KR20220116506A - 다중-특이적 항체 - Google Patents

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KR20220116506A
KR20220116506A KR1020227024452A KR20227024452A KR20220116506A KR 20220116506 A KR20220116506 A KR 20220116506A KR 1020227024452 A KR1020227024452 A KR 1020227024452A KR 20227024452 A KR20227024452 A KR 20227024452A KR 20220116506 A KR20220116506 A KR 20220116506A
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protein
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specific antibody
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dsscfv
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KR1020227024452A
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에밀리 메리 카이리스틴 배리
엠마 데이브
샘 필립 헤이우드
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유씨비 바이오파마 에스알엘
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Abstract

본원 개시내용은:
a) 화학식 (I)의 폴리펩타이드 쇄: VH-CH1-(CH2)-(CH3)-(X)-(V1); 및
b) 화학식 (II)의 폴리펩타이드 쇄: (V3)-(Z) -VL-CL-(Y)-(V2)
를 포함하거나 이로 이루어진 다중-특이적 항체에 관한 것이고,
여기서, 화학식 (II)의 폴리펩타이드 쇄는 적어도 하나의 dsscFv, dsFv, scFv, VH 또는 VHH를 포함하고, 화학식 (I)의 폴리펩타이드 쇄는 단백질 A 결합 도메인을 포함하고, 화학식 (II)의 폴리펩타이드 쇄는 단백질 A에 결합하지 않는다. 본원 개시내용은 또한 상기 다중-특이적 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제공하고, 벡터는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 숙주 세포는 상기 벡터 및/또는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본원 개시내용은 또한 예를 들면, 치료에 사용하기 위해 상기한 다중-특이적 항체를 포함하는 약제학적 제형을 제공한다. 또한 숙주 세포로부터 본원 개시내용의 다중-특이적 항체를 발현하는 방법을 제공한다.

Description

다중-특이적 항체
발명의 분야
본원 개시내용은 다중-특이적 항체, 이를 포함하는 제형, 상기 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 및 상기 벡터 및/또는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 본원 개시내용은 또한 다중-특이적 항체 및 제형의 요법에서의 용도에 관한 것이다. 본원 개시내용은 다중-특이적 항체를, 예를 들면, 숙주 세포에서 발현하는 방법으로 연장되고, 다중-특이적 항체를 정제하는 방법으로 연장되고, 상기 방법은 단백질 A 정제 단계를 포함한다.
발명의 배경
다중-특이적, 특히 이중-특이적 항체를 생성하는 다수의 접근법이 있다. 모리슨 등[참조: Morrison et al (Coloma and Morrison 1997, Nat Biotechnol. 15, 159-163)]은 단일 쇄 가변 단편 (scFv)의 전체 항체, 예를 들면, IgG로의 융합을 기술한다. 숀얀스 등(참조: Schoonjans et al., 2000, Journal of Immunology, 165, 7050-7057)은, scFv의 항체 Fab 단편으로의 융합을 기술한다. WO2015/197772는 디설파이드 안정화된 scFv (dsscFv)의 Fab 단편으로의 융합을 기술한다.
선행기술에 기술된 표준 접근법은 적어도 2개의 폴리펩타이드의 숙주 세포에서 발현을 포함하고, 상기 각각의 폴리펩타이드는, 항체의 추가 항원 결합 단편이 중쇄 및/또는 경쇄의 N- 및/또는 C- 말단 위치에 융합될 수 있는, 전체 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예를 들면, Fab의 중쇄 (HC) 또는 경쇄 (LC)에 대해 코딩된다. 2개의 (부속된(appended) Fab를 형성하는 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄) 또는 4개의 폴리펩타이드 (부속된 IgG를 형성하는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄)를 발현하여 이러한 다중-특이적 항체를 재조합으로 제조하려는 시도에서, 이의 상응하는 경쇄와의 어셈블리에서 중쇄의 적절한 폴딩을 보장하기 위해 보통 중쇄보다 과량인 경쇄를 발현하는 것이 요구된다. 특히, CH1 (중쇄 불변 영역의 도메인 1)은, 상응하는 LC에 의해 전위될 수 있는, BIP 단백질에 의해 자체로 폴딩을 방지하고; 따라서, CH1/HC의 올바른 폴딩은 이의 상응하는 LC의 이용가능성에 좌우된다 (참조: Lee et al., 1999, Molecular Biology of the Cell, Vol. 10, 2209-2219).
본 발명자들은 다중-특이적 항체를 발현하는 방법이 숙주 세포 수확물에서 유지되는 중쇄 보다 과량인 경쇄의 제조를 야기할 수 있고, 과량의 경쇄가, 목적하는 다중-특이적 항체, 특히 단량체를 사용한 제조 방법의 부산물로서 존재하고 이에 따라 정제 제거될 필요가 있는, 이량체성 복합물 (또는 "LC 이량체")를 형성하는 경향이 있다는 것을 관찰하였다.
중요하게는, 추가 항원 결합 단편(들)에 N- 및/또는 C-말단 상 융합되는 경우, 경쇄의 이량체의 형성에 관련된 기술적 문제는, 어느 정도까지 확인되지 않고, 공통으로 사용되는 분석 방법으로는 제조 방법의 불균질 생성물 중에서 이들 부속된 LC 이량체의 검출 및 정량화가 블가능하다. 이는 표준 분석 방법을 사용하여 생성물의 양을 추정하는 경우 상당한 편견(bias)을 야기할 수 있다.
따라서, 제조 방법의 가장 이른 단계에서 부속된 LC 이량체를 용이하고 효율적으로 단리하고 제거할 수 있고, 이에 따라 요법에서 사용하기 위한 특히 이의 단량체 형태의 다중-특이적 항체인 관심 대상 단백질의 수율을 개선하는 다중-특이적 항체 및 이의 제조 방법을 개선할 필요성이 있다.
발명의 요지
본 발명자들은 단백질 A 친화도 크로마토그래피를 포함하는 정제 후, 특히 1-단계 정제 후 수득된 "다중-특이적 항체" 물질, 특히 단량체의 수율을 증가시키면서 동등한 기능성 및 안정성을 갖는 개선된 다중-특이적 항체를 제공하기 위해 관련 다중-특이적 항체를 재-조작하였다.
따라서, 하나의 양상에서, 화학식 (I)의 폴리펩타이드 쇄 및 화학식 (II)의 폴리펩타이드 쇄를 포함하거나 이들로 이루어진 다중-특이적 항체를 제공한다:
화학식 (I)의 폴리펩타이드 쇄:
VH-CH1-(CH2) s -(CH3) t -X-(V1) p ; 및
화학식 (II)의 폴리펩타이드 쇄:
(V3) r -Z-VL-C L -Y-(V2) q ;
상기 화학식에서:
VH는 중쇄 가변 도메인을 나타내고;
CH1은 중쇄 불변 영역의 도메인 1을 나타내고;
CH2는 중쇄 불변 영역의 도메인 2를 나타내고;
CH3은 중쇄 불변 영역의 도메인 3을 나타내고;
X는 결합 또는 링커를 나타내고;
V1은 dsscFv, dsFv, scFv, VH, VL 또는 VHH를 나타내고;
V3은 dsscFv, dsFv, scFv, VH, VL 또는 VHH를 나타내고;
Z는 결합 또는 링커를 나타내고;
VL은 경쇄 가변 도메인을 나타내고;
CL은 C카파와 같은 경쇄 불변 영역으로부터의 도메인을 나타내고;
Y는 결합 또는 링커를 나타내고;
V2는 dsscFv, dsFv, scFv, VH, VL 또는 VHH를 나타내고;
p는 0 또는 1을 나타내고;
q는 0 또는 1을 나타내고;
r은 0 또는 1을 나타내고;
s는 0 또는 1을 나타내고;
t는 0 또는 1을 나타내고;
여기서, p가 0인 경우, X는 부재하고, q가 0인 경우, Y는 부재하고, r이 0인 경우, Z는 부재하고;
q가 0인 경우, r은 1이고, r이 0인 경우, q는 1이고;
화학식 (II)의 폴리펩타이드 쇄는 적어도 하나의 dsscFv, dsFv, scFv, VH, 또는 VHH를 포함하고;
화학식 (I)의 폴리펩타이드 쇄는 단백질 A 결합 도메인을 포함하고;
화학식 (II)의 폴리펩타이드 쇄는 단백질 A에 결합하지 않는다.
유리하게는, 본원 개시내용의 다중-특이적 항체는, 특히 개선된 방법이 산업 규모에서 비용 및 시간 효율적인 더 적은 단계를 포함한다는 점에서 선행기술에 통상 사용되는 방법을 넘어서서 개선된 정제 방법으로 보다 효율적으로 정제될 수 있다. 특히, 본원 개시내용의 다중-특이적 항체는, 관심 대상 다중-특이적 항체의 정제 및 부속된 LC 이량체의 제거가 동시에 발생하는, 단백질 A 친화도 크로마토그래피를 포함하는 1-단계 정제 방법 후 수득되는 관심 대상 단백질 (즉, 올바른 다중-특이적 항체 포맷)의 양을 최대화한다. 유리하게는, 본원 개시내용의 다중-특이적 항체의 제조 및 정제 방법은 과량의 유리, 결합되지 않은 경쇄, 특히 부속된 LC 이량체를 포획하기 위해 추가 정제 단계를 요구하지 않는다.
발명의 상세한 설명
본원 개시내용의 정황에서 사용하기 위한 항체는 전체 항체 및 기능성으로 활성인 이의 단편 (즉, 또한 항원-결합 단편으로 칭명되는 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 분자). 본원에 기재된 항체에 대한 특징은 또한, 달리 기재되지 않는 한, 항체 단편에 적용된다. 항체는 모노클로날, 다-가, 다중-특이적, 이중특이적, 완전 사람, 사람화 또는 키메라일 수 있다 (또는 이로부터 유도될 수 있다).
또한 "면역글로불린 (Ig)"으로 공지된 전체 항체는 일반적으로, 즉, 고유의 Y-형 3-차원 구조를 한정하기 위해 어셈블리되는, 디설파이드 결합에 의해 상호-연결된 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄의 구성원을 포함하는 비손상 또는 전체-길이 항체에 관한 것이다. 전형적인 천연 전체 항체는 하나의 항원 유형에 결합한다는 점에서 단일특이적이고, 2개의 독립적인 항원 결합 도메인을 갖는다는 점에서 2가이다. 용어 "비손상 항체", "전체-길이 항체" 및 "전체 항체"는 본원에 정의된 Fc 영역을 포함하는 네이티브 항체 구조와 유사한 구조를 갖는 단일특이적 2가 항체를 언급하기 위해 상호교환가능하게 사용할 수 있다.
각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에 VL로서 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역 (CL)으로 구성된다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에 VH로서 약칭됨) 및 Ig 부류에 좌우되어 3개의 불변 도메인 CH1, CH2 및 CH3, 또는 4개의 불변 도메인 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 구성된 중쇄 불변 영역 (CH)으로 구성된다. Ig 또는 항체의 "부류"는 불변 영역의 유형을 언급하고, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM을 포함하고, 이들 중 수개는 추가로 하위부류, 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4로 나누어질 수 있다. 항체의 불변 영역은, 면역글로불린이, 면역체계의 다양한 세포 (예를 들면, 이펙터 세포) 및 전형적인 보체계의 첫번째 성분 (Clq)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 결합하는 것을 매개할 수 있다.
본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 VH 및 VL 영역은 추가로, 프레임워크 영역 (FR)으로 칭명되는 구조적으로 보다 보존적인 영역과 함께 산재된, 상보성 결정 영역 (CDR)으로 칭명되는 항원의 인식을 결정하는 초가변의 영역 (또는 "초가변 영역")으로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단에서부터 카복시-말단으로 하기 순서로 배열된 3개의 CDRs 및 4개의 FRs로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. CDRs 및 FR은 함께 가변 영역을 형성한다. 관례상, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄 가변 영역에서 CDRs는 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3으로서 언급되고, 경쇄 가변 영역에서 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3으로서 언급된다. 이들은 각각의 쇄의 N-말단에서 C-말단 방향으로 순차적으로 번호매김된다.
CDRs은 통상 카바트(Kabat) 등에 의해 고안된 시스템에 따라서 번호매김된다. 이러한 시스템은 문헌에 기재되어 있다 [참조: Kabat et al., 1991, in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA (이후 "Kabat et al. (상기함)")]. 이러한 번호매김 시스템은 달리 지시하지 경우를 제외하고는 본 발명의 명세서에서 사용된다. 카바트 잔기 지정은 항상 아미노산 잔기의 선형 번호매김과 직접적으로 상응하지 않는다. 실제 선형 아미노산 서열은, 염기성 가변 도메인 구조의 프레임워크 또는 상보성 결정 영역 (CDR)인지에 상관없이, 구조적 성분의 생략, 또는 구조적 성분 내로 삽입에 상응하는 엄격한 카바트 번호매김에서 보다 더 소수의 또는 추가의 아미노산을 포함할 수 있다. 잔기의 올바른 카바트 번호매김은 제공된 항체에 대해 "표준" 카바트 번호매김된 서열을 사용한 항체의 서열에서 상동성 잔기의 정렬에 의해 결정할 수 있다.
중쇄 가변 도메인의 CDRs은 카바트 번호매김 시스템에 따라서 잔기 31-35 (CDR-H1), 잔기 50-65 (CDR-H2) 및 잔기 95-102 (CDR-H3)에 위치한다. 그러나, 코티아(Chothia) (참조: Chothia, C. and Lesk, A.M. J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987))에 따르면, CDR-H1과 동등한 루프는 잔기 26에서 잔기 32로 확장된다. 따라서, 달리 지시되지 않는 한, 본원에 이용되는 'CDR-H1'은 카바트 번호매김 시스템 및 코티아(Chothia)의 위상 루프 정의의 조합에 의해 기재된 바와 같이 잔기 26 내지 35를 언급하는 것을 의도한다. 경쇄 가변 도메인의 CDRs은 카바트 번호매김 시스템에 따라 잔기 24-34 (CDR-L1), 잔기 50-56 (CDR-L2) 및 잔기 89-97 (CDR-L3)에 위치한다. 면역글로불린 부류의 상이한 구성원의 서열의 정렬을 기초로 하여, 번호매김 계획이 제안되고, 예를 들면, 문헌에 기재되어 있다 [참조: Kabat et al., 1991, and Dondelinger et al., 2018, Frontiers in Immunology, Vol 9, article 2278].
사람 면역글로불린 VH 유전자자리는 뉴클레오티드 서열을 기초로 하여 나누어질 수 있는 6개의 주요 부류를 나타낸다. 이로부터 유도된 부류 및 VH 도메인은 일반적으로 VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6으로서 언급된다.
본원에 사용된 용어 "불변 도메인(들)", "불변 영역"은 가변 영역 밖에 있는 항체의 도메인(들)을 언급하기 위해 상호교환가능하게 사용한다. 불변 도메인은 동일한 이소형의 모든 항체와 동일하지만, 하나의 이소형은 다른 것과 상이하다. 전형적으로, 중쇄의 불변 영역은 N에서 C 말단으로, 3 또는 4개의 불변 도메인을 포함하는 CH1-힌지 -CH2-CH3-임의의 CH4에 의해 형성된다.
본 발명의 항체 분자의 불변 영역 도메인은, 존재하는 경우, 항체 분자의 제안된 기능, 및 특히 요구될 수 있는 이펙터 기능에 관련한 기능을 갖도록 선택될 수 있다. 예를 들면, 불변 영역 도메인은 사람 IgG1, IgG2 또는 IgG4 도메인일 수 있다. 특히, 사람 IgG 불변 영역 도메인을 사용할 수 있고, 항체 분자가 치료학적 용도를 의도하고, 항체 이펙터 기능을 필요로 하는 경우, 특히 IgG1 이소형을 사용할 수 있다. 대안적으로, IgG2 및 IgG4 이소형은 항체 분자가 치료학적 목적을 의도하고, 항체 이펙터 기능이 필요하지 않는 경우 사용할 수 있다. 이들 불변 영역 도메인의 서열 변종이 사용될 수 있음을 인지할 것이다. 예를 들면, 위치 241 (카바트 번호매김 시스템)에서 세린이 앤갤(Angal) 등에 의해 문헌 (참조: Angal et al., 1993. A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human (IgG4) antibody as observed during SDS-PAGE analysis Mol Immunol 30, 105-108)에 기재된 바와 같이 프롤린으로 변화된 IgG4 분자 및, 본원에 언급된 IgG4P를 사용할 수 있다.
"Fc", "Fc 단편", "Fc 영역"은 첫번째 불변 영역 도메인을 제외한 항체의 불변 영역을 포함하는 항체의 C-말단 영역을 언급하기 위해 상호교환가능하게 사용한다. 따라서, Fc는 IgA, IgD, 및 IgG의 마지막 2개의 불변 도메인, CH2 및 CH3, 또는 IgE 및 IgM의 마지막 3개의 불변 도메인, 및 이들 도메인에 대한 유연한 힌지 N-말단을 언급한다. 사람 IgG1 중쇄 Fc 영역은 잔기 C226을 이의 카복실-말단에 포함하기 위해 본원에 한정되고, 여기서, 번호매김은 카바트에서와 같이 EU 인덱스에 따른다. 사람 IgG1의 정황에서, 카바트에서와 같이 EU 인덱스에 따라서 더 낮은 힌지는 위치 226-236을 언급하고, CH2 도메인은 위치 237-340를 언급하고, CH3 도메인은 위치 341-447를 언급한다. 다른 면역글로불린의 상응하는 Fc 영역은 서열 정렬에 의해 확인될 수 있다.
본원에 기재된 항체는 단리되어 있다. "단리된" 항체는 (예를 들면, 정제 수단에 의해) 이의 천연 환경의 성분으로부터 분리한 것이다.
본원에 이용된 "다중-특이적 항체"는 적어도 2개의 항원 결합 도메인, 즉, 2개 이상의 항원 결합 도메인, 예를 들면, 2개 또는 3개의 항원 결합 도메인을 갖는 본원에 기재된 항체를 언급하고, 여기서, 적어도 2개의 항원 결합 도메인은 독립적으로 2개의 상이한 항원 또는 동일한 항원 상 2개의 상이한 에피토프에 결합한다. 다중-특이적 항체는 각각의 특이성 (항원)에 대해 1가일 수 있다. 본원에 기재된 다중-특이적 항체는 1가 및 다가, 예를 들면, 2가, 3가, 4가 다중-특이적 항체, 뿐만 아니라 상이한 에피토프에 대해 상이한 원자가를 갖는 다중-특이적 항체를 포함한다 (예를 들면, 첫번째 항원 특이성에 대해 1가이고 첫번째 것과 상이한 두번째 항원 특이성에 대해 2가인 다중-특이적 항체).
하나의 실시형태에서, 다중-특이적 항체는 이중-특이적 항체이다.
본원에 이용된 "이중특이적 또는 이중-특이적 항체"는 2개의 항원 특이성을 갖는 항체를 언급한다. 하나의 실시형태에서, 항체는 2개의 항원 결합 도메인을 포함하고, 여기서, 하나의 결합 도메인은 항원 1에 결합하고, 다른 결합 도메인은 항원 2에 결합하고, 즉, 각각의 결합 도메인은 각각의 항원에 대해 1가이다. 하나의 실시형태에서, 항체는 4가 이중특이적 항체이고, 즉, 항체는 4개의 항원 결합 도메인을 포함하고, 여기서, 예를 들면, 2개의 결합 도메인은 항원 1에 결합하고, 다른 2개의 결합 도메인은 항원 2에 결합한다. 하나의 실시형태에서, 항체는 3가 이중특이적 항체이다.
하나의 실시형태에서, 다중-특이적 항체는 삼중-특이적 항체이다.
본원에 이용된 "삼중-특이적 항체"는 3개의 항원 결합 특이성을 갖는 항체를 언급한다. 예를 들면, 항체는 3개의 상이한 항원 또는 동일한 항원 상 3개의 상이한 에피토프에 독립적으로 결합하는, 즉, 각각의 결합 도메인은 각각의 항원에 대해 1가인, 3개의 항원 결합 도메인 (3가)을 갖는 항체이다. 하나의 실시형태에서, 3개의 결합 도메인이 존재하고, 각각의 3개의 결합 도메인이 상이한 (별개의) 항원에 결합한다.
하나의 실시형태에서, 3개의 결합 도메인이 존재하고, 2개의 결합 도메인은 동일한 에피토프 또는 동일한 항원 상 상이한 에피토프에 결합함을 포함하는, 동일한 항원에 결합하고, 세번째 결합 도메인은 상이한 (별개의) 항원에 결합한다.
본 발명의 항체는 다중-파라토픽(multi-paratopic) 항체일 수 있다.
본원에 이용된 "다중-파라토픽 항체"는, 동일한 항원으로부터 또는 2개의 상이한 항원으로부터 상이한 에피토프와 상호작용하는, 2개 이상의 별개의 파라토프(paratopes)를 포함하는 본원에 기재된 항체를 언급한다. 본원에 기재된 다중-파라토픽 항체는 비파라토픽, 트리파라토픽, 테트라파라토픽일 수 있다.
본원에 이용된 "항원 결합 도메인"은 하나 이상의 가변 도메인의 부분 또는 전체를 포함하는 항체의 부분, 예를 들면, 표적 항원과 특이적으로 상호작용하는 가변 도메인 VH 및 VL의 쌍을 언급한다. 항원 결합 도메인은 단일 도메인 항체를 포함할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 각각의 항원 결합 도메인은 1가이다. 바람직하게는 각각의 항원 결합 도메인은 단지 하나의 VH 및 하나의 VL을 포함한다.
본원에 이용된 "특이적으로"는, 특이적인 항원만을 인식하는 결합 도메인 또는 특이적인 항원 또는 비-특이적인 항원에 대한 친화도와 비교하여 특이적인 항원에 상당히 더 높은 결합 친화도를 갖는 결합 도메인만을 인식하는 결합 도메인을 언급하는 것을 의도한다.
결합 친화도는 표준 검정, 예를 들면, 표면 플라스몬 공명, 예를 들면, BIAcore으로 측정할 수 있다.
본원에 이용된 "단백질 A 결합 도메인"은 단백질 A에 특이적으로 결합된 결합 도메인을 언급하는 것을 의도한다. 단백질 A 결합 도메인은, 단백질 A에 결합하는, 즉, 단백질 A 결합 계면을 포함하는, VH3 도메인 또는 VH3 도메인의 부분을 언급할 수 있다. 단백질 A에 결합하는 VH3 도메인의 부분은 VH3 도메인의 CDRs를 포함하지 않고, 즉, VH3의 단백질 A 결합 계면은 CDR에 연루되지 않고; 결과적으로, 단백질 A 결합 도메인이 본 출원에 개시된 항원 결합 도메인과 경쟁하지 않는다는 것을 이해하여야 한다.
하나의 실시형태에서, s가 0이고, t가 0인 경우, 본원 개시내용에 따른 다중-특이적 항체는 각각 화학식 (I) 및 (II)의 중쇄 및 경쇄의 이량체로서 제공되고, 여기서, VH-CH1 부분은 VL-CL 부분과 함께 기능성 Fab 또는 Fab' 단편을 형성한다.
하나의 실시형태에서, s가 1이고, t가 1인 경우, 본원 개시내용에 따른 다중-특이적 항체는 각각 화학식 (I) 및 (II)의 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄의 이량체로서 제공되고, 여기서, 2개의 중쇄는 쇄간 상호작용에 의해, 특히 CH2-CH3의 수준에서 연결되고, 각각의 중쇄의 VH-CH1 부분은 각각의 경쇄의 VL-CL 부분과 함께. 기능성 Fab 또는 Fab' 단편을 형성한다. 이러한 실시형태에서, 2개의 VH-CH1- CH2- CH3 부분은 2개의 VL-CL 부분과 함께, 기능성 전체-길이 항체를 형성한다. 이러한 실시형태에서, 전체-길이 항체는 기능성 Fc 영역을 포함할 수 있다.
VH는 중쇄 가변 도메인을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, VH는 사람화이다. 하나의 실시형태에서, VH는 완전 사람이다.
VL은 경쇄 가변 도메인을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, VL은 사람화이다. 하나의 실시형태에서, VL은 완전 사람이다.
일반적으로, VH 및 VL 쌍은 함께 예를 들면, Fab 단편에서 항원 결합 도메인을 형성한다. 하나의 실시형태에서, VH 및 VL은 동종 쌍을 형성한다.
본원에 이용된 "동종 쌍"은 생체내 생성된 단일 항체로부터 가변 도메인의 쌍을 언급하고, 즉, 숙주로부터 단리된 가변 도메인의 천연 발생 쌍형성을 언급한다. 동종 쌍은 따라서 VH 및 VL 쌍이다. 하나의 예에서, 동종 쌍은 공동-작동적으로(co-operatively) 항원에 결합한다.
일부 경우, VH는, 예를 들면, V1 및/또는 V2, 및/또는 V3에 포함되는 경우, 항원 결합 도메인을 자체적으로 형성할 수 있고, 즉, 관심 대상 항원에 자체적으로 결합하는 단일 도메인 항체를 나타낼 수 있다.
VHH는 중쇄 가변 도메인으로 이루어진 단일 도메인 항체를 나타낸다. 하나의 실시형태에서, VHH는 낙타과이다. 하나의 실시형태에서, VHH는 사람화이다. 하나의 실시형태에서, VHH는 완전 사람이다.
일부 경우, VL은, 예를 들면, V1 및/또는 V2, 및/또는 V3에 포함되는 경우, 항원 결합 도메인을 자체적으로 형성할 수 있고, 즉, 관심 대상 항원에 자체적으로 결합하는 단일 도메인 항체를 나타낼 수 있다.
본원에 이용된 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 CDRs 및 프레임워크, 특히 적합한 프레임워크를 포함하는 항체 쇄 내에 영역을 언급한다.
본원 개시내용에서 사용하기 위한 가변 영역은 일반적으로 항체로부터 유도될 것이고, 당해 기술분야에 공지된 임의의 방법으로 생성할 수 있다.
본원에 이용된 "유도된 형태"는 이용된 서열 또는 이용된 서열과 매우 유사한 서열이 본래 유전 물질, 예를 들면, 항체의 경쇄 또는 중쇄로부터 수득된다는 사실을 언급한다.
본원에 이용된 "매우 유사한"은 이의 전체 길이에 걸쳐서 95% 이상 유사한, 예를 들면, 96, 97, 98 또는 99% 유사한 아미노산 서열을 언급하는 것을 의도한다.
상기 기재된 VH 및 VL에 대한 본 발명에서 사용하기 위한 가변 영역은, 임의의 적합한 공급원에서 유래할 수 있고, 예를 들면, 완전 사람 또는 사람화일 수 있다.
하나의 실시형태에서, VH 및 VL에 의해 형성된 결합 도메인은 첫번째 항원에 특이적이다.
하나의 실시형태에서, V1의 결합 도메인은 두번째 항원에 특이적이다.
하나의 실시형태에서, V2의 결합 도메인은 두번째 또는 세번째 항원에 특이적이다.
하나의 실시형태에서, V3의 결합 도메인은 세번째 또는 네번째 항원에 특이적이다.
하나의 실시형태에서, VH-VL, V1, V2 및 V3 중 각각은, 존재하는 경우, 개별적으로 이의 각각의 항원에 결합한다.
하나의 실시형태에서, CH1 도메인은 항체 중쇄 또는 이의 유도체로부터 천연 발생 도메인 1이다. 하나의 실시형태에서, CH2 도메인은 항체 중쇄 또는 이의 유도체로부터 천연 발생 도메인 2이다. 하나의 실시형태에서, CH3 도메인은 항체 중쇄 또는 이의 유도체로부터 천연 발생 도메인 3이다.
하나의 실시형태에서, CL 단편은, 경쇄에서, 불변 카파 서열 또는 이의 유도체이다. 하나의 실시형태에서, CL 단편은, 경쇄에서, 불변 람다 서열 또는 이의 유도체이다.
본원에 이용된 천연 발생 도메인의 유도체는 천연 발생 서열에서 적어도 하나의 아미노산은 대체 또는 삭제되어, 예를 들면, 목적하지 않는 성질을 제거하여 도메인의 성질을 최적화하지만, 도메인의 고유한 특성(들)은 보유되는 경우를 언급하는 것을 의도한다. 하나의 실시형태에서, 천연 발생 도메인의 유도체는 천연 발생 서열과 비교하여 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11 또는 12개의 아미노산 치환 또는 결실을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 하나 이상의 천연 또는 조작된 쇄간 (즉, 경쇄 및 중쇄간) 디설파이드 결합은 기능성 Fab 또는 Fab' 단편에 존재한다.
하나의 실시형태에서, "천연" 디설파이드 결합은 화학식 (I) 및 (II)의 폴리펩타이드 쇄에서 CH1 및 CL 사이에 존재한다.
CL 도메인이 카파 또는 람다로부터 유도되는 경우, 시스테인을 형성하는 결합을 위한 천연 위치는 사람 c카파 및 c람다에서 214이다 (참조: Kabat numbering 4th edition 1987).
CH1에서 시스테인을 형성하는 디설파이드 결합의 정확한 위치는 실제로 이용되는 특정 도메인에 좌우된다. 따라서, 예를 들면, 사람 감마-1에서 디설파이드 결합의 천연 위치는 위치 233에 위치한다 (참조: Kabat numbering 4th edition 1987). 다른 사람 이소형, 예를 들면, 감마 2, 3, 4, IgM 및 IgD에 대한 시스테인을 형성하는 결합의 위치는, 예를 들면, 사람 IgM, IgE, IgG2, IgG3, IgG4에 대해 위치 127 및 사람 IgD 및 IgA2B의 중쇄의 128로 공지되어 있다.
임의로, 화학식 I 및 II의 폴리펩타이드의 VH 및 VL 사이에 디설파이드 결합이 존재할 수 있다.
하나의 실시형태에서, 본원 개시내용에 따른 다중-특이적 항체는 CH1 및 CL 사이의 천연 발생과 동일하거나 상응하는 위치에서 디설파이드 결합을 갖는다.
하나의 실시형태에서, CH1을 포함하는 불변 영역 및 CL과 같은 불변 영역은 비-천연 발생 위치에 존재하는 디설파이드 결합을 갖는다. 이는 아미노산 쇄 내로 요구되는 위치 또는 위치들에 시스테인(들)을 도입하여 분자 내로 조작될 수 있다. 이러한 비-천연 디설파이드 결합은 CH1 및 CL 사이에 존재하는 천연 디설파이드 결합에 부가되거나 상기 결합에 대한 대안이다. 천연 위치에서 시스테인(들)은 디설파이드 브릿지 상에 형성할 수 없는 세린과 같은 아미노산으로 대체될 수 있다.
조작된 시스테인의 도입은 당해 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 이들 방법은, 이에 제한되는 것은 아니지만, PCR 확대 중첩 돌연변이유발, 부위-지정(site-directed) 돌연변이유발 또는 카세트 돌연변이유발을 포함한다 (일반적으로, 다음 문헌을 참조한다: Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY, 1989; Ausbel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing & Wiley-Interscience, NY, 1993). 부위-지정 돌연변이유발 키트는 시판되고, 예를 들면, QuikChange® 부위-지정 돌연변이유발 키트 (Stratagene, La Jolla, CA)이다. 카세트 돌연변이유발은 문헌[참조: Wells et al., 1985, Gene, 34:315-323]를 기초로 하여 수행할 수 있다. 대안적으로, 돌연변이체는 어닐링, 결찰 및 중첩 올리고뉴클레오티드의 PCR 증폭 및 클로닝에 의해 전체 유전자 합성으로 제조될 수 있다.
하나의 실시형태에서, CH1 및 CL 사이의 디설파이드 결합은 완전히 부재하고, 예를 들면, 쇄간 시스테인은 또다른 아미노산, 예를 들면, 세린에 의해 대체될 수 있다. 따라서, 하나의 실시형태에서, 분자의 기능성 Fab 단편에서 쇄간 디설파이드 결합이 존재하지 않는다. 본원에 참조로서 포함된 WO2005/003170의 개시내용에서 쇄간 디설파이드 결합이 없는 Fab 단편을 제조하는 방법을 기술한다.
본 발명에 사용하기 위한 바람직한 항체 포맷은 부속된 IgG 및 부속된 Fab를 포함하고, 여기서, 전체 IgG 또는 Fab 단편 각각은, 예를 들면, 본원에 참조로서 포함된 WO2009/040562, WO2010035012, WO2011/030107, WO2011/061492, WO2011/061246 및 WO2011/086091에 기재된 바와 같이, 적어도 하나의 추가 항원-결합 도메인 (예를 들면, 1, 2, 3, 또는 4개의 추가 항원-결합 도메인)에, 예를 들면, 단일 도메인 항체 (예를 들면, VH 또는 VL, 또는 VHH), scFv, dsscFv, dsFv을 상기 IgG 또는 Fab의 경쇄의 및 임의로 상기 IgG 또는 Fab의 중쇄의 N- 및/또는 C-말단으로 부속시켜 조작된다. 특히, Fab-Fv 포맷은 WO2009/040562에 첫번째로 개시되었고, 이의 디설파이드 안정화된 버젼, Fab-dsFv는, WO2010/035012에 첫번째로 개시되었다. dsFv가 Fab에 단일 링커를 통해 Fv의 VL 또는 VH 도메인 및, Fab의 LC의 C 말단 사이에 연결되는 단일 링커 Fab-dsFv는, 본원에 참조로서 포함된 WO2014/096390에 첫번째로 개시되었다. dsFv를 IgG의 경쇄 (및 임의로 중쇄)의 C-말단에 부속시켜 조작된 전체-길이 IgG를 포함하는 부속된 IgG는, 본원에 참조로서 포함된 WO2015/197789에 첫번째로 개시되었다.
본 발명에 사용하기 위한 또다른 바람직한 항체 포맷은 2개의 scFvs 또는 dsscFvs에 링크된 Fab를 포함하고, 각각의 scFv 또는 dsscFv는 동일한 또는 상이한 표적을 결합한다 (예를 들면, 하나의 scFv 또는 dsscFv는 치료학적 표적에 결합하고, 하나의 scFv 또는 dsscFv는 예를 들어, 알부민을 결합하여 반감기를 증가시킨다). 이러한 항체 단편은 국제 특허 출원 공보 번호 WO2015/197772에 기재되어 있고, 이의 전문이 특히 항체 단편의 논의에 대해 본원에 참조로서 포함된다. 본 발명의 단편에서 사용하기 위한 또다른 바람직한 항체는 예를 들면, 본원에 참조로서 포함된 WO2013/068571 및 문헌[참조: Dave et al., 2016, Mabs, 8(7) 1319-1335]에 기재된 단지 하나의 scFv 또는 dsscFv에 링크된 Fab를 포함한다.
V1은, 존재하는 경우, dsscFv, dsFv, scFv, VH, VL 또는 VHH, 예를 들면, dsscFv, dsFv, 또는 scFv를 나타낸다.
V2는, 존재하는 경우, dsscFv, dsFv, scFv, VH, VL 또는 VHH, 예를 들면, dsscFv, dsFv, 또는 scFv를 나타낸다.
V3은, 존재하는 경우, dsscFv, dsFv, scFv, VH, VL 또는 VHH, 예를 들면, dsscFv, dsFv, 또는 scFv를 나타낸다.
화학식 (II)의 폴리펩타이드 쇄는 적어도 하나의 dsscFv, dsFv, scFv, VH, 또는 VHH를 포함한다.
본원에 이용된 "단일 쇄 가변 단편" 또는 "scFv"는 VH 및 VL 가변 도메인 사이의 펩타이드 링커에 의해 안정화된 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하거나 이로 이루어진 단일 쇄 가변 단편을 언급한다. VH 및 VL 가변 도메인은 임의의 적합한 방향으로 존재할 수 있고, 예를 들면, VH의 C-말단은 VL의 N-말단에 링크될 수 있거나. VL의 C-말단은 VH의 N-말단에 링크될 수 있다.
본원에 이용된 "디설파이드-안정화된 단일 쇄 가변 단편" 또는 "dsscFv"는 VH 및 VL 가변 도메인 사이의 펩타이드 링커에 의해 안정화되고, 또한 VH 및 VL 사이의 도메인-간 디설파이드 결합을 포함하는 단일 쇄 가변 단편을 언급한다.
본원에 이용된 "디설파이드-안정화된 가변 단편" 또는 "dsFv"는 VH 및 VL 가변 도메인 사이의 펩타이드 링커를 포함하지 않고 대신에 VH 및 VL 사이의 도메인-간 디설파이드 결합에 의해 안정화되는 단일 쇄 가변 단편을 언급한다.
하나의 실시형태에서, V1 및/또는 V2 및/또는 V3이 dsFv 또는 dsscFv인 경우, V1 및/또는 V2 및/또는 V3의 가변 도메인 VH 및 VL 사이의 디설파이드 결합은 하기 열거한 잔기 중 2개 사이에 있다 (문맥에서 달리 명시하지 않는 한, 카바트 번호매김이 아래 목록에서 사용된다). 카바트 번호매김이 언급된 곳은 어디든지 관련 문헌을 참조한다 [참조: Kabat et al., 1991 (5th edition, Bethesda, Md.), in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA].
하나의 실시형태에서, 디설파이드 결합은 하기를 포함하는 그룹으로부터 선택된 위치에 존재한다:
· VH37 + VL95C; 예를 들면, 문헌을 참조한다: Protein Science 6, 781-788 Zhu et al (1997);
· VH44 + VL100; 예를 들면, 문헌을 참조한다: Weatherill et al., Protein Engineering, Design & Selection, 25 (321-329), 2012);
· VH44 + VL105; 예를 들면, 문헌을 참조한다: J Biochem. 118, 825-831 Luo et al (1995);
· VH45 + VL87; 예를 들면, 문헌을 참조한다: Protein Science 6, 781-788 Zhu et al (1997);
· VH55 + VL101; 예를 들면, 문헌을 참조한다: FEBS Letters 377 135-139 Young et al (1995);
· VH100 + VL50; 예를 들면, 문헌을 참조한다: Biochemistry 29 1362-1367 Glockshuber et al (1990);
· VH100b + VL49; 예를 들면, 문헌을 참조한다: Biochemistry 29 1362-1367 Glockshuber et al (1990);
· VH98 + VL 46; 예를 들면, 문헌을 참조한다: Protein Science 6, 781-788 Zhu et al (1997);
· VH101 + VL46; 예를 들면, 문헌을 참조한다: Protein Science 6, 781-788 Zhu et al (1997);
· VH105 + VL43; 예를 들면, 문헌을 참조한다: Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 90 pp.7538-7542 Brinkmann et al (1993); 또는 Proteins 19, 35-47 Jung et al (1994);
· VH106 + VL57; 예를 들면, 문헌을 참조한다: FEBS Letters 377 135-139 Young et al (1995)
및 분자 내에 위치하는 가변 영역 쌍 내에 상응하는 위치.
하나의 실시형태에서, 디설파이드 결합은 위치 VH44 및 VL100 사이에 형성된다.
상기 열거된 아미노산 쌍은 시스테인에 의한 대체를 조장하여 디설파이드 결합이 형성되는 위치에 존재한다. 시스테인은 공지된 기술로 이들 목적하는 위치로 조작될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 따라서, 본원 개시내용에 따른 조작된 시스테인은 제공된 아미노산 위치에서 천연 발생 잔기가 시스테인 잔기로 대체된 경우를 언급한다.
조작된 시스테인의 도입은 당해 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 이들 방법은, 이에 제한되는 것은 아니지만, PCR 확대 중첩 돌연변이유발, 부위-지정 돌연변이유발 또는 카세트 돌연변이유발을 포함한다 (일반적으로, 하기 문헌을 참조한다: Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY, 1989; Ausbel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing & Wiley-Interscience, NY, 1993). 부위-지정 돌연변이유발 키트는 시판되고, 예를 들면, QuikChange® 부위-지정 돌연변이유발 키트 (Stratagen, La Jolla, CA)이다. 카세트 돌연변이유발은 문헌[참조: Wells et al., 1985, Gene, 34:315-323]을 기초로 하여 수행될 수 있다. 대안적으로, 돌연변이체를 어닐링, 결찰 및 중첩 올리고뉴클레오티드의 PCR 증폭 및 클로닝에 의해 전체 유전자 합성으로 제조될 수 있다.
따라서, 하나의 실시형태에서, V1 및/또는 V2 및/또는 V3이 dsFv 또는 dsscFv인 경우, V1의 가변 도메인 VH 및 VL 및/또는 V2의 가변 도메인 VH 및 VL, 및/또는 V3의 가변 도메인 VH 및 VL은, 2개의 시스테인 잔기 사이의 디설파이드 결합에 의해 링크될 수 있고, 여기서, 시스테인 잔기의 쌍의 위치는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: VH37 및 VL95, VH44 및 VL100, VH44 및 VL105, VH45 및 VL87, VH100 및 VL50, VH100b 및 VL49, VH98 및 VL46, VH101 및 VL46, VH105 및 VL43 및 VH106 및 VL57.
하나의 실시형태에서, V1 및/또는 V2 및/또는 V3이 dsFv 또는 dsscFv인 경우, V1의 가변 도메인 VH 및 VL 및/또는 V2의 가변 도메인 VH 및 VL, 및/또는 V3의 가변 도메인 VH 및 VL은, CDRs의 외부에 있는, 하나가 VH에 있고 하나가 VL에 있는 2개의 시스테인 잔기 사이의 디설파이드 결합에 의해 링크될 수 있고, 여기서, 시스테인 잔기의 쌍의 위치는 VH37 및 VL95, VH44 및 VL100, VH44 및 VL105, VH45 및 VL87, VH100 및 VL50, VH98 및 VL46, VH105 및 VL43 및 VH106 및 VL57로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
하나의 실시형태에서, V1이 dsFv 또는 dsscFv인 경우, V1의 가변 도메인 VH 및 VL은 하나가 위치 VH44에 있고 나머지가 VL100에 있는 2개의 조작된 시스테인 잔기 사이의 디설파이드 결합에 의해 링크된다. 하나의 실시형태에서, V2가 dsFv 또는 dsscFv인 경우, V2의 가변 도메인 VH 및 VL은 하나가 위치 VH44에 있고 나머지가 VL100에 있는 2개의 조작된 시스테인 잔기 사이의 디설파이드 결합에 의해 링크된다. 하나의 실시형태에서, V3이 dsFv 또는 dsscFv인 경우, V3의 가변 도메인 VH 및 VL은 하나가 위치 VH44에 있고 나머지가 VL100에 있는 2개의 조작된 시스테인 잔기 사이의 디설파이드 결합에 의해 링크된다.
하나의 실시형태에서, V1이 dsscFv, dsFv, 또는 scFv인 경우, V1의 VH 도메인은 X에 부착된다.
하나의 실시형태에서, V1이 dsscFv, dsFv, 또는 scFv인 경우, V1의 VL 도메인은 X에 부착된다.
하나의 실시형태에서, V2가 dsscFv, dsFv, 또는 scFv인 경우, V2의 VH 도메인은 Y에 부착된다.
하나의 실시형태에서, V2가 dsscFv, dsFv, 또는 scFv인 경우, V2의 VL 도메인은 Y에 부착된다.
하나의 실시형태에서, V3이 dsscFv, dsFv, 또는 scFv인 경우, V3의 VH 도메인은 Z에 부착된다.
하나의 실시형태에서, V3이 dsscFv, dsFv, 또는 scFv인 경우, V3의 VL 도메인은 Z에 부착된다.
당해 기술분야의 숙련가는 V1 및/또는 V2 및/또는 V3가 dsFv를 나타내는 경우, 다중-특이적 항체는 X 또는 Y 또는 Z에 부착되지 않은 상응하는 유리 VH 또는 VL 도메인을 암호화하는 세번째 폴리펩타이드를 포함할 것임을 인식할 것이다. V1 및 V2, V2 및 V3, 또는 V1 및 V2 및 V3이 dsFv인 경우, "유리 가변 도메인" (즉, 폴리펩타이드의 나머지에 디설파이드 결합을 통해 링크된 도메인)은 둘 다의 쇄에 공통일 것이다. 따라서, X 또는 Y 또는 Z를 통해 폴리펩타이드에 융합 또는 링크된 실제 가변 도메인이 각각의 폴리펩타이드 쇄에서 상이할 수 있지만, 이와 쌍형성된 유리 가변 도메인은 일반적으로 서로 동일할 것이다.
하나의 실시형태에서, V1은 항원 결합 도메인을 형성하는 VH, VL 또는 VHH이다. 하나의 실시형태에서, V1은 상보적 VL과 함께 공동-작동적으로 관심 대상 항원에 결합하는 VH이다. 하나의 실시형태에서, V1은 관심 대상 항원에 상보적 VH와 함께 공동-작동적으로 결합되는 VL이다.
하나의 실시형태에서, V2는 항원 결합 도메인을 형성하는 VH, VL 또는 VHH이다. 하나의 실시형태에서, V2는 관심 대상 항원에 상보적 VL과 함께 공동-작동적으로 결합하는 VH이다. 하나의 실시형태에서, V2는 관심 대상 항원에 상보적 VH와 함께 공동-작동적으로 결합하는 VL이다.
하나의 실시형태에서, V3는 항원 결합 도메인을 형성하는 VH, VL 또는 VHH이다. 하나의 실시형태에서, V3는 관심 대상 항원에 상보적 VL과 함께 공동-작동적으로 결합하는 VH이다. 하나의 실시형태에서, V3는 상보적 VH와 함께 공동-작동적으로 관심 대상 항원에 결합하는 VL이다.
하나의 실시형태에서, V1은 VH이고, V2는 V1의 VH에 상보적인 VL이고, VH/VL, 즉, V1/V2, 쌍은 항원 결합 도메인을 형성하고, 즉, V1의 VH는 V2의 상보적 VL과 함께 공동-작동적으로 관심 대상 항원에 결합한다.
하나의 실시형태에서, V1은 VL이고, V2는 V1의 VL에 상보적인 VH이고, VL/VH, 즉, V1/V2, 쌍은 항원 결합 도메인을 형성하고, 즉, V1의 VL은 V2의 상보적 VH와 함께 공동-작동적으로 관심 대상 항원에 결합된다.
하나의 실시형태에서, V1이 VH이고, V2가 상보적 VL인 경우, 가변 도메인 V1의 VH 및 V2의 VL은 2개의 조작된 시스테인 잔기 사이의 디설파이드 결합에 의해 링크될 수 있고, 하나는 위치 V1의 VH44에 있고, 나머지 하나는 V2의 VL100에 있다. 하나의 실시형태에서, V1이 VL이고, V2가 상보적 VH인 경우, 가변 도메인 V1의 VL 및 V2의 VH는 2개의 조작된 시스테인 잔기 사이의 디설파이드 결합에 의해 링크될 수 있고, 하나는 V1의 위치 VL100에 있고 나머지는 V2의 위치 VH44에 있다.
본원 개시내용의 화학식 (I)의 폴리펩타이드 쇄는 단백질 A 결합 도메인을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 화학식 (I)의 폴리펩타이드 쇄는 1, 2 또는 3개의 단백질 A 결합 도메인을 포함한다.
단백질 A는 세균 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 세포 벽에서 본래 발견되는 42 kDa 표면 단백질이다. 단백질 A는 면역글로불린을 검출, 정량화 및 정제하기 위해 광범위하게 사용되었다. 단백질 A는 VH3 부류 항체로부터 유도된 Fab 부분, 및 IgG의 불변 영역 부분에서 Fc 감마 영역에 결합한다 (CH2 및 CH3 도메인 사이에)고 보고되었다. 단백질 A 및 Fab로 형성된 복합물의 결정 구조는, 예를 들면, 문헌에 기재되어 있다 [참조: Graille et al., 2000, PNAS, 97(10): 5399-5404].
본원 개시내용의 정황에서, 단백질 A는, 단백질 A 변종 또는 유도체가 VH3 도메인에 결합하는 이의 능력을 유지하는 범위까지 천연 단백질 A 및 임의의 이의 변종 또는 유도체를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 화학식 (I)의 폴리펩타이드 쇄는 VH 및/또는 CH2-CH3 및/또는 V1에 존재하는 단백질 A 결합 도메인을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 화학식 (I)의 폴리펩타이드 쇄는 VH 및/또는 CH2-CH3 및/또는 V1에 존재하는 1, 2 또는 3개의 단백질 A 결합 도메인을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 화학식 (I)의 폴리펩타이드 쇄는 VH 또는 V1에 존재하는 단지 하나의 단백질 A 결합 도메인을 포함한다. 하나의 실시형태에서, s는 0이고, t는 0이고, 화학식 (I)의 폴리펩타이드 쇄는 VH 또는 V1에 존재하는 단지 하나의 단백질 A 결합 도메인을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 화학식 (I)의 폴리펩타이드 쇄는 VH에 존재하는 단지 하나의 단백질 A 결합 도메인을 포함한다. 하나의 실시형태에서, s는 0이고, t는 0이고, p는 0이고, 화학식 (I)의 폴리펩타이드 쇄는 VH에 존재하는 단지 하나의 단백질 A 결합 도메인을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 화학식 (I)의 폴리펩타이드 쇄는 V1에 존재하는 단지 하나의 단백질 A 결합 도메인을 포함한다. 하나의 실시형태에서, s는 0이고, t는 0이고, p는 1이고, 화학식 (I)의 폴리펩타이드 쇄는 V1에 존재하는 단지 하나의 단백질 A 결합 도메인을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 화학식 (I)의 폴리펩타이드 쇄는 2개의 단백질 A 결합 도메인을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 화학식 (I)의 폴리펩타이드 쇄는 각각 VH 및 CH2-CH3에 존재하는 2개의 단백질 A 결합 도메인을 포함한다. 또다른 실시형태에서, 화학식 (I)의 폴리펩타이드 쇄는 각각 VH 및 V1에 존재하는 2개의 단백질 A 결합 도메인을 포함한다. 또다른 실시형태에서, 화학식 (I)의 폴리펩타이드 쇄는 각각 CH2-CH3 및 V1에 존재하는 2개의 단백질 A 결합 도메인을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 화학식 (I)의 폴리펩타이드 쇄는 3개의 단백질 A 결합 도메인을 포함하고, 이들 각각은 VH, CH2-CH3 및 V1에 존재한다.
천연 단백질 A는 특히 IgG의 불변 영역 부분에서 Fc 감마 영역과 상호작용할 수 있다. 보다 특히, 단백질 A는 CH2 및 CH3 사이의 결합 도메인과 상호작용할 수 있다. 하나의 실시형태에서, s가 1이고, t가 1인 경우, CH2 및 CH3 둘 다는 IgG 부류의 천연 발생 도메인이다.
일부 실시형태에서, 단백질 A 결합 도메인(들)은 단백질 A에 결합되는 VH3 도메인 또는 이의 변종을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 단백질 A 결합 도메인(들)은 천연 발생 VH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 단백질 A에 결합하는 VH3 도메인의 변종은 천연 발생 VH3 도메인의 변종이고, 상기 천연 발생 VH3 도메인은 단백질 A에 결합할 수 없다.
화학식 (II)의 폴리펩타이드 쇄는 적어도 하나의 dsscFv, dsFv, scFv, VH, 또는 VHH를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 화학식 (II)의 폴리펩타이드 쇄는 단지 하나의 dsscFv를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 화학식 (II)의 폴리펩타이드 쇄는 단지 하나의 dsFv를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 화학식 (II)의 폴리펩타이드 쇄는 단지 하나의 scFv를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 화학식 (II)의 폴리펩타이드 쇄는 단지 하나의 VH를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 화학식 (II)의 폴리펩타이드 쇄는 단지 하나의 VHH를 포함한다.
본원 개시내용의 화학식 (II)의 폴리펩타이드 쇄는 단백질 A에 결합하지 않는다. 하나의 실시형태에서, V2의 결합 도메인은 단백질 A에 결합하지 않는다. 하나의 실시형태에서. V3의 결합 도메인은 단백질 A에 결합하지 않는다. 하나의 실시형태에서, V2 및 V3 둘 다는 단백질 A에 결합하지 않는다. 일부 실시형태에서, V2 및/또는 V3은 VH1 및/또는 VH2 및/또는 VH4 및/또는 VH5 및/또는 VH6을 포함하거나 이로 이루어지고, VH3 도메인을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, V2 및/또는 V3은, 단백질 A에 결합하지 않는 VH3 도메인 또는 이의 변종을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, V2 및/또는 V3은, 단백질 A에 결합할 수 없는 천연 발생 VH3 도메인을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 단백질 A에 결합하지 않은 VH3 도메인의 변종은 천연 발생 VH3의 변종이고, 상기 천연 발생 VH3 도메인은 단백질 A에 결합할 수 있다.
사람 VH3 생식계열 유전자 및 VH3 도메인 (또는 프레임워크)은 잘 특성화되어 있다. 다수의 천연 발생 VH3 도메인은 단백질 A에 결합하는 능력을 갖지만, 특정 천연 발생 VH3 도메인은 단백질 A에 결합하는 능력을 갖지 않는다 (참조: Roben et al., 1995, J Immunol.;154(12):6437-6445).
본원 개시내용에서 사용하기 위한 VH3 도메인은 수개 방법으로 수득할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 본원 개시내용에서 사용하기 위한 VH3 도메인은 본원 개시내용의 폴리펩타이드 (I) 및/또는 (II) 내에 이의 위치에 좌우되어, 단백질 A에 결합할 수 있거나 결합할 수 없기 때문에 선택된 천연 발생 VH3 도메인이다. 예를 들면, 항체의 패널은 비-사람 동물, 이어서, 사람화의 면역화에 의한 관심 대상 항원에 대항하여 생성될 수 있고, 사람화 항체는, 예를 들면, 단백질 A 친화도 컬럼에 대항하여 사람화 VH3 도메인을 통해 단백질 A에 결합할 수 있는 능력 또는 능력 부재를 기초로 하여 선별 및 선택될 수 있다. 대안적으로, 디스플레이 기술 (예를 들면, 파지 디스플레이, 이스트 디스플레이, 리보솜 디스플레이, 세균 디스플레이, 포유동물 세포 표면 디스플레이, mRNA 디스플레이, DNA 디스플레이)을 사용하여 항체 라이브러리를 선별하고, 특히 CDR에 연루되지 않거나, 단백질 A에 결합하지 않는 단백질 A 결합 계면을 통해 결합하는 VH3 도메인을 포함하는 항체를 선택할 수 있다.
대안적으로, 본원 개시내용에서 사용하기 위한 VH3 도메인은 천연 발생 VH3의 변종이다. 하나의 실시형태에서, VH3 변종은 단백질 A에 결합할 수 있는 천연 발생 VH3의 서열을 포함하고, 단백질 A에 결합하는 이의 능력을 폐지하는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 추가로 포함한다. 하나의 실시형태에서, 단백질 A에 결합되는 VH3 변종은 단백질 A에 결합할 수 없는 천연 발생 VH3의 서열을 포함하고, 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 추가로 포함한다. 이러한 실시형태에서, 돌연변이(들)는 단백질 A를 결합하는 능력을 획득하는 것을 전담하고, 즉, 돌연변이(들)는 천연에 존재하지 않는 단백질 A 결합 도메인의 세대에 기여한다.
하나의 실시형태에서, VH3 변종은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 아미노산 돌연변이를 포함한다. 하나의 실시형태에서, VH3 변종은 VH3 상 위치 15, 17, 19, 57, 59, 64, 65, 66, 68, 70, 81 또는 82에서 돌연변이를 포함하고, 카바트에 따라서 예를 들면, 문헌[참조: Graille et al., 2000, PNAS, 97(10): 5399-5404)]에 기재된 바에 따라 번호매김한다. 보다 특히, VH3 변종은 VH3 상 위치 82a 또는 82b에서 돌연변이를 포함할 수 있고, 카바트에 따라서 예를 들면, 문헌[참조: Graille et al., 2000, PNAS, 97(10): 5399-5404)]에 기재된 바에 따라 번호매김한다. 돌연변이는 치환, 결실, 또는 삽입일 수 있다. 하나의 실시형태에서, VH3 변종은 VH3 상 위치 15, 17, 19, 57, 59, 64, 65, 66, 68, 70, 81 또는 82에서 치환을 포함하고, 카바트에 따라 번호매김한다. 보다 특히, VH3 변종은 VH3 상 위치 82a 또는 82b에서 치환을 포함할 수 있고, 카바트에 따라서 예를 들면, 문헌[참조: Graille et al., 2000, PNAS, 97(10): 5399-5404)]에 기재된 바에 따라 번호매김한다.
천연 발생 VH1, VH2, VH4, VH5 및 VH6은 단백질 A에 결합하지 않는다. 하나의 실시형태에서, 단백질 A에 결합하지 않는 VH 도메인은 VH1이다. 하나의 실시형태에서, 단백질 A에 결합하지 않는 VH 도메인은 VH2이다. 하나의 실시형태에서, 단백질 A에 결합하지 않는 VH 도메인은 VH4이다. 하나의 실시형태에서, 단백질 A에 결합하지 않는 VH 도메인은 VH5이다. 하나의 실시형태에서, 단백질 A에 결합하지 않는 VH 도메인은 VH6이다.
본 발명의 정황에서, 신규한 방법이 단백질 A에 대한 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 결합 도메인의 결합을 평가하기 위해 사용될 수 있도록 개발되었다. 단백질-A 상호작용 검정은 단백질 A에 대한 결합을 정성적으로 평가하기 위해 개발되었다. 따라서, 하나의 양상에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 결합 도메인을 선택하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 단백질-A 상호작용 검정의 사용을 포함한다. 실시예에 기재된 단백질-A 상호작용 검정을 사용할 수 있다.
하나의 양상에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩타이드 (II)에서 사용하기 위한, 즉, 단백질 A에 결합하지 않는, dsscFv, dsFv, scFv, VH, 또는 VHH를 선택하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 다음을 포함한다:
a) dsscFv, dsFv, scFv, VH, 또는 VHH로 부속된 단백질 A에 결합하지 않는 Fab를 포함하는 시험 분자를 생성하는 단계;
b) 단백질 A 크로마토그래피 컬럼 상으로 단계 a)에서 수득된 시험 분자를 적재하는 단계;
c) 단계 b)로부터 수득된 통과 유체 (Flow Through)를 회수하는 단계;
d) 단계 b)의 컬럼을 작동 완충제로 세척하는 단계;
e) 산성 단계 용리를 수행하는 단계; 및
f) 통과 유체로부터 회수된 시험 분자에 포함된 dsscFv, dsFv, scFv, VH, 또는 VHH를 선택하는 단계.
하나의 실시형태에서, 단백질 A에 결합하지 않는 Fab는 뮤린 Fab이다. 하나의 실시형태에서, 단백질 A 크로마토그래피 컬럼은 POROS™ A 20 μm 컬럼 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)이다. 하나의 실시형태에서, 작동 완충제는 PBS pH 7.4이다. 하나의 실시형태에서, 단계 d)에서 컬럼을 60 컬럼 용적에 걸쳐서 30 분 동안 세척하였다. 하나의 실시형태에서, 단계 e)에서 산성 단계 용리를 0.1 M 글리신-HCl pH 2.7로 2.0 ml/min에서, 2 분 동안 수행한다.
추가로, Biacore를 사용하는 표면 플라스몬 공명 검정을 단백질 A에 대한 결합을 정량적으로 평가하기 위해 개발하였다. 따라서, 하나의 양상에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 결합 도메인을 선택하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 Biacore 검정을 사용하는 것을 포함한다. 실시예에 기재된 Biacore 검정을 사용할 수 있다.
하나의 양상에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩타이드 (II)에서 사용하기 위한, 즉, 단백질 A에 결합하지 않는 dsscFv, dsFv, scFv, VH, 또는 VHH를 선택하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 다음을 포함한다:
a) dsscFv, dsFv, scFv, VH, 또는 VHH로 부속된 단백질 A에 결합하지 않는 Fab를 포함하는 시험 분자를 생성하는 단계;
b) 단계 a)에서 수득된 시험 분자의 결합을 표면 플라스몬 공명으로, 예를 들면, Biacore를 사용하여 측정하는 단계;
c) 비-결합 음성 대조군을 적정하는 단계; 및
d) 비-결합 음성 대조군에 대해 관찰된 반응보다 2-배 이하로 더 높은 결합 반응을 갖는 시험 분자에 포함된 dsscFv, dsFv, scFv, VH, 또는 VHH를 선택하는 단계.
하나의 실시형태에서, 단백질 A에 결합하지 않는 Fab는 뮤린 Fab이다.
실시예에서 기재된 바와 같이, 본 발명자들은 본 발명의 정황에서 항체 경쇄, 즉, 화학식 (II)의 폴리펩타이드 쇄가 단백질 A에 결합하는 능력을 완전히 폐지하면서, 화학식 (I)의 폴리펩타이드 쇄가 단백질 A에 결합하는 것의 중요성을 나타내었다. 이러한 방법은 따라서, 폴리펩타이드 (I)의 부분으로서, 및 화학식 (II)의 폴리펩타이드 쇄에 포함되지 않아야 하는 단백질 A에 대해 약한 결합을 갖는 폴리펩타이드 또는 단백질 A 결합 도메인으로서 선택되고 사용될 수 있는, 단백질 A에 강력한 결합을 갖는 폴리펩타이드 또는 단백질 A 결합 도메인의 확인을 가능하게 한다.
일부 실시형태에서, p는 1이다. 일부 실시형태에서, p는 0이다. 일부 실시형태에서, q는 1이다. 일부 실시형태에서, q는 0이고, r은 1이다. 일부 실시형태에서, r은 1이다. 일부 실시형태에서, q는 1이고, r은 0이다. 일부 실시형태에서, q는 1이고, r은 1이다. 일부 실시형태에서, s는 1이다. 일부 실시형태에서, s는 0이다. 일부 실시형태에서, t는 1이다. 일부 실시형태에서, t는 0이다. 일부 실시형태에서, s는 1이고, t는 1이다. 일부 실시형태에서, s는 0이고, t는 0이다.
하나의 실시형태에서, p는 1이고, q는 1이고, r은 0이고, s는 0이고, t는 0이고, V1 및 V2 둘 다는 dsscFv를 나타낸다. 따라서, 하나의 양상에서, a) 화학식 (Ia)의 폴리펩타이드 쇄 및 b) 화학식 (IIa)의 폴리펩타이드 쇄을 포함하거나 이로 이루어진 다중-특이적 항체를 제공한다:
a) 화학식 (Ia)의 폴리펩타이드 쇄:
VH-CH1-X-V1; 및
b) 화학식 (IIa)의 폴리펩타이드 쇄:
VL-C L -Y-V2;
상기 화학식에서:
VH는 중쇄 가변 도메인을 나타내고;
CH1은 중쇄 불변 영역의 도메인 1을 나타내고;
X는 결합 또는 링커를 나타내고;
Y는 결합 또는 링커를 나타내고;
V1은 dsscFv를 나타내고;
VL은 경쇄 가변 도메인을 나타내고;
CL은 C카파와 같은 경쇄 불변 영역으로부터의 도메인을 나타내고;
V2는 dsscFv를 나타내고;
여기서, 화학식 (Ia)의 폴리펩타이드 쇄는 단백질 A 결합 도메인을 포함하고;
화학식 (IIa)의 폴리펩타이드 쇄는 단백질 A에 결합하지 않는다.
이러한 실시형태에서, V2는 단백질 A에 결합하지 않고, 즉, V2의 dsscFv는 단백질 A 결합 도메인을 포함하지 않는다. 하나의 실시형태에서, V2, 즉, V2의 dsscFv는, VH1 도메인을 포함한다. 또다른 실시형태에서, V2, 즉, V2의 dsscFv는, 단백질 A에 결합하지 않는 VH3 도메인을 포함한다. 하나의 실시형태에서, V2, 즉, V2의 dsscFv는, VH2 도메인을 포함한다. 하나의 실시형태에서, V2, 즉, V2의 dsscFv는, VH4 도메인을 포함한다. 하나의 실시형태에서, V2, 즉, V2의 dsscFv는, VH5 도메인을 포함한다. 하나의 실시형태에서, V2, 즉, V2의 dsscFv는, VH6 도메인을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 화학식 (Ia)의 폴리펩타이드 쇄는 VH 또는 V1에 존재하는 단지 하나의 단백질 A 결합 도메인을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 화학식 (Ia)의 폴리펩타이드 쇄는 V1에 존재하는 단지 하나의 단백질 A 결합 도메인을 포함한다. 또다른 실시형태에서, 화학식 (Ia)의 폴리펩타이드 쇄는 각각 VH 및 V1에 존재하는 2개의 단백질 A 결합 도메인을 포함한다.
또다른 실시형태에서, p는 0이고, q는 1이고, r은 0이고, s는 1이고, t는 1이고, V2는 dsscFv이다. 따라서, 하나의 양상에서, 화학식 (Ib)의 폴리펩타이드 쇄 및 화학식 (IIb)의 폴리펩타이드 쇄을 포함하거나 이로 이루어진 다중-특이적 항체를 제공한다:
a) 화학식 (Ib)의 폴리펩타이드 쇄:
VH-CH1-CH2-CH3; 및
b) 화학식 (IIb)의 폴리펩타이드 쇄:
VL-CL-Y-V2;
상기 화학식에서:
VH는 중쇄 가변 도메인을 나타내고;
CH1은 중쇄 불변 영역의 도메인 1을 나타내고;
CH2는 중쇄 불변 영역의 도메인 2를 나타내고;
CH3은 중쇄 불변 영역의 도메인 3을 나타내고;
Y는 결합 또는 링커를 나타내고;
VL은 경쇄 가변 도메인을 나타내고;
CL은 C카파와 같은 경쇄 불변 영역으로부터의 도메인을 나타내고;
V2는 dsscFv를 나타내고;
여기서, 화학식 (Ib)의 폴리펩타이드 쇄는 단백질 A 결합 도메인을 포함하고;
화학식 (IIb)의 폴리펩타이드 쇄는 단백질 A에 결합하지 않는다.
이러한 실시형태에서, V2는 단백질 A에 결합하지 않고, 즉, V2의 dsscFv는 단백질 A 결합 도메인을 포함하지 않는다. 하나의 실시형태에서, V2, 즉, V2의 dsscFv는, VH1 도메인을 포함한다. 또다른 실시형태에서, V2, 즉, V2의 dsscFv는, 단백질 A에 결합하지 않는 VH3 도메인을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 화학식 (Ib)의 폴리펩타이드 쇄는 VH 또는 CH2-CH3에 존재하는 단지 하나의 단백질 A 결합 도메인을 포함한다. 또다른 실시형태에서, 화학식 (Ib)의 폴리펩타이드 쇄는 각각 VH 및 CH2-CH3에 존재하는 2개의 단백질 A 결합 도메인을 포함한다.
또다른 실시형태에서, p는 0이고, q는 1이고, r은 0이고, s는 1이고, t는 1이고, V2는 dsFv이다. 따라서, 하나의 양상에서, 화학식 (Ic)의 폴리펩타이드 쇄 및 화학식 (IIc)의 폴리펩타이드 쇄를 포함하거나 이로 이루어진 다중-특이적 항체를 제공한다:
a) 화학식 (Ic)의 폴리펩타이드 쇄:
VH-CH1-CH2-CH3; 및
b) 화학식 (IIc)의 폴리펩타이드 쇄:
VL-C L -Y-V2;
상기 화학식에서:
VH는 중쇄 가변 도메인을 나타내고;
CH1은 중쇄 불변 영역의 도메인 1을 나타내고;
CH2는 중쇄 불변 영역의 도메인 2를 나타내고;
CH3은 중쇄 불변 영역의 도메인 3을 나타내고;
Y는 결합 또는 링커를 나타내고;
VL은 경쇄 가변 도메인을 나타내고;
CL은 C카파와 같은 경쇄 불변 영역으로부터의 도메인을 나타내고;
V2는 dsFv를 나타내고;
화학식 (Ic)의 폴리펩타이드 쇄는 단백질 A 결합 도메인을 포함하고;
화학식 (IIc)의 폴리펩타이드 쇄는 단백질 A에 결합하지 않는다.
이러한 실시형태에서, V2, 즉, V2의 dsFv는, 단백질 A에 결합하지 않는다. 하나의 실시형태에서, V2, 즉, V2의 dsFv는, VH1 도메인을 포함한다. 또다른 실시형태에서, V2, 즉, V2의 dsFv는, 단백질 A에 결합하지 않는 VH3 도메인을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 화학식 (Ic)의 폴리펩타이드 쇄는 VH 또는 CH2-CH3에 존재하는 단지 하나의 단백질 A 결합 도메인을 포함한다. 또다른 실시형태에서, 화학식 (Ic)의 폴리펩타이드 쇄는 각각 VH 및 CH2-CH3에 존재하는 2개의 단백질 A 결합 도메인을 포함한다.
또다른 실시형태에서, p는 0이고, q는 0이고, r은 is 1이고, s는 1이고, t는 1이고, V3는 dsscFv이다. 따라서, 하나의 양상에서, 화학식 (Id)의 폴리펩타이드 쇄 및 화학식 (IId)의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 다중-특이적 항체를 제공한다:
a) 화학식 (Id)의 폴리펩타이드 쇄:
VH-CH1-CH2-CH3; 및
b) 화학식 (IId)의 폴리펩타이드 쇄:
V3-Z-VL-C L ;
상기 화학식에서:
VH는 중쇄 가변 도메인을 나타내고;
CH1은 중쇄 불변 영역의 도메인 1을 나타내고;
CH2는 중쇄 불변 영역의 도메인 2를 나타내고;
CH3은 중쇄 불변 영역의 도메인 3을 나타내고;
Z는 결합 또는 링커를 나타내고;
VL은 경쇄 가변 도메인을 나타내고;
CL은 C카파와 같은 경쇄 불변 영역으로부터의 도메인을 나타내고;
V3은 dsscFv를 나타내고;
여기서, 화학식 (Id)의 폴리펩타이드 쇄는 단백질 A 결합 도메인을 포함하고;
화학식 (IId)의 폴리펩타이드 쇄는 단백질 A에 결합하지 않는다.
이러한 실시형태에서, V3, 즉, V3의 dsscFv는, 단백질 A에 결합하지 않는다. 하나의 실시형태에서, V3, 즉, V3의 dsscFv는, VH1 도메인을 포함한다. 또다른 실시형태에서, V3 즉, V3의 dsscFv는, 단백질 A에 결합하지 않는 VH3 도메인을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 화학식 (Id)의 폴리펩타이드 쇄는 VH 또는 CH2-CH3에 존재하는 단지 하나의 단백질 A 결합 도메인을 포함한다. 또다른 실시형태에서, 화학식 (Id)의 폴리펩타이드 쇄는 각각 VH 및 CH2-CH3에 존재하는 2개의 단백질 A 결합 도메인을 포함한다.
하나의 실시형태에서, X는 결합이다.
하나의 실시형태에서, Y는 결합이다.
하나의 실시형태에서, Z는 결합이다.
하나의 실시형태에서, X 및 Y 둘 다는 결합이다. 하나의 실시형태에서, X 및 Z 둘 다는 결합이다. 하나의 실시형태에서, Y 및 Z 둘 다는 결합이다. 하나의 실시형태에서, X, Y 및 Z는 결합이다.
하나의 실시형태에서, X는 링커, 바람직하게는 펩타이드 링커, 예를 들면, s가 0이고, t가 0인 경우 부분 CH1 및 V1을 연결하기 위해 적합한 펩타이드, 또는 예를 들면, t가 1인 경우 부분 CH3 및 V1을 연결하기 위해 적합한 펩타이드이다.
하나의 실시형태에서, Y는 링커, 바람직하게는 펩타이드 링커, 예를 들면, 부분 CL 및 V2를 연결하기 위해 적합한 펩타이드이다.
하나의 실시형태에서, Z는 링커, 바람직하게는 펩타이드 링커, 예를 들면, 부분 VL 및 V3을 연결하기 위해 적합한 펩타이드이다.
하나의 실시형태에서, X 및 Y 둘 다는 링커이다. 하나의 실시형태에서, X 및 Y 둘 다는 펩타이드 링커이다. 하나의 실시형태에서, X 및 Z 둘 다는 링커이다. 하나의 실시형태에서, X 및 Z 둘 다는 펩타이드 링커이다. 하나의 실시형태에서, Y 및 Z 둘 다는 링커이다. 하나의 실시형태에서, Y 및 Z 둘 다는 펩타이드 링커이다. 하나의 실시형태에서, X, Y 및 Z는 링커이다. 하나의 실시형태에서, X, Y 및 Z는 펩타이드 링커이다.
본원에 사용된 용어 "펩타이드 링커"는 아미노산으로 구성된 펩타이드를 언급한다. 적합한 펩타이드 링커의 범위는 당해 기술분야의 숙련가에게 공지될 수 있다.
하나의 실시형태에서, 펩타이드 링커는 50개 아미노산 길이 이하, 예를 들면, 25개 이하 아미노산, 예를 들면, 20개 이하 아미노산, 예를 들면, 15개 이하 아미노산, 예를 들면, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개 아미노산 길이이다.
하나의 실시형태에서, 링커는 서열 1 내지 67에 나타낸 서열로부터 선택된다.
하나의 실시형태에서, 링커는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2에 나타낸 서열로부터 선택된다.
하나의 실시형태에서, X는 서열 SGGGGTGGGGS (서열 번호 1)를 갖는다. 하나의 실시형태에서, Y는 서열 SGGGGTGGGGS (서열 번호 1)를 갖는다. 하나의 실시형태에서, Z는 서열 SGGGGTGGGGS (서열 번호 1)를 갖는다. 하나의 실시형태에서, X는 서열 SGGGGSGGGGS (서열 번호 2)를 갖는다. 하나의 실시형태에서, Y는 서열 SGGGGSGGGGS (서열 번호 2)를 갖는다. 하나의 실시형태에서, Z는 서열 SGGGGSGGGGS (서열 번호 2)를 갖는다. 하나의 실시형태에서, p가 1이고, q가 1이고, r이 0이고, Z가 부재하는 경우, X는 서열 번호 1에 제공된 서열을 갖고, Y는 서열 번호 2에 제공된 서열을 갖는다.
하나의 실시형태에서, X는 서열 번호 69 또는 70에 제공된 서열을 갖는다. 하나의 실시형태에서, Y는 서열 번호 69 또는 70에 제공된 서열을 갖는다. 하나의 실시형태에서, Z는 서열 번호 69 또는 70에 제공된 서열을 갖는다. 하나의 실시형태에서, p가 1이고, q가 1이고, r이 0이고, Z가 부재하는 경우, X는 서열 번호 69에 제공된 서열을 갖고, Y는 서열 번호 70에 제공된 서열을 갖는다.
표 1. 힌지 링커 서열
Figure pct00001
표 2. 유연한 링커 서열
Figure pct00002
Figure pct00003
(S)는 서열 14 내지 18에서 선택적이다.
강성 링커의 예는 펩타이드 서열 GAPAPAAPAPA (서열 번호 52), PPPP (서열 번호 53) 및 PPP를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 펩타이드 링커는 알부민 결합 펩타이드이다.
알부민 결합 펩타이드의 예는 WO2007/106120에 제공되고, 다음을 포함한다:
표 3.
Figure pct00004
유리하게는, 링커로서 알부민 결합 펩타이드를 사용하는 것은 다중-특이적 항체의 반감기를 증가시킬 수 있다.
하나의 실시형태에서, V1이 scFv 또는 dsscFv인 경우, 링커, 예를 들면, V1의 가변 도메인 VH 및 VL을 연결하기 위한 적합한 펩타이드 링커가 존재한다.
하나의 실시형태에서, V2가 scFv 또는 dsscFv인 경우, 링커, 예를 들면, V2의 가변 도메인 VH 및 VL을 연결하기 위한 적합한 펩타이드 링커가 존재한다.
하나의 실시형태에서, V3이 scFv 또는 dsscFv인 경우, 링커, 예를 들면, V3의 가변 도메인 VH 및 VL을 연결하기 위한 적합한 펩타이드 링커가 존재한다.
하나의 실시형태에서, scFv 또는 dsscFv에서 펩타이드 링커는 12 내지 25개 아미노산 길이, 예를 들면, 15 내지 20개 아미노산 길이의 범위이다. 하나의 실시형태에서, scFv 또는 dsscFv에서 펩타이드 링커는 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 아미노산이다.
하나의 실시형태에서, V1이 scFv 또는 dsscFv인 경우, V1의 가변 도메인 VH 및 VL을 연결하는 링커는 서열 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열 번호 68)을 갖는다. 하나의 실시형태에서, V2가 scFv 또는 dsscFv인 경우, V2의 가변 도메인 VH 및 VL을 연결하는 링커는 서열 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열 번호 68)을 갖는다. 하나의 실시형태에서, V3이 scFv 또는 dsscFv인 경우, V3의 가변 도메인 VH 및 VL을 연결하는 링커는 서열 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열 번호 68)을 갖는다.
하나의 실시형태에서, V1이 scFv 또는 dsscFv인 경우, V1의 가변 도메인 VH 및 VL을 연결하는 링커는 서열 SGGGGSGGGGSGGGGS (서열 번호 69)을 갖는다. 하나의 실시형태에서, V2가 scFv 또는 dsscFv인 경우, V2의 가변 도메인 VH 및 VL을 연결하는 링커는 서열 SGGGGSGGGGSGGGGS (서열 번호 69)을 갖는다. 하나의 실시형태에서, V3이 scFv 또는 dsscFv인 경우, V3의 가변 도메인 VH 및 VL을 연결하는 링커는 서열 SGGGGSGGGGSGGGGS (서열 번호 69)을 갖는다.
하나의 실시형태에서, V1이 scFv 또는 dsscFv인 경우, V1의 가변 도메인 VH 및 VL을 연결하는 링커는 서열 SGGGGSGGGGTGGGGS (서열 번호 70)을 갖는다. 하나의 실시형태에서, V2가 scFv 또는 dsscFv인 경우, V2의 가변 도메인 VH 및 VL을 연결하는 링커는 서열 SGGGGSGGGGTGGGGS (서열 번호 70)을 갖는다. 하나의 실시형태에서, V3이 scFv 또는 dsscFv인 경우, V3의 가변 도메인 VH 및 VL을 연결하는 링커는 서열 SGGGGSGGGGTGGGGS (서열 번호 70)을 갖는다.
본원 개시내용은 또한 본원에 개시된 서열과 80%, 90%, 91%, 92%, 93% 94%, 95% 96%, 97%, 98% 또는 99% 유사한 서열을 제공한다.
본원에 사용된 "동일성"은, 정렬된 서열 내 임의의 특정 위치에서, 아미노산 잔기가 서열 간에 동일하다는 것을 나타낸다.
본원에 사용된 "유사성"은, 정렬된 서열 내 임의의 특정 위치에서, 아미노산 잔기가 서열 간에 유사한 유형임을 나타낸다. 예를 들면, 류신은 이소류신 또는 발린을 대체할 수 있다. 서로에 대해 종종 치환될 수 있는 다른 아미노산은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 다음을 포함한다:
- 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판 (방향족 측쇄를 갖는 아미노산);
- 리신, 아르기닌 및 히스티딘 (염기성 측쇄를 갖는 아미노산);
- 아스파르테이트 및 글루타메이트 (산성 측쇄를 갖는 아미노산);
- 아스파라긴 및 글루타아민 (아미드 측쇄를 갖는 아미노산); 및
- 시스테인 및 메티오닌 (황-함유 측쇄를 갖는 아미노산).
동일성 및 유사성 정도는 용이하게 계산할 수 있다 (참조: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991, the BLAST™ software available from NCBI (Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. & States, D.J. 1993, Nature Genet. 3:266-272. Madden, T.L. et al., 1996, Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. & Madden, T.L. 1997, Genome Res. 7:649-656).
본 발명의 다중-특이적 항체는 당해 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 생성할 수 있다.
항원 폴리펩타이드에 대항하여 생성된 항체를 수득하고, 여기서, 예를 들면, 하기 문헌을 참조하여 잘 공지되고 일반적인 프로토콜을 사용하여 폴리펩타이드를 동물, 바람직하게는 비-사람 동물에게 투여함에 의한 동물의 면역화는 필수적이다: Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, England, 1986). 다수의 온혈 동물, 예를 들면, 토끼, 마우스, 래트, 양, 소, 낙타 또는 돼지는 면역화될 수 있다. 그러나, 마우스, 토끼, 돼지 및 래트가 일반적으로 가장 적합하다.
모노클로날 항체는 당해 기술분야에 공지된 방법, 예를 들면, 하이브리도마 기술 (참조: Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), 트리오마 기술, 사람 B-세포 하이브리도마 기술 (참조: Kozbor et al 1983, Immunology Today, 4:72) 및 EBV-하이브리도마 기술 (참조: Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp77-96, Alan R Liss, Inc., 1985)에 공지된 임의의 방법으로 제조할 수 있다.
항체는 또한 하기 문헌에 기재된 방법으로 특이적 항체의 생성을 위해 선택된 단일 림프구로부터 생성된 면역글로불린 가변 영역 cDNAs를 클로닝하고 발현하는 단일 림프구 항체 방법을 사용하여 생성할 수 있다: Babcook, J. et al 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15):7843-7848l; WO92/02551; WO2004/051268 및 WO2004/106377.
본원 개시내용에서 사용하기 위한 항체는 또한 당해 기술분야에 공지된 다양한 파지 디스플레이 방법을 사용하여 생성할 수 있고, 하기 문헌에 기재된 것을 포함한다: Brinkman et al. (in J. Immunol. Methods, 1995, 182: 41-50), Ames et al. (J. Immunol. Methods, 1995, 184:177-186), Kettleborough et al. (Eur. J. Immunol. 1994, 24:952-958), Persic et al. (Gene, 1997 187 9-18), Burton et al. (Advances in Immunology, 1994, 57:191-280) and WO90/02809; WO91/10737; WO92/01047; WO92/18619; WO93/11236; WO95/15982; WO95/20401; 및 US 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743; 5,969,108, 및 WO20011/30305.
하나의 실시형태에서, 본원 개시내용에 따른 다중-특이적 항체는 사람화이다.
본원에 이용된 사람화 (이는 CDR-이식된 항체를 포함함)는 비-사람 종으로부터 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDRs) 및 사람 면역글로불린 분자로부터 프레임워크 영역을 갖는 분자를 언급한다 (예를 들면, US 5,585,089; WO91/09967을 참조한다). 전체 CDR 보다는 CDRs의 특이성 결정 잔기를 전달하는 것만이 필수적일 수 있음을 인식할 수 있다 (예를 들면, 하기 문헌을 참조한다: Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34). 사람화 항체는 임의로 추가로 CDRs가 유도되는 비-사람 종으로부터의 하나 이상의 프레임워크 잔기를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "사람화 항체"는 중쇄 및/또는 경쇄가 수용체 항체 (예를 들면, 사람 항체)의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 프레임워크 내로 이식된 공여자 항체 (예를 들면, 뮤린 모노클로날 항체)로부터 하나 이상의 CDRs (목적하는 경우, 하나 이상의 변형된 CDRs를 포함함)을 포함하는, 항체를 언급한다. 평가를 위해, 문헌을 참조한다: Vaughan et al, Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998. 하나의 실시형태에서, 전체 CDR이 전달되기 보다는, 상기한 CDRs 중 어느 하나로부터 단지 하나 이상의 특이성 결정 잔기가 사람 항체 프레임워크로 전달된다 (예를 들면, 문헌을 참조한다: Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34). 하나의 실시형태에서, 상기한 CDRs 중 하나 이상으로부터의 단지 특이성 결정 잔기만이 사람 항체 프레임워크에 전달된다. 또다른 실시형태에서, 상기한 CDRs 각각으로부터 단지 특이성 결정 잔기만이 사람 항체 프레임워크에 전달된다.
CDRs 또는 특이성 결정 잔기가 이식되는 경우, 마우스, 영장류 및 사람 프레임워크 영역을 포함하는 CDRs가 유도되는 공여자 항체의 부류/유형을 갖는 임의의 적합한 수용체 가변 영역 프레임워크 서열이 사용될 수 있다. 적합하게는, 본 발명에 따른 사람화 항체는 사람 수용체 프레임워크 영역 뿐만 아니라 본원에 제공된 CDRs 중 하나 이상을 포함하는 가변 도메인을 갖는다.
본원 개시내용에 사용될 수 있는 사람 프레임워크의 예는 KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY 및 POM (Kabat 등 상기함)이다. 예를 들면, KOL 및 NEWM을 중쇄에 대해 사용할 수 있고, REI를 경쇄에 대해 사용할 수 있고, EU, LAY 및 POM을 중쇄 및 경쇄 둘 다에 대해 사용될 수 있다. 대안적으로, 사람 생식계열 서열이 사용될 수 있다; 이들은 하기에서 이용가능하다: http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/list2.php.
본원 개시내용의 사람화 항체에서, 수용체 중쇄 및 경쇄는 반드시 동일한 항체로부터 유도될 필요는 없고, 목적하는 경우, 상이한 쇄로부터 유도된 프레임워크 영역을 갖는 쇄를 포함할 수 있다.
프레임워크 영역은 수용체 항체의 서열과 정확히 동일한 서열을 가질 필요는 없다. 예를 들어, 특이한 잔기는 이러한 수용체 쇄 부류 또는 유형에 대한 보다 빈번하게-발생하는 잔기로 변화될 수 있다. 대안적으로, 수용체 프레임워크 영역에서 선택된 잔기는 변화될 수 있고, 이에 따라 공여자 항체에서 동일한 위치에서 발견되는 잔기에 상응한다 (참조: Reichmann et al 1998, Nature, 332, 323-324). 이러한 변화는 공여자 항체의 친화도를 회복하는데 필요한 최소한으로 유지되어야 한다. 변화될 필요가 있는 수용체 프레임워크 영역에서 잔기를 선택하기 위한 프로토콜은 WO91/09967에 기재되어 있다.
프레임워크의 유도체는 대안 아미노산으로, 예를 들면, 공여자 잔기로 대체된 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산을 가질 수 있다.
공여자 잔기는 공여자 항체, 즉, CDRs이 본래 유도되는 항체로부터의 잔기이다. 공여자 잔기는 사람 수용체 프레임워크로부터 유도된 적합한 잔기에 의해 대체될 수 있다 (수용체 잔기).
하나의 실시형태에서, 본원 개시내용의 다중-특이적 항체는 완전 사람이고, 특히 가변 도메인 중 하나 이상은 완전 사람이다.
완전 사람 항체는 중쇄 및 경쇄 둘 다의 가변 영역 및 불변 영역 (존재하는 경우)이 전부 사람 기원이거나, 사람 기원의 서열과 실질적으로 동일하지만, 반드시 동일한 항체로부터 유래할 필요는 없는 것들이다. 완전 사람 항체의 예는, 예를 들면, 상기한 파지 디스플레이 방법으로 제조된 항체 및 마우스에 의해 생성된 항체를 포함할 수 있고, 여기서, 뮤린 면역글로불린 가변 및 임의로 불변 영역 유전자는, 예를 들면, EP0546073, US5,545,806, US5,569,825, US5,625,126, US5,633,425, US5,661,016, US5,770,429, EP 0438474 및 EP0463151에서 일반적인 조건으로 기재된 바와 같이, 이들의 사람 카운터파트에 의해 대체되었다.
하나의 실시형태에서, 본원 개시내용의 다중-특이적 항체는 2개, 3개 이상의 상이한 관심 대상 항원에 선택적으로 결합할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 본원 개시내용의 다중-특이적 항체는 2, 3개 이상의 상이한 관심 대상 항원에 동시에 결합할 수 있다.
하나의 실시형태에서, VH/VL, 또는 V1 또는 V2 또는 V3에 의해 형성된 항원 결합 도메인에 의해 결합된 관심 대상 항원은 독립적으로 세포-관련 단백질, 예를 들면, 세포, 예를 들면, 세균 세포, 이스트 세포, T-세포, B-세포, 내피 세포 또는 종양 세포 상 세포 표면 단백질, 및 가용성 단백질로부터 선택된다.
관심 대상 항원은 또한 임의의 의학적으로 관련된 단백질, 예를 들면, 질환 또는 감염 동안 상향조절되는 단백질, 예를 들면, 수용체 및/또는 이들의 상응하는 리간드일 수 있다. 항원의 특정한 예는 세포 표면 수용체, 예를 들면, T 세포 또는 B 세포 신호화 수용체, 공-자극 분자, 체크포인트 억제제, 천연 킬러 세포 수용체, 면역글로불린 수용체, TNFR 부류 수용체, B7 부류 수용체, 부착 분자, 인테그린, 사이토킨/케모킨 수용체, GPCRs, 성장 인자 수용체, 키나제 수용체, 조직-특이적 항원, 암 항원, 병원체 인식 수용체, 보체 수용체, 호르몬 수용체 또는 가용성 분자, 예를 들면, 사이토킨, 케모킨, 류코트리엔, 성장 인자, 호르몬 또는 효소 또는 이온 채널, 이의 에피토프, 단편 및 번역 후 변형된 형태를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 본원 개시내용의 다중-특이적 항체는 관심 대상 항원(들)의 활성을 기능적으로 변경시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 항체 융합 단백질은 상기 항원의 활성을 직접적으로 또는 간접적으로 중화, 길항 또는 작용시킬 수 있다.
하나의 실시형태에서, V1, V2 및 V3은, 예를 들면, 그 안에 동일한 또는 상이한 에피토프에 결합하는 동일한 항원에 특이적이다. 하나의 실시형태에서, V3는 부재하고, V1 및 V2는 동일한 항원, 예를 들면, 동일한 항원 상 동일한 또는 상이한 에피토프에 대해 특이적이다. 하나의 실시형태에서, V3는 부재하고, V1 및 V2는 2개의 상이한 항원에 대해 특이적이다.
하나의 실시형태에서, VH/VL 또는 V1 또는 V2 또는 V3에 의해 결합된 관심 대상 항원은 이펙터 기능을 동원하는 능력, 예를 들면, 보체 경로 활성화 및/또는 이펙터 세포 동원을 제공한다.
이펙터 기능의 동원은 이펙터 기능이 세포에 연관된다는 점에서 직접적일 수 있고, 상기 세포는 이의 표면 상 동원 분자를 갖는다. 동원 폴리펩타이드에 대한 본 개시내용에 따른 다중-특이적 항체에서 항원 결합 도메인 (예를 들면, V1 또는 V2 또는 V3)에 대한 항원의 결합이, 예를 들면, 또한 직접적으로 또는 간접적으로 이펙터 기능을 동원할 수 있거나 신호화 경로의 활성화를 통할 수 있는, 인자의 방출을 야기할 때, 간접적 동원이 발생할 수 있다. 이의 예는 IL2, IL6, IL8, IFNγ, 히스타민, C1q, 옵소닌 및 전형적인 및 대안적인 보체 활성화 캐스케이드의 다른 구성원, 예를 들면, C2, C4, C3-컨버타제, 및 C5 내지 C9를 포함한다.
본원에 사용된, "동원 폴리펩타이드"는 FcγR, 예를 들면, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII, 보체 경로 단백질, 제한 없이, 직접적으로 또는 간접적으로 세포-매개 이펙터 기능을 동원하는 능력을 보유하는 C1q 및 C3, CD 마커 단백질 (분화 마커의 클러스터) 또는 이의 단편을 포함한다. 동원 폴리펩타이드는 또한 이펙터 기능을 갖는 면역글로불린 분자, 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE 및 IgA를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 본원 개시내용에 따른 다중-특이적 항체에서 항원 결합 도메인 (예를 들면, V1 또는 V2 또는 V3 또는 VH/VL)은 보체 경로 단백질에 대한 특이성을 갖고, C1q이 특히 바람직하다.
추가로, 본원 개시내용의 다중-특이적 항체는 핵종 킬레이터 단백질에 결합하는 단일 도메인 항체에 의해서 방사성핵종을 킬레이트화하는데 사용할 수 있다. 이러한 융합 단백질은 요법에 대한 영상화 또는 방사성핵종 표적화 접근에서 사용하는 것이다.
하나의 실시형태에서, 본원 개시내용에 따른 다중-특이적 항체 내에 항원 결합 도메인 (예를 들면, V1 또는 V2 또는 V3 또는 VH/VL)은, 예를 들면, 상기 혈청 담체 단백질, 순환하는 면역글로불린 분자 또는 CD35/CR1에 결합하여 상기 관심 대상 항원에 대해 특이성을 갖는 항체 단편에 연장된 반감기를 제공하는, 혈청 담체 단백질, 순환하는 면역글로불린 분자, 또는 CD35/CR1에 대한 특이성을 갖는다.
본원에 사용된 "혈청 담체 단백질"은 티록신-결합 단백질, 트랜스티레틴, α1-산 당단백질, 트랜스페린, 피브리노겐 및 알부민, 또는 이의 임의의 단편을 포함한다.
본원에 사용된 "순환하는 면역글로불린 분자"는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, sIgA, IgM 및 IgD, 또는 이의 임의의 단편을 포함한다.
CD35/CR1은 36 일의 반감기를 갖는 적혈구 상 존재하는 단백질이다 (정상 범위 28 내지 47 일; 참조: Lanaro et al., 1971, Cancer, 28(3):658-661).
하나의 실시형태에서, VH/VL이 특이성을 갖는 관심 대상 항원은 혈청 담체 단백질, 예를 들면, 사람 혈청 담체, 예를 들면, 사람 혈청 알부민이다.
하나의 실시형태에서, V1이 특이성을 갖는 관심 대상 항원은 혈청 담체 단백질, 예를 들면, 사람 혈청 담체, 예를 들면, 사람 혈청 알부민이다. 따라서, 하나의 실시형태에서, V1은 알부민 결합 도메인을 포함한다.
하나의 실시형태에서, V2가 특이성을 갖는 관심 대상 항원은 혈청 담체 단백질, 예를 들면, 사람 혈청 담체, 예를 들면, 사람 혈청 알부민이다. 따라서, 하나의 실시형태에서, V2는 알부민 결합 도메인을 포함한다.
하나의 실시형태에서, V3가 특이성을 갖는 관심 대상 항원은 혈청 담체 단백질, 예를 들면, 사람 혈청 담체, 예를 들면, 사람 혈청 알부민이다. 따라서, 하나의 실시형태에서, V3는 알부민 결합 도메인을 포함한다.
하나의 실시형태에서, VH/VL, V1 또는 V2 또는 V3 중 단지 하나는 혈청 담체 단백질, 예를 들면, 사람 혈청 담체, 예를 들면, 사람 혈청 알부민에 대한 특이성을 갖는다. 따라서, 하나의 실시형태에서, VH/VL, V1 또는 V2 또는 V3 중 단지 하나는 알부민 결합 도메인을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 알부민 결합 도메인은 단백질 A에 추가로 결합한다. 하나의 실시형태에서, 알부민 결합 도메인은 6개의 CDRs, 예를 들면, CDRH1에 대한 서열 번호 71, CDRH2에 대한 서열 번호 72, CDRH3에 대한 서열 번호 73, CDRL1에 대한 서열 번호 74, CDRL2에 대한 서열 번호 75 및 CDRL3에 대한 서열 번호 76을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 상기 6개의 CDRs 서열 번호 71 내지 76은 본원 개시내용의 작제물에서 위치 VH/VL에 존재한다. 하나의 실시형태에서, 상기 6개의 CDRs 서열 번호 71 내지 76은 본원 개시내용의 작제물에서 위치 V1에 존재한다. 하나의 실시형태에서, 상기 6개의 CDRs 서열 번호 71 내지 76은 본원 개시내용의 작제물에서 위치 VH/VL 및 V1에 존재한다.
하나의 실시형태에서, 알부민 결합 도메인은 중쇄 및 경쇄 각각에 대해 서열 번호 77 및 서열 번호 78로부터 선택된 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 79 및 서열 번호 80, 특히 서열 번호 77 및 79 또는 서열 번호 78 및 80로부터 선택된 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 알부민 결합 도메인은 서열 번호 81의 scFv이다. 하나의 실시형태에서, 알부민 결합 도메인은 하기 나타낸 바와 같은 서열 번호 82의 dsscFv이다:
645 scFv (VH/VL) (서열 번호 81):
Figure pct00005
645 dsscFv (VH/VL) (밑줄 친 디설파이드 결합에 대해 조작된 시스테인을 갖는) (서열 번호 82):
Figure pct00006
하나의 실시형태에서, 이들 도메인은 본원 개시내용의 작제물에서 위치 VH/VL에 존재한다. 하나의 실시형태에서, 이들 가변 도메인은 위치 V1에 존재한다. 하나의 실시형태에서, 이들 가변 도메인은 본원 개시내용의 작제물에서 위치 VH/VL 및 V1에 존재한다. 가변 도메인이 본원 개시내용의 작제물에서 2개의 위치에 존재하는 경우, 동일한 쌍의 가변 도메인은 각각의 위치에 존재할 수 있거나, 2개의 상이한 쌍의 가변 도메인이 이용될 수 있다.
하나의 실시형태에서, 본원 개시내용의 다중-특이적 항체는 표적 항원 또는 항원들에 대해 개선된 친화도를 제공하기 위해 처리된다. 이러한 변종은 CDRs 돌연변이 (참조: Yang et al J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), 쇄 셔플링(shuffling) (참조: Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), 이. 콜리(E. coli)의 변이유발 균주의 사용 (참조: Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), DNA 셔플링 (참조: Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), 파지 디스플레이 (참조: Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) 및 생식(sexual) PCR (참조: Crameri et al Nature, 391, 288-291, 1998)을 포함하는 다수의 친화도 성숙 프로토콜로 수득될 수 있다. 본(Vaughan) 등 (상기함)은 이들 친화도 성숙 방법을 논의한다.
이러한 맥락에서 본원에 이용된 개선된 친화도는 출발 분자에 대한 개선을 언급한다.
목적하는 경우 본원 개시내용에서 사용하기 위한 다중-특이적 항체 작제물은 하나 이상의 이펙터 분자(들)에 접합될 수 있다. 이펙터 분자가 단일 이펙터 분자 또는 2개 이상의 이러한 분자를 포함하여 이들이 링크되어 본 발명의 항체에 부착될 수 있는 단일 모이어티(moiety)를 형성하도록 할 수 있음을 인식할 것이다. 이펙터 분자에 링크된 항체 단편을 수득하는 것을 목적으로 하는 경우, 이는 표준 화학적 또는 재조합 DNA 절차로 제조할 수 있고, 여기서, 항체 단편을 직접적으로 또는 커플링 제제를 통해 이펙터 분자에 링크한다. 이러한 이펙터 분자를 항체에 접합하는 기술은 당해 기술분야에 잘 공지되어 있다 (참조: Hellstrom et al Controlled Drug Delivery, 2nd Ed., Robinson et al eds., 1987, pp. 623-53; Thorpe et al 1982, Immunol. Rev., 62:119-58 and Dubowchik et al 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123). 구체적인 화학적 절차는, 예를 들면, WO93/06231, WO92/22583, WO89/00195, WO89/01476 및 WO03031581에 기재된 것들을 포함한다. 대안적으로, 이펙터 분자가 단백질 또는 폴리펩타이드인 경우, 링크는, 예를 들면, WO86/01533 및 EP0392745에 기재된 재조합 DNA 절차를 사용하여 성취할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "이펙터 분자"는, 예를 들면, 생물학적 활성 단백질, 예를 들면, 효소, 다른 항체 또는 항체 단편, 합성 또는 천연 발생 중합체, 핵산 및 이의 단편, 예를 들면, DNA, RNA 및 이의 단편, 방사성핵종, 특히 방사성요오드화물, 방사성동위원소, 킬레이트화 금속, 나노입자 및 리포터 그룹, 예를 들면, 형광 화합물 또는 NMR 또는 ESR 분광법에 의해 검출될 수 있는 화합물을 포함한다.
다른 이펙터 분자는 킬레이트화 방사성핵종, 예를 들면, 111In 및 90Y, Lu177, Bismuth213, Californium252, Iridium192 및 Tungsten188/Rhenium188; 또는 약물, 예를 들면, 이에 제한되는 것은 아니지만, 알킬포스포콜린, 토포이소머라제 I 억제제, 탁소이드 및 수라민을 포함할 수 있다.
다른 이펙터 분자는, 예를 들면, 진단에서 유용한 검출가능한 물질을 포함할 수 있다. 검출가능한 물질의 예는 다양한 효소, 보철 그룹, 형광 물질, 발광 물질, 생물발광 물질, 방사성 핵종, 양전자 방출 금속 (양전자 방출 단층 촬영에서 사용하기 위해), 및 비방사성 상자성 금속 이온을 포함한다.
또다른 실시형태에서, 이펙터 분자는 항체의 생체내 반감기를 증가시킬 수 있고/있거나, 항체의 면역원성을 저하시킬 수 있고/있거나, 상피 장벽을 가로질러 면역체계로 항체의 전달을 향상시킬 수 있다. 이러한 유형의 적합한 이펙터 분자의 예는 중합체, 알부민, 알부민 결합 단백질 또는 알부민 결합 화합물, 예를 들면, WO05/117984에 기재된 것을 포함한다.
이펙터 분자가 중합체인 경우, 일반적으로, 합성 또는 천연 발생 중합체, 예를 들면, 임의로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 폴리알킬렌, 폴리알케닐렌 또는 폴리옥시알킬렌 중합체 또는 분지형 또는 비분지형 폴리삭카라이드, 예를 들면, 호모- 또는 헤테로- 폴리삭카라이드일 수 있다.
상기 언급한 합성 중합체 상 존재할 수 있는 특이적 선택적 치환체는 하나 이상의 하이드록시, 메틸 또는 메톡시 그룹을 포함한다.
본원에 사용된 "유도체"는 반응성 유도체, 예를 들면, 티올-선택적 반응성 그룹, 예를 들면, 말레이미드 등을 포함하는 것을 의도한다. 반응성 그룹은 링커 세그먼트에 직접적으로 또는 이를 통해 중합체에 링크될 수 있다. 이러한 그룹의 잔기는 일부 경우 항체 단편 및 중합체 사이의 링크 그룹으로서 생성물의 일부를 형성할 것임을 인식할 것이다.
중합체의 크기는 목적에 따라 가변적일 수 있지만, 일반적으로 평균 분자량 범위 500Da 내지 50000Da, 예를 들면, 5000 내지 40000Da, 예를 들면, 20000 내지 40000Da일 것이다. 중합체 크기는 특히 생성물의 의도된 용도, 예를 들면, 특정 조직에 위치할 수 있는 능력, 예를 들면, 종양 또는 연장된 순환하는 반감기를 기초로 하여 선택될 수 있다 (다음 문헌을 참조: Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545).
적합한 중합체는, 폴리(에틸렌글리콜) 또는, 특히 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 이의 유도체와 같은, 및 특히 약 15000Da 내지 약 40000D의 범위의 분자량의 폴리알킬렌 중합체를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 본원 개시내용에서 사용하기 위한 항체를 폴리(에틸렌글리콜) (PEG) 모이어티에 부착한다. 하나의 특정한 예에서, 항체는 항체 단편이고, PEG 분자는 항체 단편 내에 위치한 임의의 이용가능한 아미노산 측쇄 또는 말단 아미노산 기능성 그룹, 예를 들면, 임의의 유리 아미노, 이미노, 티올, 하이드록실 또는 카복실 그룹을 통해 부착될 수 있다. 이러한 아미노산은 항체 단편에서 천연으로 발생할 수 있거나, 재조합 DNA 방법을 사용하여 단편 내로 조작될 수 있다 (예를 들면, 문헌을 참조한다: US5,219,996; US 5,667,425; WO98/25971, WO2008/038024). 하나의 실시형태에서, 본 발명의 항체 분자는 변형된 Fab 단편을 포함하고, 여기서 변형은 이펙터 분자의 부착을 가능하게 하는 하나 이상의 아미노산을 이의 중쇄의 C-말단에 부가하는 것이다. 적합하게는, 추가 아미노산은 이펙터 분자가 부착될 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 변형된 힌지 영역을 형성한다. 다중 위치를 사용하여 2개 이상의 PEG 분자를 부착할 수 있다.
적합하게는 PEG 분자는 항체 단편 내에 위치한 적어도 하나의 시스테인 잔기의 티올 그룹을 통해 공유결합된다. 변형된 항체 단편에 부착된 각각의 중합체 분자는 단편 내에 위치한 시스테인 잔기의 황 원자에 공유결합될 수 있다. 공유결합은 일반적으로 디설파이드 결합 또는, 특히, 황-탄소 결합일 것이다. 티올 그룹이 적합하게 활성화된 이펙터 분자의 부착지점으로서 사용되고, 예를 들면, 티올 선택적 유도체, 예를 들면, 말레이미드 및 시스테인 유도체가 사용될 수 있다. 활성화된 중합체는 상기한 바와 같이 중합체-변형된 항체 단편의 제조에서 출발 물질로서 사용할 수 있다. 활성화된 중합체는 티올 반응성 그룹을 포함하는 임의의 중합체, 예를 들면, α-할로카복실산 또는 에스테르, 예를 들면, 요오도아세트아미드, 이미드, 예를 들면, 말레이미드, 비닐 설폰 또는 디설파이드일 수 있다. 이러한 출발 물질은 상업적으로 입수할 수 있거나 (예를 들면, 제조원: Nektar, 이전 Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, USA), 시판되는 출발 물질로부터 종래의 화학적 절차를 사용하여 제조할 수 있다. 특정한 PEG 분자는 20K 메톡시-PEG-아민 (제조원: Nektar, 이전 Shearwater; Rapp Polymere; 및 SunBio) 및 M-PEG-SPA (제조원: Nektar, 이전 Shearwater)를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 분자에서 F(ab')2, Fab 또는 Fab'는 페길화되고, 즉, 예를 들면, EP 0948544 또는 EP1090037에 개시된 방법에 따라서 이에 공유 부착된 PEG (폴리(에틸렌글리콜))을 갖는다 [또한 문헌을 참조함: "Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, New York, "Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications", 1997, J. Milton Harris and S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC and "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam and A. Dent, Grove Publishers, New York; Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54:531-545]. 하나의 실시형태에서, PEG는 힌지 영역에서 시스테인에 부착된다. 하나의 예에서, PEG 변형된 Fab 단편은 변형된 힌지 영역에서 단일 티올 그룹에 공유결합된 말레이미드 그룹을 갖는다. 리신 잔기는 말레이미드 그룹에 공유결합될 수 있고, 리신 잔기 상 아민 그룹 각각은 대략적으로 20,000Da의 분자량을 갖는 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 중합체에 부착될 수 있다. Fab 단편에 부착된 PEG의 총 분자량은 따라서 대략적으로 40,000Da일 수 있다.
구체적인 PEG 분자는 또한 PEG2MAL40K (제조원: Nektar, 이전 Shearwater)로서 공지된 N,N'-비스(메톡시폴리(에틸렌 글리콜) MW 20,000) 변형된 리신의 2-[3-(N-말레이미도)프로피온아미도]에틸 아미드를 포함한다.
PEG 링커의 대안적인 공급원은 GL2-400MA2 (여기서, 하기 구조에서 m은 5이다) 및 GL2-400MA (여기서, m은 2이다)를 공급하는 NOF를 포함하고, n은 대략적으로 450이다:
Figure pct00007
m은 2 또는 5이다.
각각의 PEG는 약 20,000Da이다.
추가 대안적인 PEG 이펙터 분자는 다음 유형:
Figure pct00008
이 Dr Reddy, NOF 및 Jenkem로부터 이용가능하다.
하나의 실시형태에서, 쇄 내에 아미노산 226에 또는 주위에, 예를 들면, (순차적인 번호매김에 의해) 중쇄의 아미노산 226에 시스테인 아미노산 잔기를 통해 부착된 (예를 들면, 본원에 기재된 PEG로) 페길화된 항체 분자를 제공한다.
하나의 실시형태에서, DNA 서열과 같은 본원 개시내용의 다중-특이적 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다.
하나의 실시형태에서, 예를 들면, 하기 화학식 (I)의 폴리펩타이드 쇄 및 화학식 (II)의 폴리펩타이드 쇄와 같은 본원 개시내용의 다중-특이적 항체의 하나 이상, 예를 들면, 2개 이상, 또는 3개 이상의 폴리펩타이드 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다:
화학식 (I)의 폴리펩타이드 쇄:
VH-CH1-(CH2) s -(CH3) t -X-(V1) p ;
화학식 (II)의 폴리펩타이드 쇄: 및
(V3) r -Z-VL-C L -Y-(V2) q
상기 화학식에서;
VH는 중쇄 가변 도메인을 나타내고;
CH1은 중쇄 불변 영역의 도메인 1을 나타내고;
CH2는 중쇄 불변 영역의 도메인 2를 나타내고;
CH3은 중쇄 불변 영역의 도메인 3을 나타내고;
X는 결합 또는 링커를 나타내고;
V1은 dsscFv, dsFv, scFv, VH, VL 또는 VHH를 나타내고;
V3은 dsscFv, dsFv, scFv, VH, VL 또는 VHH를 나타내고;
Z는 결합 또는 링커를 나타내고;
VL은 경쇄 가변 도메인을 나타내고;
CL은 C카파와 같은 경쇄 불변 영역으로부터의 도메인을 나타내고;
Y는 결합 또는 링커를 나타내고;
V2는 dsscFv, dsFv, scFv, VH, VL 또는 VHH를 나타내고;
p는 0 또는 1을 나타내고;
q는 0 또는 1을 나타내고;
r은 0 또는 1을 나타내고;
s는 0 또는 1을 나타내고;
t는 0 또는 1을 나타내고;
여기서, p가 0인 경우, X는 부재하고, q가 0인 경우, Y는 부재하고, r이 0인 경우, Z는 부재하고;
q가 0인 경우, r은 1이고, r이 0인 경우, q는 1이고;
화학식 (II)의 폴리펩타이드 쇄는 적어도 하나의 dsscFv, dsFv, scFv, VH 또는 VHH를 포함하고;
화학식 (I)의 폴리펩타이드 쇄는 단백질 A 결합 도메인을 포함하고;
화학식 (II)의 폴리펩타이드 쇄는 단백질 A에 결합하지 않는다.
하나의 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드, 예를 들면, DNA는 벡터에 포함된다.
당해 기술분야의 숙련가는 V1 및/또는 V2 및/또는 V3이 dsFv를 나타내는 경우, 다중-특이적 항체는 X 또는 Y 또는 Z에 부착되지 않은 상응하는 유리 VH 또는 VL 도메인을 암호화하는 세번째 폴리펩타이드를 포함할 것임을 인식할 수 있다. 따라서, 본 발명의 다중-특이적 항체는 하나 이상, 2개 이상 또는 3개 이상의 폴리뉴클레오티드로 암호화될 수 있고, 이들은 하나 이상의 벡터 내에 포함될 수 있다.
벡터를 작제할 수 있는 일반적인 방법, 형질감염 및 배양 방법은 당해 기술분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있다. 이러한 측면에서, 문헌을 참조한다 [참조: "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York and the Maniatis Manual produced by Cold Spring Harbor Publishing].
또한 본 발명의 다중-특이적 단백질을 암호화하는 하나 이상의 DNA 서열을 포함하는 하나 이상의 클로닝 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 임의의 적합한 숙주 세포/벡터 시스템을 본 발명의 항체를 암호화하는 DNA 서열의 발현을 위해 사용할 수 있다. 세균, 예를 들면, 이. 콜리, 및 다른 미생물 시스템을 사용할 수 있거나, 진핵생물, 예를 들면, 포유동물, 숙주 세포 발현 시스템을 또한 사용할 수 있다. 적합한 포유동물 숙주 세포는 HEK, 예를 들면, HEK293, CHO, 골수종, NSO 골수종 세포 및 SP2 세포, COS 세포 또는 하이브리도마 세포를 포함한다.
본원 개시내용은 또한 본 발명의 다중-특이적 항체를 암호화하는 DNA로부터 단백질의 발현을 유도하는 적합한 상태하에 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 다중-특이적 항체를 단리하는 단계를 포함하는 본원 개시내용에 따른 다중-특이적 항체의 제조 방법을 제공한다.
중쇄 및 경쇄 둘 다를 포함하는 생성물의 제조를 위해, 세포주를 2개의 벡터로 형질감염될 수 있고, 첫번째 벡터는 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하고 두번째 벡터는 중쇄 폴리펩타이드를 암호화한다. 대안적으로, 단일 벡터를 사용할 수 있고, 상기 벡터는 경쇄 및 중쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함한다. 하나의 예에서, 세포주는, 각각 본 발명의 항체의 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 2개의 벡터로 형질감염될 수 있다. V1 및/또는 V2 및/또는 V3이 dsFv인 경우, 세포주는, 각각 본 발명의 다중-특이적 항체의 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 3개의 벡터로 형질감염될 수 있다.
하나의 실시형태에서, 세포주는, 각각 화학식 (I)의 폴리펩타이드 쇄 및 화학식 (II)의 폴리펩타이드 쇄로부터 선택된 상이한 폴리펩타이드를 암호화하는 2개의 벡터로 형질감염된다:
화학식 (I)의 폴리펩타이드 쇄:
VH-CH1-(CH2) s -(CH3) t -X-(V1) p ; 및
화학식 (II)의 폴리펩타이드 쇄:
(V3) r -Z-VL-C L -Y-(V2) q ;
상기 화학식에서:
VH는 중쇄 가변 도메인을 나타내고;
CH1은 중쇄 불변 영역의 도메인 1을 나타내고;
CH2는 중쇄 불변 영역의 도메인 2를 나타내고;
CH3은 중쇄 불변 영역의 도메인 3을 나타내고;
X는 결합 또는 링커를 나타내고;
V1은 dsscFv, dsFv, scFv, VH, VL 또는 VHH를 나타내고;
V3은 dsscFv, dsFv, scFv, VH, VL 또는 VHH를 나타내고;
Z는 결합 또는 링커를 나타내고;
VL은 경쇄 가변 도메인을 나타내고;
CL은 C카파와 같은 경쇄 불변 영역으로부터의 도메인을 나타내고;
Y는 결합 또는 링커를 나타내고;
V2는 dsscFv, dsFv, scFv, VH, VL 또는 VHH를 나타내고;
p는 0 또는 1을 나타내고;
q는 0 또는 1을 나타내고;
r은 0 또는 1을 나타내고;
s는 0 또는 1을 나타내고;
t는 0 또는 1을 나타내고;
여기서, p가 0인 경우, X는 부재하고, q가 0인 경우, Y는 부재하고, r이 0인 경우, Z는 부재하고;
q가 0인 경우, r은 1이고, r이 0인 경우, q는 1이고;
화학식 (II)의 폴리펩타이드 쇄는 적어도 하나의 dsscFv, dsFv, scFv, VH 또는 VHH를 포함하고;
화학식 (I)의 폴리펩타이드 쇄는 단백질 A 결합 도메인을 포함하고;
화학식 (II)의 폴리펩타이드 쇄는 단백질 A에 결합하지 않는다.
하나의 실시형태에서, V1이 dsFv이고, V1의 VH 도메인이 X에 부착되는 경우, 세포주는 V1의 VL 도메인을 암호화하는 세번째 벡터로 형질감염될 수 있다.
하나의 실시형태에서, V1이 dsFv이고, V1의 VL 도메인이 X에 부착되는 경우, 세포주는 V1의 VH 도메인을 암호화하는 세번째 벡터로 형질감염될 수 있다.
하나의 실시형태에서, V2가 dsFv이고, V2의 VH 도메인이 Y에 부착되는 경우, 세포주는 V2의 VL 도메인을 암호화하는 세번째 벡터로 형질감염될 수 있다.
하나의 실시형태에서, V2가 dsFv이고, V2의 VL 도메인이 Y에 부착되는 경우, 세포주는 V2의 VH 도메인을 암호화하는 세번째 벡터로 형질감염될 수 있다.
하나의 실시형태에서, V3이 dsFv이고, V3의 VH 도메인이 Y에 부착되는 경우, 세포주는 V3의 VL 도메인을 암호화하는 세번째 벡터로 형질감염될 수 있다.
하나의 실시형태에서, V3이 dsFv이고, V3의 VL 도메인이 Y에 부착되는 경우, 세포주는 V3의 VH 도메인을 암호화하는 세번째 벡터로 형질감염될 수 있다.
하나의 실시형태에서, V3이 부재하는 경우, V1 및 V2 둘 다가 dsFv이고, V2의 VL 도메인이 Y에 부착되고, V1의 VL 도메인이 X에 부착되는 경우, 세포주는 V1 및 V2 둘 다의 공통 VH 도메인을 암호화하는 세번째 벡터로 형질감염될 수 있다.
하나의 실시형태에서, V3이 부재하는 경우, V1 및 V2 둘 다가 dsFv이고, V2의 VH 도메인이 Y에 부착되고, V1의 VH 도메인이 X에 부착되는 경우, 세포주는 공통 V1 및 V2 둘 다의 VL 도메인을 암호화하는 세번째 벡터로 형질감염될 수 있다.
숙주 세포로 형질감염된 각각의 벡터의 비가 다중-특이적 항체 생성물의 발현을 최적화하기 위해 변할 수 있다는 것을 인식할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 2개의 벡터가 사용되는 경우, 하나는 화학식 (I)의 폴리펩타이드 쇄 즉, 중쇄를 코딩하고, 나머지 하나는 화학식 (II)의 폴리펩타이드 쇄, 즉, 경쇄를 코딩하고, 벡터 (LC 함유 벡터): (HC 함유 벡터)의 비는 1:1, 5:1, 바람직하게는 1,5:1 내지 5:1를 포함할 수 있고, 예를 들면, 비는 2:1, 3:1, 4:1, 5:1일 수 있다. 하나의 실시형태에서, 3개의 벡터가 사용되는 경우, 벡터 (LC 함유 벡터): (HC 함유 벡터): 유리 도메인 함유 벡터의 비는 1:1:1 내지 5:1:1을 포함할 수 있다. 당해 기술분야의 숙련가가 형질감염 후 단백질 발현 수준의 일상적인 시험으로 최적 비를 발견할 수 있다는 것은 인식할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 각각의 벡터로부터 다중-특이적 작제물의 각각의 폴리펩타이드 쇄의 발현의 수준은 동일한 또는 상이한 프로모터를 사용하여 제어될 수 있다.
2개 이상 또는, 존재하는 경우, 3개의 폴리펩타이드 성분이 단일 벡터에서 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있다는 것을 인식할 수 있다. 또한 폴리펩타이드 성분의 2개 이상, 특히 3개 이상이 단일 벡터에서 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 경우, 각각의 폴리펩타이드 성분의 상대적 발현은 본원 개시내용의 폴리펩타이드 성분을 암호화하는 각각의 폴리뉴클레오티드를 위한 상이한 프로모터를 사용하여 변할 수 있음을 인지할 수 있다.
하나의 실시형태에서, 벡터는 단일 프로모터의 제어하에 본 발명의 다중-특이적 항체의 2개 또는 존재하는 경우, 3개의 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 단일 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 벡터는 본원 개시내용의 다중-특이적 항체의 2개, 또는 존재하는 경우, 3개의, 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 단일 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서, 각각의 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 각각의 폴리뉴클레오티드 서열은 상이한 프로모터의 제어하에 있다.
하나의 양상에서, 본 발명은 상기 정의된 화학식 (I)의 폴리펩타이드 쇄 및 화학식 (II)의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 다중-특이적 항체의 제조 방법을 제공하고, 상기 방법은:
a) 상기 정의된 화학식 (I)의 폴리펩타이드 쇄 및 화학식 (II)의 폴리펩타이드 쇄를, 숙주 세포에서 발현하는 단계, 여기서, 화학식 (II)의 폴리펩타이드 쇄는 화학식 (I)의 폴리펩타이드 쇄보다 과량인, 단계; 및
b) 단계 a)에서 발현된 폴리펩타이드의 조성물을 회수하는 단계, 상기 조성물은 다중-특이적 항체 및 화학식 (II-II)의 LC 이량체를 포함하는, 단계; 및
c) 다중-특이적 항체를 정제하는 단계, 여기서, s가 1이고, t가 1인 경우, 상기 다중-특이적 항체를 화학식 (I)의 2개의 중쇄 및 화학식 (II)의 2개의 연합된 경쇄를 갖는 이량체로서 정제하고, s가 0이고, t가 0인 경우, 상기 다중-특이적 항체를 화학식 (I)의 하나의 중쇄 및 화학식 (II)의 하나의 연합된 경쇄를 갖는 이량체로서 정제하는, 단계
를 포함하고;
화학식 (II)의 폴리펩타이드 쇄는 적어도 하나의 dsscFv, dsFv, scFv, VH 또는 VHH를 포함하고;
화학식 (I)의 폴리펩타이드 쇄는 단백질 A 결합 도메인을 포함하고;
화학식 (II)의 폴리펩타이드 쇄는 단백질 A에 결합하지 않고;
단계 c)는 임의로 적어도 하나의 정제 단계 후, 단계 b)에서 회수된 폴리펩타이드의 조성물을 단백질 A 친화도 크로마토그래피 컬럼에 적용함을 포함한다.
중쇄를 보다 과량인 경쇄를 발현하는 수단은 당해 기술분야에 잘 공지되어 있고, 예를 들면, 상기한 바와 같이 숙주 세포의 형질감염을 위해 사용되는 벡터의 비를 변화시키는 것을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 2개의 벡터가 사용되고, 하나는 화학식 (I)의 폴리펩타이드 쇄, 즉, 중쇄를 코딩하고, 나머지 하나는 화학식 (II)의 폴리펩타이드 쇄, 즉, 경쇄를 코딩하고, 여기서, 벡터 (LC 함유 벡터): (HC 함유 벡터)의 비는 1,5:1 내지 5:1를 포함하고, 예를 들면, 1,5:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1이다. 또다른 실시형태에서, 고유한 발현 벡터가 사용되고, 이는 HC를 코딩하는 전사 유닛을 보다 과량인 LC를 코딩하는 전사 유닛을 포함한다. 또다른 실시형태에서, 동일한 양의 벡터 또는 전사 유닛이 사용되지만, 상기 벡터 또는 전사 유닛은, HC 코딩 유닛이 부재하고 LC의 과-발현을 촉진하는 LC 코딩 유닛에서 변형된 전사 또는 번역 조절 요소 (예를 들면, 프로모터)를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 단계 c)는 정화 단계를 포함한다. 정화를 위한 수단은 당해 기술분야에 잘 공지되어 있고, 세포 성분 및 다른 데브리스를 포함하는 불순물을 제거하기 위해 원심분리, 여과, 응집, 및 pH 조정을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 단계 c)는 단계 b)에서 회수된 폴리펩타이드의 조성물을 사용하고, 이어서, 정화 단계로서 단백질 A 친화도 크로마토그래피 컬럼에 적용함을 포함한다. 이러한 실시형태에서, 단계 b)에서 회수된 폴리펩타이드의 조성물을 첫번째로 정화하고, 이어서, 단백질 A 친화도 크로마토그래피 컬럼 상에 적재한다.
또다른 실시형태에서, 단계 c)는 단지 하나의 정제 단계, 즉, 단백질 A 정제 단계를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 본 발명의 다중-특이적 항체의 제조 방법은 단백질 L 친화도 크로마토그래피를 포함하지 않는다.
유리하게는, 본 발명자들은 선행기술에 개시된 다중-특이적 항체를 재-조작하여 임의의 추가 정제 단계를 필요로 하지 않고 단백질 A 정제 단계를 사용하여 용이하고 효율적으로 정제할 수 있는 개선된 다중-특이적 항체를 제공하였다. 본 발명의 항체의 화학식 (II)의 폴리펩타이드는 단백질 A에 결합하지 않고, 이에 단지 다중-특이적 항체만이 단백질 A에, 이의 중쇄를 통해 결합하고, LC 이량체는 결합되지 않은 분획으로 유지된다.
하나의 실시형태에서, 5% 미만, 바람직하게는 4% 미만, 또는 3% 미만, 또는 2% 미만, 및 보다 바람직하게는 1% 미만의 화학식 (II-II)의 LC 이량체가 다중-특이적 항체로 공동-정제되고, 상기 다중-특이적 항체는, s가 1이고, t가 1인 경우, 화학식 (I)의 2개의 중쇄 및 화학식 (II)의 2개의 연합된 경쇄를 갖는 이량체로서 정제되고, s가 0이고, t가 0인 경우, 화학식 (I)의 하나의 중쇄 및 화학식 (II)의 하나의 연합된 경쇄를 갖는 이량체로서 정제된다.
또다른 양상에서, 상기 정의된 화학식 (I)의 폴리펩타이드 쇄 및 화학식 (II)의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 다중-특이적 항체를 정제하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기를 포함한다:
a) 상기 정의된 화학식 (I)의 폴리펩타이드 쇄 및 화학식 (II)의 폴리펩타이드 쇄의 조성물을 수득하는 단계 (상기 조성물은 다중-특이적 항체를 포함하고, 여기서, s가 1이고, t가 1인 경우, 다중-특이적 항체는 화학식 (I)의 2개의 중쇄 및 화학식 (II)의 2개의 연합된 경쇄를 갖는 이량체이고; s가 0이고, t가 0인 경우, 다중-특이적 항체는 화학식 (I)의 하나의 중쇄 및 화학식 (II)의 하나의 연합된 경쇄를 갖는 이량체; 및 (LC 이량체)와 함께 연합된 화학식 (II-II)의 2개의 경쇄의 이량체이고;
여기서, 화학식 (II)의 폴리펩타이드 쇄는 적어도 하나의 dsscFv, dsFv, scFv, VH 또는 VHH를 포함하고;
화학식 (I)의 폴리펩타이드 쇄는 단백질 A 결합 도메인을 포함하고;
화학식 (II)의 폴리펩타이드 쇄는 단백질 A에 결합하지 않는다);
b) 단계 a)에서 수득한 조성물을, 단백질 A 친화도 컬럼 상에 적재하여, 다중-특이적 항체는 컬럼 상에 보유되지만, LC 이량체는 컬럼에 결합하지 않고;
c) 단백질 A 친화도 컬럼을 세척하는 단계;
d) 다중-특이적 항체를 용리하는 단계;
e) 다중-특이적 항체를 회수하는 단계.
하나의 실시형태에서, 단백질 A 컬럼 상에 적재된 조성물은 정화되었다. 수개의 단백질 A 컬럼을 사용할 수 있고, 특히 네이티브 단백질 A 컬럼, 예를 들면, 컬럼 MabSelect (GE Healthcare)을 사용할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 단백질 A 친화도 컬럼은 MabSelect 컬럼이다. 하나의 실시형태에서, 단백질 A는 천연 발생 단백질 A의 변종이고, 상기 단백질 A 변종은 VH3 도메인에 결합하는 이의 능력을 유지한다. 적재 (또는 결합) 단계는 pH 7-8에서, 예를 들면, 7.4에서 수행될 수 있다. 단계 a)에서 수득한 조성물은 단백질 A 친화도 컬럼 상으로 5, 10 또는 15 분 접촉 시간 동안 적재될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 적재 단계 b)는 200mM 글리신, pH7.5를 포함하는 결합 완충제로 수행된다.
하나의 실시형태에서, 용리 단계 d)는 산성 상태하에 수행된다. 하나의 실시형태에서, 용리 단계 d)는 2 내지 4,5를 포함하는 pH에서, 바람직하게는 3 내지 4를 포함하는 pH에서 수행된다. 하나의 실시형태에서, 단계 d)는 0.1M 나트륨 시트레이트 pH3.1 용리 단계이다. 하나의 실시형태에서, 단계 d)는 0.1M 나트륨 시트레이트 pH3.2 용리 단계이다. 하나의 실시형태에서, 단계 d)는 0.1M 나트륨 시트레이트 pH3.2를 사용하는 첫번째 용리 단계, 및 0.1M 시트레이트 pH2.1을 사용하는 두번째 용리 단계를 포함한다. 대안적으로, 단계 d)에서 용리는 카오트로픽(chaotropic) 상태하에 또는 온화한 용리를 포함하는 결합된 다중-특이적 항체의 용리를 촉진하는 임의의 다른 상태하에 수행할 수 있다.
하나의 실시형태에서, 다중-특이적 항체를 정제하는 공정은 단계 d) 전 또는 후에 적어도 하나의 추가 정제 단계를 포함한다.
예를 들면, 상기 공정은 추가로 생성물 및 공정 관련 불순물이 생성물 스트림으로부터 적합하게 분해되는 것을 보장하기 위해 추가 크로마토그래피 단계(들)을 포함할 수 있고, 이온 (양이온 또는 음이온) 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및 혼합 방식 크로마토그래피를 포함한다. 정제 공정은 또한 하나 이상의 한외 여과 단계, 예를 들면, 농도 및 정용여과 단계로 구성될 수 있다.
상기 사용된 정제된 형태는 적어도 90% 순도, 예를 들면, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% w/w 이상의 순도를 언급하는 것을 의도한다.
실질적으로 내독소 비함유는 일반적으로 항체 생성물 mg당 1 EU 이하, 예를 들면, 항체 생성물 mg당 0.5 또는 0.1 EU의 내독소 함량을 언급함을 의도한다.
숙주 세포 단백질 또는 DNA의 실질적으로 비함유는 일반적으로 적합한 경우, 항체 생성물 mg당 숙주 세포 단백질 및/또는 DNA 함량 400μg 이하, 예를 들면, 항체 생성물 mg당 100μg 이하, 특히 항체 생성물 mg당 20μg를 언급함을 의도한다.
본원 개시내용에 따른 다중-특이적 단백질은 숙주 세포로부터 양호한 수준으로 발현된다. 따라서, 항체 및/또는 단편의 성질은 시판되는 프로세싱에 최적화되고 이에 용이한 것으로 나타난다.
유리하게는, 본원 개시내용의 다중-특이적 항체는 정제 후 나타나는 응집의 양은 최소화되고, 약제학적 농도에서 작제물의 제형 중 단량체의 양은 최대화되고, 예를 들면, 단량체는 총 단백질의 50%, 60%, 70% 또는 75% 이상, 예를 들면, 80 또는 90% 이상, 예를 들면, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 이상으로 존재할 수 있다. 하나의 예에서, 본원 개시내용의 다중-특이적 항체의 정제된 샘플은 4℃에서 28 일 저장 후 98% 또는 99% 초과 단량체가 남아있다. 하나의 예에서, 포스페이트 완충된 염수 (PBS) 중 5mg/ml에서 본원 개시내용의 다중-특이적 항체의 정제된 샘플은 4℃에서 28 일 저장 후 98% 초과 단량체로 유지된다.
단량체 수율은 임의의 적합한 방법, 예를 들면, 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 측정할 수 있다.
본원 개시내용의 항체 및 이를 포함하는 조성물은 병리학적 상태의 치료에서, 예를 들면, 치료 및/또는 예방에서 유용하다.
본원 개시내용은 또한 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 본원 개시내용의 항체를 포함하는 약제학적 또는 진단적 조성물을 제공한다. 따라서, 치료에서 및 특히 본원에 개시된 징후를 위한 약물의 제조에서 본원 개시내용의 항체의 용도를 제공한다.
조성물은 보통 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 멸균, 약제학적 조성물의 일부로서 공급될 것이다. 본원 개시내용의 약제학적 조성물은 추가로 약제학적으로-허용되는 보조제를 포함할 수 있다.
본원 개시내용은 또한 본원 개시내용의 항체를 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 첨가하고 혼합하는 것을 포함하는 약제학적 또는 진단적 조성물의 제조 방법을 제공한다.
항체는 약제학적 또는 진단적 조성물에 단독 활성 성분일 수 있거나, 다른 활성 성분에 의해 동반될 수 있다.
추가 실시형태에서, 본원 개시내용에 따른 항체, 단편 또는 조성물은 추가 약제학적 활성제와 병용하여 이용된다.
약제학적 조성물은 적합하게 본 발명의 항체의 치료학적 유효량을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "치료학적 유효량"은 표적화된 질환 또는 상태의 치료, 개선 또는 예방에 필요한 또는 검출가능한 치료학적 또는 예방적 효과를 나타내는 치료제의 양을 언급한다. 임의의 항체의 경우, 치료학적 유효량은 초기에 세포 배양 검정에서 또는 동물 모델 중 어느 하나에서, 보통 설치류, 토끼, 개, 돼지 또는 영장류에서 평가될 수 있다. 동물 모델은 또한 적합한 농도 범위 및 투여 경로를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 이에 이러한 정보는 사람에서 유용한 용량 및 투여 경로를 결정하기 위해 사용할 수 있다.
사람 대상자에 대한 정확한 치료학적 유효량은 질환 상태의 중증도, 대상자의 일반적 건강, 대상자의 연령, 체중 및 성별, 식이, 투여 시간 및 빈도, 약물 병용물(들), 반응 민감성 및 치료에 대한 내성/반응에 좌우될 것이다. 이러한 양은 일반적인 실험에 의해 결정할 수 있고, 임상의의 판단 내에 있다.
조성물은 개별적으로 환자에게 투여될 수 있거나, 다른 제제, 약물 또는 호르몬과 (예를 들면, 동시에, 순차적으로 또는 개별적으로) 병용하여 투여될 수 있다.
본원 개시내용의 항체가 투여되는 용량은 치료될 상태의 성질, 존재하는 염증의 정도 및 항체가 예방적으로 사용되는지 또는 기존 상태를 치료하는지 여부에 좌우된다.
용량의 빈도는 항체의 반감기 및 이의 효과 기간에 좌우될 것이다.
약제학적으로 허용되는 담체는 자체로 조성물을 받는 개체에게 유해한 항체의 생산을 유발하여서는 안되고, 독성이어서는 안된다. 약제학적으로 허용되는 담체는 당해 기술분야에 잘 공지되어 있다.
약제학적으로 허용되는 염을 사용할 수 있고, 예를 들면, 무기산 염, 예를 들면, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 포스페이트 및 설페이트, 또는 유기산의 염, 예를 들면, 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트 및 벤조에이트를 사용할 수 있다.
치료학적 조성물 중 약제학적으로 허용되는 담체는 액체, 예를 들면, 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올을 추가로 포함할 수 있다. 추가로, 보조 물질, 예를 들면, 습윤제 또는 유화제 또는 pH 완충 물질이, 이러한 조성물에 존재할 수 있다. 이러한 담체는 환자가 섭취하기 위해 약제학적 조성물을 정제, 알약, 드라제, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리 및 현탁액으로 제형화될 수 있게 한다.
투여를 위해 적합한 형태는, 예를 들면, 주사 또는 주입에 의한, 예를 들면, 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여를 위한 적합한 형태를 포함한다. 제품이 주사 또는 주입을 위한 것인 경우, 유성 또는 수성 비히클 중 현탁액, 용액 또는 에멀젼의 형태일 수 있고, 제형화 제제, 예를 들면, 현탁제, 보존제, 안정화제 및/또는 분산제를 포함할 수 있다. 대안적으로, 항체는 적합한 멸균 액체와 함께 사용하기 전에 재구성을 위한 무수 형태일 수 있다.
제형화되면, 본 발명의 조성물은 대상자에게 직접적으로 투여될 수 있다. 치료될 대상자는 동물일 수 있다. 그러나, 하나 이상의 실시형태에서 조성물은 사람 대상자에게 투여하기 위해 개조된다.
본 개시내용의 약제학적 조성물은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심실내, 경피, 경피, 피하, 복강내, 비내, 장관, 국소, 설하, 질내 또는 직장 경로를 포함하는 임의의 다수의 경로로 투여할 수 있다. 전형적으로, 치료학적 조성물은 주사가능한 형태로서, 액체 용액 또는 현탁액으로서 제조할 수 있다. 주사 전 액체 비히클 중 용액 또는 현탁액을 위한 적합한 고체 형태를 또한 제조할 수 있다.
조성물의 직접적 전달은 일반적으로 주사, 피하, 복강내, 정맥내 또는 근육내, 또는 조직의 사이질 공간으로의 전달에 의해 성취될 것이다. 조성물은 또한 관심 대상 특정 조직 내로 투여될 수 있다. 투여량 치료는 단일 용량 일정 또는 용량 일정일 수 있다.
조성물에서 활성 성분이 항체일 수 있음을 인식할 것이다. 이와 같이, 위장관 분해에 민감할 것이다. 따라서, 조성물이 위장관을 사용하는 경로에 의해 투여되어야 하는 경우, 조성물은 유리하게는 분해로부터 항체를 보호하지만 위장관으로부터 흡수되는 경우 항체를 방출한다 제제를 포함할 것이다.
병리학적 상태 또는 장애는, 예를 들면, 감염 (바이러스, 세균, 진균 및 기생충), 감염 관련 내독성 쇼크, 관절염, 예를 들면, 류마티스 관절염, 천식, 예를 들면, 심각한 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 골반염 질환, 알츠하이머병, 염증성 장 질환, 크론병, 궤양성대장염, 페이로니병, 복강 질환, 담낭 질환, 털뭉치 질환(Pilonidal disease), 복막염, 건선, 혈관염, 수술 유착(surgical adhesions), 뇌졸중, I형 당뇨병, 라임병, 수막뇌염, 자가면역 포도막염, 중추 및 및 말초 신경계의 면역 매개 염증 장애, 예를 들면, 다발경화증, 루푸스 (예를 들면, 전신 홍반 루푸스) 및 길랑-바르 증후군, 아토피피부염, 자가면역간염, 섬유화 폐포염, 그레이브병, IgA 신장병증, 특발저혈소판자색반병, 메니에르병, 천포창, 원발쓸개관간경화증, 사코이드증, 공피증, 베게너 육아종증, 다른 자가면역 장애, 췌장염, 외상 (수술), 이식편대 숙주 질환, 이식 거부, 허혈성 질환을 포함하는 심장 질환, 예를 들면, 심근경색증 뿐만 아니라 죽상동맥경화증, 혈관내응고, 뼈흡수, 뼈다공증, 골관절염, 치주염 및 위산저하증으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
본원 개시내용은 또한 통증, 특히 염증 관련 통증의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 본 발명에 따른 다중-특이적 항체를 제공한다.
따라서, 치료 및 이를 이용하는 치료 방법에 사용하기 위한 본원 개시내용에 따른 다중-특이적 항체를 제공한다.
특정 상태의 예방 또는 치료를 위해 필요한 본 발명의 항체의 양은 항체 및 치료될 상태에 좌우되어 가변적일 것이다.
본 발명의 항체는 또한 진단에서, 예를 들면, 생체내 진단 및 질환 상태의 영상화에서 사용할 수 있다.
본 명세서의 문맥에서 "포함하는(Comprising)"은 포함하는(including)을 의미하는 것을 의도한다. 기술적으로 적합한 경우, 본 발명의 실시형태를 조합할 수 있다. 실시형태는 특정한 특징/요소로서 본원에 기재된다. 본원 개시내용은 또한 상기 특징/요소로 이루어지거나 본질적으로 이루어진 개별적인 실시형태로 확장된다.
특허 및 출원과 같은 기술적인 참조는 참조로서 포함된다.
본원에 구체적이고 분명하게 인용된 임의의 실시형태는 단독으로 또는 하나 이상의 추가 실시형태와 조합하여 면책의 근거를 형성할 수 있다.
본원 개시내용은 추가로 수반된 도면을 참조하여 단지 하기 실시예에서 예의 방식으로 기술한다:
도 1: 항-알부민 645 항체의 서열
도 2: 최종 정제된 TrYbe 03의 분석. 도 2a: BEH200 SEC-UPLC (수직축; EU (방출 단위(Emission Unit)), 수평축; 시간 (분)). 도 2b: SDS-PAGE (레인 M:Mark12™; 레인 1: 비-환원 상태; 레인 2: 환원 상태).
도 3: Wittrup (Wittrup 01 및 Wittrup 02) 및 TrYbe 항체 (TrYbe 03 내지 TrYbe 06) 및 상응하는 LC 이량체의 도식. Wittrup 분자 모두는 공통 hg1FL 및 Fab 영역을 갖는다. TrYbe 분자 모두는 공통 Fab 영역을 갖는다.
도 4: Wittrup 01 및 Wittrup 02 분자에 대해 적재 물질, 용리액 및 통과 유체를 포함하는 단백질 A 및 단백질 L 크로마토그래피의 환원 (도 4a) 및 비-환원 (도 4b) SDS-PAGE 분석. 샘플은 하기와 같이 적재된다: 레인 M: Mark12™; 레인 1A-1E: Wittrup 01 (1A: 단백질 A 적재 (상청액); 1B: 단백질 A 용리액; 1C: 단백질 L 적재 (단백질 A 통과 유체); 1D: 단백질 L 용리액; 1E: 단백질 L 통과 유체); 레인 2A-2E: Wittrup 02 (2A: 단백질 A 적재 (상청액); 2B: 단백질 A 용리액; 2C: 단백질 L 적재 (단백질 A 통과 유체); 2D: 단백질 L 용리액; 2E: 단백질 L 통과 유체).
도 5: TrYbe 03 및 TrYbe 04 분자에 대한 적재 물질, 용리액 및 통과 유체를 포함하는 단백질 A 및 단백질 L 크로마토그래피의 환원 (도 5a) 및 비-환원 (도 5b) SDS-PAGE 분석. 샘플은 하기와 같이 적재된다: 레인 M: Mark12™; 레인 3A-3E: TrYbe 03 (3A: 단백질 A 적재 (상청액); 3B: 단백질 A 용리액; 3C: 단백질 L 적재 (단백질 A 통과 유체); 3 D: 단백질 L 용리액; 3E: 단백질 L 통과 유체); 레인 4A-4E: TrYbe 04 (4A: 단백질 A 적재 (상청액); 4B: 단백질 A 용리액; 4C: 단백질 L 적재 (단백질 A 통과 유체); 4D: 단백질 L 용리액; 4E: 단백질 L 통과 유체). 도 5c: 환원 SDS-PAGE의 밀도측정(Densitometrical) 분석. 샘플은 TrYbe 03 및 TrYbe 04의 단백질 A 용리액을 포함한다 (수평축). 분석을 수직축에서 중쇄 대역의 밀도에 대한 백분율로서 나타낸다.
도 6: TrYbe 03 및 TrYbe 05 분자에 대한 적재 물질, 용리액 및 통과 유체를 포함하는 단백질 A 및 단백질 L 크로마토그래피의 환원 (도 6a) 및 비-환원 (도 6b) SDS-PAGE 분석. 샘플은 하기와 같이 적재된다: 레인 M: Mark12™; 레인 3A-3E: TrYbe 03 (3A: 단백질 A 적재 (상청액); 3B: 단백질 A 용리액; 3C: 단백질 L 적재 (단백질 A 통과 유체); 3D: 단백질 L 용리액; 3E: 단백질 L 통과 유체); 레인 5A-5E: TrYbe 05 (5A: 단백질 A 적재 (상청액); 5B: 단백질 A 용리액; 5C: 단백질 L 적재 (단백질 A 통과 유체); 5D: 단백질 L 용리액; 5E: 단백질 L 통과 유체). 도 6c: 환원 SDS-PAGE의 밀도측정 분석. 샘플은 TrYbe 03 및 TrYbe 05의 단백질 A 용리액을 포함한다 (수평축). 분석을 수직축에서 중쇄 대역의 밀도에 대한 백분율로서 나타낸다.
도 7: TrYbe 04 및 TrYbe 06 분자에 대한 적재 물질, 용리액 및 통과 유체를 포함하는 단백질 A 및 단백질 L 크로마토그래피의 환원 (도 7a) 및 비-환원 (도 7b) SDS-PAGE 분석. 샘플은 하기와 같이 적재된다: 레인 M: Mark12™; 레인 4A-4E: TrYbe 04 (4A: 단백질 A 적재 (상청액); 4B: 단백질 A 용리액; 4C: 단백질 L 적재 (단백질 A 통과 유체); 4D: 단백질 L 용리액; 4E: 단백질 L 통과 유체); 레인 6A-6E: TrYbe 06 (6A: 단백질 A 적재 (상청액); 6B: 단백질 A 용리액; 6C: 단백질 L 적재 (단백질 A 통과 유체); 6D: 단백질 L 용리액; 6E: 단백질 L 통과 유체). 도 7c: 환원 SDS-PAGE의 밀도측정 분석. 샘플은 TrYbe 04 및 TrYbe 06의 단백질 A 용리액을 포함한다 (수평축). 분석을 수직축에서 중쇄 대역의 밀도에 대한 백분율로서 나타낸다.
도 8: 시판되는 정제된 단백질 A (도 8a) 및 정제된 재조합 단백질 A (도 8b)에 대해서 시험 분자 및 대조군의 각각의 농도 (수평축)에 대한 결합 반응 (반응 단위 또는 공명 단위에 대한 RU; 수직축).
실시예
실시예 1: Fab-2xdsscFv (TrYbe)의 본 발명의 실시예의 개선된 다중-특이적 항체 포맷의 제조
CHO-S XE 세포주에서 유전자 설계 및 발현
TrYbe 항체를 Fab 위치에 고정된 항-항원#1 (또는 "Ag#1") V-영역; 항-알부민(하기 실시예에서 항원#2, 또는 "Ag#2") V-영역 (645gL4gH5) 및 항원#3 (또는 "Ag#3")을 갖도록 설계하였다. V-영역 (VH1)을 HL 방향 (dsHL)으로 디설파이드-안정화된 scFv 내로 새로 포맷하고, 각각의 중쇄 및 경쇄 불변 영역의 C-말단에 11-아미노산 글리신-세린 풍부 링커를 통해 링크하였다. 수득한 항체를 Trybe 03으로서 언급한다. 항-알부민 645 항체의 서열은 도 1에 나타낸다.
경쇄 및 중쇄 유전자를 독립적으로 일과성 발현을 위한 등록상표가 있는 포유동물 발현 벡터 내로 hCMV 프로모터의 제어하에 클로닝하였다. 동일한 비의 둘 다의 플라스미드를 시판되는 ExpiCHO 엑스피펙타민 일과성 발현 키트 (Thermo Scientific)를 사용하여 CHO-S XE 세포주 (UCB) 내로 형질감염하였다. 배양물을 Corning 롤러 병에서 통풍 마개를 사용하여 37℃, 8.0% CO2, 190 rpm에서 인큐베이팅하였다. 18-22 시간 후, 배양물에 적합한 용적의 CHO 인핸서 및 제조자에 의해 제공된 HiTiter 방법을 위한 공급물을 공급하였다. 배양물을 32℃, 8.0% CO2, 190 rpm에서 추가 10 내지 12 일 동안 재인큐베이팅하였다. 상청액을, 0.45 μm 필터에 이은 0.2 μm 필터를 통한 필터-멸균 전에, 원심분리에 의해 4000 rpm에서 1 시간 동안 4℃에서 수거하였다. 발현 역가를 1 ml GE HiTrap 단백질 G 컬럼 (GE Healthcare) 및 내부에서(in-house) 생성된 Fab 표준를 사용하여 단백질 G HPLC로 정량화하였다. 발현 역가는 160 mg/L였다.
단백질 A 친화도 크로마토그래피를 사용하는 TrYbe 03의 정제
TrYbe 03을 네이티브 단백질 A 포획 단계, 이어서, 분취용 크기 배제 연마 단계로 정제하였다. 표준 일과성 CHO 발현으로부터 정화된 상청액을 MabSelect (GE Healthcare) 컬럼 상으로 5 분 접촉 시간을 제공하여 적재하고, 결합 완충제 (20mM Hepes pH7.4 + 150mM NaCl)로 세척하였다. 결합된 물질을 0.1M 나트륨 시트레이트 pH3.1 단계 용리로 용리하고, 2M 트리스/HCl pH8.5로 중화하고, 280nm에서 흡광도에 의해 정량화하였다.
크기 배제 크로마토그래피 (SE-UPLC)를 사용하여 용리된 생성물의 순도 상태를 측정하였다. 항체 (약 2 μg)를 BEH200, 200 Å, 1.7 μm, 4.6 mm ID x 300 mm 컬럼 (Waters ACQUITY) 상에 적재하고, 0.35 mL/min에서 0.2 M 포스페이트 pH 7의 등용매 구배로 현상하였다. 연속 검출을 280 nm에서 흡광도 및, 다중-채널 형광 (FLR) 검출기 (Waters)에 의해서 수행하였다. 용리된 TrYbe 03 항체는 72% 단량체인 것으로 발견되었다.
중화된 샘플을 Amicon Ultra-15 농축기 (10kDa 분자량 컷 오프(cut off) 막)를 사용하여 농축하고. 4000xg에서 스윙 아웃 로터(swing out rotor)에서 원심분리하였다. 농축된 샘플을 PBS, pH7.4에서 평형화된 XK16/60 Superdex200 컬럼 (GE Healthcare)에 적용하고, PBS, pH7.4의 등용매 구배로 1ml/min에서 현상하였다. 분획을 BEH200, 200A, 1.7 μm, 4.6 mm ID x 300 mm 컬럼 (Aquity) 상에서 크기 배제 크로마토그래피로 수집하고, 분석하였고, 0.2 M 포스페이트 pH 7의 등용매 구배로 0.35 mL/min에서 현상하고, 280nm 및 다-채널 형광 (FLR) 검출기 (Waters)에서 흡광도에 의해 검출하였다. 선택된 단량체 분획을 풀링하고, 0.22 μm 멸균 여과하고, 최종 샘플을 DropSense96 (Trinean) 상 A280 Scanning으로 농도에 대해 검정하였다. 내독소 수준은 Limulus Amebocyte Lysate (LAL) 시험 카트리지를 사용한 Charles River's EndoSafe® 휴대용 시험 시스템으로 평가하여 1.0EU/mg 미만이었다.
크기 배제 크로마토그래피에 의한 분석
최종 TrYbe 03의 단량체 상태를 BEH200, 200A, 1.7 μm, 4.6 mm ID x 300 mm 컬럼 (Aquity) 상 크기 배제 크로마토그래피로 측정하고, 0.2 M 포스페이트 pH 7의 등용매 구배로 0.35 mL/min에서 현상하고, 280nm 및 다중-채널 형광 (FLR) 검출기 (Waters)에서 흡광도에 의해 검출하였다. 최종 TrYbe 03 항체는 >99% 단량체인 것으로 발견되었다. (도 2a)
SDS-PAGE 분석
나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에 의한 분석을 위해 샘플을 4 x Novex NuPAGE LDS 샘플 완충제 (Life Technologies) 및 10X NuPAGE 샘플 환원제 (Life Technologies) 또는 100 mM N-에틸말레이미드 (Sigma-Aldrich) 중 어느 하나를 약 5μg 정제된 단백질에 첨가하여 제조하고, 100℃로 3 분 동안 가열하였다. 샘플을 10 웰 Novex 4-20% 트리스-글리신 1.0 mm SDS-폴리아크릴아미드 겔 (Life Technologies) 상으로 적재하고, 225 V의 정전압에서 40 분 동안 트리스-글리신 SDS 작동 완충제 (Life Technologies) 중에서 분리하였다. Novex Mark12 광-범위 단백질 표준 (Life Technologies)을 표준으로서 사용하였다. 겔을 Coomassie Quick Stain (Generon)으로 염색하고, 증류수에서 탈색하였다.
비-환원 SDS-PAGE 상 TrYbe (레인 1)에서, 약 100 kDa의 이론적인 분자량 (MW)은, 약 120 kDa로 이동하였다 (도 2b). TrYbe 단백질이 환원되는 경우 (레인 2), 둘 다의 쇄는 이들의 각각의 이론적인 MW, 중쇄 (HC) 약 52 kDa 및 경쇄 (LC) 약 51 kDa에 접근하는 이동 속도로 이동하였다. 약 45 - 50 kDa에서 비-환원된 겔 (레인 1) 상 추가 대역은 분자의 Fab 부분에서 디설파이드 결합이 없는 '유리' LC 및 HC이고, 이들은 완전히 환원되지 않았기 때문에 레인 2에서 LC 및 HC와 동일한 위치로 이동하지 않는다.
본 발명자들은 Trybe 03이 선행기술의 다중-특이적 항체를 넘어서는 개선된 성질을 갖는다는 것을, 특히 단백질 A 크로마토그래피 컬럼 상 1-단계 정제 후 수득한 관심 대상 단백질 (즉, 올바른 다중-특이적 항체)의 양을 최대화한다는 것을 관찰하였다. 사실상, 이전에, 본 발명자들은 이들의 상응하는 중쇄와 페어링되지 않은 부속된 경쇄를 검출하고, 관심 대상 다중-특이적 항체와 함께 공동-정제하고, 이는 부속된 경쇄의 이량체 (부속된 LC 이량체)를 형성하는 경향이 있고, 추가 포획 단계에 의해 정제할 필요가 있다. 예상치못하게, 단백질 A 정제 단계 후, 어떠한 경쇄 또는 LC 이량체도 TrYbe 03의 제조 방법의 부산물로서 검출되지 않았고, 단지 목적하는 다중-특이적 항체만을 단백질 A 컬럼으로부터 용리하였다. 추가로, 다중-특이적 항체는 고도로 단량체성이다.
본 발명자들은 부속된 LC 이량체의 단리 및 제거가 Trybe 03의 정제와 동시에 발생한다고 가설을 세웠다.
이러한 가설을 확인하기 위해, 대안 다중-특이적 항체 포맷을 사용한, 추가 실험을, 수행하고, 하기 예에 기재한다.
실시예 2: 실시예 3 내지 6에서 추가 분석을 위한 대안적인 항체 포맷의 제조
도 3에 도시된 작제물은 표 1 및 하기에 기재된 바와 같이 제조하였다. 모든 Wittrup 분자는 공통 중쇄 (hg1FL) 및 Fab 영역을 갖는다. TrYbe 분자 모두는 공통 Fab 영역을 갖는다.
표 1:
Figure pct00009
하기 예에서, 645 gH5gL4 dsscFv(HL), 즉, Ag#2 dsscFv HL은, dsscFv 1로 칭명된다.
VH1 도메인을 포함하는 Ag#3 dsscFv HL (VH1)은, dsscFv 3B로 칭명되고,
VH3 도메인을 포함하는 Ag#3 dsscFv HL (VH3)은, dsscFv 3A로 칭명된다.
Ag#4 dsscFv HL은 dsscFv 2로 칭명된다.
일과성 발현
중쇄 및 경쇄 항체 유전자를 독립적으로 일과성 발현을 위해 등록상표가 있는 포유동물 발현 벡터 내로 hCMV-mie 프로모터의 제어하에 클로닝하였다. 플라스미드를 등록상표가 있는 CHO-SXE 세포주 내로 시판되는 ExpiCHO 엑스피펙타민 일과성 발현 키트 (Thermo Scientific)를 사용하여 형질감염하였다. 배양물을 Corning 롤러 병에서 통풍 마개를 사용하여 37℃, 8.0% CO2, 190 rpm에서 인큐베이팅하였다. 18-22 시간 후, 배양물에 적합한 용적의 CHO 인핸서 및 제조자에 의해 제공된 HiTiter 방법을 위한 공급물을 공급하고, 이어서, 배양물을 32℃, 8.0% CO2, 190 rpm에서 추가 10 내지 12 일 동안 인큐베이팅하였다. 상청액을, 0.45 μm 필터에 이은 0.2 μm 필터에 의한 필터-멸균 전에, 원심분리에 의해 4000 rpm에서 1 시간 동안 4℃에서 수거하였다.
발현 역가를 1 ml HiTrap 단백질 A 컬럼 또는 1 ml HiTrap 단백질 L 컬럼 (GE Healthcare)을 사용하는 단백질 A HPLC 및 단백질 L HPLC에 의해 정량화하였다. 컬럼을 포스페이트 완충제로 평형화하고, 100μl의 샘플을 주입하고, 컬럼을 세척하고, 산성 단계 용리를 사용하여 항체를 용리하였다. 농도를 적합한 몰 흡광(extinction) 계수 보정과 함께 내부에서 정제된 Fab 표준을 사용하여 생성된 표준 곡선과 비교하여 각각의 샘플에 대한 용리 피크 면적을 사용하여 계산하였다.
단백질 L 리간드는 VL 도메인을 통해, 즉, 항체의 경쇄에 결합한다. 단백질 A는 Fc의 CH2/CH3 계면 및 단백질 A 결합 도메인을 포함하는 사람 VH 도메인의 선택을 결합한다.
경쇄 플라스미드만 발현
디설파이드 안정화된 단일 쇄 Fv (LC-dsscFv)로 부속된 경쇄의 발현을 위해, 경쇄 플라스미드만을 상기한 방법으로 형질감염시키고, 발현시키고, 정량화하였다. 표 1a는 단백질 A 및 단백질 L HPLC 검정 둘 다에 의해 정량화된 이들 발현된 경쇄 이량체에 대한 역가를 나열한다.
LC-dsscFv-1 상청액의 정량화는 단백질 L 및 단백질 A 검정와 동일한 결과를 제공하였다. 대조적으로, LC-dsscFv-2 및 LC-dsscFv-3B 상청액을 단백질 L에 의해 정량화할 수 있지만, 단백질 A 검정은 상기 정량화 수준보다 낮다. LC-dsscFv-3A 발현의 정량화는 단백질 L 검정의 약 삼분의 일의 단백질-A 검정의 값을 제공하였다.
표 1a: 단백질 A 및 단백질 L HPLC 검정에 의한 발현된 경쇄 이량체의 정량화. LOQ = 정량화 한계
Figure pct00010
표 1b: 단백질 A에 대한 경쇄 결합의 강도. 결합 강도는 강력함 (++), 약함 (+), 없음 (-)으로 분류되었다.
Figure pct00011
표 1b에 나타낸 바와 같이, LC-dsscFv-1은 단백질 A에 결합되는 dsscFv를 포함하고, 이는 계산된 단백질 L 및 단백질 A 역가가 동등한 이유를 설명한다 (표 2a). 반대로, LC-dsscFv-2 및 LC-dsscFv-3B를 단백질 L 검정에 의해서 단지 정량화할 수 있고, 단백질 A 검정으로 할 수 없고, 이로써 이들이 단백질 A 결합 도메인을 포함하지 않음을 확인하였다. LC-dsscFv-3A가 단백질 A에 약하게 결합되는 dsscFv를 포함하고, 따라서 계산된 농도가 단백질 L 검정으로부터의 농도의 단지 3분의 1임을 관찰하였다.
따라서, 결과는 dsscFv-1 및 dsscFv-3A가 단백질 A 결합 도메인을 포함함을 나타낸다. 특히, dsscFv-3A는 단백질 A에 결합할 수 있는 VH3 도메인을 포함한다.
반대로, dsscFv-2 및 dsscFv-3B는 단백질 A에 결합하지 않는다. 특히, dsscFv-3B는 단백질 A에 결합할 수 없는 VH1 도메인을 포함한다.
중쇄 및 경쇄 플라스미드의 공-발현
항체 작제물의 발현에 대해, 동일한 비의 중쇄 및 경쇄 플라스미드가 상기한 방법에 의해 공동-형질감염되고 발현된다. 이들 항체는 동일한 Fab 영역 및 이소형을 공유한다.
하기 실시예(3, 4, 5 및 6)에서 연구된 시험 상청액이 과량의 경쇄를 포함하는 것을 보장하기 위해, 단지 상응하는 경쇄 상청액만을 항체 상청액에 첨가하였다. 수득한 시험 상청액을 단백질 A 및 단백질 L HPLC 검정에 의해 정량화하였다 (표 2a).
Wittrup 01, TrYbe 05 및 TrYbe 06 시험 상청액의 정량화는 단백질 A 및 단백질 L 검정 둘 다에서 동등한 결과를 제공하였다. Wittrup 02, TrYbe 03 및 TrYbe 04의 경우 단백질 A 검정으로 측정된 농도는 단백질 L 검정으로 측정된 농도의 대략 반이었다.
Wittrup 01, TrYbe 05 및 TrYbe 06은 표 1b 및 표 2b에 기재된 바와 동일한 경쇄를 공유하고, 이러한 경쇄는 단백질 A 결합 dsscFv를 갖고, 따라서, 계산된 단백질 L 및 단백질 A 역가는, 항체 및 경쇄 이량체 둘 다가 둘 다의 검정에서 결합할 수 있는 것과 동등하였다. 항체가 단백질 A에 결합할 수 있기 때문에, 단백질 A 검정을 사용하여 Wittrup 02 및 TrYbe 03의 농도를 측정할 수 있고, 그러나 둘 다는 경쇄 상 비-단백질 A 결합 dsscFv를 갖고, 이는 각각의 경쇄 이량체가 단지 단백질 L 검정에 의해 정량화될 수 있고, 이에 따라, 2개의 검정 사이에 2-배 차이를 설명함을 의미한다. TrYbe 04는 경쇄 상 약한 단백질 A 결합 dsscFv을 갖고, 따라서 경쇄 이량체의 일부만이 결합하고, 계산된 농도는 단백질 L 검정으로부터의 농도의 단지 반이었다.
표 2a: 단백질 A 및 단백질 L HPLC 검정에 의한 시험 물질의 정량화. 샘플을 경쇄 단독 상청액을 각각의 항체 상청액 내로 스파이킹(spiking)하여 제조하였다
Figure pct00012
표 2b: 단백질 A에 대한 경쇄 결합의 강도. 결합 강도는 강력함 (++), 약함 (+), 없음 (-)으로 분류되었다. 중쇄 모두는 공통 Fab (Wittrup & TrYbe)를 통해 또는 Fc (Wittrup 단독)를 통해 결합되기 때문에 강력한 결합제로서 기재된다.
Figure pct00013
실시예 3: Wittrup 항체 포맷의 단백질 A 정제; 적합한 단백질 A 결합 성질을 갖는 dsscFv 가변 영역을 선택함.
둘 다의 Wittrup 분자를 위한 시험 상청액을 실시예 2에 기재된 바와 같이 제조하고, 항체 및 경쇄 이량체 둘 다를 포함한다. 이들 Wittrup 항체는 동일한 IgG 성분 (Fc 및 Fab)을 공유하지만, 각각은 경쇄에 부속된 상이한 dsscFv를 갖는다. Wittrup 01은 경쇄에 부속된 단백질 A 결합 dsscFv를 갖는 반면, Wittrup 02는 경쇄에 부속된 비-단백질 A 결합 dsscFv를 갖는다.
실시예 2에 나타낸 바와 같이, Wittrup 01 및 Wittrup 02 시험 상청액을 단백질 A 및 단백질 L HPLC 검정에 의해 정량화하였다 (표 3a). Wittrup 01은 둘 다의 검정에서 대략적으로 동등한 결과를 제공한 반면, Wittrup 02의 경우 단백질 A 검정은 단백질 L 검정의 단지 반이다. Wittrup 01은 경쇄에 부속된 단백질 A 결합 dsscFv (표 3b)를 갖고, 따라서, 단백질 L 및 단백질 A에 의해 계산된 역가가 동등한데, 이는 둘 다의 리간드가 경쇄 이량체를 검출할 수 있기 때문이다. 경쇄에 부속된 비-단백질 A 결합 dsscFv (표 3b)를 갖는, Wittrup 02에 대한 단백질 A 검정 결과는, 단백질 L 검정보다 상당히 더 낮은데, 그 이유는 단지 상기 항체만이 단백질 A에 결합할 수 있는 반면, Wittrup 항체 및 경쇄 이량체 둘 다가 단백질 L에 결합할 수 있기 때문이다.
표 3a: 단백질 A 및 단백질 L HPLC 검정에 의한 시험 물질의 정량화. 샘플을 경쇄 단독 상청액을 각각의 항체 상청액 내로 스파이킹하여 제조하였다.
Figure pct00014
표 3b: 단백질 A에 대한 경쇄 결합의 강도. 결합 강도는 강력함 (++), 약함 (+), 없음 (-)으로 분류되었다.
Figure pct00015
단백질 A 정제
시험 상청액을 MabSelect (GE Healthcare) 컬럼 상에 15 분 접촉 시간으로 적재하고, 결합 완충제 (200mM 글리신, pH7.5)로 세척하였다. 통과 유체를 수집하고, 0.22 μm 멸균 여과하였다. 결합된 물질을 0.1M 나트륨 시트레이트 pH3.2 단계 용리로 용리하고, 용리 피크를 수집하고, 2M 트리스-HCl pH8.5로 중화하고, 정제된 단백질을 280nm에서 흡광도로 정량화하였다. 단백질이 컬럼으로부터 완전히 용리되었음을 확인하기 위해 0.1M 시트레이트 pH2.1로 두번째 용리를 수행하였다.
단백질 L 정제
단백질 A 정제로부터의 통과 유체를 단백질 L (GE Healthcare) 컬럼 상에 10 분 접촉 시간으로 적재하고, 결합 완충제 (200mM 글리신, pH7.5)로 세척하였다. 통과 유체를 수집하고, 0.22 μm 멸균 여과하였다. 결합된 물질을 0.1M 글리신/HCl pH2.7 단계 용리로 용리하고, 용리 피크를 수집하고, 2M 트리스-HCl pH8.5로 중화하고, 정제된 단백질을 280nm에서 흡광도로 정량화하였다. 단백질이 컬럼으로부터 완전히 용리되었음을 확인하기 위해 0.1M 시트레이트 pH2.1로 두번째 용리를 수행하였다.
SDS-PAGE
나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에 의한 분석을 위해 샘플을 4 x Novex NuPAGE LDS 샘플 완충제 (Life Technologies) 및 10X NuPAGE 샘플 환원제 (Life Technologies) 또는 100 mM N-에틸말레이미드 (Sigma-Aldrich) 중 어느 하나를 첨가하여 제조하고, 100℃로 3 분 동안 가열하였다. 샘플을 15 웰 Novex 4-20% 트리스-글리신 1.0 mm SDS-폴리아크릴아미드 겔 (Life Technologies) 상에 적재하고, 225 V의 정전압에서 40 분 동안 트리스-글리신 SDS 작동 완충제 (내부에서 제조) 중에서 분리하였다. Novex Mark12 광-범위 단백질 표준 (Life Technologies)을 분자량 마커로서 사용하였다. 겔을 Coomassie Quick Stain (Generon)으로 염색하고, 증류수에서 탈색하였다.
결과
순차적인 단백질 A 및 단백질 L 정제를 평가하기 위해, 환원된 (도 4a) 및 비-환원된 (도 4b) 샘플을 SDS-PAGE 분석을 위해 제조하였다. 이들 샘플은 단백질 A 적재 물질, 단백질 A 용리액, 단백질 L 적재 물질 (단백질 A 통과 유체), 단백질 L 용리액 및 단백질 L 통과 유체를 포함하였다.
Wittrup 01은 경쇄에 부속된 단백질 A 결합 dsscFv를 갖는다. 중쇄 및 경쇄가 크기가 유사하고 이에 따라 동일한 위치로 공동-이동하기 때문에, 환원된 단백질 A 용리액 (레인 1B)에서 하나의 대역이 존재한다. 단백질 L 용리액 (레인 1D)에서 어떠한 검출가능한 대역도 존재하지 않는다. 이는 경쇄 이량체가 단백질 A 정제 동안 Wittrup 01 항체로 공동-정제되는 것을 나타낸다. 대조적으로, Wittrup 02는 경쇄에 부속된 비-단백질 A 결합 dsscFv를 갖는다. 단백질 A 용리액 (레인 2B)은 Wittrup 01 단백질 A 용리액과 비슷해 보이지만, 단백질 L 용리액에서 경쇄 이량체가 단백질 A 정제에 포획되지 않았지만, 컬럼을 통해 유동하고, 단백질 L 정제에서 후속적으로 포획되었음을 나타내는 경쇄 대역이 존재한다.
Wittrup 01에 대한 비-환원된 겔 상, 단백질 A 용리액 (레인 1B)에서 Wittrup 항체 및 경쇄 이량체에 대한 대역이 존재한다. 분자의 일부에서 CH1 및 CK 사이의 천연 쇄간 디설파이드 (ds) 결합의 불완전 형성 때문에 또한 이러한 레인에 존재하는 추가 대역이 존재한다. 단백질 L 용리액 (레인 1D)은 어떠한 검출가능한 대역도 없고, 경쇄 이량체가 단백질 A 정제에서 Wittrup 01로 공동-정제되었음을 다시 보여준다. Wittrup 02에 대해, 단백질 A 용리액 (레인 2B)에서 Wittrup 대역 뿐만 아니라 불완전 디설파이드 형성으로 인한 추가 대역이 존재한다. 경쇄 이량체 대역은 단백질 L 적재 및 단백질 L 용리액 (레인 2C, 레인 2D) 둘 다에서 볼 수 있지만, 단백질 A 용리액에서는 볼 수 없다. 이는 추가로 단지 Wittrup 02 항체만이 단백질 A 정제에서 포획되고, 경쇄 이량체가 컬럼을 통해 유동하고 후속적으로 단백질 L 정제에서 포획됨을 나타낸다.
요약하면, Wittrup 항체에서 경쇄에 부속된 단백질 A에 결합할 수 있는 dsscFv의 존재는 경쇄 이량체의 공동-정제를 야기하고, 이는 Wittrup 포맷의 경쇄에 부속된 단백질 A에 결합할 수 없는 dsscFv의 선택함으로써 회피될 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 경쇄가 선택 또는 조작되어 비-단백질 A 결합제가 될 수 있는 개선된 다중-특이적 항체를 제공하였다.
실시예 4: 상이한 가변 영역 이식을 사용한 TrYbe 항체 포맷의 단백질 A 정제; 경쇄 부속된 dsscFv의 적합한 단백질 A 결합 성질을 위한 프레임워크 선택.
TrYbe 03 및 04 분자 둘 다에 대한 시험 상청액을 실시예 2에 기재된 바와 같이 제조하고, 항체 및 경쇄 이량체 둘 다를 포함한다. 이들 TrYbes는 동일한 Fab 및 중쇄에 부속된 동일한 단백질 A 결합 dsscFv를 공유한다. 경쇄 부속된 dsscFvs는 동일한 모 가변 영역으로부터 유도되지만, TrYbe 03에서 CDRs은 비-단백질 A 결합 프레임워크 (VH1 도메인) 상으로 이식된 반면, TrYbe 04에서 CDRs은 단백질 A 결합 프레임워크 (VH3 도메인) 상으로 이식되었다.
TrYbe 03 및 TrYbe 04 시험 상청액을 단백질 A 및 단백질 L HPLC 검정에 의해 정량화하고 (표 4a), 둘 다의 경우, 단백질 A 검정은 단백질 L 검정보다 낮다.
단백질 A 검정으로 측정된 TrYbe 03의 농도는, 이러한 TrYbe이 TrYbe 항체가 단백질 A에 결합될 수 있는 경쇄 (표 4b) 상에만 비-단백질 A 결합 dsscFv를 갖기 때문에, 단백질 L 검정의 약 반이지만, TrYbe 03 및 경쇄 이량체 둘 다는 단백질 L 검정에 의해 정량화될 수 있다. TrYbe 04는 경쇄 상 약한 단백질 A 결합 dsscFv를 갖고 (표 4b), TrYbe 및 경쇄 이량체 모두는 단백질 L 검정에 결합할 수 있지만, 단백질 A 검정은 TrYbe 모두 및 경쇄 이량체의 단지 일부에 결합한다. 따라서, 이러한 상황에서 단백질 A에 의해 총 경쇄 이량체 및 TrYbe를 정확하게 정량화할 수 없다.
표 4a: 단백질 A 및 단백질 L HPLC 검정에 의한 시험 상청액의 정량화. 샘플을 경쇄 단독 상청액을 각각의 항체 상청액 내로 스파이킹하여 제조하였다.
Figure pct00016
표 4b: 단백질 A에 대한 경쇄 결합의 강도. 결합 강도는 강력함 (++), 약함 (+), 없음 (-)으로 분류되었다.
Figure pct00017
단백질 A 및 단백질 L 정제 단계, 및 SDS PAGE 분석을 실시예 3에서 상기한 바와 같이 수행하였다.
밀도측정(Densitometry)
밀도측정 분석을 ImageQuant 이미지 분석 소프트웨어 (GE Healthcare)를 사용하여 환원된 SDS-PAGE에서 수행하였다. 분석을 중쇄 대역의 밀도에 대한 백분율로서 나타낸다.
결과
순차적인 단백질 A 및 단백질 L 정제를 평가하기 위해, 환원된 (도 5a) 및 비-환원된 (도 5b) 샘플을 SDS-PAGE 분석을 위해 제조하였다. 이들 샘플은 단백질 A 적재 물질, 단백질 A 용리액, 단백질 L 적재 물질 (단백질 A 통과 유체), 단백질 L 용리액 및 단백질 L 통과 유체를 포함하였다. 추가로, 밀도측정 분석을 환원된 단백질 A 용리액 상에서 수행하여 존재하는 중쇄 및 경쇄의 비율을 비교하였다 (도 5c).
TrYbe 03은 경쇄에 부속된 비-단백질 A 결합 dsscFv를 갖는다. 단백질 A 용리액 (레인 3B)에서 환원된 겔 상에, 중쇄 및 경쇄에 상응하는 2개의 대역이 존재하고; 단백질 L 용리액 (레인 3D)에서 단지 경쇄 대역만이 존재한다. 밀도측정 분석은 단백질 A 용리액에 존재하는 중쇄 및 경쇄의 비가 동일함을 나타내었다. 따라서, 단지 TrYbe 03만이 단백질 A 정제에 의해 포획되고, 경쇄 이량체가 컬럼을 통해 유동하고, 단백질 L 정제에 의해 후속적으로 포획된다. 대조적으로, TrYbe 04는 경쇄에 부속된 단백질 A 결합 dsscFv를 갖는다. 환원된 겔 상에서, 단백질 A 용리액 (레인 4B)에서 더 강력한 경쇄 및 덜 강력한 중쇄가 존재한다. 밀도측정 (도 5c)은 중쇄보다 3배 많은 경쇄가 존재함을 나타내었다. 단백질 L 용리액 (레인 4D)에서, 어떠한 대역도 존재하지 않는다. 이는 경쇄 이량체가 단백질 A 정제 동안 TrYbe 04로 공동-정제됨을 나타낸다. 표 4b에서, TrYbe 04는 경쇄에 부속된 약한 단백질 A 결합 dsscFv를 갖는 것으로 기재되고, 이는 단백질 A HPLC 검정에 의한 정량화를 어렵게 한다. 그러나, 분취용 단백질 A 크로마토그래피에 대해 사용되는 상태하에, 결합 강도는 충분하고, 단백질 A에 양호하게 결합할 수 있다.
비-환원된 겔 상, TrYbe 03의 경우, 단백질 A 용리액에서 TrYbe 대역이 존재하고 (레인 3B), 단백질 L 용리액에서 경쇄 이량체 대역이 존재하고 (레인 3D), 따라서 이들의 크기가 유사하고, 대역이 동일한 위치로 이동한다. 단백질 A 용리액에서 또한 중쇄 및 경쇄 대역이 존재하고, 단백질 L 용리액에서 경쇄 대역이 존재하는데, 이는 적은 비율의 분자에서 CH1 및 CK 사이의 천연 쇄간 디설파이드 (ds) 결합의 불완전 형성 때문이다. 이는 또한, 비-ds 결합된 경쇄가 존재하기 때문에, 단백질 L 용리액 (레인 3E)에서 분명히 나타난다. 다시, 이들 관찰은 TrYbe 03 항체만이 단백질 A 정제에 의해 포획되고, 경쇄 이량체가 컬럼을 통해 유동하고, 후속적으로 단백질 L 정제에 의해 포획됨을 나타낸다. TrYbe 04의 경우, 단백질 A 용리액 (레인 4B)에서 TrYbe 및 경쇄 이량체 대역은 이들의 크기가 유사하기 때문에 동일한 위치에 공동-이동한다. 불완전 쇄간 ds 결합 형성 때문에 또한 중쇄 및 경쇄 대역이 존재하고, 2개의 CK 사이의 ds 결합 형성이 CH1/CK 쌍형성에서보다 덜 효율적이기 때문에 더 많은 비-ds 결합된 경쇄가 존재한다. 다시, 단백질 L 용리액 (레인 4D)에 어떠한 대역도 존재하지 않고, 이는 경쇄 이량체가 단백질 A 정제 동안 TrYbe 04로 공동-정제됨을 나타내었다.
요약하면, 경쇄 상 이러한 dsscFv의 단백질 A 결합 이식의 존재는 TrYbe를 사용한 경쇄 이량체의 공동-정제를 야기하였다. 동일한 dsscFv는 비-단백질 A 결합 프레임워크 상으로 이식되고, 이어서, 경쇄 이량체는 포획되지 않고, 단지 TrYbe만이 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제되었다.
따라서, 본 발명자들은 경쇄에 부속된 dsscFv의 VH 프레임워크가 비-단백질 A 결합제가 되도록 선택되는 개선된 다중-특이적 항체를 제공하였다. 이러한 경우, VH1은 단백질 A에 결합할 수 없기 때문에 선택되었다. 당해 기술분야의 숙련가는 동일한 결과가, 단백질 A에 결합하는 이의 능력을 폐지하는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 단백질 A에 결합하지 않는 프레임워크, 예를 들면, VH1, VH2, VH4, VH5, VH6, 단백질 A에 결합할 수 없는 천연 발생 VH3, 또는 단백질 A에 결합할 수 있는 천연 발생 VH3의 변종을 선택함으로서 수득할 수 있음을 이해할 수 있다.
실시예 5: 경쇄 부속된 dsscFv의 적합한 단백질 A 결합 성질의 대안적인 dsscFv 위치설정을 사용한 TrYbe 항체 포맷의 단백질 A 정제.
TrYbe 03 및 TrYbe 05 분자 둘 다를 위한 시험 상청액을 실시예 2에 기재된 바와 같이 제조하고, 항체 및 경쇄 이량체 둘 다를 포함한다. 이들 TrYbe는 동일한 Fab 및 동일한 쌍의 dsscFvs를 공유하지만, dsscFvs는 반대편 Fab 쇄 상으로 부속되었다. TrYbe 03에서 단백질 A 결합 dsscFv는 중쇄에 부속되고, 비-단백질 A 결합 dsscFv는 경쇄에 부속된다. 대안적으로, TrYbe 05에서 단백질 A 결합 dsscFv는 경쇄에 부속되고, 비-단백질 A 결합 dsscFv는 중쇄에 부속된다.
TrYbe 03 및 TrYbe 05 시험 상청액을 단백질 A 및 단백질 L HPLC에 의해 정량화하였다 (표 5a). TrYbe 03의 경우 단백질 A 검정은 단백질 L 검정보다 상당히 더 낮지만, TrYbe 05는 둘 다의 검정에서 동등한 결과를 야기한다.
TrYbe 03에 대한 단백질 A 검정 결과는, 이러한 TrYbe가 경쇄 상 비-단백질 A 결합 dsscFv을 갖기 때문에, 단백질 L 검정보다 상당히 더 낮고 (표 5b), 이는 단지 TrYbe 항체만이 단백질 A에 결합할 수 있는 반면, TrYbe 및 경쇄 이량체 둘 다가 단백질 L 검정에 결합할 수 있음을 의미한다. TrYbe 05는 경쇄에 부속된 단백질 A 결합 dsscFv를 갖고 (표 5b), 따라서, 계산된 단백질 L 및 단백질 A 역가는, 둘 다의 검정이 TrYbe 및 경쇄 이량체에 결합할 수 있기 때문에, 동등하다.
표 5a: 시험 상청액의 단백질 A 및 단백질 L HPLC 검정에 의한 정량화. 샘플을 경쇄 단독 상청액을 각각의 항체 상청액 내로 스파이킹하여 제조하였다.
Figure pct00018
표 5b: 단백질 A에 대한 경쇄 결합의 강도. 결합 강도는 강력함 (++), 약함 (+), 없음 (-)으로 분류되었다.
Figure pct00019
단백질 A 및 단백질 L 정제 단계를 상기한 바와 같이 수행하였다. SDS PAGE 및 밀도측정 분석을 또한 상기한 바와 같이 수행하였다.
결과
순차적인 단백질 A 및 단백질 L 정제를 평가하기 위해, 환원된 (도 6a) 및 비-환원된 (도 6b) 샘플을 SDS-PAGE 분석을 위해 제조하였다. 이들 샘플은 단백질 A 적재 물질, 단백질 A 용리액, 단백질 L 적재 물질 (단백질 A 통과 유체), 단백질 L 용리액 및 단백질 L 통과 유체를 포함하였다. 추가로, 밀도측정 분석을 환원된 단백질 A 용리액 상에서 수행하여 존재하는 중쇄 및 경쇄의 비율을 비교하였다 (도 6c).
TrYbe 03은 경쇄에 부속된 비-단백질 A 결합 dsscFv를 갖는다. 환원된 겔 상, 단백질 A 용리액 (레인 3B)에서, 중쇄 및 경쇄에 상응하는 2개의 대역이 존재하고, 단백질 L 용리액 (레인 3D)에서, 단지 경쇄 대역만이 존재한다. 밀도측정 분석은 단백질 A 용리액에 존재하는 중쇄 및 경쇄의 비가 동일함을 나타낸다. 따라서, 단지 TrYbe 03만이 단백질 A 정제에서 포획되고, 경쇄 이량체는 컬럼을 통해 유동하고, 단백질 L 정제에서 후속적으로 포획된다. 대조적으로, TrYbe 05는 경쇄에 부속된 단백질 A 결합 dsscFv를 갖는다. 환원된 단백질 A 용리액 (레인 5B)에서, 중쇄보다 40% 더 많은 경쇄가 존재하고, 단백질 L 용리액 (레인 5D)에서, 어떠한 검출가능한 대역도 존재하지 않는다. 이는 경쇄 이량체가 단백질 A 정제 동안 TrYbe 05로 공동-정제되었음을 나타낸다.
비-환원된 겔 상, TrYbe 03의 경우, 단백질 A 용리액에서 TrYbe 대역 (레인 3B) 및 단백질 L 용리액에서 경쇄 이량체 대역 (레인 3D)이 존재하고, 이들의 크기가 유사하고, 따라서, 대역은 동일한 위치로 이동한다. 또한 단백질 A 용리액에서 중쇄 및 경쇄 대역 및 단백질 L 용리액에서 경쇄 대역이 존재한다. 이들은 분자의 적은 비율에서 CH1 및 CK 사이의 천연 쇄간 디설파이드 (ds) 결합의 불완전 형성, 또는 경쇄 이량체에서 상응하는 CK/CK 쇄간 디설파이드 때문이다. 다시, 이들 결과는 단지 TrYbe만이 단백질 A 정제에서 포획되고, 경쇄 이량체가 컬럼을 통해 유동하고, 단백질 L 정제에서 후속적으로 포획됨을 나타낸다. TrYbe 05 단백질 A 용리액 (레인 5B)에서, TrYbe 및 경쇄 이량체 대역은, 이들이 크기가 매우 비슷하기 때문에, 동일한 위치에 공동-이동한다. 다시, 쇄간 디설파이드의 비-형성 때문에 중쇄 및 경쇄는 레인 3B에서와 같이 존재한다. 추가로, 또한 단백질 L 용리액 (레인 5D)에서 또한 검출가능한 대역이 존재하지 않고, 추가로 경쇄 이량체는 단백질 A 정제 동안 TrYbe로 공동-정제되었음을 나타낸다.
요약하면, 단백질 A 결합 dsscFv는 경쇄에 부속되고, 비-단백질 A 결합 dsscFv는 중쇄에 부속되는 TrYbe 분자의 배열은 경쇄 이량체 및 TrYbe 둘 다의 공동-정제를 야기하였다. 단백질 A 결합 dsscFv는 중쇄에 존재하고, 비-단백질 A 결합 dsscFv는 경쇄 상에 존재하도록 이러한 디자인을 역전시키고, 2개의 dsscFvs를 교환함으로서, 본 발명자들은 단백질 A 친화도 크로마토그래피로 TrYbe만을 정제할 수 있고, 경쇄 이량체는 컬럼을 통해 유동하였음을 나타낸다.
실시예 6: 경쇄 부속된 scFv의 단백질 A 결합 성질에 대해 부적절한 scFv 선택을 갖는 TrYbe 항체 포맷의 단백질 A 정제.
TrYbe 분자 둘 다에 대한 시험 상청액을 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하고, 항체 및 경쇄 이량체 둘 다를 포함한다. 이들 TrYbes는 동일한 Fab 및 dsscFvs의 동일한 쌍을 공유하지만, dsscFvs는 반대편 Fab 쇄 상에 부속되었다. 둘 다의 dsscFvs는 단백질 A에 결합되지만 상이한 강도를 갖는다. TrYbe 04에서, 더 약한 단백질 A 결합 dsscFv는 경쇄에 부속되고, 강력한 단백질 A 결합 dsscFv는 중쇄에 부속된다. 대안적으로, TrYbe 06에서, 더 약한 단백질 A 결합 dsscFv는 중쇄에 부속되고, 강력한 단백질 A 결합 dsscFv는 경쇄에 부속된다.
TrYbe 04 및 TrYbe 06 시험 상청액을 단백질 A 및 단백질 L HPLC에 의해 정량화하였다 (표 6a). TrYbe 06의 경우, 단백질 A 및 단백질 L 검정은 동등한 결과를 제공하는 반면, TrYbe 04의 경우, 단백질 A 검정은 단백질 L 검정보다 더 낮다.
TrYbe 06은 경쇄에 부속된 강력한 단백질 A 결합 dsscFv (표 7b)을 갖고, 따라서, 단백질 L 및 단백질 A 검정 둘 다에 대해 계산된 농도는 TrYbe 및 경쇄 이량체 둘 다가 둘 다의 검정에 결합할 수 있기 때문에 동등하다. TrYbe 04는 경쇄 상 약한 단백질 A 결합 dsscFv를 갖고 (표 6b), 따라서 TrYbe 모두 및 경쇄 이량체의 단지 일부가 단백질 A 검정에 결합할 것이다. 대조적으로 TrYbe 및 경쇄 이량체 둘 다는 단백질 L 검정에 완전히 결합된다. 따라서 단백질 A 검정을 사용하여 이러한 시험 상청액에 존재하는 경쇄 이량체 모두를 완전히 정량화할 수 없다.
표 6a: 시험 상청액의 단백질 A 및 단백질 L HPLC 검정에 의한 정량화. 샘플을 경쇄 단독 상청액을 각각의 항체 상청액 내로 스파이킹하여 제조하였다.
Figure pct00020
표 6b: 단백질 A에 대한 경쇄 결합의 강도. 결합 강도는 강력함 (++), 약함 (+), 없음 (-)으로 분류되었다.
Figure pct00021
단백질 A 및 단백질 L 정제 단계를 상기한 바와 같이 수행하였다. SDS PAGE 및 밀도측정 분석을 또한 상기한 바와 같이 수행하였다.
결과
순차적인 단백질 A 및 단백질 L 정제를 평가하기 위해, 환원된 (도 7a) 및 비-환원된 (도 7b) 샘플을 SDS-PAGE 분석을 위해 제조하였다. 이들 샘플은 단백질 A 적재 물질, 단백질 A 용리액, 단백질 L 적재 물질 (단백질 A 통과 유체), 단백질 L 용리액 및 단백질 L 통과 유체를 포함하였다. 추가로, 밀도측정 분석을 환원된 단백질 A 용리액 상에서 수행하여 존재하는 중쇄 및 경쇄의 비율을 비교하였다 (도 7c).
TrYbe 04는 경쇄에 부속된 더 약한 단백질 A 결합 dsscFv를 갖는다. 환원된 겔 상, 단백질 A 용리액 (레인 4B)에서, 더 강력한 경쇄 및 덜 강력한 중쇄가 존재한다. 밀도측정은 중쇄보다 3배 더 많은 경쇄가 존재함을 나타내었다. 단백질 L 용리액 (레인 4D)에서, 어떠한 대역도 존재하지 않는다. 이는 경쇄 이량체가 단백질 A 정제 동안 TrYbe 04로 공동-정제됨을 나타낸다. TrYbe 06은 경쇄에 부속된 강력한 단백질 A 결합 dsscFv를 갖는다. 환원된 단백질 A 용리액 (레인 6B)에서, 이러한 예에서 대역이 공동-이동하기 때문에, 중쇄 및 경쇄 둘 다에 대해 하나의 대역이 존재한다. 단백질 L 용리액 (레인 6D)에서, 어떠한 검출가능한 대역도 존재하지 않는다. TrYbe 06의 경우처럼, 이는 단백질 A 정제 동안 경쇄 이량체가 TrYbe로 공동-정제됨을 제시한다.
TrYbe 04의 경우, 비-환원된 단백질 A 용리액 (레인 4B)에서, TrYbe 및 경쇄 이량체 대역은 이들의 크기가 유사하기 때문에 동일한 위치에 공동-이동한다. 또한 불완전 쇄간 ds 결합 형성 때문에 중쇄 및 경쇄 대역이 존재한다. 경쇄 이량체의 존재로 인해 더 많은 경쇄가 존재하고, 이는 2개의 CK 사이의 쇄간 디설파이드 결합 형성이 CH1/CK 쌍형성에서보다 덜 효율적이기 때문이다.
TrYbe 04와 같이, 비-환원된 겔에서 TrYbe 06에 대한, 단백질 A 용리액 (레인 6B)은 TrYbe 및 경쇄 이량체를 포함하고, 그러나 이러한 경우, 상이하게 약간 이동되기 때문에 2개의 대역이 존재한다. 또한 중쇄 및 경쇄 대역이 존재하지만, 그러나, 환원된 겔과 대조적으로 이들은 공동-이동되어 단지 하나의 대역이 명백하다. 이전과 같이, TrYbe 04 또는 TrYbe 06의 경우 (레인 4D, 레인 6D) 단백질 L 용리액에서 어떠한 대역도 존재하지 않고, 이는 경쇄 이량체가 단백질 A 정제 동안 TrYbe로 공동-정제됨을 나타낸다.
요약하면, 경쇄에 부속된 단백질 A 결합 dsscFv의 존재는 TrYbe와 함께 경쇄 이량체의 공동-정제를 야기하였다. 이러한 공동-정제는 심지어 경쇄 부속된 dsscFv가 단지 단백질 A의 약한 결합제인 경우에도 발생하였다. 따라서, 본 발명자들은 단백질 A에 결합하는 항체 LC의 능력을 완전히 폐지하는 것의 중요성을 나타내었다.
실시예 7: 단백질-A 상호작용 검정
새로운 방법은 상호작용 검정을 통해 단백질-A 결합에 대해 항체 단편을 정성적으로 시험하기 위해 개발하였다.
검정은 4개의 주요 단계로 이루어진다: 적재, 세첵, 용리, 재-평형화. 100 μl 2.1 x 30 mm POROS™ A 20 μm 컬럼 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)을 작동 완충제 (PBS pH 7.4) 중에 평형화하였다. 50 μl의 1 mg/ml의 시험 분자 또는 대조군 분자를 컬럼 상에 0.2 ml/min으로 Agilent 1100 고-성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 시스템 (Palo Alto, CA)을 사용하여 적재하였다. 이어서, 컬럼을, 0.1 M 글리신-HCl pH 2.7로 2.0 ml/min에서, 2 분 동안 산성 단계 용리를 적용하여 임의의 잔여 강력한 결합제를 제거하기 전에, 60 컬럼 용적에 걸쳐서 작동 완충제, 예를 들면, PBS pH 7.4로 30 분 동안 서서히 세척하였다. 최종적으로, 컬럼을 다음 주입을 위한 제조시 작동 완충제 (예를 들면, 50 CV PBS pH 7.4, 2.0 ml/min의 유속 및 추가 10 CV에서 0.2 ml/min에서)에서 재-평형화하였다. 흡광도를 280 nm (A280)에서 판독하였다.
시험 분자:
시험 분자는 1가 및 단량체이어야 하고, 이러한 경우, 뮤린 Fab를 갖는 정제된 BYbe (Fab-dsscFv) 분자 (단백질 A에 결합하지 않음) 및 중쇄 (HC)에 부속된 dsscFv 시험 V-영역을 사용하였다. dsscFv-1, dsscFv-2, dsscFv-3A, dsscFv-3B는 이전 실시예에 사용된 dsscFv 분자에 상응한다. 추가로, dsscFv-4를 사용하고, 이는 강력한 결합제인 것으로 공지된 hFab-4 결합 단편의 것과 상응하는 VH 및 VL 영역을 포함한다.
대조군 분자:
대조군 분자를 사용하여 결과가 정확함을 보장하였다. hFab-1은 중간 결합제인 것으로 공지된 사람 Fab이다. hFab-4는 강력한 결합제인 것으로 공지된 사람 Fab이다. mu Fab는 뮤린 Fab이고, 단백질 A에 결합하지 않는다. IgG는 단백질 A에 강하게 결합하고, 따라서 무관한 IgG를 대조군으로서 사용하였다. 최종적으로, 사람 혈청 알부민 (HSA)을 음성 대조군으로서 사용하였다.
결과
체류 시간을 표 7에 나타낸다. 이러한 단백질 A 상호작용 검정에서, 단백질 A 비-결합제는 한정될 수 있고, 여기서, 주요 피크는 통과 유체 중에 용리하고, 따라서 0.9 분보다 낮은(inferior) 체류 시간을 갖는다. 약한 내지 강력한 단백질 A 결합제에 대한 피크 체류 시간은 각각 1-30 분의 범위일 것이다. 또한 더 강력한 결합제에 대해 피크 형태는 분자가 컬럼 아래로 굴러 떨어지기(tumbles) 때문에 넓어질 것으로 예상될 수 있다. 강력한 결합제는 산성 용리 단계까지 결합되어 유지될 수 있고, 여기서, 31 분에서 피크를 관찰할 수 있다.
IgG는 단백질 A에 강력하게 결합하고, 따라서 IgG 대조군은 단지 컬럼으로부터 검정의 산성 단계 동안 용리되고, 따라서, 주요 피크 체류 시간은 31 분이었다. 대조적으로, HSA 음성 대조군은 컬럼 통해 직선으로 이동하고, 따라서, 주요 피크는 0.7 분의 체류 시간을 갖는다. Fab-dsscFv 시험 분자에서 사용된 mu Fab는 주요 피크 체류 시간 <0.9 분을 갖고, 따라서 본 발명자들은 시험 분자의 단백질 A에 대한 결합이 단지 Fab의 중쇄에 부속된 dsscFv를 통해서 발생하였음을 확신하였다.
단백질 A 결합 V-영역에 대해 주요 피크의 체류 시간은 >1 분이었다. dsscFv-3A는 약한 단백질 A 결합제로서 이전에 기술되고, 단지 1.8 분에서 가장 짧은 체류 시간을 갖는다.
다른 단백질 A 결합 V-영역 (dsscFv-1, dsscFv-4)은 더 늦은 체류 시간을 갖고, 이는 dsscFv-3A보다 더 강력한 결합제임을 나타낸다.
단백질 A 비-결합 V-영역 (dsscFv-2, dsscFv-3B, dsscFv-mu1)에 대해 Fab-dsscFv는 컬럼을 통해 직선으로 이동하고, 주요 피크의 체류 시간은 <0.9 분이다.
표 7: 단백질 A 상호작용 검정에서 관찰된 수득한 체류 시간
Figure pct00022
실시예 8: Biacore 검정
단백질 A에 결합하는 천연 또는 조작된 가변 영역 중 어느 하나를 포함하는 항체 작제물의 능력을 확인하기 위해, 결합을 특히 Biacore를 사용하는 표면 플라스몬 공명 (SPR)에 의해 측정할 수 있다.
SPR은 단백질-단백질 상호작용의 상세하고 정량적인 연구를 위한 공통으로 사용된 기술이다. 이들의 평형 및 동역학 매개변수를 측정하기 위해 종종 사용된다 (참조: Hashimoto, 2000).
Biacore 방법은 단백질 A에 대한 항체 시험 분자 (예를 들면, BYbes)의 결합을 정량적으로 평가하기 위해 확립하였다. BIAcore™ T200 장치 (GE Healthcare)를 SPR 실험을 수행하기 위해 사용하였다.
2개의 형태의 네이티브 단백질 A에 대한 결합을 평가하였다: 에스. 아우레우스(S. aureus)로부터 정제된 시판 공급되는 단백질 A (Sigma Aldrich), 및 재조합 정제된 형태 (내부에서 제조). 각각을 CM5 센서 칩 표면 (GE Healthcare)으로 표준 아민 커플링 화학에 의해 대략적으로 400RU의 수준까지 고정하였다. 이후에 시험 분자의 결합을 30μl/min에서 60s 주입을 사용하여 각각 칩 표면 상 적정하여 평가하였다. HBS-EP+ (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA 및 0.05% 폴리소르베이트 20)를 샘플 희석 및 작동 완충제 둘 다로서 사용하였다. 각각의 주입 사이에, 표면을 60s 주입 (10μl/min에서) 10mM 글리신 pH 1.7의 주입을 사용하여 재생하였다. 각각의 샘플을 스톡 농도 (90, 30 또는 10μM)에 좌우되어 성취할 수 있는 최고 농도로부터 3-배 희석으로 일련의 10-포인트 농도에 걸쳐서 적정하고, 0nM 블랭크 주입은 기기 노이즈 및 드리프트를 공제하기 위해 각각의 샘플에 대해 포함되었다.
dsscFv 서열에 융합된 마우스 Fab 샘플을 이전 실시예에 기재된 바와 같이 선택하였다. 추가로, Mu Fab, dsscFv-mu1을 단백질 A 결합의 공지된 부재하의 음성 대조군 마우스 서열을 포함하는 음성 대조군으로서 사용하였다.
결과
표 8a 및 8b, 및 도 8은 시판되는 정제된 단백질 A (표 8a 및 도 8a) 및 정제된 재조합 단백질 A (표 8b 및 도 8b)에 대한 각각의 농도에서 샘플 주입의 말기에 (블랭크 공제 후) 결합 반응을 나타낸다. 이러한 검정 포맷을 사용하여, 결합을 고정된 단백질 A (대략적으로 400RU의 고정 수준에서)에 대해서 평가할 수 있다. 적정가능한 결합 반응 (블랭크 공제 후)을 공지된 양성 단백질 A 결합과 함께 사람 VH3 도메인을 갖는 모든 작제물에서 발견하였다. 절대 결합 반응은 고정된 단백질 A의 품질 및 관찰된 배경 신호의 수준에 좌우된다. 비-결합 음성 대조군의 적정은 10μM의 농도까지 최소이지만 측정가능한 결합 반응을 제공한다.
시험 분자의 비-결합을 10μM의 농도까지 적정가능한 결합 반응이 없음을 입증하여 확인할 수 있고, 결합 반응 (10μM에서)은 10μM에서 음성 대조군에 대해 관찰된 반응보다 2-배 이하로 더 높은 결합 반응이다.
표 8a: 시판되는 정제된 분비된 단백질 A에 대한 Fab-dsscFv 분자의 결합
Figure pct00023
표 8b: 정제된 재조합 단백질 A에 대한 Fab-dsscFv 분자의 결합
Figure pct00024
SEQUENCE LISTING <110> UCB BIOPHARMA SRL <120> MULTISPECIFIC ANTIBODIES <130> PF0207-WO-PCT <140> GB1919058.6 <141> 2019-12-20 <160> 82 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide linker <400> 1 Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide linker <400> 2 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge linker <400> 3 Asp Lys Thr His Thr Cys Ala Ala 1 5 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge linker <400> 4 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge linker <400> 5 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys 1 5 10 15 Pro Ala <210> 6 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge linker <400> 6 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys 1 5 10 15 Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 20 25 <210> 7 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge linker <400> 7 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Gly Lys Pro Thr Leu 1 5 10 15 Tyr Asn Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala Gly Thr Cys Tyr 20 25 30 <210> 8 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge linker <400> 8 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Gly Lys Pro Thr His 1 5 10 15 Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp Gly Thr Cys Tyr 20 25 30 <210> 9 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge linker <400> 9 Asp Lys Thr His Thr Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 <210> 10 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge linker <400> 10 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp 1 5 10 15 Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala 20 25 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge linker <400> 11 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Ser Cys Pro Ala 1 5 10 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 12 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 1 5 <210> 13 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 13 Asp Lys Thr His Thr Ser 1 5 <210> 14 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 14 Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 15 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 16 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 16 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 17 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 17 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly Ser 20 <210> 18 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 18 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 <210> 19 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 19 Ala Ala Ala Gly Ser Gly Gly Ala Ser Ala Ser 1 5 10 <210> 20 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 20 Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Gly Gly Gly Ser Gly Ala Ser Ala Ser 1 5 10 15 <210> 21 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 21 Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Ala Ser Ala Ser 20 <210> 22 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 22 Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Xaa Gly Gly Gly Ser Gly Ala Ser Ala Ser 20 25 <210> 23 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 23 Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser Gly Ala Ser Ala Ser 20 25 30 <210> 24 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 24 Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Ser Gly Ala Ser Ala Ser 1 5 10 <210> 25 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 25 Pro Gly Gly Asn Arg Gly Thr Thr Thr Thr Arg Arg Pro Ala Thr Thr 1 5 10 15 Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr Gln Ser His Tyr 20 25 <210> 26 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 26 Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr 1 5 10 <210> 27 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 27 Ala Thr Thr Thr Gly Ser 1 5 <210> 28 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 28 Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Ser Pro Pro Ser Lys Glu 1 5 10 15 Ser His Lys Ser Pro 20 <210> 29 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 29 Gly Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 1 5 10 15 <210> 30 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 30 Gly Gly Gly Gly Ile Ala Pro Ser Met Val Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 31 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 31 Gly Gly Gly Gly Lys Val Glu Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 32 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 32 Gly Gly Gly Gly Ser Met Lys Ser His Asp Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 33 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 33 Gly Gly Gly Gly Asn Leu Ile Thr Ile Val Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 34 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 34 Gly Gly Gly Gly Val Val Pro Ser Leu Pro Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 35 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 35 Gly Gly Glu Lys Ser Ile Pro Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 36 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 36 Arg Pro Leu Ser Tyr Arg Pro Pro Phe Pro Phe Gly Phe Pro Ser Val 1 5 10 15 Arg Pro <210> 37 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 37 Tyr Pro Arg Ser Ile Tyr Ile Arg Arg Arg His Pro Ser Pro Ser Leu 1 5 10 15 Thr Thr <210> 38 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 38 Thr Pro Ser His Leu Ser His Ile Leu Pro Ser Phe Gly Leu Pro Thr 1 5 10 15 Phe Asn <210> 39 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 39 Arg Pro Val Ser Pro Phe Thr Phe Pro Arg Leu Ser Asn Ser Trp Leu 1 5 10 15 Pro Ala <210> 40 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 40 Ser Pro Ala Ala His Phe Pro Arg Ser Ile Pro Arg Pro Gly Pro Ile 1 5 10 15 Arg Thr <210> 41 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 41 Ala Pro Gly Pro Ser Ala Pro Ser His Arg Ser Leu Pro Ser Arg Ala 1 5 10 15 Phe Gly <210> 42 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 42 Pro Arg Asn Ser Ile His Phe Leu His Pro Leu Leu Val Ala Pro Leu 1 5 10 15 Gly Ala <210> 43 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 43 Met Pro Ser Leu Ser Gly Val Leu Gln Val Arg Tyr Leu Ser Pro Pro 1 5 10 15 Asp Leu <210> 44 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 44 Ser Pro Gln Tyr Pro Ser Pro Leu Thr Leu Thr Leu Pro Pro His Pro 1 5 10 15 Ser Leu <210> 45 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 45 Asn Pro Ser Leu Asn Pro Pro Ser Tyr Leu His Arg Ala Pro Ser Arg 1 5 10 15 Ile Ser <210> 46 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 46 Leu Pro Trp Arg Thr Ser Leu Leu Pro Ser Leu Pro Leu Arg Arg Arg 1 5 10 15 Pro <210> 47 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 47 Pro Pro Leu Phe Ala Lys Gly Pro Val Gly Leu Leu Ser Arg Ser Phe 1 5 10 15 Pro Pro <210> 48 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 48 Val Pro Pro Ala Pro Val Val Ser Leu Arg Ser Ala His Ala Arg Pro 1 5 10 15 Pro Tyr <210> 49 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 49 Leu Arg Pro Thr Pro Pro Arg Val Arg Ser Tyr Thr Cys Cys Pro Thr 1 5 10 15 Pro <210> 50 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 50 Pro Asn Val Ala His Val Leu Pro Leu Leu Thr Val Pro Trp Asp Asn 1 5 10 15 Leu Arg <210> 51 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 51 Cys Asn Pro Leu Leu Pro Leu Cys Ala Arg Ser Pro Ala Val Arg Thr 1 5 10 15 Phe Pro <210> 52 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rigid linker <400> 52 Gly Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala 1 5 10 <210> 53 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rigid linker <400> 53 Pro Pro Pro Pro 1 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Gly Cys Leu Trp 1 5 10 15 Gly Arg Ser Val Lys 20 <210> 60 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Albumin binding peptide <400> 60 Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu Asp Asp 1 5 10 15 <210> 61 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Albumin binding peptide <400> 61 Arg Leu Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu 1 5 10 15 Asp Asp <210> 62 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Albumin binding peptide <400> 62 Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu Asp Asp 1 5 10 15 <210> 63 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Albumin binding peptide <400> 63 Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu Asp 1 5 10 15 <210> 64 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Albumin binding peptide <400> 64 Arg Leu Met Glu Asp Ile Cys Leu Ala Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu 1 5 10 15 Asp Asp <210> 65 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Albumin binding peptide <400> 65 Glu Val Arg Ser Phe Cys Thr Arg Trp Pro Ala Glu Lys Ser Cys Lys 1 5 10 15 Pro Leu Arg Gly 20 <210> 66 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Albumin binding peptide <400> 66 Arg Ala Pro Glu Ser Phe Val Cys Tyr Trp Glu Thr Ile Cys Phe Glu 1 5 10 15 Arg Ser Glu Gln 20 <210> 67 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Albumin binding peptide <400> 67 Glu Met Cys Tyr Phe Pro Gly Ile Cys Trp Met 1 5 10 <210> 68 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 68 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 69 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 69 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 70 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 70 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 71 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 645 CDRH1 <400> 71 Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr Ala Ile Asn 1 5 10 <210> 72 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 645 CDRH2 <400> 72 Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 73 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 645 CDRH3 <400> 73 Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu 1 5 10 <210> 74 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 645 CDRL1 <400> 74 Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn Phe Leu Ser 1 5 10 <210> 75 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 645 CDRL2 <400> 75 Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser 1 5 <210> 76 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 645 CDRL3 <400> 76 Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Thr Thr 1 5 10 <210> 77 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 645 heavy chain variable domain <400> 77 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 78 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 645 heavy chain variable domain, mutated <400> 78 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 79 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 645 light chain variable domain <400> 79 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn 20 25 30 Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile 85 90 95 Ser Asp Thr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 80 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 645 light chain variable domain, mutated <400> 80 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn 20 25 30 Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile 85 90 95 Ser Asp Thr Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 81 <211> 251 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 645 scFv (VH-VL) <400> 81 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln 130 135 140 Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val 145 150 155 160 Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn Phe Leu Ser 165 170 175 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Glu 180 185 190 Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly 195 200 205 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp 210 215 220 Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Thr 225 230 235 240 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 245 250 <210> 82 <211> 251 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 645 dsscFv <400> 82 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln 130 135 140 Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val 145 150 155 160 Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn Phe Leu Ser 165 170 175 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Glu 180 185 190 Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly 195 200 205 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp 210 215 220 Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Thr 225 230 235 240 Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 245 250

Claims (27)

  1. 화학식 (I)의 폴리펩타이드 쇄 및 화학식 (II)의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 다중-특이적 항체:
    화학식 (I):
    VH-CH1-(CH2) s -(CH3) t -X-(V1) p
    화학식 (II):
    (V3) r -Z-VL-C L -Y-(V2) q ;
    상기 화학식에서:
    VH는 중쇄 가변 도메인을 나타내고;
    CH1은 중쇄 불변 영역의 도메인 1을 나타내고;
    CH2는 중쇄 불변 영역의 도메인 2를 나타내고;
    CH3은 중쇄 불변 영역의 도메인 3을 나타내고;
    X는 결합 또는 링커(linker)를 나타내고;
    V1은 dsscFv, dsFv, scFv, VH, VL 또는 VHH를 나타내고;
    V3은 dsscFv, dsFv, scFv, VH, VL 또는 VHH를 나타내고;
    Z는 결합 또는 링커를 나타내고;
    VL은 경쇄 가변 도메인을 나타내고;
    CL은 C카파와 같은 경쇄 불변 영역으로부터의 도메인을 나타내고;
    Y는 결합 또는 링커를 나타내고;
    V2는 dsscFv, dsFv, scFv, VH, VL 또는 VHH를 나타내고;
    p는 0 또는 1을 나타내고;
    q는 0 또는 1을 나타내고;
    r은 0 또는 1을 나타내고;
    s는 0 또는 1을 나타내고;
    t는 0 또는 1을 나타내고;
    여기서, p가 0인 경우, X는 부재하고, q가 0인 경우, Y는 부재하고, r이 0인 경우, Z는 부재하고;
    q가 0인 경우, r은 1이고, r이 0인 경우, q는 1이고;
    화학식 (II)의 폴리펩타이드 쇄는 적어도 하나의 dsscFv, dsFv, scFv, VH 또는 VHH를 포함하고;
    화학식 (I)의 폴리펩타이드 쇄는 단백질 A 결합 도메인을 포함하고;
    화학식 (II)의 폴리펩타이드 쇄는 단백질 A에 결합하지 않는다.
  2. 제1항에 있어서, 화학식 (I)의 폴리펩타이드 쇄가 1, 2 또는 3개의 단백질 A 결합 도메인을 포함하는, 다중-특이적 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단백질 A 결합 도메인이 VH 및/또는 CH2-CH3 및/또는 V1에 존재하는, 다중-특이적 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 (I)의 폴리펩타이드 쇄가, VH 또는 V1에 존재하는 단지 하나의 단백질 A 결합 도메인을 포함하는, 다중-특이적 항체.
  5. 제4항에 있어서, 화학식 (I)의 폴리펩타이드 쇄가 VH에 존재하는 단지 하나의 단백질 A 결합 도메인을 포함하는, 다중-특이적 항체.
  6. 제4항에 있어서, 화학식 (I)의 폴리펩타이드 쇄가 V1에 존재하는 단지 하나의 단백질 A 결합 도메인을 포함하는, 다중-특이적 항체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 A 결합 도메인(들)이 단백질 A에 결합하는 VH3 도메인 또는 이의 변종을 포함하거나 이로 이루어진, 다중-특이적 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, V2 및/또는 V3가 VH3 도메인을 포함하지 않는, 다중-특이적 항체.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, V2 및/또는 V3가, 단백질 A에 결합하지 않는 VH3 도메인 또는 이의 변종을 포함하거나 이로 이루어진, 다중-특이적 항체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, p가 1인, 다중-특이적 항체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, q가 1인, 다중-특이적 항체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, r이 1인, 다중-특이적 항체.
  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, q가 0이고, r이 1인, 다중-특이적 항체.
  14. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, s가 1이고, t가 1이고, p가 0이고, q가 1이고, r이 0이고, V2가 dsscFv 또는 dsFv인, 다중-특이적 항체.
  15. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, s가 0이고, t가 0이고, p가 1이고, q가 1이고, r이 0이고, V1 및 V2 둘 다가 dsscFv를 나타내는, 다중-특이적 항체.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, V1이 알부민에 결합하고, 서열 번호 78의 서열의 VH3을 포함하는, 다중-특이적 항체.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, X 및/또는 Y 및/또는 Z가 펩타이드 링커, 예를 들면, 서열 번호 1, 2, 69 및 70의 펩타이드 링커인, 다중-특이적 항체.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, V1 및/또는 V2 및/또는 V3이 dsscFv 또는 dsFv이고, V1의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 및/또는 V2의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 및/또는 V3의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인이 2개의 조작된 시스테인 잔기 사이의 디설파이드 결합에 의해 링크되고, 상기 시스테인 잔기의 쌍의 위치가 VH37 및 VL95, VH44 및 VL100, VH44 및 VL105, VH45 및 VL87, VH100 및 VL50, VH100b 및 VL49, VH98 및 VL46, VH101 및 VL46, VH105 및 VL43 및 VH106 및 VL57 (카바트에 따른 번호매김)를 포함하거나 이로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 상기 VH 및 VL 값이 독립적으로, 제공된 V1 또는 V2 또는 V3 내에 있고, 예를 들면, VH44 및 VL100인, 다중-특이적 항체.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 정의된 다중-특이적 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  20. 제19항에 정의된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  21. 각각 제19항 또는 제20항의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  22. 각각의 벡터가 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 정의된 다중-특이적 항체의 상이한 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 적어도 2개의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  23. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 다중-특이적 항체 및 적어도 하나의 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  24. 치료에 사용하기 위한 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 다중-특이적 항체 또는 제23항에 따른 약제학적 조성물.
  25. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 다중-특이적 항체 또는 제23항에 따른 약제학적 조성물의 치료학적 유효량을 투여함을 포함하는 이를 필요로 하는 환자의 치료 방법.
  26. 제1항에 정의된 화학식 (I)의 폴리펩타이드 쇄 및 화학식 (II)의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 다중-특이적 항체의 제조 방법으로서, 상기 방법은:
    a) 상기 정의된 화학식 (I)의 폴리펩타이드 쇄 및 화학식 (II)의 폴리펩타이드 쇄를, 숙주 세포에서 발현시키는 단계로서, 여기서, 화학식 (II)의 폴리펩타이드 쇄는 화학식 (I)의 폴리펩타이드 쇄보다 과량인, 단계;
    b) 단계 a)에서 발현된 폴리펩타이드의 조성물을 회수하는 단계로서, 상기 조성물은 다중-특이적 항체 및 화학식 (II-II)의 LC 이량체를 포함하는, 단계; 및
    c) 상기 다중-특이적 항체를 정제하는 단계로서, 여기서, s가 1이고, t가 1인 경우, 상기 다중-특이적 항체를 화학식 (I)의 2개의 중쇄 및 화학식 (II)의 2개의 연합된 경쇄를 갖는 이량체로서 정제하고, s가 0이고, t가 0인 경우, 상기 다중-특이적 항체를 화학식 (I)의 하나의 중쇄 및 화학식 (II)의 하나의 연합된 경쇄를 갖는 이량체로서 정제하는, 단계
    를 포함하고;
    여기서, 화학식 (II)의 폴리펩타이드 쇄는 적어도 하나의 dsscFv, dsFv, scFv, VH 또는 VHH를 포함하고;
    화학식 (I)의 폴리펩타이드 쇄는 단백질 A 결합 도메인을 포함하고;
    화학식 (II)의 폴리펩타이드 쇄는 단백질 A에 결합하지 않고;
    단계 c)는 단계 b)에서 회수된 폴리펩타이드의 조성물을, 임의로 적어도 하나의 정제 단계 후, 단백질 A 친화도 크로마토그래피 컬럼에 적용함을 포함하는, 방법.
  27. 제1항에 정의된 화학식 (I)의 폴리펩타이드 쇄 및 화학식 (II)의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 다중-특이적 항체의 정제 방법으로서, 상기 방법은:
    a) 상기 정의된 화학식 (I)의 폴리펩타이드 쇄 및 화학식 (II)의 폴리펩타이드 쇄의 조성물을 수득하는 단계로서, 상기 조성물은 다중-특이적 항체를 포함하고, s가 1이고, t가 1인 경우, 상기 다중-특이적 항체는 화학식 (I)의 2개의 중쇄 및 화학식 (II)의 2개의 연합된 경쇄를 갖는 이량체이고; s가 0이고, t가 0인 경우, 상기 다중-특이적 항체는 화학식 (I)의 하나의 중쇄 및 화학식 (II)의 하나의 연합된 경쇄를 갖는 이량체; 및 (LC 이량체)와 함께 연합된 화학식 (II-II)의 2개의 경쇄의 이량체이고;
    여기서, 화학식 (II)의 폴리펩타이드 쇄는 적어도 하나의 dsscFv, dsFv, scFv, VH 또는 VHH를 포함하고;
    화학식 (I)의 폴리펩타이드 쇄는 단백질 A 결합 도메인을 포함하고;
    화학식 (II)의 폴리펩타이드 쇄는 단백질 A에 결합하지 않는, 단계;
    b) 단계 a)에서 수득한 조성물을, 단백질 A 친화도 컬럼 상에 적재하는 단계로서, 이로서 상기 다중-특이적 항체는 상기 컬럼 상에 보유되지만, 상기 LC 이량체는 상기 컬럼에 결합하지 않는, 단계;
    c) 상기 단백질 A 친화도 컬럼을 세척하는 단계;
    d) 상기 다중-특이적 항체를 용리하는 단계; 및
    e) 상기 다중-특이적 항체를 회수하는 단계
    를 포함하는, 방법.
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