피토케미컬 (phytochemical), 호르몬, 메트포르민 및 지방산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  23. 제1항 또는 제2항의 화합물 또는 제9항의 조성물의, 세포 또는 조직 괴사와 관련된 질환 또는 의학적 병태의 치료, 예방, 개선, 이의 증상의 폐지 또는 이의 발병을 감소시키기 위한 약제 제조시의 용도.
  24. CELA3A, CELA1, 또는 카텝신 C 억제제로서, 상기 제제는 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35 및 서열번호 36으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 핵산 영역에 지시된, 안티센스, siRNA, 마이크로RNA, 리보자임 및 DNAzyme로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드인, CELA3A, CELA1, 또는 카텝신 C 억제제.
  25. CELA3A, CELA1, 또는 카텝신 C 억제제로서, 상기 제제는 폴리뉴클레오타이드이고, 폴리뉴클레오타이드 제제는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3에 기재된 바와 같은 핵산 서열의 폴리뉴클레오타이드와 적어도 95 % 동일성을 공유하는, CELA3A, CELA1, 또는 카텝신 C 억제제.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 억제제가 중등도 내지 엄격한 하이브리드화 조건하에 CELA1 또는 CELA3A 서열 또는 이의 조합과 특이적으로 하이브리드화되고 CELA2A 또는 CELA3B 서열에 하이브리드화되지 않는, 억제제.
  27. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 억제제가 엄격한 하이브리드화 조건하에 CELA1 또는 CELA3A 서열 또는 이의 조합과 특이적으로 하이브리드화되고 CELA2A 또는 CELA3B 서열에 하이브리드화되지 않는, 억제제.
  28. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 억제제가 중등도 내지 엄격한 하이브리드화 조건하에 카텝신 C에 특이적으로 하이브리드화되고 카텝신 A, B, D, E, G, H, K, L1, L2, O, S, W 또는 Z에 하이브리드화되지 않는, 억제제.
  29. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 억제제가 폴리뉴클레오타이드이고, 폴리뉴클레오타이드 제제가 서열번호 1에 기재된 바와 같은 핵산 서열의 폴리뉴클레오타이드와 적어도 95 % 동일성을 공유하는, 억제제.
  30. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 억제제가 폴리뉴클레오타이드이고, 폴리뉴클레오타이드 제제가 서열번호 2에 기재된 바와 같은 핵산 서열의 폴리뉴클레오타이드와 적어도 95 % 동일성을 공유하는, 억제제.
  31. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 억제제가 폴리뉴클레오타이드이고, 폴리뉴클레오타이드 제제가 서열번호 3에 기재된 바와 같은 핵산 서열의 폴리뉴클레오타이드와 적어도 95 % 동일성을 공유하는, 억제제.
  32. 제24항 내지 제31항 중 어느 한 항의 억제제를 포함하는, 핵산 작제물.
  33. CELA3A, CELA1, 또는 카텝신 C 억제제로서, 상기 제제는 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22 및 서열번호 23으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하여 이의 기능을 억제 또는 예방하는 항체인, CELA3A, CELA1, 또는 카텝신 C 억제제.
  34. 제24항 내지 제33항 중 어느 한 항의 억제제 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 세포막의 침투를 위해 제형화되는, 약제학적 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 지질 소포체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  37. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 항-아폽토시스제를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
  38. 제37항에 있어서, 상기 항-아폽토시스제가 -[R]-N-[2-헵틸]-메틸프로파르길아민 (R-2HMP), 비타민 E, 비타민 D, 카스파제 억제제 및 친수성 담즙염 우르소데옥시콜산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
  39. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 항-노화제를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
  40. 제39항에 있어서, 상기 항-노화제가 항산화제, 피토케미컬, 호르몬, 메트포르민 및 지방산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
  41. 제24항 내지 제33항 중 어느 한 항의 억제제 또는 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항의 조성물의, 세포 또는 조직 괴사와 관련된 질환 또는 의학적 병태의 치료, 예방, 개선, 이의 증상의 폐지 또는 이의 발병을 감소시키기 위한 약제 제조시의 용도.
  42. 이를 필요로 하는 대상체에서 괴사와 관련된 질환 또는 병태의 치료, 예방, 개선, 이의 증상의 폐지 또는 이의 발병을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 치료학적 유효량의 제24항 내지 제33항 중 어느 한 항의 억제제 또는 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항의 조성물을 상기 대상체에 투여하여, 상기 대상체에서 상기 질환 또는 병태를 치료하는, 방법.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 상기 질환 또는 병태가 신경퇴행성 질환, 황반변성, 망막 괴사, 근위축증, 백혈병, 림프종, 신생아 호흡곤란 증후군, 질식, 감돈 탈장, 진성 당뇨병, 결핵, 자궁내막증, 혈관 이상증, 건선, 한냉 손상, 철-부하 합병증, 스테로이드 치료의 합병증, 허혈성 심질환, 심근경색증, 재관류 손상, 뇌혈관 질환 또는 괴저 손상, 욕창, 췌장염, 간염, 경화증, 혈색소뇨증, 패혈증, 화상, 고체온증, 크론병, 셀리악병, 구획 증후군, 괴사성 직장염, 스티븐-존슨 증후군 (SJS), 독성 표피 괴사 (TEN), 낭포성 섬유증, 류마티스 관절염, 골수염, 괴사성 근막염, 신독성, 척수 손상, 사구체신염, 급성 세뇨관 괴사, 신피질 괴사, 퇴행성 관절염, 타이로신혈증, 대사성 유전 질환, 세균, 바이러스, 진균 또는 기생충 감염, 앤더슨병, 선천성 미토콘드리아병, 페닐케톤뇨증, 태반 경색증, 매독, 무균성 괴사, 무혈성 괴사, 알콜 중독, 약물 투여 또는 노출과 관련된 괴사, 화학 독소, 농약, 중금속, 전쟁 유기인산염, 또는 거미 또는 뱀 독, 피부 필러 투여와 관련된 괴사, 이소성 약물 투여와 관련된 괴사, 화학요법 유도 괴사, 방사선 유도된 괴사, 이식 조직의 손상 또는 감소된 질 또는 노화로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 용도 또는 방법.
  44. 제42항에 있어서, 상기 대상체에게 항-아폽토시스제를 투여함을 추가로 포함하는, 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 항-아폽토시스제가 상기 화합물의 투여 전에, 투여와 동시에 또는 투여 후에 투여되는, 방법.
  46. 제44항에 있어서, 상기 항-아폽토시스제가 -[R]-N-[2-헵틸]-메틸프로파르길아민 (R-2HMP), 비타민 E, 비타민 D, 카스파제 억제제 및 친수성 담즙염 우르소데옥시콜산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  47. 제42항에 있어서, 상기 대상체에게 항-노화제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 항-노화제가 항산화제, 피토케미컬, 호르몬 및 지방산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  49. 화학식 VI의 구조를 특징으로 하는 화합물.
    화학식 VI
    Figure pct00072

    여기서, G1은 임의로 치환된 NH-피롤리딘, 임의로 치환된 NH-피페리딘, 임의로 치환된 NH-피페라진, 임의로 치환된 NH-이미다졸리딘, 임의로 치환된 NH-피라졸리딘, 임의로 치환된 NH-아릴, 임의로 치환된 NH-사이클로알킬, 임의로 치환된 피롤리딘, 임의로 치환된 피페리딘, 임의로 치환된 피페리딘, 임의로 치환된 피페라진, 임의로 치환된 이미다졸리딘, 또는 임의로 치환된 피라졸리딘이고;
    G2는 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 사이클로알킬 또는 임의로 치환된 헤테로사이클이며;
    여기서, G1이 비치환된 피롤리딘인 경우, G2는 알킬, 사이클로펜틸, 알킬사이클로펜틸 또는 푸란이 아니거나;
    G1이 피페리딘인 경우, G2는 알킬이 아니며;
    G1이 피페라진인 경우, G2는 알킬 또는 푸란이 아니다.
  50. 제49항에 있어서, G1이 피롤리딘이고 G2가 에틸 또는 푸란인, 화합물.
  51. 제49항에 있어서, G1이 치환된 피페라진이고 G2가 푸란 또는 페닐인, 방법.
  52. 제49항에 있어서, G1이 피페리딘이고 G2가 사이클로펜틸, 푸란 또는 페닐인, 화합물.
  53. 제49항에 있어서, G1이 임의로 치환된 이미다졸리딘 또는 임의로 치환된 피라졸리딘인, 화합물
  54. 화학식 VII의 구조를 특징으로 하는 화합물.
    화학식 VII
    　
    Figure pct00073

    여기서, G1은 임의로 치환된 NH-피롤리딘, 임의로 치환된 NH-피페리딘, 임의로 치환된 NH-피페라진, 임의로 치환된 NH-이미다졸리딘, 임의로 치환된 NH-피라졸리딘, 임의로 치환된 NH-피리딘, 임의로 치환된 NH-아릴, 임의로 치환된 NH-사이클로알킬, 임의로 치환된 피롤리딘, 임의로 치환된 피페리딘, 임의로 치환된 피페리딘, 임의로 치환된 피페라진, 임의로 치환된 이미다졸리딘, 임의로 치환된 피라졸리딘 또는 임의로 치환된 아릴이고;
    G2는
    Figure pct00074
    또는 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 아릴 또는 임의로 치환된 사이클로알킬이고;
    G4는 임의로 치환된 피롤리딘, 임의로 치환된 피페리딘, 임의로 치환된 피페라진, 임의로 치환된 이미다졸리딘 또는 임의로 치환된 피라졸리딘이며;
    여기서, G1이 피페리딘인 경우, G4는 피롤리딘이 아니거나 G2는 임의로 치환된 아릴이 아니거나;
    G1이 이미다졸리딘인 경우, G2는 임의로 치환된 아릴이 아니거나;
    G1이 임의로 치환된 NH-피리딘인 경우, G2는 임의로 치환된 아릴이 아니거나; G1이 임의로 치환된 NH-아릴인 경우, G2는 임의로 치환된 아릴이 아니거나;
    G1이 임의로 치환된 피리딘인 경우, G2는 임의로 치환된 아릴이 아니다.
  55. 제54항에 있어서, G1이 임의로 치환된 NH-피리딘이고, G2가
    Figure pct00075
    (여기서, G4는 피롤리딘이다)이거나, G2가 할로아릴인, 화합물.
  56. 제54항에 있어서, G1이 치환된 NH-아릴이고, G2가
    Figure pct00076
    (여기서, G4는 피롤리딘이다)인, 화합물.
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