JP2018511305A - 新規の抗−ｔｆｐｉ抗体及びこれを含む組成物 - Google Patents

Abstract

本発明はＴＦＰＩ（Ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）に特異的に結合する抗体、上記抗体をコードする核酸、上記核酸を含むベクター、宿主細胞、上記抗体の製造方法及び上記抗体を有効成分で包含する血友病治療用の医薬組成物に関するものである。本発明によるＴＦＰＩに特異的に結合する抗体はＴＦＰＩを遮断し、血液凝固の外因性経路を活性化させることができるので、抗体発生の血友病患者の治療と血友病−Ａまたは血友病−Ｂ患者の血液凝固疾患の予防に有用に使用されることができる。

Description

本発明はＴＦＰＩ（Ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）に特異的に結合する抗体、上記抗体をコードする核酸、上記核酸を含むベクター、宿主細胞、上記抗体の製造方法及び上記抗体を有効成分に含む血友病治療用の医薬組成物に関するものである。

血友病（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ａ及びＢ）患者の３０％程度が治療に使用されるＦＶＩＩＩ（Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ，因子ＶＩＩＩ）またはＦＩＸ（Ｆａｖｔｏｒ ＩＸ、因子ＩＸ）タンパク質に対する抗体が生成されて治療効果が顕著に劣ることで知られている。これに対する代案として活性化されたＦａｖｔｏｒ ＶＩＩａまたはａＰＣＣ（ｐｌａｍａ ｄｅｒｉｖｅｄ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）を投与している。

血友病患者らは週２回以上、上記組換えタンパク質を静脈注射で投与する治療を受けているが、反復的な投与による不便さが持続的に提起されている。したがって、半減期を増大させて長時間の間、作用可能な（ｌｏｎｇ ａｃｔｉｎｇ）組換えタンパク質に関する研究が活発に行われている。

血友病モデルにおいて最近ＴＦＰＩ（Ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）に対する接近が試みられている。ＴＦＰＩは血液凝固において外因性経路（Ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ ｐａｔｈｗａｙ）に関与して、ＴＦ／ＦＶＩＩａでＦａｃｔｏｒ Ｘの活性化をブロックして血液凝固を遮断する役割をする（図１参照）。したがって、ＴＦＰＩに対する抗体を通じてＴＦＰＩを阻害すると、外因性経路を通じて出血の際、血液凝固を活性化することができる。

ＴＦＰＩは三つのＫＰＩ（Ｋｕｎｉｔｚ−ｔｙｐｅ ｄｏｍａｉｎ，Ｋｕｎｉｔｚ ｄｏｍａｉｎ）で構成されて、ＫＰＩ−２（Ｋｕｎｉｔｚ ｄｏｍａｉｎ２）の場合、ＦＸａと直接バインディングしてＦＸａを阻害する（図２参照）。これはＴＦ／ＦＶＩＩａ／ＦＸａ／ＴＦＰＩの複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）を構成し、結果的にＦＸａの生産を直接阻害する作用機転を有するという意味である。

ＴＦＰＩの抗体はｉ）ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸタンパク質に対する抗体が生成された患者にも使用することができ、ｉｉ）抗体の特性上、非常に長い半減期（〜２週）を有するために投与回数を減らすことができる。

ＴＦＰＩを対象にする血友病治療剤の開発は大部分研究段階であったり、初期の開発段階にある。例えば、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ社のヒト化された単クローン抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｍＡｂ）ｍＡｂ２０２１は抗−ＴＦＰＩ単クローン抗体でヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）（ＩｇＧ４）であり、臨床１床段階に進入した状態である。また、Ｂａｘｔｅｒ社のＡＲＣ１９４９９はＴＦＰＩを標的にするＰＥＧｙｌａｔｅｄ Ａｐｔａｍｅｒに前臨床段階にある。そして、Ｂａｘｔｅｒ＆３Ｂ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＪＢＴ２３２９はＰｅｇｙｌａｔｅｄ抗−人間ＴＦＰＩ ２０ｍｅｒペプチドで前臨床段階にある。

新たな血友病治療剤に対する必要性は持続的に提起されてきて、ＦＶＩＩａのようなｂｙｐａｓｓｉｎｇ ａｇｅｎｔのほかに異なる接近方法で治療剤の開発が切実な状況であり、ＴＦＰＩの経路を遮断する薬剤の接近が好ましい。血液凝固因子を投与される血友病患者の場合、上記の因子に対する抵抗性患者が多数存在るので、新薬が必要だが、抗原−抗体複合体クリアランス（Ａｇ−Ａｂ−ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｌｅａｒａｎｃｅ）のような医学的な問題も考慮しなければならない。

これに、本発明者らは、ＴＦＰＩに特異的に結合する新規抗体を製造しようと鋭意努力した結果、上記抗体を使用する場合、ＴＦＰＩの抗凝固性機転を遮断し、血液凝固の外因性経路を活性化できることを確認して、本発明を完成した。

本発明の目的はＴＦＰＩに特異的に結合する新規抗体、上記抗体をコードする核酸、上記核酸を含むベクター、宿主細胞、この製造方法及び上記抗体を有効成分に含むＴＦＰＩを遮断し、血液凝固の外因性経路を活性化させることができる抗体発生の血友病治療用、または血友病−Ａ及び血友病−Ｂ患者の血液凝固疾患の予防用の医薬組成物を提供することにある。

上記の目的を達成するために、本発明は配列番号１６５で表示されるＴＦＰＩ（Ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）に特異的に結合する抗体を提供する。

本発明はまた、ＴＦＰＩに対する抗体をコードする核酸；上記核酸を含有するベクター；及び上記ベクターが導入されている細胞を提供する。

本発明はまた、抗−ＴＦＰＩ抗体を有効成分に含む血友病治療用の医薬組成物を提供する。

図１は血液凝固の外因性経路（Ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ ｐａｔｈｗａｙ）とＴＦＰＩを図示したものである。 図２はＴＦＰＩの簡略なタンパク質の構造及びＫＰＩドメインの役割を示したものである。 図３は精製された抗−ＴＦＰＩ抗体のうち、Ｔ４１７及びＴ３０８クローン抗体をタンパク質電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）した結果を示したものである。 図４は、抗−ＴＦＰＩ抗体のうち、クローンＴ４１７とヒト化抗体のクローン３０８のアミノ酸配列を示したものである。 図５は、精製された抗−ＴＦＰＩ抗体のうち、クローン３０８の突然変異抗体である３０８−２及び３０２−４クローン抗体のアミノ酸配列を示したものである。 図６は精製された抗−ＴＦＰＩ抗体のうち、クローン３０８の突然変異抗体である３０８−２及び３０２−４クローン抗体のＩｇＧをタンパク質電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）した結果を示したものである。 図７は動物タイプによるＴＦＰＩのＫＰＩ−２（Ｋｕｎｉｔｚ ｄｏｍａｉｎ２）タンパク質をタンパク質電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）した結果を示したものである。 図８は抗−ＴＦＰＩ抗体の親和度（Ａｆｆｉｎｉｔｙ）をグラフで示したものである。 図９はＦＸａの活性測定試験を通じた抗−ＴＦＰＩ抗体のうち、キメラ抗体の効力を評価した結果をグラフで示したものである。 図１０はＦＸａの活性測定試験を通じた抗−ＴＦＰＩ抗体のうち、ヒト化された抗体の効力を評価した結果をグラフで示したものである。 図１１はＦＸａの活性測定試験を通じた抗−ＴＦＰＩ抗体のうち逆突然変異（ｂａｃｋ ｍｕｔａｔｉｏｎ）された抗体の効力を評価した結果をグラフで示したものである。 図１２はＴＦ／ＦＶＩＩａ／ＦＸａ複合体の試験を通じた抗−ＴＦＰＩ抗体のうち、キメラ抗体の効力を評価した結果をグラフで示したものである。 図１３はＴＦ／ＦＶＩＩａ／ＦＸａ複合体の試験を通じた抗−ＴＦＰＩ抗体のうち、ヒト化された抗体の効力を評価した結果をグラフで示したものである。 図１４はＴＦ／ＦＶＩＩａ／ＦＸａ複合体の試験を通じた抗−ＴＦＰＩ抗体のうち、逆突然変異（ｂａｃｋ ｍｕｔａｔｉｏｎ）された抗体の効力を評価した結果をグラフで示したものである。 図１５はトロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎ）生成量の測定試験を通じた抗−ＴＦＰＩ抗体のうち、キメラ及びヒト化された抗体の効力を評価した結果をグラフで示したものである。 図１６はトロンビン生成量の測定試験を通じた抗−ＴＦＰＩ抗体のうち逆突然変異（ｂａｃｋ ｍｕｔａｔｉｏｎ）された抗体の効力を評価した結果をグラフで示したものである。 図１７は抗−ＴＦＰＩ抗体のうち、クローン３０８とヒトＴＦＰＩのＫ２ドメイン間の予測結合構造を示したものである。赤色で表現された分子はヒトＴＦＰＩのＫ２ドメインであり、緑色で表現された分子はクローン３０８抗体を示したものである。 図１８は抗−ＴＦＰＩ抗体のうち、クローン３０８の重鎖可変領域とヒトＴＦＰＩ抗原間の予測結合構造を示したものである。 図１９は、抗−ＴＦＰＩ抗体のうち、クローン３０８の軽鎖可変領域とヒトＴＦＰＩ抗原間の予測結合構造を示したものである。 図２０〜図２８はＦＸａ活性測定試験を通じた親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）による抗−ＴＦＰＩ抗体の効力評価の結果を示したものである。 図２９〜図３３はＴＦ／ＦＶＩＩａ／ＦＸ複合体の試験を通じた親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）による抗−ＴＦＰＩ抗体の効力評価の結果を示したものである。 図３４はトロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎ）生成量の測定試験を通じた親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）による抗−ＴＦＰＩ抗体の効力評価の結果を示したものである。

ＴＦＰＩ（Ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）は血液凝固において外因性経路（Ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ ｐａｔｈｗａｙ）に関与して、ＴＦ／ＦＶＩＩａでＦａｃｔｏｒ Ｘの活性化をブロックして血液凝固を遮断することで報告されたことがあり、血友病治療用の抗体または予防用抗体を製作しようとした。特に、ＴＦＰＩのＫＰＩ−２を遮断する抗体を通じて血液凝固の外因性経路を活性化させることが、本発明の核心である。ターゲットにする抗原部位はＴＦＰＩのＫＰＩ−２ドメインでこの部分はヒト−ウサギ−猿の間でアミノ酸配列が９０％以上一致することで、動物実験のデザインが容易であり、血液凝固の速度を測定する簡単なモデルを導入することができる。

本願で使用されたことのように、用語「組織因子経路抑制剤」または「ＴＦＰＩ（Ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）」は細胞により天然的に発現される、ヒトＴＦＰＩの任意の変異体、イソ型及び種相同体を示す。本発明の好ましい実施態様で、ＴＦＰＩに対する本発明の抗体の結合は血液凝固時間を減少させる。

本発明の実施例では、配列番号３９で表示されるＴＦＰＩ（組織因子経路阻害剤）に特異的に結合する構造特性を有する単離されたヒトモノクローナル抗体である「クローン３０８」、「クローン３０８−２」および「クローン３０８−４」を製作した。各抗体の重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列は、下記の表５および表７に示すとおりであり、以下の表４および表６に示すように、ＴＦＰＩ抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列およびそれに相同な配列を含有することができる。

本発明の他の実施例では、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ−２００バイオセンサー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｉｎｃ ＵＳＡ）を用いて、精製抗体クローンＴ４１７、クローンＴ３０８、クローン３０８、クローン３０８−２またはクローン３０８−４の組換えヒトＴＦＰＩに対する定量親和性を測定した（実施例６）。その結果、表１３及び図８に示すように、製作された全てのクローン抗体の親和性は、互いに幾分異なる。特に、クローン３０８−２およびクローン３０８−４の親和性はクローン３０８のそれよりも非常に高いことが示された。

したがって、一態様では、本発明は、配列番号３９で表されるＴＦＰＩ（組織因子経路阻害剤）に特異的に結合する抗体に関する。

本発明において、抗体は、配列番号５、１１または２３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；配列番号６，１２、２６または２７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；および配列番号７または１３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む。

本発明において、抗体は、配列番号８または１４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；配列番号９または１５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号１０または１６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。

本発明において、抗体は、配列番号１、３、２１または２４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは１００％の相同性を有する配列を含む重鎖可変領域を含むことができ、配列番号２，４または２２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは１００％の相同性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含有することができる。

本発明において、抗体は、配列番号１、３、２１、２４または２５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２、４または２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み得る。抗体は、ヒトモノクローナル抗体であってもよいが、これに限定されるものではない。

本発明の一実施例では配列番号３９で表示されるＴＦＰＩ（Ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）に特異的に結合するように構造的に特性化され、分離された単クローン抗体「クローン１００１」、「クローン１０１５」、「クローン１０２１」、「クローン１０２３」、「クローン１０２４」、「クローン１１０４」、「クローン１１２３」、「クローン１２０２」、「クローン１２０８」、「クローン１２１４」、「クローン１２１６」、「クローン１２２３」、「クローン１２２４」、「クローン１２３２」、「クローン１２３４」、「クローン１２３８」、「クローン１２４３」、「クローン１２４８」、「クローン３００７」、「クローン３０１６」、「クローン３０２４」、「クローン３１１５」、「クローン３１２０」、「クローン３１３１」、「クローン３２０３」、「クローン３２４１」、「クローン４０１１」、「クローン４０１７」、「クローン４０３４」、「クローン４０４１」、「クローン４１４１」、「クローン４１４６」、「クローン４２０６」、「クローン４２０８」、「クローン４２７８」、「クローン４２８７」、「クローン１」、「クローン２」、「クローン３」、「クローン４」、「クローン５」、「クローン６」、「クローン７」、「クローン８」、「クローン９」、「クローン１０」、「クローン１１」、「クローン１２」、「クローン１３」、「クローン１４」、「クローン１５」、「クローン１６」、「クローン１７」、「クローン１８」、「クローン１９」、「クローン２０」、「クローン２１」、「クローン２２」、「クローン２３」、「クローンＡ２４」、「クローンＡ２５」、「クローンＡ５２」、「クローンＡ６３」、「クローンＡ６７」、「クローンＡ７１」及び「クローンＡ７４」を製造した。各抗体の重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲに対するアミノ酸配列は下記表２０及び表２３に記載されたことのようである。下記表１９及び表２２に記載されたことのように、抗−ＴＦＰＩ抗体は重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列またはそれと相同性を有する配列を含むことができる。

本発明の他の実施例では精製された抗体であるクローン１２、クローン１０２３、クローン１２０２及びクローン３２４１の組換えヒトＴＦＰＩ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＴＦＰＩ）に対する定量的な結合力をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ−２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，米国）バイオセンサーを利用して測定した（実施例１３）。その結果、表２４に示したことのように、上記製造されたすべてのクローン抗体で多少の違いはあるが、親和度を示した。

従って、本発明は一観点で、配列番号３９で表示されるＴＦＰＩ（Ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）に特異的に結合する抗体に関するものである。

本発明において、上記抗体は配列番号１４９、１５７、１６３、１７２、１８１，１８２、１８３、１８８、２０１または２０３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；配列番号１５０、１５５，１５９、１６２、１６５、１６６、１６７、１６８、１７３、１８４，１８６、１８７または２０２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１５１、１５６、１７０、１７４、１７５または１８５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含有することを特徴にすることができる。

本発明において、上記抗体は配列番号１５２、１５８、１６０、１６９、１７１、１７６、１７７または１７８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１５３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１５４、１６１、１６４、１７９または１８０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含有することを特徴にすることができる。

本発明において、上記抗体は配列番号９５、９７、９８、９９、１００、１０２、１０４、１０５、１０７、１０９、１１０、１１２、１１３、１１４、１１５、１１８、１１９、１２０，１２１、１２３，１２４、１２５、１６５、１２７、１２８，１２９、１３１、１３２，１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４８、１９５、１９７、１９８、１９９または２００のアミノ酸配列と８０％以上の相同性、好ましく９０％以上の相同性、さらに好ましく１００％の相同を有する配列を含む重鎖可変領域を含有することを特徴にすることができて、上記抗体は配列番号９６、１０１、１０３、１０６、１０８、１１１、１１６、１２２、１３０、１３９、１４０、１４７または１９６のアミノ酸配列と８０％以上の相同性、好ましく９０％以上の相同性、さらに好ましく１００％の相同性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含有することができる。

本発明において、上記抗体は配列番号９５、９７、９８、９９、１００、１０２、１０４、１０５、１０７、１０９、１１０、１１２、１１３、１１４、１１５、１１８、１１９、１２０，１２１、１２３，１２４、１２５、１６５、１２７、１２８，１２９、１３１、１３２，１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４８、１９５、１９７、１９８、１９９または２００の重鎖可変領域及び配列番号９６、１０１、１０３、１０６、１０８、１１１、１１６、１２２、１３０、１３９、１４０、１４７または１９６の軽鎖可変領域を含有することを特徴にすることができて、上記抗体はヒト単クローン抗体であることを特徴にすることがとできるが、これに制限されることではない。

上記抗体は保存的置換を通じて抗体のアミノ酸配列が置換されることができる。ここで「保存的置換」ということは１つ以上のアミノ酸を該当ポリペプチドの生物学的または生化学的機能の損失を引き起こさない類似な生化学的特性を有するアミノ酸に置換することを含むポリペプチドの変形を示す。「保存的アミノ酸置換」はアミノ酸残基を類似な側鎖を有するアミノ酸残基に代替させる置換である。類似な側鎖を有するアミノ酸残基の部類は当業界で規定されている。これらの部類は、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、帯電されていない極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非−極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ−分枝された側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。本発明の抗体が保存的アミノ酸置換を有して依然として活性を保有することができることが予想される。

核酸及びポリペプチドの場合、用語「実質的相同性」は２種の核酸または２種のポリペプチドまたはこれらの指定された配列が最適に整列や比較される場合に適切なヌクレオチドまたはアミノ酸の挿入または欠失を有し、ヌクレオチドまたはアミノ酸の少なくとも約８０％、通常的にはヌクレオチドまたはアミノ酸の少なくとも約８５％、好ましくは約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％または９５％、さらに好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％または９９．５％で同一であることを示す。代案的に、切片が選択的な混成化の条件下にその鎖の相補体と混成化される場合、核酸に対する実質的相同性が存在する。本発明は本願で言及された特定核酸配列及びアミノ酸配列に対して実質的相同性を有する核酸配列及びポリペプチド配列を含む。

本発明による抗体は、例えば、表２、５及び表７に記述された重鎖（Ｖ_Ｈ）ＣＤＲ１、２及び３配列と軽鎖（Ｖ_Ｌ）ＣＤＲ１、２及び３配列は構造的に類似した重鎖（Ｖ_Ｈ）及び軽鎖（Ｖ_Ｌ）配列が混合されて重鎖（Ｖ_Ｈ）／軽鎖（Ｖ_Ｌ）組のＣＤＲ１、２及び３に配置されて形成されることができる

本発明による抗体は、例えば、表５及び表８に記述された重鎖（Ｖ_Ｈ）ＣＤＲ１、２及び３配列と軽鎖（Ｖ_Ｌ）ＣＤＲ１、２及び３配列は構造的に類似した重鎖（Ｖ_Ｈ）及び軽鎖（Ｖ_Ｌ）配列が混合されて重鎖（Ｖ_Ｈ）／軽鎖（Ｖ_Ｌ）組のＣＤＲ１、２及び３に配置されて形成されることができる。

本願で使用されたことのように、用語「抗体」または「抗体組成物」は単一分子組成の抗体分子の製剤を示す。ここで単クローン抗体の組成物は特定のエピトープに対する単一結合特異性及び親和度を示す。従って、用語「ヒト単クローン抗体」はヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列から由来された可変と不変領域を有する、単一の結合特異性を示す抗体を示す。本発明のヒト抗体はヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での無作為または部位特異的突然変異の誘発、または生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）での体細胞突然変異によって導入された突然変異）を含むことができる。

本明細書で使用される「抗体」は、特定抗原と免疫学的に反応する免疫グロブリン分子で、抗原を特異的に認識する受容体の役割をするタンパク質分子を意味し、多クローン抗体（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）及び単クローン抗体（単一クローン抗体、ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）抗体と全体抗体及び抗体単片をすべて含むことができる。また、キメラ性抗体（例えば、ヒト化ミューリン抗体）及び二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）または両特異性分子（例えば、両特異性抗体）、Ｄｉａｂｏｄｙ、Ｔｒｉａｂｏｄｙ及びｔｅｔｒａｂｏｄｙを含むことができる。

全体抗体は２つの全長の軽鎖及び２つの全長の重鎖を有する構造であり、各々の軽鎖は重鎖とジスルフィド結合で連結されている。上記全体抗体はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ及びＩｇＧを含み、ＩｇＧは亜型（ｓｕｂｔｙｐｅ）で、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む。上記抗体単片は抗原結合機能を保有している単片を意味し、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（Ａｂ’）２、ｓｃＦｖ及びＦｖなどを含む。

上記Ｆａｂは軽鎖及び重鎖の可変領域と軽鎖の不変領域及び重鎖の一番目の不変領域（ＣＨ１ドメイン）を有する構造で１つの抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端に一つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）を有するという点でＦａｂと違いがある。Ｆ（Ａｂ’）２抗体はＦａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合を成して生成される。

上記Ｆｖ（ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）は重鎖可変部位及び軽鎖可変部位のみを有している最小の抗体断片を意味する。二重鎖Ｆｖ（ｄｓＦｖ）はジスルフィド結合で、重鎖可変部位と軽鎖可変部位が連結されていて、単鎖（ｓｃＦｖ）は、一般的にペプチドリンカーを通じて重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域が共有結合で連結されている。このような抗体断片は、タンパク質加水分解酵素を利用して得ることができて（例えば、全体抗体をパパインで制限切断すると、Ｆａｂを得ることができて、ペプシンで切断すると、Ｆ（Ａｂ’）２断片を得ることができる）、遺伝子組換え技術（例えば、抗体の重鎖またはこの可変領域をコードするＤＮＡ及び軽鎖またはこの可変領域をコードするＤＮＡを鋳型にして、プライマー組を利用してＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によって増幅させ、ペプチドリンカーをコードするＤＮＡと両末端が各々重鎖またはこの可変領域及び軽鎖またはこの可変領域と連結されるようにするプライマー組を組み合わせて増幅）を通じて製作することができる。

免疫グロブリンは重鎖及び軽鎖を有して各々の重鎖及び軽鎖は不変領域及び可変領域（上記部位はドメインとしても知られている）を含む。軽鎖及び重鎖の可変領域は、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、以下「ＣＤＲ」という。）と呼ばれる３つの多変可能な領域及び４つの構造領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ）を含む。上記ＣＤＲは主に抗原のエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）に結合する役割をする。各々の鎖のＣＤＲは、典型的にＮ−末端から始まり、順次的にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と呼ばれて、また特定のＣＤＲが位置している鎖によって識別される。

本明細書で使用する単クローン抗体（単一クローン抗体、ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）は実質的に同一な抗体集団で修得した単一分子組成の抗体分子を意味して、特定エピトープに対して、単一結合特異性及び親和度を示すことができる。

本明細書で使用する単クローン抗体（単一クローン抗体、ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、ヒト免疫グロブリンから由来する分子として、相補性決定領域、構造領域を含む抗体を構成するすべてのアミノ酸配列の全体がヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列で構成されていることを意味する。ヒト抗体は通常的にヒトの疾病の治療に使用されるのに、ｉ）ヒト免疫体系とより良好に相互作用し、例えば補体−依存性細胞毒性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，ＣＤＣ）または抗体−依存性細胞性細胞毒性（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｘｉｃｉｔｙ，ＡＤＣＣ）によって目的細胞をより効率的に破壊させることができるという点、ｉｉ）ヒト免疫体系が上記抗体を外来のものと認識しないという点、及びｉｉｉ）より少ない量、より少ない頻度の薬物を投与した時にもヒト循環系内の半減期が天然発生抗体と類似であるという点で長所である。

これを考慮して、本発明による抗体はＴＦＰＩに特異的に結合する単クローン抗体でＴＦＰＩに対する優秀な親和度及び特異度を示すことができるだけではなく、ヒト由来であるため、低い免疫原性を示すので、抗体発生血友病（血友病−Ａまたは血友病−Ｂ）のような疾病の治療において適合である。

本明細書で使用する、ＴＦＰＩに特異的に結合する「クローンＴ４１７」、「クローンＴ３０８」、「クローン３０８」、「クローン３０８−２」または「クローン３０８−４」は、ＴＦＰＩに結合したけっか、ＴＦＰＩの生物学的活性を阻害する抗体を意味する。この用語は、用語「抗ＴＦＰＩ抗体」と互換的に使用することができる。ここで、クローンＴ４１７およびクローンＴ３０８は、組換えヒトＴＦＰＩでマウスを免疫感作した後に単離された抗体であり、クローン３０８は、クローンＴ４１７のヒト化によって製作された抗体である。さらに、クローン３０８−２およびクローン３０８−４は、図５に示すように、クローン３０８の重鎖のリシン（Ｋ）をグルタミン（Ｑ）またはグルタミン酸（Ｅ）で変異させることによって製作された抗体である。

抗ＴＦＰＩ抗体の平衡解離定数（ＫＤ）は、例えば以下のようにすることができる。クローン３０８のＫＤは、５．５ｘ１０^−１１Ｍ以下、好ましくは５．２５ｘ１０^−１１Ｍ以下、より好ましくは５．５ｘ１０^−１２Ｍ以下であり得る；クローン３０８−２のＫＤは、３．６３ｘ１０^−１１Ｍ以下、好ましくは３．４６５ｘ１０^−１１Ｍ以下、より好ましくは３．３ｘ１０^−１１Ｍ以下であり得る；クローン３０８−４のＫＤは、２．６４ｘ１０^−１１Ｍ以下、好ましくは２．５２ｘ１０^−１１Ｍ以下、より好ましくは２．４ｘ１０^−１１Ｍ以下であることができる。

本明細書で使用される用語ＴＦＰＩに特異的に結合する抗体、「クローン１００１」、「クローン１０１５」、「クローン１０２１」、「クローン１０２３」、「クローン１０２４」、「クローン１１０４」、「クローン１１２３」、「クローン１２０２」、「クローン１２０８」、「クローン１２１４」、「クローン１２１６」、「クローン１２２３」、「クローン１２２４」、「クローン１２３２」、「クローン１２３４」、「クローン１２３８」、「クローン１２４３」、「クローン１２４８」、「クローン３００７」、「クローン３０１６」、「クローン３０２４」、「クローン３１１５」、「クローン３１２０」、「クローン３１３１」、「クローン３２０３」、「クローン３２４１」、「クローン４０１１」、「クローン４０１７」、「クローン４０３４」、「クローン４０４１」、「クローン４１４１」、「クローン４１４６」、「クローン４２０６」、「クローン４２０８」、「クローン４２７８」、「クローン４２８７」、「クローン１」、「クローン２」、「クローン３」、「クローン４」、「クローン５」、「クローン６」、「クローン７」、「クローン８」、「クローン９」、「クローン１０」、「クローン１１」、「クローン１２」、「クローン１３」、「クローン１４」、「クローン１５」、「クローン１６」、「クローン１７」、「クローン１８」、「クローン１９」、「クローン２０」、「クローン２１」、「クローン２２」、「クローン２３」、「クローンＡ２４」、「クローンＡ２５」、「クローンＡ５２」、「クローンＡ６３」、「クローンＡ６７」、「クローンＡ７１」または「クローンＡ７４」はＴＦＰＩに結合してＴＦＰＩの生物学的活性の抑制をもたらす抗体を意味し、抗−ＴＦＰＩ抗体と混用して使用することができる。

また、本明細書で使用される用語ＴＦＰＩに特異的に結合する抗体、「クローンＴ４１７」、「クローンＴ３０８」、「クローン３０８」、「クローン３０８−２」または「クローン３０８−４」はＴＦＰＩに結合してＴＦＰＩの生物学的活性の抑制をもたらす抗体を意味し、抗−ＴＦＰＩ抗体と混用して使用することができる。ここでクローンＴ４１７とクローンＴ３０８は、マウスに組換えヒトＴＦＰＩを免疫（ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）した後、修得した抗体であり、クローン３０８は、上記のクローンＴ４１７をヒト化（ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ）して製造した抗体である。また、クローン３０８−２とクローン３０８−４は、図５に示したことのように、上記クローン３０８の重鎖のリジン（Ｋ：Ｌｙｓｉｎｅ）をグルタミン（Ｑ：Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）またはグルタミン酸（Ｒ：Ｇｌｕｔａｍａｔｅ）に各々突然変異を導入して製造した抗体である。

上記ＴＦＰＩに対する抗体のＫ_Ｄ（平衡解離常数、ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ）は、例えば：（１）クローン１２の場合、９．００９ｘ１０^−１２Ｍ以下、好ましく８．５９ｘ１０^−１２Ｍ以下、さらに好ましく８．１９ｘ１０^−１２Ｍ以下であることができて、（２）クローン１０２３の場合、３．３１ｘ１０^−１１Ｍ以下、好ましく３．１６ｘ１０^−１１Ｍ以下、さらに好ましく３．０１ｘ１０^−１１Ｍ以下であることができて、（３）クローン１２０２の場合、１０．４２ｘ１０^−１２Ｍ以下、好ましく９．９４ｘ１０^−１２Ｍ以下、さらに好ましく９．４７ｘ１０^−１２Ｍ以下であることができて、（４）クローン３２４１の場合、８．１４ｘ１０^−１１ｍ以下、好ましく７．７７ｘ１０^−１１Ｍ以下、さらに好ましく７．４ｘ１０^−１１Ｍ以下であることができる。

本発明のまた他の実施例ではヒトＴＦＰＩに結合するヒト重鎖可変領域（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）と軽鎖可変領域（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）の遺伝子を把握した後、重鎖可変領域の遺伝子はヒト免疫グロブリンタイプ４の重鎖不変領域（ＩｇＧ４ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ）の遺伝子と連結して、軽鎖可変領域の遺伝子はヒト軽鎖不変領域（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ）と連結した後、これらを各々動物細胞用のタンパク質発現ベクターに挿入してベクターを製作した後、これらをＥｘｐｉ２９３細胞株に形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）して培養して抗体を生産した後、これをプロテインＡ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）で精製して抗体を製造した（実施例１）。

本発明のまた他の実施例ではヒトＴＦＰＩに結合するヒト重鎖可変領域（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）と軽鎖可変領域（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）の遺伝子を把握した後、重鎖可変領域の遺伝子はヒト免疫グロブリンタイプ４の重鎖不変領域（ＩｇＧ４ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ）の遺伝子と連結して、軽鎖可変領域の遺伝子はヒト軽鎖不変領域（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ）と連結した後、これらを各々動物細胞用のタンパク質発現ベクターに挿入してベクターを製作した後、これらをＥｘｐｉ２９３細胞株に形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）して培養して抗体を生産した後、これをプロテインＡ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）で精製して抗体を製造した（実施例２及び実施例３）。

従って、本発明は他の観点から、上記抗体をコードする核酸に関するものである。本明細書で使用される核酸は細胞、細胞溶解物（ｌｙｓａｔｅ）中に存在するか、または部分的に精製された形態または実質的に純粋な形態で存在することもできる。核酸はアルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド化（ｂａｎｄｉｎｇ）、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動及び当業界によく知られたその他のことを含む標準技術により他の細胞成分またはその他の汚染物質、例えば他の細胞の核酸やタンパク質から精製されて出る場合、「単離」されたり「実質的に純粋になる」ことである。本発明の核酸は、例えばＤＮＡまたはＲＮＡであることができて、イントロン配列を含んだり含まないことができる。

本発明はまた他の観点から、上記核酸を含むベクターに関するものである。抗体または、その抗体断片の発現のために、部分的であったり、全長である軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡを標準分子生物学技術（例えば、ＰＣＲ増幅または目的抗体を発現するハイブリドーマを使用したｃＤＮＡクローニング）で修得することができて、ＤＮＡが転写及び翻訳制御配列に「作動されるように結合」なって発現ベクター内へ挿入されることができる。

本明細書で使用される用語「作動されるように結合」はベクター内の転写及び翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写及び翻訳を調節する意図された機能をするように抗体遺伝子がベクター内にライゲーションされることを意味することができる。発現ベクター及び発現制御配列は使用される発現用の宿主細胞と相溶性あるように選択される。抗体の軽鎖遺伝子及び抗体の重鎖遺伝子は別のベクター内に挿入されたり、二つの遺伝子ともに同一の発現ベクター内に挿入される。抗体は標準方法（例えば、抗体遺伝子断片及びベクター上の相補性制限酵素部位のライゲーション、または制限酵素部位が全く存在しない場合、ブラント（ｂｌｕｎｔ）末端ライゲーション）で発現ベクター内に挿入される。場合によって、上記組換え発現ベクターは宿主細胞からの抗体鎖の分泌を容易にするシグナルペプチドをコードすることができる。抗体鎖の遺伝子は、シグナルペプチドがフレームに合わせて抗体鎖の遺伝子のアミノ末端に結合されるようにベクター内にクローニングされることができる。シグナルペプチドは免疫グロブリンのシグナルペプチドまたは異種性シグナルペプチド（つまり、免疫グロブリンのほかのタンパク質由来のシグナルペプチド）であることができる。また、上記組換え発現ベクターは宿主細胞で抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を有する。「調節配列」は抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御するプロモーター、インヘンソ及びその他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化信号）を含むことができる。当業者は形質転換させる宿主細胞の選択、タンパク質の発現レベルなどのような因子により調節配列を他に選択して、発現ベクターのデザインを変えられることを認識することができる。

本発明はまた他の観点から、上記核酸または上記ベクターを含む宿主細胞に関するものである。上記核酸または上記ベクターは宿主細胞に形質注入またはトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）される。「形質注入」または「トランスフェクション」させるため、原核または真核宿主細胞内へ外因性核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を導入するのに通常使用される色んな種類の多様な技術、例えば、電気泳動法、リン酸カルシウム沈澱法、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションまたはリポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）などを使用することができる。本発明による抗体は哺乳類細胞への適用可能性を考慮して、真核細胞、好ましくは哺乳類の宿主細胞で発現されることができる。上記抗体の発現に適合した哺乳類の宿主細胞はチャイニーズハムスター卵巣（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ，ＣＨＯ）細胞（例えば、ＤＨＦＲの先発可能なマーカーと一緒に使用されるｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞またはＳＰ２細胞などを例示することができる。

本発明はまた他の観点から、宿主細胞を培養して抗体を発現させる段階を含む抗体の製造方法に関するものである。上記抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳類の宿主細胞内に導入された場合、抗体は宿主細胞で抗体が発現されるのに十分な期間の間、またはさらに好ましくは宿主細胞が培養される培養培地内に抗体が分泌されるように十分な期間の間、宿主細胞を培養することによって製造されることができる。

場合によって、発現された抗体は宿主細胞から分離して均一するように精製することができる。上記抗体の分離または精製は通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法、例えば、クロマトグラフィーによって遂行されることができる。上記クロマトグラフィーは、例えば、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムを含む親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーまたは疎水性クロマトグラフィーを含むことができる。上記クロマトグラフィー以外に、追加で濾過、超濾過、塩析、透析などを組み合わせることによって、抗体を分離、精製することができる。

本発明のさらに別の実施例では、抗ＴＦＰＩ抗体の効果を評価するために、ＦＸａ活性アッセイを実施した（実施例７）。その結果、図９に示すように、抗ＴＦＰＩ抗体候補のうちキメラ抗体であるクローンＴ３０８およびクローンＴ４１７の両方において、濃度依存的に吸光度が上昇し、抗体濃度依存的にＴＦＰＩ阻害効果が増加することが判明した。１０ｎＭのＴＦＰＩ濃度で効果を比較すると、クローンＴ４１７のＴＦＰＩ阻害活性がクローンＴ３０８のそれより良好であることが分かった。

さらに、図１０に示されるように、クローンＴ４１７を用いたヒト化プロセスによるえられたクローン３０８は、上記アッセイにおいてより良好な効果を有すると判定された。クローン３０８はまた、吸光度の濃度依存的増加を示し、ＴＦＰＩを阻害し得ることを示した。

さらに、図１１に示すように、クローン３０８の効果を高めるためにバック突然変異を行い、クローン３０８−２およびクローン３０８−４を得た。クローン３０８−２およびクローン３０８−４の両方がＴＦＰＩを濃度依存的に阻害することが分かった。また、４０ｎＭおよび１０ｎＭで処理した試料を比較すると、クローン３０８−２およびクローン３０８−４のＴＦＰＩ阻害活性はクローン３０８のそれと比較して増加していることが分かった。４０ｎＭの濃度で、クローン３０８−２およびクローン３０８−４は、陽性対照群（ｍＡｂ２０２１または抗ＴＦＰＩ Ａｂ）と比較してそれぞれ８５％および８２％のＴＦＰＩ阻害活性を示したが、１０ｎＭの濃度では、クローン３０８−２は７２％のＴＦＰＩ阻害活性を示し、クローン３０８−４は、７８％のＴＦＰＩ阻害活性を示し、クローン３０８−２のそれより良好であった。また、クローン抗体は、ＴＦＰＩ阻害活性が７７％であるクローンＴ４１７キメラ抗体と同等のＴＦＰＩ阻害活性を示した。

本発明のさらに別の実施例では、ＴＦ／ＦＶＩＩａ／ＦＸａ複合体アッセイを実施して、抗ＴＦＰＩ抗体の効果を評価した（実施例８）。具体的には、ＴＦＰＩが抗ＴＦＰＩ抗体と共にまたは非ＴＦＰＩ抗体と独立して存在する状態で、ＴＦａ／ＦＶＩＩａ複合体によるＦＸａの産生および阻害の程度をＦＸａ活性に基づいて評価した。

その結果、図１２に示すように、抗ＴＦＰＩ抗体候補の中のキメラ抗体であるクローンＴ３０８およびクローンＴ４１７抗体は、濃度依存的な吸光度の増加を示し、このことは、２つの抗体のＴＦＰＩ阻害効果が濃度依存的であることを示す。特に、クローンＴ４１７のＴＦＰＩ阻害活性は、クローンＴ３０８のＴＦＰＩ阻害活性よりも良好であることが分かった。

さらに、図１３に示すように、クローンＴ３０８よりも優れた効果を有するクローンＴ４１７抗体を用いたヒト化プロセスによってクローン３０８を得た。クローン３０８はまた、濃度依存的な吸光度の増加を示し、ＴＦＰＩを阻害することが示された。

また、図１４に示すように、クローン３０８ヒト化抗体の効果を高めるために、バック突然変異を行った。その結果、クローン３０８−２またはクローン３０８−４のＴＦＰＩ阻害活性はクローン３０８のそれと比較して増加した．２５ｎＭの濃度で、クローン３０８−２は３７．８％のＴＦＰＩ阻害活性を示し、クローン３０８−４は６８．４％のＴＦＰＩ阻害活性を示し、これはクローン３０８−２の活性よりも高かった。

本発明のさらに別の実施例では、ＦＸａ活性アッセイおよびＴＦ／ＦＶＩＩａ／ＦＸａ複合体アッセイによって選択されたクローン３０８−２およびクローン３０８−４のトロンビン生成アッセイを実施した（実施例９）。その結果、図１５に示すようにクローンＴ４１７およびクローン３０８の両方は、陰性対照群（抗体なし）と比較して、トロンビン生成ピークおよびトロンビン生成の増加を示した。２．５ｎＭで処理した試料では、陰性対照群（抗体なし）と比較して、クローンＴ４１７およびクローン３０８はそれぞれ２０８％および１６２％のトロンビンピーク値を示し、トロンビン生成を示すＥＴＰ値はクローンＴ４１７で１３１％であって、クローン３０８では１２２％であった。従って、クローンＴ４１７はクローン３０８抗体よりも優れた効果を有することが判明した。

また、図１６において、クローン３０８−２およびクローン３０８−４は、クローン３０８抗体と比較して、トロンビン生成ピークおよび全トロンビン生成の増加を示した。特に、２．５ｎＭで処理した試料では、クローン３０８−２およびクローン３０８−４の両方とも、陰性対照群（抗体なし）と比較して１８３％および１９１％のトロンビンピーク値の上昇を示し、ＥＴＰ値はクローン３０８−２およびクローン３０８−４の両方において１６５％であり、これはクローン抗体がトロンビンを産生する能力が高いことを示している。

本発明のまた他の実施例では、抗−ＴＦＰＩ抗体の効果を評価するためにＦＸａの活性測定試験を遂行した（実施例５）。その結果、図２０−２８に示したことのように、抗−ＴＦＰＩ候補抗体のうち、親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）による抗体の効力を確認した。上記抗体はすべて抗体処理濃度の依存的に吸光度が高まることを確認して濃度依存的にＴＦＰＩを抑制する効果が上昇することを確認した。

本発明のまた一つの実施例では、抗−ＴＦＰＩ抗体の効果を評価するためにＴＦ／ＦＶＩＩａ／ＦＸａ複合体の試験を遂行した（実施例１５）。すなわち、ＴＦＰＩが抗−ＴＦＰＩ抗体とともに、または独立的にある状況でＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体によりＦＸａが生成されて抑制される程度をＦＸａの活性程度で評価した。その結果、図２９〜図３３及び表１２〜表２１に示したことのように、抗−ＴＦＰＩ抗体であるＭＧ１１１３候補抗体のうち、親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）による抗体の効力を確認した。その結果、抗体処理濃度の依存的に吸光度が高まることを確認して候補抗体はすべて濃度依存的にＴＦＰＩを抑制する効果が上昇することを確認した。

本発明のまた他の実施例では、ＦＸａの活性測定試験、ＴＦ／ＦＶＩＩａ／ＦＸａ複合体の試験を通じて選別された抗−ＴＦＰＩ抗体に対してトロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎ）生成量の測定試験を遂行した（実施例１６）。その結果、図３４に示したことのように、上記ＦＸａの活性測定試験及びＴＦ／ＦＶＩＩａ／ＦＸａ複合体の試験を通じて選別された親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）による抗体候補らのうち、Ｎｏ．１０２３抗体に対してＴ４１７キメラ抗体を利用してトロンビン生成量の測定比較試験を遂行した。試料の希釈液のみ処理したブランク（ｂｌａｎｋ）に比べて、２．５ｎＭの場合Ｔ４１７抗体は約３３５％、Ｎｏ．１０２３抗体の場合は約４０１％高いトロンビンピーク（ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｐｅａｋ）値を示した。また、トロンビンの総生成量を示すＥＴＰの場合にも、陰性対照群（抗体不在）対比２．５ｎＭ処理したサンプルでＴ４１７抗体の場合は約２９３％、Ｎｏ．１０２３抗体の場合は約３０９％に増加される様相を示した。二つの抗体と比較すると、親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）で導出されたＮｏ．１０２３抗体がＴ４１７抗体よりもっと效力がいいことを確認した。

従って、本発明はまた他の観点から、抗体を有効成分に含む血友病治療用の医薬組成物に関するものである。

本発明で治療有効量の抗−ＴＦＰＩ抗体及び製薬上の許容される担体を含む製薬組成物を提供する。「製薬上（薬学的に）許容される担体」は製剤を製剤化したり、または安定化させることを助けるため活性成分に追加されることができる物質であり、患者に有意した有害な毒性効果を惹起しない。

上記担体は患者を刺激せず、投与化合物の生物学的活性及び特性を阻害しない担体または希釈剤をいう。液状溶液で製剤化される組成物において許容される薬学的担体としては、滅菌及び生体に適合するものとして、食塩水、滅菌数、リンゲル液、緩衝食塩水、アルブミンの注射溶液、ブドウ糖溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれらの成分のうち一つの成分以上を混合して使用することができ、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤型、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。他の担体は、例えば、文献［Ｒｅｍｉｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ）］に記載されている。このような組成物は治療有効量の１種以上の抗−ＴＦＰＩ抗体を含有することである。

製薬上許容される担体は滅菌注射可能な溶液剤または分散液剤を直ちに投与用（ｅｘｔｅｍｐｏｒａｎｅｏｕｓ）で製造するための滅菌水溶液または分散液及び滅菌粉末を含む。製薬活性物質のためのこのような媒質及び作用剤の使用は当業界に公知されている。組成物は好ましくは非経口注射用で製剤化される。組成物は溶液剤、マイクロエマルジョン剤、リポソーム剤または高い薬物濃度に適合したその他の注文された構造物として製剤化されることができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）及びこれらの適合した混合物を含有する溶媒または分散媒質であることができる。一部の場合に、組成物中に等張化剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムを含ませることができる。滅菌注射可能な溶液剤は必要な量の活性化合物を必要に応じて上記記載された成分のうち１種またはこれらの組合物と共に、適切な溶媒中に混入させた後に滅菌マイクロ濾過を遂行して製造されることができる。一般的に、分散液剤は活性化合物を基本的な分散性媒質及び上記記載されたものからのその他必要な成分を含有する滅菌ビヒクルで混入させて製造される。滅菌注射可能な溶液剤を製造するための滅菌粉末の場合、一部の製造方法は活性成分及び任意の追加の望む成分の粉末をこれのあらかじめ滅菌−ろ過させた溶液から生成する真空乾燥及び冷凍―乾燥（凍結乾燥）である。

抗−ＴＦＰＩ抗体は凝固における遺伝的及び後天的欠乏、または欠陥を治療するための治療目的で使用されることができる。例えば、上記の抗体はＴＦＰＩとＦＸａの相互作用を遮断したり、ＴＦ／ＦＶＩＩａ活性のＴＦＰＩ−依存的抑制を防止するのに使用されることができる。追加で、上記抗体はまた、ＴＦ／ＦＶＩＩａ−駆動されたＦＸａの生成を復旧させてＦＸａのＦＶＩＩＩ−またはＦＩＸ−依存的増幅の不足を迂回させるのに使用されることもできる。

上記抗体は止血障害、例えば、血小板減少症、血小板障害及び出血障害（例えば、血友病Ａ及び血友病Ｂ）の治療で治療用途を有する。このような障害は治療有効量の抗−ＴＦＰＩ抗体をこのような障害の治療が必要な患者に投与することによって治療されることができる。上記抗体はまた、外傷や出血性卒中のような適応症での制御されない出血の治療で治療用途を有する。したがって、治療有効量の抗−ＴＦＰＩ抗体を出血時間を短縮させる必要がある患者に投与することを含む、出血時間を短縮させる方法を提供する。

上記抗体は止血障害を解決するために、単一療法としてまたは他の療法と組み合わせて使用することができる。例えば、本発明の１種以上の抗体及び血液凝固因子、例えば、ＴＦ（Ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ）、ＦＶＩＩ（Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ）またはＦＸ（Ｆａｃｔｏｒ Ｘ）の共同投与は血友病の治療に有用であると考えられる。上記抗体及び血液凝固因子の同時投与または組合療法は、各々別途に製剤化されたり、一つの組成物中に一緒に製剤化された２種の治療薬物の投与を意味して、別途に製剤化された場合には大略同一な時間に、または相違な時間であるが、同一な治療期間にわたって投与する。

製薬組成物は血友病ＡまたはＢで苦痛を受ける対象体に出血エピソードの重症度によって変わることができたり、予防療法の場合には患者の血液凝固欠乏の重症度によって変わることができる投与量及び頻度で経口または非経口投与されることができる。組成物は、必要に応じてボーラスとして、または連続注入によって患者に投与されることができる。例えば、Ｆａｂの断片で提示される本発明の抗体のボーラス投与は０．００２５ないし１００ｍｇ／ｋｇ体重、０．０２５ないし０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．０１０ないし０．１０ｍｇ／ｋｇまたは０．１０ないし０．５０ｍｇ／ｋｇの量であることができる。連続注入の場合、Ｆａｂ断片で提示される本発明の抗体は０．００１ないし１００ｍｇ／ｋｇ体重／分、０．０１２５ないし１．２５ｍｇ／ｋｇ／分、０．０１０ないし０．７５ｍｇ／ｋｇ／分、０．０１０ないし１．０ｍｇ／ｋｇ／分または０．１０ないし０．５０ｍｇ／ｋｇ／分で１時間ないし２４時間、１時間ないし１２時間、２時間ないし１２時間、６時間ないし１２時間、２時間ないし８時間、または１時間ないし２時間の間に投与されることができる。全長抗体（完全不変領域を有する）で提示される本発明の抗体を投与する場合、投与量は約１ないし１０ｍｇ／ｋｇ体重、２ないし８ｍｇ／ｋｇ、または５ないし６ｍｇ／ｋｇであることができる。このような全長の抗体は典型的に３０分ないし３５分の期間の間、持続される注入を通じて投与する。投与頻度は状態の重症度によって変わる。頻度は１週当たり３回ないし毎週または２週間ごとに１回の範囲であることができる。

追加で、組成物は皮下注射を通じて患者に投与することができる。例えば、１０ないし１００ｍｇ投与量の抗−ＴＦＰＩ抗体が毎週、隔週または毎月皮下注射を通じて患者に投与することができる。

本願で使用されたことのように、「治療有効量」は生体内の血液凝固時間を効果的に増加させたり、または必要な患者に生体内の測定可能な利点を引き起こすことに要求される抗−ＴＦＰＩ抗体、またはこのような抗体及びＴＦ（Ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ）、ＦＶＩＩ（Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ）またはＦＸ（Ｆａｃｔｏｒ Ｘ）の組合物の量を意味する。正確な量は治療組成物の成分及び物理的特徴、意図された患者集団、個々の患者の考慮事項などが含むが、これに制限されない数多い因子によって変わるものであり、当業者が容易に決定することができる。これらの要因を完全に考慮するとき、副作用なく最大の効果を得るのに充分な最少量を投与することが重要であり、この服用量は分野の専門家により容易に決定されることができる。

本発明の薬剤学的組成物の服用量は特別に限定されることではないが、患者の健康状態及び体重、疾患の重症度、薬剤の種類、投与経路及び投与時間を含む様々な要因によって変更する。組成物は一日に一回量または多回容量でネズミ（ｒａｔ）、マウス（ｍｏｕｓｅ）、家畜、ヒトなどを含む哺乳類内に典型的に許容された経路、例えば、経口に、直腸に、静脈に（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓｌｙ）、皮下に（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、子宮内に（ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅｌｙ）または脳血管内に（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒｌｙ）投与されることができる。

以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明しようとする。これらの実施例は但し本発明を例示するためのものとして、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されるものと解釈されないことは当業界で通常の知識を有する者において自明である。

実施例１：抗−ＴＦＰＩ抗体の製造方法
Ｆａｃｔｏｒ Ｘの活性を阻害するＴＦＰＩ（Ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）に対する抗体で、血液凝固の遮断を防げる血友病治療用の抗体、または予防用抗体を製作しようとした。
１−１：抗体の選別
マウス（ｍｏｕｓｅ）に組換えヒトＴＦＰＩを免疫（ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）した後、脾臓（ｓｐｌｅｅｎ）を摘出してＢリンパ球を抽出して、これからトータルＲＮＡ（ｔｏｔａｌ ＲＮＡ）を分離した後ｃＤＮＡを合成した。上記合成したｃＤＮＡからマウスの多様な抗体の遺伝子をＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を用いてクローニングし、これをｐＣｏｍｂ３Ｘ ｐｈａｇｅｍｉｄに挿入し、多様な配列の抗体切片をディスプレイする抗体ライブラリーを製作した。抗体ライブラリーからヒトＴＦＰＩに特異的に結合する抗体を探すためにＴＦＰＩが固定されたマグネチックビーズ（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄ）と抗体ライブラリーを混ぜて標的抗原に結合するクローンを分離して培養した後、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ：Ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）を通じて標的抗原（ヒトＴＦＰＩ）に特異的に結合するクローン（Ｔ４１７またはＴ３０８クローン細胞）を個別的に確認して、塩基配列分析を通じて抗体の遺伝子配列及びこれによるアミノ酸配列を把握した。

その結果、表１に示したことのように、ヒトＴＦＰＩに特異的に結合するクローンＴ４１７とクローンＴ３０８を選別することができて、これらのアミノ酸配列を確認した。

表２は表２２のクローン抗体のＣＤＲアミノ酸配列をＫａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ基準で表記したものである。

１−２：Ｔ４１７及びＴ３０８クローン抗体のＩｇＧ遺伝子のクローニング
上記Ｔ４１７とＴ３０８クローン細胞からＴ４１７とＴ３０８クローン抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子が含有されたｐＣｏｍｂ３Ｘ ｐｈａｇｅｍｉｄを抽出した後、これを鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）でＡｃｃｕＰｏｗｅｒ Ｐｆｕ ＰＣＲ ｐｒｅｍｉｘ（Ｂｉｏｎｅｅｒ）を利用してＮｏｔＩが含まれた順方向プライマー（表３：配列番号１７）とＡｐａＩが含まれた逆方向プライマーで（表３：配列番号１８）ＰＣＲを遂行した。ＰＣＲの条件は９４℃で１０分間の露出後９４℃で１５秒、５６℃で３０秒、７２℃で９０秒間の露出を３０回繰り返した後７２℃で１０分間反応した。上記増幅された遺伝子を１％アガロースゲルで予想した大きさのＤＮＡバンドを確認して、これをゲル摘出キットを利用して各々分離した。以後、分離された遺伝子をＮｏｔＩ、ＡｐａＩの制限酵素で３７℃で１２時間以上反応させた後、制限酵素で反応した遺伝子を再び１％アガロースゲルから分離した。ヒトイムノグロブリンタイプ４の重鎖不変領域（ＩｇＧ４ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ）の遺伝子が入っているｐｃＩＷプラスミドベクターも同様な方法で切断して、アガロースゲル上から分離した。Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ０２０３Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ））を使用して、上記分離されたＴ４１７、Ｔ３０８重鎖可変領域の遺伝子をヒト重鎖不変領域が入っている線形ｐｃＩＷベクターのＫｐｎＩ、ＡｐａＩのサイトに挿入した。上記ライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）反応物をＸＬ１−Ｂｌｕｅバクテリア（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ；Ｃａｔ．Ｎｏ．２００２２８、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）に形質転換させた後、カルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）が含まれたＬＢプレート（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＬＮ００４ＣＡ、ＮａｒａｅＢｉｏｔｅｃｈ）に塗抹して３７℃で１２時間以上培養した後、単一コロニー（ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｌｏｎｉｅｓ）を選んで培養後プラスミドミニキット（Ｃａｔ．Ｎｏ．２７４０５、ＱＩＡＧＥＮ）を利用してプラスミドを分離し、これをＤＮＡシークエンシングを通じて確認した。

上記Ｔ４１７とＴ３０８のクローン細胞からＴ４１７とＴ３０８のクローン抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子が含有されたｐＣｏｍｂ３Ｘ ｐｈａｇｅｍｉｄを抽出した後、これを鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）でＴ４１７とＴ３０８のクローン抗体の可変軽鎖領域をＡｃｃｕＰｏｗｅｒ Ｐｆｕ ＰＣＲ ｐｒｅｍｉｘを利用してＮｏｔＩが含まれた順方向プライマー（表３：配列番号１９）とＫｐｎＩが含まれた逆方向プライマー（表３：配列番号２０）でＰＣＲを遂行した。ＰＣＲ条件は９４℃で１０分間の露出後９４℃で１５秒、５６℃で３０秒、７２℃で９０秒間の露出を３０回繰り返した後７２℃で１０分間反応した。上記増幅された遺伝子を１％アガロースゲルで予想した大きさのＤＮＡバンドを確認して、これをゲル摘出キットを利用し、各々分離した。以後、分離された遺伝子をＮｏｔＩ、ＫｐｎＩ制限酵素で３７℃で１２時間以上反応させた後、制限酵素で反応した遺伝子を再び１％アガロースゲルから分離した。ｐｃＩＷ軽鎖領域のプラスミドベクターも同様な方法で切断して、アガロースゲル上から分離した。Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ０２０３Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ））を使用して、上記分離されたＴ４１７、Ｔ３０８の軽鎖可変領域の遺伝子をヒト軽鎖不変領域が入っている線形ｐｃＩＷベクターのＮｏｔＩ、ＫｐｎＩサイトに挿入した。上記ライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）反応物をＸＬ１−Ｂｌｕｅバクテリア（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ；Ｃａｔ．Ｎｏ．２００２２８、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）に形質転換させた後、カルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）が含まれたＬＢプレート（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＬＮ００４ＣＡ、ＮａｒａｅＢｉｏｔｅｃｈ）に塗抹して、３７℃で１２時間以上培養した後、単一コロニー（ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｌｏｎｉｅｓ）を選んで培養後、プラスミドミニキット（Ｃａｔ．Ｎｏ．２７４０５、ＱＩＡＧＥＮ）を利用してプラスミドを分離してこれをＤＮＡシークエンシングを通じて確認した。

１−３：Ｔ４１７及びＴ３０８のクローン抗体のＩｇＧ生産及び精製
マウス免疫反応で得られた抗−ＴＦＰＩ抗体Ｔ４１７、Ｔ３０８のクローンを生産及び精製するために形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）一日前にＥｘｐｉ２９３Ｆ^TM細胞を２．５ｘ１０^６細胞／ｍｌの濃度で接種した。２４時間培養（３７℃、８％ＣＯ_２、１２５ｒｐｍ）後Ｅｘｐｉ２９３^TM Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ培地（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１４３５１０１、Ｇｉｂｃｏ）を添加して細胞数２．５ｘ１０^６細胞／ｍｌの濃度（生存率（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）≧９５％）で３０ｍｌを準備した。３０μｇのＤＮＡ（ｐｃＩＷ−ａｎｔｉ−ＴＦＰＩ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ：１５μｇ、ｐｃＩＷ−ａｎｔｉ−ＴＦＰＩ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ：１５μｇ）を全体の体積が１．５ｍｌになるようにＯｐｔｉＰｒｏ^TMＳＥＭ培地（Ｃａｔ．Ｎｏ．１２３０９０１９、Ｇｉｂｃｏ）に希釈して常温で５分間反応した。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ^TM２９３試薬（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１４５２４、Ｇｉｂｃｏ）８０μｌを全体の体積が１．５ｍｌになるようにＯｐｔｉＰｒｏ^TMＳＥＭ培地（Ｃａｔ．Ｎｏ．１２３０９０１９、Ｇｉｂｃｏ）１．５ｍｌに混ぜた後、常温で５分反応した。５分間の反応後各々の希釈したＤＮＡとＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ^TM２９３試薬１．５ｍｌをよく混ぜて、常温で２０〜３０分間反応した。ＤＮＡとＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ^TM２９３試薬混合液３ｍｌをＥｘｐｉ２９３Ｆ^TM細胞に処理した。１６〜１８時間懸濁培養後（３７℃、８％ＣＯ_２、１２５ｒｐｍ）ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ^TM２９３ Ｅｎｈａｎｃｅｒ１（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１４５２４、Ｇｉｂｃｏ）１５０μｌとＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ^TM２９３ Ｅｎｈａｎｃｅｒ２（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１４５２４、Ｇｉｂｃｏ）１．５ｍｌを添加して５日間懸濁培養した。培養が終わると４０００ｒｐｍで２０分間、遠心分離して細胞破壊物（Ｃｅｌｌ ｄｅｂｒｉｓ）を除去した後、上澄み液を０．２２μｍフィルターに通過させて準備した。各３０ｍｌの培養液当たりプロテインＡレジン（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｒｅｓｉｎ）であるＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｘｔｒａ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１７−５２６９−０２、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を１００μｌずつ準備して１０００ｒｐｍで２分間、遠心分離して貯蔵溶液を除去して、プロテインＡバインディングバッファー（Ｃａｔ．Ｎｏ．２１００７、Ｐｉｅｒｃｅ）で４００μｌずつ３回洗浄した。上記準備された培養液にプロテインＡレジン（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｒｅｓｉｎ）を入れて室温で３０分間回転反応した。Ｐｉｅｒｃｅ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎ−ｓｎａｐ ｃａｐ（Ｃａｔ．Ｎｏ．６９７２５，Ｔｈｅｒｍｏ）に培養液とレジン（ｒｅｓｉｎ）混合物を入れてＱＩＡｖａｃ ２４ Ｐｌｕｓ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１９４１３，ＱＩＡＧＥＮ）ｖａｃｃｕｍ ｍａｎｉｆｏｌｄを使用してカラムにレジン（ｒｅｓｉｎ）のみを残した。プロテインＡバインディングバッファー５ｍｌを入れてレジン（ｒｅｓｉｎ）を洗浄した後、プロテインＡ溶出バッファー（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）（Ｃａｔ．Ｎｏ．２１００９，Ｐｉｅｒｃｅ）２００μｌを入れて再懸濁（ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）して室温で２分間反応した後、１０００ｒｐｍで１分遠心分離して溶出した。各溶出液（ｅｌｕａｔｅ）には１．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）２．５μｌを入れて中和させた。溶出は４〜６回にわたって進行して、各分画（ｆｒａｃｔｉｏｎ）はＮａｎｏＤｒｏｐ ２００Ｃ（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量した。タンパク質が検出された分画（ｆｒａｃｔｉｏｎ）を集めてＺｅｂａ Ｓｐｉｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎｓ、７Ｋ ＭＷＣＯ、５ｍｌ（Ｃａｔ．Ｎｏ．００８９８９２，Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）のバッファーで緩衝液を交換した後、還元及び非還元条件でタンパク質電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を遂行して最終的に濃度の定量及び抗体の状態を検証して、４℃に保管した。

その結果、図３に示したことのように、良好な状態で精製されたＴ４１７及びＴ３０８のクローン抗体をタンパク質電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上で確認した。

実施例２：安定した骨組みにＣＤＲ−接木（ＣＤＲ−ｇｒａｆｔｉｎｇ）を通じたヒト化抗体の構築方法
上記Ｔ４１７とＴ３０８のクローン抗体に対するＴＦＰＩ抗原（ヒトＴＦＰＩタンパク質完全体（ｆｕｌｌ−ｆｏｒｍ）（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＴＦＰＩ−８７５Ｈ；Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍａｒｔ，米国）の定量的な結合力を評価した結果、クローンＴ４１７が最も優秀な効果を示した（図８；実施例６参照）。したがって、クローンＴ４１７を基盤にヒト化（ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ）を進行して、クローン３０８を製造しようとした。

マウスから由来したクローンＴ４１７抗体をヒト化（ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ）するためにヒト化方法中、最も広く使われる方法であるＣＤＲ−接木（ＣＤＲ−ｇｒａｆｔｉｎｇ）を選択した。まず、構造の予測サイトであるｓｗｉｓｓ−ｍｏｄｅｌ（ｈｔｔｐ：／／ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／）で５０個の見本のうち、ＱＭＥＡＮ、ＧＭＱＥ及び相同性値が総合的に最も高かった見本を通じてクローンＴ４１７の構造を予測し、上記得られた構造及びＫａｂａｔとｃｈｏｔｈｉａ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇを利用して抗原と反応するＣＤＲとＣＤＲ以外の領域である骨組み（骨格）を設定した。その次ｉｇｂｌａｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）を利用して最も高い相同性を有するヒトの骨組みを検索した。検索後、得られたいくつかの重鎖可変領域と軽鎖可変領域の組合のうち、ヒトの生殖細胞の分析で最も高い形成率を示したＶＨ３−２１／ＶＫ２−３０を選択した（ｄｅ Ｗｉｌｄｔ ＲＭ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２８５：８９５−９０１，１９９９；ｍＡｂｓ，５：３，４４５−４７０）。この後、骨組み配列であるが、抗体の安定性に影響を与えず、ヒト抗体配列にも存在するクローンＴ４１７の軽鎖可変領域Ｋ２４、Ｌ３６が含有されたクローンＴ４１７配列を含めて、Ｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇではＣＤＲ配列であるが、構造的に骨組みの配列である重鎖可変領域Ｎ３５を含むクローンＴ４１７のヒト化抗体であるクローン３０８を製作した（Ｍｅｔｈｏｄｓ，３４：１８４−１９９，２００４；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｂａｓｅ２．ｏｒｇ／）（図４及び表４参照）。

その結果、図４に示したことのように、クローンＴ４１７を基盤にヒト化（ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ）を進行して、クローン３０８を製造した。

表５は、表４のクローン抗体のＣＤＲアミノ酸配列をＫａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ基準で表記したものである。

実施例３：インシリコモデリング（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ｍｏｄｅｌｉｎｇ）を通じたクローン３０８の突然変異抗体のデザイン
実施例９のクローン３０８をＴＦＰＩのＫＰＩ−２（Ｋｕｎｉｔｚ ｄｏｍａｉｎ ２）とインシリコモデリングを利用して結合構造を予測し、抗原バインディングを向上させることができる位置を予測した（Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ−５２ａ，−６４及びｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ２７ｄ）（図５及び表６参照）。

ＢｉｏＬｕｍｉｎａｔｅ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，米国）モジュール（ｍｏｄｕｌｅ）であるホモロジーモデリング（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｍｏｄｅｌｉｎｇ）を利用してＴＦＰＩに結合するクローン３０８の抗体の構造を生成した。構造を生成するために与えられたクローン３０８の配列を利用してＰＤＢ ＤＢ（ＰＤＢ Ｄａｔａｂａｓｅ）で鋳型検索（ｔｅｍｐｌａｔｅ ｓｅａｒｃｈ）をした結果、構造が類似してｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｓｃｏｒｅが高い構造である３ＱＯＳ（ＰＤＢ ｎｕｍｂｅｒ）構造を選択した。３ＱＯＳと３０８は抗原特異的な構造を有するＨＶ ＣＤＲ Ｈ３部分を除外した残りの配列が類似したことを確認することができ、構造を生成することに適切な鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）であることを知ることができた。総５つのクローン３０８のモデルを生成し、各構造を３ＱＯＳの構造と比較して、最終的に一つの最も類似した構造を選択した。選択されたモデルはＨＶ ＣＤＲ Ｈ３部分を除外した残りの構造が類似して、タンパク質間の結合構造を予測するプログラムであるＰＩＰＥＲを使用してクローン３０８とＴＦＰＩ構造の相互作用（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）を予測した（図１７：緑色で表現された分子は３０８のクローン抗体を、赤色で表現された分子はＴＦＰＩ抗原を表す）。これを通じてクローン３０８抗体の予測されるパラトープ（ｐａｒａｔｏｐｅ）とこれと結合するヒトＴＦＰＩ抗原の予測されるエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）を確認することができた（表８）。クローン３０８の結合力を高めるため、予測構造を基に、クローン３０８のアミノ酸配列に突然変異を導入した。即ち、Ｋ６４をＱとＥに変えてＴＦＰＩのＲ１７とイオン結合を誘導するようにした。

その結果、表６に示したことのように、総２つのクローン３０８の突然変異体が製作されたことをＤＮＡシークエンシングを通じて確認した。クローン３０８の重鎖可変領域または軽鎖可変領域とヒトＴＦＰＩ抗原間の予測結合構造は図１８及び１９に図示した。
表７は、表６のクローン抗体のＣＤＲアミノ酸配列をＫａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ基準で表記したものである。

表８はクローン３０８抗体の予測パラトープ（ｐａｒａｔｏｐｅ）とこれと結合するヒトＴＦＰＩ抗原の予測エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）を表記したものである。

実施例４：クローン３０８の突然変異抗体の製造方法
４−１：クローン３０８の突然変異抗体のＩｇＧ遺伝子クローニング
合成した３０８−２、３０８−４の遺伝子（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を鋳型で各々の重鎖可変領域をＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ重合酵素（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ０１０Ｂ；Ｔａｋａｒａ）を使用してＫｐｎＩが含まれた順方向プライマー（表９：配列番号２８）とＡｐａＩが含まれた逆方向プライマー（表９：配列番号２９）でＰＣＲを遂行した。ＰＣＲ条件は９８℃で２分間の露出後９８℃で１０秒、５８℃で１０秒、７２℃で３０秒間の露出を３０回繰り返した後７２℃で５分間反応した。上記増幅された遺伝子を１％アガロースゲルで予想した大きさのＤＮＡバンドを確認して、これをゲル摘出キット（Ｃａｔ．Ｎｏ．２８７０４１、ＱＩＡＧＥＮ）を利用し、各々分離した。以後、分離された３種類の遺伝子をＫｐｎＩとＡｐａＩの制限酵素で３７℃で４時間反応させた。制限酵素で反応した遺伝子を再び１％アガロースゲルから分離した。ｐｃＩＷプラスミドベクターも同様な方法で切断して、アガロースゲル上から分離した。Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ０２０３Ｓ、ＮＥＢ）を使用して、上記分離された遺伝子をヒト重鎖不変領域が入っている線形ｐｃＩＷベクターのＫｐｎＩ、ＡｐａＩサイトに挿入した。上記ライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）反応物をＸＬ１−Ｂｌｕｅバクテリア（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ；Ｃａｔ．Ｎｏ．２００２２８、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）に形質転換させた後、カルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）が含まれたＬＢプレート（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＬＮ００４ＣＡ、ＮａｒａｅＢｉｏｔｅｃｈ）に塗抹して３７℃で１２時間以上培養した後、単一コロニー（ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｌｏｎｉｅｓ）を選んで培養後プラスミドミニキット（Ｃａｔ．Ｎｏ．２７４０５、ＱＩＡＧＥＮ）を利用してプラスミドを分離し、これをＤＮＡシークエンシングを通じて確認した。

４−２：クローン３０８の突然変異抗体のＩｇＧの生産及び精製
３０８の突然変異抗体３０８−２、３０８−４のクローンを生産及び精製するために形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）の一日前にＥｘｐｉ２９３Ｆ^TM細胞を２．５ｘ１０^６細胞／ｍｌの濃度で接種した。２４時間培養（３７℃、８％ＣＯ_２、１２５ｒｐｍ）後Ｅｘｐｉ２９３^TM Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ培地（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１４３５１０１、Ｇｉｂｃｏ）を添加して細胞数２．５ｘ１０^６細胞／ｍｌの濃度（生存率（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）≧９５％）で３０ｍｌを準備した。３０μｇのＤＮＡ（ｐｃＩＷ−ａｎｔｉ−ＴＦＰＩ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ：１５μｇ、ｐｃＩＷ−ａｎｔｉ−ＴＦＰＩ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ：１５μｇ）を全体の体積が１．５ｍｌになるようにＯｐｔｉＰｒｏ^TMＳＥＭ培地（Ｃａｔ．Ｎｏ．１２３０９０１９、Ｇｉｂｃｏ）に希釈して常温で５分間反応した。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ^TM２９３試薬（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１４５２４、Ｇｉｂｃｏ）８０μｌを全体の体積が１．５ｍｌになるようにＯｐｔｉＰｒｏ^TMＳＥＭ培地（Ｃａｔ．Ｎｏ．１２３０９０１９、Ｇｉｂｃｏ）１．５ｍｌに混ぜた後、常温で５分反応した。５分間反応後各々希釈したＤＮＡとＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ^TM２９３試薬１．５ｍｌをよく混ぜて、常温で２０〜３０分間反応した。ＤＮＡとＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ^TM２９３試薬の混合液３ｍｌをＥｘｐｉ２９３Ｆ^TM細胞に処理した。１６〜１８時間懸濁培養後（３７℃、８％ＣＯ２、１２５ｒｐｍ）ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ^TM２９３ Ｅｎｈａｎｃｅｒ１（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１４５２４、Ｇｉｂｃｏ）１５０μｌとＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ^TM２９３ Ｅｎｈａｎｃｅｒ２（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１４５２４、Ｇｉｂｃｏ）１．５ｍｌを添加して５日間懸濁培養した。培養が終わると４０００ｒｐｍで２０分間、遠心分離して細胞破壊物（Ｃｅｌｌ ｄｅｂｒｉｓ）を除去した後、上澄み液を０．２２μｍフィルターに通過させて準備した。各３０ｍｌの培養液当たりプロテインＡレジン（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｒｅｓｉｎ）であるＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｘｔｒａ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１７−５２６９−０２、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を１００μｌずつ準備して１０００ｒｐｍで２分間、遠心分離して貯蔵溶液を除去して、プロテインＡバインディングバッファー（Ｃａｔ．Ｎｏ．２１００７、Ｐｉｅｒｃｅ）で４００μｌずつ３回洗浄した。上記準備された培養液にプロテインＡレジン（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｒｅｓｉｎ）を入れて室温で３０分間回転反応した。Ｐｉｅｒｃｅ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎ−ｓｎａｐ ｃａｐ（Ｃａｔ．Ｎｏ．６９７２５，Ｔｈｅｒｍｏ）に培養液とレジン（ｒｅｓｉｎ）の混合物を入れてＱＩＡｖａｃ ２４ Ｐｌｕｓ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１９４１３，ＱＩＡＧＥＮ）ｖａｃｃｕｍ ｍａｎｉｆｏｌｄを使用してカラムにレジン（ｒｅｓｉｎ）のみを残した。プロテインＡバインディングバッファー５ｍｌを入れてレジン（ｒｅｓｉｎ）を洗浄した後、プロテインＡ溶出バッファー（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）（Ｃａｔ．Ｎｏ．２１００９，Ｐｉｅｒｃｅ）２００μｌを入れて再懸濁（ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）して室温で２分間反応した後、１０００ｒｐｍで１分間遠心分離して溶出した。各溶出液（ｅｌｕａｔｅ）には１．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）２．５μｌを入れて中和させた。溶出は４〜６回にわたって進行して、各分画（ｆｒａｃｔｉｏｎ）はＮａｎｏＤｒｏｐ ２００Ｃ（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量した。タンパク質が検出された分画（ｆｒａｃｔｉｏｎ）を集めてＺｅｂａ Ｓｐｉｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎｓ、７Ｋ ＭＷＣＯ、５ｍｌ（Ｃａｔ．Ｎｏ．００８９８９２，Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）のバッファーで緩衝液を交換した後、還元及び非還元条件でタンパク質電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を随行して最終的に濃度の定量及び抗体の状態を検証して、４℃に保管した。

その結果、実施例３の予測を基盤に選定された抗原（ヒトＴＦＰＩの組換えタンパク質）に対する抗体のバインディングを向上させることができる位置に対してクローン３０８のアミノ酸配列中４ヵ所に突然変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）を各々または組み合わせで導入し、総１８個のクローン抗体を製造し、（図５及び表４〜表７：３０８、３０８−２及び３０８−４クローン抗体のアミノ酸配列）、上記抗体は良好な状態で精製されたことをタンパク質電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を通じて確認した（図６）。このうちクローン３０８−２とクローン３０８−４はクローン３０８の重鎖リジン（Ｋ：Ｌｙｓｉｎｅ）がグルタミン（Ｑ：Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）またはグルタミン酸（Ｅ：Ｇｌｕｔａｍａｔｅ）に各々導入された突然変異を有する。

表４及び表６は抗−ＴＦＰＩクローン抗体の重鎖や軽鎖アミノ酸配列を示したものである。

表５及び表７は、表４及び表６のクローン抗体のＣＤＲアミノ酸配列をＫａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ基準で表記したものである。

実施例５：ＴＦＰＩのＫＰＩ−２製造方法
５−１：ヒトＴＦＰＩのＫＰＩ−２（Ｋｕｎｉｔｚ ｄｏｍａｉｎ ２）、ウサギＫＰＩ−２及びマウスＴＦＰＩのＫＰＩ−２遺伝子クローニング
ｐＥＴ２２ｂプラスミドベクターにヒトＴＦＰＩのＫＰＩ−２（Ｋｕｎｉｔｚ ｄｏｍａｉｎ ２）、ウサギＴＦＰＩのＫＰＩ−２、マウスＴＦＰＩのＫＰＩ−２遺伝子（表１０参照）を構築するために制限酵素サイトＮｃｏＩ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ０１９３Ｓ、ＮＥＢ）とＮｏｔＩ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ０１８９Ｓ、ＮＥＢ）を導入して、遺伝子（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ合成）をＮｃｏＩが含まれた順方向プライマー（表１１：配列番号３３から３５）とＮｏｔＩが含まれた逆方向プライマー（表１１：配列番号３６から３８）でＰＣＲを遂行した。上記ＰＣＲ条件は９４℃で２分間の露出後９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒間の露出を３０回繰り返した後７２℃で５分間反応した。増幅された遺伝子を１％アガロースゲルで予想した大きさのＤＮＡバンドを確認した上、これをゲル摘出キット（Ｃａｔ．Ｎｏ．２８７０４，ＱＩＡＧＥＮ）を利用して各々分離した。その次、分離された３種類の遺伝子をＮｃｏＩとＮｏｔＩの制限酵素で３７℃で４時間反応させた。制限酵素で反応した遺伝子を再び１％アガロースゲルから分離した。ｐＥＴ２２ｂプラスミドベクターも同様な方法でＮｃｏＩとＮｏｔＩで切断して、アガロースゲル上から分離した。準備されたｐＥＴ２２ｂ ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩベクターと挿入体（ｉｎｓｅｒｔ）をモル濃度基準に１：３で混ぜ合わせた後Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ０２０２Ｓ；ＮＥＢ）とＬｉｇａｓｅバッファー（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｂ０２０２Ｓ；ＮＥＢ）を添加し、２５℃で３時間反応した。ライゲインション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）反応物５μｌをＤＨ５α（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に添加した後、１０分ほど氷で反応させた。ヒートショック（Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ）のために４２℃に１分間おいて、細胞の回収のため、ＳＯＣ培地を添加し、４０分間３７℃で懸濁培養した。上記５０μｌの形質転換されたＤＨ５αをカルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）のプレートに塗抹して３７℃で１２時間以上培養した。生成されたコロニーのうち６個を選んでカルベニシリンが含まれたＬＢ培地に接種して、３７℃、２２０ｒｐｍで１２時間以上懸濁培養した。プラスミッド（ｐｌａｓｍｉｄ）が含まれた細胞でプラスミドミニキット（ｐｌａｓｍｉｄ ｍｉｎｉ ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２７４０５、ＱＩＡＧＥＮ）を利用してプラスミドを分離し、上記分離されたプラスミドをＤＮＡシークエンシング（ＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を通じて確認した。

下記の表１０は動物タイプによるＴＦＰＩのＫＰＩ−２（Ｋｕｎｉｔｚ ｄｏｍａｉｎ ２）のアミノ酸配列を示したものである。

下記の表１１は実施例５のＴＦＰＩのＫＰＩ−２（Ｋｕｎｉｔｚ ｄｏｍａｉｎ ２）遺伝子のクローニングに使用されたプライマーである。

５−２：ヒトＴＦＰＩのＫＰＩ−２（Ｋｕｎｉｔｚ ｄｏｍａｉｎ ２）、ウサギＴＦＰＩのＫＰＩ−２及びマウスＴＦＰＩのＫＰＩ−２タンパク質の生産及び精製
ＴＦＰＩ遺伝子の配列が確認されたクローンをＢＬ２１（ＤＥ３）バクテリア（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ；Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｃ２５２７１、ＮＥＢ）に形質転換した。ヒトＴＦＰＩのＫＰＩ−２（Ｋｕｎｉｔｚ ｄｏｍａｉｎ ２）、ウサギのＫＰＩ−２、マウスのＫＰＩ−２遺伝子を各々上記バクテリアに添加した後、１０分ほど氷で反応させた。ヒートショック（Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ）で４２℃で１分間おいて、細胞の回収のため、ＳＯＣ培地を添加し、４０分間３７℃で懸濁培養した。５０μｌ形質転換されたバクテリアをカルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）のプレートに塗抹して３７℃で１２時間以上培養した。生成されたコロニーのうち一つをカルベニシリンが含まれたＬＢ培地に接種して、３７℃、２２０ｒｐｍで１２時間以上懸濁培養した。翌日、上記培養されたバクテリアを５００ｍｌＳＢ−グルコース培地に接種して、３７℃、２２０ｒｐｍで２時間懸濁培養した。ＮａｎｏＤｒｏｐを利用してバクテリア培養液のＯＤが０．６になった時にＩＰＴＧを０．１ｍＭの濃度で添加してインダクション（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）した。その後、２５℃、１８０ｒｐｍで１２時間以上懸濁培養した。上記のバクテリアは６０００ｒｐｍで２０分間、遠心分離して回収し、原形質膜の空間（ｐｅｒｉｐｌａｓｍ）領域で発現されたタンパク質を回収するため、冷却解凍を３回繰り返した後、再び遠心分離した。上澄み液を０．２２μｍフィルターを利用して残余物を除去した後、分離精製した。精製過程にはＴａｌｏｎ ｍｅｔａｌ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｒｅｓｉｎ（Ｃａｔ．Ｎｏ．６３５５０１，Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を利用して遂行して、リン酸緩衝液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）でレジン（ｒｅｓｉｎ）を安定化させてフィルターした培養液を４℃で１２時間以上反応させた。洗浄過程は１０ｍＭイミダゾール（ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）で、溶離過程は２５０ｎＭイミダゾールで実施した。精製されたタンパク質はＮｕＰＡＧＥ４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルで電気泳動した後、クーマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ）染色を通じて分離されたタンパク質を確認した。溶離されたタンパク質はｖｉｖａｓｐｉｎ（Ｃａｔ．Ｎｏ．２８−９３２２−１８，ＧＥ）カラムを通じてＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）バッファーで緩衝液を交替した。

その結果、図７に示したことのように、良好な状態で精製された動物タイプによるＴＦＰＩのＫＰＩ−２（Ｋｕｎｉｔｚ ｄｏｍａｉｎ ２）タンパク質をタンパク質電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上で確認した。

実施例６：ＴＦＰＩ抗原に対する抗−ＴＦＰＩ抗体の定量的な結合力の測定
精製された抗−ＴＦＰＩ抗体であるクローンＴ４１７、クローンＴ３０８、クローン３０８、クローン３０８−２またはクローン３０８−４の組換えヒトＴＦＰＩ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＴＦＰＩ）に対する定量的な結合力（親和度）（Ａｆｆｉｎｉｔｙ））をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ−２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国）バイオセンサーを利用して測定した。ＨＥＫ２９３細胞から精製されたＴＦＰＩ（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＴＦＰＩ−８７５Ｈ、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍａｒｔ、米国）をアミン−カルボキシル反応を利用してＣＭ５チップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国）に２００Ｒｍａｘになるように固定させた後、ＨＢＳ−ＥＰの緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｎＭ ＮａＣｌ，３ｍＭ ＥＤＴＡ，、０．００５％ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０）に順次的に希釈したクローンＴ４１７、クローンＴ３０８、クローン３０８、クローン３０８−２またはクローン３０８−４の抗体を０．０７８ｎＭ〜１０ｎＭの濃度範囲で結合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）１２０秒、解離（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）６００秒間、流速３０μｌ／分で流した（表１２）。１０ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ ｐＨ１．５を３０秒間の間、流速３０μｌ／分で流したことによって、ＴＦＰＩに結合された抗体の解離を誘導した。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ−２００ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅを利用して親和度を運動速度常数（Ｋ_ｏｎ及びＫ_ｏｆｆ）と平衡解離常数（Ｋ_Ｄ）で修得した。

その結果、表１３及び図８に示したことのように、上記製造されたクローン３０８−２とクローン３０８−４の結合力（親和度）はクローン３０８に比べて非常に優れていることが示された。

実施例７：ＦＸａの活性測定
血液凝固は内因性経路（Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｐａｔｈｗａｙ）と外因性経路（Ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ ｐａｔｈｗａｙ）に誘導され、二つの経路は共通的にＦＸ（Ｆａｃｔｏｒ ｘ）を活性化させる共通経路（ｃｏｍｍｏｎ ｐａｔｈｗａｙ）を通じてトロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎ）を活性化させて最終的にフィブリン（ｆｉｂｒｉｎ）を形成して血液凝固を誘導する。また、ＴＦＰＩはＫｕｎｉｔｚ １（Ｋ１，ＫＰＩ−１）、Ｋｕｎｉｔｚ ２（Ｋ２、ＫＰＩ−２）及びＫｕｎｉｔｚ ３（Ｋ３、ＫＰＩ−３）のドメインと呼ばれる３つのドメインで構成されている。Ｋ１ドメインはＦＶＩＩａと結合し、Ｋ２ドメインはＦＸａと結合することで知られている。上記のようなＴＦＰＩと血液凝固因子の結合を通じて血液凝固を抑制することで知られている。したがって、抗−ＴＦＰＩ候補抗体の血液凝固過程の全般に及ぼす影響を確認するため、ＦＸａの活性程度を評価した。色々な因子（ｆａｃｔｏｒ）の影響を最小化するため、ＦＸａ、ＴＦＰＩと候補抗体のみで試験係を構成して、抗−ＴＦＰＩ候補抗体がＴＦＰＩと結合すると、ＦＸａの機能を抑制することができないことにより、ＦＸａの活性が現れる。一方、候補抗体がＴＦＰＩと効果的に結合しないと、ＴＦＰＩがＦＸａと結合して機能を阻害することで発色程度が減少することになる。そのために、ＴＦＰＩによって活性を阻害されないＦＸａの残存活性を基質分解程度で測定することになる。この時、使用される基質はＦＸａの特異的基質であるＳ−２７６５であり、基質は分解されて４０５ｎｍで測定可能な発色（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｉｃ）ｐＮＡを発生させる。上記測定方法はアミド分解アッセイ（ａｍｉｄｏｌｙｔｉｃ ａｓｓａｙ）を基盤とする。

各ＦＸａ、ＴＦＰＩ、ｍＡｂ２０２１及びＳ−２７６５溶液を、下記の表１４を参考にしてアッセイバッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｎＭ ＮａＣｌ，１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．０２％ＮａＮ_３、５ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）に希釈した溶液を１．５ｍｌのチューブに準備した。

陽性対照群（ｍＡｂ２０２１、ａｎｔｉ−ＴＦＰＩ Ａｂ、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）または抗−ＴＦＰＩ候補抗体を４０、１０、２．５または０．６２５ｎＭになるように各ウェル（ｗｅｌｌ）に５０μｌずつ入れる。４０ｎＭのＴＦＰＩ溶液を５０μｌずつ各ウェルに入れて３０分間、常温で保持する。標準曲線を得るためにＦＸａの溶液を濃度別に各ウェルに５０μｌずつ入れて、２ｎＭのＦＸａ溶液を各ウェルに５０μｌずつ入れた後、３７℃で１０分間反応させる。２ｍＭのＳ−２７６５溶液を５０μｌずつ各ウェルに入れて、３７℃で３０分間反応させた後、マイクロプレート測定器（ｍｉｃｒｏｏｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）を利用して４０５ｎｍ波長でエンドポイントモード（ｅｎｄｐｏｉｎｔ ｍｏｄｅ）で結果分析を遂行した。

その結果、図９に示したことのように、抗−ＴＦＰＩ候補抗体のうち、キメラ抗体であるクローンＴ３０８とクローンＴ４１７抗体でともに抗体処理濃度の依存的に吸光度が高まることを確認することによって、二つの抗体ともに抗体濃度に依存的にＴＦＰＩを抑制する効果が上昇することを確認した。クローンＴ３０８の場合、陽性対照群（ｍＡｂ２０２１、ａｎｔｉ−ＴＦＰＩ Ａｂ）であるＴＦＰＩが処理されなかったサンプル対比４０ｎＭ処理したサンプルではＴＦＰＩを９１％抑制する効果を示し、１０ｎＭ処理したサンプルは約６４％抑制する効果を示した。クローンＴ４１７の場合、陽性対照群（ｍＡｂ２０２１、ａｎｔｉ−ＴＦＰＩ Ａｂ）のサンプル対比４０ｎＭ処理したサンプルでＴＦＰＩを８９％抑制する効果を示し、１０ｎＭ処理したサンプルではＴＦＰＩを７２％抑制する効果を示した。処理したＴＦＰＩの量が１０ｎＭであることを勘案して効果を比較した時、クローンＴ３０８よりクローンＴ４１７のＴＦＰＩ抑制力が優秀であることを確認することができた。

また、図１０に示したことのように、上記試験を通じて效果がさらに優れたクローンＴ４１７を利用して、ヒト化過程を通じてクローン３０８を獲得した。上記クローン３０８も濃度依存的に吸光度が上昇する結果を示し、ＴＦＰＩを抑制することができた。クローン３０８の場合、陽性対照群（ｍＡｂ２０２１、ａｎｔｉ−ＴＦＰＩ Ａｂ）対比４０ｎＭ処理したサンプルで約８５．１％、１０ｎＭ処理したサンプルで約５８．２％のＴＦＰＩ抑制力を示して、同一な１０ｎＭ処理したサンプルで７８．４％の抑制力を示したクローンＴ４１７対比その効果が劣ることを知ることができた。

また、図１１に示したことのように、クローン３０８の効力を高めるために逆突然変異（ｂａｃｋ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を随行し、クローン３０８−２とクローン３０８−４を獲得した。クローン３０８−２及びクローン３０８−４でともに濃度依存的にＴＦＰＩを抑制することを知ることができた。そして４０ｎＭ及び１０ｎＭ処理したサンプルを比較すると、クローン３０８対比クローン３０８−２及びクローン３０８−４のＴＦＰＩ抑制力が増加したことを知ることができた。４０ｎＭ処理区間でクローン３０８−２とクローン３０８−４共に陽性対照群（ｍＡｂ２０２１、ａｎｔｉ−ＴＦＰＩ Ａｂ）対比８５％、８２％のＴＦＰＩ抑制力を示したが、１０ｎＭ処理区間ではクローン３０８−２が７２％、クローン３０８−４が７８％で、クローン３０８−４がさらに優秀なＴＦＰＩ抑制効果を示した。また、７７％のＴＦＰＩ抑制力を示すクローンＴ４１７キメラ抗体と比較したときにも同等な水準であることを確認した。

実施例８：ＴＦ／ＦＶＩＩａ／ＦＸａ複合体の測定
血液凝固の外因性機転で最も重要な因子としてはＴＦ（Ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ）、ＦＶＩＩ（Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ）、ＦＸ（Ｆａｃｔｏｒ Ｘ）などを言及することができる。外部信号によりＴＦとＦＶＩＩａが複合体をなすと、ＦＸをＦＸａに活性化させるようになる。その後、ＦＸａがプロトロンビン（Ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ）をトロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎ）に活性化させ、これはフィブリノゲン（ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ）をフィブリン（ｆｉｂｒｉｎ）に変形させて血液凝固に作用する。しかしながら、ＴＦＰＩ（Ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）はＦＸａにバインディングして機能を抑制することで、血液凝固作用を妨害する役割をする。上記の経路過程での抗−ＴＦＰＩ抗体の効果を評価するためにＴＦ／ＦＶＩＩａ／ＦＸａ複合体の試験を遂行した。ＴＦＰＩが抗−ＴＦＰＩ抗体とともに、または独立的にある状況でＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体によってＦＸａが生成されて抑制される程度をＦＸａで分解される基質（Ｓ２７６５）の発色程度を通じ、抗−ＴＦＰＩ抗体の効果を確認した。即ち、抗−ＴＦＰＩ抗体がＴＦＰＩを抑制する効果が大きいほど、ＦＸａの生成が多くなって基質分解量が増えて吸光度が増加することになる。

１．５ｍｌのチューブにアッセイバッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｎＭ ＮａＣｌ，１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．０２％ＮａＮ３、５ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）を利用してＴＦ（４５００Ｌ／Ｂ、Ｓｅｋｉｓｕｉ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、ＦＶＩＩａ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ、Ｎｏｖｏ Ｓｅｖｅｎ）及びＦＸ（ＰＰ００８Ａ，Ｈｙｐｈｅｎ ｂｉｏｍｅｄ）を、表１５と同様な濃度になるように混合溶液を準備した。

混合溶液を９６ウェルプレート（ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）にウェル当たり７０μｌずつ分注した。ブランクウェル（ｂｌａｎｋ ｗｅｌｌ）にはアッセイバッファー７０μｌを分注した。３７℃で１５分間反応させた後、ＴＦＰＩを各ウェルに５０ｎＭになるように３０μｌずつ分注した。ただし、ブランクウェルと陽性対照群のウェル（抗−ＴＦＰＩ抗体及びＴＦＰＩの未処理サンプル）にはアッセイバッファーを３０μｌずつ分注した。抗−ＴＦＰＩ抗体を１２，５、２５、５０及び１００ｎＭになるように各ウェルに３０μｌずつ分注した。ブランクウェル、陽性対照群のウェル（抗−ＴＦＰＩ抗体及びＴＦＰＩの未処理サンプル）、陰性対照群のウェル（抗−ＴＦＰＩ抗体の未処理サンプル）にはアッセイバッファーを３０μｌずつ分注した後、３７℃で１５分間反応させた。すべてのウェルにＥＤＴＡ（Ｅ７８８９，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を５０ｍＭになるように２０μｌずつ分注した。その次、すべてのウェルにＳ２７６５（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ、Ｓ−２７６５）を２００μＭになるように５０μｌずつ入れて、マイクロプレート測定器（ｍｉｃｒｏｏｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）を利用して３７℃で１０分間の間反応させた後、４０５ｎｍで吸光度を測定した。

その結果、図１２に示したことのように、抗−ＴＦＰＩ候補抗体のうち、キメラ抗体であるクローンＴ３０８とクローンＴ４１７の効力を確認した。二つの抗体から、抗体処理濃度の依存的に吸光度が高まることを確認して二つの抗体共に濃度依存的にＴＦＰＩを抑制する効果が上昇することを確認した。クローンＴ３０８の場合、陽性対照群（抗−ＴＦＰＩ抗体及びＴＦＰＩの未処理サンプル）対比１００ｎＭ処理したサンプルではＴＦＰＩを１００％抑制する効果を示し、５０ｎＭ処理したサンプルは約８７％抑制する効果を示した。クローンＴ４１７の場合、陽性対照群（抗−ＴＦＰＩ抗体及びＴＦＰＩの未処理サンプル）対比１００ｎＭ及び５０ｎＭ処理したサンプルでＴＦＰＩを１００％抑制する効果を示した。したがって、クローンＴ３０８よりクローンＴ４１７のＴＦＰＩ抑制力が優れたことを知ることができた。

また、図１３に示したことのように、クローンＴ３０８より効果がさらに優れたクローンＴ４１７抗体を利用して、ヒト化過程を通じてクローン３０８を獲得した。クローン３０８も濃度依存的に吸光度が上昇する結果を示し、ＴＦＰＩを抑制することを知ることができた。クローン３０８の場合、陽性対照群（抗−ＴＦＰＩ抗体及びＴＦＰＩの未処理サンプル）対比１００ｎＭ処理したサンプルで約９４．３％、５０ｎＭ処理したサンプルで約５４．２％のＴＦＰＩ抑制力を示して１００％の抑制力を示すクローンＴ４１７対比その効果が劣ることを知ることができた。

また、図１４に示したことのように、クローン３０８のヒト化抗体の効力を高めるために逆突然変異（ｂａｃｋ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を遂行し、クローン３０８−２とクローン３０８−４を獲得した。クローン３０８−２及びクローン３０８−４でともに濃度依存的にＴＦＰＩを抑制することを知ることができた。また、５０ｎＭ処理したサンプルを比較すると、クローン３０８対比クローン３０８−２とクローン３０８−４のＴＦＰＩ抑制力が増加することを知ることができた。１００ｎＭと５０ｎＭの処理区間でクローン３０８−２とクローン３０８−４で共に陽性対照群（抗−ＴＦＰＩ抗体及びＴＦＰＩの未処理サンプル）対比１００％のＴＦＰＩ抑制力を示して、２５ｎＭの処理区間ではクローン３０８−２が３７．８％、クローン３０８−４が６８．４％でクローン３０８−４がさらに優れたＴＦＰＩ抑制効果を示した。しかしながら、上記逆突然変異された抗体はクローンＴ４１７キメラ抗体と比較の時にはＴＦＰＩ抑制力が劣ることを知ることができた。

実施例９：トロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎ）生成量の測定
血液凝固機転は内因性経路（Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｐａｔｈｗａｙ）と外因性経路（Ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ ｐａｔｈｗａｙ）に分けられる。ＴＦ（Ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ）による外因性経路の最も重要な役割は、血液凝固機転で活性フィードバックの役割で非常に重要なトロンビンの爆発的な生成であり、非常に早く生成されることで知られている。この機転で最も重要な因子としてはＴＦ、ＦＶＩＩ、ＦＸなどを言及することができる。外部信号によりＴＦとＦＶＩＩａが複合体をなすと、ＦＸをＦＸａで活性化させるようになる。その次、ＦＸａがプロトロンビン（Ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ）をトロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎ）に活性化させ、これはフィブリノゲン（ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ）をフィブリン（ｆｉｂｒｉｎ）に変形させて血液凝固に作用する。しかしながら、ＴＦＰＩはＦＸａにバインディングしてＦＸａの機能を抑制することで、血液凝固作用を妨害する役割をする。トロンビン生成量の測定試験は血漿に評価しようとする試料を処理した後、活性剤（ＰＰＰ試薬、ＰＰＰ−Ｒｅａｇｅｎｔ Ｌｏｗ ｒｅａｇｅｎｔ）が存在する状況で、生成されるトロンビンが蛍光基質（ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を蛍光物質に変換させることで、これを基盤に蛍光物質の量で生成されるトロンビンの量を検証するが、キャリブレータ（Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ）という既知のトロンビンの量で補正することにより、実際生成される量を測定する方式である。

予熱された９６ウェルプレート（ｒｏｕｎｄ ｂｏｔｔｏｍ ｉｍｍｕｌｏｎ ２ＨＢ ９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）にサンプルローディングのウェルにはＰＰＰ試薬２０μｌ、キャリブレータ（Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ）のウェルにはキャリブレータ溶液２０μｌを入れて、抗−ＴＦＰＩ候補抗体を予め溶解された試料希釈液（ＦＶＩＩＩ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｐｌａｓｍａ）で０．３１２５、０．６２５、１．２５または２．５ｎＭの濃度で希釈して準備した後、ＴＦＰＩと抗−ＴＦＰＩ候補抗体が結合することができるように常温で１０分間に処理した。

キャリブレータ（Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ）とブランクのウェルには試料の希釈液（ＦＶＩＩＩ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｐｌａｓｍａ）を、残りのウェルには希釈された検液を８０μｌずつそれぞれ入れる。Ｓｏｆｔｗａｒｅ画面の下段部のスタートボタンを押すと、洗浄が先に実行される。ウォーターバス（Ｗａｔｅｒ ｂａｔｈ）で３７℃に加温させておいた蒸留水に注入チューブ（ｉｎｌｅｔ ｔｕｂｅ）を入れて、排出チューブ（ｏｕｔｌｅｔ ｔｕｂｅ）は空いた容器に入れて洗浄を行う。洗浄が終わると、次のボタン（ｎｅｘｔ ｂｕｔｔｏｎ）を押してエンプティ（ｅｍｐｔｙ）の過程を経る。３７℃で加温させておいたＦｌｕＣａ溶液に注入チューブを入れてプライム（ｐｒｉｍｅ）して溶液を満たす。排出チューブをディスペンサー（ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ）にあるＭホールに装着し、次のボタンを押下すると、各ウェルごとにＦｌｕＣａ溶液が自動に２０μｌずつ分注された後シェーキングの過程を経て分析が始まる。

その結果、図１５に示したことのように、先のＦＸａの活性測定試験及びＴＦ／ＦＶＩＩａ／ＦＸａ複合体の試験を通じて選別されたクローンＴ４１７キメラ抗体とクローン３０８ヒト化抗体を利用してトロンビン生成量の測定試験を遂行した。試料希釈液のみ処理したブランクに比べて２．５ｎＭの場合、クローンＴ４１７は２０８％、クローン３０８の場合、１６２％高いトロンビンピーク（ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｐｅａｋ）値を示した。また、トロンビンの総生成量を表すＥＴＰの場合にも、陰性対照群（抗体不在）対比２．５ｎＭ処理したサンプルで、クローンＴ４１７の場合１３１％、クローン３０８の場合１２２％に増加する様相を示した。二つの抗体を比較すると、クローンＴ４１７がクローン３０８抗体よりさらに效力がいいことを確認した。

また、図１６に示したことのように、クローン３０８ヒト化抗体の効力を高めるために逆突然変異（ｂａｃｋ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を随行した後、ＦＸａの活性測定試験ＴＦ／ＦＶＩＩａ／ＦＸａ複合体の試験を通じて選別されたクローン３０８−２とクローン３０８−４に対してトロンビン生成量の測定試験を遂行した。クローン３０８−２及びクローン３０８−４で共に濃度依存的にトロンビン生成量を増加させることを確認した。２．５ｎＭ処理したサンプルを比較すると、クローン３０８抗体対比トロンビンの生成ピーク及び総生成量がすべて増加したことを知ることができた。２．５ｎＭ処理したサンプルでクローン３０８−２とクローン３０８−４で、すべて陰性対照群（抗体不在）対比ピーク値が各々１８３％、１９１％増加することを示して、ＥＴＰ値はクローン３０８−２、クローン３０８−４で共に１６５％で、トロンビンの生成能力が向上されることを知ることができた。また、二つ抗体共にクローン３０８抗体より優れて、クローンＴ４１７キメラ抗体と同等な水準のトロンビンの生成能力を示した。

実施例１０：抗−ＴＦＰＩ抗体である３０８−４クローンとＫｕｎｉｔｚ ｄｏｍａｉｎ−２との結合構造の予測
Ｆａｃｔｏｒ Ｘの活性を阻害するＴＦＰＩ（Ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）に対する抗体で、血液凝固の遮断を防ぐことができる血友病治療用の抗体または予防用抗体を製作しようとした。

血液凝固は内因性経路（Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｐａｔｈｗａｙ）と外因性経路（Ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ ｐａｔｈｗａｙ）により誘導され、二つの経路は共通的にＦａｃｔｏｒ Ｘを活性化させる共通経路（ｃｏｍｍｏｎ ｐａｔｈｗａｙ）を通じてトロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎ）を活性化させて最終的にフィブリン（ｆｉｂｒｉｎ）を形成して血液凝固を誘導する。また、ＴＦＰＩはＫｕｎｉｔｚ １（Ｋ１）、Ｋｕｎｉｔｚ ２（Ｋ２）及びＫｕｎｉｔｚ ３（Ｋ３）のドメイン（ｄｏｍａｉｎ）で構成されている。Ｋ１ドメインはＦＶＩＩａと結合し、Ｋ２ドメインはＦＸａと結合することで知られている。

大韓民国出願特許１０−２０１５−００２６５５５に記載されている「新規の抗−ＴＦＰＩ抗体及びこれを含む組成物」で抗−ＴＦＰＩ抗体である３０８−４クローンを製造したことがあり、上記３０８−４クローンの場合、Ｋ_Ｄは２．６４ｘ１０^−１１Ｍ以下、好ましくは２．５２ｘ１０^−１１Ｍ以下、さらに好ましくは２．４ｘ１０^−１１Ｍ以下であることを知ることができた。

本発明では上記３０８−４クローンの親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）を通じてＴＦＰＩにより高い親和度（親和力）を有する抗体を製造しようとした。

まず、抗−ＴＦＰＩ抗体である３０８−４クローンとＫｕｎｉｔｚ ｄｏｍａｉｎ−２との間に結合構造を予測するために３０８−４クローンのアミノ酸配列を利用してＩｇｂｌａｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）で相同性検索をした結果、３ＱＯＳ（ＰＤＢ ｎｕｍｂｅｒ）構造が類似であることを確認した。３ＱＯＳを基盤にｂｉｏｌｕｍｉｎａｔｅ ｍｏｄｕｌｅ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，ドイツ）のうちホモロジーモデリング（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｍｏｄｅｌｉｎｇ）を利用して３０８−４クローンの構造をデザインした。デザインされた構造をタンパク質−タンパク質間の結合予測プログラムであるＰＩＰＥＲを使用してＫｕｎｉｔｚ ｄｏｍａｉｎ−２とドッキングシミュレーション（ｄｏｃｋｉｎｇ ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ）をして、結合構造の予測データを確保した。確保された結合構造でパラトープ（ｐａｒａｔｏｐｅ）を選別し出すために、３０８−４クローンとＫｕｎｉｔｚ ｄｏｍａｉｎ−２のアミノ酸残基間の相互作用の特性を分析して非共有結合を生成する３０８−４クローンのアミノ酸を選別した（表１６）。選別されたパラトープをｂｉｏｌｕｍｉｎａｔｅ ｍｏｄｕｌｅ中、親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）を利用してパラトープ各々の結合エネルギー値を計算し、他のアミノ酸で置換の時、変化される結合エネルギー値を予測した。これに安定した結合エネルギー値を有するアミノ酸を選定してプライマーデザインに反映した（表１７）。

表１６は抗−ＴＦＰＩ抗体である３０８−４クローンとＫｕｎｉｔｚ ｄｏｍａｉｎ−２のアミノ酸残基間の相互作用の特性を分析して非共有結合を生成する３０８−４クローンのアミノ酸を選別して表記したものである。

表１７は親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）を利用してパラトープの安定された結合エネルギー値を有する表１６の選別されたアミノ酸を選定して表記したものである。

実施例１１：酵母ディスプレイｓｃＦｖライブラリーを利用した３０８−４クローンの親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）による新規抗体の製造方法
１１−１：酵母ディスプレイｓｃＦｖライブラリー（ｙｅａｓｔ ｄｉｓｐｌａｙ ｓｃＦｖ ｌｉｂｒａｒｙ）の構築
酵母ライブラリーに突然変異を導入するために先ず、重鎖可変領域は３個、軽鎖可変領域は２個に分けて、切片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）重合酵素連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＰＣＲ）を随行した。重鎖可変領域ｆｒａｇｍｅｎｔ １番は抗−ＴＦＰＩ ３０８−４クローン（ｃｌｏｎｅ）の重鎖可変領域の遺伝子配列を鋳型で順方向プライマー（表１８：配列番号４０）、逆方向プライマー（表１８：配列番号４１〜４８）を添加して、重鎖可変領域ｆｒａｇｍｅｎｔ２番は抗−ＴＦＰＩ３０８−４クローンの重鎖可変領域の遺伝子配列を鋳型で順方向プライマー（表１８：配列番号４９）、逆方向プライマー（表１８：配列番号５０〜６１）を添加して、重鎖可変領域ｆｒａｇｍｅｎｔ３番は抗−ＴＦＰＩ３０８−４クローンの重鎖可変領域の遺伝子配列を鋳型で順方向プライマー（表１８：配列番号６２）、逆方向プライマー（表１８：配列番号６３〜６９）を添加した後、各々のｆｒａｇｍｅｎｔをＡｃｃｕＰｏｗｅｒ Ｐｆｕ ＰＣＲ ＰｒｅＭｉｘ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｋ−２０１５，Ｂｉｏｎｅｅｒ）を使用してＰＣＲを遂行した。ＰＣＲ条件は９５℃で２分間の露出後９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で６０秒間の露出を３０回繰り返した後７２℃で１０分間反応した。上記増幅された遺伝子を１％アガロースゲルで予想した大きさのＤＮＡバンドを確認して、これをゲル摘出キットを利用し、各々分離した（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ，ＣＡＴ．Ｎｏ．２８７０６，ＱＩＡＧＥＮ）。軽鎖可変領域ｆｒａｇｍｅｎｔ１番は抗−ＴＦＰＩ３０８−４クローンの軽鎖可変領域の遺伝子配列を鋳型で順方向プライマー（表１８：配列番号７２）、逆方向プライマー（表１８：配列番号７３〜８２）を添加して、軽鎖可変領域ｆｒａｇｍｅｎｔ２番は抗−ＴＦＰＩ３０８−４クローンの軽鎖可変領域の遺伝子配列を鋳型で順方向プライマー（表１８：配列番号８３）、逆方向プライマー（表１８：配列番号８４〜８７）を添加した後、各々のｆｒａｇｍｅｎｔをＡｃｃｕＰｏｗｅｒ Ｐｆｕ ＰＣＲ ＰｒｅＭｉｘ（Ｂｉｏｎｅｅｒ）を使用してＰＣＲを遂行した。ＰＣＲ条件は９５℃で２分間の露出後９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で６０秒間の露出を３０回繰り返した後７２℃で１０分間反応した。上記増幅された遺伝子を１％アガロースゲルで予想した大きさのＤＮＡバンドを確認して、これをゲル摘出キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ）を利用し、各々分離した。

確保された重鎖可変領域ｆｒａｇｍｅｎｔ遺伝子を１：１：１でモルの比率に合わせて鋳型で使用して順方向プライマー（表１８：配列番号７０）、逆方向プライマー（表１８：配列番号７１）を添加した後、Ｔａｋａｒａ ｐｒｉｍｅｒ ｓｔａｒ ＰＣＲ ｐｒｅｍｉｘ（ＣＡＴ．Ｎｏ．Ｒ０４０Ｂ，Ｔａｋａｒａ）を使用してＰＣＲを遂行した。ＰＣＲ条件は９５℃で２分間の露出後９５℃で１０秒、５５℃で２０秒、７２℃で３０秒間の露出を２０回繰り返した後７２℃で５分間反応した。上記増幅された遺伝子を１％アガロースゲルで予想した大きさのＤＮＡバンドを確認して、これをゲル摘出キットＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ）を利用して分離後、重鎖可変領域の遺伝子を確保した。

確保された軽鎖可変領域ｆｒａｇｍｅｎｔ遺伝子を１：１モルの比率に合わせて鋳型で使用して順方向プライマー（表１８：配列番号９１）、逆方向プライマー（表１８：配列番号９２）を添加した後Ｔａｋａｒａ ｐｒｉｍｅｒ ｓｔａｒ ＰＣＲ ｐｒｅｍｉｘ（ＣＡＴ．Ｎｏ．Ｒ０４０Ｂ，Ｔａｋａｒａ）を使用してＰＣＲを遂行した。ＰＣＲ条件は９５℃で２分間の露出後９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、７２℃で４０秒間の露出を２０回繰り返した後７２℃で５分間反応した。上記増幅された遺伝子を１％アガロースゲルで予想した大きさのＤＮＡバンドを確認して、これをゲル摘出キットＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ）を利用して分離後、軽鎖可変領域の遺伝子を確保した。

確保された重鎖可変領域の遺伝子と軽鎖可変領域の遺伝子を１：１のモルの比率に合わせて鋳型で使用して順方向プライマー（表１８：配列番号９３）、逆方向プライマー（表１８：配列番号９４）を添加した後Ｔａｋａｒａ ｐｒｉｍｅｒ ｓｔａｒ ＰＣＲ ｐｒｅｍｉｘ（Ｔａｋａｒａ）を使用してＰＣＲを遂行した。ＰＣＲ条件は９５℃で２分間の露出後９５℃で１０秒、５５℃で２０秒、７２℃で３０秒間の露出を２０回繰り返した後７２℃で５分間反応した。上記増幅された遺伝子を１％アガロースゲルで予想した大きさのＤＮＡバンドを確認して、これをゲル摘出キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ）を利用して分離後、３０８−４の親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）ｓｃＦｖライブラリー遺伝子を完成した。完成されたライブラリー遺伝子２００ｎｇに制限酵素であるＮｈｅＩ（ＣＡＴ．Ｎｏ．Ｒ０１３１Ｌ，ＮＥＢ）とＢａｍＨＩ（ＣＡＴ．Ｎｏ．Ｒ０１３６Ｌ，ＮＥＢ）で処理された線形ｐＣＴＣＯＮ遺伝子１μｇと混ぜた後、形質転換用の酵母（ＥＢＹ１００ ｅｌｅｃｔｒｏ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）に形質転換した。上記の形質転換された酵母を１００ｍｌのＹＰＤ培地に懸濁して３０℃、２００ｒｐｍで１時間振盪培養した後、１ＬのＳＤ培地に接種して３０℃、２００ｒｐｍで１２時間以上培養して、遠心分離して上澄み液を捨てて酵母の貯蔵バッファーで再懸濁して−７０℃に保管した。上記ライブラリーの大きさは形質転換して１時間後１００μｌ培養液を採取して段階的の希釈方式でＳＤプレートに塗抹して３０℃で１２時間以上培養した後、コロニーカウンティング（ｃｏｌｏｎｙ ｃｏｕｎｔｉｎｇ）を通じて確認した。

表１８は酵母ディスプレイｓｃＦｖのライブラリー構築用のプライマーを示したものである。

１１−２：抗体選別
実施例１１−１で構築したライブラリー酵母細胞をＳＤ培地に接種して３０℃、２００ｒｐｍで１２時間以上培養した後、ＳＧ培地で培地を交換した後、２５℃、２００ｒｐｍで１２時間以上培養して酵母の表面に抗体を発現させた。その次、遠心分離して回収した酵母細胞をＰＢＳＭ（３％ＢＳＡが含有されたＰＢＳ）のバッファーで洗浄し、１ｍｌのＰＢＳＭのバッファーで再懸濁してビオチンを結合させた組換えヒトＴＦＰＩタンパク質と常温で１時間反応させた。組換えヒトＴＦＰＩタンパク質と反応された酵母細胞をＰＢＳＭで洗浄した後、氷で１５分間ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ｍｉｃｒｏｂｅａｄ（ＣＡＴ．Ｎｏ．１３０−０４８−１０１，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃｈ）と反応させた。その次、ＰＢＳＭのバッファーで１回洗浄して、ＰＢＳＭのバッファーで再懸濁した後、ＭＡＣＳカラム（ＣＡＴ．Ｎｏ．１３０−０４２−９０１，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃｈ）に通過させてＴＦＰＩタンパク質と結合した酵母細胞を分離した。分離された酵母細胞をＳＤ培地に接種して４８時間以上培養して、上記過程を２回繰り返し遂行して抗体を選別した。

１１−３：ＦＡＣＳ方式の個別クローン確保
酵母ディスプイライブラリーから最終増幅された集団の単一コロニーを採取した後、ＳＤ培地に３０℃、２００ｒｐｍで１２時間以上培養後ＳＧの培地に交換して、２５℃、２００ｒｐｍで１２時間以上培養して酵母の表面に抗体を発現させた。その次、遠心分離して回収した酵母細胞をＰＢＳＦ（１％ＢＳＡが含有されたＰＢＳ）のバッファーで洗浄して、５０μｌのＰＢＳＦのバッファーで再懸濁した後、ビオチンを結合させた組換えヒトＴＦＰＩタンパク質と抗−ｃ−ｍｙｃマウス抗体（ＣＡＴ．Ｎｏ．Ｍ４４３９，Ｓｉｇｍａ）と常温で３０分間反応させた。反応させた酵母細胞をＰＢＳＦで洗浄し、５０μｌのＰＢＳＦのバッファーで再懸濁した後、ＦＩＴＣが結合された抗−マウスの抗体（ＣＡＴ．Ｎｏ．Ｆ０２５７，Ｓｉｇｍａ）とＰＥが結合されたｓｔｒｅｐｔａｎｉｄｉｎと光を遮断して氷で１５分間反応させた。その次、ＰＢＳＦのバッファーで洗浄して、５００μｌのＰＢＳＦのバッファーで再懸濁した後、ＦＡＣＳを利用してＦＩＴＣとＰＥの波長帯で，すべて高い値を示すクローンを選別して個別クローンとして確保した。

その結果、表１９に示したことのように、ヒトＴＦＰＩに特異的に結合するクローンを選別することができ、これらのアミノ酸配列を確認した。先出願された大韓民国出願特許１０−２０１５−００２６５５５に記載された抗体の中で本発明で使用された抗体は‘２０１５−２６５５５＿（選出員配列番号）’に記載した。

表２０は、表１９のクローン抗体のＣＤＲアミノ酸配列をＫａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ基準で表記したものである。

１１−４：酵母ディスプレイで確保された抗−ＴＥＰＩ抗体であるクローン３０８−４突然変異抗体のＩｇＧ遺伝子のクローニング
実施例１１−２及び実施例１１−３で確保された抗−ＴＦＰＩ抗体である３０８−４突然変異抗体の軽鎖可変領域の遺伝子各々をＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ重合酵素（ＣＡＴ．Ｎｏ．Ｒ０４０Ｂ，Ｔａｋａｒａ）を使用してＫｐｎＩが含まれた順方向プライマー（表２１：配列番号１８９）と逆方向プライマー（表２１：配列番号１９０）でＰＣＲを遂行した。また、ヒト抗体のカッパ軽鎖不変領域（ｋａｐｐａ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｌｉｇｈｔ ｒｅｇｉｏｎ）を順方向プライマー（表２１：配列番号１９１）と逆方向プライマー（表２１：配列番号１９２）でＰＣＲを遂行した。条件は９４℃で１０分間の露出後９４℃で１５秒、５６℃で３０秒、７２℃で９０秒間の露出を３０回繰り返した後７２℃で１０分間反応した。上記増幅された遺伝子を１％アガロースゲルで予想した大きさのＤＮＡバンドを確認して、これをゲル摘出キットを利用し、各々分離した。以後、各軽鎖可変領域と軽鎖不変領域を１：１の比率に混ぜて順方向プライマー（表２０：配列番号１８９）と逆方向プライマー（表２０：配列番号１９２）を使用して、条件は９４℃で１０分間の露出後９４℃で１５秒、５６℃で３０秒、７２℃で９０秒間の露出を３０回繰り返した後７２℃で１０分間反応して重畳ＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲ）を随行した。上記増幅された遺伝子を１％アガロースゲルで予想した大きさのＤＮＡバンドを確認して、これをゲル摘出キットを利用し、各々分離した。分離された遺伝子をＫｐｎＩ（ＣＡＴ．Ｎｏ．Ｒ０１４２Ｌ，ＮＥＢ）、ＨｉｎｄＩＩＩ（ＣＡＴ．Ｎｏ．Ｒ０１０４Ｌ，ＮＥＢ）制限酵素で３７℃で１２時間以上反応させた後、制限酵素で処理された遺伝子を再び１％アガロースゲルから分離した。ｐｃＩＷプラスミドベクターも同じ方法で切断して、アガロースゲル上から分離した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ０２０３Ｓ，ＮＥＢ）を使用して、分離された軽鎖領域の遺伝子を線形ｐｃＩＷベクターのＮｏｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入した。上記ライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）反応物をＸＬ１−Ｂｌｕｅバクテリア（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ−Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ；Ｃａｔ．Ｎｏ．２００２２８，Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）に形質転換させた後、カルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）が含まれたＬＢプレート（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＬＮ００４ＣＡ，ＮａｒａｅＢｉｏｔｅｃｈ）に塗抹して、３７℃で１２時間以上培養して、単一コロニー（ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｌｏｎｉｅｓ）を選別して培養した後、プラスミドミニキット（Ｃａｔ．Ｎｏ．２７４０５，ＱＩＡＧＥＮ）を利用してプラスミドを分離し、これをＤＮＡシークエンシングを通じて確認した。

重鎖可変領域は３０８−４の突然変異抗体の重鎖可変領域の遺伝子を鋳型にで各々をＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ重合酵素（Ｔａｋａｒａ）を使用してＫｐｎＩが含まれた順方向プライマー（表２１：配列番号１９３）とＡｐａＩが含まれた逆方向プライマー（表２１：配列番号１９４）でＰＣＲを遂行した。ＰＣＲ条件は９８℃で２分間の露出後９８℃で１０秒、５８℃で１０秒、７２℃で３０秒間の露出を３０回繰り返した後７２℃で５分間反応した。上記増幅された遺伝子を１％アガロースゲルで予想した大きさのＤＮＡバンドを確認して、これをゲル摘出キットを利用し、各々分離した。以後、分離された三種類の遺伝子をＫｐｎＩとＡｐａＩ制限酵素で３７℃で４時間反応させた。制限酵素で反応した遺伝子を再び１％アガロースゲルから分離した。ｐＣＩＷプラスミドベクターも同様な方法で切断して、アガロースゲル上から分離した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して、上記分離された遺伝子をヒト重鎖不変領域が入っている線形ｐｃＩｗベクターのＫｐｎＩ（ＣＡＴ．Ｎｏ．Ｒ０１４２Ｌ，ＮＥＢ）、ＡｐａＩ（ＣＡＴ．Ｎｏ．Ｒ０１１４Ｌ，ＮＥＢ）部位に挿入した。上記ライゲーション反応物をＸＬ１−Ｂｌｕｅバクテリア（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ−Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ；Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）に形質転換させて、カルベニシリンが含まれたＬＢプレート（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＬＮ００４ＣＡ，ＮａｒａｅＢｉｏｔｅｃｈ）に塗抹して３７℃で１２時間以上培養して、単一コロニー（ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｌｏｎｉｅｓ）を選別して培養した後、プラスミドミニキット（Ｃａｔ．Ｎｏ．２７４０５，ＱＩＡＧＥＮ）を利用してプラスミドを分離し、分離されたプラスミドのＤＮＡシークエンシングを遂行した。

表２１は酵母ディスプレイで確保された抗−ＴＦＰＩ抗体であるクローン３０８−４の突然変異抗体のＩｇＧ遺伝子クローニング用のプライマーを示したものである。

１１−５：抗−ＴＦＰＩ３０８−４クローンの突然変異抗体のＩｇＧ生産及び精製
実施例１１−４でクローニングされた抗−ＴＦＰＩ３０８−４クローンの突然変異抗体を生産及び精製するために形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）の一日前にＥｘｐｉ２９３Ｆ^TM細胞を２．５ｘ１０^６細胞／ｍｌの濃度で接種した。２４時間培養（３７℃、８％ＣＯ_２，１２５ｒｐｍ）後Ｅｘｐｉ２９３^TMＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ培地（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１４３５１０１、Ｇｉｂｃｏ）を添加して細胞数２．５ｘ１０^６細胞／ｍｌの濃度（生存率（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）≧９５％）で３０ｍｌを準備した。３０μｇのＤＮＡ（ｐｃＩｗ−ａｎｔｉ−ＴＦＰＩ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ：１５μｇ、ｐｃＩｗ−ａｎｔｉ−ＴＦＰＩ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ：１５μｇ）を全体の体積が１．５ｍｌになるようにＯｐｔｉＰｒｏ^TMＳＥＭ培地（Ｃａｔ．Ｎｏ．１２３０９０１９，Ｇｉｂｃｏ）に希釈して常温で５分間反応した。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ^TM２９３試薬（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１４５２４、Ｇｉｂｃｏ）８０μｌを全体の体積が１．５ｍｌになるようにＯｐｔｉＰｒｏ^TMＳＥＭ培地（Ｃａｔ．Ｎｏ．１２３０９０１９，Ｇｉｂｃｏ）１．５ｍｌに混ぜた後、常温で５分反応した。５分間の反応後各々希釈したＤＮＡとＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ^TM２９３試薬１．５ｍｌをよく混ぜて、常温で２０〜３０分間反応した。ＤＮＡとＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ^TM２９３試薬混合液３ｍｌをＥｘｐｉ２９３Ｆ^TM細胞に処理した。１６〜１８時間懸濁培養後（３７℃、８％ＣＯ_２、１２５ｒｐｍ）ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ^TM２９３ Ｅｎｈａｎｃｅｒ１（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１４５２４，Ｇｉｂｃｏ）１５０μｌとＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ^TM２９３ Ｅｎｈａｎｃｅｒ２（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１４５２４，Ｇｉｂｃｏ）１．５ｍｌを添加して５日間、懸濁培養した。培養が終わると４０００ｒｐｍで２０分間、遠心分離して細胞破壊物（Ｃｅｌｌ ｄｅｂｒｉｓ）を除去した後、上澄み液を０．２２μｍフィルターに通過させて準備した。各３０ｍｌの培養液当たりプロテインＡレジン（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｒｅｓｉｎ）であるＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｘｔｒａ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１７−５２６９−０２、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を１００μｌずつ準備して１０００ｒｐｍで２分間、遠心分離して貯蔵溶液を除去して、プロテインＡバインディングバッファー（Ｃａｔ．Ｎｏ．２１００７、Ｐｉｅｒｃｅ）４００μｌずつ３回洗浄した。上記準備された培養液にプロテインＡレジン（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｒｅｓｉｎ）を入れて室温で３０分間回転反応した。Ｐｉｅｒｃｅ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎ−ｓｎａｐ ｃａｐ（Ｃａｔ．Ｎｏ．６９７２５，Ｔｈｅｒｍｏ）に培養液とレジン（ｒｅｓｉｎ）混合物を入れてＱＩＡｖａｃ ２４ Ｐｌｕｓ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１９４１３，ＱＩＡＧＥＮ）ｖａｃｃｕｍ ｍａｎｉｆｏｌｄを使用してカラムにレジン（ｒｅｓｉｎ）のみを残した。プロテインＡバインディングバッファー５ｍｌを入れてレジン（ｒｅｓｉｎ）を洗浄した後、プロテインＡ溶出バッファー（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）（Ｃａｔ．Ｎｏ．２１００９，Ｐｉｅｒｃｅ）２００μｌを入れて再懸濁（ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）して室温で２分間反応した後、１０００ｒｐｍで１分遠心分離して溶出した。各溶出液（ｅｌｕａｔｅ）には１．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）２．５μｌを入れて中和させた。湧出は４〜６回にわたって行われ、各分画（ｆｒａｃｔｉｏｎ）はＮａｎｏＤｒｏｐ ２００Ｃ（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量した。タンパク質が検出された分画（ｆｒａｃｔｉｏｎ）を集めてＺｅｂａ Ｓｐｉｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎｓ、７Ｋ ＭＷＣＯ、５ｍｌ（Ｃａｔ．Ｎｏ．００８９８９２，Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）のバッファーで緩衝液を交換した後、還元及び非還元条件でタンパク質電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を遂行して、最終的に濃度の定量及び抗体の状態を検証して、４℃に保管した。

その結果、良好な状態で精製された抗−ＴＦＰＩ３０８−４クローンの突然変異抗体をタンパク質電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上で確認した。

実施例１２：ファージディスプレイＦａｂライブラリーを利用した抗−ＴＦＰＩ３０８−４クローンの親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）抗体の製造方法
１２−１：ファージディスプレイＦａｂライブラリー（ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ Ｆａｂ ｌｉｂｒａｒｙ）の構築
Ｆａｂライブラリーを構築するためにまず、重鎖可変領域のライブラリー構築後順次的に軽鎖可変領域のライブラリーを構築した。まず重鎖可変領域のｆｒａｇｍｅｎｔ１番は抗−ＴＦＰＩ３０８−４クローンの重鎖可変領域の遺伝子配列を鋳型で順方向プライマー（表１８：配列番号４０）、逆方向プライマー（表１８：配列番号４１〜４８）を添加して、重鎖可変領域のｆｒａｇｍｅｎｔ２番は抗−ＴＦＰＩ３０８−４クローンの重鎖可変領域の遺伝子配列を鋳型で順方向プライマー（表１８：配列番号４９）、逆方向プライマー（表１８：配列番号５０〜６１）を添加して、重鎖可変領域のｆｒａｇｍｅｎｔ３番は抗−ＴＦＰＩ３０８−４クローンの重鎖可変領域の遺伝子配列を鋳型で順方向プライマー（表１８：配列番号６２）、逆方向プライマー（表１８：配列番号６３〜６９）を添加した後、各々のｆｒａｇｍｅｎｔをＡｃｃｕＰｏｗｅｒ Ｐｆｕ ＰＣＲ ＰｒｅＭｉｘ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｋ−２０１５，Ｂｉｏｎｅｅｒ）を使用してＰＣＲを遂行した。ＰＣＲ条件は９５℃で２分間の露出後９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で６０秒間の露出を３０回繰り返した後７２℃で１０分間反応した。上記増幅された遺伝子を１％アガロースゲルで予想した大きさのＤＮＡバンドを確認して、これをゲル摘出キットを利用し、各々分離した（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ）。確保された重鎖可変領域のｆｒａｇｍｅｎｔ遺伝子を１：１：１でモルの比率を合わせて鋳型で使用して順方向プライマー（表１８：配列番号７０）、逆方向プライマー（表１８：配列番号７１）を添加した後Ｔａｋａｒａ ｐｒｉｍｅｒ ｓｔａｒ ＰＣＲ ｐｒｅｍｉｘ（Ｔａｋａｒａ）を使用してＰＣＲを遂行した。ＰＣＲ条件は９５℃で２分間の露出後９５℃で１０秒、５５℃で２０秒、７２℃で３０秒間の露出を２０回繰り返した後７２℃で５分間反応した。上記増幅された遺伝子を１％アガロースゲルで予想した大きさのＤＮＡバンドを確認して、これをゲル摘出キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ）を使用して分離して重鎖可変領域の遺伝子を確保した。確保された遺伝子をＸｈｏＩ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ０１４６Ｌ，ＮＥＢ）とＡｐａＩ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ０１１４Ｌ，ＮＥＢ）制限酵素で３７℃で４時間の間処理した。制限酵素で処理された遺伝子を再び１％アガロースゲル上から分離した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ０２０３Ｓ，ＮＥＢ）を使用して、上記分離された遺伝子を３０８−４軽鎖可変−不変領域が入っている線形ｐＣｏｍｂ３ｘベクターのＸｈｏＩ、ＡｐａＩ部位に挿入した。上記ライゲーション反応物をＸＬ１−Ｂｌｕｅバクテリア（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ；Ｃａｔ．Ｎｏ．２００２２８，Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）に形質転換させた後、ＬＢ培地３００ｍｌに１時間の間３７℃、２２０ｒｐｍで培養後カルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）１５０μｌ、ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ３００μｌを処理した後、１２時間以上３７℃、２２０ｒｐｍで懸濁培養した。その次、Ｍｉｄｉ ｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１２１４３，ＱＩＡＧＥＮ）を利用して構築された重鎖可変領域のライブラリープラスミドを確保した。ライブラリーの大きさは形質転換して１時間後、培養液１００μｌを採取して段階的の希釈方式でカルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）が含まれたＬＢプレート（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＬＮ００４ＣＡ，ＮａｒａｅＢｉｏｔｅｃｈ）に塗抹して、３７℃で１２時間以上培養した後、コロニーカウンティング（ｃｏｌｏｎｙ ｃｏｕｎｔｉｎｇ）を通じて確認した。

軽鎖可変領域のｆｒａｇｍｅｎｔ１番は抗−ＴＦＰＩ３０８−４クローンの軽鎖可変領域の遺伝子配列を鋳型で使用して順方向プライマー（表１８：配列番号７２）、逆方向プライマー（表１８：配列番号７３〜８２）を添加して、軽鎖可変領域のｆｒａｇｍｅｎｔ２番は抗−ＴＦＰＩ３０８−４クローンの軽鎖可変領域の遺伝子配列を鋳型で順方向プルライモ（表１８：配列番号８３）、逆方向プライマー（表１８：配列番号８４〜８７）を添加した後各々のｆｒａｇｍｅｎｔをＡｃｃｕＰｏｗｅｒ Ｐｆｕ ＰＣＲ ＰｒｅＭｉｘ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｋ−２０１５，Ｂｉｏｎｅｅｒ）を使用してＰＣＲを遂行した。ＰＣＲ条件は９５℃で２分間の露出後９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で６０秒間の露出を３０回繰り返した後７２℃で１０分間反応した。上記増幅された遺伝子を１％アガロースゲルで予想した大きさのＤＮＡバンドを確認して、これをゲル摘出キットを利用し、各々分離した（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ）。軽鎖可変領域はｆｒａｇｍｅｎｔ遺伝子を１：１でモルの比率を合わせて鋳型で使用して順方向プライマー（表１８：配列番号９１）、逆方向プライマー（表１８：配列番号９２）を添加した後、Ｔａｋａｒａ ｐｒｉｍｅｒ ｓｔａｒ ＰＣＲ ｐｒｅｍｉｘ（Ｔａｋａｒａ）を使用してＰＣＲを遂行した。ＰＣＲ条件は９５℃で２分間の露出後９５℃で１０秒、５５℃で３０秒、７２℃で４０秒間の露出を２０回繰り返した後７２℃で５分間反応した。上記増幅された遺伝子を１％アガロースゲルで予想した大きさのＤＮＡバンドを確認して、これをゲル摘出キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ）を使用して分離後、軽鎖可変領域の遺伝子を確保した。確保された遺伝子をＮｒｕＩ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ０１９２Ｌ，ＮＥＢ）とＸｂａＩ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ０１４５Ｌ，ＮＥＢ）の制限酵素で３７℃で４時間反応させた。制限酵素で反応した遺伝子を再び１％アガロースゲル上から分離した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ０２０３Ｓ，ＮＥＢ）を使用して、上記分離された遺伝子を３０８−４の重鎖可変領域のライブラリーが入っている線形ｐＣｏｍｂ３ｘベクターのＮｒｕＩ、ＸｂａＩ部位に挿入した。上記ライゲーション反応物をＸＬ１−Ｂｌｕｅバクテリア（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ；Ｃａｔ．Ｎｏ．２００２２８，Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）に形質転換させた後、ＬＢ培地３００ｍｌに１時間の間３７℃、２２０ｒｐｍで培養後カルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｃｉｌｌｉｎ）１５０μｌ、ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ３００μｌを処理した後、１時間の間３７℃、２２０ｒｐｍで振盪培養した。ここにＶＣＳ Ｍ１３ ｈｅｌｐｅｒ ｐｈａｇｅ ４．５ｍｌ（１０^１１ｐｆｕ）を処理した後、１時間の間３７℃、２２０ｒｐｍで振盪培養した後ｋａｎａｍｙｃｉｎ３００μｌ、カルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）３００μｌを処理して３７℃、２２０ｒｐｍで一晩培養した。翌日、培養した細胞を４０００ｒｐｍで２０分間、遠心分離した後、上澄み液を新しい容器に移し入れた。ファージ（ｐｈａｇｅ）を沈殿させるために、５ｘＰＥＧ／ＮａＣｌを１ｘになるように上澄み液に添加した後、氷に３０分以上保持した。沈殿させたｐｈａｇｅを８０００ｒｐｍ、３０分間、遠心分離した。上澄み液を捨てて沈殿されたｐｈａｇｅを１０ｍｌのＰＢＳで再懸濁した。細胞沈殿物を除去するため、１０ｍｌのＰＢＳで溶かしたｐｈａｇｅを１４，０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離して上澄み液を分離した後、４℃に保管した。ライブラリーの大きさは形質転換して１時間後、培養液１００μｌを採取して段階的の希釈方式でカルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）が含まれたＬＢプレート（ＮａｒａｅＢｉｏｔｅｃｈ）に塗抹して、３７℃で１２時間以上培養した後、コロニーカウンティング（ｃｏｌｏｎｙ ｃｏｕｎｔｉｎｇ）を通じて確認した。

１２−２：抗−ＴＦＰＩ突然変異抗体の選別
Ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ ｔｕｂｅ（Ｃａｔ．Ｎｏ．４４４２０２，Ｎｕｎｃ）に組換えヒトタンパク質ＴＦＰＩを１μｇ／ｍｌの濃度に１ｍｌ入れて４℃で１２時間以上コーティングしたチューブを０．０５％ＰＢＳＴ５ｍｌで３回洗浄した。ＴＦＰＩがコーティングされたＩｍｍｕｎｏ ｔｕｂｅに１％ＢＳＡ／ＰＢＳ５ｍｌを入れて、常温で２時間ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した。Ｉｍｍｕｎｏ ｔｕｂｅのブロッキングバッファーを除去した後ｐｈａｇｅライブラリーをチューブに処理して常温で２時間反応させた。この後ＰＢＳＴ５ｍｌに４回洗浄した。Ｉｍｍｕｎｏ ｔｕｂｅに１ｍｌ Ｇｌｙｃｉｎｅ（ｐＨ２．０）溶出（Ｅｌｕｔｉｏｎ）バッファーを処理して常温で１０分間反応させて上澄み液を得た後、溶出したｐｈａｇｅに１．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）１００μｌを添加して中和させた。約２時間培養した（ＯＤ６００＝０．８〜１．０）ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌ １０ｍｌに中和させたｐｈａｇｅを処理した。常温で３０分間感染させた後、感染されたＸＬＩ−Ｂｌｕｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌ １０ｍｌにＳＢ １０ｍｌ、ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ（５０ｎｇ／ｍｌ）２０μｌ、カルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）（１００ｍｇ／ｍｌ）１０μｌを添加し、３７℃で１時間振盪培養（２００ｒｐｍ）した。ＶＣＳＭ１３ ｈｅｌｐｅｒ ｐｈａｇｅ（＞１０^１１ｐｆｕ／ｍｌ）１ｍｌを処理した後、３７℃で１時間振盪培養（２００ｒｐｍ）した。１時間培養後ＳＢ８０ｍｌ、ｋａｎａｍｙｃｉｎ１００μｌ、カルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）（１００ｍｇ／ｍｌ）１００μｌを処理して３７℃で一晩培養（２００ｒｐｍ）した。１２時間以上培養したライブラリーは４０００ｒｐｍで１５分間、遠心分離して上澄み液のみを分離して、５ｘＰＥＧ／ＮａＣｌバッファーを１ｘに入れ混ぜた後、氷で３０分間保持した。８０００ｒｐｍで３０分間、遠心分離して上澄み液を除去して、ペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を２ｍｌの１％ＢＳＡ／ＰＢＳで再懸濁した後、１２０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離して上澄み液のみを取って、次数のｐａｎｎｉｎｇに使用した。上記の過程を４回繰り返して実施した。

１２−３：ＥＬＩＳＡ方式の抗−ＴＦＰＩ個別クローン抗体の確保
ライブラリー最終増幅集団の単一コロニーを採取した後ＳＢ／カルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）１．５ｍｌにＯＤ６００で０．８〜１．０程度まで３７℃、２２０ｒｐｍで培養した後、１ｍＭ ＩＰＴＧ、３０℃、２００ｒｐｍで１２時間以上培養させた。この反応物を５５００ｒｐｍ、５分間、遠心分離した後、各々の上澄み液のみをＴＦＰＩ抗原がコーティングされているＥＬＩＳＡプレートに添加した後、２時間の間常温で反応した後、ＰＢＳＴ（１ｘＰＢＳ、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０）で４回洗浄後ＨＲＰ／Ａｎｔｉ−ｈＦａｂ−ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ０２９３，Ｓｉｇｍａ）を１％ＢＳＡ／１ｘ ＰＢＳで１／５０００で希釈したものを添加した後、１時間の間常温で反応した後、再びＰＢＳＴ（１ｘＰＢＳ、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０）で４回洗浄した後ＴＭＢ溶液を添加した後、５〜１０分間処理した後にＴＭＢ ｓｔｏｐ溶液を添加した後、ＴＥＣＡＮ ｓｕｎｒｉｓｅを利用して４５０ｎｍ測定波長でその値を読んで高いＯ．Ｄ値を有するクローンを個別クローンとして確保した。

その結果、表２３に示したことのように、ヒトＴＦＰＩに特異的に結合するクローンを選別することができ、これらのアミノ酸配列を確認した。先出願された大韓民国出願特許１０−２０１５−００２６５５５に記載された抗体中、本発明で使用された抗体は‘２０１５−２６５５５＿（先出員配列番号）’に記載した。

表２３は表２２のクローン抗体のＣＤＲアミノ酸配列をＫａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ基準で表記したものである。

１２−４：抗−ＴＦＰＩ３０８−４クローン突然変異抗体のＩｇＧ遺伝子クローニング
確保された抗−ＴＦＰＩ３０８−４クローンの突然変異抗体の軽鎖可変領域の遺伝子を鋳型で使用して各々をＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ重合酵素（Ｔａｋａｒａ）を使用してＫｐｎＩが含まれた順方向プライマー（表２１：配列番号１８９）と逆方向プライマー（表２１：配列番号１９０）でＰＣＲを遂行した。また、ヒト抗体のカッパ軽鎖不変領域（ｋａｐｐａ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｌｉｇｈｔ ｒｅｇｉｏｎ）を順方向プライマー（表２１：配列番号１９１）と逆方向プライマー（表２１：配列番号１９２）でＰＣＲを遂行した。条件は９４℃で１０分間の露出後９４℃で１５秒、５６℃で３０秒、７２℃で９０秒間の露出を３０回繰り返した後７２℃で１０分間反応した。上記増幅された遺伝子を１％アガロースゲルで予想した大きさのＤＮＡバンドを確認して、これをゲル摘出キットを利用して各々分離した。以後、各軽鎖可変領域と軽鎖不変領域を１：１の比率で混ぜて、順方向プライマー（表２０：配列番号１８９）と逆方向プライマー（表２０：配列番号１９２）を使用して、条件は９４℃で１０分間の露出後９４℃で１５秒、５６℃で３０秒、７２℃で９０秒間の露出を３０回繰り返した後７２℃で１０分間反応して重畳ＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲ）を随行した。上記増幅された遺伝子を１％アガロースゲルで予想した大きさのＤＮＡバンドを確認して、これをゲル摘出キットを利用して各々分離した。分離された遺伝子をＫｐｎＩ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ０１４２Ｌ，ＮＥＢ）、ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ０１０４Ｌ，ＮＥＢ）の制限酵素で３７℃で１２時間以上反応させた後、制限酵素で反応した遺伝子を再び１％アガロースゲルから分離した。ｐｃＩＷプラスミドベクターも同様な方法で切断して、アガロースゲル上から分離した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ０２０３Ｓ，ＮＥＢ）を使用して、上記分離された軽鎖領域の遺伝子を線形ｐｃＩＷベクターのＮｏｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入した。上記ライゲーション反応物をＸＬ１−Ｂｌｕｅバクテリア（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ；Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．２００２２８）に形質転換させた後、カルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）が含まれたＬＢプレート（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＬＮ００４ＣＡ，ＮａｒａｅＢｉｏｔｅｃｈ）に塗抹して３７℃で１２時間以上培養した後、単一コロニー（ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｌｏｎｉｅｓ）を選んで培養後、プラスミドミニキット（Ｃａｔ．Ｎｏ．２７４０５，ＱＩＡＧＥＮ）を利用してプラスミドを分離し、これをＤＮＡシークエンシングを通じて確認した。

重鎖可変領域は３０８−４の突然変異抗体の重鎖可変領域の遺伝子を鋳型で各々をＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ重合酵素（Ｔａｋａｒａ）を使用してＫｐｎＩが含まれた順方向プライマー（表２１：配列番号１９３）とＡｐａＩが含まれた逆方向プライマー（表２１：配列番号１９４）でＰＣＲを遂行した。ＰＣＲ条件は９８℃で２分間の露出後９８℃で１０秒、５８℃で１０秒、７２℃で３０秒間の露出を３０回繰り返した後７２℃で５分間反応した。上記増幅された遺伝子を１％アガロースゲルで予想した大きさのＤＮＡバンドを確認して、これをゲル摘出キットを利用して各々分離した。以後、分離された三種類の遺伝子をＫｐｎＩとＡｐａＩ制限酵素で３７℃で４時間反応させた。制限酵素で反応した遺伝子を再び１％アガロースゲルから分離した。ｐｃＩＷプラスミドベクターも同様な方法で切断して、アガロースゲル上から分離した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して、上記分離された遺伝子をヒト重鎖不変領域が入っている線形ｐｃＩＷベクターのＫｐｎＩ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ０１４２Ｌ，ＮＥＢ）、ＡｐａＩ（ＮＥＢ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ０１１４Ｌ）部位に挿入した。上記ライゲーション反応物をＸＬ１−Ｂｌｕｅバクテリア（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ；Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．２００２２８）に形質転換させた後、カルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）が含まれたＬＢプレート（ＮａｒａｅＢｉｏｔｅｃｈ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＬＮ００４ＣＡ）に塗抹して３７℃で１２時間以上培養した後、単一コロニー（ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｌｏｎｉｅｓ）を選んで培養後、プラスミドミニキット（Ｃａｔ．Ｎｏ．２７４０５，ＱＩＡＧＥＮ）を利用してプラスミドを分離し、これをＤＮＡシークエンシングを通じて確認した。

１２−５：抗−ＴＦＰＩ３０８−４クローン突然変異抗体のＩｇＧ生産及び精製
実施例１２−４でクローニングされた抗−ＴＦＰＩ３０８−４クローンの突然変異抗体を生産及び精製するために形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）の一日前にＥｘｐｉ２９３Ｆ^TM細胞を２．５ｘ１０^６細胞／ｍｌの濃度で接種した。２４時間培養（３７℃、８％ＣＯ_２、１２５ｒｐｍ）後Ｅｘｐｉ２９３^TMＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎの培地（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１４３５０１，Ｇｉｂｃｏ）を添加して細胞数２．５ｘ１０^６細胞／ｍｌの濃度（生存率（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）≧９５％）で３０ｍｌを準備した。３０μｇのＤＮＡ（ｐｃＩＷ−ａｎｔｉ−ＴＦＰＩ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ：１５μｇ、ｐｃＩＷ−ａｎｔｉ−ＴＦＰＩ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ：１５μｇ）を全体の体積が１．５ｍｌになるようにＯｐｔｉＰｒｏ^TMＳＥＭ培地（Ｃａｔ．Ｎｏ．１２３０９０１９、Ｇｉｂｃｏ）に希釈して常温で５分間反応した。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ^TM２９３試薬（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１４５２４、Ｇｉｂｃｏ）８０μｌを全体の体積が１．５ｍｌになるようにＯｐｔｉＰｒｏ^TM ＳＥＭ培地（Ｃａｔ．Ｎｏ．１２３０９０１９、Ｇｉｂｃｏ）１．５ｍｌに混ぜた後、常温で５分反応した。５分間反応後各々の希釈したＤＮＡとＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ^TM２９３試薬１．５ｍｌをよく混ぜて、常温で２０〜３０分間反応した。ＤＮＡとＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ^TM２９３試薬混合液３ｍｌをＥｘｐｉ２９３Ｆ^TM細胞に処理した。１６〜１８時間懸濁培養後（３７℃、８％ＣＯ_２、１２５ｒｐｍ）ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ^TM２９３ Ｅｎｈａｎｃｅｒ１（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１４５２４、Ｇｉｂｃｏ）１５０μｌとＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ^TM２９３ Ｅｎｈａｎｃｅｒ２（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１４５２４、Ｇｉｂｃｏ）１．５ｍｌを添加して５日間懸濁培養した。培養が終わったら４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して細胞破壊物（Ｃｅｌｌ ｄｅｂｒｉｓ）を除去した後、上澄み液を０．２２μｍフィルターに通過させて準備した。各３０ｍｌの培養液当たりプロテインＡレジン（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｒｅｓｉｎ）であるＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｘｔｒａ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１７−５２６９−０２、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を１００μｌずつ準備して１０００ｒｐｍで２分間、遠心分離して貯蔵溶液を除去して、プロテインＡバインディングバッファー（Ｃａｔ．Ｎｏ．２１００７、Ｐｉｅｒｃｅ）４００μｌずつ３回洗浄した。上記準備された培養液にプロテインＡレジン（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｒｅｓｉｎ）を入れて室温で３０分間回転反応した。Ｐｉｅｒｃｅ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎ−ｓｎａｐ ｃａｐ（Ｃａｔ．Ｎｏ．６９７２５，Ｔｈｅｒｍｏ）に培養液とレジン（ｒｅｓｉｎ）混合物を入れてＱＩＡｖａｃ ２４ Ｐｌｕｓ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１９４１３，ＱＩＡＧＥＮ）ｖａｃｃｕｍ ｍａｎｉｆｏｌｄを使用してカラムにレジン（ｒｅｓｉｎ）のみを残した。プロテインＡバインディングバッファー５ｍｌを入れてレジン（ｒｅｓｉｎ）を洗浄した後、プロテインＡ溶出バッファー（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）（Ｃａｔ．Ｎｏ．２１００９，Ｐｉｅｒｃｅ）２００μｌを入れて再懸濁（ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）して室温で２分間反応した後、１０００ｒｐｍで１分遠心分離して溶出した。各溶出液（ｅｌｕａｔｅ）には１．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）２．５μｌを入れて中和させた。溶出は４〜６回にわたって行われ、各分画（ｆｒａｃｔｉｏｎ）はＮａｎｏＤｒｏｐ ２００Ｃ（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量した。タンパク質が検出された分画（ｆｒａｃｔｉｏｎ）を集めてＺｅｂａ Ｓｐｉｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎｓ、７Ｋ ＭＷＣＯ、５ｍｌ（Ｃａｔ．Ｎｏ．００８９８９２，Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）のバッファーで緩衝液を交換した後、還元及び非還元の条件でタンパク質電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を遂行して、最終的に濃度の定量及び抗体の状態を検証して、４℃に保管した。

その結果、良好な状態で精製された抗−ＴＦＰＩ３０８−４クローンの突然変異抗体をタンパク質電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上で確認した。

実施例１３：ＴＦＰＩ抗原に対する３０８−４突然変異抗体の定量的な結合力測定
実施例１１及び実施例１２で精製された抗−ＴＦＰＩ抗体である３０８−４クローンの重鎖可変領域の突然変異抗体１２、１０２３、１２０２、３２４１を組換えヒトＴＦＰＩに対する定量的な結合力（親和度（Ａｆｆｉｎｉｔｙ））をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ−２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）バイオセンサーを利用して測定した。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａをアミン−カルボキシル反応を利用してＣＭ５チップ（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＲ−１００５−３０，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に２００Ｒｍａｘになるように固定させた後、精製した１２、１０２３、１２０２、３２４１クローンの各々を１分間固定させたＰｒｏｔｅｉｎ Ａに結合させた後、ＨＢＳ−ＥＰの緩衝溶液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４），１５０ｎＭ ＮａＣｌ，３ｍＭ ＥＤＴＡ，０．００５％ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０）に順次的に希釈した組換えヒトＴＦＰＩを０．０７８ｎＭ〜５ｎＭの濃度の範囲で結合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）１２０秒、解離（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）３６００秒間、流速３０μｌ／分で流した。１０ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ ｐＨ１．５を３０秒間、流速３０μｌ／分で流したことによって、抗体に結合されたＴＦＰＩの解離を誘導した。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ−２００ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅを利用して親和度を運動速度常数（Ｋ_ｏｎ及びＫ_ｏｆｆ）と平衡解離常数（Ｋ_Ｄ）で表２４に示したことのように修得した。

表２４は抗−ＴＦＰＩ抗体の組換えヒトＴＦＰＩタンパク質に対する親和度を運動速度常数（Ｋ_ｏｎ及びＫ_ｏｆｆ）及び並行解離常数（Ｋ_Ｄ）で示したものである。

実施例１４：ＦＸａの活性測定
血液凝固は内因性経路（Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｐａｔｈｗａｙ）と外因性経路（Ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ ｐａｔｈｗａｙ）にり誘導され、二つの経路は共通的にＦａｃｔｏｒ Ｘを活性化させる共通経路（ｃｏｍｍｏｎ ｐａｔｈｗａｙ）を通じてｔｈｒｏｍｂｉｎを活性化させて最終的にｆｉｂｒｉｎを形成して血液凝固を誘導する。また、ＴＦＰＩはＫｕｎｉｔｚ１（Ｋ１）、Ｋｕｎｉｔｚ２（Ｋ２）及びＫｕｎｉｔｚ３（Ｋ３）ドメイン（ｄｏｍａｉｎ）で構成されている。Ｋ１ドメインはＦＶＩＩａと結合し、Ｋ２ドメインはＦＸａと結合することで知られている。このようなＴＦＰＩと血液凝固因子の結合を通じて血液凝固を抑制することで知られている。したがって、ＭＧ１１１３（抗−ＴＦＰＩ抗体）の血液凝固の過程全般に及ぼす影響を確認するため、ＦＸａの活性程度を評価した。

色々な因子（ｆａｃｔｏｒｓ）の影響を最小化するため、ＦＸａ、ＴＦＰＩと候補抗体のみで試験係を構成して候補物質がＴＦＰＩと結合すると、ＦＸａの機能を抑制することができないことにより、ＦＸａの活性が現れる。一方、候補物質がＴＦＰＩと効果的に結合しないと、ＴＦＰＩがＦＸａと結合して機能を阻害することで発色程度が減少することになる。したがって、ＴＦＰＩにより活性を阻害されないＦＸａの残存活性を基質分解程度で測定するようになる。この時に使用される基質はＦＸａの特異的基質であるＳ−２７６５であり、基質は分解されて４０５ｎｍで測定可能なｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｉｃ ｐＮＡを発生させる。上記測定方法はａｍｉｄｏｌｙｔｉｃ ａｓｓａｙを基盤にする。

各ＦＸａ、ＴＦＰＩ、ｍＡｂ２０２１、Ｓ−２７６５溶液を表２５を参考にしてアッセイバッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１５０ｎＭ ＮａＣｌ，１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ，０．０２％ＮａＮ_３，５ｍＭ ＣａＣｌ_２，ｐＨ７．４）を利用して希釈した溶液を１．５ｍｌチューブに準備した。

陽性対照群であるｍＡｂ２０２１抗体（ａｎｔｉ−ＴＦＰＩ Ａｂ，Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）と候補抗体を２０、１０、５、２．５ｎＭになるように各ウェル（ｗｅｌｌ）に５０μｌずつ添加した。４０ｎＭのＴＦＰＩ溶液を５０μｌずつ各ウェルに入れて３０分間常温で保持した。標準曲線を得るためにＦＸａ溶液を濃度別に各ウェルに５０μｌずつ入れて、２ｎＭのＦＸａ溶液を各ウェルに５０μｌずつ入れた後、３７℃で１０分間反応させた。２ｍＭのＳ−２７６５溶液を５０μｌずつ各ウェルに入れた後、３７℃で３０分間の反応後、マイクロプレート測定器（ｍｉｃｒｏｏｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）を利用して４０５ｎｍの波長でエンドポイントモード（ｅｎｄｐｏｉｎｔ ｍｏｄｅ）で結果分析を遂行した。

その結果、図２０に示したことのように、抗−ＴＦＰＩ抗体であるＭＧ１１１３候補抗体のうち、親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）抗体であるＮｏ．１０１５、１０２１、１０２３、３００７、３０１６、３０２４抗体の効力を確認した。上記抗体はすべて抗体処理濃度の依存的に吸光度が高まることを確認して濃度依存的にＴＦＰＩを抑制する効果が上昇することを確認した。そのうちＮｏ．１０１５抗体の場合、陽性対照群であるＴＦＰＩが処理されなかったサンプル対比２０ｎＭ処理したサンプルではＴＦＰＩを約８３％抑制する効果及び１０ｎＭ処理したサンプルでは約７１％抑制する効果を示した。また、Ｎｏ．１０２３抗体の場合、陽性対照群のサンプル対比２０ｎＭ処理サンプルでＴＦＰＩを約８６％抑制する効果、及び１０ｎＭ処理したサンプルではＴＦＰＩを約８４％抑制する効果を示した。処理されたＴＦＰＩの量が１０ｎＭであることを勘案して効果を比較した時、Ｎｏ．１０１５抗体よりＮｏ．１０２３抗体がＴＦＰＩ抑制能力が優秀であることを確認した。

また、図２１に示したことのように、抗−ＴＦＰＩ抗体であるＭＧ１１１３候補抗体のうち、親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）抗体であるＮｏ．３０３６、３１１５、３１２０、３１３１、４０１７、４１４１抗体の効力を確認した。上記抗体はすべて抗体処理濃度の依存的に吸光度が高まることを確認して濃度依存的にＴＦＰＩを抑制する効果が上昇することを確認した。そのうちＮｏ．４０１７抗体の場合、陽性対照群であるＴＦＰＩが処理されなかったサンプル対比２０ｎＭ処理したサンプルではＴＦＰＩを約９０％抑制する効果、及び１０ｎＭ処理したサンプルでは約７０％抑制する効果を示した。

また、図２２に示したことのように、抗−ＴＦＰＩ抗体であるＭＧ１１１３候補抗体のうち、親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）抗体であるＮｏ．１００１、１０２４、１１０４、１１２３抗体の効力を確認した。上記抗体はすべて抗体処理濃度の依存的に吸光度が高まることを確認して濃度依存的にＴＦＰＩを抑制する効果が上昇することを確認した。そのうちＮｏ．１１２３抗体の場合、陽性対照群であるＴＦＰＩが処理されなかったサンプル対比２０ｎＭ処理したサンプルではＴＦＰＩを約８８％抑制する効果、及び１０ｎＭ処理したサンプルでは約６９％抑制する効果を示した。

また、図２３に示したことのように、抗−ＴＦＰＩ抗体であるＭＧ１１１３候補抗体のうち、親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）抗体であるＡ２４、Ａ２５、Ａ５１、Ａ５２、Ａ６３、Ａ６７抗体の効力を確認した。上記抗体はすべて抗体処理濃度の依存的に吸光度が高まることを確認して濃度依存的にＴＦＰＩを抑制する効果が上昇することを確認した。そのうちＡ６７抗体の場合、陽性対照群であるＴＦＰＩが処理されなかったサンプル対比２０ｎＭ処理したサンプルではＴＦＰＩを約７９％抑制する効果、及び１０ｎＭ処理したサンプルでは約６７％抑制する効果を示した。

また、図２４に示したことのように、抗−ＴＦＰＩ抗体であるＭＧ１１１３候補抗体のうち、親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）抗体であるＮｏ．３２０３、３２４１、４２０６、４２０８抗体の効力を確認した。上記抗体はすべて抗体処理濃度の依存的に吸光度が高まることを確認して濃度依存的にＴＦＰＩを抑制する効果が上昇することを確認した。そのうちＮｏ．３２４１抗体の場合、陽性対照群であるＴＦＰＩが処理されなかったサンプル対比２０ｎＭ処理したサンプルではＴＦＰＩを約８２％抑制する効果を示し、１０ｎＭ処理したサンプルでは約８３％抑制する効果を示した。

また、図２５に示したことのように、抗−ＴＦＰＩ抗体であるＭＧ１１１３候補抗体のうち、親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）抗体であるＮｏ．１、２、３、７、８、１０抗体の効力を確認した。上記抗体はすべて抗体処理濃度の依存的に吸光度が高まることを確認して濃度依存的にＴＦＰＩを抑制する効果が上昇することを確認した。そのうちＮｏ．２抗体の場合、陽性対照群であるＴＦＰＩが処理されなかったサンプル対比２０ｎＭ処理したサンプルではＴＦＰＩを約７６％抑制する効果、及び１０ｎＭ処理したサンプルでは約７９％抑制する効果を示した。Ｎｏ．３抗体の場合、陽性対照群であるＴＦＰＩが処理されなかったサンプル対比２０ｎＭ処理したサンプルではＴＦＰＩを約８１％抑制する効果、及び１０ｎＭ処理したサンプルでは約７０％抑制する効果を示した。Ｎｏ．８抗体の場合、陽性対照群であるＴＦＰＩが処理されなかったサンプル対比２０ｎＭ処理したサンプルではＴＦＰＩを約８０％抑制する効果、及び１０ｎＭ処理したサンプルでは約６９％抑制する効果を示した。

また、図２６に示したことのように、抗−ＴＦＰＩ抗体であるＭＧ１１１３候補抗体のうち、親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）抗体であるＮｏ．１２１４、１２１６、１２２４、１２３４、１２３８、４２８７抗体の効力を確認した。上記抗体はすべて抗体処理濃度の依存的に吸光度が高まることを確認して濃度依存的にＴＦＰＩを抑制する効果が上昇することを確認した。そのうちＮｏ．１２１４抗体の場合、陽性対照群であるＴＦＰＩが処理されなかったサンプル対比２０ｎＭ処理したサンプルではＴＦＰＩを約７７％抑制する効果、及び１０ｎＭ処理したサンプルでは約６３％抑制する効果を示した。

また、図２７に示したことのように、抗−ＴＦＰＩ抗体であるＭＧ１１１３候補抗体のうち、親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）抗体であるＮｏ．１６、１９、２０、２１、２３抗体の効力を確認した。上記抗体はすべて抗体処理濃度の依存的に吸光度が高まることを確認して濃度依存的にＴＦＰＩを抑制する効果が上昇することを確認した。そのうちＮｏ．１６抗体の場合、陽性対照群であるＴＦＰＩが処理されなかったサンプル対比２０ｎＭ処理したサンプルではＴＦＰＩを約５５％抑制する効果、及び１０ｎＭ処理したサンプルでは約３４％抑制する効果を示した。

また、図２８に示したことのように、抗−ＴＦＰＩ抗体であるＭＧ１１１３候補抗体のうち、親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）抗体であるＮｏ．１１、１２、１３、１２０２抗体の効力を確認した。上記抗体はすべて抗体処理濃度の依存的に吸光度が高まることを確認して濃度依存的にＴＦＰＩを抑制する効果が上昇することを確認した。そのうちＮｏ．１１抗体の場合、陽性対照群であるＴＦＰＩが処理されなかったサンプル対比２０ｎＭ処理したサンプルではＴＦＰＩを約８９％抑制する効果、及び１０ｎＭ処理したサンプルでは約８１％抑制する効果を示した。Ｎｏ．１２抗体の場合、陽性対照群であるＴＦＰＩが処理されなかったサンプル対比２０ｎＭ処理したサンプルではＴＦＰＩを約８２％抑制する効果、及び１０ｎＭ処理したサンプルでは約８２％抑制する効果を示した。Ｎｏ．１３抗体の場合、陽性対照群であるＴＦＰＩが処理されなかったサンプル対比２０ｎＭ処理したサンプルではＴＦＰＩを約８５％抑制する効果、及び１０ｎＭ処理したサンプルでは約７６％抑制する効果を示した。Ｎｏ．１２０２抗体の場合、陽性対照群であるＴＦＰＩが処理されなかったサンプル対比２０ｎＭ処理したサンプルではＴＦＰＩを約８７％抑制する効果を示して、１０ｎＭ処理したサンプルでは約８２％抑制する効果を示した。

実施例１５：ＴＦ／ＦＶＩＩａ／ＦＸ複合体の測定
血液凝固の外因性機転で最も重要な因子としてはＴＦ（Ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ）、ＦＶＩＩ（Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ）、ＦＸ（Ｆａｃｔｏｒ Ｘ）などを言及することができる。外部の信号によりＴＦとＦＶＩＩａが複合体をなすと、ＦＸをＦＸａで活性化させるようになる。その次、ＦＸａがプロトロンビン（Ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ）をトロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎ）と活性化させ、これはフィブリノゲン（Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ）をフィブリン（ｆｉｂｒｉｎ）に変形させて血液凝固に作用する。しかしながら、ＴＦＰＩ（Ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）はＦＸａにバインディングして機能を抑制することによって、血液凝固作用を妨害する役割をする。上記経路過程での抗−ＴＦＰＩ抗体であるＭＧ１１１３の効果を評価するためにＴＦ／ＦＶＩＩａ／ＦＸａ複合体の試験を遂行した。ＴＦＰＩが抗−ＴＦＰＩ抗体であるＭＧ１１１３とともに、または独立的にある状況でＴＦ／ＦＶＩＩａの複合体によりＦＸａが生成されて抑制される程度をＦＸａで分解される基質（Ｓ２７６５）の発色程度を通じ、抗−ＴＦＰＩ抗体であるＭＧ１１１３の効果を確認した。即ち、抗−ＴＦＰＩ抗体であるＭＧ１１１３がＴＦＰＩを抑制する効果が大きいほど、ＦＸａの生成が多くなり、基質分解量が増えて吸光度が増加するようになる。

１．５ｍｌのチューブにアッセイバッファー（ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ）（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｎＭ ＮａＣｌ，１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ，０．０２％ＮａＮ_３、５ｍＭ ＣａＣｌ_２、ｐＨ７．４）を利用してＴＦ（４５００Ｌ／Ｂ，Ｓｅｋｉｓｕｉ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、ＦＶＩＩａ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｎｏｖｏ Ｓｅｖｅｎ）、及びＦＸ（ＰＰ００８Ａ，Ｈｙｐｈｅｎ ｂｉｏｍｅｄ）を表２６のような濃度になるように混合溶液を準備した。

混合溶液を９６ウェルプレート（ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）にウェル当たり７０μｌずつ分注した。ブランクのウェル（ｂｌａｎｋ ｗｅｌｌ）にはアッセイバッファー７０μｌを分注した。３７℃で１５分間反応させた後、ＴＦＰＩを各ウェルに５０ｎＭになるように３０μｌずつ分注した。ただし、ブランクのウェルと陽性対照群のウェル（抗−ＴＦＰＩ抗体であるＭＧ１１１３及びＴＦＰＩ未処理のサンプル）にはアッセイバッファーを３０μｌずつ分注した。抗−ＴＦＰＩ抗体であるＭＧ１１１３を１２．５、２５、５０及び１００ｎＭになるように各ウェルに３０μｌずつ分注した。ブランクのウェル、陽性対照群のウェル（抗−ＴＦＰＩ抗体及びＴＦＰＩの未処理のサンプル）、陰性対照群のウェル（抗−ＴＦＰＩ抗体であるＭＧ１１１３未処理サンプル）にはアッセイバッファーを３０μｌずつ分注した後、３７℃で１５分間反応させた。すべてのウェルにＥＤＴＡ（Ｅ７８８９，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を５０ｍＭになるように２０μｌずつ分注した。その次、すべてのウェルにＳ２７６５（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ，Ｓ−２７６５）を２００μＭになるように５０μｌずつ入れて、マイクロプレート測定器（ｍｉｃｒｏｏｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）を利用して３７℃で１０分間の間、反応させた後、４０５ｎｍで吸光度を測定した。

表２７はＴＦ／ＦＶＩＩａ／ＦＸ複合体の試験を通じて親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）抗−ＴＦＰＩ抗体であるＭＧ１１１３の効力評価の結果を数値化したものである。

表２８はＴＦ／ＦＶＩＩａ／ＦＸ複合体の試験を通じて親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）抗−ＴＦＰＩ抗体であるＭＧ１１１３の効力評価の結果を数値化したものである。

その結果、図２９、表１７及び表２８に示したことのように、抗−ＴＦＰＩ抗体であるＭＧ１１１３候補抗体のうち、親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）の抗体であるＮｏ．１０１５、１０２３、４０１７抗体の効力を確認した。抗体処理濃度の依存的に吸光度が高まることを確認して、候補抗体はすべて濃度依存的にＴＦＰＩを抑制する効果が上昇することを確認した。Ｎｏ．１０１５抗体の場合、陽性対照群であるＴＦＰＩが処理されなかったサンプル対比５０ｎＭ処理したサンプルではＴＦＰＩを１００％抑制する効果、及び２５ｎＭ処理したサンプルでは約２９．３％抑制する効果を示した。Ｎｏ．１０２３抗体の場合、陽性対照群のサンプル対比５０ｎＭ処理したサンプルでＴＦＰＩを１００％抑制する効果、及び２５ｎＭ処理したサンプルでは約８６．５％抑制する効果を示した。Ｎｏ．４０１７抗体の場合、陽性対照群のサンプル対比５０ｎＭ処理したサンプルでＴＦＰＩを１００％抑制する効果、及び２５ｎＭ処理したサンプルでは約３３．４％抑制する効果を示した。したがって、Ｎｏ．１０２３抗体がＴＦＰＩ抑制能力が最も優秀であることを確認した。

表２９はＴＦ／ＦＶＩＩａ／ＦＸ複合体の試験を通じて親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）の抗−ＴＦＰＩ抗体であるＭＧ１１１３の効力評価の結果を数値化したものである。

表３０はＴＦ／ＦＶＩＩａ／ＦＸ複合体の試験を通じて親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）の抗−ＴＦＰＩ抗体であるＭＧ１１１３の効力評価の結果を数値化したものである。

また、図３０、表２９及び表３０に示したことのように、上記試験を通じて効果が最も優れたＮｏ．１０２３とともに、また他の親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）の抗体であるＮｏ．１１２３とＡ６７抗体を評価した。抗体処理濃度の依存的に吸光度が高まることを確認して候補抗体すべて濃度依存的にＴＦＰＩを抑制する効果が上昇することを確認した。Ｎｏ．１０２３抗体の場合、陽性対照群であるＴＦＰＩが処理されなかったサンプル対比５０ｎＭ処理したサンプルではＴＦＰＩを約９４．８％抑制する効果、及び２５ｎＭ処理したサンプルでは約９６．６％抑制する効果を示した。Ｎｏ．１１２３抗体の場合、陽性対照群のサンプル対比５０ｎＭ処理したサンプルではＴＦＰＩを約８０．７％抑制する効果、及び２５ｎＭ処理したサンプルは２８．５％抑制する効果を示した。Ａ６７抗体の場合、陽性対照群のサンプル対比５０ｎＭ処理したサンプルではＴＦＰＩを９３．７％抑制する効果、及び２５ｎＭ処理したサンプルでは約９５．８％抑制する効果を示した。したがって、Ｎｏ．１０２３抗体とＡ６７抗体がＴＦＰＩ抑制能力が類似であることを確認した。

表３１はＴＦ／ＦＶＩＩａ／ＦＸ複合体の試験を通じて親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）の抗−ＴＦＰＩ抗体であるＭＧ１１１３の効力評価の結果を数値化したものである。

表３２はＴＦ／ＦＶＩＩａ／ＦＸ複合体の試験を通じて親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）の抗−ＴＦＰＩ抗体であるＭＧ１１１３の効力評価の結果を数値化したものである。

また、図３１、表３１及び表３２に示したことのように、上記試験を通じて効果が最も優れたＮｏ．１０２３とＡ６７及び親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）の追加候補抗体であるＮｏ．３２０３とＮｏ．３２４１の抗体を評価した。抗体処理濃度の依存的に吸光度が高まることを確認して候補抗体すべて濃度依存的にＴＦＰＩを抑制する効果が上昇することを確認した。Ｎｏ．１０２３抗体の場合、陽性対照群であるＴＦＰＩが処理されなかったサンプル対比５０ｎＭ処理したサンプルではＴＦＰＩを１００％抑制する効果、及び２５ｎＭ処理したサンプルでは約９９．８％抑制する効果を示した。Ａ６７抗体の場合、陽性対照群のサンプル対比５０ｎＭ処理したサンプルはＴＦＰＩを１００％抑制する効果、及び２５ｎＭ処理したサンプルでは約９９．２％抑制する効果を示した。Ｎｏ．３２０３抗体の場合、陽性対照群のサンプル対比５０ｎＭ処理したサンプルはＴＦＰＩを１００％抑制する効果、及び２５ｎＭ処理したサンプルでは約４６．３％抑制する効果を示した。Ｎｏ．３２４１抗体の場合、陽性対照群のサンプル対比５０ｎＭ処理したサンプルではＴＦＰＩを１００％抑制する効果、及び２５ｎＭ処理サンプルでは約９９．６％抑制する効果を示した。したがって、Ｎｏ．１０２３抗体とＡ６７抗体及びＮｏ．３２４１抗体がＴＦＰＩの抑制能力が類似していることを確認した。

表３３はＴＦ／ＦＶＩＩａ／ＦＸ複合体の試験を通じて親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）の抗−ＴＦＰＩ抗体であるＭＧ１１１３の効力評価の結果を数値化したものである。

表３４はＴＦ／ＦＶＩＩａ／ＦＸ複合体の試験を通じて親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）の抗−ＴＦＰＩ抗体であるＭＧ１１１３の効力評価の結果を数値化したものである。

また、図３２、表３３及び表３４に示したことのように、反応速度を落として候補抗体間の効力の確認のための解像度を高めるため、ＦＸの処理濃度を１７ｎＭから５ｎＭの水準に変更した。上記試験を通じて選別されたＮｏ．１０２３抗体と親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）の追加候補抗体であるＮｏ．２、３、８抗体を評価した。抗体処理濃度の依存的に吸光度が高まることを確認して候補抗体すべて濃度依存的にＴＦＰＩを抑制する効果が上昇することを確認した。Ｎｏ．１０２３抗体の場合、陽性対照群であるＴＦＰＩが処理されなかったサンプル対比５０ｎＭ処理したサンプルではＴＦＰＩを約８０．５％抑制する効果、及び２５ｎＭ処理したサンプルでは約２６．６％抑制する効果を示した。Ｎｏ．２抗体の場合、陽性対照群のサンプル対比５０ｎＭ処理したサンプルではＴＦＰＩを約９０．９％抑制する効果、及び２５ｎＭ処理したサンプルでは約５１．４％抑制する効果を示した。Ｎｏ．３抗体の場合、陽性対照群のサンプル対比５０ｎＭ処理したサンプルではＴＦＰＩを約９１．８％抑制する効果、及び２５ｎＭ処理したサンプルでは約６５．１％抑制する効果を示した。Ｎｏ．８抗体の場合、陽性対照群のサンプル対比５０ｎＭ処理したサンプルではＴＦＰＩを約８３．２％抑制する効果、及び２５ｎＭ処理したサンプルでは約４８．３％抑制する効果を示した。

表３５はＴＦ／ＦＶＩＩａ／ＦＸ複合体の試験を通じて親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）の抗−ＴＦＰＩ抗体であるＭＧ１１１３の効力評価の結果を数値化したものである。

表３６はＴＦ／ＦＶＩＩａ／ＦＸ複合体の試験を通じて親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）の抗−ＴＦＰＩ抗体であるＭＧ１１１３の効力評価の結果を数値化したものである。

また、図３３、表３５及び表３６に示したことのように、Ｎｏ．１０２３抗体と親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）の追加候補抗体であるＮｏ．１２、１３、１２０２抗体を評価した。抗体処理濃度の依存的に吸光度が高まることを確認して候補抗体すべて濃度依存的にＴＦＰＩを抑制する効果が上昇することを確認した。Ｎｏ．１０２３抗体の場合、陽性対照群であるＴＦＰＩが処理されなかったサンプル対比５０ｎＭ処理したサンプルではＴＦＰＩを約８０．３％抑制する効果、及び２５ｎＭ処理したサンプルでは約４３．７％抑制する効果を示した。Ｎｏ．１２抗体の場合、陽性対照群のサンプル対比５０ｎＭ処理したサンプルでＴＦＰＩを約９４．６％抑制する効果、及び２５ｎＭ処理したサンプルでは約５７．７％抑制する効果を示した。Ｎｏ．１３抗体の場合、陽性対照群のサンプル対比５０ｎＭ処理したサンプルではＴＦＰＩを約９６．５％抑制する効果、及び２５ｎＭ処理したサンプルでは約６２．２％抑制する効果を示した。Ｎｏ．１２０２抗体の場合、陽性対照群のサンプル対比５０ｎＭ処理したサンプルではＴＦＰＩを約９９．４％抑制する効果、及び２５ｎＭ処理したサンプルでは約６０．０％抑制する効果を示した。

実施例１６：トロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎ）生成量の測定
血液凝固の機転は内因性経路（Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｐａｔｈｗａｙ）と外因性経路（Ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ ｐａｔｈｗａｙ）に分けられる。ＴＦ（Ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ）による外因性経路の最も重要な役割は、血液凝固の機転で活性フィードバックの役割として非常に重要なトロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎ）の爆発的生成であり、非常に早く生成されることで知られている。この機転で最も重要な因子としてはＴＦ、ＦＶＩＩ、ＦＸなどを言及することができる。外部信号によりＴＦとＦＶＩＩａが複合体をなすと、ＦＸをＦＸａで活性化させるようになる。その次、ＦＸａがプロトロンビン（Ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ）をトロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎ）に活性化させ、これはフィブリノーゲン（ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ）をフィブリン（ｆｉｂｒｉｎ）に変形させて血液凝固に作用する。しかしながら、ＴＦＰＩはＦＸａにバインディングしてＦＸａの機能を抑制することで、血液凝固の作用を妨害する役割をする。トロンビン生成量の測定試験は血漿に評価しようとする試料を処理した後、活性剤（ＰＰＰ試薬、ＰＰＰ−Ｒｅａｇｅｎｔ Ｌｏｗ ｒｅａｇｅｎｔ）が存在する状況で、生成されるトロンビンが蛍光基質（ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を蛍光物質に変換させることでこれを基盤に蛍光物質の量で生成されるトロンビンの量を検証するが、キャリブレータ（Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ）という既知しているトロンビンの量で補正することによって、実際生成される量を測定する方式である。

予熱された９６ウェルプレート（ｒｏｕｎｄ ｂｏｔｔｏｍ ｉｍｍｕｌｏｎ ２ＨＢ ９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）にサンプルローディングのウェルにはＰＰＰ試薬（ＰＰＰ−Ｒｅａｇｅｎｔ Ｌｏｗ溶液）２０μｌ、キャリブレータ（Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ）のウェルにはキャリブレータ（Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ）溶液２０μｌを入れて、抗−ＴＦＰＩ候補抗体を予め溶解された試料希釈液（ＦＶＩＩＩ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｐｌａｓｍａ）で０．３１２５、０．６２５、１．２５または２．５ｎＭの濃度で希釈して準備した後、ＴＦＰＩと抗−ＴＦＰＩ候補抗体が結合することができるように常温で１０分間処理した。

キャリブレータ（Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ）とブランクのウェルには試料の希釈液（ＦＶＩＩＩ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｐｌａｓｍａ）を、残りのウェルには希釈された検液を８０μｌずつそれぞれ入れる。Ｓｏｆｔｗａｒｅ画面の下段部のスタートボタンを押すと、洗浄が先に実行される。ウォーターバス（Ｗａｔｅｒ ｂａｔｈ）で３７℃に加温させておいた蒸留水に注入チューブ（ｉｎｌｅｔ ｔｕｂｅ）を入れて、排出チューブ（ｏｕｔｌｅｔ ｔｕｂｅ）は空いた容器に入れて洗浄を行う。洗浄が終わると、次のボタン（ｎｅｘｔ ｂｕｔｔｏｎ）を押してエンプティ（ｅｍｐｔｙ）の過程を経る。３７℃で加温させておいたＦｌｕＣａ溶液に注入チューブを入れてプライム（ｐｒｉｍｅ）して溶液を満たす。排出チューブをディスペンサー（ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ）にあるＭホールに装着し、次のボタンを押下すると、各ウェルごとにＦｌｕＣａ溶液が自動に２０μｌずつ分注された後シェーキングの過程を経て分析が始まる。

その結果、図３４に示したことのように、上記ＦＸａの活性測定試験及びＴＦ／ＦＶＩＩａ／ＦＸａ複合体の試験を通じて選別された親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）の抗体候補のうち、Ｎｏ．１０２３抗体に対してＴ４１７キメラ抗体を利用してトロンビン生成量の測定比較試験を遂行した。試料希釈液のみ処理したブランク（ｂｌａｎｋ）に比べて、２．５ｎＭの場合、Ｔ４１７抗体は約３３５％、Ｎｏ．１０２３抗体の場合は約４０１％高いトロンビンピーク（ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｐｅａｋ）値を示した。また、トロンビンの総生成量を示すＥＴＰの場合にも、陰性対照群（抗体不在）対比２．５ｎＭ処理したサンプルでＴ４１７抗体の場合は約２９３％、Ｎｏ．１０２３抗体の場合は約３０９％に増加する様相を示した。二つの抗体を比較すると親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）で導出されたＮｏ．１０２３抗体がＴ４１７抗体よりもっと效力がいいことを確認した。

本発明によるＴＦＰＩに特異的に結合する抗体はＴＦＰＩを遮断し、血液凝固の外因性経路を活性化させることができるので、抗体発生の血友病患者の治療と血友病−Ａまたは血友病−Ｂ患者の血液凝固疾患の予防に有用に使用されることができる。

以上で本発明内容の特定した部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有した者において、このような具体的技術はただ好ましい実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることではないことは明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は添付された請求項とそれらの等価物によって定義されると言える。

上記の目的を達成するために、本発明は配列番号３９で表示されるＴＦＰＩ（Ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）に特異的に結合する抗体を提供する。

本発明による抗体は、例えば、表２０及び表２３に記述された重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１、２及び３配列と軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲ１、２及び３配列は構造的に類似した重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）配列が混合されて重鎖（ＶＨ）／軽鎖（ＶＬ）組のＣＤＲ１、２及び３に配置されて形成されることができる。

本発明のまた他の実施例ではヒトＴＦＰＩに結合するヒト重鎖可変領域（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）と軽鎖可変領域（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）の遺伝子を把握した後、重鎖可変領域の遺伝子はヒト免疫グロブリンタイプ４の重鎖不変領域（ＩｇＧ４ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ）の遺伝子と連結して、軽鎖可変領域の遺伝子はヒト軽鎖不変領域（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ）と連結した後、これらを各々動物細胞用のタンパク質発現ベクターに挿入してベクターを製作した後、これらをＥｘｐｉ２９３細胞株に形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）して培養して抗体を生産した後、これをプロテインＡ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）で精製して抗体を製造した（実施例１１及び実施例１２）。

本発明のまた他の実施例では、抗−ＴＦＰＩ抗体の効果を評価するためにＦＸａの活性測定試験を遂行した（実施例１４）。その結果、図２０−２８に示したことのように、抗−ＴＦＰＩ候補抗体のうち、親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）による抗体の効力を確認した。上記抗体はすべて抗体処理濃度の依存的に吸光度が高まることを確認して濃度依存的にＴＦＰＩを抑制する効果が上昇することを確認した。

本発明のまた一つの実施例では、抗−ＴＦＰＩ抗体の効果を評価するためにＴＦ／ＦＶＩＩａ／ＦＸａ複合体の試験を遂行した（実施例１５）。すなわち、ＴＦＰＩが抗−ＴＦＰＩ抗体とともに、または独立的にある状況でＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体によりＦＸａが生成されて抑制される程度をＦＸａの活性程度で評価した。その結果、図２９〜図３３及び表２７〜表３６に示したことのように、抗−ＴＦＰＩ抗体であるＭＧ１１１３候補抗体のうち、親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）による抗体の効力を確認した。その結果、抗体処理濃度の依存的に吸光度が高まることを確認して候補抗体はすべて濃度依存的にＴＦＰＩを抑制する効果が上昇することを確認した。

その結果、表２２に示したことのように、ヒトＴＦＰＩに特異的に結合するクローンを選別することができ、これらのアミノ酸配列を確認した。先出願された大韓民国出願特許１０−２０１５−００２６５５５に記載された抗体中、本発明で使用された抗体は‘２０１５−２６５５５＿（先出員配列番号）’に記載した。

Claims (16)

1. 配列番号３９で表示されるＴＦＰＩ（Ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）に特異的に結合する抗体。
2. 以下の重鎖ＣＤＲを含む重鎖可変領域を含有することを特徴とする請求項１に記載の抗体：
   配列番号１４９、１５７、１６３、１７２、１８１、１８２、１８３、１８８、２０１または２０３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；
   配列番号１５０、１５５、１５９、１６２、１６５、１６６、１６７、１６８、１７３、１８４、１８６、１８７または２０２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；及び
   配列番号１５１、１５６、１７０、１７４、１７５または１８５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３。
3. 以下の軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含有することを特徴とする請求項１に記載の抗体：
   配列番号１５２、１５８、１６０、１６９、１７１、１７６、１７７または１７８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；
   配列番号１５３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；及び
   配列番号１５４、１６１、１６４、１７９または１８０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３。
4. 配列番号９５、９７、９８、９９、１００、１０２、１０４、１０５、１０７、１０９、１１０、１１２、１１３、１１４、１１５、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４８、１９５、１９７、１９８、１９９または２００のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有する配列を含む重鎖可変領域を含有することを特徴とする請求項１に記載の抗体。
5. 配列番号９６、１０１、１０３、１０６、１０８、１１１、１１６、１２２、１３０、１３９、１４０、１４７または１９６のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含有することを特徴とする請求項１に記載の抗体。
6. 配列番号９５、９７、９８、９９、１００、１０２、１０４、１０５、１０７、１０９、１１０、１１２、１１３、１１４、１１５、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４８、１９５、１９７、１９８、１９９または２００の重鎖可変領域及び配列番号９６、１０１、１０３、１０６、１０８、１１１、１１６、１２２、１３０、１３９、１４０、１４７または１９６の軽鎖可変領域を含有することを特徴とする請求項１に記載の抗体。
7. 以下の重鎖ＣＤＲを含む重鎖可変領域を含有することを特徴とする請求項１に記載の抗体：
   配列番号５、１１または２３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；
   配列番号６、１２、２６または２７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；及び
   配列番号７または１３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３。
8. 以下の軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含有することを特徴とする請求項１に記載の抗体：
   配列番号８または１４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；
   配列番号９または１５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；及び
   配列番号１０または１６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３。
9. 配列番号１、３、２１、２４または２５のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有する配列を含む重鎖可変領域を含有することを特徴とする請求項１に記載の抗体。
10. 配列番号２、４または２２のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含有することを特徴とする請求項１に記載の抗体。
11. 配列番号１、３、２１、２４または２５の重鎖可変領域及び配列番号２、４または２２の軽鎖可変領域を含有することを特徴とする請求項１に記載の抗体。
12. 請求項１〜１０の何れか１項に記載の抗体をコードする核酸。
13. 請求項１２に記載の核酸を含むベクター。
14. 請求項１３に記載のベクターを含む宿主細胞。
15. 請求項１４に記載の宿主細胞を培養して抗体を発現させる段階を含む請求項１〜１０の中何れか１項に記載の抗体の製造方法。
16. 請求項１〜１０の何れか１項に記載の抗体を有効成分として含む血友病治療用の医薬組成物。

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